Utilidad de la Next-Generation Sequencing en el tratamiento del cáncer de pulmón no célula pequeña

Traballo de fin de grao Utilidad de la Next-Generation Sequencing en el tratamiento del cáncer de pulmón no célula pequeña Utilidade da Next-Generation Sequencing no tratamento do cancro de pulmón non célula pequena The utility of Next-Generation Sequencing in the treatment of non-small cell lung cancer Autora: Sara Ramos Casal Titor: Máximo Francisco Fraga Rodríguez Cotitor: Joaquín Mosquera Martínez Departamento: Ciencias Forenses, Anatomía Patológica, Xinecoloxía e Obstetricia, e Pediatría Curso académico: 2023/2024 (Santiago de Compostela, Xuño 2024) Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en Medicina 2 Índice 1. Resumen/Resumo/Abstract. ……………………………….....……… 3 2. Introducción…………………………………….……………...…….. 6 3. Objetivos……………...………………………………………...…... 12 4. Material y métodos………………………………………………..… 13 5. Resultados……………………………………………………….…... 15 6. Discusión……………………………………………………….......... 17 7. Conclusiones……………………………………………………........ 26 8. Referencias bibliográficas………………………………………….... 27 3 Resumen Antecedentes: El cáncer de pulmón es el cuarto tumor más prevalente, pero el que mayor mortalidad conlleva, suponiendo el 18,2% de la mortalidad por cáncer según datos de Global Cancer Observatory. Por estos datos, el estudio de alteraciones moleculares y las terapias dirigidas suponen el futuro del abordaje del cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC). Objetivos: conocer el porcentaje de pacientes en los que se descubre un biomarcador susceptible de ser tratado con una terapia dirigida utilizando técnicas de secuenciación masiva (next generation sequencing, NGS) sobre una cohorte de pacientes de NSCLC.Y determinar la supervivencia libre de progresión y la tasa de respuesta en aquellos pacientes sobre los que se haya podido realizar un tratamiento dirigido. Además de esto estudiaremos en qué momento del tratamiento se ha solicitado el estudio y como el resultado ha afectado a la terapia del paciente. Métodos: para el abordaje de nuestro trabajo de ha planteado un estudio observacional retrospectivo descriptivo sobre una población de pacientes con NSCLC tratados en el servicio de Oncología médica del Hospital Universitario de A Coruña a los que se les realizó una NGS mediante Foundation Medicine entre el 1 de septiembre de 2019 y el 31 de diciembre de 2023. Resultados: Se encontró que en 8 (40 %) de los pacientes tenemos una alteración molecular tratable tras aplicar la NGS quedando 12 (60 %) en los que no se detectó ninguna alteración molecular susceptible de ser tratada. las alteraciones moleculares nuevas detectadas con NGS con Foundation Medicine fueron: 2 pacientes (10 %) presentaron mutación en EGFR exón 20, otros 2 pacientes (10 %) mutación en EGFR, 1 (5%) con mutación en FGFR3, 1 (5 %) translocación de ALK, 1 (5 %) amplificación de MET y 1 paciente (5 %) con BRAF mutado N581S. En cuanto al tipo de respuesta de los 8 de los pacientes en los que se inició un nuevo tratamiento 4 (50%) mostraron una respuesta parcial, produciéndose ésta a los 69,5 días de haber iniciado el tratamiento (intervalo de confianza de 162 a 26 días). Otros 2 pacientes (25%) obtuvieron como mejor respuesta progresión de la enfermedad, ocurriendo esto a los 76 días de haber iniciado el tratamiento (intervalo de confianza de 89 a 63 días). Solo 1 paciente (12,5%) presentó enfermedad estable como mejor respuesta, ocurriendo esto a los 51 días de haber iniciado el tratamiento. En un paciente, por iniciar el tratamiento 37 días antes de la fecha de corte, no tenemos datos del tipo de respuesta ni de si ha habido progresión de la enfermedad. Conclusiones: La NGS es una técnica que aporta beneficios a los pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña en pacientes con enfermedad avanzada permitiendo la detección de alteraciones moleculares en un gran porcentaje de pacientes permitiendo así que se beneficien de la utilización de terapias dirigidas. Palabras clave: cáncer no microcítico de pulmón, secuenciación de nueva generación, alteraciones moleculares. 4 Resumo Antecedentes: o cancro de pulmón é o cuarto tumor con maior prevalencia, pero o que presenta maior mortalidade, representando o 18,2% da mortalidade por cancro segundo os datos do Observatorio Mundial do Cancro (GLOBOCAN 2020) (1). Debido a estes datos, o estudo das alteracións moleculares e as terapias dirixidas representan o futuro da abordaxe do cancro de pulmón non célula pequena (NSCLC). Obxectivos: coñecer a porcentaxe de pacientes nos que se descobre un biomarcador susceptible de ser tratado cunha terapia dirixida mediante técnicas de secuenciación masiva (secuenciación de próxima xeración, NGS) nunha cohorte de pacientes con NSCLC. E para determinar a supervivencia sen progresión e a taxa de resposta naqueles pacientes aos que foi posible realizar un tratamento dirixido. Ademais disto, estudaremos en que momento do tratamento se solicitou o estudo e como afectou o resultado á terapia do paciente. Métodos: para abordar o noso traballo, propúxose un estudo observacional descritivo retrospectivo sobre unha poboación de pacientes con CPNM tratados no servizo de Oncoloxía Médica do Hospital Universitario da Coruña que foron sometidos a NGS a través de Foundation Medicine entre o 1 de setembro de 2019 e o 31 de decembro de 2023. Resultados: atopouse que en 8 (40%) dos pacientes temos unha alteración molecular tratable despois de aplicar NGS, quedando 12 (60%) nos que non se