Desarrollo de métodos analíticos para el estudio en alimentos de fenómenos de oxidación lipídica y migración provenientes del material de envase

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología Desarrollo de Métodos Analíticos para el Estudio en Alimentos de Fenómenos de Oxidación Lipídica y Migración provenientes del Material de Envase Memoria para optar al grado de doctor ANA TERESA SANCHES SILVA Santiago de Compostela, Octubre 2004 III Dra. PILAR BERMEJO BARRERA, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMA: Que Dña Ana Teresa Sanches Silva presenta el trabajo titulado “DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL ESTUDIO EN ALIMENTOS DE FENÓMENOS DE OXIDACIÓN LIPÍDICA Y MIGRACIÓN PROVENIENTES DEL MATERIAL DE ENVASE” realizado bajo la dirección de la Dra. Julia López Hernández, del Dr. Perfecto Paseiro Losada y de la Dra. Maria Conceição Barreto Oliveira Castilho, en los laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Fdo. Dra. Dña. Pilar Bermejo Barrera Santiago de Compostela, Octubre 2004 V JULIA LÓPEZ HERNÁNDEZ, PERFECTO PASEIRO LOSADA Y MARIA CONCEIÇÃO BARRETO OLIVEIRA CASTILHO PROFESORES TITULARES DEL ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA AUTORIZAN a Dña Ana Teresa Sanches Silva a presentar la Tesis titulada “DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL ESTUDIO EN ALIMENTOS DE FENÓMENOS DE OXIDACIÓN LIPÍDICA Y MIGRACIÓN PROVENIENTES DEL MATERIAL DE ENVASE” para optar al Grado de Doctor, la cual ha sido realizada bajo nuestra dirección en los en laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela en Octubre de 2004. Fdo. Dra. Dña. Julia López Hernández Dr. D. Perfecto Paseiro Losada Fdo. Dra. Dña. Maria Conceição Barreto Oliveira Castilho Fdo. Dña. Ana Teresa Sanches Silva VII AGRADECIMIENTOS Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento, A los Directores de este trabajo, la Dra. Julia López Hernández, el Dr. Perfecto Paseiro Losada y la Dra. Maria Conceição Barreto Oliveira Castilho por abrirme la puerta hacia el mundo de la investigación y por todos los conocimientos científicos con los que han contribuido para la realización de esta memoria. Al Dr. Jesús Simal Lozano y a la Dra. María Asunción Lage Yusty por su atención y por haber contribuido a mi formación académica. A Mr. Ian Cooper por la oportunidad de realizar la estancia de tres meses en Inglaterra, su amabilidad, ayuda, consejos y confianza depositada en mí. A todos los compañeros y amigos que esta tesis me ha permitido conocer y con quien he compartido momentos inolvidables, sueños y que me han ayudado a enfrentar todas las dificultades. Gracias por su cariño a Raquel, María, Gonzalo, Ana, Sarah, Rocío y Laura. A Andrea, Diva, Cristina y Helena porque en todo momento habéis estado ahí, apoyándome, a pesar de la distancia. A Manoli, Iría, Helene y Mike por su sincera amistad, apoyo y compañía en momentos difíciles. Sobre todo a ti Susana, por todas las cosas que hemos vivido juntas durante tantos años de amistad y las que todavía nos quedan por vivir. A mi familia, por todo su amor, apoyo y cariño. A mis abuelos por que son los mejores maestros que una nieta puede tener. En particular a la memoria de mi abuelo, que el destino no permitió que estuviera presente a la hora de leer esta tesis, pero que estará siempre en mi corazón. VIII A mi tia, Adelaide que me considera como una hija. Gracias por su ayuda en las situaciones más delicadas y por su inestimable paciencia. A mi hermana por todo lo compartido, por el cariño que nos une y nuestra ilusión en el mañana. A mis padres por haber luchado toda su vida por sus hijas, por nuestro bien y por toda la confianza depositada en mí. Le agradezco de manera especial a mi madre el ser el aliciente para la realización de este proyecto y por la fuerza dada a la hora de principiar una nueva y muy especial etapa de mi vida. A la Comisíon Europea por la concesión del proyecto FOODMIGROSURE QLRT-2001-02390. Y por último a todas las personas que, directa o indirectamente, me han ayudado, poniendo a mi disposición sus conocimientos, consejos y experiencia, para la realización de esta tesis. IX A mis padres XVII ÍNDICE DE TABLAS I-Introducción II- Comparison between HPLC and GC methods for fatty acids identification and quantification in potato crisps Table II-1- Comparison of methods validation parameters. 51 Table II-2- Fatty acid content of potato crisps (g/100g ± SD; n = 4) determined by HPLC and GC methods. 52 III- Gas chromatographic determination of glycerides in potato crisps fried in different oils Table III-1- Analysis of 14 fatty acids in commercial potato crisps. 69 Table III-2- Classification of potato crisps brands in 3 groups according the major fatty acids present. 70 IV- Modified atmosphere packaging and temperature effect on potato crisps oxidation during storage Table IV-1- Analysis of 14 fatty acids in potato crisps stored under five atmospheres. 89 V- Study of the light effect on fatty acids of potato crisps using a gas chromatographic method Table V-1- FAMEs profile of profile crisps: A- Darkness; B- Light. 106 Table V-2- FAMEs content (g/100g sample) of potato crisps: A- Darkness; B- Lightness. 108 Table V-3- Identification of compounds generated in the oxidative process. 113 VI- Profiling flavour compounds of potato crisps during storage using solid phase microextraction Table VI-1- Comparison of compounds identified using liners with different internal diameters. 149 Table VI-2- Compounds identified and quantified (%) in oxidized potato crisps after SPME extraction. 152 Table VI-3- Aldehydes identified in oxidized potato crisps. 153 VII- Determination of hexanal as indicator of the lipídica oxidation state in potato crisps using gas chromatography and high performance liquid chromatography Table VII-1- Trials for extraction procedures optimisation of HPLC method. 188 XVIII Table VII-2- Derivatization- HPLC-UV extraction procedures. 189 VIII- Determination of triclosan in foodstuffs Table VIII-1- Parameters of calibration lines and detection limit for the determination of triclosan in foodstuffs. 217 Table VIII-2- Results for recovery and repeatability at 205 nm in three food matrices (n=6). 218 Table VIII-3- Results for recovery and repeatability at 234 nm in three food matrices (n=6). 218 Table VIII-4- Results for recovery and repeatability at 280 nm in four matrices (n=6). 219 XIX ÍNDICE DE FIGURAS I-Introducción Figure I-1- Mecanismo de la oxidación lipídica (autooxidación o enranciamiento oxidativo de los ácidos grasos). 18 Figure I-2- Sistema alimento/ envase/entorno. 20 Figure I-3- Patatas fritas. 26 II- Comparison between HPLC and GC methods for fatty acids identification and quantification in potato crisps Figure II-1- LC chromatogram with MS detection (SIR mode) for the m/z 281 (A), 279 (b) and 277 (C). Full scan mass spectra of linolenic (D), linoleic (E) and oleic (F) acids. 46 Figure II-2- HPLC chromatograms of fatty acids: A- Fresh potato crisps; B- Oxidized potato crisps. 48 Figure II-3- GC chromatograms of fatty acids: A- Fresh potato crisps; B- Oxidized potato crisps. 49 Figure II-4- Comparison of FA content (g/100g) of fresh and oxidized potato crisps. 53 III- Gas chromatographic determination of glycerides in potato crisps fried in different oils Figure III-1- Chromatograms of different potato crisps brands (A-H), this order corresponds to brands numbers from 1 to 8 of others figures. 1- C14: 0; 2- C14: 1; 3- C16: 0; 4- C16: 1; 5- C17: 0; 6- C17: 1; 7- C18: 0; 8- C18: 1; 9- C18: 2; 10- C18: 3; 11- C20: 0; 12- C20: 1; 13- C22: 0; 14- C24: 0; 66 Figure III-2- Potato crisps composition on fatty acids of different degrees of saturation. 68 Figure III-3- Fatty acids changes during 3 months storage on normal conditions: A-Brands 1-3, 6-8; B- Brands 4,5. 72 IV- Modified atmosphere packaging and temperature effect on potato crisps oxidation during storage Figure IV-1- Fatty acids profile of potato crisps stored under different atmospheres: A- Saturated FA; B- Monounsaturated FA; C- Polyunsaturated FA. 84 Figure IV-2- Polyunsaturated changes during a three month storage at room temperature and 40ºC. A- Potato crisps fried with olive oil; B- Potato crisps fried 86 XX with vegetable oil; C- Potato crisps with less 30% of fat; D- Potato crisps made from potato paste. Figure IV-3- GCFID chromatograms of potato crisps: A- Potato crisps fried with olive oil; B- Potato crisps fried with olive oil; C- Potato crisps with less 30% of fat; D- Potato crisps made from potato paste. 88 V- Study of the light effect on fatty acids of potato crisps using a gas chromatographic method Figure V-1- Fatty acid profile of potato crisps at two different storage conditions: lightness and darkness. 102 Figure V-2- GC-FID chromatograms of potato crisps FAMEs: A- Month 0; B1- Month 1 darkness; B2- Month 1 lightness; C1- Month 3 darkness; C2- Month 3 lightness. 103 Figure V-3- Polyunsaturated FAMEs changes along a three month storage of potato crisps. 105 Figure V-4- Change of FAMEs content during a three months storage: A- Light; B- Darkness. 109 Figure V-5- Contents of saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids: A- First month; B- Third month. 110 Figure V-6- GC-MS chromatograms. A- Standard; B- Darkness; C- Lightness. 111 Figure V-7- Chloro-, methane GC-MS spectrum. 121 Figure V-8- Acetic acid methyl ester GC-MS spectrum. 121 Figure V-9- Hexane GC-MS spectrum. 122 Figure V-10- Methyl-cyclopentane GC-MS spectrum. 122 Figure V-11- Benzene GC-MS spectrum 123 Figure V-12- 1, 3, 5- Cycloheptatriene GC-MS spectrum. 123 Figure V-13- Methyl-benzene GC-MS spectrum. 124 Figure V-14- Hexanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 124 Figure V-15- Ethyl-benzene GC-MS spectrum. 125 Figure V-16- Hexanal dimethyl acetal GC-MS spectrum. 125 Figure V-17- Benzaldehyde GC-MS spectrum. 126 Figure V-18- 2-Butenedioic acid (E)-dimethylester GC-MS spectrum. 126 Figure V-19- Heptanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 127 Figure V-20- Benzenemethanol GC-MS spectrum. 127 XXI Figure V-21- Heptane, 1, 1-dimethoxy GC-MS spectrum. 128 Figure V-22- Nonanal GC-MS spectrum. 128 Figure V-23- Octanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 129 Figure V-24- Benzaldehyde dimethyl acetal GC-MS spectrum. 129 Figure V-25- 1, 1- Dimethoxy-octane GC-MS spectrum. 130 Figure V-26- 1, 1- Dimethoxy dodecane GC-MS spectrum. 130 Figure V-27- Decanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 131 Figure V-28-Heptanedioic acid methyl ester GC-MS spectrum. 131 Figure V-29- Nonanoic acid, 9-oxo-methyl ester GC-MS spectrum. 132 Figure V-30- Octanedioic acid, dimethyl ester GC-MS spectrum. 132 Figure V-31- Trimethyl citrate GC-MS spectrum. 133 Figure V-32- Decanoic acid, 9-oxo, methyl ester GC-MS spectrum. 133 Figure V-33- Nonadioic acid dimethyl ester GC-MS spectrum. 134 Figure V-34- Decanedioic acid methyl ester GC-MS spectrum. 