Estudio de la migración de distintos componentes de los materiales plásticos a los alimentos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Depa amen o de Química Analí ica, Nu ición y B oma ología Á ea de Nu ición y B oma ología ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DE LOS MATERIALES PLÁSTICOS A LOS ALIMENTOS Memo ia p esen ada pa a op a al G ado de Doc o RAQUEL SENDÓN GARCÍA San iago de Compos ela, Feb e o de 2005 PILAR BERMEJO BARRERA, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMA: Que Dña. Raquel Sendón Ga cía p esen a el abajo i ulado “ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DE LOS MATERIALES PLÁSTICOS A LOS ALIMENTOS” ealizado bajo la di ección del D . Pe ec o Pasei o Losada y de la D a. Mª Concepción Pé ez Lamela, en los labo a o ios de B oma ología de la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad de San iago de Compos ela. Fdo. D a. Dña. Pila Be mejo Ba e a San iago de Compos ela, Feb e o de 2005 PERFECTO PASEIRO LOSADA, PROFESOR TITULAR DEL ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y Mª CONCEPCIÓN PÉREZ LAMELA, DOCTORA EN FARMACIA E INVESTIGADORA PARGA PONDAL DE LA UNIVERSIDAD DE VIGO AUTORIZAN a Dña. Raquel Sendón Ga cía a p esen a la Tesis i ulada “ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DE LOS MATERIALES PLÁSTICOS A LOS ALIMENTOS” pa a op a al G ado de Doc o , la cual ha sido ealizada bajo nues a di ección en los labo a o ios de B oma ología de la Facul ad de Fa macia de la Uni e sidad de San iago de Compos ela. Y pa a que así cons e, se expide la p esen e en San iago de Compos ela en Feb e o de 2005. Fdo. D . Pe ec o Pasei o Losada Fdo. D a. Mª Concepción Pé ez Lamela. Fdo. Dña. Raquel Sendón Ga cía. AGRADECIMIENTOS Me gus a ía exp esa mi más since o ag adecimien o, en p ime luga a los di ec o es de es a Tesis, que han hecho posible la ealización de es e abajo, al P o . D . Pe ec o Pasei o Losada po habe me dado la opo unidad de descub i el mundo de la in es igación y po habe me enseñado esos p incipios, mi ad ciencia mi ad sen ido común; a la D a. Concepción Pé ez Lamela po habe es ado ahí, po su apoyo incondicional y sob e odo po habe me en endido en odo momen o. A los demás p o eso es del depa amen o, que siemp e han es ado dispues os a ayuda me en odo, y po habe me apoyado siemp e. Todos han pa icipado en mi o mación lo cual ha sido una g an sue e. A odos aquellos que han pasado po es e depa amen o desde mis inicios, a la D a. Ana Rod íguez y muy especialmen e, po odo lo que le ha ocado i i , y aún así, es a siemp e dispues a a ende me una mano, a la D a. Sa ah Pas o elli. Muchos más han pasado po aquí, y ambién a ellos les ag adezco odos los buenos momen os que me han hecho pasa ; incluso a aquellos que se han empeñado en ama ga el buen ambien e que siemp e ha habido, po que ambién me han ayudado a hace me más ue e. A los que aho a es án aquí, a los que abajan codo con codo conmigo, a los “niños” y a los demás, siemp e haciéndolo odo mucho más ácil. A los dos pila es undamen ales que me han sus en ado es os úl imos años, que han hecho posible que oda ía me quede algo de co du a, y sob e odo en es e úl imo año an especial, que se han enca gado de que no me desmo onase; muchas g acias a la “cD a.” Ma ía Punín y a la D a. Ana Te esa Sanches. A mis amigas de oda la ida; c eo que es uno de los mejo es eso os que una pe sona pueda ene , la amis ad incondicional du an e es os ya más de quince años, po odo lo que hemos i ido jun as, lo bueno y lo malo, muchas g acias chicas! VII A mi amilia, que siemp e es á ahí, pase lo que pase, que siemp e me ayudan y que han sido mi pun o de pa ida, po habe me pe mi ido llega has a aquí, muchas g acias. A Eusebio, su con ianza, su apoyo, su ida, an as cosas.... ya se han hecho imp escindibles en mi ida. En in, a odos los que es u ie on y es án ahí, a mi lado. Po úl imo me gus a ía ag adece el inanciamien o económico que ha hecho posible pa e de es e abajo: A la Comisión In e minis e ial de Ciencia y Tecnología, CICYT y a la Comisión Eu opea po la concesión del p oyec o: Desa ollo de una me odología analí ica pa a la op imización y e i icación de ma e iales plás icos de uso alimen a io. Aplicaciones en la indus ia ab ican e, 1FD97-2167-C02-01. A la Comisión Eu opea po la concesión del p oyec o: FOODMIGROSURE, Modelling mig a ion om plas ics in o oods u s as a no el and cos e icien ool o es ima ion o consume exposu e om ood con ac ma e ials, QLRT-2001-02390. VIII A mis pad es, a mi he mano Y a la pe sona que ha decidido compa i su ida conmigo ÍNDICE DE TABLAS I. In oducción. Tabla I.1: Resumen de la legislación aplicable a ma e iales des inados a en a en con ac o con alimen os. 25 II. De e mina ion o Compounds om Epoxy Resins in Food Simulan s by HPLC-Fluo escence. Table II.1: Summa y mig a ion esul s o all BADGE ela ed compounds exp essed as mg BADGE dm-2. 