Desarrollo de un ensayo in vitro para la identificación de compuestos inhibidores de la actividad reductasa de la hAASS, diana terapéutica de la epilepsia dependiente de piridoxina

Desarrollo de un ensayo in vitro para la identificación de compuestos inhibidores de la actividad reductasa de la hAASS, diana terapéutica de la epilepsia dependiente de piridoxina Development of an in vitro assay for the identification of compounds that inhibit reductase activity of hAASS, therapeutic target of pyridoxine dependent epilepsy LUCÍA CABANAS TREVIN TRABALLO DE FIN DE GRAO CURSO ACADÉMICO 2021-2022 2 ÍNDICE 1. RESUMEN ........................................................................................................................................ 4 2. PALABRAS CLAVE ............................................................................................................................. 4 3. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................... 6 3.1. Metabolismo degradativo de la L-lisina .................................................................................. 6 3.2. Etiopatogenia de la epilepsia dependiente de piridoxina ....................................................... 8 3.3. Diagnóstico de la epilepsia dependiente de piridoxina .......................................................... 8 3.4. Tratamiento actual para la epilepsia dependiente de piridoxina ........................................... 9 3.5. Alfa- Aminoadipato Semialdehído Sintetasa Humana (hAASS): diana terapéutica en el tratamiento de la epilepsia dependiente de piridoxina ...................................................................... 9 4. OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 10 5. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................................. 11 5.1. Clonaje de hAASS-myc-His6 (pEF/Myc-His A) ....................................................................... 11 5.2. Transformación y amplificación del plásmido pEF6/Myc-His A en bacterias competentes DH5α ………………………………………………………………………………………………………………………………………….12 5.3. Purificación del plásmido pEF6/hAASS-myc-His6 .................................................................. 12 5.4. Transfección de pEF6/hAASS-myc-His6 y expresión en células eucariotas HEK293T ........... 14 5.5. Lisis celular ............................................................................................................................ 15 5.6. Purificación de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 ................................................. 16 5.7. Electroforesis SDS-PAGE y tinción en gel .............................................................................. 17 5.8. Confirmación de la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 purificada y dializada mediante ensayo de absorbancia ...................................................................................................................... 18 5.9. Ensayo de luminiscencia para screening de compuestos ..................................................... 18 6. RESULTADOS.................................................................................................................................. 20 6.1. Cuantificación del plásmido PEF6/hAASS-myc-His6.............................................................. 20 6.2. Transformación, amplificación y purificación del plásmido pEF6/hAASS-myc-His6 ............. 20 6.3. Transfección química de pEF6/hAASS-myc-His6 y expresión en células HEK293T ............... 21 3 6.4. Lisis celular y purificación de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 ........................... 21 6.5. Confirmación de la presencia de hAASS-myc-His6 mediante electroforesis SDS-PAGE y tinción en gel ………………………………………………………………………………………………………………………………………….23 6.6. Validación de la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 purificada ................................ 24 6.6.1. Optimización del buffer de reacción y de la cantidad de enzima hAASS-myc-His6 ...... 24 6.6.2. Optimización del tiempo de incubación, determinación del efecto de la BSA en la mezcla de reacción y análisis de la estabilidad enzimática a ciclos de congelación-descongelación ………………………………………………………………………………………………………………………………….26 6.6.3. Optimización de la concentración de NADPH ............................................................... 27 6.6.4. Optimización de la concentración de L-lisina ................................................................ 28 6.7. Acople de un ensayo luminiscente al ensayo de actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 ………………………………………………………………………………………………………………………………………….29 6.8. Cálculo del parámetro estadístico de calidad Z’ del ensayo de actividad de hAASS-myc-His6 (luminiscencia) .................................................................................................................................. 33 7. DISCUSIÓN ..................................................................................................................................... 35 8. CONCLUSIONES ............................................................................................................................. 