134 Figure V-35- Tetradecanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 135 Figure V-36- 7- Hexadecenoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 135 Figure V-37- 9- Hexadecenoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 136 Figure V-38- Hexadecanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. 136 VI- Profiling flavour compounds of potato crisps during storage using solid phase microextraction Figure VI-1- Normalized extraction efficiencies Nx measured for extractions with CAR-PDMS, PDMS-DVB, DVB-CAR-PDMS. 146 Figure VI-2- GC-MS chromatograms of potato crips flavor after extraction with a 2 mm i.d. liner. 148 Figure VI-3- Total ion current (TIC) mass chromatograms of oxidized potato crips. 151 Figure VI-4- Profiles (% area) of the major volatile families of oxidized potato crisps. 155 Figure VI-5- Acetic acid GC-MS spectrum. 163 Figure VI-6- 2H-pyran-2-one, tetrahydro-5,6-dimethyl-, trans-, GC-MS spectrum. 163 Figure VI-7- Tetrahydro-2-methyl-furan GC-MS spectrum. 164 Figure VI-8- Propanoic acid GC-MS spectrum. 164 XXII Figure VI-9- 3-Methyl butanal GC-MS spectrum. 165 Figure VI-10- 1-butanol, 3-methyl (imp.) GC-MS spectrum. 165 Figure VI-11- Hexanal GC-MS spectrum. 166 Figure VI-12- Heptanone GC-MS spectrum. 166 Figure VI-13- Heptanal GC-MS spectrum. 167 Figure VI-14- 1-Heptene-6-methyl GC-MS spectrum. 167 Figure VI-15- 2-Penthyl furan GC-MS spectrum. 168 Figure VI-16- Octanal GC-MS spectrum. 168 Figure VI-17- Heptanol GC-MS spectrum. 169 Figure VI-18- 3-Octen-2-one, (E), GC-MS spectrum. 169 Figure VI-19- 5-Ethyl didydro-2(3)-furanone GC-MS spectrum. 170 Figure VI-20- Heptanoic acid GC-MS spectrum 170 Figure VI-21- 1-Octanol GC-MS spectrum. 171 Figure VI-22- 2-Nonanone GC-MS spectrum. 171 Figure VI-23- 1,5-heptadiene, 3, 4-diol GC-MS spectrum. 172 Figure VI-24- Nonanal GC-MS spectrum. 172 Figure VI-25- 3-Nonen-2-one GC-MS spectrum. 173 Figure VI-26- Octanoic acid GC-MS spectrum. 173 Figure VI-27- 2-Decanone GC-MS spectrum. 174 Figure VI-28- 2-Octanoic acid GC-MS spectrum. 174 Figure VI-29- Decanal GC-MS spectrum. 175 Figure VI-30- Trans, transnona-2,4-dienal GC-MS spectrum. 175 Figure VI-31- 1-Nonanol GC-MS spectrum. 176 Figure VI-32- Nonanoic acid GC-MS spectrum. 176 Figure VI-33- Penthyl ester, hexanoic acid GC-MS spectrum. 177 Figure VI-34- 2-Undecenal GC-MS spectrum. 177 VII- Determination of hexanal as indicator of the lipídica oxidation state in potato crisps using gas chromatography and high performance liquid chromatography Figure VII-1- SPME-GC-MS procedure. 186 Figure VI-2- HPLC chromatograph 190 Figure VI-3- GC-MS chromatograms of potato crisps stored for one month: A- darkness; B- lightness and hexanal GC-MS spectra. 192 XXIII Figure VII-4- Derivatization reaction of hexanal with dinitrophenylhydrazine (DNPH). 193 Figure VII-5- HPLC-UV chromatograms of potato crisps stored for 3-months: A- darkness; B- lightness. 193 Figure VII-6- LC chromatograms with MS detection: A- Full scan mode for a hexanal standard solution and full scan mass spectra; B- SIR mode for the m/z 279 (1), 182 (2) and full scan mass spectra of correspondent potato crisps sample. 195 Figure VII-7– Hexanal content during an 1-month storage (SPME-GC). 196 Figure VII-8- Hexanal content during a 3-month storage period (Derivatization- HPLC). 197 VIII- Determination of triclosan in foodstuffs Figure VIII-1- Triclosan chemical structure. 204 Figure VIII-2- Three-dimensional plot of the UV-visible spectra of a triclosan standard solution of 1 µg/ml. 213 Figure VIII-3- Chromatograms of a triclosan standard solution of 1 µg/mL plotted at 205 nm, 235 nm and 280 nm. 214 Figure VIII-4- HPLC chromatogram with MS detection (SIM mode) for the m/z 288 (A). Full scan mass spectra of triclosan (B). 215 Figure VIII-5- GC chromatogram with MS detection (SIM mode) for the m/z 288 (A). Full scan mass spectra of triclosan (B). 216 Figure VIII-6- HPLC chromatogram of an orange juice (A), chicken breast (B) and Gouda cheese (C) samples spiked with triclosan (0,5 µg/mL). 219 XV ABREVIATURAS % Tanto por ciento d.i. Diámetro interno FAMEs Fatty acids methyl esters (Ésteres metílicos de ácidos grasos) FCM Food Contact Materials (Materiales en Contacto con Alimentos) FID Flame ionization detector (Detector de ionización de llama) HCl Ácido chlorídrico HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia de Líquidos de Alta Resolución) LC-MS Liquid chromatography- Mass Spectrometry (Cromatografia de gases-Espectrometria de Masas) NaOH Hidróxido de sodio Nx Extracción normalizada r2 Coeficiente de correlación rpm Revoluciones por minuto UV Ultravioleta No se incluyen las abreviaturas correspondientes al Sistema Internacional de Unidades (Decreto 1257/74, de 25 de abril de 1974, publicado en el BOE nº 110 de 08/5/1974). Resumen 6 Los resultados indicaron que ninguna marca podría ser considerada representativa de las patatas fritas en general. Sin embargo, las patatas presentan un perfil similar de ácidos grasos cuando son fritas en el mismo aceite. Las distintas marcas fueron clasificadas en tres grupos de acuerdo con el ácido graso mayoritario (ácido oleico, ácido linoleico y ácido palmítico) para a continuación identificar el tipo de aceite utilizado en el proceso de fritura de cada una. Las patatas fritas envasadas comercialmente se almacenaron a temperatura ambiente y en la oscuridad, para evaluar los cambios en el perfil durante tres meses. A lo largo de este periodo de tiempo, el contenido en ácidos grasos mayoritarios no sufrió cambios considerables. Aunque la oxidación lipídica ha sido ampliamente estudiada, son escasos los trabajos que han investigado el efecto de las condiciones de almacenamiento sobre este fenómeno. Por lo que en el cuarto capítulo, publicado en Analytica Chimica Acta (524, 2004, 185-189) se ha evaluado la influencia de la atmósfera del interior del envase y de la temperatura de almacenamiento en la oxidación de las patatas fritas. El perfil de los ésteres metílicos de los ácidos grasos (Fatty Acids Methyl Esters - FAMEs) ha sido estudiado por el método de cromatografía gaseosa propuesto anteriormente. Por un lado, han sido almacenadas a temperatura ambiente (~18- 20ºC) y a 40ºC, en la oscuridad, cuatro marcas de patatas, fritas en diferentes aceites, para evaluar el efecto de la temperatura sobre los cambios en el perfil de los FAMEs. Se ha verificado que a temperatura ambiente no hubo cambios significativos (P<0.05) en el perfil de ácidos grasos, mientras que a 40ºC se produjo una disminución significativa de los ácidos poliinsaturados para todos los tipos de patatas fritas, a excepción de las que presentaban un menor contenido en grasa. Resumen 7 Por otro lado, se almacenó un único tipo de patatas (fritas en aceite de oliva) a temperatura ambiente, en la oscuridad, bajo diferentes atmósferas: aire, vacío, absorbedor de oxígeno y nitrógeno. La atmósfera modificada ha sido utilizada con el propósito de saber cual era, entre las cuatro estudiadas, la más eficaz para evitar o retrasar la oxidación lipídica durante el almacenamiento. Los mejores resultados se obtuvieron con el absorbedor de oxígeno, ya que redujo a niveles insignificantes la concentración residual del mismo, retrasando los fenómenos oxidativos y aumentando la vida útil del alimento. Además, teniendo en cuenta que el mecanismo de oxidación lipídica se caracteriza por una cadena de reacciones donde los radicales libres atacan las posiciones adyacentes a los dobles enlaces, la luz es uno de los factores que contribuye a la formación de radicales libres. De esta forma la luz es otro importante parámetro a tener en cuenta cuando se evalúa la oxidación lipídica. En el quinto capítulo, el cual ha sido publicado en Analytica Chimica Acta 524 (2004) 191-200), se estudia la influencia de la luz en la inducción de la oxidación de las patatas fritas almacenadas. Los ácidos grasos son convertidos en sus FAMEs utilizando un método en el cual la extracción y metilación se producen simultáneamente, ahorrando trabajo y tiempo de análisis. El perfil de ácidos grasos de las patatas fritas almacenadas en la oscuridad no sufrió cambios considerables, mientras que las almacenadas en presencia de luz natural presentaron cambios muy significativos, principalmente en los ácidos grasos poliinsaturados. En relación a los contenidos en ésteres metílicos de ácidos grasos, se ha verificado una disminución en ambas condiciones de almacenamiento, aunque es más evidente para las muestras almacenadas en presencia de luz. Al cabo de los tres meses de almacenamiento se Resumen 8 detectó la aparición de nuevos compuestos, que muy posiblemente son responsables del olor y sabor desagradables. Estos, fueron identificados por cromatografía gaseosa con detector de masas y se verificó que la mayoría de los compuestos correspondían a ácidos grasos de cadena corta y aldehídos, es decir, productos resultantes de la oxidación lipídica. Se concluye por tanto, que la luz es un factor que contribuye de forma determinante en el proceso de oxidación lipídica. Con el objeto de identificar los compuestos volátiles, con bajo umbral olfativo, formados en el proceso de oxidación lipídica, se ha utilizado una novedosa técnica, la microextracción en fase sólida (SPME), que evita los inconvenientes de las técnicas más comunes (destilación, extracción con solventes, extracción con fluidos supercríticos, extracción en fase sólida, técnicas de espacio de cabeza estático y dinámico y trampas de materiales adsorbentes). Este trabajo corresponde al sexto capítulo que ha sido aceptado para su publicación en la revista Journal of Chromatography A. El método SPME permite la extracción y pre-concentración simultáneas y ha sido utilizado anteriormente en otras aplicaciones, además del estudio de los compuestos volátiles en alimentos. Se basa en la adsorción de los analitos directamente desde las muestras en una fibra cubierta de sílica fundida. A continuación los analitos son desorbidos en el inyector del cromatógrafo de gases y separados en una columna capilar. Como resultado se obtiene un cromatograma que se puede considerar como una “huella dactilar”, ya que permite determinar los compuestos responsables de los sabores y olores desagradables. La extracción ha sido llevada a cabo por el método de espacio de cabeza, durante 20 min y después de un tiempo de equilibrio de 5 min. A continuación, la fibra (DVB/PDMS/DVB) se introduce en el bloque de inyección durante 3 min a 260ºC. La separación se efectuó en una Resumen 9 columna DB-5 (30 m x 0.25 mm d.i., 1 µm de espesor) usando el siguiente programa de temperaturas: se inicia el programa a 40ºC durante 1 min, a continuación comienza el gradiente de temperatura a razón de 20ºC min -1 hasta alcanzar los 120ºC, manteniendo esta temperatura 8 min, posteriormente se continua con este gradiente hasta los 260ºC, temperatura que se mantiene por 2 min. La detección se llevó a cabo con el detector selectivo de masas en el modo barrido