Films desoxidantes para la regeneración de heridas. Estudios in vitro

FACULTADE DE CIENCIAS GRAO EN BIOQUÍMICA D.ª Valeria Fernanda Esteban Galvis FILMS DESOXIDANTES PARA A REXENERACIÓN DE FERIDAS. ESTUDOS IN VITRO Traballo Fin de Grao Xuño 2024 ÍNDICE ÍNDICE LISTA DE ABREVIACIONES .................................................................................................... 3 RESUMEN ............................................................................................................................ 5 RESUMO ............................................................................................................................. 6 ABSTRACT ........................................................................................................................... 7 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 8 1.1 Curación y regeneración de heridas .................................................................................... 8 1.2 Heridas crónicas ................................................................................................................ 10 1.3 Apósitos basados en biopolímeros ................................................................................... 11 1.4 Biopolímeros ..................................................................................................................... 12 1.5 Reguladores del estrés oxidativo: complejos de manganeso ........................................... 15 2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 16 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 17 3.1 Materiales ................................................................................................................... 17 3.2 Preparación de los films .............................................................................................. 17 3.3 Caracterización de los films ......................................................................................... 19 3.4 Evaluación en cultivos celulares in vitro de queratinocitos humanos HaCaT ............. 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 31 4.1 Preparación de los films .............................................................................................. 31 4.2 Grosor .......................................................................................................................... 32 4.3 Contenido de humedad ............................................................................................... 33 4.4 Propiedades mecánicas ............................................................................................... 33 4.5 Permeabilidad al vapor de agua .................................................................................. 34 4.6 Índice de hinchamiento ............................................................................................... 35 4.7 Perfil de liberación in vitro de MnL ............................................................................. 37 4.8 Adsorción de proteínas y ángulo de contacto ............................................................ 39 4.9 Evaluación de la citotoxicidad in vitro. Ensayo de captación del rojo neutro ............. 40 4.10 Evaluación de la viabilidad mitocondrial in vitro. Ensayo XTT .................................... 42 4.11 Evaluación de la proliferación celular en ambiente extracelular oxidativo ................ 44 4.12 Evaluación de la migración celular. Ensayo scratch .................................................... 47 4.13 Evaluación de la morfología celular. Tinción Giemsa .................................................. 48 4.14 Evaluación de la actividad antioxidante frente al ROS intracelular ............................ 48 5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 51 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 52 LISTA DE ABREVIATURAS 3 LISTA DE ABREVIACIONES AA Ácido ascórbico AC Ángulo de contacto BPs Biopolímeros BS Fuerza de rotura (Burst Strenght) BSA Seroalbúmina bovina CAT Catalasa CMC Carboximetilcelulosa sódica DB Distancia de rotura (Distance to Burst) DCF 2’,7’-diclorofluoresceína DCFH-DA 3’,6’-diacetato de 2’,7’-diclorofluoresceína DMEM Medio Eagle (Modificación de Dulbecco); (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) DMSO Dimetilsulfóxido DNCB 2,4-dinitroclorobenceno DS Desviación estándar ECH Epiclorohidrina ECM Matriz extracelular FBS Suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum) GPx Glutatión peroxidasa IH Índice de hinchamiento MnL Complejos de manganeso NaAlg Alginato de sodio PBS Tampón fosfato salino (Phosphate-Buffered Saline) PMS Metosulfato de fenazina (Phenazine Methosulfate) LISTA DE ABREVIATURAS 4 RI Reticulación iónica ROS Especies de oxígeno reactivas (Reactive Oxygen Species) RQ Reticulación química SDS Lauril sulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate) SOD Superóxido dismutasa SWF Fluido de herida simulado (Simulated wound fluid) t-BHP Hidroperóxido de tert-butilo XTT 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida WVP Permeabilidad al vapor de agua (Water Vapor Permeability) WVTR Índice de transmisión del vapor de agua (Water Vapor Transmission Rate) RESUMEN 5 Título: Films antioxidantes para la regeneración de heridas. Estudios in vitro. Resumen Las heridas crónicas exudativas se presentan como un problema recurrente en el área de atención primaria del sistema de salud, reducen la calidad de vida del paciente y son difíciles de tratar dada su naturaleza crónica. Su sintomatología está asociada a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y a las infecciones recurrentes que promueven un estado inflamatorio continuo. El uso de apósitos superabsorbentes acoplado a la terapia antibiótica es el tipo de tratamiento más frecuente para estas lesiones. En este trabajo se estudió la capacidad antioxidante, así como las propiedades fisicoquímicas y mecánicas, de films secos compuestos de alginato de sodio y carboximetilcelulosa sódica suplementados con un complejo metálico de manganeso. Se analizó el efecto que el tipo de reticulación (química o iónica) de los polímeros tuvo sobre estas propiedades. Además, se evaluó su biocompatibilidad y actividad antioxidante frente al ROS celular en cultivos in vitro de queratinocitos humanos (HaCaT). Los resultados de caracterización demostraron una relación directa entre el tipo de reticulación usada y las propiedades evaluadas para cada film, siendo la combinación de ambos métodos de reticulación la que dio lugar a films con las mejores cualidades de hinchamiento, flexibilidad, resistencia y liberación controlada del complejo. A su vez, los ensayos in vitro indicaron una total biocompatibilidad de los films, así como un claro efecto antioxidante contra el estrés oxidativo. Además, se observó un efecto positivo en la migración celular. Aunque los films sintetizados no son más que prototipos de apósitos superabsorbentes, es necesario continuar investigando las posibles aplicaciones que los biopolímeros y los complejos biomiméticos puedan tener en el tratamiento de las heridas crónicas exudativas. Palabras clave: Heridas crónicas exudativas, biopolímeros, complejos metálicos biomiméticos, manganeso, especies reactivas de oxígeno (ROS), apósitos superabsorbentes, carboximetilcelulosa sódica (CMC), alginato de sodio (NaAlg), estudios in vitro. RESUMO 6 Título: Films desoxidantes para a rexeneración de feridas. Estudos in vitro. Resumo As feridas crónicas exudativas preséntanse como un problema recorrente na área de atención primaria do sistema de saúde, reducen a calidade de vida do paciente e o seu tratamento é difícil dada a súa natureza crónica. Os seus síntomas están asociados á producción de especies reactivas de osíxeno (ROS) e ás infeccións recorrentes que promoven un estado inflamatorio continuo. O uso de apósitos superabsorbentes xunto coa terapia antibiótica é o tratamento máis común usado nestas feridas. Neste traballo estudouse a capacidade desoxidante, así como as propiedades fisicoquímicas e mecánicas, de películas secas compostas por alxinato de sodio e carboximetilcelulosa sódica complementados cun complexo metálico de manganeso. Analizouse o efecto que o tipo de reticulación (química ou iónica) dos polímeros tivo nestas propiedades. Ademais, avaliouse a súa biocompatibilidade e actividade desoxidante contra o ROS celular en cultivos in vitro de queratinocitos humanos (HaCaT). Os resultados da caracterización demostraron unha relación directa entre o tipo de reticulación usada e as propiedades avaliadas para cada película, sendo a combinación de ambos métodos de reticulación a que deu orixe a películas coas mellores cualidades de inchamiento, flexibilidade, resistencia e liberación controlada do complexo. Ó mesmo tempo, os ensayos in vitro indicaron unha total biocompatibilidade das películas, así como un claro efecto desoxidante contra o estrés oxidativo. Por outra banda, obervouse un efecto positivo na migración celular. Aínda que as películas sintetizadas non son máis que prototipos de apósitos superabsorbentes, é preciso seguir investigando as posibles aplicacións que poden ter os biopolímeros e os complexos biomiméticos no tratamento das feridas crónicas exudativas. Palabras chave: Feridas crónicas