detectou ningunha alteración molecular tratable. As novas alteracións moleculares detectadas con NGS con Foundation Medicine foron: 2 pacientes (10%) tiñan unha mutación no exón 20 de EGFR, outros 2 pacientes (10%) tiñan unha mutación en EGFR, 1 (5%) tiña unha mutación en FGFR3, 1 (5%) translocación de ALK, 1 (5%) amplificación MET e 1 paciente (5%) con BRAF mutado N581S. En canto ao tipo de resposta dos 8 pacientes nos que se iniciou un novo tratamento, 4 (50%) presentaron unha resposta parcial, producíndose 69,5 días despois do inicio do tratamento (intervalo de confianza de 162 a 26 días). Outros 2 pacientes (25%) obtiveron a progresión da enfermidade como a mellor resposta, producíndose 76 días despois do inicio do tratamento (intervalo de confianza de 89 a 63 días). Só 1 paciente (12,5%) presentou a enfermidade estable como a mellor resposta, esta ocorreu 51 días despois do inicio do tratamento. Nun paciente, debido a que o tratamento comezou 37 días antes da data de corte, non temos datos sobre o tipo de resposta ou se houbo progresión da enfermidade. Conclusións: A NGS é unha técnica que proporciona beneficios aos pacientes con cancro de pulmón non microcítico en pacientes con enfermidade avanzada, permitindo detectar alteracións moleculares nunha gran porcentaxe de pacientes, permitíndolles así beneficiarse de utilización de terapias dirixidas. Palabras clave: cancro non microcítico de pulmón, secuenciación de nova xeración, alteracións moleculares. 5 Abstract Background: Lung cancer is the fourth most prevalent tumor but the one with the highest mortality rate, accounting for 18.2% of cancer mortality according to data from the Global Cancer Observatory (GLOBOCAN 2020) (1). Due to these data, the study of molecular alterations and targeted therapies represent the future approach for non-small cell lung cancer (NSCLC). Objectives: to determine the percentage of patients in whom a biomarker susceptible to be treated with a targeted therapy is discovered using massive sequencing techniques (next generation sequencing, NGS) in a cohort of NSCLC patients. And to determine the progressionfree survival and the rate of response in those patients on whom it has been possible to perform targeted treatment. In addition to this, we will study at what point in the treatment the study was requested and how the result has affected the patient's therapy. Methods: To approach our work, a descriptive retrospective observational study has been proposed on a population of patients with NSCLC treated in the Medical Oncology service of the University Hospital of A Coruña who underwent NGS using Foundation Medicine between September 1, 2019, and December 31, 2023. Results: It was found that in 8 (40%) of the patients, a treatable molecular alteration was identified after applying NGS, leaving 12 (60%) in whom no treatable molecular alteration was detected. The new molecular alterations detected with NGS using Foundation Medicine were: 2 patients (10%) presented an EGFR exon 20 mutation, another 2 patients (10%) had an EGFR mutation, 1 (5%) had an FGFR3 mutation, 1 (5%) had an ALK translocation, 1 (5%) had MET amplification, and 1 patient (5%) had a BRAF N581S mutation. Regarding the type of response in the 8 patients who started a new treatment, 4 (50%) showed a partial response, which occurred 69.5 days after starting treatment (confidence interval of 26 to 162 days). Another 2 patients (25%) experienced disease progression as the best response, occurring 76 days after starting treatment (confidence interval of 63 to 89 days). Only 1 patient (12.5%) had stable disease as the best response, occurring 51 days after starting treatment. For one patient, who started treatment 37 days before the cut-off date, we do not have data on the type of response or whether there has been disease progression. Conclusions: NGS is a technique that provides benefits to patients with non-small cell lung cancer in patients with advanced disease, allowing the detection of molecular alterations in a large percentage of patients, thus allowing them to benefit from the use of targeted therapies. Keywords: non-small cell lung cancer, next-generation sequencing, molecular alterations. 6 Introducción El cáncer de pulmón es el cuarto tumor más prevalente, por detrás del cáncer de mama, colorrectal y próstata, pero el que mayor mortalidad conlleva, suponiendo el 18.2% de la mortalidad por cáncer, según datos de Global Cancer Observatory (GLOBOCAN 2020) (1). En lo que a la epidemiología se refiere y según los datos de la Sociedad Española de Oncología Médica (SEOM), en el año 2020 en plena pandemia de enfermedad por coronavirus (COVID- 19), el cáncer siguió siendo responsable de más muertes que la propia pandemia, siendo la segunda causa de muerte en España (sólo por detrás de las enfermedades del sistema circulatorio). Lo que supone que esta enfermedad es un problema de salud de primer nivel. Según datos de GLOBOCAN, para el año 2020 se estimaban 18.094.716 nuevos casos diagnosticados de cáncer, adjudicándole al cáncer de pulmón 2.206.771 casos, lo que supone el 12.2% de todos los tumores diagnosticados en el mundo. (1) En España, el cáncer es también una de las principales causas de morbi-mortalidad. El número de cánceres diagnosticados en España en el año 2023 se estima que alcanzará los 279.260 casos, según los cálculos de la Red Española de Registros del Cáncer (REDECAN), esperándose 31.282 nuevos casos diagnosticados de cáncer de pulmón para este año (2). El cáncer de