Efecto de Pit-1 sobre la expresión de GH y proliferación celular en glándula mamaria humana

Universidad de Santiago de Compostela Facultad de Medicina Departamento de Fisiología EFECTO DE Pit-1 SOBRE LA EXPRESIÓN DE GH Y PROLIFERACIÓN CELULAR EN GLÁNDULA MAMARIA HUMANA TESIS DOCTORAL Mª Carmen Gil Puig Santiago de Compostela Septiembre 2005 D. Román Pérez Fernández, Profesor Titular del Departamento de Fisiología, Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICA: Que la presente Tesis Doctoral titulada “EFECTO DE Pit-1 SOBRE LA EXPRESIÓN DE GH Y PROLIFERACIÓN CELULAR EN GLÁNDULA MAMARIA HUMANA”, elaborada por la Licenciada en Ciencias Biológicas Dña. María del Carmen Gil Puig, ha sido realizada bajo mi dirección en el Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela y, hallándose concluida, autoriza su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y, para que conste, expide y firma la presente certificación en Santiago de Compostela a 15 de Septiembre de 2005. Fdo. Román Pérez Fernández A mis padres, por animarme a seguir siempre adelante. Quisiera expresar mi agradecimiento, Al profesor Román Pérez, director de esta tesis, por darme la oportunidad de conocer el mundo de la investigación. A la profesora Carmen Segura, quién estuvo a mi lado cuando hice la primera PCR, por su apoyo y consejos. Al Dr. Tomás García-Caballero y a su grupo de investigación: Lía, Montse y Lola por el estudio inmunohistoquímico. Al Dr. Manuel Macia por facilitarme parte de las muestras de tejido mamario necesarias para la realización de este estudio. A todas aquellas mujeres, Dolores, Victoria, Teresa, Maria,… que, sin saberlo, han participado en este proyecto, y que sin ellas sería imposible realizarlo. A Lourdes Loidi y a su grupo de investigación del área de Medicina Molecular (CHUS) por la secuenciación de los productos de PCR y por su ayuda con la PCR a tiempo real. A todos mis compañeros de laboratorio de los que aprendí todo lo necesario para poder desarrollar esta tesis. A Eduardo y Rubén por su asesoramiento en el mundo de las PCRs. A Ángel García y María Pardo, dos de las personas que me prestaron su ayuda siempre que lo necesité. A Begoña, por ser una gran compañera pero sobre todo, por su gran amistad. A mi familia por su apoyo incondicional y por animarme a seguir siempre adelante. Abreviaturas ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNc: ADN complementario AMPc: 3´5´adenosin monofostato cíclico ARN: Ácido ribonucleico ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ATM: Gen Mutado en la Ataxia Telangiestasia ATP: Adenosin trifostato BRCA: Gen de susceptibilidad al cáncer de ovario y mama BrdU: Bromodeoxiuridina BSA: Albúmina de suero bovino DAB: Dextrano abidina-biotina DAPI: 4'-6-Diamidino-2-fenilindol DEPC: Dietilpirocarbonato CHOP: Proteína homologa C/EBP DIG: Dioxigenin DMEM: Medio dulbecco mínimo esencial DMSO: Dimetil sulfóxido dNTP: Desoxirribonucleótido 5´trifosfato DAPI: 4´-6-Diamidino-2-fenilindol DTT: Ditiotreitol EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EGF: Factor de crecimiento epidérmico EGTA: Ácido etilenglicol-bis-(β-aminoetiléter)N, N, N´, N´-tetraacético ERK: Señal extracelular regulada por kinasa FBS: Suero bovino fetal FICT: Fluoresceína isotiocianato FSB: Tampón de congelación GH: Hormona de crecimiento GHBP: Proteína transportadora de GH GHF-1: Factor de transcripción hipofisario-1 GH-R: Receptor de la hormona de crecimiento II. INTRODUCCIÓN Introducción 5 1. GLÁNDULA MAMARIA 1.1. Estructura La mama es una glándula de secreción externa situada bajo la piel a nivel del tórax, y es el resultado de la modificación de las glándulas sudoríparas de la piel adaptadas para la producción de leche. Está formada por tejido fibroadiposo y un sistema de conductos (conjunto de estructuras arboriformes o ramificadas, tubulares y huecas) que confluyen progresivamente en canalículos más gruesos hasta terminar en uno de los doce a dieciocho galactóforos. Hacia el interior de la mama, los conductos desembocan en unas agrupaciones de acinos en forma de racimos llamados lobulillos. A lo largo de toda su longitud los conductos galactóforos están tapizados por dos capas de células: una capa interna continua de células epiteliales y una capa externa discontinua de células mioepiteliales. La mama contiene además de vasos arteriales, venosos y linfáticos, grasa y tejido conectivo que junto con los ligamentos de Cooper constituyen los elementos que le dan forma y sostén. Figura 1. Estructura de la glándula mamaria. Introducción 6 1.2. Desarrollo La glándula mamaria experimenta importantes cambios a lo largo del desarrollo. En la infancia, en condiciones normales, permanece en un estado embrionario y no se desarrolla hasta la pubertad. Durante el embarazo, las mamas aumentan de tamaño, volviendo a su estado normal al terminar la lactancia. A mediados del siglo XX se recogen las primeras evidencias del papel que desempeñan las hormonas en el desarrollo de la glándula mamaria. Así, en trabajos realizados en roedores a los que se extirpó hipófisis, ovarios y las glándulas adrenales, y que posteriormente se les trató con distintas hormonas, se observó que en la morfogénesis mamaria, la hormona de crecimiento (GH) y los estrógenos estimulaban la elongación de los ductos; la progesterona era necesaria para el desarrollo alveolar, mientras que la prolactina (PRL), junto con la hormona de crecimiento y los esteroides adrenales estarían implicados en la diferenciación lóbulo-alveolar y síntesis de leche (Lyons et al., 1958). Factores de crecimiento locales, entre los que se encuentran la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) y el receptor tipo I de la PTH/PTHrP, FGF10 y su receptor FGFR2b, el factor de transcripción Lef1 8, y los productos de los genes Hoxc6 9, Msx1 10 y Msx2 11 son los responsables del desarrollo embriológico de las glándulas mamarias en ratones. De todos ellos, sólo PTHrP es necesaria para el desarrollo embriológico de las mamas en humanos (Wysolmerski et al., 2001). Desde el nacimiento hasta la pubertad se desarrolla un rudimentario sistema ductal proporcional al crecimiento corporal. En este estadío, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) podría jugar un importante papel en el desarrollo de este sistema ductal, dado que experimentos realizados en ratones knockout para el receptor de EGF, presentan una elongación defectuosa de los ductos (Russo J. y Russo I.H., 1987). En la pubertad, la glándula mamaria presenta un rápido crecimiento. En ratones, se desarrollan los conductos finales, estructuras formadas por 4-6 capas de células epiteliales cuboidales situadas encima de una capa de células mioepiteliales. Los conductos finales proliferan en el interior del tejido adiposo, mientras que las células del Introducción 7 interior sufren apoptosis generando el lumen del conducto. Estudios pioneros realizados en ratones han demostrado que una ovariectomía origina la regresión de los conductos finales y paraliza el crecimiento de los ductos, indicando que los estrógenos son necesarios para el crecimiento de los ductos durante la pubertad (Flux et al., 1954). En la pasada década, utilizando técnicas de ingeniería genética se desarrollaron ratones knockout para el receptor de estrógenos, observándose que estos animales no desarrollan conductos finales y, por tanto, no presentaban elongación de los ductos, confirmándose los datos obtenidos medio siglo antes (Couse et al., 1999). En humanos, los datos son similares, habiéndose observado en adolescentes una estrecha relación entre los niveles de estrógenos en plasma y el desarrollo mamario en adolescentes. Además, la administración de estrógenos estimula el desarrollo de las glándulas mamarias actuando sobre la elongación de los ductos (Ankarberg-Lindgren et al., 2001). Respecto a la hormona de crecimiento, estudios realizados en roedores, han demostrado que GH es necesaria para el crecimiento de la glándula mamaria durante la pubertad. GH actuaría a nivel del estroma mamario donde estimula la producción de IGF-I, que a su vez estimula a su vez la proliferación de las células que constituyen el epitelio mamario (Kleinberg, 1997). En humanos GH contribuye a la morfogénesis ductal, elevándose sus niveles durante la pubertad (Rose et al., 1991). Durante el embarazo se acelera el desarrollo mamario, activándose el desarrollo alveolar al final de los ductos. Dos son las hormonas que están implicadas en este proceso: prolactina y progesterona. Estudios realizados en ratones deficientes tanto en la síntesis de prolactina como en su receptor, muestran que son incapaces de formar los ductos y alvéolos, lo cual, indica que esta hormona está implicada en la morfogénesis alveolar (Humphreys et al., 1997). La progesterona, secretada por la placenta durante el embarazo, es necesaria para la lactogénesis y responsable del inicio de la producción de leche (Deis y Delouis, 1983). Otras hormonas necesarias para este proceso son la oxitocina, que es el principal regulador de la eyección láctea y la mencionada prolactina, que mantiene la lactancia (Crowley et al., 1992). El proceso de involución de las células mamarias se origina por la caída de los niveles de prolactina, seguido de la inducción de apoptosis en las células epiteliales, Introducción 8 eliminándose finalmente las estructuras lóbulo-alveolares recuperando una morfología similar a la presente antes de la gestación (Wilde et al., 1999) (Figura 2). GLÁNDULA MAMARIA PUBERTAD EMBARAZO INMADURA Morfogénesis ductal Morfogénesis alveolar y ESTROGENOS + Lactogénesis 1 GH + PROGESTERONA + Lactogénesis 2 LACTANCIA INVOLUCION PROGESTERONA - PROLACTINA + PROLACTINA - PROLACTINA + OXITOCINA + OXITOCINA - Figura 2. Regulación hormonal del desarrollo de la glándula mamaria. 