Diseños supramoleculares para reconocimiento y transporte de proteínas

Diseños supramoleculares para reconocimiento y transporte de proteínas Trabajo de fin de grado Curso 2015-2016 Iván Gallego Gómez. NIF: 44483230B [email protected] Santiago de Compostela, Julio 2016 Departamento de Química Orgánica y Centro Singular de Investigación en Química Biológica y Materiales Moleculares (CIQUS) D. Juan R. Granja Guillán, catedrático del departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela y D. Javier Montenegro García, Investigador Ramón y Cajal en el departamento de Química Orgánica de la Universidad de Santiago de Compostela. Certifican: Que el trabajo titulado “Diseños supramoleculares para reconocimiento y transporte de proteínas” fue realizado por Iván Gallego Gómez bajo su dirección en los laboratorios del Centro de Investigación en Química Biológica y Materiales moleculares ( ). Considerando que constituye una memoria para superar la asignatura Trabajo de Fin de Grado perteneciente al Grado en Química y autorizan su presentación en la Facultad de Química de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente autorización en Santiago de Compostela a 13 de Julio 2016                                                                                          Índice Abreviaturas ............................................................................................... 5 1. Resumen .............................................................................................. 6 1. Resumo .................................................................................................. 6 1. Abstract ................................................................................................ 6 2. Introducción ........................................................................................ 7 2.1 Antecedentes y mecanismos de captación de los péptidos penetrantes de membrana (CPPs) ............................................................................ 7 2.1.1 Penetración directa ................................................................... 9 2.1.2 Translocación mediada por endocitosis ........................................... 9 2.1.3 Translocación mediante la formación de estructuras transitorias .......... 10 2.2 Aplicaciones de los péptidos penetrantes de membrana (CPPs) ...... 11 2.3 Conceptos previos ......................................................................... 12 2.3.1 El enlace peptídico ................................................................... 12 2.3.2 Estructura de las proteínas ......................................................... 14 2.3.3 Reconocimiento de azúcares ....................................................... 16 2.3.4 Estudios de dicroísmo circular .................................................... 17 2.3.5 Síntesis peptídica en fase sólida ................................................... 18 2.3.6 Síntesis peptídica en fase sólida mediante el método Fmoc .................. 19 3. Objetivos ............................................................................................. 22 4. Discusión de resultados .................................................................... 23 4.1 Diseño general de la estructura del péptido .................................... 23 4.2 Acoplamiento y reactividad de los diferentes sacáridos .................. 24 4.3 Acoplamiento del fluoróforo .......................................................... 27 4.4 Determinación estructural mediante dicroísmo circular .................. 28 4.5 Estudios de internalización en células ............................................ 29 5. Procedimiento experimental ............................................................ 31 5.1 Descripción general de reactivos e instrumentos ............................ 31 5.2 Síntesis .......................................................................................... 32 5.2.1 Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) ...................................... 32 5.2.2 Acoplamiento de diferentes sacáridos al péptido ............................... 33 5.3 Caracterización de los compuestos ................................................ 34 5.4 Protocolo de internalización celular ............................................... 44 5.4.1 Internalización del péptido ......................................................... 44 5.4.2 Internalización del péptido con la proteína ..................................... 44 6. Conclusiones ...................................................................................... 45 6. Conclusións ........................................................................................ 45 6. Conclusions ........................................................................................ 45 Anexo I. L-Aminoácidos ........................................................................... 47 Anexo II. Grupos protectores de aminoácidos .......................................... 