46 Table II.2: Resul s o BADGE de i a i es and oligome s mig a ion exp essed as mg BADGE dm-2. 50 III. De e mina ion o Bisphenol A Diglycidyl E he and i s Hyd olysis and Chlo ohyd oxy De i a i es by Liquid Ch oma og aphy-Mass Spec ome y. Table III.1: Selec ed ions o quan i ica ion. 61 Table III.2: Possible s uc u es o o he agmen s. 66 Table III.3: Me hod alida ion pa ame e s. 67 IV. De e mina ion o Bisphenol F Diglycidyl E he and i s Rela ed Compounds by High Pe o mance Liquid Ch oma og aphy-Mass Spec ome y. Table IV.1: Chemical s uc u es o selec ed ions o quan i ica ion pu poses (only pa a, pa a isome s a e showed). 80 Table IV.2: Me hod alida ion pa ame e s. 87 V. Mig a ion su ey o bisphenol A diglycidyl e he and bisphenol F diglycidyl e he om canned ish and sea ood, in Spanish ma ke du ing las yea s. Table V.1: Summa y o esul s o BADGE and BFDGE su ey. 99 XV VI. Compila ion o Analy ical Me hods o De e mine Mig a ion o Addi i es and Monome s om Plas ics o Foods u s. Table VI.1: Chemical and physical p ope ies o I ganox 1076. 115 Table VI.2: Chemical and physical p ope ies o DPBD. 117 Table VI.3: Chemical and physical p ope ies o Chimasso b 81. 118 Table VI.4: Chemical and physical p ope ies o U i ex OB. 118 Table VI.5: Chemical and physical p ope ies o ε-cap olac am. 119 Table VI.6: Chemical and physical p ope ies o benzophenone. 120 Table VI.7: Chemical and physical p ope ies o diphenyl ph hala e. 121 Table VI.8: Chemical and physical p ope ies o DEHA. 122 Table VI.9: Resul s o p elimina y expe imen s. 129 Table VI.10: Guideline sugges ed o he analysis o eigh selec ed model mig an s. 130 Table VI.11: HPLC me hods o I ganox 1076 analysis. 131 Table VI.12: GC me hods o I ganox 1076 analysis. 131 Table VI.13: SPE (Supe c i ical Fluid Ch oma og aphy) me hods o I ganox 1076. 132 Table VI.14: HPLC-UV me hods o Chimasso b 81 and U i ex OB analysis. 132 Table VI.15: GC me hods o Chimasso b 81, U i ex OB and benzophenone analysis. 133 Table VI.16: GC-FID me hods o DEHA analysis. 133 Table VI.17: GC-MS me hods o DEHA analysis. 134 VII. S a e o he A o Analy ical s a egies o E alua e Di e en Mig an s om Food Packaging Ma e ials. Table VII.1: Chemical s uc u es. 149 Table VII.2: Chemical and physical in o ma ion. 151 Table VII.3: Resul s o p elimina y expe imen s. 166 XVI Table VII.4: Sugges ions o p epa e analy ical me hods o de e mine mig an s in oods. 170 VIII. De e mina ion o Diphenylbu adiene by Liquid Ch oma og aphy-UV- Fluo escence in Foods u s. Table VIII.1: Me hod alida ion pa ame e s. 188 Table VIII.2: DPBD eco e ies a di e en concen a ions o o ange juice, chicken b eas and Gouda cheese ob ained wi h an ul a iole de ec o . 190 Table VIII.3: DPBD eco e ies a di e en concen a ions o o ange juice, chicken b eas and Gouda cheese ob ained wi h a luo escence de ec o . 190 XVII ÍNDICE DE FIGURAS II. De e mina ion o Compounds om Epoxy Resins in Food Simulan s by HPLC-Fluo escence. Figu e II.1: Compounds o low Molecula weigh in BADGE / NOGE se ies. 41 Figu e II.2: Chemical s uc u es o BADGE, p,p-BFDGE and i s de i a i es. 42 Figu e II.3: Ch oma og ams o Bisphenol A epoxy esin (A), NOGE esin (C) and all de i a i es ob ained om BADGE and BFDGE s anda ds (B and D). 47 Figu e II.4: HPLC-MS ch oma og am o a sample wi hou pos cu ed ea men ex ac ed wi h 90% ace oni ile acqui ed in single ion eco ding mode: mass 951(A), mass 666 (B) and mass 382 (C). 48 Figu e II.5: Ch oma og ams o samples wi hou pos cu ed ea men : 3% ace ic acid (A), oli e oil (B) and 90% ace oni ile (C). 49 III. De e mina ion o Bisphenol A Diglycidyl E he and i s Hyd olysis and Chlo ohyd oxy De i a i es by Liquid Ch oma og aphy-Mass Spec ome y. Figu e III.1: Chemical s uc u es o BADGE and i s de i a i es. 59 Figu e III.2.1: MS spec a o BADGE (A), BADGE.HCl (B) and BADGE.2HCl (C). 63 Figu e III.2.2: MS spec a o BADGE.H2O (D), BADGE.H2O.HCl (E) and BADGE.2H2O (F). 64 Figu e III.3: MS ch oma og ams in APCI (+) o BADGE.HCl (A), BADGE.H2O (B) and BADGE ( R: 17.3) and BADGE.2HCl ( R: 16.0) (C) a a concen a ion o 0.8 mg/l. 68 Figu e III.4: MS ch oma og ams in APCI (-) o BADGE.H2O.HCl (A) and BADGE.2H2O (B) a a concen a ion o 0.8 mg/l. 68 IV. De e mina ion o Bisphenol F Diglycidyl E he and i s Rela ed Compounds by High Pe o mance Liquid Ch oma og aphy-Mass Spec ome y. Figu e IV.1: Compounds o low molecula weigh in NOGE se ies. 76 Figu e IV.2: Chemical s uc u es o A: p,p bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE, Mw: 312,36); B: p,p bisphenol F (2,3-dihyd oxyp opyl) glycidyl e he (BFDGE.H2O); C: p,p bisphenol F (3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) glycidyl e he (BFDGE.HCl); D: p,p bisphenol F bis(2,3-dihyd oxyp opyl) e he (BFDGE.2H2O); 77 XIX E: p,p bisphenol F bis(3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) e he (BFDGE.2HCl); F: p,p bisphenol F (3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) (2,3-dihyd oxyp opyl) e he (BFDGE.H2O.HCl, Mw:366,84). Figu e IV.3 A: APCI mass spec a o BFDGE a a concen a ion o 10 mg/L. 82 Figu e IV.3 B: APCI mass spec a o BFDGE.2H2O a a concen a ion o 10 mg/L. 83 Figu e IV.3 C: APCI mass spec a o BFDGE.2HCl a a concen a ion o 10 mg/L. 83 Figu e IV.4: MS ch oma og ams using APCI (+) o a mix u e o BFDGE.HCl and BFDGE (A and B) using m/z 390 and 354 espec i ely; and a mix u e o BFDGE.H2O and BFDGE (C and D) using m/z 372 and 354 espec i ely, a a concen a ion o 20 mg/L (exp essed as he sum o all de i a i es). 