Caracterización de 6-amino-1,3 benzotiazol-2-carbonitrilo para su uso como sonda fluorescente

CARACTERIZACIÓN DE 6-AMINO-1,3-BENZOTIAZOL-2-CARBONITRILO PARA SU USO COMO SONDA FLUORESCENTE Trabajo de fin de Grado Ana Arias Rodríguez 2019 Departamento de Química Física - GRADO EN QUÍMICA Universidade de Santiago de Compostela Mª Flor Rodríguez Prieto, Catedrática de Química Física en la Universidad de Santiago de Compostela, y Mª Carmen Ríos Rodríguez, Profesora Titular de Química Física en la Universidad de Santiago de Compostela, como tutoras docentes del Trabajo de Fin de Grado en Química de Ana Arias Rodríguez, AUTORIZAN la presentación del trabajo titulado “Caracterización de 6-amino-1,3- benzotiazol-2-carbonitrilo para su uso como sonda fluorescente” como conclusión de la labor realizada por esta alumna en el Centro Singular de Investigación en Química Biolóxica e Materiais Moleculares de la Universidad de Santiago de Compostela durante el curso 2018-2019. Para que así conste, firmamos la presente en Santiago de Compostela, a 2 de Julio de 2019. Mª Flor Rodríguez Prieto Mª Carmen Ríos Rodríguez Índice de contenidos 1. RESUMEN.................................................................................................................. 1 2. INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 3 2.1. Solvatación e interacción con el disolvente............................................................3 2.2. Transferencia intramolecular de carga (ICT)..........................................................6 2.3. Sondas fluorescentes..............................................................................................6 3. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO .....................................................................8 3.1. Objetivos ...............................................................................................................8 3.2. Plan de trabajo .......................................................................................................8 4. PROCEDIMIENTO Y TÉCNICAS EXPERMENTALES......................................9 4.1. Preparación de disoluciones ..................................................................................9 4.2. Absorción UV-Vis ...............................................................................................10 4.3. Fluorescencia en estado estacionario ...................................................................11 4.4. Medida de tiempos de vida de fluorescencia ........................................................12 4.4.1. TCSPC (Time Correlated Single photon counting) ..................................12 4.5. Tratamiento de datos ...........................................................................................13 4.5.1. Corrección de espectros de fluorescencia.................................................13 4.5.2. Medida de tiempos de vida de fluorescencia.............................................13 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..............................................................................14 5.1. Absorción UV-Visible .........................................................................................14 5.1.1. Efecto del disolvente .................................................................................14 5.1.2. Efecto de la acidez en agua.......................................................................15 5.2. Medidas de fluorescencia ....................................................................................19 5.2.1. Efecto de la acidez en agua.......................................................................19 5.2.2. Otros disolventes........................................................................................28 5.3. Tiempos de vida y fluorescencia resuelta en el tiempo ........................................32 5.3.1. Medida de tiempos de vida de fluorescencia.............................................32 5.3.2. Espectros resueltos en el tiempo (TRES)...................................................34 5.3.3. Ajuste a un modelo de tres especies...........................................................39 6. CONCLUSIONES ....................................................................................................44 7. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................48 ANEXOS ............................................................................................................................ I. Constante de disociación ácida II. Término de quenching estático III. Residuos ponderados para fluorescencia IV. Amplitud de las funciones exponenciales V. Residuos ponderados para el modelo de especies Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 1 1. RESUMEN El gran interés en la cuantificación de parámetros como la acidez o la polaridad en microentornos reactivos químicos y biológicos ha impulsado de manera notable el desarrollo de técnicas de análisis que emplean sondas fluorescentes, lo que aprovecha la elevada sensibilidad que presenta la fluorescencia de este tipo de moléculas al medio en el que se encuentran. El objetivo de este trabajo ha sido, en consecuencia, la caracterización del comportamiento fisicoquímico del 6-amino-1,3-benzotiazol-2- carbonitrilo, por medio de espectroscopía de absorción UV-Vis y de fluorescencia (en estado estacionario y resuelta en el tiempo), con el fin de analizar la influencia del entorno sobre la fluorescencia de esta molécula. Los estudios de su comportamiento en medio acuoso ácido y neutro, así como en distintos disolventes y condiciones de pH, evidencian su elevada sensibilidad tanto a la acidez como a la polaridad del medio. El seguimiento de la forma neutra (la única emisora) y la aparición de especies protonadas en regiones distintas de la molécula en estado fundamental y excitado ponen de manifiesto la existencia de procesos de transferencia intramolecular de carga fotoinducida (ICT) y de quenching. Finalmente, la obtención de un modelo que justifica la evolución temporal del decaimiento de la señal de fluorescencia mediante un proceso de solvatación en el que intervienen tres especies corrobora la alta sensibilidad de la fluorescencia de esta molécula a las condiciones del medio, y respalda su validez como sonda fluorescente. *** O grande interese en cuantificar parámetros como a acidez ou a polaridade en microcontornas reactivas químicas e biolóxicas leva impulsado de maneira notable nos últimos tempos o desenvolvemento de técnicas de análise que empregan sondas fluorescentes, o que aproveita a elevada sensibilidade que presenta a fluorescencia deste tipo de moléculas ó medio no que se atopan. O obxectivo deste traballo foi a caracterización fisicoquímica do 6-amino-1,3-benzotiazol-2-carbonitrilo, por medio de técnicas de espectroscopía de absorción UV-Vis e de fluorescencia (en estado estacionario e resolta no tempo), coa fin de analizar a influencia da contorna sobre esta molécula. Os estudios do seu comportamento en medio acuoso ácido e neutro así como en distintos Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 2 disolventes e condicións de pH evidencian a súa elevada sensibilidade tanto á acidez como á polaridade do medio. Para este fin, o seguimento da forma neutra (a única emisora) e a aparición de especies protonadas