Impacto do hábito tabáquico no proteoma subxinxival de pacientes con periodontite

Traballo de fin de grao Autora: Iria Seijo Porto Titora: Dra. Inmaculada Tomás Carmona Cotitora: Triana Blanco Pintos Departamento: Cirurxía e Especialidades Médico-Cirúrxicas Xullo 2023 Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en Odontoloxía. Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en Odontoloxía. Impacto do hábito tabáquico no proteoma subxinxival de pacientes con periodontite Impacto del hábito tabáquico en el proteoma subgingival de pacientes con periodontitis Impact of smoking on subgingival proteome in patients with periodontitis 1 Agradecimientos A la Dra. Inmaculada Tomás, por ser mi tutora, por la oportunidad, por su compromiso e implicación en este trabajo, así como también por todo lo aprendido al haberme hecho un lugar este tiempo en su Unidad de Pacientes con Necesidades Especiales (USC). A todas mis compañeras allí, en especial a Triana, por su cercanía y por haberme ayudado a seguir sus pasos en el desarrollo de este estudio. Con todo, muchas gracias por supuesto también a mi familia por todo su apoyo en estos años. 2 Índice Resumo ........................................................................................................................................... 3 1. Introducción ............................................................................................................................... 6 2. Material y métodos .................................................................................................................... 8 2.1 Sujetos de estudio y variables clínicas de interés .................................................................. 8 2.2 Recogida de las muestras de fluido crevicular gingival y su preparación para el análisis de espectrometría de masas ........................................................................................................ 9 2.3 Análisis cuantitativo de proteínas por SWATH-MS ........................................................... 10 2.3.1 Construcción de las bibliotecas espectrales MS/MS ............................................. 10 2.3.2 Cuantificación relativa .......................................................................................... 10 2.4 Análisis estadístico .............................................................................................................. 11 2.4.1 Comparación de las características clínicas entre pacientes con periodontitis no fumadores, fumadores y exfumadores .................................................................. 11 2.4.2 Evaluación de la estructura del proteoma periodontal .......................................... 12 2.4.3 Evaluación de la expresión diferencial de proteínas ............................................. 12 3. Resultados ................................................................................................................................ 13 3.1 Comparación de las características clínicas de pacientes periodontales no fumadores, fumadores y exfumadores ................................................................................................... 13 3.2 Estructura del proteoma periodontal en FCG ...................................................................... 15 3.3 Expresión diferencial de las proteínas cuantificadas en FCG ............................................. 18 3.3.1 Grupo de no fumadores comparado con grupo de fumadores .............................. 19 3.3.2 Grupo de no fumadores comparado con grupo de exfumadores ........................... 22 3.3.3 Grupo de exfumadores comparado con grupo de fumadores ................................ 24 3.3.4 Comparación de los resultados obtenidos en los tres grupos clínicos .................. 26 4. Discusión .................................................................................................................................. 27 4.1 Técnica SWATH-MS para el análisis del proteoma periodontal ........................................ 27 4.2 Evidencia sobre el impacto del hábito tabáquico sobre el proteoma periodontal ............... 28 4.3 Análisis de la estructura del proteoma periodontal en FCG ................................................ 30 4.4 Expresión diferencial de las proteínas cuantificadas ........................................................... 30 4.4.1 Grupo de no fumadores comparado con grupo de fumadores .............................. 30 4.4.2 Grupo de no fumadores comparado con grupo de exfumadores ........................... 33 4.4.3 Grupo de exfumadores comparado con grupo de fumadores ................................ 34 4.4.4 Comparación de los resultados obtenidos en los tres grupos clínicos .................. 35 5. Conclusiones ............................................................................................................................ 37 Referencias bibliográficas ........................................................................................................... 38 Apéndice S1: Comité ético .......................................................................................................... 45 3 Resumo Obxectivo: Analizar a estrutura do proteoma periodontal e a expresión diferencial das proteínas detectadas en fluído crevicular xinxival (FCX) de pacientes periodontais non fumadores, fumadores e exfumadores, mediante “sequential window acquisition of all theoretical mass spectra” (SWATH-MS), para investigar o impacto do hábito do tabaquismo no proteoma periodontal. Material e métodos: Recolléronse mostras de FCX de 40 suxeitos con periodontite en estadio III-IV segundo a clasificación de 2018, divididos en tres grupos de acordo co hábito de fumar: 13 non fumadores, 17 fumadores e 10 exfumadores. As mostras analizáronse mediante a técnica proteómica SWATH-MS, e as proteínas identificáronse empregando a base de datos UniProt específica para humanos. Primeiro, avaliouse a estrutura do proteoma periodontal mediante análise de compoñentes principais (ACP) nos tres grupos clínicos; e logo, comparouse a expresión das proteínas cuantificadas. As