2. CÁNCER DE MAMA 2.1. Definición El cáncer de mama representa una proliferación maligna de las células epiteliales que revisten los conductos o lobulillos mamarios. Es el más frecuente en las mujeres (excluyendo los cánceres cutáneos), aunque es bastante raro en los varones. El cáncer de mama humano es una enfermedad clonal. Ello quiere decir, que una única célula transformada, resultado final de una serie de mutaciones somáticas (adquiridas) o de la Introducción 9 línea germinal (heredadas), es capaz de expresar todo el potencial maligno, en una serie de sucesos que se producen de forma secuencial y aleatoria. Por lo tanto, el cáncer de mama puede existir durante un largo periodo como enfermedad no invasora, o como enfermedad invasora pero no metastásica, por ello, es necesario diagnosticarlo a tiempo y tratarlo adecuadamente (Fauci, et al., 1998). 2.2. Genética Aproximadamente entre el 5 y 10% del cáncer de mama está relacionado de forma directa con mutaciones en la línea germinal, siendo por tanto, hereditarios. El descubrimiento de los genes que confieren susceptibilidad a padecer cáncer de mama hereditario y el conocimiento de los mecanismos de acción que intervienen en este proceso han sido claves para comenzar a comprender la etiología y progresión de los tumores mamarios. Las primeras mutaciones que se identificaron en cáncer de mama se encuentran en el gen supresor de tumores p53, localizado en el cromosoma 17, y fue éste el primer gen identificado como mutante tumoral en el año 1979 (DeLeo et al., 1979). Se trata de una fosfoproteina nuclear implicada en la regulación del ciclo celular, en la reparación del ADN, apoptosis e inhibición de la angiogénesis. Por tanto, una sobreexpresión de la forma mutada de esta proteína está asociada a áreas de mayor proliferación celular. Otro gen, identificado en el año 1990 (Hall et al., 1990) y localizado en el cromosoma 17q21 y que se conoce como BRCA-1 (gen de susceptibilidad al cáncer de ovario y mama)(Miki et al., 1994), codifica a una proteína que actúa como un factor de transcripción. Dentro de su estructura destaca una secuencia en el extremo aminoterminal constituida por 126 aminoácidos, que determinan el dominio con dedos de zinc que media la unión al ADN o a otra proteína. La proteína BRCA-1 se uniría a regiones específicas del ADN y controlaría la expresión de otros genes. Además de actuar como un factor de transcripción, se ha observado que BRCA-1 está implicado en la reparación del ADN, regulación del ciclo celular, apoptosis y mantenimiento de la estabilidad cromosómica. Las mutaciones más frecuentes en este gen corresponden a delecciones o inserciones de bases que provocan un desplazamiento de la pauta de Introducción 10 lectura, originando un codón de terminación que causa la producción de proteínas truncadas a las que les falta desde un 5% a un 90% de su secuencia de aminoácidos (Hofmann y Schlag, 2000; Yoshida y Miki 2004; Arai et al., 2004). ATM (gen Mutado en la Ataxia Telangiestasia) codifica una protein-quinasa que fosforila a la proteína BRCA1 y dispara su acción reparadora. Las células de los pacientes con la proteína ATM mutada, dan lugar a una proteína no funcional que no fosforila BRCA1 y por tanto no puede reparar el ADN (Cortez et al., 1999). Posteriormente a la identificación de BRCA-1, en el año 1994, se identifica el gen BRCA-2, localizado en el cromosoma 13q12.13 (Wooster et al., 1994) que codifica una proteína constituida por 3418 aminoácidos (Tavtigian et al., 1996) y que presenta las mismas funciones que BRCA-1. Al contrario que muchos de los genes implicados en cáncer hereditario, BRCA-1 y BRCA-2 no están mutados en el cáncer de mama esporádico. Otro de los muchos genes implicados en la etiología del cáncer de mama es el que codifica para un miembro de la superfamilia de receptores del factor de crecimiento epidérmico denominado erbB2 o HER /Neu. Este gen media en la estimulación de la proliferación celular, previene la apoptosis y estimula la angiogénesis y metátasis, y por tanto, una hipersecreción de esta proteína parece estar implicada en el desarrollo del carcinoma mamario (Ross et al., 1999). Sin embargo, son numerosos los casos de cáncer de mama originados de modo esporádico. 2.3. Tipos de cáncer de mama El cáncer de mama puede clasificarse en dos grupos: - No invasivo (in situ), es decir, el cáncer permanece limitado a los conductos o lobulillos y no ha invadido el tejido adiposo circundante. - Invasivo o infiltrante, en el que, las células cancerosas invaden el tejido adiposo. Dentro de este grupo, el carcinoma ductal infiltrante, originado en los conductos Introducción 11 galactóforos y que invade el tejido adiposo originando posteriormente una metastasis, es el responsable del 80% de las neoplasias mamarias. Aproximadamente entre el 10% y 15% de los cánceres invasivos son carcinomas lobulillares infiltrantes, que se origina en las glándulas productoras de leche. Existen otros tipos de cánceres invasivos como el carcinoma medular, carcinoma coloide o carcinoma tubular, pero menor incidencia (DeVita et al., 1997). 2.4. Desarrollo del tumor Los conductos mamarios están formados por células epiteliales localizadas hacia el lumen y células mioepiteliales, que las rodean y separan de la membrana basal y del estroma. Esta estructura celular cerrada permite interacciones autocrinas y paracrinas mediadas por factores secretados por estas células. El cáncer de mama es el resultado de una serie de alteraciones moleculares en las células mioepiteliales que constituyen los conductos mamarios. Estas células son necesarias para mantener la estructura de los conductos mamarios a la vez que producen factores paracrinos con actividad antiproliferativa, anti-invasiva y anti-angiogénica (Xiao et al., 1999, Nguyen et al., 2000). Una de las hipótesis propuestas como inicio del tumor indica una pérdida de estas propiedades seguida de la activación de la proliferación, invasión y angiogénesis. En el caso de carcinomas no invasivos, las células epiteliales pierden la capacidad de mantener una única capa de células y comienzan a proliferar hacia el lumen del conducto. Al mismo tiempo descienden el número de células mioepiteliales y se incrementan las células endoteliales, linfocitos y fibroblastos, contribuyendo estos últimos a la formación de la matriz extracelular, importante en la diferenciación celular y morfogénesis mamaria (Boudreau et al., 1998). Experimentos in vitro indican que, los fibroblastos derivados de tejido normal inhiben el crecimiento del tumor mientras que los procedentes de tejido tumoral lo estimulan (Dong-Le Bourhis et al., 1997). En los carcinomas invasivos, las células mioepiteliales y la membrana basal desaparecen y las células tumorales se dispersan por el estroma (Figura 3) (Polyak, 2001). Introducción 18 internalización de la hormona junto con el receptor, de tal forma que este complejo acturaría a nivel nuclear (Lobie et al., 1994). Así, la inducción de los efectos biológicos de la GH ocurre al menos mediante dos mecanismos: - Mecanismo clásico de la generación de segundos mensajeros activados tras la unión de la hormona a su receptor en la membrana plasmática. - Actuación a nivel nuclear tras la internalización de GH acoplada a su receptor. 3.4. Efectos fisiológicos de la hormona de crecimiento Las acciones de la GH pueden dividirse en dos grupos: acciones directas y acciones indirectas. Los efectos directos son el resultado de la unión de la hormona de crecimiento a su receptor en las células diana. Entre ellos se encuentra la estimulación de la producción de IGF en el hígado y otros tejidos, la estimulación de hidrólisis de Glucosa PI 3´K Transcripción de genes diana MAPK Metabolismo Crecimiento Proliferación Diferenciación SCH STAT s GHR JAK2 GH IRS Figura 5. Cascada de señalización tras la unión de GH a su receptor. (Herrington and Carter-Su 2001). Introducción 19 ACCIONES BIOLÓGICAS DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO LIPOLÍTICA Captación de aminoácidos Síntesis de ARNm Actividad enzimática Neosíntesis proteica Balance nitrogenado positivo Destrucción de triglicéridos Ácidos grasos libres Hiperglucemia Hiperinsulinismo ANABOLIZANTE DIABETÓGENA Activación en adipocitos de la triglicérido lipasa Utilización celular de glucosa Producción hepática de glucosa triglicéridos en tejido adiposo, y la estimulación de la producción de glucosa en el hígado (Davidson, 1987). Por otro lado, los efectos indirectos están mediados principalmente por el factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) (Figura 6). El papel más importante conocido de GH es la estimulación del crecimiento corporal activando en el hígado y otros tejidos la secreción de IGF-I, que estimula la condrogénesis y el crecimiento del hueso. Por otro lado, IGF-I actúa sobre la diferenciación y proliferación de los mioblastos, favoreciendo el crecimiento muscular . La GH además de ser el principal regulador del crecimiento longitudinal en mamíferos, actúa sobre el metabolismo de carbohidratos, de lípidos, el metabolismo del nitrógeno y mineral (Davidson, 1987). Desempeña también un importante papel en el desarrollo de las estructuras linfoides y en el mantenimiento del inmune (Jeay et al., 2002) y en desarrollo del corazón (Lombardi et al., 1997). Figura 6. Efectos biológicos de la hormona de crecimiento. Introducción 20 3.5. Regulación de la secreción de la hormona de crecimiento La GH producida por las células somatotropas de la hipófisis anterior, se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso como una prohormona que posteriormente es hidrolizada pasando al aparato de Golgi donde es empaquetada en los gránulos de secreción. La producción de GH está regulada por múltiples