Mecanismos moleculares da acantose nigricans na síndrome de Rabson- Mendenhall

Traballo de fin de grao Mecanismos moleculares da acantose nigricans na síndrome de Rabson- Mendenhall Mecanismos moleculares de la acantosis nigricans en el síndrome de Rabson- Mendenhall Molecular mechanisms of acanthosis nigricans in Rabson-Mendenhall syndrome Autor: Andrés Antelo Abeijón Titor: David Araújo Vilar Cotitora: Sofía Sánchez Iglesias Departamento: Psiquiatría, Radioloxía, Saúde Pública, Enfermería e Medicina (Área de Medicina) Setembro de 2022 Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en Medicina iii AGRADECEMENTOS Gustaríame agradecer nestas liñas á UETeM e aos seus membros a oportunidade que me brindaron alá polo 2018 de poder unirme a este grupo de investigación. De xeito especial gustaríame agradecer a Silvia Cobelo Gómez, estudante predoutoral na UETeM, a súa axuda inestimable á hora de realizar as RT-qPCRs deste estudo. Sen dúbida, sen a súa colaboración este traballo non sería posible. Gardo moi bos recordos do verán do 2021 no que fun bolseiro no grupo e daquelas mañás no CEBEGA (ou “matanza de Texas”). Quero agradecer á Dra. Sofía Sánchez Iglesias a súa implicación desinteresada na miña formación en investigación. Foi un pracer ter aprendido de ti. Quedarán sempre no meu recordo aquelas charlas sobre grandes series como H2O. A Alberto, o meu compañeiro desde 3º nesta aventura, houbo bastantes anécdotas aqueles días no laboratorio. Ao meu titor, o Dr. David Araújo Vilar, por ofrecerme formar parte da UETeM e de realizar este traballo, por trasladarme inquedanzas sobre a investigación básica e clínica en medicina e por poder ter aprendido sobre a Endocrinoloxía clínica aquel verán do 2019 no que estiven de prácticas no Servizo de Endocrinoloxía e Nutrición do CHUS. A todos os meus amigos que me apoiaron durante todos estes anos, á miña familia e aos meus pais, Moitas grazas a todos. iv LISTAXE DE ABREVIATURAS AN: acantose nigricans ACOH: anticonceptivos orais hormonais cDNA: ácido desoxirribonucleico complementario CGL2: lipodistrofia conxénita xeneralizada tipo 2 DMEM: medio de Eagle modificado por Dulbecco DMSO: dimetilsulfóxido (disolvente orgánico) EGFR: receptor do factor de crecemento epidérmico. FBS: soro fetal bovino FGF-21: factor de crecemento fibroblástico 21 GMPc: guanina monofosfato cíclico. GSK-3 b : glicóxeno sintasa quinasa-3 beta HAIR-AN: síndrome de hiperandroxenismo, resistencia á insulina e acantose nigricans HbA1c: fracción da hemoglobina glicosilada IGF-1: factor de crecemento celular relacionado coa insulina tipo 1 IGF-1R: receptor do factor de crecemento celular relacionado coa insulina tipo 1 IGFBPs: proteínas de unión ao IGF IMC: índice de masa corporal IR: receptor de insulina LES: lupus eritematoso sistémico PBS: tampón salino fosfato PI3K: fosfatidilinositol 3 quinasa RNA: ácido ribonucleico RNAsa: ribonucleasa RT-qPCR: reacción en cadea da polimerasa cuantitativa en tempo real. SNC: sistema nervioso central SOP: síndrome de ovario poliquístico TGF- a : factor de crecemento tumoral alfa v RESUMO Introdución e obxectivos: A síndrome de Rabson-Mendenhall encádrase dentro das síndromes de resistencia á insulina extremas e é causado por variantes bialélicas no xene do receptor da insulina. Unha das súas características clínicas é a presenza de acantose nigricans. A literatura máis actual considera que a acantose nigricans relacionada coa resistencia á insulina pode explicarse pola acción da insulina sobre o receptor de IGF-1. Este traballo ten como obxectivo entender cales son os mecanismos moleculares que levan á aparición de acantose mediante o cultivo de fibroblastos e preadipocitos primarios de pacientes con síndrome de Rabson- Mendenhall. Material e métodos: Cultivo de dúas liñas celulares de pacientes afectados pola síndrome de Rabson-Mendenhall (fibroblastos e preadipocitos) e de fibroblastos de individuo san, que actuarán como control. Trataranse con insulina, insulina e un inhibidor de IGF-1R (Linsitinib) e insulina e un inhibidor de GSK-3b (CHIR99021), cos seus controis respectivos con DMSO. Posteriormente extraerase cDNA para avaliar a expresión xénica mediante RT-qPCR. Resultados e conclusións: Avaliouse a expresión dos seguintes xenes: MAP3K5, MAP2K1, PI3KR1, ELK1, CTNNB1, MTOR, CCNC, GSK3B mediante RT-qPCR. Os resultados amosan unha tendencia ao aumento de expresión nas liñas celulares afectadas, estatisticamente significativo nalgúns dos xenes. Tras o tratamento con Linsitinib, evidénciase en certos xenes unha tendencia á baixa na expresión. Respecto a CHIR99021, a tendencia é ao aumento na expresión, se ben non xeneralizado nos xenes a estudo. Obsérvase un aumento de expresión significativo nos xenes da ruta MAPK na liña celular de fibroblastos de Rabson-Mendenhall, o que indicaría que esta vía está involucrada no desenvolvemento de AN. Obxectívase polo tanto que parece plausible pensar que a AN nos síndromes de resistencia á insulina se relaciona con IGF-1R, mais fanse necesarios máis estudos que determinen o alcance destes achados. Palabras clave: acantose nigricans; síndrome de Rabson-Mendenhall; Rabson- Mendenhall; insulina; resistencia á insulina; IGF-1; IGF-1R; cultivo celular; expresión xénica; inhibidores de IGF-1R; inhibidores de GSK3b; Linsitinib; CHIR99021 ! vi RESUMEN Introducción y objetivos: El síndrome de Rabson-Mendenhall se encuadra dentro de los síndromes de resistencia a la insulina extremos y es causado por variantes bialélicas en el gen del receptor de insulina. Una de sus características clínicas es la presencia de acantosis nigricans. La literatura más actual considera que la acantosis nigricans relacionada con la resistencia a la insulina se puede explicar por la acción de la insulina sobre el receptor de IGF-1. Este trabajo tiene como objetivo entender cuáles son los mecanismos moleculares que llevan a la aparición de acantosis mediante el cultivo de fibroblastos y preadipocitos primarios de pacientes con síndrome de Rabson-Mendenhall. Material y métodos: Cultivo de dos líneas celulares de pacientes afectados por el síndrome de Rabson-Mendenhall (fibroblastos y preadipocitos) y de fibroblastos de individuo sano, que actuarán como control. Se tratarán con insulina, insulina y un inhibidor de IGF-1R (Linsitinib) e insulina y un inhibidor de GSK-3b (CHIR99021), con sus controles respectivos de DMSO. Posteriormente se extraerá cDNA para evaluar la expresión génica mediante RT-qPCR. Resultados y conclusiones: Se evaluó la expresión génica de los siguientes genes: MAP3K5, MAP2K1, PI3KR1, ELK1, CTNNB1, MTOR, CCNC, GSK3B mediante RT- qPCR. Los resultados muestran una tendencia al aumento de expresión en las líneas celulares afectadas, estadísticamente significativo en algunos de los genes. Tras el tratamiento con Linsitinib, se evidencia en ciertos genes una tendencia a la baja en la expresión. Respecto a CHIR99021, la tendencia es al aumento en la expresión, si bien no generalizado en los genes a estudio. Se observa un aumento de expresión significativo en los genes de la ruta MAPK en la línea celular de fibroblastos de Rabson-Mendenhall, lo que indicaría que esta vía está involucrada en el desarrollo de AN. Se objetiva por lo tanto que parece plausible pensar que la AN en los síndromes de resistencia a la insulina se relaciona con IGF-1R, aunque se hacen necesarios más estudios que determinen el alcance de estos hallazgos. Palabras clave: acantosis nigricans; síndrome de Rabson-Mendenhall; Rabson- Mendenhall; insulina; resistencia a la insulina; IGF-1; IGF-1R; cultivo celular; expresión génica; inhibidores de IGF-1R; inhibidores de GSK3b; Linsitinib; CHIR99021 vii ABSTRACT Introduction and objectives: Rabson-Mendenhall syndrome is set within extreme insulin resistance syndromes, and it is produced by biallelic variants in insulin receptor gene. One typical clinical characteristic is the presence of acanthosis nigricans. Now it is considered that acanthosis nigricans due to insulin resistance would be explained by the action of insulin in IGF-1 receptor. The objective of this project is showing what are the molecular mechanisms involved in the acanthosis through culturing fibroblasts and primitive preadipocytes of Rabson-Mendenhall syndrome patients. Material and methods: culture of two patients cell lines affected by Rabson- Mendenhall syndrome (fibroblasts and preadipocytes) and culture of fibroblasts from a healthy individual, which will act as a control. Cells will be treated with insulin, insulin and IGF-1R inhibitor (Linsitinib) and insulin and GSK-3b inhibitor (CHIR99021). Respective controls with DMSO were established. Then, cDNA will be extracted to evaluate genetic expression through RT-qPCR. Results and conclusions: Gene expression of the following genes (MAP3K5, MAP2K1, PI3KR1, ELK1, CTNNB1, MTOR, CCNC, GSK3B) was evaluated by RT- qPCR. Results tend to increase expression in the affected cell lines, statistically significant in certain genes studied. After Linsitinib treatment, gene expression tends to decrease in some genes. After CHIR99021 treatment, gene expression tends to increase, though it is not generalized in all genes. It is shown a statistically significant increase in MAPK pathway genes in fibroblasts of Rabson-Mendenhall cell line, which would indicate that this pathway in involved in the development of AN. Therefore, it is objectified that AN in insulin-resistance syndromes is related with IGF-1R, although more studies are needed to determine the impact of these findings. Key words: acanthosis nigricans; Rabson-Mendenhall syndrome; Rabson- Mendenhall; insulin; insulin resistance; IGF-1; IGF-1R; cell culture; gene expression; IGF1-R inhibitors; GSK3b inhibitors; Linsitinib; CHIR99021 viii ÍNDICE AGRADECEMENTOS ................................................................................................ iii! LISTAXE DE ABREVIATURAS ................................................................................. iv! RESUMO ..................................................................................................................... v! RESUMEN .................................................................................................................. vi! ABSTRACT ............................................................................................................... vii! 1.!INTRODUCIÓN .................................................................................................... 