Estudio del efecto de micotoxinas sobre la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma

Irene Nieto Fernández Estudio del efecto de micotoxinas sobre la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma Facultad de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2021 Modalidad del Trabajo: Experimental Trabajo de Fin de Grado Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Irene Nieto Fernández y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento NoComercial 4.0 Internacional”. Resumen Castellano El impacto de las micotoxinas sobre la salud humana ha sido objeto de estudio en los últimos años, sin embargo, existe escasa información acerca de los efectos producidos por la presencia simultánea de micotoxinas reguladas y emergentes en los alimentos. En este trabajo se han evaluado los efectos de la micotoxina regulada deoxinivalenol (DON) y de la micotoxina emergente ácido fusárico (AF) sobre la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Con este objetivo, se ha analizado el efecto de ambas toxinas sobre la viabilidad celular de forma individual y combinada utilizando el ensayo MTT (Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5- difeniltetrazol), obteniendo así sus concentraciones inhibitorias 50 (CI50). Individualmente, el DON tiene una CI50 de 0,93 µM, mientras que el AF presenta un valor de 75,02 µM. Al combinar el DON y el AF en proporción 2:1, las CI50 resultantes son 1,62 y 0,81 µM para la micotoxina regulada y la emergente, respectivamente, por lo que muestran un efecto antagónico. Finalmente, se analizó el tipo de muerte producido por ambos compuestos por citometría de flujo, observándose que el AF produce apoptosis, mientras que el DON no genera apoptosis ni necrosis en esta línea celular. Debido al antagonismo observado, la co-contaminación de los alimentos con ambas micotoxinas podría producir en un efecto protector para el consumidor. Palabras clave: micotoxinas, ácido fusárico, deoxinivalenol, citotoxicidad, antagonismo, apoptosis, emergente Galego O impacto das micotoxinas na saúde humana foi obxecto de estudo nos últimos anos, con todo, hai pouca información sobre os efectos producidos pola presenza simultánea de micotoxinas reguladas e emerxentes nos alimentos. Neste traballo avaliáronse os efectos da micotoxina regulada deoxinivalenol (DON) e da micotoxina emerxente ácido fusárico (AF) na liña celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Con este obxectivo, analizouse o efecto de ambas toxinas sobre a viabilidade celular individualmente e en combinación mediante a proba MTT (Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-ilo) -2,5-difeniltetrazol), obtendo así a súa concentración inhibitoria 50 (CI50). Individualmente, o DON ten unha CI50 de 0,93 µM, mentres que o AF presenta un valor de 75,02 µM. Ao combinar o DON e o AF nunha proporción de 2:1, as CI50 resultantes son 1,62 e 0,81 µM para a micotoxina regulada e a emerxente, respectivamente, polo que mostran un efecto antagónico. Finalmente, analizouse o tipo de morte producido por ambos compostos por citometría de fluxo, observándose que o AF produce apoptose, mentres que o DON non xera apoptose nin necrose nesta liña celular. Debido ao antagonismo observado, a co- contaminación dos alimentos con ambas micotoxinas podería producir un efecto protector para o consumidor. Palabras chave: micotoxinas, ácido fusárico, deoxinivalenol, citotoxicidade, antagonismo, apoptose, emerxente English The impact of mycotoxins on human health has been object of study in recent years. However, there is little information about the effects produced by the simultaneous presence of regulated and emerging mycotoxins in food. In this work, the effects of the regulated mycotoxin deoxinivalenol (DON) and the emerging mycotoxin fusaric acid (AF) have been evaluated on the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. With this objective, the individual and combined effects of both toxins on cell viability have been analyzed using MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay, obtaining their half inhibitory concentrations (CI50). Individually, DON has a CI50 of 0,93 µM, while FA presents a value of 75,02 µM. By combining DON and FA in a 2:1 ratio, the resulting CI50 are 1,62 and 0,81 µM for the regulated and emerging mycotoxins, respectively, so they show an antagonistic effect. Finally, the type of cell death produced by both compounds was analyzed by flow cytometry, observing that FA induces apoptosis, while DON does not produce neither apoptosis nor necrosis on this cell line. Due to the observed antagonism, food co-contamination with both mycotoxins could produce a protective effect for the consumer. Keywords: mycotoxins; fusaric acid; deoxinivalenol; cytotoxicity; antagonistic; apoptosis; emerging Índice Abreviaturas y acrónimos.......................................................................................................... 4 1. Introducción ...................................................................................................................... 6 1.1. Micotoxinas ................................................................................................................... 