en distintas rexións da molécula poñen de manifesto a existencia de procesos de transferencia intramolecular de carga fotoinducida e de quenching. Finalmente, a obtención dun modelo que xustifica a evolución temporal do decaemento do sinal de fluorescencia por medio dun proceso de solvatación no que interveñen tres especies ratifica a elevada sensibilidade da fluorescencia da molécula ás condicións do medio, e respalda a súa validez como sonda fluorescente. *** The relevance of quantifying parameters such as acidity or polarity in chemically and biologically reactive microenvironments has caused a significant development of analytical techniques focused on the use of fluorescent probes, which takes advantage of the high sensitivity of fluorescence this kind of molecules have towards their surroundings. The aim of this work has been, consequently, to study in detail the behaviour of 6-amino-1,3-benzothiazole-2-carbonitrile (ABTC), by means of UV-Vis absorption spectroscopy and fluorescence spectroscopy (steady-state and time-resolved), as a contribution to the research being done on the influence caused by the environment it experiences. The different behaviour ABTC has shown in neutral and acidic aqueous solution in addition to its varied reactivity in several solvents and pH conditions has stated its significant sensitivity towards media’s acidity and polarity. Evolution of the neutral form has been followed over time as well as the protonation processes that occur, taking place in different regions of the molecule in ground and excited state. This study has proved that ABTC experiences both intramolecular charge transfer (ICT) and quenching processes. The final assignment has been to develop a model that justifies the observed fluorescence decay, related to the solvation process the molecule undergoes, performed by three different species that evolve throughout time. This work has finally validated 6- amino-1,3-benzothiazole-2-carbonitrile’s aptitude to be used as a fluorescent probe. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 3 2. INTRODUCCIÓN La elevada especificidad y sensibilidad de la fluorescencia como método de medida la configura en la actualidad como una valiosísima herramienta para posibilitar el estudio de los procesos que tienen lugar en medios complejos. La cuantificación de parámetros como la acidez o la polaridad en microentornos reactivos químicos y biológicos, difícilmente medibles por otras técnicas disponibles en la actualidad, se ve facilitada por el uso de moléculas fluorescentes cuidadosamente seleccionadas, actuando como sondas3. Esto presenta ventajas significativas en comparación con otras técnicas, entre las que se encuentran un tiempo rápido de respuesta, una relación señal-ruido elevada, poca invasividad de la muestra a analizar y excelente precisión en la medida1,2. Previamente a su uso como sondas, los fluoróforos utilizados son sometidos a profundos estudios de caracterización que permiten desentrañar las dinámicas que rigen su comportamiento. La complejidad de los efectos que disolvente y entorno ejercen en la fluorescencia de la sonda se debe a la gran cantidad de factores de los que dependen; entre ellos se pueden mencionar la polaridad, la viscosidad y grado de relajación del disolvente o la existencia de procesos en estado fundamental y excitado que el fluoróforo puede experimentar, como la transferencia intramolecular de carga. El análisis detallado de esta amplia variedad de fenómenos constituye una vía decisiva para posibilitar el análisis ulterior de las condiciones de una gran cantidad de medios reactivos. 2.1 Solvatación e interacción con el disolvente Los estudios preliminares en distintos disolventes se fundamentan en la obtención de los espectros de excitación y emisión de la molécula objeto de estudio, así como el conocimiento de su rendimiento cuántico. La constante dieléctrica (ε) se configura como una de las escalas que cuantifican la polaridad de un disolvente, siendo esta una propiedad que depende tanto de sus movimientos electrónicos como moleculares4. La relevancia de este parámetro reside en el hecho de que la polaridad del entorno es una de las causas más estudiadas del desplazamiento Stokes apreciable en la emisión5, lo que constituye una característica fácilmente identificable de los espectros de fluorescencia1,2. La Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 4 cuantificación del desplazamiento espectral causado por el disolvente (conocido como desplazamiento solvatocrómico) tiene su antecedente en los estudios de Lippert (1955)6 y Mataga (1956)7, que proponen un modelo en el que el fluoróforo es considerado un dipolo situado en un medio de constante dieléctrica continua, sin incluir otras interacciones que afecten a su emisión (enlaces de H, interacciones ion-dipolo o fuerzas de Van der Waals). Con este análisis se postula a los disolventes apróticos como aceptores finales de la energía vibracional que pierde la molécula. En la práctica, sin embargo, esta aproximación se hace insuficiente, debido a la existencia de interacciones específicas entre la sonda y el disolvente. La emisión de los fluoróforos ocurre habitualmente a longitudes de onda mayores que la absorción. La molécula es excitada e, inmediatamente después, este excedente de energía vibracional se disipa por medio de una amplia variedad de procesos dinámicos que siguen a la absorción de luz, entre ellos la transferencia de energía al disolvente. En esta circunstancia concreta, el desplazamiento anómalo del espectro de emisión del fluoróforo a longitudes de onda mayores de lo habitual se debe a la estabilización de su estado excitado al alcanzar un estado de menor energía causado por los efectos del disolvente, más apreciables cuanto más polar sea (Figura 2.1). El fenómeno subyacente a este hecho radica en que el momento dipolar de un fluoróforo aumenta generalmente tras la excitación electrónica, por lo que las moléculas de disolvente han de reorientarse en torno al nuevo dipolo del fluoróforo hasta alcanzar un estado de energía libre mínima, menor cuanto mayor sea su polaridad10. En medios fluidos, esta relajación del disolvente es más rápida que la desactivación del fluoróforo excitado (~ 10-9 s), por lo que las moléculas de disolvente se pueden reorientar a sus posiciones de equilibrio antes de que la emisión del fluoróforo tenga lugar8,9. En última instancia, también la viscosidad del disolvente influye en su proceso de relajación. Cuando el medio es muy viscoso, la emisión del fluoróforo no se verá influida por la interacción con el disolvente, porque las moléculas de disolvente no tienen tiempo de reorientarse antes de la emisión del fluoróforo, de manera que el desplazamiento espectral no estará causado por este proceso. Cuando el tiempo de relajación del disolvente y el tiempo de vida del estado excitado son del mismo orden de magnitud, la forma y posición del máximo del espectro no se podrán relacionar directamente con la Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 5 polaridad del disolvente. Por el contrario, cuando el tiempo de relajación del disolvente es mucho menor que el tiempo de vida del estado excitado, el espectro de emisión se corresponderá con las moléculas de fluoróforo dispuestas en equilibrio con la estructura de solvatación, con lo que el decaimiento de