Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional

Facultad de Química Alfonso Cabezón Vizoso Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional Junio 2020 Trabajo de Fin de Grado presentado en la Facultad de Química de la Universidad de Santiago de Compostela para la obtención del Grado en Química Trabajo de Fin de Grado Departamento de Química Orgánica y Centro Singular de Investigaciones en Química Biológica y Materiales Moleculares (CIQUS) Dña. REBECA GARCÍA FANDIÑO, INVESTIGADORA “RAMÓN Y CAJAL” DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y D. MARTÍN CALVELO SOUTO, INVESTIGADOR PREDOCTORAL DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMAN: Que la memoria adjunta titulada “Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional” que presenta Alfonso Cabezón Vizoso para su Trabajo de Fin de Grado (TFG) ha sido realizada bajo nuestra dirección en el CIQUS y autorizamos su presentación. Y para que así conste, expedimos la presente autorización en Santiago de Compostela a 08 de Julio de 2020. Fdo. Dra. Rebeca García Fandiño Fdo: D. Martín Calvelo Souto Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional Índice Índice. ..................................................................................................................................... 3 Resumen. ................................................................................................................................ 4 Índice de abreviaturas. ........................................................................................................... 6 1. Introducción. ................................................................................................................... 7 Resistencia a antibióticos. .................................................................................... 7 Ciclopéptidos y Nanotubos Peptídicos. .............................................................. 10 Dinámica Molecular. .......................................................................................... 13 2. Objetivos. ...................................................................................................................... 20 3. Materiales y Plan de Trabajo. ....................................................................................... 22 4. Resultados y discusión. ................................................................................................. 24 Interacción de los ciclopéptidos con la membrana modelo de DMPC. ............. 24 Interacción de los ciclopéptidos con la membrana modelo de DMPC:DMPG (3:1). ............................................................................................................................ 30 Interacción de los ciclopéptidos con la membrana modelo de DMPE:DMPG (1:9). ............................................................................................................................ 36 5. Conclusiones. ................................................................................................................ 42 Bibliografía. ........................................................................................................................... 48 4 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Resumen Con el objetivo de estudiar el proceso de autoensamblaje de un ciclopéptido anfipático con potencial actividad antimicrobiana en presencia de bicapas lipídicas de diferente composición, ha sido llevado a cabo un estudio utilizando cálculos de Dinámica Molecular. A diferencia de la mayoría de antibióticos existentes en la actualidad, los cuales suelen utilizar proteínas específicas como dianas, estos ciclopéptidos tienen como objetivo determinadas composiciones lipídicas, aprovechando la distinta naturaleza de membranas celulares sanas, bacterianas o cancerígenas. Debido a que la escala de tiempo a la que se espera que ocurra este proceso no es abordable para una simulación clásica de Dinámica Molecular, es necesaria la aplicación de diferentes aproximaciones. En este proyecto se han realizado simulaciones utilizando resolución Coarse-Grain (CG), la cual permite la reducción del número total de partículas utilizando grupos de átomos. Los resultados obtenidos indican que el péptido estudiado es capaz de autoensamblarse en membranas bacterianas y cancerígenas, pudiendo provocar la rotura de las mismas, mientras que en membranas celulares sanas el autoensamblaje se produce en el disolvente que rodea a la membrana, sugiriendo que el ciclopéptido no sería tóxico para una célula con esta composición lipídica. In order to study the self-assembly process of an amphipathic cyclic peptide with potential antimicrobian activity in