6 1.1.1. Toxicidad y regulación de las micotoxinas ............................................................... 8 1.2. Toxicidad combinada .................................................................................................. 11 1.2.1. Índice de combinación de Chou & Talalay ............................................................. 12 1.3. Tipos de muerte celular ............................................................................................... 13 1.3.1. Apoptosis o muerte celular tipo 1 ............................................................................ 14 1.3.2. Autofagocitosis o muerte celular tipo 2 .................................................................. 15 1.3.3. Necrosis o muerte celular tipo 3 .............................................................................. 16 1.4. Tinciones para evaluar la viabilidad celular ................................................................ 17 1.4.1. MTT ........................................................................................................................ 17 1.4.2. Anexina V e Ioduro de propidio .............................................................................. 18 2. Objetivos ............................................................................................................................. 20 3. Material y Métodos ............................................................................................................. 21 3.1. Reactivos y materiales ................................................................................................. 21 3.2. Soluciones y medios de cultivo ................................................................................... 21 3.3. Cultivo celular ............................................................................................................. 21 3.4. Ensayo MTT ................................................................................................................ 22 3.5. Citometría de flujo ...................................................................................................... 22 3.6. Análisis estadístico ...................................................................................................... 23 4. Resultados ........................................................................................................................... 23 4.1. Evaluación del efecto individual de las micotoxinas en la viabilidad celular de la línea SH-SY5Y ................................................................................................................................ 23 4.2. Evaluación del efecto combinado de las micotoxinas sobre la viabilidad celular de la línea SH-SY5Y ........................................................................................................................ 28 5. Discusión ............................................................................................................................. 29 6. Conclusiones ....................................................................................................................... 33 7. Bibliografía ......................................................................................................................... 34 4 Abreviaturas y acrónimos ADN: Ácido Desoxirribonucleico AF: Ácido Fusárico ATGs: Genes relacionados con la autofagia, del inglés “autophagy-related genes” ATP: Adenosín Trifosfato BEA: Beauvericina BHE: Barrera hemato-encefálica CO2: Dióxido de carbono CI50: Concentración inhibitoria 50 DBH: Dopamina β-hidroxilasa DMEM: Medio Eagle modificado de Dulbecco, del inglés “Dulbecco’s Modified Eagle’s médium” DON: Deoxinivalenol DISC: señal compleja de inducción de muerte, del inglés “Death Inducing Signaling Complex” EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, del inglés “European Food Safety Authority” FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, del inglés “Food and Agricultural Organization” FB1: Fumonisina B1 FITC: Isotiocianato de fluoresceína, del inglés “Fluorescein Isotiocyanate” HEPES: Ácido 4-(2-hidroxietil) piperazin-1-iletanosulfónico IP: Ioduro de propidio LDH: Lactato deshidrogenasa mTOR: del inglés “mammalian Target of Rapamycin” MTT: Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol NIV: Nivalenol 5 NADH: Nicotinamida Adenina Dinucleótido NADPH: Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato RIP: Proteína quinasa de interacción con el receptor, del inglés “Receptor-interacting protein kinase” SDS: sodio dodecil sulfato STS: Estaurosporina 6 1. Introducción 1.1. Micotoxinas Las micotoxinas son un grupo de metabolitos secundarios de bajo peso molecular producidos por diferentes especies de hongos filamentosos. Estos compuestos producen efectos tóxicos en los seres vivos a través de la contaminación de alimentos, piensos y otras materias primas, por lo que su ingesta es un problema de interés para la salud pública. Los síndromes de toxicidad resultantes de la ingesta de micotoxinas por parte del hombre y de los animales se conocen como micotoxicosis (Adeyeye, 2016; Sainz et al., 2018). Entre los diferentes tipos de hongos capaces de producir micotoxinas destacan el phylum Ascomycota, y dentro de él los géneros Fusarium, Aspergillus (Figura 1) y Penicillium, de