Optimización del diagnóstico, caracterización molecular y análisis de virulencia del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV)

OPTI M MOLE C L A De p C a M IZACIÓN D C ULARY A A SEPTICE M p artamen t I n a rmenL ó Tesis D D ELDIAG N A NÁLISISD M IAHEM O t odeMic r n stitutod e ó pezVáz q D octoral N ÓSTICO, C EVIRULE N O RRÁGICA  r obiologí a e Acuicul t q uez C ARACTE R N CIADEL V  VIRAL(V H a yParasi t t ura R IZACIÓN  V IRUSDE  H SV) t ología OPTI M MOLE C L A De p C a M IZACIÓN D C ULARY A A SEPTICE M p artamen t I n a rmenL ó Tesis D D ELDIAG N A NÁLISISD M IAHEM O t odeMic r n stitutod e ó pezVáz q D octoral N ÓSTICO, C EVIRULE N O RRÁGICA  r obiologí a e Acuicul t q uez C ARACTE R N CIADEL V  VIRAL(V H a yParasi t t ura R IZACIÓN  V IRUSDE  H SV) t ología Dr. Carlos P. Dopazo Profesor Titular y Dra. Isabel Bandín Matos, Investigadora Ramón y Cajal de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela INFORMAN Que la presente Tesis Doctoral titulada "Optimización del diagnóstico, caracterización molecular y análisis de virulencia del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV)", que presenta Dña. Carmen López Vázquez para optar al grado de Doctora en Ciencias Biológicas, ha sido realizada en el Departamento de Microbiología y Parasitología, Instituto de Acuicultura, bajo nuestra dirección y, considerando que se haya concluida, autorizamos su presentación para que pueda ser juzgada por el Tribunal correspondiente. Y para que así conste, firmamos el presente informe en Santiago de Compostela a 28 de Marzo de 2007 Fdo: C. López Vázquez Fdo: Dr Carlos P. Dopazo Fdo: Dra Isabel Bandín Doctoranda Dir. Tesis Dir. Tesis Foron moitos os que me axudaron para levar a cabo este traballo e, sen dúbida algunha, alguén quedará sen nomear neste apartado que foi elaborado de xeito rápido e moi a última hora, as miñas desculpas por adiantado se me esquezo de alguén. En primeiro lugar, quero amosar o mais sinceiro agradecemento ós directores desta tese Carlos P. Dopazo e Isabel Bandín pola inestimable labor levada a cabo, e sobretodo polas contínuas mostras de apoio e confianza que tan ben sentan en certos momentos, en fin grazas por todo. A Alicia E. Toranzo e Juan L. Barja polo apoio e interés así como a todolos compañeiros do departamento que sempre votan un cable, a Sol, Carlos Osorio, Ysa, Bea e a todolos que se foron e por suposto a todolos novos. Quero tamén agradecer especialmente a R. Raynard e M. Snow polas atencións recibidas na miña corta estancia nas terras escocesas, así como N. Bain e J. Bruce polo seu apoio constante. A Alicia, Javi, Johnny, Juanma e Susana que supuxeron una inestimable axuda tanto no ámbito laboral como en moitos outros. Como é lóxico quero facer un agradecemento moi especial os meus pais polo apoio incondicional en todo o que fun decidindo nestes anos. Tamén graciñas as miñas amigas por estar ahí, e a Xan por acompañarme todos estos anos e por facer que todo sexa mais doado. Grazas a todos           A Inés Optimización del diagnóstico, caracterización molecular y análisis de virulencia del virus de la Septicemia Hemorrágica Viral (VHSV). VI Infección experimental 3 138 Inoculación intraperitoneal e infección por cohabitación 138 Infección por inmersión 139 EXAMEN VIROLÓGICO 139 Aislamiento viral 140 RT-PCR 140 Nested-PCR 140 RESULTADOS 141 Infección experimental 1 141 Infección experimental 2 147 Infección intraperitoneal y Cohabitación 147 Infección mediante inmersión 151 Infección experimental 3 155 Infección intraperitoneal y Cohabitación 155 Infección mediante inmersión 158 DISCUSION 159 CONCLUSIONES167 BIBLIOGRAFÍA171 PUBLICACIONES199 INTRODUCCIÓN Introducción 3 La acuicultura es el sector de producción de alimentos que está creciendo más aceleradamente en todo el mundo. Desde 1984, la producción ha aumentado a una tasa media del 10%, en comparación con el 3% correspondiente a la carne de bovino y el 1,6% de la pesca. El incremento en el desarrollo de la acuicultura a escala comercial e industrial ha llevado a los principales países y regiones productoras y consumidoras a establecer normas y reglamentos para asegurar la calidad e inocuidad del producto acuícola y reducir los efectos sociales y ambientales de la producción. Asimismo, se ha incrementado el interés en las patologías propias de las especies de cultivo que, aunque no impliquen un riesgo para el consumo humano, tienen una gran importancia económica debido a las pérdidas en producción. Así, el Acuerdo sobre la Aplicación de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO 1999) ha establecido una serie de normas mínimas de calidad e inocuidad para los organismos acuáticos comercializados y establece, entre otros puntos, una lista de enfermedades infecciosas de notificación obligatoria. Dentro de las enfermedades infecciosas que afectan a los peces cultivados, los virus constituyen uno de los problemas más importantes, debido a las altas mortalidades que producen, así como al hecho de que no existen medidas de control eficaces. Entre los virus de peces, los rhabdovirus son el grupo más numeroso, y en él se incluyen las dos patologías víricas con mayor impacto y repercusión en el cultivo mundial de peces. La familia Rhabdoviridae está formada por 6 géneros (Tabla 1), dos de los cuales afectan a plantas e insectos (géneros Cytorhabdovirus y Nucleorhabdovirus) y cuatro a vertebrados (géneros Lyssavirus, Ephemerovirus, Vesiculovirus y Novirhabdovirus) (Fauquet y col., 2005), pero sólo los dos últimos corresponden a virus de peces (Walker y col., Introducción 4 2000). El género Vesiculovirus incluye entre sus miembros, como único representante de peces, al virus de la viremia primaveral de la carpa (SVCV, spring viremia of carp virus), asignado todavía de forma provisional. Sin embargo, el género Novirhabdovirus destaca tanto por el nutrido número de miembros que lo integran, como por la incidencia en cuanto a patologías de peces se refiere. Entre ellos podemos citar el virus IHNV (virus de la necrosis hematopoyética infecciosa) que es la especie tipo de este género, el VHSV (virus de la septicemia hemorrágica viral) y otros virus de menor impacto económico, más restringidos en cuanto a localización y especies a las que afectan, como son el hirame rhabdovirus (HIRRV) o el snakehead rhabdovirus (SHRV). Además, asignados a este género aparecen de modo provisional los virus de anguila EEV-B12 y EEV-C26 (Tordo y col., 2005). Tabla 1: Clasificación de rhabdovirus Género Hospedadores Virus tipo Cytorhabdovirus Plantas e insectos Virus de la necrosis amarilla de la lechuga (LNYV) N ucleorhabdovirus Plantas e insectos Virus enano amarillo de la patata (PYDV) L yssavirus Vertebrados Virus de la rabia (RABV) E phemerovirus Vertebrados Virus de la fiebre efímera de los bóvidos (BEFV) Vesiculovirus Vertebrados Virus de la estomatitis vesicular (VSV) N ovirhabdovirus Vertebrados Virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) A continuación procederemos a una descripción detallada del g. Novirhabdovirus, por ser uno de sus miembros el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), el objeto de estudio de este trabajo. Introducción 5 G. Novirhabdovirus Las características comunes que comparten los novirhabdovirus con el resto de miembros de la familia son su morfología en forma de bala y su estructura (Figura 1), con una longitud entre 100 y 430 nm (media de 110 nm) y entre 45 y 100 nm de diámetro (media de 70 nm). La superficie del virión está cubierta con proyecciones de 5 a 10 nm de longitud y alrededor de 3 nm de diámetro, constituidas por trímeros de glicoproteína vírica. Internamente, la nucleocápside, de 30-70 nm de diámetro, muestra simetría helicoidal. La nucleocápside está formada por la molécula genómica de ARN y la nucleoproteína (N). La ARN polimerasa-ARN dependiente (L) y la fosfoproteina (M1) están íntimamente unidas a la nucleocápside formando el complejo ribonucleoproteína (RNP). Externamente se observa una envuelta Figura 1: Imagen de un rhabdovirus (VHSV) tomada mediante microscopía electrónica (Izquierda). Diagrama de la estructura de la nucleocápside y el virión de un rhabdovirus (Derecha). Introducción 6 lipídica rodeada de aproximadamente 400 espículas transmembrana constituidas por la glicoproteína viral (G); la envuelta está conectada a la nucleocápside a través de la proteína matriz (M2) (Murphy y col., 1995). Dentro del género Novirhabdovirus se ha detectado además la presencia de una proteína no estructural (NV), a la que debe su nombre el género y que permite diferenciarlo del otro género que afecta a peces (g. Vesiculovirus). El ácido nucleico de los novirhabdovirus está constituido por una cadena sencilla de ARN no segmentado con polaridad negativa, de un tamaño aproximado de 12 Kb. Su secuencia presenta seis pautas de lectura abierta (ORF) que codifican 5 proteínas estructurales (la nucleoproteína, la fosfoproteína, la proteína de la matriz M2, la glicoproteína y la ARN polimerasa) y una proteína no estructural. El proceso de replicación viral en los novirhabdovirus, al igual que en el resto de los rhabdovirus, se inicia con la adsorción viral mediada por la glicoproteína, que se une a receptores específicos de la superficie celular, lo que determina el rango de huéspedes y el tropismo viral. El virus atraviesa la membrana plasmática por endocitosis mediada por receptores, a continuación la envuelta viral se fusiona con la membrana del endosoma debido a un cambio conformacional en la glicoproteína, de naturaleza reversible e inducido por una disminución del pH en el interior del endosoma (Mas y col., 2004). Finalmente se produce la liberación de la nucleocápside viral en el citoplasma. Los fosfolípidos de la membrana parecen desempeñar un importante papel en la unión de algunos rhabdovirus a la membrana celular. Así, se ha demostrado que el receptor celular para el virus de la estomatitis vesicular (VSV) es la fosfatidilserina (Schlegel y col., 1983; Mastromarino y col., 1987; Conti y col., 1988); sin embargo, en el caso de lisavirus la naturaleza de los receptores celulares no está clara. De hecho, si bien se ha demostrado la existencia de un receptor nicotínico de acetil-colina para el virus de la Introducción 7 rabia (Lentz y col, 1982; 1986; Bracci y col., 1988; Gatska y col., 1996), también se ha postulado que este papel puede ser desempeñado por fosfo o glicolípidos (Superti y col., 1984; Wunner y col., 1984), por un complejo proteico tipo fibronectina (Broughan y Wunner, 1995), o por un factor de crecimiento nervioso (P75NTR) (Tuffereau y col., 1988). En lo que respecta a los novirhabdovirus, se ha demostrado que el VHSV se une a los componentes fosfolipídicos de las membranas de las células de peces (Bernard y col., 1984), con una especial preferencia por la fosfatidilserina, unión que es más fuerte a pH bajo (5,6) debido a un cambio conformacional en la glicoproteína viral (Coll, 1995). Además, se ha identificado el lugar de unión en la glicoproteína, que se localiza entre los residuos 79 y 113 (Estepa y Coll, 1996). Sin embargo, estudios posteriores han sugerido que el principal componente del complejo celular receptor para VHSV y otros rhabdovirus de peces podría ser la fibronectina, una proteína muy abundante en el músculo de los peces (Bearzotti y col., 1999), lo que ha llevado a estos autores a postular la hipótesis de que los rhabdovirus infectan al pez mediante 2 pasos: una entrada pasiva a través del mucus de la piel y una segunda interacción directa con la fibronectina del músculo superficial que está en contacto directo con la piel. La interacción entre la glicoproteína de VHSV y los fosfolípidos de la membrana del endosoma sí parece ser determinante en la fusión y posterior liberación de la nucleocápside viral (Estepa y Coll, 1996; Estepa y col., 2001). El proceso de fusión se produce, al igual que en el resto de los rhabdovirus, a pH bajo, aunque se ha demostrado que también se puede producir a pH fisiológico (Mas y col., 2002). Una vez que la nucleocápside se encuentra en el citoplasma, la cadena de ARN se transcribe, lo que implica la síntesis secuencial de ARNs subgenómicos libres que incluyen un pequeño ARN leader y 6 ARNs mensajeros en el siguiente orden: 3’ N-M1-M2-G-NV-L 5’. La replicación Introducción 8 requiere de la síntesis continua de la proteína N (Finke y col., 2003) lo que sugiere que se combine con la encapsidación del ARN recién generado. Una vez encapsidado el ARN, se incorpora la polimerasa formando una cola helicoidal ayudada por la acción de la proteína matriz. Este complejo, que recibe el nombre de ribonucleoproteína (RNP), migra a la membrana celular, donde se está concentrando la incipiente glicoproteína viral. Por último la proteína matriz interactúa con el dominio citoplasmático de la glicoproteína, promoviendo la extrusión de los viriones (Warrell, 2004). Virus de la Septicemia Hemorrágica Viral El virus de la septicemia hemorrágica viral es especialmente conocido como patógeno de la trucha arcoiris (Oncorrhinchus mykiss) en Europa donde es el causante de graves pérdidas económicas. En 1938, Schäperclaus describió por primera vez la enfermedad en trucha arcoiris y postuló su etiología viral. Sin embargo, la primera cepa europea del virus no se aisló hasta la década de los 60 (Jensen, 1965). Hasta 1989, el VHSV había sido aislado principalmente de salmónidos de agua dulce (Rasmussen, 1965; Ghittino, 1973; Wizigmann y col., 1980), pero desde entonces se ha aislado de una gran cantidad de especies marinas, tanto de vida libre (arenque, bacalao, lenguado, eglefino, sardina, caballa, fletán negro...) como cultivados (rodaballo, lenguado...), tanto de individuos aparentemente sanos como con signos de enfermedad (Skall y col., 2005). Asimismo, el rango geográfico se ha ampliado desde las aguas continentales europeas (Ahne y Tomsen, 1985) hasta las costas del Atlántico Norte y Mar del Norte (King y col., 2001a; Dixon y col., 2003), así como de las costas pacíficas de América del Norte (Meyers y Winton, 1995; Hedrick y col., 2003) y Japón (Takano y col., 2000; Watanabe y col., 2002). Introducción 9 Estructura y expresión génica El virus de la septicemia hemorrágica viral se ajusta a las características descritas para la familia Rhabdoviridae. El genoma de la cepa tipo F1 comprende 11.158 nucleótidos (código de acceso de GenBank Y18263) y, al igual que los demás miembros del género Novirhabdovirus, contiene 6 ORF (3’ N-M1-M2-G-NV-L 5’; Figura 2) cada uno de los cuales codifica una proteína: nucleoproteína (N), fosfoproteína (M1), proteína matriz (M2), proteína no estructural (NV), glicoproteína (G) y polimerasa (L). La transcripción a ARN mensajero monocistrónico para traducir a proteínas virales tiene lugar en el siguiente orden: En primer lugar la proteína N o nucleoproteína que presenta una masa molecular entre 38 y 41 kDa; a continuación tiene lugar la traducción de la proteína M1 una fosfoproteína unida al ARN que presenta una masa molecular entre 21,5 y 25 kDa, seguida de la M2, proteína de membrana que cubre la ribonucleoproteína y que presenta un tamaño de 19 kDa. Por último se lleva a cabo la traducción de la glicoproteína (proteína G) y de la L o polimerasa con tamaños de 72-80 kDa y 157-190 kDa respectivamente (Lenoir y de Kinkelin, 1975). El gen NV con un tamaño entre 12 y 14 kDa (Kurath y col., 1997) es transcrito en un pequeño ARN mensajero que codifica una proteína de 122 aminoácidos (Schutze y col., 1996). Figura 2: Mapa genómico de VHSV cepa F1 (Schütze y col., 1999); se indican las posiciones de inicio y final de cada ORF recogidas en la base de datos GenBank con código de acceso Y18263. Introducción 16 moleculares derivados de la PCR, la técnica de PCR en tiempo real (qPCR); en este caso, los ciclos de amplificación del genoma y su detección se producen simultáneamente gracias a la emisión de fluorescencia que se produce por el uso de marcadores específicos. Los marcadores de fluorescencia pueden ser de 2 tipos: agentes intercalantes, siendo el más conocido el SYBR Green I, y sondas de ADN tipo cadenas de TaqMan, Molecular Beacons y FRET. El SYBR Green y similares se intercalan entre el ADN bicatenal, por ello son no específicas ya que pueden unirse a dímeros de cebadores o productos inespecíficos. Por otro lado, las sondas muestran una mayor especificidad; y su marcaje con fluorocromos está diseñado de modo que el incremento en la señal fluorescente se corresponde con la amplificación específica del ADN. Además de como método de detección, la qPCR se ha usado también para la cuantificación del virus en muestras de tejidos (Chico y col., 2006). Control y prevención Debido a la ausencia de un procedimiento efectivo de tratamiento, el primer punto a considerar en un plan de control y prevención de la enfermedad es el diseño de un sistema de profilaxis basado en una vigilancia continua de las