Mejora e innovación en los procedimientos de detección y cuantificación de los métodos de análisis de toxinas PSP

TESIS DE DOCTORADO MODALIDAD DE COMPENDIO DE ARTÍCULOS MEJORA E INNOVACIÓN EN LOS PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS DE TOXINAS PSP Fdo. .............................................................. Verónica Rey López PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA EN CIENCIAS VETERINARIAS LUGO 2017 Prof. Dra. Dña. Ana M. Botana López, como Directora de la Tesis titulada: "Mejora e innovación en los procedimientos de detección y cuantificación de los métodos de análisis de toxinas PSP". Por la presente DECLARO: Que la Tesis presentada por Doña Verónica Rey López es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artículo 41 del Reglamento de Estudos de Doctorado, por la modalidad de compendio de ARTÍCULOS, en los que el doctorando tuvo participación en el peso de la investigación y su contribución fue decisiva para llevar a cabo este trabajo. Y que está en conocimiento de los coautores, tanto doctores como no doctores, participantes en los artículos, que ninguno de los trabajos reunidos en esta Tesis serán presentados por ninguno de ellos en otra Tesis de Doctorado, lo que firmo bajo mi responsabilidad. Lugo, a 1 de Septiembre de 2017. Ana M. Botana López Verónica Rey López Doctora en Química Codirectora de Tesis Dr. D. Álvaro Antelo Queijo, como Director de la Tesis titulada: " Mejora e innovación en los procedimientos de detección y cuantificación de los métodos de análisis de toxinas PSP ". Por la presente DECLARO: Que la Tesis presentada por Doña Verónica Rey López es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artículo 41 del Reglamento de Estudos de Doctorado, por la modalidad de compendio de ARTÍCULOS, en los que el doctorando tuvo participación en el peso de la investigación y su contribución fue decisiva para llevar a cabo este trabajo. Y que está en conocimiento de los coautores, tanto doctores como no doctores, participantes en los artículos, que ninguno de los trabajos reunidos en esta Tesis serán presentados por ninguno de ellos en otra Tesis de Doctorado, lo que firmo bajo mi responsabilidad. Lugo, a 1 de Septiembre de 2017. Álvaro Antelo Queijo Verónica Rey López Doctor en Química Codirector de Tesis A mis abuelos porque nada me gustaría más en el mundo que pudierais estar aquí para verlo. AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer... Al Dr. Luis M. Botana por haberme brindado la OPORTUNIDAD de formar parte de su grupo de investigación. Señalo, OPORTUNIDAD, porque es lo que los jóvenes de hoy en día necesitamos para poder demostrar lo que valemos y sin duda es lo más difícil de lograr. A la Dra. Ana M. Botana por confiar en mí y en mi trabajo, muchas veces incluso más que yo misma. Gracias por tu tiempo y dedicación, que no ha sido poco desde que en el año 2009 me embarcara en este mundo de las toxinas marinas. Gracias por tu ayuda, apoyo y sobre todo por tu perseverancia para enseñarme y ayudarme a mejorar. Gracias por TODO. Al Dr. Álvaro Antelo Queijo por depositar su confianza en mí, por su ayuda en todo momento y sus sabios consejos. Para mí más que un director ha sido un compañero, gracias por tu cercanía. Echaré inmensamente de menos nuestras largas conversaciones. A todos los que forman parte del departamento de Farmacología, que a pesar de la distancia, siempre que he necesitado ayuda la he tenido. A los trabajadores de Cifga, en especial a Mercedes, por compartir conmigo sus conocimientos, por su colaboración y sus buenos consejos. Ha sido un placer poder compartir parte de esta etapa contigo. A Marisa, mi compañera de trabajo durante una breve pero intensa etapa, sin duda la mejor de esta tesis. Obrigada amiga. A mis amigas Sonia, Vicky, Bea, Patri y Marta por estar ahí siempre, por sus palabras de ánimo en los momentos más difíciles y por su inmenso apoyo. Gracias chicas. A Miguel por su gran ayuda, esfuerzo y su valiosa tranquilidad. A mi compañero de viaje porque ha sido la persona en la que más me he apoyado y la que ha vivido conmigo toda una montaña rusa de emociones a lo largo de estos años. Gracias por todo Javi. A mi familia. A mi hermana pequeña que muchas veces ha tenido que hacer el papel de hermana mayor, gracias enana. A mi madre, porque todo lo que soy se lo debo a ella y sé que esto te hace inmensamente feliz. A todos aquellos que a lo largo de estos años de una u otra manera habéis formado parte de mí día a día. RESUMEN En los últimos años, las floraciones de algas nocivas (FAN) han atraído cada vez más la atención tanto de la comunidad científica como de la sociedad. A pesar de que estos fenómenos naturales han tenido lugar a lo largo de toda la historia, se está observado en la actualidad un claro incremento en regiones costeras de todo el mundo. Por ello se han implementado medidas más eficaces y complejas para prevenir la intoxicaciones humanas por consumo de moluscos. El número de toxinas a ensayar ha sido actualizado a lo largo de los años al igual que los métodos a usar. Pero esto no es así con los animales que actúan como vectores de estas toxinas. La presente Tesis se centra en el grupo de toxinas paralizantes (PSP), para el cual existe un claro incremento de nuevos vectores. Por esta razón, uno de los objetivos de este trabajo fue evaluar la eficacia del método de cromatografía líquida de alta eficacia con detección por fluorescencia (HPLC-FLD) y oxidación post-columna (PCOX) cuando se aplica a diferentes especies de moluscos, gasterópodos y crustáceos. Los resultados mostraron la necesidad de ajustar el método para las matrices estudiadas. Además se realizó una comparación entre los dos métodos HPLC-FLD validados por la AOAC (pre-columna y post-columna) en muestras reales. Se concluyó que el método PCOX es una herramienta fiable para la identificación y cuantificación de las PSP. Las carencias de estos métodos junto con la reciente aparición de la tetrodotoxina (TTX) y sus análogos en las costas europeas ponen de manifiesto la necesidad de desarrollar nuevos métodos químicos capaces de diferenciar entre ambos grupos de toxinas. Por esta razón, otro de los objetivos de esta Tesis Doctoral fue proponer nuevos métodos de análisis. Se presenta un nuevo método HPLC-FLD con oxidación post-columna basado en el uso de una columna de carbono grafitizado poroso que demostró ser rápido, sensible y que posee la capacidad de distinguir las PSP de la TTX en un sólo análisis. Además se propone un nuevo proceso de limpieza de muestras que dio muy buenos resultados. Se aprovecharon las excelentes características que muestra la columna de carbono grafitizado poroso para la separación de las PSP y la limpieza obtenida en el método previo, para el desarrollo de un nuevo método de cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este método demostró ser capaz de separar un amplio número de toxinas PSP (hidrófilas e hidrófobas) junto con la TTX y su análogo 4,9-anhTTX, siendo el primer método químico capaz de realizar este análisis simultáneo. Palabras clave: toxinas PSP, tetrodotoxina, interferencias de matriz, cromatografía líquida, carbono grafitizado poroso. RESUMO Nos últimos anos, as floracións de algas nocivas (FAN) atraeron cada vez máis a atención tanto da comunidade científica como da sociedade. A pesar de que estes fenómenos naturais tiveron lugar ao longo de toda a historia, estase observando na actualidade un claro incremento en rexións costeiras de todo o mundo. Por iso implementáronse medidas máis eficaces e complexas para previr as intoxicacións humanas por consumo de moluscos. O número de toxinas a ensaiar foi actualizado ao longo dos anos do mesmo xeito que os métodos a usar. Pero isto non é así cos animais que actúan como vectores destas toxinas. A presente Tese céntrase no grupo de toxinas paralizantes (PSP), para o cal existe un claro incremento de novos vectores. Por esta razón, un dos obxectivos deste traballo foi avaliar a eficacia do método de cromatografía líquida de alta eficacia con detección por fluorescencia (HPLC-FLD) e oxidación post-columna (PCOX) cando se aplica a diferentes especies de moluscos, gasterópodos e crustáceos. Os resultados mostraron a necesidade de axustar o método para as matrices estudadas. Ademais realizouse unha comparación entre os dous métodos HPLC-FLD validados pola AOAC (pre-columna e post-columna) en mostras reais. Concluíuse que o método PCOX é unha ferramenta fiable para a identificación e cuantificación das PSP. As carencias destes métodos xunto coa recente aparición da tetrodotoxina (TTX) e os seus análogos nas costas europeas poñen de manifesto a necesidade de desenvolver novos métodos químicos capaces de diferenciar entre ambos grupos de toxinas. Por esta razón, outro dos obxectivos desta Tese Doutoral foi propoñer novos métodos de análise. Preséntase un novo método HPLC-FLD con oxidación post-columna baseado no uso dunha columna de carbono grafitizado poroso que demostrou ser rápido, sensible e que posúe a capacidade de distinguir as PSP da TTX nunha soa análise. Ademais proponse un novo proceso de limpeza de mostras que deu moi bos resultados. Aproveitáronse as excelentes características que mostra a columna de carbono grafitizado poroso para a separación das PSP e a limpeza obtida no método previo, para o desenvolvemento dun novo método de cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas (LCMS/MS). Este método demostrou ser capaz de separar un amplo número de toxinas PSP (hidrófilas e hidrófobas) xunto coa TTX e o seu análogo 4,9-anhTTX, sendo o primeiro método químico capaz de realizar esta análise simultánea. Palabras chave: toxinas PSP, tetrodotoxina, interferencias de matriz, cromatografía líquida, carbono grafitizado poroso. ABSTRACT In recent years, harmful algal blooms (HABs) have attracted increasing attention from both the scientific community and society. Although these natural phenomena have occurred throughout time, a clear increase has been observed nowadays in coastal regions around the world. Therefore, more effective and complex measures have been implemented in order to prevent human intoxication from shellfish consumption. The number of toxins to be tested, as well as the method used, have been updated over the years; however this is not the case with animals that act as vectors for these toxins. This Doctoral Thesis focuses on paralytic shellfish toxins (PSP), for which there is a clear increase of new vectors. For this reason, one of the objectives of this study was to evaluate the efficacy of the high performance liquid chromatography method with fluorescence detection (HPLC-FLD) and post-column oxidation (PCOX) when it is applied to different species of shellfish, gastropods and crustaceans. The results showed the need to adjust the method for the matrices studied. In addition, a comparison was made between the two HPLC-FLD methods which were validated by AOAC (pre-column and post-column) in real samples. It was concluded that the PCOX method is a reliable tool to identify and quantify PSP. The shortcomings of these methods, together with the recent appearance of tetrodotoxin (TTX) and its analogues on European coasts, reveal the need to develop new chemical methods that are able to differentiate between both groups of toxins. For this reason, another objective of this Doctoral Thesis was to propose new methods of analysis. A new HPLC-FLD method with post-column oxidation based on the use of a porous graphitic carbon column, that proved to be fast and sensitive with the ability to distinguish PSP from TTX in a single analysis was presented. Moreover, a new sample clean-up procedure which showed very good results was proposed. The excellent characteristics of the porous graphitic carbon column for the separation of the PSP toxins and the sample clean-up procedure obtained in the previous method were used for the development of a new liquid chromatography tandem mass spectrometry method (LC-MS/MS). It proved to be able to separate all of PSP toxins (hydrophilic and hydrophobic) from the TTX and its analogue 4,9-anhTTX, thus being the first chemical method able to make this simultaneous analysis. Keywords: PSP toxins, tetrodotoxin, matrix interferences, liquid chromatography, porous graphitic carbon . ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS. AMPc: adenosín monofosfato cíclico. AMPA: ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico. AOAC: Asociación Oficial de Químicos Analíticos. ASP: intoxicación amnésica por consumo de molusco. AZAs: azaspirácidos. BTXs: brevetoxinas. CTXs: ciguatoxinas. C-CTXs: ciguatoxinas del Caribe. CFP: intoxicación ciguatérica por consumo de pescado CIs: iminas cíclicas. CM: carne de molusco. CTXs: ciguatoxinas. DA: ácido domoico. dcGTXs: decarbamoilgonyautoxinas. dcneoSTX: decarbamoilneosaxitoxina. dcSTX: decarbamoilsaxitoxina. doGTX2: 13-deoxidecarbamoilgonyautoxina 2. doGTX3: 13-deoxidecarbamoilgonyautoxina 3. doSTX: 13-deoxidecarbamoilsaxitoxina. DSP: intoxicación diarreica por consumo de molusco. DTXs: dinofisistoxinas. EFSA: Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria. ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas. eq: equivalentes. FAN: Floraciones de algas nocivas. FAO: Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. GCs: toxinas hidroxybenzoato. GMPc: guanosin monofosfato cíclico. GTXs: gonyautoxinas. GYMs: ginmodiminas. HABs: floraciones algales nocivas. INTRODUCCIÓN Figura 1. Imágenes de las principales microalgas nocivas. a) Notiluca scintillans, b) Gymnodinium catenatum, c) Pyrodinium(P.) bahamense var. compressum, d) P. bahamense var. bahamense, e) Alexandrium(A.) tamiyavanichii, f) A. affine, g) Cochlodinium (C.) fulvescens, h) C. polykrikoides, i) Levanderina fissa, j) Polykrikos hartmannii, k) Dinophysis (D.) acuminata, l) D. caudata, m) D. fortii, n) D. tripos, ñ) D. ovum, o) Phalacroma (P.) mitra, p) P. rotundatum, q) Prorocentrum (Pr.) balticum, r) Pr. gracile, s) Pr. koreanum, t) Pr. mexicanum, u) Pr. triestinum, v) Pr. lima, w) Pr. minimum, x)Pr. rhathymum 5 VERÓNICA REY LÓPEZ Las toxinas marinas se definen como metabolitos secundarios con actividad tóxica, originados por el metabolismo de estas especies de microalgas fitoplanctónicas [5]. Gran parte de la disparidad de los efectos provocados por las toxinas marinas es debido a la variedad de toxinas y análogos producidos por las microalgas, aunque la mayoría tienen influencia en la neurotransmisión o en la inhibición enzimática [6]. Las primeras clasificaciones de toxinas se basaron en los síntomas experimentados por los seres humanos después del consumo de moluscos [7, 8]. En base a ésto, se distinguieron varios tipos de intoxicación por toxinas marinas: intoxicación paralizante por consumo de moluscos (causada por saxitoxina y tetrodotoxina), intoxicación neurotóxica por consumo de moluscos (causada por brevetoxinas), intoxicación diarreica por consumo de moluscos (causada por ácido okadaico), intoxicación amnésica por consumo de moluscos (causada por ácido domoico). Debido al descubrimiento continuo de nuevas toxinas, como los azaspirácidos que fueron descubiertos como una nueva categoría de intoxicación por consumo de moluscos, y la intoxicación por ciguatera asociada con el consumo de pescado, se ha visto que un mejor enfoque para la clasificación de las toxinas marinas sería en función de su estructura química [9]: esta es la clasificación recomendada por los expertos científicos de la Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) y la que se empleará en la presente Tesis. Clasificación de la toxinas marinas En base a la estructura química de las toxinas marinas se pueden distinguir diferentes grupos como se refleja en la tabla 1, donde además se muestran los tipos de intoxicaciones que provocan y los compuestos más representativos de cada grupo. En la misma también se indican los límites máximos permitidos de las toxinas que actualmente se encuentran reguladas en la Unión Europea (UE). 