completo (full scan) en el rango de masas 35-290. Muchas de las sustancias formadas durante el proceso de oxidación lipídica fueron identificadas. La mayoría pertenece a las siguientes familias: cetonas, aldehídos, alcoholes y ácidos carboxílicos. En este trabajo se discuten las vías de formación de las sustancias identificadas. Estudiado el amplio rango de compuestos volátiles que se forman como consecuencia del proceso de oxidación lipídica, responsable del deterioro de los alimentos con alto contenido en grasas, se ha considerado la posibilidad de encontrar una sustancia que permitiera indicar el estado de oxidación de las patatas fritas. En el capítulo séptimo, publicado en la revista Journal of Chromatography A (1046 (2004) 75-81), se ha seleccionado el hexanal para evaluar su idoneidad como indicador de este proceso. Numerosos métodos de extracción y pre-concentración de volátiles se han utilizado en el pasado para determinar el hexanal. En este trabajo se han comparado tres de estos métodos: microextracción en fase sólida (SPME), extracción en fase sólida (SPE) con mini-columnas impregnadas con el agente derivatizante y derivatización directa de la muestra. Siendo este último el que presenta mayores ventajas. El método propuesto es sencillo y rápido. Se ha empleado como agente derivatizante la 2,4- dinitrofenilhidrazona (DNPH). A continuación, se ha llevado a cabo el Resumen 10 análisis cromatográfico (HPLC) empleando una columna Tracer Extrasil ODS2 5m (25 x 0.4 cm) y metanol -agua (75:25 v/v) como fase móvil a un flujo de 1.5 mL min -1 . El límite de detección para el hexanal ha sido de 9 ng ml -1 . En este trabajo también se presentan los parámetros de validación del método. Los resultados indicaron que en las patatas fritas almacenadas en la oscuridad no se produjeron cambios en el contenido de hexanal, mientras que en las almacenadas a la luz se produjo un aumento significativo del mismo. Se verifica así, que el hexanal es un buen indicador del proceso de oxidación lipídica ya que aumenta durante el almacenamiento indicando una alteración de las propiedades sensoriales. El octavo capítulo se ha dedicado al estudio de las migraciones de sustancias del material de envase hacía los alimentos. Durante las últimas décadas la preocupación por temas como la seguridad de los alimentos, la nutrición, los aditivos y el etiquetado del producto ha tenido una demanda creciente por parte de los consumidores. Dentro de este contexto, el envasado de los alimentos es una técnica fundamental para conservar la calidad de los mismos, reducir al mínimo su deterioro y limitar el uso de aditivos. Los materiales destinados a entrar en contacto con los alimentos (Food Contact Materials, FCM), como los plásticos, cumplen diversas funciones de gran importancia: contienen los alimentos, protegen del deterioro químico y físico, y proporcionan un medio práctico para informar a los consumidores sobre los productos. Asimismo, el envase preserva la forma y la textura del alimento que contiene, evita que pierda sabor o aroma, prolonga el tiempo de almacenamiento y regula el contenido de agua o humedad del alimento. En algunos casos, el material seleccionado puede llegar incluso a mejorar la calidad nutricional del producto. Resumen 11 Sin embargo hay una característica muy importante, y que se debe exigir a todos los envases, y es que no se produzcan interacciones con el contenido del mismo. Las modernas técnicas de envasado, con la utilización de nuevos materiales han solucionado muchos problemas de higiene pero plantean otros nuevos. Hay que asegurarse de que los materiales utilizados no sean tóxicos o susceptibles de interaccionar con los alimentos que van a contener. Por esto, un importante aspecto relacionado con la salud pública que preocupa a la Unión Europea es la exposición del consumidor a sustancias químicas indeseables en la dieta. Para caracterizar el fenómeno de la migración se distingue por un lado la migración global, que se refiere a la suma de todos los componentes del envase que se transfieren al alimento y por otro la migración específica, que representa la cantidad de una sustancia concreta e identificable presente en el material que se transfiere al alimento bajo ciertas condiciones. Por este motivo en la Unión Europea, existe legislación de obligado cumplimiento, que define los límites máximos de migración global y migración específica, para envases plásticos en contacto con alimentos. Las investigaciones científicas relacionadas con la migración potencial y con el comportamiento de los materiales de envasado han demostrado que la difusión y la migración pueden ser fenómenos previsibles y en principio descritos matemáticamente. Sin embargo, la escasa información relativa al comportamiento de muchas sustancias potencialmente migrantes y la creciente importancia que tiene la seguridad alimentaria, han suscitado el interés de la Unión Europea en lo referente a los materiales plásticos en contacto con alimentos. Entre los proyectos que la Unión Europea ha financiado relativos a este tema se encuentra el “Foodmigrosure”, que está siendo desarrollado en varios centros europeos de investigación. El principal objetivo de este proyecto es proporcionar Resumen 12 una herramienta novedosa y económica para la estimación de la exposición del consumidor a sustancias migrantes que provengan de los materiales en contacto con alimentos. Esta herramienta está basada en un modelo de migración físico-química que describe matemáticamente los procesos de migración desde los plásticos a alimentos reales bajo cualquier condición de contacto previsible. Incluido en este proyecto, que ha financiado la beca para la realización de esta tesis, ha sido desarrollado un método analítico, ya aceptada para su publicación en J. Separation Science, que permite evaluar los niveles de migración de triclosan, sustancia incluida en el plástico empleado para envasar alimentos. El triclosan es un agente antimicrobiano de amplio espectro, incorporado en una amplia gama de productos, incluyendo cosméticos, jabones, cremas dentales, desodorizantes y plásticos para la cocina y utensilios de mesa. Cuando es añadido a plásticos, previene el crecimiento de bacterias gram-negativas y gram-positivas en la superficie del material, aumentando la vida útil de los polímeros. Incluido en este contexto, el proyecto europeo Foodmigrosure ha seleccionado el triclosan como modelo para estudiar procesos de transporte y partición en alimentos. En el capítulo octavo se describe el procedimiento de extracción, así como el método de HPLC con detector UV usado para la cuantificación del triclosan. El método ha sido validado en cuatro alimentos seleccionados como representativos del amplio rango de complejidad de las matrices alimentarias: zumo de naranja (alimento acuoso, ácido y con contenido moderado en carbohidratos); pechuga de pollo (alimento sólido con elevado contenido en proteínas), queso gouda y patatas fritas (alimentos sólidos con elevado contenido en lípidos). Las muestras fueron preparadas según un procedimiento simple y rápido, que consistió en dos pasos. Primero, extracción con un solvente Resumen 13 orgánico (hexano) seguido por un paso de cambio de solvente. El extracto final se disuelve en acetonitrilo al 90%, un solvente compatible con la técnica cromatográfica HPLC. El método es capaz de detectar hasta 25 ng ml -1 de triclosan. La linearidad obtenida ha sido excelente (R 2 > 0.9999) lo que demuestra que el método es válido para la cuantificación de triclosan. Las recuperaciones del método, calculadas a tres niveles (0.5, 1 y 5 µg ml -1 ) han sido satisfactorias en todos los casos. La identidad de triclosan ha sido confirmada por cromatografía líquida y cromatografía de gases ambas acopladas a detectores de masas. I - INTRODUCCIÓN Introducción 22 fenómenos de corrosión, y disolución de los iones metálicos en el alimento, mientras que en los materiales cerámicos y vidrio se define como un proceso de disolución química o lixiviación que también produce la incorporación de elementos del material en el alimento. Con relación a los materiales poliméricos (plásticos y derivados celulósicos), la interacción se hace mediante la transferencia de masa a través de la matriz polimérica, produciendo la incorporación de los componentes, aditivos y residuos en los alimentos. La transferencia de masa es resultado de tres fenómenos: permeabilidad (paso de gases, vapores y radiaciones a través del material polimérico), sorción de componentes del alimento por el polímero y migración de compuestos del polímero al alimento. Los plásticos son materiales con propiedades visco-elásticas, formados por una mezcla de polímeros con otras sustancias. Los polímeros base son moléculas de elevado peso molecular, inertes y de solubilidad limitada, por lo que tienen también una migración limitada. Sin embargo, son los compuestos de bajo peso molecular que se encuentran en la matriz polimérica los que presentan mayor probabilidad de migrar. Estos incluyen: residuos (monómeros, oligómeros, disolventes) y coadyuvantes de la polimerización (catalizadores, aceleradores, inhibidores), aditivos, compuestos resultantes de la degradación del polímero y/o aditivos y sustancias adyacentes al material (adhesivos, barnices y tintas de impresión). En el presente trabajo se ha utilizado como principal alimento de estudio la patata frita envasada comercialmente. Introducción 23 I-3. La patata Después de los cereales convencionales (trigo, maíz y arroz) el cultivo de la patata es el más extendido en el mundo. Su fácil cultivo, excelente adaptabilidad y valor nutritivo, la hacen producto de mil recetas y guarnición de muchos platos. Este tubérculo americano entró a Europa por la puerta de atrás, para luego convertirse en uno de los alimentos más consumidos. I-3.1. Origen Botánicamente la patata pertenece a la familia de las Solanáceas (Solanaceae) grupo este en que se encuentra también el tabaco (otra planta americana), entre otras muchas. El nombre científico de la patata es Solanum tuberosum, su centro de origen se halla en el sur del Perú, Bolivia o norte de Argentina. Se señala como centro de origen de una especie cultivada a aquella localidad o región donde se encuentran los antecesores silvestres más directos y la mayor diversidad específica, es decir donde se encuentra la mayor cantidad de especies del mismo género, para este caso, el género Solanum. I-3.2. Su llegada a Europa Los conquistadores de América de regreso a España, por el año 1560, trajeron las patatas y después estas se dieron a conocer a toda Europa. Sin embargo, su aspecto exterior causaba repugnancia por lo que les cerraron las puertas de la cocina. Introducción 24 Un farmacéutico francés, Antoine Parmentier, se interesó por este tubérculo y descubrió su valor alimenticio, echando por tierra falsos prejuicios y propició su cultivo al descubrir su rendimiento y alto valor