1! 1.1.!ACANTOSE NIGRICANS ..................................................................................... 1! 1.2.!SÍNDROME DE RABSON-MENDENHALL E SÍNDROMES RELACIONADAS COA RESISTENCIA Á INSULINA ............................................................................................. 2! 1.2.1.!Síndrome de Rabson-Mendenhall ...................................................... 3! 1.2.2.!Leprechaunismo ou síndrome de Donohue ...................................... 6! 1.2.3.!Síndrome de resistencia á insulina tipo A ......................................... 6! 1.2.4.!Síndrome de resistencia á insulina tipo B ......................................... 7! 1.3.!MARCO MOLECULAR DA AN E A SÍNDROME DE RABSON-MENDENHALL ............... 8! 2.!XUSTIFICACIÓN E HIPÓTESE ......................................................................... 11! 2.1.!XUSTIFICACIÓN .............................................................................................. 11! 2.2.!HIPÓTESE ..................................................................................................... 11! 3.!OBXECTIVOS .................................................................................................... 13! 4.!MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 14! 4.1.!DESEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................. 14! 4.2.!PROCESADO DAS MOSTRAS E OBTENCIÓN DAS CÉLULAS .................................. 14! 4.3.!CULTIVOS CELULARES E TRATAMENTO CON INSULINA, CHIR99021 E LINSITINIB 15! 4.4.!RECOLLIDA DE CÉLULAS ................................................................................ 16! 4.5.!EXTRACCIÓN RNA CON TRIZOL ...................................................................... 16! 4.6.!RETROTRANSCRIPCIÓN .................................................................................. 17! 4.7.!TÉCNICA DE RT-QPCR .................................................................................. 17! 4.8.!ANÁLISE ESTATÍSTICO .................................................................................... 18! 5.!RESULTADOS ................................................................................................... 19! 5.1.!EXPRESIÓN DE MAP3K5 ............................................................................... 19! 5.2.!EXPRESIÓN DE MAP2K1 ............................................................................... 21! 5.3.!EXPRESIÓN DE PI3KR1 ................................................................................. 22! 5.4.!EXPRESIÓN DE ELK1 .................................................................................... 24! 5.5.!EXPRESIÓN DE CTNNB1 ............................................................................... 25! 5.6.!EXPRESIÓN DE MTOR ................................................................................... 27! ix 5.7.!EXPRESIÓN DE CCNC ................................................................................... 28! 5.8.!EXPRESIÓN DE GSK3B ................................................................................. 30! 6.!DISCUSIÓN ........................................................................................................ 32! 7.!CONCLUSIÓNS ................................................................................................. 41! 8.!REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 42! 9.!ANEXO ............................................................................................................... 48! ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 6 redución significativa nos niveis de hemoglobina glicosilada (HbA1c) e do risco de desenvolver retinopatía diabética. A forma na que actúa a metreleptina non é de todo coñecida, pero intúese que a leptina e a insulina comparten vías celulares postreceptor, o que podería favorecer unha mellora de función do receptor de insulina. Ademais, a optimización da leptinemia vese como un factor que aumenta a sensibilidade á insulina. Por outra banda, a leptina actúa sobre o centro regulador da inxesta a nivel de SNC, diminuíndo a fame e aumentando a saciedade tras as comidas. En diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, está demostrado que unha redución na inxesta enerxética provoca unha baixada nos niveis de glicosa. Non obstante, o tratamento a longo prazo con metreleptina non é suficiente para acadar os obxectivos de HbA1c < 7% [14,16]. 1.2.2. Leprechaunismo ou síndrome de Donohue O leprechaunismo ou síndrome de Donohue (OMIM 246200) é unha entidade clínica conxénita que se desenvolve na xestación e que se caracteriza pola resistencia á insulina extrema debida a unha variante no receptor de insulina [11]. Clinicamente, estes pacientes caracterízanse por unha restrición progresiva do crecemento intrauterino a partir do terceiro trimestre do embarazo. Posúen unha facies dismórfica (de duende, de aí o nome, de leipreachán, duende irlandés), que se caracteriza por: proptose, presenza de pregues infraorbitarios; orellas rotadas e de implantación baixa; engrosamento do vermellón dos labios superior e inferior; hipertrofia xenxival... Os bebés presentan hipotonía e retraso no desenvolvemento [11]. 1.2.3. Síndrome de resistencia á insulina tipo A A síndrome de resistencia á insulina tipo A (OMIM 147670) constitúe outra entidade clínica de resistencia á insulina onde hai unha disfunción do receptor de insulina. O debut está na pubertade e é característica a presenza da tríade de: resistencia á insulina, acantose nigricans e hiperandroxenismo (hirsutismo, elevación da concentración sérica de testosterona, síndrome de ovario poliquístico) en ausencia de obesidade ou lipoatrofia. É, polo tanto, unha entidade que fundamentalmente se describe en mulleres, aínda que pode ser descrita tamén nos homes [17]. O diagnóstico desta entidade é difícil, xa que non se conta na práctica clínica con ningún marcador analítico que axude a categorizar a estes pacientes [10]. No caso de mulleres obesas, con resistencia á insulina grave e presenza de síndrome de ovario poliquístico, axústase máis o caso da síndrome HAIR-AN (“hyperandrogenism”, “insulin resistance” e “acanthosis nigricans”) [10,11,17]. Introdución 7 1.2.4. Síndrome de resistencia á insulina tipo B A síndrome de resistencia á insulina tipo B caracterízase pola aparición de autoanticorpos de clase IgG cuxa diana é o receptor de insulina [18]. Frecuentemente se asocia á presenza de outras enfermidades autoinmunes, como pode ser a enfermidade de Graves, a miastenia gravis, ou o máis común, á presenza de lupus eritematoso sistémico (LES) [19]. Estes trastornos autoinmunes inducen á formación dos anticorpos anti-receptor de insulina [19]. A prevalencia desta enfermidade é descoñecida [11,18]. Este cadro clínico aparece frecuentemente en mulleres de idade media de forma concomitante a outra enfermidade autoinmune de base. Non obstante, tamén pode afectar a homes e pacientes mozos [18]. Clinicamente, o disbalance autoinmune precede á formación de autoanticorpos dirixidos ao receptor de insulina, polo que é habitual que esta síndrome sexa posterior a outras enfermidades autoinmunes concomitantes (ou asociadas). Atópanse dous espectros de enfermidade que están relacionados entre si: os pacientes afectados poden pasar dun cadro de resistencia á insulina extremo a unha situación de hipoglucemias de difícil tratamento e viceversa, que é algo que caracteriza a esta síndrome en diferencia ao resto [18]. Cerca do 90% dos pacientes afectados desenvolven AN, e en especial AN periocular, que lles confire unha facies característica [18] (Figura 5). As mulleres estudadas presentaban un patrón ecográfico de ovario cístico, aínda que non o característico da síndrome de ovario poliquístico. Observouse tamén que nestas mulleres afectadas, os niveis de testosterona estaban aumentados, e estes diminuían a medida que o control metabólico melloraba [18]. Figura 5: paciente con autoanticorpos anti-receptor de insulina. Apréciase AN periocular, perioral e labial. Fonte: modificado de Arioglu E et al. [18]. ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 8 As medidas terapéuticas van encamiñadas cara dous frontes: por unha banda, na corrección da síndrome metabólica, con medidas como o uso de insulina e o uso de antidiabéticos orais. Por outra banda, na mitigación da resposta autoinmune asociada: está descrito o uso de terapia con corticoides, a plasmaférese, o uso de ciclofosfamida, ciclos de ciclosporina A oral, ciclos de azatioprina oral [18]. A presenza de autoanticorpos contra o receptor de insulina remite de forma espontánea nun terzo dos pacientes afectados coa corrección do desaxuste metabólico [18]. 