6 INTRODUCCIÓN Tabla 1. Clasificación de las toxinas marinas Grupo Síndrome Toxina/s representativa/s Análogos más relevantes Límite máximo establecido en la UE Toxinas amnésicas Intoxicación amnésica por consumo de molusco (ASP) Ácido domoico (AD) AD A-H y 5'-epi-AD 20 mg DA/ kg CM* Toxinas diarreicas Intoxicación diarreica por consumo de molusco (DSP) Ácido okadaico (AO) y dinofisistoxinas (DTXs) DTX1, DTX2 y ésteres (DTX3, DTX4 y DTX5) 0.16 mg OA, DTX, PTX /kg CM* Ciguatoxinas Intoxicación ciguatérica por consumo de pescado (CFP) Ciguatoxina del Pacífico-1 (P-CTX-1) CTXs del Caribe (C-CTX), CTXs del Índico (I-CTX) y CTXs del Pacífico (P-CTX) Ausencia** Palitoxinas Palitoxina (PLTX) isoPLTX, ostreocinas y ovatoxinas Pectenotoxinas Pectenotoxina-2 (PTX-2) PTX-1 y PTXs-seco ácidas 0.16 mg OA, DTX, PTX/kg CM* Yesotoxinas Yesotoxina (YTX) 45 OH-YTX, homo-YTX y 45-OH- homo-YTX 3.75 mg YTX/kg CM* Azaspirácidos Intoxicación por azaspirácido Azaspirázido-1 (AZA1) AZA2, AZA3, AZA4, AZA5 y 37- epi-AZAs 0.16 mg AZA1/kg CM* Brevetoxinas Intoxicación neurotóxica por consumo de molusco (NSP) Brevetoxina (BTX) BTX-1 Iminas cíclicas (CIs) Espirólido-1 (SPX-1) y gymnodimina-A (GYM-A) 13,19-disdemetil SPX-C, 20- metil SPX-G, GYM-B y GYM-C Tetrodotoxinas Tetrodotoxina (TTX) 4,9-anhTTX, 4, 4-epiTTX, ácido tetrodónico (TDA), 11-oxo-TTX y 11-deoxiTTX Toxinas paralizantes (PSP) Intoxicación paralizante por consumo de molusco Saxitoxina (STX) Neosaxitoxina (neoSTX), gonyautoxinas (GTX) 1-6, decarbamoil gonyautoxinas (dcGTX) 1-4, decarbamoil saxitoxina (dcSTX), decarbamoil neosaxitoxina (dcNEO), y C 1-4 0.8 mg STX eq/kg CM* *CM: carne de molusco **No existe límite legal en la EU pero sí es obligatorio que los productos pesqueros no contengan esta toxina 7 VERÓNICA REY LÓPEZ 1.1.1. Grupo del ácido domoico (DA) El ácido domoico se clasifica como una potente neurotoxina producida de forma natural por varias diatomeas pertenecientes al género Pseudo-nitzschia. Desde que en 1987 se descubriera que el ácido domoico era un problema para la salud humana causando la intoxicación amnésica por consumo de moluscos [10], muchos han sido los casos de intoxicación descritos hasta el momento. Un ejemplo reciente es el mayor episodio tóxico ocurrido a lo largo de la costa este de Norte América desde mayo a agosto de 2015 [11]. La exposición al DA se ha vuelto más generalizada, además las floraciones tóxicas de Pseudo-nitzschia han aumentado tanto su frecuencia como su intensidad. Ésto sumado al significativo incremento global en el consumo de moluscos implica la necesidad de frecuentes revisiones, en particular las relativas a fuentes y riesgos para la salud humana que provoca el ácido domoico [12]. Estructura química y análogos El ácido domoico es un ácido amino tricarboxílico neuroexcitador de naturaleza polar y soluble en agua pero insoluble en disolventes orgánicos (Figura 2). Los tres grupos carboxilo son los responsables del carácter altamente hidrofílico y de la polaridad de la molécula [13]. Su estructura es similar a la de otras neurotoxinas: ácido glutámico y ácido kaínico [14]. Este compuesto tiene varios análogos: los ácidos isodomoicos designados desde A hasta H y el 5'- epi-ácido domoico [15]. Los isómeros están presentes en el medioambiente en menor concentración que el DA [12]. Figura 2. Estructura química del DA 8 INTRODUCCIÓN Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación El DA es una neurotoxina con una alta afinidad por el ácido alfa-amino-3-hidroxi-5- metil-4-isoxazolpropiónico (receptores AMPA) y las subunidades kainato (receptores kainato), que son ambos receptores del glutamato y se encuentran presentes en el sistema nervioso central (SNC) y en el miocardio [16-18]. El DA forma enlaces muy fuertes con estos receptores de glutamato debido a la geometría de la toxina [19]. Esta unión induce a una despolarización de la célula, y como consecuencia a la disfunción y muerte celular [20, 21]. Los síntomas clínicos de la intoxicación ASP son muy variables y dependen tanto de la cantidad de toxina ingerida como del estado de salud de la persona intoxicada. Náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal son algunos de los síntomas gastrointestinales detectados en personas 24 horas después del consumo de molusco contaminado; a las 48 horas de la intoxicación aparecen los efectos neurológicos como confusión, pérdida de memoria, desorientación, convulsiones, coma y muerte [22]. Vectores, productores y distribución geográfica Originalmente, el DA fue aislado de la microalga roja Chondria armata. Posteriormente se ha conocido la capacidad de producir dicha toxina de otras microalgas y diatomeas, principalmente del género Pseudo-nitzschia (P.). P. australis, P. multiseries y P. seriata están reconocidas hasta el momento como las mayores productoras de ácido domoico [12]. Su presencia no sólo se limita al norte del continente americano, puesto que se han encontrado varias especies de moluscos que contienen DA en todo el mundo, incluyendo varios países europeos como Francia, Irlanda, Portugal y España [23, 24]. Límite legal y métodos de análisis Después del incidente de Canadá en 1987 [10] donde tras consumir mejillones que contenían DA al menos 4 personas murieron y 143 fueron hospitalizadas, se estableció como límite reglamentario 20 mg DA/kg en los tejidos comestibles; posteriormente este límite fue adoptado internacionalmente [25]. Inicialmente, el método del bioensayo en ratones (MBA) desarrollado por la Asociación Oficial de Químicos Analíticos (AOAC), para la detección de toxinas paralizantes en moluscos [26], fue propuesto también para la detección del ácido domoico, pero este método no se puede usar con fines regulatorios debido a que los primeros síntomas en los ratones 9 VERÓNICA REY LÓPEZ empiezan con concentraciones de 40 mg DA/kg de molusco [27], superiores al límite reglamentario. Los métodos analíticos son las técnicas más sensibles para la determinación de este grupo de toxinas y la cromatografía líquida de alta eficacia con detección ultravioleta (HPLC-UV) es uno de los métodos sugeridos para su determinación en mejillón [28]. Actualmente es la técnica analítica preferida para su análisis en moluscos; además se dispone de un método validado oficialmente por la AOAC para determinación de DA en mejillones [29]. Por otra parte, la técnica de cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas (LC-MS) ofrece excelente sensibilidad y también una gran selectividad en la determinación de DA en tejido de mejillón [27]. No obstante el reglamento (CE) Nº 1244/2007 sugiere el uso del método oficial 2006.02 [30], como método de cribado, basado en el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) para la detección de toxinas del grupo DA. Este método muestra claras ventajas porque es sensible y rápido, puede ser automatizado, la formación para su uso es mínima y no requiere amplios equipos. 1.1.2. Grupo ácido okadaico (OA) El primer caso de enfermedad gastrointestinal (vómitos y diarrea) asociada con el consumo de mejillones cocidos data del año 1961 en los Países Bajos, pero el agente causal no llegó a ser identificado [31]. No fue hasta 1970 cuando se asoció un brote de intoxicación diarreica con una densa floración de Dinophysis en la región de Chile, donde más de 100 personas sufrieron trastornos gastrointestinales severos después de comer mejillones, pero el caso apenas tuvo mención y no se informó de ello a la comunidad internacional hasta 1991 [32]. Desde entonces han sido muchos los casos de floraciones nocivas asociadas a toxinas diarreicas en regiones de todo el mundo, con Europa y Japón como principales áreas afectadas. Estructura química y análogos La intoxicación diarreica es una intoxicación humana causada por el consumo de moluscos que contienen ácido okadaico y sus análogos, y las dinofisistoxinas (DTXs). Estas toxinas son conocidas como toxinas DSP. Todas ellas son poliéteres termoestables lipófilos. 10 INTRODUCCIÓN El OA está formado por una cadena principal de 38 carbonos con un grupo carboxilo y cuatro grupos hidroxilos, y las DTXs son el resultado de la modificación química del OA (Figura 3), de manera que la DTX1 tiene un grupo metilo adicional en C35; la DTX2 sólo difiere del OA en la posición de un grupo metilo en la molécula mientras que la DTX3 se corresponde con una amplia gama de derivados esterificados del OA, la DTX1 y la DTX2 con ácidos grasos saturados e insaturados [33]. Tanto la DTX4 como la DTX5 son derivados sulfato del OA. Los compuestos relacionados con el OA descritos más recientemente son la norakadanona [34], el 19-epi-okadaico [35, 36] y el ácido beliceánico [37]. R1 R2 R3 R4 OA CH3 H H H DTX1 . CH3 CH3 H H DTX2 H H CH3 H DTX3 CH3 CH3 H acilo Figura 3. Estructura química del AO y DTXs más comunes Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación En cuanto al mecanismo de acción se sabe que el efecto del OA y las DTXs se debe a la inhibición de la fosfatasa de serina/treonina, principalmente la 1 (PP1) y la 2A (PP2A) y que la inhibición de la PP2A es aproximadamente 200 veces superior a la de la PP1 [35]. Las fosfatasas de serina/treonina son un grupo de enzimas muy importantes que están estrechamente relacionadas con distintos procesos metabólicos esenciales en las células eucariotas [38, 39]. Se ha propuesto que el OA induce diarrea mediante la estimulación de la fosforilación de las proteínas que controlan la secreción de sodio de las células intestinales, o mediante un 11 VERÓNICA REY LÓPEZ aumento de la fosforilación de las proteínas del citoesqueleto o elementos de unión, responsables de la regulación de la permeabilidad de solutos, afectando al equilibrio del agua [40-43]. Los síntomas característicos de la intoxicación por DSP son diarrea, nauseas, vómitos y, en algunos casos, dolor abdominal, que comienza entre las 3 y las 12 horas después de la ingestión del molusco contaminado y se manifiestan durante un máximo de 3 días. No existen casos de muerte debido a la DSP hasta la fecha [44]. Vectores, productores y distribución geográfica Mejillones, almejas, vieiras y ostras son los vectores más comunes de las toxinas DSP, pero no los únicos. Estas toxinas son producidas por un grupo de dinoflagelados, sobre todo del género Dinophysis spp. y Prorocentrum spp. [45-47], que al ser sustancias lipofílicas tienden a ser más abundantes en las partes grasas del animal. Los perfiles de toxinas producidas pueden variar dentro de la misma especie. En Europa el OA y su isómero DTX2 son las toxinas DSP predominantes y se encuentran en moluscos de Irlanda [48], Portugal y España [49]. La DTX1, que es el análogo metilo del OA, predomina en Japón [46, 50]. Límite legal y métodos de análisis El método MBA, se estableció inicialmente como método oficial para la detección de las DSP. Es un detector universal capaz de proteger la salud pública aunque tiene deficiencias y no se considera una herramienta apropiada para fines de control, debido a la alta variabilidad de los resultados, la insuficiente capacidad de detección y la limitada especificidad [51]. Aunque existen varios métodos como la cromatografía líquida de alta eficacia con detección fluorescente (HPLC-FLD), inmunoensayos y ensayos de inhibición de fosfatasas, que pueden emplearse como métodos alternativos para la detección de toxinas DSP, actualmente el método de referencia para la detección de toxinas lipofílicas es el método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS), validado por los laboratorios de referencia de toxinas de la UE en un estudio de validación interlaboratorio [52]. Esta técnica debe ser aplicada como método de referencia y se utiliza en análisis rutinarios. 12 INTRODUCCIÓN El límite legal actualmente establecido en la Unión Europea (EU) es de 160 µg OA equivalentes (eq)/ kg de carne de molusco (CM) [53], para el OA y las DTXs (incluidas pectenotoxinas). 1.1.3. Grupo de las ciguatoxinas (CTXs) La ciguatoxina (CTX) es una potente neurotoxina de carácter lipídico producida por peces y moluscos. Aunque inicialmente la intoxicación por ciguatera ha sido asociada a los dinoflagelados bentónicos del género Gambierdiscus (G.) toxicus, las ciguatoxinas no están producidas directamente por estas algas, sino que son productos resultantes de la bioconversión a lo largo de la transferencia trófica [54]. Estructura química y análogos Las CTXs son altamente estables, químicamente son compuestos poliéter cíclicos, solubles en lípidos y con fuertes esqueletos estructurales (Figura 4) [55, 56] que facilitan su retención durante el cocinado, congelado y la exposición tanto a medios básicos como ácidos. Ésto las hace propensas a bioacumularse a través de la cadena trófica [57, 58]. Hasta la fecha, más de 29 análogos de la CTX han sido identificados y agrupados de acuerdo a su distribución geográfica: CTXs del Océano Índico (I-CTXs), CTXs del Caribe (C-CTXs) y las más investigadas, CTXs del Pacífico (P-CTXs) [59], cuyo representante más conocido es la P-CTX-1. Figura 4. Estructura química de la P-CTX-1 13 VERÓNICA REY LÓPEZ Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación La CTX actúa sobre los canales de sodio de los nervios, los músculos y las células cardíacas. Su acción primaria es incrementar la permeabilidad de las membranas excitables al ión Na+, causando como consecuencia la despolarización del tejido; los mecanismos celulares normales expulsan Na+ y comienzan a tomar calcio. Ese aumento de Ca+2 intracelular interrumpe los sistemas de intercambio iónico, que resultan en la secreción de fluido presentándose la diarrea [60]. Se han reportado más de 175 síntomas de esta intoxicación que principalmente se caracteriza por presentar alteraciones gastrointestinales, neurológicas y cardiovasculares [60]. Los síntomas de la intoxicación por CTXs se manifiestan antes de transcurrir 12 horas desde la ingestión del pescado. Inicialmente aparecen algunos problemas gastrointestinales como náuseas, vómitos, diarrea y dolor abdominal, que normalmente disminuyen antes de las 24 horas [61]. Los problemas cardiovasculares, generalmente una combinación de taquicardia con hipotensión, y los síntomas neurológicos también pueden aparecer aunque estas manifestaciones son menos frecuentes [62]. Las CTXs provocan el tipo de intoxicación alimentaria, debida a toxinas marinas, más común del mundo con 50.000 - 500.000 incidentes por año [63]. Vectores, productores y distribución geográfica Aunque se sabe que el principal causante de la intoxicación por CTXs es el dinoflagelado Gambierdiscus toxicus, otras especies de la familia Gambierdiscus (G.) son también productoras de estas toxinas como G. pacificus y G. polynesiensis. También pueden ser producidas por otros microorganismos como Prorocentrum concavum, Prorocentrum mexicanum, Prorocentrum rhathytum, Gymnodinium sangieneum y Gonyaulax poliedra [64]. Las toxinas producidas por las distintas especies se acumulan a lo largo de la cadena alimentaria: pasan de los peces herbívoros y especies que se alimentan de restos coralinos en los arrecifes a los órganos de los peces carnívoros que se alimentan de ellos [57]. Esta intoxicación es considerada endémica en áreas donde el consumo de pescado de arrecifes es común: estas áreas incluyen regiones del Caribe, el sur de Florida, Hawai, el Pacífico Sur y Australia [58, 65, 66]. Aunque la presencia de CTXs se restringía a estas zonas específicas, en los últimos años han sido detectadas en las costas europeas y en el Mar Mediterráneo [63], lo que sugiere una expansión de estas toxinas a nuevas áreas. 