37 9. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................ 38 10. AGRADECIMIENTOS ....................................................................................................................... 40 4 1. RESUMEN La epilepsia dependiente de piridoxina (EDP) es una enfermedad rara producida por la mutación en el gen ALDH7A1 que codifica para la antiquitina (ATQ), una enzima que participa en el metabolismo degradativo de la L-lisina. El déficit de antiquitina produce una interrupción del catabolismo de dicho aminoácido, que se traduce en la acumulación de metabolitos tóxicos (responsables de la afectación cognitiva) y en el desequilibrio entre neurotransmisores inhibidores y excitadores (responsable de las crisis convulsivas). Las crisis convulsivas de esta enfermedad se consiguen tratar con piridoxina a dosis farmacológicas, sin embargo, hasta un 75% de los pacientes presentan problemas relacionados con el neurodesarrollo. Dado que los compuestos neurotóxicos acumulados son los productos formados por la alfa aminoadipato semialdehído sintetasa humana (hAASS), se ha desarrollado un ensayo de actividad reductasa in vitro con la finalidad de una posterior identificación de compuestos inhibidores. Para ello, a partir de un plásmido comercial clonado con el cDNA que codifica para la hAASS (previamente amplificado y purificado) se llevó a cabo la expresión de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 en células HEK293T mediante un proceso de transfección química y se purificó en su forma activa mediante cromatografía de afinidad a Ni2+ y diálisis. Finalmente, se validó la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 mediante el desarrollo y optimización de un ensayo de absorbancia (monitorización del consumo de Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato o NADPH), al que se acopló un ensayo de detección luminiscente para evitar interferencias de compuestos coloreados y aumentar la sensibilidad. 2. PALABRAS CLAVE Epilepsia dependiente de piridoxina, L-lisina, déficit cognitivo, hAASS, reductasa, inhibidores. ABSTRACT Pyridoxine dependent epilepsy (PDE) is a rare disease caused by the mutation in ALDH7A1 gene which encodes for antiquitin (ATQ), an enzyme that participates in L-lysine degradative metabolism. Antiquitin deficiency produces catabolism interruption of aforementioned aminoacid, which leads to 5 the accumulation of toxic metabolites (responsibles for cognitive affectation) and the imbalance between inhibitory and excitatory neurotransmitters (responsible for convulsive crisis). The convulsive crisis of this disease can be trated with pharmacologic doses of pyridoxine nevertheless, up to 75% of patients show problems related with neurodevelopment. Due to neurotoxic compounds accumulated are the products formed by human alpha aminoadipic semialdehyde synthase (hAASS), a reductase activity in vitro assay has been developed with the purpose of the later identification of inhibitor compounds. For this, a commercial plasmid was cloned with cDNA which codifies for hAASS (previously amplified and purified), the recombinant protein hAASS-myc-His6 was expressed in HEK293T cells by a chemical transfection and purified in its active form through affinity chromatography to Ni2+ and dialysis. Finally, hAASS-myc-His6 reductase activity was validated by development and optimization of an absorbance assay (monitorization of Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate or NADPH consumption), coupling a luminescent assay detection to avoid coloured compounds interferences and to increase sensitivity. KEY WORDS Pyridoxine dependent epilepsy, L-lysine, cognitive deficiency, hAASS, reductase, inhibitors. 6 3. INTRODUCCIÓN La epilepsia dependiente de piridoxina (EDP) es una enfermedad genética autosómica recesiva, producida por la mutación en el gen ALDH7A1 (5q31) que codifica para la α-aminoadípico semialdehído deshidrogenasa, también conocida como antiquitina (ATQ), que participa en el metabolismo degradativo de la L-lisina. Se trata de una enfermedad rara cuyos valores de prevalencia e incidencia no se conocen con exactitud (1,2); los datos más recientes estiman que la prevalencia se sitúa entre 1/20000 y 1/783000 nacidos vivos (1) y que la incidencia oscila entre 1/65000 y 1/250000 nacidos vivos. Según el Registro Internacional de la epilepsia dependiente de piridoxina, entre 2014 y 2021, se notificaron más de 130 casos de la enfermedad en todo el mundo (2). La EDP cursa con crisis convulsivas que responden a dosis altas de piridoxina, pero son refractarias al tratamiento anticonvulsivante habitual. Actualmente se distinguen dos tipos de EDP en función del momento de inicio de los síntomas (3): • Clásica: es la mayoritaria, se caracteriza por ser de aparición muy precoz, suele iniciarse en las primeras semanas o meses de vida y se manifiesta con convulsiones neonatales que pueden ir precedidas de un proceso de encefalopatía. Dichas convulsiones, refractarias al tratamiento antiepiléptico convencional, se consiguen tratar con piridoxina. • Atípica: presenta un inicio más tardío pudiendo aparecer incluso durante la adolescencia. Inicialmente responde al tratamiento antiepiléptico convencional, pero con el tiempo desarrolla resistencia al mismo. En ambos casos, la severidad de los síntomas está condicionada por la edad de inicio de estos y el retraso en el diagnóstico. Así pues, una aparición prematura de los síntomas se relaciona con un peor pronóstico de la enfermedad y un retraso en el diagnóstico con un mayor déficit cognitivo (3,4). 