Regulación de la secreción gástrica de ghrelina, acción hormonal, control neuroendocrino y desarrollo postnatal

Universidad de Santiago de Compostela Regulación de la secreción gástrica de ghrelina, acción hormonal, control neuroendocrino y desarrollo postnatal Laboratorio de Endocrinología Molecular Departamento de Fisiología Facultad de Medicina Omar Al-Massadi Iglesias Diciembre 2009 El profesor Felipe Casanueva Freijo Catedrático del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela y la Doctora Luisa María Seoane Camino, Investigadora Carlos III-SERGAS Certifican: Que la presente Tesis Doctoral titulada: “Regulación de la secreción gástrica de ghrelina, acción hormonal, control neuroendocrino y desarrollo postnatal” que presenta Omar Al-Massadi Iglesias ha sido realizada bajo su dirección en el Laboratorio de Endocrinología Molecular en la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor en Biología. Y para que conste, firmamos la presente autorización en Santiago de Compostela, a 1 de Diciembre de 2009. Fdo: Felipe Casanueva Freijo Fdo: Luisa María Seoane Camino Fdo: Omar Al-Massadi Iglesias Agradecimientos AGRADECIMIENTOS A Felipe Casanueva por su acertada dirección a lo largo de estos años y por seguir los experimentos de cerca a pesar de estar extremadamente ocupado. A Sisi sin la que esta tesis no habría sido posible, por sus enseñanzas, afecto y comprensión. A María Pardo ejemplo de trabajo bien hecho y dedicación constante, por su cordialidad y amistad. A Turo y Uxía un soplo de aire fresco en este laboratorio por su innegable compañerismo, a los que les deseo y auguro un gran futuro. A Sihara y Esther mis compañeras de desayunos de la facultad y de laboratorio en tiempos pasados, por hacer que las mañanas y los tiempos muertos no sean tan pesados. A Jana todo energía y disposición por su impagable ayuda en la presentación y maquetación de esta tesis. A Laura y Andrea que esperemos vuelvan pronto con nosotros y sobre todo a Ceci por su personalidad, profesionalidad y apoyo en esta nueva etapa en los laboratorios del hospital. Al resto de personas que forman parte del laboratorio: Jesús, Yola, Ana Belén, María Amil, Carlos, María Lodeiro, Mary, Ana Castro, Maribel, Manuel Bande, Miriam y Lucia. A todo el personal de los laboratorios del IDIS por su camaradería. Agradecimientos A la gente de Fisio por hacer que me sintiese estos años como en mi casa escaleras arriba y sin los que los congresos no hubieran sido lo mismo, especialmente al grupo de Carlos Diéguez y Clara Álvarez: Chus, Rucha, Gloria, María, Susana Bravo, Susana Sangiao, Marta, Paqui, Richi, Luis, Marisol, Katia y Adenis. También agradecer la simpatía de Roberto y Patricia. Al grupo de la profesora Rosa Señaris, a Luz y Sonia por ayudarme a acabar mis experimentos y a Marta Liliana por no perder nunca esa sonrisa. A Luis Lima responsable de la instalación radiactiva y del animalario que más de una vez me sacó de un apuro. A Uberto Pagotto experto en cannabinoides que también participó en la finalización de algunos experimentos. Al personal del animalario que tanto trabajo les di en estos últimos años: Ramiro, José Luis, Bernardo, Nardo y Chema. A mis amigos del gaviota: Oscar, Rosa, Fer, Cris, Lois, Lucía, Lucía Rilo, Marcos, Hishan, Manuel, María, Sofía, y Rita por enseñarme que con poco se puede hacer mucho y por su amistad desinteresada, en especial a Eberto y Marco confidentes y aliados nocturnos. A Inés y Pili por todas esas agradables veladas y por saber escuchar en los momentos de agobio. A Silvia y Luis por ser fuente de ánimo, vitalidad y humor constante. Mención especial a quien me sirve el desayuno en la cafetería, Iria y Luis y a quien tantas veces me dio de comer, Vanesa y Rudy a todos les agradezco su calidad humana. A la Fundación IDI-CHUS y al CIBERobn (Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición CB(O6/03)) por el apoyo en la realización de este trabajo. Agradecimientos A mi familia por ser un apoyo constante durante toda mi vida y a la que nunca le podré agradecer todo lo que hacen por mí, sobre todo a mis padres. Por último a mi querida Susana con la que he pasado los mejores momentos de mi vida. Sin ti no soy nada. Índice Índice: Introducción......................................................................................................................1 1. Ghrelina gástrica.........................................................................................................2 2. Receptor de secretagogos de GH ...............................................................................3 3. Estructura de la ghrelina.............................................................................................4 4. Ghrelin O-acyl transferasa..........................................................................................5 5. Funciones principales de ghrelina ..............................................................................8 5.1 Liberación de GH .................................................................................................8 5.2 Acciones orexigénicas..........................................................................................9 6. Otras funciones de ghrelina.......................................................................................12 7. Regulación de la secreción de ghrelina .....................................................................13 7.1 Efecto de insulina y de glucosa sobre la secreción de ghrelina...........................15 7.2 Efecto de somatostatina sobre la secreción de ghrelina ......................................16 7.3 Efecto de hormona de crecimiento sobre la secreción de ghrelina......................18 7.4 Efecto de IGF-1 sobre la secreción de ghrelina...................................................19 7.5 Efecto de los estrógenos sobre la secreción de ghrelina......................................20 7.6 Efecto de la testosterona sobre la secreción de ghrelina .....................................21 7.7 Regulación de los niveles de ghrelina con la edad.............................................22 8. Subproductos del gen de ghrelina...............................................................................24 8.1 Obestatina............................................................................................................24 8.1.1 ¿GPR-39, Receptor de obestatina?............................................................25 8.1.2 Funciones principales de obestatina..........................................................26 8.1.2.1 Acciones anorexigénicas ...............................................................26 8.1.2.2 Regulación del balance energético y motilidad.............................27 8.1.2.3 Secreción hormonal.......................................................................27 8.1.2.4 Proliferación celular y apoptosis ...................................................28 8.2 Desacilghrelina.....................................................................................................28 9. El estómago ................................................................................................................30 9.1 Estructura..............................................................................................................31 9.1.1 Glándulas....................................................................................................31 9.2 Control gástrico ....................................................................................................32 9.2.1 Control neural del estómago. Sistema nervioso entérico ..........................33 9.2.2 Control hormonal del estómago .................................................................34 Objetivos.........................................................................................................................39 Resultados.......................................................................................................................43 Discusión .......................................................................................................................89 Conclusiones.................................................................................................................105 Anexo ...........................................................................................................................109 Bibliografía...................................................................................................................115 Introducción 2 Este hallazgo se confirmó tras el clonaje por el grupo de Howard de un receptor específico para secretagogos de GH (GHS-R) distinto del receptor de GHRH (Howard AD et al 1996). Figura 1: Receptor de secretagogos de GH (Modificada de Kojima M et al 2005). 1. Ghrelina gástrica: La ghrelina fue originalmente aislada en el estómago, esta hormona se encuentra en el fundus gástrico, en la llamada glándula oxíntica (la zona del estómago que secreta ácido). Existen un gran número de células endocrinas en este órgano, el 20% de estas células endocrinas expresan ARNm de ghrelina. Las células que contienen ghrelina son equivalentes a aquellas previamente conocidas como células X/A (Date Y et al 2000a). Existen dos tipos de células productoras de ghrelina, las células cerradas y las células abiertas que están en contacto con el lumen (Sakata I et al 2002a). En las células productoras de ghrelina, la desacilghrelina o ghrelina no acilada está principalmente localizada en el perinúcleo, mientras que la ghrelina acilada está localizada principalmente en la periferia del citoplasma. Está aceptado que las células endocrinas abiertas productoras de ghrelina en el tracto gastrointestinal están principalmente reguladas por señales relacionadas con el contenido luminal, mientras que las células cerradas productoras de ghrelina reciben modulación por hormonas, estimulación neuronal y distensión mecánica (Solcia E et al 2000). Introducción 3 En humanos se ha descrito así mismo un descenso de un 65% en los niveles circulantes de ghrelina en pacientes sometidos a una gastrectomía (Ariyasu H et al 2001, Pekic S et al 2006, Popovic V et al 2005), hecho que ocurre también en roedores (Dornonville dlC et al 2001). Esto sugiere que la mucosa oxíntica es la mayor fuente de producción de ghrelina del organismo aunque se ha encontrado también producción de ghrelina a menor escala en el intestino delgado (Hosoda H et al 2000a). 2. Receptor de secretagogos de GH: El receptor de ghrelina se expresa en un único gen localizado en la región cromosómica 3q26.2. Se producen dos tipos de ADN complementario a partir del ARNm del GHS-R como resultado del procesamiento alternativo de su gen, lo que da lugar a dos subtipos del receptor, tipo 1a y tipo 1b. El GHS-R1a está compuesto por 366 aa, presenta siete dominios transmembrana y tiene un peso molecular de 41 KDa, mientras que el GHS-R1b está compuesto por 289 aa con solo cinco dominios transmembrana (Howard AD et al 1996, Mc Kee KK et al 1997a). El receptor de ghrelina tipo 1a es activado tanto por ghrelina como por secretagogos de GH, sin embargo el tipo b no es activado por ninguno de estos compuestos, y además no está claro que sea un receptor funcional (Smith RG et al 1997, Howard AD et al 1996, Smith RG et al 2001, Mc Kee KK et al 1997a, Gnanapaban S et al 2002). Figura 2: Gen del receptor de secretagogos de GH (Modificada de Smith RG et al 2005). Introducción 4 Existen evidencias de la expresión de GHS-R1a a nivel central, tanto en hipófisis como en hipotálamo (Smith RG et al 1997, Gnanapavan S et al 2002) esta localización es consistente con distintas funciones centrales atribuidas a la ghrelina como el control del apetito, el balance energético y la liberación de GH. Se ha encontrado expresión de este receptor en otras áreas del SNC que afectan a los ritmos biológicos como conciencia, memoria y aprendizaje (Van Der Lely AJ et al 2004), así como en múltiples órganos periféricos como estómago, intestino, páncreas, tiroides, gónadas, glándula adrenal, corazón y en varias líneas celulares tumorales (Gnanapavan S et al 2002, Gaytan F et al 2004). El receptor de ghrelina está activado de forma constitutiva y esta situación podría tener importancia fisiológica en su papel como regulador de la ingesta y modulador de la secreción de GH (Holst B et al 2003). Se ha demostrado como este receptor activa la vía de la fosfolipasa C a través de la subunidad Gq, dando lugar a la activación de la proteína kinasa C y produciendo un incremento de la concentración de Ca+2 intracelular (Kojima M et al 2001). Recientemente se ha postulado la idea de la existencia de un receptor adicional aún desconocido para la ghrelina, basándose en estudios realizados con una sustancia sintética (BIM-28163) que presenta la capacidad de inhibir la secreción de GH y a la vez produce por otro lado un aumento del peso corporal (Halem HA et al 2005). 3. Estructura de la ghrelina: El gen de la ghrelina humana está localizado en el cromosoma 3 (3p25-26) y consta de 4 exones y 3 intrones. La proteína madura es codificada en los exones 1 y 2 (Wajnrajch MP et al 2000). Introducción 5 El precursor de la ghrelina es un péptido de 117 aa llamado preproghrelina, que tras distintos procesos enzimáticos da lugar a la secuencia final de 28 aa que compone la ghrelina (Kojima M et al 1999, Jeffery PL et al 2005). Figura 3: Estructura de la ghrelina (Modificada de Kojima M et al 2005). Antes de secretarse, la ghrelina sufre una esterificación en el citoplasma, concretamente una n-octanoilación en el residuo 3 de Serina. La enzima que cataliza este proceso es la recientemente descubierta ghrelin O-acil transferasa (GOAT) (Yang J et al 2008, Gutierrez JA et al 2008). La ghrelina constituye el primer ejemplo de acilación de una proteína secretada y parece que esta octanoilación es esencial para la unión al receptor y por tanto para su actividad biológica (Kojima M et al 1999) al menos en lo que se refiere a la secreción de GH. Algunos análogos truncados en el extremo carboxilo terminal de la ghrelina son también capaces de unirse y activar el GHS-R1a. Esos hallazgos muestran que no solamente el grupo acilo, sino también los primeros 7 aa (los cuales muestran similitudes estructurales con algunos GHS peptídicos como GHRP-6 y hexarelina) son esenciales para la activación del GHS-R1a (Bednarek MA et al 2000). 