presence of lipid bilayers with different composition, a study using Molecular Dynamics calculation has been carried out. Unlike the majority current existing drugs, which usually target specific proteins, these cyclic peptides target certain lipidic compositions, taking advantage of the different nature of healthy membrane cells, bacterial membranes or cancer cells. Due to the fact that the time scale at which this process is expected to happen is not approachable for a classic Molecular Dynamic simulation, it is necessary to apply different approximations. In this project simulations using Coarse-Grain resolution, which allow the reduction of the total amount of particles using groups of atoms, have been carried out. The results obtained show that the studied cyclic peptide is able to 5 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. self-assemble in bacterial membranes and cancer cells, being able to disrupt them, whereas in healthy cell membranes the self-assembly takes place in the solvent surrounding the membrane, which suggests that the cyclic peptide would not be toxic for a cell with this lipidic composition. Co obxetivo de estudar o proceso de autoensamblaxe dun ciclopéptido anfipático con potencial actividade antimicrobiana en bicapas lipídicas de diferente composición, levouse a cabo un estudo empregando cálculos de Dinámica Molecular. A diferenza da maioría dos antibióticos existentes na actualidade, os cales adoitan empregar proteínas específicas como diana, estes ciclopéptidos teñen como obxetivo determinadas composicións lipídicas, aproveitando a distinta natureza de membranas celulares sas, bacterianas ou canceríxenas. Debido a que a escala de tempo á que se espera que este proceso ocorra non é abordable para unha simulación clásica de Dinámica Molecular, é necesario a aplicación de diferentes aproximacións. Neste proxecto realizáronse simulacións empregando resolución Coarse- Grain (CG), a cal permite a redución do número total de partículas empregando grupos de átomos. Os resultados obtidos indican que o péptido estudado é capaz de autoensamblarse en membranas bacterianas e canceríxenas provocando a rotura das mesmas, mentres que en membranas celulares sas o autoensamblaxe prodúcese no disolvente que rodea a membrana, o que suxire que o ciclopéptido non sería tóxico para unha célula con esta composición lipídica. 6 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Índice de abreviaturas ● MD: Dinámica molecular ● CP: Ciclopéptido ● NT: Nanotubo ● AMP: Antimicrobial Peptide (Péptido antimicrobiano) ● ACP: Anticancer Peptide (Péptido anticancerígeno) ● SCPN: Self-assembled cyclic peptide nanotube (Nanotubo de ciclopéptidos autoensamblados) ● PBC: Periodic Boundary Conditions (Condiciones Periódicas de Contorno) ● fs: femtosegundo ● µs: microsegundo ● AA: all-atoms ● DMPC: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina ● DMPG: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol) ● DMPE: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina ● CG: Coarse-Grain ● CESGA: Centro de Supercomputación de Galicia 7 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. 1. Introducción Resistencia a antibióticos. La resistencia adquirida a antibióticos se ha convertido a día de hoy en una de las mayores amenazas para la salud mundial1. Este fenómeno se debe a la mutación de bacterias como respuesta al uso de fármacos y, aunque este es un proceso natural, está acelerándose debido al mal uso de antibióticos en seres humanos y animales. Este hecho dificulta el tratamiento de enfermedades infecciosas comunes, pudiendo llegar a convertirse en imposibles de tratar1. La resistencia a tratamientos médicos actuales no es exclusiva de los enfocados a enfermedades infecciosas, sino que se extiende también a terapias destinadas a tratar el cáncer, siendo la principal la quimioterapia. Esta técnica está basada en el uso de agentes químicos que matan de forma masiva a las células cancerígenas, pero presenta una selectividad muy baja, provocando a menudo diferentes efectos secundarios. Además, está viendo limitada su eficacia por el desarrollo de resistencia por parte de las células tumorales2. Se ha propuesto que ambos tipos de enfermedades podrían estar relacionadas, ya que el desgaste que supone el tratamiento del cáncer hace más vulnerables a los pacientes frente a infecciones. Además, existen evidencias de que ciertas infecciones crónicas están asociadas con el desarrollo del cáncer, atribuyéndosele a estas el 20% de los nuevos casos a nivel mundial3. 