Estudio del mecanismo de reacciones modelo de procesos enzimáticos: Catálisis electrófila en la desprotonación de la glicina en el carbono alfa

Departamento de Química Física Facultad de Química Universidad de Santiago de Compostela Estudio del mecanismo de reacciones modelo de procesos enzimáticos: Catálisis electrófila en la desprotonación de la glicina en el carbono alfa Tesis Doctoral Química Física Santiago de Compostela Enrique Riveiros Santiago Departamento de Química Física Facultad de Química Universidad de Santiago de Compostela Dña. Ana María Ríos Rodríguez, Profesora titular del departamento de Química Física de la Universidad de Santiago de Compostela, y D. Juan Crugeiras Martínez, Profesor Titular del mismo Departamento Informan: Que la presente memoria, titulada “Estudio del mecanismo de reacciones modelo de procesos enzimáticos: Catálisis electrófila en la desprotonación de la glicina en el carbono alfa”, que para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas presenta D Enrique Riveiros Santiago, ha sido realizada en el Departamento de Química Física de la Universidad de Santiago de Compostela bajo nuestra dirección. Considerando que constituye trabajo de Tesis, autorizan su presentación en la Comisión de Tercer Ciclo de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firmamos el presente informe en Santiago de Compostela, a 19 de noviembre de 2012 Fdo. Ana María Ríos Rodríguez Fdo. Juan Crugeiras Martínez El estudio que se expone en la presente memoria se ha llevado a cabo en el departamento de Química Física de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo la dirección de los profesores D. Juan Crugeiras y Dña. Ana Ríos a los que quiero expresar mi agradecimiento por su constante apoyo y dedicación. Es también mi deseo agradecer a la Dr. AnnMarie O’Donoghue, Lecturer of the University of Durham, UK, por su gran amabilidad y ayuda durante las estancias en el reino unido. A mis compañeros de laboratorio les deseo todo lo mejor, y les agradezco su amistad. A mi familia por estar siempre ahí. ÍNDICE 1. OBJETIVOS 2. INFORME BIBLIOGRÁFICO 2.1 Introducción 2.2 Reacciones de transferencia protónica en el Carbono 2.3 El centro enzimático como medio de reacción 2.4 Formación y estabilidad de los enolatos de aminoácidos 2.5 Piridoxal 5’-fosfato como cofactor enzimático 2.6 Modelos no enzimáticos de la catálisis del piridoxal 5’-fosfato 2.7 Mecanismo de actuación del PLP como catalizador de reacciones de aminoácidos 2.8 Reacciones modelo que tienen al PLP como catalizador 2.8.1 Transaminación 2.8.2 Racemización 2.8.3 Descarboxilación 2.8.4 α−β α−βα−β α−β eliminación 2.8.5 Ruptura aldólica 2.9 Piridoxamina 5’-fosfato como coenzima CAPÍTULO 3 3. Enolatos de glicina: Efecto de la formación de iones iminio con cetonas simples sobre la acidez del carbono en posición α αα α al grupo amino 3.1 Introducción 3.2 Sección Experimental 3.2.1 Materiales 3.2.2 Métodos Generales 3.2.3 Análisis Espectroscópico RMN 1 H 3 9 11 14 16 18 22 24 25 27 29 30 31 33 35 36 37 39 39 42 42 43 44 ÍNDICE 3.2.4 Determinación de las Constantes de Equilibrio 3.2.5 Medidas Cinéticas 3.3 Resultados 3.3.1 Constantes de Equilibrio para la Formación de la Imina 3.3.2 Constantes de Velocidad para el Intercambio por Deuterio 3.3.2.1 Catálisis por acetona 3.3.2.2 Catálisis por fenilglioxilato 3.4 Discusión de los Resultados 3.4.1 Caminos de Reacción 3.4.2 Correlaciones de Brønsted 3.4.3 Catálisis Electrófila en la Desprotonación de la Glicina CAPÍTULO 4 4. Efecto de los sustituyentes sobre la estabilidad termodinámica de iminas derivadas de la glicina y aldehídos aromáticos. Importancia de la estructura del piridoxal 5’-fosfato en su actividad catalítica 4.1 Introducción 4.2 Sección Experimental 4.2.1 Materiales 4.2.2 Métodos Generales 4.2.3 Análisis Espectroscópico RMN 1 H 4.2.4 Determinación de las Constantes de Equilibrio 4.3 Resultados 4.4 Discusión 4.4.1 Fuerza del enlace de hidrógeno intramolecular en aldiminas de PLP 4.4.2 Otros Efectos de los Sustituyentes sobre la Estabilidad de los 45 46 51 51 58 58 64 70 70 73 73 81 83 83 86 86 86 87 88 90 101 103 ÍNDICE Iones Iminio 4.4.3 Catálisis Enzimática CAPÍTULO 5 Efecto de los Sustituyentes en la Catálisis Electrofila por el Grupo Carbonilo: Descripción del Aumento de Velocidad en la Desprotonación de la Glicina catalizada por PLP 5.1 Introducción 5.2 Sección Experimental 5.2.1 Materiales 5.2.2 Métodos Generales 5.2.3 Análisis Espectroscópico RMN 1 H 5.2.4 Determinación de las Constantes de Equilibrio 5.2.5 Medidas Cinéticas 5.3 Resultados 5.3.1 Constantes de Equilibrio para la Formación de Iminas 5.3.2 Reacciones de Intercambio por Deuterio 5.3.2.1 Catálisis por Acetona 5.3.2.2 Catálisis por Benzaldehído (2) 5.3.2.3 Catálisis por Salicilaldehído (3) 5.4 Discusión de Resultados 5.4.1 Valores de pK a de los Ácidos de Carbono 5.4.2 Efecto de los Sustituyentes sobre la Acidez del Carbono de la Glicina 5.4.2.1 Efecto del Grupo Ión Iminio 5.4.2.2 Efecto de Sustituyentes Aromáticos en el Nitrógeno en α αα α al Grupo Iminio 113 117 119 121 121 126 126 126 127 128 129 130 130 135 135 140 141 145 147 154 154 156 CAPÍTULO 1 8 investigando el efecto catalítico de tres tipos de compuestos carbonílicos (cetonas simples, moléculas con el grupo piruvoilo y análogos del piridoxal 5´- fosfato) sobre la reacción de desprotonación de la glicina en el carbono α. Mediante este estudio se proyecta obtener información sobre los siguientes aspectos: (1) Reactividad de las bases de Schiff de aminoácidos como ácidos de carbono. Se determinarán las constantes de velocidad para la desprotonación de los iones iminio por bases. Será de interés comparar la reactividad de estos compuestos con la de otros ácidos de carbono de importancia biológica. (2) pK a de estos ácidos de carbono. Se intenta determinar las constantes de acidez para la ionización de los iones iminio actuando como ácidos de carbono. Se pretende proporcionar una medida de la estabilización de los enolatos de aminoácidos mediante la formación de estos aductos con compuestos carbonílicos. (3) Papel que desempeñan los distintos grupos funcionales presentes en la molécula de piridoxal en la actividad catalítica de esta coenzima en las reacciones de aminoácidos. Se estudiará la catálisis covalente por moléculas similares al piridoxal eliminando sistemáticamente alguno de sus grupos funcionales. Los resultados obtenidos permitirán evaluar la contribución relativa de la base de Schiff y del anillo de piridina a la estabilización del carbanión formado como intermedio en estos procesos. (4) Origen de la catálisis observada para la racemización enzimática. Se determinará qué fracción de la catálisis observada para las racemasas de aminoácidos que utilizan el piridoxal 5´-fosfato como coenzima es debida a la activación intrínseca de los protones en el carbono α del aminoácido por este cofactor electrofílico. 9 INFORME BIBLIOGRÁFICO INFORME BIBLIOGRÁFICO 11 INFORME BIBLIOGRÁFICO 2. INFORME BIBLIOGRÁFICO 2.1 Introducción Las enzimas catalizan las reacciones bioquímicas en las células de todos los organismos, reacciones que constituyen la base química de la vida. La mayor parte de las enzimas son proteínas (unas pocas son ácidos ribonucleicos o ribonucleoproteínas). En ellas los grupos catalíticos están localizados en una zona muy concreta, denominada centro activo, al cual se unen los sustratos que posteriormente son convertidos en productos. El primer objetivo de cualquier estudio mecanicista consiste en la descripción de la acción catalítica de la enzima a nivel atómico. Los sucesos fundamentales en la catálisis enzimática están determinados por las interacciones entre un sustrato y el centro activo del enzima, y constituyen la base molecular del efecto catalítico observado. Las interacciones entre el sustrato y el centro activo de la enzima pueden ser de tipo electrostático, hidrofóbico y enlace de hidrógeno, y los grupos carboxilato, amino, imidazol, hidroxilo, y tiol de las cadenas laterales de aminoácidos actúan como catalizadores ácido-base, nucleofílicos y electrofílicos. Puesto que el número de grupos funcionales de las cadenas laterales de aminoácidos es muy limitado, las propiedades químicas de las enzimas han sido extendidas, en su evolución, mediante la incorporación de coenzimas que se unen al enzima y proporcionan propiedades fisicoquímicas que no posee la estructura proteica. CAPÍTULO 2 12 Figura 2.1. Incrementos de velocidad en la catálisis enzimática. En las escalas logarítmicas de la figura se correlacionan las constantes de velocidad de orden uno para algunas reacciones, con el número de recambio, k cat , para las mismas reacciones catalizadas por enzimas. Las enzimas catalizan reacciones biológicas a velocidades que, en general, son incomprensiblemente más rápidas que las correspondientes reacciones no catalizadas. El incremento de velocidad que se produce en presencia del catalizador con respecto al proceso no catalizado ha podido determinarse para algunos tipos de reacciones enzimáticas. Este factor de incremento de velocidad puede medirse comparando la constante de velocidad para el proceso no enzimático con la constante de velocidad para la reacción enzimática. Aunque dicha comparación no siempre es fácil de realizar, en muchos casos es posible comparar constantes de velocidad para reacciones 13 INFORME BIBLIOGRÁFICO unimoleculares o pseudo-unimoleculares que transcurren en presencia y en ausencia de la enzima. En la figura 2.1 se incluyen algunos ejemplos. La escala logarítmica de la izquierda recoge las constantes de velocidad de primer orden y pseudoprimer orden, y tiempos de vida media para un conjunto de reacciones no sujetas a catálisis enzimática. En la escala logarítmica de la derecha (más ampliada) se representan los valores de k cat para las correspondientes reacciones catalizadas por enzimas. El parámetro k cat es el número de recambio para una enzima, y se define como el número de moléculas de sustrato convertidas en productos, por molécula de enzima y por unidad de tiempo. La eficiencia catalítica de un enzima se define a través de la relación k cat /K m , donde K m es la constante de Michaelis, que se corresponde con la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es igual a la mitad de la velocidad enzimática máxima. Las constantes de velocidad para las reacciones no enzimáticas van desde 10 -17 hasta 10 -1 s -1 , correspondientes a tiempos de vida media que van desde 1 billón de años hasta 5 segundos, respectivamente. Las constantes de velocidad para procesos enzimáticos, k cat , van de 10 a 10 7 s -1 , lo cual implica que el intervalo de constantes de velocidad para procesos no enzimáticos es aproximadamente diez órdenes de magnitud más amplio que el que corresponde a los procesos enzimáticos. El factor de incremento de velocidad, k cat /k, para las reacciones enzimáticas descritas en el esquema de la figura 2.1 va desde 5×10 5 para la reacción de isomerización cis-trans en proteínas hasta 7×10 19 para la descarboxilación de un aminoácido. El mecanismo a través del cual tiene lugar esta isomerización es probablemente similar en los procesos no enzimático y enzimático, ya que esta reacción no implica la ruptura de enlaces covalentes. CAPÍTULO 2 14 En el caso de la reacción de descarboxilación de aminoácidos, sin embargo, los mecanismos enzimático y no enzimático son muy distintos. En el proceso enzimático interviene una coenzima (el piridoxal-5’-fosfato) que se une al aminoácido para formar una imina, y proporciona la contribución más importante a la eficiencia catalítica de la enzima. La coenzima es un elemento del proceso enzimático, aunque introduce un cambio en el mecanismo de reacción. De todas formas, los incrementos de velocidad típicos de las enzimas son enormes independientemente del mecanismo de reacción. 2.2. Catálisis enzimática de las reacciones de transferencia protónica en el carbono Los enlaces C-H presentes en las moléculas biológicas tienen que ser estables en agua para garantizar la viabilidad de los sistemas vivos, pero a la vez es necesario que existan mecanismos de catálisis enzimática que reduzcan la escala de tiempos para la ruptura heterolítica de dichos enlaces en una gran variedad de procesos metabólicos. El análisis del mecanismo por el cual la unión de la biomolécula al catalizador enzimático facilita la reacción de transferencia protónica en el carbono requiere la integración de resultados de diferentes estudios. Estos incluyen la determinación de la estructura del complejo enzima-sustrato, la investigación del mecanismo de la correspondiente reacción de transferencia protónica en agua en ausencia de la enzima, y el estudio del efecto del entorno local de la proteína sobre la estabilidad del estado de transición para esta reacción. 1 El intervalo amplio de constantes de velocidad de orden dos (k B ) observado para la transferencia protónica no-enzimática de ácidos de carbono a 1 Richard, J. P.; Amyes, T. L.; 2001 Current Opinion in Chemical Biology. 5: 626-633. 15 INFORME BIBLIOGRÁFICO bases de Brønsted en disolución acuosa pone de manifiesto la gran variedad de barreras termodinámicas para la transferencia protónica. Sin embargo, la amplitud del intervalo de valores de la eficacia catalítica, k cat /K M , para las mismas reacciones catalizadas por enzimas es mucho menor, lo que demuestra que existen grandes diferencias en el incremento de velocidad, (k cat /K M )/k B , logrado por distintas enzimas en la desprotonación de ácidos de carbono. 2 Estas diferencias en el trabajo realizado por diferentes enzimas 3,4 se deben de tener en cuenta a la hora de comparar su mecanismo de acción en la catálisis de la transferencia protónica de ácidos de carbono fuertes y débiles. La reactividad relativa de diferentes ácidos de carbono en reacciones de transferencia protónica no catalizadas por enzimas viene determinada por su valor de pK a . El problema radica en determinar los valores de pK a para ácidos de carbono débiles en agua, debido a que la concentración de equilibrio de la base conjugada es demasiado pequeña para poder detectarla con medidas directas. Las constantes de acidez en el carbono se pueden determinar a partir de la relación de constantes de velocidad para la transferencia protónica reversible del ácido de carbono al disolvente (HO – o H 2 O) o a una base de Brønsted, junto con el valor de pK a de la especie que actúa como base. Las constantes de velocidad para la desprotonación de ácidos de carbono débiles se pueden determinar monitorizando la incorporación de deuterio en el ácido de carbono utilizando D 2 O como disolvente. 5,6 La constante de velocidad para la protonación rápida del carbanión formado se puede estimar utilizando una 2 Richard, J. P.; 1984 J. Am. Chem. Soc. 106: 4926-4936. 3 Bearne, S. L.; Wolfenden, R.; 1995 J. Am. Chem. Soc. 117: 9588-9589. 4 Taylor, E. A.; Palmer, D. R. J.; Gerlt, J. A,; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 5824-5825. 5 Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 1992 J. Am. Chem. Soc. 114: 10297-10302. 6 D’Ordine, R. L.; Bahnson, B. J.; Tonge, P. J.; Anderson, V. E.; 1994 Biochemistry. 33: 14734-14742. CAPÍTULO 2 16 reacción controlada por difusión como reloj para la transferencia protónica 7,8 , o bien directamente estudiando la protonación de enolatos generados mediante fotólisis de destello 9 , entre otros métodos. 2.3 El centro activo enzimático como medio de reacción Una gran parte del poder catalítico de las enzimas procede de la orientación favorable del sustrato en el centro activo enzimático, que favorece la formación del estado de transición para la reacción catalizada. Este centro activo es una región específica de la enzima en la que se encuentran los residuos de aminoácidos que contribuyen a la unión del sustrato (y del cofactor si lo hay) y aquellos que participan en la catálisis enzimática, también llamados grupos catalíticos. El centro activo es una parte pequeña del volumen total de la enzima. La mayor parte de los residuos de aminoácidos de la proteína no tienen contacto con el sustrato y su función es la de crear la estructura tridimensional del centro activo, en la que participan una serie de aminoácidos que están alejados unos de otros en la estructura primaria de la enzima. Los centros activos enzimáticos son generalmente hendiduras o grietas que tienen un cierto carácter no polar, es decir, con una constante dieléctrica efectiva menor que la del agua. Sin embargo, en su interior están presentes de forma estructurada un número limitado de cadenas laterales de aminoácidos con carga o polares, que a su vez interaccionan con los grupos polares o con carga del sustrato. En el microentorno no polar del centro activo, algunos de 7 Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 1996 J. Am. Chem. Soc. 118: 3129-3141. 