pulmón se mantiene como el tercer tumor más incidente en mujeres en el año 2022. Este hecho se encuentra en relación con el aumento en el consumo de tabaco en el sexo femenino a partir de los años 70, lo cual implicó un dramático incremento en el desarrollo de neoplasias relacionadas con el tabaco como este cáncer (y otros como los de la cavidad oral y faringe o los de la vejiga urinaria). El tiempo de exposición al tabaco es un factor importante para el desarrollo del tumor por lo que en torno al 44% de los pacientes tienen más de 70 años al diagnóstico. Las cifras más recientes advierten que la mortalidad por cáncer de pulmón en mujeres se ha multiplicado hasta cuatro veces. Y, desgraciadamente, se espera que estas cifras se incrementen de forma exponencial en los próximos años (3). Este fuerte incremento de la mortalidad en mujeres en las últimas décadas es debido a la incorporación tardía de éstas al hábito tabáquico mientras que la tendencia en los varones continúa siendo descendente en los últimos años. Podemos afirmar que, aunque a día de hoy sigue predominando en varones, poco a poco se está produciendo una feminización del cáncer de pulmón, siendo este cambio de tendencia en el sexo de los pacientes el rasgo más significativo de la epidemiología de esta enfermedad en los últimos años. 7 Si bien es cierto que la mortalidad por cáncer en España ha experimentado un fuerte descenso en las últimas décadas gracias a las actividades de prevención, a las campañas de diagnóstico precoz y a los avances terapéuticos; este descenso en la mortalidad no es uniforme para todos los tumores, provocando que el cáncer de pulmón continúe siendo la principal causa de muerte por neoplasia (2). Hoy en día el adenocarcinoma de pulmón es el subtipo histológico más frecuentemente diagnosticado en el mundo de todas las neoplasias pulmonares, suponiendo alrededor del 50% de todas las neoplasias pulmonares. Al cáncer microcítico de pulmón le corresponde el 15% de todos los tumores de pulmón diagnosticados. Los porcentajes son similares en nuestro medio (4, 5). Con estos datos debemos replantear el tratamiento de los pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña (NSCLC) avanzado que históricamente ha consistido en quimioterapia citotóxica sistémica. La quimioterapia tiene como objetivo general matar las células que están creciendo y dividiéndose por tanto atacar tanto a células normales como a células malignas lo que conlleva una elevada toxicidad y un empeoramiento de la calidad de vida del paciente. Por este motivo a principios de la década de los 2000 comenzamos a tener una mejor comprensión de las vías moleculares de malignidad en el NSCLC lo que condujo al desarrollo de agentes que se dirigen a vías moleculares específicas de las células malignas siendo prácticamente inocuos para las células normales gracias a la detección de agentes oncogénicos que conocemos como biomarcadores (6). No obstante, la proporción de pacientes con adenocarcinoma avanzado que es sometido a pruebas genéticas tumorales sigue siendo muy baja y, por lo tanto, es importante aumentar la conciencia sobre las alteraciones genéticas potencialmente abordables. Los biomarcadores más útiles para predecir la eficacia de la terapia dirigida en el NSCLC son las alteraciones del genoma somático conocidas como ``mutaciones conductoras´´ (7). Estas mutaciones generalmente no se encuentran en el genoma de la línea germinal del huésped y generalmente son excluyentes (es decir, es poco probable que un cáncer tenga más de una mutación conductora). En el NSCLC, así como en otras neoplasias malignas, hacer coincidir un fármaco específico con la mutación conductora identificada para un paciente individual ha resultado en una mejora significativa de la eficacia terapéutica, a menudo junto con una menor toxicidad. Por lo tanto, la detección de estas mutaciones se ha convertido cada vez más estándar del diagnóstico del NSCLC, y la información resultante es útil para elegir entre quimioterapia estándar en ausencia de la mutación objetivo frente a terapias dirigidas iniciales. 8 Los métodos para detectar mutaciones conductoras y otras anomalías en pacientes con NSCLC evolucionan continuamente. Las características que hacen que estes métodos sean clínicamente útiles son el tiempo de respuesta rápido (dos semanas o menos), la rentabilidad, la capacidad de realizarse en muestras clínicamente disponibles y la semiautomatización. Las técnicas utilizadas comúnmente en el entorno clínico son las siguientes (6): • Secuenciación de ácido desoxirribonucleico (ADN): primera técnica implementada, la cual examina la longitud completa de un solo gen para detectar la presencia de la mutación. El tiempo de respuesta es menor de 1 semana, sin embargo, la sensibilidad es muy baja puesto requiere una celularidad alta. • Pruebas de alelos específicos de ADN: analizan el ADN en busca de una anomalía predefinida y reemplazaron en gran medida la secuenciación de ADN. Tiende a ser más rápida y barata que la secuenciación de cada gen individualmente pero solo permite identificar objetos preespecificados. Por tanto, esta prueba no puede utilizarse para identificar nuevas anomalías. • Secuenciación masiva o de próxima generación (NGS) de ADN y ácido ribonucleico (ARN): la NGS supera muchas de las deficiencias de las pruebas anteriores, y está siendo adoptada rápidamente por más centros. Conserva la sensibilidad incluso en muestras con baja celularidad tumoral y permite identificar nuevas anomalías que no se detectarían