8 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Otra de las características comunes entre cáncer e infección es la composición lipídica de las membranas que componen las bacterias y las células tumorales. La membrana de una célula normal sana presenta asimetría en la distribución de cargas entre la superficie externa e interna de la membrana. La parte externa de la membrana es neutra y está formada principalmente por el fosfolípido fosfatidilcolina, mientras que la parte interna está cargada negativamente, siendo la fosfatidilserina el fosfolípido predominante. Sin embargo, esta asimetría se pierde en las células cancerígenas debido a la presencia de fosfatidilserina también en la parte externa de la membrana4,5,6 (Figura 1). Por su parte, las bacterias presentan una membrana cargada negativamente, siendo la fosfatidiletanolamina el lípido zwitteriónico más común en estas membranas. Además, en torno al 20%-25% de los lípidos constituyentes poseen carga negativa, como por ejemplo el fosfatidilglicerol7. Figura 1. Representación esquemática de la composición lipídica de la membrana de una célula sana frente a una tumoral. Los antibióticos convencionales, por lo general, se unen a receptores específicos, lo que desencadena diferentes procesos celulares que inhiben la proliferación del microorganismo8. Por tanto, aquellos nuevos medicamentos que tengan un mecanismo de acción similar también serán propensos a inducir resistencia en las bacterias, siendo necesario buscar agentes alternativos que presenten un mecanismo de acción diferente8. Como consecuencia, el estudio de agentes microbianos alternativos ha adquirido gran 9 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. importancia en los últimos años, siendo esta también una oportunidad extraordinaria para la prevención y el tratamiento del cáncer. En esta línea, ha emergido en los últimos tiempos una nueva clase de moléculas conocidas como péptidos terapéuticos, las cuales podrían tener como objetivo específico las membranas tanto de células cancerígenas como de bacterias, presentando además una toxicidad menor que algunos tratamientos actuales9. Entre los péptidos terapéuticos han sobresalido los péptidos antimicrobianos (AMPs) como una de las alternativas más atractivas. Los AMPs son, por lo general, moléculas de pequeño tamaño cargadas positivamente, los cuales se encuentran presentes en una gran variedad de organismos donde actúan como efectores esenciales del sistema inmune, siendo la defensa natural de estos contra las infecciones causadas por bacterias, virus y hongos10. Además de ser una de las alternativas a los antibióticos convencionales, algunos AMPs han mostrado tener actividad anticancerígena, estos reciben el nombre de péptidos anticancerígenos (ACPs)11. El hecho de que los péptidos terapéuticos tengan como objetivo principal las membranas lipídicas, así como su corto tiempo de interacción, hace que el desarrollo de resistencia por parte de bacterias y células tumorales sea menos probable12,13. Esta ventaja ha impulsado su investigación en los últimos años, lo que ha dado lugar a la creación de bases de datos14 en las que se recogen miles de estas sustancias tanto de origen natural como sintético. A pesar de que muchos grupos de investigación han centrado sus esfuerzos en los AMPs/ACPs, tan solo unos pocos han podido ser probados en ensayos clínicos15. Esto se debe a que su uso se ve limitado por su alto coste de síntesis, su despreciable actividad cuando son administrados oralmente ya que son poco resistentes a la digestión proteolítica, así como a su baja estabilidad in vivo16,17. Una alternativa a los péptidos terapéuticos viene dada por el uso de los biomateriales “inteligentes”. Estos sistemas podrían ser diseñados para adaptar sus propiedades químicas y mecánicas como respuesta a cambios en las condiciones fisiólogicas o a estímulos externos, presentando actividad biológica tan solo en condiciones específicas18, como por ejemplo en presencia de una membrana bacteriana o cancerígena. Estos péptidos miméticos sintéticos pueden ser construidos a partir de unidades no tóxicas de pequeño tamaño, las cuales tras autoensamblarse en la membrana de la célula tumoral o bacteriana, 16 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. 