48 5 Abreviaturas Aa Boc CPP CF: DCM: Derivado D-manosa: DIEA: DMF: Eq: Fmoc: N-HATU: [ ] [ ] N-HBTU: [ ] HEPES: [ ] HFIP: Hidroxilaminas: HPLC: MS: Mtt: Pbf: Rink Amida: RMN: SPPS: TFA: TFE: TIS: TNBS: _________ Resumen/Resumo/Abstract 6 1. Resumen La sobreexpresión de proteínas de forma aberrante es un fenotipo común de enfermedades y tumores malignos. La membrana celular resulta esencial para la regulación de funciones y el intercambio de información, sin embargo, en muchas ocasiones, supone una barrera para la internalización de moléculas bioactivas y el tratamiento de enfermedades. La posibilidad de controlar el tráfico de proteínas a través de la membrana representa una oportunidad única para la comprensión y el desarrollo de nuevas terapias y métodos de diagnóstico. Es decir, poder transportar e internalizar macromoléculas hacia el interior de las células permitiría modular externamente la regulación y la comunicación celular. 1. Resumo A sobreexpresión de proteínas é un fenotipo común de enfermidades e tumores malignos. A membrana celular resulta esencial para a regulación de funcións e o intercambio de información, sen embargo, en moitas ocasións, supón unha barreira para a internalización de moléculas bioactivas e o tratamento de enfermidades. A posibilidade de controlar o tráfico de proteínas a través da membrana representa unha oportunidade única para a comprensión e o desenvolvemento de novas terapias e métodos de diagnose. É dicir, poder transportar e internalizar macromoléculas cara o interior das células permitiría modular externamente a regulación e a comunicación celular. 1. Abstract The continuous overexpression of proteins is a common phenotype of disease and malignant tumours. The cell membrane is essential to the regulation of functions and the exchange of information, however in many occasions; is a barrier to the internalization of bioactive molecules and treatment of diseases. The possibility of controlling the traffic of proteins trough the cell membrane is an unique opportunity of understanding and developing new therapies and diagnose methods. Which is the same, the transport of macromolecules inside the cell allows to the modulation of the cell communication and regulation from outside. Introducción 7 2. Introducción La membrana plasmática de las células eucariotas es una gran barrera de control diseñada para proteger a la célula de la entrada de moléculas bioactivas. Pequeñas moléculas y fármacos proteicos pueden atravesar la membrana a través de un proceso de secuestro natural o mediante una difusión directa a través de la membrana lipídica; sin embargo en muchos otros casos, estos dos mecanismos de entrada resultan ineficientes para moléculas exógenas. Por este motivo, se han buscado transportadores moleculares que faciliten la entrada de agentes farmacéuticos activos al interior de las células1. En los últimos años se ha descubierto que ciertos dominios de péptidos ricos en aminoácidos catiónicos son responsables del paso de proteínas a través de la membrana (CPPs, péptidos penetrantes de células). Se han encontrado numerosas aplicaciones para estos péptidos penetrantes de membrana, de tal forma que esta química peptídica ha sido explotada como un medio para proporcionar nuevas herramientas a la biología y a la medicina. Numerosos tipos de fármacos han sido transportados al interior celular utilizando CPPs, de tal forma que esta bioconjugación ha permitido la captación celular y en algunos casos la especificidad del tipo celular. 2.1 Antecedentes y mecanismo de captación de los péptidos penetrantes de membrana (CPPs) Un gran avance en la identificación de estos transportadores se realizó a principios de cuando una serie de secuencias de péptidos cortos fueron capaces de atravesar la membrana plasmática de manera eficiente. Uno de estos péptidos que recibió gran atención fue el péptido (Transactivador de la transcripción génica) del virus de la inmunodeficiencia humana ( ). Este descubrimiento, junto con el de otros péptidos con actividad para atravesar la membrana y con la capacidad para transportar diversos tipos de cargas moleculares, sirvió como inicio para el estudio de un nuevo campo centrado en CPPs como transportadores moleculares, un gran avance para la entrada no invasiva de biomoléculas no permeables en membranas biológicas. En la aparecen algunos ejemplos de los CPPs utilizados comunmente; algunos de ellos, como el y Penetratina, derivan de secuencias naturales, mientras que otros son estructuras diseñadas artificialmente con las características más importantes de los sistemas naturales1. Tabla 1. Péptidos de membrana comúnmente utilizados para diferentes aplicaciones de internalización. 1Kelly M. Stewart, Kristin L. Horton and Shana O. Kelley, Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 2242. Introducción 8 La poliarginina es un oligopéptido hidrofílico y catiónico que mantiene su carga positiva en casi la totalidad del rango de debido al fuerte carácter alcalino de sus grupos guanidino. El alto porcentaje de aminoácidos catiónicos son los que confieren la capacidad para atravesar la membrana plasmática de las células. A pesar de la gran variedad de secuencias de aminoácidos, los CPPs poseen, generalmente secuencias cortas, ricas en aminoácidos básicos, como la lisina y la arginina. Estos péptidos básicos pueden ser neutralizados mediante la captación de los contraiones aniones de cierta hidrofobicidad (por ejemplo, lípidos aniónicos). La arginina resulta más ventajosa que la lisina, ya que la primera no se desprotona a fisiológico y puede unirse a un contraión, mientras que la lisina puede liberar un protón y reducir al mínimo la