mediante la prueba de alelos específicos. La sensibilidad es lo suficientemente alta como para identificar muchos reordenamientos moleculares en sangre, lo que se conoce como biopsia líquida. Utilizaremos habitualmente esta técnica en nuestra práctica clínica y será la que se desarrolle en este estudio. • Pruebas de fluorescencia in situ (FISH): se utiliza normalmente para detectar reordenamientos genéticos, como traslocaciones, amplificaciones o deleciones por ejemplo como en el reordenamiento de ROS1 o ALK. • Inmunohistoquímica (IHC): se considera una alternativa sensible y especifica a la FISH (8,9). En el cáncer de pulmón, la IHC es el único método definitivo para evaluar la tinción de la proteína PD-L1. Si bien el diagnóstico molecular tradicionalmente se ha realizado en tejido tumoral sólido, las pruebas sanguíneas o las llamadas biopsias líquidas están ganando popularidad, dado que nos permite genotipar de una manera menos invasiva y menos costosa (10,11) 9 El principio detrás de estas biopsias es la presencia de células tumorales circulantes a menudo presentes en la sangre de pacientes con cáncer de pulmón (11). Sin embargo, una limitación de estas biopsias basadas en ADN de células tumorales circulantes (ctADN) es la mayor probabilidad de falsos negativos en comparación con las biopsias tradicionales, dadas las cantidades minúsculas y variables de ADN que los tumores pueden arrojar a la circulación. La detección de mutaciones en sangre se ha asociado con características más avanzadas de la enfermedad, incluido un peor estado funcional y pronóstico, así como la presencia de más focos metastásicos. Debemos detectar las siguientes mutaciones conductoras, que son las que más comúnmente encontramos en los pacientes con cáncer microcítico de pulmón. Las mutaciones de EGFR se observan en aproximadamente el 10% de los adenocarcinomas de NSCLC y ocurren con mayor frecuencia en no fumadores (12). En las poblaciones asiáticas, la incidencia de mutaciones del EGFR es hasta un 62% mayor que en el resto de poblaciones (13). Esta puede detectarse tanto en biopsias de tejido solido como en biopsias líquidas (14). En el NSCLC avanzado, la presencia de una mutación del EGFR confiere un pronóstico más favorable y predice firmemente la sensibilidad a los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) y, por lo tanto, se debe utilizar una terapia dirigida, como el uso de osimertinib, antes que una quimioterapia. Los reordenamientos del gen ALK están presentes en aproximadamente el 4% de los adenocarcinomas de NSCLC y ocurre con mayor frecuencia en no fumadores y en pacientes más jóvenes. Las traslocaciones de ALK se pueden identificar mediante pruebas de FISH, IHC o en la mayoría de los casos con la secuenciación de próxima generación (NGS). La presencia de un reordenamiento del gen ALK predice firmemente la sensibilidad a los TKI ALK (crizotinib, ceritinib, alectinib, brigatinib, lorlatinib…) (6). El oncogén ROS1 es un receptor tirosin quinasa que actúa como oncogén conductor en entre el 1 y el 2% de los NSCLC mediante una traslocación genética entre ROS1 y otros genes, el más común de los cuales es CD74(15,16). Estas traslocaciones de ROS1 se asocian a adenocarcinoma, pacientes más jóvenes y nunca fumadores, y pueden detectarse mediante un ensayo de FISH o mediante algunos paneles NGS. La tirosina quinasa ROS1 es muy sensible al inhibidor de ROS1/MET como es el crizotinib, así como los inhibidores de ROS1/tropomiosina quinasa del receptor (TRK) como son el entrectinib y repotrectinib (17,18). Aunque la eficacia en enfermedades sistémicas parece comparable, se prefiere entrectinib o repotrectinib para pacientes con afectación del sistema nervioso central debido a una mejor penetración intracraneal. 16 paciente en un ensayo clínico, tratando a las otras 7 alteraciones moleculares (35 %) con un nuevo tratamiento asistencial. De los 3 (15 %) pacientes con translocación en ALK, 2 de ellos fueron tratados con lorlatinib y 1 con alectinib. De los 2 pacientes (10 %) con mutaciones en EGFR, uno de ellos fue tratado con osimertinib y otro con quimioterapia con carboplartino con pemetrexed. El paciente con mutación EGFR exón 20 fue tratado con mobocertinib, el paciente con mutación BRAF N518S con avulometinib en ensayo clínico, como se comentó anteriormente. Y el paciente con la amplificación de MET fue tratado con crizotinib. Otros de los objetivos primarios del estudio eran evaluar la supervivencia libre de progresión entendida esta como el intervalo de tiempo que ocurre desde el inicio de tratamiento hasta la progresión de la enfermedad definida por criterios radiológicos RECIST 1.1 o hasta la muerte – el evento que ocurra primero -) y la tasa de respuesta, considerándose respuesta a la respuesta completa, respuesta parcial y estabilidad de la enfermedad según criterios RECIST 1.1. En cuanto al tipo de respuesta de los 8 de los pacientes en los que se inició un nuevo tratamiento 4 (50%) mostraron una respuesta parcial, produciéndose ésta a los 69,5 días de haber iniciado el tratamiento (intervalo de confianza de 162 a 26 días). Otros 2 pacientes (25%) obtuvieron como mejor respuesta progresión de la enfermedad, ocurriendo esto a los 76 días de haber iniciado el tratamiento (intervalo de confianza de 89 a 63 días). Solo 1 paciente (12,5%) presentó enfermedad estable como mejor respuesta, ocurriendo esto a los 51 días de haber iniciado el tratamiento. En un paciente, por iniciar el tratamiento 37 días antes de la fecha de corte, no tenemos datos del tipo de respuesta ni de si ha habido progresión de la enfermedad. Para la establecer la duración de la respuesta hemos calculado los días que han transcurrido desde el inicio del nuevo tratamiento hasta la progresión de la enfermedad en aquellos casos en los que se haya ocurrido progresión de la enfermedad o hasta el 01/03/2024 en aquellos en los que no se haya demostrado la progresión, por tomarse ésta como la fecha de corte de datos para este trabajo. Así, la duración media de los tratamientos ha sido de 247,86 días (intervalo de confianza de 893 a 34 días). En cuanto al momento del tratamiento en el que se ha solicitado el estudio, 8 (40%) de los pacientes se encontraban en la primera línea, 8 (40%) en la segunda línea, 3 (15%) en la cuarta línea y 1 (5%) en la quinta línea de tratamiento. 