factores, incluidos el estrés, el ejercicio, la nutrición, el sueño y la propia hormona de crecimiento. Sin embargo, sus principales reguladores son a nivel hipotalámico: la somatostatina, de carácter inhibidor y la hormona liberadora de la hormona de crecimiento y otra hormona, a nivel estomacal, identificada recientemente y denominada Ghrelin (Figura 7). La hormona liberadora de la hormona de crecimiento, GHRH, es un péptido hipotalámico que estimula tanto la síntesis como la secreción de la hormona de crecimiento. La GHRH fue aislada y caracterizada por primera vez en tumores pancreáticos humanos (Guillemin et al., 1982). El gen que la codifica se encuentra en el brazo largo del cromosoma 20, abarca aproximadamente 10 kb y consta de 5 exones. El producto de transcripción es un ARNm de aproximadamente 750 bases cuya traducción da lugar a una proteína inmadura constituida por 107-108 aminoácidos (Mayo et al., 1983). La proteína madura está formada por 44 aminoácidos y es sintetizada en los cuerpos celulares de neuronas secretoras en los núcleos arcuato y ventromedial del hipotálamo. Cuando estas neuronas reciben un estímulo para su secreción, descargan GHRH desde sus terminales a la circulación portal-hipofisaria y por tanto hacia la hipófisis. GHRH se une a receptores, acoplados a la adenilciclasa por una proteina G estimulante, en la membrana plasmática de las células somatotropas. La interacción de la GHRH con sus receptores estimula la adenilciclasa, aumentando la concentración de AMPc en las células somatotropas. Este aumento activa la protein-quinasa A que a su vez fosforila proteínas que estimulan la secreción de GH (Muller et al., 1999). La somatostatina (SS) es un péptido hipotalámico que inhibe la secreción de la hormona de crecimiento en respuesta a GHRH u otros factores estimuladores, como por Introducción 21 ejemplo la baja concentración de glucosa en sangre. Es un péptido de pequeño tamaño, aislado y secuenciado por el grupo de Guillemin en 1973 (Brazeau et al., 1973), a partir de hipotálamos bovinos. El gen codificante se encuentra en el cromosoma 3 y está compuesto por 2 exones separados por un intrón. Tras su descubrimiento se han detectado varias isoformas de SS aunque son dos, SS-28 y SS-14 las biológicamente relevantes. El producto de expresión del gen que codifica la SS es la pre-pro- somatostatina, una molécula de 116 aminoácidos que da origen a una prohormona, la pro-somatostatina (proSS). La proSS, que consta de 92 aminoácidos, con un peso molecular de 10,3 kDa, da origen a dos péptidos distintos, la SS-28 y SS-14. Aunque se ha detectado expresión de SS en varias partes del hipotálamo, las neuronas que la sintetizan son especialmente abundantes en la región paraventricular anterior. Los axones de estas células terminan en las redes capilares que constituyen la circulación portal-hipofisaria, donde liberan la somatostatina a la sangre (Muller et al., 1999). La somatostatina se une a receptores en la membrana plasmática de las células somatotropas inhibiendo la expresión de GH. Estos receptores, al igual que los de GHRH, están acoplados a la adenilciclasa, pero mediante una proteína G inhibidora. La interacción de la somatostina con su receptor inhibe la acción estimulante de GHRH sobre la adenilciclasa, disminuyendo la producción de AMPc, y como consecuencia, GHRH no puede estimular la secreción de GH. Existe otra vía de inhibición en la que tras la unión hormona-receptor se reduce la entrada de Ca+2, hiperpolarizándose la membrana e impidiendo la secreción. Ghrelin es una hormona peptídica, secretada mayoritariamente en células epiteliales del estómago, que se une a su receptor en las células somatotropas de la hipofisis anterior estimulando la secreción de la hormona de crecimiento. Fue aislada a finales del año 1999 por Kojima y colaboradores en el estómago de rata y posteriormente en humanos. Se trata de un péptido formado por 28 aminoácidos que posee además importantes acciones sobre la ingesta. Su expresión se ha detectado en tejidos tales como: hipófisis, hipotálamo, intestino delgado, intestino grueso, ovario, testículo y corazón (Kojima et al., 1999, Korbonits et al., 2001). En humanos se ha Introducción 22 demostrado su expresión en placenta (Gualillo et al., 2001), células del sistema inmune (Hattori et al., 2001) y próstata (Jeffery et al., 2003). Además de estos tres principales reguladores de la expresión de la GH, existen otros moduladores, como neurotrasmisores, neuropéptidos, hormonas (glucocorticoides, hormonas tiroideas, leptina, glucosa…) y el factor de crecimiento tipo insulina, IGF-I. Elevados niveles en sangre de IGF-I disminuye la secreción de la hormona de crecimiento, no sólo ejerciendo su acción directamente sobre las células somatotropas, inhibiendo la acción estimulante de la GHRH, sino también estimulando la liberación de somatostatina e inhibiendo la secreción de GHRH a nivel hipotalámico. Sin embargo, para la activación del gen de la GH es necesaria la presencia del factor de transcripción hipofisario-1 (Pit-1 o GHF-1) Hipotálamo Tej. adiposo Hipófisis Stress Aminoácidos Hipoglucemia Hígado Figura 7. Regulació n de la secreción de la hormona de crecimiento. Introducción 23 4. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN HIPOFISARIO-1 (Pit-1/GHF-1) Los factores de transcripción son proteínas que se unen a elementos reguladores localizados en la región promotora del ADN estimulando o inhibiendo la transcripción génica. Concretamente, la activación específica de los genes de GH, prolactina y la subunidad β de TSH en tres tipos celulares específicos, somatotropas, lactotropas y tirotropas respectivamente, requiere la presencia del factor de trancripción Pit-1 (Castrillo et al., 1991, Li et al., 1990). Pit-1, desempeña además, una función importante en la diferenciación celular durante el desarrollo de la hipofisario (De la Hoya et al., 1998). En 1988 fue aislado y secuenciado por primera vez por dos grupos de investigación independientes (Bodner et al., 1988; Ingraham et al., 1988). 4.1. Estructura El gen que codifica el factor de transcripción Pit-1, conocido también como GHF-1, se localiza en humanos, en el cromosoma 3p11. Está formado por seis exones, constituidos a su vez por un número variable de pares de bases, que oscilan desde 61 que conforman el exón 5, hasta 225 pb del exón 3 (Ohta et al., 1992). Pit-1 pertenece a la familia de proteínas POU, caracterizadas por la presencia de una región altamente conservada conocida como dominio POU. Este dominio es una región constituida por 155-162 aminoácidos que se divide a su vez en dos regiones, el homeodominio POU (POUDH), formado por 60 aminoácidos y el dominio POU específico (POUs), constituido por 75-82 aminoácidos. Ambas regiones permiten la unión de la proteína al ADN con una elevada afinidad y especificidad (Figura 8). Dentro del gen que codifica para Pit-1 se han descrito dos lugares de inicio de la transcripción dando lugar a dos variantes de ARN mensajero de Pit, Pit-1 y Pit-2 y en función de dónde comience la traducción se originan a su vez dos isoformas de Pit-1. - Pit-1 es una proteína formada por 291 aminoácidos. Dentro de su secuencia se distinguen dos codones de inicio de la traducción, dando lugar a dos proteínas de Introducción 24 distinto peso molecular, 33 kDa y 31 kDa. Ambas difieren en la presencia o ausencia de 27 aminoácidos entre la primera y segunda metionina en la secuencia aminoacídica primaria. La isoforma de 33 kDa es la más abundante, encontrándose en una relación 2:1 con respecto a la de 31 kDa (Voss et al., 1991). - Pit-2, también llamada GHF-2, Pit-1a o Pit-1 β. Se origina como consecuencia de un procesamiento alternativo del ARN, en concreto del primer intrón (Theill et al., 1992). El ARN mensajero que codifica para Pit-2 es igual que el que codifica para Pit-1 pero con una inserción de 78 pb entre el primer y segundo exón, añadiendo 26 aminoácidos en el dominio de transactivación, región rica en serina y treonina, tras el aminoácido en posición 47. Por tanto, la isoforma Pit-2 es una proteína formada por 317 aminoácidos alcanzando un peso molecular de 36 kDa (Voss et al., 1991; Konzak et al., 1992; Delhase et al., 1995). En hipófisis de rata, esta isoforma de Pit activa la expresión del gen de la GH pero no activa los genes de PRL y la subunidad β de TSH, a diferencia de lo que ocurre con la isoforma Pit-1 que activa los tres genes (Ohta et al., 1992; Vila et al., 1993; Sanno et al., 1996). Esta isoforma se encuentra en la mismos tipos celulares que Pit-1 sin embargo es menos abundante que Pit-1, encuentrándose aproximadamente en una relación 7:1 con respecto a Pit- 1. Figura 8. Estructura proteica de Pit- 1. Se distinguen cuatro dominios estructurales: STA: Responsable de la actividad transcripcional. CHG: Interviene, probablemente en la actividad trancripcional. PO U y HD: intervienen en la unión específica al DNA. Introducción 25 4.2. Pit-1 y su papel fisiológico Estudios realizados por Castrillo y colaboradores en el año 1991 describen el papel de Pit-1 sobre la proliferación de células hipofisarias. Utilizando oligonucleótidos antisentido diseñados sobre la secuencia que codifica Pit-1, no sólo bloquean la expresión de los genes de GH y PRL sino que, también inhiben la incorporación de 3H- timidina en células somatotropas y lactotropas, sugiriendo que Pit-1 regularía la replicación del ADN y la proliferación celular. Además, presenta una función determinante en la diferenciación celular durante el desarrollo de la hipófisis anterior ya que ha observado una gran correlación espacio-temporal entre la expresión de Pit-1 y la activación de los genes de GH y PRL. La principal función de este factor de transcripción es la activación de los genes