3.1. Metabolismo degradativo de la L-lisina La L-lisina presenta dos vías degradativas, la vía de la sacaropina y la vía del ácido pipecólico (PA) (Figura 1). La ruta de la sacaropina está mediada por la α-aminoadipato semialdehído sintetasa (AASS), que presenta dos centros catalíticos (la L-lisina cetoglutarato reductasa o LKR y la sacaropina deshidrogenasa o SDH) encargados de los dos primeros pasos degradativos de la L-lisina. El dominio LKR cataliza la condensación de la L-lisina con el cetoglutarato para formar sacaropina, que a través del dominio SDH forma el ácido 6-semialdehído 2-aminoadípico (AASA) y L-glutamato. La ruta del ácido 7 pipecólico no está totalmente caracterizada a nivel molecular, ya que no se conoce cuál es la enzima responsable de la transformación de la L-lisina en ácido 2-oxo-6-amino caproico, que se transforma espontáneamente en 1-piperidina-2-carboxilato (P2C). Este último, por acción de una enzima citosólica forma el ácido pipecólico (PA) que por medio de una peroxidasa es convertido a piperidina-6- carboxilato (P6C), la forma cíclica del AASA. Por lo tanto, ambas vías convergen en la formación de AASA y P6C, que se encuentran en equilibrio; y el AASA es metabolizado por la ATQ a α-ácido aminoadípico (AAA), que sufre una serie de reacciones metabólicas hasta formar el acetil-CoA capaz de entrar en el Ciclo de Krebs (5). Figura 1 Esquema de las rutas degradativas de la L-lisina en el organismo destacando la actividad biológica de las dos enzimas relacionadas con la EDP -la AASS como diana terapéutica (flecha verde) y la ATQ como enzima deficiente (flecha roja)-. Modificado de: (6). La ruta de la sacaropina se considera mayoritaria, incluso en el Sistema Nervioso Central (SNC) donde inicialmente se creía que era mayoritaria la ruta del PA. Esta creencia se debía a la imposibilidad de 8 detectar la sacaropina a este nivel, a una expresión inferior de la AASS en el SNC respecto a otros tejidos y a la presencia de niveles elevados de PA en las células del SNC. Actualmente, se ha demostrado que la sacaropina se convierte rápidamente en AASA impidiendo su detección a nivel del SNC y que el PA no solo se forma por la ruta del ácido pipecólico, sino también a través de la ruta de la sacaropina (6). En la epilepsia dependiente de piridoxina el déficit de ATQ, provoca la interrupción del metabolismo de la L-lisina a nivel del AASA y P6C, cuya acumulación junto a otros metabolitos es responsable de los principales signos y síntomas de la enfermedad (3). 3.2. Etiopatogenia de la epilepsia dependiente de piridoxina La mutación en el gen que codifica para la ATQ conlleva a la acumulación de AASA, P6C, L-glutamato y PA en el organismo. El P6C acumulado reacciona con el piridoxal 5’-fosfato (PLP) y lo inactiva, generando una depleción secundaria de PLP y un desequilibrio entre el GABA (neurotransmisor inhibidor) y el L-glutamato (neurotransmisor excitador), que se propone como el origen de las crisis convulsivas (3,7). No obstante, esto solo justifica la aparición de las convulsiones, no explica el origen de los problemas en el neurodesarrollo ni en la movilidad, que también están presentes en esta patología. Recientemente, los problemas cognitivos han sido relacionados con alteraciones en el metabolismo energético producidas por el déficit de ATQ y PLP. En este sentido, las rutas degradativas de la L-lisina dejan de generar acetil-CoA que es el principal sustrato del Ciclo de Krebs; y la disminución de la síntesis de GABA debido a la carencia de PLP se traduce en una disminución de los niveles de succinato, que está implicado en la homeostasis energética. Además, la reducción de los sustratos disponibles para la producción de energía genera, en último término, alteraciones en la cadena de transporte de electrones y muerte neuronal prematura, que se ha planteado como hipótesis de los problemas en el neurodesarrollo (8). 3.3. Diagnóstico de la epilepsia dependiente de piridoxina El diagnóstico de la epilepsia dependiente de piridoxina se basa en la determinación analítica de los metabolitos degradativos de la L-lisina (AASA y P6C) en sangre u orina. Dicha determinación se hace por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS), que permite hacer una cuantificación simultánea de los distintos compuestos. El principal inconveniente de esta técnica es 9 que no está disponible en todos los laboratorios y las muestras biológicas podrían dañarse en su transporte hasta el laboratorio de análisis. Sin embargo, las muestras secas de sangre y orina (más estables que las muestras convencionales) pueden ser la solución al problema (9). Recientemente se ha descrito un nuevo compuesto de origen desconocido que también podría ser útil como biomarcador, el 6-oxo-pipecolato. Este compuesto presenta la ventaja de ser estable a temperatura ambiente pero su sensibilidad y especificidad no se han podido demostrar (4). 