4. Ghrelin O-acil tranferasa (GOAT): El gen de la ghrelina da lugar a diferentes productos de los cuales los más abundantes son las formas acilada y no acilada de este péptido. La forma acilada de la ghrelina se caracteriza por la presencia de un acido n-octanoico en el residuo de la Ser3. Introducción 6 Esta acilación es esencial para su unión al GHSR-1a y por lo tanto para llevar a cabo sus funciones endocrinas, aunque se han descrito diferentes efectos ejercidos por la forma no acilada de la ghrelina. Recientemente se ha descrito por dos grupos distintos que esta modificación de la ghrelina se produce por acción de la ghrelin O-acil transferasa (GOAT), una enzima anteriormente conocida como MBOAT4 (Gutiérrez JA et al 2008, Yang J et al 2008). Se ha postulado que esta acción se produce en el retículo endoplasmático, previo paso al aparato de Golgi donde la prohormona convertasa 1/3 va a dar lugar a la forma madura de ghrelina. Mediante estudios de inmunohistoquímica se ha demostrado que existe colocalización entre GOAT y ghrelina sugiriendo que esta acilación se produce en las mismas células donde se sintetiza la ghrelina. En estas células se ha encontrado que los niveles de ARNm de GOAT son dos veces menores que los de ghrelina (Sakata I et al 2009). GOAT se expresa en cantidades variables en: estómago, páncreas, colon, corazón, hígado, músculo, hipófisis, glándula salivar, testículo, timo, hipotálamo, tejido adiposo, glándula adrenal, placenta y ovario dependiendo de la especie estudiada (Sakata I et al 2009, Gonzalez CR et al 2008, Gutierrez JA et al 2008, Yang J et al 2008). El sustrato que utiliza GOAT para acilar la ghrelina son ácidos grasos de cadena media procedentes de la dieta (MCFAs). Los MCFAs se encuentran de forma natural en el coco, el aceite, la mantequilla, en aceites de palma y están presentes también en la leche de roedores y humanos (Nishi Y et al 2005, Kirchner H et al 2009). Existe una gran controversia en cuanto a la regulación de esta enzima por el estado nutricional. Unos autores demuestran que en ratón sigue un patrón de expresión similar al del gen de la ghrelina (Xu G et al 2009), con una elevada expresión en estados energéticos negativos y baja en estados energéticos positivos. Por otra parte otros autores encontraron en rata que la expresión de esta enzima permanece inalterada en Introducción 7 condiciones de ayuno agudo sin embargo se incrementa en casos de malnutrición prolongada (González CR et al 2008). A raíz de estos datos se ha sugerido un posible papel de esta enzima mediando la respuesta fisiológica a la malnutrición crónica, lo cual representaría una respuesta adaptativa para prevenir posibles alteraciones a largo plazo de la homeostasis energética y del peso corporal en estados de balance energético negativo (González CR et al 2008). Por otra parte, un tercer grupo encontró que se producía un aumento en la expresión de esta enzima en estados energéticos positivos en ratones. Existen resultados obtenidos con ratones knock-out para GOAT donde se demuestra que presentan un fenotipo normal, sin embargo cuando ingieren una dieta alta en MCFAs alcanzan un peso corporal significativamente menor que los wild-type (WT) alimentados con este tipo de dieta. Los autores demostraron también que el ratón TG (sobreexpresa ghrelina y GOAT) cuando se alimenta con una dieta alta en MCFAs presenta una mayor masa grasa y peso corporal que el ratón WT, debido a que el gasto energético es significativamente menor, lo que indica que los ratones TG presentan una tasa catabólica de lípidos menor que los WT. Se comprobó que este modelo es inducible y reversible cuando se modifica la dieta alta en MCFAs por una dieta normal (Kirchner H et al 2009). Así algunos autores proponen que el sistema de ghrelina es el responsable de preparar al organismo para metabolizar óptimamente el alimento y almacenar energía, más que un factor de iniciación de la ingesta o señal de apetito como se había propuesto hasta el momento. Se ha propuesto también que la expresión o síntesis de GOAT podría actuar como un represor translacional del gen de ghrelina lo cual vendría justificado por los elevados niveles plasmáticos de esta hormona encontrados en ratones knock-out para GOAT. En cuanto a un posible dimorfismo sexual o variaciones dependientes de la edad de GOAT existen muy pocos datos disponibles, solo hay constancia en la bibliografía de Introducción 8 un trabajo donde estudian la expresión de esta enzima en roedores macho de 10, 25, 60 días de edad y no ven ninguna variación entre los grupos estudiados (González CR et al 2008). 5. Funciones principales de ghrelina: 5.1. Liberación de GH: La administración de ghrelina estimula la secreción de GH tanto in vitro como in vivo (Kojima M et al 1999, Seoane LM et al 2000) en prácticamente todas las especies estudiadas. La potencia de liberación de GH es comparable a la de GHRH in vitro y es superior a esta en animales en libre movimiento y humanos (Seoane LM et al 2000, Peinó R et al 2000, Álvarez-Castro P et al 2004, Arvat E et al 2001). La inyección intravenosa (i.v.) e intracerebroventricular (i.c.v.) de ghrelina estimula la secreción de GH a dosis mínimas de 1.5 nmol y 10 pmol respectivamente (Date Y et al 2000a), demostrando una mayor potencia en el caso de la administración i.c.v. La inyección i.v de ghrelina en humanos, induce la secreción de GH de una manera dosis dependiente, con una dosis mínima de 0.2 μg/Kg (Date Y et al 2002a, Takaya K et al 2000). Aunque tanto la ghrelina como algunos secretagogos de GH son capaces de inducir la secreción de GH en cultivos primarios de células somatotropas (Kojima M et al 1999), también se ha demostrado que esta acción es mediada por estructuras suprapituitarias hipotalámicas (Popovic V et al 2003, Popovic V et al 1995, Pombo M et al 1995), por lo que no está muy claro a qué nivel actúa la ghrelina para producir la secreción de GH. La coadministración de ghrelina con GHRH, produce un efecto sinérgico en la secreción de GH (Hataya Y et al 2001, Arvat E et al 2001, Broglio F et al 2002) y la infusión de GHRH en ratas en libre movimiento resulta en un incremento significativo Introducción 9 de la expresión de los genes que codifican la ghrelina y sus receptores en la glándula hipofisiaria (Kamegai J et al 2004). Finalmente tanto los anticuerpos como los antagonistas de R-GHRH producen una atenuación de la respuesta secretora de GH a secretagogos de ghrelina (Pandya N et al 1998), así como en pacientes con una mutación del R-GHRH (Gondo RG et al 2001, Maheshwari HG et al 2002) lo cual demuestra que para que se produzca el efecto estimulador de la secreción de GH por ghrelina es necesario que el sistema de GHRH permanezca intacto (Maghnie M et al 2007, Popovic V et al 1995, Pombo M et al 1995, Popovic V et al 2003). Figura 4: Regulación de la secreción de GH (Modificada de Korbonits M et al 2004). 5.2. Acciones orexigénicas: La primera evidencia del efecto orexigénico de ghrelina fue obtenida por Arvat E et al, en el año 2000 el cual en un estudio de liberación de GH, encontró que en un 75% de los voluntarios sanos se producía un aumento del apetito como efecto colateral a la inyección de ghrelina. Estos hallazgos fueron confirmados en estudios posteriores (Nakazato M et al 2001, Wren AM et al 2001). Al mismo tiempo otros estudios reforzaron esta implicación de la ghrelina sobre la regulación del balance energético (Tschop M et al 2000, Shintani M et al 2001). La composición corporal de ratones tratados con ghrelina crónicamente muestra un aumento de la masa grasa (Tschop M et GHRH SS GHRELINA Introducción 10 al 2000). Análisis inmunohistoquímicos indican que las células neuronales que contienen ghrelina se encuentran en el núcleo arcuato del hipotálamo, una región implicada en la regulación del apetito (Kojima M et al 1999, Hosoda H et al 2002). Además publicaciones recientes indican que la ghrelina también ha sido detectada en neuronas que no habían sido previamente caracterizadas, adyacentes al tercer ventrículo entre el núcleo dorsal, el núcleo ventral, el núcleo paraventricular y núcleo arcuato del hipotálamo (Cowley MA et al 2003). Las neuronas que contienen ghrelina interactúan con neuronas que contienen neuropéptido Y (NPY), proteína asociada a Agouti (AgRP) y Orexina (Nakazato M et al 2001, Kamegai J et al 2001, Toshinai K et al 2003) y pueden estimular la liberación de péptidos orexigénicos. Por otra parte pueden inhibir la expresión de neuronas que expresan POMC (proopiomelanocortina) y CART (transcrito relacionado con cocaina y anfetamina) las cuales presentan una acción anorexigénica (Chen HY et al 2004, Shioda S et al 2008, Nogueiras R et al 2008). Figura 5: Células neuronales del núcleo arcuato hipotalámico (Modificada de Smith RG et al 2005). El núcleo arcuato hipotalámico es el principal sitio activo de la ghrelina y es también una diana para la leptina, principal hormona supresora del apetito, producida por el tejido adiposo. NPY y AgRP son producidos en las mismas neuronas de este Introducción 11 núcleo hipotalámico, y los efectos estimuladores del apetito de estos péptidos son directamente inhibidos por la leptina (Mizuno TM et al 2000). Como sugiere la distribución de las neuronas que contienen ghrelina en el hipotálamo, la inyección i.c.v. e i.v. de ghrelina induce la expresión de proteína c-fos en células neuronales NPY e incrementan la cantidad de ARNm de NPY y AgRP en el núcleo arcuato (Seoane LM et al 2003, Nakazato M et al 2001). La inyección i.c.v. de antagonistas del receptor de NPY, IgG anti-NPY, inhibidores de AgRP e IgG anti-AgRP inhiben los efectos orexigénicos de la ghrelina. Estos resultados indican que la ghrelina ejerce una actividad estimuladora del apetito en el hipotálamo promoviendo la producción y secreción de los péptidos NPY, AgRP y Orexina. Teniendo en cuenta que la administración periférica de ghrelina estimula la ingesta (Nakazato M et al 2001, Tschop M et al 2000) y que las hormonas peptídicas en la circulación sanguínea generalmente no cruzan la barrera hematoencefálica, debería haber otra vía indirecta a través de la cual la ghrelina periférica pueda activar las neuronas hipotalámicas reguladoras del apetito (Date Y et al 2002a, Williams DL et al 2003a). Se sugiere por tanto que la ghrelina secretada por el estómago, podría actuar en las terminacuiones del nervio vago a nivel gástrico y transmitir la señal al núcleo arcuato hipotalámico estimulando el apetito (Kojima M et al 2004). Recientemente se ha descrito un mecanismo de acción alternativo de la ghrelina en el hipotálamo según el cual el efecto orexigénico de la ghrelina estaría mediado por el metabolismo de los ácidos grasos (López M et al 2008). En otro estudio se propone a la ghrelina como una vía de señalización que informa al sistema nervioso central de la presencia de calorías en la dieta más que de la ausencia como es comúnmente aceptado (Kirchner H et al 2009). Introducción 18 7.3 Efecto de GH sobre la secreción de ghrelina: La ghrelina es un potente estimulador de GH tanto en humanos como en animales de laboratorio (Peino R et al 2000, Seoane LM et al 2000). Este hecho ha puesto de manifiesto la posibilidad de la existencia de un eje hipófisis-estómago. En ese caso, cualquier reducción o elevación en los niveles de GH sistémica afectaría a la ghrelina gástrica y a su secreción. En un principio se vio como la administración de GH a ratas, disminuía los niveles de ARNm y niveles plasmáticos de ghrelina hasta aproximadamente un tercio de los niveles control, posiblemente como consecuencia de un feedback negativo ejercido por la propia GH sobre la secreción de ghrelina (Qi X et al 2003, Tschop M et al 2002). Se ha demostrado que los ratones transgénicos que sobreexpresan GHRH presentan unos niveles plasmáticos de GH aproximadamente 10 veces más altos que los observados en animales no transgénicos (Debeljuk L et al 1999, Hammer RE et al 1985), mientras que los niveles de expresión de ghrelina gástrica en estos animales se encuentran disminuidos de manera importante (Qi X et al 2003). En la rata adulta de edad avanzada, los niveles de expresión, los depósitos de péptido y los niveles plasmáticos de ghrelina se incrementan significativamente cuando se comparan con ratas jóvenes, mientras que la secreción de GH disminuye con la edad en roedores (Sonntag WE et al 1980, Floríni JR 1981). Teniendo en cuenta que la administración exógena de GH produce un feed-back negativo sobre la ghrelina en estómago, el aumento en la producción y secreción de ghrelina con la edad en ratas viejas puede ser debido a la reducción en el feed-back negativo producido por la caída de GH endógena. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de la existencia de un eje GH-hipófisis- ghrelina-estómago (Qi X et al 2003, Tschop M et al 2002), sin embargo el mecanismo Introducción 19 por el cual actuaría esa realimentación negativa en la homeostasis y en la secreción de ghrelina es aún desconocido. Por otro lado existen estudios que proponen que esta regulación de GH sobre la secreción de ghrelina por parte del estómago no se produce con una administración crónica de GH (Janssen JA et al 2001). Así usando diferentes modelos de ratones transgénicos se detectó que una exposición a altos niveles de GH desde la edad temprana no afectaba a los niveles de ARNm de ghrelina en el estómago, ni a sus niveles plasmáticos, este grupo de investigación propone que la regulación de GH sobre la secreción de ghrelina en el estómago no se ve afectada por cambios en la acción periférica de GH (Nass R et al 2004). Por lo tanto existe una controversia sobre el efecto que ejerce la GH sobre la regulación de la ghrelina circulante. 