17 Discusión El cáncer de pulmón es el cáncer diagnosticado con más frecuencia y la principal causa de muerte por cáncer en ambos sexos (37). El NSCLC supone un 80-85% de todos los casos de cáncer de pulmón y por tanto su diagnóstico y tratamiento supone un gran reto a nivel mundial (38). Tenemos tres subtipos principalmente de NSCLC que serían carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. El adenocarcinoma supone la gran mayoría (40%) de todos los NSCLC (39). El NSCLC surge de células epiteliales pulmonares desde los bronquios principales hasta los alvéolos terminales. El tipo histológico se correlaciona con el sitio de origen y refleja las variaciones epiteliales de las vías respiratorias desde los bronquios hasta los alveolos. Por lo general el carcinoma de células escamosas surge cerca de un bronquio principal mientras que el adenocarcinoma y el carcinoma bronquioalveolar por lo común surgen del tejido pulmonar periférico (40). El tratamiento del NSCLC está evolucionando hacia una medicina de precisión basada en la detección de biomarcadores a través del diagnóstico con pruebas moleculares, para poder bloquearse mediante terapias dirigidas. Dentro de las alteraciones moleculares, tenemos que diferenciar las mutaciones driver (o conductoras) de las mutaciones pasajeras. El NSCLC se asocia a varias mutaciones conductoras, como son EGFR, ALK, ROS-1, BRAF Y BRAF. (41). Se conocen como mutaciones pasajeras a las que no son esenciales para mantener el fenotipo oncogénico. Debemos tener en cuenta que estas mutaciones pasajeras por lo general no se encuentran en la línea germinal y, por lo tanto, no son de transmisión hereditaria. El estudio de biomarcadores en NSCLC es un campo en continua evolución y siguen apareciendo nuevos biomarcadores susceptibles de ser tratados, como el receptor tirosina quinasa erbB-2 (ERBB2/HER2), el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (MET) y las fusiones del mismo, reordenamientos durante la transfección (RET), así como fusiones del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (41). Siguiendo estos principios de la medicina de precisión, basada en la detección de biomarcadores con las consiguientes terapias dirigidas (39)(41), la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAP) y la SEOM recomiendan la determinación de 9 biomarcadores esenciales (Tabla 2) (42) en pacientes con NSCLC: 18 Tabla 2. Gen/Proteína Alteración Frecuencia estimada en NSCLC EGFR Mutación 10-16% ALK Reordenamiento 2-5% ROS1 Reordenamiento 1% BRAF V600E Mutación 2% NTRK Reordenamiento <1% RET Reordenamiento 1-2% KRAS Mutación 25% MET Mutación, Amplificación Mutación 3-4% Amplificación 1-5% El momento óptimo de realizar este estudio molecular es el diagnóstico del tumor. Pero lo cierto, que por falta de una buena muestra sobre la que realizar el estudio o por complicaciones derivadas de las dificultades técnicas de la propia técnica, el que todos los pacientes con NSCLC tengan el estudio completo al diagnóstico continúa siendo un reto. La importancia de este estudio molecular radica en encontrar un fármaco específico para cada una de las alteraciones moleculares identificadas, lo que da como resultado una mejoría de la eficacia de los tratamientos acompañada de una menor toxicidad. Siendo todo esto la verdadera medicina de precisión. Esta determinación de alteraciones genéticas potencialmente tratables en el NSCLC se puede realizar mediante diversos métodos, los cuales han de ser clínicamente útiles con un tiempo de respuesta rápido (idealmente de dos semanas o menos), rentables, semiautomáticos y con capacidad para realizarse en muestras clínicamente disponibles. Pues, como señalamos anteriormente, la falta de una buena muestra es uno de los retos en el diagnóstico del NSCLC. Disponemos, por ello, de múltiples técnicas para realizar este estudio, cada una con características bien diferenciadas (43). La primera de ellas es la secuenciación del ADN, la cual examina la longitud completa de un solo gen. Presenta una baja sensibilidad puesto que requiere de una celularidad alta. 19 Para agilizar y abaratar la secuenciación de ADN surge la prueba de los alelos específicos, pero ésta no sirve para identificar nuevas anomalías puesto que solo permite identificar alteraciones preespecificadas. Las pruebas de FISH y la IHC son dos técnicas muy útiles en el diagnóstico del NSCLC. La FISH nos permite detectar reordenamientos genéticos, como es el caso de ROS1 y ALK, mientras que la IHC es una alternativa altamente sensible y específica a la FISH y el único método definitivo para evaluar la tinción de la expresión de la proteína PD-L1. La secuenciación masiva o de nueva generación (NGS) supera muchas de las deficiencias