proteínas cun valor p <0,05 e un tamaño do efecto absoluto >0,2 consideráronse diferencialmente expresadas. Resultados: Cuantificáronse 250 proteínas no FCX. A estrutura do proteoma non foi diferente entre non fumadores, fumadores e exfumadores. Considerando a expresión proteica, 23 moléculas expresáronse de forma diferencial en non fumadores fronte fumadores, das cales sete estiveron sobreexpresadas (tamaño do efecto: 0,85) e 16 subexpresadas (-0,24  -1,24). En non fumadores fronte exfumadores, 17 proteínas atopáronse diferencialmente expresadas, 15 sobreexpresadas (0,54  1,26) e dúas subexpresadas (-0,90  -0,92). Por último, oito proteínas detectáronse con expresión diferencial en exfumadores fronte a fumadores, unha regulada á alza (1,07) e sete reguladas á baixa (-0,53  -0,95). Conclusións: Aínda que a estrutura do proteoma non é significativamente diferente entre os tres grupos clínicos, en pacientes periodontais fumadores, hai diversas proteínas diferencialmente expresadas con respecto aos suxeitos que nunca fumaron, potenciándose varias queratinas vinculadas á inmunidade innata e proteínas asociadas á progresión da periodontite. Ademais, o tabaco induce unha menor expresión de inmunoglobulinas, persistindo este efecto sobre a inmunidade humoral incluso anos despois de ter deixado de fumar. Palabras chave: fluído crevicular xinxival, periodontite, espectrometría de masas, SWATHMS, proteómica, tabaquismo. 4 Resumen Objetivo: Analizar la estructura del proteoma periodontal y la expresión diferencial de las proteínas detectadas en fluído crevicular gingival (FCG) de pacientes periodontales no fumadores, fumadores y exfumadores, mediante “sequential window acquisition of all theoretical mass spectra” (SWATH-MS), para investigar el impacto del hábito tabáquico en el proteoma periodontal. Material y métodos: Se recogieron muestras de FCG de 40 sujetos con periodontitis en estadio III-IV según la clasificación de 2018, divididos en tres grupos de acuerdo con el hábito tabáquico: 13 no fumadores, 17 fumadores y 10 exfumadores. Las muestras se analizaron mediante la técnica proteómica SWATH-MS, y las proteínas se identificaron empleando la base de datos UniProt específica para humanos. Primero, se evaluó la estructura del proteoma periodontal de las muestras de FCG mediante análisis de componentes principales (ACP) en los tres grupos clínicos; y luego, se comparó la expresión de las proteínas cuantificadas. Las proteínas con un valor p <0,05 y un tamaño del efecto absoluto >0,2 se consideraron diferencialmente expresadas. Resultados: Se cuantificaron 250 proteínas en el FCG. La estructura del proteoma no fue significativamente diferente entre no fumadores, fumadores y exfumadores. Considerando la expresión proteica, 23 moléculas se expresaron de forma diferencial en no fumadores frente a fumadores, de las cuales siete estuvieron sobreexpresadas (tamaño do efecto: 0,85) e 16 subexpresadas (-0,24  -1,24). En no fumadores frente a exfumadores, 17 proteínas se encontraron diferencialmente expresadas, 15 sobreexpresadas (0,54  1,26) y dos subexpresadas (-0,90  -0,92). Por último, ocho proteínas se detectaron con expresión diferencial en exfumadores frente a fumadores, una regulada al alza (1,07) y siete reguladas a la baja (-0,53  -0,95). Conclusiones: Aunque la estructura del proteoma no es significativamente diferente entre los tres grupos clínicos, en pacientes periodontales fumadores, hay diversas proteínas diferencialmente expresadas con respecto a los sujetos que nunca han fumado, potenciándose varias queratinas vinculadas a la inmunidad innata y proteínas asociadas a la progresión de la periodontitis. Además, el tabaco induce una menor expresión de inmunoglobulinas, persistiendo este efecto sobre la inmunidad humoral incluso años después de haber dejado de fumar. Palabras clave: biomarcadores moleculares, fluido crevicular gingival, periodontitis, espectrometría de masas, SWATH-MS, proteómica, tabaquismo. 5 Abstract Aim: To analyse the structure of the periodontal proteome and the differential expression of proteins detected in gingival crevicular fluid (GCF) from non-smoking, smoking and former smoking periodontal patients, by “sequential window acquisition of all theoretical mass spectra” (SWATH-MS), to investigate the impact of smoking on the periodontal proteome. Material and methods: GCF samples were collected from 40 subjects with stage III-IV periodontitis according to the 2018 classification, divided into three groups according to smoking status: 13 non-smokers, 17 smokers and 10 former smokers. The samples were analysed using the proteomic technique SWATH-MS, and proteins were identified employing UniProt humanspecific database. First, the periodontal proteome structure of the GCF samples was assessed using principal component analysis (PCA) in the three clinical groups, and then expression of the quantified proteins was compared. Those proteins with a p-value <0.05 and an absolute effect size >0.2 were considered differentially expressed. Results: A total of 250 proteins in GCF were quantified. The proteome structure was not significantly different between non-smokers, smokers and former smokers. Considering protein expression, 23 molecules were differentially expressed in non-smokers vs smokers, of which seven were upregulated (effect size: 0.85) and 16 were downregulated (-0.24  -1.24). In non-smokers vs former smokers, 17 proteins were found differentially expressed, 15 upregulated (0.54  1.26) and two downregulated (-0.90  -0.92). Finally, eight proteins were detected differentially expressed in former smokers vs smokers, one upregulated (1.07) and seven downregulated (-0.53  -0.95). Conclusions: Although the proteome structure is not significantly different between the three clinical groups, in periodontal smokers, several proteins are differentially expressed compared to never smokers, enhancing several keratins linked to innate immunity and proteins associated with the progression of periodontitis. In addition, smoking induces a lower expression of immunoglobulins, and this effect on humoral immunity persists even years after smoking cessation. Keywords: molecular biomarkers, gingival crevicular fluid, periodontitis, mass spectrometry, SWATH-MS, proteomics, smoking. 