Desarrollo de nuevos métodos de microextracción en fase sólida para la determinación de contaminantes emergentes en matrices acuosas

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE QUÍMICA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Instituto de Investigaciones y Análisis Alimentarios DESARROLLO DE NUEVOS MÉTODOS DE MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES EMERGENTES EN MATRICES ACUOSAS María Polo Piñeiro Memoria para optar al grado de Doctora en Química Santiago de Compostela, Junio de 2007 D. Alberto Cepeda Sáez, Catedrático de Universidad y Director del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, Informa: Que Dña. María Polo Piñeiro ha realizado en este departamento, bajo la dirección de las Profesoras Titulares de Universidad Dña. María Llompart Vizoso y Dña. Carmen García Jares, el trabajo “Desarrollo de nuevos métodos de microextracción en fase sólida para la determinación de contaminantes orgánicos emergente en matrices acuosas”, que presenta para optar al grado de Doctora en Química. Y para que así conste, firmo el presente informe en Santiago de Compostela, a 18 Junio de 2007. D. Alberto Cepeda Sáez Dña. María Llompart Vizoso y Dña. Carmen García Jares, Profesoras Titulares de la Universidad del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, Autorizan: A la licenciada Dña. María Polo Piñeiro, la presentación de la memoria adjunta, titulada “Desarrollo de nuevos métodos de microextracción en fase sólida para la determinación de contaminantes orgánicos emergente en matrices acuosas”, que ha realizado bajo su dirección en el Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Química, para optar al grado de Doctora en Química. Y para que conste, firmamos la presente en Santiago de Compostela, a 18 Junio de 2007. Dña. María Llompart Vizoso Dña. Carmen García Jares AGRADECIMIENTOS La realización de la Tesis Doctoral posiblemente sea una de esas etapas únicas e irrepetibles que pueda vivir una persona, enriqueciéndola en todos los sentidos y en muchos casos encaminando su futuro profesional. Para mi lo ha sido y ahora que he llegado al final, es inevitable que eche la vista atrás para comprobar cuantas personas e instituciones han sido las que de algún modo u otro han colaborado en este trabajo. Así, desde estas páginas me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento a cada una de ellas. En primer lugar quiero dar las gracias a mis directoras, María Llompart y Carmen Jares, por el esfuerzo y la dedicación que les ha supuesto la supervisión de este trabajo. A ambas les agradezco sinceramente, no sólo el permitirme realizar esta Tesis bajo su dirección, sino también el darme su apoyo, compartir conmigo sus conocimientos y transmitirme su pasión por la investigación. Quisiera agradecer al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, al Instituto de Investigaciones y Análisis Alimentarios (IIAA), y en especial a Rafael Cela, el permitirme formar parte de su grupo de investigación y ofrecerme todos los medios técnicos y materiales para la realización de este trabajo. También agradezco la concesión de las becas que he disfrutado a lo largo de estos años a la Dirección Xeral de Investigación e Desenvolvemento de la Xunta de Galicia. Al doctor Jacob de Boer, y en especial al doctor Pim Leonards, por su acogida y atención durante los tres meses que pasé en el Institute for Fisheries Research (RIVO, Holanda). Dank u zeer. A todos mis compañeros del IIAA, tanto los que ya no están, como los que seguís dándole vida, por hacer que incluso los malos momentos fuesen tan divertidos. En especial a los que habéis trabajado codo con codo conmigo, por compartir vuestro esfuerzo y enseñarme que los objetivos alcanzados se disfrutan más si son compartidos. Por supuesto, a Carmen, mi compañera de fatigas, aventuras, de risas y tristezas. Por preocuparte de mi más que yo misma. Puedes estar segura que aunque nuestros barcos sigan rumbos diferentes, estaré siempre a tu lado. A mis tres mosqueteras, Fa, Noe y Laura, vivir con vosotras ha sido un verdadero placer. Sois más que mis amigas, sois mi familia. Y como no, a las niñas, Ana y Noe, ánimo que al final todo llega. Os quiero. Por último desde lo más profundo de mi corazón quiero agradecer a mi familia y amigos todo el amor, apoyo y comprensión que me han brindado. A mis padres, muy especialmente, quiero agradecerles el haberme dado oportunidades que ellos no tuvieron, y el apoyarme siempre aún sin entenderme. A mi madre por sacar fuerzas en los momentos más duros para salir adelante y disfrutar conmigo estos momentos. A Dani, agradecerle su cariño y apoyo incondicional, sin el cual no habría sido capaz de terminar este trabajo. A todos GRACIAS. María A A m mi is s p pa ad dr re es s “La imaginación es más importante que el conocimiento” “Si tu intención es describir la verdad, hazlo con sencillez y la elegancia déjasela al sastre” Albert Einstein, 1899-1955 Í ÍN ND DI IC CE E G GE EN NE ER RA AL L VI IV.2.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………. 183 IV.2.2.1. Identificación de los compuestos y optimización de las condiciones cromatográficas…………………………………………………………………………………… 183 IV.2.2.2. Optimización del proceso de microextracción…………………………………..… 184 IV.2.2.2.1. Diseño multifactorial categórico: Estudio del tipo de fibra, de la temperatura de extracción y del modo de muestreo………………………………………………………...…….. 184 IV.2.2.2.2. Evaluación de otros parámetros experimentales: Agitación, efecto salino y tiempo de extracción……………………………………………………………………………………………. 190 IV.2.2.3. Parámetros analíticos de calidad del método propuesto..……………………... 194 IV.2.2.3.1. Condiciones experimentales…..………………………………………………...…… 194 IV.2.2.3.2. Blanco de agua….…..………………………………………………………………… 194 IV.2.2.3.3. Linealidad…………………………………………………………………………….…. 196 IV.2.2.3.4. Precisión……..……………………………………………………………………..….. 196 IV.2.2.3.5. Sensibilidad………..…………………………………………………………...…..….. 197 IV.2.2.4 Análisis de muestras reales………………………………………………….……….. 198 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………….…. 200 IV.3. DETERMINACIÓN DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs) EN MUESTRAS DE AGUA…………………………………..…. 203 IV.3.1. PARTE EXPERIMENTAL……..……………………………………………………..…… 205 IV.3.1.1. Patrones y muestras…..……………………………………………………………...…. 205 IV.3.1.2. Procedimiento de microextracción en fase sólida………..………………………….. 206 IV.3.1.3. Condiciones instrumentales de medida…………..…………………………………… 207 IV.3.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………..….. 209 IV.3.2.1. Identificación de los compuestos y optimización de las condiciones cromatográficas…………………………………………………………………………………… 209 IV.3.2.2. Optimización del proceso de microextracción……………………………………. 211 IV.3.2.2.1. DISEÑO FACTORIAL: Estudio de la influencia del recubrimiento polimérico, del modo de muestreo, de la agitación y del efecto salino……………………………………….… 211 IV.3.2.2.2. Estudio del efecto de la temperatura de extracción y el volumen de las fases en la eficacia de la HSSPME de PBBs Y PBDEs……………………………………………………… 220 IV.3.2.2.3. Estudio del efecto memoria……………..……………………………………….…… 223 IV.3.2.2.4. Estudio cinético de la HSSPME de PBBs Y PBDEs……..……………………...… 224 IV.3.2.3. Validación del método propuesto………..………………………………………….. 225 Í ÍN ND DI IC CE E G GE EN NE ER RA AL L VII IV.3.2.3.1. Estudio de la linealidad, LODs y repetibilidad del método……...……………..….. 226 IV.3.2.3.2. Estudio de la recuperación. Aplicación a muestras reales………………………… 227 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………….…. 230 IV.4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN (Kfs) DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs)………….….. 233 IV.4.1. FUNDAMENTO TEÓRICO………..…………………………………………………..….. 235 IV.4.2. PARTE EXPERIMENTAL……..…………………………………………………….……. 238 IV.4.2.1. Patrones y muestras……..………………………………………………………….…… 238 IV.4.2.2. Procedimiento de microextracción en fase sólida……..….……………………….…. 238 IV.4.2.3. Condiciones instrumentales de medida………………...…………..…………………. 240 IV.4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………..…………….. 240 IV.4.3.1. Estudios preliminares de la SPME basados en la cuantificación mediante inyección líquida………………………………………………………………………………………………... 240 IV.4.3.2. Determinación de Kfs mediante depleción………..…………………………...……… 243 IV.4.3.3. Correlación entre log Kfs-log Kow……………..…………………………………...……. 252 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………….…. 254 IV.5. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS IGNIFUGOS FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES……………………………………………………………...……….. 257 IV.5.1. PARTE EXPERIMENTAL……………..………………………………………………….. 259 IV.5.1.1. Patrones y muestras…………..……………………………………………..………….. 259 IV.5.1.2. Procedimiento de microextracción en fase sólida……..……………….……………. 260 IV.5.1.3. Condiciones instrumentales de medida………………..…………………………..…. 261 IV.5.2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………..………………………………………..... 262 IV.5.2.1. Derivatización in situ de los BFRs fenólicos…………………..……………..…… 262 IV.5.2.2. Optimización del proceso de microextracción……………………………………. 266 IV.5.2.2.1. DISEÑO MULTI-FACTORIAL CATEGÓRICO: Estudio del tipo de fibra, de la temperatura de extracción y del modo de muestreo……………………………………………. 266 Í ÍN ND DI IC CE E G GE EN NE ER RA AL L VIII IV.5.2.2.2. EVALUACIÓN DE OTROS PARÁMETROS EXPERIMENTALES: Efecto salino, efecto del volumen de las fases, de la agitación y estudio cinético………………..…………. 274 IV.5.2.3. Características analíticas del método de acetilación-in situ-HSSPME propuesto …………………………...………………………………………………………………………….... 278 IV.5.2.3.1. Condiciones experimentales………..…………………………………………...…… 278 IV.5.2.3.2. Linealidad, precisión y LODs…………...………………………………………….…. 278 IV.5.2.3.3. Análisis de muestras reales………...………………………………………..……….. 281 IV.5.2.4. DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE LOS BFRs FENÓLICOS CON OTROS CONTAMINANTES FENÓLICOS……………………………………………………………..….. 282 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………..…… 287 V. CONCLUSIONES 289 VI.ANEXOS 299 VI.1. ACRÓNIMOS…………………………………………………………………………………. 301 VI.2. PUBLICACIONES……………………………………………………………………………. 305 Í ÍN ND DI IC CE E D DE E T TA AB BL LA AS S IX ÍNDICE DE TABLAS I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS II. INTRODUCCIÓN II.1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS……………………………………………………………………. 9 Tabla II.1.1.1.1. Nombre común y químico, estructuras y propiedades físico-químicas de las fragancias considerados en este trabajo………………………………………………………. 10 Tabla II.1.1.2.1. Volúmenes de consumo (en toneladas/año) de fragancias sintéticas en Europa…………………………………………………………………………………………...… 12 Tabla II.1.1.3.1.1. Concentraciones (en pg/mL) de HHCB, AHTN, ADBI, MX y MK en muestras de agua (superficiales y efluentes de EDAR) de diferente procedencia..…..….. 14 Tabla II.1.1.4.1. Toxicidad de las fragancias nitrogenadas en el medio acuático………… 16 Tabla II.1.1.4.2. Toxicidad de las fragancias policíclicas en el medio acuático…………… 17 II.2. PLASTIFICANTES: FTALATOS...................................................................................... 27 Tabla II.2.1.1.1. Nombre, acrónimo y grupos característicos de algunos ftalatos con aplicaciones industriales………………………..……………………………………………….. 28 Tabla II.2.1.1.2. Estructura y propiedades físico-químicas de los ftalatos objeto de estudio en este trabajo………………………………………………………………………………...….. 29 Tabla II.2.1.3. Concentraciones (en ng/mL) de los seis ftalatos estudiados encontradas en distintas muestras de agua……………………………………………………………………… 30 Tabla II.2.2.1.1 Concentraciones (en µg/L) de los ftalatos detectados en muestras de agua de uso común en el laboratorio…………………………………………………...…………….. 35 Tabla II.2.2.3. Métodos propuestos por la EPA para el análisis de ftalatos en diferentes muestras de agua………………………………………………………………………………… 41 II.3.COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS……………………………………………….…. 51 Tabla II.3.1.1.1. Nombre, nomenclatura según la IUPAC y estructura química de los PBDES y PBBs objeto de estudio………………………………………………………………….…….. 54 Tabla II.3.1.1.2. Nombre, presión de vapor (Po), solubilidad en agua (S), valor de la constante de Henry (H), coeficiente de partición octanol-agua (Kow) de los compuestos ignífugos fenólicos considerados………………………………………………………………. 55 Í ÍN ND DI IC CE E D DE E T TA AB BL LA AS S X Tabla II.3.1.2.1. Volúmenes de consumo estimados (en toneladas) de los principales compuestos ignífugos bromados (1999 y 2001)……………………………………..……….. 57 Tabla II.3.1.3.1 Concentraciones representativas de las diferentes familias de BFRs en el medioambiente……………………………………………………………………………………. 59 Tabla II.3.2.2.1. Características de las diferentes columnas capilares de alta resolución utilizadas por Sjödin et al………………………………………………………………………… 65 II.4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPME) COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA……………………………………………………………………………………. 66 Tabla II.4.3.1.1. Características de las fibras disponibles comercialmente por Supelco ®. 85 III. PARTE EXPERIMENTAL GENERAL Tabla III.2.2.1. Características, condiciones de trabajo y acondicionamiento, de las fibras utilizadas en los estudios de aplicación de SPME…………………………………………... 119 IV. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN IV.1. DETERMINACIÓN DE FRAGANCIAS SINTÉTICAS EN MUESTRAS ACUOSAS..… 123 Tabla IV.1.1.1.4.1. Condiciones de operación del GC-µECD utilizadas en la determinación de nitrofragancias en muestras acuosas………………………………………………….….. 128 Tabla IV.1.1.1.4.2. Condiciones instrumentales del GC-MS utilizadas en la determinación de nitrofragancias en muestras acuosas..……………………………………………………….. 128 Tabla IV.1.1.2.1. Tiempos de retención, ión de cuantificación e iones de identificación para las cuatro fragancias nitrogenadas…………………………………………………..……….. 130 Tabla IV.1.1.2.2.1. Valores de F y p para el análisis de varianza (ANOVA) y test de rango múltiple aplicados al estudio del recubrimiento de fibra……………………………………. 132 Tabla IV.1.1.2.2.2. Matriz de experiencias del diseño factorial fraccionado 3*2^4-2……. 134 Tabla IV.1.2.2.3. Respuestas analíticas (cuentas de área) obtenidas para cada compuesto en las 12 experiencias de que consta el diseño…………………………………………….. 135 Tabla IV.1.1.2.3.1 Condiciones experimentales del método de SPME propuesto para la determinación de nitrofragancias en muestras de agua………………………….………… 149 Tabla IV.1.1.2.3.2.1 Estudio de la linealidad………………………………………………… 140 Tabla IV.1.1.2.3.2.2 Límites de detección del método………………………………….….. 141 Tabla IV.1.1.2.3.2.3 Precisión del método…………………………………………………… 141 Tabla IV.1.1.2.3.5.1. Recuperaciones (%) del método propuesto para las tres muestras estudiadas……………………………………………………………………………………….. 142 Í ÍN ND DI IC CE E D DE E T TA AB BL LA AS S XI Tabla IV.1.1.2.3.5.2. Concentración (pg/mL) de las fragancias nitrogenadas encontradas en las muestras reales analizadas……………………………………………………………...… 143 Tabla IV.1.2.1.4.1. Condiciones de operación del GC-FID………………………………… 150 Tabla IV.1.2.1.4.2. Condiciones instrumentales del GC-MS………..…………..…….…… 151 Tabla IV.1.2.2.1. Tiempos de retención, ión de cuantificación e iones de identificación para las siete fragancias estudiadas…………………………………..…………………………… 153 Tabla IV.1.2.2.2.1.1. Matriz de experiencias del diseño factorial completo 4*3*2….…… 157 Tabla IV.1.2.2.2.1.2. Respuesta analítica (área de pico expresada en cuentas obtenida mediante GC-FID) de los siete compuestos estudiados…………………………..……….. 157 Tabla IV.1.2.2.2.1.3. Valores-p obtenidos en el análisis de varianza. En negrita aparecen los valores para los factores o interacciones estadísticamente significativos (p<0.05)…...… 159 Tabla IV.1.2.2.2.2. Valor de F y valor de p para el ANOVA aplicado al estudio del efecto salino……………………………………………………………………………………….…….. 165 Tabla IV.1.2.2.3.1. Condiciones experimentales del método de SPME propuesto para la determinación de seis fragancias policíclicas y una macrocíclica en muestras de agua.. 166 Tabla IV.1.2.2.3.2. Intervalo de concentraciones y coeficientes de correlación obtenidos en el estudio de la linealidad del método utilizando las fibras PDMS-DVB y CAR-PDMS…. 167 Tabla IV.1.2.2.3.3 Precisiones del método propuesto con ambas fibras para cada una de las fragancias estudiadas………………………………………………………………………….. 168 Tabla 1.2.2.3.4. Límites de detección obtenidos mediante HSSPME-GC-MS……….… 168 Tabla IV.1.2.2.4.1. Concentración (en pg/mL) de las fragancias encontradas en las muestras de efluente e influente…………………………………………………………………………. 169 Tabla IV.1.2.2.4.2 Concentraciones de las fragancias detectadas en la muestra de intercomparación (pg/mL): acalibrado externo y badición de estándar……………………. 170 Tabla IV.1.2.2.4.3 Resultados del ejercicio de intercomparación (muestra de efluente).. 171 Tabla IV.1.3.1. Concentración (pg/mL) de las fragancias detectadas en muestras reales empleando ambas fibras, CAR-PDMS y PDMS-DVB (*cuantificación por el método de adición)……………………………………………………………………………………..……. 173 IV.2. DETERMINACIÓN DE FTALATOS EN MUESTRAS DE AGUA…………………...….. 177 Tabla IV.2.1.4. Condiciones instrumentales del GC-MS……………………………..…….. 182 Tabla IV.2.2.1. Tiempos de retención, iones de cuantificación e iones de identificación para los seis ftalatos estudiados…………………………………………………………………….. 183 Tabla IV.2.2.2.1.1 Resultados del ANOVA para los seis ftalatos estudiados, mostrando la significación estadística de los factores principales y sus interacciones…………….…… 185 Í ÍN ND DI IC CE E D DE E T TA AB BL LA AS S XII Tabla IV.2.2.2.1.2. Condiciones optimas para cada compuesto dadas por el diseño factorial categórico 5*3*2………………………………………………………………………………… 189 Tabla IV.2.2.3.1. Condiciones experimentales del método de SPME propuesto para la determinación de ftalatos en muestras de agua…………………………………………….. 194 Tabla IV.2.2.3.2. Concentraciones en (pg/mL) de los ftalatos encontrados en las muestras de agua usadas como blancos en este estudio……..……………………………………… 195 Tabla IV.2.2.3.2. Intervalo de concentraciones y coeficientes de correlación obtenidos en el estudio de la linealidad del método…………………………………………………………… 196 Tabla IV.2.2.3.4 Precisión del método…………………………………….…………………. 196 Tabla IV.2.2.3.5 Límites de detección del método………………………………………….. 197 Tabla IV.2.2.6.1 Concentración (en pg/mL) de los ftalatos encontrados en las muestras reales estudiadas, obtenidas por calibrado externo……………………………...…………. 199 IV.3. DETERMINACIÓN DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs) EN MUESTRAS DE AGUA………………………………….….. 203 Tabla IV.3.1.3.1. Condiciones instrumentales empleadas en el análisis de PBDEs y PBBs ………………………………………………………………………………………………..…… 208 Tabla IV.3.1.3.2. Parámetros instrumentales específicos para cada compuesto del método de preparación de iones del método de MS-MS………………………………………..…… 208 Tabla IV.3.2.2.1.1. Matriz de experiencias del diseño factorial completo 2^4 generada por Statgraphics® Plus…………………………………………………………………………….... 214 Tabla IV.3.2.2.1.2. Condiciones óptimas para la extracción de PBDES y PBBs………... 220 Tabla IV.3.2.3.1 Condiciones experimentales del método propuesto para la determinación de PBBs y PBDEs en muestras de agua…………………………………………………….. 225 Tabla IV.3.2.3.1.1. Intervalos de concentración, coeficientes de correlación (R2) y límites de detección (LODs) obtenidos en el estudio de la linealidad del método……………….….. 226 Tabla IV.3.2.3.1.2 Repetibilidad del método propuesto……….……………….…………… 227 Tabla IV.3.2.3.2.1 Recuperación (expresada en %) de los PBDEs y PBBs para las tres muestras reales estudiadas……………………………………………………………………. 228 IV.4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN (Kfs) DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs)………..…… 233 Tabla IV.4.3.1.1. Sobrestimación de las eficacias de microextracción mediante calibrado por inyección directa……………………………………………………………………………..….. 241 Í ÍN ND DI IC CE E D DE E T TA AB BL LA AS S XIII Tabla V.4.3.2.2 Pendientes, coeficientes de regresión, eficacias de extracción y logaritmo de los valores de Kfs obtenidos en los experimentos de depleción a 100ºC………………... 246 Tabla V.4.3.2.3. Pendientes, coeficientes de regresión, eficacias de extracción y logaritmo de los valores de Kfs obtenidos en los experimentos de depleción a 25ºC………………. 251 Tabla V.4.3.2.4. Comparación del logaritmo de los valores de Kfs obtenidos para los PCBs en otros trabajos publicados y los obtenidos para los PBDEs y PBBs en el presente estudio …………………………………………………………………………………………………….. 251 IV.5. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS IGNIFUGOS FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES………………………………………………………………………. 257 Tabla IV.5.1.3. Condiciones instrumentales de GC-MS……………………………………. 262 Tabla IV.5.2.1 Tiempos de retención, iones de cuantificación e iones de identificación de los derivados acetilados de los compuestos bromados estudiados……………………..……. 263 Tabla IV.5.2.2.1.1. Resultados del ANOVA para los nueve compuestos fenólicos estudiados, mostrando la significación estadística de los factores principales y sus interacciones.… 267 Tabla IV.5.2.3.1. Condiciones experimentales del método de determinación de BFRs fenólicos en muestras de agua…………………………………………………………….….. 267 Tabla IV.5.2.3.2.1. Coeficientes de correlación y valores de F y p para el test de fallo de ajuste, obtenidos en el estudio de la linealidad del método de HSSPME para los BFRs fenólicos……………………………………………………………………………………….… 259 Tabla IV.5.2.3.2.2. Límites de detección obtenidos mediante acetilación-in situ-HSSPME- GC-MS para los BFRs fenólicos incluidos en este estudio……………………………….... 269 Tabla IV.5.2.3.2.3. Precisiones del método propuesto para la determinación de BFRs fenólicos………………………………………………………………………………………... 270 Tabla IV.5.2.6.1. Recuperaciones (en %) de los BFRs fenólicos en las muestras reales estudiadas……………………………………………………………………………………….. 271 Tabla IV.5.2.7.2. Concentraciones (en ng/mL) de los compuestos fenólicos encontrados en las muestras reales analizadas, calculadas mediante calibrado externo………….…….. 275 Í ÍN ND DI IC CE E D DE E F FI IG GU UR RA AS S XV ÍNDICE DE FIGURAS II. INTRODUCCIÓN II.1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS……………………………………………………………………. 9 Figura II.1.1.2.1. Uso (en porcentajes) de las fragancias por tipo de producto en la Unión Europea (UE)…………..…………………………………………………………………….…… 13 II.2. PLASTIFICANTES: FTALATOS...................................................................................... 27 Figura II.2.1.1. Estructura química del ácido ftálico y estructura general de un ftalato…. 27 II.3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS…………………………………………………. 51 Figura II.3.1.1.2. Estructura general de los PBDEs y los PBBs (x e y pueden tomar valores de 1 a 5)………………………………………………………………………………………...…. 52 Figura II.3.1.1.1. Estructura del TBBPA………………………………………………..……… 55 Figura II.3.1.2.1. Distribución (en %) de la aplicación de BFRs en diferentes productos de consumo……………………………………………………………………………………..……. 58 II.4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPME) COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA…………………………………………………………………………….……… 73 Figura II.4.1.1. Esquema del soporte de fibra……………………………………………..….. 75 Figura II.4.1.2. esquema de las etapas de extracción y deserción del proceso de microextracción……………………………………………………………………………...……. 76 Figura II.4.1.3.1. Modos de extracción: A) Extracción directa; B) Extracción en espacio de cabeza; C) Extracción con membrana de protección………………………………………… 77 Figura II.4.1.3.2. Posibles combinaciones de la SPME/derivatización………………..…… 79 Figura II.4.2.2.1. Efecto de la variación del tiempo de extracción en la cantidad de analito extraída………………………………………………………………………………………...….. 84 Figura II.4.3.1.1. Guía de selección de las fibras de SPME en función de las propiedades del analito……………………………………………………………………………….…………. 88 I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 3 DESARROLLO DE NUEVOS MÉTODOS DE MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE CONTAMINANTES ORGÁNICOS EMERGENTES EN MATRICES ACUOSAS I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Toda investigación científica surge para dar respuesta a problemas que afectan a la sociedad. En este sentido, la memoria de Tesis que se presenta intenta contribuir a la resolución de una de las problemáticas más importantes que se le plantean al hombre moderno, la contaminación del medio ambiente por sustancias químicas de origen antropogénico. Durante décadas de desarrollo científico y tecnológico, se liberaron al medio ambiente multitud de sustancias químicas, sin una evaluación previa de las posibles consecuencias ambientales y toxicológicas. La preocupación sobre los posibles efectos adversos de estos contaminantes, tanto por parte de la comunidad científica, como de la sociedad en general, surge a comienzos de la década de los 60 con el nacimiento de la conciencia ambiental1. Desde entonces, se han detectado en muestras ambientales un gran número de sustancias peligrosas para la salud humana y/o el medio ambiente. Este es el caso de los contaminantes orgánicos prioritarios (Priority Organic Pollutants, POPs), entre los que se incluyen los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), los bifenilos policlorados (PCBs), las dioxinas, los contaminantes fenólicos, especialmente los clorofenoles, o ciertos pesticidas. En base a estas investigaciones, el empleo de estos compuestos ha sido prohibido o restringido mediante la aplicación de diferentes legislaciones, tanto nacionales como internacionales, para reducir la exposición a los mismos. En los últimos años, sin embargo, están comenzando a ser estudiados otros grupos de contaminantes orgánicos que se consideraban inocuos o cuya toxicidad es menos conocida. Son los denominados contaminantes emergentes2. Dentro de este grupo de agentes se incluyen productos de uso diario, tales como detergentes, fármacos, productos para el cuidado y la higiene personal (Pharmaceutical and Personal Care Products, PPCPs), plásticos o compuestos ignífugos. La labor desempeñada por los químicos analíticos debe ir dirigida al desarrollo de métodos analíticos suficientemente sensibles y fiables para la detección y cuantificación de estos nuevos contaminantes ambientales en los distintos compartimentos medioambientales. I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 4 Teniendo en cuenta estas premisas, el objetivo principal de este trabajo de Tesis se centra en el desarrollo de metodología analítica para la determinación de varios grupos de compuestos químicos considerados contaminantes emergentes, entre los que se incluyen, las fragancias sintéticas, presentes en la formulación de productos de limpieza y cuidado personal, los ftalatos, utilizados como plastificantes en una inmensa variedad de productos, y los compuestos ignífugos bromados (Brominated Flame Retardants, BFRs), que presentan cierta similitud, en cuanto a su persistencia, con los PCBs o las dioxinas. La mayoría de estos compuestos se liberan directamente al medio acuático a través de las descargas de origen doméstico, así como otro tipo de efluentes industriales o urbanos, o por lixiviación de los materiales que los contienen3-6, por lo que la investigación se ha enfocado hacia muestras acuosas de interés ambiental, como son las aguas residuales urbanas e industriales, aguas continentales o aguas para consumo humano. Para el desarrollo de nuevos métodos se ha seleccionado la microextracción en fase sólida (SPME) como técnica analítica para la preparación de muestra, prestando especial interés a la optimización de los factores que afectan al proceso de microextracción. Para la optimización es muy útil el empleo de herramientas quimiométricas, en concreto, los diseños factoriales, que permiten obtener el óptimo experimental minimizando el tiempo y los recursos necesarios. La determinación final se ha llevado a cabo en la mayor parte de los casos mediante cromatografía de gases (GC) como técnica de separación, acoplada fundamentalmente a espectrometría de masas (MS y MS-MS), ya que se trata de una técnica muy adecuada para el análisis de muestras ambientales, debido a su sensibilidad y a las ventajas típicas derivadas de la obtención de espectros de masas de los compuestos. Mediante la utilización de estas herramientas analíticas y quimiométricas, se pretende obtener métodos de determinación sensible y con buena aplicabilidad al análisis de muestras reales pero a la vez rápidos y con la mínima generación de residuos. I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 5 BIBLIOGRAFÍA (1) R.L. Carson. Primavera silenciosa (1960). Ed. Crítica, Barcelona (2005). (2) C.G. Daughton, T.A. Ternes, Environ. Health Persp. 107 (1999) 907. (3) N. Paxeus, Wat. Res. 30 (1996) 1115. (4) G.G. Rimkus, B. Rimkus, M. Wolf, Chemosphere 28 (1999) 421. (5) R.A. Gimeno, R.M. Marcé, F. Borrull, Chromatographia 58 (2003) 37. (6) Y. Saito, M. Nojiri, M. Imaizumi, Y. Nakao, J. Chromatogr. A 975 (2002) 105. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 9 II.1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS II.1.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES II.1.1.1 DEFINICIÓN, ESTRUCTURA Y PROPIEDADES Las fragancias se pueden definir como mezclas complejas de distintos componentes químicos, que se emplean en la industria cosmética, en productos de limpieza y cuidado personal (PCPs), como jabones, cremas, detergentes, suavizantes y otros productos de uso doméstico. Su función es proporcionar al producto un aroma agradable y único, que permita al consumidor identificar un artículo determinado. Dentro de los componentes responsables del olor característico de una fragancia, se encuentran los compuestos aromáticos sintéticos o fragancias sintéticas, denominados genéricamente como musks según la nomenclatura inglesa1. Las fragancias sintéticas se pueden dividir en tres grandes grupos en función de su estructura química. Así, tenemos las fragancias sintéticas nitrogenadas (nitromusks), las fragancias sintéticas policíclicas (polycyclic musks) y fragancias sintéticas macrocíclicas (macrocyclic musks)2. La familia de las nitromusks está constituida por un grupo de cinco nitrobencenos con diferentes grupos alquilo, denominados según la nomenclatura inglesa como: musk ketone (MK), musk xylene (MX), musk tibetene (MT), musk ambrette (MA) y musk moskene (MM). Las fragancias sintéticas policíclicas son compuestos orgánicos derivados de la tetralina y el indano, sustituidos principalmente por grupos metilo. Los compuestos más representativos de este grupo son los conocidos por su nombre comercial: Galaxolide® (HHCB), Tonalide® (AHTN), Celestolide® (ADBI), Phantolide® (AHMI) y Traseolide® (ATII). Por último, las fragancias sintéticas macrocíclicas presentan estructuras parecidas a los compuestos aromáticos naturales. Se trata fundamentalmente de cetonas macrocíclicas, lactonas, y bis-lactonas, cuya producción es extremadamente costosa, y que se caracterizan, además, por tener una limitada estabilidad química. En este grupo se incluye los compuestos denominados como: Ambrettolide, Civetone, Musk T (etilenbrasilato), Musk R1 y Muscone (el almizcle natural). I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 10 Tabla II.1.1.1.1. Nombre común y químico, estructuras y propiedades físico-químicas de las fragancias considerados en este trabajo. *calculado teóricamente Nombre común (acrónimo) y químico Estructura S (mg/L) log Kow H (atm.L/mol) 9 Fragancias nitrogenadas Musk xylene (MX), 1-tert-butil-3,5-dimetil-2,4,6- ditrinitrobenceno NO2 O2N NO2 0.153 4.93 7.73x10-6 Musk ketone (MK), 3,5-dimetil-2,6-dinitro-1-tert-butil- acetilbenceno NO2 O2N O 0.464 4.34 1.90x10-6 Musk moskene (MM), 4,6-dinitro-1,1,3,3,5-pentametil lindano O2N NO2 0.0465 5.36 1.54x10-4 Musk tibetene (MT), 1-tert-butil-2,6-dinitro-2,4,5- trimetilbenceno NO2 O2N 0.0525 5.06 9.96x10-4 Fragancias policíclicas Celestolide®, 7-acetil-1,1-dimetil-6- tertbutildihidroindeno (ADBI) O 0.22* 5.47/5.4* 7.05x10-3 Phantolide®, 6-acetil-1,1,2,3,3,5- hexametildihidroindeno (AHDI) O 0.90* 4.9* 7.73x10-3 Traseolide®, 5-acetil-1,1,2,6-tetrametil-3-isopropil- dihidroindeno (ATII) O 0.30* 5.4* 1.94x10-2 Galaxolide®, 1,3,4,6,7,8-hexahidro-4,6,6,7,8,8- hexametilpentaciclo-(g)-2-benzopirano (HHCB) O 1.757/0.19* 5.38 7.56x10-4 Tonalide®, 7-acetil-1,1,3,4,4,6-hexametil-1,2,3,4- tetrahidronaftaleno (AHTN) O 1.257/0.36* 5.48 1.09x10-2 Cashmeran®, 1,2,3,5,6,7-hexahidro-1,1,2,3,3- pentametil-4,H-inden-4-ona (DPMI) O - - 1.42x10-1 Fragancias macrocíclicas Ambrettolide, (Z)-oxacicloheptadec-8-en-2-ona O O 0.59* 5.37* - I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 11 En la Tabla II.1.1.1 se recogen las estructuras y algunas propiedades físico-químicas, como la solubilidad en agua (S), el logaritmo de la constante de partición octanol-agua (log Kow) y la constante de Henry (H), para los compuestos incluidos en este estudio, de cada una de las familias. En general, podemos decir que las propiedades que se relacionan con estas sustancias son solubilidad en agua y volatilidad relativamente bajas y una alta solubilidad en disolventes orgánicos y tejidos grasos10. El carácter lipofílico se refleja en los coeficientes de partición octanol/agua (log Kow) que son relativamente altos. Estas propiedades indican una clara tendencia a la adsorción en la materia orgánica, características que determinan su alta persistencia una vez introducidos en los compartimentos del medio natural. Teniendo en cuenta los valores de la constante de Henry, las fragancias nitrogenadas se pueden considerar semivolátiles o poco volátiles, por lo que la dispersión de estos compuestos por volatilización es pequeña, permaneciendo más tiempo en la fase acuosa. Por otra parte, las fragancias nitrogenadas y policíclicas se caracterizan por presentar un potencial de biodegradación más bajo con respecto a la familia de las macrocíclicas. Sin embargo, se ha demostrado que son susceptibles a sufrir reacciones de biotransformación y fotodegración, ya que en diversos estudios se han identificado diferentes metabolitos de estos compuestos10,11. II.1.1.2. PRODUCCIÓN Y USOS Las fragancias naturales se usaron desde la antigüedad con fines medicinales y cosméticos; sin embargo, la producción a nivel industrial de las fragancias sintéticas se desarrolló a partir del siglo pasado, debido a la gran demanda existente en el mercado. La primera fragancia sintética (MX) fue sintetizada por primera vez por Baur en 188812. Más tarde, se sintetizaron otras fragancias nitrogenadas como, MK y MA, todos ellas productos de la nitración de compuestos aromáticos. Las fragancias policíclicas se introdujeron en el mercado en la segunda mitad del siglo XX. Su síntesis industrial es más cara que la de las fragancias nitrogenadas; no obstante, las han sustituido paulatinamente durante las últimas décadas debido a la toxicidad demostrada para algunas nitrofragancias. De hecho, en 1994 se prohibió específicamente el uso y producción de MA por sus demostrados efectos neurotóxicos y de fotosensibilización13. La I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 18 II.1.2. ANÁLISIS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES II.1.2.1 MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA II.1.2.1.1. Problemas de contaminación La contaminación durante el tratamiento de las muestras puede ser un problema en el análisis de estos compuestos en agua, ya que las fragancias sintéticas están presentes en multitud de productos de uso común. Sin embargo, esta contaminación puede minimizarse o incluso eliminarse, siguiendo una serie de precauciones durante el procesado de la muestra, como el uso de material de vidrio siguiendo un protocolo de lavado sin el uso de detergentes y secado a temperatura alta, el uso de guantes de nitrilo sin polvo y evitando la aplicación de productos cosméticos (cremas, perfumes) por parte del analista1,26,27,40,45. Además, debe tenerse especial cuidado en evitar la contaminación procedente del ambiente del laboratorio, mediante el almacenamiento del material y las muestras en una zona adecuada46. En cualquier caso, antes de comenzar un análisis deben chequearse los niveles de contaminación, mediante la realización de blancos del método. Normalmente, en el análisis de aguas, las muestras utilizadas como blancos son agua destilada1 o agua Milli-Q45. II.1.2.1.2. Conservación y pretratamiento de las muestras. Las muestras de agua para la determinación de fragancias sintéticas pueden conservarse refrigeradas a 4ºC y en ausencia de luz (botellas de vidrio ámbar), a su pH natural. El período máximo de almacenamiento suele ser de entre uno y cuatro días, para garantizar su estabilidad. En algunos casos, también se recomienda la adición de cierta cantidad de disolvente orgánico (0.2 % p/v)47, para evitar la adsorción de los compuestos en las paredes del material de vidrio. Además, antes de la extracción, las muestras que presentan un contenido alto de partículas sólidas en suspensión, deben filtrarse. Normalmente, se utilizan filtros de fibra de vidrio de entre 0.45 y 5.0 µm, sometidos a un tratamiento de limpieza previo19,47. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 19 II.1.2.1.3. Extracción Aunque se han propuesto procedimientos de extracción y preconcentración de fragancias sintéticas mediante la extracción líquido-líquido (LLE)26,27,45, el procedimiento más usado con muestras de agua es la extracción en fase sólida (SPE), tanto en el modo offline19,25,29,40,48 como en el modo on-line47, y mediante extracción con discos de membrana1,49. En algunos casos, se han propuesto métodos de extracción in-situ de la muestra acuosa29,40, como en efluentes de EDARs. Otras técnicas de extracción rápidas y adecuadas para el muestro de aguas son la microextracción en fase sólida (SPME)50,52. II.1.2.1.3.1 Extracción líquido-líquido (LLE) En general, las extracciones se realizan en discontinuo, con embudos de decantación, y utilizando un volumen de muestra grande27,45. Entre los disolventes empleados se encuentran, el tolueno, el ciclohexano o el pentano. Fromme et al51, propusieron un método de destilación y extracción simultánea (SDE, simultaneous steam-distillation/solvent extraction), el cual permite minimizar el volumen de disolvente utilizado. Además, utilizaron cloruro sódico para aumentar la eficacia de extracción. Una vez obtenido el extracto, se eliminan los restos de agua que pueda contener, en algunos casos, mediante congelación a -20ºC45 o con sulfato sódico anhídrido27,51, y finalmente se concentra. Normalmente no suele ser necesaria ninguna etapa de limpieza de los extractos (tanto de LLE como SPE). En el caso de ser necesaria, la limpieza con columnas de silica gel suele ser la opción seleccionada27,48. El uso de florisil no se recomienda, porque pueden producirse pérdidas debido a adsorciones irreversibles de las fragancias en el adsorbente. Los LODs más bajos obtenidos con esta técnica fueron de 3 y 1 pg/mL para HHCB y AHTN, respectivamente45. II.1.2.1.3.2 Extracción en fase sólida (SPE) Tal como se mencionó, la SPE es una de las técnicas de extracción más empleadas para el análisis en muestras de agua de fragancias sintéticas19,25,29,40,47,48. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 20 La ventaja que presenta esta técnica respecto a la LLE, es que se puede obtener un mayor nivel de concentración con el empleo de menos volumen de disolvente orgánico. Su limitación es el análisis de muestras con un alto contenido en sólidos, y que los volúmenes de muestra necesarios siguen siendo relativamente altos. En el caso de muestras complejas, el problema se soluciona mediante la filtración, analizando por separado la fase líquida y la fase sólida. Otra ventaja de la SPE, es que se puede usar tanto en modo discontinuo (off-line), como en modo continuo (on-line). En los métodos propuestos basados en SPE off-line, se necesitan volúmenes grandes de muestra (entre 200 y 2000 mL) 19,48. Se emplean tanto cartuchos disponibles comercialmente, como elaborados en el propio laboratorio, y los materiales adsorbentes más usados son, el octadecilsilano (C-18)19,47 y la fase polimérica basada en poliestireno-divinilbenceno (PS-DVB) 29,40,48. También se han aplicado otro tipo de fases como la resina XAD-2, aunque las recuperaciones obtenidas con este material son peores27. Los disolventes empleados para eluir las fragancias del cartucho son disolventes orgánicos, como hexano, metanol, diclorometano o mezclas de estos disolventes. Osenwengie y Steinberg40 han propuesto un método de SPE para el muestreo in-situ de efluentes, en el que la muestra es tomada directamente de la corriente de efluente durante 5 horas (45-85 L), a través de un sistema de filtrado, compuesto por lana de vidrio desactivada con un 5% de dimetildiclorosilano (DMDCS) y un filtro de 5 µm de tamaño de poro, y bombeada a través de un cartucho con 6 g de adsorbente Nexus®, en el que se combinan las fases poliméricas polimetilmetacrilato y PS-DVB (1:1)29,40. El cartucho es posteriormente tratado en el laboratorio donde se eluyen los compuestos y se concentra el eluato. Las recuperaciones obtenidas con este sistema fueron satisfactorias (90-97%). Otra opción para la monitorización in situ de las fragancias en medios acuosos, son los dispositivos de membrana semipermeable (SPMD), utilizados por Gatermann et al. en el muestreo de efluentes de EDAR y aguas superficiales (río) 39,41. Además de los cartuchos, se han empleado discos en la SPE de estos compuestos1,49. La ventaja que presentan los discos, es que el flujo de muestreo es mayor, y por tanto, se puede procesar más rápido un mayor volumen de muestra. Por otra parte, Enoch et al. han propuesto un método de SPE en modo contínuo47 para el análisis de MX y MK, acoplada a GC-ECD. El sistema esta compuesto por dos partes, una que controla la etapa de SPE (C-18), y otra que controla la transferencia de los compuestos al sistema cromatográfico mediante una serie de bucles. Además, son necesarios un gap de retención, funcionando a modo de inyector, y una precolumna, para retener los compuestos y eliminar el disolvente, antes de su evaporación hacia la columna cromatográfica. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 21 II.1.2.1.3.3 Microextracción en fase sólida (SPME) Hasta el momento, se han publicado muy pocas aplicaciones de la SPME al análisis de fragancias en muestras de agua. Sin embargo, éstas demuestran el potencial de la SPME para la determinación de este tipo de compuestos. Supone una alternativa muy interesante ya que se reduce el riesgo de contaminación durante el tratamiento de muestra, además de ser una técnica que no necesita el uso de disolventes orgánicos y requiere el empleo de poco volumen de muestra. Heberer et al.50 propusieron la primera aplicación de la SPME para la determinación en agua, tanto de fragancias policíclicas (HHCB, AHTN y ADBI), como la familia completa de fragancias nitrogenadas, empleando GC-MS para el análisis. El método propuesto consistió en el muestreo directo de 4 mL de muestra durante 40 minutos usando una fibra de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 µm, a temperatura ambiente y con agitación. No obstante, no se optimizó ninguno de estos parámetros, por lo que los LODs obtenidos (<10 ng/L) podrían ser mejores. Además el tiempo de análisis necesario resultó excesivamente largo (76 min). Por otra parte, Winkler et al.52 optimizaron diferentes parámetros de la SPME de cuatro fragancias (HHCB, AHTN, ADBI y MK), incluyendo el tipo de fibra, obteniendo las mayores respuestas con la fibra de PDMS-DVB. Sin embargo, no estudiaron la influencia de otros factores importantes, como el modo de muestreo (directo) o la temperatura de extracción (30ºC), pudiendo obtener mejores resultados muestreando el espacio de cabeza (HS) o aplicando otra temperatura. De hecho, la viabilidad de la extracción en el HS de las fragancias, tanto policíclicas como las nitrogenadas, consideradas compuestos poco volátiles por sus constantes de Henry, se confirma con al aplicación de la técnica de extracción CLSA (Closed Loop Stripping Analysis) propuesta recientemente por Mitjans y Ventura53. II.1.2.2. MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y DETECCIÓN La técnica híbrida cromatografía de gases - espectrometría de masas (GC-MS) es una de las técnicas de separación y detección más versátiles y utilizadas en el análisis de fragancias sintéticas en muestras ambientales, incluyendo muestras de agua20. El espectro de masas por EI (ionización electrónica) proporciona varios fragmentos de masas características, que pueden ser usados para la identificación de los compuestos y el análisis rutinario. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 22 Además, son adecuados como iones específicos en el modo SIM (Selected Ion Monitoring)22,43,49, por lo que, la técnica GC/EI/MS(SIM) permite la detección de las fragancias con un alto nivel de selectividad y sensibilidad. Para el análisis de trazas, se han aplicado diferentes sistemas espectrométricos, como el espectrómetro de masas de cuadrupolo19,27,40,43,48,49, sistemas de trampa de iones 22,41,51,52 y sistemas híbrido26. La técnica de espectrometría de masas en tandem (GC/MS/MS) con trampa de iones reduce considerablemente el ruido de fondo, y por tanto, se aumenta la sensibilidad y selectividad analíticas22. En general, las columnas de separación empleadas presentan recubrimientos de dimetilpolisiloxano modificado con diferentes proporciones de fenilmetilpolisiloxano (1 ó 5%), con dimensiones comprendidas entre 25-30 m de longitud x 0.22-0.35 mm de diámetro interno, lo que permite conseguir la separación con una buena resolución y un tiempo de análisis relativamente corto, en función del programa de temperaturas establecido. Ciertas fragancias como la HHCB, AHTN y ATII presentan diferentes diasteroisómeros, aunque su separación no es posible con columnas cromatográficas convencionales. En este caso sería necesario el uso de columnas quirales32. Debido a su estructura química, las fragancias policíclicas no pueden detectarse con suficiente sensibilidad con otros detectores selectivos, como el detector de captura electrónica (ECD) o el detector de nitrógeno y fósforo (NPD), a diferencia de las fragancias nitrogenadas que presentan una buena sensibilidad con estas técnicas44,47. Para la determinación simultánea de ambas familias de fragancias en agua, se han desarrollado distintos métodos con la MS como técnica de detección22,27,40,49,53. El principal inconveniente de estos métodos es la baja sensibilidad que presenta la ionización electrónica en la detección de las fragancias nitrogenadas. Rimkus y Wolf36 compararon los resultados obtenidos mediante GC/NCI/MS y mediante GC/EI/MS, llegando a la conclusión de que con la ionización química se obtenía una mayor sensibilidad para las fragancias nitrogenadas, ya que forman con facilidad iones negativos; por lo que, aunque esta técnica es menos sensible para las policíclicas, esta pérdida de sensibilidad se compensa debido a que se encuentran en unas concentraciones más altas. La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a detector fluorescente o ultravioleta, también se ha aplicado en la determinación de fragancias en muestras de agua, sin embargo en comparación con la técnica GC-MS, este método presenta una pobre eficacia en la separación y una sensibilidad moderada54. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 23 BIBLIOGRAFÍA (1) S.L. Simonich, W.M. Begley, G. Debaere, W.S. Eckhoff, Environ. Sci. Technol. 34 (2000) 954. (2) Fragrances 2000, draft for public hearing, Swedish Society for Nature Conservation, Foundations concerning criteria BRA MILJÖVAL, Estocolmo, 2000. (3) Risk Assessment Musk Xylene. European Union Risk Assessment Report. Final draft June 2003. (4) Risk Assessment Musk Ketone. European Union Risk Assessment Report. Final draft June 2003. (5) W. Schramm, A. Kaune, B. Beck, W. Thumm, A. Behechti, A. Kettrup, P. Nickolova, Wat. Res. 30 (1996) 2247. (6) Partition coefficient n-octanol/water of Galaxolide according to OECD Guideline No. 117. Givaudan Roure Corporate Safety and Environmental Affairs. Test report No. 93- E67, 1993. (7) F. Balk, R.A. Ford. Toxicology Letters 111 (1999b) 81. (8) Distribution behaviour of polycyclic musks in sewage treatment plants and in biota. Interpretation of data using free and total concentration measurements. E. Artola-Garciana. Tesis perteneciente al Institute for Risk Assessment Sciences IRA, Utrecht, Holanda, 2002. (9) L.I. Osemwengie, S. Steinberg, J. Chromatogr. A 993 (2003) 1. (10) R. Gaterman, H. Hühnerfuss, G. Rimkus, A. Attar, A. Kettrup, Chemosphere 36 (1998) 2535. (11) C.G. Daughton, T.A. Ternes, Environ. Health Persp. 107 (1999) 907. (12) A. Baur, Ver. Dtsch. Chem. Ges 24 (1891) 2832. (13) International Fragrance Association: Code and Standards, International Fragrance Association (IFRA), Ginebra, Suiza, 1994. (14) OSPAR Commission, OSPAR background document on musk xylene and other musks, ISBN 1-904426-36-0, 2004. (15) Letter of IFRA to SGCI for Swiss authorities (BUWAL) reporting on use volume survey, International Fragrance Association (IFRA), Ginebra, Suiza, 2002. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 24 (16) W.M.G.M. van Loon, M.E. Verwoerd, F.G. Wijnker, C.J. van Leeuwen, P. van Duyn, C. van de Guchte, J.M.L. Hermens, Environ. Toxicol. Chem. 16 (1997) 1358. (17) A. Rebmann, C. Wauschkuhn, W. Waizenegger. Bedeutung der Moschusduftstoffen im Wandel der Zeit. Dragoco Report 2/1998:48, 1998. (18) F. Balk, J. Blok, D. Salvito. Environmental risks of musk fragrance ingredients. En: American Chemical Society Symposium Series 791, Pharmaceutical and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. C.G. Daughton y T. Jones-Lepp. American Chemical Society, Washington DC, 2001. (19) N. Paxeus, Wat. Res. 30 (1996) 1115. (20) G.G. Rimkus, B. Rimkus, M. Wolf, Chemosphere 28 (1999) 421. (21) T. Yamagishi, T. Miyazaki, S. Horii, S. Kaneko, Bull. Environ. Contam. Toxicol. 26 (1981) 656. (22) H.-D. Eschke, J. Traus, H.-J. Dibowski, UWSF-Z. Umweltchem. Ökotox. 1. Mitteilung, 6 (1994) 183. 2. Mitteilung, 7 (1994) 131. (23) M. Winkler, G. Kopft, C. Hauptvogel, T. Neu, Chemosphere 37 (1998) 1139. (24) S.-J. Yun, T. Teraguchi, X.-M. Zhu, K. Iwashima, J. Environ. Chem 4 (1994) 325. (25) S.L. Simonich, T.M. Federle, W.S. Eckhoff, A. Rottiers, S. Webb, D. Sabaliunas, W. de Wolf , Environ. Sci. Technol. 36 (2002) 2839. (26) K. Bester, H. Hühnerfuss, W. Lange, G. G. Rimkus, N. Theobald, Wat. Res. 32 (1998) 1857. (27) A.M. Peck, K.C. Hornbuckle, Environ. Sci. Technol. 38 (2004) 367. (28) H. Hohenblum, R. Sattelberger, S. Scharf. Abwasser- und Klärschlammuntersuchungen in der Pilotkläranlage. Entsorgungsbetriebe Simmering. Umweltbundesamt Wien, ISBN 3-85457- 537-8, 2000. (29) L.I. Osemwengie, S.L. Gerstenberger. J. Environ. Monit. Published on the web of The Royal Society of Chemistry (2004). (30) E.J. van de Passche, F. Balk. Environmental risk assesment of the polycyclic musks AHTN and HHCB according to the EU-TGD. RIVM report no. 601 503 008. National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, Holanda, 1997. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 25 (31) T.A. Ternes, N. Herrmann, M. Bonerz, T. Knacker, H. Siegrist, A. Joss, Wat. Res. 38 (2004) 4075. (32) S. Franke, C. Meyer, N. Heinzel, R. Gatermann, H. Hühnerfuss, G. Rimkus, W.A. Koningg, W. Francke, Chirality 11 (1999) 795. (33) J.A. Pedersen, M. Soliman, I.H. Suffet, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 1625. (34) D. Herren, J.D. Berset, Chemosphere 40 (2000) 565. (35) H.U. Käfferlein, T.A. Göen, Crit. Rev. Toxicol. 28 (1998) 431. (36) G.G. Rimkus, M. Wolf, Chemosphere 30 (1995) 641-651. (37) J. Hajslova, P. Gregor, V. Chladkova, K. Alterova, Organohal. Comp. 39 (1998) 253. (38) R. Draisci, C. Marchiafava, E. Ferretti, L. Palleschi, G. Catellani, A. Anastasio, J. Chromatogr. A 814 (1998) 187. (39) R. Gatermann, J. Hellou, H. Hühnerfuss, G. Rimkus, V. Zitko, Chemosphere 38 (1999) 3431. (40) L.I. Osemwengie, S. Steinberg, J. Chromatogr. A 932 (2001) 107. (41) R. Gatermann, S. Biselli, H. Hühnerfuss, G.G Rimkus, M. Hecker, L. Karb, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 42 (2002) 437. (42) Draft background document concerning the elaboration of programmes and measures on musk xylene and other musks. OSPAR Commission, Bern-Ittigen, Suiza, 1999. (43) G.G. Rimkus, M. Wolf, Chemosphere 33 (1996) 2033. (44) G.G. Rimkus, W. Butte, H. Geyer, Chemosphere 35 (1997) 1497. (45) K. Bester, J. Environ. Monit. 7 (2005) 43. (46) R. Kallenborn, R. Gatermann, S. Planting, G.G. Rimkus, M. Lund, M. Schlabach, I.C. Burkow, J. Chromatogr. A 846 (1999) 295. (47) P. Enoch, A. Putzler, D. Rinner, J. Schlüter, J Chromatogr. A 822 (1998) 75. (48) I.J. Buerge, H.-R. Buser, M.D. Müller, T. Poiger, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 5636. (49) E. Verbruggen, Environ. Sci. Technol. 33 (1999) 801. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1. FRAGANCIAS SINTÉTICAS 26 (50) T. Heberer, S. Gramer, H.J. Stan, Acta Hydrochim. Hydrobiol. 27 (1999) 150. (51) H. Fromme, T. Otto, K. Pilz, Wat. Res. 35 (2001) 121. (52) M. Winkler, J.V. Headley, K.M. Peru, J. Chromatogr. A 903 (2000) 203. (53) D. Mitjans, F. Ventura, Water Sci. Technol. 52 (2005) 145. (54) W. Schüssler, L. Nitschke, Fresenius J. Anal. Chem. 361 (1998) 220. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 27 Ácido ftálico Estructura general de un ftalato O O O O R1 R2 O O O O H H Fi g ura II.2.1.1 II.2. PLASTIFICANTES: FTALATOS II.2.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES II.2.1.1. DEFINICIÓN, ESTRUCTURA Y PROPIEDADES Ftalato es el término genérico con el que se denomina a los ésteres o diésteres del ácido ftálico (ácido 1,2-bencenodicarboxílico). En la Figura II.2.1.1 se muestra la estructura química del ácido ftálico, así como la estructura general de un ftalato. Su síntesis industrial consiste en la esterificación del ácido ftálico con el correspondiente oxo alcohol en presencia de un ácido como catalizador. Se trata de un grupo muy amplio de compuestos, ya que hay una gran variedad de alcoholes que pueden reaccionar con el ácido ftálico para dar diferentes ftalatos, en los que sólo variará la cadena carbonada (R). Sin embargo, sólo alrededor de 60 tienen aplicaciones industriales (ver Tabla II.2.1.1.1) y, dentro de estos, sólo unos pocos se producen a gran escala, siendo el di (2-etilhexil) ftalato (DEHP) el de mayor volumen de producción a nivel mundial. Industrialmente, el término “iso” indica que se trata de una mezcla de isómeros y no se refiere al significado que se le da según la nomenclatura de la IUPAC. Además, con este término también se entiende que se trata de isómeros ramificados, mientras que el término “-n-” se utiliza con los isómeros lineales. Los compuestos de mayor peso molecular (excepto el DEHP) también son mezclas de isómeros, basadas en los alcoholes usados en su producción. Por ejemplo, el DNP se trata de una mezcla de esteres con cadenas de 8 a 10 carbonos, predominando los isómeros con 9 carbonos. En general, los ftalatos son compuestos estables, en estado líquido a temperatura ambiente, y con un ligero aroma. Presentan un rango muy amplio de propiedades físicoquímicas en función de su peso molecular. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 34 II.2.1.5. LEGISLACIÓN Los efectos adversos para la salud que presentan ciertos ftalatos, descritos en el apartado anterior, han provocado que la EU prohíba el uso de DBP, BBP, DEHP, DOP, DINP y DIDP en materiales plásticos para la fabricación de juguetes de bebé, ya que al introducir los juguetes en la boca, se pueden liberar estos aditivos disolviéndose en la saliva60.También se han propuesto diversas prohibiciones al uso de DEHP en material médico. En cuanto a los vertidos en el medio acuático, en 1998, la Convención para la Protección del Medioambiente Marino del Noroeste Atlántico propuso el objetivo de eliminar las emisiones de todas las sustancias peligrosas para el medioambiente para el año 2020, incluyendo al DBP y el DEHP en la lista de compuestos químicos para la acción prioritaria61. El DEHP también ha sido incluido en la llamada lista de sustancias prioritarias de la Directiva 2000/60/CE de la UE62. De acuerdo con la sección 307 de la Agencia Estadounidense para la Calidad del Agua (US Clean Water Act), los ftalatos, DEP, DMP, DEHP, BBP, DBP y DOP, deberían ser considerados contaminantes tóxicos prioritarios63. Como complemento a estas políticas, se han establecido unos niveles de concentraciones máximas permitidas en los distintos compartimentos medioambientales. A nivel internacional, la WHO ha establecido un valor límite de 8 µg/L para DEHP en aguas superficiales y de bebida64, que es próximo al nivel máximo admisible de contaminante (MCL) para este compuesto, establecido por la EPA (6 µg/L)65, aunque el objetivo debería ser la eliminación completa66. A nivel europeo, el Instituto Nacional Holandés de Salud Pública y Medioambiental (The Netherlands National Institute of Public Health and Environment) ha propuesto como niveles de riesgo ambiental (NRAs) en agua, 10 y 0.19 µg/L para DBP y para el DEHP, respectivamente. Estos niveles también se consideran como los valores NOEC en el medio acuático. Más recientemente, la Directiva comunitaria 2006/0129 (COD) establece como norma de calidad ambiental (NCA) el límite de 1.3 ng/mL de concentración media anual para en DEHP en aguas superficiales67. Respecto a la liberación de estos contaminantes a la atmósfera, en US, tres ftalatos (DMP, DBP and DEHP) se han incluido en la lista de contaminantes atmosféricos peligrosos emitida por la Agencia estadounidense de Calidad del Aire (US Clean Air Act)68. Además, la Administración estadounidense para la Salud y Seguridad Laboral (US Occupational Safety and Health Administration, OSHA), establece como límite de exposición medio (Time Weight Average, TWA), 5 mg/m3 para estos ftalatos69. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 35 II.2.2. ANÁLISIS EN MUESTRAS DE AGUA II.2.2.1. MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA II.2.2.1.1. Blancos de agua Uno de los problemas más importantes en el análisis de ftalatos en muestras de agua, es la detección de estos compuestos en las muestras usadas como blancos2,21,26,27,33,70-73. Los ftalatos se han detectado en todos los tipos de agua purificada que normalmente se utilizan en el laboratorio, como el agua destilada, el agua Milli-Q y aguas comerciales especiales para la determinación de compuestos orgánicos volátiles (VOCs)33. En la Tabla II.2.2.1.1 se recogen las concentraciones encontradas en este tipo de aguas en algunos estudios. Tabla II.2.2.1.1 Concentraciones (en µg/L) de los ftalatos detectados en muestras de agua de uso común en el laboratorio. Concentración (µg/L) Tipo de agua Ref. Método DMP DEP DBP BBP DEHP Desionizada 26 SPME-GC-ECD nd 0.04 0.15 0.005 0.49 Destilada 21 HPLC-GC-MS 0.005 0.002 Destilada 33 LLE-GC-FID 0.10 0.06 1.24 4.21 Milli-Q 72 On-line SPE-GC-MS 0.5 0.02 0.5 Purificada 27 LLE-GC-MS <0.01 0.29 1.58 0.02 1.06 Redestilada 33 LLE-GC-FID nd 0.14 3.28 0.93 Comercial para VOCs 33 LLE-GC-FID nd nd 10.58 nd II.2.2.1.2. Conservación y pretratamiento de las muestras Las muestras para la determinación de ftalatos pueden conservarse manteniendo la temperatura a 4ºC, tanto a pH natural como a pH ácido, aunque el período de almacenamiento no debería prolongarse más de cuatro días, por lo problemas de biodegradación que puedan sufrir. También se recomienda la adición de 500 mg de azida sódico por cada litro de muestra para la preservación química de los compuestos30,74. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 36 No se recomienda la conservación de muestras a pH básico17, ya que incluso refrigeradas, se ha comprobado que la mayoría de los compuestos sufren una disminución de hasta el 50%, después de 7 días de almacenamiento75. Antes de la extracción, algunas muestras deben filtrarse, sobre todo aquellas que contienen un alto nivel de partículas sólidas en suspensión. II.2.2.1.3. Extracción Los procedimientos de extracción y preconcentración de ftalatos más usados con muestras de agua, son la extracción líquido-líquido (LLE) y la extracción en fase sólida (SPE), de hecho ambas técnicas han sido propuestas en métodos oficiales (ver Tabla II.2.2.3). Además, en los últimos años, otra técnica relativamente nueva, la microextracción en fase sólida (SPME), está adquiriendo importancia en el análisis de estos compuestos. II.2.2.1.3.1 Extracción líquido-líquido (LLE) En la mayoría de las aplicaciones de la LLE para la determinación de ftalatos, las extracciones son realizadas en discontinuo con embudos de decantación y se emplean volúmenes de muestra grandes (entre 0.1 y 5 L)27,33,74-79. A menudo, las muestras se acidifican y se adiciona cloruro sódico para aumentar la eficacia de extracción. Los disolventes, diclorometano y hexano, son los más usados. Una vez obtenido el extracto, se eliminan los restos de agua que pueda contener con sulfato sódico anhídrido y finalmente se concentra. Los extractos se suelen inyectar sin ningún tipo de limpieza. Sin embargo, el nivel de concentración al que se puede aplicar, esta limitado por la presencia de contaminación a niveles traza en los disolventes empleados, y limites de detección inferiores a 0.1 µg/L no son fiables empleando esta técnica30. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 37 II.2.2.1.3.2 Extracción en fase sólida (SPE) La SPE se ha aplicado a la determinación de ftalatos en diferentes tipos de muestras acuosas21,24,28,71-75,80-84. La ventaja que presenta esta técnica respecto a la LLE, es que se puede obtener un mayor nivel de concentración con el uso de muy poco o ningún disolvente, y por tanto, se evita la contaminación introducida por éste. Su limitación es el análisis de muestras con un alto contenido en sólidos o muy contaminadas30. Los materiales adsorbentes más usados son, C-18 y la fase polimérica basada en poliestireno-divinilbenceno (PS-DVB). En un estudio reciente, se ha aplicado una nueva base polimérica, Oasis, aunque las recuperaciones obtenidas son más bajas que con C-1871. La SPE se puede usar tanto en modo discontínuo (off-line), como en modo continuo (on-line). En la SPE off-line, se emplean grandes volúmenes de muestra (entre 250 y 1000 mL). Para mejorar la eficacia de extracción, normalmente se añade una cierta cantidad de disolvente orgánico (metanol o acetonitrilo, miscibles con la agua) a la muestra. La mayoría de los cartuchos empleados son de polietileno o de polipropileno, por tanto existe un potencial nivel de contaminación de ftalatos. En estos casos, es más conveniente el uso de tubos de vidrio para elaborar el cartucho. Antes de la elución, los cartuchos se suelen secar con corriente de nitrógeno. Los disolventes empleados para eluir los ftalatos del cartucho son disolventes orgánicos, como el etilacetato, metanol, acetonitrilo o mezclas de disolventes. El eluato obtenido se concentra y, normalmente, se analiza sin ningún otro tratamiento, aunque, en el caso de muestras muy contaminadas se puede incluir un paso de limpieza con alúmina activada74,75. Una alternativa al uso de cartucho de SPE, son las membranas o discos75,83. La ventaja que presentan las membranas, es que el flujo de muestro es mayor, y por tanto, se puede procesar más rápido un mayor volumen de muestra. Esta técnica ya ha sido aplicada al análisis de ftalatos en agua75, y se ha incluido como opción en el método oficial de la EPA 8061 (ver Tabla II.2.2.3). En el caso de la SPE-on line, la muestra se bombea a través de una pre-columna rellena de pequeñas partículas (15-25 µm) de C-1821 o PS-DVB72,73 como medio adsorbente. Se han desarrollado diferentes interfases con este propósito. Por ejemplo, Hyötyläinen et al.21, han desarrollado una interfase que consiste en una cámara de vaporización donde se encuentra la precolumna y el disolvente se inyecta directamente en split en estado gaseoso. Brossa et al.72 incluyeron seis ftalatos en la determinación de diferentes disruptores endocrinos y desarrollaron un método automático SPE-GC-MS. La interfase es un vaporizador de temperatura programada (PTV) cuyo liner o inserto esta relleno con Tenax. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 38 La combinación de la SPE con GC-MS es una de las alternativas más comunes para este tipo de análisis y algunos métodos oficiales se basan en esta combinación (Tabla II.2.2.3). II.2.2.1.3.3. Microextracción en fase sólida (SPME) Existen diversas aplicaciones de la SPME al análisis de ftalatos en muestras de agua2,25,26,29,70,85-87. Supone una alternativa muy interesante ya que se reduce el riesgo de contaminación durante el tratamiento de muestra. Además, al ser una técnica que no necesita el uso de disolventes orgánicos, se pueden reducir los niveles de contaminación de fondo y obtener mejores LODs. El principal problema que presenta son los niveles de contaminación encontrados en el agua purificada empleada (ver Tabla II.2.2.1.1), en concreto, para DBP y DEHP. La mayoría de los autores lo que hacen es tener en cuenta el nivel de los blancos en su calibrado y en la estimación de los LODs. Una de las primeras aplicaciones de la SPME fue el desarrollo de un método para la determinación de DEP en agua, empleando LC-UV para el análisis87. En el desarrollo, se optimizaron diferentes parámetros de la SPME, como el tipo de fibra. CW-TRP y PDMS-DVB fueron las fibras con las que se obtuvieron mejores resultados. El método propuesto consistió en el muestro directo de las muestras a temperatura ambiente con adición al 25% (peso/volumen) de cloruro sódico. Se comprobó el rango lineal entre 5 y 50 ng/mL con un LOD de 1 ng/mL. La SPME acoplada a la LC también se aplicó en la determinación de DPP, DIBP y DCHP usando en este caso la fibra CW-DVB en el modo de desorción dinámica84. En este caso, se obtuvieron LODs entre 4 y 9.5 ng/mL. Con la técnica SPME acoplada a GC-MS, se pueden obtener LODs más bajos (del orden de ng/L). Peñalver et al25,86 estudiaron la SPME de seis ftalatos en agua. En el primer estudio, desarrollaron un método basado en la fibra de PA, mientras que el segundo, compararon las respuestas obtenidas con cinco fibras comerciales (PDMS, PDMS-DVB, PA y CW-DVB). Las condiciones finales de extracción a las que llegaron fueron: fibra de PDMSDVB, temperatura de extracción 80ºC, 30 min de extracción y desorción a 250ºC (de 3 a 5 min). Luks-Betlej et al.2 también estudiaron la extracción de los ftalatos usando diferentes fibras comerciales (100 y 7 µm PDMS, PDMS-DVB (StableFlex), PA, CW-DVB (StableFlex), DVB-Carboxen-PDMS (StableFlex). Las que proporcionaron mayores eficacias de extracción, fueron las fibras con fase DVB. En cuanto a la repetibilidad, la fibra de CW-DVB es la recomendada por estos autores. El método propuesto, consistió en la extracción a 25ºC I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 39 durante 60 min y desorción a 270ºC (5 min). En estos estudios, se detectaron algunos analitos en los blancos, por lo que, las respuestas obtenidas en ellos, se consideraron en el establecimiento de los LODs. Recientemente, se ha publicado un método de cribado para el análisis de 16 PAHs, 6 PCBs y 6 ftalatos, utilizando un diseño experimental (multisimplex) para la optimización de la SPME70. Debido a los problemas de contaminación, los LOD para algunos ftalatos, como el DEHP (3.15 µg/L), fueron bastante altos. Los ftalatos también se han determinado por SPME-GC usando un detector de captura electrónica (ECD)26. En los últimos años, también se han desarrollado otras técnicas miniaturizadas de preparación de muestra, como la microextracción en fase líquida (LPME)88, la cual presenta resultados comparables a la SPME para el análisis de ftalatos en agua. Otra técnica similar, está basada en el uso de fibras polímericas sintéticas compuestas por cientos de microfibrillas29. Este sistema se acopló on-line con un micro-LC, instalándolo como un bucle en la válvula de inyección, lo que permitió no sólo minimizar el consumo de disolvente sino mejorar los LOQs al mejorar las eficacias de extracción. II.2.2.2. MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y DETECCIÓN Aunque se han publicado algunas aplicaciones de técnicas electroforéticas para la separación de ftalatos88,89, la cromatografía de gases (GC) y la cromatografía liquida (LC) son las técnicas normalmente empleadas en el análisis de muestras acuosas. Los ftalatos son suficientemente volátiles y estables térmicamente para poder analizarse por GC. Entre los detectores que se han acoplado a la GC, se encuentran el detector de infrarrojo (IR)25y el de captura electrónica (ECD)26,75,83. Este último está propuesto en los métodos de la EPA 606 y 8060 (ver Tabla II.2.2.3). El detector de ionización de llama (FID)24,33, también se aplicó al análisis de muestras ambientales, aunque hoy en día sólo se emplea para muestras que presenten una concentración alta de los compuestos (juguetes, plásticos). En la actualidad, los métodos que se proponen, se basan en la técnica de GC con espectrometría de masas (MS) en el modo de ionización electrónica (EI)1,2,27,70-74,78,79,86,88. Los ftalatos fragmentan con iones característicos, tales como, m/z =149 (DEP, DBP, BBP, DEHP, DIBP), m/z =163 (DMP) y m/z = 293 (DINP, DIDP), lo que permite, una detección muy sensible I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 40 y específica, en concreto cuando se trabaja en el modo de monitorización de un ión seleccionado (SIM). También se pueden aplicar el modo de ionización química negativa (NCI)77 y la espectrometría de masas en tandem (MS-MS)77. En cuanto a los analizadores de masas, normalmente se utilizan los espectrómetros de baja resolución, y tanto el cuadrupolo como la trampa de iones, son las configuraciones empleadas como detectores. Las columnas de separación normalmente presentan unas medidas comprendidas entre 25-30 m de longitud x 0.25-0.32 mm de diámetro interno, revestidas con fenilmetilpolisiloxano o dimetilpolisiloxano como fases estacionarias, las cuales permiten programar las separaciones con un rango de temperaturas muy amplio. Un programa típico iría de 50ºC a 300ºC con una rampa de 10ºC/min, obteniendo una buena resolución con un tiempo de análisis relativamente corto. Sin embargo, no es posible la separación cromatográfica de todos los isómeros, por tanto, para separaciones complejas debe usarse detección selectiva de masas. Además de los ftalatos, el análisis de sus metabolitos resulta de especial interés, sobre todo, el análisis de los monoésteres, teniendo en cuenta su potencial toxicidad. Los monoésteres presenta un grupo carboxílico, que normalmente se derivatiza para mejorar su análisis cromatográfico. Se han empleado diferentes reacciones de derivatización para este fin como la metil-esterificación33 o la sililación27,82. La LC también se ha utilizado en la determinación de ftalatos de muestras acuosas mediante absorción ultravioleta como sistema de detección (UV)29,33,76,84,85,87. En las aplicaciones más recientes, también se ha empleado la MS como técnica de detección28, aunque éstas se centran más en el análisis de muestras biológicas. Con esta técnica se han propuestos diversos métodos para la evaluación de la exposición de la población a los ftalatos mediante el análisis de sus metabolitos89-91. En general, la LC-MS es menos sensible que GCMS, pero puede presentar una serie de ventajas respecto a esta, como una mayor selectividad, información respecto al peso molecular de mezclas isoméricas, procedimientos de limpieza más simples y tiempos de análisis más cortos30. Las columnas cromatográficas que se emplean suelen ser de fase reversa, y se han descrito métodos con ambos modos de elución, isocrático y en gradiente. II.2.2.3. MÉTODOS OFICIALES La EPA ha publicado numerosos procedimientos analíticos enfocados a la determinación de ftalatos en distintos tipos de muestras acuosas, como los métodos 50694 y 52595 para su determinación en muestras de agua de bebida, los métodos 60696, 62597 y I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 41 162598en aguas residuales urbanas e industriales, y los métodos 806199, 8270100 y 8410101 para aguas subterráneas y de escorrentía, además de suelos, lodos y sedimentos. En la Tabla II.2.2.3 se resume la información básica de estos procedimientos analíticos. Tabla II.2.2.3. Métodos propuestos por la EPA para el análisis de ftalatos en diferentes muestras de agua. Método (Tipo de muestra y compuestos) Muestro, Conservación y Pretratamiento Extracción Limpieza Método de detección LLE en embudo de decantación (3 x 60 mL DCM, 40 mL hexano) Discos de SPE C18 (elusión: 5 mL acetonitrilo y 10 mL DCM) EPA 506 1.1 (Agua de bebida DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DOP) 1L botellas cristal ámbar, ≤4ºC, en ausencia de luz para la decloración: 80 mg/L de Na2S2O3 Cartuchos de SPE C18 ( elusión: 10 mL de DCM) Florisil y/o alumina GC-FID Cartuchos de SPE C18 (5 mL EtAc y 5 mL DCM) EPA 525.2 (Agua de bebida DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP) Igual que EPA 506 1.1, 40-50 mg/L de Na2SO3; pH< 2 (HCl) 5 mL/L muestra de MeOH Discos de SPE C18 (5 mL EtAc; 5 mL DCM y 3 mL EtAc:DCM (1:1)) no GC-MSD EPA 606 (Agua residual urbana e industrial DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DOP) 1L botellas cristal ámbar, ≤4ºC LLE en embudo de decantación (3 x 60 mL de DCM) Florisil y/o alumina PGC-ECD LLE en embudo de decantación (3 x 60 mL de DCM, por 1 L de muestra) EPA 625 (Agua residual urbana e industrial DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DOP) Igual que EPA 506 1.1, pH>11 (NaOH) LLE en continuo (200-500 mL de DCM, 24 h) no PGC-MSD EPA 1625.2 (Efluentes industriales y urbanos DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DOP) Igual que EPA 625, pH>12-13 (NaOH) LLE en continuo (200-300 mL de DCM, 18-24 h) no GC-MSD LLE en embudo de decantación (EPA 3510C)(3 x 60 mL de DCM) EPA 8061A (Aguas subterráneas y de escorrentía DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DOP, DBEP, DEEP, DMEP, DAMP, DCHP,DHP, DIHP, DIBP, DNP, HEHP) 4 x 1 L botellas cristal ámbar; ≤4ºC; para la decloración: 3 mL/gal 10% tiosulfato sódico, pH 5-7 (H2SO4 o NaOH) Disco de SPE de C18 (5 mLacetona y 15 mL acetonitrilo). Alumina; florisil GC-ECD LLE embudo de decantación (3 x 60 mL DCM) Igual que EPA 8061A, pH <2 (HCl), pH>11 (NaOH) LLE en continuo (300-500 mL DCM (18-24h)) EPA 8270D (Aguas subterráneas y de escorrentía DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DOP) pH=5-7 (H2SO4 o NaOH) Disco de SPE de C18 (5 mL acetona, 15 mL acetonitrilo). Alumina; florisil GC-MS LLE embudo de decantación (3 x 60 mL DCM) no GC-FTIR EPA 8410 (Aguas subterráneas y de escorrentía DMP, DEP, DPP, DBP, BBP, DEHP, DOP) Igual que EPA 8061A, sin ajustar el pH LLE en continuo(300-500 mL DCM (18-24h)) I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 42 BIBLIOGRAFÍA (1) J. Berset, R. Etter-Holzer, J. of AOAC International 84 (2) (2001) 383. (2) K. Luks-Betlej, P. Popp, B. Janoszka, H. Paschke, J. Chromatogr. A 938 (2001) 93. (3) I.T. Cousin, D. Mackay, Chemosphere 41(2000) 1389. (4) I.T. Cousin, D. Mackay, T.F. Parkerton. Physical-chemical properties and evaluative fate modelling of phthalate esters. In: CA Staples, ed. The handbook of environmental chemistry. Vol 3, Part Q. Phthalate Esters, pp 57-84, Berlin: Springer-Verlag, 2003. (5) Z.P. Lin, M.G. Ikonomou, H. Jing, C. Mackintosh, F.A.P.C. Gobas, Environ Sci Technol 37 (2003) 2100. (6) The Council of the European Communities. Council Regulation (EEC) 793/93 of 23 March 1993 on the Evaluation and Control of the Risks of Existing Substances. Official Journal L 084, 05-04-1993, pp 0001-0075. (7) M.K. Stanley, K.A. Robillard, C.A. Staples. Introduction. In: CA Staples, ed. The handbook of environmental chemistry. Vol 3, Part Q. Phthalate Esters, pp 1-7, Berlin: Springer-Verlag, 2003. (8) PricewaterhouseCoopers. Eco-profile of High Volume Commodity Phthalate esters (DEHP/DINP/DIDP). European Council for Plasticizers and Intermediates (ECPI). January 2001. (9) Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Toxicological Profile for di-(2- ethylhexyl) phthalate. US Department of Health and Human Services, Public Health Service. Atlanta, 2002. (10) Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Toxicological Profile for diethyl phthalate. US Department of Health and Human Services, Public Health Service. Atlanta, 1995. (11) Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Toxicological Profile for di-n- butyl phthalate. US Department of Health and Human Services, Public Health Service. Atlanta, 2001. (12) Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Toxicological Profile for di-n- octyl phthalate. US Department of Health and Human Services, Public Health Service. Atlanta, 1997. (13) M. Castillo, D. Barceló. Trends Anal. Chem., 16 (1997) 574. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 2. PLASTIFICANTES: FTALATOS 43 (14) M.C. Yin, K.H. Su. J. Food Drug Anal. 4 (1996) 313. (15) D.J. Russel, B.M. Duffie, Chemosphere 15 (8) (1996) 1003. (16) T.J. Wams, Sci. Total Environ. 66 (1987) 1. (17) C.A. Staples, D.R. Peterson, T.F. Parkerton, W.J. Adams, Chemosphere 35 (1997) 667. (18) K. Holadová, J. Hajslová. Int. J. Environ. Anal. Chem. 59 (1995) 43. (19) M. Castillo, A. Oubiña, D. Barceló. Environ. Sci. Technol. 32 (1998) 2180. (20) M. Möder, P. Popp, J. Pawliszyn, J. Microcol. Sep. 10 (1997) 875. (21) T. Hyötyläinen, K. Grob, M. Biedermann, M.L. Riekkola, J. High Resol. Chromatogr. 20 (1997) 410. (22) H.R. Rogers. Sci. Total Environ. 185 (1996) 3. (23) P. Desideri, L. Lepri, L. Checchini, D. Santianni, Int. J. Environ. Ana.l Chem. 55 (1994) 33. (24) O.S. Fatoki, A. Noma, Water, Air and Soil Pollut 140 (2002) 85. (25) A. Peñalver, E. Pocurull, F. Borrull, R.M. Marcé, J. Chromatogr. A 922 (2001) 377. (26) G. Prokupková, K. Holadová, J. Poustka, J. Hajslová, Ana.l Chim. Acta 457 (2002) 211. (27) S. Jonsson, J. Ejlersson, A. Ledin, I. Mersiowsky, B.H. Svensson, Water Res, 37 (2003) 609. (28) R.A. Gimeno, R.M. Marcé, F. Borrull, Chromatographia 58 (2003) 37. (29) Y. Saito, M. Nojiri, M. Imaizumi, Y. Nakao, J. Chromatogr. A 975 (2002) 105. (30) F. David, P. Sandra, B. Tienpont, F. Vanwalleghem. Analytical methods review. In: CA Staples, ed. The handbook of environmental chemistry. Vol 3, Part Q. Phthalate Esters. Berlin: Springer-Verlag, 2003. (31) J. Vikelsoe, M. Thomsen, L. Carlsen, Sci. Total Environ. 296 (2002) 105. (32) A.M. Feuille. Association Francaise de Normalization, Sewage Sludge Management, Revision of Directive 86/278/CE, 1-14, 1999. (33) K. Hashizume, J. Nanya, C. Toda, T. Yasui, H. Nagano, N. Kojima, Biol. Pharm. Bull. 25 I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 51 II.3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS (BFRs) II.3.1. CARACTERÍSTICAS GENERALES II.3.1.1. DEFINICIÓN, ESTRUCTURA Y PROPIEDADES Los compuestos ignífugos bromados o “retardantes de llama bromados” (Brominated Flame Retardants, BFRs) pueden definirse como un grupo muy diverso de compuestos orgánicos, en los que uno o más átomos de hidrógeno son reemplazados por bromo. Contienen entre un 50 y un 95% en peso de bromo, y pueden clasificarse estructuralmente en compuestos aromáticos, alifáticos y cicloalifáticos1-5. Se adicionan a plásticos y polímeros sintéticos, utilizados en variedad de productos de consumo, con objeto de reducir su inflamabilidad e inhibir su probabilidad de ignición4,5. Sus aplicaciones son muy diversas, por su gran eficacia como ignífugos y su bajo coste, entre las que se encuentran, el uso en equipos eléctricos y electrónicos, materiales aislantes, carcasas de ordenadores, televisores, productos de tipo textil y materiales de construcción6-9. Existen más de 75 compuestos diferentes que pertenecen al grupo de los BFRs, entre los que se encuentran, los difenil éteres polibromados (PBDEs), los bifenilos polibromados (PBBs), el hexabromociclododecano (HBCD) y el 3,5,3',5'-tetrabromobisphenol A (TBBPA)10. En concreto, algunos congéneres de la familia de los PBDEs y el TBBPA, junto con otros compuestos fenólicos, son los BFRs de mayor volumen de consumo mundial1,11. II.3.1.1.1. PBDEs y PBBs Los PBDEs y los PBBs son estructuralmente similares a los PCBs, aunque en el caso de los PBDEs, con un átomo de oxígeno entre los dos anillos aromáticos. Por tanto, su estudio resulta interesante teniendo en cuenta que sus efectos negativos para el medioambiente y la salud humana, en tanto que son bioacumulables y resistentes a la degradación, también son similares1. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 52 En teoría, hay 209 posibles congéneres tanto de PBDEs como PBBs en función del número de bromos y su posición en los grupos fenilo (ver Figura II.3.1.1.1), pero en la práctica, no todos tienen aplicaciones en productos comerciales. El sistema de enumeración de los congéneres es análogo al sistema IUPAC de numeración de los PCBs12. Industrialmente, los PBDEs se producen por la bromación del óxido de difenilo bajo ciertas condiciones, dando como resultando productos que contienen mezclas de congéneres. Los PBBs se generan por la bromación de un bifenilo, obteniendo también mezcla de productos, al igual que ocurre con los PBDEs. Actualmente los PBBs ya no se producen, aunque pueden encontrarse en algunos productos obsoletos. Dentro de las formulaciones comerciales de PBDEs2,12, se encuentran, la mezcla técnica decaBDE, que presenta un 97% de decaBDE y un 3% de nonaBDEs, la mezcla octaBDE, que contiene principalmente hepta- y octaBDEs, pero también hexa, nona- y decaBDE en menor proporción; y por último, la mezcla pentaBDE, que se compone mayoritariamente de tetra- y pentaBDEs11,14,15. Las proporciones dentro de cada formulación son muy importantes, porque la toxicidad de cada compuesto es diferente; sin embargo, la identificación de los congéneres presentes en estas mezclas técnicas no fue posible hasta la obtención de los patrones puros de los compuestos12. Por ejemplo, se conoce que en la mezcla pentaBDE (en concreto en la mezcla comercial Bromkal 70-5DE) los congéneres más abundantes son el BDE-47 y el BDE-99 con un 37 y un 35% de porcentaje en peso, respectivamente16. También están presentes aunque en menor proporción los congéneres BDE-85, BDE-100, BDE-153 y BDE-154 (ver Tabla II.3.1.1.1). O Brx Br y 2 3 4 6 5 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ PBBsPBDEs Figura II.3.1.1.2. Estructura general de los PBDEs y los PBBs (x e y pueden tomar valores de 1 a 5). Brx 1 23 4 6 5 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ Br y I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 53 Dentro de estas tres formulaciones, la mezcla decaBDE es la más empleada12. en concreto, en Europa se ha prohibido el uso de pentaBDE y octaBDE debido a sus demostrados efectos nocivos en la salud humana; por lo que, es de esperar que la demanda de decaBDE continúe aumentando. Sin embargo, a pesar de su prohibición, estas sustancias siguen presentes en un importante número de productos todavía en circulación, por lo que su introducción en el medioambiente continuará produciéndose a lo largo de la vida útil del producto (potencialmente varias décadas). Además, el aumento en el uso de decaBDE hace necesario tener un mayor conocimiento de sus procesos degradación, relacionados con la presencia de PBDEs de menor grado de bromación en muestras ambientales. De hecho, en estudios recientes, se ha confirmado la debromación del decaBDE y la presencia de productos, identificados como PBDEs menos bromados17,18. En la Tabla II.3.1.1.1 se recogen las estructuras de los PBDEs y PBBs objeto de estudio en este trabajo, así como algunas propiedades físico-químicas de interés, centrándose en los congéneres de menor grado de bromación que son los que se encuentran en mayor proporción en muestras ambientales. En cuanto a sus propiedades físico-químicas, en general, los PBDEs son sólidos a temperatura ambiente, presentan un rango de puntos de ebullición, que se encuentra entre los 80ºC, para el BDE-47 (tetraBDE), hasta los 300ºC, para el BDE-209 (decaBDE). En cuanto a su volatilidad, su presión de vapor depende del contenido en bromo del compuesto, así, los congéneres con mayor grado de bromación son más pesado y consecuentemente menos volátiles21 (ver Tabla II.3.1.1.1). Su solubilidad en agua es relativamente baja, especialmente para los BDEs más bromados, y teniendo en cuenta los valores del coeficiente de partición octanol-agua (Kow) se pueden considerar sustancias lipofílicas. Considerando estas propiedades, podemos presuponer que los fenómenos de adsorción marcarán su distribución en el medioambiente19. Los valores de log Kow, además, nos dan una idea del posible grado de bioacumulación del compuesto20. Así, valores altos del log Kow indican una mayor lipofilia y por tanto una mayor tendencia a acumularse en los tejidos biológicos. Los valores del log Kow oscilan entre 5.9-6.2 para los tetraBDEs, 6.5-7.0 para los pentaBDEs, 8.4-8.9 para los octaBDEs y 10 para el DecaBDE15. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 54 Tabla II.3.1.1.1. Nombre, nomenclatura según la IUPAC, solubilidad en agua (S), presión de vapor (Pa), coeficiente de partición octanol-agua (Kow) y estructura química de los PBDES19 y PBBs20 objeto de estudio. Nombre Nomenclatura (IUPAC) S25ºC (mg/L) Po25ºC (Pa) Log Kow Estructura química BDE-3 4- bromofenilfeniléter - 0.259 4.85 BDE-47 2,2’,4,4’- tetrabromodifeniléter 1.5x10-2 1.86x10-4 6.55 O Br Br BrBr BDE-99 2,2’,4,4’,5- pentabromodifeniléter 9.4x10-3 1.76x10-5 7.13 O Br Br B r Br Br BDE-100 2,2’,4,4’,6- pentabromodifeniléter 4.0x10-2 2.86x10-5 6.86 O Br Br B r Br Br BDE-85 2,2’,3,4,4’ - pentabromodifeniléter 6.0x10-3 9.86x10-6 7.03 O Br Br BrBr Br BDE-153 2,2’,4,4’,5,5’- hexabromodifeniléter 8.7x10-4 2.1x10-6 7.62 O Br Br BrBr Br B r BDE-154 2,2’,4,4’,5,6’- hexabromodifeniléter 8.7x10-4 3.80x10-6 7.39 PBB-15 3,5-dibromo-1,1'- bifenilo - - 5.43 Br Br PBB-49 2,2',4,5'-tetrabromo- 1,1'-bifenilo - - 4.90 Br Br Br B r Br O I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 55 II.3.1.1.2 TBBPA y otros compuestos ignífugos fenólicos. El TBBPA comercial es uno de los BFRs de mayor volumen de producción a nivel mundial11. Como se puede ver en su estructura, mostrada en la Figura II.3.1.1.1, presenta dos anillos fenólicos con dos átomos de bromo en cada uno. Otros BFRs fenólicos comercializados son, el 2,4-dibromofenol (2,4-DBP), el 2,4,6- tribromofenol (TBP), el pentabromofenol (PBP) y el 3,5,3',5'-tetraclorobisfenol A (TCBPA)1. Además, compuestos como el 2,6-dibromofenol (2,6-DBP) y el 2,4,6-tribromofenol (TBP), pueden formarse como subproductos en los procesos de descomposición de materiales plásticos que contengan el TBBPA22,23. Considerando estas observaciones parece interesante el estudiar este grupo de compuestos en conjunto como la familia de los compuestos ignífugos fenólicos. Tabla II.3.1.1.2. Nombre, presión de vapor (Po), solubilidad en agua (S), valor de la constante de Henry (H), coeficiente de partición octanol-agua (Kow) de los compuestos ignífugos fenólicos considerados. Compuesto (Acrónimo) Po25ºC (Pa) S25ºC (mg/L) H25ºC (Pa m3/mol) Log Kow 2-bromofenol (2-BP) 42 - - 2.47 2-bromo-4-metilfenol (2-B-4-MP) 14.9 - - 2.93 4-bromo-3-metil fenol (4-B-3-MP) 2.17 - - 2.95 2,6-dibromofenol (2,6-DBP) 1.27 - - 3.41 2,4-dibromofenol (2,4-DBP) 3.65 2080 3.65x10-2 3.22*/3.43 2,4,6-tribromofenol (2,4,6-TBP) 0.20 59 4.83 x10-3 4.13*/4.33 Pentabromofenol (PBP) 5x10-5 0.1 8.41 x10-4 6.10 3,5,3',5'-tetraclorobisfenol A (TCBPA) 6.57x10-5 0.70 - 5.68 3,5,3',5'-tetrabromobisphenol A (TBBPA) 1.88x10-5 0.08 7.09 x10-6 4.54*/7.29 *determinados experimentalmente Figura II.3.1.1.1. Estructura del TBBPA. O H OH Br Br Br Br I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 56 En cuanto a sus propiedades físico-químicas (ver Tabla II.3.1.1.2), al igual que el caso de los PBDEs, se encuentran en relación directa con el contenido de bromo de los compuestos. Así, los bromofenoles de mayor grado de bromación y los bisfenoles, presentan unos valores de log Kow relativamente altos, por lo que pueden considerarse compuestos lipofílicos, a pesar de presentar una solubilidad en agua relativamente alta24. Ambas características van a favorecer su distribución en el medioambiente. La volatilidad de los compuestos también depende del contenido de bromo, así los compuestos menos bromados pueden considerarse relativamente volátiles mientras que los más pesados no presentan tendencia a la volatilización. Si los comparamos con los PBDEs, por ejemplo, el TBBPA presenta una menor volatilidad con respecto a los PBDEs más pesados. En cambio, su log Kow determinado experimentalmente tiene un valor de 4.54 (ver Tabla II.3.1.1.2), indicando un carácter menos lipofílico, aunque sus derivados alquilados pueden presentar log Kow mayores25. II.3.1.2 PRODUCCIÓN Y USOS La comercialización de los compuestos bromados como ignífugos comenzó sobre la década de los 601. En concreto, fueron los PBBs los primeros compuestos bromados introducidos en el mercado como ignífugos, para sustituir a los PCBs en ciertas aplicaciones tras su prohibición. Hoy en día los PBBs ya no se utilizan. Su producción se prohibió en US a finales de la década de los 70 y el último fabricante Europeo cesó la producción en el 20002. La demostración de sus propiedades tóxicas (están clasificados como posibles cancerígenos)26 y de su persistencia16, tras una intoxicación accidental con estos productos fue el desencadenante de este prohibición. A pesar de ello, todavía es posible encontrar estos compuestos en algunos productos obsoletos. Más tarde, comenzaron a introducirse en el mercado otros compuestos bromados como los PBDEs o el TBBPA. No obstante, no es hasta la década de los 90, cuando se dispara la demanda y producción de los BFRs, en cierta medida debido al auge en el desarrollo de productos informáticos y electrónicos. Mientras que en 1992 la producción estimada era de 40.000 toneladas (Tn), en 1998 los datos indicaban que la producción media anual de BFRs excedía las 150.000 Tn, duplicándose esta cifra un año después, es decir, sobre 300.000 Tn en 19999,17,27,28. En cuanto a los bromofenoles, el 2,4,5-TBP es el que presenta el mayor volumen de producción a nivel mundial. También se producen 2,4-DBP y PBP pero en mucho menor I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 57 proporción. En la Tabla II.3.1.2. se recoge la demanda anual (en toneladas) de cada uno de los BFRs mayoritarios, correspondientes a los años 1999 y 2001, donde puede apreciarse como los producto comerciales TBBPA y decaBDE fueron los más empleados. Tabla II.3.1.2.1. Volúmenes de consumo estimados (en toneladas) de los principales compuestos ignífugos bromados (1999 y 20019) BFRs 1999 2001 2,4,6-TBP - 9,500 TBBPA 121,300 119,700 HBCD 15,900 16,700 DecaBDE 54,800 56,100 OctaBDE 3,825 3,790 PentaBDE 8,500 7,500 Por otra parte, dependiendo de su presencia en el producto final, los BFRs se pueden dividir en dos tipos de compuestos, los reactivos y los aditivos29. Los reactivos, como el TBBPA se enlazan covalentemente al polímero durante el proceso de fabricación27. Sin embargo, los aditivos, como los PBDEs, el HBCD o los PBBs, simplemente se mezclan o disuelven en el material (antes, durante o después de la polimerización) y pueden liberarse fácilmente del mismo28. Los bromofenoles, sin embargo, no se utilizan directamente como ignífugos sino que se utilizan como intermediarios químicos en la síntesis de otros productos o en tratamientos de madera. Tal como se comentó, la principal aplicación de BFRs es en productos eléctricos o de equipamiento electrónico como, carcasas plásticas de pequeños equipos de oficina y electrodomésticos, televisores, en componentes eléctricos y cables, y en plásticos de polietileno (PE)28 (ver Figura II.3.1.2.19). También pueden encontrarse en productos textiles y otros materiales de construcción. La tendencia que se sigue actualmente es intentar reducir el consumo de BFRs, reemplazándolos por compuestos ignífugos no halogenados. Esto se debe principalmente a la preocupación por los efectos toxicológicos que pueden presentar los compuestos con halógenos pesados y los cambios en materia de regulación de estos compuestos29 (ver Apartado II.3.1.5). I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 58 II.3.1.3. DISTRIBUCIÓN Y PRESENCIA EN EL MEDIOAMBIENTE Debido a que las aplicaciones de los BFRs son muy diversas, pueden existir múltiples fuentes y rutas de transporte de estos compuestos en el medioambiente. Así, las industrias que manufacturan o aplican BFRs en sus productos (como la industria textil, automovilística o electrónica) constituyen fuentes potenciales de liberación de los BFRs en el ambiente10. A su vez, los productos que contienen BFRs pueden ser fuentes de contaminación durante toda su vida útil. La liberación de los compuestos por volatilización o lixiviado resulta un foco importante de contaminación, sobretodo en el caso de productos de uso doméstico o en empresas. La eliminación de estos productos, mediante combustión, reciclado o acumulación en vertederos, constituye la última ruta de entrada de BFRs en el ambiente6,23. En 1979, se publicó la primera evidencia de la presencia de BFRs en muestras ambientales, en concreto en muestras de suelos y lodos de los alrededores de una planta de producción de BFRs en US30. En principio, los niveles de BFRs son mayores en las cercanías de fuentes industriales23,31-33; sin embargo, se han detectado ciertos compuestos en muestras de aire recogidas en zonas árticas y en especies marinas de distintas localizaciones7,32, como el océano Ártico, Japón y el mar del Norte10,34. Esto demuestra que pueden sufrir diferentes rutas de transporte y no degradarse llegando a áreas remotas, lejos del origen de la contaminación. Productos textiles y otros 7% Tras p ortes 6% Equipos eléctricos y electrónicos 56% Construcción y edificios 31% Figura II.3.1.2.1. Distribución (en %) de la aplicación de BFRs en diferentes productos de consumo. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 59 Como ya se introdujo en el apartado II.3.1.1, los BFRs son sustancias lipofílicas y poco solubles en agua, por lo que presentan tendencia a sufrir fenómenos de adsorción sobre diferentes partículas como el polvo, sedimentos o el suelo. El transporte de estas partículas por el arrastre del aire explica la gran distribución que pueden sufrir estos compuestos7. A lo largo de las últimas décadas, se han publicado diferentes estudios que confirman la presencia de los BFRs tanto en tejidos humanos como en especies animales, y en otras muestras ambientales como sedimentos, lodos, polvo, suelos y muestras de agua, en US, Canadá, el norte de Europa y Japón2,7,23,31-35. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se centra en la presencia de la familia de los PBDEs. Estas investigaciones demuestran que el destino ambiental de los PBDEs depende del número de bromos de la molécula, es decir, del congénere especifico. Los congéneres menos bromados, como los tetra- y pentaBDEs, presentan mayores presiones de vapor, por lo que es habitual su presencia en muestras de aire2, mientras que los más pesados, como el decaBDE predominan en sedimentos, lodos o muestras de polvo. Aunque, como ya se ha comentado, el decaBDE es susceptible de sufrir degradación y producir BDEs de menor grado de bromación. Esto se traduce en un aumento de las concentraciones de, sobre todo, tetra a hexa BDEs en muestras medioambientales36,37. En cuanto a los BFRs fenólicos, existen muy poca información sobre la presencia de estos compuestos en el medioambiente. El TBBPA se ha investigado, junto con el TCBPA, en diferentes muestras ambientales, como muestras de agua38,39, suelos, sedimentos y lodos de depuradora1,40-44. La presencia de otros compuestos bromados como 2-BP, 4-BP, 2,4-DBP, 2,6-DBP y TBP, se relaciona con los procesos de tratamiento de agua. Su determinación, también resulta de interés si consideramos que son los responsable del sabor a plástico que presentan las aguas de bebida cloradas45. En concreto, el umbral de sabor se encuentra en 0.5 ng/L para el 2,6-DBP. Las concentraciones máximas encontradas en aguas superficiales (en concreto agua de río contaminada) fueron 40, 3 y 0.3 ng/mL para 2,4-DBP, 2,6-DBP y 2,4,6-TBP, respectivamente44. Sin embargo, las concentraciones normales suelen ser un orden de magnitud inferiores41. En al Tabla II.3.1.3.1, se resumen las concentraciones encontradas de los principales BFRs en diferentes muestras ambientales. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 66 La electroforesis capilar también se ha utilizado en el análisis de estos compuestos en muestras de agua obteniendo buenos resultados38,39. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 67 BIBLIOGRAFÍA (1) K. Kuosmanen, T. Hyötyläinen, K. Hartonen, M. Riekkola, J. Chromatogr. A 943 (2002) 113. (2) L.S. Birnbaum, D.F. Staskal, Environ. Health Perspect. 112 (2004) 9. (3) M. Alaee, R.J. Wenning, Chemosphere 46 (2002) 579. (4) A. Hassanin, K. Breivik, N. Meijer, E. Steinnes, G. Thomas, K. Jones, Environ. Sci. Technol., 38 (2004) 738. (5) J.H. Christensen, J. Platz, J. Environ. Monit. 3 (2001) 543. (6) R. Bloom, A. Eklund, P. Hedemalm, J.Hägsström, Brominated Flame Retardants, A Global Status Report, Orango Miljökonsulter, Gothenburg, 2000. (7) M. Alaee, P. Arias, A. Sjodin, A. Bergman, Environ. Int. 29 (2003) 6839. (8) C. Lassen, S. Lokke, Brominated Flame Retardants: Substance Flow Analysis and Assessment of Alternatives No. 494. Danish Environmental Protection Agency, Report 494, ISBN 87-7909-415-5, Copenague (1999). (9) Bromine Science and Environmental Forum (BSEF), Brominated Flame Retardants in consumer and commercial products, www.bsef.com, (2001). (10) U. Sellström, Determination of some polybrominated flame retardants in biota, sediment and sewage sludge. Tesis Doctoral, Universidad de Estocolmo, Sucia, 1999. (11) J.B. Manchester-Neesvig, K. Valters, W.C. Sonzogni, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 1072. (12) F. Rahman, KH.. Langford, M.D. Scrimshaw, J.N. Lester, The Science of The Total Environment 275 (2001)1. (13) A. Palm, I. T. Cousins, D. Mackay, M. Tysklind, C. Metcalfe, M. Alaee, Environ. Pollut. 117 (2002) 195. (14) D. Oros, D. Hoover, F. Rodigari, D. Crane, J. Sericano, Environ. Sci. Technol. 39 (2005) 33. (15) B. Strandberg, N. Dodder, I. Basu, R. Hites, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 1778. (16) A. Sjödin, D.G. Patterson, A. Bergman, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 3830. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 68 (17) M. Tysklind, U. Sellström, G. Söderström, C. de Wit, The Second International Workshop on Brominated Flame Retardants, Estocolmo, Suecia, 2001. (18) S. Lacorte, M. Guillamón, E. Martínez, P. Viana, D. Barceló, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 892. (19) S.A. Titlemier, T. Halldorson, G.A. Stern, G.T. Tomy, Environ. Toxicol. Chem. 21 (2002) 1804. (20) A.M.C.M. Pijnenburg, J.W. Evets, J. de Boer, J.P. Boon, Reviews of Environmental Contamination and Toxicology 141 (1995) 1. (21) S.A. Titlemier, G.T. Tomy, Environ. Toxicol. Chem. 20 (2001) 146. (22) J.W. Voordeckers, D.E. Fennell, K. Jones, M.M. Haggblom, Environ. Sci. Technol. 36 (2002) 696. (23) C.A. de Witt, Chemosphere 46 (2002) 583. (24) H. Kuramochi, K. Maeda, K. Kawamoto, Organohalogen. Comp. 63 (2003) 337. (25) I. Watanabe, Tatsukawa, Anthropogenic brominated aromatics in the Japanese environment. Proceedings, Workshop on brominated aromatic flame retardants, Skokloster, Suecia, octubre 24-26, pp 63-721, 1989. (26) A. Hoque, A.J. Sigurdson, K.D. Burau, H.E. Humphrey, K.R. Hess, A.M. Sweeney, Epidemiology 9 (1998) 373. (27) H. Hakk. A survey of tetrabromobisphenol A. Second International Workshop on Brominated Flame Retardants, Mayo 14-16, Universidad de Estocolmo, Suecia, pp27-30 (2001). (28) Environmental Health Criteria 192. Flame retardants: A General Introduction. World Health Organization (WHO). Ginebre, Suiza, 1994. (29) J. Christensen, M. Gasius, M. Pécseli, J. Platz, G. Pritzl, Chemosphere, 47 (2002) 631. (30) V.J. DeCarlo, Annals of New York Academy of Science, 42 (1979) 561. (31) R. Hale, M. Alaee, J. Manchester-Neesvig, HM.. Stapleton, M.G. Ikonomou, Environ. Int. 29 (2003) 771. (32) M. Remberger, J. Sternbeck, A. Palm, L. Kaj, K. Stromberg, E. Brorstrom-Lunden, I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 69 Chemosphere 54 (2004) 9. (33) C.M. Butt, M.L. Diamond, J. Truong, M.G. Ikonomou, A. ter Schure, Environ. Sci. Technol. 38 (2004) 724. (34) J. de Boer, Chemosphere 18 (1989) 2131. (35) H.M. Stapleton, N.G. Dodder, J.H. Offenberg, M.M. Schantz, S.A. Wise, Environ. Sci. Technol. 39 (2005) 925. (36) A. Covaci, J. de Boer, J. Ryan, S. Voorspoels, P. Scjepens, Anal. Chem. 74 (2002) 790. (37) K. North, Environ. Sci. Technol. 38 (2004) 4484. (38) E. Blanco, M.C. Casais, M.C. Mejuto, R. Cela, J. Chromatogr. A 1071 (2005) 205. (39) T.A. Verslycke, A.D. Vethaak, K. Arijs, C.R. Janssen, Environ. Pollut. 136 (2005) 19. (40) U. Sellström, B. Jansson, Chemosphere 31 (1995) 3085. (41) K. Öberg, K. Warman, T. Öberg, Chemosphere 48 (2002) 805. (42) R. Saint-Louis, E. Pelletier, Analyst 129 (2004) 724. (43) J. de Boer, C. Allchin, B. Zegers, J.P. Boon, S.H. Brandsma, S. Morris, A.W. Kruijt, I. van der Veen, J.M. van Hesselingen and J.J.H. Haftka, HBCD and TBBP-A in sewage sludge, sediments and biota, including interlaboratory study, RIVO Report No. C033/02, Septiembre 2002. (44) C. Shaogang, G.D. Haffner, R.J. Letcher, J. Chromatogr. A 1097 (2005) 582 (45) J.L. Acero, P. Piriou, U. von Gunten, Water Res. 39 (2005) 2979. (46) R. Hale, M. La Guardia, E. Harvey, M. Gaylor, T. Matteson-Mainor, W. Duff, Nature 412 (2001a) 140. (47) B. Strandberg, N.G. Dodder, I. Basu, R.A. Hites, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 1078. (48) J. Ebert, M. Bahadir, Environ. Int. 29 (2003) 711. (49) R. Weber, B. Kuch Environ. Int. 29 (2003) 699. (50) A. Schecter, M. Pavuk, O. Papke, J.J. Ryan, L.S. Birnbaum, R. Rosen Environ. Health Perspect. 111 (2003) 1723. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 70 (51) F.A. Simohsehk, O.M. Moller, T. Madesn, M. Stavnsbjerg, “Brominated Flame Retardants: Toxicity and Ecotoxicity”, Danish Environmental Protection Agency, Project Nº 568 (2000) (52) I.A.T.M. Meerts, J.J. van Zanden, E.A.C. Luijks, I. van Leeuwen-Bol, G. Marsh, E. Jakobsson, A. Bergman, Toxicol. Sci. 56 (2000) 95. (53) M. Ghosh, I.A.T.M. Meerts, A. Cook, A. Bergman, A. Brouwer, L.N. Johnson, Acta. Cryst. D56 (2000) 1085. (54) P.O. Darnerud, Environ. Int. 29 (2003) 841. (55) T.A. McDonald, Chemosphere 46 (2002) 745. (56) OSPAR Commission, 2001: Evaluation of the expected situation of the eutrophication status in the Maritime Area following the 50 % reduction target for nutrient inputs. ISBN 0- 946956-76-6. (57) OSPAR Commission, 2005: OSPAR background document on tetrabromobisphenol-A. ISBN 1-904426-39-5. (58) European Union Risk Assessment Report bis(pentabromophenyl) ether [Decabromophenylether]. CAS: 1163-19-5; EINECS: 214-604-9. European Commission, Joint Research Centre, 2004. (59) European Union, Risk Assessement for diphenylether, Octabromo derivative (Octabromodiphenyl ether) CAS No: 32536-52-0; EINECS No: 251-087-9. European Chemicals Bureau, Reino Unido, 2003. (60) European Union risk assessment report for diphenyl ether, Pentabromo derivative (Pentabromodiphenyl ether). CAS: 32534-81-9. EINECS: 251-084-2. European Chemicals Bureau, Reino Unido, 2000. (61) EU Risk Assessment of TBBPA- Update. EU’s Technical Committee on New and Existing Substances (TCNES), European Brominated Flame Retardant Industry Panel, Bruselas, Bélgica, Diciembre 2004. (62) Directive 2002/96/EC of the European Parliament and of the Council of 27 January 2003 on waste electrical and electronic equipment (WEEE). Official Journal L 037 , 13/02/2003 P. 0024 - 0039 (63) Directive 2002/95/EC of the European Parliament and of the Council of 27 January 2003 on the restriction of the use of certain hazardous substances in electrical and electronic equipment. Official Journal L 037 , 13/02/2003 P. 0019 – 0023 I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 71 (64) Voluntary Industry Commitment by the US and European Producers of Selected Brominated Flame Retardants covered under the OECD’s Risk Reduction Programme, 30 Junio 1995 (65) Polybrominated Flame Retardants (PBFRs). Priority Existing Chemical Assessment Report. No. 20. National Industrial Chemicals Notification and Assessments Scheme (NICNAS), Australian Government, Marrickville, New South Wales, Junio 2001. (66) Comisión de las Comunidades Europeas. Propuesta 2006/0129 (COD) de la Directiva del Parlamento Europeo y del Consejo relativa a las normas de calidad ambiental en el ámbito de la política de aguas y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE. Diario Oficial de las Comunidades Europeas. Bruselas, 17-7-2006. (67) C. Thomsen, H. Leknes, E. Lundanes, G. Becher, J. Chromatogr. A, 923 (2001) 299. (68) T. Hyötyläinen, K. Hartonen, Trends Anal. Chem. 21 (1) (2002) 13. (69) M. Riess, R. van Eldik, J. Chromatogr. A 827 (1998) 65. (70) C.R. Allchin, R.J. Law, S. Morris, Environ.l Pollut. 105 (1999)197. (71) H.G. Janssen, X. Lou, “Supercritical fluid extraction in organic analysis. Extraction methods in organic analysis”, Handley A. J. Sheffield Academic Press, 100-145, (1999) (72) G.L. Lindström, B. Hardell, E. Sundelin, G. Liljegren, P. Lindholm, Organohalogen. Comp. 35 (1997) 431. (73) K. Hartonen, S. Bowadt, S. Hawthorne, M.L. Riekkola, J. Chromatogr. A 774 (1) (1997) 229. (74) C. Thomsen, K. Janak, E. Lundanes, G. Becher, J. Chromatogr. B, 750 (1) (2001) 1. (75) T. Hayama, H. Yoshida, S. Onimaru, S. Yonekura, H. Kuroki, T. Kenichiro, H. Nohta, M. Yamaguchi, J. Chromatogr. B 809 (2004) 131. (76) C. Salgado-Petinal, M. Gracía-Chao, M. Llompart, C. García-Jares, R. Cela, Anal. Bioanal. Chem. 385 (2006) 637. (77) M. Rodil, A. M. Carro, R.A. Lorenzo, R. Cela, Anal. Chem. 77 (2005) 2259. (78) H.M. Stapleton, T. Harner, M. Shoeib, J.M. Keller, M.A. Schantz, S.D. Leigh, S.A. Wise, Ana. Bioanal. Chem. 384 (2006) 791. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 3. COMPUESTOS IGNÍFUGOS BROMADOS 72 (79) M. G. Ikonomou, S. Rayne, Anal. Chem. 74 (2002) 5263. (80) D. Herzke, G.W. Gabrielsen, A. Evenset, I. C. Burkow, Environ. Pollut. 121 (2003) 293. (81) J. De Boer, C. Allchin, B. Zegers, J.P. Boon, Trends Anal. Chem. 10 (2001) 591. (82) A.P. Vonderheide., M. Montes-Bayón, J.A. Caruso, J. Anal. At. Spectrom. 17(2002) 1480. (83) A. Sjödin, E. Jakobsson, A. Kierkegaard, G. Marsh, U. Selltröm, J. Chromatogr. A 822 (1998) 83. (84) M. del Olmo, A. Zafra, B. Suárez, A. González-Casado, J. Taoufiki, J. Vilchez, J. Chromatogr. B 817 (2005) 167. (85) A. Zafra, M. del Olmo, B. Suárez, E. Hontoria, A. Navalón, J.L. Vilchez, Water Res. 37 (2003) 735. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 73 II.4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPME) COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA. Dentro del proceso analítico, la preparación de la muestra es una de las etapas decisivas a la hora de obtener buenos resultados en los análisis. De hecho, en las últimas décadas, se han producido grandes avances en los métodos destinados a la preparación de muestra. En este sentido, es importante destacar el importante impulso que ha experimentado en los últimos años la microextracción en fase sólida ó SPME, técnica de extracción/desorción desarrollada en 1989 por Belardy y Pawliszyn en la Universidad de Waterloo (Ontario, Canadá)1,2, que elimina la mayoría de los inconvenientes de las técnicas más conocidas de extracción, ya que no requiere el uso de disolventes, ni de tratamientos complejos para concentrar, tanto compuestos orgánicos volátiles, como no volátiles. Presenta, además, otras ventajas inherentes como el que apenas requiere tratamiento de la muestra, permite la automatización y puede aplicarse al análisis tanto de muestras líquidas y gaseosas, como de muestras sólidas, de forma indirecta. En aplicaciones medioambientales, la SPME se ha utilizado para la extracción de contaminantes orgánicos tan importantes como los VOCs (compuestos orgánicos volátiles), los pesticidas (clorados, nitrogenados y fosforados), los hidrocarburos policíclicos aromáticos3, los PCBs (bifenilos policlorados) o los fenoles3,4. Teniendo en cuenta lo anterior, es evidente que la elección de la SPME como técnica de extracción en el desarrollo de nuevos métodos para la determinación de contaminantes emergentes, no es una elección al azar, sino que sigue una tendencia marcada por la búsqueda de métodos sencillos, económicos y respetuosos con el medioambiente. Siguiendo esta línea, en esta memoria de Tesis, se pretende conocer las posibilidades reales de esta técnica en la determinación de los contaminantes orgánicos seleccionados, por lo que, a continuación se dedica un apartado concreto a la descripción de la SPME y al estudio de los factores que potencialmente influirán en la extracción de matrices acuosas. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 74 II.4.1. INTRODUCCIÓN A LA TÉCNICA La técnica de microextracción en fase sólida consiste en la exposición a la muestra de una microfibra recubierta con un material extractante, que puede ser un polímero líquido, un adsorbente sólido o una combinación de ambos. Éste recubrimiento retiene los compuestos a analizar por absorción, si se trata de un polímero líquido, o por adsorción, en el caso de recubrimientos sólidos. La cantidad extraída de analito guarda una relación directa con la concentración del mismo en la muestra, lo que permite la determinación cuantitativa de la concentración5,6. A diferencia de los métodos tradicional, en los que se intentan extraer completamente los analitos de la muestra, en la SPME no se extraen cuantitativamente, ya que se trata de un equilibrio en el que la cantidad de fase polimérica utilizada es muy pequeña. Además, la capacidad de usar la SPME cuantitativamente antes de que se alcance el equilibrio, permite establecer métodos mucho más rápidos y versátiles. II.4.1.1. Dispositivo de microextracción El dispositivo de SPME más utilizado es el fabricado por Supelco, y que consiste en una fibra de sílice fundida recubierta por distintos polímeros y fijada a una aguja de acero inoxidable. La fibra se introduce en un soporte que puede describirse como una jeringa modificada. Consta de un émbolo, para permitir la exposición y protección de la fibra, un cuerpo metálico y un cuerpo ajustable, para la reproducibilidad en la colocación de la fibra. En la Figura II.4.1.1 se muestra el esquema del soporte descrito. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 75 II.4.1.2. Procedimiento El procedimiento de la SPME consta de dos etapas: extracción y posterior desorción. El esquema general de estas dos etapas, se muestra en la Figura II.4.1.2. En principio la fibra está dentro de su protección de acero. Para realizar la extracción, se introduce esta protección a través del septum (previamente agujereado) del vial donde se encuentra la muestra, seguidamente, se presiona el émbolo para exponer la fibra a la muestra y que se produzca la extracción de los analitos. Después de un tiempo determinado (tiempo de extracción) se hace ascender la fibra de nuevo a su protección y se extrae del vial. Inmediatamente se coloca el dispositivo en el instrumento de análisis, donde los analitos son liberados, bien por desorción térmica, por calentamiento en el inyector de un cromatógrafo de gases (CG), o por desorción en disolventes orgánicos, por contacto con la fase móvil de HPLC, haciendo uso de una interfase SPME/HPLC y una válvula de inyección modificada. Figura II.4.1.1. Esquema del soporte de fibra. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 82 Kfs Vf C0 Vs Kfs Vf + Khs Vh + Vs Kfs Vf C0 Vs Kfs Vf + Vs Kfs = Kfh.KhS Ecuación II.4.2.1.3 Al sustituir en la ecuación (2) se obtiene la siguiente expresión: n = –––––––––––––––– Ecuación II.4.2.1.4 De la ecuación se deduce que la cantidad de analito extraída es independiente de la localización de la fibra en el sistema, como se esperaba para las condiciones de equilibrio. Así para muestras líquidas la cantidad de analito extraída por la fibra no va a depender de si la fibra se encuentra en la fase líquida o en la fase gas, por lo que, la sensibilidad de la extracción directa es la misma que la de la extracción en espacio de cabeza, siempre y cuando, los volúmenes de las distintas fases se mantengan iguales en los dos tipos de muestreo. Si no existe espacio de cabeza (el vial que contiene la muestra está completamente lleno) el término KhS.Vh (capacidad del espacio de cabeza) se puede eliminar quedando la ecuación expresada de la siguiente forma: n = –––––––––––– Ecuación II.4.2.1.5 Esta ecuación expresa los moles adsorbidos por la fibra al alcanzar el equilibrio. Según lo expuesto en las ecuaciones Ecuación II.4.2.1.4 y Ecuación II.4.2.1.5 para cualquier proceso de SPME al alcanzar el equilibrio existe una relación directa entre la cantidad extraída de analito y su concentración inicial, independientemente del número de fases del sistema. Es importante indicar que esto también se va a cumplir aunque no se haya alcanzado la situación de equilibrio termodinámico, siempre y cuando se mantenga el tiempo de extracción constante (ver apartado siguiente). En algunas de las determinaciones puede ocurrir que Kfs.Vf << V s, es decir, que la capacidad de la fibra sea mucho menor que el volumen de muestra, por lo que se puede considerar despreciable. En estos casos se llega a la Ecuación II.4.2.1.6. n = Kfs.Vf.Co Ecuación II.4.2.1.6 I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 83 δ C δ t δ2 C δ x2 De esta ecuación se deduce que la cantidad de analito extraída es independiente del volumen de muestra. En estas condiciones se dice que se ha alcanzado el volumen infinito lo cual va a permitir simplificar enormemente los cálculos. Esta aproximación no es válida en el caso en que los analitos a determinar tengan valores de Kfs muy elevados (gran afinidad por la fibra) y se estén utilizando volúmenes de muestra muy pequeños. Los valores de Kfs van a estar influenciados por la selectividad del recubrimiento de la fibra por el analito, además de por otros factores como, la temperatura de muestreo, la fuerza iónica de la muestra, el pH o el contenido de materia orgánica disuelta. El efecto de estos parámetros sobre la constante de distribución será discutido con detenimiento en el Apartado II.4.3. II.4.2.2. Aspectos cinéticos La velocidad del proceso de extracción va a venir definida por el tiempo de difusión de los analitos de la matriz de la muestra (o la fase gaseosa en HSSPME) a las cercanías de la fase polimérica, por la difusión en la propia fase y por la transferencia de masa entre las distintas interfases existentes en el sistema. Por tanto, la etapa limitante del proceso puede estar constituida por cualquiera de estas etapas o la combinación de varias. Como la mayor parte de la teoría del transporte de masa, la cinética de la SPME está basada en la 2ª Ley de Fick de difusión. La 2ª ley de Fick de difusión para el balance de masas en un sistema dinámico y para una dimensión puede ser expresada como: –––––– = D –––––– Ecuación II.4.2.2.1 siendo: C la concentración, D el coeficiente de difusión del analito y x las dimensiones del sistema. Despreciándose la interacción entre los analitos y factores como la expansión térmica, tal como se desprende de la Ecuación II.4.2.2.1, la cinética de extracción va a estar influenciada por parámetros geométricos, como el diámetro o forma del vial (viales con mayor diámetro suponen una mayor interfase o superficie de contacto entre la muestra y el espacio de cabeza), el espesor del recubrimiento polimérico (un mayor espesor ralentiza la extracción), y por las propias características del analito (peso molecular, polaridad, etc) que determinan su D. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 84 La agitación de la muestra es uno de los factores que puede mejorar la difusión del analito en la muestra y, si esta es la etapa limitante del proceso, que se alcance antes el equilibrio. De todas formas si es necesario un tiempo excesivamente largo para alcanzar condiciones de equilibrio, se pude trabajar bajo condiciones cinéticas aunque en este caso debe controlarse cuidadosamente el tiempo de extracción. En la Figura II.4.2.2.1 se representa el error cometido para la misma variación en el tiempo de extracción si se trabaja en equilibrio o en condiciones cinéticas. Tal como puede verse el error en la respuesta es más de 20 veces mayor si se trabaja en condiciones cinéticas, de ahí la importancia en la precisión de la medida del tiempo de extracción. II.4.3. FACTORES QUE AFECTAN AL PROCESO DE EXTRACCIÓN II.4.3.1. RECUBRIMIENTO POLIMÉRICO Tal como se apuntaba en el apartado de aspectos termodinámicos, la constante de distribución del analito entre la fibra y la muestra (Kfs) describe la capacidad y selectividad del recubrimiento por el analito frente a otros componentes de la matriz. Así, la naturaleza del recubrimiento va a ser el factor que determine la selectividad del método. Figura II.4.2.2.1. Efecto de la variación del tiempo de extracción en la cantidad de analito extraída. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 85 En este sentido, se deben considerar principalmente dos parámetros para la selección del tipo de recubrimiento a usar en la microextracción, la polaridad y el espesor o volumen de recubrimiento. En principio cuanto mayor es el volumen del recubrimiento mayor será la sensibilidad. Sin embargo un espesor demasiado grande retarda el tiempo necesario para que se complete la extracción.En cuanto a la polaridad, se dispone de una amplia gama de recubrimientos comerciales, algunos de los cuáles se han desarrollado para aplicaciones específicas. En la Tabla II.4.3.1.1 se adjuntan características y propiedades de algunos fases poliméricas para las fibras de SPME disponibles comercialmente30. Tabla II.4.3.1.1. Características de las fibras disponibles comercialmente por Supelco ®. Material extractante Espesor T máx ( ºC ) Vol. (µL) Polaridad Uso Tipo PDMS 100 µm 30 µm 7 µm 280 280 340 0.612 0.132 0.026 Apolar Apolar Apolar GC/HPLC GC/HPLC GC/HPLC No enlazada No enlazada Enlazada PDMS-DVB 65 µm 50 µm 270 - 0.357 0.415 Semipolar Semipolar GC HPLC Parcialmente entrelazada Stable Flex* PDMS-DVB 65 µm - - Semipolar GC Altamente entrelazada CAR-PDMS 75 µm 340 0.436 Semipolar GC Parcialmente entrelazada Stable Flex CARPDMS 85 µm - - Semipolar GC Altamente entrelazada CW-DVB 65 µm 260 0.357 Polar GC Altamente entrelazada Stable Flex CWDVB 70 µm - - Polar HPLC Altamente entrelazada CW-TPR 50 µm - 0.330 Polar HPLC Parcialmente entrelazada Stable Flex DVBCAR-PDMS 50/30 270 - Semipolar GC Altamente entrelazada PA 85 µm 320 0.521 Polar GC/HPLC Parcialmente entrelazada * el recubrimiento está depositado sobre una fibra de sílice fundida flexible II.4.3.1.1. Recubrimientos homogéneos Los más importantes de este grupo son el polidimetilsiloxano (PDMS) y el poliacrilato (PA). I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 86 Los recubrimientos de PDMS son los más utilizados, ya que fueron de los primeros en comercializarse. Son los más adecuados para los analitos apolares aunque, en algunos casos, también pueden ser usados para la determinación de analitos con cierta polaridad. Las fibras de PDMS se comercializan en diferentes espesores (100 µm, 30 µm y 7 µm). El tratarse de un polímero líquido, la extracción de los analitos de la muestra mediante las fibras de PDMS se debe principalmente a fenómenos de absorción31,32 aunque algunos autores han indicado que la extracción de algunos analitos (sobre todo si son muy apolares) puede realizarse vía adsorción ya que existe una cierta competitividad entre ambos efectos33-36. Las fibras de PA, en cambio, son adecuadas para analitos polares y, aunque el recubrimiento es un polímero sólido, su baja densidad hace que los analitos sean absorbidos por la fibra al igual que en las fibras de PDMS31,37. Sin embargo, los coeficientes de difusión de los analitos en las fibras de PA son menores que los que poseen los analitos en las fibras de PDMS por lo que en general los tiempos de extracción son mayores A pesar de su resistencia a los disolventes, las fibras de PA pueden oxidarse fácilmente cuando se exponen a temperaturas mayores de 280ºC. Temperaturas de ese orden son las que se requieren para desorber los analitos en el inyector de un cromatógrafo de gases, por lo que la corriente de gas ha de estar libre de oxígeno para evitar que la fibra se oxide y no pueda utilizarse de nuevo. II.4.3.1.2. Recubrimientos heterogéneos Los recubrimientos de este tipo se caracterizan por estar constituidos por una fase polimérica líquida con partículas porosas embebidas en su interior. Los poros ofrecen una mayor capacidad de adsorción de los analitos, reteniéndolos además físicamente. Así, la cantidad de analito extraída variará en función de su tamaño con la dimensión del poro. La principal desventaja de estos polímeros comparados a los homogéneos es que ofrecen un rango lineal dinámico más pequeño6. Entre estos recubrimientos se encuentran: I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 87 - Polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB). Se trata de una mezcla de partículas porosas de DVB suspendidas en la fase líquida PDMS. El DVB posee principalmente poros de tamaño medio. Los mesoporos son ideales para retener analitos de C6-C15. La combinación de estas dos fases proporciona una mejor retención de analitos más pequeños que con el PDMS solo, además de presentar cierta afinidad por los analitos polares. - Polidimetilsiloxano/Carboxen (PDMS/CAR) Cuando el CAR se mezcla con el PDMS se crea una fase bipolar El Carboxen contiene micro, meso y macroporos, y gracias a sus microporos puede extraer moléculas muy pequeñas. Es ideal para extraer moléculas de C2- C12. Sin embargo, para las moléculas de más de 12 C la desorción es más lenta, generalmente por fenómenos de histéresis (condensación del analito en los macroporos). Para minimizar este efecto se deben usar temperaturas altas de desorción. - Carbowax/Resina templada (CW-TPR) La fibra está formada por una suspensión de resina templada (TRP), esferas de alta pureza, sobre CW. La naturaleza polar de CW combinada con la TPR, hace a la fibra eficiente en la extracción de grandes moléculas polares. Esta fibra ha sido especialmente diseñada para aplicaciones como fase para acoplamiento con HPLC. - Carbowax/divinilbenceno (CW-DVB). El CW es relativamente polar, pero cuando se combina con DVB su polaridad se incrementa, por lo que es la fibra más adecuada para extraer analito polares. La principal limitación que presenta es que es un recubrimiento frágil que puede desprenderse de la fibra, por ello han de tomarse precauciones necesarias para su protección, por ejemplo adicionando agentes entrelazantes que le confieren mayor estabilidad. El Carbowax también es sensible a la oxidación, por lo que la fibra debe preservarse de la luz y aislarse. En la Figura II.4.3.1.1 se observan los principales criterios que se pueden utilizar a la hora de seleccionar la fibra más adecuada en función de las propiedades de volatilidad y polaridad de los analitos. El efecto de la polaridad de las fibras se ha demostrado en diversos estudios que comparan fibras para la extracción de compuestos polares38,39. No obstante, la polaridad de la fibra muestra un efecto mínimo en la extracción de moléculas de bajo peso molecular40. Parece que, en la extracción de moléculas pequeñas, la porosidad y el espesor de la fibra influyen más que la polaridad41. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 88 II.4.3.2. OTROS FACTORES IMPORTANTES En este apartado se incluyen principalmente las condiciones que afectan a las constantes de distribución que intervienen en el proceso de microextracción (Kfs y Khs). Entre ellas se encuentran: > La temperatura de extracción. Va a influir tanto en los aspectos termodinámicos como cinéticos del proceso. Los coeficientes de difusión de los analitos aumentan al incrementar la temperatura, por lo que se acelera la cinética de extracción y aumenta la cantidad de analito extraída. En HSSPME, además, al aumentar la temperatura aumenta la concentración de los analitos en el espacio de cabeza (se incrementan las presiones de vapor) por lo que la extracción es también más rápida. Sin embargo, bajo condiciones de equilibrio, el proceso de microextracción es exotérmico, tal como se deriva de la ecuación; por lo que, el aumento de temperatura provoca una disminución del Kfs, resultando en una disminución de la cantidad de analito extraída en el equilibrio30. ⎟ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎜ ⎝ ⎛− ∆− = O ofs TTR H KK 11 exp (Ecuación II.4.3.2.1) Figura II.4.3.1.1. Guía de selección de las fibras de SPME en función de las propiedades del analito . I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 89 Ko es la constante de distribución cuando la fibra y la muestra están a To, ∆H es el cambio en la entalpía del analito cuando va de la muestra a la fibra, R es la constante de los gases. Este efecto debe considerarse en la optimización del tiempo de extracción para un recubrimiento dado. En general debe usarse la temperatura más alta que provoque una sensibilidad satisfactoria y no alargue el análisis. > El volumen de las fases. La sensibilidad del método de SPME es proporcional a la cantidad de analito extraída de la muestra (n) que viene determinada por la Ecuación II.4.2.1.3. Tal como se indica en la ecuación, la cantidad de analito extraída se incrementa al aumentar el volumen de la muestra Vs y disminuir el volumen de la fase gaseosa Vhs. Si el volumen de muestra es mucho mayor que el producto Kfs.Vf, en este caso, n no depende del volumen. En consecuencia, el uso de volúmenes de muestra mayores del volumen infinito no afectará a la sensibilidad del método pero sí puede mejorar la precisión. > La adición de sal. Puede aumentar o disminuir la cantidad de analito extraída dependiendo del compuesto y la concentración de sal. La adición de sal afecta a la partición de los analitos por que varía la fuerza iónica de la solución. Con especies moleculares al añadir sal se disminuye su solubilidad en la matriz acuosa (el agua solvata a los iones de la sal en lugar del analito) y favorece la extracción por la fibra. Con especies iónicas, disminuye la cantidad de analito extraída ya que aumenta el coeficiente de actividad de las especies iónicas al aumentar la fuerza iónica. > El pH. Asumiendo que solo las formas neutras pueden ser extraídas por el recubrimiento de la fibra, es necesario seleccionar el pH adecuado para mejorar la sensibilidad de la extracción. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 90 Para ello, el pH debe estar dos unidades por debajo del pKa de los analitos ácidos y dos unidades por encima para los básicos, que asegura que estén en su forma molecular. El pH además debe estar comprendido en el rango de trabajo recomendado para cada tipo de fibra. > La agitación. El proceso de extracción es controlado por la difusión y la agitación promueve la difusión de los analitos a la fibra o de analitos volátiles al espacio de cabeza. La efectividad de la técnica de agitación determina el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio entre fases. La técnica de agitación más utilizada en los tres tipos de muestreos es la agitación magnética. Debe asegurarse un movimiento constante y homogéneo de la barra agitadora durante la extracción. Otra forma de agitación es por la utilización de energía de ultrasonidos. Sin embargo, su desventaja es que calienta la muestra, además de ser ruidosa. > La materia orgánica disuelta. Por lo general, disminuye la eficiencia de la extracción porque compite con los analitos orgánicos en la absorción por la fase polimérica de la fibra. Además la presencia de ciertas sustancias (sustancias húmicas) pueden dañar la fase polimérica al quedar retenidas de forma irreversible. Para corregir este efecto matriz se pueden emplear patrones internos para corregir la respuesta, o agentes derivatizantes que mejora la afinidad de los analitos por la fibra. > La presencia de disolventes orgánicos. Aunque en general la presencia de solventes orgánicos en muestras acuosas disminuye la cantidad de analito extraída ya que aumenta la solubilidad de los analitos en la muestra, en algunas ocasiones el proceso de extracción puede verse favorecido42 debido a cambios en las interacciones entre la fibra y los analitos, o bien cuando se analizan muestras sólidas ya que la presencia de agua o de un solvente orgánico puede ayudar a la difusión de los analitos desde la matriz hasta la fibra43-45. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 4. LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA COMO ETAPA DE PREPARACIÓN DE MUESTRA 91 II.4.3. FACTORES QUE AFECTAN A LA ETAPA DE DESORCIÓN La desorción térmica de los analitos en el inyector de un cromatógrafo de gases depende de la volatilidad de los analitos, de la posición de la fibra en el inyector, del espesor de la fibra, de la temperatura del inyector y del tiempo de exposición. A medida que aumenta la temperatura, los coeficientes de partición fibra/gas portador, disminuyen. Asimismo, disminuye rápidamente la capacidad de la fibra para retener los analitos. El flujo constante de gas portador en el inyector del cromatógrafo de gases facilita la liberación de los analitos. Por tanto, los parámetros a optimizar cuando la desorción se realiza térmicamente en un cromatógrafo de gases son: > La temperatura de desorción. Como regla general se recomienda fijar como temperatura aquélla que es la máxima recomendada por el fabricante de la fibra. Al aumentar la temperatura, la afinidad de los compuestos por la fibra disminuye y los analitos son introducidos y arrastrados por la columna por el flujo del gas portador. Normalmente, la temperatura óptima de desorción es aquélla que coincide aproximadamente con la del punto de ebullición del analito menos volátil. > Tiempo de desorción. Debe ser el adecuado para que la desorción de los analitos sea completa y no queden restos en la fibra. Esto puede suceder si el tiempo o la temperatura de desorción no son suficientes para la desorción completa de los analitos. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 5. NUEVAS APLICACIONES DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 98 La extracción múltiple consiste en realizar extracciones sucesivas del mismo vial. La concentración decae exponencialmente y, dependiendo de los Kfs de los compuestos, es posible extraer completamente la cantidad inicial de compuesto en la muestra tras un determinado número de extracciones. La técnica ya ha sido empleada por Urruty y Montury en la determinación de los coeficientes de partición entre una muestra acuosas y la fibra de PDMS28, por Zimmerman et al.29 y por Nardi mediante SPME in-tube30. II.5.1.2. Influencia del recubrimiento polimérico Normalmente el cálculo de los coeficientes de distribución se lleva a cabo con recubrimientos poliméricos líquidos, como PDMS, en los que el proceso de reparto se produce por mecanismos de absorción. Si se utiliza una fase extractante mixta (del tipo CW-DVB, PDMS-DVB o CAR-PDMS) se produce interacción por adsorción en la superficie de las partículas porosas del recubrimiento. Las superficies tienen un número limitado de posiciones activas debido a mecanismos competitivos y al impedimento estérico. En este caso la expresión para el coeficiente de reparto (Kfs) no es totalmente correcta, debiendo tener en cuenta otros términos que incluyan los mecanismos de adsorción13. El reparto de analito en la fibra de PDMS mediante absorción de demostró a partir de imágenes de microscopía fluorescente obtenidas en el estudio publicado por Mayer et al16. En este caso, debería encontrarse siempre correlación entre log Kfs y log Kow. Sin embargo, en numerosos estudios se encontraron problemas a la hora de correlacionar ambos parámetros, sobre todo al estudiar compuestos de peso molecular alto, como PCBs y PAHs7,11,12,15,17. Estos resultados anómalos se debieron, en la mayoría de los casos, a unas malas condiciones experimentales, al no considerar posibles fenómenos de adsorción sobre las paredes del vial o las barras agitadoras, muy probables teniendo en cuenta las propiedades físico-químicas de estos compuestos (altos Kow y baja solubilidad), y que pueden conducir a error a la hora estimar la cantidad de analito extraída por la fibra11,31. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 5. NUEVAS APLICACIONES DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 99 II.5.1.3. Efecto de la mezcla de analitos En la mayoría de los estudios en los que se pretende determinar Kfs se trabaja con mezclas de compuestos, en ocasiones, con propiedades muy diferentes. En principio no debe encontrarse una desviación significativa entre el cálculo de Kfs para un analito individualmente o en una mezcla de compuestos, si se considera la fibra de PDMS ya que la absorción es un fenómeno no competitivo e independiente de la concentración7. Este hecho ha sido confirmado por Poerschmann y Gorecki en el estudio de PCBs32. Sin embargo, otros autores como Paschke y Popp obtuvieron valores de Kfs para el compuesto individual mayores que con mezcla de diferentes compuestos, en el caso de pp´DDE y ciertos PCBs de alto peso molecular17. La posible explicación de este resultado, según los autores, serían los efectos debidos a la presencia de otros solutos que afectan a la actividad de cada uno de los analitos presentes en la fase acuosa en diferente grado. Este hecho podría relacionarse con la solubilidad de Hildebrand (δ), parámetro que mide la solubilidad de un analito en una fase orgánica. Este concepto de solubilidad es importante para describir la partición del analito en fibras líquidas. Así, cuando se consideran analitos de distintas clases, que presentan distinta solubilidad en la fibra podrían encontrarse problemas al estimar Kfs. II.5.2. CORRELACIÓN ENTRE Kfs y Kow Tal como se indicaba al inicio de esta Sección, en los últimos años se han publicado varios estudios intentando establecer una relación entre Kfs y Kow, teniendo en cuenta que Kow es una medida de la lipofília de los compuestos y su potencial de bioacumulación. Existe una gran variabilidad en los resultados obtenidos, algunos autores consiguen buena correlación en todo el rango de Kow16 o sólo cuando Kow<67,12; mientras que otros presentan una mala correlación en todo el rango11,17. Realmente todos los analitos deberían presentar correlación, independientemente del I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 5. NUEVAS APLICACIONES DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 100 valor de Kow, por lo que algunos autores atribuyen esta pobre correlación para los compuestos más pesados a pérdidas por adsorción. Estos estudios se llevan a cabo, en muchos casos, con mezclas complejas de analitos de varias clases en las que el rango de Kow es amplio. En la Figura II.5.2.1 se comparan los datos obtenidos en diferentes estudios11,12,16,17,33 Ref. 11. Compuestos estudiados: PAHs. Fibra PDMS de 100 µm. Ref. 12. Compuestos estudiados: PAHs. Fibra PDMS de 100 µm. Ref. 16. Compuestos estudiados: PAHs, bencenos clorados, PCBs, pp´DDE. Fibra PDMS de 15 µm. Ref. 17. Compuestos estudiados: alcanos, PAHs y PCBs. Fibra PDMS de 100 µm. Ref. 33. Compuestos estudiados: ciclohexanos clorados, bencenos clorados, PAHs, pp´DDE y PCBs. Fibra PDMS de 100 µm. Tal como se puede ver, en algunos estudios se produce una desviación progresiva de la correlación a medida que aumenta Kow, y para valores de log Kow > 6 se pierde la linealidad. Para establecer esta correlación, la mayor parte de los autores hacen referencia a valores de Kow previamente publicados. Sin embargo, existen grandes discrepancias entre los Kow de diferentes estudios y su selección puede ser un factor determinante a la hora de obtener una buena correlación. Por ejemplo, para el 2-nitrofenol, log Kow varía entre 0.76 y 2.24, usando diferentes técnicas como HPLC y embudo de decantación34. Figura II.5.2.1. Correlación entre Kfs y Kow encontrada en diferentes estudios. 1 2 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 8 log Kow log Kfs 26 43 12 23 19 I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 5. NUEVAS APLICACIONES DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 101 En el caso del estudio simultáneo de varias familias de compuestos, como el propuesto por Paschke y Popp17 para PAHs y PCBs, la mala correlación obtenida podría justificarse debido a la interacción entre compuestos, tal como se indicaba en el Apartado II.5.1.1.4. De hecho, si se establece la correlación de las familias de compuestos de forma separada, la correlación mejora, tal como se confirma en la Figura II.5.2.2. Aunque lo más probable es que se produjesen pérdidas por adsorción. En definitiva, los estudios publicados hasta la fecha intentando establecer una correlación entre entre Kfs y Kow, no han sido del todo correctos, en gran medida de bido a errores de tipo experimental, por lo que es necesario proponer métodos alternativos para la determinación de Kfs que permitan eliminar estos problemas. Figura II.5.2.2. Correlación entre Kfs y Kow para PCBs y PAHs por se p arado en el estudio de Paschke y Po pp 17. R 2 = 0,9994 R2 = 0,9863 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 3 4 5 6 log Kow log Kfs PAHs PCBs I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 5. NUEVAS APLICACIONES DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 102 BIBLIOGRAFÍA (1) P. Mayer, Partitioning based approaches to study exposure and effects of hydrophobic organic substances, Tesis Doctoral, Universidad de Utrecht, Holanda, Junio 2000. (2) S. Lee, J. Gan, W.P. Liu, M.A. Anderson, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 5597. (3) E.U. Ramos, S.N. Meijer, W.H.J. Vaes, H.J.M. Verhaar, J.L.M. Hermens, Environ. Sci. Technol. 32 (1998) 3430. (4) D. Lambropoulou, V.A. Sakkas, T.A. Albanis, J. Chromatogr. A 952 (2002) 215. (5) W. Chen, K.F. Poon, H.W. Lam, Environ. Sci. Technol. 32 (1998) 3816. (6) R.U. Holt, J. Chromatogr. A 937 (2001) 107. (7) J. Hall, M. Satterfield-Doerr, R. Parikh, S. Brodbelt, Anal. Chem. 70 (1998) 1788. (8) B.I. Escher, M. Berg, J. Mühlemann, M.A.A. Schwarz, L.M. Hermens, W.H.J. Vaes, R.P. Schwarsenbach, Analyst 127 (2002) 42. (9) P.A. Martos, J. Pawliszyn, Anal. Chem. 69 (1997) 402. (10) P. Pollien, D. Roberts, J. Chromatogr. A 864 (1999) 183. (11) B. Shurmer, J. Pawliszyn, Anal. Chem. 72 (2000) 3660. (12) R. Doong, S.M. Chan, Anal. Chem. 72 (2000) 3467. (13) I. Valor, M. Pérez, C. Cortada, D. Apraiz, J.C. Molto, G. Font, J. Sep. Sci. 24 (2001) 39. (14) E.Y. Zeng, D. Tsukada, J.A. Noblet, J. Peng, J. Chromatogr. A 1066 (2005) 165. (15) Y. Yang, S.B. Hawthorne, D.J. Miller, Y. Liu, M.L. Lee, Anal. Chem. 70 (1998) 1866. (16) P. Mayer, W.H.J. Vaes, J.L.M. Hermens, Anal. Chem. 72 (2000) 459. (17) A. Paschke, P. Popp, J. Chromatogr. A 999 (2003) 35. (18) J.H.M. de Bruijn, F. Busser, W. Seinen, J. Hermens, Environ. Toxicol. Chem. 8 (1989) 499. (19) A.G. van Haelst, P.F. Hessen, F.W.N. van der Wielen, H.A.J. Govers, Chemosphere 29 (1994) 1651. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 5. NUEVAS APLICACIONES DE LA MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA 103 (20) E. Braekevelt, S.A. Titlemier, G.T. Tomy, Chemosphere 51 (2003) 563. (21) J. Dugay, C. Miege, M.C. Hennion, J. Chromatogr. A 795 (1998) 27. (22) K. Grob, Split and Splitless Injection for Quantitative Gas Chromatography, Wiley-VCH, Weinheim, 2001. (23) G. Ouyang, Y. Chen, L. Setkova, J. Pawliszyn, J. Chromatogr. A 1097 (2005) 9. (24) S. Kolb, Chromatographia 15 (1982) 587. (25) O. Ezquerro, B. Pons, M.T. Pena, J. Chromatogr. A 985 (2003) 247. (26) Z. Penton, SPME, Application Note 17, Varian, Bellefonte, PA, 1995. (27) D. de la Calle, M. Reichenbacher, K. Danzar, C. Hurlbeck, C. Bartzsch, K.H. Feller, Fresenius J. Anal. Chem. 360 (1998) 784. (28) L. Urruty, M. Montury, J. Chromatogr. Sci. 37 (1999) 277. (29) T. Zimmermman, W.J. Ensinger, T.C. Schmidt, J. Chromatogr. A 1102 (2006) 51. (30) L. Nardi, J. Chromatogr. A 985 (2003) 39. (31) E. Baltussen, S. Pat, D. Frank, H.G. Janssen, C. Cramers, Anal. Chem. 71 (1999) 5213. (32) J. Poerschmann, T. Górecki, Environ. Sci. Technol. 34 (2000) 3824. (33) J. Poerschmann, J. Microcolumn Sep. 12 (2000) 603. (34) J.R. Dean, W.R. Tomlinson, V. Makowskaya, R. Cumming, M. Hetheridge, M. Comber, Anal. Chem. 68 (1996) 130. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 6. QUIMIOMETRÍA APLICADA AL DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS 105 II.6. QUIMIOMETRÍA APLICADA AL DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS Toda investigación en el campo de la química analítica, y en concreto en el área medioambiental, debería comenzar preguntándose cuáles son los parámetros determinantes en el proceso estudiado, de qué forma le afectan, y en caso de ser posible, la obtención de algún modelo que permita relacionar el comportamiento observado con las condiciones estudiadas1. Tal como se describió en el Apartado II.4.3, son muchas las variables que influyen en el proceso de microextracción; por tanto, es evidente que la labor de optimización de un método de determinación basado en la SPME puede convertirse en proceso complejo y tedioso si no se recurre a herramientas quimiométricas. Así, en los diferentes métodos abordados en esta memoria de Tesis, se han considerado los siguientes aspectos de la quimiometría, con el objetivo de resolver los problemas encontrados de la manera más sencilla y simple posible, pero obteniendo conclusiones fiables. Estos aspectos son: - la planificación y diseño de experimentos para la optimización de los procedimientos de microextracción para cada familia de compuestos considerados - la evaluación de la calidad de los métodos propuestos. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 6. QUIMIOMETRÍA APLICADA AL DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS 106 II.6.1 DISEÑO EXPERIMENTAL Y OPTIMIZACIÓN El diseño experimental se utiliza para la identificación de los factores que pueden influir en el resultado de un experimento, empleando el análisis estadístico para separar y evaluar los efectos de los factores implicados, y determinar los valores de los factores que proporcionan una mayor respuesta, en nuestro caso una mayor eficacia del proceso de microextracción1,2,3. El número de experimentos que se necesitan para alcanzar estos objetivos es normalmente inferior al que se necesitaría si se utilizara la aproximación tradicional en la cual se estudia la influencia de cada factor individualmente; además, la información obtenida es más completa. En el diseño de experimentos, se denomina como factores a las variables o a cualquier aspecto de las condiciones experimentales que producen una variación en el fenómeno estudiado. Los diferentes valores que puede tomar un factor se conocen como niveles. El efecto de un factor es la variación de la respuesta producida por un cambio en el nivel del factor, y a esta variación se le denomina efecto principal2. En algunos experimentos, podemos encontrar que la diferencia de respuesta entre los niveles de un factor, no es la misma para todos los niveles de otro factor. Cuando esto ocurre, se produce una interacción entre los factores. La determinación de interacciones puede llegar a ser muy importante en la optimización del proceso, y no se podrían evaluar si estudiáramos cada factor por separado. Dentro de los diseños experimentales, los diseños de cribado de factores (Screening Designs) son los más utilizados. Éstos consisten en investigar cuales, de todos los factores potencialmente influyentes, lo son en el campo experimental fijado. Dentro de estos diseños tenemos los diseños factoriales completos y fraccionados1. En el diseño factorial completo, se incluyen medidas de respuesta para todas las combinaciones posibles de factores a todos los niveles. N factores y k niveles incluyen kN experimentos. En el diseño factorial reducido, los factores pueden ser evaluados usando una pequeña fracción de experimentos, suponiendo que sean despreciables las interacciones de segundo orden y superiores. El diseño factorial fraccional viene dado por kN-P experimentos, donde P es siempre menor que N. Los diseños de cribado de factores normalmente se aplican a dos niveles (k=2) y los experimentos propuestos por la matriz experimental, deben ser diferentes para evitar información replicada. Además dependiendo de su resolución se puede obtener una mayor o menor definición de la información obtenida. I II I. . I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 6. QUIMIOMETRÍA APLICADA AL DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS 107 La resolución de un diseño determina el grado de confusión entre factores, de modo que no se pueden separar sus efectos. Así, tenemos: 1. Diseño de resolución R=III: no confunde los efectos principales entre sí, pero los confunde con las interacciones de dos factores. 2. Diseño de resolución R=IV: no confunde los efectos principales con las interacciones de dos factores, pero confunde las interacciones de dos factores entre sí. 3. Diseño de resolución R=V: no confunde los efectos principales con las interacciones de dos factores, pero confunde las interacciones de dos factores con las de tres factores, etc. Otra limitación que presenta este tipo de diseños, es que al incluir sólo dos niveles, no se puede estudiar el intervalo completo de niveles posible de los factores. Esto se puede lograr empleando los diseños multifactoriales categóricos (Multifactor Categorical Designs), en los cuales los factores puede variarse en un rango de más de dos niveles. En este caso, el diseño se define como N*kN, donde kN son los niveles considerados para cada factor. Por otro lado, a la hora de decantarnos por uno u otro diseño, es importante definir los grados de libertad (d.f.) disponibles para evaluar el error. Los grados de libertad del error son necesarios para comprobar el nivel de significación de los efectos de los factores. Si no se tienen puntos centrales y si se quieren estimar todos los efectos principales y las interacciones entre dos factores, es imprescindible disponer de grados de libertad suficientes. Dada la complejidad de los cálculos matemáticos necesarios para la aplicación de los diseños descritos, resulta indispensable el uso de programas estadísticos especializados. Dentro de estos se encuentra el programa Statgraphics-Plus®, que permite entre otras opciones, realizar contrastes de significación, diseños experimentales de diferentes tipos, métodos de control de calidad, etc4. La aplicación de este programa para la optimización de procesos mediante diseño factorial presenta las siguientes opciones estadísticas con sus correspondientes representaciones gráficas. I II II I. . P PA AR RT TE E E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AL L G GE EN NE ER RA AL L I II II I. . P PA AR RT TE E E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AL L G GE EN NE ER RA AL L 117 En este capítulo, se describen los reactivos de uso general, los materiales y los procedimientos generales empleados en la realización de los estudios incluidos en la presente memoria. Para conocer los patrones comerciales, muestras, equipos instrumentales, condiciones de medida y procedimientos experimentales específicos de cada uno de los estudios realizados consultar los apartados correspondientes del Capítulo IV. Resultados e interpretación. I II II I. . P PA AR RT TE E E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AL L G GE EN NE ER RA AL L 118 III.1. DISOLVENTES, REACTIVOS Y GASES - Agua ultrapura (Milli-Q), obtenida en el propio laboratorio con un sistema de purificación (Millipore). - Acetona (Vorquímica), de baja calidad utilizada para la limpieza de material. - Acetona, 99.5% (Merck). - n-Hexano, 96% (Scharlau). - Ciclohexano, 99.5% (Merck). - Isooctano, 99.5% (Merck). - Metanol, grado gradiente HPLC (Merck). - Anhídrido acético, 99% (Aldrich). - Bicarbonato de potasio, 99.7% (Aldrich). - Carbonato de potasio, 99 % (Merck). - Cloruro de sodio, 99% (Aldrich). - Nitrógeno seco usado como gas portador y gas auxiliar del GC-ECD y del GC-FID, generado y purificado convenientemente en el mismo laboratorio. - Helio, 99,999% (Hidrocarburos Metálicos), usado como gas portador del GC-MS. III.2. INSTRUMENTAL III.2.1. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES - Material de vidrio de uso habitual en el laboratorio. - Agitador magnético con placa calefactora Agimatic-N (P-SELECTA). - Termómetro con escala de temperaturas de 0 a 150ºC. - Pipetas automáticas de 20-200, 100-1000 µL y 1-5 mL (TRANSFERPETTE®). - Balanza electrónica con cinco decimales de precisión (Sartorius BP211D). - Balanza granataria (Sartorius BP310S). III.2.2. SPME - Viales de vidrio PYREX de 22 y 120 mL (SUPELCO). - Septa recubiertos de teflón para el sellado de los viales (SUPELCO). - Cápsulas de aluminio para el sellado de los viales (SUPELCO). I II II I. . P PA AR RT TE E E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AL L G GE EN NE ER RA AL L 119 - Agitador magnético con placa calefactora Agimatic-N (P-SELECTA) - Termómetro con escala de temperaturas de 0ºC a 150 ºC. - Barras magnéticas recubiertas de PTFE de 25 mm de longitud y 6 mm de diámetro (Afora) y puntas de acero empleadas como barras agitadoras. - Soporte de SPME para inyección manual (SUPELCO). - Kit de fibras SPME para muestreo manual (SUPELCO). En la siguiente tabla se muestras las características de cada una de ellas. Antes de ser utilizadas por primera vez, las fibras de SPME deben ser acondicionadas convenientemente en una atmósfera inerte. Con este acondicionamiento previo de la fibra se consiguen eliminar los posibles residuos procedentes de su fabricación, evitan la aparición de picos extraños durante el análisis. Las distintas fibras empleadas en los estudios aquí recogidos en esta memoria, se acondicionaron en el sistema inyector de un cromatógrafo de gases en las condiciones recomendadas por la casa comercial y que figuran en la Tabla III.2.2.1. Tabla III.2.2.1. Características, condiciones de trabajo y acondicionamiento, de las fibras utilizadas en los estudios de aplicación de SPME. Material Adsorbente Espesor de Fase (µm) Tª de trabajo (ºC) Tª de acondic. (ºC) Tiempo (h) Polaridad Tipo PDMS 100 270 250 1 Apolar No enlazada PDMS-DVB 65 270 260 0.5 Bipolar Parcialmente entrecruzada CAR-PDMS 75 300 280 0.5 Bipolar Parcialmente entrecruzada CW-DVB 65 260 250 0.5 Polar Parcialmente entrecruzada PA 85 300 300 2 Polar Parcialmente entrecruzada III.2.3. TRATAMIENTO DE MUESTRA - Filtros de fibra de vidrio, 47 mm de diámetro, 0,45 µm de tamaño de poro (Whatman). - Equipo de filtración. I II II I. . P PA AR RT TE E E EX XP PE ER RI IM ME EN NT TA AL L G GE EN NE ER RA AL L 120 III.3. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE PATRONES Y MUESTRAS ACUOSAS Durante la realización de los estudios que se detallan en el Capítulo IV se prepararon disoluciones patrón y disoluciones de trabajo, tanto en disolventes orgánicos, como en matrices acuosas, siguiendo un procedimiento similar. En todos los casos se partió de patrones comerciales de los compuestos (sólidos o disoluciones de concentración conocida), a partir de los cuales se prepararon por pesada, distintos patrones conteniendo uno o varios de los analitos de interés. El disolvente empleado en estos patrones debe disolver con cierta facilidad a los analitos, o ser miscible con los disolventes en los que los analitos estaban originalmente disueltos. Se prepararon a continuación patrones intermedios en acetona para la preparación de las muestras acuosas. Todas las disoluciones se conservaron a -20ºC en ausencia de luz hasta un periodo máximo de un mes. Las muestras de agua empleadas en las distintas pruebas se tomaron en botellas de color ámbar de distinto tamaño (1 o 2.5 L), con tapón de rosca con la cara recubierta de Teflon. Se conservaron a 4ºC en ausencia de luz, por un periodo máximo de una semana. Las muestras de agua residual se filtraron, antes de su análisis, con filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm de tamaño de poro Las muestras con adición se prepararon añadiendo distintos volúmenes de patrones acetónicos hasta alcanzar un determinado nivel de concentración en el volumen de muestra analizado. Para obtener una distribución homogénea de los analitos en la matriz y así poder emplear alícuotas de una misma muestra para las diferentes investigaciones se precisa un tiempo de equilibrio. Por tanto, las muestras se conservaron a 4 ºC en nevera durante un periodo de 12 a 24 h antes de ser analizadas. La presencia de acetona en la matriz conduce a un descenso de la cantidad de los analitos extraída con el recubrimiento de SPME, por lo que el volumen de acetona siempre se mantuvo por debajo del 0.5% del volumen total de la muestra analizar. La cantidad de acetona añadida a las muestras en los estudios de la linealidad y de la exactitud de los métodos propuestos, se mantuvo constante en todos los experimentos, independientemente de la adición realizada. I IV V. . R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 1. DETERMINACIÓN DE FRAGANCIAS SINTÉTICAS EN MUESTRAS ACUOSAS 123 IV.1. DETERMINACIÓN DE FRAGANCIAS SINTÉTICAS EN MUESTRAS ACUOSAS IV.1.1. FRAGANCIAS NITROGENADAS Dado que las fragancias nitrogenadas evidencian un carácter más tóxico1,2 que las fragancias policíclicas y están sometidas a mayores restricciones, se decidió comenzar el estudio de determinación de fragancias sintéticas en muestras acuosas por este grupo de compuestos. La mayoría de los métodos publicados hasta el momento para el análisis de fragancias sintéticas, están centrados en el estudio de las fragancias policíclicas, aunque algunos incluyen algún compuesto nitrogenado. Tal como se indicaba en el Apartado II.1.2 del Capítulo de Introducción, son pocos los trabajos desarrollados hasta el momento sobre la aplicación de la SPME para el análisis de estos compuestos en agua, pero ponen de manifiesto el potencial de esta técnica para este fin3,4. Sin embargo, en estos trabajos, por una parte, no se ha incluido la familia completa de fragancias nitrogenadas, y por otra, no se han optimizado los factores que afectan al proceso de microextracción o se han investigado utilizando metodología univariante. Considerando estas premisas, se decidió desarrollar un método de SPME y cromatografía de gases con detector de micro captura electrónica (GC-µECD) para la determinación de esta familia de fragancias. En concreto, se seleccionaron cuatro de los cinco compuestos pertenecientes al grupo de las fragancias nitrogenadas que todavía pueden encontrarse en productos comerciales. Los factores que afectan a la SPME se optimizaron mediante diseño experimental, permitiendo seleccionar las mejores condiciones de trabajo minimizando el número de experiencias y considerar las interacciones entre factores que no son detectables mediante el ensayo individual. Los resultados obtenidos en la optimización se discuten en los siguientes apartados, así como el estudio de los parámetros analíticos de calidad del método propuesto. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 3. DETERMINACIÓN DE PBBs Y PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA 226 IV.3.2.3.1 Estudio de la linealidad, LODs y repetibilidad del método El estudio de la linealidad del método, se realizó mediante la obtención de curvas de calibrado empleando disoluciones en agua ultrapura en el rango de concentraciones para cada compuesto indicado en la Tabla IV.3.2.3.1.1. Cada nivel de concentración se analizó por duplicado o por triplicado. Las curvas de calibrado fueron lineales en todo el rango de concentraciones estudiado y los valores de los coeficientes de correlación (R2) fueron iguales o superiores a 0.997 para todos los compuestos (excepto para el BDE-3), demostrando que existe una relación directamente proporcional, en este caso lineal, entre la cantidad de analito extraída y la que existe inicialmente en la muestra para el rango de concentraciones estudiado. Además, se calcularon los LODs para cada congénere, que también se incluyen en la tabla, como la concentración correspondiente a una señal analítica tres veces superior al ruido de fondo, encontrándose comprendidos entre 7.5 pg/L para el PBB-49 y 190 pg/L para el BDE- 3. Tabla IV.3.2.3.1.1. Intervalos de concentración, coeficientes de correlación (R2) y límites de detección (LODs) obtenidos en el estudio de la linealidad del método. Compuesto Intervalo de concentración (pg/mL) Coeficiente de correlación (R2) LODs (S/N=3, pg/L) BDE-3 1-500 0.9977 190 PBB-15 1-500 1.000 9.0 PBB-49 1-500 1.000 7.5 BDE-47 0.41-205 0.9998 20 BDE-100 0.12-60 1.000 60 BDE-99 0.41-205 0.9999 47 BDE-85 0.1-5 0.9991 49 BDE-154 0.3-15 1.000 150 BDE-153 0.2-10 0.9995 100 La repetibilidad se estudió a dos niveles de concentración diferentes y realizando las pruebas por triplicado. En la Tabla IV.3.2.3.1.2 se muestran los valores de RSD calculados en tanto por cien para cada nivel. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 3. DETERMINACIÓN DE PBBs Y PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA 227 Tabla IV.3.2.3.1.2 Repetibilidad del método propuesto. Compuesto Concentración (pg/mL) Repetibilidad (RSD %, n=3) Concentración (pg/mL) Repetibilidad (RSD %, n=3) BDE-3 10.0 4.4 199 6.3 PBB-15 10.1 3.8 201 12 PBB-49 9.5 2.8 190 1.7 BDE-47 4.1 17 82 1.2 BDE-100 1.2 15 24 10 BDE-99 4.1 20 82 9.3 BDE-85 0.1 - 2.0 10 BDE-154 0.3 24 6.8 9.3 BDE-153 0.2 26 4.6 8.8 Se puede concluir que la repetibilidad del método es buena dado que para el nivel más bajo, la variación se encontró entre 3.8% para el PBB-15 y 26% para el BDE-153, y entre 1.2% para el BDE-47 y 12% para el PBB-15, al nivel más alto de concentración. IV.3.2.3.2. Estudio de la recuperación. Aplicación a muestras reales. El método SPME-GC-MS, una vez optimizado, se aplicó a la determinación de los compuestos estudiados (dos PBBs y siete BDEs) en muestras reales de agua, en concreto a agua de grifo y a aguas residuales urbanas, antes y después de su tratamiento, es decir, muestras de influente y efluente de una planta de tratamiento, respectivamente. En el análisis inicial de las muestras no se detectaron concentraciones al nivel de los LODs para ningún compuesto, por lo que se utilizaron para estudios de recuperación. Con los estudios de recuperación, se pretende estudiar la capacidad del método de dar resultados verdaderos, es decir, su exactitud. En este caso, se expresa como el porcentaje de recuperación entre la respuesta medida y el valor verdadero. Las muestras se filtraron y se fortificaron con estándares acetónicos de los analitos para obtener las concentraciones resumidas en la Tabla IV.3.2.3.2.1. La concentración de los compuestos se determinó por el método de calibrado externo. Tras el análisis, se calcularon las recuperaciones que, como se ve en Tabla IV.3.2.3.2.1, fueron cuantitativas para todos los compuestos por lo que no se produce efecto matriz. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 3. DETERMINACIÓN DE PBBs Y PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA 228 Tabla IV.3.2.3.2.1 Recuperación (expresada en %) de los PBDEs y PBBs para las tres muestras reales estudiadas. Muestra Agua de grifo Efluente Influente Compuesto Concentración (pg/mL) Recuperación ±RSD (%) Concentración (pg/mL) Recuperación ±RSD (%) Concentración (pg/mL) Recuperación ±RSD (%) BDE-3 1.00 99±1 10.0 100±4 199 106±10 PBB-15 1.01 97±4 10.1 92±2 201 90±6 PBB-49 0.95 90±21 9.5 94±1 190 93±5 BDE-47 0.41 91±8 4.1 97±7 82 83±7 BDE-100 0.12 100±4 1.2 83±17 24 95±4 BDE-99 0.41 87±19 4.1 90±12 82 92±8 BDE-85 0.010 nd 0.10 95±15 2,0 82±10 BDE-154 0.034 nd 0.34 100±25 6.8 74±11 BDE-153 0.023 nd 0.23 117±13 4.6 82±11 En la Figura IV.3.2.3.2.1 se muestran el cromatograma de iones de la muestra de influente adicionada con las concentraciones indicadas en esta tabla. En conclusión, la validación del método analítico propuesto demuestra que las características representativas del mismo cumplen con las especificaciones para su aplicación en el análisis de los compuestos estudiados a nivel traza en muestras de agua y aguas residuales. Además reúne las cualidades para ser considerado un método fiable, reproducible y sobre todo sensible, es decir, permite alcanzar límites de detección muy bajos, adecuados al nivel de cuantificación requerido para el cumplimiento de la Directiva comunitaria 2006/0129 (COD) de reciente aprobación por el Parlamento europeo27. Los resultados de este estudio se han publicado en la revista Analytical Chemistry 76 (2004) 1054, que se adjunta en el Anexo VI.2. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 3. DETERMINACIÓN DE PBBs Y PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA 229 10.0 12.5 15.0 17.5 Minutos 0 5 10 15 20 25 kCuentas 0 5 10 15 20 25 kCuentas 0 50 100 150 kCuentas 0 5 10 15 20 25 kCuentas 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 kCunetas 0 100 200 300 400 500 600 Cuentas Iones: 141+220 Iones: 389+391 Iones: 324+326+328 Iones: 404+406 Iones: 482+484+486 BDE-3 PBB-15 PBB-49 BDE-47 BDE-100 BDE-99 BDE-154 BDE-153 Figura IV. 3.2.3.2.1 Cromatograma de iones de una muestra de influente con adición de los compuestos al nivel de concentración indicado en la Tabla IV.4.2.3.3.1. BDE-85 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 3. DETERMINACIÓN DE PBBs Y PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA 230 BIBLIOGRAFÍA (1) T. McDonald, Chemosphere 46 (2002) 745. (2) Environmental Health Criteria 192. Flame retardants: A General Introduction; World Health Organization (WHO), Ginebra, Suiza, 1994. (3) J. H. Christensen, J. Platz, J. Environ. Monit. 3 (2001) 543. (4) M. Alaee, D. B. Sergeant, M. G. Ikonomou, J. M. Luross, Chemosphere 44 (2001) 1489. (5) S. Lacorte, M. Guillamón, E. Martínez, P. Viana, D. Barceló, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 892. (6) U. Sellström, A. Kierkegaard, C. de Wit, B. Jansson, L. Asplund, L. Bergander, A. Bignert, T. Odsjö, M. Olsson, Organohalogen. Compd. 28 (1996) 526. (7) U. Sellström, A. Kierkegaard, C. de Wit, B. Jansson, Environ. Toxicol. Chem. 17 (1998) 1065. (8) U. Sellström, B. Jansson, Chemosphere 31 (1995) 3085. (9) B. Van Bavel, E. Sundelin, J. Lillback, M. Dam, G. Lindstrom, Organohalogen. Compd. 40 (1999) 359. (10) P. Landín, M. Llompart, M. Lourido, R. Cela, J. Microcolumn Sep. 13 (2001) 275. (11) P. Landín, M. Llompart, M. Lourido, C. García-Jares, N. Carro, R. Cela, J. AOAC Int. 86 (2003) 44. (12) Ch. Brochu, S. Moore, G. Hamelin, Nota de aplicación Varian 64, 2000. (13) M. Lauševic, M. Splendore, R. E. March, J. Mass Spectrom. 31 (1996) 1244. (14) J. B. Plomley, R. S. Mercer, R. E. March, Organohalogen. Compd. 23 (1995) 7. (15) D. G. Hayward, K. Hooper, D. Andrzejewski, Anal. Chem. 71 (1999) 212. (16) J.-W. Choi, S. Fujimaki, K. Kitamura, S. Hashimoto, H. Ito, N. Suzuki, S.-I. Sakai, M. Morita, Environ. Sci. Technol. 37 (2003) 817. (17) A. Sjödin, D. G. Patterson, A. Bergman, Environ. Sci. Technol. 35 (2001) 3830. (18) V. Pino, J. H Ayala., A. M. Afonso, V. González, Anal. Chim. Acta 477 (2003) 81. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 3. DETERMINACIÓN DE PBBs Y PBDEs EN MUESTRAS DE AGUA 231 (19) R. Doong, S. Chang, Anal. Chem. 72 (2000) 3647. (20) E. Shirey, R. F. Mindrup, Supelco, Nota de Aplicación Sigma-Aldrich, 1999. [http://info.sial.com/Graphics/Supelco/objects/8000/7943.pdf]. (21) A. Palm, I. T. Cousins, D. Mackay, M. Tysklind, C. Metcalfe, M. Alaee, Environ. Pollut. 117 (2002) 195. (22) M. Möder, P. Popp, R. Eisert, J. Pawliszyn, Fresenius J. Anal. Chem. 610 363 (1999) 680. (23) J. J. Langelfeld, S. B. Hawthorne, D. J. Miller, Anal. Chem. 68 (1996) 144. (24) T. Gorecki, J. Pawliszyn, Analyst 122 (1997) 1079. (25) T. Gorecki, A. Khaled, J. Pawliszyn, Analyst 123 (1998) 2819. (26) Pawliszyn, J. Solid-Phase Microextraction: Theory and Practice; Wiley-VCH:Nueva York, 1997. (27) Comisión de las Comunidades Europeas. Propuesta 2006/0129 (COD) de la Directiva del Parlamento Europeo y del Consejo relativa a las normas de calidad ambiental en el ámbito de la política de aguas y por la que se modifica la Directiva 2000/60/CE. Diario Oficial de las Comunidades Europeas. Bruselas, 17-7-2006. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 233 IV.4 ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN (Kfs) DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs) Debido a la diversidad de aplicaciones de los BFRs, su distribución en el medioambiente se puede producir a través de múltiples fuentes y rutas de transporte. Los PBDEs y los PBBs, son de los grupos más estudiados en cuanto a su determinación analítica en muestras ambientales; sin embargo, todavía no existe suficiente información acerca de sus efectos sobre la salud humana, aunque ya se han demostrado efectos tóxicos en ensayos de laboratorio. Por tanto, resulta necesario un estudio más completo sobre las propiedades físicoquímicas de estos compuestos, con el objetivo de conocer su potencial distribución, bioacumulación y toxicidad en el medioambiente. En el Capitulo anterior, se demostró la aplicación de la SPME como técnica analítica en la determinación de los PBDEs y los PBBs. La SPME presenta, además, otras aplicaciones, tal como se comentaba en el capítulo de Introducción, como la determinación de los coeficientes de microextracción (Kfs) que pueden servir como base para la estimación de la lipofília y bioacumulación de un compuesto, a través de su correlación con los coeficientes de partición octanol-agua (Kow). Así, el objetivo de este capítulo de la Tesis se centró, por una parte, en la estimación de los coeficientes de partición entre la fibra de polidimetilsiloxano (PDMS) y muestras de agua, basándose en la depleción mediante extracciones múltiples como método de calibración, y por otra, en establecer una correlación entre estos coeficientes y los Kow para estos compuestos. Este método se utilizó previamente con éxito en la determinación de los coeficientes de microextracción para otros compuestos de bajo peso molecular1,2,3. Los resultados obtenidos en este estudio se desarrollan y discuten a continuación. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 234 V.4 ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN (Kfs) DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs) IV.4.1 FUNDAMENTO TEÓRICO……………………………………………………………..….. 235 IV.4.2 PARTE EXPERIMENTAL…………………………………………………………….……. 238 IV.4.2.1 Patrones y muestras………………...……………………………………………….…… 238 IV.4.2.2 Procedimiento de microextracción en fase sólida………………………………….…. 238 IV.4.2.3 Condiciones instrumentales de medida……………………………..…………………. 240 IV.4.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………..…………….. 240 IV.4.3.1 Estudios preliminares de la SPME basados en la cuantificación mediante inyección líquida………………………………………………………………………………………………... 240 IV.4.3.2 Determinación de Kfs mediante depleción……………………………………...……… 243 IV.4.3.3 Correlación entre log Kfs-log Kow…………………………………………………...……. 252 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………….…. 254 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 235 IV.4.1 FUNDAMENTO TEÓRICO Para el fundamento teórico del método utilizado en este estudio, se adoptó una estrategia de cuantificación basada en la microextracción múltiple de una misma muestra y se consideró la eficacia de extracción (α) propuesta por Urruty y Montury1. La eficacia de extracción representa la porción de analito extraída por la fibra (nf1 para la primera extracción) frente a la cantidad inicial presente en la muestra (ns0), y sólo va a depender de las propiedades del recubrimiento polimérico y del analito. nf1= αns0 Ecuación IV.4.1.1 siendo α para un sistema de tres fases en equilibrio (αeq): αeq= KfsVf/(KhsVh+ KfsVf+Vs) Ecuación IV.4.1.2 En donde Vf , Vs y Vhs son los volúmenes del recubrimiento polimérico, de la muestra y del espacio de cabeza sobre la muestra, respectivamente; mientras que Kfs es el coeficiente de partición entre la fibra y la muestra y Khs el coeficiente de partición entre la muestra y el espacio de cabeza. En el caso de los PBDEs y PBBs, la capacidad del espacio de cabeza puede considerarse despreciable frente a la capacidad de la fase acuosa teniendo en cuenta sus valores de la constante de Henry (ver Apartado II.3.1.1.1)4. Después de la primera extracción, la cantidad de analito que permanece en la muestra puede calcularse como una fracción de la cantidad inicial (ns0) según la siguiente ecuación: ns1=ns0- nf1=ns0-αns0=ns0(1- α) Ecuación IV.4.1.3 Mediante la realización de x extracciones consecutivas, el descenso en la cantidad de analito que queda después de la extracción puede determinarse mediante la siguiente ecuación general2: nsx=ns0(1- α)x (4) Ecuación IV.4.1.4 La cantidad de analito en la muestra disminuye exponencialmente en función de esta ecuación, de acuerdo con el estudio publicado por Arthur et al.5. Respecto a la cantidad de analito extraída por la fibra, ésta se pude determinar mediante la siguiente relación entre dos extracciones consecutivas: I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 242 En la Figura IV.4.3.1.1 se muestra la comparación entre la media de las respuestas obtenidas para cada compuesto en la inyección de 1 µL de estándar de 100 ng/mL, en el primer caso (A), preparado en disolventes diferentes, y en el segundo caso (B), utilizando tiempos de splitless diferentes. El intervalo mostrado corresponde a un nivel de confianza del 95%. Tal como se puede observar, no se observan diferencias significativas en las respuestas al modificar el tipo de disolvente, ni al modificar el tiempo de splitless. Se ha confirmado que otros factores como el diámetro interno del liner, la temperatura del inyector7 y el volumen de inyección8, también son factores críticos a la hora de calibrar SPME por inyección líquida. Además, en un estudio reciente sobre la influencia de la técnica de inyección y el sistema cromatográfico en la determinación de PBDEs mediante GC, se demostró que durante la inyección cromatográfica se pueden producir fenómenos de discriminación entre los diferentes congéneres, y en consecuencia la precisión empeora si no se seleccionan las Figura I V .4.3.1.1 Comparación entre la media de las respuestas obtenidas para cada compuesto (cuentas de área) en la inyección de 1 µL de estándar: (A) preparado en disolventes diferentes (B) utilizando tiempos de splitless diferentes 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 BDE-3 PBB-15 PBB-49 BDE-47 BDE-100 BDE-99 BDE-85 BDE-154 BDE-153 Hexano Isooctano 0,5min 2 min 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 BDE-3 PBB-15 PBB-49 BDE-47 BDE-100 BDE-99 BDE-85 BDE-154 BDE-153 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 243 condiciones adecuadas. La inyección on-column resultó ser la más eficaz, en función de los datos obtenidos en este estudio9. Teniendo en cuenta estos aspectos sobre la inyección líquida, se decidió emplear una estrategia alternativa para estimar los valores de Kfs de los BFRs basándose en un método de depleción mediante extracciones múltiples. IV.4.3.2 Determinación de Kfs mediante depleción Como se introdujo en el Apartado II.5.1.1, la extracción múltiple consiste en realizar extracciones sucesivas del mismo vial. La estimación de los Kfs requiere conocer la cantidad de analito extraída de forma muy precisa, por lo que debemos asegurarnos de que, durante este procedimiento, no se producen fenómenos de adsorción, ya que estos efectos podrían conducir a resultados erróneos. De hecho, en compuestos de alto peso molecular, como los PCBs, se han demostrado estos fenómenos de adsorción, tanto en las paredes de los viales, como en las barras agitadoras, afectando significativamente al cálculo de los Kfs10,11,12. Por tanto, los primeros experimentos se orientaron hacia el estudio de las posibles pérdidas de los compuestos mediante fenómenos de adsorción. En estos experimentos, se introdujeron alícuotas de 100 mL de muestra dopada con 100 pg/mL de los compuestos en tres viales de 120 mL. Se colocó también una barra agitadora en cada vial y las muestras se extrajeron a 100ºC tal como se describe en el Apartado IV.4.2.2, durante 1, 2 y 8 horas, respectivamente. Tras la extracción, a cada uno de los viales y barras agitadoras se les adicionó 10 mL hexano y se mantuvieron en un baño de ultrasonidos durante 20 minutos con el fin de extraer la posible cantidad de analito adsorbida sobre las paredes. Los lavados recogidos se inyectaron directamente y, además, se concentraron 5 mL a 100 µL antes de su inyección. En la inyección directa de los lavados no se detectó ninguno de los compuestos, pero en los concentrados se detectaron BDE-47, BDE-100 y BDE-99. No obstante, las pérdidas por adsorción variaron entre 0.6% para el BDE-47 y 2.8% para el BDE-99, confirmando que no son significativas en el balance de masas total del proceso de microextracción. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 244 Una vez demostrado que los fenómenos de adsorción no son significativos, se llevaron a cabo los experimentos de depleción mediante la realización de extracciones múltiples de una misma muestra con una fibra de 100 µm de PDMS. Se seleccionó esta fibra entre las disponibles comercialmente porque se trata de un polímero líquido, y el proceso de reparto se produce por absorción, fenómeno confirmado mediante imágenes de microscopia fluorescente por Mayer et al.13, lo que permite considerar un mecanismo de extracción no competitivo e independiente de la concentración14, evitándose los posibles efectos de interacción entre compuestos (ver Apartado II.5.1.3). Los primeros experimentos de depleción se realizaron a 100ºC. Una única muestra (10 mL) dopada con 200 pg/mL se extrajo en modo espacio de cabeza (10 mL) durante dos horas. Tras este periodo de extracción, la fibra se inyectó en el sistema cromatográfico y, a continuación, se expuso nuevamente al espacio de cabeza del vial para realizar la siguiente extracción. En la Figura IV.4.3.2.1 se muestran los cromatogramas obtenidos en cinco extracciones sucesivas de esta muestra. Tal como se puede ver, las áreas de pico para cada compuesto diminuyen progresivamente con cada extracción, aunque se pueden apreciar diferencias entre los congéneres. Por ejemplo, mientras que el área de pico para PBB-49 es mayor que el de PBB-15 en la primera extracción, en la segunda extracción el área de pico para ambos compuestos es similar. Figura IV.4.3.2.1. Cromatogramas de ión total de cinco microextracciones sucesivas (en escala de colores) de una muestra acuosa adicionada mediante GC-MS/MS. cuentas de área 0 25 50 75 100 125 BDE-47 7 9 10 11 12 13 14 15 16 minutos BDE-3 PBB-15 PBB-49 BDE-100 BDE-99 BDE-85 BDE-154 BDE-153 150 x 10 3 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 245 Por otra parte, en la Figura IV.4.3.2.2 (A) se recogen las curvas de depleción para cada compuestos obtenidas mediante la representación del área de pico frente al número de extracciones (x) -1. Se observa una caída exponencial en la respuesta de acuerdo con la Ecuación IV.4.1.6. Esta disminución en la señal se debe a un descenso en la cantidad de analito que permanece en la muestra. Como se pude apreciar en la Figura, para la mayoría de los compuestos, tras cinco extracciones se consigue extraer significativamente la cantidad de analito inicial en la muestra, Figura IV.4.3.2.2 Depleción a 100ºC: (A) Descenso en el área de pico con el número de extracciones; (B) Log (área de pico) vs. número de extracciones. Número de extracciones (x-1) 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 0 1 2 3 4 5 cuentas de área BDE-3 PBB-15 PBB-49 BDE-47 BDE-100 BDE-99 BDE-85 BDE-154 BDE-153 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 0 12345 log Ax (A) (B) I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 246 por tanto la extracción múltiple podría utilizarse como técnica de cuantificación mediante un número pequeño de extracciones. Las diferencias en el comportamiento durante la depleción entre los compuestos de estudios se hace más evidente si se representa el área de pico en forma logarítmica, tal como se muestra en la Figura IV.4.3.2.2 (B). De acuerdo con la Ecuación IV.4.1.7, la eficacia de extracción (αt=2h) para cada compuesto se pude calcular a partir de la pendiente de la recta representada. En al Tabla V.4.3.2.2 se recogen, junto con el valor de la pendiente para la recta de depleción de cada compuesto, el coeficiente de regresión (r2) y la eficacia de extracción calculada (αt=2h). Tabla V.4.3.2.2 Pendientes, coeficientes de regresión, eficacias de extracción y logaritmo de los valores de Kfs obtenidos en los experimentos de depleción a 100ºC. Compuesto Pendiente (1-α) Coeficiente de regresión (r2) Eficacia de extracción (αt=2h) Log Kfs BDE-3 -0.07±0.01 0.978 0.15±0.01 3.47 PBB-15 -0.18±0.01 0.994 0.34±0.01 3.91 PBB-49 -0.50±0.02 0.998 0.68±0.01 4.55 BDE-47 -0.43±0.03 0.999 0.63±0.01 4.47 BDE-100 -0.43±0.02 0.995 0.63±0.01 4.73 BDE-99 -0.40±0.03 0.991 0.60±0.01 4.81 BDE-85 -0.31±0.02 0.994 0.51±0.02 4.77 BDE-154 -0.38±0.03 0.990 0.58±0.03 5.21 BDE-153 -0.32±0.03 0.987 0.51±0.03 5.30 Los resultados de depleción se ajustan adecuadamente a un modelo lineal de primer orden, obteniendo un r2>0.990 para la mayoría de los compuestos. Respecto a la eficacia de extracción, los valores más bajos se obtuvieron para los compuestos menos bromados BDE-3 (un monoBDE) y PBB-15 (un diPBB). Observando con detenimiento la Figura IV.4.3.2.2 (B), se aprecia como la disminución en la cantidad de analito durante las extracciones sucesivas para estos dos compuestos, no es tan marcada como para el resto de BFRs. Por el contrario, las mayores eficacias de extracción se obtuvieron para los compuestos con mayor grado de bromación, para los cuales se consigue extraer entre un 50 y un 70% de la I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 247 cantidad inicial de analito en la muestra con un sólo muestreo. Este hecho explica la alta sensibilidad obtenida en la aplicación de la SPME al análisis de PBDEs y PBBs desarrollada en el capítulo anterior. En función de la Ecuación IV.4.1.8, los coeficientes de partición (Kfs) pueden calcularse fácilmente a partir de αeq, si el sistema se encuentra bajo condiciones de equilibrio; o a partir de αt de acuerdo con la ecuación Ecuación IV.4.1.12, si aun no se alcanzado el equilibrio. En este caso, es necesario conocer la constante cinética (b). Para conocer si el sistema se encuentra en equilibrio en las condiciones de los experimentos de depleción, se tomó como referencia el estudio de la cinética de extracción de PBDEs y PBBs incluido en el capítulo anterior (ver Figura IV.3.2.2.4.1). De las curvas cinéticas se concluye que los compuestos menos bromados, incluyendo mono-, di-, y tetra-congéneres, alcanzan en el equilibrio en dos horas; mientras que los penta y hexaBDEs no alcanzan el equilibrio con cuatro horas de exposición, aunque parecen estar próximos a esta condición. La Ecuación IV.4.1.10 se ajusta bien a los datos obtenidos (r2>0.99), tal como se desprende de la Figura IV.4.3.2.3, lo cual permite obtener la constante cinética (b). Figura IV.4.3.2.3. Cinética de extracción para algunos compuestos representativos a 100ºC. Ajuste según la Ecuación 5.1.10. cuentas de área minutos 0 50 100 150200 250 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 PBB-49, b=0.07±0.04, r 2 = 0.9964 BDE-3, b=0.043±0.001, r 2 = 0.9997 BDE-100, b=0.015±0.002, r 2 = 0.9891 BDE-154, b=0.0056±0.0002, r 2 = 0.9955 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 248 El logaritmo de los Kfs calculados según la Ecuación IV.4.1.8 para cada compuesto que alcanzó el equilibrio en dos horas (αeq=αt=2h), y según la Ecuación IV.4.1.12 para los que no alcanzaron el equilibrio se recogen en la Tabla V.4.3.2.2. Los valores calculados se encuentran entre 3.47 y 5.30. Los valores de Kfs aumentan con la lipofilia de los compuestos, la cual viene determinada por el grado de bromación de los compuestos (ver Apartado II.3.1.1.1); por tanto, los compuestos más bromados presentan los valores de Kfs más altos, resaltando su gran afinidad por el recubrimiento de PDMS. Por otra parte, no se apreció un descenso en los valores de Kfs con el aumento del peso molecular de los compuestos, confirmando que la distribución de los analitos desde la muestra a la fibra esta controlada por mecanismos de absorción, como se concluyó en estudios previos13,15. El procedimiento de depleción a 100ºC se repitió con fibras de PDMS diferentes varios meses después, bajo las mismas condiciones de extracción y cromatográficas, con el objetivo de verificar la reproducibilidad de la aproximación propuesta, no encontrando diferencias significativas en los valores de las eficacias de extracción y Kfs para cada compuesto. Una vez demostrada la aplicabilidad del método de depleción con los experimentos a 100ºC, se llevó a cabo el proceso de depleción a 25ºC. En este caso el tiempo de extracción seleccionado para la realización de las extracciones sucesivas fue de 24 horas y el número total de extracciones fue cinco. En la Figura IV.4.3.2.4 (A) se muestran las curvas de depleción para algunos compuestos representativos obtenidas mediante la representación del área de pico frente al número de extracciones (x-1). Se observa un descenso exponencial en la respuesta para los compuestos menos pesados de acuerdo con la Ecuación IV.4.1.6, mientras que para los compuestos de alto peso molecular (penta y hexaBDEs), la disminución en la respuesta no es tan marcada. Mediante la representación de los logaritmos del área de pico, como muestra la Figura IV.4.3.2.4 (B), la depleción se visualiza mejor. Según la Ecuación IV.4.1.7, la eficacia de extracción (αt=24h) para cada compuesto se puede obtener a partir de la pendiente de la recta. Tal como se expuso en la depleción a 100ºC, es necesario conocer si el sistema se encuentra en condiciones de equilibrio, por lo que también se incluyó el estudio de la cinética de extracción a 25ºC, en este caso prolongando el tiempo de extracción hasta 8 días. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 249 En la Figura IV.4.3.2.5 se recogen las curvas cinéticas a 25ºC para algunos compuestos representativos. A temperatura ambiente, ningún compuesto de los considerados alcanza el equilibrio en 8 días, excepto BDE-3 y PBB-15; por tanto, es necesario calcular la constante cinética (b) para poder estimar los Kfs de todos los compuestos. Figura IV.4.3.2.4 Depleción a 25ºC: (A) Descenso en el área de pico con el número de extracciones; (B) Log (área de pico) vs. número de extracciones. 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 0 1 2 3 4 cuentas de área BDE-3 PBB-49 BDE-47 BDE-99 BDE-154 (A) 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 6,5 0 1 2 3 4 x-1 lo g Ax (B) I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 250 Sin embargo, no todas las curvas cinéticas se ajustan a la Ecuación IV.4.1.10. De hecho sólo se consigue un buen ajuste para los compuestos menos bromados (mono-, di- y tetra-congéneres), los cuales alcanzan el equilibrio en 8 días o están próximos a alcanzarlo con este tiempo de extracción. No se consiguió un ajuste adecuado para los compuestos más bromados ya que se encuentran muy lejos de las condiciones de equilibrio. El tiempo de extracción necesario para que estos compuestos alcancen el equilibrio es demasiado largo (posiblemente varias semanas), condiciones que podrían derivar en resultados anómalos ya que no está garantizada la estabilidad de la muestra. Debido a esto, no se consideró el estudio de tiempos de extracción mayores. En estas circunstancias, se estimaron sólo los Kfs a 25ºC para BDE-3, PBB-15, PBB-49 y BDE-47 mediante la Ecuación IV.4.1.12. En la Tabla IV.45.3.2.3 se incluyen las pendientes de la depleción a 25ºC, el coeficiente de regresión (r2), la eficacia de extracción calculada (αt=24h) y los logaritmos de Kfs para estos compuestos. Figura IV.4.3.2.5. Cinética de extracción para algunos compuestos representativos a 25ºC. Ajuste según la Ecuación 5.1.10. 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 cuentas deárea 0 50 100 150 200 horas PBB-15 BDE-47 (respuestas/5) BDE-100 (respuestas/2) BDE-153 b=0.019±0.003 r 2=0.9932 b=0.086±0.006 r 2=0.9993 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 4. ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN DE PBBs Y PBDEs 251 Tabla IV.4.3.2.3. Pendientes, coeficientes de regresión, eficacias de extracción y logaritmo de los valores de Kfs obtenidos en los experimentos de depleción a 25ºC. Compuesto Pendiente (1-α) Coeficiente de regresión (r2) Eficacia de extracción (αt=2h) Log Kfs BDE-3 -0.41±0.01 0.997 0.61±0.02 4.23 PBB-15 -0.544±0.003 0.991 0.71±0.02 5.20 PBB-49 -0.32±0.03 0.977 0.52±0.01 5.86 BDE-47 -0.32±0.01 0.996 0.52±0.01 6.05 BDE-100 -0.20±0.01 0.991 0.37±0.03 - BDE-99 -0.20±0.01 0.990 0.37±0.03 - BDE-85 -0.24±0.01 0.995 0.42±0.02 - BDE-154 -0.14±0.03 0.967 0.26±0.03 - BDE-153 -0.18±0.03 0.927 0.35±0.03 - A esta temperatura, las eficacias de extracción expresadas como porcentaje se encuentran entre un 40 y un 70%, excepto para los compuestos de mayor grado de bromación. En cuanto a los valores de Kfs, éstos son mayores que los obtenidos a 100ºC para BDE-3, PBB-15, PBB-49 y BDE-47, de acuerdo con fundamentos termodinámicos de SPME (ver Apartado II.4.2.1). La absorción en la fibra es un proceso exotérmico, por tanto, en condiciones de equilibrio, cuando la temperatura aumenta, la constante de distribución disminuye18. El efecto de la temperatura sobre los coeficientes se confirma con los resultados obtenidos. Por otra parte, los Kfs también aumentan respecto a la lipofília de los compuestos, tal como se encontró a 100ºC. Hasta el momento, no existen datos disponibles sobre los coeficientes de partición de los BFRs, por tanto para poder comparar los datos obtenidos en este estudio con algunos valores de referencia, se decidió tomar los Kfs para PCBs, para los cuales existen varios estudios centrados en su estimación (ver Tabla IV.4.3.2.4). Tabla IV.4.3.2.4. Comparación del logaritmo de los valores de Kfs obtenidos para los PCBs en otros trabajos publicados y los obtenidos para los PBDEs y PBBs en el presente estudio. Log Kfs Nº de sutitución PCBs13 PCBs19 PCBs20 PBDEs y PBBs a 100ºC PBDEs y PBBs a 25ºC Di 5.11 - 4.65 3.91 5.20 Tetra 5.49-5.80 5.38 5.14 4.47-4.45 5.86-6.05 Penta 5.61-5.73 5.71-5.89 5.48 4.73-4.81 - Hexa 5.44-5.52 6.16-6.28 6.01 5.21 - I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 258 IV.5 DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS IGNIFUGOS FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES IV.5.1 PARTE EXPERIMENTAL………………………………………………………………….. 259 IV.5.1.1 Patrones y muestras…………………………………………………………..………….. 259 IV.5.1.2 Procedimiento de microextracción en fase sólida……………………….……………. 260 IV.5.1.3 Condiciones instrumentales de medida……………………………………………..…. 261 IV.5.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………………..... 262 IV.5.2.1 Derivatización in situ de los BFRs fenólicos…………………………………..…… 262 IV.5.2.2 Optimización del proceso de microextracción……………………………………. 266 IV.5.2.2.1. DISEÑO MULTI-FACTORIAL CATEGÓRICO: Estudio del tipo de fibra, de la temperatura de extracción y del modo de muestreo……………………………………………. 266 IV.5.2.2.2 EVALUACIÓN DE OTROS PARÁMETROS EXPERIMENTALES: Efecto salino, efecto del volumen de las fases, de la agitación y estudio cinético………………..…………. 274 IV.5.2.3 CARÁCTERISTICAS ANALÍTICAS DEL MÉTODO DE ACETILACIÓN-IN SITUHSSPME PROPUESTO………………………………………………………………………….... 278 IV.5.2.3.1 Condiciones experimentales……………………………………………………...…… 278 IV.5.2.3.2 Linealidad, precisión y LODs……………………………………………………….…. 278 IV.5.2.3.3 Análisis de muestras reales…………………………………………………..……….. 281 IV.5.2.4 DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE LOS BFRs FENÓLICOS CON OTROS CONTAMINANTES FENÓLICOS……………………………………………………………..….. 282 BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………..…… 287 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 259 IV.5.1 PARTE EXPERIMENTAL IV.5.1.1 Patrones y muestras En estas investigaciones se utilizaron patrones de los compuestos 2-bromofenol (2-BP, 98%), 2-bromo-4-metilfenol (2-B-4-MP, 96%), 4-bromo-3-metilfenol (4-B-3-MP, 99%), 2,4- dibromofenol (2,4-DBP, 95%), 2,4,6-tribromofenol (TBP, 99%), pentabromofenol (PBP, 96%), 3,5,3’,5’-tetraclorobisfenol A (TCBPA, 98%) y 3,5,3’,5’-tetrabromobisfenol A (TBBPA, 97%) suministrados por Aldrich-Chemie (Steinheim, Alemania), y el 2,6-dibromofenol (2,6-DBP, >97%) por Fluka Chemika (Buchs, Suiza). Por otra parte, los patrones de los compuestos utilizados en el estudio del análisis simultáneo de los bromofenoles con otros compuestos fenólicos, fenol, o-cresol, p-cresol, 2,4- dimetilfenol (2,4- DMP), 2-clorofenol (2-CP), 3-clorofenol (3-CP), 4- clorofenol (4-CP), 4-cloro-3- metilfenol (4-C-3-MP), 2,6-diclorofenol (2,6-DCP), 2,4-diclorofenol (2,4-DCP), 2,5-diclorofenol (2,5-DCP), 3,5-diclorofenol (3,5-DCP), 2,3-diclorofenol (2,3-DCP), 3,4-diclorofenol (3,4-DCP), 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP), 2,3,6-triclorofenol (2,3,6- TCP), 2,3,5-triclorofenol (2,3,5-TCP), 2,4,5-triclorofenol (2,4,5-TCP), 2,3,4-triclorofenol (2,3,4-TCP), 2,3,4,6- tetraclorofenol (2,3,4,6- TeCP) y pentaclorofenol (PCP), se obtuvieron de Aldrich-Chemie. Otros reactivos, como el anhídrido acético y el bicarbonato potásico (KHCO3, 99.7%), utilizados en la etapa de derivatización, fueron suministrados por Merck (Mollet del Vallés, Barcelona, España) y Aldrich-Chemie, respectivamente. Partiendo de los patrones comerciales se prepararon disoluciones stock individuales en metanol a una concentración de 5000 µg/mL. A partir de estas disoluciones concentradas se prepararó una disolución mezcla de los compuestos incluidos en este trabajo, a nivel de 50 µg/mL en acetona, y a partir de ésta se obtuvieron, por dilución, las disoluciones para realizar adiciones. En el estudio también se utilizaron muestras de agua sin adición y con adición, preparadas según se indica en el Apartado III.3. En el proceso de optimización del método y en el estudio de los parámetros analíticos de calidad, se emplearon disoluciones en agua Milli-Q y en los estudios de aplicación del método, se analizaron muestras de agua de grifo tomadas en el propio laboratorio, muestras de agua residual compuestas, correspondientes a un flujo de 12 horas, tomadas en la entrada y la I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 260 salida de una planta de tratamiento de aguas residuales urbanas (Santiago de Compostela), y de colectores urbanos situado en la misma ciudad. Antes de su análisis, las muestras de agua residual, se filtraron con filtros de fibra de vidrio de 0.45 µm de tamaño de poro. IV.5.1.2 Procedimiento de microextracción en fase sólida La extracción y concentración de los compuestos fenólicos halogenados estudiados en las muestras de agua, se realizó siguiendo el esquema que aparece en la Figura IV.5.1.2. En primer lugar, antes de añadir la disolución de trabajo a los viales (22 mL de capacidad), se pesaron en éstos cantidades variables de NaCl entre 0 y 3.5 g, según la investigación a realizar, y 0.3 g de KHCO3. A continuación se adicionaron alícuotas de 10 mL de la disolución de trabajo y 100 µL de anhídrido acético, procediéndose al cierre de los viales con cápsulas de aluminio y septa con la cara interior recubierta de PTFE. En las pruebas en las que se necesitó la aplicación de agitación magnética, se introdujeron barras magnéticas y, a continuación, se sellaron los viales. Figura IV.5.1.2. Esquema del procedimiento de SPME empleado en la determinación de BFRs fenólicos en agua. M Mu ue es st tr ra a 1 10 0 m mL L ( (3 3) ) D DS SP PM ME E/ /H HS SS SP PM ME E 5 5- -6 60 0 m mi in n S Se ep pa ar ra ac ci ió ón n y y d de et te ec cc ci ió ón n G GC C- -M MS S E Ef fe ec ct to o s sa al li in no o 0 0- -3 35 5% % ( (p p/ /v v) ) N Na aC Cl l ( (1 1) ) T Te em mp pe er ra at tu ur ra a: : 2 25 5º ºC C, ,5 50 0º ºC C, ,1 10 00 0º ºC C T Te er rm mo os st ta at ti iz za ac ci ió ón n 5 5 m mi in n D De es so or rc ci ió ón n 2 2 m mi in n T Te em mp pe er ra at tu ur ra a 2 26 60 0º ºC C, , 2 28 80 0º ºC C y y 3 30 00 0º ºC C D De er ri iv va at ti iz za ac ci ió ón n 0 0. .3 3 g g KHCO3 (2) 100 µL anhídrido acético (4) V Vi ia al l 2 22 2 m mL L ( (2 2) ) ( (1 1) ) I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 261 Antes de la extracción, el vial con la muestra se mantuvo en un baño de agua a temperatura controlada durante 5 min, para conseguir la temperatura indicada por el experimento (25, 50 o 100ºC). Una vez perforado el septum con una aguja e introducida la guía del dispositivo de SPME, se expuso la fibra al espacio de cabeza sobre la muestra (HSSPME) o directamente a la misma (DSPME). En este estudio se consideraron cinco fibras comerciales, que cubren el espectro completo de posibilidades en cuanto a polaridad del recubrimiento, y que incluyen la fibra de 85 µm de poliacrilato (PA), la de 100 µm de polidimetilsiloxano (PDMS), la de 75 µm de Carboxenpolidimetilsiloxano (CAR-PDMS), la de 65 µm de polidimetilsiloxano-divinilbenceno (PDMSDVB) y la de 65 µm de Carbowax-divinilbenceno (CW-DVB). Una vez finalizado el periodo de extracción, 30 minutos, excepto en el estudio cinético (de 5 a 60 min), la fibra se retrajo, retirándola de forma segura en el soporte, el cual se insertó en el inyector del cromatógrafo de gases para llevar a cabo el análisis cromatográfico. La desorción se realizó durante 2 min, coincidiendo con el tiempo de purga marcado en el programa cromatográfico, a la temperatura máxima recomendada para la fibra en cuestión por el fabricante: 260ºC para la fibra de CW-DVB, 280ºC para PDMS y PDMS-DVB y 300ºC para PA y CAR-PDMS. Para evitar posibles efectos de memoria en las fibras, se prolongó el tiempo de desorción durante cinco minutos más, ya con la válvula de purga abierta en el inyector. Además, se chequearon blancos periódicamente para confirmar la ausencia de contaminación durante los análisis. IV.5.1.3 Condiciones instrumentales de medida Para el análisis mediante GC-MS, se contó con un cromatógrafo de gases modelo Varian® 3800 (Varian Chromatography System, Walnut Creek, CA), provisto de un inyector split/splitless, trabajando en el modo splitless y acoplado a un detector de masas modelo Varian® Saturn 2000 GC-MS, con trampa de iones operando en ionización electrónica (EI). El control del equipo y el procesado de la señal se llevo a cabo con el programa informático Varian® Saturn GC-MS, versión 5.418. Las condiciones instrumentales utilizadas se recogen en la Tabla IV.5.1.3. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 262 Tabla IV.5.1.3. Condiciones instrumentales de GC-MS. Varian® 3800 (GC) Columna Dimensiones Gas portador Tipo de inyector Modo de inyección Tiempo de purga Tª del inyector Relación de split Flujo en columna (He) Tª de la línea de transferencia CPSil8 CB low-bleed MS ((5% fenil, 95% dimetil)-polisiloxano) 25mx0.25mmx0.25µm He (99.999% de pureza) Split/splitless Splitless 2 min de 260ºC a 300ºC según el tipo de fibra 50 1 mL/min (constante) 300ºC Programa de Temperaturas • Primer Gradiente Tª inicial Tiempo inicial Rampa de temperatura Tª final Tiempo final Tiempo total del análisis 90ºC 2 min 10ºC/min 300ºC 6 min 28 min Varian® Saturn 2000 (MSD) Modo de ionización Voltaje del multiplicador Voltaje de modulación axial Tª de la trampa de iones Tª del manifold Rango de masas Velocidad de escaneado Corriente de emisión del filamento EI (ionización electrónica), 70 eV 1800 V 4 V 250ºC 50ºC 90-650 m/z 1 s/scan 15 µA IV.5.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN IV.5.2.1 Derivatización in situ de los BFRs fenólicos Cuando los fenoles se analizan directamente mediante GC, tienden a proporcionar picos anchos y con cola, debido a su capacidad de unirse a la fase estacionaria de las columnas cromatográficas mediante un enlace con el hidrógeno del grupo alcohol. Esto hace necesario la introducción de una etapa de derivatización para transformar los fenoles en compuestos menos polares19 Se han aplicado diferentes procedimientos de derivatización para mejorar la separación cromatográfica de fenoles halogenados, como la metilación mediante dimetilsulfato o diazometano, o la esterificación mediante anhídrido acético o bromuro de pentafluorobencilo (PFBB)20. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 263 La acetilación mediante anhídrido acético en presencia de una sal de bicarbonato como tampón es una de las reacciones de derivatización más estudiadas de las aplicadas al análisis de fenoles17,21. La reacción puede producirse en medio acuoso eficazmente, en pocos minutos y empleando reactivos de bajo coste22. La reacción de acetilación in situ seguida de la microextracción ha sido aplicada con éxito en el análisis de diferentes contaminantes fenólicos tanto en muestras de agua como en muestras sólidas16,23. Siguiendo esta línea, se decidió estudiar la adecuación del procedimiento de acetilación-in situ-SPME en el análisis de los ignífugos considerados. Para ello, se llevó a cabo la extracción de muestras de agua con adición de los compuestos a un nivel de ng/mL, después de la adición de NaCl (35% p/v) y los reactivos necesarios para la acetilación (0.3 g de bicarbonato de potasio y 100 µL de anhídrido acético), durante 30 minutos y usando una fibra de 100 µm de PDMS. De los resultados obtenidos se concluye que la técnica es viable para el análisis de BFRs fenólicos y que empleando las condiciones cromatográficas de la Tabla IV.5.1.3 se consigue una buena resolución de los compuestos. En la Tabla IV.5.2.1 se muestran los tiempos de retención (tr), bajo las condiciones cromatográficas recogidas en la Tabla IV.5.1.3, así como, los iones característicos de los espectros de masas correspondientes a los derivados acetilados obtenidos. Tabla IV.5.2.1 Tiempos de retención, iones de cuantificación e iones de identificación de los derivados acetilados de los compuestos bromados estudiados. Compuesto tR (min) Iones de identificación Iones de cuantificación 2-BP 7.15 172:174, 214:216 172+174 2-B-4-MP 8.58 186:188, 228:230 186+188 4-B-3-MP 9.11 186:188, 228:230 186+188 2,6-DBP 10.03 250: 254, 294:296 250+252+254 2,4-DBP 10.44 250:254, 294:296 250+252+254 2,4,6-TBP 12.83 328:334, 374 328+330+332+334 PBP 19.58 486:492, 533 486+488+490 TCBPA 22.44 349:353, 438:450 349+351+353 TBBPA 26.39 527:531, 542:546 527+529+531 Para la elección de los iones característicos más adecuados para la cuantificación de cada especie, se tuvo en cuenta la mejor relación señal/ruido obtenida para cada suma de iones. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 264 Figura IV.5.2.1. Espectros de masas de los derivados acetilados los compuestos ignífugos bromados considerados en este estudio. 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 174 193 214 266 311 327 383 399 415 465 505 528 555 O Br Ac 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 166 186 209 228 251 267 327 355 383 415 489 533 O Br Ac 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 160 188 228 255 300 327 355 401 478 503 535 553 O Br Ac 200 300 400 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 170 197 215 252 296 327 346 389 415 461 477 551 O Br Br Ac I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 265 Continuación Figura IV.5.2.1. 200 300 400 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 173 205 223 252 294 327 353 387 415 443 475 511 533 549 O Br Br Ac 200 300 400 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 170 207 222 250 301 330 359 374 407 428 445 463 478 537 552 O Br Br Br Ac 200 250 300 350 400 450 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 178 220 252 299 316 329 342 380 408 430 457 490 O Br Br Br Br Br Ac 200 250 300 350 400 450 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 166 187 203 229 250 264 278 301 314 351 366 405 477 OO Ac Cl Cl Cl Cl Ac I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 266 Los iones de cuantificación se corresponden con los iones del cluster base de los espectros de masas (ver Figura IV.5.2.1). En el caso de los derivados acetilados de los bromofenoles, los espectros de masas presentan como cluster base el correspondiente a la perdida del grupo acetilo, mientras que para los bisfenoles halogenados, se corresponde con la perdida de los grupos acetilo y un grupo metilo. En cuanto a los isómeros, estos se identificaron mediante el tiempo de retención obtenido en el análisis de los compuestos por separado. IV.5.2.2 OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE MICROEXTRACCIÓN IV.6.2.2.1. DISEÑO MULTI-FACTORIAL CATEGÓRICO: Estudio del tipo de fibra, de la temperatura de extracción y del modo de muestreo. Una vez confirmada la posibilidad de llevar a cabo la derivatización-in situ-SPME de los compuestos seleccionados, se realizó el estudio de los parámetros más influyentes en el proceso de extracción. Para ello se seleccionó un diseño multifactorial categórico, el cual permite evaluar un mayor número de niveles de los factores considerados. En este caso, se incluyó en el diseño, el tipo de fibra, pudiendo considerar cinco fibras comerciales (PA de 85 µm, PDMS de 100 µm, CW/DVB de 65 µm, CAR/PDMS de 75 µm y PDMS/DVB de 65 µm), la temperatura de extracción, estudiada a tres niveles (25, 50 y 100ºC) y el modo de muestreo (DSMPE y HSSPME). Continuación Figura IV.5.2.1. 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0% 25% 50% 75% 100% 165 181 196 212 242 277 293 340 358 385 408 434 490 508 529 O Br Br Br O Br Ac Ac I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 267 El diseño seleccionado 5*3*2, se trata de un diseño de resolución tipo V24, lo que permite, tal como se explicaba en el capitulo de Introducción, evaluar los efectos principales, así como, las interacciones entre factores, que en muchas ocasiones pueden ofrecer información relevante a la hora de la puesta punto del método de microextracción. Además, dispone de ocho grados de libertad para evaluar el error experimental, lo que proporciona estimaciones certeras de los resultados. La selección de los valores del resto de factores, que se mantuvieron constantes durante las experiencias marcadas por el diseño, se basó en diferentes consideraciones. El tiempo de extracción se seleccionó de forma que se consiguiese el máximo rendimiento teniendo en cuenta el tiempo necesario para el análisis cromatográfico (ver Tabla IV.6.1.3), por lo que se determinó un tiempo de extracción de 30 minutos. Por otra parte, teniendo en cuenta que la adición de sal puede favorecer el paso de los analitos orgánicos de la matriz de la muestra hacia la fibra, se decidió adicionar a la muestra NaCl al 35% p/v. Además, se utilizó agitación magnética para acelerar la transferencia de masa en el medio acuoso. Tal como se recoge en el Apartado II.5.1, el diseño realizado permite estudiar los resultados obtenidos tras la realización de las 30 experiencias que propone, mediante diferentes tests estadísticos y opciones gráficas. La finalidad es obtener los factores que presentan un efecto significativo para cada compuesto, de la manera más sencilla posible y la robustez estadística necesaria. Una de estas opciones es el ANOVA, que ya se presentó en el estudio de aplicación de la SPME al análisis de fragancias sintéticas (ver Apartado IV.1.2.2). El ANOVA permite identificar los factores significativos mediante la estimación de los valores de la constante F para cada factor e interacción. En la Tabla IV.5.2.2.1.1 se recogen los valores de F así como los valores de p, para cada compuesto. El valor de F nos da una idea de la contribución de cada factor o interacción a la varianza de la respuesta para cada compuesto, y el valor de p prueba la significación estadística de estos efectos. Los factores o interacciones que presentan valores de p menores de 0.05 (señalados en negrita), se consideran estadísticamente significativos. Así, podemos comprobar como la temperatura de extracción (B) presentó un efecto significativo para todos los compuestos, excepto para el PBP y los bisfenoles, y como el modo de extracción (C), así como su interacción con la temperatura (BC), también fueron factores significativos en la extracción de varios compuestos. El tipo de fibra (A), por su parte, mostró un efecto significativo en la extracción de los compuestos 2-BP, 2-B-4-MP, PBP y TBBPA. Para este último, también fue significativa la interacción entre la fibra y el modo de muestreo (AC). I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 274 IV.5.2.2.2 EVALUACIÓN DE OTROS PARÁMETROS EXPERIMENTALES: Efecto salino, efecto del volumen de las fases, de la agitación y estudio cinético. Como se indicaba en el apartado anterior, la adición de sal no se incluyó inicialmente en el diseño. El hecho de añadir sal a la muestra provoca un incremento de la fuerza iónica de la disolución acuosa, por lo que puede disminuir la solubilidad de los compuestos orgánicos en esta fase y favorecer su desplazamiento hacia el HS o hacia la fibra25 (ver en el capítulo de Introducción el apartado II.4.3.2). Con el fin de evaluar este posible efecto positivo de la adición de sal en la extracción de los BFRs fenólicos, se realizaron extracciones de muestras acuosas con diferentes concentraciones de sal, desde 0 hasta 35% peso/volumen de NaCl. Las condiciones de extracción que se emplearon fueron, el muestreo del HS con CAR-PDMS a 100ºC, de 10 mL de muestra en viales de 22 mL. El incremento de la respuesta con el contenido de sal en la muestra se ilustra en la Figura IV.5.2.2.2.1 para algunos compuestos representativos del comportamiento general. Con este estudio, se concluye que la adición de sal es un factor importante para alcanzar mejores eficacias de extracción para todos los compuestos. El efecto del volumen de las fases implicadas en el proceso de extracción tampoco se consideró en el diseño. Figura IV.6.2.2.2.1 Efecto de la concentración de sal (% NaCl) en la HSSPME a 100ºC de algunos compuestos representativos (respuestas expresadas en cuentas de área). 0 200000 400000 600000 800000 2-BP 4-B-3-MP 2,4-DBP 2,4,6-TBP TCBPA 0% 10% 20% 35% I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 275 Sin embargo, la relación de volúmenes entre fases para el proceso de HSSPME puede tener relevancia a la hora de seleccionar las mejores condiciones. Para investigar el efecto del volumen de fases en la HSSPME de los BFRs fenólicos, se realizaron extracciones con la fibra de PDMS a 100ºC de alícuotas de 5 mL de muestra en viales de 12 (7 mL de capacidad para el HS) y 22 mL (17 mL de HS), y de alícuotas de 10 mL en viales de 22 mL (12 mL de HS). Los resultados obtenidos en estas pruebas se muestran en la Figura IV.5.2.2.2.2. Considerando sólo los aspectos termodinámicos, el incremento del volumen del espacio de cabeza debería disminuir la respuesta, si la capacidad de esta fase es importante, o no afectar a la respuesta, si la capacidad de esta fase es despreciable. Si comparamos las dos primeras barras de la Figura, las cuales representan el mismo volumen de muestra pero distinto espacio de cabeza, vemos como para la mayoría de los compuestos el volumen de HS no presenta un efecto significativo en la respuesta, excepto para el 2-BP y los bisfenoles. Para estos compuestos al aumentar el volumen de HS, la respuesta disminuye de manera importante. Por otra parte, la sensibilidad del proceso de SPME es proporcional a la cantidad de analito en la muestra, por lo que es de esperar que al aumentar el volumen de muestra aumente la respuesta. Si comparamos, la primera y última barra de la Figura, vemos que manteniendo más o menos constante el volumen de HS, pero aumentando el volumen de muestra de 5 a 10 mL, las respuestas aumentan para la mayoría de los compuestos, con la excepción otra vez del el 2-BP y los bisfenoles, para los cuales las respuestas son prácticamente iguales. Figura IV.5.2.2.2.2 Efecto del volumen de muestra y del HS en la HSSPME a 100ºC de los compuestos estudiados (respuestas expresadas en cuentas de área). 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 2-BP (x10) 2-B-4MP 4-B-3MP 2,6-DBP 2,4-DBP 2,4,6-TBP (:2) PBP TCBPA (:10) TBBPA 5 mL en vial de 12 mL 5 mL en vial de 22 mL 10 mL en vial de 22 mL I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 276 A la vista de los resultados, se decidió seguir trabajando con alícuotas de 10 mL en viales de 22 mL. Este efecto del volumen de las fases resulta difícil de explicar, ya que depende directamente de las constantes de distribución de los analitos entre las distintas fases que componen el sistema, sobre los que influyen tanto aspectos termodinámicos como aspectos cinéticos, si nos encontramos bajo condiciones de no equilibrio. Por otra parte, la agitación magnética de la muestra se consideró inicialmente en el diseño como un factor constante para favorecer la difusión del analito entre las fases, incluyendo el paso, tanto de la muestra acuosa hacia la fibra, como de la muestra al espacio de cabeza. La aceleración de la transferencia de masa entre las fases, disminuye el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio, pero no afecta a la extracción si los compuestos se encuentran bajo condiciones de equilibrio25. Para confirmar el efecto de la agitación sobre la extracción de los nueve compuestos fenólicos estudiados mediante HSSPME, se realizaron una serie de experiencias sin y con aplicación de agitación mediante el muestreo durante 30 min a 100ºC con la fibra de PDMS. En la Figura IV.5.2.2.2.3 se representan los resultados obtenidos en estas pruebas. A partir de los resultados, se llega a la conclusión de que la agitación sólo presenta un efecto significativamente positivo en la extracción de los bisfenoles. Por tanto, para favorecer la extracción de estos dos compuestos se decidió aplicar agitación a las muestras en el resto de experiencias. Figura IV.5.2.2.2.3 Efecto de la agitación sobre la extracción de algunos compuestos representativos (respuestas expresadas en cuentas de área). sin agitación con agitación 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 2-BP 4-B-3MP 2,4-DBP PBP TCBPA TBBPA (:10) I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 277 Como ya se ha comentado, el hecho de que la agitación no afecte a la extracción del resto de los compuestos bromados, indica que bajo las condiciones de extracción utilizadas y para el tiempo de extracción marcado (30 min) ya se ha alcanzado el equilibrio. Para confirmar este supuesto, se incluyó el estudio de la influencia del tiempo de extracción en la HSSPME de los nueve BFRs fenólicos. Para ello, se llevaron a cabo extracciones durante 0, 5, 15, 30 y 60 minutos, bajo las condiciones experimentales siguientes: PDMS-DVB, 100ºC y con agitación. Las curvas cinéticas obtenidas para algunos compuestos representativos se muestran en la Figura IV.5.2.2.2.4. Tal como puede apreciarse, el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio, en general, está directamente relacionado con el peso molecular de los compuestos. Confirmando los resultados encontrados en el estudio de la agitación, para los compuestos menos bromados (incluyendo el TBP) las cinéticas de extracción son relativamente rápidas y el equilibrio se alcanza en aproximadamente 15 minutos. Sin embargo, para el PBP y los bisfenoles, el equilibrio no se alcanza con 30 minutos de extracción, aunque parecen estar próximos a esta condición con 60 min de exposición. Figura IV.5.2.2.2.4 Curvas cinéticas de la HSSPME con la fibra CAR-PDMS para algunos de los BFRs fenólicos estudiados (respuestas en cuentas de área). 2,6-DBP 4-B-3-MP 2,4,6-TBP PBP TCBPA 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 0 10 20 30 40 50 60 minutos x50 x3 I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 278 En general, tal como se observa en las gráficas, el incremento de las respuestas para los compuestos que no están en equilibrio al aumentar el tiempo de extracción de 30 a 60 min, es inferior a un 10%. Por tanto, dado que es necesario establecer un compromiso entre el tiempo de análisis y la sensibilidad del método, se decidió mantener 30 minutos como tiempo de extracción. IV.5.2.3 CARÁCTERISTICAS ANALÍTICAS DEL MÉTODO DE ACETILACIÓN-IN SITUHSSPME PROPUESTO. IV.5.2.3.1 Condiciones experimentales En el estudio de los parámetros analíticos de calidad del método se emplearon las condiciones experimentales optimizadas por el diseño y las pruebas posteriores, que aparecen recogidas en la Tabla IV.5.2.3.1. Tabla IV.5.2.3.1 Condiciones experimentales del método de determinación de BFRs fenólicos en muestras de agua. Parámetro Valor Fibra CAR-PDMS, PDMS Temperatura 100ºC Modo de muestreo HSSPME Volumen de muestra 10 mL Volumen del vial 22 mL Agitación Si (magnética) Adición de sal 35% (p/v) Tiempo de extracción 30 min IV.5.2.3.2 Linealidad, precisión y LODs La linealidad del método se evaluó mediante la realización de estudios de calibrado empleando ambas fibras, CAR-PDMS y PDMS, analizando disoluciones de agua Milli-Q a distintos niveles de concentración. El rango de concentraciones estudiado fue desde los 0.1 ng/mL a los 10 ng/mL para todos los compuestos. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 279 En la Tabla IV.5.2.3.2.1 se recogen los coeficientes de correlación (R2) correspondientes a las curvas de calibrado de cada compuesto. Tabla IV.5.2.3.2.1. Coeficientes de correlación y valores de F y p para el test de fallo de ajuste, obtenidos en el estudio de la linealidad del método de HSSPME para los BFRs fenólicos. Coeficiente de regresión (R2) Valores de F Valores de p Compuesto CAR-PDMS PDMS CAR-PDMS PDMS CAR-PDMS PDMS 2-BP 0.9980 0.9967 4.66 3.74 0.12 0.09 2-B-4-MP 0.9978 0.9983 4.74 1.48 0.12 0.31 4-B-3-MP 0.9987 0.9988 1.93 0.83 0.30 0.54 2,6-DBP 0.9960 0.9979 6.96 3.94 0.07 0.05 2,4-DBP 0.9996 0.9990 1.23 3.16 0.43 0.10 2,4,6-TBP 0.9997 0.9999 6.65 0.90 0.08 0.50 PBP 0.9990 0.9994 0.18 1.80 0.70 0.23 TCBPA 0.9977 0.9990 0.01 0.09 0.93 0.96 TBBPA 0.9964 0.9972 0.02 0.03 0.98 0.99 Todos los compuestos presentaron una relación directamente proporcional, entre la cantidad de analito extraída y la que existe inicialmente en la muestra, tanto con la fibra de CAR-PDMS (R2≥ 0.996), como con la fibra de PDMS (R2≥ 0.997). Para completar el estudio, se realizó un análisis de la varianza de la regresión (ANOVA). Éste análisis se compone del test de fallo de ajuste, que determina si el modelo seleccionado es adecuado para describir los datos experimentales obtenidos, o si debería utilizarse un modelo más complejo. El test compara la variabilidad de los residuales del modelo propuesto con la variabilidad de los datos observados (cuentas de área) para los valores replicados de la variable independiente (concentración conocida de cada uno de los compuestos en las muestras de agua Milli-Q). Los resultados del ANOVA para el rango de concentraciones considerado y un intervalo de confianza del 95% también se recogen en la Tabla IV.5.2.3.2.1. Los valores de p para el test de fallo de ajuste fueron iguales o mayores a 0.05, esto nos indica que el modelo lineal de primer orden seleccionado resulta adecuado para explicar los datos experimentales, para todos los compuestos con ambas fibras. Los LODs se estimaron como la concentración correspondiente a una señal analítica tres veces superior al ruido de fondo. Para calcular la señal correspondiente al ruido de fondo, se promedió el área de cinco picos tomados en las proximidades del pico cromatográfico7. I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 280 Los LODs estimados para cada uno de los compuestos se recogen en la Tabla 5.2.3.2.2, y como puede comprobarse, estos fueron inferiores a 15 pg/mL con la fibras de CARPDMS, excepto para el PBP (46 pg/mL); e inferiores a 16 pg/mL con la fibra de PDMS, remarcando la alta sensibilidad del método con ambas fibras. Tabla IV.5.2.3.2.2. Límites de detección obtenidos mediante acetilación-in situ-HSSPME-GC- MS para los BFRs fenólicos incluidos en este estudio. LODs (S/N=3, pg/mL) Compuesto CAR-PDMS PDMS 2-BP 2.1 16 2-B-4-MP 1.3 6.5 4-B-3-MP 2.2 9.2 2,6-DBP 2.0 8.0 2,4-DBP 2.2 13 2,4,6-TBP 1.3 2.5 PBP 46 12 TCBPA 15 12 TBBPA 12 12 La precisión del procedimiento experimental se evaluó a dos niveles de concentración, 0.1 y 2 ng/mL, calculando la desviación estándar relativa (RSD) de tres réplicas para cada nivel. En la Tabla IV.5.2.3.2.3 se muestran los valores de RSD calculados. Tabla IV.5.2.3.2.3. Precisiones del método propuesto para la determinación de BFRs fenólicos. Repetibilidad (RSD %, n=3) 0.1 ng/ml 2 ng/mL Compuesto CAR-PDMS PDMS CAR-PDMS PDMS 2-BP 4.9 3.2 6.9 4.3 2-B-4-MP 4.6 5.0 7.1 1.6 4-B-3-MP 5.8 9.5 8.2 9.5 2,6-DBP 6.9 6.7 7.6 6.7 2,4-DBP 2.3 0.5 5.5 7.8 2,4,6-TBP 6.8 2.8 2.9 5.9 PBP 23 5.0 19 8.4 TCBPA 7.5 13 8.1 11 TBBPA 8.4 18 7.4 10 Para el nivel más bajo de concentración, los valores de RSD fueron inferiores al 10% para todos los compuestos y con ambas fibras, excepto para el PBP con al fibra de CAR-PDMS (23%) y para los bisfenoles con la fibra de PDMS (13% TCBPA y 18% TBBPA). Para el nivel I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 281 más alto de concentración los valores de RSD fueron similares que los encontrados a 0.1 ng/ml, siendo el PBP otra vez el que presenta la menor precisión con la fibra de CAR-PDMS. IV.5.2.3.3 Análisis de muestras reales Debido a que el proceso de microextracción se puede ver influenciado por la naturaleza de la matriz, es necesario demostrar que el método es aplicable al análisis de muestras reales. En este estudio se incluyeron tres tipos de muestras reales, agua de grifo y el efluente y el influente de una planta de tratamiento de aguas residuales urbanas. Las muestras se analizaron mediante el método propuesto e inicialmente no se encontraron concentraciones detectables de los analitos estudiados, siendo por tanto adecuadas para realizar estudios de recuperación. A las muestras de agua de grifo y efluente se les adicionó una concentración de 0.5 ng/mL de cada uno de los compuestos, mientras que al influente se le adicionó 1 ng/mL. Las concentraciones de cada analito se determinaron mediante calibrado externo obtenido mediante análisis de estándares en Milli-Q. La recuperación para cada compuesto en cada una de las muestras se calculó, entonces, como la relación entre la concentración medida según la curva de calibrado y la concentración adicionada, expresada en porcentaje. En la Tabla IV.5.2.6.1 se recogen las recuperaciones encontradas que, para la mayoría de los compuestos considerados, fueron cuantitativas. Tabla IV.5.2.6.1 Recuperaciones (en %) de los BFRs fenólicos en las muestras reales estudiadas. Recuperaciones % (± RSD, n=3) Agua de grifo Efluente Influente Influente* Comppuestos PDMS CAR-PDMS PDMS CAR-PDMS PDMS PDMS 2-BP 106±5 101±5 102±15 104±15 102±8 98±14 2-B-4MP 104±6 102±5 104±13 96±10 100±15 100±23 4-B-3MP 100±14 105±6 103±8 100±13 108±9 98±8 2,6-DBP 99±1 107±8 102±2 98±7 106±16 92±14 2,4-DBP 99±3 102±18 108±2 117±4 110±13 102±12 2,4,6-TBP 106±4 108±1 111±15 108±4 92±15 108±11 PBP 91±5 103±7 103±5 113±5 108±7 107±8 TCBPA 96±6 98±1 104±8 20±7 17±4 107±11 TBBPA 101±7 - 109±13 13±9 20±5 108±4 * Mediante calibrado por adición I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 282 La cuantificación mediante calibración externa demuestra así que resulta aceptable ya que no se evidencia la presencia de efecto matriz, excepto para los bisfenoles en la muestra de influente. Sin embargo, hay que puntualizar que esta muestra es la más compleja de todas las estudiadas. En este caso, se aplicó el método de calibración mediante adición de estándares, consistente en adicionar a la propia muestra distintos niveles de concentración de los compuestos. Igual que con el método anterior, las recuperaciones se calcularon como la relación entre la concentración medida según la curva de calibrado y la concentración adicionada, expresada en porcentaje. Éstas aparecen recogidas en la última columna de la Tabla IV.5.2.6.1 y, como puede verse, con este método fueron cuantitativas para todos los compuestos incluyendo TCBPA y TBBPA. También es importante mencionar que, excluyendo a algún dato en particular, la mayoría de las recuperaciones presentaron una RSD inferior al 15% incluso para el PBP empleando la fibra de CAR-PDMS y para los bisfenoles con la fibra de PDMS, los cuales en el estudio de la precisión habían presentado los peores resultados. En conclusión, la aplicabilidad del método en el análisis de muestras reales queda claramente confirmada, incluyendo las muestras de matriz más compleja. IV.5.2.4 DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE LOS BFRs FENÓLICOS CON OTROS CONTAMINANTES FENÓLICOS En estudios previos respecto al análisis mediante SPME de otros contaminantes fenólicos, como los clorofenoles, las condiciones de extracción optimizadas fueron similares a las seleccionadas en este estudio para los BFRs fenólicos (CAR-PDMS o PDMS, HSSPME y 100ºC)16. Este hecho abre la posibilidad de que el método propuesto pueda utilizarse para el análisis simultáneo de los BFRs y otros contaminante fenólicos (incluyendo los clorofenoles). En la Figura IV.5.2.7.1 se muestran los cromatogramas de ión seleccionado de una muestra de agua conteniendo 1 ng/mL de fenol, cuatro fenoles metilados, y dieciséis clorofenoles (incluyendo tres mono, seis di- y cinco triclorofenoles, un tetra y el pentaclorofenol), así como, los nueve compuestos objeto de estudio (ocho bromofenoles y TCBPA). I IV V R RE ES SU UL LT TA AD DO OS S E E I IN NT TE ER RP PR RE ET TA AC CI IÓ ÓN N 5. DETERMINACIÓN DE BFRs FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES 283 La extracción se realizó en el modo HSSPME a 100ºC y con la fibra de CAR-PDMS, durante 30 min. Como puede observarse, pudo realizarse la extracción simultánea de todas las familias de fenoles incluidas. Figura IV.5.2.7.1. Cromatogramas de iones seleccionados obtenido mediante HSSPME con la fibra de CAR-PDMS de una muestra de agua Milli-Q conteniendo 1 ng/mL de los compuestos fenólicos considerados. 5 10 15 20 25 minutos 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 kCuentas 0.0 2.5 5.0 7.5 kCuentas 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 kCuentas 0 10 20 30 kCuentas 0 5 10 15 20 kCuentas 0 50 100 150 200 kCuentas 0 25 50 75 100 125 kCuentas Ion: 94 Ion: 108 Ion: 122 Ion: 128 Ion: 142 Ions: 162+164 Ions: 196+198 50 100 150 200 250 kCuentas Ions: 232+234 0 Fenol 1: o-cresol 2: p-cresol 2,4-DMP 1: 2-CP 2: 3-CP 3: 4-CP 4-C-2-MP 1: 2,6-DCP 2: 2,4-DCP+2,5-DCP 3: 3,5-DCP 4: 2,3-DCP 5: 3,4-DCP 1: 2,4,6-TCP 2: 2,3,6-TCP 3: 2,3,5-TCP 4: 2,4,5-TCP 5: 2,3,4-TCP 2,3,4,6-TeCP 1 2 3 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 V. CONCLUSIONES 291 V. CONCLUSIONES Tras la discusión de los resultados obtenidos en los estudios incluidos en el Capítulo anterior, es conveniente revisar los objetivos marcados en un principio y ver si se alcanzado estos objetivos, extrayendo las conclusiones más relevantes al respecto. En general, se ha demostrado la viabilidad de la SPME para la determinación de las diferentes familias de contaminantes orgánicos emergentes considerados en muestras acuosas, resultando una alternativa válida a las técnicas utilizadas habitualmente en la etapa de preparación de muestra. La optimización de los parámetros que afectan al proceso de microextracción mediante diseño experimental permitió minimizar el número de experimentos a realizar y conseguir una interpretación más completa de los resultados al evaluar también las interacciones que pudieran producirse entre los factores. La selección de la fibra más adecuada para cada aplicación y el modo de muestreo fueron los parámetros más importantes a tener en cuenta al desarrollar el método analítico basado en SPME. Además, para mejorar la eficacia del proceso, se tuvieron en cuenta diferentes parámetros que afectan a la etapa de extracción como el tiempo de muestreo, la temperatura, la aplicación de agitación o la adición de sal. La evaluación de las características analíticas de calidad de los métodos desarrollados, confirmaron la sensibilidad de los mismos, obteniendo LODs, en la mayoría de los casos, inferiores a los publicados hasta el momento, obteniendo buena correlación lineal en los rangos de concentraciones estudiados y demostrando su aplicabilidad en el análisis de muestras reales. En los siguientes apartados se resumen las conclusiones extraídas en concreto para cada uno de los estudios. V. CONCLUSIONES 292 V.1. DETERMINACIÓN DE FRAGANCIAS SINTÉTICAS EN MUESTRAS ACUOSAS En la primera parte de este estudio enfocado hacia la determinación de la familia completa de fragancias nitrogenadas, se desarrolló un método de SPME acoplada a la cromatografía de gases con detector de micro captura electrónica (GC-µECD). Las principales conclusiones de este estudio son, que: - El diseño factorial fraccionado, permite obtener, con pocas experiencias, una amplia información de la optimización e influencia de los factores en el proceso de extracción. - Los valores óptimos para los factores significativos dados por el diseño fueron, el muestreo en espacio de cabeza, a 100ºC, resultando esenciales para alcanzar una mayor sensibilidad. - Se recomiendan las fibras CAR/PDMS o PDMS/DVB en la extracción de nitrofragancias, ya que la respuesta obtenida con ambas fibras es similar. - La adición de sal no presenta un efecto significativo en la extracción de los compuestos. - El método de HSSPME desarrollado presenta una alta sensibilidad, con LODs del orden de los pg/mL, buena correlación lineal en el rango de concentraciones estudiado y buena repetibilidad para las cuatro nitrofragancias. - Demuestra su aplicabilidad para el análisis de diferentes muestras reales, incluyendo aguas residuales. Siguiendo el estudio iniciado con las fragancias nitrogenadas, en la segunda parte del estudio, se llevó a cabo la puesta a punto de una metodología para la determinación de siete fragancias, incluyendo seis policíclicas y una macrocíclica, en muestras acuosas mediante el acoplamiento de la SPME, como técnica de preparación de muestras, y la GC-MS, como técnica de separación y detección. Las conclusiones extraídas de este estudio son: - Para una mayor eficiencia del proceso de extracción se recomienda trabajar con HSSPME para todas las fibras estudiadas. - Los tipos de fibra CAR-PDMS y PDMS-DVB son los que presentan mejores recuperaciones para todos los compuestos, por lo que, en principio cualquiera V. CONCLUSIONES 293 de ellas podría utilizarse para determinar estos compuestos. Sin embargo, la fibra CAR-PDMS presenta mayor efecto memoria que la fibra PDMS-DVB. - Para la extracción mediante HSSPME se consigue una mayor eficacia trabajando a 100ºC. - Mediante la agitación magnética de las muestras durante la extracción no se mejoran las respuestas. - La evaluación del efecto salino indica que la adición de sal no favorece la extracción de las fragancias estudiadas. - La desorción de la fibra en el cromatógrafo de gases durante 2 min, y posterior desorción en otro cromatógrafo durante 5 min, garantizan la eliminación de las fragancias de las fibras. - La linealidad y repetibilidad de ambas fibras son satisfactorias, con unos valores del coeficiente de correlación superiores a 0.990 para todos los compuestos, con una sólo excepción. Los limites de detección obtenidos para una relación señal/ruido igual a 3 son del orden de los pg/mL. - En el análisis de muestras de agua de una planta de tratamiento de aguas residuales urbanas se detectaron cinco de los siete compuestos estudiados, siendo Galaxolide y Tonalide las que presentan una mayor concentración, lo cual resulta coherente con los resultados obtenidos por otras investigaciones, debido a que estos compuestos son los utilizados mayoritariamente en las formulaciones de los productos de limpieza. Además, se demostró la posibilidad del análisis simultáneo de los distintos tipos de fragancias mediante un único método basado en HSSPME/GC/MS, ya que las condiciones de extracción que se obtuvieron para el análisis de la familia de las fragancias nitrogenadas (CARPDMS o PDMS-DVB, HSSPME y 100ºC), fueron similares a las obtenidas para las fragancias policíclicas. V. CONCLUSIONES 294 V.2. DETERMINACIÓN DE FTALATOS EN MUESTRAS DE AGUA En este apartado, se desarrolló un método de SPME acoplada a la GC-MS para el análisis de los ftalatos en muestras de agua, prestando especial atención a los aspectos metodológicos encaminados a minimizar el problema de la contaminación. Las principales conclusiones son, que: - Las mejores respuestas se alcanzan trabajando con la fibra de PDMS-DVB a 100ºC, aunque para DEHP las respuestas con PA y PDMS-DVB son comparables. - Para DMP, DEP y BBP, la eficacia de extracción fue mayor mediante el muestreo directo (DSPME) a cualquier temperatura. Para el DEHP y DOP, se observa una interacción entre ambos factores. A bajas temperaturas la respuesta mediante HSSPME es muy baja, por tanto se recomienda trabajar en DSPME, en este intervalo de temperaturas. A 100ºC, sin embargo, se produce un incremento muy pronunciado de la respuesta para HSSPME. - La agitación presenta un efecto significativamente positivo sobre la DSPME de todos los ftalatos estudiados - La adición de sal provoca un incremento en la respuesta para el DMP y el DEP, los compuestos más hidrofílicos y de menor peso molecular, mientras que para el resto de los compuestos, se observa un descenso en la señal, sobre todo en el caso del DOP. - El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio, en general, esta directamente relacionado con el peso molecular de los ftalatos. Para DMP y DEP, las cinéticas de extracción son relativamente rápidas y el equilibrio se alcanza en aproximadamente 40 minutos. Para el resto de los compuestos, el equilibrio no se alcanza incluso con 80 minutos de exposición. - El método de DSPME desarrollado para la determinación de ftalatos en agua presenta buena correlación en un rango lineal amplio, con LODs muy inferiores a los encontrados en estudios anteriores utilizando SPME, permitiendo su aplicación tanto al análisis de aguas potables como aguas residuales. - El DEP, el DBP y el DEHP son los compuestos encontrados a concentraciones más altas en las muestras analizadas. - Al contrastar los resultados obtenidos para el influente y el efluente, se observa una reducción importante en las concentraciones de estos compuestos por lo que los tratamientos son esenciales para su eliminación. V. CONCLUSIONES 295 V.3. DETERMINACIÓN DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs) EN MUESTRAS DE AGUA Con este estudio se confimó que la SPME es un técnica adecuada para la extracción de los PBDEs y los PBBs, y se desarrolló un método de detección basado en la GC