3.4. Tratamiento actual para la epilepsia dependiente de piridoxina El tratamiento actual para la epilepsia dependiente de piridoxina se basa en la administración de piridoxina, en la restricción del aporte de lisina en la dieta y en la suplementación de arginina (“terapia triple”). La monoterapia con piridoxina, molécula que una vez en el organismo se transforma en PLP (su forma activa) (7), es efectiva para el tratamiento de las convulsiones, pero hasta un 75% de los pacientes con respuesta positiva al control de las convulsiones, presenta problemas cognitivos puesto que no se consiguen disminuir los niveles de P6C y AASA (compuestos neurotóxicos). En consecuencia, es necesario restringir el aporte dietético de L-lisina, mediante el empleo de fórmulas proteicas exentas de L-lisina, para disminuir la formación de P6C y AASA; y administrar suplementos de L-arginina que mediante un mecanismo competitivo impide el acceso de la L-lisina al SNC a través de los transportadores de aminoácidos catiónicos mCAT1 y mCAT3 (3,10). 3.5. Alfa- Aminoadipato Semialdehído Sintetasa Humana (hAASS): diana terapéutica en el tratamiento de la epilepsia dependiente de piridoxina La hAASS es la proteína responsable de las dos primeras etapas del catabolismo de la L-lisina; se expresa en numerosos tejidos del organismo, pero se encuentra mayoritariamente en el hígado y actúa a nivel mitocondrial (3). Se trata de una enzima bifuncional que presenta 926 aminoácidos, una estructura en α-hélice y cadena plegada β y dos dominios: el L-lisina α-cetoglutarato reductasa (LKR) en el extremo N-terminal y el dominio sacaropina deshidrogenasa (SDH) en el extremo C-terminal; ambos separados por un grupo de tres aminoácidos (452-455) (Figura 2) (11). 16 Para la cuantificación de la proteína se empleó el kit comercial DC Protein Assay (500-0111, BioRad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, este kit se basa en un método colorimétrico: se forman complejos entre el tartrato de cobre y las proteínas en un medio alcalino, que reducen el reactivo de Folin generando un color azulado que se detectó mediante espectrofotometría UV (λ=750 nm) en el lector de placas multipocillo Tecan INFINITE PRO M1000. El valor de absorbancia medio obtenido para la muestra se interpoló a partir de una recta de calibrado realizada previamente y se obtuvo la concentración proteica del lisado. 5.6. Purificación de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 Tras determinar la concentración proteica del lisado, se procedió a la purificación de la hAASS-myc- His6 mediante una cromatografía de afinidad en el equipo ÄKTA start (29022094, Cytiva) (Figura 6) empleando una columna de níquel HisTrapTM FF Crude de 1 mL (11000458, Cytiva). El flujo se ajustó a 1 mL/min y se monitorizó el proceso a 280 nm con el detector UV. Figura 6 Equipo ÄKTA start automatizado empleado en la purificación mediante cromatografía de afinidad a Ni2+ de la hAASS-myc-His6. En primer lugar, se descongeló el lisado, se filtró a través de un filtro de 0.22 µm y se diluyó 1:4 en el buffer de binding y equilibrado (Tris 25 mM, pH 8, NaCl 150 mM). La columna se equilibró con 5 17 volúmenes de buffer y a continuación se cargó la muestra (lisado). La fracción no retenida se almacenó a -80oC para análisis posteriores. Seguidamente se realizó un lavado con 15 volúmenes de buffer de equilibrado y una elución isocrática con 5 volúmenes de buffer de elución (Tris 25 mM, pH 8, NaCl 150 mM, imidazol 500 mM). El imidazol compite con los grupos histidina de la hAASS-myc-His6 y la desplaza de su unión a la columna, recolectándose las tres fracciones eluídas correspondientes al pico de absorbancia a 280 nm. Para la eliminación del imidazol y las sales se empleó el kit comercial de diálisis Pur-A-LyzerTM Maxi 12000 (PURX12015, Sigma-Aldrich), que consta de tubos de diálisis con una membrana de tamaño de poro de 12 kDa, que permitieron la salida de las sales y el imidazol al medio, pero retuvieron la proteína de interés. La muestra se dializó frente 1 L de PBS durante 24 h, a 4oC con agitación magnética sustituyéndose por PBS fresco cada 8 h. Finalmente, se cuantificó la proteína y se almacenó en alícuotas a -80oC para evitar ciclos congelación-descongelación. 5.7. Electroforesis SDS-PAGE y tinción en gel Para confirmar la presencia de la proteína hAASS-myc-His6 en la muestra, se realizó una electroforesis SDS-PAGE que separó a las proteínas en función de su peso molecular. Se analizó el lisado previo a la purificación por afinidad y las tres fracciones eluídas purificadas y dializadas. Brevemente, se tomó una alícuota de 20 µg de proteína de cada muestra y se les añadió el tampón de carga NuPAGETM LDS (4X) (NP0007, InvitrogenTM). Se calentaron a 95oC durante 5 minutos para facilitar la desnaturalización proteica y se microcentrifugaron durante 30 segundos. A continuación, se preparó el dispositivo de electroforesis Mini Gel Tank (A25977, ThermoFisher Scientific) empleando el gel comercial de 12 pocillos BoltTM 4-12%, Bis-Tris, 