repulsión ( ) 2. Figura 1. La polilisina pKa=10,5 suele perder algún protón a un cercano al fisiológico y de esta forma minimiza las repulsiones entre las cargas. La poliarginina con pKa=12,5 no pierde los protones tan fácilmente por lo que para minimizar la repulsión entre las cargas se une a contraiones. Se ha buscado la obtención de información sobre las reglas generales que regulan la captación de los péptidos penetrantes de membrana como por ejemplo los efectos de la longitud del péptido o las propiedades químicas. Con este fin, numerosas investigaciones se han llevado a cabo para dilucidar el mecanismo de internalización de los CPPs. El transporte de moléculas polares e iones a través de membrana requiere de la participación de multitud de proteínas de forma natural, como pueden ser los canales iónicos y la endocitosis entre otras. La importancia de incorporar de forma efectiva y selectiva en el interior celular a un determinado tipo de moléculas ha llevado al desarrollo de alternativas, dentro de las cuales se incluyen los CPPs3. No existe consenso sobre el mecanismo de transporte de los CPPs, pero se puede agrupar en tres principales métodos de entrada: la permeación directa, la entrada mediada por endocitosis y la translocación a través de la formación de una estructura transitoria1. 2Takeuchi T.; Sakai N. and Matile S., Counterion-activated polyions as soft sensing systems in lipid bilayer membranes: From cell-penetrating peptides to DNA, Faraday Discuss, 2009, 143, 187. 3Kadonosono, T.; Yamano, A.; Goto, T.; Tsubaki, T.; Niibori, M.; Kuchimaru, T.; Kizaka-Kondoh, S., Cell penetrating peptides improve tumor delivery of cargos through neuropilin-1-dependent extravasation, J. Control. Release, 2015, 201, 14. Introducción 9 2.1.1 Penetración directa La mayoría de las investigaciones iniciales sugerían que la translocación de los CPPs policatiónicos a través de la membrana biológica ocurría a través de un proceso celular independiente de energía. Se creía que lo más seguro es que la translocación involucraba una interacción electrostática directa con fosfolípidos cargados de forma negativa. Diferentes investigadores propusieron varios modelos en un intento de elucidar el mecanismo biofísico de este proceso, y aunque los CPPs promueven efectos directos en las propiedades biofísicas de la membrana, la utilización de sondas marcadas fluorescentemente causó que se hiciera una reevaluación del mecanismo de importación de los CPPs. Estos estudios promueven la endocitosis como la vía para la translocación. Se ha propuesto un ejemplo de penetración directa para , este modelo se basa en la interacción del péptido con la membrana plasmática por medio de interacciones electrostáticas, generándose una deformación en la membrana suficiente como para permitir su entrada. Sin embargo en los últimos años se ha demostrado que en muchos de los casos en los quese observaba una penetración directa, lo que realmente tenía lugar era un artefacto debido a la distribución citoplasmática de los CPPs despues de fijar las células para su observación en el microscopio. Recientemente, en modelos de células vivas sin fijar, se ha establecido un modelo detallado para la posible translocación directa a través de la membrana; este mecanismo involucra interacciones fuertes entre los CPPs y los grupos fosfato de la bicapa lipídica, la inserción de cadenas laterales con cargas que producen la formación de un poro transitorio, y la translocación del péptido al difundirse por la superficie del poro. Este mecanismo explica la gran importancia de la cooperatividad entre péptidos, la gran carga positiva, así como las fluctuaciones membranales para la contribución a la admisión. Este modelo contiene muchas características con controversia, aunque algunos datos experimentales recientes validan este modelo mostrando que los CPPs generan los poros de transición en la bicapa lipídica1. 2.1.2 Translocación mediada por endocitosis La endocitosis es otro de losmecanismos responsables de la internalización celular. La endocitosis incluye la fagocitosis y la pinocitosis, y es un proceso de regulación que utilizan las células para la internalización de solutos y fluidos del medio extracelular, es decir, es el proceso de la ingestión celular con la cual la membrana plasmática se pliega hacia el interior para aportar diferentes sustancias a la célula. La fagocitosis se lleva a cabo en células especializadas (macrófagos y neutrófilos) y es un proceso complejo para la internalización de grandes partículas. En cambio la pinocitosis tiene lugar en todo tipo de células y puede ser clasificado en cuatro tipo de vias: macropinocitosis, dependiente de clatrina, dependiente de caveolina/balsas lipídicas y endocitosis independiente de clatrina/caveolina. Si bien el mecanismo de cada uno de estos procesos de pinocitosis difiere respecto a la estructura de la vesícula, así como la maquinaria utilizada, todos ellos presentan un resultado común: moléculas extracelulares son encapsuladas en vesículas lipídicas que se internalizan tras el sellado de la membrana plasmática1. Introducción 16 Los aminoácidos se disponen en función de su afinidad con el medio (efecto hidrofóbico), de tal forma que el polipéptido adopta una forma tal que la exposición de los grupos polares al entorno acuoso sea máxima, a la vez que se minimiza