8 Richard, J. P.; Williams, G.; Gao, J.; 1999 J. Am. Chem. Soc, 121: 715-726. 9 Bakulev, V. A.; Chiang, Y.; Kresge, A. J.; Meng, Q.; Morzherin, Y. Y.; Popik, V. V.; 2001 J. Am. Chem. Soc, 123: 2681-2682. 17 INFORME BIBLIOGRÁFICO estos residuos polares adquieren propiedades especiales que son esenciales para la catálisis. La barrera termodinámica para la transferencia protónica constituye la contribución más importante a la barrera de activación para la desprotonación de un carbono en posición alfa a un grupo carbonilo en el centro activo enzimático. La bibliografía recoge un gran número de evidencias experimentales que indican que ciertos grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de aminoácidos son necesarios para observar una catálisis eficiente. Sin embargo, la catálisis de esta reacción de desprotonación por ácidos y bases de Brønsted en agua es generalmente débil. No se han realizado muchos estudios dirigidos a entender el origen de este aumento en la magnitud de la catálisis por ácidos y bases de Brønsted en reacciones catalizadas por enzimas. 10 La existencia de una mayor fuerza impulsora para la transferencia protónica del carbono a la base catalítica en el medio enzimático en comparación con el medio acuoso permitiría explicar la intensificación de la catálisis ácido-base en presencia de la enzima. El centro activo enzimático es un medio de constante dieléctrica muy inferior a la del agua, en el que están presentes una serie de grupos polares con la orientación adecuada para proporcionar una estabilización electrostática del anión enolato formado como producto de la reacción. La magnitud de esta interacción electrostática es inversamente proporcional a la constante dieléctrica del medio y, por lo tanto, la estabilización del estado de transición será mayor en el medio enzimático que en disolución. 11,12,13 Además, la interacción entre el estado de transición y 10 Richard, J. P.; 1998 Biochemistry 37: 4305-4309. 11 Richard, J. P.; Amyes, T. L.; 2004 Bioorganic Chemistry 32: 354-366. 12 Simonson, T.; Carlsson, J; Case, D. A.; 2004 J.Am. Chem. Soc. 126: 4167-4180. 13 Antosiewicz, J.; McCammon, J. A.; Gilson, M. K.; 1996 Biochemistry 35: 7819-7833. CAPÍTULO 2 24 alfa al grupo imino, ya que la ruptura heterolítica de cualquiera de estos enlaces con pérdida de H + , CO 2 o R + permite obtener un enolato fuertemente estabilizado por delocalización de la carga negativa en el sistema π conjugado. El trabajo pionero del grupo de E. E. Snell alrededor de 1950 sobre la reactividad de esta coenzima proporcionó el fundamento mecanicista necesario para analizar su actividad enzimática. 25,26 2.6 Modelos no enzimáticos de la catálisis por piridoxal 5’-fosfato La capacidad del piridoxal 5’-fosfato, PLP, para estabilizar la carga negativa en el carbono en alfa al nitrógeno de la imina hace que, en ausencia de la enzima, este cofactor catalice muchas de las reacciones en las que está implicado a nivel metabólico. Sin embargo, estas reacciones modelo son, en general, reacciones muy lentas, hecho que, junto con la complicación derivada de la existencia de diferentes formas iónicas de la aldimina, dificulta enormemente su estudio. 27 En los primeros estudios sobre el mecanismo de las reacciones catalizadas por la vitamina B6, E. E. Snell y col. identificaron el grupo aldehído, el grupo fenol y el anillo de piridina como las características estructurales de esta molécula que son esenciales para su actividad catalítica. De los estudios llevados a cabo en su laboratorio sobre las reacciones noenzimáticas del PLP estos autores obtuvieron las siguientes conclusiones: 25 Snell, E..E; 1944 J. Biol. Chem.. 154: 313-314. 26 Snell, E..E; Leklem, J. E.; Reynolds, R. D.; 1981 Methods in Vitamin B 6 Nutrition 1-19, Plenum, New York. 27 Metzler, D. E.; Ikawa, M.; Snell, E. E.; 1954 J. Am. Chem. Soc. 76: 648-652. 25 INFORME BIBLIOGRÁFICO (i) El grupo aldehído del cofactor reacciona fácil y reversiblemente con distintos aminoácidos para formar las correspondientes bases de Schiff, que posteriormente evolucionan para dar los productos de reacción. (ii) Un aldehído es un buen catalizador cuando posee un grupo fuertemente atractor de electrones, como el nitrógeno del anillo de piridina del PLP, en posición orto o para al grupo –CHO. (iii) La presencia del grupo hidroxilo adyacente al grupo aldehído hace aumentar la actividad catalítica del PLP. Esto se considera debido a la formación de un anillo quelato de seis miembros que mantiene la base de Schiff en una conformación plana. (iv) En sistemas modelo, los grupos 5-hidroximetil y 2-metil no juegan un papel importante en la catálisis. Sin embargo, en medios enzimáticos el grupo 5-CH 2 OPO 32– constituye un punto de unión de la coenzima a la proteína. El efecto que producen los diferentes sustituyentes sobre la capacidad catalítica del PLP es objeto de estudio de este informe. 2.7 Mecanismo de actuación del PLP como catalizador de reacciones de aminoácidos En 1952 Braunstein y col. 28 propusieron un mecanismo general para la acción catalítica del PLP basándose en estudios de enzimas que utilizan este cofactor para catalizar reacciones del metabolismo de los aminoácidos. Este mecanismo, que coincide con el propuesto por Snell 29 a partir del estudio de reacciones no-enzimáticas, puede ser resumido como: El piridoxal fosfato reacciona para convertir el grupo amino de un substrato en una base de Schiff 28 Braunstein, A. E.; Kritzmann, M. G.; 1952 Dokl Akad Nauk SSSR. 85: 1115-1118. 29 Metzler, D. E.; Ikawa, M.; Snell, E. E.; 1954 J. Am. Chem. Soc. 76: 648-652. CAPÍTULO 2 26 que es electrónicamente equivalente a un carbonilo adyacente. Sin embargo, la base de Schiff de un aminoácido con un aldehído sencillo (como por ejemplo el acetaldehído) tiene la polaridad opuesta a la de este grupo C=O, así que una imina no podría sustituir a un grupo carbonilo en la activación de un protón en posición α ni en facilitar la ruptura del enlace C-C del aminoácido. Es necesaria por lo tanto la presencia de un grupo fuertemente aceptor de electrones, como la piridina, conjugado con el grupo C=N, de forma que los electrones puedan fluir del substrato a la coenzima. Figura 2.4 Piridoxal 5’-Fosfato (PLP), un coenzima especial para las r eacciones de los aminoácidos. 27 INFORME BIBLIOGRÁFICO 2.8 Reacciones modelo que tienen al PLP como catalizador Se conocen en la actualidad las estructuras de 1125 enzimas que utilizan el piridoxal 5’-fosfato como cofactor. La gran abundancia de enzimas dependientes del PLP en sistemas biológicos es debida, sin duda, a la utilidad catalítica de este cofactor en las transformaciones químicas de los aminoácidos, y no es por lo tanto sorprendente el número considerable de reacciones químicas no-enzimáticas que pueden experimentar las aldiminas formadas por el PLP con α-aminoácidos. Se han identificado, a través del estudio de sistemas modelo, los siguientes tipos de reacciones de aminoácidos en las que participa el PLP. 1. Transaminación (de aminoácido a cetoácido) 2. Intercambio del protón en posición α. 3. Racemización del centro quiral en el carbono en posición α. 4. Ruptura del enlace C-C en la posición α−β del aminoácido (ruptura aldólica). 5. Reacción de α−β eliminación cuando el sustituyente en posición β es electronegativo. 6. Descarboxilación en la posición α. 7. Descarboxilación en la posición γ. El descubrimiento de estas reacciones, tanto en ausencia como en presencia de enzimas, se produjo más o menos simultáneamente, aunque algunas de ellas fueron descritas en primer lugar en sistemas no-enzimáticos. La gran ventaja del estudio de sistemas modelo en disolución acuosa frente a los correspondientes sistemas enzimáticos radica en la posibilidad de observar la reacción en intervalos amplios de pH y así poder determinar la reactividad CAPÍTULO 2 28 de las distintas formas iónicas de la aldimina. Al mismo tiempo, en ocasiones es útil hacer modificaciones en la estructura del PLP, eliminando sistemáticamente alguno de sus grupos funcionales. De esta forma se puede obtener información sobre el papel de los distintos sustituyentes presentes en el cofactor en la catálisis. El 5´-deoxipiridoxal (DPL) es muy útil como análogo del PLP en estudios llevados a cabo mediante espectroscopía RMN, debido a las complicaciones que causa el grupo fosfato cuando se utiliza esta técnica. Figura 2.5 Estructuras del piridoxal 5’-fosfato y algunos de sus análogos utilizados en los estudios de reacciones modelo de este cofactor enzimático con aminoácidos. 29 INFORME BIBLIOGRÁFICO 2.8.1 Transaminación Las reacciones de transaminación y racemización de aminoácidos fueron las primeras reacciones en la que se demostró experimentalmente la presencia de la base de Schiff formada con el PLP y su papel como intermedio de la reacción. 30 La transaminación convierte el α-aminoácido en un αcetoácido a través de una segunda base de Schiff denominada cetimina. 30 Metzler, D. E.; Ikawa, M.; Snell, E. E.; 1954 J. Am. Chem. Soc. 76: 648-652. Figura 2.6 Mecanismo de la reacción de transaminación catalizada por piridoxal. CAPÍTULO 2 30 El intermedio de la reacción es un carbanión producido por la desprotonación de la aldimina en el carbono α y que está estabilizado por delocalización de la carga negativa en el anillo de piridina del cofactor. La reprotonación de este intermedio en el carbono 4’ del cofactor conduce a la cetimina, que se hidroliza para formar la piridoxamina 5’-fosfato y el correspondiente α-cetoácido. Martell y col. 31 sugirieron que la tendencia a reprotonar el carbanión en el carbono α debería predominar, ya que la aldimina formada estaría estabilizada por conjugación con el anillo aromático. Sin embargo, la presencia de grupos dadores de carga unidos a la posición α favorecería la distorsión de la nube electrónica delocalizada, aumentando la reprotonación del carbanión en la posición 4’ y por lo tanto la formación de una cetimina. 2.8.2 Racemización La reacción de racemización de un α-aminoácido catalizada por PLP viene precedida por la formación de un carbanión tras la abstracción de un protón del carbono en la posición α de la base de Schiff. La reprotonación del intermedio carbaniónico en la misma posición ocurre sin estereoespecificidad. Las enzimas que catalizan esta reacción se denominan racemasas y tienen gran importancia para las bacterias, pues sintetizan D-alanina y D-ácido glutámico a partir de los isómeros L-. 32 La ruptura heterolítica del enlace del átomo de hidrógeno en posición α a la base de Schiff es el punto de partida de muchas de las reacciones de los α-aminoácidos catalizadas por piridoxal. 31 Martell, A. E.; 1982 Adv. Enzymol. 53: 163-199. 32 Shaw, J. P.; Petsko, G. A.; Ringe, D.; 1997 Biochemistry. 36: 1329-1342. 31 INFORME BIBLIOGRÁFICO 2.8.3 Descarboxilación La reacción de descarboxilación de los α-aminoácidos es una reacción irreversible que suele aparecer con frecuencia como la etapa final en la síntesis de compuestos con un grupo amino. 33 Son muchas las enzimas dependientes del piridoxal 5’-fosfato que catalizan esta reacción, dando lugar a la formación de aminas bioactivas. La catálisis por PLP de la reacción de descarboxilación de ácidos α-amino monocarboxílicos es muy difícil de observar en sistemas modelo, 34 ya que existen otras reacciones que se inician con la desprotonación del carbono α que ocurren a mayor velocidad. 35 En las aldiminas formadas entre los α-aminoácidos y el PLP, el grupo carboxilato está coordinado a través de un enlace de hidrógeno al átomo de nitrógeno protonado de la imina. La existencia de este enlace de hidrógeno favorece la orientación del grupo carboxilato en el plano del anillo aromático. La disposición más favorable para liberar el par electrónico enlazante por superposición con el sistema π de la base de Schiff sería una posición perpendicular al plano del anillo aromático. 36 La coordinación del grupo carboxilato con el nitrógeno protonado de la imina parerce ser suficiente para prevenir la descarboxilación en posición α. Diversos estudios en sistemas modelo no-enzimáticos han demostrado que el piridoxal 5’-fosfato cataliza una serie de reacciones de los aminoácidos. Sin embargo, una enzima dependiente del PLP concreta es muy específica, catalizando solo un tipo de reacción. Este hecho lleva a plantear la pregunta de 33 Kalyankar, G. D.; Snell, E. E.; 1962 Biochemistry. 1: 594-600. 34 Dunathan, H. C.; 1966 Proc. Natl. Acad. Sci. USA.. 55: 712-716. 35 Shaw, J. P.; Petsko, G. A.; Ringe, D.; 1997 Biochemistry. 36: 1329-1342. 36 Tatsumoto, K.; Martell, A. E.; 1977 J. Am. Chem. Soc. 99: 6082-6088. CAPÍTULO 2 32 cómo una enzima logra esta especificidad utilizando un cofactor que puede catalizar múltiples reacciones. En respuesta a esta cuestión, Dunathan propuso en 1966 que las enzimas dependientes del PLP utilizan efectos estereoelectrónicos para controlar la especificidad de sus reacciones. Según su hipótesis, la enzima situa el enlace que debe romper en la aldimina externa paralelo al sistema π, de forma que el orbital p que se genera al romper el enlace está alineado con el sistema π para conseguir el máximo solapamiento σ−π. De esta forma, la energía del estado de transición disminuye y la velocidad de la reacción aumenta. Esta orientación también produciría una geometría más cercana a la del intermedio, minimizando el movimiento molecular en la aproximación al estado de transición. En la figura 2.7 se muestra la geometría de la aldimina más favorable para la ruptura del enlace C- H en la posición α del aminoácido. Se consigue otra geometría adecuada para la ruptura del mismo enlace al rotar el aminoácido 180º. Las reacciones enzimáticas de las bases de Schiff del PLP tienen lugar normalmente sobre una misma cara de la estructura molecular relativamente plana (figura 2.7). Este resultado es el esperado si un único grupo ácido-base Figura 2.7 Aspectos estereoquímicos de la catálisis enzimática con PLP como coenzima. 33 INFORME BIBLIOGRÁFICO actúa como aceptor de protones en una etapa y como dador de protones en una etapa posterior. Esto conduce, naturalmente, a la retención de configuración observada en las etapas que incluyen desplazamiento y transferencia de protones desde una posición de una cara a otra posición de la misma cara.37 2.8.4 α−β α−βα−β α−β eliminación Martell y Tatsumoto38 realizaron estudios cinéticos de la reacción de eliminación de grupos electronegativos en la posición β de aminoácidos (serina, fosfoserina y β-cloroalanina). La catálisis por piridoxal depende de una serie de factores que controlan las dos etapas determinantes de la velocidad, la disociación del protón en posición α y el desplazamiento del sustituyente electronegativo en posición β. La figura 2.8 muestra el mecanismo propuesto para la reacción de β-eliminación de la forma monoprotonada de la aldimina. La velocidad de la eliminación del grupo electronegativo en posición β varía con el valor del pH debido a las diferencias en reactividad de las distintas formas protonadas de la base de Schiff. A valores de pH comprendidos entre 6,5 y 10, la velocidad de la reacción aumenta rápidamente con el pH, alcanzar un valor máximo a pH entre 8 y 9, y disminuye a valores de pH mayores. La determinación de las constantes de disociación de las bases de Schiff monoprotonada y diprotonada hace posible el cálculo de las constantes de velocidad específicas para cada especie.39 Las constantes de velocidad asignadas a las especies monoprotonadas son entre 10 a 30 veces mayores que 37 Floss, H. G.; Vederas, J. C.; 1982 New Comprehensive Biochemistry Stereochemistry. Vol 3. 