1.3. MARCO MOLECULAR DA AN E A SÍNDROME DE RABSON-MENDENHALL Fisiopatoloxicamente non chegamos a comprender cal é o mecanismo exacto a nivel molecular que provoca que pacientes con resistencia á insulina desenvolvan AN. Vese que a AN aparece en doentes que presentan obesidade e/ou diabetes mellitus tipo 2 [9]; en doentes que padecen acromegalia, que se caracteriza por un exceso de GH que se traduce nun aumento na concentración de IGF-1 sérica [20] e tamén en cadros de resistencia á insulina extremos como é a síndrome de Rabson-Mendenhall [12,14] ou a lipodistrofia conxénita xeneralizada tipo 2 -Síndrome de Berardinelli-Seip- (CLG2) [21]. A hipótese de porque aparece AN nas síndromes de resistencia á insulina atopámola no aumento dos niveis de insulina en sangue. A insulina é unha molécula cunha estrutura similar ao factor de crecemento relacionado coa insulina tipo 1 (IGF- 1). O aumento na concentración de insulina pode traducirse nunha hiperfunción do seu receptor, o que ademais dos efectos deletéreos que poida ocasionar na economía, favorece a proliferación celular (Figura 6) [22]. Figura 6: vías celulares dependentes do receptor de insulina (IR). Fonte: elaboración propia Cell membrane ↑Insulin Shc-Grb2-SOS Ras Raf-1 MEK ERK MAPK IRS-1 PI3K PDK PKB/AKT mTOR GSK3 AS160 RAB-10 GLUT4 FOXO Cell growth and differentiation ↑Glycogen ↑Adipogenesis BCL2 ↓Apoptosis Glucose transport Protein synthesis Insulin receptor Extracellular Intracellular Introdución 9 Ademais do efecto intrínseco do receptor de insulina (IR) en presenza de hiperinsulinemia, proponse que o exceso de insulina en sangue pode resultar nunha activación de forma directa ou indirecta do receptor de IGF-1, e que iso sexa un “trigger” para a proliferación dos fibroblastos e queratinocitos [3,23]. Ademais dos diversos tipos de AN, sucede que a AN asociada á resistencia á insulina é das máis comúns. Atópase este fenómeno en cadros como obesidade, diabetes tipo 2 e SOP, entre outros [9]. Por outra banda, a redución das concentracións de insulina en doentes con lipodistrofia conxénita xeneralizada reduce significativamente a gravidade da AN nalgúns doentes [16]. Polo tanto, a hiperinsulinemia vese como factor que podería actuar directamente sobre o receptor de IGF-1. Ademais, a hiperinsulinemia provoca un aumento nos niveis de IGF-1 libre ao diminuír a concentración das proteínas de unión a IGF (IGFBPs, IGF binding proteins). Isto implica un aumento na vida media de IGF-1, que xunto co efecto directo que se propón da insulina sobre o IGF-1R, favorece a proliferación e diferenciación celular dos fibroblastos e queratinocitos [24]. Obsérvase que a AN mellora en consonancia á corrección da síndrome metabólica e coa optimización do control glicémico destes pacientes [21]. Vese que en pacientes obesos con AN cando perden peso ponderal e tamén en pacientes con cadros de resistencia á insulina graves, ao seren tratados con metreleptina recombinante humana [p.e. Síndrome de Rabson-Mendenhall [14] ou nas lipodistrofias [21]]), a AN mellora e incluso chega a desaparecer. Pódese asumir que tras a activación do receptor de IGF-1, a vía canónica dependente de Wnt/b-catenina se activa e favorece a proliferación celular, mediante a interacción que ten lugar entre os ligandos Wnt cos receptores de tipo Frizzled e cos correceptores LRP5/6 que favorecen a estabilización citoplasmática da b-catenina, que se trasloca ao núcleo e se asocia á familia de ligandos LEF/TCF, que estimulan a transcrición e en consecuencia a proliferación e diferenciación celular, o que podería explicar a AN [25,26]. Nun primeiro momento, asociábamos a activación da vía celular dependente de PI3K coma un dos mecanismos celulares responsables do aumento da proliferación celular, responsable, en última instancia, da aparición de AN. Como se ve nas Figura 6 e Figura 7, vese que a activación dos receptores de insulina e IGF-1 contribúen á activación da vía de PI3K, que ao través da inhibición de GSK3b, aumenta a estabilización de b-catenina cuxa consecuencia é a proliferación celular [27]. Parece razoable pensar que a hiperactivación do receptor de IGF-1 debido á hiperinsulinemia favorece o aumento de actividade da vía do PI3K, que trae en consecuencia a proliferación celular responsable da AN. Non obstante, o mecanismo patoxénico da síndrome SHORT fainos desbotar esta primeira hipótese. A síndrome SHORT (OMIM 269880) é unha enfermidade que se caracteriza por un cadro clínico caracterizado por baixa estatura, hiperextensibilidade das articulacións e/ou hernia inguinal, depresión ocular, anomalía de Rieger e retraso na dentición. A súa causa etiolóxica é xenética e están descritas diversas variantes no xene PI3KR1 (situado no cromosoma 5q13.1). Os pacientes SHORT, ademais do anterior, caracterízanse por ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 10 unha marcada resistencia á insulina e en consecuencia, AN. Nestes pacientes, ao contrario das síndromes de resistencia á insulina descritos, como a síndrome de Rabson-Mendenhall, a síndrome de Donohue ou leprechaunismo e as lipodistrofias xeneralizadas, como a síndrome de Berardinelli-Seip (CGL2), non atopamos rasgos acromegaloides. Polo tanto, en primeira instancia consideramos menos probable a influencia da vía PI3K como responsable da AN nos síndromes de resistencia á insulina, xa que os pacientes con SHORT, por presentaren variantes no xene de PI3KR1, a expresión desta vía non pode estar aumentada [28,29]. Ademais, tamén se observa que en cadros nos que tamén hai hiperinsulinemia (aínda non derivada de resistencia á insulina), como pode ser o caso dos insulinomas, non presentan AN [30], como tampouco a presentan necesariamente a maioría dos doentes diabéticos tratados con doses altas de insulina. Por outra banda, na AN paraneoplásica, proponse que as células canceríxenas secretan moléculas como TGF-alfa, que tras a unión con EGFR nas células da pel, producen papilomatose e hiperqueratose, que en última instancia levan á aparición de AN [1]. Consideramos polo tanto, que a AN asociada á resistencia á insulina xorde pola hiperinsulinemia que caracteriza a estes cadros, mais que non é o único factor illado que predispón a aparición de lesións con características de AN. 2. XUSTIFICACIÓN E HIPÓTESE 2.1. XUSTIFICACIÓN Neste estudo, pretendemos indagar sobre cales poderían ser os mecanismos moleculares que levan á aparición da AN e para iso, baseamos o noso estudo en pacientes afectados por unha síndrome de resistencia á insulina extrema, nas que unha das súas características clínicas é a presenza de AN. Para o estudo traballaremos con cultivos celulares. Utilizaremos tres liñas celulares: dúas liñas celulares de doentes coa síndrome de Rabson-Mendenhall, procedente da Unidade de Lipodistrofias do Servizo de Endocrinoloxía e Nutrición do Complexo Hospitalario de Santiago de Compostela, unha de fibroblastos e outra de preadipocitos; e outra liña celular de fibroblastos procedente dun individuo san que actuará como control. Cultivaremos estas liñas celulares e tratarémolas por un lado cun inhibidor do IGF-1R, que actuaría inhibindo a ruta dependente deste receptor e por outro lado, cun inhibidor de GSK3b, que activaría a PI3K, para a posteriori avaliar a expresión xénica resultante en cada condición. Asumimos, que se ben os procesos de sinalización intracelular son fundamentalmente dependentes de cambios posttradución de certas proteínas (fosforilación), tamén se producen cambios na expresión xénica. 2.2. HIPÓTESE A nosa hipótese principal parte de que a AN asociada á resistencia á insulina está relacionada coa hiperinsulinemia. Isto evidénciase nos pacientes coa síndrome de Rabson-Mendenhall, que adoitan ter unhas concentracións de insulina en sangue moi elevadas e que tras a mellora no control metabólico, a AN redúcese [14]. Pensamos que a insulina, a altas concentracións, se une ao receptor de IGF-1. Nun primeiro momento, a nosa hipótese principal baseábase en que a unión da insulina co receptor de IGF-1 favorecía a fosforilación de PI3K, co que se activaba a vía PI3K-Akt-mTOR. Non obstante, consideramos de menos importancia esa posibilidade estudando a síndrome de SHORT, onde se atopa unha variante en PI3K e son pacientes que presentan unha grande resistencia á insulina e acantose nigricans [31]. Así a todo, PI3K, a través de Akt e mTOR, inhiben a GSK3b. A inhibición de GSK3b favorece a estabilización citoplasmática de b-catenina de forma independente á vía dependente de Wnt, e en consecuencia, favorécese a proliferación celular (Figura 7) [32,33]. Valoramos entón que a unión entre insulina e IGF-1R activaría ás rutas SHC-ERK, SHC-JNK e MAPK, que son vías que están implicadas na proliferación e diferenciación celular (Figura 7). ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 12 Ademais, a activación de IGF-1R pode ter relación coa activación da ruta Wnt/bcatenina, cuxo destino final, a través dos ligandos Lec/Tef, favorece a proliferación celular de fibroblastos (Figura 7) [34]. Figura 7: mecanismos celulares implicados no desenvolvemento de AN. Fonte: elaboración propia 3. OBXECTIVOS O obxectivo principal deste estudo é intentar determinar os mecanismos moleculares que levan a aparición de acantose nigricans baixo o paradigma da resistencia á insulina, considerando como substrato a proliferación celular dos fibroblastos. Desenvólvense unha serie de obxectivos específicos para lograr o obxectivo principal: - Cultivo de tres liñas celulares obtidas de doentes con síndrome de Rabson- Mendenhall e outra liña celular sa, que actuará como liña control. Comprobaremos que por medio da administración de fármacos inhibidores do receptor de IGF-1 (IGF-1R) e activadores da ruta Wnt/b-catenina, se observan variacións na expresión xénica. - Avaliar a expresión xénica de diversos xenes con implicación na proliferación celular: MAP3K5, MAP2K1, PI3KR1, ELK1, CTNNB1, MTOR, CCNC, GSK3B. 4. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo conta co ditame favorable do CEIC de Galicia. Os titores legais dos doentes deron o seu consentimento informado para a realización de este estudo que seguiu as recomendacións da Declaración de Helsinki para experimentación con seres humanos. 4.1. DESEÑO EXPERIMENTAL Características dos pacientes con síndrome de Rabson-Mendenhall: - Rabson #1: nena de 3 años con antecedente de hipotonía xeneralizada ao mes de vida. Hipoglucemias de xaxún. Exploración física: facies tosca, hipertricose, acantose nigricans, pel redundante en mans e pés, hipertrofia xenxival, hepatomegalia de 3 cm, clitoromegalia, mamas (Tanner 3). Estudio molecular: variantes nos exóns 2 e 3 do xene INSR ([c.425G>A];[877T>C]). Bioquímica: hiperinsulinemia (insulina 7.525 mUI/l), péptido C 80,8 ng/ml, HbA1C 6,7%. Tratamento: metformina (425 mg cada 24 horas). - Rabson #2: home de 12 anos. Presentaba velocidade de crecemento acelerada. Exploración física: acantose nigricans, hipertricose, paladar oxival, apiñamento dental, hipertrofia xenxival, rasgos toscos, macropene, vello púbico Tanner 2 e testes 3-4 ml. Estudio molecular: variante en heterocigose composta no xene codificante para o receptor de insulina, INSR (p.(Arg926Trp);(Arg914Cys)). Bioquímica: insulinemia basal 810,0 mUI/L [RN: 1,5-18,5] e tras sobrecarga de glucosa (100 g) 3.403,0 mUI/l, péptido C 16,0 ng/ml [RN: 0,9-4,0], HbA1c 6,1%. Resistencia grave á insulina. Tratamento: metformina (850 mg cada 24 horas). O noso estudo constará do cultivo de dous tipos de liñas celulares: por un lado, fibroblastos procedentes de Rabson #1 e preadipocitos procedentes de Rabson #2 e por outro, fibroblasto dun individuo san que actuará como liña control. A razón de utilizar liñas celulares distintas (fibroblastos vs. preadipocitos) foi para comprobar se a nosa hipótese era máis plausible precisamente nas células involucradas na AN (fibroblastos). 4.2. PROCESADO DAS MOSTRAS E OBTENCIÓN DAS CÉLULAS Obtívose unha pequena mostra de pel e tecido adiposo procedentes de dous pacientes afectos pola síndrome de Rabson-Mendenhall e tamén unha mostra de pel dun control san de 6 anos. Os explantes obtidos foron procesados inmediatamente seguindo o disposto a continuación: os fragmentos obtidos de tecido foron suplementados con PBS e Material e métodos 15 cultiváronse nunha placa de 60 mm (ref. 353004, BD FalconTM; Mississauga, ON, Canada), na presenza de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; ref. 41965-039, Life Technologies Limited, Paisley, UK), ademais de soro fetal bovino ao 30% (FBS; ref. 35-079-CV, Mediatech Inc., Woodland, CA, USA) e xentamicina 50 µg/ml (ref. G1397-10ML, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Incubouse a 37 ºC nun incubador de CO2 Water-Jacket (NuAire, Plymouth, MN, USA). Despois dunha semana, as células migraron dos explantes. No caso dos preadipocitos, éstes foron recoñecidos grazas á presenza de pequenas vacuolas lipídicas entre os fibroblastoslike. Os tecidos explantados retiráronse das placas e as células foron posteriormente cultivadas con medio fresco ata obter unha confluencia do 70% en monocapa. Posteriormente, as células foron tripsinizadas (ref. 12605010; TrypLE™ Express Stable Trypsin-like Enzyme with Phenol Red; Gibco Life Technologies; Carlsbad, CA, USA) e cultivadas en placas de 100 mm (ref. 430167, Corning Incorporated, Corning, NY, USA) con medio fresco DMEM, suplementados con FBS ao 10% e penicilinaestreptomicina ao 1% (PenStrep, ref. 15140-122; Life Technologies Corporation; Grand Island, NY, USA). O medio de cultivo era cambiado cada tres días. As células eran separadas unha vez se alcanzaba unha confluencia do 80%. Para o experimento utilizáronse células con número baixo de pases. 4.3. CULTIVOS CELULARES E TRATAMENTO CON INSULINA, CHIR99021 E LINSITINIB Tras a obtención das células despois do procesamento tras a biopsia de pel e de tecido adiposo (das liñas celulares afectadas e da liña control), estas foron ultraconxeladas para a súa conservación. Para o experimento desconxeláronse as células e tras comprobar a súa viabilidade procedeuse ao seu cultivo. Son un total de 6 condicións por cada liña celular. Os fibroblastos e preadipocitos sementáronse asegurando unha concentración de 5000 células/cm2 en placas multiwell de 6 pocillos de 35 mm (ref. 3516, Corning Incorporated, Corning, NY, USA). Utilizouse medio DMEM suplementado con FBS ao 10% e penicilina-estreptomicina ao 1%. Tras a sembra (día 0), as células foron cultivadas durante 3 días. No 4º día, as células foron suplementadas con insulina 10 µg/ml (insulina humana recombinante, ref. 11376497001; Merck Life Science, Madrid, Spain), insulina 10 µg/ml + CHIR99021 2,5 µM (ref. 5ML1046-5MG; Merck Life Science, Madrid, Spain) e insulina 10 µg/ml + Linsitinib 1 µM (ref. HY-10191, Dismed Medchem, Gijón, Spain). Establecéronse, ademais, controis con DMSO (ref. D2438- 5X10ML; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). As células foron recollidas ao 7º día e conxeladas ata a extracción de RNA (Táboa 2). CHIR99021 é un inhibidor da GSK3b (quinasa relacionada coa síntese de glicóxeno). GSK3b é un intermediario metabólico relacionado en múltiples procesos a nivel molecular e en especial, inhibindo a vía Wnt. Este composto, mediante a inhibición de GSK3b, favorece a estabilización citoplasmática de b-catenina e polo tanto, a diferenciación e proliferación celular [35]. ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 22 Figura 9: expresión relativa de MAP2K1 . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de MAP2K1 para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina. B: Expresión xénica relativa de MAP2K1 nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; *p<0,05 vs. control (en DMSO); ªp<0,05 vs. control (en insulina+DMSO); %p<0,05 vs. R#1 (en insulina); ^p<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); #p<0,05 vs. R#2 (condicións basais) e vs. R#2 (en insulina); ¬p<0,05 vs. R#1 (condicións basais). Fonte: elaboración propia 5.3. EXPRESIÓN DE PI3KR1 En condicións basais, non se aprecia diferencia na expresión entre as liñas Rabson#1 e Rabson#2 respecto da liña control. En presencia de DMSO, obsérvase aumento estatisticamente significativo na expresión nas liñas Rabson#1 (197%, p<0,05) e Rabson#2 (75%, p<0,05) respecto á control. En presenza de insulina, non se observa diferencia na expresión entre as liñas celulares. En presencia de insulina+DMSO, observamos un descenso estatisticamente significativo na expresión nas liñas Rabson#1 (-52%, p<0,05) e en Rabson#2 (-74%, p<0,05) respecto da control (Figura 10AB). En presenza de insulina+CHIR99021 (e DMSO), apréciase un aumento significativo na expresión na liña Rabson#2 (75%, p<0,05) respecto da control, mentres que non hai diferenza entre Rabson#1 e a control. Na liña Rabson#1, non se observa diferenzas entre as diferentes condicións de cultivo. Na liña Rabson#2, observamos un aumento de expresión nas tratadas con CHIR99021 sobre condicións basais (232%, p<0,05), con DMSO (136%, p<0,05), con insulina (104%, p<0,05) e con insulina+DMSO (462%, p<0,05) (Figura 10B). En presenza de insulina+Linsitinib (e DMSO), obsérvase un aumento significativo en Rabson#2 vs. a control (125%, p<0,05), mais non se atopan variacións na liña Rabson#1 respecto á control. Na liña Rabson#1, vese un aumento de expresión 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression MAP2K1 Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B * * ª ^# % ¬ p<0,05 p<0,05 p<0,05 Resultados 23 respecto á condición basal (89%, p<0,05) e á condición insulina+DMSO (191%, p<0,05), mentres que co resto de condicións non hai variación. Na liña Rabson#2, apréciase aumento da expresión respecto á condición basal (91%, p<0,05) e á condición con insulina+DMSO (223%, p<0,05), non así co resto (Figura 10B). Figura 10: expresión relativa de PI3KR1 . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de PI3KR1 para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina. B: Expresión xénica relativa de PI3KR1 nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; *p<0,05 vs. control (en DMSO); ^p<0,05 vs. control (en insulina+DMSO); ªp<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); #p<0,05 vs. R#2 (en condicións basais) e vs. R#2 (en insulina); %p<0,05 vs. control (en insulina+Linsitinib+DMSO); $p<0,05 vs. R#1 (condicións basais); +p<0,05 vs. R#2 (condicións basais). Fonte: elaboración propia 0 10 20 30 40 50 60 70 Control Rabson#1 Rabson#2 Control + insulina Rabson#1 + insulina Rabson#2 + insulina Relative gene expression PI3KR1 Basal conditions Insulin A 0 20 40 60 80 100 120 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression PI3KR1 Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B * * ^ ^ ª# %+ $ p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,05 ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 24 5.4. EXPRESIÓN DE ELK1 En condicións basais, obsérvase un aumento estatisticamente significativo na expresión nas liñas Rabson#1 (164%, p<0,05) e Rabson#2 (113%, p<0,05) respecto á liña control. En presenza de DMSO, apréciase un aumento significativo (p<0,05) na expresión en Rabson#1 (177%, p<0,05) e Rabson#2 (280%, p<0,05) respecto a liña control. En presenza de insulina, apréciase un aumento de expresión nas liñas Rabson#1 (249%, p<0,05) e Rabson#2 (80%, p<0,05) sobre a control. En presenza de insulina e DMSO, non hai diferenzas na expresión entre as liñas (Figura 11AB). En presenza de insulina+CHIR99021 (e DMSO), vese un aumento significativo de expresión nas liñas Rabson#1 (424%, p<0,05) e Rabson#2 (791%, p<0,05) respecto á control. Na liña Rabson#1, non se observan variacións significativas entre o resto de condicións celulares. Na liña Rabson#2, apréciase un aumento respecto á condición insulina+DMSO (75%, p<0,05) e á condición DMSO (31%, p<0,05), mentres que no resto non se atopa variación (Figura 11B). En presenza de insulina+Linsitinib (e DMSO), non hai variación entre as liñas Rabson#1 e Rabson#2 respecto á control. Na liña Rabson#1, non se observan variacións significativas entre o resto de condicións celulares. Na liña Rabson#2, apréciase un diminución significativa (-54%, p<0,05) respecto á condición en presencia de DMSO, mentres que no resto non se atopa variación (Figura 11B). 