𝑉𝑒𝑙𝑒 =∑ 𝑖>𝑗 𝑞𝑖𝑞𝑗 4𝜋𝜀0𝑟𝑖𝑗 Donde qi y qj son las cargas puntuales de los átomos, ε0 es la constante dieléctrica del medio y rij es la distancia entre los átomos. El segundo subtérmino engloba las repulsiones de Pauli que se producen entre dos átomos que se encuentran muy próximos, de manera que sus orbitales comienzan a solaparse, y las fuerzas de atracción a larga distancia de van der Waals. Ambas interacciones se suelen expresar a través del potencial de Lennard-Jones: 𝑉𝐿𝐽 =∑ 𝑖>𝑗 4𝜀𝑖𝑗[(𝜎𝑖𝑗 𝑟𝑖𝑗)12−(𝜎𝑖𝑗 𝑟𝑖𝑗)6] Donde el minuendo representa la repulsión y el sustraendo la atracción. Los términos εij y σij son parámetros de interacción que expresan, respectivamente, cómo de fuerte es esta y la distancia entre partículas que es necesaria para que se vuelva cero. Estos parámetros se calculan a partir de los propios de cada átomo34: 𝜀𝑖𝑗 =√𝜀𝑖𝜀𝑗 𝜎𝑖𝑗 =𝜎𝑖+𝜎𝑗 2 A día de hoy, no es posible llevar a cabo simulaciones de MD incluyendo todos los átomos que participan en un sistema “real”, pues esto supondría una cantidad de partículas que la potencia de los ordenadores todavía no puede manejar. Para la realización de las simulaciones MD se define un espacio tridimensional, el cual se denomina “caja de simulación”. Una de las limitaciones que esto conlleva es que debido a que el tamaño típico de estas cajas está en la escala nanométrica, la proporción de partículas que se encuentran en la superficie de la caja de simulación interaccionando con el vacío es mucho más grande que en sistemas reales. Como alternativa, se introduce el concepto de condiciones periódicas de contorno (PBC), que consiste en replicar la caja de simulación infinitas veces 17 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. en todas las dimensiones del espacio, de tal forma que las ecuaciones de movimiento solo son resueltas para la caja original y el resto se limitan a replicar lo que ocurre en esta. Además, cuando el movimiento de las partículas implica que una de estas salga de su caja, una partícula idéntica entrará para ocupar su lugar por el borde contrario, puesto que el mismo movimiento está ocurriendo en todas las cajas de forma simultánea. De este modo, esta aproximación permite mantener constante el número de átomos en el recipiente en todo momento. Cabe destacar que, de considerar todas las posibles interacciones no enlazantes entre átomos al introducir las PBC, el coste computacional de los cálculos sería muy elevado. Por ello, para reducir el coste y asegurarse de que cada interacción se calcula una sola vez, se introduce una distancia de corte (cut-off). Por tanto, solo se calcularán las interacciones no enlazantes que se den entre átomos separados por una distancia menor que la de corte, siendo el resto de interacciones no calculadas de manera explícita. Otra dificultad que puede surgir en las simulaciones de MD es el control de la temperatura y la presión. Con el fin de solucionar esto se han definido diferentes algoritmos que actúan como termostatos y barostatos. Para el control de la temperatura los termostatos más utilizados son V-rescale35, Berendsen36, Nose-Hoover36 y Andersen37, los cuales adaptan la energía cinética de los átomos por modificación de su velocidad para tal tarea. En cuanto al control de la presión, los barostatos más utilizados son el de Berendsen y el Parrinello- Rahman, los cuales la ajustan modificando el volumen de la caja de simulación 38. Como ya se ha comentado anteriormente, la MD consiste en la integración de las ecuaciones del movimiento de Newton con el fin de determinar cómo varía la posición de las partículas del sistema con el tiempo. Para realizar la integración numérica de las ecuaciones existen diversos algoritmos como el Verlet o el Leap-Frog. Estos algoritmos se basan en el cálculo de las posiciones y velocidades de los átomos a un tiempo t+dt a partir de las fuerzas que actúan sobre ellos en un tiempo anterior t, para el cual se conocen las posiciones y velocidades. Es por tanto necesario definir unas condiciones iniciales. En el caso de las velocidades, estas se suelen obtener a partir de una distribución de Maxwell- Boltzmann para la temperatura de simulación, recalculándose a cada paso utilizando el potencial obtenido con el campo de fuerzas. Las coordenadas iniciales se pueden obtener 18 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. de datos experimentales, de repositorios online como el Protein Data Bank39, de otros modelos teóricos o incluso pueden ser dibujadas usando un software específico. Otro aspecto importante de cara a correr la simulación es la selección del tiempo de paso o time step (dt). En las simulaciones de MD, se suele utilizar un time step de 2 fs. Muchos de los parámetros mostrados hasta el momento como las constantes de fuerza o las distancias y ángulos de equilibrio varían dependiendo del campo de fuerzas escogido. Por tanto, la elección de uno u otro es crucial, ya que puede llevar a cambios en los resultados. Normalmente, cada partícula de un campo de fuerzas coincide con un átomo, como por ejemplo en los campos de fuerzas de Amber40 o CHARMM41. Sin embargo, esto no siempre es así, ya que hay campos de fuerzas en los que los átomos pesados se agrupan con sus hidrógenos no polares (típicamente son hidrógenos en estructuras como: CH2, CH3, NH2...) para formar una