84 Figu e IV.5: MS ch oma og ams using APCI (-) o a mix u e o BFDGE.2HCl (A), BFDGE.H2O.HCl (B) and BFDGE.2H2O (C) using m/z 383+385, 365 and 347 espec i ely, a a concen a ion o 20 mg/L (exp essed as he sum o all de i a i es). 85 Figu e IV.6: MS ch oma og ams in APCI (+) o a mix u e o NOGE (comme cial s anda d); NOGE 4- ings o m/z 678 (A), NOGE 3- ings, using m/z 516 (B), and BFDGE, using m/z 354 (C) a a concen a ion o 50 mg/L (exp essed as he sum o all compounds). 86 V. Mig a ion su ey o bisphenol A diglycidyl e he and bisphenol F diglycidyl e he om canned ish and sea ood, in Spanish ma ke du ing las yea s Figu e V.1: Ch oma og am o mussels in pickled sauce wi h a concen a ion o 1.43 mg BFDGE /kg o oods u . 99 Figu e V.2: Ch oma og am o una in oil wi h a concen a ion o 1.2 mg BADGE /kg o oods u 100 Figu e V.3: Ch oma og am o mussels in pickled sauce wi h a concen a ion o all BADGE de i a i es o 0.16 mg/kg oods u . 101 Figu e V.4: Ch oma og am o una in oil wi h a concen a ion o BADGE below 0.1 mg/kg o oods u , bu wi h oligome s o high molecula weigh . 102 Figu e V.5: Ch oma og am o una in oil wi h a concen a ion o BFDGE o 0.4 mg/kg o oods u . 103 XX VIII. De e mina ion o Diphenylbu adiene by Liquid Ch oma og aphy-UV- Fluo escence in Foods u s. Figu e VIII.1: HPLC ch oma og am o a DPBD s anda d solu ion (1 µl/ml) A: Signal o UV de ec ion a a wa eleng h o 330 nm and B: Fluo escence de ec ion a exci a ion and emission wa eleng hs o 330 and 375 nm espec i ely. 187 Figu e VIII.2: HPLC ch oma og am o an o ange juice sample spiked wi h DPBD (1 µl/ml) A: Signal o UV de ec ion a a wa eleng h o 330 nm and B: Fluo escence de ec ion a exci a ion and emission wa eleng hs o 330 and 375 nm espec i ely. 189 XXI ABREVIATURAS ABS Ac iloni ilo/Bu adieno/Es i eno ADI Acep able Daily In ake (Inges a Dia ia Admisible) AESA Agencia Española de Segu idad Alimen a ia APCI A mosphe ical P esu e Chemical Ioniza ion (Ionización Química a P esión A mos é ica) ATBC T i-n-bu il ci a o BADGE Bis enol A diglicidil é e BFDGE Bis enol F diglicidil é e BHT Hid oxi olueno Bu ilado Bp Boiling Poin (Pun o de Ebullición) BSE Bo ine Spongi om Encephalopa hy (Ence alopa ía Espongi o me Bo ina) CAS Chemical Abs ac s Se ice Da Dal ons DEHA Bis 2-die hylehxyl adipa e DIPN Diisop opilna aleno DPBD Dipheynilbu adiene DMF Dime il o mamida E/VA E ileno/Ace a o de Vinilo EFSA Eu opean Food Sa e y Au ho i y (Agencia Eu opea de Segu idad Alimen a ia) Em Emisión ESI Elec osp ay Ioniza ion EUFIC Eu opean Food In e na ional Council (Consejo Eu opeo sob e la Alimen ación) EVOH E ileno/Alcohol Vinílico Ex Exci ación FAO Food And Ag icul u e O ganiza ion o he Uni ed Na ions (O ganización de las Naciones Unidas pa a la Ag icul u a y la Alimen ación) XXIII Resumen eu opea sob e ecub imien os basados en esinas epoxi y ma e iales en con ac o con alimen os. En el capí ulo II (De e mina ion o compounds om epoxy esins in ood simulan s by HPLC- luo escence) de es a Tesis Doc o al se desc ibe el desa ollo de un mé odo analí ico de c oma og a ía líquida de al a esolución en ase e e sa con de ec o de luo escencia que pe mi e la sepa ación y cuan i icación de bis enol A diglicidil é e (BADGE), bis enol F diglicidil é e (BFDGE) y sus de i ados clo ados e hid oxilados, así como de los oligóme os del BADGE y de los no olac glicidil é e es (NOGE). El mé odo desa ollado ha sido aplicado al análisis de una esina de ipo epoxi des inada a su uso como ecub imien o pa a en ases alimen a ios. A es a esina se le aplica on dos mé odos de cu ado di e en es, uno a empe a u a ambien e du an e 24 ho as y o o a 100ºC du an e una ho a. Los ensayos de mig ación se han ealizado en es simulan es alimen a ios, es ablecidos po la legislación eu opea y que son: ácido acé ico al 3 % (p/ ), (simulan e pa a alimen os ácidos acuosos) e anol al 10 % ( / ) (simulan e pa a alimen os con un con enido en e anol meno al 10 %) y acei e de oli a ec i icado (simulan e pa a los alimen os g asos). Los simulan es acuosos han sido analizados di ec amen e, mien as que pa a lle a a cabo el análisis de los ex ac os de acei e de oli a, se aplicó un mé odo de ex acción ápido y sencillo. También se ealiza on ensayos de ex acción con ace oni ilo, compa ando es os esul ados con los ob enidos pa a los simulan es. La cuan i icación de los dis in os compues