7.4 Efecto de IGF-1 sobre la secreción de ghrelina: El IGF-1 (factor de crecimiento insulínico tipo 1) es sintetizado principalmente en el hígado por acción de la GH. Se sabe poco sobre la interacción entre esta hormona y la ghrelina. Existen estudios que muestran una correlación negativa entre estas dos hormonas en adolescentes y niños (Whatmore AJ et al 2003, Bellone S et al 2003, Bellone S et al 2002, Kitamura S et al 2003). También se ha propuesto la existencia de una regulación negativa del IGF-1 sobre la expresión del receptor de ghrelina en la hipófisis de rata (Kamegai J et al 2005). Por el contrario estudios en humanos adultos no muestran la existencia de correlación alguna (Dall R et al 2002, Malik IA et al 2004, Rigamonti AE et al 2002, Tschop M et al 2002). Es por tanto muy pobre el conocimiento a cerca del efecto que el IGF-1 ejerce sobre la regulación de ghrelina y los datos que existen hasta el momento son controvertidos. Introducción 20 7.5. Efecto de los estrógenos sobre la secreción de ghrelina: El receptor α de estrógenos (ERα) se expresa en el estómago, concretamente en la mucosa gástrica en las células productoras de ghrelina (Campbell-Thompson ME et al 2001). Este dato sugiere la posibilidad de que exista una interrelación a nivel gástrico entre los estrógenos y la ghrelina. Distintos estudios tanto en animales de experimentación como en humanos, demuestran que variaciones en los niveles de estrógenos están involucradas en la regulación de la secreción de ghrelina. Existe un estudio que propone que son los estrógenos sintetizados en el propio estómago los que regulan directamente la ghrelina gástrica (Sakata I et al 2006). Estudios in vitro demuestran que los estrógenos incrementaban la secreción gástrica de este péptido de una forma dosis-dependiente en células aisladas de estómago de roedores mientras que el pretratamiento con antagonistas del receptor de estrógenos bloquean ese incremento en la secreción de ghrelina (Sakata I et al 2006). Existen datos contradictorios en la bibliografía sobre el efecto de la ovariectomía sobre los niveles de ghrelina, mientras que Gualillo et al determinaron que este procedimiento no afectaba a los niveles circulantes de ghrelina (Gualillo O et al 2001b), Matsubara M et al mostraron como tanto la ghrelina plasmática, el ARNm y el número de células productoras de ghrelina se incrementan en animales sometidos a una ovariectomía y este aumento era revertido tras el restablecimiento de los niveles fisiológicos de estrógenos mediante la administración de β-estradiol (Matsubara M et al 2004). Estudios realizados en humanos demuestran que el tratamiento con β-estradiol a mujeres menopáusicas produce un incremento en los niveles plasmáticos de ghrelina total (Di CC et al 2007) y acilada (Kellokoski E et al 2005). Además pacientes con Introducción 21 anorexia nerviosa presentan una elevación en los niveles de ghrelina plasmática tras la administración de estrógenos (Grispoon S et al 2004). En otro trabajo no se encuentra ninguna relación entre estas dos hormonas en un estado hipoestrogénico (Purnell JQ et al 2003). Aunque los datos existentes sobre el tema pueden parecer contradictorios en un primer momento, los diferentes resultados pueden explicarse por las diferencias metodológicas entre esos trabajos experimentales. 7.6. Efecto de la testosterona sobre la secreción de ghrelina: Hasta la fecha existen muy pocas evidencias experimentales del efecto que produce la testosterona sobre la secreción de ghrelina en animales de experimentación. Se ha demostrado que existen receptores de andrógenos en el estomago y tejido gastrointestinal humano (Wilson CM et al 1996) y de primate no humano (Winborn WB et al 1987) lo que indica que es posible una relación directa entre estas hormonas. Estudios en humanos han buscado esta posible relación en pacientes con hipogonadismo, a los que se les administró un suplemento de testosterona o mujeres diagnosticadas de ovario poliquístico, que suelen presentar unos niveles superiores a lo normal de andrógenos debido a su patología. Datos experimentales muestran una controversia en cuanto al efecto que produce la suplementación con testosterona en personas del sexo masculino. Algunos autores defienden que esta suplementación en pacientes con hipogonadismo aumenta los niveles séricos de ghrelina (Pagotto U et al 2002). Sin embargo otro estudio en pacientes adolescentes muestra una disminución de la secreción plasmática de ghrelina tras la administración de hormonas sexuales (Lebenthal Y et al 2006). Existen datos conflictivos sobre los niveles de ghrelina en mujeres con síndrome de ovario poliquístico (PCOS), mientras unos trabajos defienden que los niveles en estas Introducción 22 mujeres están significativamente disminuidos (Pagotto U et al 2002, Schofl C et al 2002, Moran LJ et al 2004), otros defienden que están significativamente aumentados (Wasko R et al 2004). Por último otros estudios muestran que no existe correlación alguna entre los niveles séricos de ghrelina y los niveles de testosterona en mujeres con esta patología. Esos datos tan contradictorios tienen difícil explicación. 7.7 Regulación de los niveles de ghrelina con la edad: La distribución de los péptidos neuroendocrinos varía con la edad en diferentes localizaciones del tracto gastrointestinal. Es posible que la ghrelina gástrica cambie con la edad para adaptar el organismo a los requerimientos metabólicos demandados en cada etapa de la vida. Varios trabajos han estudiado las variaciones de los niveles de ghrelina durante el desarrollo postnatal, sin embargo estos trabajos muestran resultados muy controvertidos. En un estudio llevado a cabo en ratones, no se encontraron cambios significativos en la expresión de ARNm de ghrelina con la edad (Tanaka M et al 2001). Por el contario, la mayoría de estudios en roedores muestran que la expresión de ghrelina gástrica es detectable justo después del nacimiento y aumenta gradualmente hasta la edad adulta (Sakata I et al 2002b, Gualillo O et al 2001b). Existen estudios histológicos en los cuales se detecta un patrón similar al de los niveles de expresión de ARNm de ghrelina en células gástricas inmunopositivas para ghrelina (Sakata I et al 2002b). Sorprendentemente este patrón de expresión de la ghrelina es completamente opuesto al encontrado en la hipófisis, donde los niveles de expresión de este péptido son elevados en el periodo fetal y disminuyen después del nacimiento (Kamegai J et al 2001). Sin embargo la expresión del receptor GHS-R1 en hipófisis sigue el mismo patrón que la expresión gástrica de ghrelina. Introducción 23 Desde un punto de vista metabólico, uno de los procesos más relevantes en el desarrollo postnatal de la rata es el destete. El destete está asociado con cambios drásticos tanto en la dieta como en el entorno, y está caracterizado por alteraciones en la morfología del tracto gastrointestinal, por lo cual todas las modificaciones relacionadas con este periodo pueden estar afectando a la producción y expresión de ghrelina. Un estudio en crías de especie porcina mostró que la administración de ghrelina exógena durante el destete, produce una rápida recuperación de la disminución de peso corporal producida por este fenómeno (Salfen BE et al 2004). Los niveles de ghrelina en animales lactantes están regulados de diferente manera que en animales adultos, así en animales de una semana de edad, ocho horas de restricción de leche disminuyen la concentración de ghrelina en el estómago sin embargo los niveles de ghrelina plasmática aumentan como es característico en el estado de restricción calórica (Hayashida T et al 2002). La pubertad es otra etapa en la cual los requerimientos energéticos y consecuentemente los niveles de hormonas circulantes están alterados de manera notable. Varios trabajos demuestran que los cambios más relevantes en los niveles de ghrelina son producidos en la etapa puberal, en paralelo con variaciones en los niveles de hormonas sexuales. Estas alteraciones asociadas a la edad afectan a la expresión de ARNm de ghrelina, células inmunopositivas para ghrelina y ghrelina plasmática (Matsubara M et al 2004). Aunque se han publicado datos sobre los niveles de ARNm de ghrelina y contenido proteico, no existen datos sobre secreción de ghrelina desde tejido gástrico a lo largo del desarrollo postnatal. Introducción 24 8. Subproductos del gen de ghrelina: Existen diferentes subproductos del gen de ghrelina entre los que destacan la obestatina (Zhang JV et al 2005), la desacilghrelina y la desglut-14ghrelina (Hosoda H et al 2000b). La obestatina procede de una modificación postraduccional a partir de la preproghrelina, la desglut-14-ghrelina se produce por un diferente procesamiento del ARNm del gen de ghrelina y la desacilghrelina no presenta la acilación postraduccional de la forma octanoilada. 8.1. Obestatina: La obestatina es un péptido de 23 aa que se descubrió en el año 2005 (Zhang JV et al 2005). Su descubrimiento se produjo a partir de predicciones bioinformáticas partiendo de la hipótesis de la existencia de posibles señales metabólicas derivadas de propéptidos de hormonas conocidas, así la obestatina proviene del mismo gen que la ghrelina y mediante diferentes modificaciones da lugar a dicho péptido (Zhang JV et al 2005). Su nombre procede de una contracción de la palabra obese del latín obedere que significa devorar y statin que denota supresión. Se postuló que esta hormona presenta la capacidad de inhibir la ingesta y disminuir el peso corporal, el vaciamiento gástrico y la motilidad intestinal (Zhang JV et al 2005). Hasta el momento se ha encontrado expresión de obestatina a nivel del sistema nervioso central (Zhang JV et al 2005), en el tracto gastrointestinal, así como en otros órganos periféricos de roedores como el bazo, el páncreas (Chanoine JP et al 2006) o en testículo (Dun SL et al 2006). El gen de la ghrelina codifica un pre-propéptido de 117aa (pre-proghrelina), que mediante una serie de modificaciones produce un propéptido, la proghrelina (1-94aa) donde se incluye la ghrelina madura, que corresponde a los primeros 28aa y una cola de 66aa (29-94) (Kojima M et al 1999, Jeffery PL et al 2005), la cual puede circular como péptido con Introducción 25 su longitud total (C-ghrelin) o como péptidos pequeños principalmente como obestatina. Mientras la ghrelina presenta una modificación postraduccional (ácido octanoico), la obestatina presenta una amidación en su extremo C-terminal con Gly-Lys siendo esta amidación necesaria para su actividad biológica (Zhang JV et al 2005). Figura 6: Representación esquemática de la síntesis de obestatina y de ghrelina. 8.1.1. ¿GPR-39, receptor de obestatina?: En un principio el grupo de Zhang et al en 2005 describe el receptor huérfano GPR- 39 como el receptor de la obestatina. Tras ese hallazgo no tardaron en aparecer nuevos trabajos que corroboraban esos datos (Moechars D et al 2006, Zhang JV et al 2008) aunque paradójicamente aparecieron también trabajos que los contradecían (Chartrel N et al 2007, Holst B et al 2007, Lauwers E et al 2006, Zhang JV et al 2007) lo cual estableció una fuerte controversia sobre este tema que en el momento actual no se ha resuelto. El receptor GPR-39 presenta un peso molecular de 52 kDa y está localizado en el cromosoma 2q21-q22 que codifica una proteína de 453 aa, presenta 7 dominios Gen de g hrelina A RNm de g hrelina Prepro-ghrelina 117 aa Pro g hrelina 94 aa Des-acyl ghrelina C- g hrelina Ghrelina Obestatina GOAT Introducción 26 transmembrana característicos de los receptores asociados a proteínas G (GPC-R). El receptor GPR-39 pertenece a una familia de receptores en los que se incluyen los receptores para la motilina y la ghrelina (McKee KK et al 1997b). El GPR-39 presenta una amplia distribución, se encuentra en ciertas zonas del sistema nervioso central, así como en otros órganos periféricos como el hígado, páncreas, pulmones, ovarios y testículos y en grandes cantidades en el tracto gastrointestinal (Zhang JV et al 2005). 8.1.2. Funciones principales de obestatina: 8.1.2.1 Acciones anorexigénicas: Al contrario que la ghrelina, la obestatina se propone como señal supresora del apetito y del peso corporal. Así el artículo original de Zhang y colaboradores justifican estos efectos argumentando que existe expresión del supuesto receptor de obestatina en el hipotálamo, un área cerebral implicada en la regulación del apetito, al que se uniría la obestatina para ejercer sus acciones reguladoras del metabolismo. Estos resultados fueron corroborados por una serie de grupos (Zhang JV et al 2005, Zhang JV et al 2007, Lagaud GJ et al 2007, Nagaraj SR et al 2008). A pesar de los estudios realizados en los últimos años indicando un papel de la obestatina sobre la regulación de la ingesta tanto per se como de forma indirecta, la gran mayoría de trabajos hechos en distintos modelos experimentales (animales en ayuno, sin restricción de comida, knock-out para el receptor GPR-39, ratas obesas y normopesas) en los que se utiliza un amplio rango de dosis y rutas de administración, no fueron capaces de reproducir esos resultados (Gourcerol G et al 2007, Holst B et al 2007, Nogueiras R et al 2007, Samson WK et al 2007, Tremblay F et al 2007, Yamamoto D et al 2007, Zizarri P et al 2007, Seoane LM et al 2006, Goucerol G et al 2006). Introducción 27 Una posible explicación a esta controversia sería un reciente estudio que propone que la relación dosis respuesta de la obestatina con la ingesta y el peso corporal sigue una curva en forma de U en la que altas y bajas dosis no tienen efecto, sin embargo sí lo tienen las dosis intermedias (Lagaud GJ et al 2007). 