única subunidad de interacción, como en el campo de fuerzas de GROMOS42. La aproximación utilizada es lo que determina la resolución de la simulación. Para aquellos casos en los que se representa cada átomo de forma explícita e individual, la resolución se denomina atomística o all-atoms (AA), mientras que cuando no todos los átomos están representados, sino que los hidrógenos no polares están descritos como parte de agrupaciones, recibe el nombre de united-atoms (UA)43. Un paso más allá sería la resolución que se emplea en el presente trabajo y que recibe el nombre de resolución Coarse-Grain (CG), la cual permite reducir el número de partículas del sistema a estudiar agrupando átomos pesados en una única unidad de interacción, la cual recibe el nombre de “bead”. El trabajo aquí presentado se ha realizado utilizando el campo de fuerzas Martini, uno de los más comunes para este tipo de resolución44 (Figura 4). 19 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 4. Comparación de los distintos tipos de resolución empleados en simulaciones de MD: (a) α,γ-CP en resolución AA; (b) SDS en resolución UA y (c) Lípido DMPC en resolución CG con el mapeado de Martini y su equivalencia en AA (imagen tomada de http://cgmartini.nl/index.php/about). En este campo de fuerzas cada partícula está formada por cuatro átomos pesados y sus respectivos hidrógenos, estando las interacciones no enlazantes parametrizadas a partir de energías libres de partición experimentales entre fases polares y apolares y las enlazantes en simulaciones AA. Además, con el fin de simplificar el modelo, solo se contemplan cuatro tipos de interacciones entre partículas: polares, no polares, apolares y cargadas44. Esto tiene ciertos inconvenientes, ya que algunas interacciones no están bien definidas, como el caso de los enlaces de hidrógeno, que son esenciales en la formación y conservación de las estructuras secundarias de las proteínas. Sin embargo, la cantidad de partículas que forman el sistema se ve reducida considerablemente permitiendo simular sistemas más grandes que las simulaciones AA. Algo similar ocurre con el time step, para las simulaciones AA se suele utilizar un time step de 2 fs pero, debido a la simplificación realizada, este se puede aumentar en las simulaciones CG casi en un orden de magnitud. Gracias a esto, una simulación CG-MD en el mismo número de pasos que una simulación AA-MD alcanzará un tiempo total de simulación mucho mayor. 20 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. 2. Objetivos. El objetivo de este proyecto es estudiar el proceso de autoensamblaje de CPs en nanotubos peptídicos en diferentes entornos lipídicos utilizando simulaciones de MD. La información obtenida podría ayudar en un futuro al diseño más inteligente de secuencias de CPs con mejores actividades. La formación espontánea de nanotubos a nivel atomístico (AA) es un proceso muy costoso a nivel computacional. A día de hoy, este proceso solo puede ser abordado utilizando una resolución CG. Mientras que en trabajos previos del grupo siempre se había partido de un nanotubo ya formado, en este trabajo se partirá de los CPs en disolución, analizándose su posible autoensamblaje. Se ha utilizado un CP anfipático con una secuencia cuya actividad antimicrobiana ha sido previamente demostrada25 (Figura 5). 21 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 5. Se representa el D,L-α-CP utilizado en el plano (izquierda) y con resolución CG (derecha). Tratando de imitar las composiciones más habituales de las membranas de células de mamíferos y de bacterias, se utilizarán tres bicapas lipídicas distintas. Una de ellas estará formada íntegramente por 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DMPC), un fosfolípido con carga neta 0 con la que se pretende representar las membranas de las células de los mamíferos, ya que este lípido representa alrededor de la mitad de los fosfolípidos en la mayoría de estas células. Las otras dos serán modelos de membranas bacterianas: para una de ellas se combina el fosfolípido DMPC anterior con 1,2-dimiristoil- sn-glicero-3-fosfo-(1’-rac-glicerol) (DMPG) en proporción 3:1 y para la otra se utiliza 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DMPE) y DMPG en proporción 1:9. Variando el contenido de cargas negativas de la membrana, se pretende entender el rol que desempeña la carga de la bicapa lipídica en el proceso de autoensamblaje de los SCPNs. 22 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. 