de las otras técnicas. Conserva una elevada sensibilidad incluso en muestras con baja celularidad tumoral y permite a su vez identificar nuevas alteraciones moleculares. Todo esto hace que esta sea la técnica utilizada cuando se busca realizar un estudio molecular completo. Y es por ello que hemos centrado este trabajo en esta técnica. La NGS se puede realizar tanto en tejido sólido como en muestras de líquidos corporales, las llamadas biopsias líquidas, fundamentalmente en sangre, aunque se pueden realizar determinaciones en cualquier líquido, como el pleural, pericárdico, abdominal o en la orina. Así esta técnica permite hacer un genotipado de una manera menos invasiva y menos costosa (10,11). Además, la biopsia líquida tiene utilidades más allá del diagnóstico molecular, como es detectar el ADN circulante de las células tumorales (ctDNA), cuya presencia, al menos en ensayos clínicos, permite detectar recidivas o progresiones antes de que provoquen manifestaciones radiológicas o clínicas. El gran reto del tratamiento del NSCLC es que se trata de una enfermedad dinámica. Las alteraciones moleculares pueden estar presentes al momento del diagnóstico o aparecer como mecanismo de resistencia adquirida secundaria a los tratamientos recibidos. Y la presencia o ausencia de estas alteraciones condiciona la evolución de la enfermedad al influir en la forma en que dirigimos el tratamiento contra ellas. Por ello, hemos plantado este trabajo para saber cómo influye la realización de una técnica de secuenciación masiva en la evolución y el tratamiento de pacientes con NSCLC de vida real. Todos estes datos son esclarecedores para nuestro estudio observacional retrospectivo en el que se ha incluido una cohorte de 20 pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña que han sido sometidos a NGS en diferentes momentos del tratamiento: un 40% de los pacientes en primera línea, 40% en segunda línea, 3% en la cuarta línea y 5% en la cuarta línea, mostrando la mayor rentabilidad de estas técnicas en líneas precoces y en pacientes que no han recibido todavía muchos tratamientos. 20 De los 20 pacientes 5 (25%) son hombres y 15 (75%) mujeres. Tradicionalmente, la existencia de alteraciones moleculares se ha asociado con pacientes nunca fumadores, gran parte de ellos mujeres, dada la incorporación más tardía de ellas al hábito tabáquico. Además, la media de edad son 58 años, teniendo 12 (60%) de ellos menos de 58 años y 8 (40%) más de 58 años. Así, está cohorte de pacientes está formada por mujeres jóvenes, una población en la que es esperable la existencia de alteraciones moleculares. El 100% de los pacientes presentaba un estadio IV el cual se caracteriza por tener cualquier T, cualquier N y M1. Este estadio se divide a su vez en IVB (metástasis a distancia del pulmón) el cual presentaban 18 (90%) de nuestros peciente y IVA (metástasis pulmonares, pleurales, derrames pleural y pericárdico o metástasis única a distancia del pulmón) en cual presentaban 2 (10%) de los pacientes. Uno de los objetivos primarios del estudio era analizar el porcentaje de pacientes en los que se descubre un biomarcador susceptible de ser tratado con una terapia dirigida. Inicialmente, 9 pacientes (45 %) tenían una alteración molecular conocida y 11 (55 %) no, lo que es algo esperable en una población joven mayoritariamente femenina, como se comentó anteriormente. En la alteración molecular inicial tratable tenemos que en 4 (20 %) del total de pacientes presenta mutación en EGFR, 3 (15 %) translocación de ALK, 1 (5 %) translocación en RET y 1 (5%) mutación en KRAS. Estos porcentajes son similares a los reportados en la literatura, como ya se ha comentado. Al realizar la NGS, se encontró que en 8 (40 %) de los pacientes una alteración molecular tratable. Así, las alteraciones moleculares nuevas detectadas con NGS con Foundation Medicine fueron: 2 pacientes (10 %) presentaron mutación en EGFR exón 20, otros 2 pacientes (10 %) mutación en EGFR, 1 (5%) con mutación en FGFR3, 1 (5 %) translocación de ALK, 1 (5 %) amplificación de MET y 1 paciente (5 %) con BRAF mutado N581S. En 12 pacientes (60 %) no se ha detectado ninguna alteración molecular tratable. Hay que destacar que las mutaciones en FGFR3, la amplificación de MET y las mutaciones en BRAF diferentes a las V600E no se pueden detectar con otras técnicas distintas a la NGS. Por lo que, de no haberse realizado esta técnica, estos pacientes no se habrían beneficiado de un tratamiento dirigido. Con estos datos, el resultado de la NGS supuso un cambio en el tratamiento de 8 pacientes (40 %), manteniendo en 12 de ellos (60 %) la misma estrategia terapéutica. Solo una de las alteraciones moleculares (en concreto la mutación en BRAF N581S) permitió la inclusión del paciente en un ensayo clínico, tratando a las otras 7 alteraciones moleculares (35 %) con un nuevo tratamiento asistencial. De los 3 (15 %) pacientes con translocación en ALK, 2 de ellos fueron tratados con lorlatinib y 1 con alectinib. De los 2 pacientes (10 %) con mutaciones en EGFR, uno de ellos fue tratado con osimertinib y otro con quimioterapia con carboplartino con pemetrexed. El paciente con mutación EGFR exón 20 fue tratado con mobocertinib, el paciente con mutación 21 BRAF N518S con avulometinib en ensayo clínico, como se comentó anteriormente. Y el paciente con la amplificación de MET fue tratado con crizotinib. En un 40% de los pacientes sometidos a NGS se demostró una alteración molecular tratable en contraposición al 45% que se habían identificado