8.1.2.2 Regulación del balance energético y motilidad gástrica: En un trabajo publicado en el año 2007 por Nogueiras R y colaboradores que estudia el impacto de la administración de obestatina sobre diversos factores relacionados con el metabolismo energético (ingesta, peso corporal, composición corporal, gasto energético, actividad motora, cociente respiratorio y neuropéptidos hipotalámicos) se concluye que este péptido no afecta a ninguno de estos parámetros (Nogueiras R et al 2007). Al igual que ocurre con la ingesta los resultados del efecto de la obestatina sobre la motilidad gástrica son controvertidos y dudosos (Zhang et al JV 2005, Zhang JV et al 2007, Ataka K et al 2008, De Smet B et al 2007, Bassil AK et al 2007). 8.1.2.3 Secreción hormonal: Zhang et al describen en su artículo de 2005 que la obestatina no altera la secreción de GH en un cultivo de células hipofisarias. Por otra parte Zizarri P et al en 2007 encontraron que la obestatina aunque es incapaz de regular la secreción basal de GH en experimentos in vitro e in vivo, sí es capaz de inhibir la secreción de GH inducida por la ghrelina en ratas en libre movimiento. El resto de estudios experimentales no son capaces de demostrar una relación entre estas dos hormonas (Samson WK et al en 2007, Nogueiras R et al 2007, Yamamoto D et al 2007). Introducción 34 principalmente involucrado en la coordinación de los patrones de motilidad (Konturek SJ et al 2008). Algunas evidencias sugieren una posible interacción entre las terminaciones vagales aferentes y las neuronas entéricas vecinas (Burdyga G et al 2004). Figura 8: Composición gástrica e inervación nerviosa (Modificada de Young B et al 2004). 9.2.2 Control hormonal del estomago: El tracto gastrointestinal es uno de los mayores órganos endocrinos del organismo y produce alrededor de 30 hormonas peptídicas diferentes, las cuales actúan en diferentes tejidos como glándulas exócrinas y SNC. Los péptidos gastrointestinales son secretados desde las células enteroendocrinas en respuesta a la ingesta, actuando normalmente en la regulación a corto plazo de la ingesta de alimentos y la homeostasis energética, aunque pueden interactuar a varios niveles con las hormonas involucradas en la regulación a largo plazo del peso corporal como por ejemplo leptina o insulina (Konturek SJ et al 2008). Después de ingerir alimentos, varias hormonas son liberadas desde diferentes áreas del tracto gastrointestinal: colecistokinina (CCK) (Rehfeld JF et al 1998) desde la parte proximal del intestino delgado, péptido similar al glucógeno tipo Introducción 35 1 (GLP-1) (Herrmann C et al 1995) y péptido YY (PYY) (Adrian TE et al 1985), desde la parte distal del intestino delgado. Esas hormonas gastrointestinales juegan un papel fundamental en varias funciones digestivas como el vaciamiento gástrico, así como en la regulación del apetito (Inui A et al 2004). Diversas patologías entre las cuales se encuentran la diabetes, la insuficiencia renal y desordenes neurológicos como distrofias miotónicas, enfermedad de Parkinson o enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple, están asociadas con la reducción del tránsito gastrointestinal (Hellström PM et al 2009). Por esa razón los péptidos derivados de esa zona involucrados en el control del balance energético han adquirido un gran protagonismo en los últimos tiempos, entre esos péptidos la ghrelina está considerada como la más relevante. Figura 9: Acciones de la ghrelina (Modificado de Xiao-Ying Dong et al 2009). OBJETIVOS Objetivos 39 La regulación de la secreción de ghrelina y sus niveles plasmáticos han sido exhaustivamente estudiados tanto en animales de experimentación como en seres humanos. Dado que el 70% de la ghrelina circulante procede del estómago, se ha asumido de una forma automática que todo cambio plasmático refleja un cambio en la secreción gástrica. Se ha ignorado de esta forma, las condiciones secretoras del estómago y el papel jugado por otros tejidos intestinales, así como el aclaramiento de la ghrelina circulante por otros órganos. Dado que la regulación de la secreción de ghrelina por el tejido gástrico no ha sido estudiada y se carecía de un modelo in vitro adecuado, en el presente trabajo nos hemos planteado los siguientes objetivos: 1. Desarrollar y validar un modelo in vitro que permita estudiar directamente la secreción gástrica de ghrelina en cualquier situación experimental. Modelo simple, reproducible y de coste razonable. 2. Establecer la acción de los componentes del eje somatotropo: GH, GHRH, IGF- 1 y SS, sobre la secreción de ghrelina directamente a nivel gástrico. 3. Observar de que forma el desarrollo asociado a la edad y el sexo modulan la secreción de ghrelina y niveles de expresión de GOAT por el tejido gástrico. 4. Determinar de que forma el estado de lactancia influye en el desarrollo de la capacidad secretora de ghrelina y niveles de expresión de GOAT por el estómago. Objetivos 40 5. Observar como el estado de ayuno o alimentación regulan la secreción de ghrelina directamente a nivel gástrico. 6. Determinar si es el estómago directamente o alternativamente el SNC quien detecta los cambios de ingesta que regulan la secreción de ghrelina. 7. Evaluar el papel que puede jugar el nervio vago y el plexo mientérico en la regulación de la secreción de ghrelina por células X/A. RESULTADOS Resultados 43 © 2007, Editrice Kurtis. © 2007, Editrice Kurtis NOT PRINTABLE J. Endocrinol. Invest. 30: RC22-RC25, 2007 RC22 Key-words: Ghrelin, somatotropic axis, GH, GHRH, SS, IGF-I. Correspondence: L.M. Seoane, Área de Investigación, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, PO Box 563, E-15780, Santiago de Compostela, Spain. E-mail: [email protected] Accepted June 11, 2007. ABSTRACT. Ghrelin is a 28-amino-acid hormone produced mainly by the stomach which strongly promotes food intake. It is the only known peripheral orexigenic hormone that induces the release of GH. Ghrelin has been proposed as a link between the enteric system and central regulation of energy balance and growth. Although it has recently been the focus of extensive study, the secretion mechanism is not yet well characterized. The aim of this study was to test the direct effect of hormones from the somatotropic axis on ghrelin release directly from the stomach. To this end, an organ culture model of gastric tissue explants from rat donors was used. These stomach explants were incubated in 6 well plates for 1, 2, and 3 h after treatment with either GH, GHRH, SS or IGF-I, all them at 10 -6 M. After incubation, the medium was collected and the amount of ghrelin secreted by the gastric tissue was measured by radioimmunoassay. It was observed that GH and SS significantly decreased gastric ghrelin secretion, while GHRH and IGF-1 had no effect on the present model. These results would confirm the capacity of GH and SS to act directly upon gastric level, inhibiting ghrelin secretion in vitro. (J. Endocrinol. Invest. 30: RC22-RC25, 2007) ©2007, Editrice Kurtis INTRODUCTION The main function of the somatotropic axis is the regulation of GH secretion and general metabolism (1). The somatotropic axis is made up of GH, GHRH, somatostatin (SS), and IGF-I, and the recently incorporated ghrelin. This 28-amino-acid peptide (2) is expressed in a large number of tissues (3-5) but mainly in endocrine cells within the oxyntic gland of the stomach (6). There is evidence suggesting a relation between ghrelin and the other components of the somatotropic axis (7, 8). GH is controlled by metabolic status and is profoundly altered in states such as obesity, malnutrition, fasting, and diabetes mellitus (1). For its part, plasma ghrelin is also affected by nutritional status, being enhanced in the fasting state and reduced in obesity and situations of positive energy balance (9-11). In light of this, ghrelin may well be the link between the somatotropic axis and metabolism. There is currently controversy over the effect of GH on the regulation of ghrelin secretion. It is difficult to explain as the interplay between GHRH, GH, and ghrelin levels has not yet been established. Exogenous treatment with another component of the somatotropic axis SS and its analogues has been reported to produce inhibition of plasma ghrelin levels in normal subjects (12). Systemic administration of SS suppresses the secretion of a wide range of splanchnic hormones, such as insulin, glucagon, and gastroentero-pancreatic hormones and ghrelin may be part of that list. IGF-I is a primary mediator of GH functions as a negative feed-back regulator of GH secretion in vivo. However, little is known about how IGF-I affects the regulation of ghrelin secretion. A negative correlation between these two hormones has been reported in humans (13), and there have been reports of a down regulation of IGF-I on ghrelin receptor (GHS-R) in rat pituitary (14). Although it is commonly assumed that any variation of plasma ghrelin reflects changes in the rate of secretion by the stomach, this has not been looked into. The intimate mechanisms governing the biosynthesis and secretion of RAPID COMMUNICATION Growth hormone and somatostatin directly inhibit gastric ghrelin secretion. An in vitro organ culture system L.M. Seoane 1,2 , O. Al-Massadi 1,3 , F. Barreiro 4 , C. Dieguez 2,5 , and F.F Casanueva 1,2,3 1 Molecular Endocrinology, Investigation Area, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS); 2 CIBER de Fisiopatología Obesidad y Nutricion (CB06/03) Instituto Salud Carlos III; 3 Departaments of Medicine, 4 Surgery and 5 Physiology, Santiago de Compostela University, Santiago de Compostela, Spain Resultados 50 levels are elevated through the fetal period and decrease after birth (21). However, the expression of ghrelin receptor (GHS-R) at pituitary level, it was found to be in line with gastric ghrelin expression (22). From a metabolic point of view, one of the most relevant processes in rat development is the weaning period, which is associated in the offspring with drastic dietary and environmental changes. In addition, this period is characterized by alterations in the gastrointestinal tract morphology and these weaning-related effects might possibly be affecting ghrelin production (3). A study in pigs shows that exogenously administered ghrelin to animals during the weaning period, rapidly regain their temporary body weight decrease associated to this nutritional change (31). Ghrelin levels in suckling animals are regulated in a different manner than in adult animals. It was shown in 1 week old animals that eight hours of milk restriction significantly decrease ghrelin concentration in the stomach while at the same time plasmatic ghrelin levels increased as expected during the fasting period (18). In addition, puberty is a life stage characterized by noticeably high energy requirements and alterations in circulating hormone levels. Available studies have shown that most relevant changes in ghrelin levels are produced in the pubertal stage under different interventions associated to estrogen levels variations (e.g., ovariectomy and estradiol treatment). These approaches affect gastric ghrelin mRNA, the number of positive ghrelin cells and plasma ghrelin (26) Although several articles have been published about gastric mRNA levels and protein content, the mechanism of gastric ghrelin regulation is still unknown and the factor/s regulating the secretion has not been identified yet. The recently identified enzyme for ghrelin acylation (GOAT) has been studied in relation to nutritional status but not with the developments. Under this context, there is no data available about the regulation of ghrelin secretory function of the stomach and GOAT expression by age, puberty and breastfeeding. The deep study of these topics might be of great relevance for the possible role of gastric ghrelin in neonatal and pubertal development. The three objectives of this paper are: first to gain insight into the control of ghrelin secretion directly from the stomach in response to different stages of life and the role of lactation, second the role of gonadal hormones on ghrelin secretion and third the regulation of GOAT levels by age, sex and lactation. Resultados 51 MATERIALS AND METHODS: ANIMALS AND EXPERIMENTAL DESIGN For all experiments, Sprague Dawley rats were used. Animal research was conducted according to protocols approved by the Animal Care Committee of Santiago de Compostela University. Rats were housed in air conditioned rooms (22-24 C) under controlled light/dark cycle (12 hours light, 12 hours darkness) with free access to food and water (n=10). Surgical procedures were performed under anesthesia by intraperitoneal (ip) injection of a mixture of ketamine/xylazine (Ketamine 100 mg/Kg body weight + Xylazine 15mg/kg body weight). Animals were euthanatized by decapitation. Trunk blood was collected and immediately centrifuged and plasma stored at -20ºC for the biochemical measurements. Experiment 1: Age related variations in gastric ghrelin secretion. To investigate if differential secretion of gastric ghrelin takes place during development, male and female rats (1-9 weeks of age), were used to measure gastric ghrelin secretion, and levels of ghrelin and testosterone in plasma (n=10). Upon decapitation, trunk blood was collected and the uterus was dissected out of the surrounding fat and its weight recorded after a brief drying with cellulose paper. Due to the difficulty of measuring basal estrogen levels directly by RIA, the measurements of the uterus weight were used as an index of pubertal maturation and activation of the reproductive axis. It was shown that this value is strongly associated with estrogen circulating levels (25). The variations in ghrelin mRNA levels were tested by real time PCR in male and female rats (2, 4, 6 and 8 weeks of age). Experiment 2: Effect of estrogen and testosterone in vitro on gastric ghrelin secretion. Explants of gastric tissue obtained from adult female rats with the method described below were incubated for 3 hours with 17β-estradiol at dose of 1 μM (β-estradiol 3 benzoato, Sigma Aldrich, Steinheim, Germany). On the other hand, the gastric explants obtained from male animals were incubated with testosterone propionate (Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland) at a dose of 1 μM for 3 hours. The medium was collected and ghrelin levels in the culture medium were measured by radioimmunoassay (RIA). Resultados 52 Experiment 3 and 4: Effects of the estrogen and testosterone ex vivo on gastric ghrelin secretion. To study the role of sexual hormones of gastric ghrelin secretion, young animals (4 weeks-old), females and males, were bilaterally ovariectomized, orchidectomized or sham operated respectively, under ketamine-xylazine anesthesia. After 3 days, rats were killed by euthanasia. One group ovariectomized animals was implanted subcutaneously with a Silastic tubing (i.d. 1.0mm, o.d. 1.5 mm, 20 mm in length) cannula, containing 17 β estradiol (sigma Aldrich; Steinheim, Germany). One group of male, orquidectomized was implanted with a similar cannula to those described above but containing testosterone propionate. Experiment 5: Breastfeeding effect on gastric ghrelin secretion With the aim of testing the weaning effect on gastric ghrelin secretion, the model of delay weaning (DW) was developed by preventing pups from eating solid food from day 21 (3 weeks of age) to day 28 (4 weeks of age), leaving the pups with the mum for this period. The corresponding controls (4 weeks) that were previously weaned at 3 weeks of age were used. The pup body weight was monitored. Testosterone levels were measured by RIA and uterus weight recorded. Experiment 6: Regulation of gastric GOAT mRNA expression by age and breast feeding. In order to test the possible changes in the ghrelin O-acyl tranferase (GOAT) with age, the mRNA levels of this enzyme were studied by real time qPCR in the same experimental groups were mRNA ghrelin levels were tested (2, 4, 6, 8 weeks of age). To test the effect of the weaning in gastric GOAT expression, real time qPCR for GOAT was performed in stomach mucosa from animal groups of the experiment 5. RNA ISOLATION AND REAL-TIME QUANTITATIVE RTPCR Total RNA was isolated from rat stomach mucosa using Trizol (Invitrogen, CA, USA), according to the manufacturer’s recommendations. Extracted total RNA was purified with DNase treatment by means of DNA-free kit as a template (Ambion, USA) to generate first-strand cDNA synthesis using High-capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, USA). Quantitative real-time PCR was performed using an ABI PRISM 7300 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) with specific Taqman qRT-PCR primers and probes (Table 1). For the analysis, gene expression levels of ghrelin and GOAT were normalized using as a housekeeping gene 18S rRNA Resultados 53 (TapMan: Applied Biosystems) and Hypoxanthine phosporibosyltransferase 1 (HPRT1), respectively, and were expressed in respect to the average value for the control group (13). TISSUE EXPLANTS CULTURE A model of tissue explants culture was developed as described. In brief, to obtain exvivo tissue, the stomachs were immediately excised and transported to the incubator in sterile Krebs-Ringer-Hepes buffer (NaCl, 125 mmol/l; KCl, 5 mmol/l; MgSO4, 1.2 mmol/l; KH2PO4, 1.3 mmol/l; CaCl2, 2 mmol/l; glucose, 6 mmol/l; Hepes 25 mmol/l; pH=7.4). After blood vessel and connective tissue elimination, stomach tissue was washed with sterile Krebs-Ringer-Hepes. Tissue explants, mostly gastric fundus, were placed in six well dishes containing 2.5 ml Dulbecco´s modified Eagle´s medium supplemented with penicillin (100 U/ml) and streptomycin sulphate (100 μg/ml) and incubated at 37 ºC under a humidified atmosphere of 95% air-5% CO2. After a preincubation period of 1 hour, the media was discarded and 2.5 ml of fresh medium was dispensed into each well. Culture medium was then collected at 2 hours and tissue was weighed with a precision scale. Media was stored at -20ºC until ghrelin assay. BIOCHEMICAL ANALYSIS: Total ghrelin levels were determined by means of a double antibody RIA using reagents kits and methods provided by Linco Reseach (St Charles, Misssouri). Samples for measuring the secretions from the tissue explants were obtained directly by collecting the culture medium. Samples were analyzed by RIA, as previously described. The limit of assay sensitivity was 93 pg/ml. Results were expressed as ng/ml of ghrelin per gram of tissue in the culture media. Testosterone concentrations in serum samples were measured using commercial kit purchased from ICN Biomedical, Inc. (Costa Mesa, CA) following the manufacturer’s instructions. The sensitivity of the assay was 100 pg/ml. STATISTICAL ANALYSIS Data were expressed as mean ± SEM. Statistical significance was determined by in GraphPad InStat software using a Mann-Whitney test where * p≤ 0,05, **p≤ 0, 01 were considered significant and very significant respectively. Resultados 54 RESULTS 1. AGE RELATED VARIATIONS IN GASTRIC GHRELIN SECRETION COMPARED WITH PLASMA GHRELIN LEVELS AND mRNA Plasmatic ghrelin levels were unchanged by age in both male and female (Figures 1 A and E). The total gastric ghrelin secretion increased with age as long as the body weight was increasing. However when gastric ghrelin secretion was corrected per gram of gastric tissue, the data showed interesting variations, specifically at two points of the study: At 4-weeks of age the levels of gastric ghrelin secretion dramatically decreased in both male (30.8±2.1 ng/ml at 3 weeks old; 11.2±0.5 ng/ml 4weeks old; 19.1±1.2 ng/ml at 5 weeks old; *p≤0.05, **p≤0.01 vs 3 weeks old (Figure 1B) and female (20.4±1.5 ng/ml at 3 weeks old; 7.9 ±0.5 ng/ml 4weeks old; 20.3±12.9 ng/ml in 5 weeks old; (*p≤0.05, **p≤0.01vs 3 weeks old) animals (Figure 1F). The other outstanding finding was a peak in gastric ghrelin secretion found in 6 weeks old males (19.1±12.3 ng/ml at 5 weeks old, 27.6±2.5 ng/ml at 6 weeks old, 19.6±2.4 at 7 weeks old; #p≤0.05, ##p≤0.01 vs 6 weeks old ) (Figure 1B). However, in the 6 week old female group, gastric ghrelin secretion was increased to values characteristic of the adult stage, remaining constant trough the adulthood (Figure 1F). The age of 4 weeks coincide with the initial pubertal stage in females, as it was shown by the uterus weight data. Between the first and the third week of life the uterus remained small in size (0.05- 0.02 g), however in the fourth week it experienced a considerable increase in their volume (0.2 g at 4 and 5 weeks), and after the sixth week the uterus remained constant throughout adult stage (Figure 1H). This parameter can be considered as an index of pubertal maturation and it is directly related with circulating levels of estrogen (25). The latter indicates that at 4 weeks of age the animals began the pubertal stage with an increase in estrogen levels. On the other hand the measurements of testosterone levels in males showed a peak at just 6 weeks of age coinciding with the pubertal stage in males. The levels of testosterone measured by RIA were of 0.02±0.002 ng/ml between the first and the fifth week of age and exhibited a noticeable increase at 6 weeks of age (0.12±0.05 ng/ml) through the adult age (Figure 1D). The mRNA levels for gastric ghrelin determined by real-time PCR, showed that gastric mRNA ghrelin raised in 4 weeks old females (2 weeks old females. 100 ±17 arbitrary Resultados 55 units vs 4 weeks old: 217±45 arbitrary units; * p≤0.05) (Figure 1G). On the contrary, in the male it was not found mRNA ghrelin variations with age (Figure 1 C). 2. EFFECT OF IN VITRO TREATMENT WITH ESTROGENS AND TESTOSTERONE ON GASTRIC GHRELIN SECRETION Treatment with testosterone propionate (1 μM) directly on gastric tissue explants did not affect gastric ghrelin secretion (Figure 2A). On the contrary, the treatment of gastric tissue explants in vitro with 1μM of estradiol induced a significant decrease in gastric ghrelin secretion (14.5±0.5 ng/ml in control animals vs 11.0±0.7 ng/ml in estradiol treated ones; **p≤0.01) (Figure 2B). 3. EFFECT OF EX VIVO TESTOSTERONE ON GASTRIC GHRELIN SECRETION Testosterone influence on stomach ghrelin secretion was tested by ghrelin measurements in the medium secreted from gastric tissue explants extracted from young male rats of several experimental groups: three days orquidectomized rats, testosterone propionate treated rats after three days orquidectomized and the corresponding shamoperated controls. Young animals presented low levels of gastric ghrelin secretion as well as low levels of testosterone. Orquidectomy did not affect gastric ghrelin secretion in the same way that testosterone treatment had no effect in orquidectomized males (Figure 3B). These effects at gastric level were reflected in the circulating levels of the hormone (Figure 3A). 4. EFFECT OF ESTROGENS EX VIVO ON GASTRIC GHRELIN SECRETION Taking into account that the key age for gastric ghrelin regulation was young age (4 weeks old), this parameter was studied in young female rats under several experimental approaches: animals 3 days after being subjected to surgical ovariectomy, animals with estrogen replacement after 3 days of ovariectomy and the sham-operated control animals (26). It was found that estrogen treatment in young ovariectomized females reversed the stimulatory effect on gastric ghrelin secretion exerted by the ovariectomy (control animals: 23.3±1.1 ng/ml, ovariectomized animals: 38.1±2.6 ng/ml, ovariectomy plus estradiol treatment: 26.8±2.1 ng/ml; **p≤0.01 vs control, ##p≤0.01 vs ovariectomy) (Figure 3D). 5. BREASTFEEDING EFFECT ON GASTRIC GHRELIN SECRETION Two experimental models were performed in order to determine what the implication of maternal food intake has on gastric ghrelin secretion. The first of those included young Resultados 56 animals of 4 weeks old which has been weaned at the end of the third week of life (21 days old). The second group was comprised of young animals that were still not weaned, named delay weaning model (DW). In the female group delay weaning did not alter the gastric secretion neither the plasmatic ghrelin levels (Figure 4 A and B). On the other hand, in the male group the delay of the weaning produced an increase in gastric ghrelin secretion (control animals: 51.6±2.9 vs delay weaning 61.3±3.3 ng/ml; *p≤0.05) (Figure 4 B). In circulating ghrelin levels the variation was not statistically significant (Figure 4A). Gastric mRNA levels of ghrelin were measured by quantitative real-time RT-PCR. It was found a decrease in gastric mRNA levels in females subjected to delay weaning (control: 100±12.8 vs delay weaning: 44.9±8.9 arbitrary units, **p≤0.01). Contrarily, gastric mRNA in males was not affected by delay weaning. (Figure 4C). Body weight was measured in the different groups and surprisingly it was found that delay weaning was associated with a decrease in body weight in both, males and females (control male: 74.5±2.6 g, delay weaning male: 62.5±2.8 grams, *p≤0.05; control female: 67.9±2.5 g, delay weaning female: 54.6±1.5 g, *p≤0.05) (Figure,5C). Estrogen and testosterone levels were calculated in each one of these experimental groups and it was found that delay weaning caused a diminution of the uterus weight in females (control: 0.058±0.007 g vs DW: 0.035±0.003 g, *p≤0.05) (Figure 5B). In addition, the delay weaning decreased the testosterone circulating levels in male animals (control: 0.02±0.002 ng/ml vs DW: 0.007±0.001 ng/ml; *p≤0.05) (Figure 5A). 6. AGE AND BREASTFEEDING EFFECT ON GOAT mRNA IN STOMACH MUCOSA. In the male groups an increase in GOAT mRNA levels was found with age: 2 weeks old females: 100 ±12 arbitrary units; 4 weeks old: 366±66 arbitrary units; 6 weeks old: 740±91.5 arbitrary units, **p<0.01 vs 2 weeks old; 8 weeks old: 814±155 arbitrary units, **p<0.01 vs 2 weeks old; * p<0.05)(Figure 6A). On the contrary the female group showed a peak in GOAT mRNA levels at 6 week of age: 320±43 arbitrary units vs 2 weeks old: 100±27 arbitrary units, **p<0.001 (Figure 6 B). By the other way, in the male group the breastfeeding induces a decrease in gastric GOAT mRNA levels as probed by the delay weaning group values (control: 100±14 arbitrary units vs delay weaning: 66±11 arbitrary units, *p<0.05). In contrast, in four weeks old male the daly of weaning did not affect GOAT mRNA levels (Figure 6C). Resultados 57 DISCUSSION An organ culture model of gastric tissue developed and validated by our group (32;33), has been used in the present study to assess the direct regulation of ghrelin secretion by the stomach during postnatal life. With this model, it has been shown that age, sexual steroids and dietary modifications regulate the stomach ghrelin secretory function, independently of the mRNA and circulating levels of this hormone. The most relevant findings in this paper were four: First, puberty is a key stage in the regulation of gastric secretory activity. The hormonal modifications associated to the pubertal period, i.e. variations of estrogen circulating levels, directly regulate gastric ghrelin secretion. Second, weaning is strongly implicated in gastric ghrelin secretion and body weight regulation. Third, the weaning delay affects sexual hormone levels, weight and ghrelin secretion. Fourth, all the mentioned factors are closely implicated in gastric GOAT mRNA regulation. Ghrelin expression shows age-related changes and sexual dimorphism. Several studies have reported that ghrelin producing cells are differentiated in a sexual dimorphic manner (28). In the present study, it was shown that plasmatic ghrelin levels were not affected in a significant way by age (Figure 1 A and E). According to the published results, our data indicate an increase in mRNA ghrelin expression in young (4 weeks old) female rats (Figure 1G). However, the most novel results showed that ghrelin secretion from the stomach was strongly altered in both male and female animals at 4 weeks of age and in 6 week old male animals (Figure 1 B and F). In the females, the beginning of the pubertal stage started at 4 weeks of life, and coincided with an increase in the uterus weight (Figure 1H); while in males it started at 6 weeks of life as shown by the