14 INTRODUCCIÓN Figura 7. Estructura química general de la YTX y sus principales análogos Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación Dado que las YTXs pueden coexistir con el OA, inicialmente fueron englobadas dentro del grupo de las DSP, por lo tanto para aclarar el mecanismo de acción de las YTXs se estudió el efecto de este grupo de toxinas sobre la fosfatasa de serina/treonina, y se concluyó que la acción de las YTXs no inhibía estas enzimas [109]. Las YTXs actúan directamente sobre los niveles de Ca en el citosol, adenosín monofosfato cíclico (AMPc), proteína quinasa C (PKC), las fosfodiesterasas (PDE) y la guanosín monofosfato cíclico (GMPc), además de influir en la actividad mitocondrial y producir la destrucción y apoptosis en células humanas [110]. Los síntomas de intoxicación producidos por las YTXs en humanos son relativamente desconocidos debido a que hasta la fecha no se han dado casos de este tipo de intoxicación. Sin embargo, se sabe con claridad que las YTXs no producen diarrea en humanos [111]. 21 VERÓNICA REY LÓPEZ Vectores, productores y distribución geográfica Protoceratium reticulatum, Lingulodinium polyedrum y Gonyaulax spinifera fueron identificados como los dinoflagelados productores de este grupo de toxinas [105, 107, 112]. Además de en Japón, las YTXs han sido identificadas en moluscos de varios países de Europa, incluyendo España, Italia, Noruega, el Mar Adriático, Rusia, Chile y Nueva Zelanda [110]. Límite legal y métodos de análisis La determinación de las YTXs es compleja debido al gran número de análogos existentes y sus propiedades de solubilidad comunes con otras toxinas lipofílicas. Existen varios métodos para su detección, entre ellos se encuentra el MBA que también en este caso es el método oficial [52]. Este grupo de toxinas también puede ser detectado mediante HPLC-FLD, LC-MS, inmunoensayos y biosensores de resonancia de plasmón superficial (SPR) [108], entre otros. La Unión Europea ha elevado recientemente el límite legal para las YTXs de 1 a 3.75 mg YTX equivalente/ kg de carne de molusco [113], ya que como se ha mencionado, las intoxicaciones en humanos debidas a las YTXs no han sido nunca informadas. 1.1.7. Grupo de los azaspirácidos (AZAs) Los azaspirácidos se identificaron por primera vez en la década de los 90 después de un brote de intoxicación en seres humanos sucedido en los Países Bajos. Fue debido al consumo de mejillones contaminados procedentes de Puerto Killary, Irlanda [114]. Los síntomas que mostraban las personas intoxicadas eran típicos de las toxinas DSP, pero los niveles detectados de DSP estaban muy por debajo del nivel reglamentario. Posteriormente, se estableció que estaban contaminados con una toxina marina única, originalmente llamada "toxina Killary" o KT-3, que más tarde fue renombrada como azaspirácido [115]. Estructura química y análogos El nombre de este grupo de toxinas se debe a que su estructura química está formada por anillos azaspiro de 5 y 6 miembros, uno de ellos unido a un anillo 2,9-dioxobiciclononano y en el otro extremo de la molécula un ácido carboxílico (Figura 8). Los AZAs difieren de 22 INTRODUCCIÓN cualquier otra toxina nitrogenada previamente conocida, ya que poseen disposiciones únicas: una amina cíclica en lugar de un grupo imino cíclico, sin anillo carbocíclico o de lactona [115]. Figura 8. Estructura química de los AZAs y sus análogos más representativos Hasta la fecha, se han identificado más de 30 análogos en fitoplancton y moluscos [116]. De la carne de los mejillones responsables de la intoxicación sucedida en los Países Bajos [114], se consiguió aislar azaspirácido-1 (AZA1). Dos nuevos análogos, azaspirácido-2 (AZA2) y azaspirácido-3 (AZA3), fueron aislados de mejillones recolectados en la Isla de Arranmore en Irlanda en 1997, que causaron un nuevo episodio de intoxicación humana. Estos dos análogos fueron definidos estructuralmente como 8-metilazaspirácido (AZA2) y 22- dimetilazaspirácido (AZA3) [117]. También se consiguió aislar azaspirácido-4 (AZA4) y azaspirácido-5 (AZA5), y se determinaron sus estructuras, 3-hidroxi-22-dimetilazapirácido y 23-hidroxi-22-dimetilazaspirácido, respectivamente [118]. Estudios posteriores revelaron la existencia de más de 20 análogos pertenecientes a este grupo, incluyendo 37-epi-AZAs, dihidroxi-AZAs y carboxi-AZAS en mejillones recolectados durante un evento tóxico en la costa noroeste de Irlanda ocurrido en 2005 [119, 120]. Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación Dada la similitud de la sintomatología provocada por la ingesta de moluscos contaminados con AZAs y con DSPs, los AZAs se clasificaron originalmente junto con las toxinas DSP. Como se ha descrito anteriormente las DSPs son inhibidores de las fosfatasas 23 VERÓNICA REY LÓPEZ (PP1, PP2A), por ello se postuló también como mecanismo de acción más probable de los AZAs, pero varios trabajos han demostrado que no es así [121, 122]. Aunque hasta la fecha el mecanismo de acción de los AZAs permanece todavía desconocido, sí se han descrito algunos de sus efectos: son potentes agentes citotóxicos que causan cambios morfológicos y del citoesqueleto en la actina y proteínas de membrana [122, 123], provocan alteraciones en el flujo de iones en diversos tipos de células [124-126] y actúan como bloqueantes agudos de los canales de potasio cardíacos humanos (hGER) [127]. El consumo de alimentos marinos contaminados por AZAs induce una enfermedad aguda caracterizada por síntomas gastrointestinales, que se manifiestan horas después de la ingestión de las toxinas, además incluye náuseas, vómitos, diarrea severa y calambres en el estómago. Los síntomas pueden persistir durante 2-3 días [128, 129]. Hasta la fecha no se han reportado efectos a largo plazo. Vectores, productores y distribución geográfica Los AZAs fueron detectados tanto en plancton como en agua de mar, pero no fue hasta el año 2007 cuando se descubrió el organismo productor de estas toxinas [130]. Se trata de un pequeño dinoflagelado, que más tarde fue llamado Azadinium spinosum [131], fácilmente destruido en los procedimientos estándar para el análisis de plancton. Se conocen un total de 4 especies capaces de producir AZAs (Azadinium spinosum, Azadinium poporum, Azadinium dexteroporum, Amphidoma languida) [116]. En los últimos años, los AZAs han sido encontrados en moluscos de muchas regiones costeras de Europa occidental, norte de África, y norte y sur de América [116]. Se han documentado un total de 6 casos de intoxicación por consumo de mejillones contaminados con AZAs [117, 132, 133], pero aunque el principal vector sea el mejillón, estas toxinas se han aislado también en otros moluscos bivalvos, además de en algunas especies de crustáceos o en esponjas [116]. Límite legal y métodos de análisis En el caso de los AZAs la UE determinó que el nivel máximo es de 160 µg de AZA1 eq/kg CM [53]. El método de referencia oficial para su detección durante muchos años fue exclusivamente el MBA, pero desde 2011 se reconoce LC-MS/MS como método de 24 INTRODUCCIÓN referencia para la detección de AZAS (AZA1, AZA2 y AZA3) y desde 2014 es el único método oficial [52]. 1.1.8. Grupo de las brevetoxinas (BTXs) Las brevetoxinas son producidas por el dinoflagelado Karenia (K.) brevis, muy común en las aguas del Golfo de Méjico, y es el organismo responsable de las mareas rojas que afectan principalmente a Florida y a Texas. Son las responsables de la muerte masiva de peces, de la mortalidad de mamíferos y, en el ser humano, de la intoxicación neurotóxica por consumo de moluscos y de síntomas similares al asma a través de la ingestión o inhalación de aerosoles [134]. Estructura química y análogos Estructuralmente las BTXs son un grupo de compuestos poliéteres cíclicos liposolubles estables al calor cuyo esqueleto está formado por 10-11 anillos éter con una lactona en uno de sus extremos (Figura 9). Las BTXs se dividen en dos grupos dependiendo de su esqueleto: de tipo A y de tipo B. Las de tipo A poseen 10 éteres cíclicos mientras que las de tipo B tienen 11 éteres cíclicos [135]. Figura 9. Estructura química de la BTX-1 (tipo A) 25 VERÓNICA REY LÓPEZ Se han identificado numerosos análogos y derivados en floraciones y cultivos de K. brevis. Estos compuestos se clasifican en función de las diferencias en su estructura química y se encuentran al menos 10 formas diferentes. Las tres BTXs más abundantes encontradas en las floraciones que tienen lugar en la costa de Florida son la BTX-1 y la BTX-2, y la BTX-3 como producto primario de la reducción de la BTX-2. Cabe destacar que la BTX-2 es la más abundante mientras que la BTX-1 es la más potente [135]. Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación Las BTXs muestran gran afinidad por el sitio 5 en la subunidad α de los canales de sodio dependientes del voltaje (VGSC), causando una cascada de eventos patológicos que eventualmente pueden conducir a la muerte celular [136]. Actúan abriendo los canales, alterando las propiedades de las células excitables y aumentando el flujo de iones Na + en la célula. Este flujo incontrolado de iones Na+ en las células conduce a la despolarización de las membranas celulares de las células neuronales y musculares [135]. En humanos, la intoxicación por BTXs se produce tanto a través del consumo de moluscos que contienen estas toxinas, dando como resultado la intoxicación neurotóxica, como a través de la inhalación de aerosoles oceánicos, lo que provoca complicaciones respiratorias afectando particularmente a pacientes asmáticos. Las toxinas NSP causan una serie de síntomas, tanto neurológicos como gastrointestinales. Los más comunes son: náuseas, vómitos, diarrea, entumecimiento y hormigueo tanto en labios, boca y cara como en las extremidades, pérdida de coordinación general, parálisis parcial de las extremidades, dolor de cabeza, dilatación de las pupilas y fatiga general. Los síntomas gastrointestinales se manifiestan al mismo tiempo que los síntomas neurológicos, siendo estos últimos los que persisten durante más tiempo [137].Aunque en algunos casos de intoxicación ha sido necesaria la hospitalización, no se han reportado hasta la fecha casos de muerte como resultado de intoxicación NSP. La mayoría de los pacientes se recuperan en un plazo de dos o tres días, y no muestran efectos crónicos a largo plazo. En cuanto a la inhalación de aerosoles, estudios recientes sugieren que produce un síndrome caracterizado por problemas respiratorios que incluyen irritación e incomodidad en las vías respiratorias superiores y disminución de la función pulmonar, además de irritación ocular [62]. 26 INTRODUCCIÓN Vectores, productores y distribución geográfica Karenia brevis es el principal dinoflagelado responsable de la producción de las BTXs que aparece de forma natural en el Golfo de México, Mar Caribe y a lo largo de las costas de Nueva Zelanda, Florida y Texas. Las floraciones de numerosas Karenia sp. se han reportado en lugares de todo el mundo, sin embargo hasta ahora no se han encontrado en peces o moluscos de Europa [103]. Límite legal y métodos de análisis Como en los casos anteriores, el MBA se ha empleado tradicionalmente para la detección de toxinas del grupo de las BTXs. Se han desarrollado ensayos in vitro e inmunoensayos como alternativas al MBA, aunque necesitan un mayor desarrollo. Los métodos LC-MS/MS ofrecen una opción muy valiosa para la cuantificación de las BTXs, aunque el principal inconveniente que se encuentra es la falta de materiales de referencia certificados que permitan validar y desarrollar este tipo de métodos [138]. Dado que estas toxinas no se han encontrado en Europa, todavía no se ha establecido ninguna legislación para ellas y tampoco programas de vigilancia. 1.1.9. Grupo de las iminas cíclicas (CIs) Las iminas cíclicas son el grupo de biotoxinas marinas de descubrimiento más reciente. La clave que permitió su identificación fue su toxicidad de acción rápida, induciendo una muerte rápida en el bioensayo de ratones; además se observó un efecto "todo o nada", en donde una inyección intraperitoneal de concentraciones tóxicas que no llegan a ser letales en ratones, no produce secuelas en el animal y éste es capaz de recuperarse por completo [139]. Estructura química y análogos Estructuralmente son compuestos macrocíclicos que contienen grupos imina y grupos éter con uniones tipo espiro en su estructura [140]. Este grupo de toxinas incluye 8 tipos de compuestos producidos por dinoflagelados: espirólidos, gymnodiminas, pinnatoxinas (PnTXs), pteriatoxinas (PtTXs), prorocentrólidos, espiro-prorocentrimina [140, 141], simbioiminas [142] y portiminas [143]. Se consideran todas estas toxinas dentro del mismo grupo de las CIs por dos razones: primero, por su semejanza en la estructura química y 27 VERÓNICA REY LÓPEZ segundo, por su similitud en la toxicidad intraperitoneal en ratones [139]. En la Figura 10 se muestra la estructura química de los SPX-1 y GYM-A que son las toxinas más representativas de los dos subgrupos mayoritarios, SPXs y GYMs, y mejor caracterizados de este grupo de biotoxinas marinas. a) b) Figura 10. Estructura química: a) SPX-1 , b) GYM-A Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación La falta de materiales de referencia ha dificultado las investigaciones sobre el mecanismo de acción de este complejo grupo de toxinas. Son potentes neurotoxinas y hay evidencias de que su acción neurotóxica se basa en la inhibición de los receptores nicotínicos y muscarínicos de acetilcolina en el sistema nervioso central y periférico y en la unión neuromuscular [140]. Vectores, productores y distribución geográfica Los SPXs fueron identificados por primera vez en Nueva Escocia (Canadá) en el año 1995 [144] y desde entonces se han detectado en Norte América y Europa. Además han sido encontrados en marisco, plancton y agua marina en diferentes partes del mundo [145]. Son metabolitos de los dinoflagelados Alexandrium ostenfeldii y Alexandrium peruviamun y se encuentran a menudo en presencia de otras toxinas marinas como las toxinas paralizantes (PSP). Se conocen 12 análogos de este grupo de toxinas siendo 13-desmetil SPX-C, también conocido como SPX-1, la toxina de referencia de este grupo. Son el grupo más grande dentro de las CIs [140]. 