en un primer momento. Lo que supone un alto porcentaje de pacientes susceptibles de ser tratados con terapias dirigidas. Por tanto, con la NGS se han podido identificar biomarcadores recogidos en los niveles 1 y 2 de la base de datos OncoKB (43)(44). En cuanto al segundo y tercero de nuestros objetivos, analizando la supervivencia libre de progresión y la tasa de respuesta obtuvimos que de los 8 pacientes en los que se inició un nuevo tratamiento, 4 (50%) mostraron una respuesta parcial, produciéndose ésta a los 69,5 días de haber iniciado el tratamiento (intervalo de confianza de 162 a 26 días). Otros 2 pacientes (25%) obtuvieron como mejor respuesta progresión de la enfermedad, ocurriendo esto a los 76 días de haber iniciado el tratamiento (intervalo de confianza de 89 a 63 días). Solo 1 paciente (12,5%) presentó enfermedad estable como mejor respuesta, ocurriendo esto a los 51 días de haber iniciado el tratamiento. En un paciente, por iniciar el tratamiento 37 días antes de la fecha de corte, no tenemos datos del tipo de respuesta ni de si ha habido progresión de la enfermedad. Todo ello con una duración media de los tratamientos ha sido de 247,86 días. Esto prueba que no sólo es que se haya podido iniciar un nuevo tratamiento, si no que en gran parte de los pacientes se traduce en respuesta a este tratamiento y una respuesta duradera. Más, si tenemos en cuenta que son pacientes que ya han recibido previamente al menos una línea de tratamiento. Buscando experiencias similares recientes a nuestro estudio, en Taiwán se llevó a cabo un estudio retrospectivo basado en informes sobre NGS durante el periodo comprendido entre noviembre de 2020 y diciembre de 2022(43). Este estudio pretendía demostrar la utilidad de NGS en la identificación de objetivos clínicamente procesables, según lo definido y categorizado por la base de conocimientos de oncología de precisión de OncoKB(8), de una manera similar a como planteamos nuestro estudio. En Taiwán, el estudio con NGS se sugiere en escenarios clínicos en los cuales no se identifican mutaciones de EGFR, ALK y ROS1, o cuando los pacientes experimentan un fracaso del tratamiento y un progreso de la enfermedad. Se incluyó una cohorte de 73 pacientes con edades comprendidas entre 42 y 86 años (mediana 66 años). La proporción entre mujeres y hombres fue de 1,15 a 1 con un total de 39 mujeres y 34 hombres. En cuanto a las características histológicas de la cohorte tenemos que en 67 de los casos (91,8%) se trataba de un adenocarcinoma, 1 caso (1,4%) carcinoma de células escamosas, 1 22 caso (1,4%) carcinoma adenoescamoso, carcinoma linfoepitelial 1 (1,4%), carcinoma neuroendrocino de células grandes 1 (1,4%) y carcinoma sarcomatoide 1 (1,4%). La mayoría de los pacientes, al igual que en nuestro estudio, presentaron inicialmente una enfermedad avanzada irresecable. Del total de pacientes 64 (87,7%) se encontraban en un estadio mayor o igual de IIIB y 9 (12,3%) en un estadio menor o igual a IIIA. Esto último es llamativo, pues no es habitual realizar estudios de secuenciación masiva en pacientes en estadios tan precoces. En el momento del diagnóstico inicial se evaluaron 29 (39,7%) casos, mientras que los otros 44 (60,3%) fueron evaluados en el transcurso de la enfermedad, habiendo recibido quimioterapia o terapia dirigida previamente. Las muestras patológicas comprendieron 40 (54,8%) biopsias, 29 (39,7%) resecciones y 4 (5,5%) bloques celulares. En los 72 casos identificados en la cohorte tenían una mutación similar a estudios previos donde ya se identificaron los genes más comúnmente mutados como son el. EGFR, TP53, KRAS, RB1 y CDKN2A. El estudio sugiere que con una sola prueba NGS estos pacientes pueden beneficiarse del tratamiento sugerido por las guías, detectándose mutaciones sensibilizadoras a EGFR TKI, inserciones del exón 20 de EGFR, fusión de ROS1, fusión de RET1, KRAS G12C, BRAF V600E y mutaciones de omisión del exón 14 de MET. En particular este estudio demostró la utilidad de NGS para identificar biomarcadores de nivel 1 y 2 definidos en la base de datos de OncoKB distintos de las mutaciones sensibilizadoras a EGFR TKI. En los casos sin mutación del EGFR se pudo detectar un objetivo clínicamente viable hasta en el 47,1% de los casos incluyendo una fusión de biomarcador ROS 1 de nivel 1. En Taiwán los casos sin mutación de EGFR se examinan mediante IHC para detectar sobreexpresión de ROS1. Aquellos con expresión de ROS1 por encima del umbral positivo se analizan posteriormente mediante hibridación in situ para detectar la fusión de ROS1. En este caso se informó un resultado de tinción inmunohistoquímica de ROS1 inferior al umbral lo que se consideró como un falso negativo cuando se obtuvo el resultado de NGS. Este ejemplo pudo demostrar el valor de una prueba NGS que permite identificar alteraciones genéticas con una sensibilidad superior en comparación con métodos tradicionales. En la cohorte, el análisis NGS identificó 1 mutación de nivel 1 (ROS1), 24 mutaciones de nivel 2 (mutaciones ERB2, mutación del exón 20 de EGFR, fusión RET, KRAS G12C, BRAF V600E, mutación omitida del exón. 20 de MET, amplificación de MET), 23 Además, en la cohorte se identificó un marcador de nivel 3, la fusión de NRG1. Según los resultados de NGS, el 46,1% de las alteraciones genéticas procesables (niveles 1 y 2) y potencialmente procesables (nivel 3) llevaron al paciente a recibir una terapia compatible. Entre los pacientes con inserciones del exón 20 de EGFR y mutaciones de ERBB2, el 75% y el 55,6 % recibieron