que codifican la hormona de crecimiento, prolactina y la subunidad β de TSH. Ratones enanos “Snell” y “Jackson”, con mutaciones en el gen de Pit-1 muestran una deficiencia en estos tres genes a la vez que, presentan una hipófisis anterior hipoplásica (Camper et al., 1990; Li et al., 1990; Voss y Rosenfeld, 1992). Otro gen regulado por Pit-1 es el gen que codifica el receptor de la hormona liberadora de GH, GHRH-R (Lin et al., 1992), que juega un importante papel en el desarrollo y proliferación de adenomas hipofisarios, estimulando la producción de GH. Por tanto, Pit-1 presenta una implicación indirecta sobre la proliferación celular a través del efecto mitogénico de GH (Osamura et al., 2004). En humanos la expresión de Pit-1 ya se detecta a las seis semanas de gestación y se localiza específicamente en tres tipos celulares de la adenohipófisis, células somatotropas, lactotropas y tirotropas (Puy y Asa 1996). El grupo de Friend detecta, mediante Northern blot, la expresión de Pit-1 en tumores hipofisarios humanos secretores de GH, PRL y TSH (Friend et al., 1993), aunque es Pelligrini y colaboradores quienes observan una mayor expresión de Pit-1 en tumores hipofisarios secretores de GH, PRL y TSH en relación al tejido normal y que, tanto este tejido como el neoplásico expresan la isoforma de Pit-1β, originada por procesamiento alternativo del ARN ( Pellegrini et al., 1994). Además, mediante estudios de hibridación in situ, se Introducción 26 observa que la expresión de Pit-1 en tumores está correlacionada con la expresión de GH, PRL y TSH (Asa et al., 1993). Existen varias mutaciones en el gen que codifica para Pit-1 responsables del denominado déficit combinado de hormonas hipofisarias, CPHD (Combined Pituitary Hormone Deficiency) presente en humanos. Muchas de estas mutaciones están localizadas en el dominio POU de Pit-1, implicado en la unión al ADN, y sólo dos se localizan en el dominio de transactivación de dicho gen. En ambos casos lo que se origina son niveles de GH, PRL y TSH inferiores a los normales (Radovick, 1992; Reynaud et al., 2004). 5. GH Y Pit-1 EXTRAHIPOFISARIO 5.1. GH extrahipofisaria Tradicionalmente, la expresión de la GH se localizaba en las células somatotropas de la hipófisis anterior. Sin embargo, en los últimos años se ha observado su expresión en tejidos extrahipofisarios como en células endoteliales (Wu et al., 1996), fibroblastos (Palmetshofer et al., 1995), timocitos (Maggiano et al., 1994), células del sistema inmune como macrófagos, células B y linfocitos T (Weigent et al., 1991), en la línea celular de leucemia mieloide humana, HL60 (Costoya et al.,1996) y en la glándula mamaria (Mol et al., 1995). La expresión de GH a nivel de ARNm en tejido mamario humano fue descrita inicialmente por Mol y colaboradores en el año 1995, aunque posteriormente, y mediante técnicas inmunohistoquímicas e hibridación in situ, el grupo de Raccurt demuestran la expresión de GH en muestras de tejido mamario normal o patológicas como fibroadenoma, concretamente en las células epiteliales y mioepiteliales que constituyen los ductos. Sin embargo, en muestras tumorales, se observa además síntesis Introducción 27 de novo de GH en células del estroma mamario, asociando esta nueva localización a la progresión del cáncer de mama. En este estudio se detecta también una mayor expresión de GH en tejidos tumorales en relación a los niveles presentes en tejido mamario normal (Raccurt et al., 2002). 5.2. Pit-1 extrahipofisario Los estudios iniciales sobre la expresión de Pit-1 localizaban a este factor de transcripción únicamente a nivel hipofisario, por eso fue denominado “factor de transcripción específico de hipófisis” (Bodner y Karin, 1987). Posteriormente la expresión de Pit-1 ha sido detectada en tejidos extrahipofisarios entre los que se encuentran placenta (Lee et al., 1996; Schanke et al., 1997), tejidos linfoides y hematopoyéticos (Delhase et al., 1993) y en la línea celular HL60 (leucemia promielocítica humana) (Costoya et al., 1998). En todos estos tejidos la expresión de Pit-1 parece estar asociada a la expresión de GH, lo cual, parece indicar que al igual que ocurre a nivel hipofisario, Pit-1 podría mediar en la regulación del gen de GH. No obstante, estudios realizados en glándula mamaria de perros tratados con progesterona, los niveles de Pit-1 detectados por Northern Blot eran muy bajos o inexistentes, mientras que los niveles de GH si son detectables, lo que parecía indicar que, Pit-1 era independiente o no era necesario para la transcripción del gen que codifica la hormona de crecimiento (Lantinga-van Leeuwen et al., 1999). Otra de las funciones descritas para Pit-1 es su efecto estimulador sobre la proliferación celular. Existen dos estudios que reflejan esta función. Uno de ellos, realizado por Castrillo y colaboradores en células hipofisarias, donde la inhibición de la expresión de Pit-1 inhibe la proliferación celular (Castrillo et al., 1991). El otro estudio que refleja una relación entre proliferación y Pit-1, es el realizado en la línea celular HL60, donde la proliferación está asociada a un aumento de la expresión de Pit-1, tanto a nivel de ARN mensajero como a nivel proteico (Costoya et al., 1998). Material y Métodos 31 1. CULTIVO CELULAR La línea celular de adenocarcinoma mamario humano, MCF-7, procedente de la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC), se cultiva en placas Petri de 90 mm2 en medio de cultivo esencial (DMEM) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina y 2 mM de aminoácidos no esenciales (L-glutamina) a 37ºC en atmósfera húmeda y con 5% de CO2. La rutina del subcultivo consiste en el cambio de medio cada 3 días previo lavado con tampón fosfato salino (PBS). Una vez que las células llegan a un estado de confluencia se recogen con una solución que contiene tripsina-EDTA (Sigma, St Louis, USA) diluida en PBS (1:4) sembrándose alrededor de 106 células por placa de 90 mm2. 2. TEJIDOS HUMANOS Las muestras de tejido mamario normal y tumoral, proceden de piezas quirúrgicas obtenidas en el servicio de Anatomía Patológica del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS). Los tejidos tumorales, carcinomas ductales infiltrantes, se seleccionan por su frecuencia clínica. Una parte del tejido se guarda a -80ºC para el análisis de ARNm y de proteína, y el resto, se fija en formol tamponado para la realización del análisis inmnohistoquímico. La hipófisis humana procede de una autopsia, mientras que la placenta humana se obtiene en el servicio de Ginecología y Obstetricia del CHUS. El uso de tejidos humanos en este trabajo tiene la aprobación del Comité Ético de Investigación. 3. ESTUDIO DEL ARNm 3.1. Extracción de ARN Las células MCF-7 cuando llegan a un estado de confluencia se recogen con tripsina-EDTA diluida en PBS en relación 1:4. El precipitado obtenido tras la centrifugación de la suspensión celular durante 5 minutos a 700 rpm, se lava con PBS y Material y Métodos 32 se centrifuga de nuevo bajo las mismas condiciones. El precipitado celular se resuspende en TRIZol (Invitrogen, Scotland, UK). El tejido se homogeniza mecánicamente en un homogenizador (Polytron), en 1 ml de TRIZol. La suspensión obtenida se centrifuga durante 10 minutos a 14000 rpm para eliminar fragmentos de tejido no disgregado. A continuación, las muestras se incuban durante 5 minutos a temperatura ambiente y se le añaden 250 µl de cloroformo. Tras una fuerte agitación, las muestras se centrifugan a 14000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. La superior y transparente, donde se encuentra el ARN, se retira a un tubo limpio y se le añade isopropanol. El precipitado de ARN se obtiene centrifugando las muestras durante 10 minutos a 4ºC y 14000 rpm. El sobrenadante obtenido se desecha y el precipitado, una vez seco, se resuspende en agua tratada con DEPC (agua destilada con dietilpirocarbonato al 0.1%), y se guarda a -80ºC hasta su procesamiento. Para la cuantificación del ARN se utiliza el espectrofotómetro ajustado a dos longitudes de onda: 260 y 280 nm. La absorción a 260 nm proporciona la cantidad de ácido nucleico y a 280 nm la cantidad de proteína. La pureza del ARN viene dada por el cociente A260/280, considerándose aceptable una oscilación 1.8-2. 3.2. RT-PCR La síntesis de ADNc (ADN complementario) se lleva a cabo en un volumen total de 30 µl, con los siguientes componentes: 2 µg de ARN total, 6µl de tampón (5X First Strand Buffer, Invitrogen conteniendo: 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 50 mM DTT; 5 mM MgCl2; 2 mM de cada dNTP (Invitrogen), 500 ng de random primers (Invitrogen), 20 unidades de inhibidor de RNasa (RNAsin, GeneCraft, Germany), 400 unidades de M-MLV reversotranscriptasa (Invitrogen). La mezcla se incuba durante 50 minutos a 37ºC, 15 minutos 45ºC y, finalmente, 5 minutos a 95ºC. 5 µl de ADNc se amplifican en un volumen total de 50 µl bajo las siguientes condiciones: 5 µl de tampón de PCR (10X PCR Buffer, GeneCraft que contiene 10 mM Material y Métodos 33 Tris-HCl pH 8.4, 50 KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM de cada dNTP (Invitrogen), 25 pM de cada oligonucleótido, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (GeneCraft). Los oligonucleótidos se diseñan sobre la secuencia que codifica para ARN mensajero de cada uno de los genes estudiados tal y como se indica en siguiente tabla: ARNm Oligonucleótido Secuencia Producto GH Sentido 5´CCGACACCCTCCAACAGGGA 3´ 344pb Antisentido 5´CCTTGTCCATGTCCTTCCTG 3´ Pit-1A Sentido 5´GTGTCTACCAGTCTCCAACC 3´ 247pb Antisentido 5´ACTTTTCCGCCTGAGTTCTTC 3´ Pit-1B Sentido 5´GCAACTCTGCCTCTGATAATG 3´ 295pb Antisentido 5´CCACCAATTTACTTTTCCGCC 3´ 18S Sentido 5´GTAACCCGTTGAACCCCATT3´ 131 pb Antisentido 5´CCATCCAATCGGTAGTAGCG3´ IGF-I Sentido 5´AGCAGTCTTCCAACCCAATTATTT3´ 