la fluorescencia refleja de manera precisa la despoblación del estado excitado1. De este modo, la gran variedad de interacciones que involucran a soluto y disolvente configuran la dinámica de los procesos de solvatación. Figura 2.1. Dinámica de un proceso de solvatación (figura tomada de la bibliografía)2. El estudio de los fenómenos de solvatación está condicionado, sin embargo, por la complejidad intrínseca de sus circunstancias de medida, ya que, como se anticipaba anteriormente, los tiempos de vida de fluorescencia (1-10 ns) son significativamente superiores a los requeridos para la relajación del disolvente (10-100 ps)1. Por este motivo el espectro de absorción tampoco revela información acerca de estos procesos, ya que la absorción de luz tiene lugar en órdenes de magnitud en torno a 10-15 s, un periodo de tiempo excesivamente limitado para apreciar movimiento en el soluto o el disolvente. Esto explica que el espectro de absorción no presente excesiva sensibilidad a la polaridad del disolvente, ya que la molécula se encuentra en el mismo entorno tanto en estado fundamental como excitado. Sin embargo, el espectro de emisión está expuesto al disolvente en condiciones de relajación, con lo que refleja el comportamiento del fluoróforo en estado excitado una vez que las moléculas de disolvente se han reorientado en torno a él. Consecuentemente y en términos generales, a longitudes de onda próximas Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 12 4.4 Medida de tiempos de vida de fluorescencia Los tiempos de vida de fluorescencia se midieron empleando la técnica de recuento de fotones individuales correlacionada con el tiempo o TCSPC, utilizando un espectrofotómetro marca EDINBURGH INSTRUMENTS modelo LifeSpec-ps. Este equipo utiliza un láser de diodo de picosegundos como fuente de excitación, con λ EXC = 370 nm; la emisión de luz polarizada de esta fuente hace necesaria la presencia de un polarizador Glan Thompson. También se incluye un monocromador con rendijas de 0,5, 1 y 2 mm y un fotomultiplicador Multichannel Plate como detector27. 4.4.1. TCSPC (Time Correlated Single Photon Counting)2 La técnica TCSPC o Time Correlated Single Photon Counting (técnica de recuento de fotones individuales correlacionada con el tiempo) es una de las herramientas más sensibles disponibles en la actualidad para la medida de tiempos de vida de fluorescencia. Figura 4.3. Esquema electrónico de la TCSPC (figura tomada de la bibliografía)2. El fundamento de esta técnica (Figura 4.3) se basa en la correlación entre el recuento de fotones y el pulso de excitación. La muestra se excita y genera una señal que pasa por un CFD (Constant Function Discriminator) que determina con precisión su tiempo de llegada. La señal pasa posteriormente a un TAC (Time to Amplitude Converter), que origina un voltaje creciente que aumenta de manera lineal en relación al tiempo en una escala de nanosegundos. Paralelamente, un segundo canal detecta el pulso procedente del fotón emitido mediante otro CFD, lo que cuantifica la demora (∆t) entre Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 13 las señales de excitación y emisión. Este voltaje se amplifica utilizando un PGA (Programmable Gain Amplifier) y un ADC (Analog to Digital Converter) lo transforma en un valor numérico, reflejando el decaimiento de la señal de fluorescencia2. 4.5 Tratamiento de datos Los datos experimentales obtenidos en este trabajo se analizaron utilizando el programa Sigmaplot 12.5, a excepción de los ajustes realizados con los datos de fluorescencia resuelta en el tiempo, gestionados usando MATLAB. 4.5.1. Corrección de espectros de fluorescencia La dependencia de la eficiencia de los monocromadores de excitación y emisión y de los tubos fotomultiplicadores con la longitud de onda hace necesaria una corrección posterior a su obtención de los espectros de excitación y emisión de la muestra, con la finalidad de que reflejen la realidad. Esta corrección se lleva a cabo con una función suministrada por la casa comercial [𝐶(𝑣)], que tras multiplicar por las medidas obtenidas experimentalmente [𝐹′(𝑣)] proporciona los datos reales [𝐹(𝑣)] : 𝐹(𝑣)=𝐶(𝑣)⋅𝐹′(𝑣) 4.5.2. Medida de tiempos de vida de fluorescencia2 La emisión de fluorescencia que sucede a la excitación de una muestra se puede expresar de acuerdo con los valores experimentales F(t), una distribución temporal generada a partir de la integral de convolución del pulso de la fuente, L(t). El equipo que se utiliza es capaz de generar D(t) – la señal de fluorescencia que se obtendría si el sistema fuese excitado con un pulso muy breve – mediante el método de reconvoluciones iterativas por mínimos cuadrados, suponiendo modelos de decaimiento basados en sumas de funciones exponenciales que permitan calcular F(t) y compararlo con el experimental. 𝐹(𝑡)= 𝐿 (𝑡′) 𝐷 (𝑡−𝑡′) 𝑑𝑡 𝑡 0 Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 14 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 5.1 Absorción UV-Visible 5.1.1 Efecto del disolvente El estudio del ABTC se inicia con el análisis de su comportamiento en estado fundamental, por medio de la medida de su espectro de absorción UV-Visible en dos disolventes, H2O y etanol (Figura 5.1). Figura 5.1. Espectros de absorción UV-Vis en H2O y EtOH medidos a una concentración 6,31 × 10-5 mol dm-3 de ABTC. La destacable similitud en la forma de los espectros nos confirma que la molécula se encuentra en los dos casos en una misma especie, la forma neutra (a la que nos referiremos en adelante como N). En ambos se observa una banda principal de intensidad significativa y ligeramente ancheada – banda B – (engloba dos transiciones electrónicas), y una segunda banda de intensidad notablemente inferior – banda A –, correspondiente a otra transición más energética (situada a menor longitud de onda). Estas bandas varían su posición en función del disolvente, presentándose el espectro ligeramente desplazado hacia longitudes de onda mayores en el caso del etanol (Tabla 5.1). A B Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 15 Tabla 5.1. Posición de los máximos de absorción de las dos bandas UV-Vis en H2O y EtOH . El desplazamiento del espectro de absorción de ABTC en agua respecto al espectro en etanol pone de manifiesto su comportamiento solvatocrómico6,7 (un desplazamiento espectral en respuesta a una variación de la polaridad del disolvente). También corrobora la fuerte interacción de la molécula con el disolvente y su elevada sensibilidad como sonda fluorescente para determinar variaciones en la polaridad del medio, y predice una enorme relevancia de la dinámica de solvatación en su comportamiento. 