la exposición de los grupos hidrofóbicos, los cuales tienden a situarse cara el interior de la proteína. Distinguimos dos formas básicas de estructuras terciarias: las estructuras fibrosas o filamentosas y las estructuras globulares 1 3. Finalmente, la estructura cuaternaria se refiere a la asociación entre unidades estructurales independientes, resulta de la unión mediante enlaces débiles no covalentes de varias cadenas polipeptídicas con estructura terciaria; asociación de diferentes cadenas polipeptídicas entre sí para dar lugar a proteínas multiméricas complejas. Por lo tanto, no solamente es necesario conocer la estructura primaria de una proteína, sino que hay que considerar también sus estructuras secundarias, terciarias e incluso, si la proteína está formada por varias subunidades, su estructura cuaternaria, para entender la estructura del complejo multimérico así como su función. 2.3.3 Reconocimiento de azúcares La interacción proteína-carbohidrato es un paso clave en muchos procesos biológicos y eventos patológicos y fisiológicos, este reconocimiento es, en varios casos, uno de los primeros pasos selectivos que desencadenan una serie de procesos biológicos que conducen a funciones biológicas. Esta interacción se caracteriza por una alta selectividad y una dependencia de cationes divalentes, en la mayoría de los casos de calcio y magnesio 1 4. Figura 11. Interacción proteína-carbohidrato dependiente de cationes divalentes para el reconocimiento de azúcares. Las lectinas son una amplia gama de proteínas de origen animal y vegetal que se unen a moléculas de azúcares con una elevada especificidad, con un papel fundamental en los fenómenos de reconocimiento de carbohidratos tanto a nivel molecular como celular. Debido a esta propiedad las lectinas pueden aglutinar glucoconjugados e incluso aglutinar células que los posean en la superficie. De los últimos descubrimientos efectuados sobre las lectinas, uno de los más impactantes fue la comprobación de que podían diferenciar células cancerosas de las normales por lo que surgió inmediatamente su uso terapéutico. 1 4 Sánchez N. M.; Muñoz A.; Illescas B. M.; Rojo J. and Martín N.; Fullerene as Multivalent Scaffold Efficient Molecular Recognition of Globular Glycofullerenes by Concanavalina A, Chem. Eur. J., 2011, 17, 766. Introducción 17 Cuando se comenzó a estudiar las lectinas se las consideró como anticuerpos vegetales, sin embargo esta hipótesis no es cierta por varias razones:  Los anticuerpos son el producto del sistema inmune de los animales superiores en respuesta a un estímulo de una sustancia extraña. Las lectinas se encuentran presentes como proteínas constituyentes del organismo (y en muchos organismos son incapaces de generar respuesta inmune)  La especificidad de los anticuerpos es más amplia que la de las lectinas  En cuanto a su estructura química, mientras que los anticuerpos presentan una estructura similar, las lectinas no guarda ninguna relación e incluso difieren mucho entre sí generando una superfamilia de inmunoglobulinas. En el caso de la Concanavalina A se encontró que estaba compuesta de subunidades dispuestas asimétricamente, de peso molecular , unidas como dímeros tetrámeros y formas de alto peso molecular dependientes del pH. Cada cadena posee una secuencia de 238 aminoácidos y la molécula de Con-A presenta una estructura globular. 2.3.4 Estudios de dicroísmo circular Para poder determinar la conformación de las estructuras peptídicas se utiliza la técnica de dicroísmo circular. Esta técnica se basa en hacer pasar luz polarizada circularmente de izquierda a derecha sobre compuestos ópticamente activos 1 5. Esta técnica da información sobre las estructuras secundarias quirales de las macromoléculas biológicas. En la siguiente figura se representan los espectros característicos de un péptido con estructura helicoidal (dos bandas negativas a ) lámina (una banda negativa a ) o random coil (una banda negativa a ). Figura 12. Espectros de dicroísmo circular para distintas estructuras secundarias peptídicas Estos experimentos se pueden realizar en distintos disolventes aportando información sobre la estabilidad y las condiciones más adecuadas para que se produzca el plegamiento. Una de las grandes ventajas de este método es que se puede cuantificar el porcentaje de helicidad usando la . 1 5Greenfield, J.N. Nat. Prot. 2006, 1, 2876. Introducción 18 Fórmula 1. Fórmula para calcular el porcentaje de helicidad. 2.3.5 Síntesis peptídica en fase sólida La síntesis orgánica en fase sólida fue desarrollada originalmente para la preparación de péptidos por R.B. Merrifield en 1 6. Esta técnica se basa en el uso de una resina, generalmente de poliestireno en forma de pequeñas esferas que es insoluble en casi todos los solventes. La utilización de disolventes adecuados hace que estas se solvaten (se hinchen) consiguiendo una buena exposición de los grupos químicos anclados en la resina para su posterior funcionalización. Mientras que la síntesis orgánica en disolución involucra procesos laboriosos de purificación y aislamiento (extracción, cromatografía y cristalización), la síntesis en fase sólida permite que las reacciones sean cuantitativas en cada etapa gracias a que es posible utilizar un exceso de los reactivos, ya que se pueden eliminar fácilmente una vez finalizada la reacción por procesos