aguas y un aislamiento de los peces sanos de aquellas zonas que constituyan un posible foco de contaminación. Una segunda vía es el rápido aislamiento y destrucción de los lotes infectados, lo cual precisa de métodos rápidos y eficaces de diagnóstico. Otro método de prevención es la vacunación. Tradicionalmente las vacunas eran vivas (atenuadas) o muertas (inactivadas). Los peligros de estas vacunas tradicionales son la reversión y el porcentaje residual de patógeno vivo, respectivamente. Con el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, se ha hecho posible la construcción de vectores vivos (bacterias o virus inocuos) que pueden usarse para transportar un antígeno de interés en protección contra Introducción 17 un patógeno, o bien para la producción, en grandes cantidades, del antígeno extraído del patógeno (vacunas subunitarias) obviando la producción del mismo. Entre las vacunas por subunidades, hasta hace poco sólo se conocían las basadas en subunidades proteicas o de lipopolisacáridos; recientemente, sin embargo, se han desarrollado vacunas genéticas o de ADN que abren perspectivas muy optimistas (Fernandez-Alonso y col., 1999). En teoría estas son las vacunas más seguras que existen ya que, al utilizar únicamente el material genético, es imposible que se produzcan fenómenos de reversión; de hecho, suelen conferir una protección eficaz sin provocar efectos secundarios negativos (Manoj y col., 2004). Desde que se comenzó a introducir la posibilidad de la utilización de las vacunas ADN en acuicultura, la mayoría de los estudios realizados en vacunas ADN frente a virus en peces, se han realizado con rhabdovirus, principalmente con los virus VHSV (Boudinot y col., 1998; Heppell y col., 1998) e IHNV (Anderson y col., 1996; Leong y col., 1997). La producción de estas vacunas de ADN se basan en los tradicionales plásmidos de Scherichia coli diseñados para la expresión transitoria en células eucariotas y en todos los casos el gen del virus que se incluye es el de la glicoproteína, ya que las vacunas de ADN que codifican para cualquiera de las otras proteínas (N, NV, M, P) no protegen frente a una infección con virus virulento (Corbeil y col., 1999). Una de las posibilidades para aumentar la inmunogenicidad de una vacuna, y por lo tanto aumentar la protección que esta confiere, es la administración conjunta de ésta con un adyuvante. Los adyuvantes actúan fundamentalmente favoreciendo la presentación de los antígenos al sistema inmune, mediante el secuestro de los antígenos vacunales y la posterior liberación de manera lenta y prolongada, así como produciendo una ligera inflamación que activa la atracción de las células presentadoras. Si con ello se consigue aumentar la capacidad y duración de la protección que confiere una vacuna, la dosis de vacuna a emplear podría disminuir, lo que conllevaría una reducción de costes (Jiménez y col., 2005). En el caso de vacunas ADN, además Introducción 18 de la posible utilización de adyuvantes tradicionales, existe la posibilidad de utilizar otro tipo de adyuvantes moleculares que se encuentren incluidos en el propio plásmido vacunal. Por ejemplo, secuencias cortas de ADN repetitivo no metilado que se encuentran generalmente en los plásmidos de las bacterias. Sin embargo, por el momento, su capacidad adyuvante en vacunas ADN para peces no ha sido estudiada en profundidad (Lorenzen y col., 2002). Otro de los problemas que afectan a la posible aplicación de las vacunas ADN a la acuicultura es la limitada duración de la inmunidad específica inducida por ellas. Una posible solución sería que las vacunas de ADN no sólo transfectaran los tejidos adecuados sino que los transformaran permanentemente, de modo que la producción de antígeno y por lo tanto la inmunidad sería constante (Coll, 2001). La ruta idónea para la administración de una vacuna en peces sería por baño o inmersión; sin embargo, hasta ahora, la ruta de administración de las vacunas de ADN que ha resultado mas efectiva en peces es la intramuscular, lo que conlleva que la administración de la vacuna sea una tarea demasiado laboriosa, costosa e inviable en la práctica, sobre todo con peces de pequeño tamaño y escaso valor comercial. Aunque la utilización de ultrasonidos de baja frecuencia (Fernández-Alonso y col., 2001) y el choque hiper-osmótico (Huising y col., 2003) parecen mejorar el resultado de la vacunación por baño-inmersión, los niveles de protección siguen siendo muy inferiores a los obtenidos con la inyección intramuscular. A pesar de que para la mayoría de sistemas las vacunas ADN confieren una protección efectiva hasta 9 meses post-vacunación, éstas no podrán estar disponibles para su uso rutinario en acuicultura mientras no se conozcan los mecanismos inmunológicos mediante los cuales se obtiene la protección y no se resuelvan los problemas relacionados con su seguridad, producción a gran escala y rentabilidad económica (Jiménez y col., 2005). CAPÍTULO1: OPTIMIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE RT-PCR PARA DIAGNÓSTICO DE VHSV IN VITRO Capítulo 1 21 RESUMEN El virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) es un patógeno de reconocido interés en el cultivo de trucha arcoiris (Onchorrhynchus mykiss). El único método de diagnóstico de VHVS reconocido oficialmente por la Unión Europea está basado en la detección del agente viral en cultivo celular seguido de la identificación mediante técnicas inmunológicas. En este capítulo se propone la transcripción inversa seguida de una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) como método de detección e identificación alternativo o complementario al cultivo celular. Para ello, se ha llevado a cabo la optimización de la técnica en todos sus pasos, incluyendo la extracción del ácido nucleico y la selección de cebadores. Los resultados obtenidos permiten concluir que se ha conseguido poner a punto una metodología rápida, sensible (límite de detección 10 fg de ARN viral) y altamente específica para el diagnóstico de este virus. Capítulo 1 23 INTRODUCCIÓN El virus VHSV es el agente causal de la septicemia hemorrágica viral (VHS), enfermedad que causa graves pérdidas económicas en la acuicultura continental, fundamentalmente en Europa (Smail, 1999). Debido a que en la actualidad no se dispone de tratamientos ni vacunas efectivos contra el VHSV, la única medida de control de la infección es evitar la exposición de los peces al virus y, especialmente, evitar los movimientos de peces infectados. Por este motivo es de vital importancia que el agente infeccioso sea rápidamente identificado, lo que hace imprescindible la puesta a punto de procedimientos de diagnóstico rápidos, sensibles y específicos. La VHS es una de las enfermedades consideradas de declaración obligatoria en el ámbito de la Unión Europea, según establece la Directiva 93/53. Por este motivo la decisión 2001/183/CE establece los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de esta enfermedad. Conforme a esta normativa, el examen virológico ha de iniciarse con el cultivo celular, que debe incluir las líneas celulares BF-2 (pedúnculo de bluegill) o RTG-2 (gónada de trucha arcoiris) y EPC (epitelioma papuloso de carpa) o FHM (tronco caudal de fathead minnow). Si se observa la aparición de efecto citopático (ECP) en el cultivo celular inoculado, se debe proceder a la identificación del virus mediante una o varias de las siguientes pruebas: seroneutralización, inmunofluorescencia (IF) o ELISA (enzyme linked inmunoabsorvent assay). El material tisular puede además someterse a otras técnicas de diagnóstico como la RT-PCR, la IFA aplicada sobre cortes congelados, o la inmumohistoquímica (realizada con material fijado con formol); sin embargo, estas técnicas deben completarse siempre con el aislamiento del virus en cultivo celular. Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 24 El aislamiento en cultivo celular es un método laborioso que requiere tiempo (entre 15 y 20 días, siguiendo las normas de la UE) y, aunque la sensibilidad es teóricamente alta, puesto que en principio se puede detectar la presencia de una única partícula viral en la muestra inoculada en una monocapa, la efectividad de la técnica obviamente depende de la susceptibilidad de la línea celular elegida y de la capacidad de propagación del virus (Dopazo y Barja, 2001). La susceptibilidad puede depender, además del tipo y edad del clon, del número de pases o de la edad de la monocapa, así como del pH del medio de cultivo, por lo que la sensibilidad de esta técnica es a menudo más baja de la esperada. Por otro lado, hay una serie de puntos críticos que afectan a la eficacia de esta técnica para el diagnóstico. Así, algunos autores han indicado que la susceptibilidad de los cultivos celulares frente a VHSV puede verse favorecida con un tratamiento de la monocapa celular con polietilenglicol antes de la inoculación del virus (Batts y col., 1991). Además, determinados factores pueden afectar a la propagación viral, que puede fallar por razones de baja cantidad de partículas infectivas, inactivación del virus o toxicidad del extracto tisular para el cultivo celular. Aunque el aislamiento en cultivo celular es, en general, bastante efectivo cuando se trabaja con infecciones en fase aguda, su eficacia se reduce drásticamente cuando se trata de detectar virus en peces que presentan una infección latente o subclínica (Winton y Einer-Jensen, 2002). Por último, algunos autores han demostrado que por este método es inevitable que no se detecte determinado tipo de cepas, como se ha observado en muestras procedentes de bacalao atlántico, rodaballo o arenque (Jensen y col., 1979; Scholtfeldt y col., 1991; Dixon y col., 1997), que producían poco o ningún efecto citopático en células EPC. Las técnicas serológicas aplicadas directamente sobre el tejido infectado reducen considerablemente el tiempo necesario para la confirmación del diagnóstico del virus; pero, según la normativa europea, para el diagnóstico Capítulo 1 25 confirmativo estas técnicas deben completarse con el aislamiento en cultivo celular. En este sentido, aunque la Unión Europea permite el uso de las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFAT; indirect fluorescence antibody test) y ELISA directamente sobre el homogenado de tejidos cuando se trata de confirmar un presunto brote de VHSV, evitando por tanto las limitaciones inherentes al cultivo celular, en la práctica su uso está muy restringido, ya que, tanto si el resultado es negativo como si se trata de la primera detección de VHSV en la zona, exige la realización adicional del aislamiento en cultivo celular. Por otra parte, la capacidad de identificación del virus mediante técnicas serológicas es limitada. Así, el test de neutralización tiene, según Ahne (1981), una sensibilidad de alrededor de 106 partículas virales, mientras que el nivel de sensibilidad de ELISA para VHSV sería según Mourton y col. (1990), de 104 TCID50 por gramo de tejido. El test de inmunofluorescencia se describe como el método de diagnóstico serológico más sensible, siendo capaz de detectar una partícula viral (Ahne, 1981), pero su sensibilidad puede verse afectada, al igual que con cualquier técnica serológica, por el grado de especificidad del antisuero empleado. Durante la última década, se han desarrollado y aplicado nuevas metodologías para el diagnóstico de virus y enfermedades virales, conocidas como técnicas moleculares, concepto que engloba técnicas basadas en la detección del genoma viral, principalmente hibridación de ácidos nucleicos (HAN) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La hibridación de ácidos nucleicos se ha utilizado para el diagnóstico de numerosos virus de peces. Sin embargo, aunque algunos autores han publicado que presenta una alta sensibilidad (Winton, 1991), otros señalan que su sensibilidad es incluso relativamente inferior comparada con ELISA y siempre menor cuando la detección pretende hacerse directamente de tejido de pez (Dopazo y col., 1994). La primera referencia a la utilización de HAN Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 32 Extracción con métodos de captación de resinas: Nucleospin RNA II (Macherey-Nagel).- Un volumen de 200 µl de virus crudo se transfirió a un vial eppendorf, se añadieron 400 μl de solución de lisis RA1 suplementada con ß-mercaptoetanol (a una concentración final de 0,14 M) y se agitó fuertemente en un vórtex; la suspensión lisada se transfirió a una unidad de filtración NucleoSpin y se centrifugó durante 1 min a 13.000 x g. Al lisado homogenizado se le añadieron 300 μl de etanol, se mezcló en vórtex y se transfirió a una columna NucleoSpin. A continuación se centrifugó a 8.000 × g durante 30 seg, se transfirió la columna a un nuevo tubo colector y se centrifugó de nuevo 1 min a 13.000 × g. Para eliminar los restos de ADN celular, 95 μl de la solución de DNasa I (suministrada por el fabricante) se aplicaron directamente en el centro de la columna. Tras incubación durante 15 min a temperatura ambiente, se añadieron 500 μl de solución RA2, se centrifugó 30 seg a 8.000 × g, se descartó el filtrado, se añadieron 600 μl de solución RA3 y se repitió la centrifugación. A continuación, se vació el líquido filtrado, se añadieron 250 μl de solución RA3 y se centrifugó a 13.000 × g durante 2 min, para secar la membrana completamente. La columna se transfirió a un vial eppendorf, se añadieron 100 μl de H2O-LN directamente sobre la membrana y se centrifugó 1 min a 13.000 × g para eluir el ARN. La suspensión de ARN extraído se conservó a –20 ºC. SV-Total RNA Isolation (Promega).- A un volumen de 200 µl de virus crudo se le añadieron 175 µl de tampón de lisis suplementado con ß-mercaptoetanol a una concentración final de 0,14 M. Los lisados viscosos se pasaron repetidamente por una jeringa con aguja de calibre 20G. La suspensión resultante se transfirió a un vial eppendorf de 1,5 ml, al que se añadieron 350 μl de tampón de Capítulo 1 33 dilución, se mezcló invirtiendo el vial repetidamente y a continuación se incubó a 70 ºC durante 3 min. El homogenado se centrifugó 10 min a temperatura ambiente y el sobrenadante resultante se transfirió a un nuevo vial, se le añadieron 200 μl de etanol al 95% y se mezcló pipeteando varias veces. La suspensión se transfirió a una columna SV proporcionada por el fabricante y se centrifugó 1 min a 12.000 × g; el líquido recogido se vació y la columna se lavó haciendo pasar 600 µl de solución de lavado suplementada con etanol al 95%. A la columna se le añadieron 50 µl de solución de DNasa (suministrada por el fabricante), 40 μl de tampón Yellow Core, 5 μl de MnCl2 (0,09 M) y 5 μl de DNasa I y se incubó 15 min a temperatura ambiente; a continuación se añadieron 200 μl de solución de paro y se centrifugó 1 min; el filtro se lavó 2 veces con solución de lavado mediante centrifugación. Finalmente, el ARN retenido en el filtro se eluyó añadiendo 100 μl de H2O-LN y centrifugando durante 1 min; la solución de ARN recogida en el vial se conservó a –20 ºC hasta su uso. RNeasy® Mini Kit (Qiagen).- A un volumen de 200 µl de virus crudo se le añadieron 350 µl de tampón de lisis RLT suplementado con ßmercaptoetanol a una concentración final de 0,14 M y se homogenizó con una pipeta. A continuación se añadieron 350 µl de etanol al 70%, la suspensión de lisis se transfirió a una columna RNeasy Spin (suministrada por el fabricante) y se centrifugó a 8000 × g durante 15 seg. Tras descartar el filtrado, el ácido nucleico retenido en la columna se lavó añadiendo 700 µl de tampón RW1 y centrifugando como ya se ha descrito. A continuación se cambió el tubo colector, se añadieron 500 µl de tampón RPE (suplementado con 4 volúmenes de etanol absoluto) y se centrifugó nuevamente. Seguidamente se descartó el filtrado, se añadieron de nuevo 500 µl de tampón RPE y se centrifugó Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 34 2 min a 8000 × g. Se cambió el tubo colector y se añadieron 100 µl de H2O-LN, se incubó 30 seg a temperatura ambiente y se centrifugó un min para eluir el ARN, que se conservó a –20 ºC hasta su uso. CUANTIFICACIÓN DEL ARN EXTRAIDO Para medir la concentración del ARN extraído se utilizó un espectrofotómetro GeneQuant (Pharmacia Biotech), con una cubeta de cuarzo de 60 µl de volumen de medición (QS 1000, Hellma®). La concentración se calculó en base a la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm (teniendo en cuenta esta longitud de onda, a un valor de absorbancia de 1 le corresponde una concentración de ARN de 40 ng × μl-1). Por otro lado, la relación entre las absorbancias a 260 y 280 nm representa una estimación de la pureza del ARN; así el ARN puro presenta un ratio de 2 entre ambas absorbancias; ratios entre 1,7 y 2 se consideran medidas aceptables y corresponden a ARN altamente puro (Ausubel y col., 1995). SELECCIÓN DE CEBADORES Para la detección de VHSV por RT-PCR se diseñaron un total de 3 parejas de cebadores (Tabla 1.2) con un tamaño entre 19 y 23 nucleótidos, seleccionados para la síntesis de productos de amplificación específicos de tamaños entre 358 y 432 pares de bases. La selección se realizó en base a la secuencia genómica de la cepa de VHSV FR-07/71 (Número de acceso de la GenBank AJ233396), así como otras secuencias incluidas en la base de datos de secuencias genómicas GenBank. A continuación se llevó a cabo la selección de cebadores con el programa PrimerSelect, y una evaluación teórica de las distintas parejas, consistente en la Capítulo 1 35 búsqueda de homologías entre las secuencias de los cebadores preseleccionados y las diversas secuencias de los virus, mediante el programa MegAling ambos incluidos en el paquete de software DNASTAR™ (Lasergene). Asimismo, se tuvo en cuenta la capacidad de autohibridación y de formación de estructuras "hairpin" de solapamiento de cada uno de estos cebadores. Tabla 1.2: Descripción de los cebadores ensayados. CEBADORES SECUENCIA (5’-3’) POSICIÓN1 F (Pb)2 VHSV-cm1a CGTGCCGTCGAAGAAGAGATA 2718-2738 432 VHSV-cm1b ACTGATAGCGGGAGATGGATG 3129-3149 VHSV-cm3a CAGGCGTTGTCCGTGCTTCT 278-297 358 VHSV-cm3b ACCCTGCGAGAGTTTCCTGATGG 615-635 VHSV-cm10a ACAACAGCGCTCAATACAAG 3988-4007 399 VHSV-cm10b AGAACTGCTGCATCGGAATC 4367-4386 1.