nutritivo. Este estudioso profetizó que las patatas con el tiempo se convertirían en el pan de los pobres y en manjar de los ricos y la historia le hizo justicia. A finales del siglo XVIII, la patata ya se conocía y se cultivaba en todas partes. En España como “patata”, en Finlandia como “peruna”, en Alemania como “kartoffel”, en Francia como “pomme de terre”, en Irlanda como “murphy”, en Italia como “tartuffolo” y en los Países Bajos como “aardappel” (manzana de la tierra). Sin embargo no se convirtió en un producto de consumo a gran escala en Europa hasta principios del siglo XIX. En el siglo XIX una plaga arrasó la cosecha de patata y trajo como consecuencia numerosas muertes por hambre. Nuevas técnicas de hibridación han dado, al cabo de los años, patatas más resistentes a los parásitos y enfermedades. Los nuevos métodos de cultivo, la selección de la tierra para la siembra, variedades, tecnologías, etc., han contribuido a mejorar los rendimientos de la producción, la forma, la piel, el gusto, los calibres y las cualidades culinarias. Hoy en día, iniciado el siglo XXI, la patata representa el 50% de toda la producción mundial de tubérculos y raíces. A la larga, el resultado fue el gran boom europeo de la patata, servida en todas sus presentaciones: frita, en purés, al vapor, horneada, salteada, en tortillas, etc. Introducción 25 I-3.3. Composición nutricional/Valor Nutritivo La patata es una hortaliza que debido a su composición es difícil de encuadrar, se encuentra entre el grupo de las verduras y el de los cereales. El valor calórico de la patata no es elevado, 75-80 Kcal./100g cuando están cocidas y hasta las 253 Kcal cuando están fritas. Entre los nutrientes que presenta se destacan: los glúcidos (20%); prótidos (2%); fibra (2%) y agua (80%). La principal propiedad de la patata es su contenido en almidón. Casi no tiene materia grasa. Al ser consumida como alimento básico también aporta una proporción alta de folato, vitamina C (sobre todo cuando es de nueva cosecha), tiamina (B 1 ), potasio y hierro, a la vez que contribuye de manera importante a la ingesta de proteínas. De hecho, si se consume suficiente cantidad de patatas como para satisfacer las necesidades energéticas se obtendrá un volumen equilibrado de nutrientes, con la excepción de las vitaminas liposolubles. Entre los fitoquímicos presentes en las patatas están las cumarinas y antoxantinas. Debe evitarse el consumo de patatas de color verdoso, ya que contienen glicoalcaloides tóxicos. I-3.4. La patata Frita En la dieta humana, la patata puede ser preparada varias formas. La opción más sana y mejor de tomar patata es asada o cocida. La patata frita aumenta el porcentaje de grasa y es más difícil de digerir, aún así, es muy sabrosa, pero no siempre recomendable, y más si lleva mucha sal, ya que aumenta la absorción de los líquidos. Introducción 26 Figura I-3 – Patatas fritas: (imagen tomada de la página web: www.racetothetop.org/.../ module7/page_1.htm) Las patatas fritas fueron cocinadas por primera vez en 1853 por un cocinero indo-americano llamado George Crum, tras ser devueltas a cocina varias veces por uno de sus clientes más exigentes, por lo que decidió hacer freír las patatas más finas hasta la fecha, en aceite. Este exigente magnate ferroviario llamado Cornelius Vanderbilt, quedó maravillado de la finura de la patata y del exquisito manjar. Las patatas fueron todo un éxito. La industria de la comida rápida que incluye patatas en su elaboración, ha experimentado un gran auge entre los países en desarrollo, por lo que se ha ampliado su consumo. Lo cierto es que las patatas fritas de bolsa son hoy en día uno de los snacks más vendidos en todo el mundo. Existen infinidad de sabores, formas, texturas y calidades. De ahí que la presente tesis haya seleccionado como principal alimento de estudio la patata frita, principalmente debido a tres características: su elevado consumo, bajo riesgo de contaminación microbiológica y elevado contenido en grasa (lo que influye en el proceso de oxidación lipídica). Introducción 27 I.4- Objetivos del trabajo 1- Optimización, validación y aplicación de métodos analíticos para la determinación de componentes nutritivos y organolépticos, relacionados con procesos de oxidación lipídica y de migración desde el material de envase. 2- Evaluación de la influencia de las condiciones de envasado/almacenamiento en la alteración o aparición de dichos compuestos. La presente tesis dedica la mayoría de sus capítulos al estudio de la influencia de las condiciones del almacenamiento del producto envasado (ej.: tiempo, luz, atmósfera, temperatura) en componentes nutritivos susceptibles a la oxidación lipídica (ácidos grasos), así como al estudio del perfil aromático obtenido en distintas condiciones de almacenamiento y a la búsqueda de una herramienta analítica que permita la detección precoz y la evaluación de la extensión de los procesos de oxidación lipídica. El último capítulo se ha dedicado al desarrollo de un método analítico que permite evaluar los niveles de migración de un antibacteriano (triclosan) incluido en el plástico para envasar alimentos. Este trabajo forma parte del proyecto Foodmigrosure, el cual ha financiado la beca para la realización de la esta tesis. Los resultados del presente estudio han sido objeto de una serie de artículos publicados en revistas internacionales y comunicaciones a congresos internacionales. Introducción 28 Artículos en revistas: 1- “Gas Chromatographic Determination of Glycerides in Potato Crisps Fried in Different Oils”. Chromatographia, 58 (2003) 1-5. 2- “Comparison Between HPLC and GC Methods For Fatty Acids Identification and Quantification in Potato Crisps”. Journal of Chromatography A, 1032 (2004) 7-15. 3- “Modified Atmosphere Packaging and Temperature Effect on Potato Crisps Oxidation During Storage”. Analytica Chimica Acta, 524 (2004) 185-189. 4- “Study of the Light Effect on Fatty Acids of Potato Crisps Using a Gas Chromatographic Method”. Analytica Chimica Acta, 524 (2004) 191- 200. 5- “Profiling Flavor Compounds of Potato Crisps During Storage Using Solid Phase Microextraction”. Journal of Chromatography A, in press (aceptado para publicación el 4 de mayo de 2004). 6- “Determination of Hexanal as Indicator of the Lipidic Oxidation State in Potato Crisps using Gas Chromatography and High Performance Liquid Chromatography”. Journal of Chromatography A, 1046 (2004) 75-81. 7- “Determination of Triclosan in Foodstuffs”, Journal of Separation Science in press. Introducción 29 Comunicaciones a congresos: 1- “Gas Chromatographic Determination of Glycerides in Potato Crisps Fried in Different Oils”. International Symposium on Separation and Characterization of Natural and Synthetic Macromolecules, Amsterdam, Holanda, 5-7 Febrero, 2003. 2- “Comparison Between HPLC and GC Methods For Fatty Acids Identification and Quantification in Potato Crisps”. 27th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, Nice, Francia, 15-19 Junio 2003. 3- “Modified Atmosphere Packaging and Temperature Effect on Potato Crisps Oxidation During Storage”. VII International Symposium on Analytical Methodology in the Environmental Field, XII Meeting of the Spanish Society of Analytical Chemistry (VIII ISAMEF/ SEQA 2003), A Coruña, España, 21-24 Octubre, 2003. 4- “Study of the Light Effect on Fatty Acids of Potato Crisps Using a Gas Chromatographic Method”. VII International Symposium on Analytical Methodology in the Environmental Field, XII Meeting of the Spanish Society of Analytical Chemistry (VIII ISAMEF/ SEQA 2003), A Coruña, España, 21-24 Octubre, 2003. 5- “Determination of Hexanal as Indicator of the Lipidic Oxidation State in Potato Crisps using Gas Chromatography and High Performance Liquid Chromatography”. VII International Symposium on Analytical Methodology in the Environmental Field, XII Meeting of the Spanish Society of Analytical Chemistry (VIII ISAMEF/ SEQA 2003), A Coruña, España, 21-24 Octubre, 2003. 6- “Identification of Substances Formed During Lipid Oxidation by GCMS”. Congresso Nacional dos Farmacêuticos 2003, Lisboa, Portugal, 27- 29 Noviembre, 2003. Introducción 30 7- “Profiling Flavor Compounds of Potato Crisps During Storage Using Solid Phase Microextraction”. Eighth International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers, Brugge, Belgica, 4-6 Febrero, 2004. 8- “Determination of Triclosan in Foodstuffs”. Eighth International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers, Brugge, Belgica, 4-6 Febrero, 2004. 9- “Food Contact Plastic Materials: Development of Analytical Methods and Study of Migration Kinetics”. Congreso Internacional de Seguridad Alimentaria, Reynosa, México, 13-15 Octubre, 2004. Introducción 31 Bibliografía [1] T. Richardson, J. W. Finley, Chemical Changes in Food During Processing. AVI Publishing Company, INC, Westport, Connecticut, 1985. [2] J. B. Gutierrez, Ciencia Bromatológica. Ed. Diaz de Santos, Madrid, España, 2000. [3] G. L. Robertson, Food Packaging, Marcel Dekker, New Cork, EEUU, 1993. [4] R. Catalá, R. Gavara, Migración de componentes y residuos de envases en contacto con alimentos, Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Valencia, España, 2002. [5] J. M. Verdú, Nutrición y Alimentación Humana. Ed. Ergon, Madrid, España, 2002 . HPLC/GC 38 II-2. Experimental II-2.1. Sampling Potato crisps fried in olive oil, according to the package information, were bought in a supermarket. GC and HPLC analysis were performed on the same day: immediately after being purchased (fresh potato crisps) and following a three-month storage period exposed to natural light (oxidized potato crisps). Packages were sealed under a nitrogen atmosphere after each analysis to avoid the oxidative effect of air. II-2.2. Reagents and Analytical Standards All reagents were of analytical quality. Methanol, ethanol, HCl, nhexane, acetonitrile and sodium hydroxide were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Toluene and sodium sulfate were from Sigma Aldrich (Madrid, Spain). Ultrapure water was prepared using a Milli-Q filter system (Millipore, Bedford, MA, EEUU). The analytical standards: oleic acid (18:1 n-9); linoleic acid (18:2 n-9, 12); linolenic acid (18:3 n-9, 12, 15) and their methyl esters were from Sigma Aldrich (Madrid, Spain). Stock solutions for HPLC analysis were prepared in methanol, while for GC analysis were diluted in hexane. All were stored at 4ºC and remained stable for at least two weeks. Methanolic HCl was prepared by slow addition of HCl to methanol (5:95, v/v), with constant stirring. 