5.1.2. Efecto de la acidez en agua El estudio en UV-Vis continúa con el análisis del comportamiento de la molécula en distintas condiciones de pH, con la finalidad de caracterizar su reactividad para su uso posterior como una sonda fluorescente que permita determinar las condiciones de acidez del medio objeto de análisis. Utilizando como disolvente H2O, se adicionan NaOH y HClO4 en dos series distintas. Con ello se comprueba que el espectro de absorción de la molécula en agua no cambia al basificar el medio, con lo que el ABTC no se desprotona en esas condiciones de acidez. Por el contrario, el espectro de absorción de ABTC en agua varía tras la acidificación progresiva del medio en un rango entre pH ~ 4 y pH ~ 0,8 (Figura 5.2)II. A medida que aumenta la acidez, la banda con máximo a 350 nm (correspondiente a la molécula neutra) pierde intensidad progresivamente al avanzar la protonación, mientras que la banda que presentaba inicialmente un máximo a 274 nm experimenta un aumento continuado en intensidad y desplaza ligeramente la posición del II Los espectros correspondientes a series de medidas (Figuras 5.2 y 5.6) se representan con el factor de corrección correspondiente a la dilución causada por la adición de ácido Disolvente λ Banda A / nm λ Banda B / nm H2O 274 350 EtOH 278 370 Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 16 máximo a longitudes de onda mayores. Este aumento paulatino en la absorbancia paralelo al aumento de protones en el medio corrobora la hipótesis de que esa banda se corresponde con la aparición de una forma catiónica (protonada) de la molécula. A pH ~ 1, la banda correspondiente a la molécula neutra presenta una intensidad mínima, y la banda correspondiente a la forma protonada de la molécula alcanza su máximo de absorbancia, lo que evidencia una protonación total. Figura 5.2. Espectros de absorción UV-Vis en una serie de acidificación progresiva con HClO4 de pH 4 a 1 medidos a una concentración inicial de 7,13 × 10-5 mol dm-3 de ABTC. Confirmada la existencia de un proceso de aparición de una forma catiónica de la molécula en medio ácido, pasa a discutirse la posición a la que se dirigen los protones y la posibilidad de una protonación múltiple, debido a la existencia de dos posibles zonas de protonación (el grupo amino y el átomo de N del grupo benzotiazol). La forma y posición de la banda correspondiente al catión (con máximo a longitudes de onda menores que la molécula neutra) respaldan la protonación única en el grupo amino, sustentada también por la comparación con datos bibliográficos de moléculas similares como la anilina28. Una hipotética protonación en el N benzotiazólico vendría acompañada de la aparición de una banda de absorción desplazada hacia longitudes de onda mayores que la banda de absorción de la molécula neutra29, lo que no se observa. Esto postula al grupo amino como la zona más básica de la molécula en estado fundamental e identifica a la molécula protonada como el 2-cianobenzo[d]tiazol-6-aminio (Figura 5.3), a la que nos Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 17 referiremos en adelante como catión aminio (CA), cuya aparición se debe al proceso N + H+ → CA. Figura 5.3. Estructura molecular del catión aminio (CA). Sabiendo que el espectro de absorción de la molécula se debe a todas las especies presentes en disolución y que la absorbancia a valores bajos es una propiedad física directamente relacionada con la concentración (Ec 1), la absorbancia de la muestra medida se deberá a la suma de las absorbancias de las dos formas en las que está presente la molécula: la forma neutra (N) y la forma protonada, el catión aminio (CA). 𝐴(𝜆)=∑ 𝜀𝑖 𝑛𝑖=1 ·𝑐𝑖· 𝑏 (Ec 1) (Siendo i cada especie que absorbe radiación, εi su coeficiente de absorción molar en M-1 cm-1, ci su concentración en disolución y b la longitud en cm de la cubeta en la que se llevan a cabo las medidas). Obtenidos experimentalmente los espectros en el rango de pH 4-1, procede a realizarse un ajuste con los datos de absorbancia que proporcione el valor de la constante de disociación ácida (Ka) del catión aminio (CA) según el proceso CA ⇄ N + H+, obteniendo un valor que satisfaga la ecuación a todas las longitudes de onda (Ec 2)III. 𝐴(𝜆,𝐻+)=𝐴1(𝜆)· [𝐻+] 𝐾𝑎 + [𝐻+] + 𝐴2(𝜆)· 𝐾𝑎 𝐾𝑎 + [𝐻+] (Ec 2) Del ya mencionado ajuste de la (Ec 2) a los datos espectrales de la (Figura 5.2) se obtienen los valores de los términos A1 y A2 para cada longitud de onda (ya que dependen de la longitud de onda de la medida además de la concentración de protones) y el valor Ka del catión (Tabla 5.2). Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 18 Tabla 5.2. Valores de los términos A1, A2 y la constante Ka a varias λ, obtenidos del ajuste de la (Ec 2) a los datos de la (Figura 5.4) IV. Se calcula un valor promedio de Ka = 0,00888(26) M (lo que se corresponde con un pKa = 2,051(29)). La representación gráfica de los datos experimentales y los obtenidos mediante el ajuste confirma que el modelo propuesto es adecuado (Figura 5.4). Figura 5.4. Datos experimentales de absorbancia frente a la concentración de protones a varias longitudes de onda (puntos) y representación del ajuste (línea). III Desarrollo matemático de la ecuación en el anexo IV Los valores negativos no tienen sentido matemático en estas circunstancias y se aproximan a 0 por medio de la desviación estándar λ / nm A1 A2 Ka / M 270 0,3795(20) 0,2433(16) 0,00950(70) 285 0,5048(45) 0,1337(15) 0,00900(50) 300 0,2636(19) 0,1370(24) 0,00990(70) 315 0,1439(26) 0,2850(24) 0,00790(70) 330 0,0407(60) 0,4515(53) 0,00840(60) 350 -0,0131 ~ 0 0,5434(68) 0,00860(60) [H+] / M Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 19 5.2 Medidas de fluorescencia 5.2.1 Efecto de la acidez en agua Finalizado el estudio del comportamiento del ABTC en estado fundamental se procede al análisis de su reactividad en estado excitado, que se inicia con la medida de su espectro de excitación y emisión en H2O (Figura 5.5). Comparando el espectro de excitación (Figura 5.5) con el espectro de absorción UV-Vis (que corresponde a la especie N – Figura 5.2), la similitud en la forma y la coincidencia de la posición del máximo (a 350 nm) confirman que la molécula se encuentra en forma neutra (N) en ambos casos. El espectro de emisión de N* muestra muy poco solapamiento con su espectro de excitación, lo que indica que N experimenta un cambio estructural en estado excitado, que se discutirá más adelante. Figura 5.5. Espectros de excitación y emisión para ABTC en H2O y a pH=2. Analizada la relevancia de la presencia de protones en el medio para el comportamiento del ABTC en estado fundamental, se prevé que las condiciones de pH afecten también de manera significativa en estado excitado. Se lleva a cabo, por tanto, una primera aproximación a la influencia de la acidez del medio en estas condiciones por medio del cálculo de la constante de disociación ácida para la molécula en estado excitado (pKa*), ya que el pKa* difiere del valor del pKa en estado fundamental, calculado previamente en el apartado anterior (pKa = 2,051). Para ello se aplica la ecuación del EXC EM Intensidad de fluorescencia / u.a. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 20 Ciclo de Förster (Ec 3)1. En esta expresión 𝑣𝑁 y 𝑣𝐶𝐴 hacen referencia a los valores en número de onda de las transiciones 0 → 0 de las formas N y CA respectivamente. Dado que los espectros de ABTC en agua no muestran estructura vibracional no es posible conocer el número de onda de estas transiciones, pero (𝑣𝑁−𝑣𝐶𝐴) se puede estimar como la diferencia entre los máximos de absorción correspondientes a las especies neutra y protonada del ABTC en estado fundamental (Tabla 5.3). (Ec 3) Tabla 5.3. Posición de los máximos de absorción de las formas neutra y protonada de ABTC. Especie λ / nm 𝒗 / 103 cm-1 ABTC neutro (N) 349,5 28,61 Catión aminio (CA) 284,5 35,15 En condiciones análogas a las de este estudio, en las que la banda de emisión de la forma neutra se encuentra a longitudes de onda mayores que la de la forma protonada, el valor de pKa* será menor que el de pKa. El cálculo proporciona, confirmando este planteamiento teórico, un valor de pKa* = -11,7 para el proceso CA ⇄ N + H+, y postula a la molécula CA* como un ácido mucho más fuerte que CA. Casos análogos bibliográficamente documentados de otras moléculas similares al ABTC como la acridina también presentan valores de pKa* notablemente inferiores a los de pKa, debidos a la tendencia de los electrones solitarios del grupo -NH2 a experimentar un aumento de la conjugación al anillo aromático en estado excitado. Estas condiciones implican la imposibilidad de la protonación en el grupo amino en estado excitado, ya que se requeriría un pH extremadamente ácido para lograr un direccionamiento de los protones hacia esa posición. Sin embargo, una adición preliminar de HClO4 (pH ~ 2) muestra unos espectros de intensidades notablemente distintas a las que presentaba la molécula en medio neutro (Figura 5.5), aunque con máximos de excitación y emisión comunes – 350 y 489 nm respectivamente – (Tabla 5.4), que se utilizarán como parámetros fijos para las medidas de todos los espectros de este apartado. 𝑝𝐾𝑎*− 𝑝𝐾𝑎 =2,1 ⋅10−3· (𝑣𝑁−𝑣𝐶𝐴) Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 21 Tabla 5.4. Posición de los máximos de excitación y emisión de ABTC en H2O. El estudio prosigue con un análisis detallado de la influencia de la acidez para seguir el avance de la protonación que tiene lugar y poder contrastarlo con el comportamiento de la molécula en estado fundamental. Para tal fin se registraron los espectros de fluorescencia en estado estacionario del ABTC en agua, en una serie de acidificación progresiva en un rango entre pH ~ 5 y pH ~ 1 (Figura 5.6) a λ EXC = 350 nm, en condiciones de acidez análogas a la llevada a cabo en estado fundamental. Esta serie muestra una gran disminución de la intensidad de fluorescencia de N* al aumentar la acidez del medio. La emisión de N* tiene su origen en la excitación de N (la especie que absorbe a 350 nm), y dado que al disminuir el pH la especie N se protona en el estado fundamental para dar el catión CA (que no absorbe apreciablemente a 350 nm), la intensidad de fluorescencia de N* debe disminuir al aumentar la acidez, como de hecho se observa, debido a la desaparición progresiva de N en el estado fundamental. Figura 5.6. Espectros de fluorescencia en estado estacionario a λ EXC = 350 nm en una serie de acidificación progresiva con HClO4 de pH 5 a 1, a una concentración 3 × 10-6 mol dm-3 de ABTC. Disolvente λ EXC / nm λ EM / nm H2O 350 489 Intensidad de fluorescencia / u.a. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 28 Figura 5.11. Valores experimentales de fluorescencia (F/F0) a 470, 500 y 550 nm y modelo de quenching propuesto para el proceso (negro), con las contribuciones del término de quenching estático (azul) y dinámico (rojo). Del ajuste de este modelo en un rango de longitudes de onda entre los 450 y los 550 nm se obtiene un valor de Ka = 0,00760(20) M (concordante con el obtenido en las medidas de absorción UV-Vis: Ka = 0,00888(26)) y un producto τ · kq = 2,582(41) × 102 M-1, que hace necesarias las medidas de tiempo de vida de la molécula para poder despejar el valor de kq. La obtención de un valor de tiempo de vida para la molécula en H2O τ = 5,75 ns nos indicará un valor de kq = 4,49 × 1010 M-1 s-1, lo que sugiere la existencia de control por difusión 5.2.2 Otros disolventes Con la finalidad de constatar, para su uso como sonda, que la molécula objeto de este estudio (el ABTC) es altamente sensible a las condiciones de polaridad del medio en que se encuentra, se profundiza en el análisis realizando medidas de su comportamiento en distintos disolventes. La fuerte interacción con el disolvente ya se evidenciaba en el espectro de la molécula en agua realizado a comienzos del apartado anterior (Figura 5.5 – apartado 5.2.1), que presentaba un amplio desplazamiento Stokes acompañado de una pérdida significativa de energía (el máximo se presenta a longitudes de onda mayores). [H+] / M Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 29 El poco solapamiento de las bandas correspondientes a la excitación y emisión de la molécula también se presenta en las medidas en otros disolventes como etanol, 2- butanol, acetonitrilo, ciclohexano, THF o DMSO (como el observa en la (Figura 5.12) para acetonitrilo, DMSO y THF) poniendo de manifiesto la existencia de procesos que suponen modificaciones estructurales debidas a la solvatación e interacción con el disolvente. Las interacciones que se establecen entre la molécula y el disolvente (de tipo Van der Waals o enlaces de H) estabilizan energéticamente a la molécula, provocando cambios en su energía de solvatación, y dependerán también de su polarizabilidad y la del disolvente cuando ambos presentan momento dipolar Figura 5.12. Espectros de emisión de ABTC en disolventes apróticos (acetonitrilo, DMSO y THF). Con el fin de analizar el comportamiento en más disolventes se registran sus espectros de excitación y emisión. A pesar de que el espectro de emisión (Figura 5.13) aparece siempre a longitudes de onda mayores que el de excitación, la interacción con el disolvente puede desplazarlo a longitudes de onda todavía mayores, siendo esta situación conocida como desplazamiento solvatocrómico. Esto se debe a que, después de la excitación, el disolvente sufre una relajación que lo lleva a alcanzar un estado de energía libre mínima, que será menor cuanto mayor sea su polaridad. Esta reorientación de los dipolos de los disolventes polares tiene como consecuencia una estabilización del estado excitado de la molécula, provocando un descenso de su energía. Por el contrario, los disolventes apolares tienen un momento dipolar nulo (μ = 0), con lo que no hay dipolos que se reorienten alrededor del fluoróforo en estado excitado. Intensidad de fluorescencia / u.a. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 30 Figura 5.13. Espectros de emisión de ABTC en varios disolventes (agua, etanol, 2-butanol, ciclohexano, acetonitrilo, DMSO y THF). Un análisis preliminar de los espectros de la (Figura 5.13) pone de manifiesto la existencia de solvatocromismo positivo (batocromismo), al desplazarse las bandas a longitudes de onda mayores en respuesta a un aumento de la polaridad del disolvente. El análisis continúa aplicando la ecuación de Lippert-Mataga (Ec 11), que cuantifica, por medio del desplazamiento espectral, la pérdida de energía vibracional de la molécula en disolventes apróticos (aquellos incapaces de formar enlace de H). (Ec 11) (Siendo 𝜈𝑎 y 𝜈𝑒, los máximos, en número de onda, de los espectros de excitación y emisión; 𝜇𝑒 y 𝜇𝑔 los momentos dipolares de los estados excitado y fundamental, 𝛥𝑓 la polarizabilidad de orientación (mayor cuánto más polar sea el disolvente), h la constante de Planck, c la velocidad de la luz y a el radio de la cavidad que alberga el soluto)6,7. Este modelo considera al fluoróforo como un dipolo situado en un medio de constante dieléctrica continua, sin incluir otras interacciones químicas que afectan a la emisión de la molécula. Esto explica la detección de desviaciones de la teoría general en casos que incluyan, por ejemplo, la formación de enlaces de H. En la ecuación de Lippert- Mataga se cuantifica el cambio en la magnitud del momento dipolar de transferencia de 𝑣𝑎−𝑣𝑒=2 𝛥𝑓 ℎ⋅𝑐⋅𝑎3 𝜇𝑒−𝜇𝑔 2 Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 