gran interés para la salud humana y animal dado que tienen la capacidad de colonizar plantas de cultivo destinadas al consumo (Gruber-Dorninger et al., 2017). Cabe destacar que el maíz es uno de los cereales más susceptibles de ser contaminado por micotoxinas, y que, junto al arroz y al trigo, supone el 94% del consumo total de cereales en el mundo (Ranum et al., 2014). Figura 1. (A) Cultivo de Fusarium sp y (B) Aspergillus sp. Fotografías cedidas por J. González Jartín Se han identificado más de 300 tipos de micotoxinas, pero solo alrededor de 20 pueden estar presentes en cultivos y alimentos a una concentración suficiente como para producir una toxicidad relevante. Desde el punto de vista de la salud pública, las micotoxinas más importantes son: las aflatoxinas, la ocratoxina A, la patulina, los tricotecenos, la zearalenona y las fumonisinas (Kifer et al., 2020; Sainz et al., 2018). Basándonos en estos datos, no es de extrañar que la contaminación con micotoxinas suponga una gran amenaza para la salud humana. Esto se debe en gran medida a su estabilidad 7 física y química, ya que resisten a procesos de molienda, secado o cocción, lo que impide que puedan ser destruidas durante el tratamiento industrial. Otro factor importante es su capacidad de colonización de los cultivos, que puede ocurrir durante su crecimiento en el campo, viéndose favorecido por temperaturas extremas y alta humedad, o después de la cosecha, durante el almacenamiento, transporte y procesamiento (Sainz et al., 2018). En este sentido, el cambio climático está estrechamente relacionado con el aumento de la contaminación de los cultivos por micotoxinas. El aumento del CO2, de la temperatura, y del estrés por sequía en los campos son elementos clave para el desarrollo de hongos micotoxigénicos, incluyendo las especies de Fusarium, Aspergillus y Penicillium. El impacto del cambio climático sobre los cultivos europeos ha sido examinado por la Agencia Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA), concluyendo que los efectos variarán dependiendo del área geográfica y podrán ser perjudiciales o beneficiosos. Por ejemplo, se prevé que en el norte de Europa el aumento de las temperaturas resulte beneficioso para los cultivos, mientras que en la cuenca mediterránea los cambios extremos en las condiciones meteorológicas aumentarán gradualmente la contaminación con micotoxinas. El cambio climático también influye en el desequilibrio entre la relación patógeno/plaga, planta huésped y medio ambiente (Figura 2). Estudios recientes sugieren que plagas invasoras de cultivos básicos migran a los polos a una velocidad de 3-5 km/año, aumentando así el estrés ambiental al que se ven sometidas las plantas, y reduciendo su resistencia al desarrollo de micotoxinas. Por lo tanto, el cambio climático conllevará grandes impactos en la seguridad alimentaria en los diferentes continentes (Medina et al., 2017). Figura 2. Esquema de las relaciones entre los diferentes factores que intervienen en el desarrollo de las micotoxinas y su impacto en la salud humana y animal 14 1.3.1. Apoptosis o muerte celular tipo 1 La apoptosis, o muerte celular programada tipo 1, es el tipo principal de muerte celular que ocurre cuando las alteraciones en el ADN de las células son irreparables. Los procesos patológicos en los que esto ocurre son enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares, inmunológicas, y procesos cancerígenos, aunque también está descrita en procesos fisiológicos. Por ejemplo, en muchas especies, la apoptosis ocurre durante el proceso de desarrollo embriológico y fetal para eliminar células del sistema nervioso y permitir la diferenciación. Este tipo de muerte celular está caracterizada por cambios morfológicos y bioquímicos específicos en las células sobre las que actúa, incluyendo la contracción de las células, la condensación y fragmentación del núcleo, la aparición de una ampolla en la membrana plasmática, y la pérdida de adhesión a células vecinas o a la matriz extracelular. Todos estos cambios son coordinados por unas enzimas pertenecientes a la familia de las cisteín-proteasas llamadas caspasas (Ouyang et al., 2012; Ramanpreet et al., 2021). Existen dos rutas principales que pueden intervenir en la activación de la apoptosis, pudiendo diferenciar entre ellas la vía intrínseca o mitocondrial, o la vía extrínseca o de receptor de muerte (Figura 5). En ambas vías intervienen las caspasas y tienen como resultado en las células los cambios morfológicos y bioquímicos anteriormente descritos. Figura 5. Esquema de la apoptosis por vía extrínseca e intrínseca. Modificado de (Alvariño Romero, 2019) La apoptosis extrínseca depende de la unión de un ligando a receptores de muerte localizados en la membrana plasmática. Los ligandos más conocidos son los FasL/FasR y TNF- α/TNRF1, y al unirse crean un complejo en la cara interna de la membrana plasmática llamado 15 DISC (del inglés “Death Inducing Signaling Complex”), que hace que la señal de muerte se transmita desde la superficie de la célula hasta el medio intracelular, lo que activa la caspasa 3 a través de la caspasa 8 y se inicia el proceso apoptótico. Por otro lado, la apoptosis intrínseca se inicia a través de estímulos que no están mediados por receptores y que se transmiten al interior de la célula generando señales intracelulares que llegan a las mitocondrias. Estas señales deben dar lugar a diversos estímulos que inhiben la proteína anti-apoptótica Bcl-2, permitiendo la apertura del poro mitocondrial. Una vez abierto, comienza la liberación de factores inductores de la apoptosis desde el interior mitocondrial, entre los que se encuentran el citocromo c, la smac/DIABLO y la endonucleasa G, activando así las caspasas 9 y 3, con las cuales comienza la cascada apoptótica. Además, la endonucleasa G y los factores inductores de apoptosis se dirigen al núcleo celular, dando lugar a la fragmentación del ADN y la condensación de la cromatina (Fernández Araujo, 2015; Ouyang et al., 2012; Ramanpreet et al., 2021). 