increase in testosterone levels (Figure 1D). Under this context, the relevant variations in ghrelin secretion by the stomach were found in puberty, a period characterized by noticeable variations in estrogen and testosterone circulating levels, suggesting that both hormones may act on the stomach to regulate ghrelin production. To confirm this affirmation, a culture system of gastric tissue explants previously established by our group (33) was used in both ex vivo and in vitro studies. With this approach, the direct in vitro effect of estrogen treatment on this tissue induced a significant decrease in ghrelin secretion (figure 2B). On the contrary, direct treatment with testosterone on the stomach did not affect gastric ghrelin secretion (figure 2A). Our data is supported by the fact that estrogen receptor α (ERα) expression has been Resultados 58 reported in the stomach mucosa of rats; concretely in ghrelin producing cells (7). A previous study, using isolated stomach cells, found that estrogen treatment significantly stimulates ghrelin mRNA expression and the number of inmunopositive cells for ghrelin (29). These results are in agreement with our findings, as proved by an increase in gastric ghrelin mRNA in 4 week old females (Figure 1 G) which coincided with an increase in uterus weight (Figure 1 H), indicating high levels of estrogen during this stage of life. Together all these results suggested a new mechanism for gastric ghrelin production regulation, proposing that the decrease in ghrelin secretion from the stomach may be reflected in a greater amount of protein storage in ghrelin positive cells, as consequence of the increase in the mRNA expression found after estrogen treatment. In this paper, the effect of estrogen and testosterone modulation on gastric ghrelin secretion was tested ex vivo. It was found that estrogens act by regulating gastric ghrelin secretion. In a first phase after birth, basal estrogen levels are low, and around the fourth week of age, these levels increase noticeably reaching the threefold value at which they act as a triggered signal of the puberty onset and dropped gastric ghrelin secretion. This physiological regulation was reproduced in the lab through different approaches of estrogen manipulation. The increase in estrogen levels produced in early stage pubertal animals (4 weeks old) was blocked by surgical ovariectomy, and because of it manipulation, the drop in gastric ghrelin secretion was prevented as well. This kept the secretion within the range of basal values found between the 1st and the 3rd week of life (Figure 3C). Moreover, when the estrogen values were replaced by exogenous treatment, the ovariectomy effect was reverted. Gastric mRNA and plasma ghrelin modifications have been described in response to ovariectomy in several works (26). Previous data from other groups showed no specific changes in mRNA ghrelin levels in adult rat stomachs after ovariectomy (15), however another showed that gastric ghrelin expression increased in 4 weeks old animals with ovariectomy. This change is reverted by administration of 17-β estradiol. Our findings help to understand the contradictory data reported in the bibliography since it is confirmed that estrogen plays an important role in the regulation of ghrelin through a mechanism dependent upon age. The decreased gastric ghrelin secretion found in 4 week old males (Figure 1B) can not be explained as a consequence of variations in testosterone levels since the puberty in males was not reached until the sixth week of life. This fact was confirmed in the lab since these animals were subjected to orquidectomy and did not show variations in gastric ghrelin secretion (Figure 3B) Resultados 59 A modification of diet, the weaning, takes place immediately prior to the fourth week of life. This process is characterized by the step from breastfeeding to solid food ingestion and takes place at the end of the 3rd week of life. Possibly gastric ghrelin secretion modifications found at 4 weeks might be produced as a consequence of the weaning. This is supported by previous data showing that weaning appears to be important for gastric ghrelin expression regulation; this process has several effects on the maturation of ghrelin producing cells and morphology in the gastrointestinal tract (3). The direct ghrelin secretion by the stomach was measured in animals subjected to a delay in weaning in order to determine a possible association between weaning and gastric ghrelin production. This approach consists of preventing pups from eating solid food from day 21 (3 weeks of age) to day 28 (4 weeks of age), the pups remained with the mum for this period. In the female pups, the delay of weaning did not affect gastric ghrelin secretion (Figure 4A), probably due to the powerful effect of estrogen, which may be masking the effect of the diet modification. However the mRNA ghrelin was strongly inhibited as a consequence of the delay in weaning (Figure 4C), which is in agreement with the increase in ghrelin mRNA levels found in weaned females (figure 1C). Opposite to females, the delay weaning in male pups prevented the drop in gastric ghrelin secretion evoked in 4 week old weaned animals (Figure 4B). Although the tendency of the gastric ghrelin secretion was reflected in the circulating ghrelin (Figure 4A), the variation was not statistically significant. However, ghrelin mRNA was not affected by the weaning in males (figure 4C), and this is supported by the lack of effect of age in ghrelin mRNA (figure 1C). Our results are in contrast with previous data from another group which found a decrease in plasma ghrelin levels, ghrelin mRNA and ghrelin cell density in delayed weaning rats (11)but this group did not test the direct ghrelin secretion from the stomach. In addition the discrepancy with the present data could be explained because there are several methodological differences (e.g., the age of weaning). The possibility that maternal ghrelin could be crossing to the pup through ingestion of milk, should be considered since it is suggested by the data of plasmatic ghrelin levels (figure 4A), where it found that both, males and females under maternal feeding present increased ghrelin levels. However, with our explants model, direct secretion from the pup stomach was measured (figure 4B) and together with the data of mRNA (figure 4C), there is evidence that the stomach has its own mechanism of ghrelin regulation under diet modifications. Resultados 66 20. Iglesias MJ, Pineiro R, Blanco M, Gallego R, Dieguez C, Gualillo O, Gonzalez-Juanatey JR, Lago F. Growth hormone releasing peptide (ghrelin) is synthesized and secreted by cardiomyocytes. Cardiovasc Res 62:481-488, 2004. 21. Kamegai J, Tamura H, Shimizu T, Ishii S, Sugihara H, Oikawa S. Regulation of the ghrelin gene: growth hormone-releasing hormone upregulates ghrelin mRNA in the pituitary. Endocrinology 142:4154-4157, 2001. 22. Kamegai J, Wakabayashi I, Kineman RD, Frohman LA. Growth hormonereleasing hormone receptor (GHRH-R) and growth hormone secretagogue receptor (GHS-R) mRNA levels during postnatal development in male and female rats. J Neuroendocrinol 11:299-306, 1999. 23. Kirchner H, Gutierrez JA, Solenberg PJ, Pfluger PT, Czyzyk TA, Willency JA, Schurmann A, Joost HG, Jandacek RJ, Hale JE, Heiman ML, Tschop MH. GOAT links dietary lipids with the endocrine control of energy balance. Nat Med 15:741-745, 2009. 24. Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 402:656- 660, 1999. 25. Marriott LK, McGann-Gramling KR, Hauss-Wegrzyniak B, Sheldahl LC, Shapiro RA, Dorsa DM, Wenk GL. Brain infusion of lipopolysaccharide increases uterine growth as a function of estrogen replacement regimen: suppression of uterine estrogen receptor-alpha by constant, but not pulsed, estrogen replacement. Endocrinology 148:232-240, 2007. Resultados 67 26. Matsubara M, Sakata I, Wada R, Yamazaki M, Inoue K, Sakai T. Estrogen modulates ghrelin expression in the female rat stomach. Peptides 25:289-297, 2004. 27. Pekic S, Pesko P, Djurovic M, Miljic D, Doknic M, Glodic J, Dieguez C, Casanueva FF, Popovic V. Plasma ghrelin levels of gastrectomized and vagotomized patients are not affected by glucose administration. Clin Endocrinol (Oxf) 64:684-688, 2006. 28. Sakata I, Tanaka T, Matsubara M, Yamazaki M, Tani S, Hayashi Y, Kangawa K, Sakai T. Postnatal changes in ghrelin mRNA expression and in ghrelin-producing cells in the rat stomach. J Endocrinol 174:463-471, 2002. 29. Sakata I, Tanaka T, Yamazaki M, Tanizaki T, Zheng Z, Sakai T. Gastric estrogen directly induces ghrelin expression and production in the rat stomach. J Endocrinol 190:749-757, 2006. 30. Sakata I, Yang J, Lee CE, Osborne-Lawrence S, Rovinsky SA, Elmquist JK, Zigman JM. Colocalization of ghrelin O-acyltransferase and ghrelin in gastric mucosal cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 297:E134-E141, 2009. 31. Salfen BE, Carroll JA, Keisler DH, Strauch TA. Effects of exogenous ghrelin on feed intake, weight gain, behavior, and endocrine responses in weanling pigs. J Anim Sci 82:1957-1966, 2004. 32. Seoane LM, Al-Massadi O, Barreiro F, Dieguez C, Casanueva FF. Growth hormone and somatostatin directly inhibit gastric ghrelin secretion. An in vitro organ culture system. J Endocrinol Invest 30:RC22-RC25, 2007. Resultados 68 33. Seoane LM, Al-Massadi O, Caminos JE, Tovar SA, Dieguez C, Casanueva FF. Sensory stimuli directly acting at the central nervous system regulate gastric ghrelin secretion. an ex vivo organ culture study. Endocrinology 148:3998-4006, 2007. 34. Tanaka M, Hayashida Y, Nakao N, Nakai N, Nakashima K. Testis-specific and developmentally induced expression of a ghrelin gene-derived transcript that encodes a novel polypeptide in the mouse. Biochim Biophys Acta 1522:62-65, 2001. 35. Xu G, Li Y, An W, Li S, Guan Y, Wang N, Tang C, Wang X, Zhu Y, Li X, Mulholland MW, Zhang W. Gastric mammalian target of rapamycin signaling regulates ghrelin production and food intake. Endocrinology 150:3637-3644, 2009. 36. Yang J, Brown MS, Liang G, Grishin NV, Goldstein JL. Identification of the acyltransferase that octanoylates ghrelin, an appetite-stimulating peptide hormone. Cell 132:387-396, 2008. Resultados 69 FIGURE LEGENDS: FIGURE 1: Plasmatic ghrelin concentration in male (A) and female (E) rats of different ages (1-9 weeks old). n=10 Gastric ghrelin secretion from tissue explants from male (B) and female (F) rats of different ages (1-9 weeks old), to the incubation medium *p≤0.05, **p≤0.01 vs 3 weeks old; # p≤0.05, ## p≤0.01 vs 6 weeks old, n=10. Ghrelin mRNA expression in gastric mucosa by quantitative real-time RT-PCR, standardized by 18S mRNA levels in males (C) and females (G) with different ages (2, 4, 6, 8 weeks old), *p≤0.05, n=10. Testosterone levels from the male animals (1-9 weeks old) (D) and uterus weight from the female animals (H) of different age (1,3,4,5,7 and 9 weeks old).Values are mean ± SEM. *P≤0.05. **p≤0.01. n=10. FIGURE 2: Changes in gastric ghrelin secretion in A) Gastric explants from adult male rats treated in vitro with testosterone propionate. B) Gastric explants from adult female rats treated in vitro with 17β-estradiol. Values are mean ± SEM of ten individual dishes. **p ≤0.01. FIGURE 3:Plasmatic ghrelin levels from male (A) and female rats (C) and gastric ghrelin secretion from tissue explants from male (B) and female rats (D) under different approaches (sham: control 4 week old rats; OVX/ORQX: 4 week old rats subjected to surgical orquidectomy; ORQX+T: 4 week old rats treated with testosterone propionate and previously subjected to surgical orquidectomy and OVX+E: 4 weeks old rats treated with 17 β estradiol and previously subjected to surgical ovariectomy). Values are mean ± SEM . *p≤0.05, **p≤0.01, n=10. FIGURE 4: (A) Plasmatic ghrelin concentration in 4 week old male and female rats (B) Gastric ghrelin secretion from tissue explants from 4 week old male and female rats to the incubation medium (C) Ghrelin mRNA expression in gastric mucosa by quantitative real-time RT-PCR, standardized by 18S mRNA levels in 4 week old males and females C: control; DW: delay weaning. Values are mean ± SEM. *p≤0.05, **p≤0.01. n=10. FIGURE 5:(A) Testosterone levels (ng/ml) in control and delay weaning young male rats (B) Uterus weight in grams in control and delay weaning young female rats (C) Body weight in grams measured in males and females 4 weeks old rats, control and subjected to delay weaning. Values are mean ± SEM .*p≤0.05, n=10. Resultados 70 FIGURE 6: GOAT m RNA levels in gastric mucosa by quantitative real-time RT-PCR, standardized by Hypoxanthine phosporibosyltransferase 1 (HPRT1) RNA levels in males (A) and females (B) with different ages (2, 4, 6, 8 weeks old) and (C) 4 weeks old male and female rats C: control; DW: delay weaning. Values are mean ± SEM. *p< 0.05, **p< 0.001 vs 2 weeks, # p< 0.05 vs 4 weeks. n=10. Table 1: Primers and probes for real time-qPCR analysis. Resultados 71 Figure 1 Resultados 72 Figure 2 Figure 3 Resultados 73 Figure 4 Resultados 74 Figure 5 Resultados 75 Figure 6 Resultados 82 respect to fasting, but in the same way than glucose, increased with refeed to normal values (Fig. 4B). Body weight also showed compliance with the fasting protocol (Fig. 4C). To control the short-term time dynamic of the plasmatic changes observed, plasma ghrelin was measured at shorter intervals in freely moving cannulated rats (Fig. 5A). In the fasting group, plasma ghrelin remained high throughout, while refeeding induced a reduction in ghrelin levels that was evident at 15 and 30 min [620 ⫾66 pg/ml fast vs. 222 ⫾ 45 pg/ml control and 529 ⫾96 pg/ml refeed at 15 min (**, P⬍0.01 vs. control); 573 ⫾76 pg/ml at 36 h fasting vs. 250 ⫾ 34 pg/ml control and 441 ⫾82 pg/ml in refeed at 30 min (**, P⬍0.01 vs. control)]. On the other hand, tease feeding induced a dramatic reduction in ghrelin levels evident at 15 min (468 ⫾37 pg/ml tease feeding, NS vs. refeed) and 30 min (450 ⫾27 pg/ml tease feeding, NS vs. refeed), but the reduction disappeared at 60 min (45 min: 296 ⫾62 pg/ml control, 487 ⫾87 pg/ml fast, 317.5 ⫾73 pg/ml refeed, and 0 100 200 300 400 BODY WEIGHT (gram ) Control Fast 36h 0 36h0 36h INSULIN 0 1 2 3 CONTROL FAST 36 h REFEED TEASE FEEDING Insulin (ng/ml) ** GLUCOSE 0 50 100 150 200 250 CONTROL FAST 36 h REFEED TEASE FEEDING Glucose (mg/dl) ** * ** A B C F IG . 