acoplada a espectrometría de masas en tandem (MS/MS), para obtener una mayor sensibilidad y selectividad en la determinación: - Los parámetros del método de MS-MS, se optimizaron mediante la utilización de la herramienta AMD (Automated Method Development). - El patrón de fragmentación mayoritario es el correspondiente a la pérdida de dos átomos de bromo, [M-2Br•]+ (para PBB-15, BDE-47, BDE-100, BDE-99, BDE-153 y BDE-154), de manera similar al comportamiento encontrado previamente para la familia de los PCBs. En la comparación de cinco fibras comerciales, la eficacia obtenida con PDMS y PA, recubrimientos homogéneos, es superior a la obtenida con las fibras restantes, que presentan recubrimientos poliméricos con partículas porosas. Para la optimización de los parámetros que afectan a la SPME, se aplicó, como en los estudios anteriores, un diseño experimental: - La fibra y el modo de muestro presentan un efecto importante en la extracción de todos los congéneres estudiados. - Se obtiene una extracción más eficaz con la fibra de PDMS. - Se mejora el resultado de la extracción si se muestrea el espacio de cabeza en lugar de realizar el muestreo directo. La única excepción son los congéneres hexabromados (BDE-153 y BDE-154), para los cuales la eficacia de extracción mejora en inmersión, aunque este factor no es significativo. - La microextracción se favorece mediante la agitación de las muestras. - La adición de sal sólo presenta un efecto claramente positivo para el BDE-3. La linealidad, la precisión y la sensibilidad del método también se han evaluado, encontrando los LODs y LOQs al nivel de los fg/mL. La validación del método analítico propuesto demostró que las características representativas del mismo cumplen con las especificaciones para su aplicación en el análisis de los compuestos estudiados a nivel traza en muestras de agua y aguas residuales. Además reúne las cualidades para ser considerado un método fiable, reproducible y sobre todo sensible, es decir, permite alcanzar límites de detección y cuantificación bajos. V. CONCLUSIONES 296 V.4 ESTIMACIÓN DE LOS COEFICIENTES DE MICROEXTRACCIÓN (Kfs) DE BIFENILOS POLIBROMADOS (PBBs) Y DIFENIL ÉTERES POLIBROMADOS (PBDEs) En este estudio, se realizó la estimación de los coeficientes de partición entre la fibra de polidimetilsiloxano (PDMS) y muestras de agua, basándose en la depleción mediante extracciones múltiples como método de calibración, comprobándose que resulta un método muy adecuado. Las conclusiones más relevantes son, que: - La inyección directa de estándares de distintas concentraciones y volúmenes como calibrado externo de SPME no es válida, sin una optimización de las condiciones cromatográficas, debido a que las pérdidas en inyección directa parecen ser mayores que en SPME. - La extracción múltiple de una muestra es un modelo de calibrado interno que permite conocer la cantidad extraída por la fibra de SPME y el cálculo de la eficacia de extracción. - Las eficacias obtenidas a 100ºC varía entre el 0.15 (BDE-3) y el 0.68 (PBB- 49). - El valor de log Kfs a 100ºC para los compuestos objeto de estudios varía entre 3.47 y 5.30. - Las cinéticas de extracción a 25ºC demuestran que todos los compuestos están bajo condiciones cinéticas con el tiempo de extracción seleccionado para el estudio de depleción a 25ºC (24h). - Para el cálculo de Kfs a 25ºC es necesario obtener la constante cinética b mediante el ajuste de las curvas cinéticas. Los valores de Kfs para BDE-3, PBB-15, PBB-49 y BDE-47 son mayores que los obtenidos a 100ºC, de acuerdo con fundamentos termodinámicos de SPME. - El cálculo de Kfs es complejo y requiere tener una serie de variables en cuenta, como el volumen de muestra, las pérdidas, la eficacia de extracción, las condiciones de equilibrio, etc, pero también se debe tener en cuenta el modo de calibración ya que puede ser la principal fuente de error. - Se puede establecer una correlación lineal entre los valores de Kfs y Kow, y con los BFC por lo que los Kfs son tan adecuados como los Kow para estimar el potencial de bioacumulación de los contaminantes orgánicos en los tejidos grasos de los animales. V. CONCLUSIONES 297 V.5. DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS IGNIFUGOS FENÓLICOS EN MUESTRAS ACUOSAS AMBIENTALES Se implementó un método de determinación de compuestos halogenados fenólicos en muestras de agua, incluyendo la familia de los bromofenoles y los bisfenoles TCBPA y TBBPA, basado en la SPME seguida por GC-MS. Para ello fue necesario introducir una etapa de derivatización in situ obteniendo los correspondientes derivados acetilados. Las principales conclusiones de este estudio son, que: - El procedimiento de acetilación-in situ-SPME es viable en el análisis de los ignífugos considerados y empleando las condiciones cromatográficas optimizadas se consigue una buena resolución de los compuestos - En cuanto al tipo de recubrimiento, CAR-PDMS y PDMS-DVB son las fibras que proporcionan una mayor respuesta en el análisis de los compuestos con menor grado de bromación. Para los compuestos más bromados, PBP y TBPA, la fibra de PDMS es la que resulta más eficaz. - Parece apreciarse una relación entre el peso molecular de los compuestos y la eficacia de extracción para la fibra de CAR-PDMS. - El modo HSSPME presentó mejores respuestas a temperaturas altas mientras que a temperatura ambiente resultó más eficaz el muestreo directo. - La adición de sal es un factor importante para alcanzar mejores eficacias de extracción para todos los compuestos - La agitación sólo presenta un efecto significativamente positivo en la extracción de los bisfenoles. - Para los compuestos menos bromados (incluyendo el TBP) las cinéticas de extracción son relativamente rápidas y el equilibrio se alcanza en aproximadamente 15 minutos. Para el PBP y los bisfenoles, el equilibrio no se alcanza con 30 minutos de extracción. - Todos los compuestos presentaron una relación directamente proporcional, entre la cantidad de analito extraída y la que existe inicialmente en la muestra, tanto con la fibra de CAR-PDMS (R2≥ 0.996), como con la fibra de PDMS (R2≥ 0.997). - Los LODs estimados para cada uno de los compuestos son inferiores a 15 pg/mL con la fibra de CAR-PDMS, excepto para el PBP (46 pg/mL); e inferiores a 16 pg/mL con la fibra de PDMS, remarcando la alta sensibilidad del método con ambas fibras. V. CONCLUSIONES 298 - Las recuperaciones obtenidas en muestras reales son cuantitativas incluso con muestras complejas (influente) demostrando su aplicabilidad en este tipo de análisis. Considerando que los clorofenoles pueden ser uno de los principales problemas de contaminación del medio acuático, se decidió investigar la posibilidad de proponer un método para el análisis simultáneo de clorofenoles y bromofenoles en agua. Con este estudio, se demostró también la aplicabilidad del método de acetilación-in situ-HSSPME-GC-MS para la determinación simultánea de bromofenoles junto con otros contaminantes fenólicos en muestras complejas. De este modo, se consigue analizar un importante número de contaminantes fenólicos utilizando un único método, disminuyendo las etapas de manipulación de muestra y el tiempo necesario para el análisis. V VI I. . A AN NE EX XO OS S VI. ANEXOS 2. PUBLICACIONES 306 ORIGINAL PAPER Optimization of a sensitive method for the determination of nitro musk fragrances in waters by solid-phase microextraction and gas chromatography with micro electron capture detection using factorial experimental design Maria Polo &Carmen Garcia-Jares & Maria Llompart &Rafael Cela Received: 23 February 2007 /Revised: 7 May 2007 /Accepted: 10 May 2007 #Springer-Verlag 2007 Abstract A solid-phase microextraction method (SPME) followed by gas chromatography with micro electron capture detection for determining trace levels of nitro musk fragrances in residual waters was optimized. Four nitro musks, musk xylene, musk moskene, musk tibetene and musk ketone, were selected for the optimization of the method. Factors affecting the extraction process were studied using a multivariate approach. Two extraction modes (direct SPME and headspace SPME) were tried at different extraction temperatures using two fiber coatings [Carboxen–polydimethylsiloxane (CAR/PDMS) and polydimethylsiloxane–divinylbenzene (PDMS/DVB)] selected among five commercial tested fibers. Sample agitation and the salting-out effect were also factors studied. The main effects and interactions between the factors were studied for all the target compounds. An extraction temperature of 100 °C and sampling the headspace over the sample, using either CAR/PDMS or PDMS/DVB as fiber coatings, were found to be the experimental conditions that led to a more effective extraction. High sensitivity, with detection limits in the low nanogram per liter range, and good linearity and repeatability were achieved for all nitro musks. Since the method proposed performed well for real samples, it was applied to different water samples, including wastewater and sewage, in which some of the target compounds (musk xylene and musk ketone) were detected and quantified. Keywords Nitro musk fragrances .Solid-phase microextraction .Gas chromatography–micro electron capture detection .Water analysis .Factorial design Introduction In the last few years, increasing attention has been given to a class of emerging toxic substances like some components of the so-called pharmaceuticals and personal care products (PPCPs). Numerous products like soaps, detergents, cosmetics and other consumer products are being continuously released into the environment. Since fragrances are constituents of many of these products, their musk components can be characterized by their ubiquity [1]. Three families of musks, nitro musks, polycyclic musks and macrocyclic musks, were developed to substitute the extremely expensive natural musks. Among the synthetic musk compounds, the nitro musk family includes five members: musk xylene (MX), musk ambrette, musk moskene (MM), musk tibetene (MT), and musk ketone (MK) [2]. In particular, MX and MK are the most widely used nitromusks, mainly in detergents and cosmetics, so their primary method of release into the environment is through discharges of domestic wastewater. Since the time when nitro musk compounds were detected by Yamagishi et al. [3,4] in marine animals and humans from Japan, MX has no longer been used in that country. Subsequently, MX and MK were mostly detected in Europe in aquatic biota [5–7], as well as in human milk and adipose tissue [8], demonstrating the lipophilic nature and the high bioaccumulation potential of nitro musk compounds. On Anal Bioanal Chem DOI 10.1007/s00216-007-1359-z M. Polo :C. Garcia-Jares (*):M. Llompart :R. Cela Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, Facultad de Química, Instituto de Investigación y Análisis Alimentario, Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain e-mail: [email protected] the basis of these findings, and owing to general concern about the environmental fate of nitro musks, their substitution by other compounds, mainly polycyclic musks, was recommended. In 1994, the use of musk ambrette was specifically forbidden in all fragrance products owing to its demonstrated neurotoxic effect [9]. In 1998, MX was included in the third list of contaminants for priority action of the EU and the OSPAR Commission [10]. This musk proved to be carcinogenic in animal studies. MK is suspected of increasing the carcinogenic effects of other substances [11]. Nowadays, polycyclic musks like galaxolide and tonalide form part of most fragrance formulations for household and cosmetic products. However, nitro musks are currently present in about 5% of the products that were not reformulated, and although nitro musks are being phased out in Europe, completion is expected in 2008 [12]. Hence, the environmental persistence of nitro musks associated with their lipophilicity makes the routine monitoring of nitro musks in wastewaters and other environmental samples still necessary today. Several analytical methods have been developed for the identification and quantification of musk compounds in a variety of environmental samples, but most of them have mainly focused on the analysis of polycyclic musks. In the case of nitro musk compounds, available methods are based on gas chromatography (GC) using electron capture detection [13], or coupled to spectral detection techniques such as mass spectrometry (MS), in the electron ionization mode [7,14] or in the negative chemical ionization mode [11], and tandem MS [15]; GC–atomic emission spectroscopy has also been used [16]. Several procedures have been reported for the separation of musk compounds depending on the sample matrix. Liquid–liquid extraction has been applied to determine polycyclic and nitro musks in water [17–19], and accelerated solvent extraction [20] and Soxhlet extraction have been used for other more complex environmental samples [14]. Sorbents [6,21], disks [20], semipermeable membrane devices [22], and closed-loop stripping analysis [23] have also been employed for extraction of musks from water samples. In any case, all approaches based on liquid–liquid extraction and solid-phase extraction imply the use of organic solvents, which constitutes a pollution problem by itself. As an alternative, solid-phase microextraction (SPME) is a solventless technique [24] that has been successfully applied to determine a wide range of water pollutants such as phthalates, polychlorinated biphenyls, brominated flame retardants, and phenolic compounds [25– 32], among many others. The high octanol–water partition coefficient (K ow ) of nitro musks is responsible for their absorption through skin and tissues, as well as for their bioaccumulation in the environment, but it also makes SPME a suitable technique for the extraction of these compounds from water samples. Nevertheless, very few studies have dealt with the application of SPME to the analysis of nitro musks. Struppe et al. [16] described the use of SPME to determine MX, MK, and musk ambrette in cosmetic products, but to the best of our knowledge, there is still a lack of studies which consider the full optimization of a SPME method with enough sensitivity to determine nitro musks in water samples at environmental concentration levels. This fact may be the consequence of the growing use of polycyclic musks, which are extensively found in waters at concentrations notably higher than those of nitro musks, and thus applications of SPME to musk fragrances in water samples [16,33–35] did not include nitro musks or included only one or two compounds [34,35]. In the present paper, a method based on SPME-GC-micro electron capture detection (μECD) allowing the rapid and very sensitive analysis of nitro musk compounds in water is proposed. The chemical structures and the main physical– chemical properties of the target compounds are summarized in Table 1. Method optimization was carried out using an experimental design strategy. In this way, all factors were simultaneously considered to find the optimal working conditions with economy of experimental media. In addition, this strategy allowed the study of possible interactions between factors, not detectable with a one-by-one factor-optimization approach. A full discussion on factors that could influence the extraction of MX, MM, MT, and MK is provided. These include the type of fiber coating, extraction temperature, extraction mode, salting-out effect, and sample agitation. After optimization, the method performance is evaluated, and results obtained for linearity, limits of detection, precision, and accuracy are reported. Finally, to demonstrate the feasibility of the SPME method developed, it was applied to real water samples, including wastewater. Experimental Reagents and materials MX, MM, MT, and MK were all purchased as individual solutions of 10 mg L −1 in cyclohexane from Promochem (LGC Desealers, Barcelona, Spain). Cyclohexane, acetone, methanol, and NaCl were all supplied by Merck (Mollet del Vallés, Barcelona, Spain). All the solvents and reagents were of analytical grade. Standard mixture solutions of the nitro musk compounds were obtained by appropriate dilutions in cylcohexane and acetone, and were stored in amber glass vials in the dark at −20 °C. Spiked water solutions were prepared by adding different volumes of acetone solutions of the target analytes. Real samples, tap water, wastewaters, and raw sewage samples were used. Anal Bioanal Chem Tap water samples were collected from the water supply of our laboratory. Flow-proportional 12-h composite wastewater samples were taken from the influent and from the effluent of a wastewater treatment plant (for a city of 125,000 inhabitants). Raw sewage samples were taken from different city sewers. These samples were stored in the dark at 4 °C until they were analyzed. The SPME manual holders and fibers were obtained from Supelco (Bellefonte, PA, USA). Five fibers were used: 85 μm polyacrylate (PA), 100 μm polydimethylsiloxane (PDMS), 75 μm Carboxen–PDMS (CAR/PDMS), 65 μm PDMS–divinylbenzene (PDMS/DVB), and 65 μm Carbowax–DVB (CW/DVB). Before working with the fibers, they were conditioned as recommended by the manufacturer. Experimental set-up Samples were placed in headspace 22-mL vials. The vials were sealed with a headspace aluminum cap furnished with a Teflon-faced septum and immersed in a water bath maintained at a temperature depending on the actual experiment. Samples were left to equilibrate for 5 min before extraction. Afterwards, the fiber was exposed to the headspace over the sample (or directly immersed into the water sample) for 25 min, depending on the experiment. If agitation was required, a stir bar was introduced into the vial and magnetic stirring was performed during all the sampling process. Once the exposure period had finished, the fiber was immediately inserted into the GC injection port, and the chromatographic analysis was carried out. The desorption time was set at 2 min although an extra period of 5 min for desorption was considered to avoid a possible carryover effect after the analysis of concentrated samples. The desorption temperatures were 260 °C for CW/DVB, 270 °C for PDMS and PDMS/DVB, and 300 °C for PA and CAR/PDMS. Other experimental parameters were optimized by factorial design, so further discussion about them will be provided in the “Results and discussion.” In the case of wastewater samples, the samples were filtered through glass filters of 0.45-μm pore size (Millipore, Madrid, Spain), just before the analysis. GC analysis GC-μECD analysis was performed with an Agilent 6890N gas chromatograph (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) equipped with a split/splitless injector and a 63 Ni microelectron capture detector. Musk compounds were separated in an HP-5 30-m long×0.25-mm inner diameter column coated with a 0.25-μm-thick film. The GC oven temperature program was as follows: 60 °C hold for 2 min, 10 °C/min to 250 °C, and 20 °C/min to 280 °C (total analysis time, Table 1 Identification and physical–chemical properties of the target nitro musks Compound CAS No Chemical structure Solubility (mg/L) log Kow Henry´s Constant (atm.L/mol) Musk xylene (MX), 1-tert-butyl-3,5-dimethyl- 2,4,6-trinitrobenzene 81-15-2 NO2 O2N NO2 0.15 4.9 7.73x10-6 Musk ketone (MK), 2,6-dimethyl-3,5-dinitro-4- tert-acetophenone 81-14-1 NO2 O2N O 0.46 4.3 1.90x10-6 Musk moskene (MM), 4,6-dinitro-1,1,3,3,5- pentamethyl indane 116-66-5 O2N NO2 0.046 5.3 1.54x10-4 Musk tibetene (MT), 1-tert-butyl-2,6-dinitro-3,4,5- trimethylbenzene 145-39-1 NO2 O2N 0.052 5.0 9.96x10-4 Anal Bioanal Chem 23.5 min). Nitrogen (purity 99.999%) was employed as a carrier and make-up gas, with a column initial head pressure of 12 psi, which led to a total column flow of 1 mL min −1 measured at 60 °C, and a make-up flow of 40 mL min −1 . The injector was operated in the splitless mode, and was programmed to return to split 2 min after the beginning of a run; its temperature ranged from 260 to 300 °C, depending on the type of fiber coating being desorbed. The detector temperature was maintained at 285 °C. GC-MS analysis was performed using a Varian 3800 gas chromatograph (Varian Chromatography Systems, Walnut Creek, CA, USA) equipped with a Varian Saturn 2000 iontrap mass detector. The system was operated by Saturn GC-MS Workstation v5.4 software. Separation of the analytes was performed in a Varian CP-Sil8 CB Lowbleed/MS 25-m long×0.25-mm inner diameter column coated with a 0.25-μm-thick film. The GC oven temperature program was the same as employed in the GC-μECD analyses. Helium (purity 99.999%) was employed as a carrier gas, with a constant column flow of 1 mL min −1 . The injector was operated in the splitless mode (2 min) at a temperature between 260 and 300 °C, depending on the fiber used. The ion-trap mass spectrometer was operated in the electron ionization mode (70 eV) with an acquisition mass range from 100 to 300 m/z. The experimental parameters for ionization were as follows: multiplier voltage, 1,800 V; filament emission current, 15μA; axial modulation voltage, 4 V; ionization control, automatic mode; filament/multiplier delay, 4 min. Trap, manifold, and transfer line temperatures were 220, 50 and 290 °C, respectively. Results and discussion The first experiments were conducted to achieve good chromatographic separation of the target nitro musks. The determination of these compounds was performed by GC- μECD because of its sensitivity and selectivity for structures containing nitro groups. GC-MS was used to ensure the correct identification of nitro musks and to confirm μECD results on the basis of mass spectra and retention parameters. Mass spectra were obtained that allowed the selection of the most suitable ions for their identification (M + and [M-CH 3 ] + ) and quantification ([M- CH 3 ] + ) in water samples (Table 2). Figure 1shows the GC-μECD chromatogram of a Milli- Q water solution spiked with the analytes at the nanogram per liter concentration level, and sampled in the headspace mode at 100 °C with a CAR/PDMS fiber. MX 55 pg/mL MM 420 pg/mL MT 474 pg/mL MK 93 pg/mL Min 15 16 17 18 19 20 Hz 0 10000 20000 30000 40000 50000 Fig. 1 Gas chromatography– micro electron capture detection (GC-μECD) chromatogram of an ultrapure water sample spiked with the target nitro musks. MK musk ketone, MM musk moskene, MT musk tibetene, MX musk xylene Table 2 Retention time and selected ions for the analysis of the target nitro musks Compound Retention time (min) Identification ions (m/z) Quantification ions (m/z) Musk xylene 17.19 282, 283, 297 282 Musk moskene 17.46 263, 264, 278 263 Musk tibetene 18.03 251, 252, 266 251 Musk ketone 18.48 279, 280, 294 279 Anal Bioanal Chem Factorial design: study of the influence of temperature, fiber coating, extraction mode, agitation, and salting out on SPME efficiency A factorial design was run to simultaneously study the main factors affecting the microextraction process. Five experimental factors were considered. The factors (and levels) included in the design were as follows: (1) extraction temperature (25, 60, and 100 °C); (2) fiber coating (PDMS/ DVB and CAR/PDMS); (3) extraction mode (direct SPME and headspace SPME); (4) agitation of samples (no, yes); and (5) the salting-out effect (0 and 20% w/v NaCl). Before the multivariate optimization, some experiments were carried out to test five commercial fibers (PDMS, PDMS/DVB, CAR/PDMS, PA, CW/DVB) using aliquots of 10 mL of spiked water in 22-mL vials extracted under the same experimental conditions (headspace, 100 °C) for 25 min. These experiments were performed in duplicate and the data were subjected to a one-factor analysis of variance to determine the statistical significance of the differences observed between fibers. From the results (data not shown), it could be concluded that the efficiency obtained with each of the fibers tested could be considered statistically different for all compounds, with the exception of MT. Figure 2shows the comparison of the average responses obtained for each musk using the five fibers. The intervals displayed are 95.0% confidence intervals of the mean. As can be seen, the extraction efficiency of PDMS/DVB and CAR/PDMS is higher than that shown by the other fibers, and so these two fibers were the ones kept for the experimental design. A mixed level fraction 3×2 4-2 type IV resolution design, which involved 12 runs, was selected [36]. In this design, the main effects are clear from two-factor interactions, but these last ones are partially confounded with other twofactor-interaction effects. Considering that one of the objectives of this work is the development of a method that uses a small volume of sample and generates the minimum amount of residues, the design experiments were performed by sampling aliquots of 10 mL water samples spiked at the nanogram per liter concentration level in 22-mL vials. Table 3shows the resulting matrix of experiments. The analysis of the results obtained after running the 12 experiments produced the standardized Pareto charts shown in Fig. 3, in which factors and interactions that exhibited the lowest effects on the results obtained for each nitro musk have been removed. The length of each bar in the graphs is proportional to the absolute value of its associated standardized effect. It was obtained by dividing the estimated effect of each factor or sum of interactions by its standard error. The effects are displayed in decreasing order of importance, which allows easy identification of the most important factors. Figure 4 shows plots of the main effects, in which the effect of each factor is shown by a line drawn between the low and the high level for the corresponding factor. The magnitude of the effect on the microextraction process can be appreciated on the basis of the length of the lines, and the level of the factor that produces a higher response is evident from the sign of the slope. As can be seen in Figs. 3and 4, temperature was the most important factor for the extraction of all analytes. This factor was the only one studied at three levels, and the plot of the main effects shows an optimum experimental setting at the highest level (100 °C) of this factor for all compounds. The factor fiber was not significant for any compound. As can be seen in Fig. 4, for MX and MM, both fibers tested showed similar performance, while for MT and MK, the positive slope and the length of the lines mean that the CAR/PDMS fiber was slightly more efficient for these two compounds. The extraction mode was also significant for most of the compounds and the best results were attained by working at a high level of this factor, which means sampling in the headspace mode, for most compounds. From Fig. 4, the extraction mode seems to be not significant for the extraction of MK. The agitation of the sample was also an important factor for most of the target musks, especially for MK, although Fig. 2 Comparison of the headspace solid-phase microextraction efficiency using five different commercial fibers (responses are the mean for each fiber expressed as area counts): bars from left to right Carboxen–polydimethylsiloxane , Carbowax–divinylbenzene, polyacrylate, polydimethylsiloxane, and polydimethylsiloxane– divinylbenzene Anal Bioanal Chem this factor did not reach the significant level in any case (Fig. 3). Speeding up mass transfer leads to a shortening of equilibrium times, but it does not have an effect if compound extraction is done in equilibrium conditions [24]. The positive slope of the lines representing this factor, as shown in Fig. 4, indicates that extraction is favored by sample stirring, and so, at the selected extraction time (25 min), the SPME of the target compounds is under kinetic conditions. The salting-out effect was not significant for any compound. As can be seen in Fig. 3, the slope of the lines representing the factor indicates that the addition of salt had only a very slight effect on the extraction of nitro musks. Regarding factor interactions, Fig. 3shows that the most interesting one was the interaction between temperature and MT 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 E: Salting out AA+BE+CE AB+AE B: Fiber BD+CE D: Agitation C: Extraction mode AC+AD A: Temperature Standardized effect MK Standardized effect 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 BC+DE AA+BE+CE AB+AE B: Fiber AC+AD BD+CE D: Agitation A: Temperature MX Standardized effect 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 B: Fiber E:Salting out AB+AE BD+CE D: Agitation BC+DE C: Extraction mode AC+AD A: Temperature MM Standardized effect 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 AA+BE+CE E: Salting out AB+AE BD+CE BC+DE D: Agitation C: Extraction mode AC+AD A: Temperature Fig. 3 Stardardized Pareto charts for the main effects and interactions Table 3 Matrix of the mixed level fraction 3×2 4-2 factorial design Run Temperature (°C) Fiber Extraction mode Agitation NaCl (%) 1 25 CAR/PDMS HSSPME Yes 0 2 62.5 PDMS/DVB HSSPME No 0 3 100 CAR/PDMS HSSPME Yes 0 4 100 PDMS/DVB DSPME No 20 5 25 CAR/PDMS DSPME No 0 6 62.5 PDMS/DVB DSPME Yes 0 7 100 CAR/PDMS DSPME No 0 8 100 PDMS/DVB HSSPME Yes 20 9 62.5 CAR/PDMS HSSPME No 20 10 25 PDMS/DVB HSSPME Yes 20 11 25 PDMS/DVB DSPME No 20 12 62.5 CAR/PDMS DSPME Yes 20 CAR Carboxen, DVB divinylbenzene, PDMS polydimethylsiloxane, DSPME direct solid-phase microextraction, HSSPME headspace solid-phase microextraction Anal Bioanal Chem extraction mode (AC), which appeared confounded by interaction between temperature and agitation (AD). Pareto charts indicate that these interactions were significant for three of the target compounds. The estimated response surfaces for the factors temperature and extraction mode are shown in Fig. 5. For MX, MM, and MT, the direct SPME response was lower than the headspace SPME response at any temperature, but a noticeable increment in headspace efficiency was observed at 100 °C, so the maximum response is attained under these conditions. However, the direct SPME response for MK was higher at 25 °C than at 100 °C, and was much higher than the headspace SPME response at 25 °C, although the improvement in headspace SPME efficiency observed with temperature meant that at 100 °C both extraction modes were comparable in terms of efficiency. The fact that MK can be efficiently extracted in the headspace mode might appear unexpected since this compound can be considered nonvolatile from its low vapor pressure and from the value of its Henry’s law constant (Table 1)[34]. Nevertheless, the same behavior has been described for other compounds, such as PCBs, polybrominated biphenyls and polybrominated diphenyl ethers, which are considered semivolatile or nonvolatile species on the basis of the values of their Henry’s law constants [28,31]. Working with headspace SPME provides several advantages over direct SPME extraction modes. Among them, headspace SPME allows the extension of the operative lifetime of the fiber, preventing possible damage MT 25 100 DSPME HSSPME MX 25 100 DSPME HSSPME MM 25 100 DSPME HSSPME MK 25 100 DSPME HSSPME Fig. 5 Estimated response surfaces (in area counts) for the factors temperature and extraction mode for the target nitro musks. DSPME direct solidphase microextraction, HSSPME headspace solid-phase microextraction a b c de 0 2 4 6 8 (X 10000) 0 1 2 3 4 5 (X 10000) abcde 0 1 2 3 4 5 6 (X 10000) ab c d e 0 1 2 3 4 5 6 (X 10000) abcde MX MM MT MK Fig. 4 Influence of the main effects on the extraction of the target nitro musks: temperature (a), fiber (b), extraction mode (c), agitation (d), and salting out (e). Responses are given as area counts Anal Bioanal Chem from complex matrices, as well as minimizing interferences from undesirable species. Since the optimal values for each factor considered were similar, a general SPME method can be established for the analysis of nitro musks. Sampling the headspace at 100 °C was selected as the best condition for the significant factors extraction mode and temperature, since these levels were clearly the optima for all target compounds. Besides, an improvement in extraction was observed by stirring the samples, so sample agitation is proposed. Regarding fiber selection, both PDMS/DVB and CAR/PDMS fibers would be suitable for the extraction of nitro musk compounds, but according to previous discussion on the slightly better results obtained with CAR/PDMS fiber for MT and MK, this last fiber was employed for method performance. From the results obtained, salt addition was discarded. The effect of the extraction time on the response was evaluated by analyzing spiked water samples after 0, 10, 20, 45 and 60 min of headspace sampling using a CAR/ PDMS fiber. Figure 6shows the extraction time profiles for MX, MM, and MK. As can be seen, all compounds reached the equilibrium condition in 45 min. However, the extraction time was finally set at 25 min since the sensitivity of the response was high enough to propose a rapid extraction method according to the chromatographic run time. Study of performance and application to real samples To evaluate the linearity of the SPME method, a calibration study was performed in duplicate at six levels of concentration in the range from 5 to 1,000 ng L −1 (1–1,000 ng L −1 for MX). Coefficients of determination (R 2 ) are given in Table 4. Since they were equal to or higher than 0.997, a directly proportional relationship between the amount of compound extracted and its initial concentration in the sample was demonstrated. The precision of the experimental procedure was evaluated at two concentration levels (50 and 500 ng L −1 ) by calculating the relative standard deviation (RSD) of three replicates for each level. The results are also shown in Table 4. The RSD values ranged from 2.4 to 11% for the low concentration level, and from 4.0 to 9.4% for the high level. Table 4 Linearity, repeatability, recovery, limits of detection (LOD), and limits of quantification (LOQ) of the proposed headspace solid-phase microextraction–gas chromatography–micro electron capture detection method Compound Coefficient of determination (R 2 ) Repeatability (RSD %, n=3) Recovery±RSD (%) LOD (ng L −1 ) (S/N=3) LOQ (ng L −1 ) (S/N=10) 50 ng L −1 500 ng L −1 Tap water (n=3) Effluent wastewater (n=3) Influent wastewater (n=3) Musk xylene 0.9991 2.4 4.0 106±3 108±8 96±4 0.25 0.83 Musk moskene 0.9994 3.7 9.4 96±4 96±9 92±8 1.82 6.07 Musk tibetene 0.9973 3.6 6.8 103±4 108±11 102±12 3.60 12.0 Musk ketone 0.9984 11 7.9 84±10 105±7 96±9 1.05 3.50 RSD relative standard deviation 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 015 30 45 60 Minutes Area (counts) MX MM MK Fig. 6 Extraction time profiles at 100 °C sampling headspace (response in are counts) Anal Bioanal Chem To evaluate the detection limits of the method, it is necessary to have proper water blanks to establish the background of the method. The risk of sample contamination with nitro musks appears to be less than with other musk compounds like galaxolide and tonalide, which are widely present in large amounts in many cosmetic and household product formulations. Nevertheless, the possible sample contamination should not be undervalued, and precautions to minimize sources of interference in the laboratory environment should be stressed. To avoid water sample contamination through handling, dedicated glassware and nitrile powderless hand gloves were used during sample treatment. In addition, analysts did not use perfumes or personal care products containing fragrances. The limits of detection (based on a signal-to-noise ratio of 3) are shown in Table 4and ranged between 0.25 and 3.6 ng L −1 . These limits of detection are comparable to those found in recent literature [23], underlining the high sensitivity of the proposed SPME-GC-μECD method. Limits of quantification (based on a signal-to-noise ratio of 10) are also included in Table 4. In addition, the feasibility of the method was demonstrated with real samples. The optimized method was applied to analyze tap water, as well as the effluent and influent wastewaters obtained from an urban sewage treatment plant. Headspace SPME analyses of unspiked tap water did not show initial detectable concentrations of the target compounds, but trace levels of MX and MK were detected in effluent and influent wastewater samples. Then, tap water was spiked with the compounds at 50 ng L −1 , effluent wastewater at 200 ng L −1 , and influent wastewater, which was the most complex sample, at 500 ng L −1 . Fortified samples were analyzed by the proposed method using external calibration. In the case of the wastewaters, peak areas for MX and MK for the unspiked samples were subtracted from those measured for the spiked ones. Recoveries were then calculated as ratio of the measured concentration to the spiked concentration and were expressed as a Min 16 17 18 19 20 Hz 500 1000 1500 2000 2500 MX MK Fig. 7 GC-μECD chromatogram of a real contaminated water sample taken from the influent of an urban sewage treatment plant Table 5 Concentration of the nitro musk compounds found in environmental contaminated samples Compounds Concentration (ng L −1 ) Effluent (n=2) Influent (n=3) Raw water 1 (n=2) Raw water 2 (n=2) Raw water 3 (n=2) Raw water 4 (n=2) Musk xylene 2.4 7.1±0.8 9.3 15 6.2 13 Musk moskene ND ND ND ND ND ND Musk tibetene ND ND ND ND ND ND Musk ketone <LOQ 3.8±0.4 5.8 <LOQ 4.3 6.3 ND not detected Anal Bioanal Chem 963 (2002) 277–285 282 ´ C . Garcıa-Jares et al . /J . Chromatogr . A Table 4 Fiber–extraction mode interaction (results are expressed as area counts) Compound Extraction Fiber mode PDMS PDMS–DVB CAR–PDMS CW–DVB Cashmeran HS 67271 143104 111686 44826 Direct 32214 81966 95713 23939 Celestolide HS 157076 264813 320323 108946 Direct 77373 83556 122122 54945 Phantolide HS 99571 179302 206293 76426 Direct 60274 72043 101900 47065 Traseolide HS 110208 168553 195945 80505 Direct 50730 46648 64521 37467 Galaxolide HS 163384 242351 242335 102956 Direct 86311 83974 105896 55011 Tonalide HS 149772 232641 263371 106404 Direct 86556 80984 111335 61403 Ambrettolide HS 179792 232411 226174 123290 Direct 75029 57634 65451 50359 considered: sample volume, agitation, salting-out and sample volume of 100 ml is recommended for carryover. analysis requiring high sensitivity. Sample volume can increase the total amount of The possible influence of agitation on the efmusks extracted by the fiber. To check the effect of ficiency when HS-SPME is performed was also sample volume on the amount of musks extracted by evaluated by exposing the PDMS–DVB fiber to the the HS-SPME method, a set of experiments was headspace of magnetically stirred samples. Results carried out using the PDMS–DVB fiber. Samples of showed that extraction efficiency was not affected by 10, 30, 60 and 100 ml were introduced in 120 ml stirring. vials and HS-SPME was carried out. As can be seen Salting-out was evaluated analysing water samples in Table 6, increasing the volume led to higher without salt and with 20% NaCl in the HS-SPME responses for all the target compounds [16]. Thus, a mode. No differences in response were found in these experiments. Carryover was evaluated for the PDMS–DVB and Table 5 CAR–PDMS fibers working in the HS-SPME mode Temperature–extraction mode interaction (results are expressed as area counts) after the extraction of water samples spiked with 500 pg/ml. After desorption, the fiber was reinserted in Compound Extraction Temperature (8C) the GC injector and a blank analysis was run. This mode 25 60 100 Cashmeran HS 24540 123389 127238 Table 6 Direct 56752 80936 37686 Effect of sample volume on the efficiency of the SPME (expressed Celestolide HS 24982 260568 352819 as area counts) Direct 60809 88738 103950 Phantolide HS 14049 159388 247757 Compound Sample volume (ml) Direct 50682 77098 83181 10 30 60 100 Traseolide HS 11457 146463 258490 Direct 33143 44521 71861 Cashmeran 7061 71234 96631 141324 Galaxolide HS 15989 209385 337896 Celestolide 33628 381298 557916 838700 Direct 58319 82949 107127 Phantolide 34384 311506 404534 543526 Tonalide HS 13322 186025 364795 Traseolide 42557 377437 544807 786854 Direct 58015 83248 113946 Galaxolide 63229 482575 632160 835668 Ambrettolide HS 25696 217179 328375 Tonalide 67527 490390 619408 805002 Direct 39674 51007 95673 Ambrettolide 89498 600448 836276 1177926 963 (2002) 277–285 283 ´ C . Garcıa-Jares et al . /J . Chromatogr . A process was carried out with each fiber. The response CAR–PDMS fibers. Linearity of cashmeran could recorded for the seven target musks, was compared not be evaluated at the total concentration range to the response obtained for the previously analysed considered when using CAR–PDMS fiber, due to water samples. In all cases, carryover for the CAR– interference by a major unknown coeluting substance PDMS fiber was higher than for the other fiber. For (most probably a polysubstituted phenolic com- PDMS–DVB, carryover increased as did the repound). tention time of the compounds. Nevertheless, it was The precision of the experimental procedure was lower than one thousandth (1‰), even for the also evaluated at two different concentration levels macrocyclic musk, ambrettolide. When CAR–PDMS by calculating the relative standard deviation (RSD) was used, the carryover found was about 3–5‰, of three replicates of each level (Table 7). The RSD with the exception of ambrettolide (25‰). This values were between 7.7% and 21.0% with PDMS– could be expected due to its more highly lipophyllic DVB, and between 2.2% and 17.4% with CAR– nature. PDMS. Highest values were obtained for the less volatile and more lipophyllic musk, the ambrettolide. 