os se ha lle ado a cabo u ilizando la calib ación ex e na, y los pa áme os de ca ac e ización del mé odo ue on sa is ac o ios. Debido a que no exis en pa ones come ciales de los oligóme os del BADGE y NOGE, se han cons uido dos ec as de calib ación usando BADGE y BFDGE, que han sido usadas pa a cuan i ica sus oligóme os. Con es as ec as de calib ación hechas con los pa ones come ciales pu os (de BADGE y BFDGE) se ob u ie on en odos los casos coe icien es de de e minación mayo es a 0,996 y lími es de de ección de adecuados. La concen ación del BFDGE ha sido calculada como la suma de sus es isóme os. Pa a la cuan i icación de los de i ados del 4 Es udio de la mig ación de dis in os componen es de los ma e iales plás icos a los alimen os BADGE y BFDGE el p ocedimien o usado es simila . De es a mane a odos los esul ados es án exp esados como BADGE y BFDGE asumiendo que los ac o es de espues a de es os de i ados son simila es a los de los pa ones pu os. La p epa ación de los de i ados clo ados e hid oxilados del BADGE y BFDGE se ha ealizado aplicando dos p ocesos di e en es pa a cada uno, pa a así pode iden i ica los de i ados ob enidos. La p epa ación de los de i ados hid oxilados se ha lle ado a cabo median e una disolución de los pa ones en agua y su pos e io man enimien o a una empe a u a ele ada. Los de i ados clo ados se ob ienen median e la adición de ácido clo híd ico a una disolución concen ada de los pa ones. En el caso del BFDGE la exis encia de es isóme os di icul a mucho es a iden i icación. Expe imen almen e se comp obó que 2 ho as son su icien es pa a la ob ención de los de i ados hid oxilados (BADGE.H2O, BADGE.2H2O, BFDGE.H2O, BFDGE.2H2O) y 20 minu os son su icien es pa a la ob ención de los de i ados clo ados (BADGE.H2O.HCl, BADGE.2HCl, BFDGE.H2O.HCl, BFDGE.2HCl). Pa a la con i mación posi i a de la iden idad de los de i ados y oligóme os se ha empleado la c oma og a ía liquida en ase e e sa con de ec o de espec ome ía de masas. Se comp obó que el ecub imien o analizado e a del ipo BADGE, no se encon ó ningún de i ado ipo NOGE o BFDGE y los únicos de i ados cuan i icados después de los ensayos de mig ación ue on de i ados hid oxilados y oligóme os del BADGE. A pesa de que es aban p esen es oligóme os con M>1000 Da, es os no ue on cuan i icados po que no e an obje o de es e es udio. El compo amien o de la mig ación ha sido el espe ado ya que en los simulan es acuosos, el BADGE se hid oliza después de habe mig ado a es os simulan es. No se han de ec ado oligóme os del BADGE en es os simulan es, debido a su baja solubilidad. En cambio, los ex ac os de acei e de oli a con enían oligóme os del BADGE y en ellos no se de ec a on can idades signi ica i as de los de i ados hid oxilados. Los ex ac os de ace oni ilo con enían los mismos compues os epoxi que el acei e de oli a, lo cual con i mó los da os ob enidos en el ensayo de mig ación con es e úl imo. Los da os ob enidos mues an que el ecub imien o epoxídico analizado cumple la legislación eu opea. Pe o cuando se usa el ensayo al e na i o con el ace oni ilo y el ecub imien o no ha sido some ido a un a amien o pos e io a al a 5 Resumen empe a u a, la can idad o al de sus ancias mig an es (incluidos los oligóme os del BADGE) es más al a que en el ensayo de mig ación pa a el acei e de oli a. Se ha obse ado ambién que pa a odas las mues as some idas a un p oceso pos e io a al a empe a u a, se ob ienen alo es de mig ación meno es. El obje i o del capí ulo III (De e mina ion o BADGE and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es by LC-MS) ha consis ido en desa olla un mé odo que pe mi a an o la cuan i icación como la iden i icación posi i a del BADGE y de odos sus de i ados usando un mé odo de c oma og a ía líquida de al a esolución en ase e e sa acoplada a un espec óme o de masas ía una sonda de ionización química a p esión a mos é ica (APCI). La legislación eu opea es ablece que la suma del BADGE, sus de i ados hid oxilados (BADGE.H2O y BADGE.2H2O) y clo ados (BADGE.HCl, BADGE.2HCl y BADGE.H2O.HCl) no debe excede el lími e de mig ación especí ica de 1 mg/kg de alimen o o simulan e. La cuan i icación de es as sus ancias se ha lle ado a cabo usando el modo SIR (“single ion eco ding”) después de habe seleccionado los agmen os más ca ac e ís icos en los espec os de masa ob enidos. Así pa a el BADGE y BADGE.H2O se op ó po el modo APCI (+) y los agmen os seleccionados se co esponden con los “clus e s” o mados po el p opio anali o y una molécula de ace oni ilo [M+CH3CNH]+. Pa a el BADGE.2H2O se seleccionó el modo APCI (-) y el agmen o co espondien e al ión cuasi molecula ha sido conside ado el más selec i o. Pa a el BADGE.HCl el agmen o más abundan e co esponde al [M+CH3CNH]+. El caso del BADGE.2HCl es más di ícil de explica po que el agmen o más abundan e y simul áneamen e más especí ico pod ía co esponde a un clus e simila