1.3.2. Autofagocitosis o muerte celular tipo 2 La autofagia, aunque menos común que la apoptosis, es un importante mecanismo de muerte celular que se caracteriza por ser un proceso catabólico, independiente de las caspasas, y altamente regulado por genes relacionados con la autofagia (ATGs). La función principal de esta vía es promover la supervivencia celular mediante el reciclaje de componentes celulares, lo que le proporcionará a la célula la energía mínima necesaria para mantenerse. La autofagia se activa como mecanismo de supervivencia tras recibir señales de estrés tanto intra como extracelulares, cuando, por ejemplo, la célula tiene déficit de nutrientes. Otro ejemplo bien conocido de la activación de la autofagia ocurre durante el desarrollo animal, en concreto en el proceso de metamorfosis larva-pupa, en el que se requieren una serie de ATGs para degradar el intestino medio larval. Sin embargo, la sobreactivación de este sistema puede resultar en una muerte celular dependiente de la autofagia (Denton & Kumar, 2019). El principal responsable de la regulación del proceso de autofagia que se activa cuando la célula se encuentra con escasez de nutrientes es la proteína mTOR (del inglés “mammalian target of rapamycin”). Esta proteína del grupo de las quinasas es ampliamente conocida por integrar una gran cantidad de rutas relacionadas con el crecimiento celular. Su función reguladora depende de sus dos subunidades: TORC1 y TORC2. En presencia de nutrientes y señales de crecimiento, TORC1 previene la autofagia fosforilando e inhibiendo la actividad del complejo Atg1/ULK1. Sin embargo, en situación de inanición, TORC1 queda inactivo, lo que permite la activación del Atg1 y con ello el inicio de la autofagia. La autofagia termina con la fusión del autofagosoma y el lisosoma, formando un autolisosoma para la degradación o 16 reciclaje de componentes celulares (Figura 6) (Denton & Kumar, 2019; Fernández Araujo, 2015; Murrow & Debnath, 2013; Ouyang et al., 2012). Figura 6. Esquema del mecanismo de autofagia celular en situación de inanición. Ante la escasez de nutrientes, la proteína mTORC1 queda inactivada, lo que permite la activación del Atg1 y en consecuencia el inicio de la autofagia. Se diferencian las distintas fases: 1) comienzo del aislamiento de la membrana o fagóforo; 2) formación de la doble membrana que forma el autofagosoma; 3) fusión del autofagosoma y lisosoma; 4) formación del autolisososoma; 5) degradación y reciclaje del contenido celular 1.3.3. Necrosis o muerte celular tipo 3 La necrosis es un tipo de muerte celular no controlada caracterizada por una serie de eventos que desencadenan la ruptura de la membrana plasmática y la consecuente salida de material intracelular, dando lugar a una reacción inflamatoria en los tejidos circundantes. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que también puede iniciarse de forma controlada mediante vías de señalización específicas entre las que intervienen principalmente las proteínas RIP1 y RIP3 (del inglés “receptor-interacting protein kinase”), por lo que también juega un importante papel en la eliminación de células dañadas (Fernández Araujo, 2015; John W Baynes, 2019). Los cambios celulares que encontramos en la necrosis y que nos pueden ayudar a identificar este tipo de muerte celular mediante diversas tinciones son: aumento del volumen celular, presencia de ADN fragmentado en el citosol, ruptura de la membrana plasmática y salida del material intracelular. Además, se está comenzando a estudiar la forma de identificar la necrosis controlada mediante las vías de señalización anteriormente mencionadas. 17 Hasta hace poco se pensaba que la aparición de necrosis en las células estaba necesariamente ligada a la carencia de ATP. Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que el agotamiento del ATP no es el único fenómeno crítico capaz de iniciar este proceso, sino que otras causas como el aumento del Ca+2 intracelular, la oxidación, o ciertas infecciones como la inducida por Mycobacterium tuberculosis también son capaces de activar la necrosis celular (Ramírez Agudelo & Rojas López, 2010). 