6 1. Introducción Actualmente, las enfermedades periodontales son una de las condiciones orales más prevalentes a nivel mundial suponiendo un preocupante problema de salud pública (1). En 2017, se estimó que la periodontitis severa afecta a cerca de 800 millones de personas en el mundo, con una prevalencia estandarizada por edad de aproximadamente el 10% (2). Asimismo, entre 1990 y 2019, esta tasa aumentó alrededor de un 8%, debido principalmente al crecimiento de la población mundial por lo que se espera que siga aumentando en las próximas décadas (3). La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta al tejido blando que rodea los dientes (encía), al hueso y al ligamento periodontal que ancla el diente al hueso alveolar (4). La etiología de esta enfermedad es multifactorial, siendo los más relevantes el biofilm microbiano y el sistema inmune del huésped. La disbiosis del microbioma oral provoca una sobreactivación del sistema inmunológico, que activa a su vez la función osteoclástica, provocando la reabsorción del hueso alveolar y, en última instancia, pudiendo conducir a la pérdida dental (5-7). Las enfermedades periodontales no sólo deterioran la salud bucodental, sino que también afectan profundamente aspectos físicos, sociales y psicológicos de la calidad de vida del paciente (8). Además, actualmente hasta 57 enfermedades sistémicas han demostrado estar relacionadas con la periodontitis de forma bidireccional (9), incluyendo las enfermedades cardiovasculares (10), la diabetes mellitus (11), la enfermedad de Alzheimer (12) y resultados adversos durante el embarazo (13). Aunque la inflamación gingival causada por la acumulación de placa es un factor patogénico necesario para la periodontitis (6) , sólo deriva en periodontitis en aquellas personas susceptibles de padecer la enfermedad (4). Existen varios factores de riesgo asociados al desarrollo de la periodontitis, los cuales pueden ser no modificables (por ejemplo, la edad, el sexo, la genética y el origen étnico), pero la mayoría de ellos son modificables, ya que están relacionados con enfermedades sistémicas o hábitos (por ejemplo, la higiene oral o el tabaquismo) (14). El tabaquismo es considerado un verdadero factor de riesgo para el desarrollo de la periodontitis, puesto que incrementa la probabilidad de que ocurra en un 85% (15); mientras que su abandono reduce el riesgo de periodontitis a un nivel comparable al de quienes nunca fumaron (16). 7 Además, durante los últimos años, se ha demostrado que varias proteínas detectadas en el fluido crevicular gingival (FCG) desempeñan un papel esencial en el inicio, progresión y severidad de la periodontitis (17), aunque se ha evidenciado que algunas de ellas se ven afectadas por el hábito tabáquico (18-20). Esto podría estar relacionado con que el tabaco influye en la patogénesis de la periodontitis a través de vías sistémicas y locales, afectando tanto a la microbiota oral como a la respuesta inmunitaria del huésped (21). Sin embargo, resulta necesario seguir investigando para aclarar su influencia en el proteoma periodontal (21). En este sentido, las técnicas proteómicas de alto rendimiento y, en particular, la cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (“liquid-chromatography tandem mass spectrometry”, LC-MS/MS), han surgido como métodos que permiten estudiar el proteoma periodontal de forma más exhaustiva y, por tanto, contribuyen a una comprensión más amplia y profunda de los perfiles proteicos asociados a la periodontitis (17, 22). Teniendo en cuenta los distintos métodos de LCMS/MS, actualmente las técnicas sin etiquetado (“label-free”) son las más empleadas, ya que son más asequibles, se asocian a una preparación de muestras más sencilla y pueden admitir mayores tamaños muestrales que las técnicas de etiquetado (23). Por otra parte, considerando las estrategias de adquisición de datos, “selected-reaction monitoring” (SRM) sigue siendo el método de cuantificación de referencia (24). Sin embargo, debido a su baja cobertura del proteoma de la muestra (23), la adquisición independiente de datos (AID) no dirigida ha surgido como alternativa, ya que teóricamente permite cuantificar todas las moléculas presentes en la muestra (24). En consonancia con estas técnicas, se ha desarrollado el método “sequential window acquisition of all theoretical mass spectra” (SWATH-MS). SWATH-MS combina la identificación de péptidos mediante un modo de adquisición dependiente de datos (ADD) con un enfoque AID para extraer información cuantitativa de las proteínas previamente identificadas (25). Estas características la convierten en una estrategia eficaz para cuantificar un gran número de proteínas con una consistencia y precisión similares a la SRM dirigida (23). En consecuencia, a pesar de su reciente desarrollo, SWATH-MS ha atraído rápidamente el interés de la comunidad científica (23), demostrando resultados prometedores en diversas áreas clínicas (26, 27). Estos diferentes enfoques proteómicos condujeron al descubrimiento de múltiples proteínas del FCG, con perfiles de expresión significativamente distintos en función del estado periodontal (28-30). Sin embargo, la influencia del hábito tabáquico en este perfil proteómico ha sido escasamente evaluado. Stein et al. observaron diferencias en el proteoma del FCG de pacientes 8 con periodontitis entre fumadores y no fumadores (31), mientras que Grant et al. demostraron que la expresión de ciertos péptidos antimicrobianos en saliva varía entre sujetos sanos y con periodontitis de acuerdo con el hábito tabáquico (32). Además, hasta el momento, no se ha evaluado la influencia del cese del hábito tabáquico en el proteoma periodontal. Asimismo, la técnica SWATH-MS aún no ha sido aplicada para analizar el proteoma periodontal (33). Por consiguiente, el objetivo de este estudio transversal fue analizar la estructura del proteoma periodontal y la expresión diferencial de las proteínas detectadas en FCG mediante SWATH-MS de sujetos con periodontitis diferenciando por hábito tabáquico en tres grupos: no fumadores, exfumadores y fumadores. 