0.5 N NaOH in ethanol/water (94:4, v/v) was obtained by dissolving the NaOH in water and then diluting with ethanol until the desired concentration was achieved. HPLC/GC 39 II-2.3. Calibration curves A standard mixture of the fatty acids was prepared in methanol for HPLC analysis and in hexane for GC analysis. The concentration of the standard solution for the HPLC method was: 5.7 (18:1 n-9), 3.2 (18:2 n- 9,12), 0.116 (18:3 n-9, 12, 15) mg /100 ml while for the GC analysis (expressed as mg / 50 ml) was: 250.0; 150.0 and 10.0 for 18:1 n-9, 18:2 n- 9,12 and 18:3 n-9, 12, 15, respectively. Both standard mixtures had the sample fatty acid profile. Calibration curves were constructed using diluted solutions with a range concentration such that the concentration of fatty acids in the sample lay in the middle of the range. The curves consisted of a plot of peak area vs. concentration. II-2.4. Sample Preparation II-2.4.1. HPLC Samples were prepared according to a modification of the method described by Li et al [6]. In a 15 ml glass tube, about 0.1 g of potato crisps was added to 1 ml 0.5N NaOH. The mixture was centrifuged (Eba 12 centrifuge, Hettich, Kirchlengern, Germany) at 5500 rpm for 5 min after vortex-mixing (Autovortex SA6, Stuart Scientific, Redhill, UK) and one night at room temperature. The supernatant was transferred to another tube and 1 ml 0.6 N HCl was added. After 1 min on vortex, the solution was allowed to settle for 30 min. Afterwards, samples were evaporated to dryness under a N 2 stream. Residue was re-dissolved with 10 ml of methanol and 20 µl of the solution HPLC/GC 40 were analyzed by HPLC. Samples were stored at 4ºC in the dark until analysed. II-2.4.2. GC The method was similar to the one reported previously by Sukhija and Palmquist [11]. It presented a single step that combines lipid extraction and transesterification. 2 ml of toluene and 3 ml of freshly prepared methanolic HCl was added to 0.1 g of sample. After 2 h in a water bath (70ºC) under a nitrogen atmosphere, 5 ml of a 6% K 2 CO 3 solution and 1 ml of toluene were added to the tubes and it content mixed in a vortex. Following a centrifugation at 1100 rpm (5 min), the organic phase was dried with sodium sulfate and filtered by a Millipore 0.45 µm. A 1 µl aliquot was injected into the GC. Prior to injection, the samples were maintained at 4ºC in the dark. Both sample preparation procedures were performed in a light protected laboratory with the temperature maintained under control. II-2.5. Apparatus and Chromatographic conditions II- 2.5.1. HPLC-UV The HPLC system (Hewlett-Packard, CA, USA) equipped with a HP 1100 quaternary pump, an HP 1100 degassing device, a 20 µl injection loop (Rheodyne, Cotati, CA), a column thermostatting system (Spectra- Physics 8792, San Jose, CA, USA), an UV HP1100 detector set at 195 nm and HP ChemStation® chromatography software. Chromatographic separation was performed with a Tracer Extrasil ODS2 column (25 x 0.4 cm I.D., 5 µm particle size) at 60ºC. Mobile HPLC/GC 41 phases were: A- acetonitrile/water (25:75, v/v); B- acetonitrile. 0.12% of acetic acid was added to both mobile phases. Mobile phases were filtered prior to use. Gradient program started with 50% of each mobile phase and changed linearly to 15%A/85% B within 6 min, then returned to initial proportion until 20 min. Flow rate was 1.2 ml/min until 6 min and then increased to 2.0 ml/min to allow a correct column cleaning. Fatty acid identification was carried out not only on basis of retention time but also with respect to mass spectra (acquired by LC-MS) and UV spectra (acquired by spectrophotometry). II-2.5.2. LC-MS A Spectra Physics series P200 liquid chromatograph equipped with a Rheodyne loop (50 µl) and a mass detector (Fisons VG Platform) (VG Biotech, Altrincham, UK) was used to identify fatty acids. Single-ion recording (SIR) was obtained every second with a scan delay time of 0.01s. The column and mobile phase was the same as in HPLC-UV analysis (flow rate 1ml/min). Detector operated under the following conditions: negative atmospheric pressure chemical ionization mode (APCI-); probe temperature 500ºC; source temperature 130ºC, cone voltage -30 V, electron multiplier voltage 700 V, drying gas nitrogen at 425 l/h, APCI sheet gas nitrogen at 175 l/h. II-2.5.3. UV-visible spectrometry A UV scan from 190 nm to 400 nm was performed with a Cary 3E UV-Visible double - beam spectrophotometer. The software Cary Win UV was used for data acquisition. HPLC/GC 42 II-2.5.4. GC-FID A Fisons 8000 series gas chromatograph comprised with a flame ionization detector (FID 80) and an AS 800 autosampler (Manchester, UK) was used. The GC was fitted with a fused silica capillary column with polyethyleneglycol phase Supelcowax 10 (30 m x 0.32 mm I.D. x 0.25 µm film thickness) (Supelco, Madrid, Spain). A 50 cm desactivated fused silica column (0.32 mm I.D.) was used to protect the analytical column. Helium was used as carrier gas with a flow rate of 1.2 ml/min. The injection port and detector temperatures were set at 240ºC and 260ºC respectively. The column temperature was programmed as follows: 1 min at 160ºC, ramp at 3.5ºC/min to 230ºC, isothermal at 230ºC for 14 min. Injection was performed in the split mode with a split ratio of 1:30. The software Chrom-Card for windows® (version 1.18) was used for data processing. II-2.5.5. Statistical analysis Data were statistically analysed using the SPSS software package, (version 11.0). Differences between HPLC and GC and among potato crisps were determined using t-test for related and independent samples (P < 0.05). II-3. Results and Discussion II-3.1. Sample Preparation The method developed to prepare samples for RP-HPLC analysis avoids derivatization, this way it is possible to use free fatty acids for HPLC/GC 43 further analysis or purposes. The first step uses 0.5 N sodium hydroxide in a solution of ethanol/water (94:4, v/v) as saponification reagent. Ethanol dissolves the sodium salts of fatty acids. The second step, extraction by 0.6 N HCl, separates fatty acids from salts and other water-soluble impurities, avoiding HPLC column contamination. Finally, FA are transferred from their sodium salt to their free acid forms (dissolved in methanol) [6]. Czauderna et al [3] used a similar sample preparation procedure, which employed 2 M NaOH and 4 M HCl. However, this method requires subsequent derivatization with dibromacetophenone in the presence of triethylamine. In the past, the preparation of food samples prior to GC-FID analysis consisted in two steps: lipid extraction and transesterification. Lipid extraction was usually carried out with mixtures of organic solvents like chloroform-methanol (Bligh and Dyer and Folch et al procedures) or automatically with Soxhlet or Goldfish apparatus [12]. These approaches are laborious, time consuming, expensive and require large sample amounts and large reagent volumes [13, 14]. In order of overcome these main drawbacks, new methods have been developed such as “in situ” procedures [15-17]. These consist of one single step for extraction and methylation (which reduces analysis time, cost and work) as described in the experimental section. Methyl esters can be prepared with alkaline, acid or alkaline and acid catalysis as in the American Oil Chemists’ Society (AOCS) official method [4, 18]. Diazomethane can also be used for free fatty acid although its short shelf life and the handling care required are a major limitation [13]. Despite advantages of alkaline catalysts (e.g. short reaction time and room temperature) an acid catalyst has been selected (methanolic HPLC/GC 44 HCl) since this reagent derivatizes free and linked acids with little risk of saponification [13]. Ulberth et al [17] studied the influence of water in the transesterification reaction and concluded that a moisture content of 40.7% did not interfere with the process. Thus, potato crisp samples do not represent a problem. Toluene was used as solvent because of its effectiveness and toxicity when compared to other solvents (benzene, hexane, tetrahydrofuran and chloroform) [13]. The amount of sample used is a critical factor during the extraction [14]. If the sample exceeds the capacity of the solvent, false contents may be determined. Moreover, a sample too small in size may yield a considerable variation coefficient. In order to avoid these problems distinct quantities of sample where tested (0.1-0.5 g). 0.1 g was considered to be the most suitable amount to produce quantitative results. II-3.2. Chromatographic analysis During method development several chromatographic conditions were assayed in order to optimize the mobile phase, flow rate and column temperature. Various mobile phases initial proportions (A = acetonitrile/water; B = acetonitrile) were tested: 100%A/0%B; 75%A/25%B; 50%A/50%B; 0%A/100%B. The best results were obtained starting the mobile phase gradient with 50% A/50% B. Acetonitrile was used instead of methanol because several authors have reported that acetonitrile reduces retention time of unsaturated components and seems to be more effective on account of its lower viscosity [19]. HPLC/GC 45 Glacial acetic acid was added to both mobiles phases to suppress the ionization of fatty acids [19]. Moreover, it is easily removed by evaporation when fatty acid fractions are further used. Carboxylic group absorbance of acetic acid does not affect the chromatogram [6]. Several flow rates were tried between 0.8 and 2 ml/min. Column was thermostatted in a range of temperature from 25ºC to 65ºC at 10ºC intervals. The optimal conditions for achieving a good chromatographic resolution were 1.2 ml/min and 60ºC. As been reported by Li et al the selected wavelength for HPLC-UV was 195 nm [6]. The highest absorbance found when an UV scanning was carried out using a FA standard was 205 nm. Nevertheless, 195 nm was selected in order to minimize possible interferences. In preliminary studies carried out in this lab, the GC method was optimized assaying several split ratios (1:30; 1:50 and 1:100), and the effect of a pre-column in the peaks resolution was also evaluated. With respect to peaks identification, in GC method FAME (fatty acid methyl esters) were identified only by comparing of their retention time (t r ) with standards, whereas in HPLC method a confirmation by LCMS (figure II-1) and UV spectrophotometry was necessary because different FA may be eluted simultaneously [6]. In order to achieve the best conditions in LC-MS, several assays were performed. SIR mode was selected due to a higher sensitivity in relation to full scan mode (figure II-1.A-C). Several probe temperatures (200, 350 and 500ºC) and cone voltages (10, 30 and 60V) were evaluated. Best response was achieved with 500ºC and 30V. Characteristic masses (m/z) were 281, 279 and 277 for oleic, linoleic and linolenic acids, respectively (figure II-1.D-F). They corresponded to the ionization form [M-H] - of each molecule. According to Baty et al [9], one of the difficulties of FA analysis by HPLC is the separation of FA with the same HPLC/GC 46 effective carbon number (like palmitoleic, linoleic and myristic acids). However, this does not affect current analysis once the three FA analyzed belong to the same carbon series. Thus, peaks were fully resolved, sharp and without shoulders. Figure II-1 - LC chromatogram with MS detection (SIR mode) for the m/z 281 (A), 279 (B) and 277 (C). Full scan mass spectra of linolenic (D), linoleic (E) and oleic (F) acids. A B C HPLC/GC 47 F % Relative Abundance m/z D E F Figure II-1 (continuation) HPLC/GC 54 The HPLC method is sensitive and precise and may be considered as a good alternative analytical tool for the routine determination of 18:1 n-9, 18:2 n-9, 12 and 18:3 n-9, 12, 15 in potato crisps. However, when a more complete study of FA profile is required, GC is a more suitable method, because HPLC may present peaks co-elution. HPLC/GC 55 References [1] L. Masson, C. Urra, M. Izaaurieta, J. Ortiz, P. Robert, N. Romero, E. Witting, Grasas y Aceites 52 (2001) 175. [2] J. B. Gutierrez, Ciencia Bromatologica. Ed. Diaz de Santos, Madrid, Spain, 2000, p 300. [3] M. Czauderna, J. Kowalczyk, J. Chromatogr. B 760 (2001) 165. [4] R. Aparicio, R. Aparicio-Ruiz, J. Chromatography A, 881 (2000) 93 [5] E. W. Hammond, Trends in Analytical Chemistry 8 (1989) 308. [6] Z. Li, T. Gu, B. Kelder, J. J. Kopchick, Chromatographia 54 (2001) 463. [7] A. A. Carelli, A. Cert, J. of Chromatogr. 