28 INTRODUCCIÓN Las GYMs son producidas por el dinoflagelado Karenia selliformis. La estructura inicial fue descubierta en 1995 en Nueva Zelanda [146]. A esta GYM descubierta inicialmente se le denomina GYM-A y se conocen dos análogos más GYM-B y GYM-C. También se han reportado brotes de intoxicación por la GYM-A en Túnez y Australia [140]. Las PnTXs fueron descubiertas por primera vez en extractos de glándulas digestivas de almeja Pinna attenuata después de un brote ocurrido en China y Japón [147]. Este bivalvo, en concreto su músculo aductor, es muy popular como ingrediente de sushi en China y Japón, por lo que las intoxicaciones alimentarias por ingesta de este grupo de toxinas ocurren con frecuencia [140]. Este subgrupo cuenta con 7 análogos (A, B, C, D, E, F y G) y en los últimos años se ha detectado su presencia en moluscos de Europa y Noruega [148]. Las PtTXs fueron aisladas en el año 2001 a partir de la ostra Pteria penguin [149]. Este subgrupo está formado por tres análogos (A, B y C). Aunque este tipo de ostra está ampliamente distribuido no han sido encontradas estas toxinas en Europa todavía, y su presencia se limita exclusivamente a moluscos japoneses [150]. Los prorocentrólidos son el subgrupo de las CIs que presentan mayor tamaño con pesos moleculares alrededor de 1000 Da. Existen dos análogos: prorocentrólido A, aislado en el año 1988 por primera vez a partir del dinoflagelado Prorocentrum lima [151] y prorocentrólido B, aislado posteriormente del dinoflagelado Prorocentrum maculosum [152]. La espiro-prorocentrimina es la única toxina de este subgrupo, no existen análogos conocidos hasta la fecha. Es una toxina polar liposoluble que fue aislada de una cepa bentónica de Prorocentrum spp. en Taiwán [153]. Algunos autores [142, 143] incluyen dentro del grupo de las CIs las simbioiminas y las portiminas. Las simbioiminas son producidas por el dinoflagelado simbiótico Symbiodinium spp., un tipo de zooxantela que se encuentra en una amplia gama de invertebrados marinos y que tienen la capacidad de producir compuestos conocidos como los compuestos de carbono de cadena larga (SCCs) [142]. Las portiminas son otro subgrupo aislado del dinoflagelado bentónico marino Vulcanodinium rugosum recolectado en Nueva Zelanda [143]. Límite legal y métodos de análisis Las CIs no han estado directamente ligadas a intoxicaciones humanas en Europa, pero la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) solicitó más datos de exposición para evaluar adecuadamente el riesgo que las CIs plantean a los consumidores de moluscos [154]. 29 VERÓNICA REY LÓPEZ La falta de datos toxicológicos impide que se fijen límites reglamentarios para estas toxinas y no se establece por ello un método oficial para su detección, aunque sí se han desarrollado métodos como el MBA, LC-MS/MS y ensayos de fluorescencia de polarización para su detección [140]. 1.2. GRUPO DE LA TETRODOTOXINA (TTX) La tetrodotoxina es una neurotoxina asociada históricamente al pez globo. Este pez es considerado una delicatessen en países como Japón, a pesar de su conocido potencial tóxico. Actualmente se sabe que esta toxina no sólo se limita al pez globo, dado que se ha encontrado en gran variedad de especies de peces y otros organismos que incluyen: artrópodos, equinodermos, algas, moluscos, gusanos, tritones, ranas y sapos [155]. En Europa han sido pocos los casos de detección de TTX en moluscos bivalvos pero cada vez están siendo más frecuentes. En el año 2007 en Málaga, se dio un incidente de intoxicación alimentaria resultante de la ingestión de un gasterópodo depredador autóctono de aguas atlánticas y mediterráneas, Charonia lampas lampas, capturado en aguas de sur de Portugal. Aunque el paciente llegó a estar en coma, transcurridas 72 horas los síntomas revirtieron por completo y el hombre se recuperó [156]. Posteriormente, se informó de la presencia de TTX en moluscos bivalvos europeos (mejillones y ostras) cosechados entre el año 2013 y 2014. Se demostró que esta toxina está presente en aguas templadas del Reino Unido, y en los moluscos que se alimentan por filtración. Aunque las concentraciones cuantificadas fueron bajas en comparación con las dosis letales mínimas publicadas para seres humanos, dichos resultados demuestran que existe un riesgo para el consumidor [157]. En 2015 se presentó un estudio que constituye el primer informe sobre la detección de TTX en moluscos bivalvos europeos (mejillones y almejas), donde las muestras analizadas datan del período comprendido entre 2006 y 2012. Estos estudios demuestran la presencia de TTX en moluscos bivalvos en Europa. Aunque los niveles de toxinas encontrados en estas muestras fueron relativamente bajos, no se puede excluir la posibilidad de un aumento en sus concentraciones en un futuro y obviar el riesgo que supone para los consumidores [158]. 30 INTRODUCCIÓN conocido como toxinas GC: este nuevo grupo fue identificado en cepas de Gymnodinium (G.) catenatum aisladas de aguas de la costa de Australia e inicialmente fueron nombradas GC1, GC2 y GC3 basándose en el fitoplancton del cual fueron aisladas [182]. Posteriormente, se descubrieron nuevos análogos de este grupo y se nombraron como GC4, GC5 y GC6 [183]. La toxicidad de estos compuestos no se conoce bien hasta el momento, sin embargo han sido identificadas en cepas de G. catenatum aisladas en Portugal, España, China, Japón y Uruguay [184], quedando así demostrada su extensión a nivel mundial. 37 VERÓNICA REY LÓPEZ Tabla 2. Estructura molecular de los principales análogos de la STX Carbamato R1 R2 R3 R4 STX H H H GTX2 H H OSO ₃ GTX3 H OSO ₃ H neoSTX OH H H GTX1 OH H OSO ₃ GTX4 OH OSO ₃ H N-sulfo-carbamoil GTX5 H H H C1 H H OSO ₃ C2 H OSO ₃ H GTX6 OH H H C3 OH H OSO ₃ C4 OH OSO ₃ H Decarbamoil dcSTX H H H OH¯ dcGTX2 H H OSO ₃ dcGTX3 H OSO ₃ H dcneoSTX OH H H dcGTX1 OH H OSO ₃ dcGTX4 OH OSO ₃ H 13-deoxidecarbamoil doSTX H H H CH3 doGTX2 H OSO ₃ H doGTX3 H H OSO ₃ Hidroxibenzoato GC1 H H OSO ₃ GC2 H OSO ₃ H GC3 H H H GC4 OH H OSO ₃ GC5 OH OSO ₃ H GC6 OH H H 38 INTRODUCCIÓN Mecanismo de acción y síntomas de intoxicación Los canales de sodio dependientes del voltaje son las dianas moleculares de estas neurotoxinas. Las toxinas PSP se consideran agentes de bloqueo que reducen el número de canales de sodio conductores, se unen al sitio 1 de estos canales con alta afinidad, inhibiendo temporalmente la permeabilidad de los iones sodio a los que se unen firmemente (Figura 14). Esto impide que dichos iones pasen a través de las membranas de las células nerviosas, provocando interferencias en la transmisión de señales a lo largo de los nervios. El bloqueo generalizado resultante impide la generación de impulsos en los nervios periféricos y en los músculos esqueléticos [185]. Figura 14. Simulación de la interacción de la STX con los canales de sodio dependientes del voltaje: a) canal de sodio, b) bloqueo del canal de sodio por la STX. Como modelos del canal de sodio se tomó la estructura cristalina NavRh [186] Los síntomas de la intoxicación PSP incluyen: sensación de hormigueo en labios, boca y lengua, entumecimiento de las extremidades, sensación anormal de cosquilleo, calor y frío (parestesia), debilidad muscular, dificultad para coordinar movimientos (ataxia), náuseas, dificultad para respirar, mareos, vómitos, dolor de cabeza, dificultad para tragar (disfagia) y para articular sonidos y palabras (disartria) [174]. También se ha observado hipertensión 39 VERÓNICA REY LÓPEZ sistólica/diastólica en casi todos los pacientes [187]. Los síntomas ocurren generalmente a los 30 minutos de consumir el marisco contaminado, aunque si la concentración de toxina presente en el molusco es lo suficientemente elevada estos síntomas pueden manifestarse a los pocos minutos de la ingestión [188]. Se han reportado casos de muerte por envenenamiento PSP, en un tiempo de 3-4 horas tras el consumo de moluscos contaminados [189]. Es importante señalar que no hay un tratamiento específico para esta intoxicación y tampoco existen antídotos aprobados para el tratamiento en humanos [190]. El tratamiento sintomático durante la fase inicial es crucial para la recuperación posterior del paciente, puesto que la intoxicación PSP es una amenaza de riesgo para la vida; sin embargo, el diagnóstico precoz puede atribuir los síntomas a otras causas como la intoxicación por abuso de drogas, trastornos psiquiátricos o accidentes cerebrovasculares [191, 192]. El tratamiento médico existente consiste en realizar intubación al paciente, evacuación del contenido estomacal y terapia de fluidos para facilitar la excreción de la toxina, además de apoyo respiratorio mediante respiración asistida. El uso de diuréticos y monitorización de los parámetros cardiovasculares es importante, ya que se han encontrado casos de hipertensión y taquicardia [192, 193]. Para los pacientes que logran sobrevivir 24 horas, ya sea con o sin respiración asistida, el pronóstico es considerado bueno [194]. En casos fatales, la muerte se produce por asfixia [174]. Los niveles de toxicidad que han dado lugar a casos de enfermedad y muerte por envenenamiento PSP son muy variables y parecen depender principalmente de las diferencias en la sensibilidad que presenta cada individuo. Desde la implantación de programas de monitoreo en muchos países afectados por eventos tóxicos de toxinas PSP, se han logrado minimizar los riesgos para la salud de los consumidores de moluscos y se han reducido considerablemente los casos de intoxicación y muerte [174]. Vectores, productores y distribución geográfica Las toxinas PSP son producidas por dinoflagelados marinos de los géneros Alexandrium, Pyrodinium y Gymnodinium. Más específicamente, Alexandrium tamarense, Alexandrium fundyense, Alexandrium catenella, Gymnodinium catenatum y Pyrodinium bahamense son los responsables de la mayoría de los casos de intoxicación PSP reportados (Figura 15) [195, 196]. 40 INTRODUCCIÓN Figura 15. Principales productores marinos de toxinas PSP: A) Alexandrium tamarense, B) Alexandrium fundyense, C) Pyrodinium bahamense, D) Alexandrium catenella, E) Pyrodinium bahamense Existen también numerosos informes sobre la producción de estas toxinas por organismos procariotas presentes en aguas dulces (Figura 16), tales como las cianobacterias filamentosas, que incluyen Anabaena circinalis, Aphanizomenon gracile, Cylindrospermopsis raciborskii y Lyngbya wollei [197]. Las floraciones de estas cianobacterias han sido las responsables de casos de intoxicación de poblaciones vivas y de la contaminación de embalses de agua dulce [198]. El subgrupo de toxinas GC de descubrimiento más reciente son producidas por cepas de G. catenatum [184] de naturaleza globalmente extendida. También han sido propuestos como productores de toxinas PSP algunas bacterias: existen estudios donde se demuestra que las bacterias pueden por lo menos desempeñar un papel en la producción de dinoflagelados productores a su vez de estas toxinas [199, 200]. 41 VERÓNICA REY LÓPEZ Figura 16. Principales cianobacterias productoras de toxinas PSP: A) Anabaena circinalis, B) Aphanizomenon gracile, C) Cylindrospermopsis raciborskii, D) Lyngbya wollei La vía tradicional de inserción de las toxinas PSP en la cadena alimentaria implica la ingestión y concentración de dinoflagelados tóxicos por parte de los moluscos que se alimentan por filtración, en particular los bivalvos [195]. La mayoría de los seres humanos que experimentan intoxicación PSP han consumido bivalvos tóxicos [195], pero también ocasionalmente vectores no tradicionales tales como gasterópodos y crustáceos [196], y rara vez han estado implicados peces [201]. Los bivalvos retienen las toxinas PSP durante largos períodos de tiempo, siendo algunas especies capaces de depurar las toxinas rápidamente mientras que otras son más lentas. La mayoría de las especies pueden eliminar las toxinas en semanas [195, 196] mientras que otras como las almejas (S. solidissima, S. gigantea) y las vieiras (P. magellanicus) retienen altos niveles de toxinas durante largos períodos de tiempo, desde meses hasta más de cinco años [202, 203]. Los perfiles de toxina de los bivalvos tóxicos, y por lo tanto el riesgo para el consumidor, varían dependiendo de la especie de dinoflagelado a la que los moluscos estén expuestos, por ejemplo, aquellos bivalvos expuestos a A. tamarense y A. catenella acumulan altos niveles de gonyautoxinas, mientras los que se 42 INTRODUCCIÓN encuentran expuestos a P. bahamense y G. catenatum acumulan niveles muy bajos de este tipo de toxinas [204]. La región geográfica, la estación y la distribución de los componentes tóxicos en los diferentes tejidos también son factores determinantes del perfil tóxico del bivalvo, siendo ésto de vital importancia en el caso de las vieiras puesto que las toxinas se concentran en la glándula digestiva (concretamente en el hepatopáncreas) y no se acumulan fácilmente en su músculo aductor que es la parte consumible, por lo que suelen considerarse seguras para el consumo público incluso en presencia de algas tóxicas [202]. El conocimiento de qué toxinas se depositan en qué tejidos y cómo éstas se transforman dentro del bivalvo y a lo largo de la cadena alimentaria, es crítico para determinar el riesgo de salud pública derivado de su consumo. Se conoce la capacidad de los bivalvos de biotransformar las toxinas N-sulfocarbamoil , que son las menos potentes, en su análogos carbamato más tóxicos [205]. Aunque los moluscos que se alimentan por filtración son los vectores tradicionales de este grupo de toxinas, con mejillones y almejas como dominantes, existe un incremento de vectores considerados no tradicionales. Dentro de este grupo se incluyen gasterópodos marinos (carnívoros y herbívoros) principalmente el caracol y oreja de mar [196, 206], crustáceos como cangrejos y langostas [207] y ciertas especies de peces tales como salmón [208], arenque [209] y caballa [210]. Como se explicó anteriormente, las toxinas PSP también pueden acumularse en ciertas especies de pez globo [155]. Los eventos de toxinas PSP representan un impacto económico para la industria del marisco en todo el mundo, los casos encontrados se presentan en Europa, África, América, Asia y Oceanía [174]. En Australia, Nueva Zelanda y Brasil, las toxinas PSP afectan a aguas potables [190]. 