83 pb Antisentido 5´ AGATGCGAGGAGGACATGGT3´ Las condiciones de amplificación que se utilizan son las siguientes: desnaturalización a 95ºC durante 1 minuto, hibridación a 54ºC para Pit-1B, 58ºC para Pit-1A, 64ºC para IGF-I, 55ºC para GH y 60ºC para 18S y 72ºC durante 1 minuto y 10 minutos de extensión final a 72ºC. El número de ciclos utilizado es de 27 ciclos para 18S y 35 ciclos para Pit-1, IGF-I y GH. Los productos de PCR se visualizan en un gel de agarosa al 1,5% en TAE 1X (TAE 50X: 2 M Trizma Base, 50 mM EDTA, 8 mM ácido acético glacial) teñidos con bromuro de etidio bajo una luz ultravioleta acoplada a un sistema de imagen digital (Molecular Analyst, Biorad) que permite cuantificar la densidad óptica de las bandas. Material y Métodos 34 Los fragmentos obtenidos mediante la PCR se comprueban mediante cortes con los siguientes enzimas de restricción: Mbo II y Pvu II (Promega, UK) para Pit-1 y Bgl II (Promega, UK) para GH. 3.3. Secuenciación El primer paso antes de realizar la secuenciación de los productos PCR, consiste en la purificación de los mismos. Para ello, se utiliza el kit ExoSAP-IT (USB, USA), que contiene un enzima con actividad exonucleasa que elimina todas las cadenas sencillas de los oligonucleótidos, obteniendo únicamente el producto PCR de interés. La reacción se realiza a 37º C durante 15 minutos con otros 15 minutos de inactivación de la actividad enzimática a 80ºC. El proceso de secuenciación consiste en una reacción mediada por una ADN polimerasa (secuenasa) que junto con 5µl de producto purificado, dNTPs marcados y 2µl del oligonucleótido correspondiente (GH/Pit-1), se mantienen durante 15 segundos a 95º C, 15 segundos a 55º C y 1 minuto a 60º C en el fmol DNA sequencing system (Promega). Finalmente se purifica este producto de reacción y se somete a una electroforesis capilar. 3.4. PCR a tiempo real Los niveles de ARN mensajero de Pit-1 presentes en la glándula mamaria normal y en los carcinomas ductales infiltrantes de mama y los niveles de ARNm de IGF-I en la línea celular MCF-7 tras la sobreexpresión de Pit-1 se detectan mediante la técnica de PCR a tiempo real en un termociclador fluorescente (LightCycler, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Se utiliza, en la reacción de retrotranscripción 2 µg de ARN. La PCR se realiza en un volumen total 20 µl conteniendo: 2 µl de cada reacción de RT, 4 mM de MgCl2, 0,5 µM de cada oligonucleótido y 2 µl de LightCycler DNA Master SYBR Green I mix (Roche Molecular Biochemicals). Tras la desnaturalización inicial de 95ºC durante 30 s, las condiciones de amplificación utilizadas son: desnaturalización a 95ºC durante 15 s, hibridación a 60ºC para 18S, 58ºC para Pit-1 y 64ºC para IGF-I durante 15 s y Material y Métodos 35 extensión a 72ºC durante 15 s. Para confirmar los productos obtenidos las muestras se enfrian a 42ºC y se aumenta la temperatura a 95ºC. La emisión de fluorescencia de cada ciclo es monitorizada y se cuantifica usando un método derivado del software de LigthCycler (Roche Molecular Biochemicals). Los niveles de Pit-1 e IGF-I se normalizan respecto a los niveles obtenidos de 18S. 4. ESTUDIO DE LA PROTEÍNA 4.1. Extracción de proteína Las placas de cultivo se lavan tres veces con PBS frío. A continuación, se despegan con 100 µl de SDS al 1% a 95º C. Los extractos celulares se pasan a un tubo limpio y se incuban durante 5 minutos a 95ºC, finalmente se vuelven a incubar en hielo durante 20 minutos con 500 µl de tampón de lisis (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 5mM MgCl2, 1% SDS, 10% glicerol, 1% Tritón X-100), al que se adicionó en fresco 10mM NaVO4, aprotinina 50mg/ml y 4 mM PMSF. Tras un breve sonicado, las muestras se centrifugan a 14000 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante obtenido contiene las proteínas que se cuantifican mediante el método de Bradford. El tejido de glándula mamaria normal y carcinomas mamarios se homogeniza mecánicamente en polytron, en 1 ml de tampón de lisis. El homogenado se mantiene 30 minutos en hielo y posteriormente se centrifugan durante 10 minutos a 4ºC y 14000 rpm. El sobrenadante obtenido contiene las proteínas que se cuantifican mediante el método de Bradford. 4.2. Inmunoprecipitación La cantidad de proteína utilizada en la inmunoprecitación procedente de la línea celular MCF-7 y tumores mamarios es de 1.5 mg de proteína mientras que para el tejido mamario normal es de 2 mg. A todos ellos se les añadió 1 µg de anticuerpo monoclonal anti-Pit-1 (Transduction Lab. Lexington, KY, USA), incubándose toda la noche a 4ºC en un agitador orbital. A continuación, se añadieron 30µl de una suspensión de proteína –G -Sepharosa (Amersham Pharmacia, Sweden) que se va a unir Material y Métodos 36 al anticuerpo, incubándose 45 minutos a 4ºC y en agitación. Las muestras se centrifugaron a 4ºC durante 1 minuto a 14000 rpm y se lavaron 5 veces con tampón HNTG (20mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% glicerol y 0,1% triton X-100). Tras la última centrifugación el precipitado obtenido se resuspende en tampón de carga 1X (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 1% de β-mercaptoetanol, 0.1% de azul de bromofenol), se hierve durante 5 minutos, se agita y finalmente se vuelve a centrifugar a temperatura ambiente durante 5 minutos. El sobrenadante resultante contiene las proteínas que van a ser cargadas en el gel de poliacrilamida. 4.3. Western blot La electroforesis se realiza en geles de SDS-PAGE. El porcentaje de los geles utilizado es del 12% para Pit-1 y del 15% para GH. La cantidad de proteína que se carga en el gel es variable: para la detección de Pit-1 en extractos proteicos de la línea celular MCF-7, en tumores mamarios humanos y en tejido de glándula mamaria normal es el resultado de la inmunoprecipitación, mientras que para la detección de GH en la línea celular se parte de extracto proteico total (80 µg). La electroforesis se realiza a 120 V durante 2-3 horas en el tampón de electroforesis que contiene: 25 mM Trizma Base, 192 mM glicina y 0.1% SDS (p/v). Una vez finalizada la electroforesis las proteínas se transfirieren a una membrana de nitrocelulosa en una cubeta de electrotransferencia y en tampón de transferencia compuesto por: 25 mM Tris, 192 mM Glicina y 20% metanol. La transferencia se realiza a 4ºC y 0.2 A durante 3 horas. Para la detección de las proteínas se utiliza un kit de quimioluminiscencia (Tropix, PE Biosystem, Bedford, MA, USA). El protocolo a seguir fue el siguiente: La membrana se mantiene durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación en solución de bloqueo (0.2% I-Block (p/v) y Tween 20 al 0.1% en PBS) . Tras la incubación durante toda la noche en agitación constante con el primer anticuerpo: anti- Pit-1 policlonal (Santa Cruz Biotecnology, USA) a una dilución 1:1000 y anti-GH policlonal (NIDDK, USA) a una dilución 1:4000 en solución de bloqueo diluida 1:10 Material y Métodos 37 con PBS, se hacen 5 lavados de 5 minutos en solución de lavado (0.1% Tween 20 en PBS). A continuación se añade el segundo anticuerpo a una dilución 1:5000, en solución de bloqueo y se dejó incubando 1 hora con agitación constante. Se lava de nuevo 5 veces con solución de lavado y se incuba 2 veces de 8 minutos con tampón de ensayo en agitación. Finalmente la membrana se sumerge en el sustrato quimioluminiscente durante 5 minutos y sin agitación, posteriormente se coloca en un casete autoradiográfico. Los tiempos de exposición variaron según el anticuerpo utilizado. Las membranas que se rehibridaron con el anticuerpo de β-actina (Sigma), que se utiliza como control interno de carga, se sumergen en la solución de glicina 0.2M pH 2.2, SDS 0.1%, Tween 1% durante 1 hora en agitación constante, y se lavan 3 veces de 8 minutos cada una en solución de lavado, antes de incubar la membrana con la solución de bloqueo. 4.4. Inmunohistoquímica Las células se fijan en portas estériles, según el protocolo siguiente: 15 minutos en PBS al 3.7% de formaldehído, 5 minutos en PBS, 4 minutos en metanol a -20º C y 2 minutos en acetona a -20º C. Las muestras de tejido tumoral y tejido normal de glándula mamaria humana son fijadas en paraformaldehido al 4% y tras la obtención de los bloques de tejido se procede a la realización de cortes de 4 µm con un microtomo (Microm; Walldorf, Alemania) sobre los que se detecta la expresión de Pit-1. Los cortes se recogen en portaobjetos silanizados (Histobond adhesión Micro Slides, Marienfeld, Alemania) y se dejan secar una noche a 45ºC. Tras desparafinarlos e hidratarlos se continua con el protocolo. Como pretratamiento se realiza una incubación con tampón citrato sódico 10mM pH 6 en el microondas a 750 watios durante 20 minutos. Los cortes, una vez enfriados, se lavan dos veces en TBS (Tampón Buffer Salino, 0.05 mol/L pH 7.9 con 0.3 mol/L NaCl).A continuación se incuba con el primer anticuerpo policlonal anti-Pit-1 (X-7, Santa Cruz Biotecnology) diluido 1:10 y el anticuerpo policlonal anti-GH (Dako, Denmark) diluido 1:100, en función de las muestras a Material y Métodos 38 estudiar, durante toda la noche a 4ºC. El exceso de anticuerpo se elimina realizando dos lavados con tampón TBS durante 5 minutos. El método seleccionado para la detección inmunohistoquímica es el EnVision que consiste en bloquear la peroxidasa endógena con peróxido de hidrógeno (Merck) durante 10 minutos. A continuación los cortes se lavan dos veces durante 5 minutos con TBS y se incuba con el polímero de dextrano conjugado con Ig de cabra anti – conejo/ratón y con el enzima peroxidasa (EnVision peroxidase, Dako; CA) durante 30 minutos. Los cortes se vuelven a lavar dos veces con TBS durante 5 minutos y finalmente se revela con DAB (Merck).Las muestras se lavan con agua destilada y tras la deshidratación, aclarado