simples de lavado y filtrado. Finalmente, el producto deseado se desprende del soporte, y su purificación y caracterización se llevan a cabo en disolución. En consecuencia, no hay que purificar cada intermedio sintético, lo que se traducirá en una reducción de tiempo y un aumento en la producción. Sin embargo, existe un problema importante a tener en cuenta en esta técnica, las reacciones no transcurren con rendimientos cuantitativos. Esto es, si cualquier residuo N-terminal de una de las muchas cadenas polipeptídicas en crecimiento adheridas a la resina permanece sin acilar después de la etapa de acoplamiento, esto lleva a que el producto final esté contaminado por secuencias incompletas. En este caso se dan dos situaciones: el residuo puede ser exitosamente acoplado en el siguiente ciclo, resultando en un péptido suprimido, o el residuo puede no ser acoplado subsecuentemente, lo que dará un péptido truncado 1 7. Este problema puede solucionarse forzando a que cada etapa de acoplamiento se lleve a cabo en su totalidad. Para ello suele usarse un exceso del agente acilante, utilizar agentes de acoplamiento más reactivos, cambiar el disolvente e incluso repetir esta etapa más de una vez. Desgraciadamente la síntesis tampoco puede ser seguida con facilidad por las técnicas utilizadas en disolución, sobre todo el RMN. Es por ello que se han desarrollado diferentes agentes que permiten comprobar si la etapa no se ha completado en su totalidad con pruebas como el test de Kaiser 1 8. El test TNBS, es otro de esos métodos y es el que será empleado en este caso. El ensayo de TNBS es más fácil de realizar y de una sensibilidad casi equivalente a la del ensayo de Kaiser y solamente es utilizado para la detección de grupos amino primarios. 1 6a) Merrifield, R. B.; Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149. b) Merrifield, R. B., Automated synthesis of peptides, Science, 1965, 150, 178. 1 7a) Dick, F., Acid cleavage/deprotection in Fmoc/t-Bu Solid-Phase Peptide Synthesis, Peptide Synthesis Protocols, Humana Press, 1994. b) Pennington, M. W.; Byrnes, M. E., Procedures to Improve Difficult Couplings. Peptide Synthesis Protocols, Humana Press, 1994. c) Atherton, E., Sheppard, R. C. Solidphase peptide synthesis: A practical Approachc. 1989 1 8Kaiser, E.; Colescott, R. L.; Bossinger, C. D.; Cook, P. I., Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides, Anal. Biochem, 1970, 34, 595. Introducción 19 Figura 13. Esquema de la metodología empleada en la síntesis en fase sólida. P1 y P2 son los grupos protectores ortogonales permanentes de las cadenas laterales de los aminoácidos que lo requieran a lo largo de la síntesis. T denota un grupo protector temporal utilizado en el extremo N-terminal. 2.3.6 Síntesis peptídica en fase sólida mediante el método Fmoc La metodología más empleada en la síntesis peptídica en fase sólida es la estrategia t 1 9 que emplea condiciones más suaves a las utilizadas en la estrategia , en la que el tratamiento continuado con puede acabar por alterar los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos y requiere de un tratamiento ácido muy fuerte, generalmente con al final del proceso. Por tanto, la capacidad del o para degradar las proteínas en las condiciones del desanclaje final condujo a la introducción de un nuevo protector del grupo amino, basado en el 9-fluorenilmetiloxicarbonilo ( ), que requiere una acción de desprotección y liberación del péptido más suave. Este método utiliza una base, normalmente la piperidina (20 %) en para la eliminación del grupo Fmoc, quedando el grupo amino libre y listo para reaccionar con un nuevo aminoácido activo. Los grupos protectores temporales de las cadenas laterales de los aminoácidos se basan en el grupo terc-butilo. La separación del péptido de la resina y la eliminación de los grupos protectores ortogonales solo requiere del tratamiento con un medio ácido como el TFA. 1 9Chang, W. C.; White, P. D., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University: New York, 2000. Introducción 20 Figura 14. a) Reactivos y grupos protectores en la estrategia Fmoc/tBu. El grupo Fmoc se desprotege por tratamiento con una disolución de piperidina al 20% en DMF. Las cadenas laterales se desprotegen simultáneamente a la liberación de la resina por tratamiento con TFA. b) Mecanismo de desprotección del grupo Fmoc situado en el extremo N-terminal de un aminoácido creciente sobre la resina. Paralelamente al desarrollo del método Fmoc para la SPPS, se han creado diversas resinas que pueden ser tratadas con para la liberación del péptido. Se usan dos resinas principalmente, dependiendo de la funcionalización deseada en el extremo C-terminal. La resina Wang es la más usada para péptidos con ácidos carboxílicos C-terminales, mientras que se utiliza la resina de Rink si se desea una amida C-terminal20-21. La resina Rink es la seleccionada para la síntesis de los péptidos en esta memoria. La etapa clave de la síntesis de péptidos es la formación de los enlaces amida entre los aminoácidos. La formación eficiente de estos enlaces requiere la activación del grupo carboxilo, existiendo diferentes formas de llevarla a cabo. El método más utilizado comúnmente se basa en la formación in situ de ésteres activos. Este método consiste en la activación del ácido en el mismo medio en el que está presente el grupo amino y sin aislar el intermedio reactivo generado. Esto permite llevar a cabo reacciones limpias y rápidas, incluso con aminoácidos de elevados impedimentos estéricos. Los reactivos encargados de la activación se denominan agentes de acoplamiento; siendo los siguientes algunos de los más utilizados. Figura 15. Agentes de acoplamiento más utilizados en la síntesis en fase sólida. 