al que o ma el BADGE. El BADGE.H2O.HCl se ha de e minado usando APCI (-) en ez de (+) debido a la imposibilidad de sepa a lo c oma og á icamen e del BADGE.H2O. De es a o ma se seleccionó un agmen o muy selec i o co espondien e a [M-H]-. El mé odo ha sido e aluado en ace oni ilo al 90% ( / ) y en agua. En ambos casos se ob ienen pa a odas las sus ancias coe icien es de de e minación 6 Es udio de la mig ación de dis in os componen es de los ma e iales plás icos a los alimen os mayo es a 0,99 y lími es de de ección sa is ac o ios, compa ándolos con los lími es de mig ación especí ica es ablecidos en la legislación. Una ez op imizado el mé odo, se han ealizado análisis alea o ios con la as acías, ex ayéndolas con ace oni ilo. No se ha encon ado ninguna de las sus ancias ci adas, lo cual demues a la ga an ía de inocuidad de las la as e aluadas. Es os ensayos de ex acción son ac ualmen e u ilizados po a ios au o es ya que el ace oni ilo es un buen disol en e de ex acción y se consigue así, ene una idea de la segu idad de es os ma e iales an es de se usados como en ases pa a alimen os. En el capí ulo IV (De e mina ion BFDGE and i s ela ed compounds by HPLC-MS), al igual que en el an e io , se desc ibe la pues a a pun o de un mé odo analí ico basado en la c oma og a ía líquida de al a esolución en ase e e sa acoplada a un espec óme o de masas y usando la ionización química a p esión a mos é ica (APCI) pa a la sepa ación, cuan i icación e iden i icación del bis enol F diglicidil é e y sus de i ados hid oxilados y clo ados. La legislación eu opea elacionada con el uso de de e minados compues os epoxídicos como ma e iales en con ac o con alimen os, es ablece que la suma de los ni eles de mig ación del BFDGE y sus de i ados no debe excede el alo de 1 mg/kg de alimen o o simulan e (o 1 mg/6dm2 en el ma e ial e aluado). Pa a el NOGE se es ablece (desde ma zo de 2003), que la can idad de es os componen es con más de dos anillos a omá icos, y con al menos un g upo epoxi, y sus de i ados con moléculas de clo o, y un peso molecula meno de 1000 Da, deben se no de ec ables a ni eles in e io es a 0,2 mg/6dm2. Así, una ez op imizadas odas las condiciones analí icas y pa a es ablece los pa áme os de cuan i icación, se han ealizado ensayos iniciales con disoluciones concen adas de es os compues os pa a ob ene la máxima in o mación posible de sus espec os de masas. En la p oducción de BFDGE, la condensación en e el enol y el o maldehído puede ocu i en las posiciones o o y pa a del anillo enólico. Es a es la azón po la que es e compues o es á o mado po es isóme os y puede es a acompañado po compues os de es o más anillos. Es o hace que su sepa ación c oma og á ica enga una mayo di icul ad si la compa amos con la del BADGE. 7 Resumen Además, ambién es impo an e des aca que sólo hay disponibles en el me cado es pa ones come ciales (BFDGE, BFDGE.2H2O y BFDGE.2HCl); así pa a los que no exis en es os pa ones es necesa io p epa a mezclas que con engan los demás de i ados (BFDGE.H2O, BFDGE.HCl y BFDGE.H2O.HCl) al y como se desc ibe en el capí ulo II, pe o la sepa ación c oma og a ica y la iden i icación indi idual es po an o, ealmen e di ícil. La ionización de es os compues os iene un pe il simila a la obse ada en el capí ulo III pa a el BADGE. Una ez seleccionados los iones más selec i os se han cons uido las ec as de calib ado (sólo pa a aquellos compues os disponibles en el me cado como pa ones pu os). Se han ob enido en odos los casos coe icien es de de e minación mayo es de 0,99 y lími es de de ección adecuados, eniendo en cuen a el lími e de mig ación especí ica. En cuan o al NOGE, únicamen e es posible la cuan i icación de los de i ados de has a cua o anillos a omá icos, pe o la única es icción de es e mé odo es el lími e de de ección, incon enien e que puede soluciona se usando un paso p e io de concen ación. La p incipal en aja de es e mé odo es que al u iliza el modo SIR (“selec ing ion eco ding”) se consigue di e encia mezclas complejas. Du an e los úl imos años, el sec o de la indus ia conse e a ha demos ado una e iden e p eocupación po la posible con aminación de sus p oduc os po los compues os an e io men e ci ados. Es o ha hecho posible el es udio desc i o en el capí ulo V (Mig a ion su ey o BADGE and BFDDGE om canned ish and sea ood, in Spanish ma ke du ing las yea s). Se han e aluado los ni eles de BADGE y BFDGE en 389 mues as de conse as de pescado suminis adas di ec amen e po indus ias nacionales du an e los úl imos seis años. Pa a dicha e aluación se ha u ilizado un sencillo mé odo de ex acción de las mues as, y el mé odo de análisis c oma og á ico desc i o en el capí ulo II. En odas las mues as se ha ealizado un análisis cuan i a i o del BADGE y BFDGE, y ambién se han iden i icado o os de i ados. Los esul ados encon ados mues an una e olución en la concen ación de es os compues os epoxídicos. Así, en