y montaje se observan al microscopio. Los controles negativos se realizan incubando el primer anticuerpo con su antígeno homólogo, el péptido Pit-1 y GH recombinante respectivamente, en agitación durante toda la noche a 4º C. 4.5. ELISA GH Esta técnica permite cuantificar la secreción de hGH por las células de adenocarcinoma mamario al medio de cultivo mediante una reacción colorimétrica. Para ello se prepara, sobre placas de 96 pocillos que contienen el anticuerpo anti-hGH en su superficie, una curva de concentraciones conocidas entre 2 y 50 pg/ml de GH y las muestras que contienen el medio de cultivo de las células en las que se transfectó con el plásmido de expresión de Pit-1, pRSV-hPit-1 durante 24, 48 y 72 horas. Como control se utiliza el medio de las células sin tratar. Se incuba durante 1 hora a 37º C. Tras varios lavados se incuban con el anticuerpo anti-hGH unido a digoxigenin (anticuerpo antihGH-DIG) durante 1 hora a 37º C. El exceso de anticuerpo se elimina con un lavado y se le añaden 200 µl de anti-DIG-POD (anticuerpo anti-digoxigenin conjugado con peroxidasa) incubándose durante una hora a 37º C. Finalmente se añade el sustrato ABST que cataliza el enzima dando lugar a un producto colorimétrico. Esta reacción se desarrolla entre 15 - 20º C y en agitación. La absorbancia de las muestras se cuantifica en un lector de ELISA a una longitud de onda de 490 nm. Material y Métodos 39 5. PLÁSMIDOS Y TRANSFECCIONES 5.1. Preparación de bacterias competentes y transformación Para obtener plásmidos a gran escala es necesario transformar las bacterias con cada uno de ellos. Para ello se realiza un cultivo de las bacterias DH5α en 5 ml de LB en agitación toda la noche a 37ºC. A 100 ml de medio SOB con Mg+ (bactotriptona 2%, extracto de levadura 0.5%, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4) se le añade 1 ml de este medio de cultivo y se incuba, en agitación, a 37º C hasta obtener una densidad óptica a 600 nm de entre 0.3 - 0.5. El cultivo se reparte en dos tubos y se incuba durante 10-15 minutos en hielo. Transcurrido este tiempo se centrifugan a 2500 rpm durante 10 minutos a 4ºC. El precipitado obtenido se resuspende en 1/3 del volumen inicial de FSB (100 mM KCl, 45 mM MnCl2 4H2O, 10 mM CaCl2 2 H2O, 3 mM HACoCl3, 10 mM acetato K, 10% glicerol p/v), y se incuba durante 10-15 minutos en hielo. A continuación, se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos a 4º C y el precipitado obtenido se resuspende en 1/12.5 del volumen inicial de FSB. Se añade 3.5% (v/v) de DMSO y se agita inmediatamente. Tras incubarse en hielo durante 5 minutos a la mezcla se le añade DMSO hasta obtener una concentración final de 7% y se incuba 10-15 minutos en hielo. Finalmente se alicuetean y se guardan a -80º C. Las bacterias DH5α competentes se transforman con cada uno de los siguientes plásmidos: pRSVhPit-1 (plásmido de expresión de Pit-1), pRc/pRSV (plásmido sin la secuencia que codifica para Pit-1), pEPuro (plásmido de resistencia a puromicina) y pGL3B-GH300, tal y como se indica a continuación: 1µl del plásmido se añade a 100 µl de bacterias competentes. La reacción se incuba a 4ºC durante 30 minutos seguida de otra incubación a 37º C durante 10 minutos. A cada una de las reacciones se le añaden 250 µl de LB y se mantienen en agitación a 37º C durante 45 minutos. Una vez que las bacterias han crecido se siembran en placas de LB-agar con ampicilina y se incuban a 37ºC toda la noche en un incubador de bacterias. En las colonias que crecieron se confirma la expresión de cada uno de los plásmidos y se pasa a la obtención a gran escala, utilizando el kit: Maxiprep Jet Star (Genomed, Roche). Resultados 45 1. ESTUDIO in vitro: LÍNEA CELULAR MCF-7 1.1. Detección de ARNm de Pit-1 y GH por RT-PCR En las células de adenocarcinoma mamario humano se determina la expresión de Pit-1 y GH mediante RT-PCR. El producto obtenido correspondiente a Pit-1 está constituido por 295 pb mientras que el correspondiente a GH está formado por 344 pb. Ambos productos se visualizan en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio y se confirma que corresponden a los productuos amplificados mediante digestión enzimática. Así, el enzima de restricción Mbo II es el utilizado para la digestión del producto de amplificación para Pit-1 dando lugar a fragmentos de 219 pb y 76 pb, tal y como se muestra en la figura 9. En el caso de GH el enzima de restricción seleccionado es Bgl II que da lugar a fragmentos de 237 pb y 107 pb (Fig. 10). Ambos productos de PCR fueron también secuenciados demostrándose que la secuencia amplificada es idéntica a la presente a nivel hipofisario. Figura 9. Detección de ARNm de Pit-1 en la línea celular MCF7 mediante RTPCR. Calle 1 : marcador de pesos moleculares. Calle 2: control po sitivo (hipófisis humana). Calle 3: línea celular MCF-7. Calle 4: digestión enzimática del producto PCR con el enzima Mbo II, que origina fragmentos de 219 y 76 pb. Figura 10 . Expresión del ARNm que codifica GH en la línea celular MCF- 7. En la calle 1 se muestra el marcador de pesos moleculares. Calle 2: control positivo (hipófisis humana). Calle 3: MCF- 7. Calle 4: digestión enzimática del producto de PCR por el enzima de restricción Bgl II, dando lugar a dos fragmentos constituidos por 237 y 107 pb. 1 2 3 4 ← ←← ← 295 pb ← ←← ← 219 pb ← ←← ← 76 pb 1 2 3 4 ← ←← ← 344 pb ← ←← ← 107 pb ← ←← ← 237 pb Resultados 46 1.2. Expresión proteica de Pit-1 y GH 1.2.1. Inmunoprecipitación y Western blot La expresión, a nivel proteico, de Pit-1 se detectó en extractos obtenidos de la línea celular MCF-7 mediante una inmunoprecipitación seguida de Western blot. Tras la inmunodetección se distinguen dos isoformas de Pit-1, una de 33 kDa y otra de 31 kDa originadas por un procesamiento alternativo del ARNm (Voss et al., 1991). Como control positivo se utilizó el extracto proteico obtenido a partir de hipófisis humana (Fig. 11). La expresión de la hormona de crecimiento en las células de adenocarcinoma mamario humano se determina mediante Western blot. Tras la incubación con el anticuerpo anti-hGH se observa una banda constituida por 22 kDa que corresponde al peso molecular de la GH. Se observa también una banda del mismo peso molecular en los controles positivos utilizados: GH recombinante (Fig. 12, línea 2) y extracto proteico de hipófisis humana (Fig. 12 línea 3). Figura 11. Western blot para Pit- 1 en el cultivo celular. Calle 1: marcador d e pesos moleculares. Calle 2: extracto proteico de hipófisis humana. Calle 3: extracto proteico de la línea celular de adenocarcinoma mamario humano (MCF-7). Figura 12. Western blot para GH. Calle 1: extracto proteico de la línea celular MCF-7. Calle 2: control po sitivo (GH recombinante humana). Calle 3: control positivo (extracto proteico de hipófisis humana). ← ←← ← 33 kDa ← ←← ← 31 kDa ← ←← ← 22 kDa 1 2 3 1 2 3 Resultados 47 1.2.2. Inmunohistoquímica Los resultados obtenidos mediante PCR y Western blot se confirman por un análisis inmunohistoquímico. Para la inmunoreactividad frente a Pit-1, se observa una señal punteada localizada en el núcleo, concretamente en los nucleolos (Fig.13A). No se observa señal cuando el anticuerpo primario es preabsorbido utilizando su antígeno homólogo, proteína purificada Pit-1 (Fig. 13B). La inmunoreactividad frente a GH en la línea celular MCF-7, tal y como se observa en la figura 14A, se localiza en el citoplasma. No se observa señal cuando el anticuerpo frente a GH se preabsorbe con GH recombinante (Fig. 14B). 1 4A 1 4B Figura 14. Inmunohisquímica para GH en la línea celular MCF-7. 14A: Inmunoreactividad para GH. Se observa expresión de la hormona de crecimiento a nivel citoplasmático (40X). 14B: Control negativo para GH (20X). 13A 13B Figura 13. Inmunohistoquímica para Pit-1. 13A: Detección de Pit-1 a nivel nucleolar (40X). 13B: Control negativo para Pit-1. El anticuerpo se preabsorbe con su antígeno homólogo, el péptido Pit-1 (20X). Resultados 48 1.3. Efecto de Pit-1 sobre la expresión de GH en la línea celular MCF-7 1.3.1. Estudio de la expresión a nivel de ARNm Tras demostrar la expresión del factor de transcripción Pit-1 y de GH en la línea celular MCF-7 el siguiente paso consiste en determinar si, al igual que ocurre a nivel hipofisario, Pit-1 regula la expresión de la hormona de crecimiento en esta línea celular. Para ello se realiza una transfección con el plásmido de expresión, pRSVhPit-1 y se observa el incremento de Pit-1 a distintos tiempos mediante Western blot (Fig. 15). Una vez confirmado el incremento de Pit-1, se realizan tratamientos con el plásmido de expresión de Pit-1 durante 24, 48 y 72 horas y se estudia la expresión de GH por RT-PCR. El producto obtenido, constituido por 344 pb. y secuenciado posteriormente, corresponde a GH (Fig. 16). 1 2 3 4 5 6 C 12h 24h 36h 48h ← ←← ← 33 kDa ← ←← ← 31 kDa Figura 15. IP - Western blot para Pit-1. Se observa un i ncremento de la proteína Pit-1 en la línea celular MCF- 7 transfectada con pRSVhPit-1 durante 12, 24. 36 y 48 horas. . 1 2 3 4 5 6 ← ←← ← 344 pb ← ←← ← 131 pb Figura 16. RT-PCR para GH. El producto de PCR se visualiza en un gel de aga rosa y las bandas obtenidas se densitometran. La expresión se corrige utilizando como control interno 18S. Calle 1: marcador de pesos moleculares. Calle 2: control negativo de la PCR. Calle 3: MCF- 7 sin tratar. Calle 4, 5 y 6: Células MCF- 7 tratadas con Pit- 1 durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente. Resultados 49 Los valores obtenidos por densitometría muestran que el incremento de la expresión de GH en la línea celular MCF-7 es significativo, con una p<0.001 a las 48 horas (1.38 ± 0.32) y 72 horas (1.57 ± 0.11) tras la transfección en relación a las células control, no transfectadas con pRSVhPit-1 (0.56 ± 0.1) y las células tratadas con pRSVhPit -1 durante 24 horas (0.67 ± 0.12) (Fig.17). 