3. Materiales y Plan de Trabajo El ciclopéptido utilizado para llevar a cabo el trabajo es uno para el que ya se había demostrado con anterioridad su actividad antimicrobiana25, y para el que ya se disponía de una geometría inicial, pues ha sido usado por otros investigadores con anterioridad45 así como por miembros del grupo46. Las membranas utilizadas también fueron proporcionadas por el grupo de investigación, por lo que el primer paso fue añadir, con una distribución aleatoria, los ciclopéptidos a la caja de simulación en la que se encontraba la membrana solvatada con agua. Dado que el CP utilizado posee carga positiva (carga neta +3, se consideran los residuos de lisina y la arginina protonados), se añadieron iones hasta obtener un sistema neutro (Figura 6). Se han utilizado tres membranas diferentes y, para cada una, se han preparado un total de cuatro simulaciones variando la cantidad de CPs añadidos: 20, 40, 80 y 160. De este modo, el número total de sistemas simulados es doce. 23 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 6. Esquema de la preparación del sistema con GROMACS (se omiten las aguas por claridad). La membrana lipídica se representa en azul claro, lo iones en azul y los CPs en amarillo. Los sistemas fueron preparados con el programa GROMACS47 en su versión 2018.3. Posteriormente, y también con el mismo programa, se optimizaron los sistemas, se ajustaron y equilibraron la presión y la temperatura y se simularon durante 20 µs utilizando un time step de 25 fs. La presión utilizada durante la simulación fue de 1 bar, controlada mediante un sistema semi-isotrópico Parrinello-Rahman48, mientras que la temperatura utilizada fue 303K controlada mediante un termostato V-rescale35. La parte de preparación de los sistemas, optimización y equilibrado se realizó en un ordenador proporcionado por el grupo mientras que las producciones finales fueron realizadas en el CESGA. Una vez terminadas las simulaciones, para la visualización e interpretación de los resultados obtenidos se utilizó el programa VMD49. Posteriormente se utilizó un algoritmo desarrollado con Python por los miembros del grupo cuya validación se realizó previamente como trabajo en prácticas externas. Este algoritmo permite realizar un análisis rápido de la trayectoria de una simulación, obteniendo una serie de gráficas y archivos de texto que recogen importante información estructural como por ejemplo el número de CPs que se encuentran formando clústeres de diferentes tamaños en función del tiempo de simulación, la disposición paralela/antiparalela de CPs que forman parte de NTs o los ángulos de rotación entre CPs contiguos. 24 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. 4. Resultados y discusión. Interacción de los ciclopéptidos con la membrana modelo de DMPC. Como ya se ha mencionado, con esta bicapa se pretende representar la composición de una membrana celular de un mamífero sano. Como se observa en los snapshots de la Figura 7 se aprecian dos tendencias en la formación NTs. Por una parte, en la simulación con 20 CPs, la de menor concentración, se aprecia como las unidades se ensamblan en la superficie de la membrana, mientras que al utilizar una cantidad de CPs superior se observa una clara tendencia al autoensamblaje en el medio acuoso, así como al agrupamiento de los SCPNs. Además, incluso a las concentraciones más elevadas de CPs no se observa una tendencia clara del péptido a unirse a la membrana. Este resultado indicaría que el CP no sería excesivamente activo para este tipo de células, sugiriendo una baja toxicidad. 25 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 7. Comparación del estado inicial (izquierda) y final (t= 20µs; derecha) de las simulaciones de MD realizadas para la membrana PC, (a) simulación con 20 CPs. (b) simulación con 40CPs, (c) simulación con 80CPs y (d) simulación con 160 CPs. Se muestran en color dorado los grupos fosfato de los lípidos y en morado el esqueleto peptídico de los CPs. El análisis de la trayectoria completa con el algoritmo desarrollado por el grupo permite analizar de forma cuantitativa cuantos clústeres se han formado, así como el tamaño de los mismos en cada instante de la simulación (Figura 8). Figura 8. Gráficas obtenidas por el algoritmo de análisis en las que se representa el número de CPs que se ensamblan en los clústeres de distinto tamaño formados a lo largo de todo el tiempo de simulación donde (a) es la gráfica para la concentración de 20 CPs, (b) para 40 CPs, (c) para 80 CPs y (d) para 160 CPs. 32 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 18. Número de CPs que se ensamblan en los clústeres de distinto tamaño formados a lo largo de todo el tiempo de simulación donde (a) es la gráfica para la simulación con 20 CPs, (b) para 40 CPs, (c) para 80 CPs y (d) para 160 CPs. Este sistema presenta una tendencia menor a la formación de NTs que el anterior, pues en este caso , cerca del 67% de los CPs se encuentran formando clústeres. Aunque es en esta membrana en la que se registra el SCPN de mayor tamaño de forma estable (en la anterior el heptámero solo aparecía de manera puntual en un frame), se puede observar una disminución general del tamaño de los clústeres, predominando todavía más los dímeros y los trímeros. Además, cabe destacar que el heptámero se formó en el medio acuoso y no en la membrana. Del análisis de los últimos 5 µs de la trayectoria se obtuvo la relación entre dímeros paralelos y antiparalelos, siendo presentada en la Figura 19. 