20 Fields, G. B.; Noble, R. L.; Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxycarbonyl aminoacids, Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 35, 161. 21Alsina. J.; Albericio F., Solid-Phase synthesis of C-terminal modified peptides, J. Pept. Science, 2003, 71, 454. Introducción 21 Los diversos agentes de acoplamiento presentan diferentes reactividades. El mecanismo de la reacción de activación se ejemplifica en el siguiente esquema para el . En este mecanismo se genera el éster ``activo´´ que reacciona posteriormente con la amina libre. Figura 16. Mecanismo de reacción del reactivo de acoplamiento HBTU para la formación del éster activo y su posterior acoplamiento con el grupo amino para la formación del enlace amida entre aminoácidos. Figura 17. Esquema detallado de la metodología rutinaria para el acoplamiento de los diferentes aminoácidos y crecimiento del péptido sobre la resina. Este procedimiento se llevará a cabo n veces en función del número de aminoácidos que presente el péptido diseño que se crece sobre la resina. El desanclaje final del péptido de la resina y la posterior eliminación de los grupos protectores permanentes son llevadas a cabo por el . De este modo, el método es ortogonal en dos direcciones, es decir, la desprotección del grupo amino y el desanclaje final de la resina. Objetivos 22 3. Objetivos Recientemente se ha descubierto que ciertos dominios de péptidos ricos en aminoácidos catiónicos son responsables del paso de proteínas a través de la membrana (CPPs, péptidos penetrantes de células). Por este motivo en este proyecto, se plantea la síntesis y el estudio de péptidos sencillos que contengan una parte catiónica (transportadora) y otra parte de unión (ligando) a una macromolécula (proteína) de interés. De esta forma, estos péptidos se unirían de forma no covalente a diferentes proteínas permitiendo el paso a través de la membrana y la internalización de la macromolécula, pudiendo liberarla una vez atravesada la membrana. Tal y como se ha mencionado, los CPPs poseen la capacidad para atravesar las membranas celulares. Existe un gran número de péptidos que poseen esta propiedad aunque la mayoría de ellos se caracteriza por poseer un elevado número de residuos catiónicos o bien por poseer un carácter anfipático en el que se alternan patrones polares (formados por residuos polares y/o catiónicos) con patrones hidrofóbicos (formados por residuos apolares). El primer y más importante objetivo es la síntesis de diferentes péptidos sencillos catiónicos y que contengan grupos reactivos (hidroxilaminas) donde anclar un ligando que interaccione con la proteína de interés. Se estudiará la reactividad de estos compuestos con los correspondientes ligandos, donde la selección de estos depende del tipo de proteína que se va a transportar. En los primeros estudios se empleará la Concanavalina A como proteína, que reconoce azucares sencillos (glucosa y manosa) con alta especificidad. La caracterización de estos compuestos se llevará a cabo mediante las más novedosas técnicas disponibles (RMN, MS, HPLC, Fluorescencia). Figura 18. Esquema simplificado de la estructura del péptido y la formación del complejo transportable que permita la internalización de la proteína de interés. En posteriores etapas, una vez ensambladas las dos partes del péptido (transportadora y ligando) el siguiente objetivo es evaluar el transporte de la proteína seleccionada (o macromolécula) mediante marcaje fluorescente de la misma; la consecución de este objetivo permitirá abordar el transporte de nuevas proteínas en células con posibilidades terapéuticas. El control sobre la activación o la inhibición del tráfico proteico resultará una herramienta enormemente poderosa tanto para el tratamiento como el diagnóstico de enfermedades. Discusión de resultados 23 4. Discusión de resultados 4.1 Diseño general de la estructura del péptido Para comenzar es necesario diseñar la estructura del péptido a sintetizar; para ello, y tal y como se mencionó anteriormente, se busca que el péptido de interés adquiera una estructura secundaria con una conformación de hélice , que presente una parte catiónica y una parte reactiva donde se acoplen los ligandos de interés dependiendo del tipo de proteína que se quiera internalizar. Esta conformación en hélice orienta los distintos dominios del péptido en diferentes regiones espaciales permitiendo llevar a cabo su función de manera efectiva. Figura 19. (a) Configuración en estrella de los aminoácidos, agrupados en diferentes regiones del péptido. (b) Configuración tridimensional en hélice , simulando las distintas regiones espaciales de cada dominio de acuerdo con el diseño inicial del péptido. (c) Estructura lineal del péptido a sintetizar. En cuanto a la elección de los aminoácidos que formarán parte de la estructura de nuestro péptido, las se encargan de aportar la parte catiónica al péptido que les permitirá actuar como péptidos penetrantes