exudativas, biopolímeros, complexos metálicos biomiméticos, manganeso, especies reactivas de osíxeno (ROS), apósitos superabsorbentes, carboximetilcelulosa sódica (CMC), alxinato de sodio (NaAlg), estudos in vitro. ABSTRACT 7 Title: Antioxidants films for wound healing. in vitro studies. Abstract Exudative chronic wounds are a recurring problem regarding primary care in the health system, these injuries hinder the patient's quality of life and are hard to treat successfully due to their chronical nature. Their clinical presentation is associated with an increment in the production of reactive oxygen species (ROS) and recurring infections that, together, promote a continuous inflammatory state in the affected tissue. The use of superabsorbent dressings coupled with extensive antibiotic therapy is the most frequent treatment course for these types of wounds. In this work, the antioxidant activity, as well as the mechanical and physicochemical properties, of dry films composed by a blend of sodium alginate and sodium carboxymethyl cellulose containing a manganese metallic complex were investigated. The aim was to determine whether the crosslinking method (chemical or ionic) used to obtain the films influenced the aforementioned properties. Moreover, the biocompatibility and the antioxidant effect against cellular ROS was evaluated using in vitro cultures of human keratinocytes (HaCaT). Results showed a direct correlation between the crosslinking method used to obtain the films and the properties evaluated for each film synthesized, being the use of both chemical and ionic crosslinking the technique that resulted in films with the most desirable characteristics regarding swelling degree, flexibility, strength and controlled release of the manganese complex. At the same time, in vitro assays showed complete biocompatibility between the films and the cell culture, as well as an evident antioxidant effect against oxidative stress. A positive effect on cellular migration was also reported. Although the films obtained in this work are nothing more than prototypes of superabsorbent wound dressings, it is necessary to continue doing research on the possible applications that biopolymers and biomimetic metallic complexes can have on the treatment of exudative chronic wounds. Keywords: Chronic exudative wounds, biopolymers, biomimetic metal complexes, manganese, reactives oxygen species (ROS), superabsorbent dressings, carboxymethylcellulose sodium (CMC), sodium alginate (NaAlg), in vitro studies. 1. INTRODUCCIÓN 8 1. INTRODUCCIÓN Una herida puede definirse como una ruptura en la continuidad de un tejido u órgano que afecta su funcionamiento y estructura. Las heridas crónicas exudativas surgen de un desarrollo incompleto del proceso de regeneración y curación del tejido, que además se ve agravado por la existencia de patologías subyacentes.1 Estas lesiones pueden durar años y suponen una reducción en la calidad de vida del paciente, usualmente se encuentran en puntos de presión constante que, una vez generada la herida, impiden la movilidad normal. Además, requieren de curas continuas que pueden llegar a ser en extremo dolorosas e implican una pérdida en la autonomía del paciente.2 En la actualidad, los apósitos usados para el tratamiento de las heridas crónicas exudativas han evolucionado para tener características ideales que manejen la sintomatología típica de estas lesiones. El uso de films secos superabsorbentes que además sean bioactivos y con capacidad antioxidante, ya sea por si mismos o mediante la liberación de sustancias activas en el lecho de la herida es cada vez más frecuente.3 El trabajo de investigación de otros autores en el campo de la tecnología farmacéutica para el desarrollo de materiales que cumplan con estos requerimientos ha dado lugar a la obtención de diversos prototipos de apósitos como films antioxidantes suplementados con nanopartículas de cerio,4 hidrogeles con capacidad antibiótica suplementados con fibrinógeno y nisina,5 films antiinflamatorios con povidona yodada añadida,6 hidrogeles con liberación controlada de fármacos,7 entre otros. Aunque se han hecho grandes avances en el desarrollo de materiales biocompatibles y con características ideales para ser aplicados en el tratamiento de las heridas crónicas exudativas, hasta el momento no se ha encontrado una solución definitiva para este tipo de lesiones. Por consiguiente, es necesario continuar estudiando las propiedades antioxidantes, proliferativas y antiinflamatorias de estos apósitos. Todo con el fin de mejorar el panorama actual de tratamiento y cuidado de este tipo de lesiones que se presentan como un problema recurrente en el área de atención primaria del sistema de salud.8 1.1 Curación y regeneración de heridas La regeneración de heridas es uno de los procesos biológicos más complejos y dinámicos que ocurren en un ser vivo. Una vez generada una ruptura en la barrera epidérmica se desencadena una respuesta coordinada e inmediata de diversas rutas de señalización inter e intracelulares que buscan restaurar la integridad y homeostasis tisular.9,10 La curación de una herida se da a lo largo de tres etapas que, aunque son consecutivas y se superponen temporalmente, son claramente diferenciables por los marcadores bioquímicos y procesos biológicos que las caracterizan. Estas etapas son: inflamación, proliferación celular y remodelación tisular (Figura 1.1).11,12 1. INTRODUCCIÓN 9 Figura 1.1 Representación esquemática del proceso de curación y regeneración de una herida. Las tres etapas del proceso son a) inflamación, b) proliferación celular y c) remodelación y maduración tisular. Adaptado de Gutner et al..9 Creado con BioRender.com La inflamación es inmediata tras la generación de una herida y está asociada a la activación de la cascada de coagulación, la liberación de intermediadores metabólicos proinflamatorios y un aumento en la actividad del sistema inmune. Esto evita la pérdida de fluidos (y sangre) y previene la infección. Una vez controlada la homeostasis se da la etapa de proliferación celular, la cual lleva a la generación de nuevo tejido y se caracteriza por la migración de los queratinocitos hacia la dermis lesionada (desde el borde hacia el interior de la herida). Además, en esta etapa también ocurre la angiogénesis, proceso de formación de nuevos capilares y vasos sanguíneos para reanudar la irrigación sanguínea a la zona afectada. Finalmente, sucede la etapa de remodelación o maduración tisular. Inicia a partir de la segunda semana desde el momento de generación de la herida y puede llegar a durar hasta dos años. En esta etapa se eliminan por apoptosis las células mediadoras del sistema inmune y las células endoteliales de los vasos sanguíneos formados en el proceso de angiogénesis, dejando atrás una red de colágeno y proteínas características de la matriz extracelular. Es en esta etapa donde el colágeno tipo III depositado inicialmente en la herida será remodelado a colágeno tipo I (propio de la piel), aumentando la fuerza del tejido reparado.9 Este proceso de regeneración tisular puede verse afectado por diversos factores como la deshidratación de la herida, una deficiente irrigación del tejido (poca oxigenación), el desarrollo de infecciones y la presencia de condiciones patológicas previas como la diabetes mellitus, el cáncer o la obesidad. Un fallo en el desarrollo de alguna de estas fases puede alargar en el tiempo el proceso de curación, elevando el riesgo de la evolución de una herida normal a una herida de tipo crónica.6 2. OBJETIVOS 16 2. OBJETIVOS El objetivo principal de este Trabajo Fin de Grado es el desarrollo y caracterización de films secos de alginato de sodio y carboximetilcelulosa sódica, conteniendo un complejo de manganeso como principio activo antioxidante para su posible aplicación en el tratamiento de las heridas crónicas exudativas. Los objetivos parciales de este trabajo son: 1) la obtención de un prototipo del sistema de liberación de complejo de manganeso, 2) la caracterización de las propiedades fisicoquímicas y mecánicas del film; 3) la evaluación de su biocompatibilidad en cultivo de queratinocitos humanos y 4) la evaluación de la capacidad antioxidante de estos sistemas en cultivo in vitro. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 17 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales Los siguientes materiales fueron adquiridos y usados para la preparación de los films: Alginato de Sodio (NaAlg) (W201502, Sigma-Aldrich, Estados Unidos), carboximetilcelulosa sódica 1550- 4500 (CMC) (Mg94225, Guinama, España), glicerol (G-7757, Sigma-Aldrich, Estados Unidos), cloruro de calcio anhidro (CaCl2) (141221, Panreac Química SLU, España), hidróxido de sodio (NaOH) (141686, Panreac Química SLU, España), epiclorohidrina (ECH) (E1055, Sigma-Aldrich, Estados Unidos). Los complejos de manganeso empleados en este trabajo fueron cedidos por el grupo de investigación del profesor M. Maneiro. Los demás reactivos utilizados fueron de grado analítico. 