630 (1993) 213. [8] S. M. 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The profiles were analysed and compared, with regard to 14 fatty acids, by use of a gas chromatographic method. Results showed that the fatty acid profile is quite variable among brands and depends on the type of oil used in the frying process. To provide a means of identifying the frying oil correctly, brands were classified into three groups depending on the main fatty acid present. After the first analysis samples were stored at room temperature in the dark and analysed again 1 and 3 months later. Keywords: Gas chromatography; Lipid oxidation; Fatty acid profile; Potato crisps. Fatty Acids Profile in Crisps 60 III-1. Introduction Potato crisps are one of the most widely consumed snack foods [1]. Their high lipid content makes them very susceptible to oxidation, which results in loss of functional, sensory, and nutritive value, and affects the safety of the fried foods [2, 3]. By minimizing oxidation, therefore, shelf life can be improved [4, 5]. The industrial frying process occurs at high temperature for a short time and results in a crunchy golden product with a pleasant flavour which is improved by addition of a small amount of salt. The frying process has several disadvantages, however; it causes hydrolytic degradation (owing to water loss); oxidative degradation (owing to reaction of atmospheric oxygen with lipid molecules at the surface), and thermal degradation (because of the high temperature). This last problem is important because it is results in a decrease in nutritive value, because of the loss of polyunsaturated fatty acids (PUFA), which are essential in the human diet [6–9]. The most important factor affecting the oxidation of fried food is the type of oil used for frying, to be specific its fatty acid composition. Indeed, the fatty acid profile found in the frying oil is quite similar to that in the potato crisps, disregarding slight changes occurring during the frying process. By analysis of the fatty acid profile of potato crisps it is, therefore, possible to determine the type of oil used for frying. Fatty acid analysis has evolved remarkably in the last few decades. Many methods have been developed, for example gravimetric [10–12], IR spectrophotometric [13], volumetric [14], and colorimetric [15] methods. Nowadays, however, chromatographic methods are most commonly used [16] - HPLC [17, 18] and, especially, GC with flame ionization detection (FID) [19–24]. Several methods for preparation of samples for GC–FID Fatty Acids Profile in Crisps 61 analysis are reported in the literature. Classical methods based on lipid extraction with chloroform–methanol, in Soxhlet or Goldfisch apparatus, or saponification with KOH followed by transesterification to form FAME, and subsequent GC, are not easy tasks. These approaches are time-consuming, laborious, cumbersome, expensive, require handling of highly toxic solvents (chloroform), and are susceptible to errors resulting from incomplete removal of solvents and peroxidation of polyunsaturated FA during extraction and/or ester preparation [23, 25, 26]. The need for a rapid, economic, and easy method that could at least partly overcome these deficiencies has prompted the development of new techniques. The most outstanding of these involve use of microwaves and supercritical fluids (SF) to perform lipid extraction, and ‘in situ’ procedures. This report describes continued efforts to obtain more information about the composition and stability of fried food [27–39]. The purpose of the work was to apply an ‘in situ’ procedure (combining extraction and methylation in one step) for determination of glycerides in potato crisps, by gas chromatography, after conversion into fatty acids. The kind of oil used is identified on the basis of the main fatty acid and other characteristic fatty acids present. Storage stability was evaluated under normal storage conditions and after three months. III-2. Experimental III-2.1. Reagents and Lipid Standards Myristic acid methyl ester (C 14:0 ), myristoleic acid methyl ester (C 14:1 ), palmitic acid methyl ester (C 16:0 ), palmitoleic acid methyl ester (C 16:1 ), heptadecanoic acid methyl ester (C 17:0 ), heptadecenoic acid methyl ester (C 17:1 ), stearic acid methyl ester (C 18:0 ), oleic acid methyl ester (C Fatty Acids Profile in Crisps 62 18:1 ), linoleic acid methyl ester (C 18:2 ), linolenic acid methyl ester (C 18:3 ), arachidic acid methyl ester (C 20:0 ), eicosenoic acid methyl ester (C 20:1 ), behenic acid methyl ester (C 22:0 ), and lignoceric acid methyl ester (C 24:0 ) were from Sigma (Madrid, Spain). Methanol, HCl, and n-hexane were from Merck (Germany). Toluene was from Sigma Aldrich (EEUU). All reagents were analytical grade. III-2.2. Sampling Potato crisps were purchased from a local supermarket. After immediate analysis they were stored in the dark, at room temperature (20 ± 2ºC), and analysed again 1 and 3 months later (before expiry of the date by which they should have been consumed). Each sample was analysed by duplicate by GC. After each analysis the potato crisp package was sealed under a nitrogen atmosphere to minimize the effect of oxygen on the oxidative process. III-2.3. One-Step Methylation–Extraction Method Each sample (approx. 0.5 g) was weighed in 15-ml Pyrex tubes with PTFE-lined screw caps and toluene (2 ml) and 5% methanolic HCl (freshly prepared, 3 ml) were added. After filling the vial headspace with nitrogen and carefully mixing the contents the tubes were placed in a water bath (70ºC) for 2 h. K 2 CO 3 solution (6%, 5 ml) and toluene (1 ml) were added after cooling the tubes. The tubes were vortex-mixed and immediately centrifuged at 1100 rpm for 5 min (Hettich) to separate the phases. The organic phase was dried with a small quantity of Na 2 SO 4 , filtered through a 0.45-µm Millipore filter, and 1 µL was injected into the GC–FID. Fatty Acids Profile in Crisps 63 III-2.4. Gas Chromatographic Analysis Gas chromatography was performed with a Fisons (Manchester, UK) 8000 series instrument equipped with a flame ionisation detector (FID; 260ºC), an AS 800 auto sampler and a split–splitless injector. Fatty acid methyl esters (FAME) were separated on a 30 m, 0.32 mm i.d., 0.25 µm film thickness Supelcowax 10 column from Supelco (Madrid, Spain). Helium was used as carrier gas; the flow rate was 1.2 ml min -1 . The injector temperature was 240 ºC and the split ratio was 1:30 (this was selected after investigation of 1:50 and 1:100 split ratios). The column temperature was held at 160 ºC for 1 min during injection then increased at 3.5 ºC min -1 to 230 ºC which was held for 14 min. Because systematic use of this column resulted, after analysis of approximately 60 samples, in loss of resolution (calculated for C18:0 and C18:1), a 50-cm precolumn of 0.32 mm i.d. deactivated fused silica was used between the injector and the analytical column, with the aim of improving column life. Use of the precolumn also resulted in increased resolution. The software used to process peak areas was Chrom-Card for Windows (version 1.18) and FAME from samples were identified by comparison of their retention times (t R ) with those of standards. Statistical analysis of results was performed by use of SPSS for Windows (version 11.0). III-3. Results and Discussion III-3.1. Sample Preparation The ‘in situ’ procedure described in this paper saves time, effort, and cost. It requires minimal amounts of sample and reduces the use of 70 Table III-2 - Classification of potato crisps brands in 3 groups according the major fatty acid present. Brands 3, 4, and 5 formed a second group; in these the major fatty acid was C 18:2 and the frying medium could have been sunflower oil or soybean oil [44, 45]. By determination of the amount of C 18:3 it was possible to determine which of these two oils was used for each brand. In brands 4 and 5 the amount of C 18:3 was approximately 7% whereas in brand 3 it was lower than 1%; it is therefore possible to conclude that the frying medium used for brands 4 and 5 (with small differences between them) was soybean oil whereas that used for brand 3 was sunflower oil. Finally, group 3 comprised brands 6 and 7 in which the major fatty acid was C 16:0 , a saturated fatty acid associated with the health hazard of cardiovascular disease. The FAME profile is indicative of palm oil as frying medium [44, 45]. The lack of information on the crisp packages is quite amazing. In general, only for potato crisps fried in olive oil is detailed information given about the kind of oil used; for others it is limited to ‘‘vegetable oil’’ or ‘‘mixture of fats’’. According with many authors, potato crisps fried in oils rich in unsaturated fatty acids have a better impact on human health by helping to reduce blood cholesterol and LDL levels and contributing to the development of biological membranes, although a diet rich in Group Brand Major fatty acid 1 1, 2, 8 C 18:1 2 3, 4, 5 C 18:2 3 6, 7 C 16:0 71 polyunsaturated fatty acids can also reduce HDL, which protect against cardiovascular disease and recent studies have revealed that monounsaturated fats do not reduce HDL but increase them and also increase apolipoprotein A-I, which has an important antiatherogenic role. A diet containing monounsaturated fats can therefore be recommended for prevention of cardiovascular problems [45, 47]. The outcome of this work is, therefore, that brands 1 and 2, fried in olive oil, have the best effect on human health, because of the high C 18:1 content. Olive oil also contains natural polyphenols which can reduce lipid oxidation rate and improve product shelf life, so addition of antioxidants, for example rosemary extract, sage extract, citric acid or ascorbic acid, to the frying oil can be avoided [2, 48, 49]. Despite the advantages of olive oil, consumption of large amounts of this type of product is not recommended because of the high fat content. III-3.3. Effect of Storage on the FAME Profile of Potato Crisps Potato crisp containers were stored at room temperature, in darkness, to evaluate profile changes during 3 months. Over this period C 16:0 ; C 18:1 , C 18:2 , and C 18:3 content did not change (Figure 3), except for minor fluctuations. C18:3, with three double bonds, is, of the fatty acids studied in this work, the most susceptible to oxidation. Because it is the first to change, C 18:3 can be used as an indicator of the early stage of oxidation. 