1.0 mm (NW04120BOX, InvitrogenTM) y buffer de electroforesis NuPAGETM MES SDS Running Buffer (1X) (NP0002, InvitrogenTM). Seguidamente, se cargaron las muestras y 10 µL del marcador de peso molecular PageRulerTM Prestained Protein Ladder (26616, Thermo Scientific) en sus respectivos pocillos y se corrió la electroforesis a 165 V durante 30 minutos. Una vez finalizada la electroforesis, se fijaron las proteínas del gel con una mezcla de ácido acético (10%) y metanol (40%) durante 15 minutos en agitación. A continuación, se realizaron 2 lavados con agua destilada durante 5 minutos, también en agitación. Finalmente, se descartó el agua destilada y se procedió a la tinción del gel con 20 mL de Quick Coomassie Stain (NB-45-0078, Neo Biotech) incubándolo a temperatura ambiente y en agitación hasta el día siguiente. Posteriormente, se lavó con agua ultrafiltrada para eliminar los restos del reactivo de tinción. 18 5.8. Confirmación de la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 purificada y dializada mediante ensayo de absorbancia La validación de la actividad enzimática de la proteína hAASS-myc-His6 se llevó a cabo mediante un ensayo de reducción monitorizando la variación de absorbancia en modo cinético (17,18). En la reacción se emplearon α-cetoglutarato y L-lisina como sustratos; y como cofactor se utilizó NADPH. El consumo de NADPH -y como consecuencia la disminución de absorbancia a λ=340 nmpermite determinar la presencia de enzima activa en la mezcla de reacción (Figura 7). Figura 7 Esquema de la reacción catalizada por el dominio LKR de la hAASS. En una placa transparente de 384 pocillos (781101, Greiner) se pipeteó el buffer de ensayo 50 mM HEPES, pH=7.35; a continuación, se añadió α-cetoglutarato a concentración final 4 mM, NADPH a concentración final 0.4 mM y la proteína hAASS-myc-His6 (5 µg). Finalmente se añadió L-lisina a una concentración final de 10 mM en un volumen final de reacción 50 µL. La lectura de la absorbancia se realizó en el lector Tecan INFINITE PRO M1000 a 340 nm durante 2 h a 37oC. 5.9. Ensayo de luminiscencia para screening de compuestos Para evitar las interferencias de compuestos coloreados y aumentar la sensibilidad del ensayo en el cribado de moléculas se implementó de forma adicional al ensayo de absorbancia un ensayo de luminiscencia; siendo necesario transferir el contenido de la placa multipocillo transparente a una placa multipocillo negra de fondo transparente (781096, Greiner) incubándola 20 minutos a temperatura ambiente. Para el ensayo de luminiscencia se empleó el kit NAD(P)H-GloTM Detection System (G9062, Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Este kit permite la detección luminiscente del NADPH 19 presente en una mezcla (Figura 8). Brevemente, se descongeló el kit a temperatura ambiente, se reconstituyó el liofilizado de luciferina con el buffer de reacción y se agitó por inversión hasta obtener una solución homogénea. A continuación, se preparó el reactivo de detección completo necesario para realizar una mezcla 1:1 con los volúmenes de muestra en los pocillos (50 µL) de la placa negra de fondo transparente (781096, Greiner). Para ello, se añadió el volumen correspondiente de reductasa (1:200) y de sustrato (1:200) al buffer de reacción. Figura 8 Esquema de la reacción fundamental del NAD(P)H-GloTM Detection System (19). Finalmente, se realizó la lectura cinética de la luminiscencia a temperatura ambiente durante una hora en el lector multipocillo HAMAMATSU. 20 6. RESULTADOS 6.1. Cuantificación del plásmido PEF6/hAASS-myc-His6 El plásmido cedido por el Duve Institute de Bruselas, fue cuantificado y se determinó su pureza en un NanoDropTM. La concentración obtenida fue de 0.9 µg/µL y los índices de pureza obtenidos: A260/A280= 1.88 y A260/A230= 2.06. El primero de ellos (1.7-2) fue indicativo de que la muestra está libre de contaminación proteica, así como de otros ácidos nucleicos y el segundo (>1.8) indicó que la concentración de sales, fenoles y carbohidratos en la muestra es baja. 6.2. Transformación, amplificación y purificación del plásmido pEF6/hAASS-myc-His6 Una vez transformadas las células competentes de Escherichia coli DH5-α (cepa K-12) por choque térmico, se sembraron en placas de agar LB-ampicilina (100 µg/mL), se incubaron a 37oC hasta el día siguiente y se obtuvieron colonias individuales y diferenciadas (Figura 9). Figura 9 Placa de agar-LB suplementada con ampicilina (100 µg/mL) donde se observan colonias individuales y diferenciadas de E.coli DH5-α transformadas con el vector de expresión pEF6/hAASS-myc-His6. Una de las colonias se inoculó en medio líquido LB-ampicilina (100 µg/mL) y se incubó durante 24 h a 37oC. Transcurrido ese tiempo se centrifugó el cultivo para sedimentar el pellet bacteriano y se purificó 21 el plásmido pEF6/hAASS-myc-His6. La concentración de DNA plasmídico obtenida fue de 4.37 µg/µL y los índices de pureza fueron: A260/A280= 1.91 y A260/A230= 2.02, resultando en unos parámetros adecuados para su posterior transfección en células eucariotas. 