1.3.1. Métodos de análisis Bioensayo El MBA modificado por la AOAC es considerado el método regulatorio en muchos países [26]. El tiempo transcurrido desde la inyección intraperitoneal del extracto ácido de los tejidos de molusco a ratones de 20 g hasta la muerte del animal, es usado en dicho método para estimar la cantidad de toxina presente en los moluscos, con un límite de detección de 40 µg STX eq/ 100 g (Figura 17). A pesar de ser usado en todo el mundo, presenta una serie de desventajas entre las que se incluyen: pobre especificidad, baja sensibilidad, bajo rendimiento 43 VERÓNICA REY LÓPEZ por muestra, un coste considerable, su aplicación requiere de trabajo muy laborioso y presenta alta variabilidad de los resultados [174, 211, 212]. El MBA reporta poca información sobre el perfil de toxinas, aunque es capaz de informar sobre la toxicidad total de la muestra. Todo ésto sumado a las presiones éticas sobre el uso de animales en investigación ha hecho que se planteen métodos analíticos alternativos [213, 214]. Figura 17. Esquema del método MBA, AOAC 2005 Métodos basados en unión a receptor (RBA) Existen numerosos ensayos que actualmente están siendo utilizados para garantizar la seguridad de los moluscos y la salud humana. Los métodos basados en ensayos de unión a 44 INTRODUCCIÓN receptores se desarrollan usando dianas biológicas de las toxinas marinas. El primer método basado en esta técnica se desarrolló a principios de los 90 [215]; después de un refinamiento extensivo fue aceptado como método oficial de análisis por la AOAC en 2011 [216]. Este ensayo es altamente específico, dado que aprovecha la interacción de las toxinas con sus receptores, como los canales de sodio. Previo a la aceptación de este método por la AOAC, varios estudios habían demostrado la posibilidad de usar RBA para detectar toxinas PSP en matrices de interés como el plasma humano [217] y extractos de mejillón [215]. El rendimiento y la eficiencia en el análisis de las muestras habían sido mejorados [218], y los resultados obtenidos mostraban gran concordancia con el MBA. Una reducción del tiempo de ensayo a 4 horas y la introducción de nuevas matrices como algas, zooplancton y fluidos humanos fueron otros de los avances conseguidos; además la correlación de los resultados con los obtenidos por HPLC en extractos de alga, orina humana y muestras de suero fue muy alta [219]. Todas estas mejoras pusieron de manifiesto la capacidad de RBA de proporcionar estimaciones precisas de la toxicidad global de las muestras, obteniendo resultados que concordaban bien con los demás métodos establecidos para el análisis de las PSP en moluscos [174]. Sin embargo, la principal limitación para su implementación fue la necesidad de utilizar materiales radioactivos marcados (3H-STX). Este material además de ser escaso, también hace difícil para algunos laboratorios el poder cumplir los requerimientos necesarios para la ejecución de dichos ensayos [174]. Ensayo por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) Los ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas son un tipo de ensayo bioquímico que utiliza anticuerpos que se unen al analito de interés. Se han establecido una serie de ensayos para la saxitoxina y varios de sus análogos que pueden desarrollarse como ensayos competitivos o directos, con anticuerpos policlonales y monoclonales [220]. Como la técnica ELISA ha sido bien desarrollada a lo largo de los años, están disponibles varios kits comerciales que ofrecen importantes ventajas, como su fácil uso y alto rendimiento [174]. Se encontró una buena correlación entre ELISA y MBA en algunos estudios [221, 222] pero no existe unanimidad [223]. Como ya se ha explicado, el perfil de toxinas puede llegar a ser complicado, por lo que una de las preocupaciones con esta técnica es la reactividad cruzada dentro de los diferentes derivados, que se da cuando un mismo anticuerpo es capaz de reconocer distintos analitos presentes en la muestra. No se considera un obstáculo si la 45 VERÓNICA REY LÓPEZ reactividad cruzada se correlaciona con la toxicidad, por ejemplo las toxinas C tienen baja reactividad cruzada, pero también baja toxicidad, y por lo tanto el resultados del ensayo puede indicarnos la toxicidad real. Sin embargo, este no es el caso de las variantes altamente tóxicas como GTX1, GTX4 y NEO que exhiben pobre reactividad cruzada en algunos ensayos [224]. Además, el número de falsos positivos encontrados con esta técnica es muy elevado. Debido a estas preocupaciones, se recomienda que los métodos ELISA se utilicen como herramientas de detección en lugar de como ensayos de cuantificación [225]. Resonancia de plasmón superficial (SPR) La resonancia de plasmón superficial ha sido ampliamente utilizada en investigación biomédica y en la industria. Esta técnica ha sido evaluada para la detección e investigación de toxinas de pequeño peso molecular. Se ha desarrollado un método con SPR en el año 2007 para detectar toxinas PSP usando la unión a anticuerpos de tipo inhibidor [226]. El rendimiento de este ensayo en muestras reales sugirió que esta tecnología podría ser útil como un ensayo de detección para este grupo de toxinas. Posteriormente se llevó a cabo un estudio de validación [227] donde se mostró que el método presentaba altas correlaciones en los resultados obtenidos del análisis de muestras reales, en comparación con los métodos de la AOAC: MBA y HPLC. Entre las ventajas de esta técnica se encuentran: la preparación de la muestra no es tan laboriosa como en otros métodos, no requiere ninguna identificación de los componentes que interactúan, las interacciones se miden en tiempo real con un tiempo de análisis de minutos, por lo tanto la velocidad de análisis y los bajos costes del biosensor lo hacen muy adecuado para la detección de toxinas [174]. Sin embargo, el desarrollo de esta técnica se ha centrado en pruebas con moluscos y los límites de detección todavía no son adecuados para la detección de toxinas PSP en agua potable. Además, cuando se utilizan anticuerpos, las mismas preocupaciones con respecto a la reactividad cruzada que limitan la utilidad de los métodos ELISA también se aplican a esta tecnología [225]. Todas estas técnicas descritas no permiten estudiar el perfil tóxico y pueden aparecer problemas al analizar muestras muy complejas; es por ello que se han desarrollado métodos analíticos que permiten la separación de los distintos análogos, haciendo así que puedan ser identificados y cuantificados. Por lo tanto, estos métodos ofrecen la ventaja de dar a conocer el perfil tóxico de las muestras además de su toxicidad total. 46 INTRODUCCIÓN previos publicados hasta ese momento [257, 258], supuso un punto de inflexión en el uso de esta técnica para la detección de toxinas PSP. Diener y col. llevaron a cabo un nuevo estudio sobre HILIC en el año 2007 [259]. Con esta nueva modificación del método la separación de varios análogos era mejor que la que se mostraba en el método publicado por Dell'Aversano y col. [256]. Además, también consiguieron tiempos de retención más estables para todas las toxinas en varias matrices como mejillones y algas (Alexandrium catenella). Aunque los autores sugirieron que era viable su aplicación en análisis rutinarios, era necesario todavía un tiempo de 40 minutos para la detección de estas toxinas. Ésto dificultó su implementación en programas de control rutinarios, que requieren resultados en tiempos de análisis cortos. Otros autores han reportado diferentes métodos HILIC-MS/MS para la detección de toxinas PSP, aunque la sensibilidad, recuperación de los analitos, y la estabilidad de los tiempos de retención eran los principales problemas que se encontraron debido al efecto significativo que tiene la matriz [174]. El gran número de picos que interfieren en los cromatogramas cuando los extractos son analizados con LC-MS/MS, sugirió la necesidad de llevar a cabo un proceso de limpieza de las muestras previo a su análisis, con el fin de eliminar las sales o los picos que interfieren en la identificación de las toxinas. Varios autores han investigado diferentes procesos de limpieza de muestras, tales como la extracción en fase sólida (SPE) [260, 261]. Recientemente se ha propuesto un nuevo proceso de limpieza de las muestras basado en el uso de cartuchos de carbono grafitizado (PGC) (Figura 20), que mostró muy buenos resultados en términos de sensibilidad, selectividad y rapidez para el análisis de las toxinas PSP en gran variedad de muestras [262]. 53 VERÓNICA REY LÓPEZ Figura 20. Diagrama del proceso de limpieza mediante SPE de carbono grafitizado [262] A la vista de los avances logrados en los últimos años, esta área de investigación se está expandiendo rápidamente y promete ser una herramienta efectiva para la detección de toxinas PSP [174], puesto que su mayor ventaja es que los métodos LC-MS/MS son métodos confirmatorios. 54 2. OBJETIVOS OBJETIVOS 2. OBJETIVOS Debido al incremento tanto en intensidad como en frecuencia de las floraciones de algas nocivas, se han establecido programas de monitorización de toxinas marinas en las costas de todo el mundo. Para ello es necesario disponer de métodos que permitan la cuantificación de dichas toxinas, que sean rápidos, eficaces, que garanticen bajos límites de detección y sobre todo que sean capaces de proteger la salud de los consumidores. Por lo tanto el objetivo de la presente Tesis Doctoral es por una parte estudiar los métodos existentes para la detección de toxinas PSP y proponer mejoras, y por otra parte proporcionar métodos alternativos que resuelvan las carencias de los métodos ya existentes. Los objetivos específicos son: 1. Estudiar la influencia de diferentes matrices reales de moluscos, equinodermos y gasterópodos en la separación de las toxinas PSP, cuando se utiliza como método de análisis el método PCOX y optimizar dicho método para las matrices estudiadas. 2. Evaluar los métodos cromatográficos con detección fluorimétrica validados por la AOAC, con derivatización pre-columna y post-columna, en la identificación y cuantificación de toxinas PSP. 3. Poner a punto un método de cromatografía líquida con detección fluorimétrica y oxidación post-columna, empleando una columna de carbón grafitizado poroso, para el análisis simultáneo de toxinas PSP y TTX. 4. Poner a punto un método LC-MS/MS para el análisis de toxinas PSP y TTXs, utilizando una columna de carbón grafitizado poroso. 56 3.PUBLICACIONES PUBLICACIONES 58 3. PUBLICACIONES Esta sección recoge la metodología empleada en la realización de los experimentos, los resultados obtenidos durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral y las discusiones correspondientes a cada bloque de resultados. El conjunto de datos se encuentra recogido en cinco artículos. Para su presentación se subdividen en un primer bloque correspondiente a las mejoras en los procedimientos de detección y cuantificación para el análisis de toxinas PSP; y un segundo bloque que recoge los resultados en la innovación de los procedimientos de detección y cuantificación en el análisis de toxinas PSP y TTXs, simultáneamente. 3.1. BLOQUE I: MEJORA EN LOS PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS DE TOXINAS PSP. Artículo 1. Influence of different shellfish matrices on the separation of PSP toxins using a postcolumn oxidation liquid chromatography method. Verónica Rey, Amparo Alfonso, Luis M. Botana y Ana M. Botana. Publicado el 15 de abril de 2015 en Toxins 7(4):1324-40, doi:10.3390/toxins7041324. En este artículo se estudió la separación de las PSP empleando para su análisis el método PCOX. Se estudiaron diferentes matrices reales de molusco (mejillón, vieira, almeja y ostra). La separación de las toxinas PSP depende de varios factores, y es crucial tener en cuenta la presencia de picos de matriz interferentes para llevar a cabo una buena separación y una correcta identificación. Los picos de matriz no siempre son iguales, lo que es una cuestión importante cuando se trata de obtener resultados buenos y fiables con respecto a la resolución y a la información sobre toxicidad. Se propuso que la separación debería realizarse considerando el tipo de matriz, ya que la concentración de heptano sulfonato en los disolventes que componen la fase móvil debe variar en relación a la matriz que se vaya a analizar, para conseguir una adecuada separación. Las matrices de vieira y ostra necesitan una VERÓNICA REY LÓPEZ 59 disminución en la concentración de heptano sulfonato para separar GTX4 de los picos de matriz que eluyen al inicio, con una concentración de 6.5 mM para el disolvente A y 6.25 mM para el disolvente B. La matriz de ostra también presentó problemas de interferencias para la dcGTX3, que se logró resolver con esta disminución del par iónico en la fase móvil. En el caso de las matrices de mejillón y almeja, los picos interferentes no son tan grandes como lo son en el otro grupo, pero aún así se observó la necesidad de hacer cambios en la composición de la fase móvil con respecto a lo descrito en el método PCOX. Por ello la concentración de heptano sulfonato fue de 8.25 mM para ambos disolventes, lo que supone una disminución con respecto al método original. Se observó que estas interferencias, debidas a componentes fluorescentes naturales de los bivalvos, dependen de: las especies, lugar de muestreo y fecha de recogida. En el caso de las vieiras y las ostras, tanto el tamaño como la cantidad de interferencias debidas a la matriz no sólo dependen del lugar de muestreo sino también de la fecha de recogida así como de las especies; para mejillones y almejas, sólo se observan diferencias cuando el lugar de muestreo varía. Se analizaron varias muestras reales aplicando estas modificaciones para verificar que los cambios propuestos fueran efectivos en muestras de diferentes especies, diferente origen y fecha de muestreo; y los resultados demostraron que las modificaciones funcionan en todos los casos. Artículo 2. Determination of gonyautoxin-4 in echinoderms and gastropod matrices by conversion to neosaxitoxin using 2-mercaptoethanol and post-column oxidation liquid chromatography with fluorescence detection. Verónica Rey, Marisa Silva, Ana Botana, Vitor Vasconcelos y Luis Botana. Publicado el 30 de diciembre de 2016 en Toxins 8(1):1-11; doi:10.3390/toxins8010011. Este trabajo explora la aplicabilidad del método de cromatografía líquida con detección por fluorescencia y oxidación post-columna (PCOX), para el análisis de diferentes matrices consideradas como vectores no tradicionales de las PSP: gasterópodos, equinodermos, crustáceos y peces. El método PCOX, utilizado rutinariamente en nuestro laboratorio, ha demostrado ser un método fiable para el seguimiento de toxinas paralizantes en especies de mejillón, vieira, ostra y almeja. Sin embargo, como se había observado en estudios previos PUBLICACIONES 60 con matrices de vieira y ostra, debido a su alta sensibilidad, puede haber compuestos naturales fluorescentes que coeluyen con GTX4 lo que daría como resultado identificaciones erróneas. Esto ocurrió tanto en el caso de las muestras de equinodermos como en las muestras de gasterópodos que se analizaron. Para superar este reto se aprovechó la capacidad que el compuesto 2-mercaptoetanol tiene para transformar las toxinas GTX (1-4) en su forma reducida STX o NEO: en este trabajo se optimizó la reacción de transformación de GTX1 y GTX4 a NEO mediante el empleo de 2-mercaptoetanol. Se presenta un método nuevo, con una buena recuperación (82.2%, RSD=1.1%, n=3) y que ahorrará tiempo ya que solamente requiere una etapa de reacción. Las muestras que eran sospechosas de contener GTX4 y/o interferencias fluorescentes naturales fueron sometidas a esta reacción de reducción, sirviendo para confirmar la presencia de GTX4 y permitiendo su cuantificación. Artículo 3. Quantification of PSP toxins in toxic shellfish matrices using postcolumn oxidation liquid chromatography and pre-column oxidation liquid chromatography methods suggests post-column oxidation liquid chromatography as a good monitoring method of choice. Verónica Rey, Luis M. Botana y Ana M. Botana. Publicado el 13 de febrero de 2017 en Toxicon 129:28-35; doi. 10.1016/j.toxicon.2017.02.003. En este trabajo se analizaron diferentes muestras de molusco mediante cromatografía líquida con oxidación pre- y post-columna con detección por fluorescencia (PreCOX y PCOX respectivamente), para comparar los perfiles de toxinas obtenidos con cada uno de los métodos oficiales de la AOAC y estudiar el grado de acuerdo entre ambos en las matrices estudiadas. Entre las especies de molusco incluídas en este estudio se encuentran algunas para las cuales los métodos no habían sido validados inicialmente: almeja Donax sp, vieira Aropecten sp. y almeja navaja Ensis sp. Fueron analizadas un total de 24 muestras. Los resultados obtenidos por PreCOX y PCOX, el coeficiente lineal de correlación (r2=0.94) y el test t por parejas (dos colas, α= 0.05), indicaron que no existen diferencias significativas entre ambos conjuntos de datos. Sin embargo, se encontraron diferencias importantes relacionadas con los perfiles de toxinas: en 16 de las 24 muestras las diferencias entre ambos métodos fueron mayores del 20%; fue notable la diferencia en los resultados para las gonyautoxinas 1 VERÓNICA REY LÓPEZ 61 y 4 y decarbomoylgonyautoxinas 2 y 3, debido a una sobreestimación del método precolumna. Se observó que el método PCOX es una buena herramienta para la identificación de las toxinas del grupo C (C1-4) ya que no se encontraron interferencias de matriz y es capaz de separar cada uno de los isómeros en un tiempo de 24 minutos. Fue necesario modificar las condiciones de elución en el método post-columna para evitar la interferencia de los picos de matriz a tiempos de retención cercanos a los tiempos de retención de los estándares, principalmente cuando se trabajó con matrices de vieira. Para las demás matrices estudiadas la identificación se llevó a cabo sin problemas de interferencias y la interpretación de los resultados resultó ser sencilla. Una vez optimizado el método PCOX para el análisis de las matrices de interés, resultó ser un buen método para su uso rutinario en programas de monitoreo de dichas matrices. 