161-199. Elsevier, Amsterdam. 38 Tatsumoto, K.; Martell, A. E.; Motekaitis, R. J.; 1981 J. Am. Chem. Soc. 103: 6197-6203. 39 Metzler, D. E.; Longenecker, J. B.; Snell, E. E.; 1953 J. Am. Chem. Soc. 75: 2786-2787. CAPÍTULO 3 40 de rayos X 56 muestran que la conversión del aminoácido unido a la proteína en un intermedio de reacción zwitteriónico iluro está favorecido por el medio poco polar del centro activo enzimático. 57 El piridoxal 5’-fosfato (PLP) es un catalizador electrofílico extraordinario para la reacción de desprotonación en el carbono de los αaminoácidos en agua, 58,59 y en centros activos enzimáticos. 60 La primera etapa del mecanismo en la catálisis covalente por PLP es la formación de una imina con el aminoácido. La formación de este aducto debilita todos los enlaces del carbono en posición α al grupo imino, debido a que la ruptura heterolítica de uno de estos enlaces y la consiguiente pérdida de H + , CO 2 o R + produce un carbanión que está muy estabilizado por delocalización de la carga negativa en el anillo de piridina del cofactor. En algunas enzimas que catalizan la descarboxilación de aminoácidos está presente el grupo prostético piruvoilo, lo que sugiere que esta cetona es un catalizador electrófilo efectivo de las reacciones que transcurren a través de intermedios carbaniónicos. 61,62,63,64 Sin embargo, poco se sabe sobre la eficiencia catalítica relativa de compuestos carbonílicos sencillos respecto al PLP en los procesos de catálisis electrófila de la desprotonación de 56 Pillai, B.; Cherney, M. M.; Diaper, C. M.; Sutherland, A.; Blanchard, J. S.; Vederas, J. C.; James, M. N. G. 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 103: 8668-8673. 57 Richard, J. P.; Amyes, T. L. 2004 Bioorg. Chem., 32: 354-366 . 58 Dixon, J. E.; Bruice, T. C.; 1973 Biochemistry 12: 4762-4766. 59 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. 60 Toney, M. D. 2005 Arch. Biochem. Biophys., 433: 279-287. 61 Tolbert, W. D.; Zhang, Y.; Cottet, S. E.; Bennett, E. M.; Ekstrom, J. L.; Pegg, A. E.; Ealick, S. E. 2003 Biochemistry, 42: 2386-2395. 62 Graham, D. E.; Xu, H.; White, R. H. 2002 J. Biol. Chem., 277: 23500-23507. 63 Bach, R. D.; Canepa, C. 1997 J. Am. Chem. Soc, 119: 11725-11733. 64 Gallagher, T.; Rozwarski, D. A.; Ernst, S. R.; Hackert, M. L. 1993 J. Mol. Biol., 230: 516- 528. 41 CAPÍTULO 3 aminoácidos. Esto se debe principalmente a la falta de estudios modelo en los que se utilicen compuestos carbonílicos sencillos. 65,66 65 Owen, T. C.; Young, P. R., Jr. 1974 FEBS Lett, 43: 308-312. 66 Young, P. R.; Howell, L. G.; Owen, T. C. 1975 J. Am. Chem. Soc, 97: 6544-6551. Figura 3.1 Formación de los iones iminio de la glicina metil éster con acetona (1-H ), de la glicina con fenilglioxilato (2-H), de la glicina con DPL y su posterior desprotonación. CAPÍTULO 3 42 Una cetona simple como la acetona posee una fracción significativa del poder del PLP como catalizador de la desprotonación de aminoácidos, debido a la gran acidez del carbono del aducto ión iminio 1-H (figura 3.1). 67 En este capítulo se exponen los resultados obtenidos en la investigación sobre la catálisis por bases de Brønsted de la desprotonación de 1-H y sobre la catálisis de la desprotonación de glicina por fenilglioxilato (figura 3.1). Cuando comparamos la catálisis por fenilglioxilato de la desprotonación de la glicina con la catálisis por 5’-deoxipiridoxal (DPL) 68 se puede ver que la acidez del carbono en posición α al grupo imino de los aductos de fenilglioxilato (2-H, figura 3.1) y DPL son similares. Por lo tanto, se puede aumentar la acidez del carbono en posición α al grupo amino de los aminoácidos formando iones iminio con compuestos carbonílicos de estructuras mucho más sencillas que el PLP. Sin embargo, el DPL es mucho mejor catalizador de la desprotonación de la glicina que el fenilglioxilato a pD 7, por lo que debe poseer otras propiedades que le confieren un papel único como cofactor en la catálisis de reacciones bioorgánicas. 3.2 Sección Experimental 3.2.1 Materiales. Los compuestos comerciales que se citan a continuación fueron adquiridos a la compañía Aldrich: ácido clorhídrico deuterado (37 wt %, 99,5%D), deuteróxido potásico (40 wt %, 98 + % D), hidrocloruro de la glicina metil ester, hidrocloruro de quinuclidina, 3- quinuclidinol, hidrocloruro de 3-cloroquinuclidina, 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2- 67 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 68 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. 43 CAPÍTULO 3 propanol (HFIP), y 2,2,2-trifluoroetanol (TFE). La glicina y el ácido fenilglioxílico fureron adquiridos a Fluka. Las quinuclidinas sustituidas en la posición 3 fueron purificadas por recristalización con los siguientes disolventes: hidrocloruro de quinuclidina, etanol; 3-quinuclidinol, acetona; hidrocloruro de 3-cloroquinuclidina, metanol/propanol 1:1 (v/v). Los demás reactivos fueron utilizados sin ninguna purificación adicional. 3.2.2 Métodos generales. Debido a que las reacciones tienen lugar en agua deuterada como disolvente, los protones ácidos de la glicina, hidrocloruro de glicina metil ester, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , los hidrocloruros de quinuclidina y 3- cloroquinuclidina y el protón del grupo alcohol del 3-quinuclidinol fueron intercambiados por deuterio disolviéndolos en D 2 O, y evaporando posteriormente el disolvente a baja presión. Este proceso se repitió al menos en otras dos ocasiones, y se finalizó con el secado a vacío, a una temperatura de 50 ºC, durante aproximadamente 12 horas. 69,70,71,72 El ácido fenilglioxílico, el ácido metoxiacético, el hexafluoroisopropanol (HFIP), y el trifluoroetanol (TFE) fueron disueltos directamente en D 2 O, produciendo un aumento de menos de un 1% en el contenido de protio del disolvente. Los tampones fosfato se prepararon mezclando las disoluciones stock de K 2 DPO 4 y KD 2 PO 4 en D 2 O a I = 1,0 (KCl) para dar la relación ácido/base deseada. Los tampones acetato se prepararon disolviendo la forma básica del tampón en D 2 O, que contenía la cantidad de KCl necesaria para que la fuerza iónica fuese la unidad, seguida de la adición de DCl hasta dar la relación 69 Rios, A.; Richard, J. P.; 1997 J. Am. Chem. Soc. 119: 8375-8376. 70 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 71 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 72 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2002 J. Am. Chem. Soc. 124: 8251-8259. CAPÍTULO 3 44 ácido/base deseada. Los tampones de metoxiacético, HFIP, y TFE se prepararon disolviendo sus formas ácidas con KCl en D 2 O seguido de la adición de KOD para dar la relación ácido/base deseada a I = 1,0 (KCl). Las disoluciones de los cationes quinuclidina, 3-quinuclidinol, y 3- cloroquinuclidina en tampones fosfato a pD 7,6 se prepararon mezclando las disoluciones del ión amonio terciario (I = 1,0 KCl), el tampón fosfato (I = 1,0 KCl) y 1 M de KCl para dar una concentración total de tampón de 0,1 M. Los valores de pH y de pD se determinaron a 25 ºC usando un pHmetro modelo Orion 350 equipado con un electrodo Radiometer pHC4006-9 ( γ OL = 0,78). Los valores de pD se obtuvieron añadiendo 0,4 unidades al valor de pH observado en el pHmetro. 73 La concentración de ión deuteróxido a cualquier pD fue calculado usando la ecuación 3.1, donde K w = 10 -14,87 es el producto iónico del agua deuterada a 25 ºC y γ OL es el coeficiente de actividad aparente del DO - en las condiciones experimentales. 74,75 DO  10    3.1 3.2.3 Análisis espectroscópico RMN 1 H. Los espectros de RMN 1 H a 500 MHz en D 2 O fueron registrados en un espectrómetro Bruker AMX500. 76,77,78,79 En todos los casos, el tiempo de relajación entre pulsos fue al menos 10 veces superior al tiempo de relajación de los protones de los 73 Glasoe, P. K.; Long, F. A. 1960 J. Phys. Chem., 64: 188-190. 74 Glavas, S.; Tanner, M. E.; 1999 Biochemistry 38: 4106-4113. 75 Rios, A.; O’Donoghue, A. C.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2005 Can. J. Chem., 83: 1536- 1542. 76 Rios, A.; Richard, J. P.; 1997 J. Am. Chem. Soc. 119: 8375-8376. 77 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 78 Richard, J. P.; Williams, G.; Gao, J.; 1999 J. Am. Chem. Soc, 121: 715-726. 79 Amyes, T. L.; Richard, J. P. 1992 J. Am. Chem. Soc, 114: 10297-10302. 45 CAPÍTULO 3 sustratos que están siendo examinados (T 1 = 4 s para la glicina metil éster y la glicina). Los espectros fueron obtenidos con un ancho de barrido de 2600 Hz, un ángulo de pulso de 90º, y un tiempo de adquisición de 6 s. Las líneas base fueron corregidas antes de la integración de los picos. Los desplazamientos químicos de las señales se referenciaron con respecto a las señales de HOD a 4,67 ppm ó (CH 3 ) 4 N + a 2,94 ppm. 3.2.4 Determinación de las constantes de equilibrio. La posición del equilibrio en la formación de iminas de la glicina y glicina metil ester fue determinada por análisis de RMN 1 H a 25 ºC. La formación de la imina de la glicina metil éster fue monitorizada en disoluciones que contenían 0,1 M de glicina metil ester y 3,0 M de acetona a I = 1,0 (KCl). La formación de la imina de la glicina se monitorizó en disoluciones que contenían entre 0,1 - 2,0 M de glicina y 0,8 M de fenilglioxilato a I = 1,0 (KCl). En todas las disoluciones se mantuvo constante el valor del pD usando una concentración 0,10 M de los siguientes tampones: ácido metoxiacético, pD 3,3 – 4,8; ácido acético, pD 4,5 – 6; fosfato, pD 6,2 – 8; HFIP, pD 8,9; TFE, pD 12 – 13. La glicina metil ester tuvo el doble papel de reactivo y tampón en los experimentos a valores de pD mayores que 8. La hidrólisis del éster a valores de pD menores que 8,8 no fue significativa (< 6%) durante el tiempo necesario para obtener el espectro de RMN (aproximadamente una hora), pero a valores de pD superiores la ruptura del éster impidió la determinación de las constantes de equilibrio para la formación de la imina / ión iminio. Los valores de la constante de equilibrio observada (K add ) obsd para la formación de la imina fueron determinados a partir de la relación de las áreas integradas de los picos de los protones del grupo metileno del producto imina CAPÍTULO 3 46 (   ), y del reactivo glicina ó glicina metil ester (   , ecuación 3.2). Las concentraciones relativas de equilibrio de la imina glicina–fenilglioxilato a pD > 8 se determinaron 24 h después de la mezcla de los reactivos para asegurar que se había alcanzado el equilibrio químico.    !" X$D % Gly % Cetona      Cetona X1,2 3.2 La velocidad de intercambio por deuterio del hidrógeno del grupo metileno de la glicina catalizado por fenilglioxilato a valores de pD entre 12 y 13 es similar a la velocidad de formación de la imina. Sin embargo, los análisis de RMN 1 H muestran que el enriquecimiento por deuterio de los grupos metileno de la glicina y de la imina formada con fenilglioxilato es el mismo teniendo en cuenta el error experimental. Así pues, la relación de las concentraciones de glicina y de su imina con el anión fenilglioxilato se pudo determinar como la relación de la suma de las áreas integradas de los picos de los grupos – CH 2 - y – CHD – obtenidos de los análisis de RMN 1 H. 3.2.5 Medidas cinéticas. Todas las reacciones de intercambio por deuterio se realizaron en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). Las reacciones se iniciaron mezclando las disoluciones del ácido de carbono, el catalizador, y el tampón al mismo valor de pD y I = 1,0 (KCl), para obtener una concentración final del ácido de carbono de 15 mM. Se observó una disminución lenta del pD durante la reacción de intercambio por deuterio de la glicina metil ester, debida 47 CAPÍTULO 3 a la reacción de hidrólisis del éster. 80 El pD de estas disoluciones se monitorizó durante toda la reacción manteniéndolo en el valor inicial (±0,05 unidades) mediante la adición de alícuotas de una disolución 2 M de KOD. En la reacción de intercambio por deuterio de la glicina catalizada por fenilglioxilato se pudo observar una pequeña disminución en el valor del pD (0,03 unidades en dos semanas) en aquellos casos en los que la concentración de tampón es pequeña, en cualquier caso una disminución mucho menor que en las reacciones de la glicina metil éster. Durante el transcurso de la reacción no se observó la aparición de nuevas señales en los espectros de RMN 1 H, y tampoco se vio una desviación en las representaciones de los datos cinéticos para esta reacción. La figura 3.2 muestra espectros RMN 1 H a 500 MHz de la glicina metil éster obtenidos durante la reacción de intercambio por deuterio de los protones en posición α en presencia de acetona (0,05 M) a pD = 5,6 (tampón de acetato 0,25 M) en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). 80 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. CAPÍTULO 3 48 3.56 3.54 3.58 3 . 3 8 0 3 . 3 9 0 3 . 4 0 0 3.4103.4203.430 3 3 . 7 9 0 3 . 8 0 0 3 . 8 1 0 3. 203.8303.840 3.94 3.92 3.96 GLYCINE 258 hrs 83 % 159 hrs 66 % 88 hrs 45 % Figura 3.2 Espectros RMN 1 H a 500 MHz de la glicina metil éster obtenidos durante el intercambio por deuterio de los protones en posición α en presencia de acetona (0,50 M) y tampón de acetato (0,25 M, pD = 5,6) en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). A la derecha de cada espectro se indica la fracción de aminoácido monodeuterado y el tiempo transcurrido desde el inicio de la reacción. El último espectro corresponde a la glicina procedente de la hidrólisis del éster que tiene lugar durante la reacción de intercambio. Glicina 49 CAPÍTULO 3 El intercambio por deuterio da lugar a la desaparición del singlete debido al grupo – CH 2 – del substrato y a la aparición de un triplete a campo más alto debido al grupo – CHD – del producto. 81 Las reacciones fueron seguidas durante el intercambio por deuterio de entre un 20 a un 90 % del primer protón en posición α del sustrato, y el progreso de la reacción, R, se calculó utilizando la ecuación 3.3, donde   y   son las áreas integradas de los picos de los grupos α-CH 2 y α-CHD, respectivamente. Las constantes de velocidad de primer orden observadas para el intercambio de un solo protón del grupo α-CH 2 del sustrato, k obsd , se calcularon a partir de las pendientes de las representaciones semilogarítmicas de R frente al tiempo (ecuación 3.4), y los valores de la constante de velocidad de primer orden para el intercambio del primer protón en posición α para dar el producto monodeuterado, k ex , se calcularon como k ex = 2 k obsd . 81 1     2  3.3 Ln 1 $4 !" t 3.4 Las velocidades de las reacciones de intercambio por deuterio e hidrólisis de la glicina metil éster en presencia de acetona son similares a pD = 7,6. El enriquecimiento en deuterio del producto de la hidrólisis fue determinado por análisis RMN 1 H después de más de 10 tiempos de vida media para la reacción de hidrólisis. Los valores de k ex = 2 k obsd fueron determinados a partir de las áreas integradas del singlete debido al grupo α-CH 2 de la glicina y 81 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. CAPÍTULO 3 56 4,5 x 10 -11 M, 84 (K a ) 2-D = 6,5 x 10 -7 M, y permitió obtener un valor de (K add ) 2-D = (1,0 ± 0,1) x 10 -4 M -1 para la formación del ión iminio 2-D (Tabla 3.1).    !"    PH QI  2   PH I  2    R 3.9 También podemos ver en la figura 3.7 los valores de (K add ) obsd para la adición de glicina a 5’-deoxipiridoxal obtenidos de la bibliografía 85 y que se muestran a modo de comparación. 84 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 85 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. O O D 3 N H H O O D 2 N H H (Kadd)2 aD/(Ka)GlyD aD/(Ka)2-D (kDO)2-D [DO-] + (kB)2-D [B] O O D 3 N D H a D /(K a ) 2-D (K add ) 2-D 2 2-D 2-D 2 O COO O COO O O N H H OOC O O N H H OOC DO OD N H H OOC D (k DO ) 2-D [DO - ] + (k B ) 2-D [B] 2 2 2 Figura 3.6 Esquema del equilibrio de formación del ion iminio del fenilglioxilato con glicina en equilibrio con sus diferentes formas protonadas y la posterior reacción de intercambio por deuterio de uno de los protones en posición α al grupo imino. 