31 carga con la excitación. Este parámetro es relevante debido a que un cambio en la densidad electrónica de una molécula implica un cambio en su momento dipolar, haciendo que el momento dipolar de una molécula en estado excitado pueda diferir del valor en estado fundamental, siendo habitualmente mayor (μe > μg). Cuando la representación gráfica de 𝛥𝑓 frente a 𝜈𝑎−𝜈𝑒 (Figura 5.14) no refleja un comportamiento lineal, si no que la linealidad se observa considerando por separado en dos series a los disolventes próticos y los apróticos, se corrobora la existencia de interacciones específicas entre el soluto y el disolvente, como podrían ser enlaces de H. Por este motivo los disolventes apróticos presentan habitualmente un comportamiento lineal2. En el caso que se estudia, al estar la no linealidad motivada por las medidas en alcoholes, se confirma que el cambio estructural y energético está relacionado con la capacidad de estos disolventes de formar enlace de H y no con otros fenómenos, como la transferencia intramolecular de carga. Se podrá obtener información acerca de la dinámica específica de solvatación del ABTC en alcoholes mediante la realización de medidas de fluorescencia resuelta en el tiempo, que se discutirá en el apartado 5.3. Figura 5.14. Representación de la ecuación de Lippert-Mataga para el ABTC en varios disolventes próticos (etanol y butanol, utilizando el ciclohexano como valor en el origen) y apróticos (ciclohexano, acetonitrilo, DMSO y THF), siendo el valor encima del eje y el correspondiente al ciclohexano, por tener 𝛥𝑓 = 0. Los valores experimentales se representan como puntos y el ajuste como una línea, siendo R2 = 0,9709 para los disolventes próticos y R2 = 0,8279 para los apróticos. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 32 5.3 Tiempos de vida y fluorescencia resuelta en el tiempo 5.3.1 Medida de tiempos de vida de fluorescencia Como parte final del estudio de caracterización de la molécula de ABTC se llevan a cabo las medidas de tiempos de vida de fluorescencia. Una primera aproximación analiza el comportamiento de la molécula en H2O y etanol, aunque la viscosidad de estos disolventes es tan baja que la velocidad del proceso de solvatación es excesivamente rápida. Para resolver este problema se elige un disolvente viscoso, el 1-Butanol, y se registra la evolución temporal de la intensidad de fluorescencia del ABTC en un rango de longitudes de onda situadas entre los 400 y los 600 nm (Figura 5.15). Figura 5.15. Decaimiento de la fluorescencia para ABTC en 1-Butanol, representando en azul los datos experimentales y en rojo los resultados del ajuste utilizado (los residuos ponderados para esta medida están disponibles en el anexo). Los datos experimentales obtenidos presentan un comportamiento multiexponencial que evidencia una cinética compleja; un ajuste matemático permite expresar el decaimiento de la señal de fluorescencia como el sumatorio de tres funciones exponenciales (Ec 12). La función propuesta (representada como una línea roja en la Figura 5.15) genera valores que representan adecuadamente la realidad, al coincidir con los obtenidos experimentalmente, y se obtienen también los valores de tiempos de vida (τi) (Tabla 5.5) y los factores preexponenciales (ai). Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 33 𝐹(𝑡,𝜆)=∑𝑎𝑖(𝜆) 3𝑖=1 ⋅𝑒−𝑡𝜏𝑖 (Ec 12) Tabla 5.5. Valores de tiempo de vida τ1, τ2 y τ3 para el ABTC en 1-Butanol. τ1 / ns τ2 / ns τ3 / ns 0,0977 0,4495 4,6379 El ajuste a la suma de tres funciones exponenciales prosigue cuantificando la contribución de cada una de ellas por medio de un análisis de sus amplitudes. Los valores obtenidos experimentalmente cada 5 nm en un rango entre los 410 y los 515 nm han de dividirse por el tiempo de medida para poder ser comparables (Figura 5.16). Esto se debe a que las mediciones de los decaimientos a cada longitud de onda se llevan a cabo hasta que el valor máximo alcanza las 5000 cuentas, lo que requiere un tiempo de adquisición diferente para cada una. Por el contrario, cuando se registra un espectro de fluorescencia en estado estacionario, el tiempo de adquisición a cada λ es constante. Figura 5.16. Contribución de las exponenciales propuestas de acuerdo con el modelo de ajuste, correspondiendo la serie en negro al espectro de la molécula (suma de las tres exponenciales), y las serie en rojo y azul a espectros correspondientes a la suma de la segunda y la tercera exponencial y a la tercera exponencial respectivamente. Se incluye una tabla con los valores representados en el anexo. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 34 Persiguiendo evidenciar que el modelo propuesto representa la realidad, se grafican los decaimientos de fluorescencia experimentales junto con los valores predichos de las contribuciones de las tres exponenciales y la suma de las mismas a varias longitudes de onda (Figura 5.17). El hecho de que sea necesaria una función triexponencial para ajustar los datos experimentales de fluorescencia pone de manifiesto que el modelo de solvatación presenta una cinética compleja. Sin embargo, es posible obtener más información del modelo de solvatación a partir de los espectros resueltos en el tiempo. Figura 5.17. Contribución de las exponenciales a varias longitudes de onda, siendo la línea azul los valores experimentales, la línea roja los valores predichos según el modelo de ajuste y las áreas coloreadas en azul, verde y rosa las correspondientes a las exponenciales 1, 2 y 3 respectivamente. 5.3.2 Espectros resueltos en el tiempo (TRES) Realizadas las primeras aproximaciones de ajuste a los datos experimentales obtenidos, se prosigue planteando un modelo que los represente adecuadamente, con la finalidad de analizar en profundidad y con detalle el trascurso de los procesos que tienen Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 35 lugar por medio de la evolución de los espectros. Para este fin se generan los espectros resueltos en el tiempo o TRES (Time Resolved Emisión Spectra) (Figura 5.18) a partir de los valores discretos obtenidos experimentalmente. Una vez obtenidos los espectros con datos cada 5 nm se generan los espectros en el intervalo completo de longitudes de onda por medio de una función logaritmo normal (Ec 13). (Ec 13) (Siendo 𝑓0 la intensidad de fluorescencia máxima, 𝑣0 la posición del máximo de emisión (en cm-1), 𝛥 la anchura media de la banda y b el parámetro de asimetría). Figura 5.18. Espectros resueltos en el tiempo en dos series (de 0 a 0,1 ns cada 1 ps y de 0,15 a 1,95 ns cada 5 ps). Los valores discretos obtenidos experimentalmente se representan como puntos, y el ajuste a una función logarítmica como líneas Los valores de 𝑓0 y 𝑣0 se obtienen de los espectros experimentales; el ajuste de la (Ec 13) a esos datos conduce a los espectros de la (Figura 5.18). La existencia de dos puntos isoemisivos (en los que los espectros presentan la misma intensidad) pone de manifiesto la interconversión de unas especies en otras y descarta que el proceso que tiene lugar se deba únicamente al desplazamiento espectral con el tiempo, es decir, al cambio de la posición del máximo, de acuerdo con un proceso análogo al que se observa en la 𝐼(𝑣)=𝑓0⋅exp −ln2 · ln 1 + 2𝑏·(𝑣−𝑣0)2 𝛥 𝑏 Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 36 figura inferior (Figura 5.19). Este análisis pone de manifiesto la hipótesis de que los espectros representen un mecanismo de evolución de especies. Figura 5.19. Evolución de la posición del máximo cuando los espectros únicamente se desplazan a longitudes de onda mayores con el tiempo (figura tomada de la bibliografía).1 Para confirmar esta hipótesis se estudia la evolución de la posición del máximo en nm y cm-1 (Figura 5.20), lo que revela su ajuste (siendo la posición del máximo el valor de la función, f, y el tiempo en ns el parámetro x) a una función biexponencial (Ec 14). De este ajuste se obtienen tanto los valores de los parámetros de la ecuación como los tiempos de vida de la molécula en 1-butanol (Tabla 5.6), que resultan ser equiparables a los que se presentan en estudios bibliográficos como el de Maroncelli34. (Ec 14) Figura 5.20. Evolución de la posición del máximo en cm-1 (izquierda) y nm (derecha), y contribución de las dos funciones exponenciales que las constituyen (exp1 en verde y exp2 en azul). 