4. A, Plasma glucose levels in: ad libitum animals (control), fast 36 h, 15 min refeed after fasting, and tease feeding for 15 min after fasting expressed as mean ⫾ SE (n ⫽10) (**, P⬍0.01; *, P⬍0.05). B, Plasma insulin levels in: ad libitum animals (control), fast 36 h, 15 min refeed after fasting, and tease feeding for 15 min after fasting expressed as mean ⫾ SE (n ⫽10) (**, P⬍0.01; *, P⬍0.05). C, Body weight of experimental animals before and after fasting for 36 h. Seoane et al. • Ghrelin and Food Intake Endocrinology, August 2007, 148(8):3998–4006 4003 Resultados 83 426 ⫾36 pg/ml tease feeding; and 60 min: 312 ⫾62 pg/ml control, 481 ⫾69 pg/ml fast, 400 ⫾60 pg/ml refeed, and 585 ⫾103 tease feeding). It was measured insulin and glucose plasma levels in parallel to ghrelin to assess that the changes observed in plasma ghrelin were not mediated by changes in insulin. It was found that insulin (Fig. 5B) and glucose concentration were not affected by tease feeding because the values obtained were similar to that obtained in the fasting group. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 15 30 45 60 PLASMATIC GHRELIN (pg/ml) CONTROL FAST REFEED TEASE FEEDING ** ** ** ** **** * 0 100 200 300 400 500 600 700 800 15 30 45 60 PLASMATIC GHRELIN (pg/ml) CONTROL FAST REFEED TEASE FEEDING ** ** ** ** ** ** ** **** ** **** * 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 15 30 45 60 GLUCOSE (mg/dl) CONTROL FAST REFEED TEASE FEEDING **** * * *** 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 15 30 45 60 GLUCOSE (mg/dl) CONTROL FAST REFEED TEASE FEEDING **** * * *** 0 1 2 3 4 5 15 30 45 60 INSULIN (ng/ml) CONTROL FAST REFEED TEASE FEEDING **** ** **** 0 1 2 3 4 5 15 30 45 60 INSULIN (ng/ml) CONTROL FAST REFEED TEASE FEEDING **** ** **** **** ** **** A B C F IG . 5. A, Plasmatic ghrelin levels (pg/ml) at 15, 30, 45, and 60 min [**, P⬍0.01; *, P⬍0.05 (n ⫽10)]. B, Plasma glucose levels (pg/ml) at 15, 30, 45, and 60 min [*, P⬍0.05 (n ⫽10)]. C, Plasma insulin levels (pg/ml) at 15, 30, 45, and 60 min [*, P⬍0.05 vs. control groups (n ⫽ 10)]. 4004 Endocrinology, August 2007, 148(8):3998–4006 Seoane et al. • Ghrelin and Food Intake Resultados 84 Discussion To assess the direct regulation of ghrelin secretion by the stomach, an organ culture model of gastric tissue has been standardized in the present study. With this model, it has been proved that the food-mediated changes in plasma ghrelin levels are due to variations in ghrelin release by the stomach. However, there were two findings that were more surprising. First, excised tissues incubated for a total of 3 h, despite no longer being under central nervous system (CNS) control, still maintained the previous CNS conditioning. In fact, 15 min of feeding or even tease feeding, led to a reduction in gastric ghrelin secretion that was maintained 1–3 h after excision of the explant. Second, tease feeding (smell and sight of food, but not intake) was able to reduce gastric secretion of ghrelin in a way similar to true feeding. These findings strongly suggest that the influence of food on ghrelin secretion is partly mediated by nondigestive sensory signals, perhaps involving the vagus nerve. The findings also indicate that the neuronal network of the myenteric plexus is endowed with medium-term memory. As the first known orexigenic peptide coming from splanchnic tissues, ghrelin has raised considerable interest in the scientific community. A large number of communications have described the variations in ghrelin plasma levels in diverse clinical and experimental situations (1, 7, 12). It is well known that plasma ghrelin increases in states of negative energy balance, like fasting, and that it normalizes after refeeding (10). However, the mechanism of regulation has not been described, leading to the unproved assumption that any changes in plasma ghrelin are a reflection of changes in gastric release (23). A model that allows direct assessment of gastric ghrelin secretion would improve knowledge of ghrelin regulation. In the present study, a model for assessing gastric ghrelin secretion directly from gastric tissue explants was validated, and the optimal incubation period for the gastric explants was found to be 2 h. In states of fasting and refeeding, the observed ghrelin changes reported here in plasma, incubation media, and mRNA unambiguously validate this model for use in further studies. Fasting induced an increase in both gastric ghrelin secretion and mRNA content, generating an increase in ghrelin plasma levels. The fact that refeeding rapidly reversed those changes demonstrates, for first time, that the often-cited ghrelin changes in plasma under such conditions (24) are a direct reflection of changes in the gastric release of ghrelin. However, the effect of food intake on circulating ghrelin levels was found to involve a more complex mechanism of action than was previously thought. The time-course study of plasmatic ghrelin levels in freely moving rats showed that refeeding produced a strong and time-dependent reversion of the fasting-induced increase in plasma ghrelin levels; at 45 min of refeeding, ghrelin values were identical to those obtained in fed animals. Refeeding for just 15 min was enough to induce a quick blockade of ghrelin secretion from the stomach, but the time of refeeding was too short to affect enhanced ghrelin synthesis. These data suggest that ghrelin secretion directly from the stomach is the first target of ingested food and that inhibitory signals stop the release of previously synthesized ghrelin. The cephalic phase reflexes are anticipatory changes in the digestion process that allow a more efficient use of food. These complex changes are mostly mediated by enteric hormones whose release is dependent on CNS-generated neural stimuli, more than on nutrient-induced stimulation (25). It has been reported in many species that the cephalic response to sensory stimulations of food produces an increase in insulin, glucagon, and other incretins mediated by vagus nerve action on the pancreas (26). The present study aimed to analyze whether something similar could be controlling gastric ghrelin secretion. Human studies on this kind of anticipatory responses are limited, and some were not able to show clear results because psychological, cognitive, and social attitudes toward food influence individual responses (27). Similarly, studies have been performed in animals to assess the cephalic phase reflexes, but their mechanisms were not elucidated (25). The tease feeding used in this study is a model to study whether ghrelin is secreted as an anticipatory response to an imminent feeding or is activated by food stimuli; the model has been validated in the present work by the measure of insulin levels in which it was found a anticipatory response of insulin to sensory stimulus of food in the tease feeding group (Fig. 4B), although this change is not relevant to mediate the effect of this stimulus on plasma ghrelin as it was observed in insulin time-course study (Fig. 5B). Surprisingly, it was found that tease feeding and true refeeding produced similar effects on gastric ghrelin secretion and ghrelin plasma levels. The great difference between the two models was that in refeeding, the restored circulating ghrelin levels were maintained through the time, whereas in tease feeding, there was just a transient effect. These changes affected gastric ghrelin secretion but did not alter expression because enhanced ghrelin mRNA was unaltered. Interestingly, previous studies in sheep with pseudofeeding, in which the animals were provided with food wrapped in a nylon bag that could be swallowed but not digested, reported that the preprandial pulse of circulating ghrelin was reverted (25). This suggests that the regulation of circulating ghrelin is not merely due to absorption of nutrients, although in that model, the mechanical stimuli to esophagus and gastric wall were fully operative. In the tease feeding model presented here, there was no direct mechanical contact between food and esophagus or stomach; the only operative factor was sensorial stimuli acting at the CNS level because the animals could smell and see the food but not swallow, taste, or chew it. Nevertheless, a clear effect of blockade in ghrelin secretion was found. The present study suggests that ghrelin secretion directly from the stomach is not only due to direct mechanical contact with the gastric wall, digestion, or absorption of nutrients. Another relevant factor involved in this process is the CNS sensorial stimuli, which induce the cephalic responses. The implication of vagus nerve mediating the cephalic response of ghrelin to foodrelated stimuli is supported in the present study by the fact that both vagotomy and cholinergic blockade with atropine sulfate prevented the tease feeding-mediated ghrelin reduction because the values of gastric ghrelin secretion and plasmatic ghrelin levels in this group did not differ from those observed in fasting animals. We propose that ghrelin could be a neurally mediated integrative factor, constituting a link among the sensory qualities of food, neural activation, and nutrient metabolism. Moreover, ghrelin could be considered an incretin hormone. Gastric tissue excised from the organism maintained the previous secretory status for a period of 3 h after excision, sug- Seoane et al. • Ghrelin and Food Intake Endocrinology, August 2007, 148(8):3998–4006 4005 Resultados 85 gesting that the neurons from the enteric system of the gastric tissue have medium-term memory. Previous studies showed that there exists a molecular memory of synaptic activity at the enteric nervous system (27). Electrophysiological studies provide evidence that the prolonged activation of myenteric plexus neurons of the guinea pig contribute to a slowly developing, sustained increase in excitability of the neurons associated with depolarization and that this increased excitability lasted for up to 3.5 h after stimulation (28). In conclusion, the present study presents a suitable model for studying ghrelin secretion directly from the stomach, which eliminates interference produced by other organs. This new model demonstrated that food intake regulation of plasmatic ghrelin is mediated by gastric tissue because changes in nutritional status first affect ghrelin secretion before expression or circulating levels. For the first time, it has been shown that sensorial stimuli related to food, but without food ingestion, are able to modify gastric ghrelin secretion and circulating ghrelin levels in the same way that true food ingestion does, demonstrating that factors other than those caused by nutrient digestion or absorption are involved in ghrelin regulation. This regulation of ghrelin secretion from the stomach by food-related stimuli is mediated by a medium-term memory mechanism from the system of sensory neurons integrated in the enteric nervous system. Acknowledgments We thank Ms. Mary Lage and Dr. Francisco Barreiro for their expert technical assistance. Received February 15, 2007. Accepted April 30, 2007. Address all correspondence and requests for reprints to: Luisa M. Seoane, Area de Investigacion, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, P.O. Box 563, E-15780, Santiago de Compostela, Spain. E-mail: [email protected]. This research was supported by grants from the FIS (Fondo de Investigacio´n Sanitaria) and the Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad y Consumo (CP04/00158, PI 060935, PI 060705, and PI042251), and Xunta de Galicia (PGIDIT05BTF20802PR and PGIDIT06PXIB918360PR) and European Union (LSHM-CT-2003-503041). L.M.S. currently holds research contracts from the Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad y Consumo. Disclosure Statement: The authors have nothing to disclose. References 1. Van der Lely AJ, Tschop M, Heiman ML, Ghigo E 2004 Biological, physiological, pathophysiological, and pharmacological aspects of ghrelin. Endocr Rev 25:426–457 2. Barreiro ML, Gaytan F, Caminos JE, Pinilla L, Casanueva FF, Aguilar E, Dieguez C, Tena-Sempere M 2002 Cellular location and hormonal regulation of ghrelin expression in rat testis. Biol Reprod 67:1768–1776 3. 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Neuroscience 76:619–634 Endocrinology is published monthly by The Endocrine Society (http://www.endo-society.org), the foremost professional society serving the endocrine community. 