57 Figura 3.7 Dependencia logarítmica de ( conversión de glicina y glicina metil éster en D 2 O a 25 ºC y ( ). R eacción de la glicina con 5’- d log (K add ) obsd -4,0 -3,0 -2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 CAPÍTULO 3 Dependencia logarítmica de ( K add ) obsd (M - 1 ) con el pD para la conversión de glicina y glicina metil éster en sus correspondientes iminas O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). Reacción de la glicina con fenilglioxilato eacción de la glicina metil éster con acetona ( ). R eacción de la d eoxipiridoxal en H 2 O ( ). pD 2 4 6 8 10 12 CAPÍTULO 3 ) con el pD para la sus correspondientes iminas glicina con fenilglioxilato eacción de la 14 CAPÍTULO 3 58 3.3.2 Constantes de velocidad para el intercambio por deuterio 3.3.2.1 Catálisis por acetona. El intercambio por deuterio del primer protón del grupo metileno de la glicina metil éster en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl) fue seguido por RMN 1 H (500 MHz). 86,87 La dependencia lineal de k ex con la concentración total del tampón acetato (pD 5,56) cuando vamos aumentando la concentración fija de acetona se muestra en la figura 3.8 A. Las ordenadas en el origen de estas correlaciones corresponden a k o = k w f 1-D (tabla 3.2) para el intercambio por deuterio catalizado por el disolvente, donde f 1-D es la fracción de glicina metil éster presente en la forma ión iminio 1-D y k w es la constante de velocidad de primer orden aparente para la reacción con el disolvente. 88 6 PH    PH Cetona =12    I  > 3.10 86 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 87 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2002 J. Am. Chem. Soc. 124: 8251-8259. 88 La fracción de glicina metil éster presente como 1-D viene dada por la ecuación 3.10 (X = 1), obtenida del esquema mostrado en la figura 3.5 considerando que la concentración de imina / ión iminio es despreciable porque menos de un 1% del aminoácido se transforma en imina / ión iminio en presencia de una concentración de acetona de 0,5 M a pD inferior a 8. 59 [Tampón] 0,0 0,1 k ex /10 -7 s -1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 A Figura 3.8 (A) Influencia de la concentración total de tampón sobre intercambio del primer protón del grupo metileno de la glicina metil éster en presencia de acetona y de tampón acetato (pD 5,56) en D acetona; ( ) 0,10 M acetona; ( Representación de las ordenadas en el origen de las correlaciones de la figura 3. frente a la concentración de acetona. La pendiente de la figura 3. (k w ) obsd (M -1 s -1 ) para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por acetona a pD 5,56. (C) Representación frente a la concentración de acetona. La pendiente proporciona (M -2 s -1 ) para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por 5,56. CAPÍTULO 3 [Tampón] T /M 0,2 0,3 k o /10 -8 s -1 0,0 0,5 1,0 1,5 [acetona] /M 0,0 0,2 0,4 (k B ) obsd /10 -7 s -1 0,0 3,0 6,0 9,0 B C Influencia de la concentración total de tampón sobre k ex intercambio del primer protón del grupo metileno de la glicina metil éster en presencia de de tampón acetato (pD 5,56) en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). ( 0,10 M acetona; ( ) 0,25 M acetona; ( ) 0,50 M acetona. (B) de las ordenadas en el origen de las correlaciones de la figura 3. la concentración de acetona. La pendiente de la figura 3. 8 B proporciona ) para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por acetona a pD Representación de las pendientes de las correlaciones de la figura 3. la concentración de acetona. La pendiente proporciona ) para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por tampón y acetona a CAPÍTULO 3 [acetona] /M 0,4 0,6 (s - 1 ) para el intercambio del primer protón del grupo metileno de la glicina metil éster en presencia de = 1,0 (KCl). ( ) 0,05 M ) 0,50 M acetona. (B) de las ordenadas en el origen de las correlaciones de la figura 3. 8A (k o ) B proporciona el valor de ) para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por acetona a pD de las pendientes de las correlaciones de la figura 3. 8A (k B ) obsd la concentración de acetona. La pendiente proporciona T B obsd ( ) k tampón y acetona a pD CAPÍTULO 3 Al representar los valores de total de acetona, como se muestra en la figura 3.8 B, se obtiene cuya pendiente es igual a la constante de velocidad aparente 10 -8 M -1 s -1 para la reacción de desprotonación disolvente catalizada por acetona a pD 5,56 ( que procede de las ecuaciones k w para la desprotonación de de (k w ) obsd = 2,7 x 10 y a D = 10 -5,56 M en la ecuación velocidad aparente de primer orden para la reacción con el disolvente x 10 -6 s -1 . Si se hace un tampón fosfato a los valores de pD 7,64 y 6,61 (tabla valores de k w = 9,3 x 10 En la figura desprotonación de 1- la desprotonación de por mínimos cuadrados de las constantes CAPÍTULO 3 Al representar los valores de k o ( tabla 3.2) frente a la concentración como se muestra en la figura 3.8 B, se obtiene una línea pendiente es igual a la constante de velocidad aparente ( k la reacción de desprotonación de la glicina metil éster por disolvente catalizada por acetona a pD 5,56 ( ecuación 3.11 ). La ecuación ecuaciones 3.10 y 3.11 , muestra la relación entre ( para la desprotonación de 1-D por el disolvente D 2 O. Al sustituir los valores = 2,7 x 10 -8 M -1 s -1 , (K add ) 1-D = 0,0033 M -1 , (K a ) Gly-D = 3,3 x 10 M en la ecuación 3.12 obtenemos el valor de la constante de velocidad aparente de primer orden para la reacción con el disolvente o w obsd w a Gly-D w obsd D w add ( ) [Cetona] (3.11) ( ) ( ) 1 (3.12) ( ) k k aaaaaa aaaaaa k f K ka kKaa = =   +     = X-D X-D un análisis similar de los datos para la misma reacción en tampón fosfato a los valores de pD 7,64 y 6,61 (tabla 3. 2) se obtienen los = 9,3 x 10 -4 s-1 y kw = 1,0 x 10-4 s-1, respectivamente. figura 3.9 podemos ver el perfil con el pD de log D en D2O ( ). La línea de pendiente unidad muestra que la desprotonación de 1-D es por DO– ((kDO)1-D, figura 3.5 ). El ajuste no line por mínimos cuadrados de las constantes de velocidad aparente 60 tabla 3.2) frente a la concentración una línea recta, k w)obsd = 2,7 x de la glicina metil éster por el ). La ecuación 3.12, , muestra la relación entre ( kw)obsd y O. Al sustituir los valores = 3,3 x 10 -9 M la constante de velocidad aparente de primer orden para la reacción con el disolvente , kw = 8,2 ( ) [Cetona] (3.11) (3.12) la misma reacción en 2) se obtienen los respectivamente. log kw para la de pendiente unidad muestra que ). El ajuste no line al de velocidad aparente s kw para la 61 reacción con el disolvente producto iónico del D aparente de DO – en las condiciones experimentales, proporciona un valor de (k DO ) 1-D = 13.000 M - 1 log 89 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 7950. Figura 3.9 Representación de log ( ) el primer hidrógeno del grupo de 2-D;( ) el primer hidrógeno del grupo ( ) el primer hidrógeno del grupo 5 log (kw) (s-1) -10,0 -8,0 -6,0 -4,0 -2,0 CAPÍTULO 3 reacción con el disolvente a la ecuación 3.13, en la que K w = 10 producto iónico del D 2 O a 25 ºC, y γ OL = 0,79 es el coeficiente de actividad en las condiciones experimentales, proporciona un valor de 1 s -1 para la desprotonación de 1-D por DO – . 89 log k K k γ                      1-D 1-D 1-D 1-D DOw wOL aa ( ) aaa =a log+pD ( 3.13 ) Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. Representación de log k w (s - 1 ) frente al pD para el intercambio por deuterio de: ) el primer hidrógeno del grupo α-CH 2 de 1-D; ( ) el primer hidrógeno del grupo ) el primer hidrógeno del grupo α-CH 2 de la glicina metil éster ) el primer hidrógeno del grupo α-CH 2 de la glicina N-protonada. 90 pD 6 7 8 9 10 CAPÍTULO 3 = 10 -14,87 M 2 es el = 0,79 es el coeficiente de actividad en las condiciones experimentales, proporciona un valor de 89 log+pD ( 3.13 ) 123: 7949- pD para el intercambio por deuterio de: ) el primer hidrógeno del grupo α-CH 2 N-protonada, 90 11 12 CAPÍTULO 3 62 90 referencia de la figura 3.9 Tabla 3.2 Constantes de velocidad para el intercambio por deuterio del primer protón del grupo metileno de la glicina metil ester en presencia de acetona y tampones acetato o fosfato en D 2 O. a (k TB ) obsd /M -2 s -1 f 1,1 × 10 -4 4,5 × 10 -5 1,6 × 10 -6 a A 25 ºC y I = 1,0 (KCl). b Valores de pK a aparentes de los ácidos conjugados en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). 91 c Constantes de velocidad aparentes de primer orden para el intercambio por deuterio, determinadas a partir de las ordenadas en el origen de las representaciones de k ex (s -1 ) frente a la concentración total del tampón. d Constantes de veloci dad aparentes de segundo orden para la reacción de intercambio catalizada por tampón, determinadas como las pendientes de las representaciones de k ex (s -1 ) frente a la concentración total del tampón. e Constantes de velocidad aparentes de segundo orden par a la desprotonación de glicina metil éster catalizada por acetona determinadas como las pendientes de las representaciones de k o frente a la concentración de acetona. f Constantes de velocidad observada de tercer orden para la desprotonación de glicina met il éster catalizada por tampón, determinadas a partir de las pendientes de las representaciones de (k B ) obsd frente a la concentración de acetona. (k w ) obsd /M -1 s -1 e 2,7 × 10 -6 3,3 × 10 -7 2,7 × 10 -8 (k B ) obsd /M -1 s -1 d 2,9 × 10 -6 3,9 × 10 -6 7,4 × 10 -6 1,3 × 10 -5 1,1 × 10 -6 2,3 × 10 -6 4,1 × 10 -6 9,1 × 10 -6 8,2 × 10 -8 1,4 × 10 -7 3,8 × 10 -7 8,1 × 10 -7 k o /s -1 c 3,7 × 10 -7 4,1 × 10 -7 4,9 × 10 -7 6,2 × 10 -7 4,7 × 10 -8 6,3 × 10 -8 8,0 × 10 -8 1,1 × 10 -7 3,7 × 10 -9 5,6 × 10 -9 8,5 × 10 -9 1,6 × 10 -8 [acetona]/M 0,01 0,02 0,05 0,10 0,02 0,05 0,10 0,20 0,05 0,10 0,25 0,50 pD 7,64 6,61 5,56 Base DPO 42– pK BD = 7,0 b CH 3 COO – pK BD = 5,0 b 90 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 91 Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 1996 J. Am. Chem. Soc. 118: 3129-3141. 63 CAPÍTULO 3 Las pendientes de las correlaciones de la figura 3.8 A corresponden a (k B ) obsd = (k B ) 1-D f B f 1-D (tabla 3.2) para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por tampón a una concentración dada de acetona, donde (k B ) 1-D es la constante de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 1-D por la forma básica del tampón y f B es la fracción del catalizador en forma básica. Los valores de (k B ) obsd aumentan linealmente con la concentración de acetona, como se puede ver en la figura 3.8C, y la pendiente de esta correlación es la constante de velocidad aparente de tercer orden para la desprotonación de la glicina metil éster catalizada por acetona y por el anión acetato, 4 B %  !" = 1,6 x 10 -6 M -2 s -1 (tabla 3.2). Al sustituir 4 B %  !" en la ecuación 3.14, con (K add ) 1- D = 0,0033 M -1 , f B = 0,75, (K a ) Gly-D = 3,3 x 10 -9 M y a D = 10 -5,56 M se obtiene el valor de (k B ) 1-D = 6,5 × 10 -4 M -1 s -1 para la desprotonación de 1-D por el ión acetato (figura 3.5). 4 B  GH 4 B %  !" =12    I  > 6 B    GH 3.14 Un tratamiento similar de los datos para la reacción catalizada por tampón fosfato a los valores de pD 7,64 y 6,61 (tabla 3.2) proporciona los valores de 4 B %  !" que se resumen en la tabla 3.2, y cuando se llevan a la ecuación 3.14, como se describió para la reacción catalizada por ión acetato, se obtienen los valores (k B ) 1-D = 4,7 × 10 -2 M -1 s -1 y (k B ) 1-D = 4,8 × 10 -2 M -1 s -1 para la desprotonación de 1-D por el dianión fosfato a los valores de pD 7,64 y 6,61, respectivamente. Los valores de las constantes k ex para el intercambio por deuterio del primer protón en posición α de la glicina metil éster a pD = 7,64 (0,1 M de CAPÍTULO 3 64 tampón fosfato) en presencia de acetona y quinuclidina, 3-quinuclidinol ó 3- cloroquinuclidina se pueden ver en la tabla A2. En la tabla 3.3 se resumen los valores de (k B ) obsd para la catálisis por estas aminas terciarias de la reacción de intercambio por deuterio de la glicina metil éster, que fueron determinadas como las pendientes de las regresiones lineales de k ex frente a la concentración total de las formas ácida y básica de la amina. Los valores de (k B ) 1-D (tabla 3.3) fueron calculados a partir de los valores de (k B ) obsd de la misma forma que para la reacción catalizada por el anión acetato. 3.3.2.2 Catálisis por fenilglioxilato. El intercambio por deuterio del primer protón en posición α de la glicina fue estudiado en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl) utilizando tampones de fosfato para mantener constante el valor del pD del medio de reacción (pD 6,49 – 7,65). En la tabla A3 se recogen los valores de las constantes de velocidad observadas, k ex , para el intercambio por deuterio en presencia de varias concentraciones de fenilglioxilato y tampón fosfato a pD 6,49, 7,05 y 7,65, determinadas tal y como se indica en la sección experimental. La figura 3.10 muestra el efecto de un aumento en la concentración de tampón fosfato sobre la constante de velocidad k ex a pD 7,65 y a diferentes concentraciones fijas de fenilglioxilato. La ordenada en el origen de las representaciones lineales corresponde a la constante de primer orden k o = k w f 2-D (tabla 3.4) para el intercambio catalizado por el disolvente a un valor de pD 7,65, donde f 2-D = (K add ) 2-D [fenilglioxilato] es la fracción de glicina presente en la forma 2-D, calculada usando la ecuación 3.10 (X = 2, 1 >> ((K a ) Gly-D / a D )). 65 CAPÍTULO 3 Tabla 3.3 Constantes de velocidad para el intercambio del primer protón del grupo metileno de la glicina metil éster en presencia de acetona y quinuclidinas sustituidas en posición 3 a pD 7,64 a (k B ) 1-D /M -1 s -1 f 460 ± 30 29 ± 3 3,6 ± 0,5 a 0,1 M de tampón fosfato en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). b Valores de pK a aparentes de los cationes de las quinuclidinas sustituidas en posición 3. 92 c Fracción de la amina terciaria presente en forma básica a pD 7,64. d Constantes de velocidad observada de segundo orden para el int ercambio por deuterio catalizado por quinuclid ina a pD 7,64, determinadas como las pendientes de las representaciones de k ex frente a la concentración total de quinuclidina. e Constantes de velocidad observada de tercer orden para la desprotonación de glicina metil éster catalizada por acetona y por quinuclidinas sustituidas en la posición 3 a pD 7,64, determinadas como las pendientes de la representación de ( k B ) obsd frente a la concentración de acetona. f Constantes de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 1-D por las quinuclidinas sustituidas en la posición 3 determinadas usando la ecuación 3.14. ( 4 B % ) obsd /M -2 s -1 e 4,6 × 10 -5 7,3 × 10 -5 9,0 × 10 -5 (k B ) obsd /M -1 s -1 d 8,0 × 10 -7 1,4 × 10 -6 2,4 × 10 -6 5,0 × 10 -6 1,9 × 10 -6 2,3 × 10 -6 3,9 × 10 -6 8,4 × 10 -6 1,4 × 10 -6 2,6 × 10 -6 6,5 × 10 -6 9,5 × 10 -6 [acetone] /M 0,01 0,02 0,05 0,10 0,01 0,02 0,05 0,10 0,01 0,02 0,05 0,10 f Bc 3,5 × 10 -5 8,7 × 10 -4 8,6 × 10 -3 pK BDb 12,1 10,7 9,7 Base quinuclidine 3-quinuclidinol 3-chloroquinuclidine 92 Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 1996 J. Am. Chem. Soc. 118: 3129-3141. CAPÍTULO 3 72 relación entre la constante de velocidad aparente independiente del pD, (k w ) o , y la constante de velocidad 4   KHK correspondiente a la reacción de desprotonación de la forma iónica minoritaria 2-D 2 por el ión deuteróxido. Un valor de 4   KHK Y3 x 10 [ M -1 s -1 (Tabla 3.5) fue calculado utilizando la ecuación 3.17, el valor experimental de (k w ) o , K w = 10 -14,87 M 2 , γ OL = 0,78 y    KHK Y1,7 x 10 \ M (tabla 3.1). 4 T  4   KHK  T    KHK   3.17 4 B 4 B  KH 24 B  KHK I     KHK 3.18 La constante de velocidad aparente de segundo orden k B para la desprotonación de 2-D por DPO 42– aumenta cuando disminuye el valor del pD, debido también a la presencia de un segundo camino de reacción para la desprotonación del ácido de carbono fuerte 2-D 2 por DPO 42- (figura 3.6). La ecuación 3.18 proporciona la relación entre las constantes de velocidad aparentes k B y las constantes de velocidad de desprotonación de 2-D ((k B ) 2-D ) y 2-D 2 4 B  KHK  por DPO 42– . La representación de k B frente a a D es lineal. La ordenada en el origen de la recta corresponde a la constante de velocidad de segundo orden para la desprotonación del ión iminio 2-D por DPO 42– , (k B ) 2-D = 2,8 x 10 -2 M -1 s -1 (tabla 3.5). A partir de la pendiente, y teniendo en cuenta el valor de    KHK 1,7 x 10 \ M (Tabla 3.1), obtenemos la constante de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 2-D 2 por DPO 42– , 4 B  KHK = 1 x 10 2 M -1 s -1 (tabla 3.5). 