𝑓=𝐴+𝐵⋅𝑒−𝑥∕𝜏1+𝐶⋅ 𝑒−𝑥∕𝜏2 Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 37 Tabla 5.6. Posición de los máximos de la función logarítmica que representa las amplitudes y separación entre ellos, en nm y cm-1. Este análisis también revela los valores esperados de la posición de los máximos en el modelo de especies que se estudiará posteriormente (Tabla 5.7). Tabla 5.7. Posición de los máximos obtenida del ajuste de la evolución de la posición del máximo a una función logarítmica, y separación entre ellos, en nm y cm-1. La posibilidad de ajuste de los datos a un modelo en el que intervienen especies que evolucionan en el tiempo se analiza asimismo por medio del seguimiento de otros parámetros obtenidos en el ajuste a la función logaritmo normal. La evolución de la anchura media del espectro (FWHM) (Figura 5.21) también respalda esta hipótesis; al no configurarse como una función continuamente creciente ni decreciente (presenta un hombro que revela su ajuste biexponencial) se pone de manifiesto que el proceso no responde únicamente a la evolución espectral con el tiempo. También se detalla la evolución de la anchura media del espectro durante los cien primeros ps (correspondientes a τ1), con la finalidad de poder observar el tiempo de relajación del 1-Butanol. La evolución de la anchura media del espectro obtenida se ve reflejada, en última instancia, representando funciones gaussianas teóricas correspondientes con un modelo de evolución de dos especies (Figura 5.22), a diferencia de lo que sucedía cuando la evolución temporal de los espectros se debía únicamente a su desplazamiento a λ mayores. A B C τ1 / ns τ2 / ns Valor / nm 454.9983 - 22.0296 - 15.6219 0.1269 0.5652 Valor / cm-1 21977.9943 1202.2593 776.4917 0.1213 0.5595 Máx. 1 Máx. 2 Máx. 3 Máx 1-2 Máx 2-3 f / nm 417 439 454 ∆ f / nm 22 15 f / cm-1 23956 22754 22001 ∆ f / cm-1 1202 753 Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 44 6. CONCLUSIONES En este trabajo se ha analizado el comportamiento fisicoquímico del 6-amino-1,3- benzotiazol-2-carbonitrilo (ABTC) en diferentes disolventes y condiciones de acidez, por medio de medidas de absorción UV-Vis y fluorescencia en estado estacionario y resuelta en el tiempo. Se ha estudiado su interacción con los protones presentes en el medio y la dinámica de los procesos de solvatación que experimenta. Del análisis de los resultados obtenidos se infieren las conclusiones siguientes: 1) En estado fundamental, la molécula de ABTC permanece en forma neutra (N) en medio acuoso y en medio de basicidad creciente, mientras que en medio ácido se protona en el grupo amino dando lugar a la especie catiónica CA, que presenta una constante de disociación ácida Ka = 0,00888(26) M (pKa = 2,051(29)). 2) En estado excitado, CA* presenta un pKa* = -11,7 (es una especie mucho más ácida que CA), con lo que se disocia dando lugar a N* (única especie emisora). 3) La interacción con los protones persiste, sin embargo, en estado excitado, al experimentar la forma neutra de la molécula de ABTC una transferencia intramolecular de carga fotoinducida (ICT) que la lleva a protonarse en el átomo de N benzotiazólico, dando lugar a la especie catiónica CB* (no emisora). 4) En estado excitado, los protones presentes en el medio se configuran como quencher, dando lugar un proceso de quenching dinámico (que ocurre simultáneamente al quenching estático) que provoca un descenso significativo en la señal de fluorescencia, regido por una constante kq = 4,49 × 1010 M-1 s-1. 5) En cuanto a la interacción con el medio, la especie N presenta una elevada sensibilidad a la polaridad de los disolventes en los que se encuentra, como consecuencia del incremento de momento dipolar que experimenta en estado excitado. 6) Se determina que la molécula de ABTC presenta solvatocromismo positivo (batocromismo), al desplazarse el espectro hacia λ mayores en respuesta a un aumento de la polaridad. También se confirma la formación de enlaces de H con disolventes próticos. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 45 7) Finalmente, el seguimiento de su proceso de solvatación en 1-BuOH revela un modelo constituido por tres especies que evolucionan en el tiempo: A (molécula en el momento inicial), B (molécula solvatada rotando en la esfera de disolvente) y C (producto final, molécula solvatada después de haber establecido interacciones específicas – enlace de H – con el disolvente). 8) El análisis de las constantes cinéticas que rigen el mecanismo evidencia que los procesos de evolución A→B y B→C son mucho más rápidos que los procesos de desactivación de las propias especies, de acuerdo con tiempos τA = 0,0977 ns y τB = 0,4495 ns, mientras que la especie C tiene un tiempo de vida τC = 4,6379 ns. *** Neste traballo analizouse o comportamento fisicoquímico do 6-amino-1,3- benzotiazol-2-carbonitrilo (ABTC) en diferentes disolventes e condicións de acidez, por medio de medidas de absorción UV-Vis e fluorescencia en estado estacionario e resolta no tempo. Analizouse a súa interacción cos protóns presentes no medio así como a dinámica dos procesos de solvatación que experimenta. Da análise dos resultados obtidos obtéñense as conclusións seguintes: 1) En estado fundamental, a molécula de ABTC permanece en forma neutra (N) en medio acuoso e en medio de basicidade crecente, mentres que en medio ácido se protona no grupo amino dando lugar á especie catiónica CA, que presenta unha constante de disociación ácida Ka = 0.00888(26) M (pKa = 2,051(29)). 2) En estado excitado, CA* presenta un pKa* = -11,7 (é unha especie moito máis ácida que CA), co que se disocia dando lugar a N* (única especie emisora). 3) A interacción cos protóns persiste, sen embargo, en estado excitado; a forma neutra da molécula de ABTC experimenta unha transferencia intramolecular de carga fotoinducida (ICT), que a leva a protonarse no átomo de N benzotiazólico, dando lugar á especie catiónica CB* (non emisora). 4) En estado excitado, os protóns presentes no medio actúan como quencher, dando lugar a un proceso de quenching dinámico (que ocorre simultaneamente ó Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 46 quenching estático) o que provoca un descenso significativo no sinal de fluorescencia, de acordo con unha constante kq = 4,49 × 1010 M-1 s-1. 5) En canto á interacción co medio, a especie N presenta unha elevada sensibilidade á polaridade dos disolventes nos que se atopa, como consecuencia do incremento de momento dipolar que experimenta en estado excitado. 