el año 1999, se de ec a on ni eles de BADGE en casi un 50 % de las mues as, pe o siemp e en ni eles in e io es a los lími es es ablecidos en la legislación. En cuan o al BFDGE se encon a on alo es 8 Es udio de la mig ación de dis in os componen es de los ma e iales plás icos a los alimen os que excedían los lími es legales en un 4 % de las mues as. Desde es e año (1999) y has a inales del 2001, sólo un 1 % de las mues as supe ó el lími e de 1 mg/kg, y en los siguien es es años (2002-2004) ninguna mues a alcanzó es e alo . Compa ando es os da os con los ob enidos p e iamen e en nues o labo a o io, se puede conclui que es os compues os se encuen an en concen aciones in e io es a las que se ob enían a inales de los años 90. En la Unión Eu opea exis e legislación de obligado cumplimien o, que de ine los lími es máximos de mig ación global y mig ación especí ica, pa a en ases plás icos en con ac o con alimen os. Las in es igaciones cien í icas elacionadas con la mig ación po encial y con el compo amien o de los ma e iales de en asado han demos ado que la di usión y la mig ación pueden se enómenos p e isibles y en p incipio desc i os ma emá icamen e. Sin emba go, la escasa in o mación ela i a al compo amien o de muchas sus ancias po encialmen e mig an es y la c ecien e impo ancia que ienen los emas de segu idad alimen a ia, ha susci ado el in e és de es a po los ma e iales plás icos en con ac o con alimen os. En e las acciones que la Unión Eu opea ha decidido inicia es á el inanciamien o de un p oyec o de in es igación llamado “FOODMIGROSURE”, que ac ualmen e siendo desa ollado en a ios cen os eu opeos de in es igación, en e los incluido es á incluido nues o labo a o io. El p incipal obje i o de es e p oyec o es p opo ciona una he amien a no edosa y económica pa a la es imación de la exposición del consumido a sus ancias mig an es que p o engan de los ma e iales en con ac o con alimen os. Es a he amien a es á basada en un modelo de mig ación ísico-química que desc ibe ma emá icamen e los p ocesos de mig ación desde los plás icos a alimen os eales, bajo cualquie condición de con ac o p e isible. Den o de es e p oyec o eu opeo exis en es secciones p incipales. - La p ime a incluye la de inición y selección de los ma e iales plás icos obje o de es udio, sus ancias modelo y alimen os ep esen a i os de cada g upo. - La segunda hace e e encia al abajo de in es igación expe imen al que en ocado a ob ene los da os ísico-químicos de los mig an es modelo seleccionados. - La e ce a, p e ende hace una e aluación mul idisciplina e in e ac i a, así como lle a a cabo la ejecución del abajo. 9 Resumen Incluidos en la segunda sección del plan de abajo del p oyec o exis en dos módulos di e enciados. En el p ime módulo se dis inguen es pa es: el desa ollo de mé odos analí icos y el diseño expe imen al pa a las dos siguien es pa es; los es udios de ciné ica de mig ación desde ilmes plás icos a alimen os y los es udios de p ocesos de anspo e y pa ición de los mig an es modelo en los alimen os. Los capí ulos VI, VII y VIII ecogen el abajo in eg ado en el p ime módulo en la sección co espondien e al desa ollo de los mé odos analí icos y diseño expe imen al. Así, una ez que el p oyec o ha seleccionado los ma e iales plás icos de e e encia, se han elegido ambién mig an es modelo de di e en es p opiedades ísicas y químicas que han sido es udiadas en los capí ulos VI y VII. En el capí ulo VI (Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s om plas ics o oods u s), las sus ancias e aluadas ue on: I ganox 1076®, di enilbu adieno, Chimasso b 81®, U i ex OB®, cap olac ama, benzo enona, di enil ala o y bis (2-die ilhexil) adipa o (DEHA). En p ime luga se ha ealizado una ex ensa e isión bibliog á ica de las p opiedades ísicas y químicas de los compues os seleccionados. Debido a que muchos de es os da os es aban incomple os, algunas de es as p opiedades se e alua on en nues o labo a o io. Pa a cada sus ancia se ecopila on los di e en es da os y las p opiedades disponibles como el núme o CAS, la ó mula y el nomb e químico, peso molecula , pun o de usión y ebullición, solubilidad en agua y en a ios sol en es, es uc u a química, uso, coe icien e de epa o y p opiedades espec ales, odas ellas conside adas impo an es pa a el pos e io desa ollo de mé odos analí icos. También se ha lle ado a cabo una e isión bibliog á ica de odos los mé odos analí icos disponibles pa a cada compues o en políme os, simulan es y alimen os. La bibliog a ía elacionada con es e ema, es escasa y da más én asis al con enido o al del mig an e en políme os y a la mig ación en simulan es, que a la mig ación en alimen os. Además, los mé odos analí icos disponibles es án aún en ase de desa ollo, no habiendo po an o mé odos de ap obación gene al. Po 10 Es udio de la mig ación de dis in os componen es de los ma e iales plás icos a los alimen os úl