0 10 20 30 40 50 60 70 Control Rabson#1 Rabson#2 Control + insulina Rabson#1 + insulina Rabson#2 + insulina Relative gene expression ELK1 Basal conditions Insulin * * A ^ ^ Resultados 25 Figura 11: expresión relativa de ELK1 . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de ELK1 para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina; *p<0,05 vs. control (condicións basais); ^p<0,05 vs. control (en insulina). B: Expresión xénica relativa de ELK1 nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; +p<0,05 vs. control (en DMSO); ªp<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); %p<0,05 vs. control (insulina+Linsitinib+DMSO). Fonte: elaboración propia 5.5. EXPRESIÓN DE CTNNB1 En condicións basais, apréciase un aumento estatisticamente significativo da expresión na liña Rabson#2 (92%, p<0,05) respecto á control, mentres que na liña Rabson#1 non hai variacións significativas. En presencia de DMSO, vese un aumento significativo na expresión en Rabson#1 (533%, p<0,05) respecto ao control, mentres que en Rabson#2 non se ven diferenzas. En presenza de insulina, apréciase un aumento nas liñas Rabson#1 (78%, p<0,05) e Rabson#2 (98%, p<0,05) respecto á control. En presenza de insulina+DMSO, non se observan variacións na expresión (Figura 12AB). En presencia de insulina+CHIR99021 (e DMSO), vese un aumento de expresión en Rabson#1 (59%, p<0,05) respecto ao control, mentres que en Rabson#2 non se ven diferenzas. Na liña Rabson#1, vese unha diminución significativa na expresión respecto á condición con DMSO (-54%, p<0,05) e un aumento respecto á condición con insulina+DMSO (95%, p<0,05), mentres que no resto de condicións non se atopan diferencias. Na liña Rabson#2, non se aprecian diferenzas na expresión da condición de tratamento respecto ás outras (Figura 12B). En presencia de insulina+Linsitinib (e DMSO), apréciase un aumento significativo na expresión na liña Rabson#1 (236%, p<0,05) respecto á control, mentres que na 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression ELK1 Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B + + ª ª % % p<0,05 p<0,05 ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 26 liña Rabson#2 non se atopan diferenzas. Na liña Rabson#1, apréciase unha diminución na expresión respecto á condición con DMSO (-53%, p<0,05) e un aumento respecto á condición con insulina+DMSO (100%, p<0,05), mentres que no resto de condicións non se atopan diferenzas. Na liña Rabson#2, apréciase unha diminución na expresión respecto á condición basal (-53%, p<0,05) e á condición con insulina (-54%, p<0,05), mentres non hai diferenzas respecto ao resto (Figura 12B). Figura 12: expresión relativa de CTNNB1 . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de CTNNB1 para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina; *p<0,05 vs. control (condicións basais); ^p<0,05 vs. control (en insulina). B: Expresión xénica relativa de CTNNB1 nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; +p<0,05 vs. control(en DMSO); ªp<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); $p<0,05 vs. control (en insulina+Linsitinib+DMSO); ¬p<0,05 vs. R#2 (en condicións basais) e vs. R#2 (en insulina). Fonte: elaboración propia 0 10 20 30 40 50 60 70 Control Rabson#1 Rabson#2 Control + insulina Rabson#1 + insulina Rabson#2 + insulina Relative gene expression CTNNB1 Basal conditions Insulin A *^ ^ 0 20 40 60 80 100 120 140 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression CTNNB1 Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B + ª$ ¬ p<0,05 p<0,05 Resultados 27 5.6. EXPRESIÓN DE MTOR En condicións basais, apréciase un descenso estatisticamente significativo na expresión na liña Rabson#2 respecto á control (-67%, p<0,05), mentres que na liña Rabson#1 non se aprecian diferenzas. En presenza de DMSO, apréciase un aumento significativo na expresión nas liñas Rabson#1 (315%, p<0,05) e Rabson#2 (206%, p<0,05) respecto á control. En presenza de insulina, obsérvase en Rabson#1 un aumento significativo (105%, p<0,05) respecto ao control, mentres que en Rabson#2 non se atopan diferenzas. En presenza de insulina+DMSO, non hai diferenzas na expresión en Rabson#1 e Rabson#2 respecto da control (Figura 13AB). En presenza de insulina+CHIR99021 (e DMSO), non se observan diferenzas na expresión en Rabson#1 e Rabson#2 respecto do control. Na liña Rabson#1, vese un aumento na expresión respecto das condicións basal (171%, p<0,05) e da condición de insulina+DMSO (167%, p<0,05), mentres que non se atopan diferenzas no resto. Na liña Rabson#2, obsérvase un aumento na expresión respecto á condición basal (471%, p<0,05) e á condición con insulina (74%, p<0,05), mentres que non se ven diferenzas respecto ás demais. (Figura 13B). En presenza de insulina+Linsitinib (e DMSO), non se aprecian diferenzas en Rabson#1 e Rabson#2 respecto do control. Na liña Rabson#1, obsérvase unha diminución significativa na expresión respecto á condición de insulina (-55%, p<0,05) e á condición con DMSO (-68%, p<0,05), mentres que non hai variación respecto do resto de condicións. Na liña Rabson#2, vese un aumento na expresión respecto á condición basal (267%, p<0,05), mentres que respecto ao resto de condicións non se ven variacións (Figura 13B). 0 5 10 15 20 Control Rabson#1 Rabson#2 Control + insulina Rabson#1 + insulina Rabson#2 + insulina Relative gene expression MTOR Basal conditions Insulin A * ^ ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 28 Figura 13: expresión relativa de MTOR . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de MTOR para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina; *p<0,05 vs. control (en condicións basais); ^p<0,05 vs. control (en insulina). B: Expresión xénica relativa de MTOR nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; +p<0,05 vs. control (en DMSO); #p<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); %p<0,05 vs. R#1 (condicións basais); $p<0,05 vs. R#2 (en condicións basais) e vs. R#2 (en insulina); ªp<0,05 vs. R#1 (en condicións basais) e vs. R#1 (en insulina); ¬p<0,05 vs. R#2 (en condicións basais). Fonte: elaboración propia 5.7. EXPRESIÓN DE CCNC En condicións basais, apréciase un aumento estatisticamente significativo na expresión nas liñas Rabson#1 (113%, p<0,05) e Rabson#2 (198%, p<0,05) respecto á liña control. En presencia de DMSO, apréciase un aumento en Rabson#1 (737%, p<0,05) e Rabson#2 (142%, p<0,05) respecto do control. En presenza de insulina, obsérvase un aumento na expresión en Rabson#1 (72%, p<0,05) e en Rabson#2 (193%, p<0,05) respecto do control. En presenza de insulina+DMSO, non se atopan diferenzas en Rabson#1 e Rabson#2 respecto do control (Figura 14AB). En presenza de insulina+CHIR99021 (e DMSO), vese un aumento na expresión na liña Rabson#2 (236%, p<0,05) respecto do control, mentres que non hai variación en Rabson#1. Na liña Rabson#1, apréciase un aumento de expresión respecto ás condicións basal (250%, p<0,05), con insulina (312%, p<0,05) e con insulina+DMSO (306%, p<0,05), mentres que non hai variación respecto á condición con DMSO. Na liña Rabson#2, obsérvase un aumento na expresión respecto á condición basal (212%, p<0,05), con DMSO (386%, p<0,05), con insulina (201%, p<0,05) e con insulina+DMSO (351%, p<0,05) (Figura 14B). En presenza de insulina+Linsitinib (e DMSO), apréciase un aumento de expresión en Rabson#1 (918%, p<0,05) e Rabson#2 (925%, p<0,05) respecto ao control. Na liña 0 5 10 15 20 25 30 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression MTOR Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B ++ #% #$ ª ¬ p<0,05 Resultados 29 Rabson#1, obsérvase unha diminución na expresión respecto ás condicións con DMSO (-81%, p<0,05), con insulina+DMSO (-31%, p<0,05) e basal (-40%, p<0,05), non habendo variación respecto á condición de insulina. En Rabson#2, visualízase unha diminución respecto á condición basal (-57%, p<0,05) e con insulina (-58%, p<0,05), mentres que non se aprecian diferenzas fronte o resto (Figura 14B). Figura 14: expresión relativa de CCNC . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de CCNC para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina; *p<0,05 vs. control (en condicións basais); ^p<0,05 vs. control (en insulina). B: Expresión xénica relativa de CCNC nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; +p<0,05 vs. control (en DMSO); %p<0,05 vs. control (insulina+CHIR99021+DMSO); $p<0,05 vs. R#1 (en condicións basais) e vs. R#1 (en insulina); #p<0,05 vs. R#2 (en condicións basais) e vs. R#2 (en insulina); ªp<0,05 vs. control (en insulina+Linsitinib+DMSO); ∫p<0,05 vs. R#1 (en condicións basais); ¬p<0,05 vs. R#2 (en condicións basais) e vs. R#2 (en insulina). Fonte: elaboración propia 0 5 10 15 20 25 30 Control Rabson#1 Rabson#2 Control + insulina Rabson#1 + insulina Rabson#2 + insulina Relative gene expression CCNC Basal conditions Insulin A * * ^ ^ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression CCNC Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B + + %# $ ª∫ª¬ p<0,05 p<0,05 p<0,05 ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 30 5.8. EXPRESIÓN DE GSK3B En condicións basais, obsérvase un aumento estatisticamente significativo na expresión xénica nas liñas Rabson#1 (138%, p<0,05) e Rabson#2 (164%, p<0,05) respecto da liña control. En presencia de DMSO, apréciase un aumento na expresión en Rabson#1 (50%, p<0,05) e en Rabson#2 (110%, p<0,05) respecto ao control. En presenza de insulina, vese un aumento na expresión en Rabson#2 (72%, p<0,05) respecto da control, mentres que non se observan variacións na liña Rabson#1 respecto da control. En presenza de insulina+DMSO, non se aprecian diferenzas en Rabson#1 e Rabson#2 respecto da control (Figura 15AB). En presenza de insulina+CHIR99021 (e DMSO), obsérvase un aumento de expresión significativo en Rabson#2 respecto do control (53%, p<0,05), mentres que en Rabson#1 non se aprecian variacións na expresión. Na liña Rabson#1, vese un aumento na expresión respecto ás condicións de insulina (92%, p<0,05) e insulina+DMSO (82%, p<0,05), mentres que non se aprecian variacións fronte ao resto. Na liña Rabson#2, apréciase un aumento significativo na expresión respecto á condición con insulina (91%, p<0,05), con DMSO (14%, p<0,05) e con insulina+DMSO (77%, p<0,05), non habendo diferenzas respecto á condición basal (Figura 15B). En presenza de insulina+Linsitinib (e DMSO), vese un aumento de expresión na liña Rabson#2 respecto da control (153%, p<0,05), mentres que na liña Rabson#1 non se aprecian variacións respecto ao control. Na liña Rabson#1, obsérvase unha diminución na expresión respecto á condición con DMSO (-48%, p<0,05) e con insulina+DMSO (-38%, p<0,05), mentres que non se ven variacións respecto ao resto. Na liña Rabson#2, apréciase unha diminución na expresión respecto ás condicións basal (-40%, p<0,05) e en DMSO (-43%, p<0,05), mentres que non hai diferenzas salientables fronte ao resto (Figura 15B). 0 10 20 30 40 50 60 Control Rabson#1 Rabson#2 Control + insulina Rabson#1 + insulina Rabson#2 + insulina Relative gene expression GSK3B Basal conditions Insulin A ** ^ Resultados 31 Figura 15: expresión relativa de GSK3B . Datos representados como media ± desviación estándar. A: Expresión xénica relativa de GSK3B para as dúas liñas afectas (Rabson#1 e Rabson#2) e a liña control en condicións basais e suplementadas con insulina; *p<0,05 vs. control (en condicións basais); ^p<0,05 vs. control (en insulina). B: Expresión xénica relativa de GSK3B nas 2 liñas afectas e na liña control en presenza do solvente DMSO, en DMSO+insulina, DMSO+insulina+CHIR99021 e DMSO+insulina+Linsitinib; +p<0,05 vs. control (en DMSO); %p<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); %p<0,05 vs. control (en insulina+CHIR99021+DMSO); $p<0,05 vs. R#1 (en insulina); ¬p<0,05 vs. R#2 (en insulina); #p<0,05 vs. control (en insulina+Linsitinib+DMSO); ç p<0,05 vs. R#2(en condicións basais). Fonte: elaboración propia 0 10 20 30 40 50 60 70 Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Iinsulin + Linsitinib Basal (+DMSO) Insulin Insulin + CHIR99021 Insulin + Linsitinib Relative gene expression GSK3B Control + DMSO Rabson#1 + DMSO Rabson#2 + DMSO B + + %$ ¬ #ç p<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,05 ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 38 Estes datos parecen demostrar que CTNNB1, e en consecuencia, b-catenina, participa neste proceso, xa que se aprecia unha maior expresión nas células afectadas e baixo o tratamento con Linsitinib, tende a reducirse a expresión. Con CHIR99021 parece razoable esperar un aumento, debido a ser unha molécula que inhibe a GSK3b. GSK3b é un regulador negativo da estabilización de b-catenina independente da vía canónica intracelular dependente de WNT, polo que un bloqueo a nivel de GSK3b favorece a estabilización de b-catenina e en tanto, o aumento da súa expresión [32,33]. - Expresión de MTOR MTOR é un xene que está localizado no locus 1p36.22 e codifica unha proteína quinasa que está configurada pola unión de dous complexos estrutural e funcionalmente distintos, que son TORc1 (ao que se lle atribúe funcións reguladoras do crecemento, de proliferación celular e de tradución de mRNA) e TORc2 (que actúa estabilizando o citoesqueleto de actina e favorece a progresión no ciclo celular) [55,56]. A nosa hipótese implica que sería de esperar un aumento na expresión de MTOR nas células casos respecto ás controis, así como un descenso na expresión tras o tratamento con Linsitinib. Os resultados en condicións de non tratamento son contraditorios, na medida en que se demostrou un aumento significativo na expresión nos casos respecto dos controis na condición con DMSO, mentres que en condicións basais atopamos que na liña Rabson#2 está descendida a súa expresión (de xeito estatisticamente significativo). Tras o tratamento con Linsitinib, vemos que os resultados tampouco son claros. Na liña Rabson#1 demóstrase un descenso na expresión tras o tratamento con Linsitinib, mais na liña Rabson#2 está aumentada a expresión. Co tratamento con CHIR99021, si que se demostra en ambas liñas un aumento na expresión nas tratadas respecto ás non tratadas. - Expresión de CCNC CCNC é un xene que se localiza no locus 6q16.2 e é responsable de codificar á ciclina C. A ciclina C é unha proteína que, xunto co ligando Cdk3, é responsable da transición da fase G0 á fase G1 no ciclo celular [57,58]. Ademais, mediante a unión co ligando Cdk8, forma parte do complexo holoenzimático dependente da RNA polimerasa II [59]. A nosa hipótese implica que sería de agardar un aumento na expresión nos casos respecto dos controis, así como un descenso na expresión tras o tratamento con Linsitinib. En condicións basais, demóstrase que a expresión de CCNC é maior de xeito estatisticamente significativo nas células afectadas pola síndrome de Rabson- Mendenhall respecto ás controis, que tamén se traduce nas células que foron suplementadas con insulina e con DMSO. Discusión 39 Demóstrase que a expresión é estatisticamente menor nas células tratadas con Linsitinib fronte ás non tratadas en ambas liñas celulares, o que vai a favor da nosa hipótese. Con CHIR99021, obxectivamos un aumento estatisticamente significativo en ambas liñas celulares, o que pode poñer en relación que a inhibición de GSK3b mediante a estabilización citoplasmática de b-catenina e a proliferación e diferenciación celular consecuentes, impliquen un aumento na actividade da ciclina C e en consecuencia, este aumento na expresión xénica de CCNC. Hochberg I. et al. describen en 2015 un aumento na expresión xénica en cultivos celulares de pacientes con acromegalia. Isto tamén vén a apoiar a nosa hipótese. Ademais, estes autores describen que nas células acromegálicas a expresión de CDKN2B, regulador negativo do ciclo celular, está reducida. - Expresión de GSK3B GSK3B é un xene que se localiza no locus 3q13.3 e que codifica unha proteína que ten implicacións no metabolismo enerxético. Regula a apoptose celular mediante o control de MCL1, PI3K e AKT [50]. GSK3b é un regulador negativo da vía Wnt, impedindo a estabilización de b-catenina a nivel citoplasmático e inhibindo a diferenciación e proliferación celular [32,33,60]. A nosa hipótese establece que sería de esperar un descenso na expresión nas células afectadas respecto aos controis, así como un aumento tras o tratamento con Linsitinib. Esperamos un aumento de expresión tras o tratamento con CHIR99021 ao ser este un inhibidor de GSK3b. Os resultados amosan unha maior expresión de GSK3B nas células afectadas respecto das células controis, sendo dito aumento estatisticamente significativo, o que contradí a nosa hipótese, pero que podería estar relacionado cunha función alterada de PI3K. No tratamento con Linsitinib, obsérvase unha diminución estatisticamente significativa respecto ás células sen tratar en ambas liñas celulares. Nas tratadas con CHIR99021, obxectívase un aumento de expresión estatisticamente significativo en ambas liñas celulares. En resume, observamos que a AN é un proceso que aparece en síndromes de resistencia á insulina extremos e que un posible mecanismo patoxenético podería ser a activación do IGF-1R pola propia insulina, promovendo a proliferación celular pola activación da ruta das MAPKs. O estudo dos anteriores 8 xenes non nos ofrece unha resposta integrada á nosa hipótese, xa que en certos casos o resultado obtido non se corresponde co que cabía de esperar pola acción do xene. Dito o cal, os resultados apuntan a que dita relación co IGF-1R parece correcta na medida en que observamos unha expresión aumentada en MAP3K5, CCNC e ELK1, sobre todo en fibroblastos, pero tamén en preadipocitos. A maior expresión de CTNNB1, que codifica para b- ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 40 catenina e que favorece a proliferación celular, podería estar influída pola acción do propio IGF-1R, a través de Wnt, ou pola maior expresión de GSK3b, consecuencia dunha menor actividade de PI3K, con independencia da súa expresión, pero esperable nunha situación de mal funcionamento do receptor da insulina. Os resultados da intervención con compostos que actúan sobre as rutas celulares foi dispar e difícil de interpretar. Sería de interese comparar os resultados obtidos neste traballo con outros estudos nos que se avalíe a expresión xénica en pacientes con resistencia á insulina, co obxectivo de poder comparar os resultados. Tamén sería interesante ampliar este estudo a máis tipos celulares de pacientes afectados pola síndrome de Rabson- Mendenhall, coa finalidade de aumentar a evidencia do obxectivado. Por último, débese ter en conta como limitación neste estudo o número reducido de casos da enfermidade (n=2) e de controis (n=1), debido á dificultade de obter mostras de tecido de pacientes afectados (por ser o Rabson-Mendenhall unha enfermidade rara con moi baixa prevalencia) e tamén debido a razóns orzamentarias. Os xenes seleccionados para o estudo da expresión son só unha mostra de rutas que cremos que poden ter relación con este proceso, mais cómpre ter en conta que na patoxenia da AN relacionada coas síndromes de resistencia á insulina probablemente haxa máis xenes e rutas que xoguen un papel importante. Se ben observamos aumentos e descensos respectivos e algúns estatisticamente significativos, non se pode esquecer que variacións na expresión e nos resultados obtidos pódense ver modificados por factores endóxenos (niveis de insulina, fondo xenético/epixenético) e/ou esóxenos, que incluso poden ter maior importancia para o estudado neste traballo. Este proxecto constitúe un estudo piloto, polo que os resultados obtidos deben tomarse con precaución, máis alá da significación estatística obtida. A longo prazo, sería interesante avaliar outro tipo de mecanismos que permitan desvelar en detalle os procesos que levan a estes cadros, (fosforilación das proteínas implicadas no proceso, taxa de proliferación celular, etc.). 