1.4. Tinciones para evaluar la viabilidad celular La viabilidad celular se define como el número de células funcionales en una muestra. Evaluar la viabilidad celular es de interés en numerosos ensayos celulares, sobre todo en aquellos que se relacionan con la toxicidad. Los ensayos que evalúan la viabilidad celular pueden diferenciarse en aquellos que analizan la población celular en su totalidad, y aquellos que se centran en el análisis de células individuales. Existen diferentes tinciones y métodos que podemos utilizar para evaluar la viabilidad celular, y dependerá de su coste, velocidad y complejidad del equipamiento requerido el que elijamos uno u otro (Stoddart, 2011). A continuación, se describirán las tinciones para determinar la viabilidad celular que se han utilizado en el presente trabajo. 1.4.1. MTT El MTT (Bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) es un compuesto perteneciente a la familia de sales de tetrazolio utilizado para determinar la cantidad de células viables en una muestra. Esta determinación está basada en un método colorimétrico, ya que el MTT se transforma en cristales insolubles de formazán de color azulado tras el proceso de reducción que es llevado a cabo por las deshidrogenasas mitocondriales (Figura 7). Los cristales de formazán formados tras la reducción del MTT se pueden solubilizar con distintos disolventes, permitiendo la lectura de la absorbancia a longitudes de onda entre 540 y 595 nm, y la señal será proporcional al número de células viables. Debido a que la actividad mitocondrial está relacionada con la viabilidad en la mayoría de los tipos celulares, este ensayo permite evaluar la viabilidad basándose en la actividad metabólica de la célula (Kupcsik, 2011). 18 Figura 7. Reacción de reducción del MTT en las mitocondrias. Modificada de (Grant, 2014) El ensayo MTT se ha convertido en un método de evaluación de viabilidad celular estandarizado, aplicado principalmente para testar la toxicidad de productos farmacéuticos o de sus combinaciones, y de fármacos anticancerígenos a diferentes concentraciones. Por ejemplo, este ensayo ha sido utilizado sobre células de leucemia linfoblástica aguda pediátrica, evaluando la viabilidad celular de ciertos medicamentos para poder predecir su efecto in vivo. Otra de sus aplicaciones es evaluar la resistencia a medicamentos (van Meerloo et al., 2011). La capacidad de reducción de la célula depende de la cantidad de NADH y NADPH que contenga, que a su vez se ve comprometida por la cantidad de glucosa extracelular disponible. Por tanto, un medio celular agotado tendrá menor concentración de estas sustancias, producirá una menor reducción, veremos un color poco azulado, y la lectura de su absorbancia de MTT será baja (Kupcsik, 2011). 1.4.2. Anexina V e Ioduro de propidio La tinción con Anexina V e ioduro de propidio (IP) permite diferenciar las células en necrosis y en apoptosis. Morfológicamente existe una clara distinción entre las células que sufren procesos de apoptosis y las que sufren necrosis. En las células en apoptosis se distingue una disminución del volumen celular, fragmentación del ADN y formación de cuerpos apoptóticos, mientras la membrana celular queda intacta. En la necrosis observamos la lisis de la membrana celular, la dilatación del citoplasma y del núcleo, y la descomposición de las organelas (Pietkiewicz et al., 2015). La Anexina V es una proteína que se une de forma específica a residuos de fosfatidilserina, que se encuentran expuestos en la cara externa de la membrana plasmática cuando se desencadena la apoptosis. Esto la convierte en un biomarcador efectivo de células apoptóticas, 19 en las cuales esta membrana celular sigue existiendo. La Anexina V no es fluorescente, por lo que se conjuga con diferentes fluoróforos para poder identificar a las células en apoptosis, como es el caso del isotiocianato de fluoresceína (FITC, del inglés “Fluorescein Isotiocyanate”). Para diferenciar células apoptóticas de células necróticas, combinamos la Anexina V con un marcador de ADN que no sea permeable a la membrana a menos que esta se encuentre dañada, como es el caso del marcador catiónico IP. De esta forma, con la combinación de ambas tinciones podemos distinguir entre células en apoptosis, que serán positivas a la Anexina V, y células necróticas, negativas a la Anexina V y positivas al IP (Figura 8). La fluorescencia emitida por ambas moléculas se puede monitorizar por citometría de flujo (Martínez Salazar, 2009). Figura 8. Esquema del funcionamiento de las tinciones Anexina V-FITC (verde) y Ioduro de propidio (rojo). La Anexina V actúa como marcador de apoptosis uniéndose a los fosfolípidos de la cara externa de la membrana que se externalizan cuando la célula entra en apoptosis, y el IP penetra en la célula en necrosis cuando se pierde la integridad de la membrana, tiñendo el ADN 20 2. Objetivos La contaminación de alimentos con micotoxinas supone un problema para la salud pública que se está viendo agravado por el cambio climático, ya que el aumento de la temperatura y la humedad favorecen la aparición de hongos micotoxigénicos. Actualmente, el mecanismo de acción de estas toxinas, así como sus efectos en combinación, son prácticamente desconocidos. En este contexto, los objetivos de este Trabajo Fin de Grado son: -Evaluar los efectos individuales de las micotoxinas DON y AF sobre la viabilidad de la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y -Analizar el tipo de muerte producido por las micotoxinas DON y AF en las células SHSY5Y -Estudiar los efectos in vitro sobre la viabilidad celular de la combinación de DON y AF en la proporción encontrada