imo, se ha e i icado que algunos de los p o ocolos encon ados en la bibliog a ía no es án desc i os con su icien e de alle de o ma que pe mi an su epe ición en o os labo a o ios. Es a es una si uación común cuando una me odología analí ica se encuen a en su ase inicial de desa ollo. En conclusión, ac ualmen e, no es án disponibles, p o ocolos analí icos pa a la de e minación de g an mayo ía de los mig an es po enciales. Pa a comple a es a e isión se ealiza on es udios p elimina es pa a conoce expe imen almen e las ca ac e ís icas de es as sus ancias. Es os consis ie on en el es udio de las p opiedades de ul a iole a y de luo escencia, y la posibilidad del uso de la c oma og a ía líquida con de ec o de espec oscopía de masas y de la c oma og a ía gaseosa. Los compues os e aluados en el capí ulo VII (S a e o he a o analy ical s a egies o e alua e di e en mig an s om ood packaging ma e ials) han sido: es i eno, bis enol A, 1-oc eno, limoneno, di-isop opilna aleno (DIPN), lau olac ama, iace in, i-n-bu ilace il ci a o (ATBC), hid oxi olueno bu ilado (BHT) y iclosan. Al igual que en el capí ulo an e io se ha e isado la bibliog a ía disponible sob e los mé odos analí icos en políme os, simulan es de alimen os y alimen os, y aunque escasa, se ha encon ado más in o mación basada en el análisis de simulan es y políme os que en alimen os. Se e alua on ambién en el labo a o io di e en es p opiedades espec oscópicas, ya que en la mayo ía de los casos, es as no es aban ecogidas en la bibliog a ía y ealmen e se conside an el pun o de pa ida en el desa ollo de los mé odos analí icos. En ambos capí ulos se sugie en y discu en unas guías gene ales pa a la de e minación de es os compues os en alimen os eniendo en cuen a las p opiedades de cada molécula. Va ios mé odos analí icos han sido desa ollados en el ma co del p oyec o “FOODMIGROSURE”. En el capí ulo VIII (De e mina ion o DPBD by LC-UV- Fluo escence in oods u s) se desc ibe uno de ellos, conc e amen e el desa ollado pa a el análisis del di enilbu adieno (DPBD). 11 Resumen Es e compues o es un abso bedo de la luz ul a iole a inco po ado en un amplio ango de ma e iales polimé icos. Su unción es, una ez que ha sido añadido al ma e ial, abso be los ayos ul a iole as de la luz y cede los como luz azul. Es a luz azul in e ac úa con el colo ama illo y le da al ma e ial la apa iencia de se más blanco. Pa a pode de e mina los ni eles de mig ación en alimen os, se ha desa ollado un mé odo analí ico pa a de e mina el DPBD en es alimen os con p opiedades ísico-químicas muy di e sas: zumo de na anja (alimen o acuoso, ácido y con un con enido medio de hid a os de ca bono), pechuga de pollo (alimen o sólido con un al o con enido en p o eínas) y queso gouda (alimen o sólido con un al o con enido en g asa). El mé odo analí ico es á basado en la c oma og a ía líquida de al a esolución en ase e e sa con de ec o es de ul a iole a y luo escencia, ob eniéndose una buena linea idad. La de e minación de es e compues o en los alimen os se ha lle ado a cabo median e la ex acción con hexano y pos e io cambio de sol en e compa ible con la écnica analí ica empleada. Pa a la iden i icación posi i a de es a sus ancia se ha empleado la c oma og a ía gaseosa con de ec o de espec ome ía de masas. Pa a e alua la p ecisión del mé odo se han analizado mues as de los es alimen os con eniendo es ni eles di e en es de concen ación de DPBD. Las ecupe aciones ob enidas han sido sa is ac o ias. Se han ealizado es udios con o os alimen os pa a e alua la posibilidad de aplica es e mismo mé odo. Los alimen os analizados son: compo a de manzana, leche UHT, ke chup, cola, ma ga ina, leche condensada, chocola e, pan os ado, ha ina, a oz y miel. No se han encon ado en ningún caso in e e encias al iempo de e ención del DPBD. 12 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I I: : I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N Capí ulo I a iable. La celulosa iene una es uc u a lineal o ib osa, en la que se es ablecen múl iples puen es de hid ógeno en e los g upos hid oxilo de dis in as cadenas yux apues as de glucosa, haciéndolas impene ables al agua, y o iginando ib as compac as que cons i uyen la pa ed de las células ege ales. Es as ib as se ag upan en e ellas en haces, y es os dan luga a la ib a de papel. Al papel se le llama po lo gene al ca ón cuando su densidad es mayo a los 224 g/m2 (ILSI 2004). Papel y ca ón pueden se usados en con ac o con alimen os de mane as muy di e sas, an o di ec amen e como indi ec amen e, y ambién solo o laminado con o os ma e iales como plás icos o papel de aluminio. En e los a ios ipos que se usan hoy en día en el en asado alimen a io enemos: ¾ En ase de papel: na u al o blanqueado, ecubie o o asociado con o os ma e iales, puede encon a se en o ma de bolsa. ¾ En ase de ca ón: Se puede encon a como cajas pa a p oduc os de pas ele ía o como ecipien