4006 Endocrinology, August 2007, 148(8):3998–4006 Seoane et al. • Ghrelin and Food Intake DISCUSIÓN Discusión 89 DISCUSIÓN En los últimos años se han descubierto una gran cantidad de hormonas producidas en tejidos periféricos del organismo diferentes de los órganos endocrinos “clásicos”. Entre estos tejidos destacan el adiposo y el tracto gastrointestinal por lo cual algunos autores los han definido como auténticos órganos endocrinos. Aunque la ghrelina ha despertado desde el primer momento una gran expectación y se ha profundizado mucho en su conocimiento desde diversos campos científicos, aun no se ha aclarado por completo cual es su mecanismo de acción y de regulación. La mayoría de los trabajos relacionados con el tema versan sobre la variación de los niveles de ARNm, contenido gástrico de proteína a partir de extractos celulares y niveles plasmáticos o séricos de ghrelina (Tschop MH et al 2000, Van der Lely AJ et al 2004, Cummings DE et al 2001), dando por supuesta la teoría no probada de que cualquier cambio en la secreción plasmática de esta hormona se debe a cambios en la secreción gástrica (Sánchez J et al 2004). De esta manera un modelo que permitiese el estudio directo de la secreción gástrica de ghrelina podría mejorar el conocimiento de la regulación de esta hormona. En el presente trabajo se ha puesto a punto un sistema de cultivo de explantes de tejido gástrico, con el fin de determinar cómo es regulada la secreción de ghrelina directamente desde el estómago, sin interferencias de otros órganos. Se ha utilizado este sistema para determinar el efecto de los componentes del eje somatotropo, del desarrollo asociado a la edad, del estado de lactancia y de diferentes estímulos externos relacionados con la ingesta sobre la secreción gástrica de ghrelina. Discusión 90 Mediante experimentos in vitro, en un primer estudio, se ha estudiado el efecto de los componentes clásicos del eje somatotropo (GHRH, SS, GH e IGF-1) sobre la secreción gástrica de ghrelina. Demostramos como la adición de GH y SS a la placa de cultivo donde se encuentran los explantes gástricos es capaz de producir una disminución en la secreción gástrica de ghrelina a las dos y tres horas de incubación. Por otra parte la adición de IGF-1 y GHRH no alteraban los niveles basales de ghrelina gástrica (Seoane LM et al 2007a; Figura 1). En este trabajo se observó que la administración de GHRH a una concentración de 10-6 M no modificaba la secreción basal de ghrelina, esto puede justificarse por el hecho de que no se han encontrado hasta la fecha receptores de GHRH en el estómago por lo que esta hormona no tendría efectos relevantes a este nivel. Recientemente se ha encontrado un nuevo subtipo de receptor para esta hormona denominado SVI (Busto R et al 2002) pero los datos de este trabajo parecen indicar que los efectos de este receptor no incluyen la regulación de la secreción de ghrelina. En cuanto a la SS se sabe desde hace tiempo que se produce localmente en el estómago y que suprime la acción de varias hormonas entéricas de forma paracrina. Existen receptores para esta hormona en la mucosa gástrica lo cual sugiere que estas células productoras de SS en contacto con las células productoras de ghrelina podrían estar interaccionando a nivel del fundus gástrico (Di Vito L et al 2002, Shimada M et al 2003, Patel YC et al 1999). Varios trabajos sugieren una regulación negativa por parte de la GH sobre la ghrelina gástrica (Lee HM et al 2002, Qi X et al 2003, Tschop M et al 2002), apoyado este argumento en el hecho de la existencia de receptores de GH en el estómago e intestino (Nagano R et al 1995). Discusión 91 El mecanismo de acción bajo el cual se produce la disminución de los niveles de ghrelina mediados por GH puede ser aquel en el que el aumento de GH puede activar sus receptores en el estómago y aumentar los niveles de SS en el mismo, para reducir la secreción de ghrelina gástrica y posteriormente los niveles circulantes. La relación entre IGF-1 y ghrelina aun no está clara, de hecho hay una controversia sobre este tema en el que algunos autores postulan un aumento (Dall R et al 2002, Malik IA et al 2004, Rigamonti AE et al 2002) y otros un descenso (Whatmore AJ et al 2003, Bellone S et al 2003, Bellone S et al 2002, Kitamura S et al 2003) en los niveles de ghrelina tras una infusión de IGF-1. En este estudio se ha descartado un efecto positivo de IGF-1 directamente sobre la regulación del estómago. La ghrelina es un potente péptido orexigénico derivado del estómago que está implicado en la regulación del balance energético. Es razonable pensar que los niveles de este péptido varían con la edad para atender a las demandas energéticas de cada período de la vida. En un segundo estudio se demostró que aunque los niveles plasmáticos de ghrelina no están afectados de manera significativa por la edad, si lo está la secreción de ghrelina por el estómago (Al-Massadi O et al submmited, Figura 1). Se observó que las mayores variaciones en la secreción de esta hormona tanto en machos como en hembras se produjeron a la 4 y 6 semanas de edad. De acuerdo con los datos publicados hasta el momento también se observó un aumento de los niveles de expresión de ARNm de ghrelina en ratas hembra de 4 semanas, etapa que coincide con el inicio del periodo puberal (Sakata I et al 2002b). Los resultados sugieren que la pubertad es una etapa clave en la regulación de la secreción gástrica de ghrelina y que está regulada de manera independiente a la expresión de ARNm de ghrelina (Al-Massadi O et al submmited, Figura 1). Discusión 98 hormona los niveles de GOAT disminuyen. Así mismo los niveles de GOAT se incrementan en el periodo entre 4-6 semanas de edad (Al-Massadi O et al submmited, Figura 6A, B) en paralelo con la disminución en la secreción gástrica de ghrelina (Al- Massadi O et al submmited, Figura 1B, F). Los hallazgos más relevantes de este apartado son: primero, la etapa puberal es clave en la regulación de la actividad secretora de ghrelina a través de las modificaciones hormonales asociadas a este periodo, como por ejemplo variaciones en los niveles circulantes de estrógenos; segundo, las modificaciones producidas en la dieta como consecuencia del destete están fuertemente implicadas en la regulación de la secreción gástrica de ghrelina; tercero, la prolongación de la lactancia en roedores afecta a las hormonas sexuales y el peso corporal; cuarto, los niveles de ARNm de GOAT están regulados fuertemente por la edad y el destete de manera inversa a la secreción gástrica de ghrelina. En conclusión, todos estos datos podrían indicar que el estómago por él mismo puede regular su propia producción de ghrelina y de GOAT durante el desarrollo postnatal independientemente de otros órganos, para adaptar el organismo a los requerimientos metabólicos demandados en cada etapa de la vida. Por otra parte utilizando el mismo modelo de explantes de tejido gástrico se estudió mediante experimentos ex vivo, el comportamiento de esta hormona bajo cuatro estados nutricionales diferentes como son: ad libitum (libre acceso al alimento), ayuno de 36 h, realimentación tras un periodo de ayuno, y finalmente un grupo menos común en el que establecimos un simulacro de alimentación (tease feeding) donde el animal únicamente percibía los estímulos relacionados con el alimento (visión y olor) pero sin ingestión del mismo (Seoane LM et al 2007b; Figura 2B). Discusión 99 En este último estudio se hicieron medidas de expresión de ARNm, secreción desde tejido y niveles circulantes de ghrelina (Seoane LM et al 2007b; Figura 2). Dado que los niveles de ghrelina aumentan en estados energéticos negativos como el ayuno y que estos niveles se normalizan tras la realimentación, en el presente trabajo el ayuno produjo un aumento de los niveles de expresión de ARNm de ghrelina, así como de la secreción de ghrelina por el estómago, generando por tanto un aumento en los niveles de ghrelina plasmática (Seoane LM et al 2007b; Figura 2). El hecho de que la realimentación revierta de forma rápida esos niveles constituye la prueba de que los cambios en los niveles plasmáticos de ghrelina que se producen en esas condiciones son una consecuencia directa de los cambios en la secreción gástrica. Sin embargo, el efecto del alimento sobre los niveles de ghrelina circulante supone unos mecanismos de acción más complejos de los que previamente se pensaba. Un experimento que permitió un seguimiento del comportamiento de la ghrelina plasmática en el tiempo en ratas en libre movimiento, mostró que la realimentación produce una inhibición sostenida en el tiempo del incremento de los niveles plasmáticos de ghrelina inducido por el ayuno, así 45 minutos después de la realimentación, los niveles de ghrelina fueron idénticos a los valores obtenidos para las ratas alimentadas ad libitum. Además la realimentación durante 15 minutos tras un ayuno de 36 horas produce un bloqueo de la secreción gástrica de ghrelina pero no afecta a la síntesis de ghrelina que se encontraba incrementada por el ayuno (Seoane LM et al 2007b; Figura 5A). Este dato sugiere que la secreción de ghrelina directamente por el estómago es la primera diana del alimento ingerido. El simulacro de alimentación (tease feeding) que se ha utilizado es un modelo para estudiar como la ghrelina es secretada como respuesta anticipatoria a una alimentación Discusión 100 inminente; el modelo ha sido validado en este trabajo por la medida de los niveles de insulina en el cual encontramos una respuesta anticipatoria de insulina a los estímulos sensoriales en el simulacro de alimentación (Seoane LM et al 2007 b; Figura 4B) aunque este cambio no es relevante en la mediación del efecto de estos estímulos en la ghrelina plasmática como se observa en la cinética de insulina plasmática (Seoane LM et al 2007 b; Figura 5C). En este trabajo, por primera vez, se demuestra como los estímulos sensoriales relacionados con el alimento, pero sin que exista ingesta real del mismo, son capaces de modificar la secreción gástrica y los niveles circulantes de ghrelina de la misma manera que lo hace la verdadera ingesta de nutrientes. Este hecho muestra que otros factores diferentes de aquellos causados por la digestión o absorción de nutrientes están involucrados en la regulación de esta hormona. Esta regulación de la secreción gástrica de ghrelina por estímulos relacionados con el alimento está mediada por un mecanismo de memoria a medio plazo. Prueba de ello es el hecho de que tanto 15 minutos de realimentación como incluso 15 minutos de simulacro de alimentación tras el ayuno, dan lugar a una reducción en la secreción gástrica de ghrelina que se mantiene al menos durante 3 horas tras la extirpación del órgano, probablemente como consecuencia de la existencia de una red neuronal que compone el plexo mientérico del estómago (Seoane LM et al 2007 b; Figura 2B) Debido a la más que probable implicación del nervio vago en la mediación de los efectos de la ghrelina, se eliminó la conexión nerviosa que conecta el SNC y el estómago mediante una vagotomía quirúrgica bilateral o mediante un bloqueo farmacológico del impulso colinérgico en el grupo de ayuno y en el simulacro de alimentación para ver si esta inhibición en los niveles gástricos de ghrelina producida por los estímulos sensoriales era transmitida por esta vía. Al ver que la secreción Discusión 101 gástrica de ghrelina era idéntica en ambos grupos tras la operación quirúrgica y el bloqueo químico colinérgico se llegó a la conclusión de que los estímulos sensoriales eran capaces de regular la secreción gástrica de ghrelina y que esta regulación era mediada a través del nervio vago (Seoane LM et al 2007 b; Figura 3). En resumen, el presente trabajo presenta un modelo adecuado para el estudio de la secreción de ghrelina directamente a partir del estómago, el cual elimina posibles interferencias producidas por otros órganos. Constituye la primera demostración de que tanto GH como SS reducen la ghrelina plasmática por una acción inhibitoria directamente sobre el estómago, mientras IGF-1 y GHRH no producen ningún efecto en este modelo. También se ha probado que la secreción gástrica de ghrelina está regulada por la edad, esteroides sexuales y modificaciones en la dieta de forma independiente a los niveles circulantes y expresión de ARNm de este péptido. Por primera vez se muestra en el presente estudio que los niveles de testosterona en ratas macho así como el tamaño del útero en crías hembra disminuyen con el retraso del destete. Por otra parte los niveles de ARNm de GOAT están regulados fuertemente por la edad y el destete. En este nuevo modelo la regulación de los niveles de ghrelina plasmática por los estímulos sensoriales relacionados con la ingesta de alimentos es mediada por el tejido gástrico, teniendo en cuenta que cambios en el estado nutricional afectan a la secreción de ghrelina antes que a la expresión o a la ghrelina circulante y estos cambios son mediados por el nervio vago CONCLUSIONES Conclusiones 105 CONCLUSIONES: a) Se ha validado un nuevo modelo de explantes de tejido gástrico simple y reproducible que permite evaluar directamente la secreción tisular de ghrelina sin interferencias de otros tejidos o del aclaramiento metabólico. b) La GH y la SS inhiben la secreción gástrica de ghrelina actuando directamente a nivel gástrico. IGF-1 y GHRH no tienen actividad en este modelo. c) Existe una regulación género y edad dependiente de la secreción gástrica de ghrelina y de los niveles de ARNm de GOAT de alta relevancia. d) La lactancia modula la secreción gástrica de ghrelina y los niveles de ARNm de GOAT. e) Los estrógenos actúan directamente sobre el tejido gástrico disminuyendo la secreción gástrica de ghrelina mientras que la testosterona no presenta acciones evidentes en este modelo. f) Tanto el ayuno como la realimentación se traducen en un ajuste de larga duración en la secreción gástrica de ghrelina, que aumenta y disminuye respectivamente. Conclusiones 106 g) El SNE que regula la secreción de ghrelina opera funcionalmente a través de un mecanismo de memoria de duración horaria. h) La secreción gástrica de ghrelina está completamente subordinada a las órdenes del SNC. Una falsa alimentación contrarresta el efecto que ejerce el ayuno sobre la misma operando mediante señales que se transmiten por el nervio vago. ANEXO Bibliografía 115 BIBLIOGRAFÍA Adrian TE, Ferri GL, Bacarese-Hamilton AJ, Fuessl HS, Polak JM, Bloom SR. Human distribution and release of a putative new gut hormone, peptide YY. Gastroenterology 89:1070-7; 1985 Aimaretti G, Baffoni C, Broglio F, Janssen JA, Corneli G, Deghenghi R, van der Lely AJ, Ghigo E, Arvat E. Endocrine responses to ghrelin in adult patients with isolated childhood-onset growth hormone deficiency. Clin Endocrinol 56:765-71; 2002. Al-Massadi O, Crujeiras AB, Gonzalez CR, Dieguez C, Casanueva FF, Seoane LM. Direct ghrelin secretion from stomach and GOAT mRNA levels are influenced by age, sex and lactation status. Submmited. Alvarez-Castro P, Isidro ML, Garcia-Buela J, Leal-Cerro A, Broglio F, Tassone F, Ghigo E, Dieguez C, Casanueva FF, Cordido F. 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