7. CONCLUSIÓNS Partindo dos obxectivos expostos e de acordo aos resultados obtidos, podemos concluír: - A AN asociada ás síndromes de resistencia á insulina parece ter orixe na presenza de hiperinsulinemia. - A expresión dos xenes estudados, relacionados coa proliferación e diferenciación celular, tenden a estar aumentadas nas células afectadas pola síndrome de Rabson-Mendenhall cando comparamos a expresión en células controis. - A expresión dos xenes da ruta MAPK está aumentada na liña celular de fibroblastos de Rabson-Mendenhall, confirmando que esta vía contribúe ao desenvolvemento da AN. - O uso de inhibidores do receptor de IGF-1 (IGF-1R) parece reducir a expresión dos xenes estudados, que redundaría nunha redución na proliferación celular. - O uso de inhibidores da glicóxeno sintasa 3-b (GSK-3b) parece aumentar a expresión de xenes relacionados con este proceso. 8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Das A, Datta D, Kassir M, Wollina U, Galadari H, Lotti T, et al. Acanthosis nigricans: A review [Internet]. Vol. 19, Journal of Cosmetic Dermatology. J Cosmet Dermatol; 2020 [cited 2021 Jul 19]. p. 1857–65. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32516476/ 2. Karadağ AS, You Y, Danarti R, Al-Khuzaei S, Chen WC. Acanthosis nigricans and the metabolic syndrome. Clin Dermatol. 2018;36(1):48–53. 3. Higgins SP, Freemark M, Prose NS. Acanthosis nigricans: A practical approach to evaluation and management. Vol. 14, Dermatology Online Journal. 2008. 4. Pollitzer S. Acanthosis nigricans: A symptom of a disorder of the abdominal sympathetic. J Am Med Assoc [Internet]. [cited 2022 Mar 16] 1909;LIII(17):1369– 73. Available from: https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/430538 5. Lee HW, Suh HS, Choi JHC, Lee MW, Choi JHC, Moon KC, et al. Hyperkeratosis of the nipple and areola as a sign of malignant acanthosis nigricans [Internet]. Vol. 30, Clinical and Experimental Dermatology. John Wiley and Sons, Ltd; 2005 [cited 2022 May 20]. p. 721–2. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2230.2005.01889.x 6. Curth HO. Classification of acanthosis nigricans. Int J Dermatol [Internet]. [cited 2022 Jul 8] 1976;15(8):592–3. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-4362.1976.tb04895.x 7. Hernández-Pérez E. On the Classification of Acanthosis Nigricans [Internet]. Vol. 23, International Journal of Dermatology. Int J Dermatol; 1984 [cited 2022 May 12]. p. 605–6. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/6519871/ 8. Schwartz RA. Acanthosis nigricans. J Am Acad Dermatol [Internet]. [cited 2022 May 12] 1994;31(1):1–19. Available from: http://www.jaad.org/article/S0190962294701288/fulltext 9. Cruz PD, Hud JA. Excess insulin binding to insulin-like growth factor receptors: Proposed mechanism for acanthosis nigricans. J Invest Dermatol. 1992;98(6 SUPPL.):S82–5. 10. Musso C, Cochran E, Moran SA, Skarulis MC, Arioglu Oral E, Taylor S, et al. Clinical course of genetic diseases of the insulin receptor (type A and Rabson- Mendenhall syndromes): A 30-year prospective. Medicine (Baltimore). 2004;83(4):209–22. 11. Ben Harouch S, Klar A, Falik Zaccai TC. INSR-Related Severe Syndromic Insulin Resistance [Internet]. GeneReviews®. University of Washington, Seattle; 1993 [cited 2022 Mar 28]. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK476444/ 12. Araújo-Vilar D, Barreiro J, Sánchez-Iglesias S, Guillín-Amarelle C. Acantosis nigricans in severe insulin resistance syndromes. An Pediatr. 2017;86(3):166– 8. 13. Semple RK, Williams RM, Dunger DB. What is the best management strategy for patients with severe insulin resistance? Clin Endocrinol (Oxf) [Internet]. [cited 2022 May 20] 2010;73(3):286–90. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1365-2265.2010.03810.x 14. Brown RJ, Cochran E, Gorden P. Metreleptin improves blood glucose in patients with insulin receptor mutations. J Clin Endocrinol Metab [Internet]. [cited 2021 Referencias bibliográficas 43 Jul 19] 2013;98(11):E1749–56. Available from: https://academic.oup.com/jcem/article/98/11/E1749/2834516 15. Regan FM, Williams RM, McDonald A, Umpleby AM, Acerini CL, O’Rahilly S, et al. Treatment with Recombinant Human Insulin-Like Growth Factor (rhIGF)- I/rhIGF Binding Protein-3 Complex Improves Metabolic Control in Subjects with Severe Insulin Resistance. J Clin Endocrinol Metab [Internet]. [cited 2022 Jul 18] 2010;95(5):2113–22. Available from: https://academic.oup.com/jcem/article/95/5/2113/2596682 16. Araujo-Vilar D, Sánchez-Iglesias S, Guillín-Amarelle C, Castro A, Lage M, Pazos M, et al. Recombinant human leptin treatment in genetic lipodystrophic syndromes: the long-term Spanish experience. Endocrine [Internet]. [cited 2022 Jul 21] 2015;49(1):139–47. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s12020-014-0450-4 17. Taylor SI. Lilly lecture: Molecular mechanisms of insulin resistance: Lessons from patients with mutations in the insulin-receptor gene. Diabetes [Internet]. [cited 2022 May 20] 1992;41(11):1473–90. Available from: https://diabetesjournals.org/diabetes/article/41/11/1473/7780/Lilly-Lecture- Molecular-Mechanisms-of-Insulin 18. Arioglu E, Andewelt A, Diabo C, Bell M, Taylor SI, Gorden P. Clinical course of the syndrome of autoantibodies to the insulin receptor (type B insulin resistance): A 28-year perspective. Medicine (Baltimore). 2002;81(2):87–100. 19. Zhang S, Wang G, Wang J. Type B insulin resistance syndrome induced by systemic lupus erythematosus and successfully treated with intravenous immunoglobulin: Case report and systematic review. Clin Rheumatol [Internet]. [cited 2022 May 20] 2013;32(2):181–8. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s10067-012-2098-x 20. Lause M, Kamboj A, Faith EF. Dermatologic manifestations of endocrine disorders [Internet]. Vol. 6, Translational Pediatrics. AME Publications; 2017 [cited 2022 May 26]. p. 300. Available from: /pmc/articles/PMC5682371/ 21. Brown RJ, Araujo-Vilar D, Cheung PT, Dunger D, Garg A, Jack M, et al. The diagnosis and management of lipodystrophy syndromes: A multi-society practice guideline. J Clin Endocrinol Metab [Internet]. [cited 2021 Jul 19] 2016;101(12):4500–11. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27710244/ 22. Belfiore A, Frasca F, Pandini G, Sciacca L, Vigneri R. Insulin receptor isoforms and insulin receptor/insulin-like growth factor receptor hybrids in physiology and disease [Internet]. Vol. 30, Endocrine Reviews. Oxford Academic; 2009 [cited 2022 Jun 8]. p. 586–623. Available from: https://academic.oup.com/edrv/article/30/6/586/2355072 23. Barrett EJ. El páncreas endocrino. In: Boron WF, Boulpaep EL, editors. Fisiología médica. 3o edición. Barcelona, Spain: Elsevier España; 2017. p. 1035–53. 24. Nam SY, Lee EJ, Kim KR, Cha BS, Song YD, Lim SK, et al. Effect of obesity on total and free insulin-like growth factor (IGF)-1, and their relationship to IGF- binding protein (BP)-1, IGFBP-2, IGFBP-3, insulin, and growth hormone. Int J Obes [Internet]. [cited 2021 Jul 19] 1997;21(5):355–9. Available from: https://www.nature.com/articles/0800412 25. Song Y, Boncompagni AC, Kim SS, Gochnauer HR, Zhang Y, Loots GG, et al. ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 44 Regional Control of Hairless versus Hair-Bearing Skin by Dkk2. Cell Rep [Internet]. [cited 2021 Jul 26] 2018;25(11):2981-2991.e3. Available from: https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.11.017 26. Andl T, Reddy ST, Gaddapara T, Millar SE. WNT signals are required for the initiation of hair follicle development. Dev Cell. 2002;2(5):643–53. 27. Engelman JA. Targeting PI3K signalling in cancer: Opportunities, challenges and limitations [Internet]. Vol. 9, Nature Reviews Cancer. Nature Publishing Group; 2009 [cited 2022 Jun 8]. p. 550–62. Available from: https://www.nature.com/articles/nrc2664 28. Thauvin-Robinet C, Auclair M, Duplomb L, Caron-Debarle M, Avila M, St-Onge J, et al. PIK3R1 mutations cause syndromic insulin resistance with lipoatrophy. Am J Hum Genet [Internet]. [cited 2022 Jun 8] 2013;93(1):141–9. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0002929713002322 29. Chudasama KK, Winnay J, Johansson S, Claudi T, König R, Haldorsen I, et al. SHORT syndrome with partial lipodystrophy due to impaired phosphatidylinositol 3 kinase signaling. Am J Hum Genet [Internet]. [cited 2022 Jun 8] 2013;93(1):150–7. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S000292971300236X 30. Okabayashi T, Shima Y, Sumiyoshi T, Kozuki A, Ito S, Ogawa Y, et al. Diagnosis and management of insulinoma [Internet]. Vol. 19, World Journal of Gastroenterology. Baishideng Publishing Group Inc.; 2013 [cited 2021 Jul 21]. p. 829–37. Available from: https://www.wjgnet.com/1007- 9327/full/v19/i6/829.htm 31. Micheil Innes A, Dyment DA. SHORT Syndrome. 