en muestras naturalmente contaminadas 21 3. Material y Métodos 3.1. Reactivos y materiales Las micotoxinas DON y AF (pureza >98%), la estaurosporina (STS), la saponina y el MTT se obtuvieron en Merck (Madrid, España). Las células SH-SY5Y se obtuvieron en la American Type Culture Collection (número CRL2266). El medio de cultivo Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)/F12, el suero fetal bovino (FBS), la penicilina/estreptomicina y la tripsina/EDTA se compraron en Thermo Fisher Scientific (Madrid, España). La solución Detachin™ se obtuvo de Genlantis (San Diego, EE. UU.). El kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC/IP se compró en Inmunostep (Salamanca, España). Las placas de cultivo de 96 y 12 pocillos, así como los frascos de cultivo celular, se obtuvieron de Jet Biofil (China). 3.2. Soluciones y medios de cultivo Para realizar los ensayos se han utilizado las siguientes soluciones stock, tampones salinos y medios de cultivo:  Soluciones de DON y AF: la solución stock de las micotoxinas se preparó en DMSO, y se mantuvieron almacenadas a -20 º C en viales de vidrio xilenizado. Las diluciones seriadas se realizaron en medio de cultivo.  Medio de cultivo celular: DMEM/F12 en proporción 1:1 que contiene 1% de glutamax, 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina) y 10% de FBS (suero fetal bovino). Además, incluye el indicador de pH rojo fenol.  Solución salina Locke’s, utilizada en el ensayo de MTT para disolver el indicador y lavar el medio. Consta de los siguientes componentes expresados en mM: NaCl a 154; KCl a 5,6; NaHCO3 a 3,6; CaCl2 a 1,3; MgCl2 a 1; HEPES (Ácido 4-(2- hidroxietil) piperazin-1-iletanosulfónico) a 10; glucosa a 5 (pH 7,2-7,4).  PBS (del inglés “phosphate buffered saline”): solución salina utilizada durante el protocolo de detección de apoptosis mediante la tinción Anexina V-FITC/IP, compuesta por: NaCl 137 mM; KCl 3,2 mM; Na2HPO4 8,2 mM y KH2PO4 1,5 mM. Su pH debe ser de 7,4.  Tampón de unión de Anexina V-FITC al 1%, utilizada en el kit de detección de apoptosis con esta tinción, constituido por Hepes 0,01 M, NaOH 0,01 M, NaCl 0,14 M y CaCl2 2,5 mM (pH 7,4). 3.3. Cultivo celular Se utilizó la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, cultivada en el medio DMEN/F12 anteriormente descrito. Las células se mantuvieron en un incubador a 37ºC, con una 22 atmósfera humidificada, con un 95% de aire y un 5% de CO2, y se disociaron una vez a la semana usando tripsina/EDTA a un 0,05%. Para el subcultivo celular, se realizó una dilución 0,3:10 de las células disociadas, añadiendo 0,3 mL de la suspensión celular a 9,7 mL de medio en frascos de cultivo de 25 mL. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 x 104 células/pocillo para el ensayo de MTT, y en placas de 12 pocillos con 5 x 105 células/pocillo para el ensayo de citometría de flujo. 3.4. Ensayo MTT Como se ha explicado anteriormente, el efecto de las micotoxinas sobre la actividad metabólica de las células fue evaluado mediante el ensayo MTT. Para llevarlo a cabo, se cultivaron las células SH-SY5Y en placas de 96 pocillos de fondo plano a una concentración de 5 x 104 células/pocillo, añadiendo 200 µL de suspensión celular en cada pocillo. Las células se incubaron a una temperatura de 37ºC con una atmósfera humidificada al 5% de CO2 y 95% de aire durante 24 horas. Pasadas estas 24 horas, se trataron las células con las micotoxinas a evaluar en un rango de concentraciones entre 0,1 y 10 µM para el DON y 0,1 y 100 µM para el AF, con el objetivo de determinar la CI50 de ambas. La saponina se utilizó como control de muerte a 1 mg/mL, concentración que se determinó anteriormente realizando una curva dosisrespuesta con este compuesto. Para evaluar la toxicidad de ambas micotoxinas en combinación se utilizó una proporción de concentraciones 2:1 de DON y AF, respectivamente. Dicha ratio se determinó en base a estudios previos realizados en muestras naturales contaminadas de la Península Ibérica (González-Jartín et al., manuscrito en preparación). En los tratamientos con las toxinas combinadas se usó la CI50 de ambos compuestos como control. Tras 24 horas de incubación con los compuestos, las células se lavaron tres veces con tampón Locke’s y se añadieron 200 µl/pocillo de MTT (500 µg/mL) disuelto en Locke’s. La placa se incubó durante 1 hora a 37ºC y 300 rpm, se aspiró el exceso de MTT y, finalmente, se añadió sodio dodecil sulfato (SDS) al 5% para disolver los cristales de formazán. La absorbancia del MTT se midió a 595 nm en un lector de placas Sinergy 4 (BioTek). La absorbancia de la saponina a 1 mg/mL se utilizó como blanco y se restó del resto de medidas. Para cada uno de estos experimentos se realizaron al menos tres réplicas independientes por triplicado. 3.5. Citometría de flujo Para comprobar qué tipo de muerte celular producen los compuestos, se utilizó el kit de Detección de Apoptosis de Anexina V-FITC previamente descrito. 