3.2. BLOQUE II: INNOVACIÓN EN LOS PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS DE TOXINAS PSP Artículo 4. Liquid chromatography with a fluorimetric detection method for analysis of paralytic shellfish toxins and tetrodotoxin based on a porous graphitic carbon column. Verónica Rey, Ana M. Botana, Mercedes Álvarez, Álvaro Antelo y Luis M. Botana. Publicado el 28 de junio de 2016 en Toxins 8(7):196-212; doi:10.3390/toxins8070196. Este artículo presenta el desarrollo y la validación del método de cromatografía líquida con derivatización post-columna y detección por fluorescencia aplicable a las PSP en muestras de molusco, basado en la utilización de una nueva fase estacionaria de carbono grafitizado poroso. Las toxinas PSP tradicionalmente han sido analizadas por cromatografía líquida con derivatización tanto precomo post-columna y siempre con fase estacionaria a base de sílice. Esta técnica dio lugar a diferentes métodos que necesitan más de una ejecución para analizar las toxinas. En este trabajo se consigue la separación de 13 PSP en un único análisis siendo necesario para ello un tiempo de 37 minutos, lo que reduce considerablemente PUBLICACIONES 62 el tiempo de análisis con respecto al método PCOX e incluye la capacidad de separar dcNEO, algo que el método citado sólo consigue si se lleva a cabo una ejecución de 75 minutos. También se optimizó el proceso de limpieza de las muestras, incluyendo una extracción en fase sólida con cartuchos SPE Hypersep Hypercarb®. Este nuevo proceso dio muy buenos resultados, puesto que en las matrices estudiadas consiguió eliminar cualquier interferencia natural fluorescente y los resultados de recuperación de las toxinas fueron satisfactorios. El método se ensayó en cuatro matrices de moluscos: mejillón (Mytillus galloprovincialis), almeja (Pecten maximus), vieira (Ruditapes decussatus) y ostra (Ostrae edulis). Se proporcionaron los resultados para todos los parámetros estudiados y se mejoraron los límites de detección para la mayoría de toxinas con respecto a los métodos de cromatografía líquida previos: los valores más bajos fueron los de dcGTX2 y GTX2 en mejillón (0.0001 mg STX · diHCl kg-1 para cada toxina), dcSTX en almeja (0.0003 mg STX · diHCl kg-1), C1 y C2 en vieira (0.0001 mg STX · diHCl kg-1 para cada toxina) y dcSTX (0.0003 mg STX · diHCl kg-1) en ostra; GTX2 mostró el límite de detección más alto en ostra (0.0366 mg STX · diHCl kg-1). Además de todo lo anterior, al haber sido recientemente encontrada la tetrodotoxina en bivalvos en lugares del norte de Europa debido al cambio climático, y puesto que sus signos de toxicidad son similares en el bioensayo a los de las PSP, es importante analizarlas conjuntamente y poseer métodos analíticos que sean capaces de distinguir ambos grupos de toxinas. En este artículo se propone también por ello una modificación del método para el análisis simultáneo de las PSP y la TTX, con algunos pequeños cambios en el gradiente de la fase móvil, aunque el límite de detección obtenido para la TTX no permite su uso en la actualidad con fines regulatorios. Artículo 5. Rapid analysis of Paralytic Shellfish Toxins and Tetrodotoxins by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry using a porous graphitic carbon column. Verónica Rey, Ana M. Botana, Álvaro Antelo, Mercedes Álvarez, Luis M. Botana. Sometido a Food Chemistry. En este estudio se describe un nuevo método LC-MS/MS basado en el uso de una columna de carbono grafizitado poroso que posee la capacidad de discriminar entre la mayoría de las PSP, tanto hidrófilas como hidrófobas, TTX y su análogo 4,9 anhTTX, siendo PUBLICACIONES 69 Artículo 4. Liquid chromatography with a fluorimetric detection method for analysis of paralytic shellfish toxins and tetrodotoxin based on a porous graphitic carbon column. Verónica Rey, Ana M. Botana, Mercedes Álvarez, Álvaro Antelo y Luis M. Botana. Publicado en 2016 en Toxins 8(7):196-212; doi:10.3390/toxins8070196. http://www.mdpi.com/2072-6651/8/7/196/pdf VERÓNICA REY LÓPEZ 70 Artículo 5. Rapid analysis of Paralytic Shellfish Toxins and Tetrodotoxins by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry using a porous graphitic carbon column. Verónica Rey, Ana M. Botana, Álvaro Antelo, Mercedes Álvarez, Luis M. Botana. Sometido a Food Chemistry. PUBLICACIONES 71 Rapid analysis of Paralytic Shellfish Toxins and Tetrodotoxins by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry using a porous graphitic carbon column Veronica Reya, Ana M. Botanaa,*, Alvaro Antelob, Mercedes Alvarezb, Luis M. Botanac,* aAnalytical Chemistry Department, Faculty of Sciences, University of Santiago de Compostela, Lugo 27002, Spain bCIFGA S.A., Plaza de Santo Domingo 20-5ª, Lugo 27001, Spain; [email protected]; [email protected] cPharmacology Department, Veterinary Faculty, University of Santiago de Compostela, Lugo 27002, Spain *Corresponding author: Ana M. Botana. Dpt. of Analytical Chemistry, Science Faculty, University of Santiago de Compostela, 27002 Lugo, Spain.Phone:+34-982-824-071,E- mail:anam[email protected]. Luis M. Botana. Dpt. of Pharmacology, Veterinary Faculty, University of Santiago de Compostela, 27002 Lugo, Spain. Phone: +34-982-822-233, Fax no.: +34-982-824-001, E- mail: luis.bo[email protected]. Abstract Although paralytic shellfish toxins (PSTs) have been traditionally analyzed by liquid chromatography with either pre- or post-column derivatization and they have been successfully validated through inter-laboratory validation studies, mass spectrometry methods have also been described in literature to be used in monitoring programs. Liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) detection methods need to be improved in terms of method sensitivity, analyte recovery and retention time stability because of undesirable matrix effects. Furthermore tetrodotoxin (TTX) has been found in bivalves of northern Europe, so it is important to analyze TTX compounds along with PSTs because their signs of toxicity are similar in the bioassay. It is the first time that a chemical method allows the determination of PSTs, both hydrophilic and hydrophobic, alongside TTX and its analogue 4,9-anhydro tetrodotoxin (4,9-anhTTX) by LC-MS/MS using a Hypercarb® column. It was possible to validate the method for 13 hydrophilic PSTs, TTXs and to discriminate 6 hydrophobic PSTs, named as GCs, in 20 minutes. The method was developed for four shellfish matrices: mussel (Mytillus galloprovincialis), clam (Ruditapes decussatus), VERÓNICA REY LÓPEZ 72 scallop (Pecten maximus) and oyster (Ostrae edulis). The clean-up procedure used in this work allowed us to obtain good results for the validation parameters in case of PSTs and TTXs. No standard is available up to now for the validation of GCs. It was possible to reduce considerably the matrix effect with the clean-up procedure employed in this work and so the validation parameters were good in terms of repeatability, detection and quantification limits, and analyte recovery. Keywords Mussel; Clam; Scallop; Oyster; PSTs; GCs; TTXs; Hypercarb; LC-MS/MS 1. Introduction Paralytic shellfish poisoning (PSP) is a common seafood toxicity problem with worldwide distribution. Toxic dinoflagellates are ingested and concentrated by filter-feeding mollusks and then paralytic shellfish toxins (PSTs) get into the food web. Although these mollusks are the traditional pathway for the presence of these toxins, mainly in mussels and clams, they are not the only vectors and there are increasing reports about other sources, such as marine gastropods, crustaceans, and certain fish [Deeds, 2008]. The most prevalent paralytic shellfish toxins (PSTs) can be divided into three families based on structural differences in their functional groups: the carbamate family includes saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO) and the gonyautoxins (GTX1-4); the decarbamoyl family includes decarbamoyl-gonyautoxins (dcGTX1-dcGTX4) and decarbamoyl-saxitoxins (dcSTX, dcNEO); the N-sulfocarbamoyl toxins include GTX5, GTX6 (also called B1 and B2, respectively) and C toxins (C1-4). A novel group of PSTs were identified in strains of Gymnodinium catenatum [Negri, 2007] found in Australian, Chinese, Portuguese, Uruguayan and Spanish waters. They are a new family of PSTs containing a hydroxybenzoate side-chain and named as GC toxins(GC1-6). The official regulatory method for determining PSTs in shellfish in most countries is the mouse bioassay [AOAC, 2005]. This method gives quantitative information about the toxicity of samples. It is calculated from the time of death in replicate mice injected with acidic extracts of shellfish. It has several limitations, particularly related to ethical concerns with the use of live animals, and so there have been great efforts to establish alternative methods. They include receptor binding assay (RBA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and PUBLICACIONES 73 surface plasmon resonance (SPR). In addition to these assays, there are also analytical methods to separate individual toxin congeners which can then be identified and quantified [Etheridge, 2010]. High performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD) methods are the chemical methods successfully validated for PSTs. They were validated through inter-laboratory validation studies [Lawrence, 2005;Van de Riet, 2010]. As the STX analogues do not contain a chromophore, they have to be oxidized before detection. This derivatization is performed with either pre- or post-column oxidation. The pre-column method [Lawrence, 2005], also called the Lawrence method, was accepted as an alternative for PSTs detection in shellfish samples. It is being used for regulatory purposes in the European Union (EU) [Anon, 2006]. The post-column method (PCOX) [Van de Riet, 2010] was accepted by the Association of Official Analytical Chemists (AOAC) in 2011 as an alternative method for PSTs [AOAC, 2011], when it was validated through a inter-laboratory validation study. This study was undertaken for mussels, clams, oysters and scallops. There are advantages and disadvantages with both methods [DeGrasse, 2011;Rourke, 2008], so the right choice should rather be done with regard to the monitoring environment where the method is used. Mass spectrometry methods have also been described in literature [Dell’Aversano, 2005; Diener, 2007; Jaime, 2001] for the analysis of PSTs in shellfish monitoring programs. Dell'Aversano et al. [Dell’Aversano, 2005] improved liquid chromatography with mass spectrometry (LC-MS) detection capabilities, by establishing a method based on hydrophilic interaction liquid chromatography. It was more sensitive than those of previous studies. In 2007, Diener et al. [Diener, 2007] published a new LC-MS/MS method that used a zwitterionic (ZIC) hydrophilic interaction chromatography (HILIC) column for the separation of the three groups of PSTs in a single chromatographic run. Other authors have reported different HILIC-MS/MS methods for the determination of PSTs, although method sensitivity, analyte recovery, and retention time stability are compromised due to significant matrix effects [Turrell, 2008]. The high number of interfering peaks in the chromatograms when shellfish extracts are analyzed with LC-MS/MS suggests that an extensive sample clean-up is needed in order to remove either salts or such interfering peaks. Some authors have investigated different types of clean-up procedures such as solid phase extraction (SPE) [Turrell, 2008; Sayfritz, 2008]. More recently, Boundy et al. [Boundy, 2015] proposed a new sample clean-up procedure based on the use of graphitized carbon SPE cartridges that VERÓNICA REY LÓPEZ 74 eliminated matrix interferences, followed by HILIC-MS/MS analysis. This allowed a sensitive, selective and rapid analysis of PSTs from a variety of samples and this method has been subjected to single-laboratory validation and is being used for regulatory testing in New Zealand [Turner, 2015]. On the other side, although tetrodotoxin (TTX) does not belong to the family of PSTs it has the same toxicity symptoms as them [Bane, 2014] and the co-ocurrence of both TTX and PSTs was reported [Shiu, 2003]. The mouse bioassay was used in several cases to establish their toxicity, but their presence in seafood might be misdiagnosed because they block sodium channels similarly to STX [Wingerd, 2012]. LC-MS and LC-MS/MS have been generally the best choice to analyze TTX and its related compounds [Bane, 2014]. In addition to the ability of porous graphitic carbon in the sample clean-up procedure, it was recently published the analysis of PSTs and TTX using a HPLC-FLD post-column method with a porous graphitized column [Rey, 2016]. This column has very powerful properties related to separation performance and robustness; moreover in this work samples clean-up was also made with graphitized carbon SPE cartridges, showing good ability to remove matrix interferences. In this study we describe a new LC-MS/MS method based on the use of a LC porous graphitized column coupled to a mass spectrometry equipment. It has the capability to discriminate the majority of PSTs, both hydrophilic and hydrophobic, TTX and its analogue 4,9-anhydro tetrodotoxin (4,9-anhTTX). The previously developed clean-up procedure with SPE porous graphite cartridges was also tested in order to check the ability of it when bivalve samples were analyzed by LC-MS/MS [Rey, 2016]. 2. Materials and methods 2.1 Chemicals HPLC grade methanol and acetonitrile, analytical reagent grade trifluoroacetic acid (TFA), dichloromethane, tetrahydrofuran, propionic acid, 2-propanol and ammonium acetate were all from Panreac Química S.A. (Barcelona, Spain). Trichloroacetic acid (TCA) and triethylamine were purchased from Sigma Aldrich (Madrid, Spain). HPLC grade water was used to prepare reagent solutions. Certified reference materials provided by Cifga S.A. (www.cifga.es, Lugo, Spain) were: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO), decarbamoylsaxitoxin (dcSTX), gonyautoxin 5 PUBLICACIONES 75 (GTX5), gonyautoxins 1 and 4 (GTX1,4), gonyautoxins 2 and 3 (GTX2,3), decarbamoylgonyautoxins 2 and 3 (dcGTX2,3), N-sulfocarbamoyl-gonyautoxins 2 and 3 (C1,2), tetrodotoxin (TTX) and 4,9-anhydrotetrodotoxin (4,9-anhTTX). Decarbamoylneosaxitoxin (dcNEO) was obtained from NRC (Halifax, Nova Scotia, Canada). Decarbamoylgonyautoxins 1 and 4 (dcGTX1,4) were obtained by hydrolysis under basic pH from GTX1,4 certified reference material. N-sulfocarbamoyl-gonyautoxins 1 and 4 (C3,4), gonyautoxin 6 (GTX6) and hydroxybenzoate toxins (GCs) were obtained from strains of Gymnodinium catenatum provided by Cifga S. A. Commercial toxin-free shellfish samples of mussel (Mytillus galloprovincialis), clam (Ruditapes decussatus), scallop (Pecten maximus) and oyster (Ostrae edulis) were used. 2.2. Instrumentation The HPLC equipment consisted of an Alliance 2695 Separation Module (Waters, Barcelona, Spain) provided with: a quaternary pumps system, an autoinjector with refrigerated rack, degasser, column oven and system controller. A post-column system 515 HPLC pump from Waters was used. This system was coupled to a triple quadrupole mass spectrometer Quattro MicroTM API equipped with an electrospray (ESI) source (Waters, Barcelona, Spain). The separation and identification of toxins was achieved in a Hypercarb® column (i.d. 2.1 mm x 100 mm, particle size 3 µm) from Thermo (Fisher Scientific, Madrid, Spain). 