de membrana; las se encargan de aportar hidrofobicidad a la estructura, aspecto importante del que depende la configuración de hélice . Por último, las actúan como soporte de unión para la estructura reactiva donde posteriormente se acoplará el ligando de interés. Tal y como se muestra en la , estos residuos se encuentran hacia lados opuestos de la hélice con el fin de formar estructuras tridimensionales complejas (en redes) a la hora de interaccionar con la proteína de interés. Discusión de resultados 24 Para la obtención del péptido diseñado, se utiliza la técnica de síntesis en fase sólida de Merrifield por el método Fmoc/t-Bu, utilizando como soporte físico la resina Rink Amida Figura 20. Estructura de la resina Rink Amida con su grupo amino funcional protegido con Fmoc, a través del cual se inicia el anclaje de los aminoácidos del péptido. La particularidad de nuestra estrategia consiste en el empleo de lisinas protegidas con el grupo Mtt, que se desprotege selectivamente usando unas condiciones ácidas más suaves permitiendo la posibilidad de modificar sintéticamente el péptido mientras todavía se encuentra anclado en la resina Esta metodología permitió el anclaje de los residuos de hidroxilamina sobre los que acoplaremos los sacáridos. Figura 21. Esquema detallado de los pasos necesarios para la obtención del péptido 1, donde se muestra el crecimiento del péptido sobre la resina y el acoplamiento de las hidroxilaminas. 4.2 Acoplamiento y reactividad de los diferentes sacáridos Con el objetivo de reconocer diferentes proteínas, se anclaron distintos tipos de sacáridos a la cadena peptídica. En primer lugar se emplearon azúcares comerciales como D-glucosa, D- galactosa, D-manosa, N-acetilglucosamina (monosacáridos) y maltosa (disacárido). Discusión de resultados 25 Para el acoplamiento de los péptidos que contenían residuos de hidroxilamina con azúcares reductores como los que se muestran en la , se necesitó en todos los casos el calentamiento a durante 2 horas. En estas condiciones de reacción, se observó, mediante , la completa desaparición del producto de partido y la aparición de un único pico del producto final. Figura 22. Estructura cíclica de los azúcares comerciales empleados para el acoplamiento al péptido 1 (A) D-glucosa (B) D-galactosa (C) N-acetilglucosamina (D) D-manosa (E) maltosa. Figura 23. Estructura lineal de los péptidos acoplados a los diferentes sacáridos comerciales de la figura 22. Péptido 2 (sacárido A), péptido 3 (sacárido B), péptido 4 (sacárido C), péptido 5 (sacárido D) y péptido 6 (disacárido E). Procedimiento experimental 32 5.2 Síntesis 5.2.1 Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) A) Preparación de la resina: La síntesis se llevará a cabo utilizando la resina Rink Amida, en primer lugar se pesan de resina en un cartucho de síntesis de fase sólida, situado en un matraz de fondo redondo de dos bocas, se añade DMF y se burbujea con un flujo constante de Ar durante minutos. Transcurrido este tiempo, se filtra, obteniéndose una resina hinchada y lista para realizar los acoplamientos. B) Ruptura del grupo protector temporal (Fmoc): Se añade sobre la resina una disolución de piperidina al en DMF bajo flujo de Ar durante minutos aproximadamente para desproteger el grupo de la resina. Una vez finalizado este tiempo, se filtra a vacío y se realizan tres lavados con de DMF de minutos cada uno. C) Acoplamiento de los aminoácidos: Para realizar el primer acoplamiento, se disuelven de HBTU ( ) y la cantidad correspondiente de aminoácido ( ) en de DMF, a continuación se añaden de DIEA ( en DMF) a la disolución anterior. La mezcla resultante se añade al cartucho y se deja burbujear con Ar durante minutos aproximadamente. Transcurrido este tiempo, se filtra y se realizan nuevamente tres lavados con de DMF de minutos cada uno. Una vez que la resina está filtrada y lavada, para comprobar que el acoplamiento ha transcurrido cuantitativamente se realiza el test TNBS, para ello se retira una pequeña cantidad de resina y se introduce en un eppendorf a la cual se le añaden los reactivo del test, si se observa una coloración blanca el acoplamiento ha sido efectivo, mientras que por lo contrario, si se observa un color rojizo el acoplamiento no ha tenido lugar en su totalidad y por tanto, sería necesario realizar un capping. Para ello se prepararía una disolución de de 2,6-lutidina y de anhídrido acético, y se añadiría sobre la resina siguiendo el procedimiento como si se tratara de un acoplamiento habitual. El resto de aminoácidos se acoplan siguiendo el mismo procedimiento al descrito anteriormente hasta la obtención del péptido final deseado. D) Terminación:  Acetilación: Una vez finalizada la síntesis del péptido, se acetila el grupo amino del último aminoácido acoplado, para ello se utiliza una disolución de anhídrido acético y 2, 6-lutidina bajo flujo de Ar durante 30 minutos; una vez transcurrido ese tiempo se realizan tres lavados con DMF y otros tres con DCM-HPLC.  