23 Las células SH-SY5Y se cultivaron en placas de 12 pocillos a una concentración de 5 x 105 células/pocillo durante 24 horas. Tras este tiempo, se trataron con las micotoxinas durante 24 horas a la CI50 calculada con el ensayo MTT. Como control inductor de apoptosis para este experimento se utilizó la STS a una concentración de 0,05 µM (Rouco et al., 2020). Para disociar las células se utilizó Detachin™ como alternativa menos agresiva que la tripsina/EDTA, y después se lavaron con PBS y se resuspendieron en el tampón de unión de Anexina V-FITC. Se añadieron la Anexina V-FITC y el IP y se incubaron las células durante 15 minutos a temperatura ambiente. Por último, volvieron a ser resuspendidas en PBS y después filtradas. La fluorescencia de 10000 eventos se analizó mediante citometría de flujo a 488 nm de excitación y 520 y 620 nm de emisión. Para la adquisición de los datos se utilizó el equipo ImageStreamMKII (Amnis Corporation, Luminex Corp, Austin, EE. UU.) y el software IDEAS Application 6.0 (Amnis Corporation, Luminex Corp). 3.6. Análisis estadístico Los datos se expresan como la media ± SEM (error estándar de la media) de las réplicas independientes realizadas. Se realizó una comparación estadística mediante la prueba de t de Student para datos no pareados, considerándose como significativos los valores p < 0,05. La CI50 de los compuestos individualmente y en combinación se obtuvo ajustando los datos con un modelo log(inhibidor) vs respuesta en el software Graph Pad Prism 8. Los efectos sinérgicos, aditivos o antagónicos de los compuestos se evaluaron cuantitativamente mediante el índice de combinación de Chou & Talalay mediante la siguiente fórmula: Índice de combinación = 𝑎 A+𝑏 B donde a y b son las CI50 de los compuestos combinados, y A y B las CI50 de los compuestos individualmente. 4. Resultados 4.1. Evaluación del efecto individual de las micotoxinas en la viabilidad celular de la línea SH-SY5Y En primer lugar, para poner a punto el experimento de MTT y estimar la densidad celular necesaria, así como el tiempo de incubación, se comenzó realizando este ensayo de viabilidad sobre la línea celular SH-SY5Y utilizando saponina. La saponina es un compuesto tóxico que produce micelas en las membranas celulares y ha sido ampliamente utilizado como inductor de 30 micotoxinas aparecen conjuntamente contaminando a un alimento, estos efectos pueden verse potenciados o disminuidos dependiendo de si los compuestos tienen acción aditiva, sinérgica o antagonista entre sí, lo que nos lleva a la importancia de este estudio (Speijers & Speijers, 2004). Esta presencia de más de una micotoxina en la naturaleza es algo que ocurre con frecuencia debido a la capacidad de la mayoría de los hongos para producir simultáneamente diferentes micotoxinas. El aumento de esta co-ocurrencia está favorecido a su vez por factores como el cambio climático, ya que el incremento de las temperaturas a nivel global crea las condiciones propicias para el crecimiento de diferentes especies de hongos (Juan-García et al., 2019). Por tanto, no es de extrañar que muchos alimentos, especialmente cereales, se encuentren contaminados al mismo tiempo por DON y AF, ambas toxinas producidas por especies del género Fusarium (Blandino et al., 2015; Weaver et al., 2021). Sin embargo, a pesar del aumento en su ocurrencia y de las implicaciones en la salud pública y animal, existen muy pocos estudios sobre la toxicidad generada por la contaminación conjunta de varias micotoxinas, y por tanto se desconocen los efectos de su presencia simultánea en la toxicidad de los alimentos. De hecho, en el caso de las micotoxinas emergentes, no existen límites máximos legales debido a la falta de información sobre su toxicidad (EFSA, 2014; Speijers & Speijers, 2004). Con el fin de aportar más datos sobre la toxicidad de las micotoxinas DON y AF, en este estudio se ha trabajado sobre la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y para comprobar los efectos neurotóxicos de estos compuestos. Es de especial interés el estudio de la neurotoxicidad del AF, puesto que actualmente apenas hay trabajos publicados sobre esta toxina no regulada y su efecto neurotóxico (Berthiller et al., 2013). En primer lugar, se analizó el efecto individual de estas micotoxinas sobre la viabilidad celular, con un ensayo que evalúa el funcionamiento de las mitocondrias. Para ello, se calculó la CI50 de ambas toxinas, concluyéndose que la micotoxina regulada DON es la que produce un mayor daño celular, con una CI50 de 0,93 µM. Estos resultados coinciden con otros estudios publicados previamente, en los que la CI50 de esta misma micotoxina tiene un valor similar (0,94 µM) en la misma línea celular (Pérez-Fuentes et al., 2021). Por otro lado, se obtuvo una CI50 de 75,02 µM para el AF, micotoxina emergente y por tanto no regulada, sobre la que encontramos mucha menos información acerca de su efecto individual y combinado. A pesar de que este es el primer estudio que se realiza con esta micotoxina sobre células neuronales, existen trabajos en los que se tratan con AF otro tipo de células y con los que podemos contrastar cierta información. Por ejemplo, al igual que ocurre en el presente trabajo, el AF también produce apoptosis sobre células humanas de carcinoma 31 epitelial de esófago (Devnarain et al., 2017). Otras publicaciones que respaldan el efecto apoptótico del AF se han realizado sobre la línea celular de hepatocitos humanos HepG2 y células hepáticas de ratones (Ghazi et al., 2020; Sheik Abdul et al., 2016). Con el fin de aumentar el conocimiento sobre el mecanismo de acción del AF, y