-Posición en el genoma de la cepa FR07/71 (AJ233396). 2.-Tamaño del fragmento de amplificación, en pares de bases. El producto de amplificación resultante del uso de la pareja de cebadores VHSV-cm1 presenta un tamaño de 432 pb, localizado en la región intergénica entre el gen de la proteína Matriz (M2) y el gen que codifica para la glicoproteína (gen G). La pareja de cebadores VHSV-cm3 amplifica un producto de 358 pb, perteneciente a la región codificadora de la nucleoproteína (N). Finalmente, la pareja de cebadores VHSV-cm10 ha sido seleccionada en una región del gen G y presenta un producto de amplificación de 399 pb. La Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 36 localización y el tamaño de los cebadores se pueden observar esquematizados en la figura 1.1. AMPLIFICACIÓN MEDIANTE RT-PCR Para la amplificación del ARN viral y obtención del fragmento específico se empleó el kit comercial de RT-PCR SuperScriptTM III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen) que permite realizar las reacciones de transcripción inversa y de PCR en un mismo vial. Una cantidad aproximada de 100 ng de ARN viral se desnaturalizó a 95 ºC durante 4 min en presencia de los cebadores correspondientes (a una concentración final de 1 µM), y rápidamente se transfirió a 48 ºC para permitir la renaturalización durante 10 min. Seguidamente se añadieron 25 µl de Mezcla de Reacción 2X (dNTP 0,4 mM; MgSO4 2,4 mM) y 1 µl de la mezcla de enzimas (transcriptasa inversa y ADN polimerasa), además de H2O-LN hasta completar un volumen total de 50 µl. La mezcla se incubó 30 min a 48 ºC (fase de transcripción inversa), tras la cual la transcriptasa inversa se inactivó Figura 1.1: Mapa de localización (en la secuencia genómica de la cepa de referencia FR07/71) de los fragmentos de amplificación correspondientes a las tres p are j as de cebadores testadas. Capítulo 1 37 mediante desnaturalización durante 5 min a 94 ºC. Seguidamente se aplicaron 35 ciclos de amplificación, cada uno consistente en 30 seg a 94 ºC (desnaturalización), 1 min a 60 ºC (rehibridación) y 2 min a 68 ºC (fase de elongación). Finalmente se aplicó una fase de extensión durante 10 min a 68 ºC. Como control negativo para la RT-PCR se usó H2O-LN. ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA Los productos de RT-PCR se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa. Para ello, se mezcló un volumen de 10 μl del producto de amplificación con 2 μl de tampón de carga (xilene-cianol:azul de bromofenol:glicerol; 1:1:5) y la mezcla se cargó en un gel de 2% de agarosa en tampón TAE 1X (tris-HCl 40 mM; ácido acético 20 mM; EDTA 2 mM, pH 8,0). La electroforesis se llevó a cabo a 100 V durante 2 horas; a continuación, el gel se tiñó en una solución de bromuro de etidio (0,5 mg × ml-1) durante aproximadamente 30 min y las bandas se visualizaron en un transiluminador de luz U.V. con ayuda del sistema de fotodocumentación Gelprinter Plus (TDI). En ocasiones el gel de agarosa se preparó directamente con una concentración de bromuro de etidio de 0,5 µg × ml-1, lo que permitió la visualización del gel bajo luz U.V. durante el transcurso de la electroforesis. El tamaño de los productos de amplificación se determinó mediante comparación con marcadores de pesos moleculares. EVALUACIÓN DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Una segunda evaluación de la eficacia de cada uno de los procedimientos empleados para la obtención del ARN viral se realizó de forma cualitativa. Para ello, se utilizaron placas de 6 pocillos con monocapas Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 38 semiconfluentes de células EPC que se inocularon a una MOI entre 0,01 y 0,1 con cada una de las 4 cepas de referencia, incubando a 15 ºC. Tras el desarrollo de ECP en cada pocillo, se aplicaron los métodos de extracción descritos anteriormente. A continuación, el ARN viral extraído en cada uno de los casos se sometió a RT-PCR empleando la pareja de cebadores VHSVcm3. La obtención de un producto de amplificación específico y el nivel de intensidad del mismo en el gel de agarosa se consideraron como indicadores cualitativos de la eficacia de la extracción. EVALUACIÓN DE LAS PAREJAS DE CEBADORES Evaluación de la eficacia y especificidad.- Para llevar a cabo la evaluación de la eficacia de las parejas de cebadores preseleccionados, cada una de las cepas de referencia utilizadas se inoculó en frascos de 25 cm2 con tapices confluentes de células EPC. Cuando comenzó a visualizarse el ECP, los tapices infectados se sometieron a extracción del ARN viral empleando el método de Trizol; se midió la cantidad de ARN extraído y se igualó la concentración de ARN de los aislados. El ARN extraído se repartió en 3 alícuotas, cada una de las cuales se sometió a amplificación como se indicó anteriormente, con cada una de las tres parejas de cebadores descritas. Tras electroforesis en gel de agarosa, la eficacia de los cebadores se evaluó cualitativamente en base a la especificidad y al nivel de amplificación, determinado por la ausencia de bandas inespecíficas y por la intensidad de la banda específica, respectivamente. Evaluación de la sensibilidad.- Para evaluar la sensibilidad de la RTPCR con las 3 parejas de cebadores se utilizó virus semipurificado de la cepa FR07/71. La muestra de ARN viral, extraído mediante el método de PK/FC se ajustó a una concentración de 10 ng × µl-1 y se sometió a 3 diluciones decimales seriadas para alcanzar las concentraciones de 1 ng, 100 pg y 10 pg en los 5 µl usados para la RT-PCR, que se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Capítulo 1 39 Límite de detección.- Para establecer el límite de detección con la técnica de RT-PCR se utilizó nuevamente la cepa FR07/71, en este caso con la pareja de cebadores que demostró mayor eficacia en el apartado anterior. Para ello, el ARN viral obtenido mediante extracción con el método PK/FC se sometió a diluciones seriadas hasta alcanzar concentraciones de ARN de 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg y 0,1 fg, en un volumen de 5 μl; estas fueron sometidas a RT-PCR con el kit SuperScriptTM III One-Step RT-PCR system with Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen), como se indicó anteriormente. Además se valoró, del modo indicado en el apartado siguiente, el efecto de los procedimientos de confirmación de especificidad (HAN y nested-PCR) sobre el límite de detección en el diagnóstico. EVALUACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD DE LA RT-PCR La evaluación de la especificidad del producto amplificado con las tres parejas de cebadores se comprobó mediante las técnicas de Southern blot e hibridación con sondas específicas (SB/HAN) y nested-PCR. SB / HAN Preparación y marcaje de las sondas de ADNc. Los productos de amplificación obtenidos con las distintas parejas de cebadores, a partir de ARN extraído de la cepa de referencia FR-07/71, se sometieron a electroforesis en agarosa al 1,5%. Las bandas se cortaron con un bisturí y el ADNc se extrajo y purificó empleando el sistema DNA Gel Extraction Kit (Millipore), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. A continuación, entre 30 y 50 ng de ADNc se marcaron con digoxigenina utilizando el kit DIG-High Prime (Roche Diagnostics Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 40 Corporation), siguiendo el protocolo descrito por el fabricante. Las sondas marcadas se almacenaron a -20 ºC hasta su uso. Southern Blot (SB).- Los productos de amplificación se sometieron a electroforesis en agarosa al 1,5% durante 1 hora a 100 V. A continuación, los fragmentos de ADN fueron transferidos a una membrana de nylon Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech) utilizando el sistema Mini Trans-blot® Cell (Biorad) (Figura 1.2). Para desnaturalizar el ADN transferido, el gel se incubó a 4 ºC durante 15 min en agitación continua, en una solución de NaOH 150 mM, y a continuación se neutralizó con una solución de TBE 0,5X (Tris 20 mM, ácido bórico 20 mM, EDTA 1 mM) durante 10 min en agitación a 4 ºC. La transferencia se realizó durante 1 hora a 60 voltios, sobre una membrana de nylon equilibrada en tampón TBE 0,5X durante 15 min a 4 ºC. Finalmente el ADN se fijó a la membrana con luz UV (1.200 Kj durante 3 min) en un crosslinker CL-1000 (UVP) y se secó a 60 ºC durante 5-10 min. Hibridación de ácidos nucleicos (HAN).- Las membranas se incubaron en tampón de prehibridación Hibrisol I (3 ml × cm-2), en el interior de Figura 1.2: Sistema Mini Trans-Blot Cell / Mini Protean 3. Capítulo 1 41 bolsas selladas, en un horno de hibridación a 45 ºC durante 1,5 a 2 horas. Transcurrida la prehibridación, la solución fue sustituida por nueva solución hibrisol I (3 ml × cm-2), suplementada con 10 μl de la sonda previamente desnaturalizada durante 5 min a 100 ºC. La hibridación se realizó durante al menos 4 horas en un horno de hibridación a 45 ºC. Tras la incubación se retiró el tampón de hibridación y se procedió a lavar las membranas, primero un breve lavado con SSC 2X seguido de un lavado con una solución SSC 2X/SDS 0,1 % durante 15 min a temperatura ambiente, y a continuación un tercer lavado en solución SSC 0,1X/SDS 0,1 %, durante otros 15 min a temperatura ambiente. A continuación las membranas se lavaron con solución de lavado (ácido maleico 0,1 M; NaCl 0,15 M, pH 7,5; Tween 20 0,3%) durante 1 min, y se incubaron durante 30 min en la misma solución, suplementada con un 1,5% de reactivo bloqueante (Boehringer Mannheim). La solución de bloqueado se retiró, se añadió el anticuerpo conjugado Anti DIG-AP (Anti-Digoxigenina fosfatasa alcalina) en una relación 1:10.000 en solución de lavado, incubando 30 min. Para eliminar los restos de anticuerpo no incorporados se realizaron dos lavados consecutivos de 15 min en solución de lavado. Las membranas se trataron brevemente con tampón de fosfatasa (Tris-HCl 100 mM, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM; pH 9,5) y se incubaron con CSPD (Roche) diluido 1:100 en tampón fosfatasa a temperatura ambiente, en oscuridad y agitación. La membrana se secó sobre un papel de filtro, dejándola ligeramente húmeda, se introdujo en una bolsa sellada, se incubó a 37 ºC durante 15 min en oscuridad y a continuación se expuso contra una película autorradiográfica durante 30-40 min. Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 48 las 4 cepas de referencia de VHSV, representativas de los 4 genotipos. Así, como podemos observar en la figura, la amplificación en todos los casos dio lugar a bandas nítidas, bien definidas y del tamaño esperado, con ausencia total de productos de amplificación inespecíficos. Evaluación de la especificidad.- Las tres parejas de cebadores demostraron ser totalmente específicas para VHSV ya que no se obtuvo producto de amplificación cuando se aplicó RT-PCR al ARN extraído de cuatro cepas de IHNV representativas de los 4 electroferotipos (Figura 1.7). Este resultado se confirmó posteriormente por southern blot e hibridación con las sondas específicas de VHSV (resultados no mostrados). Evaluación de la sensibilidad.- Como se muestra en la figura 1.8, se observaron diferencias significativas en cuanto a la sensibilidad entre las 3 parejas de cebadores. Así, mientras con las parejas de cebadores VHSV-cm1 y Figura 1.7: Evaluación de la especificidad de los cebadores de VHSV. Productos de amplificación obtenidos al aplicar RT-PCR con cada una de las 3 parejas de cebadores (Cb) para VHSV (cm1, cm3 y cm10), utilizando como patrón el ARN viral extraído (mediante el método Trizol, LSReagent) de tapices celulares infectados con el virus VHSV (cepa FR07/71), o con cada una de las 4 cepas de referencia (Cr) del virus IHNV (1, 2, 3 y 4). Std2: Estándar de tamaños moleculares ( φ X174 cortado con Hae III) cuyos valores se indican en pares de bases. Capítulo 1 49 VHSV-cm10 solo se consiguieron productos de amplificación a partir de la dilución más alta utilizada como patrón (1 ng), la pareja VHSV-cm3 mostró el mayor nivel de sensibilidad al ser capaz de detectar hasta la dilución más baja de ARN (10 pg). Límite de detección.- Una vez seleccionada la pareja de cebadores que aportaba a priori una mayor sensibilidad, se llevó a cabo la determinación cuantitativa de un verdadero límite de detección. Así, como se muestra en la figura 1.9A, el límite de detección por RT-PCR, empleando la pareja de cebadores VHSV-cm3, fue de 10 fg. Este resultado se confirmó mediante Southern blot/HAN, comprobando además que la capacidad de detección se incrementaba en 1 lg, permitiendo la detección de 1 fg (Figura 1.9B). Figura 1.8: Productos de amplificación obtenidos mediante RT-PCR utilizando cada una de las 3 parejas de cebadores para VHSV (cm1, cm3 y cm10) y como patrón cantidades ARN de 1 ng, 100 pg y 10 pg de ARN. C-: control negativo, constituido por ARN extraído del virus IPNV; Std1: Estándar de tamaños moleculares (Bench Top 100bp DNA Ladder, Promega) cuyos valores se indican en pares de bases. Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 50 La sensibilidad se incrementó aún más al aplicar nested-PCR al producto de RT-PCR, si bien los resultados obtenidos variaron en función del procedimiento utilizado. Así, el límite de detección se redujo en 2 logaritmos, hasta 0,1 fg, cuando se utilizó como patrón ADNc extraído del gel de agarosa (Figura 1.10B), mientras que la capacidad de detección se mantuvo igual que por southern blot (1 fg de ARN) cuando se utilizó el producto de RT-PCR directamente del vial de amplificación (figura 1.10A). Figura 1.9: Evaluación del límite de detección por RT-PCR y RTPCR+SB/HAN. A. Gel de agarosa mostrando los productos de amplificación obtenidos mediante RT-PCR, utilizando la pareja de cebadores VHS-cm3, aplicado sobre diferentes cantidades de ARN (100, 10 y 1 pg; 100, 10, 1 y 0,1 fg) de la cepa FR07/71. Std3: Estándar de tamaños moleculares (100bp DNA Ladder, Genecraft) cuyos valores se indican en pares de bases. B. Southern blot e Hibridación utilizando una sonda específica para el producto de amplificación de VHSV-cm3. Capítulo 1 51 CINÉTICA DE DETECCIÓN Con el fin de determinar el tiempo mínimo (p.i.) de detección de ARN viral en células infectadas con VHSV, se llevaron a cabo los experimentos de cinética cuyos resultados se muestran en la figura 1.11. Como se puede observar, entre las 4 y las 12 h p.i. se obtuvo una marcada graduación en el nivel de detección en términos de intensidad de la banda de amplificación. Entre las 8 y las 10 h se obtuvieron bandas marcadas y bien definidas con las cepas de referencia de los 4 genotipos. Con los genotipos I y III, el tiempo mínimo para la detección del virus fue de 6 h, aunque en este caso las bandas de amplificación fueron generalmente poco definidas y los resultados no siempre repetibles. Los resultados a las 4 h fueron muy poco reproducibles aunque ocasionalmente se obtuvieron bandas de amplificación. Es importante indicar que todos estos positivos fueron confirmados mediante Southern blot/HAN, técnica que además, permitió descubrir y confirmar hasta las bandas menos definidas. Figura 1.10: Límite de detección del ARN viral mediante RTPCR/nested-PCR. Gel de agarosa mostrando los productos de amplificación obtenidos con la pareja de cebadores VHS-cm3 intro (A) utilizando 10 µl del producto de RT-PCR, (B) o utilizando ADNc extraído de un gel de agarosa. Std1: Estándar de tamaños moleculares (Bench Top 100bp DNA Ladder, Promega). Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 52 DISCUSIÓN Las enfermedades de origen viral son una de las causas más importantes de mortalidad en la acuicultura a nivel mundial, debido fundamentalmente a que en la actualidad no existe un método efectivo de tratamiento de las mismas; por ello, se hace imprescindible disponer de métodos de diagnóstico rápido y efectivos que permitan la pronta aplicación de medidas de control que eviten la diseminación de virus y la contaminación de lotes de peces y/o plantas de cultivo. Figura 1.11: Cinética de detección de ARN viral extraído de células EPC infectadas con virus VHSV. En la figura se presentan los geles de agarosa mostrando los productos de amplificación obtenidos al aplicar RT-PCR, con la pareja de cebadores VHS-cm3, al ARN extraído de las células infectadas con cepas de referencia de los genotipos I, II, III y IV del VHSV, a las 4, 6 y 8 horas (A) y a las 8, 10 y 12 horas post-inoculación (B); Std1: Estándar de tamaños moleculares (Bench Top 100bp DNA Ladder, Promega). Std2: estándar de tamaños moleculares φ X174, cortado con Hae III. Capítulo 1 53 Por tratarse de un virus de declaración obligatoria, los métodos de diagnóstico aplicables para la detección del virus VHSV se han establecido normativamente (Directiva 93/53) en el seno de la Unión Europea. Esta normativa exige la detección del virus en cultivo celular, seguida de la identificación mediante técnicas inmunológicas. En la actualidad se emplean métodos serológicos estandarizados y algunos comerciales que, sin embargo, pueden presentar problemas de sensibilidad (Dixon y col., 1997). Por ello, algunos autores opinan que es preferible la aplicación de métodos moleculares para el diagnóstico de este virus (Miller y col., 1998; Strømmen y Stone, 1998; Enzmann y col., 2000). Entre ellos, la técnica de RTPCR es una de las más utilizadas. Aunque de reconocida eficacia, su utilización como técnica de diagnóstico para VHSV es controvertida (Hiney, 2000; EinerJensen y col., 2002; Winton y Einer-Jensen, 2002), fundamentalmente por dos motivos: En primer lugar, antes de su utilización es preciso optimizar todos los factores que pueden influir en su capacidad de detección o sensibilidad, y en segundo lugar debemos asegurar su especificidad y repetibilidad (Dopazo y Barja, 2002). La técnica de PCR permite, al menos de modo teórico, la detección de tan solo una molécula de genoma viral, lo que da un máximo de sensibilidad en la detección del virus, y hace posible la detección del virus en cultivos celulares infectados, mucho antes de que se detecte efecto citopático en los mismos, lo cual redunda en rapidez (Bruchhof y col., 1995; Guillou y col., 1999). Por otro lado, el correcto diseño y selección de las parejas de cebadores debería asegurar la detección de cualquier cepa del virus, lo cual redunda en su fiabilidad, además de evitar el desarrollo de falsos positivos con otros virus (asociado al concepto de especificidad). Además, la idoneidad de estas tecnologías permite su estandarización para alcanzar la máxima reproducibilidad (Dopazo y Barja, 2002) Estas premisas, sensibilidad, especificidad, fiabilidad, reproducibilidad y rapidez, son la meta a alcanzar en el diseño de nuevas técnicas de diagnóstico, Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 54 así como en la puesta a punto de las ya conocidas. Por ello, el objetivo central de este capítulo ha sido optimizar todos los factores que pueden influir en la capacidad de detección de VHSV mediante RT-PCR in vitro. El paso crítico por antonomasia en cualquier técnica molecular de diagnóstico y, por supuesto, en el caso de la PCR, es la extracción del ácido nucleico. Esto es así porque, para la detección del ácido nucleico viral, éste debe ser obtenido en cantidad y pureza apropiada para facilitar su amplificación enzimática (Dopazo y Barja, 2002). Un problema común relacionado con la aplicación de la PCR en un diagnóstico de rutina para VHSV es la presencia de inhibidores de la amplificación (Strømmer y Stone, 1998). La inhibición de la PCR se puede producir, además, por un exceso de ARN celular (mensajero y ribosómico) que enmascara los cebadores e impide su unión al ácido nucleico del virus. Algunos grupos han superado este problema introduciendo un paso de purificación del virus para desechar el exceso de material celular y otros inhibidores potenciales antes de la extracción del ácido nucleico (Yang y Xu 1993), aunque el riesgo de contaminación se incrementa al aumentar la manipulación de la muestra, además de reducir la eficacia en la detección debido a las pérdidas de material genómico inherentes a toda manipulación, sin descartar la ralentización que toda manipulación extra implica en el proceso de diagnóstico. Por ello, una de las primeras variables examinadas en el presente trabajo fue el método de extracción del ácido nucleico. Debemos destacar, no obstante que este ha sido, aunque profundo, un ensayo preliminar cuyo objetivo único era la selección del método de extracción que aportara una optimización de la detección del virus objeto de estudio. Queremos destacar, por otro lado, que nuestros resultados coinciden con los de un estudio mucho más amplio llevado a cabo por una parte de nuestro equipo, en el que se analizan todas las variables que afectan a la eficacia de la extracción de ácido nucleico (Olveira, 2006). En este caso, debemos destacar los resultados obtenidos con los métodos Trizol LS-Reagent (Invitrogen) y RNeasy MiniKit (Quiagen). El primero basado Capítulo 1 55 en el método tradicional de extracción con fenol, además de proporcionar resultados satisfactorios, presenta la ventaja de resultar muy económico, aspecto de gran importancia en diagnóstico rutinario; aunque es un método relativamente laborioso y lento, reduce el tiempo de ejecución, respecto al método tradicional de proteinasa K/Fenol-cloroformo, el cual, no obstante aportó resultados satisfactorios. Por el contrario, cabe destacar la rapidez de los métodos basados en resinas de captación, como es el caso del kit RNeasy, aspecto que también es de especial trascendencia cuando el volumen de muestras es elevado, aunque por supuesto se trata de un método de mayor coste. Fue sorprendente, por no esperable, la poca reproductibilidad obtenida con el resto de kits de resinas ensayados que por supuesto, han sido descartados. Basándonos en nuestros resultados, tanto el Trizol como el kit RNeasy podrían ser utilizados indistintamente en el diagnóstico rutinario de VHSV. Sin embargo, en el caso de diagnóstico rutinario en número elevado apostamos por el método Trizol LSReagent debido a su bajo coste. Si bien los ensayos de comparación de métodos de extracción de ácido nucleico que se presentan en este capítulo se realizaron con virus semipurificado, para asegurar una mayor pureza del ARN, la utilización de virus crudo en los ensayos de evaluación de los cebadores no presentó problemas claros de inhibición. La evaluación de 3 parejas de cebadores para la detección del virus VHSV a partir de cultivo celular infectado indicó que todas proporcionaban resultados satisfactorios en cuanto a su especificidad, si bien la pareja de cebadores VHSV-cm3 fue la que proporcionó mejores resultados en cuanto a sensibilidad. Es interesante señalar que esta pareja de cebadores está localizada en el gen de la nucleoproteína, región del genoma de VHSV que, según algunos autores, presenta gran similitud con IHNV (Enzmann y Bruchhof, 1989) por lo que a priori podría dudarse de su especificidad. Sin embargo nuestros resultados han demostrado que esta pareja de cebadores es igualmente eficaz para la diferenciación entre los novirhabdovirus que las situadas en otras Optimización de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vitro 56 regiones del genoma, principalmente en el gen G, región elegida por la mayoría de los grupos de investigación para el diagnóstico de VHSV (Bruchhof y col., 1995; Miller y col., 1998; Strømmen y Stone, 1998; Guillou y col., 1999); además de confirmar su capacidad para el diagnóstico de cualquier genotipo del virus VHSV. La capacidad de detección del virus en cultivo celular, mediante la técnica de RT-PCR, a diferentes tiempos post-infección, parece no depender en gran medida del genotipo del virus, y está asegurada a las 8 horas post-infección; si bien es cierto que, para algunos genotipos fue posible la detección a las 6 h p.i., esta fue aleatoria y no del todo reproducible, lo que nos hace suponer que nos encontramos ante niveles que rondan el límite de detección. Comparando estos resultados con los de otros autores, se puede observar por ejemplo que con virus como IPNV se habla de tiempos mínimos de detección mediante RT-PCR de 10 h p.i., 6 h p.i. mediante HAN (Olveira, 2006) o bien de 16 h mediante IF (Espinoza y Kuznar, 2002). De este modo, a la alta sensibilidad debemos sumar la rapidez del método; el ARN total es extraído satisfactoriamente en menos de 1 hora (RNeasy, Qiagen), y la técnica de RT-PCR, amplificando ácido nucleico después de su paso en cultivo celular, permite el diagnóstico en 3 días lo que contrasta con el aislamiento del virus en cultivo celular que requiere al menos 20 días para dar un diagnóstico tanto negativo como positivo, y este tiempo se incrementa si se produce toxicidad o problemas de contaminaciones. Aunque es difícil comparar los resultados entre diferentes métodos y diferentes laboratorios (Nerette y col., 2005), quizás este tipo de comparación cuantitativa sea la menos subjetiva para determinar el mejor método de diagnóstico por su fiabilidad, sensibilidad y especificidad. El límite de detección es otro factor a tener en cuenta en la puesta a punto de la técnica de RT-PCR para la detección de cualquier virus. En este Capítulo 1 57 sentido, los límites de detección obtenidos en nuestros análisis han, como mínimo, igualado los de otros autores. Así, nuestro resultado de 10 fg como mínimo detectable es similar a los resultados descritos para otros virus de interés en acuicultura como el virus de la necrosis pancreática infecciosa IPNV (Wang y col., 1997) el gill-associated virus GAV (Cowley y col., 2000) o el yellow head virus (YHV) (Wongteerasupaya y col., 1997). Aunque el Southern blot/HAN es una conocida herramienta de confirmación de la especificidad de la amplificación por PCR, creemos que esta es la primera vez en que se demuestra que su aplicación incrementa la sensibilidad de la PCR, bajando el nivel de detección a 1 fg, resultado equivalente al obtenido con la aplicación de la nestedPCR directamente sobre el producto de la primera amplificación por PCR. Esto no coincide con los resultados obtenidos por Dalla Valle y col. (2000) con betanodavirus quienes, usando una alícuota del producto de RT-PCR (no purificado), obtienen un incremento de la sensibilidad de al menos 2 logaritmos. No obstante, nosotros hemos alcanzado ese mismo resultado recurriendo a la purificación, previa a la nested, del producto de la primera PCR a partir del gel de agarosa. Como conclusión podemos decir que la técnica de RT-PCR puesta a punto en el presente capítulo permite una detección específica, sensible y fiable de VHSV especialmente si se combina con Southern blot o nested-PCR, y asegurando la obtención de resultados en un corto periodo de tiempo. Además, la utilización de esta técnica para la detección del virus en cultivo celular aproxima el diagnóstico a las normativas europeas, confirmando, simultáneamente la viabilidad del virus detectado (una de las más frecuentes críticas al método de diagnóstico por PCR), evitando los largos periodos de incubación que se requerían con el simple aislamiento en cultivo celular. Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 64 fallar por razones de baja cantidad de partículas infectivas, inactivación del virus o toxicidad del material para el cultivo celular, entre otros motivos. La introducción de la técnica de RT-PCR en el diagnóstico de VHSV (Bruchhof y col., 1995; Strømmen & Stone, 1998; Guillou y col., 1999) ha solventado la mayoría de los problemas descritos, dado que se trata de un método de diagnóstico rápido, altamente sensible y específico. Sin embargo, los protocolos desarrollados hasta el momento se basan en procedimientos de muestreo cruento; lo que en ciertos casos, como en el control de lotes de reproductores, implica una carga económica difícil de asumir por los piscicultores, convirtiéndose incluso en una herramienta inútil y absurda cuando se trata de seleccionar individuos libres del virus para su uso en cadenas de producción con reducción de riesgos patológicos. En los últimos años se ha incrementado el estudio de métodos de análisis incruento que permiten determinar la presencia o ausencia de virus en peces sin necesidad de matar a los individuos y por lo tanto son de gran utilidad para el control de los lotes de reproductores en plantas comerciales, o bien especies de vida libre que se encuentran en peligro de extinción. Así, se han descrito protocolos que permiten el aislamiento de virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) a partir de muestras de sangre, mucus, branquias, piel y recto de ejemplares de salmón atlántico (Salmo salar) infectados experimentalmente (Munro y col., 2004). También se ha demostrado la idoneidad de las muestras de sangre para la detección y/o aislamiento de portadores asintomáticos de fletán atlántico (Hippoglossus hippoglossus) (Gahlawat y col., 2004) y rodaballo (Scophtalmus maximus) (Cutrín y col., 2005). Otros autores han notificado el aislamiento del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) a partir de muestras de fluido ovárico de peces portadores (Mulcahy y Batts, 1987), y del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) a partir del mucus de las branquias de peces asintomáticos (Griffiths y Melville, 2000). Capítulo 2 65 Por otro lado, la combinación de estas dos técnicas, análisis incruento mediante muestras de sangre y diagnóstico por RT-PCR, ha resultado muy efectiva para virus como ISAV, habiendo demostrado que el número de positivos se incrementa considerablemente (Giray y col., 2005) en comparación con los resultados de cultivo celular e IFAT (Opitz y col., 2000; Snow y col., 2003). OBJETIVO En el presente capítulo el objetivo principal ha sido desarrollar y optimizar un método específico y sensible para la detección de VHSV en muestras de sangre mediante RT-PCR y comparar su eficacia con la detección viral por RT-PCR aplicada directamente a los tejidos de peces, así como con los métodos tradicionales de aislamiento viral en cultivo celular. MATERIAL Y METODOS CEPAS VIRALES Y PROPAGACIÓN EN CULTIVOS CELULARES Para este estudio se utilizó, como referencia, la cepa F1 de VHSV, aislada originalmente a partir de trucha arcoiris (Jensen, 1965), que se propagó en frascos de 25 cm2 de la línea celular EPC (Figura 2.1). Para ello, tras vaciar el medio de los frascos se inoculó 100 µl de virus a la concentración necesaria para obtener una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 - 0,01 virus por célula. Después de un período de adsorción de 45 min a temperatura ambiente y en agitación, se eliminó el resto de inóculo y el tapiz se cubrió con medio mínimo Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 66 esencial de Eagle (EMEM). La incubación se realizó a 15 ºC hasta la visualización de efecto citopático (ECP) (Figura 2.1), momento en el que se procedió a recoger la suspensión viral (virus crudo). Una alícuota de esta suspensión se sometió a titulación viral tal y como se describe en el capítulo 1. Figura 2.1: Visualización de células EPC con 2, 5 y 20 días de crecimiento (A), y de los tapices de la misma línea celular mostrando efecto citopático a las 24, 48 y 72 horas post-infección (B). Capítulo 2 67 Para el reaislamiento viral tras la inoculación experimental en peces, se usaron, además de la línea EPC, las líneas celulares RTG-2 (Gónada de trucha arcoiris; Wolf y Quimby, 1962) y CHSE-214 (Embrión de salmón Chinook; Nims y col., 1970). ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LA RT-PCR IN VITRO Con el fin de determinar la capacidad de detección de la RT-PCR en muestras de tejido, se diseñaron dos experimentos para los que se utilizó una suspensión viral con un título de 1 × 105 TCID50 × ml-1. Experimento 1: Para este ensayo, cuya representación esquemática se puede observar en la figura 2.2, se utilizó 1 g de tejido (mezcla de bazo y riñón) procedente de un pez no infectado (confirmado por RT-PCR); a este se la añadió 1 ml de la suspensión viral original y se homogenizó utilizando un OMNI 2000. El homogenizado resultante se incubó durante 24 horas a 15 ºC para permitir la adsorción y penetración del virus. Una vez transcurrido ese tiempo, la suspensión se centrifugó a 1.000 × g durante 30 minutos, y el precipitado se conservó a -20 ºC hasta su uso. Para determinar la cantidad de virus no adsorbido por las células del tejido, se procedió a la titulación de tres alícuotas del sobrenadante tal y como se describió en el capítulo anterior. La carga viral por gramo de tejido se determinó calculando la diferencia entre el virus inicialmente inoculado (1×105 TCID50) y la media del título de las tres alícuotas de virus no adsorbido (3×103 TCID50), lo que nos proporcionó un valor de virus adsorbido de 0,97 × 105 TCID50 × g-1. Una vez conocida la carga viral del tejido, este se diluyó 1:10 en EMEM con antibiótico y se mezcló con distintos volúmenes de Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 68 una suspensión de tejido no infectado a relaciones de dilución de 1:1, 1:5, 1:10 y 1:100. De esta forma se prepararon las siguientes concentraciones 4,85×103, 1,93×103, 0,97×103 y 0,97×102 TCID50× ml-1 que equivalen a 4,85×104, 1,93×104, 0,97×104 y 0,97×103 TCID50 × g-1 de tejido, respectivamente. A continuación se procedió a la extracción de ARN total, a partir de 300 µl de cada dilución del tejido homogenado, usando Trizol LS Reagent, según descrito por el fabricante, y tal y como se describe en el capítulo 1. El ARN resultante se resuspendió en 50 µl de H2O-LN. Experimento 2: Paralelamente se llevó a cabo un segundo experimento, siguiendo el protocolo descrito por Mikalsen y col. (2001) para otro virus de peces, el ISAV. Para ello se utilizó una alícuota de la misma suspensión de virus original (título 1 × 105 TCID50 × ml-1) a partir de la que se prepararon diluciones decimales seriadas, (en tampón Earle’s suplementado con Capítulo 2 69 penicilina 1.000 U.I./ ml, estreptomicina 1.000 µg/ml y fungizona 10 µg/ml), comprendiendo un rango entre 105 y 100 TCID50 × ml-1. Cada una de las diluciones se mezcló, en una proporción 1:1, con tejido (bazo y riñón) procedente de peces no infectados y la mezcla se incubó durante 1 hora a 15 ºC (Figura 2.3). Finalizado el periodo de incubación, se procedió al procesado de las muestras, siguiendo el protocolo descrito por Ledo y col. (1987). Brevemente, la mezcla virus-tejidos se trituró hasta alcanzar una mezcla homogénea, se centrifugó a 2.000 × g durante 20 min y el sobrenadante se incubó durante un mínimo de 4 horas a temperatura ambiente para permitir la actuación del antibiótico. Finalmente se extrajo el ácido nucleico usando Trizol LS-Reagent (Invitrogen) como se describió anteriormente. En ambos experimentos, el ARN obtenido se sometió a RT-PCR, nested-PCR y Southern blot / hibridación de ácidos nucleicos (SB/HAN) siguiendo los protocolos descritos en el capítulo 1. Para poder comparar los límites de detección mediante RT-PCR obtenidos en este ensayo con los obtenidos en el capítulo anterior utilizando virus parcialmente purificado, se utilizó la siguiente formula: γ=n/N×GL×NcMw; donde γ es la cantidad en gramos de ARN, correspondiente a un titulo viral conocido, n es el número Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 70 de moléculas de ARN equivalente al valor de TCID50 (asumimos que 1 TCID50 corresponde a 1 partícula viral), N es el número de Avogadro (6,023 x 1023 ), GL es la longitud del genoma de VHSV (estimado como 11.000 nucleótidos) y NcMw es el peso molecular medio de un nucleótido de ARN monocatenal (estimado en 340,5 Da). EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DETECCIÓN IN VIVO Para este ensayo se emplearon 180 ejemplares de trucha común (Salmo trutta fario) de unos 12 - 15 cm, proporcionadas por el Servicio de protección da Natureza de la Consellería de Medio Ambiente, Xunta de Galicia. Los peces se mantuvieron en las instalaciones del Instituto de Acuicultura durante un periodo de aclimatación de 30 días, en tanques de 25 l con aireación y temperatura de 10 ºC. Durante este periodo se tomaron muestras de 10 individuos que se procesaron para el diagnóstico virológico y descartar la presencia del virus VHSV, IHNV e IPNV. La infección experimental se realizó mediante inyección intraperitoneal. Para ello se inocularon 160 peces con un volumen de 0,1 ml de suspensión viral con un título de 1 × 105 TCID50, como controles negativos se emplearon 10 peces inoculados con la misma cantidad (0,1 ml) del sobrenadante de un cultivo de células EPC no infectado. A los 10 días post-infección se tomaron muestras heparinizadas de sangre de 40 peces (200 - 500 µl), mediante punción de la vena caudal de los individuos previamente anestesiados. A continuación se sacrificaron los peces y se procedió a la extracción, en condiciones asépticas y de forma individualizada, de bazo y riñón. Cada muestra se identificó con un código similar que permitiese relacionar sangre y tejidos obtenidos del mismo individuo. Las muestras se Capítulo 2 71 procesaron para la extracción del ácido nucleico tal y como se describe a continuación: Extracción de ARN viral a partir de muestras de sangre: Para la extracción del ARN de las muestras de sangre se utilizó el kit comercial QIAamp® RNA blood Mini Kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante con ligeras modificaciones como se describe a continuación. Cada muestra de sangre heparinizada (200 μl) se mezcló con 1 ml de tampón EL y se incubó durante 15 min en hielo. A continuación se centrifugó durante 10 min a 400 × g y a 4 ºC, se desechó el sobrenadante y se añadió nuevo tampón EL, repitiendo la centrifugación. A continuación se añadió el tampón RLT suplementado con β-mercaptoetanol; la mezcla resultante se transfirió a la columna QIAshredder y se centrifugó 2 min a 14.000 × g y a 4 ºC. El precipitado resultante se mezcló con 350 μl de etanol al 70% y se transfirió a una columna QIAamp para su centrifugación durante 30 seg a 8.000 × g y a 4 ºC. Seguidamente, el filtro de la columna se lavó una vez con tampón RW1 (30 seg, 8.000 × g, 4 ºC) y dos veces con tampón RPE (8.000 × g durante 30 seg y 3 min respectivamente). El ARN resultante se resuspendió en 50 μl de H2O libre de nucleasas. Extracción de ARN viral a partir de muestras de tejido: Las muestras de tejido se procesaron siguiendo el protocolo descrito por Ledo y col. (1987), procediéndose a la extracción del ARN con Trizol LS-Reagent (Invitrogen) como se describió en el capítulo 1. El ARN obtenido de ambos tipos de muestras se sometió a RT-PCR y los resultados se confirmaron mediante SB / HAN, o mediante nested-PCR, según se ha descrito en el capítulo 1. Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 72 El mismo procedimiento se repitió a los días 20, 30 y 40 postinfección usando en cada caso 40 peces. Por otra parte las muestras de tejidos (bazo y riñón de cada pez) se procesaron para su inoculación en cultivo celular siguiendo las indicaciones de la Comisión Europea 2001/183/EC (exceptuando los tiempos e incluyendo las células CHSE-214 que no se recomiendan para el aislamiento de VHSV). Las muestras se inocularon por triplicado en monocapas semiconfluentes de células EPC, RTG-2 y CHSE-214 en placas de 24 pocillos y se incubaron a 15 ºC. Los cultivos celulares se examinaron diariamente hasta detectar el desarrollo de ECP; después de 20 días las muestras positivas y negativas se sometieron a un segundo pase o pase en blanco que se finalizó pasados los 15 días de incubación. RESULTADOS EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD DE LA DETECCIÓN POR RT-PCR IN VITRO Los resultados obtenidos permitieron establecer un límite de detección en tejidos infectados que osciló entre 0,97 × 103 y 1 × 100 TCID50 × g-1 dependiendo del experimento. Así cuando el tejido se incubó durante 24 horas con la suspensión viral se visualizó producto de amplificación partiendo de una carga viral de 0,97 × 103 TCID50 × g-1 (Figura 2.4). Este valor corresponde a un total de 29 TCID50 por 50 μl de ARN extraído (considerando que 103 TCID50× g1 equivalen a 102 TCID50 × ml-1, y que se utilizaron 300 µl de suspensión de tejido para la extracción del ARN). Además, teniendo en cuenta que de la suspensión final de ARN (50 µl) se emplearon únicamente 5 µl como patrón para el RT-PCR, el límite de detección absoluto se estableció en Capítulo 2 73 aproximadamente 3 TCID50, que se corresponden con 18,7 ag de ARN (Tabla 2.1). Tabla 2.1: Límite de detección de ARN viral extraído a partir de tejido (en comparación con los resultados obtenidos en el capítulo anterior con ARN de virus purificado). Muestra Método utilizado Límite de detección Equivalencia (2) ARN viral de tejidos (1) RT-PCR (24 horas) 3 TCID50 18,7 ag RT-PCR (1 hora) 0,02 TCID50 0,124 ag ARN de virus purificado (*) RT-PCR 10 fg 1,6 × 103 TCID50 RT-PCR+Southern (3) 1 fg 1,6 × 102 TCID50 RT-PCR+Nested (4) 1 fg 1,6 × 102 TCID50 RT-PCR+Nested (5) 0,1 fg 1,6 × 101 TCID50 (1): ARN extraído a partir de tejidos incubados con VHSV (24 horas de absorción y 1 hora) detectado por RT-PCR. (2): Datos que corresponden a la equivalencia (considerando que 1 partícula viral = 1 TCID50) calculado según la fórmula γ=n/N×GL×NcMw donde γ es la cantidad en gramos de ARN correspondiente a un titulo viral conocido, n es el número de moléculas de ARN equivalente al valor de TCID50, N es el número de Avogadro (6,023 x 1023 ), GL es la longitud del genoma de VHSV (11000 nucleótidos) y NcMw es el peso molecular medio de un nucleótido de ARN monocatenal (340,5 Da). (*) Resultados obtenidos en el capítulo 1. (3): RT-PCR seguido de Southern Blot. (4): RT-PCR seguido de nested-PCR con el producto de PCR. (5): RT-PCR seguido de nested-PCR con el producto de RT-PCR purificado. Figura 2.4: Límite de detección en tejidos correspondiente a la absorción del virus durante 24 horas. Las calles se corresponden con los siguientes títulos virales 1, 4,85×104 TCID50; 2, 1,93×104 TCID50; 3, 0,97×104 TCID50 y 4, 0,97×103 TCID50 por cada gramo de tejido. Std3: Estándar de tamaños moleculares (100bp DNA Ladder, Genecraft). C+ control positivo. Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 80 experimental de este tipo, es necesario considerar tiempos de incubación que simulen lo mejor posible las condiciones naturales. La transformación de los límites de detección obtenidos en los tejidos infectados (expresados en TCID50) en cantidades de ARN (asumiendo que un TCID50 equivale a una partícula viral) nos proporcionó unos valores sospechosamente bajos. Así, estos límites se establecían en 18,7 o 0,124 ag (incubación de 24 y 1 hora respectivamente), muy inferiores a los obtenidos utilizando el ARN purificado (10 fg, resultados presentados en el capítulo 1). Ante una diferencia tan grande, decidimos aplicar la fórmula utilizada en el cálculo anterior a la suspensión viral utilizada (1,7 × 108 TCID50/10 ml) para obtener el ARN del virus purificado y, teniendo en cuenta las diluciones realizadas a partir del ARN extraído (168 ng/µl), establecer el límite de detección. Estos cálculos nos proporcionaron un resultado de 1,24 ag, aproximadamente unas 8.000 veces menos que el límite de detección realmente observado (10 fg). Este tipo de cálculo, aplicado a los resultados obtenidos en otros virus de ARN monocatenal como el ISAV (Devold y col., 2000), nos proporcionó una relación similar: el valor calculado resultó 5.500 veces menor que el observado. Estos resultados indican que la asunción de que 1 TCID50 equivale a una partícula viral claramente infraestima la concentración real de virus en la suspensión. Podría argumentarse que la infraestima se deba al método de titulación empleado (TCID50) y que habría sido más apropiado titular el virus mediante el método de unidades formadoras de placa (PFU), que determinaría con más fiabilidad el número de partículas infectivas. Sin embargo, dado que se reconoce que 1 TCID50 equivale aproximadamente a 1,44 PFU (Dulbeco y Ginsberg, 1988), los valores de titulación obtenidos por ambos métodos no difieren demasiado. Por otro lado, aún aceptando la infraestima del método, que no detectaría partículas defectivas o variantes no infectivas (Devold y col., 2000; Villanueva y col., 2000), que sí aportarían su genoma y podrían ser detectadas Capítulo 2 81 por RT-PCR, la diferencia observada es tan grande que probablemente existen otros factores que contribuyen a esa divergencia. La utilización de las técnicas de RT-PCR y nested-PCR para el diagnóstico de VHSV en muestras de sangre, obtenidas de peces infectados experimentalmente, han demostrado que la capacidad de detección de este tipo de tecnología es claramente superior a la del aislamiento en cultivo celular. La sensibilidad de las dos técnicas en muestras de tejidos, aunque inferior a la mostrada en sangre, continuó siendo superior a la del aislamiento viral. Este resultado coincide con los obtenidos por Miller y col. (1998) usando RT-PCR seguido de seminested PCR aplicado directamente a muestras de tejido, quienes demuestran que este procedimiento es mucho más sensible que los métodos virológicos convencionales. Sin embargo, debemos remarcar que en algunos casos se podía apreciar un cierto número de bandas inespecíficas en los geles de agarosa tras la amplificación por RT-PCR de muestras de tejido, haciendo necesario el uso de hibridación mediante Southern blot para confirmar los resultados positivos, lo que permitió además incrementar la sensibilidad de detección. Estos resultados no concuerdan con los obtenidos por otros autores para ISAV que mantienen que el uso de Southern blot no incrementa el número de positivos detectados por RTPCR en muestras de tejido, aunque sí confirma la especificidad de la PCR (McBeath y col., 2000). Una de las críticas más importantes planteadas por numerosos investigadores con respecto al diagnóstico de infecciones virales mediante PCR es que esta técnica proporciona sólo una evidencia indirecta de la presencia del virus (Hiney y col., 2000; Einer-Jensen y col., 2002; Winton y Einer-Jensen, 2002), que además en muchos casos no puede confirmarse porque el patógeno no crece en cultivo celular. Es evidente que para obtener un resultado positivo mediante PCR sólo se necesita un fragmento de ADN, pero también es sobradamente conocido que la sensibilidad del cultivo celular puede ser Validación de la técnica de RT-PCR para el diagnóstico de VHSV in vivo 82 limitada, especialmente en peces portadores (Miller y col., 1998; Lorenzen y col., 1999; Taksdal y col., 2001). Además el diseño experimental que hemos planteado en este capítulo revela claramente que la RT-PCR está detectando partículas infectivas en lugar de simples fragmentos de ARN. De hecho el alto nivel de detección que se produce pasados los 10 días desde la inoculación tanto en sangre como en tejidos sugiere la existencia de una viremia, mientras que la progresiva disminución en los días sucesivos, donde sólo es posible detectar virus en sangre, parece indicar que la infección ha entrado en una fase de persistencia, fase en la que las partículas virales únicamente se encontrarían en el interior de los leucocitos como se ha sugerido previamente (Enzman, 1981). Por otra parte, es interesante señalar que la utilización de los periodos de incubación recomendados por la normativa europea para el aislamiento de VHSV en cultivo celular (7 - 10 días) no habría permitido la detección de los peces infectados en este estudio ya que fue necesario esperar hasta 20 días para observar la aparición de ECP. Los resultados obtenidos en este trabajo cuestionan la idoneidad de las directivas comunitarias cuando se trata de detectar portadores de VHSV y demuestran la utilidad de las tecnologías basadas en la PCR para la detección de portadores asintomáticos en términos de sensibilidad y tiempo de detección, como se había sugerido previamente para éste y otros virus (Bruchhof y col., 1995; Dalla Valle y col., 2000; Griffiths y Melville, 2000; Rodríguez y col., 2001). CAPÍTULO3: ANÁLISIS FILOGENÉTICO DE CEPAS DE VHSV GALLEGAS Y DEL FLEMISH CAP Capítulo 3 85  RESUMEN En este capítulo se evalúa la diversidad genética de un grupo de 31 aislados de VHSV con distinto origen, tanto geográfico como de hospedador, y se comparan con los genotipos representativos del virus mediante dos técnicas: análisis de secuencias y análisis de fragmentos de restricción (RFLP’s). En primer lugar, se comparan las secuencias de nucleótidos de una región específica del gen de la nucleoproteína que comprende una longitud de 335 nucleótidos. Por otro lado se desarrolla un método molecular basado en RFLP’s que simplifica el genotipado de rutina del virus VHSV. Para ello se emplea un fragmento de 1259 nucleótidos del gen de la glicoproteína, que se somete a restricción selectiva con uno o dos enzimas alternativos. Los resultados obtenidos han establecido que en general los aislados objeto de estudio de origen continental se agrupan en el genotipo I y los de origen marino en el genotipo III, mientras que los aislados a partir de especies anádromas pueden encontrarse en los dos grupos. Capítulo 3 87 INTRODUCCIÓN El virus de la septicemia hemorrágica viral es especialmente conocido como patógeno de trucha arcoiris (Oncorhinchus mykiss) en Europa, donde causa graves pérdidas económicas en granjas comerciales. Aunque durante muchos años se consideró a aquella el huésped principal de VHSV, el virus se ha aislado