73 La incertidumbre e han estimado para la desprotonación del ácido de carbono DPO 42– es grande. E n primer lugar inherente al valor de mostrados en la figura 3.4 ( dos grupos carboxilato lo tanto, cual de ellos se protonará en primer lugar. no permiten distinguir entre las dos formas 3.4.2 Correlaciones de Brønsted. constantes de velocidad de segundo orden bases generales, m ostra tabla 3.5. La pendiente de valor de β = 0,92 ± 0,04 para la desprotonación de la glicina metil éster N protonada 101 (figura 3.11 observada para 1-D en comparación con la glicina metil éster N consistente con un desplazamiente más temprano para la desprotonación del ácido de carbono más 3.4.3 C atálisis electr objetivo que nos fijamos diferentes catalizadores electró La formación de una imina entre la acetona y la glicina metil éster constante de velocidad 101 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 102 Hammond, G. S. 1955 CAPÍTULO 3 La incertidumbre e n los valores de las constantes de velocidad que se han estimado para la desprotonación del ácido de carbono 2-D 2 por DO n primer lugar , hay que tener en cuenta la incertidumbre de a ( )K 2 2-D det erminado mediante el ajuste de los datos mostrados en la figura 3.4 ( ) a la ecuación 3.8. En segundo lugar dos grupos carboxilato para los cuales se desconoce su basicidad relativa y, por lo tanto, cual de ellos se protonará en primer lugar. Los datos experimentales distinguir entre las dos formas posibles de 2-D 2 . Correlaciones de Brønsted. La correlación de Brønsted de la de velocidad de segundo orden k B para la desprotonación de ostra da en la figura 3.11 ( ), se obtuvo con los datos de la pendiente de esta correlación, β = 0,83 ± 0,01, es meno = 0,92 ± 0,04 para la desprotonación de la glicina metil éster N 3.11 ( )). La disminución en el valor de β en comparación con la glicina metil éster N - un desplazamiente tipo Hammond a un estado de transición temprano para la desprotonación del ácido de carbono más fuerte atálisis electr ófil a de la desprotonación de la glicina. que nos fijamos en este trabajo es la determinación del efecto diferentes catalizadores electró filos sobre la acidez del carbono de la glicina. La formación de una imina entre la acetona y la glicina metil éster constante de velocidad de segundo orden k DO para la desprotonación Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373- 9385 1955 J. Am. Chem. Soc, 77: 334-338. CAPÍTULO 3 n los valores de las constantes de velocidad que se por DO – y por la incertidumbre erminado mediante el ajuste de los datos segundo lugar , en 2-D hay su basicidad relativa y, por datos experimentales La correlación de Brønsted de la s para la desprotonación de 1-D por los datos de la = 0,83 ± 0,01, es meno r que el = 0,92 ± 0,04 para la desprotonación de la glicina metil éster N - β de Brønsted - protonada es un estado de transición fuerte . 102 a de la desprotonación de la glicina. Un la determinación del efecto de sobre la acidez del carbono de la glicina. La formación de una imina entre la acetona y la glicina metil éster multiplica la para la desprotonación por DO – 9385 . CAPÍTULO 3 del carbono en posición Esto refleja la difer encia de 7 unidades en el valor del p pasa de 21 en la glicina metil éster protonada en el nitrógeno a 14 para la imina 1-H. 103 103 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 7950. Figura 3.11 desprotonación de protonada q y p equivalentes en el reactivo e hidrógenos ácidos equivalentes en el producto log ( k B /q) (M -1 s -1 ) CAPÍTULO 3 del carbono en posición α al grupo amino por un factor de 2200 encia de 7 unidades en el valor del p K a del carbono la glicina metil éster protonada en el nitrógeno a 14 para la imina Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. Figura 3.11 Correlaciones de Brønsted para la desprotonación de 1-D ( ) y de la glicina metil éster N- protonada ( ) por bases generales y DO – en D 2 O, donde son e l número de centros básicos químicamente equivalentes en el reactivo e hidrógenos ácidos equivalentes en el producto , respectivamente. pK BD + log(p/q) 4 8 12 16 log ( k B /q) (M s ) -8,0 -4,0 0,0 4,0 8,0 74 al grupo amino por un factor de 2200 (figura 3.12). del carbono , que la glicina metil éster protonada en el nitrógeno a 14 para la imina Chem. Soc. 123: 7949- 75 CAPÍTULO 3 Por otro lado, la formación de una imina entre la glicina y el fenilglioxilato produce un aumento mucho mayor en la constante de velocidad de segundo orden k DO multiplicándola por un factor de 2,2 x 10 8 . Este incremento es 50 veces mayor que el efecto que produce la formación de una imina con la forma del 5’-deoxipiridoxal ionizada en el oxígeno (figura 3.12). Combinando k DO = 1,7 x 10 4 M -1 s -1 para la desprotonación de 2-D con un valor estimado del efecto isotópico del disolvente de k DO /k HO = 1,5 se obtiene un valor de k HO = 1,1 x 10 4 M -1 s -1 para la desprotonación de 2-H por el ión hidróxido en H 2 O (figura 3.6). 104 La ecuación 3.19 proporciona una correlación lineal logarítmica entre k HO y la acidez del carbono pK CH para la desprotonación de cetonas y ésteres catiónicos. 105 p  =10,2$log 4  0,44 > 3.19 Con esta correlación y el valor de k HO = 1,1×10 4 M -1 s -1 obtenemos un valor de 14 para el pK a del carbono de 2-H. El pK a de este ión iminio es 15 unidades menor que el del carbono de la glicina (pK a = 29), 106 e incluso menor que el valor de pK a de 17 estimado para el aducto 3-H 2 . 106 Como comparación, la formación de una imina con la acetona produce sólo una reducción de 7 unidades en el pK a de la glicina metil éster. 105 La fuerte acidez del carbono de 2-H muestra la estabilización de la carga negativa del carbanión 4, debida 104 Este valor del efecto isotópico corresponde al efecto isotópico secundario del disolvente determinado para la desprotonación de la acetona por HO – a 25 ºC (Pocker, Y. 1959 Chem. Ind, 1383-1384) 105 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 106 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. CAPÍTULO 3 76 presumiblemente a la delocalización de la carga negativa en los sustituyentes deficientes de electrones de 4 (figura 3.13). 107108109 Referencias de la figura 3.12 Es importante distinguir la reactividad absoluta relativa de los compuestos carbonílicos que actúan como catalizadores de la desprotonación de estos aminoácidos, de la acidez relativa de los grupos metileno de los aductos ión iminio de dichos compuestos (figura 3.12). Así, el 5’- deoxipiridoxal (DPL) es mucho mejor catalizador de la desprotonación de la 107 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2002 J. Am. Chem. Soc. 124: 8251-8259. 108 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 109 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. Figura 3.12 Constantes de velocidad de segundo orden para la desprotonación por ión hidroxido del grupo metileno de la glicina metil éster protonada en el nitrógeno 107 y de su aducto con acetona, 108 y de la glicina 107 , y de sus aductos con fenilglioxilato y DPL. 109 77 CAPÍTULO 3 glicina que el anión fenilglioxilato, a pesar de que el carbono de su aducto con la glicina tiene una acidez inferior . A efectos comparativos, en la figura 3.14 se muestran las constantes de velocidad para la desprotonación catalizada por el disolvente de la glicina metil éster y de la glicina, y las constantes de velocidad observadas en presencia de una concentración 0,01 M del compuesto carbonílico utilizado como catalizador. En la primera fila se puede observar que la adición de una concentración 0,01 M de acetona da lugar a una catálisis moderada de la desprotonación de la glicina metil éster a pD 7,6, a pesar de la fuerte acidez del Figura 3.13 Formas resonantes del carbanión formado al extraer un protón en posición α al grupo imino del aducto formado por glicina y fenilglioxilato. CAPÍTULO 3 78 carbono del aducto ión iminio. Esto es debido a que la constante de formación de la imina es poco favorable. 110 Referencia de la figura 3.14 Sin embargo, se observa un aumento de velocidad de 250 veces para la catálisis de la desprotonación de la glicina por una concentración 0,01 M de fenilglioxilato, un catalizador mucho más efectivo que la acetona. Esta catálisis es inmensamente inferior al aumento de 3×10 6 veces observado para la catálisis de la desprotonación de la glicina por una concentración 0,01 M de DPL a pH 7,1, donde la constante de velocidad estimada para la desprotonación de la glicina catalizada por disolvente es sólo de 5 x 10 -12 s -1 . 111 110 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. 111 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. Figura 3.14 Constantes de velocidad para la desprotonación de la glicina y glicina metil éster catalizada por disolvente, y constantes de velocidad observadas para el proceso catalizado por distintos compuestos carbonílicos con una concentración 0,01 M. 79 CAPÍTULO 3 La gran diferencia que se observa en la actividad catalítica del DPL como catalizador comparada con la del fenilglioxilato, se debe a que la constante de formación de la imina con el DPL es mucho más favorable. De hecho, la imina 2-D es sólo apenas detectable por RMN 1 H en disoluciones que contienen glicina en concentraciones del orden de 1,0 M y anión fenilglioxilato 0,8 M, mientras que la reacción de 0,01 M de glicina con 0,010 M de DPL a pH 7,1 da lugar a la conversión del 80% del DPL en 3-H 2 . 112 Estos resultados muestran que una de las razones por las que los catalizadores enzimáticos utilizan preferentemente el piridoxal 5’-fosfato como coenzima frente al grupo prostético piruvoilo 113,114,115 en las diferentes reacciones de los aminoácidos, se debe a la gran afinidad del cofactor piridínico comparado con los α-cetoácidos por la adición al grupo amino para formar una imina. Esta razón fue sugerida previamente en un estudio publicado sobre la formación de iminas con el PLP. 116 Como conclusión se puede decir que las iminas formadas entre el piridoxal y aminoácidos están fuertemente estabilizadas por interacciones intramoleculares entre el anillo de piridina, los sustituyentes del anillo y el nitrógeno del grupo imino, 117 comparado con las interacciones intramoleculares correspondientes en las iminas formadas entre aminoácidos y cetonas o aldehídos sencillos. 112 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. 113 Tolbert, W. D.; Zhang, Y.; Cottet, S. E.; Bennett, E. M.; Ekstrom, J. L.; Pegg, A. E.; Ealick, S. E. 2003 Biochemistry, 42: 2386-2395. 114 Graham, D. E.; Xu, H.; White, R. H. 2002 J. Biol. Chem., 277: 23500-23507. 115 Gallagher, T.; Rozwarski, D. A.; Ernst, S. R.; Hackert, M. L. 1993 J. Mol. Biol., 230: 516- 528. 116 Gout, E.; Zador, M.; Beguin, C. G. 1984 Nouv. J. Chim., 8: 243-250. 117 Hammond, G. S. 1955 J. Am. Chem. Soc, 77: 334-338. 81 CAPÍTULO 4 CAPITULO 4 CAPÍTULO 4 88 4.2.4 Determinación de las constantes de equilibrio. La posición del equilibrio para la adición de glicina a los aldehídos 1-4 para formar las correspondientes iminas en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl) se determinó por espectroscopía RMN 1 H. La formación de una imina entre la glicina y cada uno de estos aldehídos aromáticos se monitorizó en disoluciones que contenían: 0,1-2,0 M de aminoácido y 5-20 mM de 1; 0,1-0,5 M de aminoácido y 5-10 mM de 2; 0,3-1,0 M de aminoácido y 50 mM de 3; o 0,001-2,0 M de aminoácido y 0,005-1,0 M de 4. El valor del pD de estas disoluciones se mantuvo constante usando 0,10 M de las siguientes disoluciones tampón: cloroacetato pD 3,2-4,5; acetato pD 4,2-6,0; fosfato pD 6,0-8,0; pirofosfato pD Figura 4.2 Valoración potenciométrica de 2 en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). La línea recta representa el ajuste de los datos experimentales a la ecuación pD = pK BD + log ([B – ] / [BD]). log ([B-]/[BD]) -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 pD 4 6 8 10 12 89 CAPÍTULO 4 8,4-8,9; HFIP pD 9,0-11; TFE pD 12,2-13,7. La glicina se utilizó también como tampón en algunos experimentos en el intervalo de pD 9,5-11,4. La relación de concentraciones de equilibrio del aducto imina y del aldehído ó del aducto imina y el aminoácido se determinaron entre una y dos horas después de la mezcla de los reactivos. Este período de tiempo fue lo suficientemente largo para asegurar que se alcanzan las condiciones de equilibrio, como se pudo comprobar en experimentos de control en los que la relación de concentraciones se determinó de nuevo 24 h después de haber comenzado la reacción. Los valores de las constantes de equilibrio observadas (K add ) obsd para la formación de iminas con los aldehídos 1, 2, o 3 se determinaron a partir de la relación de las áreas integradas de los picos del protón metínico de la imina (  P^_ ) y del aldehído (  P ) usando para ello la ecuación 4.1, donde [X-IM] e , [X] e , y [Gly] e son las concentraciones totales de equilibrio de la imina, del aldehído, y de la glicina, respectivamente. La concentración de aminoácido en el equilibrio fue calculada utilizando la ecuación 4.2, donde [Gly] T y [X] T son las concentraciones totales del aminoácido y aldehído, respectivamente.    !" P$^_ : P : Gly :   P^_   P Gly : PG,K,` 4.1 Gly : Gly % $P$^_ :  Gly % $P % Q  P^_   P 2  P^_ R PG,K,` 4.2 CAPÍTULO 4 90 Los valores de las constantes de equilibrio observadas (K add ) obsd (M -1 ) para la formación de la imina con el aldehído 4 se determinaron a partir de la relación de las áreas integradas de los picos correspondientes a los protones metileno de la imina (  a^_ ) y de la glicina (   ) de acuerdo con la ecuación 4.3, donde [4-IM] e y [4] e son las concentraciones de la imina y aldehído en el equilibrio, respectivamente. La concentración del aldehído en el equilibrio se calculó utilizando la ecuación 4.4, donde [Gly] T y [4] T son las concentraciones totales del aminoácido y del aldehído, respectivamente y K hyd es la constante de equilibrio aparente para la hidratación del aldehído, determinada por RMN 1 H en las condiciones de cada experimento.    !" a$^_ : a : Gly :   a^_    a : 4.3 a : 1 12 < ba % $  a^_    2  a^_ Gly % c 4.4 4.3 Resultados El valor del desplazamiento químico d   !" G^_ de la señal del protón metínico de 1-IM (imina de la glicina con benzaldehído, figura 4.3, Z=CH, X=1) aumenta desde 8,07 a 8,62 ppm cuando pasamos de valores de pD altos a pD = 5,0, debido a la protonación del nitrógeno imínico (figura 4.5). La dependencia del desplazamiento químico d   !" G^_ con el valor del pD viene descrita por la ecuación 4.5, obtenida a partir del esquema de la 91 CAPÍTULO 4 figura 4.3, donde d  G^_ y d  G^_H son los desplazamientos químicos del hidrógeno metínico de 1-IM y 1-IM-D, respectivamente, y (K a ) 1-IM-D es la constante de acidez del nitrógeno imínico. La línea en la figura 4.5 muestra el ajuste no lineal por mínimos cuadrados de los datos experimentales a la ecuación 4.5, utilizando el valor d  G^_ 8,07 ppm observado a valores de pD alto, y tratando d  G^_H y (K a ) 1- IM-D como parámetros variables. El valor de p(K a ) 1-IM-D obtenido de este ajuste se recoge en la tabla 4.1. La variación del desplazamiento químico d   !" K^_ de la señal del protón metínico del 2-IM (imina de la glicina con el o-hidroxibenzaldehído, figura 4.4, X=2) al variar el pD (figura 4.5), es debida a la protonación del nitrógeno imínico y del oxígeno del fenóxido. Los datos experimentales se ajustaron a la ecuación 4.6, obtenida a partir del esquema mostrado en la figura 5.5, utilizando el valor de: d  K^_H = 8,09 ppm para el desplazamiento Figura 4.3 Equilibrio de formación de una imina entre la glicina y el benzaldehído (Z = CH, X = 1) o entre la glicina y el piridincarboxaldehido (Z = N, X = 4). CAPÍTULO 4 92 químico del protón metínico de 2-IM-D determinado de los datos experimentales a valores de pD intermedio. La línea en la figura 4.5 muestra el ajuste a dicha ecuación, que proporcionó valores de d  K^_HK = 8,48 ppm y d  K^_ = 8,38 ppm para los desplazamientos químicos del protón metínico de 2- IM-D 2 y 2-IM, respectivamente, y los valores de las constantes de acidez    K^_HK y    K^_H para 2-IM-D 2 y 2-IM-D, respectivamente, que se resumen en la tabla 4.1. d !" P^_ d P^_    P^_H 2d P^_H I     P^_H 2I   PG,a 4.5 d !" P^_  d P^_    P^_H    P^_HK 2d P^_H    P^_HK I  2d P^_HK I  L    P^_H    P^_HK 2   P^_HK I  2I  L  PK,` 4.6 93 CAPÍTULO 4 Figura 4.4 Equilibrio de formación de una imina entre la glicina y el ohidroxi benzaldehído (X = 2) o entre la glicina con el p-hidroxi benzaldehído (X = 3). CAPÍTULO 4 94 pD 4 6 8 10 12 14 (δ H ) obsd /ppm 8,2 8,4 8,6 Figura 4.5 Influencia del pD sobre el desplazamiento químico del protón metínico de las iminas formadas en D 2 O conteniendo: ( ) 0,1-2,0 M glicina y 5-20 mM de 1; ( ) 0,1-0,5 M glicina y 5-10 mM de 2 a 25 ºC y I=1,0 (KCl). Las líneas trazadas muestran el ajuste de los datos experimentales a la ecuación 4.5, obtenida a partir del esquema de la figura 4.3 ( ) o a la ecuación 4.6 que puede obtenerse del esquema de la figura 4.4 ( ) 95 CAPÍTULO 4 El cambio del desplazamiento químico d   !" `^_ de la señal de los hidrógenos metilénicos del 3-IM (imina de la glicina con p-hidroxi- benzaldehído, figura 4.4, X = 3) con el valor del pD (figura 4.6) se debe a la protonación del nitrógeno imínico y del oxígeno del fenóxido. Se realizó un ajuste no lineal por mínimos cuadrados de los datos experimentales a la ecuación 4.6, utilizando para ello los valores: d  `^_ = 3,90 ppm y d  `^_HK = 4,20 ppm para los desplazamientos químicos de los protones del grupo α-CH 2 de 3-IM y 3-IM-D 2 , respectivamente. La línea en la figura 4.6 muestra el resultado del ajuste, que proporcionó d  `^_H = 4,00 ppm para el desplazamiento químico de los hidrógenos del grupo α-CH 2 de 3-IM-D y los valores de las constantes de acidez    `^_HK y    `^_H para 3-IM-D 2 y 3-IM-D que se recogen en la tabla 4.1. La variación del desplazamiento químico d   !" a^_ de la señal de los protones del grupo metileno de 4-IM (imina de la glicina con el 4- piridincarboxaldehído, figura 4.3, Z=N, X=4) con el valor del pD (figura 4.6) es debida a la protonación del nitrógeno imínico. La línea mostrada en la figura 4.6 corresponde al ajuste no linal de los datos experimentales a la ecuación 4.5, utilizando el valor d  a^_ = 4,09 ppm para el desplazamiento químico de la hidrólisis del grupo α-CH 2 de 4-IM obtenido experimentalmente a valores de pD alto. Este ajuste permitió obtener d  a^_H = 4,27 ppm para el grupo α-CH 2 de 4-IM-D y el valor de la constante de acidez (K a ) 4-IM-D que se recoge en la tabla 4.1. CAPÍTULO 4 96 Figura 4.6 Influencia del pD sobre el desplazamiento químico de los hidrógenos del grupo metileno de las iminas formadas en D 2 O conteniendo: ( ) 0,3-1,0 M glicina y 50 mM de 3, ( ) 0,001-2,0 M glicina y 0,005-1,0 M de 4 a 25 ºC e I=1,0 (KCl). Las líneas muestran el ajuste de los datos experimentales a la ecuación 4.5, obtenida a partir del esquema de la figura 4.3, ( ) o a la ecuación 4.6, obtenida a partir del esquema de la figura 4.4 ( ). pD 2 4 6 8 10 12 14 (δ CH 2) obsd /ppm 3,9 4,0 4,1 4,2 4,3 97 CAPÍTULO 4 Tabla 4.1 Constantes de equilibrio en D 2 O para la adición de glicina a los aldehídos aromáticos 1-4 a (K add ) ++ f (M -1 ) (3,4 ± 0,1) × 10 -2 (8,7 ± 0,9) × 10 -3 a A 25 ºC y I = 1,0 (KCl). b pK a aparente del nitrógeno del ión iminio en D 2 O, determinado por valoración RMN. c pK a aparente del grupo fenol del ión iminio en D 2 O, determinado por valoración RMN. d Constante de equilibrio para la adición de la forma básica del aminoácido a la forma básica del aldehído. e Constante de equilibrio p ara la adición del aminoácido en forma zwitteriónica a la forma básica del aldehído. f Constante de equilibrio para la adición del aminoácido en forma zwitteriónica a la forma protonada del aldehído. (K add ) + e (M -1 ) (3,3 ± 0,4) × 10 -3 72 ± 8 0,29 ± 0,03 (2,0 ± 0,4) × 10 -3 (K add ) d (M -1 ) 44 ± 8 1,76 ± 0,02 0,49 ± 0,03 500 ± 20 p(K a ) OD c 5,55 ± 0,04 6,61 ± 0,02 p(K a ) IM b 6,29 ± 0,01 12,13 ± 0,05 10,16 ± 0,03 4,95 ± 0,06 Ion iminio Aldehído H N CO2 D O (D) CAPÍTULO 4 104 El efecto de distintos sustituyentes X en el anillo aromático del benzaldehído sobre la constante de equilibrio para la adición de la glicina a este aldehído (K add ) y sobre el valor del pK a del ión iminio correspondiente, se resumen en la tabla 4.3. La adición de un sustituyente p-O – al benzaldehído produce un aumento en el pK a del ión iminio de 3,9 unidades (figura 4.8B). Este cambio corresponde a la suma de las interacciones estabilizantes por resonancia y electrostáticas de este sustituyente con el nitrógeno imínico, que son mayores en el ión iminio que en la imina neutra. Cuando el sustituyente está en posición orto (figura 4.8A), el efecto sobre la acidez del ión iminio es 1,9 unidades superior al observado para el sustituyente en posición para (figura 4.8B), lo que podría reflejar una estabilización adicional del ión iminio por formación de un enlace de hidrógeno intramolecular entre el oxígeno del fenolato y el nitrógeno imínico. El efecto global observado para cada sustituyente puede utilizarse para estimar la fuerza de este enlace de hidrógeno intramolecular después de realizar una corrección para tener en cuenta la diferente estabilización del nitrógeno imínico por los sustituyentes o-O – y p-O – a través de interacciones electrostáticas y de resonancia. El efecto que tiene el sustituyente p-O – sobre el valor del pK a de la benzilamina (figura 4.9) 150,151 es de 0,5 unidades, lo que corresponde a una energía de estabilización de 0,7 kcal/mol, y proporciona una estimación de la interacción polar que existe entre este sustituyente y la carga positiva del nitrógeno del ion iminio. Se puede calcular un valor de 4,6 kcal/mol para la diferencia en estabilización del ion iminio comparado con la imina neutra mediante interacción resonante con el anión p-O – , restándole al efecto 150 Bunting, J. W.; Stefanidis, D. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112: 779–86. 151 Hine, J. Structural Effects on Equilibria in Organic Chemistry; John Wiley & Sons: 1975, New York. 105 CAPÍTULO 4 estabilizante global de 5,3 kcal/mol observado para el sustituyente p-O – (figura 4.8B, figura 4.9) la contribución electrostática estimada. Este valor proporciona un límite superior para la diferencia en estabilización por resonancia del ion iminio deficiente en electrones con respeto a la imina por interacción con el sustituyente o-O – . Sin embargo, el análisis de los datos en la tabla 4.3 muestra que el efecto del sustituyente o-O – sobre la constante de equilibrio para la adición del anión glicina al benzaldehído para formar la imina neutra (figura 4.10A) es aproximadamente el 70% del efecto del sustituyente p-O – sobre la misma constante de equilibrio (figura 4.10B). Esto indica una mayor estabilización del grupo carbonilo del aldehído que del grupo imina del producto por interacción resonante con un sustituyente p-O – comparado con un sustituyente o-O – . Una estimación de la diferencia en estabilización por resonancia del ión iminio del benzaldehído comparado con la imina neutra por interacción con el anión orto-O – se puede obtener como el 70% del efecto resonante total observado para el anión para- O – , que corresponde a (0,70) × (4,6) = 3,2 kcal/mol. Figura 4.8 Comparación del efecto del sustituyente en orto o para sobre la basicidad de la imina formada entre la glicina y el benzaldehído sustituido. CAPÍTULO 4 106 Tabla 4.3 Efecto de la presencia de sustituyentes en el anillo, o de la sustitución del C-4 del anillo por N, sobre la constante de equilibrio para la adición de la glicina al benzaldehído para formar la correspondiente imina a ∆(pK a ) X g 0 5,8 3,9 -0,1 -1,3 a Datos de la tabla 4.1 para reacciones en D 2 O, al menos que se indiquen otras condiciones. b Constantes de equilibrio para la adición del anión glicina al aldehído indicado en la primera columna para formar la correspondiente imina no protonada. c El efecto del sustituyente X sobre la variación de la energía de Gibbs para la formación de la imina a partir del aldehído y aminoácido libres. d Constantes de equilibrio para la adición del zwitterión de la glicina al aldehído indicado en la primera colu mna para formar el correspondiente ión iminio. e El efecto del sustituyente X sobre la variación de la energía de Gibbs para la formación del ión iminio a partir del aldehído y el aminoácido libres. f Constantes de acidez aparentes para los iones iminio sustituídos. g El efecto del sustituyente X sobre el p K a para la ionización del ión iminio. h Datos de la referencia 152 para reacciones en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). p(K a ) X-IMD f 6,29 12,13 10,16 6,19 h 4,95 ∆∆G X e (kcal/mol) 0 -5,9 -2,7 2,1 0,3      e      e 1 22000 88 0,03 0,61      e f 0,0033 72 0,29 1 x 10 -4 h 0,002 ∆∆G X c (kcal/mol) 0 1,9 2,7 2 -1,4           1 0,04 0,011 0,034 11,4 (K add ) X b 44 1,76 0,49 1,5 h 500 Aldehído 152 Sharif, S.; Huot, M. C.; Tolstoy, P. M.; Toney, M. D.; Jonsson, K. H. M.; Limbach, H.-H. 2007, J. Phys. Chem. B 111: 3869–3876. 107 CAPÍTULO 4 El ión iminio del salicilaldehído (5) puede ser estabilizado también por una interacción Coulómbica a través del espacio entre el nitrógeno cargado positivamente y el anión fenóxido cargado negativamente. Una aplicación sencilla de la ley de Coulomb nos permite determinar la relación de energías electrostáticas en los dos iones iminio 5 y 6. Si se considera que no hay diferencia en la constante dieléctrica efectiva y en la magnitud de las cargas en ambas interacciones, entonces E 5 /E 6 =r 6 /r 5 , donde r 5 y r 6 son las distancias entre cargas opuestas en 5 y 6, respectivamente. Las estructuras calculadas por métodos computacionales para 5 y 6 (figura 4.11) muestran que los dos centros cargados están a una distancia de 2,6 y 6,5 Å, respectivamente, y por tanto, E 5 /E 6 = 2,5. Al usar el valor de 0,7 kcal/mol estimado anteriormente para la interacción entre el nitrógeno cargado positivamente y el anión p-fenóxido en 6, obtenemos un valor de 1,8 kcal/mol para la interacción entre estos dos grupos en 5. Se puede suponer que los efectos estéricos son despreciables dada la conformación substancialmente plana de estas moléculas. Si restamos las contribuciones de los efectos de resonancia y electrostáticos a través del espacio del efecto total de 8,0 kcal/mol que el sustituyente o-O – ejerce sobre la acidez del ión iminio del benzaldehído (figura 4.8A), la energía restante (8,0 – 3,2 – 1,8) = 3,0 kcal/mol puede ser atribuida a la contribución del enlace de hidrógeno a la mayor estabilización del ión iminio comparado con la imina neutra. CAPÍTULO 4 108 Los enlaces de hidrógeno intermoleculares en disolución acuosa son normalmente muy débiles debido a que las moléculas de agua compiten eficientemente en la solvatación de los grupos ácidos y básicos. 153 Sin embargo, las interacciones de enlace de hidrógeno en agua pueden hacerse significativas cuando el dador ácido y el aceptor básico están en la misma molécula y forzados a una geometría apropiada por restricciones moleculares. 154,155 Este es el caso del ión iminio 5, para el cual hemos demostrado que está estabilizado por un enlace de hidrógeno intramolecular en disolución acuosa. La energía de esta interacción por enlace de hidrógeno es aproximadamente 3 kcal/mol superior al valor predicho para una interacción electrostática simple entre el catión iminio y el anión fenóxido y no es muy distinta del valor estimado de 4 kcal/mol para la energía de estabilización 153 Stahl, N.; Jencks, W. P. 1986, J. Am. Chem. Soc. 108: 4196–205. 154 Frey, P. A.; Cleland, W. W. 1998, Bioorg. Chem. 26: 175–192. 155 Hibbert, F.; Emsley, J. 1990, AdV. Phys. Org. Chem. 26: 255–79. Figura 4.9 Efecto del sustituyente cargado en posición para sobre el valor del pK a de la benzilamina en agua y de la imina formada por benzaldehído y glicina en D 2 O. 109 CAPÍTULO 4 implicada en la formación de un enlace de hidrógeno intramolecular en el caso del anión salicilato (7) en agua. 156 En ambas moléculas, la naturaleza especial del enlace de hidrógeno interno parece estar fuertemente relacionada con la existencia de conjugación directa entre los grupos aceptor y dador del enlace de hidrógeno (figura 4.12). Sin embargo, a pesar del gran número de investigaciones sobre este tipo de estructuras, 157 no hay un acuerdo general sobre si la fuerza extra de este enlace de hidrógeno intramolecular es debida a la estabilización por resonancia, 158,159 o el resultado de la orientación favorable y la coplanaridad de los grupos aceptor y dador. 160 156 Hermans, J., Jr.; Leach, S. J.; Scheraga, H. A. 1963, J. Am. Chem. Soc. 85: 1390–5. 157 Sobczyk, L.; Grabowski, S. J.; Krygowski, T. M. 2005, Chem. ReV. 105: 3513–3560. 158 Gilli, G.; Bellucci, F.; Ferretti, V.; Bertolasi, V. 1989, J. Am. Chem. Soc. 111: 1023–8. 159 Gilli, P.; Bertolasi, V.; Ferretti, V.; Gilli, G. 2000, J. Am. Chem. Soc. 122: 10405–10417. 160 Sanz, P.; Mo, O.; Yanez, M.; Elguero, J. 2007, J. Phys. Chem. A 111: 3585–3591. Figura 4.10 Comparación del efecto del sustituyente en posición orto o para sobre el equilibrio para la adición del anión glicina al benzaldehído para formar una imina neutra. CAPÍTULO 4 110 El efecto de un sustituyente o-O – sobre el valor del pK a del ión iminio formado entre el 4-piridin-carboxaldehído y la glicina (tabla 4.4) es una unidad menor que el efecto del mismo sustituyente sobre el valor del pK a del ión iminio del benzaldehído (tabla 4.3). La menor estabilización proporcionada por este sustituyente cuando el anillo fenílico es substituido por un anillo de piridina refleja la transferencia de carga negativa al nitrógeno piridínico, lo cual reduciría el grado de estabilización por resonancia debido a la delocalización de la carga negativa en el grupo ión iminio de 8. No es de esperar que se produzca un cambio significativo en la fuerza del enlace de hidrógeno intramolecular en el ión iminio 5 al introducir un anillo de piridina para dar lugar a 8. La sustitución del C-4 del anillo por N conduce a una disminución de 1,3 unidades en el valor del pK a del ión iminio del benzaldehído (tabla 4.3). Este descenso es similar a la disminución de 1,4 unidades en el valor del pK a al pasar del fenol (pK a = 10,0) a la 3-hidroxi- piridina (pK a = 8,6). 161 Esto sugiere que, como consecuencia de la introducción del nitrógeno piridínico, la acidez del dador de enlace de hidrógeno y el aceptor aumenta en la misma proporción, de forma que la fortaleza del enlace de hidrógeno no se ve afectada significativamente por esta sustitución. Concluimos por tanto que la energía de estabilización involucrada en la formación de un enlace de hidrógeno interno en los iones iminio del PLP en agua debería ser similar al valor de 3 kcal/mol estimado para 5. Nuestros datos son por lo tanto consistentes con la existencia en disolución acuosa de un enlace de hidrógeno intramolecular en iones iminio derivados de o-hidroxiaril aldehídos y aminoácidos. 161 Metzler, D. E.; Harris, C. M.; Johnson, R. J.; Siano, D. B.; Thomson, J. A. 1973, Biochemistry 12: 5377–92 . 111 CAPÍTULO 4 Limbach y colaboradores obsevaron que el desplazamiento químico de 15 N para el átomo de nitrógeno protonado de la imina del piridoxal en CD 3 OH disminuía desde 238 ppm para la aldimina a 154 ppm para su complejo por enlace de hidrógeno con el ácido perfluorobutírico (Figura 4.13A). 162 Esto indica que la protonación parcial del nitrógeno piridínico está acoplado con un desplazamiento del protón desde el oxígeno del fenóxido hacia el nitrógeno imínico en el enlace de hidrógeno intramolecular –O – · + NH– fuertemente covalente. En cambio, en agua, el desplazamiento químico de δ = 146 ppm para el nitrógeno imínico observado a un valor de pH 10, al cual el anillo de piridina está desprotonado, es consistente con la casi total protonación de este nitrógeno. 