6.3. Transfección química de pEF6/hAASS-myc-His6 y expresión en células HEK293T Las células HEK293T con una confluencia próxima al 70% fueron transfectadas con el plásmido pEF6/hAASS-myc-His6 y se incubaron a 37oC y 5% de CO2 durante 48 h para la expresión proteica. En paralelo, las células HEK293T fueron transfectadas en condiciones similares con un plásmido de expresión de proteína de fluorescencia verde (pEF6/GFP-myc-His6) para comprobar la eficacia del proceso. Transcurridas 48 h se observó fluorescencia GFP en las células transfectadas con el vector de expresión fluorescente indicando que las condiciones de transfección en esta línea celular resultaron adecuadas (Figura 10). Figura 10 Imagen de microscopía de fluorescencia de células HEK293T transfectadas con el vector pEF6/GFP- myc-His6 expresando la proteína GFP. 6.4. Lisis celular y purificación de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 A continuación, las células transfectadas se recolectaron en PBS, se centrifugó la suspensión celular y se conservó el pellet a -80oC para su posterior lisis mediante choque térmico. La concentración proteica obtenida en el lisado celular fue de 2.75 µg/µL y la cantidad total de proteína fue de 110 mg (40 mL). 22 La purificación de la proteína hAASS-myc-His6 mediante cromatografía de afinidad se llevó a cabo en el equipo automatizado ÄKTA start utilizando una columna de níquel HisTrapTM FF Crude de 1 mL (diseñadas para la retención de proteínas con tags de His6). La elución isocrática se realizó con buffer Tris 25 mM, pH 8, NaCl 150 mM, imidazol 500 mM y se obtuvo un pico de absorbancia a 280 nm correspondiente a las fracciones eluídas 5, 6 y 7 como se puede observar en la figura 11. Figura 11 Cromatograma de afinidad obtenido a 280 nm durante la purificación de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 a partir de un lisado de células HEK293T transfectadas -se señala el pico de elución correspondiente a las fracciones 5, 6 y 7-. Las fracciones 5, 6 y 7 se sometieron a un proceso de diálisis durante 24 h frente a PBS para eliminar el exceso de sales e imidazol de la muestra eluída. Una vez dializada, se cuantificó la concentración proteica: 1.59 µg/µL, resultando en un total de 3.975 mg de hAASS-myc-His6 (2.5 mL de muestra). Además, se cuantificó la proteína en la fracción no retenida y se obtuvo una concentración de 0.72 µg/µL, 28.8 mg en 40 mL del no retenido. El rendimiento de la purificación fue de un 3.61%. 23 6.5. Confirmación de la presencia de hAASS-myc-His6 mediante electroforesis SDS-PAGE y tinción en gel Para confirmar la presencia de hAASS-myc-His6 en las fracciones dializadas se realizó una electroforesis SDS-PAGE. Se analizaron las siguientes muestras: el lisado transfectado y la proteína purificada y dializada (fracciones 5,6 y 7); y se cargó una alícuota de 20 µg de proteína de cada una de ellas. En los resultados obtenidos tras la tinción del gel durante 24 h se aprecia una banda proteica teñida entre los marcadores de peso molecular de 100 y 130 kDa que confirmó la presencia de la proteína de interés -peso molecular teórico de 112 kDa (17,18)- en las fracciones purificadas y dializadas (Figura 12). El resto de las bandas (40, 55 y 60 kDa) presentes en las fracciones analizadas podrían corresponderse con fragmentos procedentes de la proteólisis de la proteína hAASS-myc-His6 durante la lisis celular y su purificación o podría tratarse de otras proteínas copurificadas en el proceso. Figura 12 Gel de electroforesis SDS-PAGE teñido. La flecha señala la banda correspondiente a la hAASS-myc- His6 (112 kDa). 24 6.6. Validación de la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 purificada La hAASS es una enzima bifuncional con actividad L-lisina α-cetoglutarato reductasa (LKR) y sacaropina deshidrogenasa (SDH). La actividad enzimática de interés específico a validar fue la primera: una reacción de condensación reductiva del α-cetoglutarato con la L-lisina para la formación de sacaropina y agua, empleando el NADPH como cofactor (Figura 13). Figura 13 Esquema de la reacción catalizada por el dominio LKR de la hAASS. La confirmación de la actividad LKR de la proteína hAASS-myc-His6 se basó en el método descrito por Fjellstedt y Robinson (1975) y Hutzler y Dancis (1975). Se monitorizó la disminución de absorbancia a 340 nm (NADPH) en lectura cinética a 37oC en las distintas mezclas de reacción empleando un multilector Tecan PRO INFINITE M1000. En este sentido, se llevaron a cabo distintas optimizaciones para establecer las condiciones idóneas de la reacción enzimática. 6.6.1. Optimización del buffer de reacción y de la cantidad de enzima hAASS-myc-His6 Se ensayaron dos tampones de reacción: HEPES 50 mM (pH 7.35) y KH2PO4 25 mM (pH 7.5). El primero está descrito en la bibliografía (17,18) y se añadió con 4 mM α-cetoglutarato, 0.4 mM NADPH, 10 mM L-lisina y distintas cantidades de enzima (1.5, 2.5, 5 y 10 µg/pocillo); incubándose durante 15 minutos a 37oC. El buffer de KH2PO4 25 mM (pH 7.5) suplementado con 5 mM α-cetoglutarato, 0.25 mM NADPH y 10 mM L-lisina, fue propuesto por el laboratorio colaborador (Duve Institute, Bruselas) y se combinó con cantidades similares de hAASS-myc-His6; durante 30 minutos a 37oC. Los resultados obtenidos (Figuras 14 y 15) muestran que la hAASS-myc-His6 purificada fue activa, que la reacción transcurrió con mayor velocidad en HEPES 50 mM y que la disminución de la absorbancia es dependiente y proporcional a la cantidad de enzima purificada empleada. En base a esto, se seleccionó el HEPES 50 mM (pH 7.35) como buffer de reacción y las cantidades de 5 y 10 µg de enzima para continuar con las siguientes optimizaciones. 