1.3.2. Expresión de GH a nivel proteico 1.3.2.1. Western blot Para valorar si Pit-1 incrementa los niveles proteicos de GH en la línea celular MCF-7, estas células se transfectaron con el plásmido pRSVhPit-1 y tras 24, 48 y 72 horas de tratamiento se procede a la extracción de la proteína y posterior análisis de la expresión de GH mediante Western blot (Fig. 18). Figura 17. Resultados obtenidos tras densitometrar las bandas correspondientes a la expresión de GH en la línea celular MCF- 7 transfectada con pRSVhPit- 1 en relación a células no tratadas. Se utilizó como control de carga 18S. ***p<0.001. ← ←← ← GH ← ←← ←β-actina C 24h 48h 72h Figura 18. Expresión de GH en la línea celular MCF-7 tras el tratamiento con pRSVhPit-1. Se utiliza como control de carga β-actina. Relación GH/18S C 24h 48h 72h *** *** Resultados 50 Los valores obtenidos por densitometría muestran un incremento significativo en la expresión de GH a las 48 y 72 horas de la transfección con respecto a las células control (no transfectadas con pRSVhPit-1) con una p<0.01 (control: 0.59 ± 0.2; 24 horas: 0.77 ±0.09; 48 horas: 1.19 ± 0.22 y 72 horas: 1.4 ± 0.18) (Fig. 19). 1.3.2.2. ELISA GH Se determina también, mediante la técnica de ELISA, la secreción de la hormona de crecimiento al medio de cultivo tras transfectar las células MCF-7 con pRSVhPit-1. Las células que no sobreexpresan Pit-1, es decir, aquellas que no han sido transfectadas con el plásmido (células control), presentan un bajo nivel de GH en el medio de cultivo, mientras que, cuando son tratadas con el plásmido de expresión de Pit-1 los niveles de hormona de crecimiento en el medio extracelular se incrementan. Así, los valores que se obtienen son los siguientes: control: 3.01 ± 2.3, 24 horas: 4.85 ± 0.28, 48 horas: 5.52 ± 1.53 y 72 horas: 9.52 ± 3.03 (Fig. 20). Figura 19. Valores obtenidos tras la densitometría del Western blot . **p<0.01. Relación GH/β actina ** ** Resultados 51 1.3.3. Análisis de la actividad transcripcional del promotor de GH Para demostrar que Pit-1 actúa a nivel transcripcional sobre el promotor de GH en la línea celular MCF-7 se realiza una cotransfección con el plásmido pGL3-basic- GH300, que presenta la secuencia del promotor del gen de la GH, desde la posiciones -300 a -1, que contiene los dos lugares de unión para Pit-1, unido al gen reporter con actividad luciferasa y distintas concentraciones del plásmido de expresión pRSVhPit-1 (100ng, 250 ng, 500 ng y 1000 ng). Transcurridas 72 horas tras la transfección las células se recogen en tampón de lisis y se cuantifica la actividad transcripcional. Como se muestra en la figura 22, se observa un incremento significativo entre células control (no transfectadas con el plásmido pRSVhPit-1), y aquellas transfectadas con 250 ng o concentraciones superiores del plásmido pRSVhPit-1 (Figura 21). Los resultados de tres experimentos independientes se muestran en la siguiente tabla: hGH pg/ml Figura 20 . ELISA para GH. Las células transfectadas muestran un nivel detectable pero no si gnificativo en la secreción de GH al medio a las 24 y 48 horas, s ólo tras 72h de transfección los niveles de GH se ven significativamente incrementados con respecto a los niveles de GH presentes en el medio de cultivo de las células control. **p<0.01. C 24h 48h 72h ** Resultados 52 100 ng 250 ng 500 ng 1000 ng CONTROL 31971,8 ± 9620 26797 ± 9161 30603 ± 10252 28734 ± 6332 TRATADO 40082 ± 15405 50492 ± 10328 51332 ± 13648 73074 ± 19501 1.4. Efecto de Pit-1 sobre la expresión de IGF-I mediante PCR a tiempo real Para evaluar si Pit-1 incrementa los niveles de IGF-I (directamente o a través de GH), en la línea celular MCF-7, se sobreexpresa Pit-1 durante 24, 48 y 72 horas y se analiza posteriormente la expresión de IGF-I mediante PCR a tiempo real. Los valores obtenidos se corrigen utilizando como control de carga el ARN ribosómico 18S. Tal y Actividad luciferasa/ β-galactosidasa Figura 21. Efecto de pRSVhPit-1 sobre la expresión de p-GH300Luc. Los resultados muestran una relación dosis-dependiente entre la concentración del plásmido de expresión de Pit-1 y la transcripción de GH. Los datos se expresan la actividad luciferasa corregida con la actividadad β-galactosidasa. ***p<0.001. Concentración de pRSVhPit-1 (ng) 0 20000 40000 60000 80000 100000 *** Relative luciferase activity - + - + - + - + 100 250 500 1000 *** *** 0 20000 40000 60000 80000 100000 *** Relative luciferase activity - + - + - + - + 100 250 500 1000 *** *** Resultados 53 como se muestra en la figura 22, no se observan diferencias entre los niveles de IGF-I entre células control (no transfectadas con el plásmido pRSVhPit-1) y las transfectadas con el plásmido de expresión de Pit-1(control 5.1 ± 0.9; 24 horas 5.42 ± 0.09; 48 horas 5.53 ± 0.49 y 72 horas 5.45 ± 0.15) (Fig.22). 1.5. Papel de Pit-1 en proliferación celular Para determinar el papel de Pit-1 sobre proliferación celular, las células de adenocarcinoma mamario humano se cotransfectan con 250 ng del plásmido de expresión de Pit-1 (pRSVhPit-1) y el plásmido que codifica para puromicina (pEPuro) en relación 1:10, y posteriormente se seleccionan añadiendo 1 µg/ml de puromicina. Se incuban con bromodeoxiuridina, que será incorporada por aquellas células que estén sintetizando ADN, es decir, que estén en fase S. Mediante microscopia de fluorescencia se cuantifican los núcleos en fase S frente a los núcleos totales teñidos con DAPI a diferentes tiempos (24h, 48h, 72h). Se observa un incremento significativo de proliferación celular a las 48 horas (18.3 ± 2.9% vs 29.6 ± 5.1%) y a las 72 horas (15.8 ± 5.7 vs 30.2 ± 7.7) de la transfección, respecto a las células control, transfectadas con Figura 22. PCR a ti empo real para IGF- I. No se observa diferencias entre las células tratadas con el plásmido de expresión de Pit- 1 y las células control (no tratadas). Expresión de ARNm de IGF-I (Unidades arbitrarias) Resultados 60 Para verificar el producto obtenido por PCR correspondiente a Pit-1 en el tejido mamario normal y tumoral se realizó un corte con dos enzimas de restricción (Pvu II y Mbo II) seleccionadas sobre la secuencia amplificada. Tras la digestión enzimática con el enzima Pvu II se obtienen dos fragmentos constituidos por 211 y 36 pb, respectivamente, mientras que el enzima Mbo II origina otros dos fragmentos pero constituidos por 181 y 66 pb. (Fig. 30). 2.2. Detección proteica de Pit-1 2.2.1. Inmunoprecipitación y Western blot La expresión a nivel proteico de Pit-1 se detectó en extractos obtenidos de tejido mamario normal y carcinomas ductales infiltrantes humanos mediante una imunoprecipitación seguida de Western blot. En ambos casos se pueden distinguir dos isoformas de Pit-1, una de 33 kDa y otra de 31 kDa originadas por un procesamiento alternativo del ARN (Voss et al., 1991) (Fig. 31). A pesar de que la cantidad de proteína de la se partió en la glándula mamaria normal es de 2 mg, mientras que en los carcinomas mamarios se utilizó 1.5 mg, se observa una mayor expresión de Pit-1 en los tumores mamarios en relación a la glándula mamaria normal. 247 pb → →→ → ← ←← ← 247 pb Figura 30. Digestión enzimática del producto PCR . Las calles 1 y 5 representan el producto sin cortar. Calle 2: digestión con el enzima Mbo II. Calle 3: marcador de pesos moleculares. Calle 4: digestión con el enzima Pvu II. 1 2 3 4 5 ← 211 pb 181 pb → →→ → Mbo II Pvu II Resultados 61 Como controles negativos de la inmunoprecipitación-western blot para Pit-1 se utilizó la proteína obtenida a partir de glándula adrenal de rata y la línea celular Saos-2 y como positivos proteína purificada de Santa Cruz Biotecnology y placenta humana (Fig. 32). ← ←← ← 33 kDa ← ←← ← 31 kDa ← ←← ← 33 kDa ← ←← ← 31 kDa ← ←← ← 33 kDa ← ← ← ← 31 kDa 1 2 3 4 5 6 7 Figura 31. Inmunoprecipitación - Western blot para Pit-1. Se detectan dos bandas constituidas por 33 y 31 kDa y correspondientes a las dos isoformas de Pit-1. 31A y 31B : expresión de Pit-1 en 14 carcinomas mamarios ductales infiltrantes y en 7 glándulas mamarias normales. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 31 A 31 B ← ←← ← 33 kDa ← ←← ← 31 kDa Figura 32. Control positivo y negativo de la IP-WB frente a Pit-1. Calle 1: Proteína Saos-2. Calle 2: glándula adrenal de rata. Calle 3: proteína purificada de Pit-1 (Santa Cruz Biotecnology). Calle 4: mama normal. Calle 5: tumor de mama. 1 2 3 4 5 TUMORES MAMA NORMAL Resultados 62 2.2.2. Inmunohistoquímica Estudios previos han demostrado que GH se expresa en las células que constituyen los ductos mamarios, por lo que, nuestro siguiente objetivo fue determinar cuales son las células que expresan Pit-1 en la glándula mamaria normal y en tumores de mama. Para ello se realiza un estudio inmunohistoquímico. Así, tras incubar las diferentes muestras de tejido con el anticuerpo anti-Pit-1 y posterior detección mediante el método EnVision, se observa que el tejido mamario normal presenta una tinción del núcleo de las células epiteliales y mioepiteliales que constituyen los ductos y alveolos de la glándula mamaria (Fig.33A). Esa misma tinción, a nivel nuclear, se observa también en los carcinomas mamarios ductales infiltrantes (Figs. 33C y 33D). Esta señal desaparece cuando el anticuerpo se preabsorbe con su antígeno homólogo, el péptido Pit-1 (control negativo) (Fig.33B). Resultados 63 33 B Figura 33. Inmunohistoquímica para Pit-1. 33A: Inmunopositividad para Pit- 1 en la glándula mamaria normal. Se observa una tinción nuclear tanto en células epiteliales como mioepiteliales que const ituyen los ductos, mientras que es estroma no expresa Pit-1 (40X). 33B : Control negativo. Se realizó una preabsorción del anticu erpo primario con su antígeno homólogo, proteína Pit-1, y no se observa señal (40X). 