2.3. Samples extraction and clean-up Samples were extracted according to the official procedure for PSTs described in the PCOX method [AOAC, 2011]: 5 g of shellfish homogenate were extracted with 5 mL of 0.1M HCl. The mixture was mixed using a vortex mixer; the pH was adjusted between 2 and 4, preferably 3. When necessary the pH was adjusted by adding dropwise either 5 M HCl or 0.1 M NaOH. The sample mixture was placed into a boiling water bath for 5 min and then cooled down to room temperature. The pH was checked back and adjusted to 3, if necessary. The mixture was centrifuged at 3.000 x g for 10 min, and the supernatant was decanted. The samples clean-up procedure was that described in literature [Rey, 2016]: 500 µL of the supernatant solution were deproteinated by adding 25 µL 30% (w/v) TCA, mixed in a vortex mixer and centrifuged at 16.000 x g for 5 min; 40 µL of 1.0 M NaOH were then added, mixed and centrifuged again at 16.000 x g for 5 min [AOAC, 2011]. VERÓNICA REY LÓPEZ 76 After that, a dichloromethane extraction was made: 500 µL of dichloromethane were added to a deproteinated sample, mixed in a vortex and the aqueous and organic phases separated by gravity. The aqueous phase was cleansed using a Hypersep Hypercarb® SPE cartridge (200 mg, 3 mL) of porous graphitic carbon (PGC) (Thermo Fisher Scientific, Madrid, Spain): 500 µL of sample extract were loaded onto the conditioned cartridges and washed with 11 mL of 0.1 M ammonium acetate. The cartridges were previously conditioned with 3 mL of dichloromethane/methanol 80/20 (v/v), followed by 3 mL of methanol and 3 mL of 0.1 M ammonium acetate. Toxins were eluted with 500 µL of 0.1 M citrate buffer (pH= 4.0) in 10% acetonitrile (v/v) [Rey, 2016]. 2.4. Matrix effect evaluation The possible interferences caused by the compounds present in the matrices under study were investigated: mussel, clam, scallop and oyster extracts were used to establish interferences in LC-MS/MS. The standards were diluted in the four types of extracts and chromatographic separation was carried out. The chromatographic conditions were those optimized and described in this study (see "Methods" section). Matrix effects were calculated according to the following equation, for each toxin and in each matrix: % ME = [[(A + B) -B]/A] *100 being % ME = percentage of matrix effect, A = area of the toxin standard, B = area of shellfish extract and A + B = area of shellfish extract spiked with the toxin standard. A value of ME= 1 means that there is no matrix effect; if ME is higher than 1 it means that the ionization has been enhanced, therefore it shows the presence of a positive matrix effect; if ME is less than 1 it means that there has been ionic suppression and so the presence of a negative matrix effect [Rossignoli, 2015]. To calculate the matrix effect, different assays were performed to accomplish the clean-up procedure: 1) shellfish extracts were deproteinated by adding TCA and filtered through a 0.2 µm syringe filter as described in PCOX method [AOAC, 2011]; 2) shellfish extracts were deproteinated by adding TCA and the extract was purified using a Hypersep Hypercarb® (PGC) SPE cartridge as previously described (see "Samples extraction and clean-up" section); 3) extracts were deproteinated by adding TCA, then extracted with dichloromethane and PUBLICACIONES 77 purified using a Hypersep Hypercarb® (PGC) SPE cartridge as previously described (see "Samples extraction and clean-up" section). Table 1 shows the percent data of the matrix effect for each clean-up procedure. 2.5. Methods An Alliance 2695 Separation Module coupled to a Quattro Micro mass spectrometer equipped with an ESI source was used for sample analysis. The HPLC system was equipped with a Hypercarb® column (i.d. 2.1 mm x 100 mm, particle size 3 µm) inside a column oven at 25 °C; the injection volume was 10 µL (partial loop with needle overfill mode). Mobile phase composition was: 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid in water for solvent A, solvent B was acetonitrile and solvent C was water. The flow rate was set at 0.250 mL min-1. The gradient conditions for PSTs and TTX are summarized in Table 1S. A post-column solution composed by propionic acid/2-propanol 75/25 (v/v) was mixed with the LC eluent through a tee-union, before reaching the electrospray capillary; the flow rate of the post-column solution was 0.075 mL min-1. The Quattro Micro mass spectrometer operated with the following optimized source-dependent parameters (ESI source): capillary voltage 2.7 kV, desolvation temperature 500 °C, desolvation gas flow 850 L/h N2, cone gas flow 30 L/h N2, source temperature 150 °C, collision Argon pressure 3x10-3 mbar. The cone voltages and collision energies were optimised for each toxin by standard infusion. MassLynx 4.1 with QuanLynx software (Waters, Manchester, UK) was used for data processing. Figure 1 shows the ion chromatogram obtained for the separation of PSTs, both hydrophilic and hydrophobic, together with TTX and 4,9-anhTTX. The mass spectrometer operated in MRM (multiple reaction monitoring), detecting in positive mode, and analyzed two product ions per PST and TTX (Table 2): one for quantification (the most abundant) and another for confirmation. Collision energies, cone voltages and dwell times were optimised for maximum sensitivity. 2.6. Validation parameters 2.6.1 Linearity Linearity was calculated by injecting each PST and TTX standard at different concentrations in solvent, calculating the peak areas of the toxins. Equations and the correlation coefficient VERÓNICA REY LÓPEZ 78 (r) for each toxin were obtained by mathematical treatment of analysis data for each compound at different concentrations as shown in Table 2S [Martin-Smith, 1990]. 2.6.2 LODs and LOQs Limits of detection (LODs) for matrix-free toxins were determined from the data for samples extrapolated to a signal to noise ratio of 3. Five blank replicate extracts for each matrix (mussel, clam, scallop and oyster) were analyzed and repeated over 6 days (n=30). The results are expressed as µg STX diHCl eq kg-1 where the toxicity equivalent factors (TEF) were taken from Oshima [Oshima, 1995 #20],in case of PSTs; for TTX and its analogue the results were expressed in µg kg-1. Limits of quantification (LOQs) were determined multiplying LODs by a factor of 3 [Alder, 2000]. Table 3 shows LODs and LOQs for PSTs and TTXs in the four matrices under study. 2.6.3 Repeatability Repeatability was calculated for each matrix at 3 different concentration levels: 200 µg STX·diHCl kg-1, 800 µg STX·diHCl kg-1 and 1.600 µg STX·diHCl kg-1, in case of PSTs; 3.225 µg g-1, 0.806 µg g-1 and 0.202 µg g-1, for TTX; 0.375 µg g-1, 0.094 µg g-1 and 0.023 µg g-1, for 4,9-anhTTX. Six replicates were analyzed and repeated over 8 days (n= 48), for each matrix at each concentration level. Relative standard deviation percentages (%RSD) were calculated (Table 4). 2.6.4 Recovery It was verified by measuring the recovery at a known concentration level of spiked blank samples; six replicates were made for each of the four matrices under study. At the concentration level of spiked blank samples, six replicates were made for each of the four matrices under study. The concentrations and recovery results are summarized in Table 5. 3. Results and discussion 3.1 Optimized chromatography and MS/MS method The percentage of TFA has a significant influence on the retention time of PSTs, TTX and its analogue, reducing polar retention because it can act as a competitive modifier. Therefore, the first step was to select the right concentration of TFA in the mobile phase: different PUBLICACIONES 85 AOAC. (2011). Official method 2011.02. Determination of Paralytic Shellfish Poisoning Toxins in mussels, clams, oysters and scallops. Post-column oxidation method (PCOX). First action 2011. . In A. International (Ed.), Official Methods of Analysis ). Gaithersburg, MD, USA. Bane, V., Lehane, M., Dikshit, M., O'Riordan, A., & Furey, A. (2014). Tetrodotoxin: Chemistry, toxicity, source, distribution and detection. Toxins, 6(2), 693-755. Boundy, M. J., Selwood, A. I., Harwood, D. T., McNabb, P. S., & Turner, A. D. (2015). 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Este problema sólo era conocido en muestras de vieiras [251, 268], en las cuales se suponía que los componentes de los extractos de estos moluscos eluían en esa región y perturbaban el equilibrio cromatográfico de los componentes. Para paliar este efecto se sugirieron, en trabajos previos, cambios en la composición de los disolventes de la fase móvil [268]. Las condiciones descritas en esos trabajos funcionaron en nuestro caso para las muestras de mejillón y almeja pero no para vieira y ostra, donde las interferencias son mayores y variables dependiendo tanto de la zona como de la fecha de muestreo. No todas las toxinas PSP muestran la misma toxicidad: en el caso de la GTX4 su alta toxicidad con respecto a la STX [229] da como resultado un efecto significativo sobre la toxicidad total de la muestra, lo que hace crítico obtener una buena separación de esta toxina con cualquier pico de interferencia. En el caso de la ostra se vio que también existían interferencias con dcGTX3, por lo tanto fue necesario ajustar la fase móvil en función de la especie que se pretendía analizar. Estos resultados reafirman lo descrito por algunos autores [239], que sugieren la necesidad de validar los métodos analíticos, o por lo menos verificar su rendimiento, para cada una de las especies de interés. En el caso concreto del método oficial PCOX que fue inicialmente validado para vieira (Placopectic magellanicus) y ostra (Crassotrea virginicus) previamente a su implementación, se requieren validaciones adicionales en otras especies de vieiras y ostras. Además, la importancia de pruebas completas con los métodos HPLC-FLD en muestras locales con variabilidad temporal y espacial es fundamental debido a la influencia que muestra la matriz, tanto en la separación cromatográfica como en la recuperación de las propias toxinas. En Europa la gran mayoría de las intoxicaciones humanas atribuidas a mariscos contaminados con biotoxinas marinas se han relacionado con moluscos bivalvos vivos, ya que es así como se comercializan y en algunos casos también se consumen. El número de toxinas marinas a ensayar se ha actualizado a lo largo de los años. Los métodos de ensayo también se actualizaron para incluir métodos analíticos como alternativas o reemplazando al MBA. No obstante, no se ha llevado a cabo una revisión de los grupos de animales que actúan como VERÓNICA REY LÓPEZ 102 vectores de toxinas marinas, manteniéndose sin cambios desde las directivas establecidas en el año 2004 [53, 269]. El aumento del consumo de pescados y mariscos y la búsqueda de nuevos recursos pesqueros o de acuicultura para satisfacer la creciente demanda de estos productos, puede estar exponiendo a las poblaciones de la UE a nuevos vectores de toxinas no controlados regularmente. Existe un aumento en la producción y captura de especies para las cuales los actuales programas de monitoreo no han sido adecuadamente diseñados. Para vectores no bivalvos no se han establecido, hasta la fecha, detalles específicos sobre los planes de muestreo. Este grupo incluye animales que se alimentan por filtración, otros son herbívoros, mientras existen grupos que se alimentan de otros bivalvos entre otras presas [270]; por ello resulta complicado establecer un plan de muestreo para este grupo, pues habría que tener en cuenta las diferentes estrategias de alimentación de estos organismos. Los métodos europeos de referencia para la determinación de biotoxinas se desarrollaron y optimizaron para moluscos bivalvos. En este sentido, parte de la investigación realizada en el presente trabajo se centró en la aplicación del método PCOX para la identificación de toxinas PSP en matrices consideradas no tradicionales, en este caso equinodermos y gasterópodos. La producción o captura de equinodermos y tunicados en la UE es residual en comparación con pescados y otros mariscos. Sin embargo como respuesta al comercio mundial, en particular al mercado asiático, se ha mostrado un gran interés en la UE en la explotación de estos recursos marinos [270]. La comercialización de gasterópodos y crustáceos marinos ha ido en aumento en los últimos años [271]. Según informes de la FAO [271] la pesca de crustáceos superó la producción de moluscos bivalvos en la UE durante los últimos años, y la pesca de gasterópodos marinos ha aumentado sustancialmente, hasta llegar a duplicarse en las dos últimas décadas. A la vista del creciente interés por parte de los consumidores en estas nuevas especies, toma especial importancia evaluar la exposición de los consumidores a las biotoxinas marinas a través de estos nuevos vectores, y para ello ajustar los métodos de referencia existentes para estas nuevas matrices. Debido a la alta sensibilidad que presenta el método PCOX a las interferencias fluorescentes naturales de la matriz cuando se trabaja con matrices no tradicionales, se propuso un método rápido, fácil y económico para confirmar la presencia de GTX4 en estas especies, puesto que se observó que coeluye con picos de matriz. PCOX, como se mencionó anteriormente, requiere del uso de extractos de matriz libres de toxinas, pero en el caso de los DISCUSIÓN 103 organismos de interés no estaban disponibles. Se propuso por ello un nuevo método de transformación de GTX1,4 en NEO que se basa en la capacidad de los reactivos tiol para reducir las toxinas GTXs a STX o NEO, basándose en lo descrito en trabajos previos [272, 273]. Aunque los resultados de conversión no fueron tan altos como se esperaba (90% [273]), sí se logró un alto porcentaje de conversión (82.2%) que permite confirmar la presencia de GTX4 en las muestras y cuantificarla. Además la reacción de transformación se simplificó a un solo paso, lo que supone un importante ahorro de tiempo en el procesamiento de la muestra. Los métodos analíticos son capaces de separar los isómeros de forma individual, pudiendo así identificarlos y cuantificarlos. Esta ventaja es importante, como ya se ha mencionado, debido a que no todos los análogos de la STX presentan la misma toxicidad, y el perfil de estas toxinas en las muestras es diferente del perfil de toxinas de los dinoflagelados de los que proceden, puesto que los moluscos producen conversiones durante la metabolización de estos analitos. Para el grupo de las PSP la técnica HPLC con detección por fluorescencia es hoy en día la más establecida. Tanto el método HPLC-FLD con oxidación pre-columna como el método con oxidación post-columna, proporcionan mayor sensibilidad cuando se comparan con el MBA y ambos generan un valioso cálculo del perfil tóxico de las muestras, no disponible previamente a través del uso sólo del MBA. En la presente Tesis Doctoral se llevó a cabo un estudio comparativo entre el método oficial PreCOX y el método PCOX. Para ello se analizaron