3.2 Preparación de los films Se prepararon 3 tipos de films blancos (sin MnL) con la misma concentración de polímeros y plastificante, 3% (m/v) alginato de sodio/2% (m/v) CMC/3% (m/v) glicerol, pero variando las concentraciones de reticulante iónico (CaCl2) y químico (epiclorohidrina). Así, para la composición del film 1 (F1) se utilizó una disolución 0,05% (m/v) CaCl2 como reticulante iónico del alginato de sodio y se empleó una relación 3:4 entre la cantidad (gramos) de CMC y ECH, que se incorporó a la disolución a modo de reticulante químico. En el film 2 (F2), se mantuvo la relación 3:4 gramos CMC/gramos ECH, pero se incrementó la concentración de reticulante iónico, utilizando una disolución 0,1% CaCl2 en la dispersión de NaAlg. Por último, el film 3 (F3) se preparó empleando únicamente una reticulación química, estableciendo una relación 3:4 entre la cantidad total de polímero (CMC + NaAlg) y la cantidad de ECH añadida. Para la preparación de films con MnL, únicamente se añadió la cantidad necesaria de complejo durante la preparación de cada film, obteniendo una concentración final de 0,1% (m/v) MnL en la dispersión. A continuación, se detalla el proceso de preparación de cada uno de los films, tanto films blancos como films 0,1% MnL. En la Tabla 3.1 y Tabla 3.2 se detallan las concentraciones de polímeros, glicerol y agentes reticulantes usados en la preparación de cada film. Muestra Alginato Carboximetilcelulosa CaCl2 Epiclorohidrina Glicerol Film 1 (Blanco) 3% 2% 0,05% 2,7% 3% Film 2 (Blanco) 3% 2% 0,1% 2,7% 3% Film 3 (Blanco) 3% 2% 0% 6,7% 3% Tabla 3.1 Concentraciones de alginato de sodio, carboximetilcelulosa sódica, CaCl2, epiclorohidrina y glicerol usadas para la preparación de los films blancos. Todas las concentraciones se dan en % m/v. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 18 Muestra Alginato Carboximetilcelulosa CaCl2 Epiclorohidrina Glicerol MnL Film 1 (0,1% MnL) 3% 2% 0,05% 2,7% 3% 0,1% Film 2 (0,1% MnL) 3% 2% 0,1% 2,7% 3% 0,1% Film 3 (0,1% MnL) 3% 2% 0% 6,7% 3% 0,1% Tabla 3.2 Concentraciones de alginato de sodio, carboximetilcelulosa sódica, CaCl2, epiclorohidrina y glicerol usadas para la preparación de los films 0,1% MnL. Todas las concentraciones se dan en % m/v. 3.2.1 Film 1 (Blanco) El film 1 se preparó a partir de dos disoluciones iniciales de volúmenes iguales. Primero, se procedió a preparar la dispersión de CMC en una disolución 6% (m/v) NaOH, agitando a mano con una varilla de vidrio hasta conseguir una dispersión homogénea del polímero, obteniendo una concentración final de 4% CMC (m/v) (1). En otro vaso, se dispersó el NaAlg en una disolución 0,05% (m/v) CaCl2 obteniendo una concentración final de 6% (m/v) de NaAlg, a la cual se añadió glicerol para conseguir una concentración final de 6% (m/v) glicerol (2). De la misma manera que la disolución (1), se agitó a mano con una varilla de vidrio hasta conseguir una dispersión homogénea del alginato de sodio. Se cubrió cada vaso con Parafilm® y se mantuvo en nevera a 4°C durante 12 horas, para garantizar la completa hidratación de las cadenas de los polímeros y evitar la aparición de grumos durante el proceso de preparación. Una vez atemperadas ambas disoluciones a 25°C (temperatura ambiente), se mezcló en un tercer vaso la disolución de CMC (1) y la disolución de NaAlg/glicerol (2), agitando a mano con una varilla de vidrio. La concentración final de esta dispersión será de 3% (m/v) NaAlg /2% (m/v) CMC/3% (m/v) glicerol. Tras obtener una mezcla homogénea se incorporó a la dispersión la cantidad de epiclorohidrina calculada, gota a gota y con agitación continua a mano con una varilla de vidrio durante 20-30 minutos, hasta conseguir un gel viscoso completamente homogéneo. Se llevó el vaso de precipitados a una estufa de vacío (Estufa de vacío 1490, VWR, Estados Unidos) a 200 mbar durante 12 horas, con el fin de eliminar las burbujas generadas en el proceso de mezcla de las dispersiones. Se cubrió el vaso con Parafilm® y se llevó a un baño de agua a 50°C durante 4-5 horas. Pasado este tiempo se dejó enfriar a temperatura ambiente. Como último paso, se pesaron 8 gramos de dispersión en placas de Petri (23,75 cm2), y se mantuvieron a 30ºC en estufa (Estufa de secado UE 400, Memmert, Alemania) con silica gel durante ≈3 días. El film seco se despegó cuidadosamente de la placa y se almacenó en un contenedor cerrado a temperatura ambiente. 3.2.2 Film 1 (0,1% MnL) El proceso de preparación de este film fue exactamente el mismo que se describe en el apartado anterior [Film 1 (Blanco)], a excepción de la elaboración de la dispersión (1). Además de añadir el NaAlg y el glicerol a la disolución 0,05% (m/v) CaCl2, se añadió también MnL en la cantidad necesaria para obtener una concentración de 0,2% (m/v) MnL. Una vez mezclada con la dispersión (2) la concentración final será de 0,1% (m/v) MnL. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 19 3.2.3 Film 2 (Blanco) El proceso de preparación siguió los mismos pasos que el Film 1 (Blanco), el único cambió estuvo en la concentración de CaCl2 de la dispersión (1). En este caso, se disolvieron el NaAlg y el glicerol en una disolución 0,1% (m/v) CaCl2. 3.2.4 Film 2 (0,1% MnL) Para la preparación de este film se procedió de la misma manera que con el Film 2 (Blanco), pero variando la composición de la dispersión (1). Además de añadir el NaAlg y el glicerol a la disolución 0,1% (m/v) CaCl2, se añadió también MnL en la cantidad necesaria para obtener una concentración de 0,2% (m/v) MnL. Una vez mezclada con la dispersión (2) la concentración final será de 0,1% (m/v) MnL. 3.2.5 Film 3 (Blanco) Se dispersaron el alginato de sodio, la CMC y el glicerol en una disolución 0,6% (m/v) NaOH, agitando a mano con una varilla de vidrio hasta conseguir una dispersión homogénea de los polímeros, obteniendo una concentración final de 3% (m/v) NaAlg/2% (m/v) CMC/3% (m/v) glicerol. Se cubrió el vaso con Parafilm® y se reservó en la nevera a 4°C durante 12 horas, para garantizar la completa hidratación de los polímeros y evitar la aparición de grumos en pasos posteriores. Una vez atemperada la dispersión a 25°C (temperatura ambiente), se añadió a la dispersión la cantidad de epiclorohidrina calculada (relación 3:4 entre cantidad total de polímero/gramos ECH), gota a gota y con agitación continua a mano con una varilla de vidrio durante 20-30 minutos hasta conseguir un gel viscoso completamente homogéneo. Se llevó el vaso a una estufa de vacío a 200 mbar durante 12 horas. Una vez cubierto el vaso con Parafilm®, se llevó a un baño de agua a 50°C durante 4-5 horas. Pasado este tiempo se dejó enfriar a temperatura ambiente. Como último paso, se pesaron 8 gramos de dispersión en placas de Petri (23,75 cm2), se extendió cuidadosamente la dispersión sobre la placa y se llevó a secar en estufa con silica gel a 30°C durante ≈3 días. El film seco se despegó cuidadosamente de la placa y se almacenó en un contenedor cerrado a temperatura ambiente. 3.2.6 Film 3 (0,1% MnL) Para la preparación de este film se procedió de la misma manera que el Film 3 (Blanco), pero añadiendo a la dispersión la cantidad necesaria de MnL para obtener una concentración final de 0,1% (m/v) MnL. 3.3 Caracterización de los films 3.3.1 Grosor El grosor de los films (µm) fue evaluado con un medidor de espesor ET115S (Etari GmbH, Stuttgart, Alemania), tomando medidas en 3 puntos distintos de cada muestra (n=3). Los resultados se expresaron como el valor del grosor medio calculado para cada film. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 20 3.3.2 Contenido de humedad Se tomaron 3 muestras de entre 0,2 y 0,7 gramos de cada film, previamente acondicionados durante 1 semana en un desecador a 30°C con una solución saturada de bromuro de sodio para obtener una humedad en equilibrio de 57,7%. Se tomó la medida de peso inicial de cada muestra y se almacenaron en una estufa con silica gel a 100°C durante 24 horas. Una vez finalizado el tiempo de desecación, se tomó la medida de peso final en la misma balanza analítica. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El cálculo de contenido de humedad total en porcentaje se realizó según la ecuación (3.1): 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 (%) = 𝑃𝑜−𝑃𝑓 𝑃0∗100 (3.1) Donde P0 es el peso inicial y Pf es el peso final de cada muestra. 3.3.3 Propiedades mecánicas Las propiedades mecánicas de las muestras se evaluaron en un texturómetro (TA-XTplus, Stable Micro Systems, UK). El test de punción determina la fuerza necesaria que debe ejercer una sonda cilíndrica sobre la muestra, en el punto de rotura, para mantener una velocidad constante, y la distancia recorrida por la sonda desde el momento en que entra en contacto con la muestra hasta el punto de rotura. Esta medida permite obtener los parámetros de fuerza de rotura (BS) (gramos) y distancia de rotura (DB) (mm) de cada film.32 En la Figura 3.1 se presenta un esquema de este proceso. Figura 3.1 Representación esquemática del proceso del test de punción. Adaptado de Cazón et al..32 Todos los films evaluados se acondicionaron durante 1 semana, previa a la toma de medidas, en un desecador a 30°C y una humedad en equilibrio de 57,7%. Se tomó una muestra de ≈6 cm2 de cada film y se aseguró en la plataforma de soporte del texturómetro. Se estableció una velocidad de 0,5 mm/seg, una distancia total de recorrido de 30 mm y una fuerza detonante de 0,010 N. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 21 3.3.4 Permeabilidad al vapor de agua La determinación de la permeabilidad al vapor de agua (WVP) cuantifica la cantidad de agua que atraviesa la matriz del film por unidad de grosor, tiempo y diferencia de presión entre el exterior de la cámara de permeabilidad y el interior del recipiente (g/s*m*Pa). Para este estudio se utilizó una cámara de permeabilidad preparada para tal efecto en el laboratorio de P. Cazón (Figura 3.2).33 Para la realización de este ensayo se acondicionaron los films de la misma forma que se describió anteriormente (apartado 3.3.2). Figura 3.2 Representación esquemática de la cámara de permeabilidad usada para llevar a cabo el ensayo. Adaptado de Cazón et al..33 Primero, se llevó a cabo el acondicionamiento de la cámara de permeabilidad. Para esto se llenó el recipiente con 100 ml de agua destilada, se cerró herméticamente para evitar su evaporación y se posicionó en el centro de la balanza analítica sin que este toque en ningún momento las paredes de la cámara de permeabilidad. Se establecieron 30°C de temperatura y después de cerrar la cámara, se mantuvo cerrado durante 3 horas permitiendo que el sistema llegara al equilibrio, esto es, que haya un 100% de humedad dentro del recipiente cerrado y un 0% de humedad en el interior de la cámara por efecto de la silica gel. Una vez se acondicionó el sistema se procedió a evaluar la primera muestra. Se tomó una muestra circular entera de film y se cortó al tamaño de la apertura del soporte del (área apertura = 5x10-3 m2). Seguidamente, se aseguró la muestra en el interior del soporte con un seguro de goma y se cerró el recipiente completamente cuidando de dejar una distancia de ≈50 mm entre la superficie del agua y el borde superior del recipiente para evitar el contacto del líquido con la muestra. Durante este tipo de ensayos, es importante evitar pinchar, arrugar o romper el film, ya que esto cambiaría el equilibrio del sistema permitiendo la evaporación de líquido sin atravesar la muestra. Una vez tarada la balanza y posicionado el recipiente dentro de la cámara y sin que este llegue a tocar las paredes, se cerró la cámara y se comenzaron a tomar las medidas de la variación de peso en el recipiente durante 6 horas. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 22 En este caso, las medidas fueron tomadas y registradas automáticamente en un documento de Excel a través de un software específico. Para el análisis de datos se usaron los valores de peso obtenidos a partir de las 3 horas desde el inicio del ensayo en intervalos de 10 minutos. El dato de resistencia al vapor de agua del film se determinó analizando por regresión lineal la pendiente de la recta obtenida tras representar gráficamente la variación del peso del recipiente (∆w) frente a la variación del tiempo (∆t). El índice de transmisión de vapor de agua (WVTR), la permeancia al vapor de agua y la permeabilidad al vapor de agua (WVP) se calcularon de acuerdo a las ecuaciones (3.2), (3.3) y (3.4) respectivamente: 𝑊𝑉𝑇𝑅 ( 𝑔 𝑠∗𝑚2) = ∆𝑤 ∆𝑡∗𝐴 (3.2) 𝑝𝑒𝑟𝑚𝑒𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 ( 𝑔 𝑠∗𝑚2∗𝑃𝑎) = 𝑊𝑉𝑇𝑅 ∆𝑃 (3.3) 𝑊𝑉𝑃 ( 𝑔 𝑠∗𝑚∗𝑃𝑎) = 𝑝𝑒𝑟𝑚𝑒𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 ∗ 𝑔𝑟𝑜𝑠𝑜𝑟 𝑓𝑖𝑙𝑚 (3.4) Donde ∆w/∆t (g/s) es el flujo medido como variación del peso del recipiente ∆w por unidad de tiempo frente a la variación del tiempo ∆t, A (m2) es el área total de film expuesto (determinada a partir del área de la apertura del soporte 1*10-3 m2) y ∆P (Pa) es la diferencia presión de vapor de agua (4245 Pa a 30°C)34 asumiendo un 100% de saturación dentro del recipiente y un 0% fuera del recipiente dentro de la cámara con silica gel. 3.3.5 Índice de hinchamiento Este ensayo se llevó a cabo para determinar el porcentaje máximo de absorción de líquido de cada film preparado, mantenido en un recipiente cerrado a temperatura ambiente. Se tomó una muestra de entre 0,1 y 0,5 gramos y se suspendió en un volumen en exceso (10 ml) de líquido de inmersión. El perfil de hinchamiento de cada film se evaluó usando como medio de hinchamiento tampón fosfato salino (PBS) (pH=7,4) y fluido de herida simulado (SWF) (2% BSA, 0,02 M CaCl2, 0,4 M NaCl, 0,08 M tampón Tris)5 (pH=7,5). Se tomaron medidas de peso en una balanza analítica cada 10 minutos durante un total de 180 minutos. La medida se realizó extrayendo cada film del líquido de inmersión y eliminando el líquido en exceso con papel de filtro. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El cálculo del índice de hinchamiento en porcentaje se realizó según la ecuación (3.5): Í𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑛𝑐ℎ𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (%) = 𝑃𝑡−𝑃0 𝑃0∗100 (3.5) Donde Pt es el peso del film a tiempo t y P0 es el peso inicial del film. 3.3.6 Evaluación del perfil de liberación de MnL Se evaluó el perfil de liberación de MnL de los films 0,1% MnL preparados, mantenidos a temperatura ambiente en un recipiente cerrado. Se pesó una muestra de ≈1,0 gramos de cada film y se suspendió en 1,0 ml de solución de liberación. Se incubaron las muestras a 37°C con 3. MATERIALES Y MÉTODOS 23 agitación constante a 100 rpm durante la duración total del ensayo (agitador-incubador Heidolph 1000, Alemania). Se tomaron muestras de 250 µl a intervalos preestablecidos de tiempo, reponiendo el mismo volumen de medio de liberación. Se determinó la concentración de MnL en las muestras midiendo su absorbancia (λabs=500 nm) en un espectrofotómetro Evolution 60s UV-VIS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU) de acuerdo con la recta de calibrado calculada para el complejo (Abs=696*[MnL]+0.152). Se evaluó la liberación usando como medio de liberación tampón fosfato salino (pH=7,4) y fluido de herida simulado (2% BSA, 0,02 M CaCl2, 0,4 M NaCl, 0,08 M tampón Tris)5 (pH=7,5). Todos los experimentos se realizaron por triplicado 3.3.7 Adsorción de proteínas La concentración de proteínas en las muestras se determinó utilizando el kit comercial de evaluación de proteínas BCA (Millipore, Estados Unidos). Se tomaron muestras de film de ≈1,0 cm2 y se incubaron en 1,0 ml de una disolución 0,2% (m/v) BSA durante 1 hora a 37°C con agitación continua a 100 rpm (agitador-incubador Heidolph 1000, Alemania). Una vez finalizado el tiempo de incubación se retiró cada muestra de la disolución y se lavó con 1,0 ml de agua destilada, recogiendo el agua de lavado en un tubo. Se evaluaron como muestras el líquido remanente de la incubación y la solución de lavado. Se determinó la concentración proteica de acuerdo al protocolo establecido en el kit comercial para un ensayo a microescala en una placa de 96 pocillos, midiendo la absorbancia (λabs=570 nm) de la placa e interpolando en la curva de calibrado. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. 3.3.8 Ángulo de contacto El ángulo de contacto se determinó por el método de la gota sésil. Este método se basa en la medición del ángulo generado en la intersección de las interfases líquido/sólido y líquido/gas, donde el líquido es agua destilada, el sólido es el film evaluado y el gas es el aire atmosférico. Esto con el fin de determinar las propiedades de humectabilidad de la muestra, así como el carácter hidrofílico/hidrofóbico de la superficie del film. Se tomo una muestra de cada film y se depositaron 40 µl de agua destilada con una micropipeta, pasado 1 segundo se tomó una fotografía de la gota con una cámara digital (108 MP, Xiaomi, China). El análisis de imagen se realizó con el software ImageJ. En la Figura 3.3 se representa un esquema de este proceso. Todos los experimentos ser realizaron por triplicado. Figura 3.3 Representación esquemática de la determinación del ángulo de contacto. 3. MATERIALES Y MÉTODOS 24 3.4 Evaluación en cultivos celulares in vitro de queratinocitos humanos HaCaT Para la evaluación in vitro de la citotoxicidad, proliferación celular y actividad antioxidante de los films y los complejos MnL se adquirió la línea celular de queratinocitos humanos inmortalizados HaCaT (CLS, Cell Lines Service, GmbH, Alemania). Los queratinocitos fueron cultivados en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma –Aldrich Chemie, GmbH, Alemania) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de solución antibiótica (10.000 U/penicilina; 10 mg estreptomicina, Sigma-Aldrich Chemie, GmbH, Alemania). Las condiciones de cultivo fueron 37°C de temperatura, 5% de CO2 y una humedad relativa del 95% 3.4.1 Obtención de los extractos de los films La obtención de los extractos de films se realizó siguiendo el protocolo establecido en la norma ISO 10993-12 (2022). Clasificando los films como un producto de tipo membrana según la Tabla 3.3, todos los procesos de extracción se realizaron bajo los mismo métodos y condiciones. Se estableció una proporción de 0,1 gramos de film/1,0 ml de solución de extracción, incubando las muestras a 37°C durante 24 horas. Como medio de extracción se utilizó tampón fosfato salino (pH=7,4) en todos los casos. Para realizar la evaluación de los extractos sobre cultivos celulares se realizaron diluciones seriadas de cada muestra en el medio de cultivo específico del ensayo a realizar. Espesor (mm) Proporción de extracción (área superficial o masa/volumen) Ejemplos de formas de los materiales < 0,5 6 cm2/ml Película, lámina, pared de un tubo 0,5 a 1,0 3 cm2/ml Pared de un tubo, placa, artículos moldeados pequeños > 1,0 3 cm2/ml Artículos moldeados grandes Productos sólidos de forma irregular 0,2 g/ml Polvo, gránulos, espuma, artículos moldeados no absorbentes, materiales porosos de alta densidad Productos porosos de forma irregular 0,1 g/ml Membranas, textiles Tabla 3.3 Áreas superficiales estándar y volúmenes del líquido extractor establecidos por la norma ISO 109933-12 para la evaluación biológica de productos sanitarios. 