72 Figure III-3- Fatty acids changes during 3 months storage on normal conditions: A-Brands 1-3, 6-8; B- Brands 4, 5. 6,00 6,20 6,40 6,60 6,80 7,00 7,20 7,40 7,60 7,80 8,00 0123 Time (months) Area % brand 4 brand 5 brand 4, y = -0,0206x + 7,514 brand 5, y = 0,0233x + 6,9954 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 0123 Time (months) Area % brand 1 brand 2 brand 3 brand 6 brand 7 brand 8 brand 1, y = 0,044x + 0,7569 brand 2, y = 0,0015x + 0,8127 brand 8, y = -0,0071x + 0,545 brand 3, y = -0,0171x + 0,4413 brand 7, y = 0,0035x + 0,2696 brand 6, y = -0,0061x + 0,4813 73 References [1] Niemelä, J.R.K.; Wester,I.; Lahtinen, R.M. Grasas y aceites 1996,47(1-2), 1-4. [2] Man, Y. B. and Tan, C. P. JAOCS 1999, 76(3), 331-339. [3] van Ruth, S.M.; Roozen, J.P.; Posthumus, M.A.; Jansen, F. J. H. M. J. Agric. 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In the present work, an extraction method that involves extraction and derivatization of free fatty acids to fatty acids methyl esters (FAMEs) in a single step followed by gas chromatography is used. In one hand, four potato crisps brands, fried in different oils, were stored at room temperature and at 40ºC, in the dark, to evaluate the effect of temperature on the fatty acids. On the other hand, a single kind of potato crisps (fried in olive oil), was stored at room temperature, in darkness, under different atmospheres: air, vacuum, oxygen scavenger, and nitrogen. The most effective conditions in order to avoid or at least delay lipid oxidation were storage at room temperature with an oxygen scavenger. Keywords: One-step extraction, Modified atmosphere packaging, Temperature, Lipid oxidation, Potato crisps. Atmosphere and Temperature effect in fatty acids 78 IV-1. Introduction In the past few years the consumer demand for food products with high quality has increased. In this context, food packaging has an outstanding importance once protects the food from microbial and chemical contamination, as well as from oxygen, water vapour and light [1]. The atmosphere surrounding the food constantly change as volatile compounds and moisture are formed during metabolic processes. In line with these facts, modified atmosphere packaging (MAP), defined by Ahvenainen et al [2] as a method where the normal gas atmosphere is changed by a package headspace as close as possible to optimal conditions, have been a challenge for scientific research due to contribute to an extend of shelf life of packed products. Moreover, the barrier properties of the polymeric material will further influence the movement of gases and moisture into and out the package. Despite the advantages of MAP, like improvement of product presentation and reduction of the need of food additives, this method has several drawbacks, such as problems with leak detection and environmental impact [2]. MAP can be a passive (before sealing) or an active operation (during storage), using a gas absorber or emitter. The latter is a recent technological innovation which involves the use of chemical scavengers (e.g. ethylene, oxygen, water) or which can release a specific gas (carbon dioxide, or microbial inhibitors such as ethanol or sulphur dioxide) [3]. Passive MAP technique has already been applied to many food products like: fruits (e.g. apples; peaches; cherries) [4-6]; vegetables (e.g. lettuce, carrots; vegetables for soup; potatoes) [7-10]; meat (e.g. cooked pork; ground beef; turkey breast fillets; cooked pork sausage) [11-14]; fish (e.g. salmon) [15]; cheese (e.g. Mozzarella) [16-17]; hazelnuts [18]; shrimp [19]; olive [20]. However, in the majority of the papers results Atmosphere and Temperature effect in fatty acids 79 have been evaluated in a microbiological and not in a nutritional perspective. The major purpose of this paper is the evaluation of the influence of storage temperature and headspace package atmosphere, on the induction of lipid oxidation in packed potato crisps. The aim of studying the influence of the temperature is to observe if high temperature influences the fatty acid profile. With respect to the atmosphere package conditions, the main reason for using a modified atmosphere inside the package container is to achieve the atmosphere medium that can better avoid or delay lipid oxidation during storage. IV-2. Experimental IV-2.1. Sampling Potato crisps were purchased from a local supermarket. In order to evaluate the effect of temperature on FAMEs profile, four potato crisps brands were stored at room temperature and at 40º C, in the dark, after an analysis conducted on day 1 (day they were bought). Brands selected pretend to represent different kinds of potato crisps once they had different characteristics: according the package information: brand 1 (fried in olive oil); brand 2 (fried in vegetable oil); brand 3 (with 30% less of fat); brand 4 (made from potato paste). To evaluate the effect of modified atmosphere package (MAP), a single kind of potato crisps (brand 1) was stored at room temperature, in darkness, under different atmospheres: intact (market sample) atmosphere, air, vacuum, oxygen scavenger (Ageless; Mitsubishi gas chemical Co. Japan) and nitrogen. A semiautomatic packaging machine (Audiovac VM Atmosphere and Temperature effect in fatty acids 86 25 27 29 31 33 35 0123 Time (months) Area (%) Room temperature 40 ºC IV-3.2. The effect of storage temperature Figure IV-2 represents the polyunsaturated fatty acid profile during a 3-month storage for the four types of potato crisps and figure IV-3 shows the GC-FID chromatograms. 40ºC temperature induce lipid oxidation yielding a decrease of polyunsaturated fatty acids. These changes are generally significant for all types of potato crisps except for potato crisps with lower fat content (30% less). ¡Error! 8 9 10 11 12 0123 Time (months) Area (%) Room temperature 40 ºC A B Figure IV-2 Atmosphere and Temperature effect in fatty acids 87 Figure IV-2- Polyunsaturated changes during a 3-month storage at room temperature and 40ºC. A- Potato crisps fried with olive oil; B- Potato crisps fried with vegetable oil; C- Potato crisps with less 30% of fat; D- potato crisps made from potato paste. In brief, temperature is a parameter that affects oxidation, so should be controlled in order to avoid or at least delay this destructive chemical process. 10 11 12 13 0123 Time (months) Area (%) Room tempearture 40 ºC 20 21 22 23 24 25 0123 Time (months) Area (%) Room tempearture 40 ºC C D Atmosphere and Temperature effect in fatty acids 88 Figure IV-3 - GC-FID chromatograms of potato crisps: A- Potato crisps fried with olive oil; B- Potato crisps fried with vegetable oil; C- Potato crisps with less 30% of fat; D- Potato crisps made from potato paste. A B C D Table IV-1: Analysis of 14 fatty acids in potato crisps stored under five atmospheres. Time Month 0 Month 3 Atmosphere Market sample Air N2 Scavenger O2 Vacuum FA Mean a SD b Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD C 14:0 0,07 0,02 0,05 0,00 0,04 0,00 0,05 0,00 0,05 0,00 0,05 0,00 C 14:1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 C 16:0 11,24 0,38 10,53 0,04 10,34 0,18 10,46 0,00 10,20 0,12 10,00 0,06 C 16:1 0,52 0,02 0,45 0,01 0,44 0,00 0,45 0,00 0,44 0,01 0,44 0,00 C 17:0 0,07 0,01 0,05 0,01 0,06 0,01 0,06 0,00 0,05 0,00 0,06 0,01 C 17:1 0,07 0,00 0,06 0,00 0,06 0,00 0,06 0,00 0,06 0,00 0,06 0,00 C 18:0 3,49 0,05 3,27 0,03 3,22 0,03 3,21 0,00 3,14 0,01 3,25 0,01 C 18:1 53,73 0,40 55,17 0,57 56,01 0,01 55,61 0,27 55,27 0,30 55,88 0,18 C 18:2 29,04 0,18 29,36 0,46 28,89 0,23 29,14 0,21 29,73 0,33 29,26 0,10 C 18:3 0,83 0,09 0,54 0,11 0,40 0,01 0,45 0,06 0,56 0,09 0,43 0,00 C 20:0 0,35 0,04 0,22 0,00 0,21 0,00 0,20 0,00 0,19 0,00 0,16 0,01 C 20:1 0,17 0,01 0,11 0,00 0,11 0,00 0,11 0,00 0,10 0,00 0,11 0,00 C 22:0 0,29 0,03 0,10 0,00 0,14 0,00 0,13 0,00 0,14 0,01 0,22 0,00 C 24:0 0,13 0,02 0,08 0,02 0,09 0,00 0,08 0,00 0,06 0,02 0,08 0,00 a area %; n=4 b standard deviation Atmosphere and Temperature effect in fatty acids 90 References [1] F. 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Presented as a poster at: - VII International Symposium on Analytical Methodology in the Environmental Field, XII Meeting of the Spanish Society of Analytical Chemistry (VIII ISAMEF/ SEQA 2003), A Coruña, Spain, 21-24 October, 2003 [GC-FID]. - Congreso Nacional dos Farmacéuticos 2003, Lisboa, Portugal, 27-29 November, 2003 [GC-MS]. Light effect in fatty acids 95 Abstract A storage study was carried out to evaluate the behavior of fatty acids of potato crisps. Samples were stored in the darkness and under natural light. A one step extraction-methylation method followed by gas chromatographic determination was used to analyze and compare profiles (% area) and contents (g/100g sample). Quantification was carried out using nonadecanoic acid as internal standard. The profile of potato crisps stored in the darkness has not shown considerable variation, while the one of crisps exposed to natural light has decreased significantly. Regarding FAMEs content, there was a decrease under both conditions, which was more evident in crisps stored under light. In spite of greatly contribute for the development of lipid oxidation, light should be avoided during potato crisps storage. Keywords: Fatty acids, Gas chromatography, Light, Potato Crisps. Light effect in fatty acids 102 V-3.2. Fatty acids methyl esters profile/content During a 3-month storage period (fig. V-1) the fatty acid profile has not changed (P > 0.05) in potato crisps stored in the dark, while under light storage conditions has changed significantly (P < 0.05). Figure V-1- Fatty acid profile of potato crisps at two different storage conditions: lightness and darkness. The gas chromatographic separation of the FAMEs in potato crisps is presented in figure V-2. Good resolution was achieved, peaks were sharp and without shoulders. Oleic acid was the major fatty acid present ( > 50%) and C 16:1 level was higher than 0.5%. This profile was identical to the one found in olive oil, which confirms the package information (see Experimental). As expected, polyunsaturated FAMEs (fig. V-3) were those which showed the main changes. The decrease of polyunsaturated fraction was mainly due to the oxidation into