33 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 19. Histogramas d el número de CPs paralelos/antiparalelos para las diferentes cantidades de CPs añadidos: (a) 20 CPs, (b) 40 CPs, (c) 80 CPs y (d) 160 CPs. En estos sistemas se observa una mayor disparidad en la proporción de parejas de CPs que guardan relación paralela o antiparalela. Cabe destacar, el cambio de tendencia que se observa de las simulaciones con una baja cantidad de CPs a la simulación con 160 CPs. Este hecho se observa en presencia de todas las distintas composiciones, siendo este el sistema con la mayor diferencia. Esto puede sugerir que la concentración de CPs puede afectar a la disposición que toman unos respecto de otros al ensamblarse. El análisis de los ángulos de rotación de los dímeros paralelos se representa en la Figura 25. 34 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 20. Distribución de los ángulos de rotación calculados por el algoritmo para los CPs paralelos a las diferentes cantidades de CPs añadidos: (a) 20 CPs, (b) 40 CPs, (c) 80 CPs y (d) 160 CPs. Aunque entre las parejas de CPs paralelos los intervalos de rotación predominantes siguen siendo los mismos que en los sistemas anteriores, cabe destacar el aumento, al menos en las simulaciones con menor cantidad de CPs, de parejas en las que el ángulo de rotación está entre 90-120˚ y 240-270˚. En los valores angulares pertenecientes a estos rangos, las conformaciones posibles pueden presentar 6 residuos hidrofóbicos (2 Triptófanos y una Leucina de cada CP) alineados (90˚ y 270˚) o enfrentados pero sin eclipsarse. Es decir, estando las cadenas laterales alternadas como se representa en la Figura 21 (Resto de valores de los rangos angulares). 35 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 21. A la izquierda se muestra un dímero paralelo con ángulo de rotación de 114˚ y a la derecha uno con ángulo de rotación de 245˚. Las esferas que representan las cadenas laterales se han reducido en tamaño para facilitar la visualización. Que estas conformaciones no sean tan notorias en las simulaciones con mayor número de CPs puede deberse a que, como se vió anteriormente, en estas hay un mayor número de CPs ensamblados en el medio acuoso, y esta disposición de los CPs, según muestran las simulaciones, se da sobre todo en NTs que se han ensamblado en la membrana y que, además, no se han internalizado mucho, de forma que estos residuos hidrofóbicos se enfrentan unos a otros dentro de la membrana, quedando el resto expuestos al agua (Figura 22). Figura 22. Dímero formado por CPs paralelos en el que el ángulo de rotación es de 114˚. Las moléculas de agua se han puesto en un tamaño menor para permitir la visualización del dímero. 36 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. El análisis de los ángulos de rotación de los dímeros antiparalelos se representa en la Figura 23. Figura 23. Distribución de los ángulos de rotación calculados por el algoritmo para los CPs antiparalelos a las diferentes cantidades de CPs añadidos: (a) 20 CPs, (b) 40 CPs, (c) 80 CPs y (d) 160 CPs. La distribución de los ángulos de rotación obtenidos para los CPs antiparalelos no difiere mucho de los valores obtenidos para la membrana anterior, siguen siendo mayoritarios aquellos valores en los que se enfrentan un mayor número de residuos hidrofóbicos. Interacción de los ciclopéptidos con la membrana modelo de DMPE:DMPG (1:9) Esta membrana está formada por una mezcla 1:9 de los lípidos DMPE y DMPG respectivamente, y es la que posee mayor densidad de carga negativa. Como se observa en la Figura 21, en el momento inicial de la simulación los CPs ya se encuentran más próximos a la membrana, debido a que en el paso previo de equilibrado ya se ha producido un pequeño desplazamiento de los CPs hacia la membrana. Además, como se puede apreciar en dicha figura para las 4 concentraciones estudiadas, se observa la formación de NTs en la 37 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. membrana y en ningún caso, a diferencia de las otras membranas estudiadas, los CPs se agregan en el medio acuoso. Estos resultados sugieren que el CP sería tóxico para