2014;1993–2022. 32. Gattinoni L, Zhong XS, Palmer DC, Ji Y, Hinrichs CS, Yu Z, et al. Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells. Nat Med 2009 157 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2009;15(7):808–13. Available from: https://www.nature.com/articles/nm.1982 33. De Herreros AG, Duñach M. Intracellular Signals Activated by Canonical Wnt Ligands Independent of GSK3 Inhibition and β-Catenin Stabilization. Cells 2019, Vol 8, Page 1148 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2019;8(10):1148. Available from: https://www.mdpi.com/2073-4409/8/10/1148/htm 34. Palsgaard J, Emanuelli B, Winnay JN, Sumara G, Karsenty G, Kahn CR. Crosstalk between insulin and Wnt signaling in preadipocytes: Role of Wnt co-receptor low density lipoprotein receptor-related protein-5 (LRP5). J Biol Chem. 2012;287(15):12016–26. 35. Petkov S, Hyttel P, Niemann H. The small molecule inhibitors PD0325091 and CHIR99021 reduce expression of pluripotency-related genes in putative porcine induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram [Internet]. [cited 2022 Jan 18] 2014;16(4):235–40. Available from: https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/cell.2014.0010 36. Sakolish C, House JS, Chramiec A, Liu Y, Chen Z, Halligan SP, et al. Tissue- Engineered Bone Tumor as a Reproducible Human in Vitro Model for Studies of Anticancer Drugs. Toxicol Sci [Internet]. [cited 2022 Jan 5] 2020;173(1):65–76. Available from: https://academic.oup.com/toxsci/article/173/1/65/5593667 37. Shirakawa J, Tajima K, Okuyama T, Kyohara M, Togashi Y, De Jesus DF, et al. Luseogliflozin increases beta cell proliferation through humoral factors that activate an insulin receptor- and IGF-1 receptor-independent pathway. Referencias bibliográficas 45 Diabetologia [Internet]. [cited 2022 Jan 18] 2020;63(3):577–87. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s00125-019-05071-w 38. Mulvihill MJ, Cooke A, Rosenfeld-Franklin M, Buck E, Foreman K, Landfair D, et al. Discovery of OSI-906: A selective and orally efficacious dual inhibitor of the IGF-1 receptor and insulin receptor. Future Med Chem [Internet]. [cited 2022 Jan 18] 2009;1(6):1153–71. Available from: https://www.futurescience.com/doi/abs/10.4155/fmc.09.89 39. Tunçer S, Gurbanov R, Sheraj I, Solel E, Esenturk O, Banerjee S. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Sci Reports 2018 81 [Internet]. [cited 2022 Jul 21] 2018;8(1):1–15. Available from: https://www.nature.com/articles/s41598- 018-33234-z 40. Okawa MC, Cochran E, Lightbourne M, Brown RJ. Long-Term Effects of Metreleptin in Rabson-Mendenhall Syndrome on Glycemia, Growth, and Kidney Function. [cited 2022 Mar 17] 2022;107(3). Available from: https://academic.oup.com/jcem/article/107/3/e1032/6413714 41. Moncada VY, Hedo JA, Serrano-Rios M, Taylor SI. Insulin-Receptor Biosynthesis in Cultured Lymphocytes From an Insulin-Resistant Patient (Rabson-Mendenhall Syndrome): Evidence for Defect Before Insertion of Receptor Into Plasma Membrane. Diabetes [Internet]. [cited 2022 Jul 19] 1986;35(7):802–7. Available from: https://diabetesjournals.org/diabetes/article/35/7/802/6248/Insulin-Receptor- Biosynthesis-in-Cultured 42. Takahashi Y, Kadowaki H, Ando A, Quin JD, MacCuish AC, Yazaki Y, et al. Two aberrant splicings caused by mutations in the insulin receptor gene in cultured lymphocytes from a patient with Rabson-Mendenhall’s syndrome. J Clin Invest. 1998;101(3):588–94. 43. Ardon O, Procter M, Tvrdik T, Longo N, Mao R. Sequencing analysis of insulin receptor defects and detection of two novel mutations in INSR gene. Mol Genet Metab Reports. 2014;1(1):71–84. 44. Scapin G, Dandey VP, Zhang Z, Prosise W, Hruza A, Kelly T, et al. Structure of the insulin receptor–insulin complex by single-particle cryo-EM analysis. Nat 2018 5567699 [Internet]. [cited 2022 Jul 19] 2018;556(7699):122–5. Available from: https://www.nature.com/articles/nature26153 45. Ichijo H, Nishida E, Irie K, Ten Dijke P, Saitoh M, Moriguchi T, et al. Induction of Apoptosis by ASK1, a Mammalian MAPKKK That Activates SAPK/JNK and p38 Signaling Pathways. Science (80- ) [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 1997;275(5296):90–4. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.275.5296.90 46. Wang XS, Diener K, Jannuzzi D, Trollinger D, Tan TH, Lichenstein H, et al. Molecular Cloning and Characterization of a Novel Protein Kinase with a Catalytic Domain Homologous to Mitogen-activated Protein Kinase Kinase Kinase *. J Biol Chem [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 1996;271(49):31607–11. Available from: http://www.jbc.org/article/S0021925819790322/fulltext 47. Hochberg I, Tran QT, Barkan AL, Saltiel AR, Chandler WF, Bridges D. Gene Expression Signature in Adipose Tissue of Acromegaly Patients. PLoS One [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2015;10(6):e0129359. Available from: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0129359 ANDRÉS ANTELO ABEIJÓN 46 48. Seger R, Krebs EG. The MAPK signaling cascade. FASEB J [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 1995;9(9):726–35. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1096/fasebj.9.9.7601337 49. Scholl FA, Dumesic PA, Barragan DI, Harada K, Bissonauth V, Charron J, et al. Mek1/2 MAPK Kinases Are Essential for Mammalian Development, Homeostasis, and Raf-Induced Hyperplasia. Dev Cell [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2007;12(4):615–29. Available from: http://www.cell.com/article/S1534580707001098/fulltext 50. Maurer U, Charvet C, Wagman AS, Dejardin E, Green DR. Glycogen synthase kinase-3 regulates mitochondrial outer membrane permeabilization and apoptosis by destabilization of MCL-1. Mol Cell [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2006;21(6):749–60. Available from: http://www.cell.com/article/S1097276506001110/fulltext 51. Mylona A, Theillet FX, Foster C, Cheng TM, Miralles F, Bates PA, et al. Opposing effects of Elk-1 multisite phosphorylation shape its response to ERK activation. Science (80- ) [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2016;354(6309):233–7. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.aad1872 52. Novak A, Dedhar S. Signaling through β-catenin and Lef/Tcf. Cell Mol Life Sci C 1999 565 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 1999;56(5):523–37. Available from: https://link.springer.com/article/10.1007/s000180050449 53. Eastman Q, Grosschedl R. Regulation of LEF-1/TCF transcription factors by Wnt and other signals. Curr Opin Cell Biol. 1999;11(2):233–40. 54. Benham-Pyle BW, Pruitt BL, Nelson WJ. Mechanical strain induces E-cadherin- dependent Yap1 and β-catenin activation to drive cell cycle entry. Science (80- ) [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2015;348(6238):1024–7. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.aaa4559 55. Jacinto E, Loewith R, Schmidt A, Lin S, Rüegg MA, Hall A, et al. Mammalian TOR complex 2 controls the actin cytoskeleton and is rapamycin insensitive. Nat Cell Biol 2004 611 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2004;6(11):1122–8. Available from: https://www.nature.com/articles/ncb1183 56. Thoreen CC, Chantranupong L, Keys HR, Wang T, Gray NS, Sabatini DM. A unifying model for mTORC1-mediated regulation of mRNA translation. Nat 2012 4857396 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2012;485(7396):109–13. Available from: https://www.nature.com/articles/nature11083 57. Akoulitchev S, Chuikov S, Reinberg D, Ogawa. Cyclin C Makes an Entry into the Cell Cycle. Dev Cell [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2004;6(5):607–8. Available from: http://www.cell.com/article/S1534580704001376/fulltext 58. Ren S, Rollins BJ. Cyclin C/Cdk3 promotes Rb-dependent G0 exit. Cell [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2004;117(2):239–51. Available from: http://www.cell.com/article/S0092867404003009/fulltext 59. Akoulitchev S, Chuikov S, Reinberg D. TFIIH is negatively regulated by cdk8- containing mediator complexes. Nat 2000 4076800 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2000;407(6800):102–6. Available from: https://www.nature.com/articles/35024111 60. Zeng X, Tamai K, Doble B, Li S, Huang H, Habas R, et al. A dual-kinase mechanism for Wnt co-receptor phosphorylation and activation. Nat 2005 4387069 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2005;438(7069):873–7. Available from: https://www.nature.com/articles/nature04185 Referencias bibliográficas 47 61. Barrett LE, Van Bockstaele EJ, Sul JY, Takano H, Haydon PG, Ebewine JH. Elk- 1 associates with the mitochondrial permeability transition pore complex in neurons. Proc Natl Acad Sci U S A [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2006;103(13):5155–60. Available from: www.pnas.orgcgidoi10.1073pnas.0510477103 62. Liu F, Thirumangalathu S, Gallant NM, Yang SH, Stoick-Cooper CL, Reddy ST, et al. Wnt-β-catenin signaling initiates taste papilla development. Nat Genet 2006 391 [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2006;39(1):106–12. Available from: https://www.nature.com/articles/ng1932 63. Sarbassov DD, Guertin DA, Ali SM, Sabatini DM. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex. Science (80- ) [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2005;307(5712):1098–101. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.1106148 64. Yu Y, Yoon SO, Poulogiannis G, Yang Q, Ma XM, Villén J, et al. Phosphoproteomic analysis identifies Grb10 as an mTORC1 substrate that negatively regulates insulin signaling. Science (80- ) [Internet]. [cited 2022 Jul 10] 2011;332(6035):1322–6. Available from: https://www.science.org/doi/10.1126/science.1199484