primary and secondary oxidation products. During a three-month storage they decreased from 29.86% to 5.83%. This decrease was more evident during the first month (y= 16.161 x + 29.863; a 1 = 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 % Area Month 0 Month 1- darkness Month 1-light Month 3-darkness Month 3-light Saturated Monounsaturated Polyunsaturated Light effect in fatty acids 103 -16.161) than during the second and third months (y= -3.935 x + 17.637; a 2 = -3.935; a 2 < a 1 ). Figure V-2 Light effect in fatty acids 104 Figure V-2 Light effect in fatty acids 105 Figure V-2- GC-FID chromatograms of potato crisps FAMEs A- Month 0; B1- Month 1 darkness; B2- Month 1 lightness; C1- Month 3 darkness; C2- Month 3 lightness. Figure V-3- Polyunsaturated FAMEs changes along a three month storage of potato crisps. Among all fatty acid studied, linolenic acid was the most susceptible to oxidative deterioration due to the presence of the greatest number of double bonds [10]. Its % area has decreased from 0.83% (month 0) to 0.67% 0 10 20 30 40 50 0123 Time (months) % Area Light Darkness Light effect in fatty acids 106 and 0.05% (3 months later) respectively to potato crisps stored in the darkness and in the light (see table V-1). Table V-1- FAMEs profile of potato crisps: A- Darkness; B- Light. A Darkness Month 0 Month 1 Month 3 Mean (% Área) DS Mean (% Área) DS Mean (% Área) DS C14:0 0,074 0,016 0,053 0,007 0,058 0,001 C14:1 0,002 0,001 0,001 0,000 0,002 0,000 C16:0 11,243 0,377 10,595 0,461 11,234 0,496 C16:1 0,525 0,018 0,469 0,010 0,477 0,004 C17:0 0,065 0,006 0,028 0,014 0,060 0,007 C17:1 0,068 0,003 0,057 0,003 0,058 0,003 C18:0 3,485 0,052 3,061 0,081 3,268 0,048 C18:1 53,733 0,403 54,800 0,430 54,331 0,317 C18:2 29,037 0,182 29,775 0,257 29,278 0,335 C18:3 0,826 0,089 0,622 0,109 0,666 0,053 C20:0 0,352 0,038 0,195 0,004 0,211 0,015 C20:1 0,173 0,011 0,116 0,004 0,125 0,007 C22:0 0,287 0,031 0,127 0,002 0,129 0,008 C24:0 0,129 0,018 0,100 0,026 0,104 0,018 B Light Month 0 Month 1 Month 3 Mean (%) DS Mean (%) DS Mean (%) DS C14:0 0,074 0,016 0,047 0,005 0,136 0,076 C14:1 0,002 0,001 0,000 0,000 0,000 0,001 C16:0 11,243 0,377 14,669 0,237 21,384 0,709 C16:1 0,525 0,018 0,518 0,016 0,429 0,024 C17:0 0,065 0,006 0,029 0,008 0,075 0,019 C17:1 0,068 0,003 0,072 0,000 0,114 0,022 C18:0 3,485 0,052 4,625 0,153 6,731 0,016 C18:1 53,733 0,403 65,171 0,017 62,788 0,827 C18:2 29,037 0,182 13,508 0,283 5,782 0,075 C18:3 0,826 0,089 0,194 0,030 0,050 0,024 C20:0 0,352 0,038 0,240 0,010 0,321 0,009 C20:1 0,173 0,011 0,472 0,022 1,449 0,129 C22:0 0,287 0,031 0,350 0,103 0,435 0,057 C24:0 0,129 0,018 0,103 0,004 0,305 0,066 Light effect in fatty acids 107 Nevertheless, % area data gives only limited information. It allows one to evaluate the effect of light, once the decrease of the polyunsaturated FAMEs fraction is more evident when potatoes are exposed to natural light during storage. However, it does not allow predicting the extension of this change in the FAMES contents (g/100g sample). This way, the quantification of fourteen FAMEs was carried out using the internal standard method. Nonadecanoic acid, which is not present in potato crisps according our preliminary tests, was selected as internal standard. The content of fourteen FAMEs of the potato crisps stored during 3 months it is presented in table V- 2. A considerable amount of papers has identified and quantified the fatty acids present in potato crisps [30-31]. Nevertheless this information is scarce with respect to the effect of light in the oxidation phenomenon during the storage period. Masson et al [32] have studied the progression of the deterioration of crisps stored at room temperature (daylight and darkness), and in darkness (at 40 ºC and –23 ºC). However, he studied other parameters aside from fatty acids. Figure V-4 shows that the FAMEs content decreased with storage time and this diminution was more significant when crisps were stored in presence of light. After the first month, stored potato crisps under light present lower amounts of FAMEs that those stored in the darkness, however this difference is significative just for monoun- and polyunsaturated FAMEs (fig. V-5A). After 3 months (fig. V-5B) the difference between the two conditions, is more evident (about 22 times lower under light for polyunsaturated and 3.6 and 1.8 times lower for monounsaturated and saturated, respectively). Light effect in fatty acids 108 Table V-2- FAMEs content (g/100g sample) of potato crisps. A- Darkness; B- Lightness. Month 0 Month 1 Month 3 A- Darkness Mean DS Mean DS Mean DS C14:0 0,016 0,000 0,006 0,001 0,004 0,001 C14:1 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 C16:0 2,353 0,007 1,279 0,151 0,959 0,177 C16:1 0,086 0,001 0,047 0,005 0,034 0,008 C17:0 0,011 0,000 0,003 0,002 0,005 0,001 C17:1 0,016 0,000 0,008 0,000 0,006 0,001 C18:0 0,829 0,002 0,426 0,049 0,323 0,067 C18:1 12,054 0,029 7,329 0,580 5,183 1,156 C18:2 6,533 0,019 3,989 0,309 2,801 0,638 C18:3 0,155 0,001 0,067 0,015 0,050 0,008 C20:0 0,099 0,000 0,030 0,003 0,023 0,004 C20:1 0,058 0,000 0,022 0,003 0,017 0,003 C22:0 0,092 0,001 0,022 0,002 0,016 0,003 C24:0 0,040 0,004 0,019 0,005 0,013 0,001 Total 22,671 13,581 9,765 Month 0 Month 1 Month 3 B- Light Mean DS Mean DS Mean DS C14:0 0,016 0,000 0,004 0,000 0,002 0,000 C14:1 0,001 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 C16:0 2,353 0,007 1,138 0,072 0,412 0,201 C16:1 0,086 0,001 0,037 0,002 0,007 0,004 C17:0 0,011 0,000 0,004 0,000 0,001 0,000 C17:1 0,016 0,000 0,007 0,000 0,003 0,002 C18:0 0,829 0,002 0,412 0,030 0,151 0,077 C18:1 12,054 0,029 6,003 0,368 1,361 0,706 C18:2 6,533 0,019 2,247 0,068 0,125 0,063 C18:3 0,155 0,001 0,034 0,001 0,002 0,001 C20:0 0,099 0,000 0,025 0,001 0,008 0,004 C20:1 0,058 0,000 0,041 0,001 0,046 0,026 C22:0 0,092 0,001 0,029 0,001 0,012 0,006 C24:0 0,040 0,004 0,013 0,001 0,009 0,003 Total 22,671 10,319 2,471 Light effect in fatty acids 109 Figure V-4- Change of FAMES content during a three months storage: A- Light; B- Darkness. 0 2 4 6 8 10 12 Amount (g/100g sample) 013 Time (months) Saturated Monounsaturated Polyunsaturated 0 2 4 6 8 10 12 Amount (g/100g sample) 013 Time (months) Saturated Monounsaturated Polyunsaturated A B Light effect in fatty acids 110 Figure V-5- Contents of saturated, monounsaturated and polyunsaturated fatty acids: A- First month; B- Third month. Chromatograms of potato crisps stored for 1 and 3 months allow one to see the formation of new peaks. These peaks possibly correspond to new compounds generated in the oxidation process. With the aim of identifying these compounds, samples were injected in a gas chromatograph coupled with mass selective detector. Figure V-6 shows the chromatograms obtained. Table V-3 shows the identified compounds. Most of these compounds are fatty acids of shorter carbon chain and aldehydes. A 02468 Polyunsaturated Monounsaturated Saturated Contents (g/100g sample) Darkness Lightness B 0123456 Polyunsaturated Monounsaturated Saturated Content (g/100g sample) Darkness Lightness Light effect in fatty acids 111 Figure V-6- GC-MS chromatograms. A- Standard; B- Darkness; C- Lightness. A B C APPENDIX I Light effect in fatty acids 121 Figure V-7- Chloro-, methane GC-MS spectrum. Figure V-8- Acetic acid methyl ester GC-MS spectrum. Light effect in fatty acids 122 Figure V-9- Hexane GC-MS spectrum. Figure V-10- Methyl-cyclopentane GC-MS spectrum. Light effect in fatty acids 123 Figure V-11- Benzene GC-MS spectrum. Figure V-12- 1,3,5-Cycloheptatriene GC-MS spectrum. Light effect in fatty acids 124 Figure V-13- Methyl-benzene GC-MS spectrum. Figure V-14- Hexanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. Light effect in fatty acids 125 Figure V-15- Ethyl-benzene GC-MS spectrum. Figure V-16- Hexanal dimethyl acetal GC-MS spectrum. Light effect in fatty acids 126 Figure V-17- Benzaldehyde GC-MS spectrum. Figure V-18- 2-Butenedioic acid (E)-dimethylester GC-MS spectrum. Light effect in fatty acids 127 Figure V-19- Heptanoic acid methyl ester GC-MS spectrum. Figure V-20- Benzenemethanol GC-MS spectrum. Conclusiones 230 QUINTA: Se ha propuesto un método de microextración en fase sólida (SPME) seguido de cromatografía de gases con detector de masas, para la determinación de los compuestos volátiles generados en el proceso de oxidación lipídica de las patatas fritas. Se han comparado varias fibras teniendo en cuenta la eficacia de extracción normalizada (Nx). Los mejores resultados se obtuvieron con la fibra DVB/CAR/PDMS, la cual presenta una polaridad media. Esta ha permitido identificar treinta y un compuestos, los cuales corresponden a las siguientes familias químicas: alcoholes, aldehídos, ácidos carboxílicos, ésteres, furanos, hidrocarburos, cetonas y otros. La mayoría de estos compuestos son el resultado de los procesos de degradación/reordenación de lípidos y carbohidratos. SEXTA: Se han propuesto dos métodos para la evaluar la idoneidad del hexanal como indicador del proceso de oxidación lipídica. Primeramente, se ha optimizado un método de microextracción en fase sólida (SPME) seguido de cromatografía gaseosa con detección de masas. A continuación se ha puesto a punto un método de derivatización con 2,4- dinitrofenilhidrazina seguido de cromatografía líquida de alta resolución. Ambos métodos han demostrado ser adecuados para la identificación y cuantificación del hexanal. El método de cromatografía gaseosa presenta un límite de detección más bajo (1ng/ml) que el de cromatografía líquida (9ng/ml), sin embargo, se recomienda este último para la determinación del hexanal en patatas fritas dada su excelente repetibilidad y linearidad. Los resultados indicaron que en las patatas fritas almacenadas en la oscuridad no hubo cambios en el contenido de hexanal, mientras que en las almacenadas a la luz se produjo un aumento significativo. Se verifica así, que el hexanal es un buen indicador del proceso de oxidación lipídica Conclusiones 231 ya que este aumenta durante el almacenamiento e indica la alteración de las propiedades sensoriales. SEPTIMA: Para la determinación de triclosan, antimicrobiano incluido en plásticos para envasar alimentos, se propone un método de cromatografía líquida de alta resolución con detección ultravioleta a 205, 235 y 280 nm. El método ha sido validado en cuatro alimentos seleccionados como representativos del amplio rango de complejidad de las matrices alimentarias. Los coeficientes de correlación de las rectas de calibración (r>0,99) muestran que el método es válido para la cuantificación de triclosan. Las recuperaciones del método, calculadas a tres niveles (5, 1 y 0.5 µg/ml) han sido satisfactorias (83.22-105.39%) en todos los casos. La confirmación de la identidad del triclosan ha sido evaluada por cromatografía gaseosa y líquida, ambas acopladas a un detector de masas. 233 La fotografía de la portada fue tomada de la página web: www.vitro.com/envases/ ingles/home.htm.