dada la escasa cantidad de estudios que han sido publicados sobre su toxicidad, sería interesante realizar más ensayos para evaluar su efecto tóxico sobre otro tipo de células, y ampliar estos trabajos para demostrar si la apoptosis que produce esta micotoxina es extrínseca o intrínseca, mediante el análisis de su efecto sobre la actividad y la expresión de las caspasas, así como de otras proteínas implicadas en estas rutas intracelulares. Con respecto al DON, cuando analizamos la integridad de la membrana plasmática y el tipo de muerte celular mediante citometría de flujo, encontramos que esta micotoxina no muestra efectos citotóxicos sobre las células de neuroblastoma humano. Para entender estos resultados debemos tener en cuenta que el ensayo MTT, mediante el cual hemos calculado la CI50, se basa en el funcionamiento mitocondrial (Kupcsik, 2011), por lo que permite analizar el metabolismo y la proliferación celular. Por otro lado, con la tinción de Anexina V-FITC e IP evaluamos la integridad de la membrana y permite discernir entre muerte celular por apoptosis o necrosis (Crowley et al., 2016). Por tanto, en vista de los resultados obtenidos, la mitocondria parece estar afectada por el DON, pero la integridad de la membrana plasmática no se ve comprometida a la concentración usada. Estos resultados coinciden con otro estudio en el que se evaluó el potencial de membrana mitocondrial tras el tratamiento con DON, en el que se observó que la cadena de transporte electrónico de las células SH-SY5Y no funcionaba correctamente, y por tanto las mitocondrias estaban dañadas. Sin embargo, al analizar los niveles de lactato deshidrogenasa, enzima citosólica que se libera al medio cuando se rompe la membrana plasmática de la célula, no se observó un aumento de la misma hasta concentraciones de 10 µM, por lo que la membrana plasmática sigue intacta (Pérez-Fuentes et al., 2021). A pesar de que en la línea celular utilizada en el presente trabajo el DON no produce apoptosis, diversos estudios avalan la capacidad de esta micotoxina de producir este tipo de muerte en otras células, como en la línea de adenocarcinoma de colon humano HCT116/HT-29, o en la línea de eritroleucemia humana K562. No obstante, encontramos claras diferencias entre dichos estudios y el presente trabajo, pues además de tratarse de otros tipos celulares, se usó una concentración de DON mucho mayor que la utilizada en este trabajo (80 y 100 µM, respectivamente) (Bensassi et al., 2012; Krishnaswamy et al., 2010; Minervini et al., 2004). Una hipótesis que podría explicar nuestros resultados es que las células neuronales sufren un proceso de mitofagia o autofagia mitocondrial al ser expuestas a esta micotoxina, ya que se observa una disminución de la actividad mitocondrial pero la integridad celular no está afectada (Zhu et al., 2021). Esta teoría puede apoyarse con diversos estudios en los que se comprueba 32 que el DON causa autofagia en diferentes líneas celulares (Guo et al., 2019; Liao et al., 2020; Ren et al., 2020). La mitocondria tiene un papel fundamental en la fosforilación oxidativa, la oxidación de ácidos grasos, y en la regulación de la muerte celular. Sin embargo, también es la principal responsable de producir especies reactivas de oxígeno, que producen daño en el ADN mitocondrial, proteínas y lípidos, lo que a su vez hace que estos orgánulos secreten más moléculas dañinas. Para paliar este daño oxidativo, las mitocondrias poseen un control intrínseco sobre su propio funcionamiento, y cuando el estrés oxidativo supera la capacidad del sistema de control mitocondrial, la llamada mitofagia degrada las mitocondrias dañadas para mantener la homeostasis celular (Hirota et al., 2012). Concluimos el estudio calculando el índice de combinación de ambas toxinas mediante el método de Chou & Talalay, obteniéndose que la mezcla de estas micotoxinas produce un efecto antagonista. Por tanto, los alimentos contaminados simultáneamente con DON y AF no tendrán una toxicidad superior a aquellos que estén contaminados con las toxinas individualmente. No es de extrañar el resultado antagónico de esta combinación, ya que por definición, el efecto antagonista entre dos compuestos suele darse entre moléculas con distintos mecanismos de acción (Jaramillo, 2006). Así, el AF produciendo apoptosis y el DON generando posiblemente mitofagia, actúan mediante diferentes mecanismos de acción, lo que explicaría su efecto antagonista. 33 6. Conclusiones 1. El DON presenta una CI50 de 0,93 µM en la viabilidad celular de la línea de neuroblastoma humano SH-SY5Y. 2. El AF solo produce efectos sobre la viabilidad de las células SH-SY5Y a concentraciones superiores a 50 µM, mostrando una CI50 de 75,02 µM. 3. El AF induce apoptosis en la línea celular SH-SY5Y, mientras que el DON no genera apoptosis ni necrosis en dichas células. 4. La combinación 2:1 de DON y AF produce efectos antagónicos sobre las células SHSY5Y, por lo que la contaminación simultánea con estas micotoxinas no incrementa la toxicidad. 34 7. Bibliografía Adeyeye, S. A. O. (2016). Fungal mycotoxins in foods: A review. Cogent Food & Agriculture, 2, 1213127. https://doi.org/10.1080/23311932.2016.1213127 AESAN. (2021). Deoxinivalenol. 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