2. Material y métodos 2.1 Sujetos de estudio y variables clínicas de interés Se reclutó una muestra por conveniencia de 40 individuos con periodontitis, a partir de 150 pacientes consecutivos de la población general que fueron remitidos a la Facultad de Medicina y Odontología (Universidade de Santiago de Compostela, España) entre 2022 y 2023 para una evaluación de su estado de salud oral. La muestra de estudio estuvo constituida por sujetos sistémicamente sanos que cumplían los siguientes criterios de inclusión: 1) edad entre 20-75 años, 2) presencia de al menos 10 dientes naturales, 3) no haber recibido tratamiento periodontal previo, 4) no presentar enfermedades sistémicas; 4) no embarazo o lactancia, 5) no haber ingerido antibióticos en los 6 meses previos o antiinflamatorios en los 4 meses previos, 6) no usar antisépticos de forma rutinaria, 7) no presentar caries activas, periodontitis apical, infección dentaria ni infecciones asociadas a mucosas, 8) no antecedentes de abuso de alcohol o drogas, 9) ausencia de aparatos de ortodoncia, 10) no haber fumado nunca (no fumador), haber fumado durante al menos un año (fumador), o haber dejado de fumar hace al menos un año independientemente del tiempo que había fumado (exfumador). Dos odontólogos experimentados y previamente calibrados efectuaron el diagnóstico periodontal, analizando los parámetros clínicos (variables clínicas de interés): profundidad de sondaje (PS), pérdida de inserción clínica (PIC), grado de sangrado al sondaje (SS) y niveles de placa bacteriana (NPB). El registro del SS y de NPB se realizó en toda la boca con una escala binaria (presencia/ausencia) en seis puntos por diente. La PS y la PIC se registraron con una sonda 15 3.2 Estructura del proteoma periodontal en FCG El análisis SWATH-MS nos permitió cuantificar un total de 250 proteínas en las muestras de FCG para los tres grupos clínicos. En primer lugar, evaluamos la estructura del proteoma en FCG usando un ACP. Las dos primeras dimensiones corresponden al 44,4% del total de la varianza (Figura 1). Figura 1. Valor propio del porcentaje de variabilidad dentro de cada dimensión en las muestras del FCG. 16 El gráfico ACP mostró una agrupación de las muestras del FCG de acuerdo con el hábito tabáquico. Se puede observar un gran grado de solapamiento entre las muestras de fumadores y exfumadores, siendo ligeramente diferente en no fumadores (Figuras 2A y 2B). Sin embargo, los test ANOSIM y adonis2 demostraron que las diferencias no fueron significativas en la estructura del proteoma periodontal en FCG entre los tres grupos clínicos (Tabla 2). Figura 2A. ACP de las muestras de FCG según el grupo clínico: no fumador (verde), fumador (rojo) y exfumador (azul). Se muestran los centroides de cada grupo clínico y sus correspondientes rangos de valores. 17 Figura 2B. ACP de las muestras de FCG según el grupo clínico: no fumador (verde), fumador (rojo) y exfumador (azul). Se muestran los centroides de cada grupo clínico y sus correspondientes intervalos de confianza del 95%. Tabla 2. Valores de los tests ANOSIM y adonis2 de las proteínas del FCG en los diferentes grupos clínicos. Condición objetivo Condición control Valor p en ANOSIM Valor p en adonis2 No fumador Fumador 0,801 0,369 No fumador Exfumador 0,133 0,082 Exfumador Fumador 0,427 0,371 Abreviaturas: ANOSIM: análisis de similitudes. El nivel de significación se estableció en p <0,05 18 3.3 Expresión diferencial de las proteínas cuantificadas en FCG Considerando la expresión de las 250 proteínas del FCG cuantificadas, se observó que 23 (9,2%) se expresaban de forma diferencial (valor p <0,05; tamaño del efecto absoluto >0,2) en las muestras de no fumadores en comparación con los fumadores. De ellas, 16 (69,6%) estaban reguladas a la baja y siete (30,4%) al alza. Comparando a los no fumadores con los exfumadores, 17 proteínas (6,8%) se expresaron de forma diferencial, de las cuales 15 fueron reguladas al alza (88,2%) y dos a la baja (11,8%). En las muestras de exfumadores en comparación con fumadores, ocho proteínas (3,2%) se expresaron de forma diferencial, con siete (87,5%) reguladas al alza y una a la baja (12,5%) (Figura 3). Figura 3. Número de proteínas (porcentajes) del FCG sobreexpresadas y subexpresadas en cada grupo clínico. Abreviaturas: EF: exfumador; F: fumador; nº: número; NF: no fumador; vs: versus. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2 (sobreexpresada) o <-0,2 (subexpresada). 0 5 10 15 20 25 NF vs F NF vs EF EF vs F 7 15 1 16 2 7 Nº de proteínas diferencialmente expresadas Sobreexpresadas Subexpresadas (69,6%) (30,4%) (11,8%) (88,2%) (69,6%) (87,5%) %) (12,5%) 19 3.3.1 Grupo de no fumadores comparado con grupo de fumadores Si nos centramos en las siete proteínas reguladas al alza en los pacientes no fumadores en comparación con los fumadores, dos mostraron un tamaño del efecto grande (0,85 en ambas) y cinco un tamaño del efecto mediano (0,64 – 0,79) (Tabla 3 y Figura 4). Dichas proteínas reguladas al alza con un tamaño del efecto grande fueron la elastasa neutrofílica (0,85) y olfactomedina-4 (0,85). Tabla 3. Proteínas del FCG sobreexpresadas en no fumadores en comparación con fumadores (N=7). Acceso a UniProt Nombre de la proteína Foldchange Valor p Tamaño del efecto (DE) Mag. P08246 Elastasa neutrofílica 1,56 0,0364 0,85 (26603,92) Grande (N=2) Q6UX06 Olfactomedina-4 1,40 0,0400 0,85 (389,87) A0A0C4DH68 Ig kappa variable 2-24 2,13 0,0238 0,79 (3999,74) Mediano (N=5) P02671 Cadena alfa del fibrinógeno 1,64 0,0445 0,77 (14753,78) P35754 Glutarredoxina-1 1,41 0,0492 0,74 (391,95) P01859 Ig gamma 2 constante pesada 1,66 0,0492 0,68 (76718,88) P01876 Ig alfa 1constante pesada 1,54 0,0295 0,64 (57833,75) Abreviaturas: DE: desviación estándar; Ig: inmunoglobulina; Mag.: magnitud del tamaño del efecto. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2. Magnitud del tamaño del efecto: mediano (morado): 0.5  0.8; grande (rojo): >0.8. Por su parte, si analizamos las 16 proteínas reguladas a la baja, cinco obtuvieron un tamaño del efecto grande (-0,83  -1,24) y 11 un tamaño del efecto pequeño-mediano (-0,24  -0,79) (Tabla 4 y Figura 5). Dichas proteínas subexpresadas con un tamaño del efecto grande corresponden de menor a mayor con: proteína 5 de unión a ácidos grasos (-1,24), cornulina (-0,98), proteína-glutamina gamma-glutamiltransferasa E (-0,95), factor de elongación 1-gamma (-0,85) y chaperona del retículo endoplásmico proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein, BiP) (-0,83) (Tabla 4). 20 Tabla 4. Proteínas del FCG subexpresadas en no fumadores en comparación con fumadores (N=16). Acceso a UniProt Nombre de la proteína Foldchange Valor p Tamaño del efecto (DE) Mag. Q01469 Proteína 5 de unión a ácidos grasos 0,48 0,0107 -1,24 (19946,93) Grande (N=5) Q9UBG3 Cornulina 0,38 0,0023 -0,98 (2250,69) Q08188 Proteína-glutamina gamma-glutamiltransferasa E 0,51 0,0402 -0,95 (7649,03) P26641 Factor de elongación 1-gamma 0,69 0,0238 -0,85 (1208,39) P11021 Chaperona del retículo endoplásmico BiP 0,73 0,0265 -0,83 (1360,66) P19013 Queratina, tipo II citoesquelética 4 0,16 0,0120 -0,79 (88171,39) Pequeño-Mediano (N=11) P04080 Cistatina-B 0,56 0,0190 -0,79 (13577,58) P02545 Prelamina-A/C 0,62 0,0328 -0,77 (846,69) P07900 Proteína de choque térmico HSP 90-alfa 0,63 0,0491 -0,76 (1364,90) P13646 Queratina, tipo I citoesquelética 13 0,23 0,0363 -0,73 (386694,53) Q06830 Peroxirredoxina-1 0,67 0,0445 -0,70 (23707,55) P14550 Familia 1 de la aldo-ceto reductasa, miembro A1 0,66 0,0445 -0,68 (930,83) P22314 Enzima activadora de modificadores similares a la ubiquitina 1 0,69 0,0328 -0,65 (385,86) P29508 Serpina B3 0,69 0,0363 -0,61 (16388,59) P08727 Queratina, tipo I citoesquelética 19 0,62 0,0492 -0,47 (3072,08) P17931 Galectina-3 0,81 0,0171 -0,24 (834,27) Abreviaturas: BiP: proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein); DE: desviación estándar; Mag.: magnitud del tamaño del efecto; Ig: inmunoglobulina. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto <-0,2. Magnitud del tamaño del efecto: pequeño-mediano (azul): -0.5  -0.8; grande (verde): <-0.8. 21 Figura 4. Diagrama de volcán de las proteínas del FCG sobreexpresadas (N= 7; 2 de tamaño de efecto grande y 5 mediano) y subexpresadas (N= 16; 5 de tamaño de efecto grande y 11 pequeño-mediano) en no fumadores en comparación con fumadores. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2 (sobreexpresada) o <-0,2 (subexpresada). Magnitud del tamaño del efecto: pequeño-mediano subexpresado (azul): -0,2  -0,8; grande subexpresado (verde): <- 0,8; pequeño-mediano sobreexpresado (morado): 0,2  0,8; grande sobreexpresado (rojo): >0.8. 22 3.3.2 Grupo de no fumadores comparado con grupo de exfumadores Tabla 5. Proteínas del FCG expresadas diferencialmente en no fumadores con respecto a exfumadores (sobreexpresadas: N=15; subexpresadas: N=2). PROTEÍNAS SOBREEXPRESADAS Acceso a UniProt Nombre de la proteína Foldchange Valor p Tamaño del efecto (DE) Mag. P01876 Ig alfa 1 constante pesada 2,29 0,0048 1,26 (48798,75) Grande (N=8) P01023 Alfa-2-macroglobulina 1,72 0,0083 1,20 (78795,96) P01624 Ig kappa variable 3-15 2,64 0,0377 0,89 (1902,74) P01714 Ig lambda variable 3-19 1,69 0,0377 0,87 (2933,40) P02763 Alfa-1-glicoproteína ácida 1 2,16 0,0377 0,84 (20842,56) P01742 Ig pesada variable 1-69 1,84 0,0120 0,83 (3688,22) P01011 Alfa-1-antiquimotripsina 1,58 0,0377 0,81 (53669,43) A0A0C4DH68 Ig kappa variable 2-24 2,44 0,0236 0,80 (4362,18) P69892 Subunidad gamma-2 de la Hb 3,08 0,0438 0,76 (14825,82) Mediano (N=7) P02749 Beta-2-glicoproteína 1 2,21 0,0170 0,71 (18885,15) P02774 Proteína de unión a la vitamina D 2,01 0,0377 0,64 (86354,25) P02768 Albúmina 2,24 0,0236 0,62 (28297838,10) P02765 Alfa-2-HS-glicoproteína 1,58 0,0200 0,58 (12922,53) Q14624 Inhibidor inter-alfa-tripsina de cadena pesada H4 1,64 0,0377 0,55 (7328,19) P00747 Plasminógeno 1,73 0,0438 0,54 (1496,90) PROTEÍNAS SUBEXPRESADAS Acceso a UniProt Nombre de la proteína Foldchange Valor p Tamaño del efecto (DE) Mag. P00558 Fosfoglicerato quinasa 1 0,46 0,0438 -0,92 (2083,45) Grande (N=2) P63104 Proteína 14-3-3 zeta/delta 0,79 0,0277 -0,90 (7273,59) Abreviaturas: DE: desviación estándar; Hb: hemoglobina; Ig: inmunoglobulina; Mag.: magnitud del tamaño del efecto. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2 (sobreexpresada) o <-0,2 (subexpresada). Magnitud del tamaño del efecto: mediano sobreexpresado (morado): 0.5  0.8; grande sobreexpresado (rojo): >0.8; grande subexpresado (verde): <-0,8. 23 Figura 5. Diagrama de volcán de las proteínas del FCG sobreexpresadas (N= 15; 8 de tamaño de efecto grande y 7 mediano) y subexpresadas (N= 2 con tamaño de efecto grande) en no fumadores en comparación con exfumadores. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2 (sobreexpresada) o <-0,2 (subexpresada). Magnitud del tamaño del efecto: grande subexpresado (verde): <-0,8; pequeño-mediano sobreexpresado (morado): 0,2  0,8; grande sobreexpresado (rojo): >0.8. 24 Si consideramos las proteínas diferencialmente expresadas en no fumadores con respecto a exfumadores, comprobamos que 15 estuvieron reguladas al alza, donde ocho presentaron un tamaño del efecto grande (0,80  1,26) y siete un tamaño del efecto mediano (0,54  0,76) (Tabla 5 y Figura 5). Las proteínas más diferencialmente expresadas fueron (de mayor a menor): inmunoglobulina (Ig) alfa 1 pesada constante (1,26), alfa-2-macroglobulina (1,20), Ig kappa variable 3-15 (0,89), Ig lambda variable 3-19 (0,87), alfa-1-glicoproteína ácida 1 (0,84), Ig variable pesada 1-69 (0,83), alfa-1-antiquimotripsina (0,81) e Ig kappa variable 2-24 (0,80). Por otra parte, las proteínas reguladas a la baja de forma significativa fueron dos, ambas con tamaño del efecto grande: fosfoglicerato quinasa 1 (-0,92) y proteína 14-3-3 zeta/delta (-0,90) (Tabla 5 y Figura 5). 