33C: Inmunodetección para Pit-1 en los ca rcinomas ductales infiltrantes. (20X). 33D : Se observa en las células tumorales una tinción nuclear. (40X). 33 A 33C 33 D VI. DISCUSIÓN Discusión 65 Tradicionalmente, la síntesis de GH se localizaba en las células somatotropas de la hipófisis anterior, actuando como un factor endocrino sobre tejidos periféricos. Posteriormente, se ha demostrado su expresión en tejidos extrahipofisarios humanos, por ejemplo cerebro, tejidos linfoides (Wu et al., 1996), colon, piel, riñón, pulmón y músculo (Kyle et al., 1981; Kao et al., 1992; Kooijman et al., 1997). GH también se expresa en tejidos reproductores como testículos (Untergasser et al., 1997), ovarios (Schwarzler et al., 1997), placenta y glándula mamaria tanto normal como tumores de mama (Mol et al., 1995). En estos tejidos extrahipofisarios, GH ejerce funciones de tipo autocrino/paracrino. Así, GH está implicada en el desarrollo y diferenciación del epitelio mamario (Plaut et al., 1993) ejerciendo su función a través de su propio receptor, GH-R, que también se expresa en células mamarias (Feldman et al., 1993; Decouvelaere et al., 1995). Kaulsay y col. en el año 99, utilizando la línea celular MCF- 7 (adenocarcinoma mamario humano) demuestran que GH incrementa el número de las células mamarias como consecuencia de una activación de la mitogénesis y un descenso de la apoptosis, actuando como un potente estimulador de la motilidad celular. Estas acciones son significativamente más evidentes si GH actúa de forma autocrina, en relación a la administración exógena de esta hormona. Estos efectos los ejerce al unirse a su propio receptor y no al de PRL, ya que si se bloquea el receptor de GH se inhibe la proliferación y motilidad celular (Kaulsay et al., 2001). Debido a la gran homología de los receptores de GH y PRL se activan rutas de señalización muy similares. Así, además de activarse la vía Jun Kinasa 2 y los activadores de transcripción STAT5 y STAT3, se activa también fosfolipasa C y fosfatidil-inositol-3 kinasa. Todas estas rutas incrementan proliferación celular, supervivencia y motilidad. Además, la activación de ERK está implicada en metástasis (Waters y Conway-Campbell, 2004). Estudios también realizados en la línea celular MCF-7 demuestran que GH autocrina regula la expresión de HOXA1, un potente oncogen necesario para el incremento de la expresión de c-myc, ciclina D1 y Bcl-2 (Zhang et al., 2003). Además, GH regula gadd153 (CHOP) que activa la protección frente a apoptosis (Mertani et al., 2001). Más recientemente, se ha observado que la producción autocrina de GH incrementa los niveles del ARNm que codifica para la subunidad catalítica de la Discusión 66 telomerasa (TERT), inmortalizando las células epiteliales mamarias humanas (Lobie, 2004). La producción autocrina de GH confiere un fenotipo invasivo en células de carcinoma mamario como resultado de la transición epitelio-mesénquima (Mukhina et al., 2004). Todos los datos experimentales reflejados hasta el momento, utilizando la línea celular MCF-7, han sido obtenidos al transfectar estas células con un vector de expresión de GH. Sin embargo, y aunque pueda parecer sorprendente, no existe ningún estudio sobre la expresión endógena de GH por esta línea celular. Nuestro primer objetivo, por tanto, fue el comprobar si la línea celular MCF-7 expresaba GH. Para ello, a partir de ARN de células MCF-7 y utilizando oligonucleóticos específicos diseñados sobre la secuencia que codifica para GH, amplificamos por PCR una región constituida por 344 pares de bases, que corresponde a GH, tal y como se confirma por análisis con enzimas de restricción específicos. Además, tras secuenciar el producto PCR obtenido, demostramos que es idéntica a la GH producida a nivel hipofisario. Una vez determinada la presencia de GH a nivel de ARNm, analizamos su expresión proteica por Western blot. Nuestros resultados muestran una banda inmunoreactiva de 22 kDa en el extracto proteico de células MCF-7 que corresponde a GH. Para completar el estudio y localizar su expresión en la célula, se realiza una inmunohistoquímica, observándose inmunoreactividad frente a GH a nivel citoplasmático. Al contrario, no se observa señal cuando el anticuerpo es preincubado con el antígeno homólogo (GH recombinante), de manera que se elimina cualquier señal inespecífica que pudiese originar un error. Dado que nuestros resultados indicaban que la línea celular MCF-7 expresaba GH, el siguiente objetivo en nuestro estudio fue el determinar si esta línea celular expresaba también su principal regulador hipofisario, el factor de transcripción hipofisario-1 o Pit-1. Pit-1, también conocido como GHF-1 (Growth Hormone Factor-1), es una proteína que actúa como un factor de transcripción en las células de la hipófisis anterior estimulando la expresión de los genes de GH y PRL, así como de la subunidad β de Discusión 67 TSH, en tres tipos celulares específicos: somatotropas, lactotropas y tirotropas respectivamente. Así mismo, desempeña una función determinante en la diferenciación celular durante el desarrollo de la hipófisis anterior (De la Hoya et al., 1998). Esta proteína se aisló, purificó y secuenció por primera vez a finales de los años 80 de forma simultánea por dos grupos independientes (Lefevre et al., 1987, Nelson et al., 1988). Mientras los primeros defendían la hipótesis de que Pit-1 era el determinante primario de la expresión de GH y que su localización in vivo era específica en células de la línea somatotropa, los datos obtenidos por el segundo grupo confirmaban que Pit-1 era capaz de unirse tanto al gen de GH como al de PRL, estimulando la transcripción de ambos genes. Durante algún tiempo, se pensó que se trataba de dos proteínas distintas, debido a la discordancia de resultados entre ambos grupos. Estudios posteriores confirmaron la identidad de ambas proteínas como un solo factor de transcripción que se expresaba en la hipófisis anterior y que es capaz de unirse a regiones reguladoras en el gen de GH y PRL y de la subunidad β de TSH, así como en el propio promotor del gen Pit-1, autorregulando su expresión (González-Parra et al., 1994). Aunque inicialmente, como en el caso de GH, su expresión se localizaba en la hipófisis, también se encuentra en tejidos y líneas celulares extrahipofisarias, entre las que se encuentran placenta humana (Bamberger et al., 1995, Schanke et al., 1997), tejidos hematopoyéticos y linfoides (Delhase et al., 1993), y en la línea celular HL60, leucemia promielocítica humana (Costoya et al., 1998). Para valorar la expresión de Pit-1 en la línea celular MCF-7, se utilizó el mismo protocolo experimental que en el caso anterior, es decir, se realizó un estudio a nivel de ARNm y a nivel proteico. Utilizando oligonucleótidos específicos, diseñados sobre la secuencia que codifica Pit-1, por medio de RT-PCR se amplifica una región constituida por 295 pares de bases que corresponde, tal y como se confirma por análisis con enzimas de restricción, a Pit-1. La secuenciación del producto PCR nos indica además que el factor de transcripción Pit-1 expresado en células MCF-7 es idéntico al que se expresa en hipófisis. Para determinar su presencia a nivel proteico, se inmunoprecipita el extracto proteico de las células MCF-7 utilizando un anticuerpo monoclonal y Discusión 74 celulares múltiples, pérdida del contacto célula-célula y ausencia de adhesión, no observándose este efecto tras la administración exógena de GH (Mukhina et al., 2004). Pit-1 actuaría como un importante factor en el desarrollo y progresión de los tumores de mama, de tal forma que una desregulación de la expresión de Pit-1 aumentaría la expresión de GH (¿y/o PRL?) y por tanto se incrementaría el riesgo de cáncer de mama. El bloqueo de la síntesis de este factor de transcripción, probablemente disminuiría la síntesis de GH (y/o de otros factores dependientes de Pit-1) en la propia glándula mamaria disminuyendo por tanto, la proliferación celular originada por incremento de ambas hormonas o bien directamente por el propio factor de transcripción. VII. CONCLUSIONES Conclusiones 77 Las conclusiones de este trabajo son las siguientes: Estudio in vitro sobre la línea celular MCF-7: 1.- La línea celular MCF-7 (adenocarcinoma mamario humano) expresa el gen que codifica para GH y el factor de transcripción Pit-1. 2.- La expresión de Pit-1 se localiza a nivel nuclear, concretamente en los nucleolos, mientras que la expresión de GH es citoplasmática. 3.- Al igual que ocurre a nivel hipofisario, el factor de transcripción Pit-1 regula la transcripción del gen de la GH. 4.- Dosis crecientes en la concentración del plásmido de expresión de Pit-1 ejercen un efecto proliferativo sobre la línea celular MCF-7. Estudio in vivo: 5.- La glándula mamaria normal y los carcinomas ductales infiltrantes procedentes de muestras humanas expresan Pit-1, observándose una expresión significativamente mayor en tejido tumoral en relación al tejido normal. 6.- Mediante inmunohistoquímica la expresión de Pit-1 en estos tejidos se localiza en los núcleos las células epiteliales y mioepiteliales que constituyen los ductos y alveolos de la glándula mamaria. VIII. BIBLIOGRAFIA Bibliografía 79 Ankarberg-Lindgren C., Elfving M., Wikland K.A., Norjavaara E. 2001. Nocturnal application of transdermal estradiol patches produces levels of estradiol that mimic those seen at the onset of spontaneous puberty in girls. J. Clin. Endocrinol. Metab., 86: 3039-44. Arai M., Utsunomiya J., Miki Y. 2004. Familial breast and ovarian cancers. Int. J. Clin. Oncol., 9: 270-82. Argetsinger L.S, Carter-Su C. 1996. Mechanism of signaling by growth hormone receptor. Physiol. Rev., 76: 1089-107. 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