3 .3. Performance evaluation of the proposed Detection limits (based on a signal-to-noise ratio5 method 3) are shown in Table 7. These were below 1 pg/ml for celestolide, phantolide and traseolide with both Linearity, repeatability and detection limits were fibers; 1–2 pg/ml for cashmeran, galaxolide and evaluated in order to assess the performance of the tonalide; and somewhat higher for ambrettolide. HSSPME method. Results are shown in Table 7. Nevertheless, these limits of detection must always The calibration studies were performed with be checked by analysing blank samples daily in order PDMS–DVB and CAR–PDMS fibers, using 100 ml to update signal-to-noise ratios. spiked water samples. These samples were analysed A real contaminated water sample taken from the in duplicate or triplicate at the optimal extraction effluent of an urban treatment plant was also anaconditions established by the design and the comlysed to check the method performance. Fig. 2 shows plementary experiments discussed above. Calibration the total ion chromatogram. Concentration of the curves were linear in the concentration range studied: identified compounds was evaluated by external from 2 to 2000 pg/ml. As can be seen in Table 7, the calibration and by standard addition. Both the 2 rvalues were higher than 0.990 for all of the PDMS–DVB and the CAR–PDMS fibers were used compounds so, a directly proportional relationship again. Results are presented in Table 8. These were between the extracted amount of musks and its initial very consistent using both fibers and both quantificaconcentration in the sample at the tested concention methods. It must be pointed out that concentration range was demonstrated. No differences were trations lie in the low ppt for the most of the musks, found in linearity when considering PDMS–DVB or and only galaxolide and tonalide appear at higher Table 7 Linearity, limit of detection and repeatability for the target musk compounds considering the PDMS–DVB and the CAR–PDMS fibers 2 Compound Correlation factor (r) Detection limit (S/N53 pg/ml) Repeatability (RSD, % n53) PDM–DVB CAR–PDMS PDM–DVB CAR–PDMS PDM–DVB CAR–PDMS 10 pg/ml 2000 pg/ml 10 pg/ml 2000 pg/ml Cashmeran 0.9989 1.7 1.5 9.1 13.2 3.9 7.9 Celestolide 0.9990 0.9985 0.1 0.1 8.4 7.9 3.7 6.5 Phantolide 0.9990 0.9991 0.2 0.3 9.1 11.1 2.4 0.96 Traseolide 0.9977 0.9991 0.3 0.3 8.9 13.5 6.9 14.1 Galaxolide 0.9986 0.9989 1.2 1.0 7.7 10.9 2.2 17.4 Tonalide 0.9999 0.9999 1.8 1.0 9.9 15.1 7.2 9.1 Ambrettolide 0.9968 0.9973 4.6 9.0 18.8 21.0 17.9 15.1 963 (2002) 277–285 284 ´ C . Garcıa-Jares et al . /J . Chromatogr . A Fig. 2. Total ion chromatogram of a real water sample taken at the effluent of an urban treatment plant. Table 8 Concentration (pg/ml) of the target musk compounds found in a real contaminated sample from an urban treatment plant Compound Standard addition External standard PDMS–DVB CAR–PDMS PDMS–DVB CAR–PDMS Cashmeran nd nd nd nd Celestolide 12.360.8 9.861.1 9.160.6 10.761.2 Phantolide 6.860.7 4.960.7 5.360.6 4.560.6 Traseolide 15.860.3 12.361.2 12.960.3 12.861.3 Galaxolide 478633 50765 372626 51465 Tonalide 12561 15363 10261 13663 Ambrettolide nd nd nd nd Results were obtained for the fibers PDMS–DVB and CAR–PDMS by two calibration methods: standard addition and external standard. ´ levels (about 500 and 120 ppt, respectively). As can (Consellerıa de Medio Ambiente), project be seen, a slight matrix effect was found for PDMS– PGIDT99MA23701, and from the Ministerio de ´ DVB and so, the results obtained by this fiber using Ciencia y Tecnologıa, project REN2000-0984 HID is the external standard procedure were lower. gratefully acknowledged. A cknowledgements R eferences Financial support from the Xunta de Galicia [1] H.H. Wisneski, J. AOAC Int. 84 (2001) 376. 963 (2002) 277–285 285 ´ C . Garcıa-Jares et al . /J . Chromatogr . A [2] C.G. Daughton, T.A. Ternes, Environ. Health Persp. 107 [10] S. Schwartz, V. Berding, M. Matthies, Chemosphere 41 (1999) 907. (2000) 671. [3] G.G. Rimkus, M. Wolf, Chemosphere 30 (1995) 641. [11] K.D. Buchholz, J. Pawliszyn, Environ. Sci. Technol. 27 ¨ [4] C. Struppe, B. Schafer, W. Engewald, Chromatographia 45 (1993) 2844. (1997) 138. [12] M. Llompart, B. Blanco, R. Cela, J. Microcol. Sep. 12 [5] R. Draisci, C. Marchiafava, E. Ferretti, L. Palleschi, G. (2000) 25. Catellani, A. Anastasio, J. Chromatogr. A 814 (1998) 187. [13] P. Landin, M. Llompart, M. Lourido, R. Cela, J, Microcol. [6] J. Hajslova, P. Gregor, V. Chladkova, K. Alterova, Organoh- Sep. 13 (2001) 275. al. Comp. 39 (1998) 253. [14] M. Winkler, J.V. Headley, K.M. Peru, J. Chromatogr. A 903 ¨ [7] K. Bester, H. Huhnerfuss, W. Lange, G.G. Rimkus, N. (2000) 203. Theobald, Water Res. 32 (1998) 1857. [15] Statgraphics-Plus, Experimental Design, Appendix C, Manu- [8] R. Kallenborn, R. Gatermann, S. Planting, G.G. Rimkus, M. gistics, Rockville, MD, 1996. Lund, M. Schlabach, I.C. Burkow, J. Chromatogr. A 846 [16] J. Pawliszyn, Solid-Phase Microextraction, Theory and Prac- (1999) 295. tice, Wiley, New York, 1997. [9] T. Heberer, S. Gramer, H.J. Stan, Acta Hydrochim. Hydrobiol. 27 (1999) 150. Journal of Chromatography A, 1072 (2005) 63–72 Multivariate optimization of a solid-phase microextraction method for the analysis of phthalate esters in environmental waters Maria Polo, Maria Llompart∗, Carmen Garcia-Jares, Rafael Cela Departamento de Quimica Analitica, Nutricion y Bromatologia, Facultad de Quimica, Instituto de Investigacion y Analisis Alimentario, Universidadde Santiago de Compostela, E-15782 Santiago de Compostela, Spain Available online 5 January 2005 Abstract A solid-phase microextraction method (SPME) coupled to gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) has been developed for the determination of the six phthalate esters included in the US Environmental Protection Agency (EPA) Priority Pollutants list in water samples. These compounds are dimethyl phthalate (DMP), diethyl phthalate (DEP), di-n-butyl phthalate (DBP), butylbenzyl phthalate (BBP), di-2- ethylhexylphthalate(DEHP)anddi-n-octyl phthalate (DOP).Detaileddiscussionof thedifferentparameters,which could affecttheextraction process, is presented. Main factors have been studied and optimized by means of a multifactor categorical design. Different commercial fibers, polydimethylsiloxane (PDMS), polydimethylsiloxane–divinylbenzene (PDMS–DVB), polyacrylate (PA), Carboxen–polydimethylsiloxane (CAR–PDMS) and Carbowax–divinylbenzene (CW–DVB), have been investigated, as well as the extraction mode, exposing the fiber directly intothesample(DSPME)orintotheheadspaceoverthesample(HS-SPME),anddifferentextractiontemperatures.Theuseofthisexperimental design allowed for the evaluation of interactions between factors. Extraction kinetics has also been studied. The optimized microextraction method showed linear response and good precision for all target analytes. Detection limits were estimated considering the contamination problems associated to phthalate analysis. They were in the low pgmL−1, excluding DEHP (100pgmL−1). The applicability of the developed SPME method was demonstrated for several real water samples including mineral, river, industrial port and sewage water samples. All the target analytes were found in real samples. Levels of DEP and DEHP were over 1ngmL−1in some of the samples. © 2004 Elsevier B.V. All rights reserved. Keywords: Multifactor optimization; Factorial design; Solid-phase microextraction; Extraction methods; Phthalate esters; Water analysis 1. Introduction Phthalic acid esters (dialkyl or alkylaryl esters of 1,2- benzenedicarboxylic acid), also known as phthalates, are a class of chemicals that are produced at large scale due to the wide variety of uses. World production of these compounds is estimated to be several million tonnes per year. Significant migration of them into the environmental compartments is possible during their production, manufacture, use and disposal [1,2]. Certain phthalates and/or their metabolites are suspected human cancer-causing agents, and endocrine disruptors [3]. Due to their potential risks for human health and environment, several of them have been included in the pri- ∗Corresponding author. Tel.: +34 981563100x14387; fax: +34 981595012. E-mail address: [email protected] (M. Llompart). ority list of pollutants of different national and supranational organizations. In this way, up to 12 PAEs, including di-n- butyl phthalate (DBP), butylbenzyl phthalate (BBP), and di- 2-ethylhexylphthalateester(DEHP),areinthelistoftheproposed substances suspected to produce endocrine alterations published by European Union (EU) [4]. According to Section 307 of the US Clean Water Act, diethyl phthalate (DEP), dimethyl phthalate (DMP), DEHP, BBP, DBP and di-n-octyl phthalate (DOP) should be considered Priority Toxic Pollutants [5]. DEHP is the most prevalent phthalate used and, thus, the most regulated. The EU has included it in the list of 33 substances of priority or possibly priority substances in the field of water policy [6]. The World Health Organization (WHO) has established a guideline value of 8ngmL−1for DEHP for fresh and drinking water [7], which is similar to the maximum contaminant level (MCL) for DEHP set by the Environmental Protection Agency (EPA) (6ngmL−1). This 0021-9673/$ – see front matter © 2004 Elsevier B.V. All rights reserved. doi:10.1016/j.chroma.2004.12.040 64 M. Polo et al. / J. Chromatogr. A 1072 (2005) 63–72 agencyrecommendsthecloselymonitoringofconcentrations above 0.6ngmL−1[8]. Other institutions as the Netherlands National Institute of Public Health and Environment [3] and the Danish Environmental Protection Agency [9] have also established some limits. Taking into account all these considerations, the development of sensitive and reliable analytical methods to analyze phthalates from different water samples is necessary. Considerable care must be taken to avoid sample contamination, which is the main problem associated to phthalate analysis [10]. Extraction and pre-concentration techniques, such as liquid–liquid extraction (LLE) and solid-phase extraction (SPE) are widely applied to determine phthalates in water samples [10–13]. The EPA has published analytical procedures dealing with the determination of phthalate esters in drinking water and in municipal and industrial wastewater [14,15] based on these pre-concentration techniques. Nevertheless, these methods are expensive, time-consuming, and employ different sorbent materials and solvents, enhancing contamination risks. In the last years, solid-phase microextraction (SPME) has acquired an increased importance in the analysis of semivolatile compounds [16–18] including phthalates [19–23]. This technique is an interesting alternative for the determination of phthalates in aqueous samples, because the risk of contamination during sample handling can be significantly reduced. In addition, the elimination of organicsolventsinthesamplepreparationprocesscouldreduce phthalatebackgroundlevels. Nevertheless,the mainproblem for applying SPME to phthalate analysis is the levels of phthalatesfound inblanks oflaboratory purifiedwaterandeven commercial water (especially for DBP and DEHP). In these studies, some factors affecting the extraction efficiency are evaluated. Nevertheless, most papers consider optimization strategies based in the study of one factor at a time. This approach can lead to erroneous conclusions about the importance of certain factors on the extraction process, due to the fact that interactions between factors are not being considered. A multivariate approach to the optimization of the SPME process allows the simultaneous study of various factors and then, it is more advantageous than univariate. To the knowledge of the authors, up to now only one study using a multivariate strategy was applied to the problem of phthalate determination by SPME [23]. In this interesting study, a screening method for the analysis of 16 PAHs, 6 PCBs and 6 phthalate esters has been developed using multisimplex optimization. Due to blank problems, detection limits for some phthalates were quite high, especially for DEHP (3.15␮gL−1).Inaddition,duetoinherent difficultiesof simplex with categorical variables only one fiber (PDMS) was studied, although many others are potentially applicable to phthalate analysis. In the present work, a SPME method followed by gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) analysis was developed for the determination of phthalate esters in water samples following a multivariate optimization strategy. A multifactor categorical design was selected to study and optimize main experimental factors affecting SPME. This kind of experimental design allows the study of main effects as well as second order interactions. The factors included in this design were type of fiber, extraction mode and extraction temperature, and from the result obtained, it could be demonstrated that these three factors are essential to achieve high sensitivity. It could be also demonstrated that some interaction effects between factors must be considered. BearinginmindthatthemainproblemforapplyingSPME to phthalate analysis are the levels of phthalates found in blanks of purified water, detailed discussion about methodological aspects of the analysis (such as the precautions to minimize contamination) is provided. Finally, the optimized methodisevaluatedintermsoflinearityandprecision.Limits of detection (LODs) are found at the pgmL−1level and the applicability of the proposed method to real water samples is demonstrated. 2. Experimental 2.1. Reagents and materials Dimethyl phthalate (>98%) and diethyl phthalate (>98%) were purchased from Fluka Chemika (Buchs, Switzerland); di-n-butyl phthalate (>98%) and di-2-ethylhexyl phthalate (>99%) were from Sigma (St. Louis, MO, USA); and benzyl butyl phthalate (97.2%) and di-n-octyl phthalate (99.7%) were supplied by Riedel-de H¨ aen (Seelze-Hannover, Germany) and Supelco (Bellefonte, PA, USA), respectively. Isooctane, acetone, and NaCl were all purchased from Merck (Mollet del Valles, Barcelona, Spain). All the solvents andreagents wereanalyticalgrade.Ultrapure(resi-analyzed) water for environmental inorganic and organic trace analysis was supplied by J.T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Individual stock solutions of each phthalate ester (20mgmL−1) were prepared in acetone. A standard mixture of the target analytes was prepared at a final concentration of about 200␮gmL−1in acetone. From this solution, several standard working solutions were prepared. Solutions were stored at −20◦C and working solutions were prepared weekly. Different real water samples were analyzed: bottled mineral water, river water, industrial harbour water, influent and effluent from a sewage treatment plant (corresponding to a population of approximately 100,000 inhabitants located in Galicia, Spain), and wastewater from an urban collector. Commercially available 100␮m polydimethylsiloxane (PDMS), 65␮m polydimethylsiloxane–divinylbenzene (PDMS–DVB), 85␮m polyacrylate (PA), 74␮m Carboxen– polydimethylsiloxane(CAR–PDMS)and 65␮mCarbowax– divinylbenzene (CW–DVB) fibers housed in manual SPME holders were obtained from Supelco (Bellefonte, PA, USA). M. Polo et al. / J. Chromatogr. A 1072 (2005) 63–72 65 Special care was taken to avoid the contact of reagents and solutions with plastic materials. Laboratory glassware was washed prior to use with ultrapure water and dried at 250◦C. This material was stored in aluminium foil to avoid adsorption of phthalates from the air. 2.2. Experimental set-up Aliquots of 10mL sample were placed in headspace vials of 22mL, which were cleaned according to the procedure described earlier. Stir bars (also previously cleaned) were introduced into the samples, and then, vials were sealed with a headspace aluminium cap furnished with a PTFE- faced septum, and immersed in a water bath maintained at the temperature of the experiment. Samples were let to equilibrate for 5min before analysis. SPME fibers were reconditioned at 260–290◦C (depending on the fiber used) for at least 3min and then, exposed to the headspace over the sample or immersed into the sample for 5–80min, depending on the experiment. During all the sampling process, samples were magnetically stirred. Once finished the exposition period, the fiber was immediately inserted into the GC injector and chromatographic analysis was carried out. Considering the thermal stability of phthalates, we selected the maximum possible desorption temperatures for each fiber (without exceeding 290◦C) in order to achieve maximumresponse;thus,desorptiontemperaturewas260◦C for CW–DVB, 270◦C for PDMS and PDMS–DVB, and 290◦C for PA and CAR–PDMS fibers. Desorption time was set at 5min. Thewastewatersamplesanalyzedwerepreviouslyfiltered through glass fiber filters (Millipore, Madrid, Spain). All the filtration process was performed using glass material which wascleanedfollowingtheprocedureindicatedinSection2.1. 2.3. Gas chromatography–mass spectrometry The GC–MS analyses were performed on a Varian 3800 gas chromatograph (Varian Chromatography Systems, Walnut Creek,CA, USA)equippedwith anion-trap massdetector Varian Saturn 2000 (Varian Chromatography Systems, WalnutCreek,CA,USA).ThesystemwasoperatedbySaturn GC–MS Workstation v5.4 software. Phthalate esters were separated on a 25m length×0.25mm i.d., CP-Sil8 CB Lowbleed/MScolumn(VarianChromatography Systems,Walnut Creek, CA, USA) coated with a 0.25␮m film. The GC oven temperatureprogramwas:60◦Chold2min,rate20◦Cmin−1 to 190◦C, rate 10◦Cmin−1to 280◦C, hold for 5min. Helium (purity 99.999%) was employed as carrier gas, with a constantcolumnflowof1.2mLmin−1.Injectorwasoperated in the splitless mode and programmed to return to the split mode after 2min from the beginning of a run. Split flow was set at 50mLmin−1. Injector temperature was between 260 and 290◦C depending on the fiber used. The ion-trap mass spectrometer was operated in the electron ionisation mode (70eV). The mass range was scanned from 80 to 300amu. Table 1 Retention time and selected ions for the analysis of the target phthalates Compound Retention time (min) Quantification ions Identifications ions DMP 8.31 163, 164 163, 164 DEP 9.21 149, 177 149, 176, 177, 222, 223 DBP 11.93 149 149, 205 BBP 15.06 149, 206 91, 104, 149, 206 DEHP 16.15 149, 167 149, 167 DOP 17.90 149, 279 149, 279 Experimental parameters for ionisation were: multiplier voltage, 1750V; filament emission current, 30␮A; axial modulation voltage, 4V; ionisation control, automatic mode; filament/multiplier delay, 6min. Trap, manifold and transfer line temperatures were 250, 50 and 280◦C, respectively. 3. Results and discussion First experiments were conducted to optimize the chromatographic separation of the target analytes and the optimal conditions are described in Section 2. In these conditions, all analyzed phthalate esters were adequately resolved avoiding interferenceswithsiloxanepeakscomingfromthechromatographiccolumnand/orthecoatingofSPMEfibers.InTable1, the retention times at the optimized chromatographic conditions, as well as, the identification and quantification ions (based on best signal-to-noise criteria) are shown. Itiswell knownthatthe mostimportantproblem concerningphthalateanalysisistheriskofcontamination,resultingin false positive results and over-estimated concentrations. The sourcesofcontamination canbe presentinanystep oftheanalytical procedure. To check the presence of phthalates in the chromatographic system (in the inlet and the gas supply system), blank runs of the chromatograph and direct injections ofisooctane weremade. Thepresence ofphthalateesterswas not detected. None of the target phthalates was present in the chromatograms. Before starting SPME optimization, blank chromatographic injections of the SPME device using different coatings were made. In these analyses, the presence of phthalates was detected. To avoid this background problem, the SPME fibers were desorbed at 270◦C just before injection. In this way, consistent blanks were attained. So this pre-processing step was applied systematically in all experiments described. 3.1. Optimization of microextraction process: multifactor categorical design Afactorialdesignwascarriedouttoevaluatetheinfluence ofmainfactorsaffectingthemicroextractionprocessin order to obtain the optimal values. The experimental parameters studied were: type of fiber, extraction mode and extraction temperature. The fibers included in the design were: 100␮m PDMS, 65␮m PDMS–DVB fiber, 75␮m CAR–PDMS, 66 M. Polo et al. / J. Chromatogr. A 1072 (2005) 63–72 Table 2 ANOVA results showing the significance of main effects and interactions Compound Source Main effects Interactions Fiber (A) Temperature (B) Extraction mode (C) AB AC BC DMP F-value 10.31 0.65 26.48 1.62 5.57 0.84 p-ratio 0.00 0.55 0.00 0.25 0.02 0.47 DEP F-value 14.99 5.49 44.38 1.76 8.10 1.08 p-ratio 0.00 0.03 0.00 0.22 0.01 0.38 DBP F-value 20.09 44.33 90.63 3.16 6.41 8.59 p-ratio 0.00 0.00 0.00 0.06 0.01 0.01 BBP F-value 8.15 2.29 77.44 1.14 4.47 0.92 p-ratio 0.01 0.16 0.00 0.43 0.01 0.44 DEHP F-value 3.33 35.13 5.83 1.35 0.55 20.96 p-ratio 0.07 0.00 0.04 0.34 0.71 0.00 DOP F-value 6.66 40.57 0.11 3.17 0.54 10.93 p-ratio 0.01 0.00 0.74 0.06 0.71 0.01 Italized numbers are used to denoted a significant effect. 65␮m CW–DVB and 85␮m PA. In principle, all these fibers could be adequate for phthalate extraction. Extraction temperature was set at three levels: 25, 60 and 100◦C and the extraction mode was direct sampling (DSPME) and headspace sampling (HS-SPME), depending on the experiment. A multifactor categorical 5×3×2 type V resolution design, which involves 30 runs, was selected [24]. This design is a standard factorial, consisting of all combinations of the levels of the factors, that enables the study of main effects, as well as two-factor interactions. The design was carried out with 10mL aliquots of ultrapure water spiked at 4ngmL−1 of each target analyte. Sampling time was set at 20min to achieve maximum throughput considering GC run time. One of the statistical options of the proposed design is the analysis of variance (ANOVA) which measures whether a factor contributes significantly to the variance of the response. The results of the ANOVA are shown in Table 2.In this table, and for the sake of simplicity, only the F-ratios and p-values are given. The F-ratios measure the contribution of eachfactororinteractiononthevarianceoftheresponse.The p-values test the statistical significance of each of the factors and interactions. When p-value is less than 0.05, the factor has a statistically significant effect at the 95% confidence level. As can be seen, all three main factors were found to be significant for most compounds. Furthermore, interaction between type of fiber and extraction mode (AC), and interaction between temperature and extraction mode (BC) were significant for some compounds. Considering F-ratio values, it is evident that temperature plays a very important role in the extraction of DBP, DEHP and DOP, and extraction mode in the extraction of DMP, DEP, DBP and BBP. An adequate selection of the optimal conditions requires a deeper look at the results of the design by means of the graphic options. Fig. 1 shows the response plots for type of fiber and extraction temperature. As can be seen, the most efficient extraction conditions for DMP and DEP were obtained using CAR–PDMS at 100◦C. Nevertheless, for the remaining compounds, other fibers perform better. That is, their response increases while the response for CAR–PDMS decreases. The highest microextraction response is reached usingPDMS–DVBfiberat100◦C(forDEHP,responseswith PDMS–DVB and PA were almost identical). CAR–PDMS, however, presented very low efficiency for the extraction of BBP, DEHP and DOP. For this last compound, the CAR–PDMS response was almost negligible. On the other hand, PDMS–DVB yielded the highest microextraction efficiency for DBP, BBP, DEHP and DOP, and was the second most efficient fiber for the extraction of DMP and DEP. Both fibers (CAR–PDMS and PDMS–DVB) have an intermediate polarity but they differ in the pore size. Carboxen coating has a micropore size ideal to extract small molecules and PDMS–DVB mainly presents mesopore size best suited to extract medium molecular sized compounds. The relation between molecular size and extraction efficiency using CAR–PDMS fiber was clearly appreciated in our study, where CAR–PDMS was only suitable for the extraction of the two compounds with the smallest molecular size (DMP and DEP). Regarding the type of fiber other aspect can be pointed out. For DOP and especially for DEHP, the responses with all fibers excluding CAR–PDMS were quite similar and, initially, all these fibers would be suitable for the extraction of these two compounds. As it has been already mentioned, the most favourable extraction temperature for all compounds was 100◦C but the influence of this factor is more pronounced for the two least volatile compounds, DEHP and DOP. For these compounds, responses at 25 and 60◦C are considerably lower (see Fig. 1). Fig. 2 shows the response plots for the factors temperature and extraction mode. No significant interaction was found for DBP, DMP, DEP and BBP, and the most suitable extraction mode at any temperature is direct sampling M. Polo et al. / J. Chromatogr. A 1072 (2005) 63–72 67 Fig. 1. Fiber–extraction temperature interaction plots for all target phthalates (response in area counts): ( )25◦C, ( )60◦C and () 100◦C. (DSPME), although, the highest microextraction response was generally obtained by direct sampling at 100◦C. However, for DEHP and DOP, a significant interaction between thesetwofactorswas,infact,observed.At25and60◦C, HSSPME response was very low and, therefore, DSPME is recommended at this temperature interval. However, at 100◦C, the response obtained by HS-SPME increases markedly, and maximum response is achieved under these conditions. Initially, it might appear strange that the apparently less volatile analytes are more efficiently extracted by HS-SPME and the least volatile ones by DSPME. It is true that the lower molecular weight phthalate esters are quite volatile, but because of their moderate water solubility they have a very low Henry law constant (H)[25]. In consequence, they volatilise very slowly from aqueous solutions. On the other hand, the higher molecular weight phthalate esters are less volatile, but because of their very low water solubility they have a considerably higher Henry law constant (H). Thus, the higher molecular weight phthalate esters will potentially evaporate more rapidly from water, especially at high temperature and this phenomena might be the cause of the behavior observed. Finally, Fig. 3 shows the response plot for the factors type offiberandextractionmode.Onlythediagramcorresponding to DOP has been included since the graphs for the remaining compoundsdonotaddmoreinformationtotheresultsalready commented. In this figure, HS-SPME appears as the most convenient sampling mode for all the fibers but PDMS–DVB and, although responses for all fibers and for both sampling modes are quite similar (excluding CAR–PDMS responses) maximum response was achieved by PDMS–DVB and direct sampling. As concluded from these observations, the optimal extraction conditions are presented in Table 3. These conditionsweredifferentdependingontheconsideredcompounds, so the final selection should consider the purpose of the study. If the objective is mainly to analyze DEHP, best conditions would include HS-SPME sampling mode. On the other hand, to analyze the most volatile phthalate esters, such as DMP and DEP, CAR–PDMS would be the most suitable fiber. If simultaneous analysis of all compounds is required; the most favourable conditions are DSPME at 100◦C using PDMS–DVB fiber. In fact, these conditions were employed for the rest of experiments in this study. BFRs in the environment was published. 9 The range of methods available differs in their capacity to provide accurate and reproducible results. The most widely used technique to analyze samples for BFRs is gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometry (MS), using both high-resolution (HRMS) 10-13 and lowresolution (LRMS) 14-17 instruments. The LRMS techniques are most often based on negative chemical ionization, which offers higher sensitivity than electron impact ionization. Operating in HRMS has demonstrated the best selectivity and detection levels. 18 Sample preparation plays an important role in the analysis of BFRs in the environmental samples because of the complexity of the matrixes and the low concentrations of these analytes. Typically, BFRs are solvent extracted from the samples, and the extracts are then purified, fractionated, and concentrated before final analysis. 4,10,17,19-22 Most preparation methods usually require large sample volumes, are time-consuming, and involve the use of hazardous and expensive solvents. Recently, supercritical fluid extraction 23 and pressurized hot water extraction 24 have been proposed as faster and more efficient extraction techniques. Solid-phase microextraction (SPME) is a fast, simple, inexpensive, and solvent-free extraction technique. 25 It has been successfully applied to the extraction of trace levels of semivolatile organic pollutants in different environmental matrixes. 26-31 The aim of this study is to analyze whether SPME is a suitable technique for the extraction of PBBs and PBDEs. In addition, GC/ MS/MS is used for the first time in the analysis of these groups of analytes, obtaining high sensitivity and selectivity. Previously, this quantification technique has been successfully applied to PCBs and related compounds. 30-35 Consequently, a method based on SPME and GC/MS/MS is optimized using an experimental design. The performance of the method is evaluated in terms of linearity, precision, accuracy, and limits of detection. Finally, the method is applied to the analysis of real water samples including tap water and sewage wastewater. EXPERIMENTAL SECTION Reagents and Materials. PentaBDE mixture (Pentamix) at 10 µg/mL in cyclohexane and the 4-bromophenylphenyl ether (BDE-3) at 100 µg/mL in methanol were supplied by Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Germany). The composition of this commercial pentamix was experimentally confirmed: 2,2′,4,4′- tetrabromodiphenyl ether (BDE-47) 4.1 µg/mL, 2,2′,4,4′,5-pent- abromodiphenyl ether (BDE-99) 4.1 µg/mL, 2,2′,4,4′,6-pentabro- modiphenyl ether (BDE-100) 1.2 µg/mL, 2,2′,3,4,4′-pentabromo- diphenyl ether (BDE-85) 0.10 µg/mL, 2,2′,4,4′,5,5′-hexabromo- diphenyl ether (BDE-153) 0.23 µg/mL, 2,2′,4,4′,5,6′-hexabromo- diphenyl ether (BDE-154) 0.34 µg/mL. 4,4′-dibromobiphenyl (PBB-15),and 2,2′,4,5′-tetrabromobiphenyl (PBB-49)were supplied by Supelco (Bellefonte, PA). Isooctane stock solutions of PBB-15 and PBB-49 were prepared. Isooctane, cyclohexane, acetone, and NaCl, were all purchased from Merck (Mollet del Valle´s, Barcelona, Spain).All the solvents and reagents were of analytical grade. Working solutions were obtained by appropriate dilutions in cyclohexane, isooctane, and acetone and stored at -20 °C before use. Tap water and urban wastewater samples (Santiago de Compostela, Spain) were collected in amber glass containers and maintained in the dark at 4 °C until analysis. The SPME manual holders and fibers were obtained from Supelco. In this work, five fibers were used: 85-µm polyacrylate (PA), 100-µm poly(dimethylsiloxane) (PDMS), 75-µm Carboxenpoly(dimethylsiloxane) (CAR/PDMS), 65-µm poly(dimethylsiloxane)-divinylbenzene (PDMS/DVB), and 65-µm Carbowaxdivinylbenzene (CW/DVB). The fibers were conditioned as recommended by the manufacturer. Experimental Setup. Aqueous samples of different volumes were placed in headspace vials of 22 or 120 mL depending on the experiment performed. Vials were sealed with a headspace aluminum cap furnished with a Teflon-faced septum and immersed in a water bath maintained at the extraction temperature selected for the experiment (25, 50, 75, or 100 °C). Samples were let to equilibrate for 5 min before SPME. Afterward, the fiber was exposed to the headspace over the sample (or immersed into the sample) from 5 to 280 min, depending on the experiment. If agitation was required, a stir bar was introduced in the sample vial and magnetic stirring was performed during all the sampling process. Once finished the exposition period, the fiber was immediately inserted into the GC injector and the chromato- (9) Hyo¨tyla¨inen, T.; Hartonen, K. TrAC, Trends Anal. Chem.2002,21,13-29. (10) Alaee, M.; Sergeant, D. B.; Ikonomou, M. G.; Luross, J. M. Chemosphere 2001,44, 1489-1495. (11) Choi, J.-W.; Fujimaki, S.; Kitamura, K.; Hashimoto, S.; Ito, H.; Suzuki, N.; Sakai, S.-I.; Morita, M. Environ. Sci. Technol.2003,37, 817-821. (12) Ikonomou, M. G.; Rayne, S. Anal. Chem.2002,74, 5263-5272. (13) Herzke, D.; Gabrielsen, G. W.; Evenset, A.; Burkow, I. C. Environ. Pollut. 2003,121, 293-300. (14) Sjo¨din, A.; Patterson, D. G.; Bergman, A. Environ. Sci. Technol.2001,35, 3830-3833. (15) Strandberg, B.; Dodder, N. G.; Basu, I.; Hites; R. A. Environ. Sci. Technol. 2001,35, 1078-1083. (16) Vetter, W. Anal. Chem.2001,73, 4951-4957. (17) Lacorte, S.; Guillamo´n, M.; Martı´nez, E.; Viana, P.; Barcelo´, D. Environ. Sci. Technol.2003,37, 892-898. (18) De Boer, J.; Allchin, C.; Zegers, B.; Boon, J. P. TrAC, Trends Anal. Chem. 2001,10, 591-599. (19) Sellstro¨m, U.; Kierkegaard, A.; de Wit, C.; Jansson, B.; Asplund, L.; Bergander, L.; Bignert, A.; Odsjo¨, T.; Olsson, M. Organohalogen Compd. 1996,28, 526-529. (20) Sellstro¨m, U.; Kierkegaard, A.; de Wit, C.; Jansson, B. Environ.Toxicol. Chem. 1998,17, 1065-1072. (21) Sellstro¨m, U.; Jansson, B. Chemosphere 1995,31, 3085-3092. (22) Van Bavel, B.; Sundelin, E.; Lillback, J.; Dam, M.; Lindstrom, G. Organohalogen Compd.1999,40, 359-362. (23) Kuosmanen, K.; Hyo¨tyla¨inen, T.; Hartonen, K.; Riekkola, M.-L. J. Chromatogr., A 2002,943, 113-122. (24) de Boer, J.; van der Zande, T. E.; Pieters, H.; Ariese, F.; Schipper, C. A.; van Brummelen, T.; Vethaak, A. D. J. Environ. Monit.2001,3, 386-393. (25) Pawliszyn, J. Solid-Phase Microextraction: Theory and Practice; Wiley-VCH: New York, 1997. (26) Pawliszyn, J. Applications of Solid-Phase Microextraction; The Royal Society of Chemistry: Cambridge, UK, 1999. (27) Scheppers-Wercinski, S. A. Solid-Phase Microextraction: A Practical Guide; Marcel Dekker Inc.: New York, 1999; Chapter 5. (28) Zygmunt, B.; Jastrzebska, A.; Namiesnik, J. CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 2001,31,1-18. (29) de Fatima Alpendurada, M. J. Chromatogr., A 2000,889,3-14. (30) Landı´n, P.; Llompart, M.; Lourido, M.; Cela, R. J. Microcolumn Sep.2001, 13, 275-284. (31) Landı´n, P.; Llompart, M.; Lourido, M.; Garcı´a-Jares, C.; Carro, N.; Cela, R. J. AOAC Int. 2003,86,44-49. (32) Brochu, Ch.; Moore, S.; Hamelin, G. Varian Application Note 64, March 2000. (33) Laucˇevic, M.;Splendore, M.;March, R.E. J.Mass Spectrom.1996,31,1244- 1252. (34) Plomley, J. B.; Mercer, R. S.; March, R. E. Organohalogen Compd.1995, 23,7-12. (35) Hayward, D. G.; Hooper, K.; Andrzejewski, D. Anal. Chem.1999,71, 212- 220. Analytical Chemistry, Vol. 76, No. 4, February 15, 2004 1055 [Document text truncated for crawler view.]