3.4.2 Evaluación de la citotoxicidad in vitro. Ensayo de recaptación del rojo neutro La biocompatibilidad de los films y el MnL se determinó mediante el ensayo de captación del rojo neutro. Este ensayo permite obtener una estimación cuantitativa del número de células viables en un cultivo celular midiendo por absorbancia la cantidad de colorante captado en una densidad celular conocida. El método del ensayo se basa en la capacidad de las células viables 3. MATERIALES Y MÉTODOS 25 para captar el colorante que tiñe sus lisosomas. una vez finalizada la incubación, se libera el colorante de las células y se diluye en una solución ácida para facilitar su cuantificación por métodos espectrofotométricos.35 Para la realización del ensayo, se sembraron queratinocitos a una densidad de ≈5000 células/pocillo en placas de 96 pocillos, se incubaron durante 24 horas previas al tratamiento con las muestras para asegurar la adhesión celular. Una vez finalizado el tiempo de incubación se trató el cultivo con diluciones 1:10, 1:25 y 1:50 de cada uno de los films blancos sintetizados (diluciones realizadas a partir de extractos de cada film en PBS), así como diluciones de entre 0,0009 mM y 0,25 mM de MnL. Para la cuantificación del número de células viables, se incluyó una recta de calibrado en el rango 0 – 5000 células/pocillo. Todas las diluciones usadas como tratamiento sobre las células se realizaron en medio de cultivo. Se incubó la placa durante 24 horas una vez iniciado el tratamiento. Finalizado el tiempo de incubación se retiraron por aspiración las muestras y se añadieron 100 µl/pocillo de una disolución 50 µg/ml de rojo neutro en medio de cultivo, se incubó la placa durante 3 horas permitiendo la captación del colorante por parte de las células viables. Pasado este tiempo se retiró la solución rojo neutro/DMEM y se lavó el cultivo con 100 µl/pocillo de PBS. Se añadieron 150 µl/pocillo de solución fijadora (1,37 ml formaldehido 37%/100 ml PBS) y se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos, se retiró la solución fijadora y se lavó 2 veces con PBS. Se añadieron 150 µl/pocillo de la solución de extracción del rojo neutro (1% (v/v) ácido acético glaciar/49% (v/v) agua destilada/50% (v/v) etanol) y se cuantificó espectrofotométricamente la absorbancia a λabs=540 nm del rojo neutro en un lector placas, agitando previamente durante 60 segundo a 980 rpm (Espectrofotómetro de placas Multiskan, Thermo Scientific, EE. UU). Los datos de viabilidad en porcentaje fueron calculados en función de la recta de calibrado incluida en el ensayo y según la ecuación (3.6): 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 (%)=𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∗100 (3.6) Se usó como control positivo medio de cultivo y como control negativo una disolución 0,1% (v/v) SDS/DMEM. Se incluyeron 3 réplicas de cada muestra. 3.4.3 Evaluación de la viabilidad mitocondrial in vitro. Ensayo XTT Otro método de evaluación de la biocompatibilidad de los films y el MnL en disolución fue mediante el ensayo XTT. Este ensayo se basa en la reducción de la sal de tetrasodio XTT (amarilla) (Alfa Aesar, Alemania) a formazán (naranja) a través del transporte electrónico en la membrana plasmática de células metabólicamente activas, esta reducción requiere un intermediador que actúe como aceptor de electrones, en este caso se usa el metosulfato de fenazina (PMS).36 La determinación por métodos espectroscópicos de la absorbancia del formazán permite obtener una estimación cuantitativa del número de células viables en el cultivo. Se describe a continuación el procedimiento para la determinación de la viabilidad por este método. Para este ensayo tanto la siembra del cultivo como las disoluciones de las muestras de tratamiento se realizaron en medio DMEM sin rojo fenol con el fin de evitar la interferencia de este marcador con la medida de absorbancia del formazán. Se sembraron queratinocitos a una 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 32 plastificante, el resultado fueron partículas con una coloración ligeramente amarilla en seco que desaparece una vez se hinchan.43 Esto podría indicarnos que el alginato de sodio también aporta a la aparición de esta coloración en los films. 4.2 Grosor El grosor de los films se determinó principalmente para su uso en los cálculos relacionados al estudio de la permeabilidad al vapor de agua. Sin embargo, los datos obtenidos también aportaron información relevante sobre el efecto del proceso de reticulación en cada film. El análisis de la varianza (ANOVA) confirmó que existen diferencias significativas en el efecto de la concentración y tipo de reticulante sobre el grosor de los films (p<0,05). Las diferencias no solo se observaron entre los 3 films evaluados, también se observó una alta variabilidad entre las distintas medidas tomadas dentro de una misma muestra, llegando a tener un error relativo superior al 10% en relación al grosor promedio de cada film. El test de Student confirmó que la mayor variabilidad entre las muestras se encuentra en el film 3 (p<0,05). Los resultados se resumen en la Tabla 4.1 y se expresan en media ± desviación estándar. El efecto de la reticulación en la heterogeneidad del grosor observado de cada film podría ser explicado por una reticulación irregular de los polímeros. Teniendo en cuenta que el film 1 y 2 primero atraviesan un proceso de reticulación iónica (RI), puede que al momento de añadir la epiclorohidrina para dar lugar a la reticulación química (RQ) haya una distribución heterogénea de los enlaces iónicos entre el Ca+2 y el alginato de sodio dentro de la dispersión polimérica, además de una distribución desordenada de las cadenas de los biopolímeros tanto de la CMC como del NaAlg. Esto da como resultado zonas de mayor reticulación que en el momento de secado dan lugar a áreas de un grosor promedio mayor en el film obtenido. En el caso del film 3 solo se utiliza epiclorohidrina (ECH) como agente reticulante. La naturaleza covalente de los enlaces formados por la ECH, mucho más fuertes que los enlaces iónicos formados por el Ca+2, hacen que esta dispersión sea mucho más viscosa llegándose a formar un hidrogel que adopta la forma del vaso donde se da la reacción de reticulación. Esto dificulta su extensión en la placa de Petri para la formación del film seco y da como resultado un film irregular con algunas zonas mucho más gruesas que otras. Muestra Grosor ± DS (mm) Contenido de humedad ± DS (%) Fuerza de rotura ± DS (kg)+ Distancia de rotura ± DS (mm)+ Permeabilidad ± DS (g/m*s*Pa) Film 1 (Blanco) 0,31 ± 0,03 30,49 ± 0,96 0,83 ± 0,16 5,52 ± 1,02 2,72E-10 ± 5,37E- 11 Film 2 (Blanco) 0,33 ± 0,05 28,12 ± 0,775 0,91 ± 0,22 5,55 ± 0,86 1,92E-10 ± 3,40E- 11 Film 3 (Blanco) 0,96 ± 0,09* 28,39 ± 0.56 0,44 ± 0,37* 6,44 ± 1,02* 4,74E-10 ± 2,30E- 11* Tabla 4.1 Resultados experimentales de las propiedades fisicoquímicas y mecánicas de los films obtenidos en el trabajo. Se expresan los resultados en media ± desviación estándar de todos los experimentos realizados por triplicado (n=3). Se evaluaron las muestras entre sí con el test-t de Student *(p<0.05) +(n=6). 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33 4.3 Contenido de humedad Los resultados del análisis para determinar el contenido de agua en los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) se resumen en la Tabla 4.1 y se expresan en media ± desviación estándar. El análisis de la varianza (ANOVA) confirmó que existen diferencias significativas en el efecto de la concentración y tipo de reticulante sobre el contenido de humedad de los films (p<0,05). Las ligeras diferencias observadas entre los contenidos de humedad de los films, principalmente entre el film 1 y los films 2 y 3 pueden ser explicadas por la naturaleza hidrofílica del agente plastificante utilizado en su síntesis (glicerol), así como el carácter hidrofílico de los grupos hidroxilo libres presentes en los biopolímeros (NaAlg y CMC). Aunque la concentración de NaAlg y CMC es igual en todos los casos, la concentración de agente reticulante iónico (CaCl2) usado en la síntesis del film 1 es la mitad de la usada en el film 2, esto da a entender que el grado de reticulación es menor, es decir, hay menos grupos hidroxilo formando enlaces iónicos con el Ca+2. Esto explicaría el incremento en el contenido de humedad del film 1 donde hay más grupos hidroxilo disponibles para unirse a moléculas de agua. Estos resultados están en consonancia con los obtenidos por Costa et al., quienes demostraron la relación existente entre la concentración de reticulante (CaCl2) y el contenido de humedad de films de alginato de sodio, donde se comprobó una disminución en el contenido de humedad con el incremento en la concentración de agente reticulante.44 4.4 Propiedades mecánicas La fuerza de rotura (BS) y la distancia de rotura (DB) son los parámetros que representan las propiedades mecánicas de los films. Los resultados del análisis