163 El desplazamiento químico de 15 N para este nitrógeno ( δ = 146 ppm) no muestra un cambio detectable cuando se disminuye el valor del pH en agua desde 10 (<<1% de protonación del nitrógeno de la piridina) a 6 (60% de protonación del nitrógeno de la piridina), 163 por lo que puede considerarse que el protón del ión iminio permanece esencialmente estacionario cuando se protona el nitrógeno de la piridina. Estos resultados demuestran que, o no hay 162 Sharif, S.; Denisov, G. S.; Toney, M. D.; Limbach, H.-H. 2007, J. Am. Chem. Soc. 129: 6313–6327. 163 Sharif, S.; Huot, M. C.; Tolstoy, P. M.; Toney, M. D.; Jonsson, K. H. M.; Limbach, H.-H. 2007, J. Phys. Chem. B 111: 3869–3876. Figura 4.11 Comparación de las distancias entre los centros cargados cuando el sustituyente O – está en posición orto o para. Las estructuras han sido determinadas por métodos computacionales. CAPÍTULO 4 112 interacción directa por enlace de hidrógeno entre el ion iminio catiónico y el anión fenóxido en agua, o que el enlace de hidrógeno intramolecular entre estos átomos en agua se comporta como un par iónico, con una transferencia protónica mínima del nitrógeno al oxígeno. En este trabajo estimamos que la magnitud de la interacción estabilizante entre el catión iminio y el anión fenóxido es aproximadamente 3 kcal/mol mayor que para una simple interacción electrostática entre los correspondientes iones libres, lo que proporciona una evidencia fuerte de la existencia de un enlace de hidrógeno intramolecular –O – · + NH– en agua. La estabilización de 3 kcal/mol refleja sin duda un grado pequeño de transferencia Figura 4.12 Formas resonantes de diferentes fenoles estabilizados por enlace de hidrógeno intramolecular con conjugación directa entre los grupos dador y aceptor. N H O H CO2 5 N H O H CO2 O O 7 O H O OO H N N H O H CO2 8 N N H O H CO2 113 CAPÍTULO 4 protónica del nitrógeno al oxígeno. Los datos de desplazamientos químicos de 15 N ponen de manifiesto que la posición del protón en este enlace de hidrógeno no cambia de forma apreciable con la protonación del anillo de piridina. Sin embargo, un desplazamiento grande del protón hacia el nitrógeno no es posible, ya que el cambio en disolvente del metanol al agua ha dado lugar ya a un movimiento en la posición del protón del oxígeno al nitrógeno como consecuencia del cambio en las basicidades relativas del oxígeno del fenóxido y del nitrógeno imínico (figura 4.13). 4.4.2 Otros efectos de los sustituyentes sobre la estabilidad de los iones iminio. El análisis de los resultados resumidos en la tabla 4.4 conduce a una serie de conclusiones interesantes que conciernen al efecto de los sustituyentes en el anillo sobre la estabilidad de los iones iminio del piridoxal: (a) En primer lugar, la acidez del ion iminio de la glicina y el DPL es 2,1 Figura 4.13 Desplazamientos químicos de RMN 15 N del nitrógeno protonado de la imina del piridoxal en metanol y en disolución acuosa. 121 CAPÍTULO 5 5. Efecto de los Sustituyentes en la Catálisis Electrofila por el Grupo Carbonilo: Descripción del Aumento de Velocidad en la Desprotonación de la Glicina catalizada por PLP. 5.1 Introducción Durante los últimos 15 años nuestro grupo de investigación ha trabajado en la caracterización de las barreras cinética y termodinámica para la desprotonación del carbono en posición α al grupo amino de aminoácidos 175,176 (figura 5.1) y péptidos 177 en disolución acuosa y en el análisis del mecanismo que emplean las enzimas para disminuir estas barreras en la catálisis de la desprotonación de aminoácidos. 176,178 La selección natural de pequeñas moléculas como catalizadores ha visto la evolución del piridoxal 5’-fosfato como cofactor de un gran número de enzimas 179,180,181,182,183 que catalizan la desprotonación del carbono en posición α al grupo amino de aminoácidos como primera etapa de reacciones más complejas. Estas reacciones enzimáticas incluyen la racemización 184,185,186 y descarboxilación 187,188,189,190,191,192 del 175 Rios, A.; Richard, J. P.; 1997 J. Am. Chem. Soc. 119: 8375-8376. 176 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 177 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2002 J. Am. Chem. Soc. 124: 8251-8259. 178 Richard, J. P.; Amyes, T. L. 2004 Bioorg. Chem., 32: 354-366 . 179 Toney, M. D. 2005 Arch. Biochem. Biophys., 433: 279-287. 180 John, R. A. 1995, Biochim. Biophys. Acta 1248: 81–96. 181 Jansonius, J. N. 1998, Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 759–769. 182 Eliot, A. C.; Kirsch, J. F. 2004, Annu. Rev. Biochem. 73: 383–415. 183 Christen, P.; Mehta, P. K. 2001, Chem. Rec. 1: 436-447. 184 Sun, S.; Toney, M. D. 1999, Biochemistry 38: 4058-65. 185 Watanabe, A.; Yoshimura, T.; Mikami, B.; Hayashi, H.; Kagamiyama, H.; Esak, N. 2002, J. Biol. Chem. 277: 19166–19172. 186 Major, D. T.; Gao, J. 2006, J. Am. Chem. Soc. 128: 16345-16357. 187 Zhou, X.; Toney, M. D. 1999, Biochemistry 38: 311-320. 188 Zhou, X.; Jin, X.; Medhekar, R.; Chen, X.; Dieckmann, T.; Toney, M. D. 2001, Biochemistry 40: 1367-1377. CAPÍTULO 5 122 aminoácido, la transaminación para formar un α-cetoácido y piridoxamina 5’fosfato 193,194,195,196 , la sustitución de un buen grupo saliente en la posición β al grupo amino a través de la eliminación del grupo saliente de un carbanión estabilizado por el piridoxal para formar un alqueno activado, que sufre la adición de un segundo nucleófilo 197,198 , y la adición aldólica del carbanión estabilizado por piridoxal al formaldehído 199 o acetaldehído 200 . Los primeros estudios realizados en nuestro grupo de investigación sobre la catálisis de la desprotonación de aminoácidos se centraron en determinar el efecto de la presencia de grupos alquilo en el nitrógeno del grupo amino y en el oxígeno del carboxilato sobre la acidez del carbono alfa de la glicina 201,202 (figura 5.1). El siguiente paso consistió en examinar la catálisis electrófila de la desprotonación de la glicina metil éster por acetona (1, figura 189 Jackson, L. K.; Brooks, H. B.; Osterman, A. L.; Goldsmith, E. J.; Phillips, M. A. 2000, Biochemistry 39: 11247-11257. 190 Jackson, L. K.; Brooks, H. B.; Myers, D. P.; Phillips, M. A. 2003, Biochemistry 42: 2933- 2940. 191 Fogle, E. J.; Liu, W.; Woon, S.-T.; Keller, J. W.; Toney, M. D. 2005, Biochemistry 44: 16392-16404. 192 Lin, Y.-L.; Gao, J. 2010, Biochemistry 49: 84-94. 193 Kirsch, J. F.; Eichele, G.; Ford, G. C.; Vincent, M. G.; Jansonius, J. N.; Gehring, H.; Christen, P. 1984, J. Mol. Biol. 174: 497–525. 194 Hayashi, H.; Kagamiyama, H. 1997, Biochemistry 36: 13558-13569. 195 Hayashi, H.; Mizuguchi, H.; Miyahara, I.; Islam, M. M.; Ikushiro, H.; Nakajima, Y.; Hirotsu, K.; Kagamiyama, H. 2003, Biochim. Biophys. Acta 1647: 103-109. 196 Liu, W.; Peterson, P. E.; Langston, J. A.; Jin, X.; Zhou, X.; Fisher, A. J.; Toney, M. D. 2005, Biochemistry 44: 2982-2992. 197 Miles, E. W. 2001, Chem. Rec. 1: 140-151. 198 Dunn, M. F.; Niks, D.; Ngo, H.; Barends, T. R. M.; Schlichting, I. 2008, Trends Biochem. Sci. 33: 254-264. 199 Schirch, V.; Szebenyi, D. M. E. Curr. Opin. 2005, Chem. Biol. 9: 482-487. 200 Paiardini, A.; Contestabile, R.; D’Aguanno, S.; Pascarella, S.; Bossa, F. 2003, Biochim. Biophys. Acta 1647: 214-219. 201 Rios, A.; Richard, J. P.; 1997 J. Am. Chem. Soc. 119: 8375-8376. 202 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 123 CAPÍTULO 5 5.1), 203,204 y análogos del piruvoilo, como el fenilglioxilato (PG), 204 a través del correspondiente ión iminio (por ejemplo, 1-IMH). Por último, se investigó la catálisis por 5’deoxipiridoxal (DPL, figura 5.2) de la desprotonación de la glicina en un intervalo amplio de pH. 205 203 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 204 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2008, J. Am.Chem. Soc. 130: 2041–2050. 205 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021. O OH3N HO OMeH3N H O OMe3N HO OMeMe3N H O ON H H R1 R2 O O OO 1 PG 1-IMH H H HH H Figura 5.1 E structura del zwitterión glicina y de varios de sus análogos utilizados en el estudio cinético de la desprotonación de los carbonos en posición α al grupo amino de distintos aminoácidos. PG: fenilglioxilato; 1 : acetona, compuestos carbonílicos utilizados como catalizadores electrofílicos de reacciones de desprotonación de aminoácidos a través de intermedios de reacción como 1-IMH : Ión iminio formado por la adición del zwitterión glicina a una cetona o aldehído. CAPÍTULO 5 124 La catálisis efectiva por acetona de la desprotonación del carbono en posición α al grupo amino de la glicina 206 muestra que el grupo carbonilo del PLP es la fuente esencial de su poder catalítico. La catálisis por el grupo carbonilo es asistida por otros grupos funcionales del cofactor, y los más importantes son el nitrógeno piridínico y el sustituyente 2-O – en el anillo de piridina. Se ha especulado mucho sobre el papel que desempeñan estos sustituyentes en la catálisis de la desprotonación del carbono en posición α al grupo amino 207 , pero la función de los distintos sustituyentes no ha sido 206 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2008, J. Am.Chem. Soc. 130: 2041–2050. 207 Jencks, W. P.; 1987. Catalysis in Chemistry and Enzymology. Dover Mineola, New York. O O NH H O O O NH O O NH H N H OH N O H O 3 PO OH N O H OH O OH PLP DPL 3 2 O 3 PO O O NH H N O H O PLP-IMH 2 DPL-IMH 2 2-IMH 3-IMH H H H H H O O NH H N O DPL-IMH H Figura 5.2 Aldehídos utilizados como catalizadores en el estudio de la desprotonación del carbono en posición α al grupo amino de la glicina; PLP: piridoxal 5’fosfato; DPL : 5’ deoxipiridoxal; 2: benzaldehído; 3: salicilaldehído. PLP-IMH 2 ; DPL-IMH 2 ; DPL-IMH , 2-IMH; y 3-IMH , son los iones iminio formados por la adición del zwitterión glicina a los aldehídos anteriores. 125 CAPÍTULO 5 evaluada de forma rigurosa. La comprensión de los efectos de estos sustituyentes proporcionará una asistencia importante para el desarrollo de moléculas pequeñas como catalizadores efectivos de estas reacciones 208 , y al mismo tiempo permitirá avanzar en el entendimiento del mecanismo de acción de las enzimas que utilizan el PLP como cofactor. 209 El grupo 5’fosfato del PLP no parece activar de manera importante al cofactor para la desprotonación de α-aminoácidos. El papel más probable de este grupo funcional es el de proporcionar energía de enlace para la estabilización del complejo de Michaelis y de los estados de transición de aquellas reacciones en las cuales el PLP participa como cofactor. 210,211,212 La estabilización del carbanión del α-aminoácido por delocalización de la carga negativa en el nitrógeno del catión piridinio de DPL-IMH 2 debería ser mucho mayor que la obtenida por delocalización en el nitrógeno neutro del anillo de piridina de DPL-IMH o en el anillo fenílico de 3-IMH. Sin embargo, el carbanión del aminoácido está ya ampliamente delocalizado lo que debería dar lugar a una atenuación del efecto del nitrógeno catiónico del anillo de piridina sobre la estabilidad del carbanión. 213 En este capítulo se recogen los resultados de los experimentos que permiten comparar las actividades del DPL y del salicilaldehído (3) como catalizadores de la desprotonación de la glicina. El sustituyente 2-O – del DLP y del salicilaldehído, activa estos aldehídos para la catálisis mediante la estabilización de los iones iminio de la 208 Felten, A. E.; Zhu, G.; Aron, Z. D. 2010, Org. Lett. 12: 1916-1919. 209 Toney, M. D. 2005 Arch. Biochem. Biophys., 433: 279-287. 210 Morrow, J. R.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2008, Acc. Chem. Res. 41: 539–548. 211 Denesyuk, A. I.; Denessiouk, K. A.; Korpela, T.; Johnson, M. S. 2002, J. Mol. Biol. 316: 155-172. 212 Richard, J. P.; Amyes, T. L.; Crugeiras, J.; Rios, A. 2009, Curr. Opin. Chem. Biol. 13: 1-9. 213 Bordwell, F. G.; Fried, H. E. 1981, J. Org. Chem. 46: 4327-4331. CAPÍTULO 5 126 glicina, DPL-IMH 2 y 3-IMH, por la formación de un enlace de hidrógeno intramolecular con el nitrógeno del grupo imino. 214 Este efecto está probablemente atenuado, ya que la transferencia protónica parcial desde el nitrógeno catiónico al oxígeno da lugar a una disminución en la carga sobre el nitrógeno y por lo tanto a una reducción en la estabilización electrostática del carbanión del α-aminoácido. Se presentan en este capítulo los resultados de un estudio de la desprotonación de la glicina catalizada por los aldehídos 2 y 3 que define la contribución de este sustituyente 2-O – a la catálisis de la desprotonación de la glicina por DPL. 5.2 Sección Experimental 5.2.1 Materiales. La glicina y el salicilaldehído fueron adquiridos a la compañía Fluka, mientras que el benzaldehído, el 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2- propanol (HFIP), el 2,2,2-trifluoroetanol (TFE), el ácido clorhídrico deuterado (37 wt %, 99,5% D), el deuteróxido potásico (40 wt %, 98+% D), el agua deuterada (99,9% D), y la acetona–d 6 (99,9 atom % D) se compraron a Aldrich. Todas las demás sustancias, tanto orgánicas como inorgánicas, eran grado reactivo y se utilizaron sin ningún tipo de purificación adicional. 5.2.2 Métodos generales. Los protones ácidos de la glicina, K 2 HPO 4 y KH 2 PO 4 , se intercambiaron por deuterio 215 antes de preparar disoluciones de estos compuestos en D 2 O. El salicilaldehído, HFIP y TFE se disolvieron directamente en D 2 O, lo que dio lugar a un aumento inferior al 1% en el contenido de protio del disolvente. 214 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Richard, J. P. 2009, J. Am. Chem. Soc. 131: 15815- 15824. 215 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 127 CAPÍTULO 5 Los tampones de fosfato se prepararon mezclando disoluciones stock de K 2 DPO 4 y KD 2 PO 4 en D 2 O a I = 1,0 (KCl) para dar la relación ácido/base deseada. Los tampones de pirofosfato y carbonato se prepararon disolviendo la forma básica del tampón en D 2 O que contenía la cantidad de KCl necesaria para que la fuerza iónica fuese la unidad, seguida de la adición de DCl hasta dar la relación ácido/base deseada. Los tampones de HFIP, y TFE se prepararon disolviendo la forma ácida y la cantidad adecuada de KCl en D 2 O seguido de la adición de KOD para dar la relación ácido/base deseada a I = 1,0 (KCl). Los valores de pD se determinaron a 25 ºC usando un pHmetro modelo Orion 350 equipado con un electrodo Radiometer pHC4006-9. Los valores de pD se obtuvieron añadiendo 0,4 unidades al valor de pH observado en el pHmetro. 216 La concentración de ión deuteróxido a cualquier pD fue calculada usando la ecuación 5.1, donde K w = 10 -14,87 es el producto iónico del agua deuterada a 25 ºC y γ OL = 0,78 es el coeficiente de actividad aparente del ión lióxido en las condiciones experimentales. 217 DO  10    5.1 5.2.3 Análisis espectroscópico RMN 1 H. Los espectros de RMN 1 H a 500 MHz fueron registrados en D 2 O utilizando un espectrómetro Bruker AMX500 217,218 . En todos los casos, el tiempo de relajación entre pulsos fue al menos 10 veces superior al tiempo de relajación más lento de los protones de interés. Los espectros fueron obtenidos con un ancho de barrido de 2600 Hz, 216 Glasoe, P. K.; Long, F. A. 1960 J. Phys. Chem., 64: 188-190. 217 Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 1996 J. Am. Chem. Soc. 118: 3129-3141. 218 Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 1992 J. Am. Chem. Soc. 114: 10297-10302. CAPÍTULO 5 128 un ángulo de pulso de 90º, y un tiempo de adquisición de 6 s. Las líneas base fueron corregidas antes de la integración de los picos. Los desplazamientos químicos de las señales se referenciaron con respecto a la señal de (CH 3 ) 4 N + a 2,94 ppm. 5.2.4 Determinación de las constantes de equilibrio. La posición del equilibrio para la adición de glicina a la acetona para formar la imina correspondiente a 25 ºC en D 2 O y I = 1,0 (KCl) se determinó por espectroscopía RMN 1 H, 219,220 monitorizando la formación de la imina en disoluciones que contenían 0,1 M de glicina y 1,0 M de acetona a I = 1,0 (KCl). El valor del pD se mantuvo constante añadiendo 0,10 M de las siguientes disoluciones tampón: fosfato, pD 6,1 – 8,0; pirofosfato, pD 8,6 – 9,5; carbonato, pD 10,0 – 11,1; y TFE, pD 12,0 – 13,0. Los valores de la constante de equilibrio observada (K add ) obsd para la formación de la imina se determinaron a partir de la relación de las áreas integradas de las señales de los protones metileno de la imina (  G^_ ) y de la glicina (   ) de acuerdo con la ecuación 5.2, donde [1-IM] e y [Gly] e son las concentraciones totales en el equilibrio de la imina y de la glicina, respectivamente. La relación de concentraciones de equilibrio se determinó entre 1 y 2 horas después de la mezcla de los reactivos, excepto a pD mayor que 8, donde se esperó 24 horas para asegurar que se alcanzara el equilibrio químico. A pD = 13 se produjo la incorporación de deuterio en la glicina catalizada por acetona durante este período de espera. Sin embargo, el análisis 219 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2008, J. Am.Chem. Soc. 130: 2041–2050. 