un organismo que posea en sus células una composición lipídica similar a la presentada, pudiendo llegar a romper la membrana celular. También cabe destacar la acusada curvatura que adquiere la membrana a la concentración más alta, lo que sugiere de nuevo que estos CPs la distorsionan de forma significativa. (Figura 24). Este fenómeno puede ser debido a la acumulación de NTs en la membrana, de forma que al aumentar la proporción de lípidos DMPG la interacción con la misma es mayor provocando así una deformación más severa. Figura 24. Comparación de los estados inicial (izquierda) y final (t=20µs; derecha) de las simulaciones de MD realizadas para la membrana DMPE:DMPG (1:9). (a) simulación con 20 CPs, (b) simulación con 40 CPs, (c) simulación con 80 CPs y (d) simulación con 160 CPs. Del análisis completo de las trayectorias se obtiene el número de SCPNs formados por distinto número de CP a lo largo del tiempo (Figura 25). 38 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 25. En las gráficas se representa el número de CPs que se ensamblan en los clústeres de distinto tamaño formados a lo largo de todo el tiempo de simulación donde (a) es la gráfica para la simulación con 20 CPs, (b) para 40 CPs, (c) para 80 CPs y (d) para 160 CPs. Como se puede observar, este el sistema con una menor tendencia a la formación de NTs, econtrándose de media para el momento final de la simulación algo menos del 50% de los CPs en clústeres. Además, el tamaño de los SCPNs que se forman se limita prácticamente a dímeros y trímeros, encontrándose únicamente un tetrámero y un pentámero en la parte final de la simulación que cuenta con la mayor cantidad de CPs añadidos. Estos datos sugieren que, aunque el CP muestra una gran afinidad por la membrana, la formación de NTs no es tan favorable como en los casos anteriores. Del análisis de los últimos 5 µs de las trayectorias se obtuvieron las gráficas que relacionan el número de dímeros paralelos y antiparalelos (Figura 26), las relativas al análisis de los ángulos de rotación en dímeros paralelos (Figura 27) y las que hacen referencia a los ángulos de rotación en los dímeros antiparalelos (Figura 28). 39 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 26. Histogramas obtenidos para las diferentes simulaciones: (a) 20 CPs, (b) 40 CPs, (c) 80 CPs y (d) 160 CPs. Igual que en los casos anteriores no se aprecia una gran diferencia entre el número de parejas que son paralelas y aquellas que son antiparalelas. También para este sistema se observa como cambia la proporción en función del número de CPs presentes en la simulación. 40 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 27. Se muestra la distribución de los ángulos de rotación calculados por el algoritmo para los CPs paralelos a las diferentes cantidades de CPs añadidos: (a) 20 CPs, (b) 40 CPs, (c) 80 CPs y (d) 160 CPs. Los ángulos de rotación más habituales entre los CPs paralelos vuelven a estar entre 0-30˚ y 330-360˚. Además, el predominio de estos valores en esta membrana es, aparentemente, mayor que en las anteriores. Esto puede deberse a que, al encontrarse los CPs más fuertemente atraídos hacia la membrana, debido al mayor carácter negativo de la misma, la internalización sea mayor y por tanto se vean más favorecidos los ángulos en los que hay un mayor número de residuos hidrofóbicos enfrentados dentro de la membrana. Cabe destacar, que en las simulaciones con 80 y 160 CPs vuelven a ser significativos los intervalos angulares comprendidos entre 100-120˚ y 240-270˚, esto sugiere que en estas simulaciones en las que la membrana está más saturada de CPs, no todos son capaces de alcanzar la misma profundidad. 41 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Figura 28. Se muestra la distribución de los ángulos de rotación calculados por el algoritmo para los CPs antiparalelos a las diferentes cantidades de CPs añadidos: (a) 20 CPs, (b) 40 CPs, (c) 80 CPs y (d) 160 CPs En el caso de CPs antiparalelos la distribución de los ángulos de rotación no difiere excesivamente de los casos anteriores, la mayor diferencia se observa en la simulación con 20 CPs en la que aparecen una gran cantidad de parejas con ángulos de rotación entre 100- 130˚ y 230-260˚. Sin embargo, esto no se ajusta a lo esperado ya que son las configuraciones en las que menos residuos hidrofóbicos se enfrentan (Figura 29). Figura 29. Representación de las conformaciones adoptadas por dímeros antiparalelos cuando el ángulo de rotación es 115˚ y 245˚ (Valores medios de los rangos). 48 Infección y cáncer: una aproximación a través de la química computacional. Bibliografía 1 WORLD HEALTH ORGANIZATION. Antibiotic Resistance. 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