Acoplamiento del espaciador: En caso de añadir al extremo de los péptidos un fluoróforo, se realiza el acoplamiento del aminoácido 6-(Fmoc-amino) caproic acid. Para ello se desprotege el Fmoc del último aminoácido acoplado y se añade el espaciador siguiendo el procedimiento C. Procedimiento experimental 33 E) Ruptura del grupo Mtt de las Lys: se prepara una disolución de de DCM-HPLC, de HFIP, de TIS y de TFE (4 ml). Debido a la presencia de más de un grupo Mtt, se realiza la desprotección dos veces bajo agitación, utilizando dos mililitros de la disolución anterior, durante dos horas de cada una de las veces. Entre cada proceso se realizan varios lavados con DCM-HPLC. F) Acoplamiento del grupo reactivo [(Boc-aminooxy)acetic Acid]: Una vez desprotegido el grupo Mtt, se hincha la resina utilizando DMF y se procede al acoplamiento de las hidroxilaminas. Para ello se emplea ( por Lys), HATU ( por Lys), y DIEA ( por Lys). Se pesan las cantidades necesarias de HATU y de , y se diluyen en de DMF cada uno, a continuación se añaden ambas disoluciones a la resina y por último, se adiciona lentamente gota a gota y bajo flujo de Ar la cantidad correspondiente de DIEA, observándose como la disolución en el cartucho adquiere una coloración amarillo-verdoso. Al finalizar, se lava la resina tres veces con DMF y con DCM-HPLC. G) Acoplamiento de la carboxifluoresceína: Para aquellos péptidos terminados con el aminoácido espaciador, se procede al acoplamiento del fluoróforo. Para ello la reacción se lleva a cabo sobre la resina como si se tratara de un acoplamiento de un aminoácido. En primer lugar se añade piperidina (20% en DMF) bajo flujo de Ar durante min aproximadamente para desproteger el grupo del ligando espaciador. Transcurrido este tiempo se realizan tres lavados con DMF de dos minutos cada uno. Para realizar el acoplamiento, se disuelven de HBTU ( ) y de fluoróforo ( ) en de DMF, y se añaden de DIEA ( ) a la disolución anterior. La mezcla resultante se añade al cartucho y se deja burbujear con Ar durante minutos aproximadamente. Transcurrido este tiempo, se realizan nuevamente tres lavados con DMF de dos minutos cada uno. Para comprobar que cada uno de los paso ha tenido lugar correctamente, se realizan análisis de HPLC-MS a pequeñas porciones del péptido rompiéndolo de la resina. H) Rotura del péptido de la resina: Sobre la resina se añaden 2 ml de una disolución formada por : y se agita mecánicamente durante aproximadamente dos horas. Transcurrido este tiempo, se filtra y se lava con TFA. El filtrado se concentra burbujeando con Ar en el matraz que lo contiene para eliminar la mayor cantidad de TFA posible. A continuación dichos filtrados se añadieron lentamente sobre (25 ml) para la precipitación del péptido, se centrifuga unos minutos y se retira el disolvente. Una vez aislado el precipitado se redisuelve en , se purifica y se liofiliza. 5.2.2 Acoplamiento de diferentes sacáridos al péptido Una vez purificado el péptido, se prepara una disolución molar del mismo en para el posterior anclaje de los diferentes sacáridos. Procedimiento experimental 34 A) Azúcares comerciales: La D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, N-acetilglucosamina (monosacáridos) y maltosa (disacárido) se acoplaron a las hidroxilaminas presentes en la cadena peptídica. Para dicho acoplamiento se preparan disoluciones 120 mM de cada uno de los sacáridos y se hace reaccionar con la disolución anterior del péptido a 60ºC durante dos horas. B) Derivado de la D-manosa: Se prepara una disolución 120 mM del azúcar (2 eq por cola) y se añade sobre la disolución del péptido anterior. En este caso la reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente durante 15 min. 5.3 Caracterización de los compuestos Péptido 1. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] MS (ESI-TOF, ): 1373.03 (100, [ ] ); 877,89 (20, [ ] ) Figura 33. Espectro HPLC y MS del péptido 1 Procedimiento experimental 35 Péptido 2. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] MS (ESI-TOF, ): 1373.03 (100, [ ] ); 877,89 (20, [ ] ) Figura 34. Espectro de HPLC y MS del péptido 2 Procedimiento experimental 36 Péptido 3. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] MS (ESI-TOF, ): 877,89 (100, [ ] ); 839.92 (20, [ ] ); 630,16 (80, [ ] ); 458.71 (40, [ ] ) Figura 35. Espectro HPLC y MS del péptido 3 Procedimiento experimental 37 Péptido 4. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] MS (ESI-TOF, ): 1414.21 (100, [ ] ); 905.18 (30, [ ] ). Figura 36. Espectro HPLC y MS del péptido 4 Procedimiento experimental 38 Péptido 5. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] MS (ESI-TOF, ): 1373.03 (100, [ ] ); 877.88 (20, [ ] ). Figura 37. Espectro HPLC y MS del péptido 5 Procedimiento experimental 39 Péptido 6. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] MS (ESI-TOF, ): 1535.16 (100, [ ] ); 985.43 (20, [ ] ). Figura 38. Espectro HPLC y MS del péptido 6 Procedimiento experimental 40 Péptido 7. Se sintetiza siguiendo el procedimiento descrito anteriormente para péptidos. Se purifica mediante HPLC en fase reversa siguiendo el método: [Nucleosil 120-10-C-18, con un (disolvente A) y con (disolvente B) ] T.r= 7,8 min; se obtuvieron 33 mg (15%). 1H NMR (D2O , 300 MHz) δ 7.62 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 4.75 (s, 2H), 4.75 – 4.67 (m, 4H), 4.48 – 4.37 (m, 4H), 4.16 (d, J = 11.6 Hz, 13H), 3.90 – 3.45 (m, 12H), 3.17 – 2.98 (m, 16H), 1.92 (s, 3H), 1.78 – 1.15 (m, J = 65.3 Hz, 51H), 0.90 – 0.62 (m, J = 15.7 Hz, 30H). MS (ESI-FIA-TOF, ): 1187.2149 (100, [ ] ); 791.8179 (20, [ ] ). Procedimiento experimental 41 Figura 39. Espectro HPLC, MS y 1H-RMN del péptido 7 48 Anexo II. Grupos protectores de aminoácidos