terapias dirigidas que incluían afatinib, trastuzumab deruxtecan y mobocertinib (TAK-788), respectivamente. Uno de los dos pacientes con mutaciones BRAF V600E fue tratado con dabrafenib y trametinib. Los tumores con KRAS G12C, mutación con omisión del exón 14 de MET o fusión NRG1 se trataron dirigiéndose a los agentes sotorasib, capatinib y afatinib. La fusión ROS1 se detectó en un caso que no había sido identificado mediante IHC. Sin embargo, el paciente murió antes de que se obtuvieran los resultados de la NGS. El único paciente con fusión RET fue remitido a otro hospital para recibir tratamiento adicional. La detección de la amplificación de MET no condujo al uso de agentes dirigidos a MET En el estudio también se demostró que las enfermedades progresivas tenían más mutaciones concurrentes de nivel 1 y 2 en comparación con la enfermedad primaria (20,5% frente a 0% p:0,0093). Lo que indica que en comparación con la enfermedad primaria, las mutaciones objetivo podrían ser diversas y una prueba NGS puede ampliar las estrategias de tratamiento y ayudar a optimizar la terapia. Se demostró que se puede identificar una mutación clínicamente procesable y potencialmente procesable en el 75,3% de los pacientes con cáncer de pulmón no célula pequeña y que en el 46,1% de los casos el paciente se puede beneficiar del uso de una terapia dirigida. Volviendo a nuestro estudio, y pese las limitaciones evidentes que éste tiene, derivadas fundamentalmente de un tamaño muestral muy pequeño y de una cohorte de pacientes no representativa de la realidad del cáncer de pulmón en España, al ser la del estudio una población joven (edad media de 58 años) y formada mayoritariamente por mujer, este trabajo demuestra la utilidad de la secuenciación masiva a la hora de cambiar la actitud terapéutica en el cáncer de pulmón. Ya sea porque nos permite detectar alteraciones moleculares subsidiarias de ser tratadas mediante terapias dirigidas que no se pueden detectar mediante otras técnicas (como es el caso de las mutaciones de FGFR, amplificación de MET, mutaciones no habituales de BRAF,…), como demostrar que el cáncer de pulmón es una enfermedad dinámica, pues muchas 24 de alteraciones moleculares ocurren en el transcurso de la enfermedad como mecanismo de resistencia a los tratamientos recibidos. Además, estos tratamientos dirigidos se traducen en efectividad con respuesta sobre la enfermedad tumoral, siendo además la respuesta duradera en el tiempo. Todo ello acompaño de un perfil de seguridad muy bien tolerado por los pacientes, y mejor tolerado que otros tratamientos oncológicos clásico, como la quimioterapia, más inespecífica y tóxica. Aunque en este trabajo no nos hemos centrado en aspectos relacionados con los efectos adversos de los diferentes tratamientos, estos son radicalmente distintos a los de la quimioterapia, pues no producen tantas alteraciones hematológicas ni constitucionales, produciendo mayoritariamente efectos cutáneos (rash), digestivos (diarrea y aumento de transaminasas) o alteraciones oculares (miodesopsias). Es importante destacar que, en los pacientes con alteraciones moleculares conocidas, si no se detecta una alteración molecular tratable, la opción terapéutica esperada en pacientes ya tratados, sería recibir quimioterapia basada en platino. Pese a ello, la NGS no es todavía una técnica de rutina en la mayoría de los hospitales españoles, debido la complejidad de la propia técnica y a su coste. Por ello, siempre que sea posible, se debería de incentivar a los pacientes a participar en estrategias de secuenciación masiva, como es el proyecto ATLAS del Grupo Español de Cáncer de Pulmón (GECP). En este proyecto, se pretende realizar NGS a una base de pacientes españoles partiendo del Registro de Tumores Torácicos llevado a cabo por dicho grupo. Se realizará NGS a pacientes con NSCLC que hayan recibido tratamiento de 1ª línea de enfermedad avanzada o metastásica con el fin de determinar si el resultado de la NGS influye en la decisión terapéutica. Previamente a la NGS, se determinará una estrategia terapéutica y una vez realizada ésta y con el resultado disponible, se comparará la decisión posterior con el resultado molecular con la tomada previamente. Participan por el momento 20 centros españoles y se prevé que analicen 1000 muestras de pacientes (45). Este tipo de estrategias buscan que se puedan beneficiar de estás técnicas el mayor número de pacientes, independientemente del centro donde se traten y de su localización geográfica, pues como se ha repetido en este trabajo, afectan al tratamiento y a la evolución del cáncer de pulmón. Aunque todo esto en el momento actual, es una utopía para muchos centros españoles, europeos y de otras partes del mundo. Este trabajo puede ser el punto de partida para realizar otros trabajos de mayor envergadura con esta técnica de secuenciación molecular con mayores tamaños muestrales y en población con otras características, pues todo este tipo de estrategias forman parte de la llamada Medicina Personalizada: tratamientos dirigidos y específicos, que suponen una ventaja terapéutica en forma de respuesta y duración de respuesta, con mejor perfil de seguridad que otros tratamientos oncológicos, como la clásica quimioterapia. 25 Así, los avances en biomarcadores con terapias dirigidas han sido junto a la inmunoterapia, los grandes avances en el tratamiento del NSCLC que se han producido en la última década. avances que han modificada sustancialmente la evolución supervivencia a esta dramática enfermedad.