3.3.3 Grupo de exfumadores comparado con grupo de fumadores Tabla 6. Proteínas del FCG expresadas diferencialmente en exfumadores con respecto a fumadores (sobreexpresadas: N=1; subexpresadas: N=7). PROTEÍNAS SOBREEXPRESADAS Acceso a UniProt Nombre de la proteína Foldchange Valor p Tamaño del efecto (DE) Mag. P07737 Profilina-1 1,54 0,0149 1,07 (17473,45) G (N=1) PROTEÍNAS SUBEXPRESADAS Acceso a UniProt Nombre de la proteína Foldchange Valor p Tamaño del efecto (DE) Mag. P11021 Chaperona del retículo endoplásmico BiP 0,69 0,0196 -0,95 (1409,19) Grande (N=2) P02763 Alfa-1-glicoproteína ácida 1 0,57 0,0420 -0,87 (13279,60) O43707 Alfa-actinina-4 0,79 0,0420 -0,78 (3197,76) Mediano (N=5) P01011 Alfa-1-antiquimotripsina 0,68 0,0328 -0,74 (47135,15) P19013 Queratina, tipo II citoesquelética 4 0,21 0,0171 -0,71 (93538,58) P0DOX5 Cadena pesada de Ig gamma 0,59 0,0255 -0,66 (316983,71) P69892 Subunidad gamma 2 de la Hb 0,42 0,0328 -0,53 (14437,30) Abreviaturas: BiP: proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein); DE: desviación estándar; G: grande; Hb: hemoglobina; Ig: inmunoglobulina; Mag.: magnitud del tamaño del efecto. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2 (sobreexpresada) o <-0,2 (subexpresada). Magnitud del tamaño del efecto: grande sobreexpresado (rojo): >0.8; grande subexpresado (verde): <-0,8; mediano subexpresado (azul): -0.5  -0.8. 31 citoquinas proinflamatorias (68) y en la literatura se muestra sobreexpresada en periodontitis frente a salud (50). La proteína-glutamina gamma-glutamiltransferasa E tiene una actividad catalítica que interviene en la formación de la envoltura cornificada de los queratinocitos (69). En relación con la periodontitis, estas enzimas parecen tener un papel clave en los procesos de remodelación, curación y adaptación gingivales (70). El factor de elongación 1-gamma facilita los eventos de elongación y sugiere una mayor actividad metabólica en la bolsa periodontal estando sobreexpresado en pacientes periodontales con respecto a sujetos sanos (71). La chaperona del retículo endoplásmico BiP desempeña un papel auxiliar en el transporte postraduccional de pequeñas proteínas presecretoras a través del retículo endoplásmico (72) y su papel en la periodontitis parece estar todavía por determinar. Por último, conviene mencionar que tres queratinas se muestran subexpresadas con un tamaño del efecto pequeño-mediano en no fumadores con respecto a fumadores (sobreexpresadas, por tanto, en fumadores): queratina, tipo II citoesquelética 4 (-0,79), queratina, tipo I citoesquelética 13 (-0,73) y queratina, tipo I citoesquelética 19 (-0,47). Consecuentemente, según nuestros resultados, en la periodontitis asociada al consumo de tabaco hay una sobreactivación de proteínas potenciadoras implicadas en la patogenia de la enfermedad, así como de varias queratinas que forman parte de la inmunidad innata sobreactivada frente a una sustancia extraña dañina como supone el tabaco (73). Por otra parte, también resulta relevante analizar las proteínas que se mostraron sobreexpresadas (por tanto, infraexpresadas en fumadores). Las dos con tamaño del efecto grande (0,85) fueron la elastasa neutrofílica y olfactomedina-4. La elastasa neutrofílica hidroliza proteínas, modifica las funciones de las natural killer, los monocitos y los granulocitos e inhibe la liberación de enzimas y la quimiotaxis de los neutrófilos dependientes de C5a (74). Baliban et al. y Huynh et al. señalaron su relación con presencia y/o actividad de la periodontitis (75, 76), indicando que su sobreexpresión en periodontitis guía la fagocitosis, la lisis celular durante la inflamación, presentando una actividad antimicrobiana (76). En cuanto a la olfactomedina-4 (OLFM4), su regulación parece estar estrechamente ligada con la Porphyromonas gingivalis. Así, la regulación positiva de OLFM4 por parte de esta bacteria podría prevenir una respuesta inmune antibacteriana efectiva y contribuir a las propiedades sigilosas de este microorganismo. Además, Streptococcus gordonii inhibe la expresión de esta proteína, lo que favorecería una respuesta destructiva que potenciaría el desarrollo de la enfermedad. Por lo que la menor expresión de esta proteína hallada en los sujetos fumadores podría favorecer la actividad destructiva de la periodontitis (77). Por último, es interesante mencionar que tres de las cinco proteínas 32 sobreexpresadas (infraexpresadas en los fumadores) con tamaño del efecto mediano fueron Igs. (kappa variable 2-24, gamma 2 constante pesada y alfa 1constante pesada), que constituyen la principal línea de defensa frente a bacterias al actuar como receptores que, al unirse a un antígeno específico, desencadenan la expansión clonal y la diferenciación de los linfocitos B en células plasmáticas secretoras de Igs., para la eliminación de los antígenos unidos (78, 79). Este hecho resulta coherente con lo expuesto por Huang et al. en relación al cierto estado de inmunosupresión vinculado al consumo de tabaco (80). Estos resultados nos indican que el tabaco puede reducir la expresión de proteínas que limitan la destrucción periodontal, como el caso de la olfactomedina- 4; así como también, inducir una menor expresión de proteínas con actividades antimicrobianas (inmunoglobulinas). Tabla 8. Funciones de las principales proteínas del FCG con expresión diferencial en pacientes fumadores en comparación con los no fumadores (según hábito tabáquico). Nombre de la proteína Función en periodontitis Expresión en fumadores Proteína 5 de unión a ácidos grasos Regulación de la inducción de PGE2 (66)  Cornulina Diferenciación epitelial y respuesta inmunitaria (67)  Proteína-glutamina gamma-glutamiltransferasa E Remodelación y curación gingival (68)  Factor de elongación 1-gamma Facilita eventos de elongación, actividad metabólica (71)  Chaperona del retículo endoplásmico BiP Desconocida  Queratina, tipo II citoesquelética 4 Inmunidad innata frente a sustancia extraña dañina (tabaco) (73)  Queratina, tipo I citoesquelética 13  Queratina, tipo I citoesquelética 19  Elastasa neutrofílica Actividad antimicrobiana (76)  Olfactomedina-4 Limitar la respuesta inflamatoria destructiva (77)  Ig kappa variable 2-24 Línea defensiva frente a bacterias (78-80)  Ig gamma 2 constante pesada  Ig alfa 1constante pesada  Abreviaturas: BiP: proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein); Ig: inmunoglobulina; PGE2: prostaglandina E2. 