diferentes muestras pertenecientes a distintas especies, empleando ambos métodos con el fin de obtener un perfil de toxinas de cada una de las muestras y tener información fiable sobre el grado de concordancia entre los resultados de ambos, para las matrices que se emplearon en dicho estudio. Aunque el método PreCOX cumple con los criterios de seguridad del MBA tiene varios inconvenientes, bien conocidos por la comunidad científica, cuando se aplica en un ámbito rutinario y legal [240, 255]. Es por ello que a pesar de que esta técnica ha sido establecida como herramienta regulatoria, incluso con esta aprobación es improbable que muchos laboratorios la implanten debido a: sus limitaciones de tiempo, costes de instrumentación y la necesidad de disponer de científicos especializados en el análisis de muestras e interpretación de los resultados debido a los múltiples productos de oxidación que se obtienen para cada toxina (Tabla 3 de la introducción ). El método PCOX ofrece una serie de ventajas con respecto al método de VERÓNICA REY LÓPEZ 104 oxidación pre-columna (Tabla 4): el proceso de preparación de las muestras para su posterior análisis es mucho más simple y menos laborioso, tiene la capacidad de separar todos los isómeros lo que implica que la toxicidad total de la muestra es más exacta cuando se usa este método, la cromatografía es más simple puesto que no existen múltiples productos de oxidación como en el caso de PreCOX, la respuesta rápida en muestras que contienen toxinas y la sensibilidad del método es mejor que la de los dos métodos oficiales, MBA y PreCOX. En cuanto a los inconvenientes que presenta cabe resaltar: son necesarias dos columnas cromatográficas para el análisis de todas las toxinas, el tiempo de análisis inicial es de 24 minutos frente a los 15 minutos de PreCOX, algo que es importante cuando se analizan muestras que no contienen toxinas (Fig. 18 de la introducción); es muy laborioso analizar las muestras sin oxidar puesto que es necesario cambiar los reactivos post-columna y quizá la desventaja más importante es que no es capaz de identificar y cuantificar GTX6 y dcNEO para las cuales sí existen en estos momentos estándares comerciales disponibles [240]. Tabla 4. Resumen de los requerimientos y dificultades para la implementación de los dos métodos HPLC-FLD para la detección de toxinas PSP en moluscos PreCOX PCOX Nº columnas LC 1 columna con excelente vida útil 2 columnas con vida útil corta Preparación de la muestra Muy laboriosa Sencilla y rápida Tiempo de análisis completo 30 min + 45 min = 75 min 24 min x 2 = 48 min Nº de análogos 16 análogos 14 análogos (excluye dcNEO y GTX6) Separación de epímeros No Sí Cromatografía Compleja Sencilla Interpretación de los resultados Difícil y es necesaria mucha práctica Dificultad intermedia Correlación con MBA Buena Buena Hasta la fecha se han publicado un buen número de estudios donde se comparan ambos métodos oficiales, MBA y PreCOX [239]; sin embargo, son menos los que contrastan el DISCUSIÓN 105 nuevo método PCOX con PreCOX [230, 240]. Los datos que se obtuvieron en este trabajo demuestran que existe buena correlación entre los resultados generados por ambos métodos. Tras el análisis estadístico de los resultados obtenidos tampoco se encontraron diferencias significativas entre los datos, lo que concuerda con los trabajos previamente publicados [230, 240]. Sin embargo, tras el estudio del perfil de toxinas generados por cada uno de los métodos sí se observaron diferencias en las cantidades de algunas toxinas, este es el caso de GTX1,4 y dcGTX2,3, lo que implica que la toxicidad total de la muestra sea diferente dependiendo del método analítico empleado dada la gran contribución de estos análogos. Debido a que estas toxinas no son fácilmente cuantificables por PreCOX, algo ya resaltado por algunos investigadores [274], los resultados se consideraron poco fiables dada la sobreestimación existente al no separar pares de epímeros; PCOX reportó resultados de toxicidad más precisos en términos de perfil tóxico y cuantificación de toxicidad. La técnica de HPLC-FLD presenta un desafío importante debido a que es posible que los compuestos naturales fluorescentes de las muestras puedan interferir con la identificación de las toxinas, como ya se ha informado [275]. Se observó que las muestras de vieira empleadas en este estudio presentaban interferencias de matriz importantes tras el análisis por ambos métodos, ésto impedía la identificación de algunos analitos, por lo que se tuvieron que aplicar modificaciones en los procesos tanto de extracción como de elución para solventar estas dificultades. Esto demuestra que es crucial verificar el rendimiento de cada método con las especies de interés. Aunque PreCOX demuestra ser más robusto y la vida útil de la columna cromatográfica es excelente, las importantes ventajas de PCOX afirman que su uso como método de identificación y cuantificación de las PSP en las muestras estudiadas es una buena opción. Sin embargo, se recomienda que la elección entre ambos métodos HPLC-FLD debe ser hecha en el contexto del objetivo del trabajo, disponibilidad de la instrumentación necesaria y tanto disponibilidad como habilidad del analista, puesto que en ambos casos es necesario un adecuado entrenamiento. A pesar de que estos métodos basados en HPLC-FLD se están utilizando hoy en día en diferentes laboratorios a lo largo de todo el mundo para pruebas oficiales de control, existe todavía margen para un mayor desarrollo y mejora de la eficiencia en ambos casos. En el caso concreto de PCOX, aunque tiene importantes ventajas, existen una serie de mejoras que la VERÓNICA REY LÓPEZ 106 comunidad científica está demandando [239]. En los trabajos de validación del método [250, 251], los autores afirman que pueden llegar a realizarse 600 inyecciones antes de que se llegue a detectar un deterioro significativo en el funcionamiento de la columna cromatográfica. Sin embargo, se ha observado en el trabajo desarrollado en esta Tesis que tanto la edad como el estado de la columna tienen gran impacto en la resolución y ello se debe a que las condiciones de trabajo que se emplean en el método no son las ideales para el tipo de columnas que se utilizan, lo que provoca un acortamiento en la vida útil de las mismas. Además se vio que el hecho de que se almacene una columna y luego se recupere para analizar muestras o estándares, hace que en algunos casos la columna ya no funcione en absoluto, incluso si la cantidad de inyecciones no es muy alta en el momento en el que fue almacenada. Esto pone de manifiesto la necesidad de proponer nuevas columnas que proporcionen una mayor vida útil y que además mejoren la eficacia de la separación, puesto que algunas toxinas no se resuelven completamente: este es el caso de GTX5 que sólo se resuelve un 50% de la línea base y dcSTX y STX que presentan una resolución del 70% de una en relación a la otra [230]. Por otra parte, debido a los importantes avances en el campo de desarrollo de estándares analíticos para las biotoxinas marinas, un requisito claro es la extensión del método PCOX para la identificación y cuantificación de dcNEO. Esta toxina no se incluyó inicialmente en el método debido a su coelución con NEO bajo las condiciones de elución descritas. Es posible sin embargo resolver dcNEO y NEO modificando el gradiente, pero el tiempo requerido para ello sería de 75 minutos [251]. Aunque desde el punto de vista regulatorio, esto no es considerado un problema importante ya que la toxicidad de dcNEO es menor que la de NEO y en el peor de los casos se haría una ligera sobreestimación de la toxicidad total de la muestra, sí sería interesante conseguir incluir este analito dentro del rango de toxinas detectables por PCOX. Serían especialmente bienvenidos métodos HPLC-FLD más rápidos, puesto que para la identificación de todas las toxinas para las que PCOX se encuentra validado son necesarios dos análisis de 24 minutos aproximadamente, lo que supone un tiempo total de 48 minutos. En vista de las carencias que presenta PCOX, en la presente Tesis Doctoral se describe un nuevo método HPLC-FLD con oxidación post-columna. Este método está basado en el uso de una nueva columna Hypercarb®, cuya fase estacionaria está compuesta por carbono DISCUSIÓN 107 grafitizado poroso, y que es capaz de separar 13 análogos del grupo de las PSP en tan sólo 37 minutos. Este nuevo relleno de columna presenta unas propiedades únicas como fase estacionaria, que lo distinguen de los rellenos convencionales de las columna cromatográficas. Proporciona tanto una retención como una separación adecuada para compuestos polares, tiene la capacidad de separar isómeros y otros compuestos estrechamente relacionados y es estable en todo el rango de pH por lo que permite el uso de fases móviles agresivas [276]. Además este tipo de columnas ofrecen la posibilidad de ser regeneradas, lo que hace que se consiga devolver la columna a las condiciones iniciales. Fueron posibles aproximadamente 6.000 inyecciones, lo que supone 10 veces más de lo que permiten las columnas PCOX y no se observaron problemas tras su almacenamiento. Se separaron e identificaron 13 toxinas PSP correctamente en el estudio, incluyendo dcNEO; todas mostraron una resolución del 100% con respecto a la línea base y el tiempo de análisis necesario para ello se acortó a 37 minutos, lo que supone una mejora importante con el método de la AOAC [252]. Para la mayoría de las toxinas los valores de LOD y LOQ obtenidos se mejoraron con respecto a los reportados en los métodos pre- y post-columna publicados anteriormente [253, 267]; además, los resultados obtenidos en este método suponen una mejora importante tanto en el tiempo de análisis como en los parámetros de validación, en relación a los resultados generados en la optimización que se realiza en esta Tesis para el método de PCOX [277] (Tabla 5), con la excepción de GTX5 y C1 para las cuales con el nuevo método se obtuvieron resultados ligeramente superiores. Aun así, este nuevo método propuesto muestra buena capacidad de detección y cuantificación para fines regulatorios. VERÓNICA REY LÓPEZ 108 Tabla 5. LODs y LOQs (mg STX•diHCl/kg)obtenidos para mejillón con ambos métodos en nuestro laboratorio PCOX MÉTODO HPLC-FLD PROPUESTO LOD LOQ LOD LOQ dcNEO 0.0045 0.0070 dcSTX 0.0047 0.0141 0.0004 0.0007 dcGTX3 0.0071 0.0213 0.0006 0.0019 STX 0.0100 0.0300 0.0044 0.0055 NEO 0.0239 0.0717 0.0093 0.0163 GTX5 0.0011 0.0033 0.0027 0.0099 dcGTX2 0.0210 0.0630 0.0001 0.0003 GTX3 0.0055 0.0165 0.0012 0.0113 GTX4 0.0183 0.0549 0.0015 0.0059 GTX1 0.0642 0.1926 0.0037 0.0117 C2 0.0011 0.0033 0.0003 0.0007 GTX2 0.0099 0.0297 0.0001 0.0038 C1 0.0001 0.0003 0.0002 0.0005 Conocido el impacto que la matriz de los distintos moluscos tiene en la eficacia de la separación cromatográfica y los problemas que genera en la identificación de las toxinas [239], se hicieron diversos intentos para minimizar los efectos de la matriz: se ensayaron diferentes procedimientos de extracción, utilizando filtros de corte por peso molecular y tanto diferentes cartuchos de fase reversa como de intercambio iónico; sin embargo no se consiguió eliminar el efecto de la matriz. Finalmente se desarrolló un proceso de limpieza de las muestras basado en el empleo de cartuchos SPE de PGC que permite eliminar cualquier interferencia cromatográfica y simplifica considerablemente la interpretación de los resultados, evitando así falsos positivos o una cuantificación errónea de las toxinas, aunque para la eliminación completa de la matriz fue necesario realizar una desproteinización de la muestra seguida de la extracción con diclorometano, previos a la limpieza con cartuchos (Figura 21). En esta secuencia de pasos, se consiguió eliminar cualquier tipo de interferencia en las especies de moluscos utilizadas en el estudio. DISCUSIÓN 109 Figura 21. Diagrama del proceso de extracción y limpieza de las muestras de moluscos Por otra parte y dado que en la última década la TTX ha sido encontrada en diferentes especies en las costas europeas [157, 158, 278], aunque se ha asociado esta toxina históricamente a aguas tropicales, varios investigadores han formulado la teoría de la migración Lessepsiana [155], para explicar la reciente aparición de TTX en regiones europeas. Esta migración se ha producido debido a la apertura del Canal de Suez en el año 1869 que ha beneficiado la invasión del Mar Mediterráneo por parte de especies procedentes del Mar Rojo; además el aumento de la temperatura de las aguas costeras como resultado del cambio climático, ha ayudado a que estas especies marinas típicas de aguas tropicales y subtropicales se adapten a aguas menos cálidas. De hecho, ya se han descrito casos de intoxicaciones debidas a la ingesta de TTX en las costas europeas [156, 279], lo que pone de manifiesto la existencia de nuevos riesgos sobre la seguridad alimentaria. Hoy en día aquellas intoxicaciones que antes se diferenciaban por el área geográfica en la que sucedían, son más difíciles de distinguir. Esto sumado a que la TTX y las PSP producen los mismos efectos tóxicos y que en las especies que eran características de contener PSP se esté detectando TTX, VERÓNICA REY LÓPEZ 110 hace que las intoxicaciones debidas a TTX puedan ser erróneamente atribuidas a PSP. Además, en el caso de la TTX aún no se han establecido límites reglamentarios y no hay un método oficial para su detección. Debido a estas razones, es importante la existencia de métodos capaces de identificar y distinguir ambos grupos de biotoxinas marinas. El MBA ha sido muy usado pero no es completamente satisfactorio porque no tiene la capacidad de distinguir entre TTX y las PSP [155]. Algunos autores [280, 281] evidenciaron la capacidad del método de Oshima [229] de detectar simultáneamente ambos grupos de toxinas, pero al igual que ocurre con las PSP, no son analizadas en una sola inyección. El método HPLC-FLD con oxidación post-columna y columna de carbono grafitizado poroso presentado en este trabajo, es capaz de detectar e identificar TTX junto con 13 análogos del grupo de las PSP en un sólo análisis. La única modificación que requiere es un ligero cambio en las condiciones del gradiente inicialmente descrito para separar las toxinas PSP, debido al solapamiento entre dcNEO y TTX. Se consiguió una separación cromatográfica buena de todas las toxinas y de este modo se ofrece la posibilidad de identificar correctamente TTX con respecto a las PSP (Tabla 6). Los valores de LOD y LOQ obtenidos en este trabajo para la TTX se consideran demasiado altos si se comparan con la técnica LC-MS/MS [155]. Esto es debido a que no se emplearon las longitudes ni de excitación ni de emisión idóneas para esta toxina sino que se trabajó en el rango adecuado para las toxinas PSP, pero pese a esta desventaja el método HPLC-FLD presentado es el primero que permite la detección de ambos grupos de toxinas en un sólo análisis. BIBLIOGRAFÍA 117 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Gago-Martínez, A.I., I. Ruppén, and J. Hungerford, Biotoxinas marinas, in Toxicología Alimentaria, A. Cameán and M. Repetto, Editors. 2006, Ed. Díaz de Santos: Madrid. p. 141-172. 2. Oliveira, M.M., A.S. Camanho, and M.B. Gaspar, The phycotoxins' impact on the revenue of the Portuguese artisanal dredge fleet. Marine Policy, 2014. 52: p. 45-51. 3. Sournia, A., M.J. Chretiennot-Dinet, and M. Ricard, Marine phytoplankton: how many species in the world ocean? J Plankton Res, 1991. 13: p. 6. 4. 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