6) Determínase que a molécula de ABTC presenta solvatocromismo positivo (batocromismo), ó desprazarse o espectro cara a lonxitudes de onda maiores en resposta a un aumento da polaridade. Tamén se confirma a formación de enlaces de H con disolventes próticos. 7) Finalmente, o seguimento do seu proceso de solvatación en 1-BuOH revela un modelo constituído por tres especies que evolucionan no tempo: A (molécula no momento inicial), B (molécula solvatada rotando na esfera de disolvente) e C (produto final, a molécula solvatada logo de ter establecido interaccións específicas de tipo enlace de H co disolvente). 8) A análise das constantes cinéticas que rexen o mecanismo evidencia que os procesos de evolución A→B y B→C son moito máis rápidos que os procesos de desactivación das propias especies, de acordo con tempos τA = 0,0977 ns e τB = 0,4495 ns, mentres que a especie C ten un tempo de vida τC = 4,6379 ns. *** In this work, the physiochemical behaviour of 6-amino-2- benzothiazolecarbonitrile (ABTC) has been studied in different solvents and pH conditions, by means of UV-Vis absorption and steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy measurements. Its interaction with protons and the dynamics of solvation processes it undergoes have also been studied thoroughly. Through the discussion of the results the following conclusions have been reached: 1) ABTC molecule remains in the neutral form (N) in excited state, in neutral aqueous solution and increasingly basic media. However, in acidic media, it undergoes protonation in the amino group, yielding the cationic form CA, which shows an acid dissociation constant Ka = 0.00888(26) M (pKa = 2,051(29)). Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 47 2) In excited state CA* shows a pKa* = -11,7 (CA* is significantly more acidic than CA), and it dissociates, consequently, yielding N* (the only emitting species). 3) Nevertheless, ABTC still interacts with protons in excited state; neutral form of ABTC, N, goes through an intramolecular charge transfer (ICT) process, which allows its protonation on the benzothiazolic N, returning cationic species CB* (non-emitting). 4) Protons available in excited state act as a quencher, inducing a dynamic quenching process (which takes places simultaneously to a static quenching process). These conditions cause a significant decline in the fluorescence signal, according to a constant kq = 4,49 × 1010 M-1 s-1. 5) In terms of the interactions with media, ABTC molecule shows a remarkable sensitivity towards solvents’ polarity, as a consequence of the increase in the dipole moment it experiences in excited state. 6) Our studies reveal ABTC shows positive solvatocromism (batocromism), as the spectra is shifted towards higher wavelengths in response of an increase in polarity. H bonding with protic solvents is also observed. 7) Lastly, ABTC’s solvation process is followed using 1-BuOH as a solvent. This study reveals a model shaped by time evolution of three different species: A (ABTC in the initial moment), B (solvated molecule rotating in its solvation shell) and finally C (final product, solvated molecule having stablished specific interactions – H bonding – with solvent). 8) Further analysis of the kinetic constants that regulate this mechanism reveals that evolution processes from A→B and B→C are way faster than the species’ itself deactivating processes, according to times τA = 0,0977 ns and τB = 0,4495 ns. Meanwhile, C species shows a deactivation lifetime τC = 4,6379 ns. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 48 7. BIBLIOGRAFÍA 1. Valeur, B.; Berberan-Santos, M. N. 2012. Molecular Fluorescence. Principles and Applications. 2a ed., Wiley-Vch, Alemania. 2. Lakowicz, J.R. 2006. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3ª ed., Springer. USA. 3. Schäferling, M. 2012. The art of fluorescence imaging with chemical sensors. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 51, 3532–54. 4. 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Static and dynamic quenching of biologically active coumarin derivative by aniline in benzene–acetonitrile mixtures. Journal of Luminescence, 130(8), 1330-1337. 33. Airinei, A.; Tigoianu, R. I.; Rusu, E.; Dorohoi, D. O. 2011. Fluorescence quenching of anthracene by nitroaromatic compounds. Digest Journal of Nanomaterials and Biostructures, 6(3), 1265-1272. 34. Horng, M. L.; Gardecki, J. A.; Papazyan, A.; Maroncelli, M. 1995. Subpicosecond measurements of polar solvation dynamics: Coumarin 153 revisited. Journal of Physical Chemistry, 99(48), 17311-17337. Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 51 ANEXOS • Cálculo de la constante de disociación ácida (Ka) para el catión aminio con datos de la serie de acidificación pH 4-1: CA ⇄ N + H+ ; 𝐾𝑎=[𝑁]⋅[𝐻+] [𝐶𝐴] ; C0 = [N] + [CA] [𝐶𝐴]= 𝐾𝑎 ⋅ 𝐶0 𝐾𝑎 + [𝐻+] ; [𝑁]=[𝐻+] ⋅ 𝐶0 𝐾𝑎 + [𝐻+] A (λ) = ελ · b · c ; A = A (N) + A (CA) 𝐴 (𝜆,𝐻+)=𝜀𝑁 (𝜆) ⋅𝑏· [𝐻+] 𝐾𝑎 + [𝐻+] + 𝜀𝐶𝐴 (𝜆)·𝑏· 𝐾𝑎 𝐾𝑎 + [𝐻+] 𝐴 (𝜆,𝐻+)=𝐴1(𝜆)· [𝐻+] 𝐾𝑎 + [𝐻+] + 𝐴2(𝜆)· 𝐾𝑎 𝐾𝑎 + [𝐻+] • Cálculo del término de quenching estático para la molécula de ABTC: En el momento inicial [N] = C0; a medida que avanza la protonación va disminuyendo. La intensidad de fluorescencia, F, es directamente proporcional a la concentración de N* en estado estacionario, que viene dada por [𝑁∗]𝑠𝑠=𝐼𝑎 𝑘𝑟 + 𝑘𝑛𝑟 donde la intensidad de luz absorbida (Ia) es directamente proporcional a [N], por lo que el cociente entre la intensidad de fluorescencia en ausencia de H+ (F0), y en presencia de H+ (F) vendrá dada por 𝐹0 𝐹=𝐶0 [𝑁] =1+ 1 𝐾𝑎 ⋅[𝐻+] Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 52 Incluyendo el término de quenching dinámico Con lo que la expresión resulta Lo que operado es igual a • Detalle de los residuos ponderados para decaimiento de la fluorescencia: • Valores de la amplitud de las funciones exponenciales para la molécula de ABTC: 𝐹0 𝐹= 𝑘𝑟 + 𝑘𝑛𝑟 + 𝑘𝑞⋅[𝐻+] 𝑘𝑟 + 𝑘𝑛𝑟 [𝑁∗]𝑠𝑠=𝐼𝑎 𝑘𝑟 + 𝑘𝑛𝑟 + 𝑘𝑞⋅[𝐻+] 𝐹0 𝐹=1+𝑘𝑞⋅𝜏⋅[𝐻+] Trabajo de Fin de Grado Ana Arias Rodríguez 53 (Los valores representados se encuentran recogidos en la tabla siguiente) Un análisis detallado pone de manifiesto que la contribución de la primera exponencial (e1), que en el momento inicial era la más significativa, disminuye a medida que aumenta la longitud de onda. Por el contrario, la segunda exponencial (e2) tiene relevancia en un intervalo intermedio de longitudes de onda, mientras que la contribución de la tercera exponencial (e3) se postula como significativa a longitudes de onda mayores. λ / nm Amplitud 1 Amplitud 2 Amplitud 3 405 9060,835 1609,19 202,4983 410 8046,247 2378,386 312,144 415 7094,228 2802,708 531,4331 420 5189,553 3587,428 843,4327 425 3660,086 3808,157 1327,744 430 1735,017 4055,701 1883,427 435 722,4833 3544,38 2611,677 440 -790,232 3246,832 3347,103 445 -1248,12 2303,893 4100,052 450 -1805,19 1492,123 4830,919 455 -1948,23 715,3691 5245,123 460 -1771 -86,8679 5499,122 465 -2145,01 -574,15 5812,585 470 -2013,63 -1150,66 5984,927 475 -2019,05 -1420,43 6116,005 480 -4904,58 -1898,08 6261,536 485 -4742,85 -2185,9 6359,451 490 -4345,28 -2588,72 6421,667 495 -4252,03 -2662,82 6409,021 500 -4018,71 -2984,99 6530,557 505 -3922,38 -2978,21 6440,907 510 -3685,4 -3310,89 6562,723 515 -3695,81 -3276,62 6538,806 520 -3522,37 -3553,69 6642,786