33 4.4.2 Grupo de no fumadores comparado con grupo de exfumadores Contrariamente, si comparamos el grupo de no fumadores vs exfumadores, aunque el número de proteínas diferencialmente expresadas fue similar (17, el 7% de las 250), la gran mayoría de ellas estuvieron reguladas al alza en no fumadores (15, el 88%, es decir infraexpresadas en exfumadores) y sólo dos (12%) reguladas a la baja (es decir, sobreexpresadas en exfumadores). Además, en este caso, las proteínas más diferencialmente expresadas estuvieron reguladas al alza en los no fumadores (es decir, infraexpresadas en exfumadores). De las ocho proteínas sobreexpresadas en no fumadores (infraexpresadas en exfumadores) con un tamaño del efecto grande (0,80-1,26), cinco fueron Igs (alfa 1 pesada constante (1,26), kappa variable 3-15 (0,89), lambda variable 3-19 (0,87), variable pesada 1-69 (0,83) y kappa variable 2-24 (0,80)), manifestando que la función defensiva en pacientes exfumadores está más disminuída que en no fumadores y apoyando una vez más el cierto estado de inmunosupresión persistente vinculado al consumo de tabaco (80). Las tres restantes proteínas reguladas al alza (infraexpresadas en exfumadores) fueron alfa-2-macroglobulina, alfa-1-glicoproteína ácida 1 y alfa-1-antiquimotripsina. La alfa-2-macroglobulina es una proteína de fase aguda e inhibidora de proteinasas, que protege contra los daños inflamatorios. La presencia de niveles altos en el FCG podría asociarse a una acción antiinflamatoria, contrarrestando los procesos de degradación tisular y resorción ósea propios de la periodontitis (28). Igualmente, la alfa-1-glicoproteína ácida 1 también es una proteína de fase aguda, que se incrementa en respuesta a la infección bacteriana (actividad antiinflamatoria) (53). Por último, la función fisiológica de la alfa-1-antiquimotripsina aún no está clara, aunque parece que su objetivo fisiológico es la catepsina G de los neutrófilos (destrucción de bacterias mediada por neutrófilos) y la quimasa de los mastocitos (28, 81). Por tanto, desde el punto de vista de la enfermedad periodontal, constituiría una defensa natural al proteger a los tejidos periodontales del daño causado por las enzimas proteolíticas (28). Frente a lo expuesto, tan sólo dos proteínas se mostraron reguladas a la baja (sobrexpresadas en exfumadores), ambas con tamaño del efecto grande (-0,90  -0,92): fosfoglicerato quinasa 1 y proteína 14-3-3 zeta/delta. La fosfoglicerato quinasa 1 es una enzima glucolítica que cataliza reacciones productoras de adenosín trifosfato (ATP) (82, 83); incluyendo la remodelación o reprogramación metabólica del tejido periodontal (84). La proteína 14-3-3 zeta/delta regula la apoptosis y remodelación del tejido conjuntivo. En cuanto a su relación con la periodontitis, es posible que, la pérdida de control del ciclo celular y apoptótico conduzca a un desequilibrio de la 34 respuesta inmunitaria, promoviendo la destrucción incontrolada e irreversible mediada por el huésped (76). Con todo, de forma similar a lo observado en fumadores, en los exfumadores se apreció una infraexpresión de proteínas con actividades antimicrobianas (inmunoglobulinas) con respecto a los no fumadores, aunque también de determinadas proteínas con acción antiinflamatoria. Tabla 9. Funciones de las principales proteínas del FCG con expresión diferencial en pacientes exfumadores en comparación con los no fumadores (según hábito tabáquico). Nombre de la proteína Función en periodontitis Expresión en exfumadores Ig alfa 1 constante pesada Línea defensiva frente a bacterias (78-80)  Ig kappa variable 3-15  Ig lambda variable 3-19  Ig pesada variable 1-69  Ig kappa variable 2-24  Alfa-2-macroglobulina Acción antiinflamatoria: contrarrestra degradación tisular y resorción ósea (28)  Alfa-1-glicoproteína ácida 1 Acción antiinflamatoria: proteína de fase aguda (53)  Alfa-1-antiquimotripsina Defensa natural; protección de tejidos periodontales del daño causado por enzimas proteolíticas (28)  Fosfoglicerato quinasa 1 Remodelación o reprogramación metabólica del tejido periodontal (84)  Proteína 14-3-3 zeta/delta Favorece desequilibrio de la respuesta inmunitaria: destrucción incontrolada mediada por el huésped (76)  Abreviaturas: Ig: inmunoglobulina. 4.4.3 Grupo de exfumadores comparado con grupo de fumadores Por último, si comparamos el grupo de los exfumadores con el de los fumadores actuales, el número de proteínas diferencialmente expresadas se reduce a ocho (3%), de las cuales siete estuvieron subexpresadas en exfumadores y tan sólo una sobreexpresada (es decir, sobreexpresadas e infraexpresadas en fumadores, respectivamente). Sin embargo, esta única proteína, la profilina-1, fue la que demostró estar más diferencialmente expresada, con un tamaño del efecto de 1,07. Es una proteína de unión a la actina que afecta a la estructura del citoesqueleto (85). En algún estudio se ha observado sobreexpresada en pacientes periodontales (86), y aunque aún no se ha aclarado su papel en los procesos inflamatorios, se ha asociado a la progresión de la periodontitis (87). 35 Otras dos proteínas demostraron estar diferencialmente expresadas con un tamaño del efecto grande, pero infraexpresadas (-0,87  -0,95, es decir, sobreexpresadas en fumadores): chaperona del retículo endoplásmico BiP y alfa-1-glicoproteína ácida 1. Como mencionamos, de la primera aún no se ha aclarado el papel en la periodontitis y la segunda es una proteína de fase aguda con actividad antiinflamatoria (53). Por tanto, comprobamos que en esta comparativa las diferencias fueron menos significativas y afectó a un menor número de proteínas. Se aprecia cierta persistencia del efecto del tabaco a largo plazo sobre la funcionalidad proteica asociada a la periodontitis. Se encontró sobreexpresión en exfumadores de alguna proteína asociada positivamente con la progresión de la periodontitis (profilina-1), como también infraexpresión de otras con acción antiinflamatoria (alfa-1- glicoproteína ácida). Tabla 10. Funciones de las principales proteínas del FCG con expresión diferencial en pacientes fumadores en comparación con los exfumadores (según hábito tabáquico). Nombre de la proteína Función en periodontitis Expresión en fumadores Expresión en exfumadores Profilina-1 Favorece progresión de periodontitis (inflamación) (87)   Chaperona del retículo endoplásmico BiP Desconocida   Alfa-1-glicoproteína ácida 1 Acción antiinflamatoria: proteína de fase aguda (53)   Abreviaturas: BiP: proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein). 