para los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) se resumen en la Tabla 4.1 y se expresan en media ± desviación estándar. El análisis de la varianza (ANOVA) confirmó que existen diferencias significativas en el efecto de la concentración y tipo de reticulante sobre la fuerza y distancia de rotura en los films (p<0,05). La fuerza de rotura incrementó notoriamente con la concentración de CaCl2 usada para la reticulación iónica de los films, pasando de 0,83 ± 0,16 kg a 0,91 ± 0,22 kg entre el film 1 y 2 respectivamente. Esto se debe al desarrollo de una estructura polimérica más rígida a mayores concentraciones de CaCl2. Los resultados coinciden con los obtenidos por Benavides et al., quienes demostraron el incremento de la fuerza de rotura en films de NaAlg a concentraciones crecientes del agente reticulante (CaCO3), también observaron una disminución en el índice de elasticidad con el aumento de la concentración de CaCO3.45 Los resultados obtenidos en la determinación de la distancia de rotura de los films evaluados no se corresponden con los hallados en la bibliografía, es posible que la diferencia en las concentraciones de CaCl2 entre el film 1 y 2 no fuese suficiente para verse reflejada en la DB. En el caso del film 3, los valores de BS y DB determinados varían mucho en comparación con los films 1 y 2, tanto la disminución en la BS como el aumento de la DB pueden ser explicados por el método de reticulación empleado. En la reticulación química se da una interacción desorganizada entre las cadenas de polímero y la epiclorohidrina, que rompe con la 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 34 conformación ordenada que tienden a adaptar tanto el NaAlg como la CMC, esto da lugar a la formación de regiones amorfas de menor resistencia, pero que confieren mayor capacidad de elongación al film en el momento de la rotura. Shi et al. determinaron que la reticulación de celulosa con epiclorohidrina para la síntesis de membranas resultó en una disminución de la estructura cristalina del polímero y un aumento en las regiones amorfas, lo cual tuvo un efecto en las propiedades mecánicas disminuyendo la resistencia y aumentando la elasticidad de las membranas.46 Esto coincide con nuestros resultados experimentales obtenidos sobre los films sintetizados. 4.5 Permeabilidad al vapor de agua Los resultados del análisis para determinar la permeabilidad de los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) se resumen en la Tabla 4.1 y se expresan en media ± desviación estándar. El análisis de la varianza (ANOVA) confirmó que existen diferencias significativas en el efecto de la concentración y tipo de reticulante sobre la permeabilidad de los films (p<0,05). La permeabilidad al vapor de agua (WVP) es un parámetro importante en los films destinados al tratamiento de las heridas crónicas exudativas, si la WVP es demasiado alta se dará una deshidratación de la lesión, lo que dificulta la curación de la herida. Por otro lado, si la WVP es muy baja se dará una oclusión de la zona, lo que evitará el drenaje del exudado y creará un ambiente que facilite las infecciones.47 De las 3 muestras evaluadas el film con menor WVP fue el film 2 (Blanco) con una permeabilidad de 1,92E-10 ± 3,40E-11 g/m*s*Pa. Este dato puede ser explicado por el alto nivel de reticulación que experimenta este film, el incremento en la rigidez de la estructura polimérica a causa de la concentración de reticulante iónico (0,1% CaCl2) usada, así como la segunda reticulación con epiclorohidrina (reticulación química) no solo disminuyen la cantidad de grupos hidroxilo disponibles en la estructura del polímero para atraer moléculas de agua, también reducen el espacio disponible entre las cadenas de los polímeros por el que las moléculas de agua pueden difundir. En comparativa con el film 1 (Blanco) que se trata con la mitad de la concentración de reticulante iónico (0,05% CaCl2) que el film 2, la permeabilidad al vapor de agua es mayor, siendo de 2,72E- 10 ± 5,37E-11 g/m*s*Pa. De manera similar al caso anterior, el film 1 tiene una mayor cantidad de grupos hidroxilo disponibles que atraen más fácilmente las moléculas de agua hacia el interior del entramado polimérico, además, su grado de reticulación menor genera una estructura donde las cadenas de NaAlg y CMC se encuentran más separadas, facilitando el movimiento de moléculas de agua a través del film. Por otro lado, la permeabilidad del film 3 (4,74E-10 ± 2,30E-11 g/m*s*Pa) es ≈1,7 y ≈2,5 veces la obtenida con el film 1 y 2 respectivamente. Esto es consistente con el tipo de reticulación que se usa en su síntesis (únicamente reticulación química), donde la epiclorohidrina da lugar a una estructura polimérica desordenada con una mayor separación entre las cadenas del NaAlg y la CMC debido a su tamaño, mucho mayor en comparativa con los iones de Ca+2 que actúan como agente reticulante en los films 1 y 2. Esta separación entre las cadenas de los biopolímeros 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35 facilita la difusión de las moléculas de agua a través del film. Según la bibliografía, Giz et al. demostraron una disminución en la permeabilidad al vapor de agua en relación a la concentración creciente de reticulante iónico (Ca+2) en films de alginato de sodio47. Esto se corresponde con nuestros resultados experimentales. En relación a la influencia de la reticulación con epiclorohidrina en la permeabilidad al vapor de agua no se encontraron datos de otros autores, sin embargo, nuestras conclusiones se asocian adecuadamente a la bibliografía utilizada para explicar los resultados experimentales de las propiedades mecánicas de los films (apartado 4.4) 4.6 Índice de hinchamiento El índice de hinchamiento (IH) (%) de los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) fue evaluado tanto en tampón fosfato salino (PBS) (pH=7,4), como en fluido de herida simulado (SWF) (2% BSA, 0,02 M CaCl2, 0,4 M NaCl, 0,08 M tampón Tris)5 (pH=7,5). Los resultados se representan en la Figura 4.2 y se dan como media ± desviación estándar. De los 3 films estudiados, el film 1 (Blanco) tuvo los peores resultados en cuanto a su capacidad de absorción de líquido, tanto en PBS como en SWF se dio una disolución completa del film a los 90 y 130 minutos respectivamente, lo que impidió la continuación de las medidas. Esta desintegración del film podría explicarse por su menor grado de reticulación en comparativa con los films 2 y 3, lo que podría facilitar la disolución de las cadenas de alginato y carboximetilcelulosa una vez se satura de líquido la matriz polimérica. Como hinchamiento inicial a tiempo 10 minutos, el film incremento entre 2,5 y 3 veces su tamaño, llegando a un hinchamiento máximo de 350% (PBS) y 384% (SWF). Aunque el perfil de hinchamiento del film pueda parecer ideal, mostrando una mayor absorción de líquido inicial en comparativa con el film 2 y 3, su desintegración total lo descarta completamente como posible prototipo de apósito superabsorbente para el tratamiento de heridas crónicas exudativas. En relación a los films 2 (Blanco) y 3 (Blanco), estos demostraron los mejores perfiles de hinchamiento tanto en PBS como en SWF, ambas muestras perduraron en el tiempo durante el desarrollo del ensayo sin mostrar signos de descomposición estructural. Esto indicaría un grado de reticulación deseable en el que la matriz polimérica permite la retención de líquido manteniendo la tensión entre las fibras de NaAlg y CMC. Sin embargo, hay una clara diferencia en la capacidad de hinchamiento entre las dos muestras, siendo el IH del film 2 ≈1,85 veces mayor que el IH del film 3. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 Figura 4.2 Representación del índice de hinchamiento (%) en función del tiempo (minutos) de los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) en a) tampón fosfato salino (pH=7,4) y b) fluido de herida simulado5 (pH=7,5). Se expresan los resultados en media ± desviación estándar de todas las medidas realizadas por triplicado (n=3). Aunque los resultados obtenidos podrían determinar al film 2 (Blanco) como la muestra más indicada para su uso como apósito para el tratamiento de heridas exudativas, es necesario realizar más ensayos experimentales que permitan establecer el índice de hinchamiento en equilibrio y el tiempo de desintegración de los films 2 y 3. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 Índice de hinchamiento (%) Tiempo (minutos) Film 1 (Blanco) Film 2 (Blanco) Film 3 (Blanco) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 Índice de hinchamiento (%) Tiempo (minutos) Film 1 (Blanco) Film 2 (Blanco) Film 3 (Blanco) a) PBS b) SWF 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 37 4.7 Perfil de liberación in vitro de MnL Los resultados de liberación de los complejos de Mn obtenidos a partir de los films (Figura 4.3) fueron extremadamente irregulares. Esto podría indicar que el método utilizado para el estudio de la liberación no fue el más adecuado (apartado 3.3.6). Por ejemplo, es posible que los errores experimentales del ensayo puedan ser explicados por la tendencia del film 1 para desintegrarse en medio líquido, observada en los resultados del índice de hinchamiento (apartado 4.6), y el poco volumen tanto de líquido de liberación usado, como volumen de muestra tomada en cada medida. Figura 4.3 Representación de la liberación (%) de MnL en función del tiempo (minutos) de los films 1 (0,1% MnL), 2 (0,1% MnL) y 3 (0,1% MnL) en a) tampón fosfato salino (pH=7,4) y b) fluido de herida simulado5 (pH=7,5). Se expresan los resultados en media ± desviación estándar de todas las medidas realizadas por triplicado (n=3). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Liberación (%) Tiempo (minutos) Film 1 (Blanco) Film 2 (Blanco) Film 3 (Blanco) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 010 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Liberación (%) Tiempo (horas) Film 1 (Blanco) Film 2 (Blanco) Film 3 (Blanco) b) SWF a) PBS 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 38 A pesar de la elevada desviación encontrada en los resultados experimentales, se evaluó el perfil de liberación de los films ajustándolos al modelo cinético de Korsmeyer-Peppas. Este modelo cinético es el más utilizado para definir el mecanismo de liberación de moléculas a partir de matrices poliméricas. Tiene en cuenta tanto la porosidad, como la capacidad de hinchamiento y la separación que ocurre entre las cadenas de los polímeros una vez se encuentran en disolución.48,49 El modelo Korsmeyer-Peppas viene definido por la ecuación (4.1): 𝑄𝑡 𝑄∞= 𝐾 ∗𝑡𝑛 (4.1) Donde Qt/Q∞ es el porcentaje de molécula liberada a tiempo t, K es la constante de difusión de la matriz de liberación y n es el exponente difusional, el valor de n es el que caracteriza el mecanismo de transporte que prima en el perfil de liberación de la molécula.50 Los resultados del ajuste, así como los valores del parámetro n de los films evaluados tanto en tampón fosfato salino como en fluido de herida simulado se resumen en la Tabla 4.2. Muestra Tampón fosfato salino Fluido de herida simulado r2 n r2 n Film 1 (0,1% MnL) 0,969 0,319 0,906 0,210 Film 2 (0,1% MnL) 0,997 0,244 - - Film 3 (0,1% MnL) 0,957 1,072 0,995 0,078 Tabla 4.2 Resultados del ajuste por mínimos cuadrados de los resultados experimentales de liberación de MnL al modelo cinético de Korsmeyer-Peppas. Se incluye el coeficiente de correlación (r2) y el valor del parámetro n. Lo primero que se puede observar en los resultados del ajuste son los coeficientes de correlación relativamente bajos, esto es así por los valores de error experimental del ensayo. A pesar de esto, los datos obtenidos para el parámetro n nos permite tener una idea de los mecanismos de trasporte que actúan sobre la liberación del complejo de manganeso desde la matriz polimérica de los films. Los valores obtenidos para el parámetro n sugieren que el mecanismo predominante en la liberación del MnL es la difusión del complejo desde las capas más superficiales del film una vez entra en contacto con el medio acuoso, al finalizar este proceso el ritmo de liberación disminuye y predomina la difusión del MnL desde capas más interiores del film. Este mecanismo vendrá definido por el tamaño de poro, el grado de reticulación y la capacidad de hinchamiento de la matriz polimérica.50 Estos resultados están en consonancia con los obtenidos por Maver et al., quienes evaluaron el perfil de liberación in vitro de diclofenaco y lidocaína a partir de un film de NaAlg y CMC con el uso de una celda de difusión de Franz, sus resultados se ajustaron al modelo cinético Korsmeyer- Peppas, el cual determinó que el mecanismo de liberación fue una combinación de procesos de 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 39 difusión y procesos de erosión controlada de la matriz polimérica.50 Además, observando los resultados (Figura 4.3) se podría relacionar el perfil de liberación de los films con su índice de hinchamiento (apartado 4.6), en ambos casos el film 2 tiene el mayor índice de hinchamiento y la mayor liberación de MnL en comparativa con los films 1 y 3. Para finalizar, atendiendo a los métodos y resultados que utilizan otros autores para llevar a cabo esta determinación, se hace evidente la necesidad no solo de repetir este ensayo, sino de mejorar la metodología empleada en este experimento con el fin de obtener resultados que aporten información fiable acerca del perfil de liberación de los films sintetizados. 4.8 Adsorción de proteínas y ángulo de contacto La adsorción de proteínas en mg BSA/cm2 film y el ángulo de contacto (AC) (°) de los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) se resumen en la Tabla 4.3, los resultados se representan como media ± desviación estándar. Muestra Adsorción de proteínas ± DS (mg/cm2) Ángulo de contacto ± DS (°) Film 1 (Blanco) 0,46 ± 0,21 63,64 ± 4,16 Film 2 (Blanco) 0,61 ± 0,13 49,30 ± 3,87 Film 3 (Blanco) 0,41 ± 0,16 51,06 ± 9,21 Tabla 4.3 Resultados experimentales de la absorción de proteína y el ángulo de contacto evaluado en agua destilada de los films obtenidos en el trabajo. Se expresan los resultados en media ± desviación estándar de todos los experimentos realizados por triplicado (n=3). El ángulo de contacto entre un líquido y una superficie permite determinar la humectabilidad de la superficie y da una idea de las propiedades hidrofílicas del material que se evalúa. Lee et al. demostró una relación existente entre el ángulo de contacto del agua, la adsorción proteica y la proliferación celular de fibroblastos de ratón en una membrana de polietileno, donde un AC de ≈45°-62° permitió un mayor nivel de adhesión y proliferación celular.51 Así mismo, Machida- Sano et al. determinó la relación entre el tipo de reticulación iónica, la adhesión y proliferación celular de fibroblastos humanos y la adsorción de proteínas sobre una membrana de alginato de sodio.52 En este caso, las características de los films no permitieron evaluar la adsorción de proteínas según los métodos utilizados por los autores anteriormente mencionados, por esto se optó por evaluar la adsorción de proteínas según la metodología descrita en la sección de materiales y métodos de este trabajo (apartado 3.3.7). No se encontraron diferencias significativas en los resultados experimentales de adsorción de proteína o el ángulo de contacto de los films. Aun así, se podrían relacionar las ligeras diferencias entre la cantidad de proteína adsorbida por cada muestra con los resultados obtenidos en la determinación del índice de hinchamiento (apartado 4.6) donde el film 2 tiene el mayor índice de hinchamiento y la mayor adsorción de proteínas en mg BSA/cm2. Además, los resultados obtenidos de ángulo de contacto entran en el 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40 rango valores determinados por Lee et al. como positivos a la hora de promover la proliferación y adhesión celular de fibroblastos de ratón, lo que podría indicarnos que todos los films evaluados poseen esta cualidad. 4.9 Evaluación de la citotoxicidad in vitro. Ensayo de captación del rojo neutro Con el fin de evaluar la biocompatibilidad de los componentes de los films obtenidos, así como del complejo de manganeso a distintas concentraciones, se realizó un ensayo de citotoxicidad basado en la captación del colorante rojo neutro por parte de las células viables sobre un cultivo de queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT). Figura 4.4 Porcentaje de viabilidad de los queratinocitos determinado por el ensayo de captación del rojo neutro incubados 24 horas con disoluciones 1:10, 1:25 y 1:50 de los films a) 1 (Blanco), b) 2(Blanco) y c) 3 (Blanco). Los resultados se expresan en media ± desviación estándar (n=3). -5 15 35 55 75 95 115 viabilidad celular (%) -5 15 35 55 75 95 115 viabilidad celular (%) -5 15 35 55 75 95 115 viabilidad celular (%) a) Film 1 (Blanco) b) Film 2 (Blanco) c) Film 3 (Blanco) 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 41 No se encontraron diferencias significativas en la viabilidad de las células incubadas con las muestras en comparativa con las células no tratadas. Los resultados tras 24 horas de incubación con distintas diluciones de los films 1 (Blanco), 2 (Blanco) y 3 (Blanco) (Figura 4.4) dieron resultados de viabilidad altos (>80%), excepto en el caso de las diluciones 1:10 de los films 1 y 2 con un 71% y 78% de viabilidad celular respectivamente. Esta disminución en los porcentajes de viabilidad no es suficiente para determinar un efecto citotóxico por parte de los films, por lo que se concluye que su composición es biocompatible. En otros estudios se dan resultados similares a los obtenidos en este trabajo. Por ejemplo, Sharma et al. evaluó la citotoxicidad de films de alginato de sodio, pectina y carboximetilcelulosa sobre células HaCaT mediante el ensayo MTT sin encontrar efectos significativos de los films sobre la viabilidad celular.53 Figura 4.5 Porcentaje de viabilidad de los queratinocitos determinado por el ensayo de captación del rojo neutro incubados 24 horas con disoluciones 0,0009 mM – 0,25 mM de MnL en medio de cultivo. Los resultados se expresan en media ± desviación estándar (n=3). En relación a la citotoxicidad del complejo de manganeso, no se encontraron diferencias significativas en la viabilidad de las células incubadas con las muestras de MnL en comparativa con las células no tratadas. Los resultados tras 24 horas de incubación con distintas concentraciones del complejo en medio de cultivo (0,0009 mM – 0,25 mM) (Figura 4.5) dieron resultados de viabilidad altos (>96%), por lo que se concluye que no poseen una actividad citotóxica, al menos en ese rango de concentraciones y en los tiempos de exposición estudiados. En la bibliografía no se encontraron datos que respaldaran estos resultados, principalmente por la falta de coincidencia en las concentraciones de complejo de manganeso evaluado, la línea celular utilizada y el método empleado para determinar la biocompatibilidad. -5 15 35 55 75 95 115 135 155 viabilidad celular (%) 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48 De todas la muestras y controles evaluados se observó el mejor efecto positivo en la migración celular con la concentración 25 µM MnL, cuyo índice de “cierre” tras las primeras 24 horas de incubación fue del 78,2% (Figura 4.12), 0,68% y 15,8% por encima del control positivo para migración normal el control positivo para migración en medio antioxidante respectivamente. En general, los resultados fueron muy similares para todas las concentraciones de MnL evaluadas, excepto en el caso de MnL 35 µM, cuyo efecto final fue el mismo que en todas las muestras y controles, pero su velocidad de “cierre” fue mucho menor. Los resultados generales de este ensayo podrían compararse con los obtenidos por Stelling et al. quienes demostraron el efecto positivo de Mn+2 sobre la migración de células de epitelio pulmonar de ratón (LLC), incubaron células LLC con 10 µM de MnCl2 durante 1 hora y observaron un incremento en los eventos de migración del cultivo en comparativa con el control.55 4.13 Evaluación de la morfología celular. Tinción Giemsa Con objeto de evaluar los posibles cambios en la morfología celular de los queratinocitos provocados por el complejo de manganeso, se observó por microscopía óptica células HaCaT incubadas por 24 horas con 20 µM, 25 µM, 30 µM y 35 µM de MnL y se comparó con el control (+) (medio de cultivo). Figura 4.13 Imágenes tomadas por microscopía óptica de queratinocitos humanos incubados 24 horas con 20 µM MnL (derecha) en comparativa con el control (+) (medio de cultivo) (izquierda). No se observaron diferencias macroscópicas en la morfología de las muestras en comparativa con el control positivo (Figura 4.13). Se podría concluir que el complejo de manganeso a las concentraciones evaluadas no tiene efectos sobre el tamaño, forma o estructura de las células HaCaT. No se encontró información en la bibliografía que respalde estas conclusiones, es necesario continuar investigando los efectos que el MnL pueda tener en la morfología celular o en su posible captación. 4.14 Evaluación de la actividad antioxidante frente al ROS intracelular Con la intención de profundizar en el efecto antioxidante de los complejos de manganeso, así como en el posible efecto coadyuvante que los films sintetizados, se determinó la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelular en queratinocitos humanos tras su estimulación con H2O2 100 µM y 2,4-clorodinitrobenceno (DNCB) 60 µM como agentes oxidantes. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4.14 y Figura 4.15. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49 Los resultados obtenidos fueron en extremo irregulares, presentando una elevada variabilidad en la mayoría de las muestras evaluadas. Estos resultados han servido para determinar que el tiempo de incubación de las células con los agentes oxidantes fue excesivo (24 horas), dando como resultado mortalidad en el cultivo. Este efecto se observó en las intensidades de fluorescencia extremadamente bajas tanto en los controles como en las muestras coincubadas con H2O2 100 µM o DNCB 60 µM. La observación del cultivo por microscopía óptica una vez finalizado el ensayo confirmó la mortalidad celular producida por los agentes oxidantes. Este error experimental impidió el correcto análisis de los datos, pues la falta de controles no permitió realizar un estudio comparativo entre la respuesta al ROS intracelular de las concentraciones de MnL contra la respuesta del cultivo incubado con los agentes oxidantes. Figura 4.14 Intensidad de fluorescencia medida en el cultivo coincubado por 24 horas con H2O2 100 µM y muestras de a) Film 1 (0,1% MnL), b) Film 2 (0,1% MnL) y c) Film 3 (0,1% MnL). Se incluye como control positivo de actividad antioxidante ácido ascórbico 200 µM. Los resultados se expresan en media ± desviación estándar (n=3). 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Intensidad de fluorescencia (IF) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Intensidad de fluorescencia (IF) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Intensidad de fluorescencia (IF) a) Film 1 (0,1% MnL) b) Film 2 (0,1% MnL) c) Film 3 (0,1% MnL) 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50 No obstante, se obtuvieron medidas de intensidad de fluorescencia altas en las muestras coincubadas con MnL en ambos controles oxidantes (Figura 4.15). Aunque esto no permite precisar la actividad antioxidante del complejo en relación al ROS intracelular, los resultados son prometedores y están en consonancia con los obtenidos en este mismo trabajo sobre la determinación de la capacidad antioxidante del complejo en ambiente celular oxidativo (apartado 4.11). Figura 4.15 Intensidad de fluorescencia medida en el cultivo coincubado por 24 horas con distintas concentraciones de MnL (20 µM, 25 µM, 30 µM, 35 µM) en medio con a) DNCB 60 µM y b) H2O2 100 µM. Se incluye como control positivo de actividad antioxidante ácido ascórbico 200 µM (solo en b). Los resultados se expresan en media ± desviación estándar (n=3). Esta aparente actividad antioxidante del manganeso en relación al ROS intracelular fue evaluada por Chen et al., quienes demostraron una disminución del 40% en los niveles de ROS intracelular, determinado por fluorescencia del DCF, de células neuronales de ratón incubadas con complejos de manganeso polinitrogenados durante 24 horas.54 Para finalizar y en vista de los resultados obtenidos, se puede concluir que sería necesario continuar con la investigación sobre el efecto de estos complejos de manganeso como agentes antioxidantes frente al ROS intracelular. Ampliando este tipo de ensayos de actividad antioxidante y variando los distintos factores que puedan afectar a estos procesos (tiempo de exposición, concentración de estímulos, etc). 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 Intensidad de fluorescencia (IF) 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Intensidad de fluorescencia (IF) a) MnL en DNCB 60 µM b) MnL en H2O2 100 µM 5. CONCLUSIONES 51 5. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en el presente trabajo nos permiten concluir que es posible producir films a base de polímeros reticulados y con las propiedades fisicoquímicas, mecánicas y de biocompatibilidad celular adecuadas para una posible aplicación como apósitos para la absorción de exudados de heridas. Se logró demostrar el efecto que distintos métodos de reticulación tienen sobre las propiedades mecánicas de los films sintetizados. Esto se vio reflejado en los resultados obtenidos a partir de los ensayos de caracterización, donde el índice de hinchamiento, resistencia, permeabilidad, flexibilidad y liberación variaron en función del tipo de reticulación y concentración de agente reticulante usado. De las tres muestras evaluadas, es el film 2 el que presenta los mejores resultados de caracterización, teniendo propiedades mecánicas similares a las buscadas en los apósitos destinados al tratamiento de heridas crónicas. Además, se comprobó la total biocompatibilidad que polímeros como el alginato de sodio y la carboximetilcelulosa presentan sobre cultivos in vitro de queratinocitos humanos, al no indicar citotoxicidad celular en ninguno de los ensayos realizados. Por otro lado, la evaluación de la actividad antioxidante de los complejos de manganeso demostró su potencial como moléculas bioactivas con capacidad de contrarrestar los procesos oxidativos característicos de las heridas crónicas, pudiendo además obtener, unos rangos de concentración considerados como biocompatibles. Atendiendo a estos resultados, se puede decir que se obtuvo de manera exitosa un prototipo de apósito superabsorbente, antioxidante y suplementado con complejo de manganeso para su posible aplicación en el tratamiento de las heridas crónicas exudativas. Cabe puntualizar, que al tratarse de un prototipo inicial es necesario continuar con el estudio de todas sus propiedades de interés, con el fin de obtener una formulación final que cumpla con los requerimientos que este tipo de apósitos deben tener para llegar a la fase final de un estudio preclínico. Para finalizar, y en vista de los resultados preliminares, pero prometedores, que se han obtenido en este trabajo, cabe mencionar la necesidad de continuar con la investigación sobre las posibles aplicaciones que los biopolímeros y los complejos metálicos biomiméticos pueden tener en el área clínica como formulaciones para el tratamiento de las heridas crónicas exudativas. 6. BIBLIOGRAFÍA 52 6. BIBLIOGRAFÍA 1. Boateng J, Catanzano O. Advanced Therapeutic Dressings for Effective Wound Healing— A Review. J Pharm Sci. 104(11):3653-80. 2. W. G. Meijer, J. Trip, S. M. H. J. J. Quality of life in patients with diabetic foot ulcers. Disabil Rehabil. 23(8):336-40. 3. 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