220 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Richard, J. P. 2009, J. Am. Chem. Soc. 131: 15815- 15824. 129 CAPÍTULO 5 de RMN 1 H mostró el mismo enriquecimiento de deuterio en los grupos metileno de la glicina y de su imina dentro del error experimental. Así pues, la relación de las concentraciones de equilibrio del aducto imina y de la glicina en estas condiciones se calculó como la relación de la suma de las áreas de los picos debidos a los grupos -CH 2 - y -CHD-.    !" G$^_ : Gly : Acetona  G^_    Acetona 5.2 5.2.5 Medidas cinéticas. Todas las reacciones se llevaron a cabo en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). Las reacciones de intercambio por deuterio de la glicina en presencia de acetona o 3 se iniciaron mezclando disoluciones del ácido de carbono, el catalizador y el tampón al mismo valor de pD y I = 1,0 (KCl). La concentración final del aminoácido estuvo comprendida entre 5 y 15 mM. Las reacciones de intercambio por deuterio de la glicina en presencia de 2 en disoluciones alcalinas de D 2 O, se iniciaron mezclando las disoluciones del ácido de carbono, 2, y KOD a la misma fuerza iónica (I = 1,0 (KCl)) hasta obtener una concentración final de glicina de 5 mM. El intercambio por deuterio del primer protón del grupo metileno de la glicina fue seguido por espectroscopía RMN 1 H a 500 MHz, monitorizando la desaparición del singlete debido al grupo – CH 2 – del aminoácido y la aparición de un triplete a campo más alto debido al grupo – CHD – del producto monodeuterado. 221,222,223 El progreso de la reacción, R, se calculó 221 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 222 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. 223 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2008, J. Am.Chem. Soc. 130: 2041–2050. CAPÍTULO 5 136 Figura 5.6 I nfluencia de la concentración total de tampón de HFIP sobre k ex (s -1 ) para el intercambio del primer protón del grupo metileno de la glicina en presencia de acetona a pD 9,98 ([RO - ] / [ROH] = 1,0) en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). ( ) 0,10 M de acetona; ( ) 0,25 M de acetona; ( ) 0,50 M de acetona. [tampón] T /M 0,0 0,1 0,2 k ex /10 -7 s -1 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 137 CAPÍTULO 5 6 G^_H    G^_H acetona =12    I  > 5.7 Los datos experimentales para las reacciones en presencia de tampones de HFIP al 20 y 80% de base libre se analizan de modo similar (tabla C1), obteniendo un valor de k w = 1,6 × 10 -5 s -1 y k w = 2,2 × 10 -4 s -1 para la desprotonación del ión iminio a pD 9,27 y 10,48, respectivamente. El perfil de velocidad (log k w ) frente a pD para la desprotonación de 1-IM-D en D 2 O se puede ver el la figura 5.7 ( ). La línea de pendiente unidad muestra el ajuste por mínimos cuadrados de los datos a la ecuación 5.8, utilizando (k DO ) 1-IM-D = 4,2 M -1 s -1 para la desprotonación de 1-IM-D por DO – (figura 5.3), donde K w = 10 -14,87 M 2 es el producto iónico del agua deuterada a 25 ºC y γ OL = 0,78 es el coeficiente de actividad aparente del ión lioxido bajo nuestras condiciones experimentales. log4 T log= 4   T   >2pD 5.8 Las pendientes de las correlaciones lineales de la figura 5.6 son iguales a (k buf ) obsd = (k B ) 1-IM-D f B f 1-IM-D para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por tampón a una concentración dada de acetona, donde (k B ) 1-IM-D es la constante de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 1-IM-D por la base del tampón (figura 5.3) y f B es la fracción del catalizador en su forma básica. Los valores de k B recogidos en la tabla 5.2 fueron calculados a partir de los valores de (k buf ) obsd utilizando los valores apropiados de f B y f 1-IM-D . La media de los valores de k B determinados a diferentes fracciones de base del CAPÍTULO 5 138 tampón proporciona un valor de (k B ) 1-IM-D = 2,4 x 10 -4 M -1 s -1 para la desprotonación de 1-IM-D por la forma básica de HFIP (figura 5.3). 226227228 (referencias de la figura 5.7) 226 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Amyes, T. L.; Richard, J. P. 2008, J. Am.Chem. Soc. 130: 2041–2050. 227 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 228 Rios, A.; Crugeiras, J.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2001 J. Am. Chem. Soc. 123: 7949- 7950. Figura 5.7 Representación de log k w (s - 1 ) frente al pD para el intercambio por deuterio de l primer hidrógeno del grupo metileno de: ( ) 1-IM-D; ( ) 2-IM; ( ) 3-IM-D; ( ) glicina N protonada 226 ; ( ) glicina metil éster N protonada; ( ) el ión iminio formado a partir de la glicina metil éster y la acetona. 227,228 pD 6 8 10 12 14 log (k w ) (s -1 ) -10,0 -8,0 -6,0 -4,0 -2,0 139 CAPÍTULO 5 Tabla 5.2. Constantes de velocidad para el intercambio del primer proton del grupo metileno de la glicina en presencia de acetona y tampones de HFIP en D 2 O a k B /M -1 s -1 h 2,4 × 10 -4 3,0 × 10 -4 2,3 × 10 -4 2,6 × 10 -4 2,2 × 10 -4 a A 25 o C y I = 1.0 (KCl). b Valor del pK a aparente del ácido conjugado en D 2 O a 25 o C y I = 1.0 (KCl). c Fracción del tampón presente en forma básica. d Fracción de la glicina presente en la forma reactiva de ión iminio 1-IM-D, calculada utilizando la ecuación 5.7 y los valores de las constantes de equilibrio de la tabl a 5.1. e Las ordenadas en el origen de la representación de k ex frente a [tampón] T (Figura 5.6). f Constantes de velocidad aparente s de primer orden para la desprotonación de 1-IM-D catalizada por el disolvente, calculadas a partir de los valores de k o como se describió en el texto . g Las pendientes de las representaciones de k ex frente a [tampón] T (Figure 5.6). h Constantes de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 1-IM-D catalizada por la base de HFIP, calculadas a partir de los valores de ( k buf ) obsd como se describió en el texto. (k buf ) obsd / M -1 s -1 g 1,3 × 10 -7 6,6 × 10 -8 1,2 × 10 -7 2,8 × 10 -7 5,8 × 10 -8 k w /s -1 f 2,2 × 10 -4 5,1 × 10 -5 6,5 × 10 -5 7,1 × 10 -5 1,6 × 10 -5 k o /s -1 e 1,5 × 10 -7 2,3 × 10 -8 7,0 × 10 -8 1,5 × 10 -7 2,1 × 10 -8 f 1-IM-D d 6,8 × 10 -4 4,4 × 10 -4 1,1 × 10 -3 2,1 × 10 -3 1,3 × 10 -3 [acetona] /M 0,25 0,10 0,25 0,50 0,25 pD 10,48 9,87 9,94 9,98 9,27 f B c 0,8 0,5 0,2 Base HFIP pK BD = 9,9 b CAPÍTULO 5 140 5.3.2.2 Catálisis por benzaldehído (2). El intercambio por deuterio del primer protón del grupo metileno de la glicina en presencia de 2 a varias concentraciones de ión deuteróxido en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl) fue seguido por espectroscopía RMN 1 H (500 MHz). La tabla C2 del apéndice recoge los valores de las constantes de velocidad de primer orden k ex para la reacción de intercambio por deuterio y los valores de f 2-IM , la fracción del aminoácido que se convierte en imina (figura 5.8) bajo las condiciones experimentales, determinados por análisis espectroscópico RMN 1 H de mezclas de glicina y 2 en D 2 O 229 . Las constantes de velocidad para la desprotonación del aducto imina catalizada por el disolvente, k w = k ex / f 2-IM , aumentan linealmente con la concentración de ión deuteróxido. La pendiente de esta correlación proporciona un valor de ((k DO ) 2-IM = 2,90 x 10 -4 M -1 s -1 ) para la constante de velocidad de segundo orden correspondiente a la desprotonación de 2-IM catalizada por ión deuteróxido. La figura 5.7 ( ) muestra el perfil de log k w frente a pD para la desprotonación de 2-IM en D 2 O. La línea de pendiente unidad muestra el ajuste de los datos a la ecuación 5.8 ((k DO ) 2-IM = 2,90 x 10 -4 M -1 s -1 ). No fue posible determinar el valor de la constante de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 2-IM-D por DO – debido a que la reacción de intercambio por deuterio es demasiado lenta para ser monitorizada a valores de pD inferiores a 11, donde la concentración de 2-IM-D empezaría a ser significativa. 229 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Richard, J. P. 2009, J. Am. Chem. Soc. 131: 15815- 15824. 141 CAPÍTULO 5 5.3.2.3 Catálisis por salicilaldehído (3). El intercambio por deuterio del primer protón del grupo metileno de la glicina en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl) fue examinado en disoluciones tamponadas por HFIP (pD 9,3 – 10,5). Los valores de la constante de velocidad observada de primer orden, k ex, para la reacción de intercambio por deuterio en presencia de varias concentraciones de 3 y HFIP a valores de pD 9,3; 9,8; y 10,5 se presentan en la tabla C3 del apéndice. En esta tabla se recogen también los valores de f 3-IM-D , fracción de la glicina total que se convierte en el ión iminio reactivo (figura 5.9) a cada concentración de 3 al valor de pD dado. Estos valores se determinaron como se explicó en apartados anteriores, por espectroscopía RMN 1 H de mezclas de glicina y 3 230 . La dependencia lineal de k ex con la concentración total del tampón HFIP (pD 9,8) para reacciones a dos concentraciones fijas de 3 se puede observar en la figura 5.10. Las ordenadas en el origen de estas representaciones lineales son las constantes de velocidad de primer orden k o = k w f 3-IM-D (tabla 5.3), para el intercambio catalizado por el disolvente al valor de pD indicado, donde k w es la constante de velocidad aparente de primer orden para la reacción con el disolvente, y f 3-IM-D es la fracción de glicina presente como el ión iminio 3-IM-D (tabla C3). Los valores de k w , calculados como k w 230 Crugeiras, J.; Rios, A.; Riveiros, E.; Richard, J. P. 2009, J. Am. Chem. Soc. 131: 15815- 15824. Figura 5.8 Equilibrio de adición de la glicina al benzaldehído y reacción de intercambio por deuterio de un protón en posición α al grupo imino de 2-IM. CAPÍTULO 5 142 = k o / f 3-IM-D para reacciones a dos concentraciones diferentes de 3 se recogen en la tabla 5.3. Un tratamiento análogo de los datos experimentales para las reacciones a valores de pD 10,5 y 9,3 (tabla 5.3) permite obtener los valores k w =1,1 × 10 -5 s -1 y k w =7,8 × 10 -7 s -1 , respectivamente. La representación de k w frente a la concentración de DO – es lineal y su pendiente proporciona la constante de velocidad de segundo orden (k DO ) 3-IM-D = 0,19 M -1 s -1 para la desprotonación de 3-IM-D por el ión deuteróxido. La figura 5.7 ( ) muestra la representación de log k w frente al pD para la desprotonación de 3-IM-D en D 2 O. La línea de pendiente unidad trazada a través de los datos se calculó utilizando la ecuación 5.8 y el valor (k DO ) 3-IM-D = 0,19 M -1 s -1 . Las pendientes de las correlaciones lineales de la figura 5.10 son las constantes de velocidad aparentes de segundo orden , (k buf ) obsd = (k B ) 3-IM-D f B f 3-IM-D , para la reacción de intercambio por deuterio catalizada por tampón a la concentración dada de 3, donde (k B ) 3-IM-D es la constante de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 3-IM-D por la forma básica del tampón, y f B es la fracción del catalizador en su forma básica. Los valores de k B que se muestran en la tabla 5.3 fueron calculados a partir de los valores de (k buf ) obsd , f B y f 3-IM-D . El valor (k B ) 3-IM-D = 2,9 × 10 -5 M -1 s -1 para la Figura 5.9 Equilibrio de adición del zwitterión de la glicina al salicilaldehído y posterior reacción de intercambio por deuterio de un protón en posición α al ión iminio de 3-IM-D. 143 CAPÍTULO 5 desprotonación de 3-IM-D por la forma básica del HFIP se calculó como la media de los valores de k B determinados a diferentes fracciones de base del tampón. Figura 5.10 In fluencia de la concentración total de tampón de HFIP sobre k ex ( s -1 ) para el intercambio por deuterio del primer protón del grupo metileno de la glicina en presencia de salicilaldehído a pD de 9,8 en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). ( ) 10 mM de 3; ( ) 52 mM de 3. [tampón] T /M 0,00 0,05 0,10 0,15 k ex /10 -6 s -1 0,0 1,0 2,0 3,0 CAPÍTULO 5 144 Tabla 5.3 Constantes de velocidad para el intercambio del primer protón del grupo metileno de la glicina en presencia de 3 y tampones de HFIP en D 2 O a k B /M -1 s -1 h 2,6 × 10 -5 2,8 × 10 -5 2,6 × 10 -5 3,3 × 10 -5 3,2 × 10 -5 a A 25 ºC y I = 1,0 (KCl). b Valor del pK a aparente del ácido conjugado en D 2 O a 25 ºC y I = 1,0 (KCl). c Fracción del tampón presente en su forma básica. d Fracción de glicina presente en la forma reactiva de ión iminio 3-IM-D a la concentración dada de 3, determinada por análisis espectroscópico de RMN 1 H de la mezcla en equilibrio de glicina e imina. e Las ordenadas en el origen de las representaciones de k ex frente a la concentración total de tampón (Figura 5.10). f Constantes de velocidad aparentes de primer orden para la desprotonación de 3-IM-D catalizada por el disolvente, calculadas a partir de los valores de k o como se describió en el texto. g La pendiente de las representaciones de k ex frente a la concentración total de tampón (Figura 5.10). h Constantes de velocidad de segundo orden para la desprotonación de 3-IM-D catalizada por la base del tampón de HFIP, calculadas a partir de los valores de (k buf ) obsd , tal y como se describió en el texto. (k buf ) obsd / M -1 s -1 g 3,1 × 10 -6 8,8 × 10 -6 4,2 × 10 -6 1,2 × 10 -5 2,9 × 10 -6 k w /s -1 f 1,1 × 10 -5 1,1 × 10 -5 2,2 × 10 -6 2,5 × 10 -6 7,8 × 10 -7 k o /s -1 e 1,7 × 10 -6 4,4 × 10 -6 6,9 × 10 -7 1,8 × 10 -6 3,5 × 10 -7 f 3-IM-D d 0,15 0,39 0,32 0,73 0,45 [aldehído] /M 6,0 × 10 -3 2,0 × 10 -2 1,0 × 10 -2 5,2 × 10 -2 2,0 × 10 -2 pD 10,53 10,52 9,80 9,86 9,35 f B c 0,8 0,5 0,2 Base HFIP pK BD = 9,9 b 145 CAPÍTULO 5 5.4 Discusión de los resultados La acetona (1), el salicilaldehído (3) y el benzaldehído (2) son catalizadores efectivos de la desprotonación del carbono en posición α al grupo amino de la glicina en D 2 O. Esta reacción conduce al intercambio del hidrógeno de la glicina por deuterio del disolvente, que se monitoriza por espectroscopía RMN 1 H. La observación que las reacciones de intercambio por deuterio son de primer orden en la concentración del catalizador electrofílico e ión deuteróxido, indica que transcurren a través de la formación de la imina ó ión iminio de la glicina, que sufre la desprotonación por el ión deuteróxido para formar el correspondiente enolato (figuras 5.3, 5.8 y 5.9). La tabla 5.4 muestra las constantes de equilibrio K add para la formación de aductos entre la glicina y 1, 2 ó 3 y las constantes de velocidad de segundo orden k DO para la desprotonación de estos aductos. Las constantes de velocidad de segundo orden k HO = 2,9 M -1 s -1 , 0,13 M -1 s -1 y 2,0 x 10 -4 M -1 s -1 (tabla 5.5), para la desprotonación de 1-IMH, 3-IMH y 2-IM, respectivamente, por el ión hidróxido en agua fueron calculadas utilizando los valores experimentales de k DO y un valor estimado para el efecto isotópico secundario del disolvente de k DO / k HO = 1,46. Este valor del efecto isotópico secundario del disolvente para la desprotonación de 1-IM-L, 3-IM-L y 2-IM por el ión lióxido se supone igual al medido para la desprotonación de la acetona. 231 En la tabla 5.5 se recogen los valores de k HO para la desprotonación de la glicina y algunos de sus derivados determinados en los estudios que forman parte de esta tesis doctoral y en trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación. 232,233,234 231 Pocker, Y. 1959 Chem. Ind, 1383-1384) 232 Rios, A.; Amyes, T. L.; Richard, J. P.; 2000 J. Am. Chem. Soc. 122: 9373-9385. 233 Toth, K.; Richard, J. P. 2007 J. Am. Chem. Soc., 129: 3013-3021.