de una gran cantidad de especies tanto de vida libre como cultivados entre las que podemos citar trucha común (Salmo truta fario) y salmón atlántico (Salmo salar) (Rasmussen, 1965), bacalao (Gadus morhua) (Jensen y col., 1979), rodaballo (Scophthalmus maximus) (Schlotfeldt y col., 1991; Ross y col. 1994; Nishizawa y col., 2006), coregono (Coregonus sp.) (Ahne y Tomsen, 1985), bacalao del pacífico (Gadus macrocephalus) (Meyers y col., 1992), arenque (Clupea harengus pallasi) (Meyers y col. 1994), lenguado del pacífico (Paralichthys olivaceus) (Takano y col., 2000), eglefino (Melanogrammus aeglefinus) (Smail, 2000), fletán negro (Reinhardtius hippoglossoides) (Dopazo y col., 2002), sardina (Sardinops sagax) y caballa (Scomber japonicus) (Hedrick y col., 2003), lubina americana (Morone saxatilis) (Gagné y col., 2005) y lucio americano (Esox masquinongy) (Elsayed y col., 2006). Del mismo modo que aumenta el número de especies susceptibles al virus, lo hace el rango geográfico (Figura 3.1). Así, aunque los primeros aislamientos se realizaron en aguas continentales de un número limitado de países europeos, como Dinamarca, Francia y Alemania (Ahne y Tomsen, 1985; Meier y col., 1994), en la actualidad hay descripciones de VHSV en especies de agua dulce en países como Noruega, Portugal, Grecia y Suiza (Brudeseth y Evensen, 2002; Ariel y Olensen, 2002; Knuesel y col., 2003). En lo que respecta a aislados de origen marino, las descripciones abarcan aguas Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 88 costeras europeas especialmente en Mar del Norte, Báltico, alrededores de Gran Bretaña e Irlanda (King y col., 2001a), pero también Eslovenia (Ocvirk y col., 1981), Estonia y Rusia (Ariel & Olesen, 2002) y Turquía (Nishizawa y col., 2006), costas norteamericanas del Pacífico y del Atlántico (Meyers y Winton, 1995; Hedrick y col., 2003; Gagné y col., 2005) y zonas costeras de Tailandia y Japón (Takano y col., 2000; Watanabe y col., 2002). En otros lugares donde se desarrolla la acuicultura comercial como puede ser Chile o Australia no se ha descrito hasta el momento. Los virus aislados de peces marinos son serologicamente indistinguibles de los aislados continentales (Benmansour y col., 1997) y, aunque han demostrado ser poco o nada patógenos para trucha arcoiris (Skall y col., 2004a), sí lo son para rodaballo (King y col., 2001b). Inicialmente la clasificación serológica de VHSV comprendía tres serotipos: el serotipo 1 representado por la cepa F1, el serotipo 2 representado por la cepa Hededam (ambos aislados de trucha arcoiris en Dinamarca) y el serotipo 3 representado por la cepa francesa 23/75 aislada de trucha común (LeBerre y col., 1977). Sin embargo, en la década de los 90 Olesen y col. (1993) apuntaban la existencia de reacciones cruzadas entre estos tres serotipos Figura 3.1: Distribución geográfica del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV). Capítulo 3 89 y sugerían el uso de un antisuero policlonal y 4 anticuerpos monoclonales que definirían 4 serogrupos. En los últimos años la clasificación serológica ha sido desplazada por la utilización de técnicas moleculares, especialmente la secuenciación de ácidos nucleicos, que permite el tipado y la clasificación del virus de una forma fiable y relativamente rápida. Aunque el genoma de VHSV está compuesto por 6 genes (3’-N-M1-M2-G-NV-L-5’), la mayor parte de los estudios de secuenciación realizados se han basado en la secuencia completa o parcial del gen correspondiente a la glicoproteína (G) (Benmansour y col., 1997; Stone y col., 1997; Nishizawa y col., 2002; Thiéry y col., 2002, EinerJensen y col., 2004) y en menor medida en fragmentos del gen de la nucleoproteína (N) (Snow y col., 2004). Los primeros análisis de secuencias llevados a cabo por Stone y col. en 1997, establecieron la existencia de tres genogrupos: el genogrupo I estaría representado por las cepas americanas, el genogrupo II por los aislados de bacalao atlántico H17/5 y H19/1 y el genogrupo III estaría representado por los aislados tipo europeo F1, 23-75, He o FR07/71. En este mismo año otro grupo de investigadores (Benmansour y col., 1997) realizó un genotipado diferente basado también en una secuencia parcial del gen G. Así, según estos autores el genotipo I contendría los aislados continentales europeos, el genotipo II englobaría los aislados de rodaballo en Escocia y el genotipo III estaría constituido por los aislados americanos. En 1999, Snow y col. tras la secuenciación de un fragmento del gen N de un grupo de aislados de distintos orígenes propusieron la creación de 4 genotipos que incluyen uno nuevo correspondiente a aislados de la zona del Báltico. Sin embargo, trabajos posteriores (Nishizawa y col., 2002; Thiéry y col., 2002) mantuvieron la clasificación en los 3 genotipos establecidos en 1997 por Benmansour y col. Recientemente, Einer-Jensen y col. (2004) dividen al genotipo I, correspondiente a las cepas europeas, en 5 subgrupos. Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 96 se añadió una cantidad suficiente de H2O para obtener un volumen final de 20 µl. La reacción de secuenciación constó de 25 ciclos de 96 ºC (30 seg), 50 ºC (15 seg) y 60 ºC (4 min). Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante la purificación de los productos de extensión; para ello se añadieron 2 µl de acetato sódico 3M, (pH 4,6) y 50 µl de etanol 95%, se incubaron a temperatura ambiente de 15 a 30 min, se centrifugaron 20 min a 10.000 × g y a continuación se lavaron con 250 µl de etanol 70%. Las muestras se secaron mediante vacío y se resuspendieron en 4 μl de tampón de carga conteniendo formamida desionizada y EDTA 25 mM (pH 8) con azul dextrano (50 mg×ml-1) en una proporción 5:1. Finalmente, se desnaturalizaron a 95 ºC durante 2 min e inmediatamente se transfirieron a hielo para cargarlos en un gel de poliacrilamida al 4% en un secuenciador ABI modelo 373A DNA. Análisis de secuencias Las secuencias se editaron usando los programas SeqMan II y EditSeq, ambos del paquete DNASTAR (Lasergene, v.6). El alineamiento de las secuencias se realizó usando el programa MegAlign, que también forma parte del software DNASTAR, con los siguientes parámetros de alineamiento clustal W con gap penalty de 15 y gap length de 6,66 en el modo slow-accurate. Para los alineamientos múltiples se usaron los mismos parámetros además de un retraso en las secuencias divergentes (delay divergent seqs) del 30% y un peso de transición de ADN (DNA transition weight) de 0,5. El análisis filogenético se desarrolló según el método neighbour-joining (NJ) modelo F84, usando el programa Phylogeny Inference Package (PHYLIP versión 3.63), con la frecuencia de las 4 bases normalizada en función de las bases presentes en las secuencias objeto de estudio y dando un valor de 2 a la relación entre transición y transversión. El árbol filogenético se construyó usando el programa TreeView 1.5, con bootstrap de 1000. Capítulo 3 97 ANÁLISIS DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP’s) Selección de los enzimas de restricción El análisis de los RFLP’s se aplicó a un fragmento de 1259 pb correspondientes a una región del gen G. La selección teórica de las endonucleasas se realizó mediante el programa MapDraw de DNASTAR y su base de datos de enzimas (Lasergene, Inc.). Inicialmente se probaron alrededor de 250 enzimas y se preseleccionaron más de 100 en base a la presencia de lugares específicos de restricción en algunas de las secuencias de referencia empleadas, descartando los enzimas que a nivel teórico presentaban más de 4 dianas de restricción en una única secuencia o daban lugar a fragmentos difíciles de separar o de visualizar en geles de agarosa (por tener tamaños similares o por ser fragmentos demasiado pequeños, respectivamente). A partir de esta preselección teórica, se llevó a cabo una selección definitiva de los enzimas a ensayar, teniendo en cuenta el número de dianas de restricción esperadas para cada uno de los genotipos de VHSV, y el tamaño de los fragmentos obtenidos en la digestión. Las 10 endonucleasas finalmente elegidas fueron: Acc I, Alu I, Bsp 1286 I, Cfo I (isozima Hha I), Dde I, Eco RI, Eco RV, Hpa II (isozima Msp I), Mbo II y Nci I. El número de dianas de restricción y la posición de las mismas en los productos de PCR se determinaron en base a las secuencias publicadas correspondientes a las cepas FR07/71 (código de acceso AY546616) y DK3592B (X66134) del subgrupo Ia, DK1p12 (AY546574) y DK1p40 (AY546575) del subgrupo Ib, DK1p52 (AY546576) del genotipo II, UK860/94 (AY546628), UK-H17/5/93 (AY546630), DK-4p101 (AY546581), IRF13.02.97 (AY546620), UK-H17/2/95 (AY546629) y FR-L59X (AY546618) del genotipo III y USMakah (U28747) del genotipo IV usando el paquete de software de análisis de secuencias DNASTAR (Lasergene, Inc). Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 98 Predicción de la fiabilidad del sistema de tipado Tras la selección de los mejores enzimas, se llevó a cabo una evaluación teórica del sistema de tipado (mediante el software de Lasergene) englobando todas las secuencias disponibles en la base de datos GeneBank (70 secuencias: 35 de subgrupo Ia, 16 de Ib, 3 de Ic, Id y genotipo II, 9 de genotipo III y 1 del genotipo IV), y los resultados se expresaron como porcentaje esperado de cepas con un determinado RFLP. Obtención de los RFLP’s RT-PCR Para este ensayo se utilizó la pareja de cebadores (90103U y 90103L) localizadas en el gen G y que dan lugar a un producto de amplificación de 1259 pb (Tabla 3.4). Tabla 3.4: Cebadores empleados para el análisis mediante RFLP’s Nombre Secuencia (5’-3’) Longitud Posición* Ubicación 90103U TCCCGATTCGACCAGCTCAACTCA 1259 3119-4377 Gen G 90103L CCCTCCCACAACCCCCATCC * Posición referida a la secuencia publicada de la cepa de referencia FR07/71 (Acc. no. AJ233396). Con el fin de conocer la temperatura óptima para la reacción de transcripción inversa, ésta se llevó a cabo en ensayos previos, empleando un gradiente de temperaturas que abarcó de los 40 a los 49 ºC. Una vez optimizada esa fase, la reacción de RT-PCR se llevó a cabo con el Kit GeneAmp® Gold RNA PCR core (Applied Biosystem) en un Capítulo 3 99 termociclador MyCycler (BioRad). En una primera fase, al ARN viral desnaturalizado a 94 ºC durante 2 min, se le añadió la mezcla de reacción para la transcripión inversa (RT-PCR buffer 1X, 2,5 mM de MgCl2, 1 mM de dNTP, 0,5 U/µl RNAse inhibitor, 10 mM de dTT, 1,25 μM de random hexamers y 0,75 U/µl del enzima MultiScribe; Applied Biosystem) se incubó a 25 ºC durante 10 min y a 42 ºC durante 30 min. Al igual que en el paso anterior para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se aplicaron ensayos previos para determinar la temperatura óptima de renaturalización, por lo que para este paso se ensayó un gradiente de temperatura desde 50 a 59 ºC. Una vez optimizado este paso, la reacción de PCR se llevó a cabo preparando una mezcla de reacción con 0,15 μM de los cebadores específicos, dNTP 0,8 mM, 1,75 mM de MgCl2, RT-PCR buffer 1X y 0,05 U/μl de AmpliTaq Gold DNA polymerasa, al que se añadieron 5 μl del producto de la RT. La reacción se llevó a cabo comenzando con una incubación de 95 ºC 10 min, seguido de 45 ciclos de PCR con una desnaturalización de 60 seg a 94 ºC, renaturalización de 55 ºC, 90 seg y una amplificación de 90 seg a 72 ºC. La polimerización se concluyó con un período de extensión de 10 min a 72 ºC. Los productos de RT-PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa 1,5% con 0,5 mg/ml de bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz UV. A continuación se procedió a cortar las bandas específicas y el ADN se purificó usando el sistema DNA Gel extraction Kit (Millipore) según descrito en el capítulo 1. Tratamiento con endonucleasas de restricción La mezcla de reacción se preparó con aproximadamente 1 µg de ADNc, 1U del enzima seleccionado, 2 μl de tampón de restricción suministrado por el fabricante (específico para cada endonucleasa) y una cantidad de Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 100 H2O ajustada para un volumen final de 20 μl. A continuación se incubó a 37° C entre 3 y 4 horas. Los fragmentos de ADN, producto de la digestión, se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%; a continuación los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 mg/ml) durante 30 min y se visualizaron bajo luz ultravioleta. El tamaño de los fragmentos de ADN se estimó por comparación con la migración de un marcador de pesos moleculares (Bench Top 100 bp DNA ladder, Promega, o 100 bp DNA ladder, Genecraft). RESULTADOS ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS El análisis de la secuencia de un fragmento de 335 nucleótidos del gen de la nucleoproteína nos permitió establecer una serie de homologías entre los aislados analizados en este estudio y las cepas de referencia representativas de los distintos genotipos de VHSV; estos resultados se presentan ordenados según el genotipo (Tabla 3.5), o la especie huésped del aislado, en la tabla 3.6. Así, analizando cada una de las cepas y aislados por separado, podemos apreciar dos grupos de similitud, con los mayores porcentajes de homología de secuencias: un primer grupo, con homologías en torno al 98% con las cepas de referencia aisladas en epizootias de rodaballo cultivado (IR-F13.02.97 y UK860/94) y un segundo grupo con absoluta identidad de secuencia con la cepa FR07/71, cepa de referencia de trucha arcoiris (Tabla 3.5). Un análisis de las secuencias de nuestros aislados, agrupados según el huésped original, aportó datos interesantes. Así, observamos que prácticamente la totalidad de Capítulo 3 101 Tabla 3.6: Relaciones de similitud entre grupos de cepas (de referencia y aislados) Cepas de referencia (por genotipo) Aislados agrupados por especie de huésped Ia Ib II III IV STF Ssp OM CP SS SA SC SM GH 100±0 95,9±0,3 86,7±0,2 88,6±0,7 83,6±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 87,2±0 87,2±0 87,4±0,1 87,2±0,1 Ia 99,6±0,5 87,2±0,3 88,9±0,4 82,8±0,3 95,9±0,3 95,9±0,3 95,9±0,3 95,9±0,3 95,9±0,3 88±0,3 88±0,3 88,2±0,3 88±0,3 Ib 99,9±0,2 89,4±0,3 85,7±0 86,7±0,2 86,7±0,2 86,7±0,2 86,7±0,2 86,7±0,2 88,9±0,2 88,9±0,2 89,1±0,2 88,9±0,2 II 98,7±1 85,6±0,4 88,6±0,6 88,6±0,7 88,6±0,7 88,6±0,6 88,6±0,6 97,5±0,4 97,5±0,4 97,7±0,4 97,4±0,4 III 100±0 83,6±0 83,6±0 83,6±0 83,6±0 83,6±0 86±0 86±0 86,2±0,1 86±0,1 IV 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 87,2±0 87,2±0 87,4±0,1 87,2±0,1 STF 100±0 100±0 100±0 100±0 87,2±0 87,2±0 87,4±0,1 87,2±0,1 Ssp 100±0 100±0 100±0 87,2±0 87,2±0 87,4±0,1 87,2±0,1 OM 100±0 100±0 87,2±0 87,2±0 87,4±0,1 87,2±0,1 CP 100±0 87,2±0 87,2±0 87,4±0,1 87,2±0,1 SS 100±0 100±0 99,8±0,1 100±0,1 SA 100±0 99,8±0,1 100±0,1 SC 99,9±0,1 99,8±0,2 SM 100±0,1 GH Cada valor representa la media y la desviación típica de homologías entre grupos. Grupo STF:Trucha común; Grupo Ssp: Lenguado; Grupo OM: Trucha arcoiris; Grupo CP: Boga; Grupo SS: Salmón atlántico; Grupo SA: Dorada; Grupo SC: Salmón coho; Grupo SM: Rodaballo; Grupo GH: Fletán negro. Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 102 Capítulo 3 103 aislados obtenidos de peces marinos, fletán negro (grupo GH), rodaballo (grupo SM), y dorada (grupo SA) mostraban el mayor nivel de homología con el genotipo III, al igual que el aislado de salmón coho (grupo SC). Por su parte los aislados de peces de aguas continentales, trucha arcoiris (grupo OM), trucha común (grupo STF) y boga (grupo CP) junto con los aislados de salmón atlántico (grupo SS) presentaban una homología del 100% con el genotipo I, en concreto con el subgrupo Ia. Asimismo, es necesario destacar la total similitud observada entre el aislado de lenguado (grupo Ssp) con el mismo genotipo y subgrupo Ia. La secuencia de nucleótidos de los aislados del Flemish Cap obtenidas en el presente estudio han sido depositadas en la base de datos de secuencias GenBank con números de acceso del AJ849477 al AJ849490. ANALISIS FILOGENÉTICO Con el objetivo de examinar las relaciones existentes entre los aislados secuenciados en este capítulo y otros aislados de VHSV previamente secuenciados, se elaboró el árbol filogenético que se representa en la figura 3.3. La topología del árbol se corresponde con la de otros estudios previos (EinerJensen y col., 2004; Snow y col., 1999, 2004), manteniendo los 4 genotipos establecidos (I - IV) con el apoyo de valores significativos de bootstrap. Dentro del genotipo I se identificaron los 2 subgrupos Ia y Ib, pudiendo observar que todos nuestros aislados de origen continental, así como los de salmón atlántico, aparecen incluidos en el subgrupo Ia, junto con la cepa de referencia FR07/71; curiosamente también se engloba aquí el aislado de lenguado (Ssp11.02), coincidiendo con los resultados de homología anteriormente expuestos. Los aislados de origen marino, así como el aislado de salmón coho, aparecen agrupados con las cepas de referencia del genotipo III, entre los que se encuentran aislados del mar del Norte y de aguas costeras de Gran Bretaña e Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 104 Figura 3.3: Relaciones filogenéticas de los aislados objeto de estudio y las cepas de referencia de los distintos genotipos de VHSV. El árbol filogenético se obtuvo usando Neighbour-joining incluido en el programa PHYLIP (Phylogeny Inference Packege) versión 3.63. Los valores de Bootstrap están indicados como porcentajes de 1000 repeticiones. Los valores inferiores a 30 no se representan. Capítulo 3 105 Irlanda. La relación genética entre los miembros del genotipo III ilustrada en el árbol demuestra claramente dos brazos sustentados en valores de bootstrap de 100, donde podemos observar de nuevo que nuestros aislados se encuentran estrechamente relacionados con las cepas aisladas de rodaballo en Escocia e Irlanda, especialmente con la cepa UK860/94. RFLP’s Evaluación de enzimas de restricción De los 11 enzimas seleccionados a nivel teórico, únicamente las endonucleasas Hpa II (Msp I) y Mbo II presentaron perfiles diferenciados para cada genotipo de VHSV. Sin embargo estos enzimas presentan demasiados puntos de corte, como puede verse esquematizado en la figura 3.4, lo que daría lugar a fragmentos de tamaños relativamente pequeños (inferiores a 100 bp), lo que dificultaría su visualización en geles de agarosa y generaría cierta confusión para diferenciar los RFLP’s. Un problema similar se presentó con la endonucleasa Dde I, que teóricamente permitiría la diferenciación de los 4 genotipos, pero en realidad presenta patrones electroforéticos confusos dado que abundan los fragmentos de pequeño tamaño debido a la existencia de varias dianas de restricción. Además de la evaluación teórica negativa, se llevó a cabo una serie de ensayos a nivel práctico que confirmaron que estos enzimas no resultaban apropiados para el genotipado de los VHSV (resultados no mostrados). En la figura 3.4 se muestra el patrón de restricción a nivel teórico de un cuarto enzima, la endonucleasa Alu I, que no se reprodujo a nivel práctico. Así, a pesar de que teóricamente distinguían entre genotipo I, II, III y IV, al llevar a cabo el ensayo agrupó a los genotipos I y II en un único RFLP. Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 112 Por último, la endonucleasa Nci I (figura 3.9) tal y como se esperaba, presentó un mismo patrón electroforético para los genotipos II y III, con una diana de restricción en la posición (865) que dio lugar a dos fragmentos, de 865 Figura 3.9: RFLP’s de VHSV obtenidos con la endonucleasa Nci I. A. Representación esquemática de las dianas de restricción y la posición de las mismas. B. Perfiles electroforéticos obtenidos en los ensayos de restricción con la endonucleasa Nci I para una cepa de referencia de cada uno de los genotipos de VHSV. Std: 100 bp DNA ladder, Genecraft. Capítulo 3 113 y 394 pb. Sin embargo, permitió diferenciar entre los dos subgrupos del genotipo I (Ia y Ib), ya que las cepas del subgrupo Ia presentaron dos dianas de restricción, dando lugar a tres fragmentos, de 658, 395 y 206 pb y las del subgrupo Ib mostraron 3 dianas, con resultado de cuatro fragmentos de 658, 206, 207 y 188 pb. Finalmente, el genotipo IV se caracteriza a nivel teórico, por la presencia de 3 dianas de restricción que deben producir cuatro fragmentos, de 702, 400, 156 y 1 pb; sin embargo como se muestra en la figura 3.9B, solo se visualizan las 3 bandas de mayor tamaño, por ser indetectable la banda de 1 pb. Como resumen, en la tabla 3.7 se muestran los RFLP’s generados en los ensayos experimentales con cada enzima. Como podemos observar, los enzimas Acc I, Alu I y Cfo I generaron únicamente tres perfiles, de tal forma que agruparon a los genotipos Ib, II y III (Acc I), a los genotipos I y II (Alu I), o al genotipo Ia y II por un lado y Ib y III por otro (Cfo I). Las endonucleasas Hpa II y Dde I presentaron 4 RFLP’s, pero los resultados con ambos enzimas no siempre pudieron ser reproducidos y ocasionalmente aparecieron diferentes resultados cuando se emplearon los isozimas. Aunque el enzima Mbo II generó 5 Tabla 3.7: RFLP’s obtenidos con las endonucleasas aplicadas a los genotipos de VHSV. Endonucleasa RFLP 1 2 3 4 5 Acc I Ia Ib, II, III IV ---- ---- Alu I I1, II III IV ---- ---- Bsp 1286 I Ia Ib, II III IV --- Cfo I (Hha I) Ia, II Ib, III IV ---- ---- Dde I I1 II III IV --- Eco RI III I1, II, IV ---- ---- ---- Eco RV I1 II III IV --- Hpa II (Msp I) Ia Ib II, III IV ---- Mbo II Ia Ib II III IV Nci I Ia Ib II, III IV ---- 1.-Genotipo 1, incluye el subgrupo Ia y Ib. Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 114 RFLP’s con las cepas de referencia, la interpretación de los resultados directamente en un gel de agarosa puede ser difícil, tanto por la falta de coincidencia entre los resultados esperados y los observados para el genotipo II, como por la dificultad de diferenciar las cepas del genotipo I entre sí (subgrupos Ia y Ib) debido al reducido tamaño de las bandas (inferiores a 100 bp) que dificultarían su visualización en geles de agarosa y generarían cierta confusión para diferenciar los RFLPs. Por último los enzimas Bsp 1286 I, Eco RV y Nci I resuelven la mayoría de los genotipos. Así, Bsp 1286 I muestra 4 perfiles electroforéticos, uno para cada genotipo, aunque el RFLP 2 agrupa al subgrupo Ib y al genotipo II. El enzima Eco RV presenta 3 perfiles diferentes para los genotipos II, III y IV y un único RFLP para el genotipo I (subgrupos Ia y Ib). Con el enzima Nci I se obtienen 3 RFLP’s para los genotipos Ia y Ib y IV respectivamente y agrupa al genotipo II y III en el mismo RFLP. Desarrollo de un sistema de genotipado rápido y simple para VHSV Los resultados obtenidos en los ensayos de análisis de restricción con cada uno de los enzimas indicaron que ninguno de los enzimas ensayados permite diferenciar de forma individual todos los genotipos conocidos; por ello, para el desarrollo de un sistema de genotipado de VHSV se optó por un sistema alternativo en 2 pasos. Dado que los enzimas que generaban 4 o 5 RFLP’s permitían la separación de la mayoría de los genotipos, parecían ser los más adecuados para su utilización en este sistema. Para la selección de los enzimas más adecuados se tuvo en cuenta la sencillez de interpretación y repetibilidad de resultados (aspecto por el que fue descartado el enzima Mbo II), así como los análisis de fiabilidad a nivel teórico (robustez), en términos de repetibilidad de resultados con todas las cepas de cada genotipo con secuencias disponibles en GenBank (resultados no mostrados). En Capítulo 3 115 este sentido el único enzima que aportó un 100% de robustez fue Bsp 1286I, por lo que fue inmediatamente seleccionada como enzima primaria para el diseño del test de tipado; los restantes enzimas dieron porcentajes inferiores o muy inferiores, principalmente dentro de los genotipos I y III, exceptuando el enzima Nci I, con porcentajes de robustez ligeramente inferiores al 100% para los genotipos I y II, por lo que fue seleccionada como enzima secundario. De este modo, el sistema de genotipado por análisis de restricción en dos pasos (2-SRA) quedó diseñado de la siguiente manera (Tabla 3.8): el análisis de restricción con el enzima Bsp 1286I como enzima primario podría dar lugar a tres resultados resolutivos, con aislados de VHSV de los genotipos Ia, III y IV; solo en el caso de cepas de los genotipos Ib y II, que generarían un mismo RFLP, sería necesario aplicar al fragmento original, el enzima secundario Nci I, que permite separar ambos genotipos en 2 RFLP’s bien diferenciados. Tabla 3.8: Sistema de genotipado de cepas de VHSV mediante análisis de restricción en 2 pasos (2-SRA). Enzima 1 RFLP Genotipo Enzima 2 RFLP Genotipo Bsp 1286I 1 Ia 2 Ib, II Nci I 1 Ib 2 II 3 III 4 IV Aplicación del método de 2-SRA para aislados de VHSV En la tabla 3.9 se muestran los RFLP’s obtenidos con cada uno de los enzimas ensayados, con los aislados de VHSV objeto de estudio, y una asociación con los genotipos de referencia. Como se observa, solo el enzima Nci I proporcionó un tipado homólogo al obtenido en el análisis de secuencias. Es Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 116 destacable, además, que los enzimas Bsp 1286 I, Dde I y Eco RV aportaron un tipado de los aislados marinos (excepto el de lenguado) completamente diferenciativo respecto a los demás aislados, e incluso respecto a los genotipos de referencia. Tabla 3.9: Patrones de restricción característicos obtenidos con endonucleasas (RFLP’s) aplicados a los distintos genotipos y aislados de VHSV utilizados en este estudio. Endonucleasa Patrones de restricción 1 2 3 4 5 Alu I I1, OM, Ssp, CP, STF, SS, II, GH. SM, SA, SC III IV Bsp 1286I Ia, OM, Ssp, CP, STF, SS Ib, II III IV GH. SM, SA, SC Cfo I Ia, OM, Ssp, CP, STF, SS, II, GH. SM, SA, SC Ib, III IV Dde I I1, OM, Ssp, CP, STF, SS II III IV GH. SM, SA, SC Eco RI III Ia (OM, Ssp, CP, STF, SS), Ib, II, GH. SM, SA, SC y IV Eco RV I1, OM, Ssp, CP, STF, SS II III IV GH. SM, SA, SC Nci I Ia, OM, Ssp, CP, STF, SS Ib II, III, GH. SM, SA, SC IV 1.-Genotipo I que incluye los subgrupos Ia y Ib. La aplicación del sistema de tipado 2-SRA a los aislados de VHSV objeto de este estudio reveló que la utilización del primer enzima Bsp 1286 I permite la caracterización inequívoca de los aislados pertenecientes al genotipo I, subgrupo Ia (Figura 3.10) se trata de los grupos de aislados continentales, de trucha arcoíris, trucha común, salmón atlántico y boga además del aislado de lenguado. Sin embargo, el patrón obtenido con los aislados de origen marino Capítulo 3 117 (dorada, salmón coho, rodaballo y fletán negro) no se correspondía con ninguno de los perfiles definidos para las cepas de referencia, apreciándose 3 fragmentos de 593, 508 y 158; resultantes de la presencia de 2 dianas de restricción. La utilización del segundo enzima propuesto para el tipado en dos pasos, el Nci I (Figura 3.11), también permitió el tipado de todos los aislados del subgrupo Ia, pero no del resto de aislados de origen marino, ya que presentaban un patrón electroforético igual al obtenido para los genotipos II y III, con una diana de restricción en posición 865 dando lugar a 2 fragmentos de 865 y 394 pb. Los ensayos realizados con la endonucleasa Eco RV permitieron agrupar los aislados objeto de estudio en dos grupos bien definidos, como se puede observar en la figura 3.12. Por una parte, los aislados continentales y el aislado de lenguado mantuvieron el patrón electroforético esperado para cepas pertenecientes al subgrupo Ia, con tres bandas de 658, 395 y 206 pb (aunque Figura 3.10: Perfiles electroforéticos obtenidos con aislados de VHSV en ensayos de restricción con la endonucleasa Bsp1286I. Como estándar se usó Std 1 (Bench Top 100bp DNA Ladder, Promega) y Std 2 (100 bp DNA Ladder, Genecraft). Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 118 indistinguible del RFLP esperado para el subgrupo Ib), mientras que el resto de aislados (de origen marino) presentaron un patrón electroforético caracterizado por la ausencia de dianas de restricción, observándose un único fragmento que 1259 pb que corresponde a la longitud total de ADNc amplificado. Aunque este resultado difiere del patrón que presenta la cepa de referencia empleada en este estudio para el genotipo III, UK860/94 (dos fragmentos de restricción), a nivel teórico otras cepas de referencia del genotipo III se caracterizan por la ausencia de dianas de restricción para este enzima Eco RV (resultado no mostrado). Queremos hacer resaltar un resultado interesante obtenido con el aislado marino Ssp11.01 que, a pesar de proceder de lenguado, se agrupó, con ambos enzimas, con los aislados de origen continental y no con los restantes de origen marino. Figura 3.11: Perfiles electroforéticos obtenidos con aislados de VHSV en ensayos de restricción con la endonucleasa Nci I. Como estándar de tamaños moleculares se usó Std (Bench Top 100bp DNA Ladder, Promega). Capítulo 3 119 DISCUSIÓN La existencia de 4 genotipos dentro de VHSV directamente relacionados con el área geográfica de los aislados se ha demostrado en base a estudios filogenéticos, usando tanto el gen N (Snow y col., 1999, 2004) como el gen G (Einer-Jensen y col., 2004, 2006). Hasta el momento el genotipo III incluía aislados marinos del Mar del Norte y aguas costeras de las Islas Británicas junto con 2 aislados producto de brotes de VHS en granjas de rodaballo de Escocia e Irlanda (Einer-Jensen y col., 2004; Snow y col., 2004), así como un aislado de anguila capturada en el norte de Francia (Thiéry y col., 2002). Los resultados obtenidos en este estudio, tras la secuenciación de un fragmento de 335 nucleótidos de una región Figura 3.12: Perfiles electroforéticos obtenidos con aislados de VHSV en ensayos de restricción con la endonucleasa Eco RV. Como estándar de tamaños moleculares se usó Std1 (Bench Top 100 bp DNA Ladder, Promega). Análisis comparativo de secuencias genómicas de aislados de VHSV 120 correspondiente al gen N, indican que los aislados de rodaballo y salmón (atlántico y coho) cultivados en las costas gallegas deben ser agrupados dentro del genotipo III. Además, es interesante señalar que los aislados del Flemish Cap se agruparon en este mismo genotipo, extendiendo así el área geográfica comprendida por el genotipo III. El Femish Cap (Terranova), como sabemos, está alejado de las aguas europeas donde se han obtenido el resto de los aislados pertenecientes a este genotipo, sin embargo, la dispersión del virus se puede explicar si se tienen en cuenta los patrones migratorios del fletán. En este sentido los peces pertenecientes a esta especie están ampliamente distribuidos por el Atlántico Norte y sus movimientos migratorios pueden extenderse a grandes distancias que van desde Noruega e Islandia hasta los grandes bancos de Terranova (Vis y col., 1997). Además, las rutas migratorias del salmón atlántico salvaje relacionan directamente, a través de un área de alimentación (Sur de Groenlandia, Islandia y Feroes) a todas las poblaciones de esta especie, desde Canadá a los países escandinavos, y desde Galicia hasta Escocia (Anónimo 2001); por supuesto la interacción de las poblaciones de esta especie con otras especies a lo largo de sus rutas migratorias, podría explicar la diversidad geográfica y de huésped de las cepas del genotipo III. Los aislados de fletán negro del Flemish Cap (grupo GH) exhiben entre si una variabilidad baja, que podría extrapolarse a la totalidad de la población, lo que sugiere que estas cepas estarían compartiendo un origen común y relativamente reciente. La inclusión de los aislados gallegos y los de fletán dentro del genotipo III incrementa la variabilidad dentro de este genotipo. De hecho el número de diferencias entre algunos de los aislados de fletán y otros miembros del genotipo III, previamente secuenciados, es del orden de 7 a 10 nucleótidos en un fragmento de 335. En un estudio previo, Snow y col. (2004) mostraron una media de 4 nucleótidos de diferencias en unas 30 cepas de este genotipo, y solo 3 de ellas exhibían unas diferencias similares a las observadas en este estudio. Capítulo 3 121 Los aislados del Femish Cap muestran una alta similaridad (homologías del 97,4%) con las cepas del genotipo III empleadas como referencia: UK860/94 e IR-F13.02.97. Este alto nivel de homología con dos cepas que han estado implicadas en epizootias en granjas de rodaballo (Ross y col., 1994) advierte sobre el riesgo que las especies marinas de vida libre pueden representar para las piscifactorías de rodaballo, riesgo que ha sido sugerido ya por otros autores (Snow y Smail, 1999; King y col., 2001b; Snow y col., 2004). La homología de los aislados del Flemish Cap es incluso superior con los aislados gallegos (obtenidos de peces cultivados con síntomas de enfermedad), con niveles del 99,8 al 100%, lo que corrobora la relación entre los aislados de peces de vida libre y los cultivados, y cuestiona las normas de la Unión Europea para VHSV, basadas en el establecimiento de zonas autorizadas donde la enfermedad o el agente no han sido detectados. Resulta curioso que los aislados gallegos presenten una mayor homología con los aislados del Flemish Cap, que con aislados más próximos geográficamente y procedentes de la misma especie hospedadora. Dado que esta comparación se ha hecho sobre un fragmento relativamente pequeño, se podría pensar que obtendríamos una mayor resolución de resultados empleando un fragmento más grande y comparando con distintas regiones del genoma, sin embargo Einer-Jensen y col. (2005a) observaron que los resultados eran similares empleando un fragmento del gen N o bien la totalidad de los genes G o NV. Con respecto a los aislados de origen continental (SS, CP, STF, OM), estos presentan un nivel del 100% de homología con relación a la cepa de referencia del genotipo I, subgrupo Ia (FR07/71) aislada de