4.4.4 Comparación de los resultados obtenidos en los tres grupos clínicos Si comparamos los resultados obtenidos en los tres grupos clínicos podemos observar que chaperona del retículo endoplásmico BiP y queratina, tipo II citoesquelética 4 se hallaron subexpresadas en no fumadores y exfumadores en comparación con el grupo de fumadores (es decir, sobreexpresadas en fumadores). Por lo tanto, fumar incrementa la expresión de estas dos proteínas. Como se ha mencionado anteriormente, la relación de la primera con la periodontitis todavía es incierta, pero la queratina, tipo II citoesquelética 4, como todas las queratinas, es esencial para el mantenimiento de la integridad epitelial, de modo que una vez que dicha integridad se ve alterada por el biofilm, las bacterias asociadas pueden invadir los tejidos periodontales más profundos, desencadenando una respuesta inflamatoria. Así, estas conexiones célula-célula son una parte crucial de la respuesta inmunitaria innata, con el fin de combatir el desafío tóxico y microbiano (73). Por lo que, como se mencionó previamente, la sobreexpresión de queratinas en 36 pacientes fumadores responde a una potenciación de la inmunidad innata. Así, en base a nuestros resultados, su sobreexpresión persiste mientras se fuma, pero retorna a niveles no significativamente diferentes tras dejar fumar (Tabla 11). En contraposición, las Ig alfa 1 constante pesada y kappa variable 2-24 se hallaron sobreexpresadas en no fumadores con respecto a los fumadores y a los exfumadores (es decir, infraexpresadas en la condición tabáquica). Por lo que el consumo actual o previo de tabaco reduce su expresión (88). Dado que dichas proteínas de la inmunidad humoral constituyen una línea defensiva frente a bacterias, de estos datos se interpreta que la función antimicrobiana puede verse comprometida por el tabaco incluso años después de haberlo dejado (Tabla 11). Tabla 11. Posible relación con la periodontitis e interpretación de las proteínas con expresión diferencial en no fumadores vs fumadores, no fumadores vs exfumadores y exfumadores vs fumadores. Condición Nombre de la proteína Posible relación con la periodontitis o el tabaco Interpretación NF vs F NF vs EX EX vs F SUB NS SUB Chaperona del RE BiP Desconocida Fumar incrementa la expresión respecto a NF y EX Queratina, tipo II citoesquelética 4 Mantenimiento de la integridad epitelial (73) SOBRE SOBRE NS Ig alfa 1 constante pesada Línea defensiva frente a bacterias (88) Fumar o haberlo dejado reduce la expresión respecto a NF Ig kappa variable 2-24 Línea defensiva frente a bacterias (88) NS SOBRE SUB Alfa-1-antiquimotripsina Defensa natural; protección de tejidos periodontales del daño causado por enzimas proteolíticas (28) Fumar incrementa la expresión respecto a EX Haber sido fumador reduce la expresión respecto a NF Alfa-1-glicoproteína ácida 1 Proteína de fase aguda, actividad antiinflamatoria (53) Subunidad gamma-2 de la Hb Sangrado debido a la inflamación (89) Abreviaturas: BiP: proteína de unión a inmunoglobulina (binding immunoglobulin protein); EX: exfumadores; F: fumadores; Hb: hemoglobina; Ig: inmunoglobulina; NF: no fumadores; NS: no significativo; RE: retículo endoplasmático; SOBRE: sobreexpresadas; SUB: subexpresadas; vs: versus. Se consideraron proteínas diferencialmente expresadas para un valor p <0,05 y tamaño del efecto >0,2 (sobreexpresada) o <-0,2 (subexpresada). Por otra parte, alfa-1-antiquimotripsina, alfa-1-glicoproteína ácida 1 y la subunidad gamma-2 de la Hb se hallaron reguladas al alza en no fumadores en comparación con los exfumadores (es decir, infraexpresadas en exfumadores), mientras que la comparativa de exfumadores con respecto a fumadores se mostraron subexpresadas (es decir, sobreexpresadas en fumadores). La alfa-1- antiquimotripsina constituye una defensa natural al regular la destrucción de bacterias mediada por neutrófilos a través de la catepsina G y proteger los tejidos periodontales del daño causado por 37 enzimas proteolíticas (28). Por su parte, la alfa-1-glicoproteína ácida 1 presenta actividad antiinflamatoria (53) y la subunidad gamma-2 de la Hb está implicada en el sangrado vinculado al proceso inflamatorio de la periodontitis (89). De estos resultados se interpreta que inicialmente la acción del tabaco no condiciona la actividad de estas proteínas vinculadas a un papel antiinflamatorio y de tendencia al sangrado, pero el haberlo dejado implica una reducción de su expresión (Tabla 11). 5. Conclusiones En conclusión, la condición tabáquica no modifica significativamente la estructura del proteoma periodontal del FCG en sujetos con periodontitis en estadios III y IV. Sin embargo, en pacientes periodontales fumadores hay diversas proteínas diferencialmente expresadas con respecto a los sujetos que nunca han fumado, potenciándose varias queratinas vinculadas a la inmunidad innata y proteínas asociadas a la progresión de la periodontitis. El tabaco también induce una menor expresión de inmunoglobulinas con actividad antimicrobiana, persistiendo este efecto sobre la inmunidad humoral incluso años después de haber dejado de fumar. 38 Referencias bibliográficas (1) Chapple ILC, Mealey BL, Dyke TE, Bartold PM, Dommisch H, Eickholz P, et al. Periodontal health and gingival diseases and conditions on an intact and a reduced periodontium: Consensus report of workgroup 1 of the 2017 World Workshop on the Classification of Periodontal and Peri‐ Implant Diseases and Conditions. J Clin Periodontol 2018 Jun;89:S74-S84. (2) Bernabe E, Marcenes W, Hernandez CR, Bailey J, Abreu LG, Alipour V, et al. Global, regional, and national levels and trends in burden of oral conditions from 1990 to 2017: a systematic analysis for the global burden of disease 2017 study. JDR 2020 Apr;99(4):362-373. (3) Chen MX, Zhong YJ, Dong QQ, Wong HM, Wen YF. 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