25 Figura 14 Resultados de la lectura de absorbancia del ensayo enzimático en buffer HEPES 50 mM empleando distintas cantidades de hAASS-myc-His6 por pocillo. Figura 15 Resultados de la lectura de absorbancia obtenidos en el ensayo enzimático en buffer KH2PO4 25 mM empleando distintas cantidades de hAASS-myc-His6 por pocillo. 32 Con la finalidad de aumentar la ventana de actividad de la hAASS-myc-His6 se disminuyó la concentración inicial de NADPH a 0.4 mM (concentración descrita bibliográficamente (17,18) y la concentración mínima a la que la proteína recombinante purificada demostró ser activa en nuestro laboratorio) para evitar la saturación de la señal luminiscente y se aumentó el tiempo de incubación a 2 h para disminuir el NADPH remanente en la mezcla enzimática (Figura 23). En estas condiciones se monitorizó la cinética de la señal de luminiscencia durante 1 h (Figura 24): la saturación no se alcanzó hasta superados los 10 minutos, durante ese tiempo se observó una ventana de señal considerable, así como una buena proporcionalidad y reproducibilidad entre los distintos replicados y condiciones ensayadas. Además, se determinó el cociente S/B a 5 (8.22) y a 10 minutos (3.11), empleándose como tiempos de referencia en la reacción. Figura 23 Resultados de la lectura de absorbancia en el ensayo de actividad reductasa en HEPES 50 mM, 0.4 mM NADPH, 5 µg de hAASS-myc-His6/pocillo y 10 mM de L-lisina a 37oC durante 2 h. 33 Figura 24 Resultados de la lectura en cinética de la señal de luminiscencia empleando el kit NAD(P)H-GloTM Detection System (izquierda) e imagen de la placa multipocillo adquirida a los 10 minutos de incubación, que muestra la diferencia de señal en presencia y ausencia (azul) de hAASS-myc-His6 purificada y dializada (derecha). 6.8. Cálculo del parámetro estadístico de calidad Z’ del ensayo de actividad de hAASS- myc-His6 (luminiscencia) El parámetro estadístico Z’ atiende a la variabilidad y dispersión de la señal en los replicados con valores máximos (ausencia de enzima) y en los replicados de valores mínimos (presencia de enzima y cantidades mínimas remanentes de NADPH), así como a la diferencia que existe entre dichos grupos de valores (rango de señal). Si Z’ se sitúa entre 0.5-1 indica una buena ventana experimental y una baja dispersión, resultando en un ensayo de screening reproducible y robusto (20). En este sentido, para el cálculo del parámetro Z’ se tomaron los valores de señal luminiscente a los 5 y 10 minutos de lectura cinética obteniéndose un valor de 0.776 y 0.664 respectivamente, lo que indica que el ensayo desarrollado en nuestro laboratorio presenta a ambos tiempos una reducida variabilidad y una robustez y calidad adecuadas para su empleo en un screening de alto rendimiento para la búsqueda de compuestos inhibidores de la hAASS-myc-His6 (Figuras 25 y 26). Finalmente, el tiempo de lectura de luminiscencia seleccionado para la realización del posterior cribado de moléculas fue de 5 minutos, atendiendo a su mayor Z’ y a su mayor ratio S/B -8.22 frente a 3.11 a los 10 minutos de lectura-. 34 Figura 25 Valores medios de luminiscencia (+/- desviación estándar o SD) a los 5 minutos de lectura cinética en los replicados con 5 µg de hAASS-myc-His6 (verde) y sin hAASS-myc-His6 (gris) empleados para el cálculo del parámetro Z’. Figura 26 Valores medios de luminiscencia (+/- SD) a los 10 minutos de lectura cinética en los replicados con 5 µg de hAASS-myc-His6 (verde) y sin hAASS-myc-His6 (gris) empleados para el cálculo del parámetro Z’. 35 Tabla 2 Tabla resumen de las condiciones de reacción óptimas para la hAASS-myc-His6 fijadas tras las optimizaciones realizadas mediante el ensayo de luminiscencia. Buffer HEPES 50 mM Concentración final NADPH 0.4 mM Cantidad hAASS-myc-His6 por pocillo 5 µg Concentración final de L-lisina 10 mM Temperatura 37oC Tiempo de incubación 2 h 7. DISCUSIÓN Los principales logros de este trabajo han sido la producción y purificación de la proteína recombinante hAASS-myc-His6 activa y el desarrollo de un ensayo de screening miniaturizado y de alto rendimiento de actividad reductasa para la identificación de compuestos inhibidores potencialmente útiles en el tratamiento de la epilepsia dependiente de piridoxina (6). Este estudio comenzó con la transformación del vector de expresión pEF6/Myc-His A, previamente clonado y cedido por el Duve Institute de Bruselas, en células bacterianas competentes E. coli DH5α. La transformación, amplificación y posterior purificación del vector permitieron obtener la cantidad necesaria y suficiente de DNA plasmídico para llevar a cabo transfecciones transitorias sistemáticas. Una vez purificado el plásmido se transfectaron células eucariotas HEK293T para la expresión de la proteína hAASS-myc-His6. En paralelo, se transfectó dicha línea celular en condiciones similares -ratio 1 (µg de DNA plasmídico): 2 (µL de reactivo de transfección)- empleando el plásmido pEF6/GFP-myc- His6 como control; a las 48 h de incubación la expresión de la proteína de fluorescencia verde (GFP) indicó que las condiciones de transfección utilizadas resultaron óptimas para una adecuada expresión proteica. La lisis celular se realizó por choque térmico y la purificación de la hAASS-myc-His6 fue llevada a cabo mediante cromatografía de afinidad, empleando columnas de Ni2+ a las que se unió el tag de hexahistidinas de la proteína recombinante. La purificación se monitorizó mediante un detector UV (λ= 280 nm) presente en el cromatógrafo, observándose un pico de absorbancia (fracciones 5, 6 y 7) compatible con el desplazamiento de la hAASS-myc-His6 de la columna provocado por el imidazol 36 presente en el buffer de elución. Además, con las alícuotas eluídas de la muestra se procedió a la realización de una electroforesis SDS-PAGE y tinción en gel que mostró una banda a 112 kDa -peso molecular teórico de la hAASS-myc-His6 (17,18)- confirmando la presencia de la proteína recombinante en las tres fracciones eluídas. Las bandas observadas a menor peso molecular (40, 55 y 60 kDa) podrían deberse a una fragmentación de la proteína recombinante durante el proceso de lisis y purificación o bien a una copurificación de proteínas ricas en histidina con afinidad a la columna de Ni2+. Para el desarrollo y validación del ensayo de actividad reductasa LKR se testaron las condiciones descritas en la bibliografía (17,18) y las propuestas por el laboratorio colaborador (Duve Institute, Bruselas) empleando distintas cantidades de hAASS-myc-His6. En este sentido, se observó una dependencia proporcional entre la disminución de la señal de absorbancia a 340 nm (NADPH) y la cantidad de enzima empleada, así como una mayor actividad enzimática en HEPES 50 mM -que se seleccionó como buffer de reacción-. Además, se estableció 1 h como tiempo óptimo de incubación, se comprobó la estabilidad de la proteína recombinante a ciclos de congelación-descongelación y se confirmó la disminución de actividad en presencia de BSA. Durante la optimización de la concentración de NADPH y L-lisina se comprobó que altas concentraciones de estos metabolitos producían una saturación de la señal de absorbancia, relacionada también con la inhibición sujeta a sustrato que la LKR ha mostrado en otras especies (21). Una vez validada la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 mediante absorbancia, se procedió a implementar un ensayo de luminiscencia que evitará interferencias de compuestos coloreados en el screening posterior a realizar y que posee además una mayor sensibilidad. Se establecieron como condiciones óptimas de la reacción inicial hAASS-myc-His6 las siguientes: buffer HEPES 50 mM, 4 mM α-cetoglutarato, 0.4 mM NADPH, 5 µg hAASS-myc-His6 por pocillo y 10 mM L-lisina; e incubación a 37oC durante 2 h. Finalmente, se calculó el parámetro estadístico de calidad Z’ obteniéndose un valor de 0.776 a los 5 minutos de lectura de la luminiscencia, resultado que indicó que el ensayo es lo suficientemente robusto y reproducible para su aplicación en un screening de compuestos inhibidores LKR de alto rendimiento. 37 8. CONCLUSIONES • Se ha conseguido expresar y purificar la proteína recombinante hAASS-mys-His6, que constituye la principal diana terapéutica para el tratamiento de la epilepsia dependiente de piridoxina, en su forma activa. • Se confirmó la actividad reductasa de la hAASS-myc-His6 mediante el desarrollo de un ensayo de absorbancia (λ= 340 nm) observándose una proporcionalidad directa entre la disminución de la señal específica (consumo de NADPH) y la cantidad de enzima empleada. Además, se acopló con éxito un ensayo de luminiscencia para reducir interferencias de compuestos coloreados y aumentar la sensibilidad en posteriores ensayos de screening de alto rendimiento. • Se constató la reproducibilidad y robustez del método experimental para la búsqueda de compuestos inhibidores LKR mediante el cálculo del parámetro estadístico de calidad Z’ (Z’= 0.776). 38 9. BIBLIOGRAFÍA 1. Orpha.net: Portal de información de enfermedades raras y medicamentos huérfanos [Internet]. París: Orphanet; 2000 [actualizado nov 2015; citado 23 May 2022]. Epilepsia dependiente de piridoxina. Disponible en: https://www.orpha.net/consor/cgibin/OC_Exp.php?Lng=ES&Expert=3006 2. PDE: Pyridoxine-Dependent Epilepsy [Internet]. [citado 23 May 2022]. Disponible en: https://www.pdeonline.org/ 3. Kaminiów K, Pająk M, Pająk R, Paprocka J. Pyridoxine-Dependent Epilepsy and Antiquitin Deficiency Resulting in Neonatal-Onset Refractory Seizures. Brain Sci. 2021 Dic;12(1):65. 4. 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Al Duve Institue de Bruselas por habernos cedido los vectores de expresión pEF6/hAASS-myc-His6 y pEF6/GFP-myc-His6. A mis padres por todo el apoyo y confianza que me han transmitido en todo momento, impidiendo que olvidara que con trabajo, esfuerzo y dedicación podría conseguir mi meta. A mi hermana Paula, mi mejor maestra en el día a día, capaz de sacarme una sonrisa siempre, incluso después de mis largas jornadas de estudio.