trucha arcoiris. Es interesante señalar que en este grupo se incluye también la cepa Ssp 11.02, aislada de lenguado, y que hasta la fecha los aislados marinos de Europa se habían agrupado en los genotipos Ib, II y III (Einer-Jensen y col., 2004; Snow y col., 2004). Capítulo 4 129 INTRODUCCIÓN La septicemia hemorrágica viral (VHS) es la enfermedad más grave que puede producirse en una explotación industrial de trucha arcoiris, tanto desde el punto de vista patológico como económico. Al igual que otros virus de salmónidos, el virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) afecta especialmente a los individuos más jóvenes de la población, causando una enfermedad aguda con mortalidades en alevines que pueden llegar al 90%. No se han observado diferencias entre sexos en cuanto a la enfermedad, pero sí en el curso de la infección, ya que los portadores asintomáticos son más frecuentemente hembras. El punto de entrada del virus son las branquias, donde puede detectarse ya a los 2 días de la infección; otro punto de entrada, aunque en menor medida, es por el tracto gastrointestinal; por otro lado, la eliminación del virus se produce principalmente por la orina, lo que demuestra el relevante papel que presenta el riñón en la dispersión de la enfermedad (Neukirch, 1984, 1986), e incluso a través del mucus de la piel. La transmisión se realiza de forma horizontal, ya sea directa a través del contacto entre peces o indirecta, por la manipulación inadecuada por parte del piscicultor, o por medio de otras especies animales que actuarían como reservorios de la enfermedad (Wolf, 1988). En los últimos años se ha comprobado que esta enfermedad afecta también a peces no salmónidos. Se han descrito epizootias en especies de agua dulce en Centro Europa (Meier y col., 1994), así como en distintas especies de peces marinos salvajes y cultivados a lo largo del hemisferio norte, en Alemania (Schlotfeldt y col., 1991), Alasca (Meyers y col., 1992, 1994), Escocia (Ross y col., 1994) o Japón (Takano y col., 2000). Como su nombre indica, la VHS es una enfermedad de tipo hemorrágico. Se caracteriza por producir graves lesiones en los órganos productores de las células sanguíneas y en los vasos sanguíneos de los animales infectados. De Susceptibilidad de rodaballo Scophthalmus maximus y trucha común Salmo trutta fario a aislados de VHSV 130 hecho, la multiplicación del virus se produce en las células endoteliales del sistema vascular sobre todo de riñón y bazo, donde el título infectivo es más alto y comienza la viremia. Es reseñable el elevado porcentaje de reaislamiento del virus en cerebro, lo que explicaría los signos nerviosos con que cursa el estado clínico de VHS. La patología de la enfermedad está descrita ampliamente en trucha arcoiris, en la que transcurre en tres formas, conocidas como aguda, crónica y nerviosa, seguidas por el estado de portador de los peces supervivientes. El estado agudo, se manifiesta en los peces de los 0 a 30 días, a temperaturas entre 8 y 12 ºC y se caracteriza por la aparición de peces enfermos en el fondo del tanque, o con natación en espiral; a continuación se produce un progresivo aletargamiento de los animales que evitan toda actividad y se dejan llevar por el movimiento del agua. Externamente se observa oscurecimiento de la piel y exoftalmia bilateral; las branquias aparecen pálidas, y en la base de las aletas y en la piel se pueden ver pequeñas manchas hemorrágicas. Internamente la cavidad abdominal está llena de líquido seroso. Los análisis hematológicos demuestran un significativo descenso en el recuento de eritrocitos y del nivel de hemoglobina (Wolf, 1988). El estado crónico refleja una infección persistente sin signos externos evidentes; las truchas supervivientes aparecen con el abdomen retraído y una contracción clara en la línea longitudinal del cuerpo; desaparecen la anemia branquial, la exoftalmia y la distensión abdominal; se produce además un descenso en el nivel de glucosa y los valores de mortalidad son bajos (Řehulka, 2003). La fase nerviosa está caracterizada por la natación errática, que se asocia con el tropismo que presenta el virus por el cerebro, donde puede llegar a alcanzar un título de 1×109 TCID50/g (Smail, 1999). Aunque las causas del tropismo nervioso se desconocen, se cree que puede estar relacionado con la interacción específica de la glicoproteína de estos virus envueltos con la membrana lipoproteica de las células diana del tejido nervioso. En este sentido, Bearzotti y col. (1995) identificaron dos aminoácidos en la Capítulo 4 131 glicoproteína de VHSV que estarían asociados con la reducción de virulencia y el incremento del tropismo por el tejido nervioso. Peces no salmónidos, como lucio, coregono o salvelino europeo, que sufren epizootias debidas a VHSV exhiben signos externos y lesiones histológicas idénticas a las descritas para trucha arcoiris (Meier y col., 1994). Por su parte, la sintomatología de los peces marinos, en especial de rodaballo, se caracteriza por una marcada exoftalmia y distensión abdominal, con hemorragias del músculo esquelético, de la retina, del tracto digestivo y de la piel. El examen histológico revela colapso generalizado del músculo cardíaco y necrosis muy marcadas en las fibras ventriculares así como en las células del hígado (Ross y col., 1994; Brudeseth y col., 2005). El ataque cardíaco es probablemente la primera causa de muerte en los rodaballos infectados por VHSV, patología que no ha sido descrita en salmónidos (Smail, 1999; Brudeseth y col., 2005). Es conocido que la temperatura es determinante entre los numerosos factores ambientales que pueden influir sobre el desencadenamiento de la enfermedad. La VHS es una enfermedad de aguas frías, ya que la temperatura óptima para la replicación del virus en el pez varía entre los 9 y los 12 ºC. Las epizootias más frecuentes ocurren durante la primavera y el otoño, cuando la temperatura del agua es de 10 a 12 ºC (Nicholson, 1982) coincidiendo con la temperatura óptima para la replicación del virus. Por otro lado la multiplicación del virus en trucha arcoiris se inhibe a temperaturas superiores a 15 ºC, de modo que a 20 ºC el virus es ya indetectable a las dos semanas de infección (Jørgensen, 1982). En contraposición la infección persiste hasta 400 días en trucha arcoiris mantenidas a 4 ºC (Neukirch, 1986). Las epizootias en peces no salmónidos se han desarrollado también a temperaturas de 10-12 ºC (Meier y col., 1994), mientras que en rodaballo se produjeron cuando la temperatura del agua oscilaba entre los 13 y 15 ºC (Schlotfeldt y col., 1991; Ross y col., 1994). Susceptibilidad de rodaballo Scophthalmus maximus y trucha común Salmo trutta fario a aislados de VHSV 132 Además, otros factores ambientales (salinidad, contaminación…), de manipulación o factores inherentes al pez (estatus nutricional, edad…) pueden afectar al desarrollo de la enfermedad. Entre los factores inherentes al pez, se ha observado que las truchas se vuelven más resistentes a la infección por VHSV a medida que se incrementa su edad y peso. Así, mientras que en alevines infectados con una cepa virulenta de VHSV la mortalidad puede alcanzar entre el 80 y el 100% a temperatura óptima, bajo las mismas condiciones supondrían una mortalidad del 10-50% si se trata de juveniles o adultos (Smail, 1999). Sin embargo, las epizootias naturales descritas en rodaballo se han notificado en peces adultos, con tamaños que pueden oscilar de los 500 a 2.000 g de peso (Schlotfeldt y col., 1991; Ross y col., 1994). El elevado número de aislamientos de VHSV procedente de diferentes especies de peces, especialmente marinos, tanto de vida libre como cultivados, asintomáticos o con signos evidentes de enfermedad (Tabla 4.1), ha propiciado el desarrollo de numerosos estudios encaminados a determinar el grado de virulencia de algunos de estos aislados sobre distintas especies de peces, así como la susceptibilidad de determinadas especies marinas de interés comercial para cepas de VHSV de distinto origen (Tabla 4.2). En este sentido, se ha comprobado que aislados de VHSV de origen marino no son patógenos o muestran poca virulencia en trucha arcoiris (Snow y col., 2000; Ito y col., 2004; Skall y col., 2004) aunque se advierte de un incremento de la virulencia de estos virus en los sucesivos pases en el pez (Snow y col., 2000). Por otra parte, se ha observado la alta susceptibilidad del rodaballo frente a cepas de VHSV de origen continental (Castric & Kinkelin, 1984), así como ante distintas cepas de origen marino (Snow y col., 1999b, 2005a; King y col., 2001b; Brudeseth y col., 2005). Capítulo 4 133 Tabla 4.1: Especies de las cuales se ha aislado el virus VHSV Hospedador Nombre científico Referencia Trucha arcoiris Oncorrhinchus mykiss Jensen, 1965 Trucha salvelino Salvelinus fontinalis Rasmussen, 1965 Salmón atlántico Salmo salar Rasmussen, 1965 Trucha lacustre Salvelinus namaycush Ghittino, 1973 Bacalao Gadus morhua Jensen y col., 1979 Salvelino europeo Thymallus thymallus Wizigmann y col., 1980 Lucio E sox lucius Meier y Jorgensen, 1980 Coregono Coregonus sp. Meier y col. 1986 Salmón coho Oncorrhinchus kisutch Brunson y col., 1989 Salmón chinook Oncorrhinchus tshawytsha Hopper, 1989 Rodaballo Scophthalmus maximus Schlotfeldt y col., 1991 Bacalao del pacífico Gadus macrocephalus Meyers y col., 1992 Trucha común Salmo trutta fario de Kinkelin y Le Berre, 1977 Anguila A nguilla anguilla Castric y col., 1992 Arenque del pacífico Clupea harengus pallasi Meyers y col., 1994 Perca Cymatogaster aggregata Traxler y col., 1995 Arenque atlántico Clupea harengus Dixon y col., 1997 Espadín Sprattus sprattus Mortensen y col., 1999 Pez plata (Argentina) A rgentina sphyraena Mortensen y col., 1999 Merlán M erlangius merlangus Mortensen y col., 1999 Faneca Trisopterus esmarkii Mortensen y col., 1999 Barbada R hinonemus cimbrius Mortensen y col., 1999 Bacaladilla M icromesistius poutassou Mortensen y col., 1999 Abadejo de Alasca Theragra chalcogramma Meyers y col., 1999 Bolo del pacífico A mmodytes hexapterus Hershberger y col., 1999 Bacalao negro A naplopoma fimbria Traxler y col., 1999 Sardineta Sardinops sagax Traxler y col., 1999 Lenguado del pacífico P aralichthys olivaceus Takano y col., 2000 Eglefino M elanogrammus aeglefinus Smail, 2000 Eperlano del Pacífico Thaleichthys pacificus Kaufman y Holt, 2001 Capelán Trisopterus minutus King y col., 2001a Fletán negro R einhardtius hippoglossoides Dopazo y col., 2002 Bolo japonés A mmodytes personatus Watanabe y col., 2002 Caballa del pacífico Scomber japonicus Hedrick y col., 2003 Limanda L imanda limanda Skall y col., 2005 Bolo A mmodytes sp Skall y col., 2005 Lubina americana M orone saxatilis Gagné y col.,2005 Trucha marrón Salmo trutta trutta Gagné y col.,2005 Espinosillo Gasterosteus aculeatus Gagné y col.,2005 M ummichogs F undulus heterocitus Gagné y col.,2005 Lucio americano E sox masquinongy Elsayed y col., 2006 Susceptibilidad de rodaballo Scophthalmus maximus y trucha común Salmo trutta fario a aislados de VHSV 134 Tabla 4.2: Especies que muestran susceptibilidad experimentalmente ante VHSV Hospedador Referencia D icentrarchus labrax Castric & de Kinkelin, 1984 H ippoglossus hippoglossus Snow y col., 1999b, 2005b; Bowden, 2003 A canthopagrus schlegelii Isshiki y col., 2003 E pinephelus akaara Isshiki y col., 2003 Sebastes schlegelii Isshiki yl col., 2003 P agrus majo r Ito y col., 2004 Seriola quinqueradiata Ito y col., 2004 OBJETIVO El objetivo de este capítulo ha sido conocer el grado de virulencia, sobre rodaballo y trucha común, de aislados de VHSV de distintos orígenes, utilizando como control dos cepas de referencia altamente virulentas para cada una de ambas especies. MATERIAL Y METODOS LÍNEAS CELULARES Y AISLADOS VIRALES La línea celular utilizada para la propagación viral fue EPC (Epitelioma papuloso de carpa) que se cultivó en medio EMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y antibióticos, tal y como se ha descrito en el capítulo 1. Las células se propagaron a una temperatura óptima de crecimiento de 25 °C Capítulo 4 135 hasta alcanzar la semiconfluencia celular. La incubación de los tapices infectados se realizó a 15 ºC hasta la visualización del ECP; momento en el que se recogieron los restos del tapiz en suspensión con el medio de cultivo. Esta suspensión se tituló mediante el método de TCID50, según se ha descrito en capítulos anteriores. Se utilizaron 3 aislados de VHSV de distintos orígenes y dos cepas de referencia (Tabla 4.3). Los aislados virales empleados en este estudio fueron: GH40, obtenido a partir de ejemplares de fletan negro (Reinhardtius hippoglossoides) aparentemente sanos capturado en el Flemish Cap (Dopazo y col., 2002); SM2897, procedente de ejemplares de rodaballo cultivado que exhibieron ulceras en la piel y STF170.01, obtenido a partir de trucha común asintomática cultivada en Galicia. Las cepas de referencia utilizadas con fines comparativos fueron UK860/94, cepa altamente patógena para rodaballo que fue aislada de una epizootia en una piscifactoría de rodaballo en Escocia (Ross y col., 1994) y FR07/71, una cepa altamente virulenta aislada de trucha arcoiris (Le Berre y col., 1977). Tabla 4.3: Descripción de los virus ensayados en el presenta estudio. Cepa Genotipo Origen Hospedador Año Referencia FR07/71 Ia Francia Oncorhynchus mykiss 1977 LeBerre y col. 1977 STF170.01 Ia Galicia Salmo trutta fario 2001 Este trabajo UK860-94 III Escocia Scophthalmus maximus 1994 Ross et al. 1994 SM2897 III Galicia Scophthalmus maximus 1995 Este trabajo GH40 III Flemish cap Reinhardtius hippoglossoides 1994 Dopazo y col. 2002 Susceptibilidad de rodaballo Scophthalmus maximus y trucha común Salmo trutta fario a aislados de VHSV 136 INFECCIONES EXPERIMENTALES EN RODABALLO (Scophthalmus maximus) En este ensayo se utilizaron 3 aislados de origen marino: GH40, SM2897 y la cepa de referencia UK860/94. Infección experimental 1 Se emplearon 220 rodaballos de unos 25 g de peso obtenidos de una granja comercial, que se dividieron en dos grupos y se mantuvieron en las instalaciones del Instituto de Acuicultura durante un periodo de 15 días para adaptarlos a la temperatura deseada (8 ºC ó 15 ºC). Antes de la infección experimental, se procesaron 20 individuos (10 de cada grupo) para realizar un análisis virológico y descartar la presencia de VHSV, IHNV (virus de la necrosis hematopoyética infecciosa) e IPNV (virus de la necrosis pancreática infecciosa). Durante la duración del ensayo, la temperatura del agua osciló un máximo de ± 0,5 ºC y la salinidad se mantuvo en 35‰, los peces se alimentaron diariamente. Una vez aclimatados, los peces se dividieron en 6 tanques (30 peces en cada uno) identificados por un número, indicativo de la cepa inoculada (1 para la cepa UK860/94, 2 para GH40 y 3 para SM2897) y una letra (A o B) correspondiente a la temperatura de mantenimiento (8 ó 15 ºC respectivamente). Todos los peces recibieron una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de suspensión viral; la mitad de los individuos de cada tanque se marcaron y se inocularon con una dosis de 1×106 TCID50 por pez (dosis alta), mientras que la otra mitad recibió una dosis de 1×105 TCID50 por pez (dosis baja). Capítulo 4 137 Como control negativo, a cada temperatura se inocularon 10 peces con 0,1 ml del sobrenadante de un cultivo de células EPC no infectado. Infección experimental 2 Para este ensayo se emplearon un total de 300 rodaballos de unos 25 g, de un origen diferente al de los peces utilizados en el experimento anterior. Como en el experimento anterior, se dividieron en dos grupos para su aclimatación gradual a la temperatura deseada (8 ºC y 15 ºC) durante unos 15 días; a cada temperatura, un grupo de 10 individuos fueron sacrificados y procesados para el análisis virológico. En este segundo diseño experimental se utilizaron 3 vías de infección: inyección intraperitoneal (IP), cohabitación (Coh) e inmersión (I). Inoculación intraperitoneal e infección por cohabitación. Tal y como se describió en el experimento anterior, los rodaballos se distribuyeron en 6 tanques (30 peces en cada tanque) identificados por un número y una letra indicativos de la cepa inoculada y la temperatura de mantenimiento (8 y 15 ºC). De cada tanque se retiraron 15 individuos que se inocularon con 0,1 ml de la suspensión viral ajustada a un título de 1×105 TCID50 por pez, se marcaron para su identificación y se devolvieron a los tanques para cohabitar con los otros 15 peces (no inoculados) en una proporción 1:1. Como control negativo, para cada temperatura se emplearon 10 peces, que recibieron, mediante inyección i.p., una cantidad de 0,1 ml del sobrenadante de un cultivo de células EPC no infectado. Infección por inmersión. En este experimento se utilizaron 60 rodaballos distribuidos en 6 tanques (10 peces/tanque) identificados como en el ensayo anterior; los rodaballos se expusieron a una