e. Es el en ase más u ilizado en p oduc os di igidos di ec amen e al consumido , como comida congelada o como ecipien e pa a alimen os líquidos. ¾ Ca ón ondulado: Ma ón o blanco, esis en e a la humedad o a la comp esión, es os es uches cons i uyen el mayo olumen de papel y ca ón usado pa a aplicaciones en con ac o con alimen os. Ha habido un signi ican e aumen o del uso de es os ma e iales en los úl imos 50 años, debido a a ias azones: es sólido y adap able, es p ác ico, se ecicla ácilmen e y es á hecho de ma e ia eno able (ILSI 2004). I.2.2 Ma e iales plás icos Los ma e iales plás icos son compues os mac omolecula es o gánicos ob enidos po polime ización, policondensación, poliadición o algún o o p oceso simila , a pa i de moléculas de peso molecula in e io o po modi icación química de mac omoléculas na u ales. En su o mulación in e ienen los monóme os de pa ida, así como o os compues os habi ualmen e de bajo peso molecula que se adicionan in encionadamen e como coadyudan es del p oceso de ab icación, o 20 In oducción modi icado es de las ca ac e ís icas del p oduc o inal; “adi i os” des inados a consegui de e minados e ec os écnicos (plas i ican es, an ioxidan es, colo an es...). Según sus ca ac e ís icas e modinámicas, los plás icos pueden clasi ica se en (Sa ia Vidal 1999): 9 Te moplás icos:  Poliole inas: como el polie ileno (PE), el e ileno/ace a o de inilo (E/VA), el e ileno/alcohol inílico (E/AL o VEO), el polip opileno (PP), el polibu eno (PB) y el polime ilpen eno (PMP).  Plás icos de Polies i eno: como el polies i eno (PS), el es i eno/ac iloni ilo (SAN), es i eno/bu adieno (SB) o PS de al o impac o (HIPS) y el ac iloni ilo/bu adieno/es i eno (ABS).  Plás icos clo ados: como el policlo u o de inilo ígido (PVC) y el policlo u o de inilideno (PVDC).  Plás icos luo ados: como el poli luo e ileno o e lón (PTFE).  Plás icos ipos és e : como el poli e e ala o de e ileno (PET) y el polica bona o (PC).  Plás icos con g upos de ni ógeno (poliamidas): Como las poliamidas ali á icas semic is alinas (PA), las poliamidas semia omá icas cíclicas o el poliac iloni ilo (PAN). 9 Plás icos e moes ables:  Fenoplas os o plás icos enólicos (PF).  Aminoplas os.  Resinas Poliés e .  Resinas epoxi. 9 Elas óme os 9 Plas icos de al as p es aciones Los ecub imien os son ma e iales plás icos que p opo cionan una p o ección necesa ia y suplemen a ia al ma e ial base y al p oduc o. Es os ma e iales 21 Capí ulo I de ecub imien o se aplican sob e una supe icie o mando una ina película con inua, con el in de aumen a la ine cia en ase-alimen o. Es os ecub imien os ya se u ilizaban en la p ehis o ia, es ando compues os en aquel momen o po sus ancias como g asa de animales, ie as colo eadas y ca bón. Aunque es o no se co esponde con nues a noción de un ecub imien o mode no, es án basados en el mismo p incipio. En la mayo ía de los casos, el ecub imien o se aplica di ec amen e sob e una hojala a u o o ma e ial base an es de la o mación del en ase. El ecub imien o in e io de las la as es muy impo an e po que p e iene la eacción de los me ales con los ing edien es del alimen o enla ado. El ex e io de la la a es pin ado pa a p e eni la co osión y po azones deco a i as. I.2.3 O os El id io es un ma e ial du o, ágil y anspa en e. A pesa de compo a se como sólido, es un líquido sob een iado y amo o (sin es uc u a c is alina). Los ecipien es de id io se conocen desde la más emo a an igüedad, y alcanza on su g an di usión en la época del impe io omano, al di undi se las écnicas de soplado con caña, pe o el uso de es os ecipien es como en ases, ga an izando la conse ación de alimen os y bebidas du an e la go iempo, y acili ando su anspo e, es mucho más ecien e. Los en ases de p ime a ab icación (los que se ob ienen po con o mación del id io undido, cuya composición básica es silica o de sodio y calcio) son los más comúnmen e usados pa a alimen os y bebidas. El uso de ce ámicas esmal adas en en ases pa a conse a alimen os y bebidas es in ecuen e, aunque c ece día a día; es muy común en cambio, su uso en ajilla pa a cocina y se i , en ecipien es pa a consumo ápido y equipamien os del más di e so ipo. A di e encia de los en ases de id io, la composición química de los esmal es u ilizados es muy a iable y se emplean a iadas ecnologías pa a su ab icación (Ca alá y Ga a a, 2002). 22 In oducción I.3.- ASPECTOS LEGISLATIVOS DE LOS MATERIALES EN CONTACTO CON ALIMENTOS El con ac o exis en e en e el en ase y el alimen o in oduce la posibilidad de ans e i cons i uyen es p oceden es del en ase a és os. Con el in de asegu a que es e enómeno no p oduzca ningún daño en la salud del consumido , los ma e iales des inados a en a en con ac o con alimen os es án some idos a in es igación y a legislaciones especí icas. I.3.1 La legislación Eu opea La legislación de la Unión Eu opea (UE) iene como obje i o inal, la o al a monización en odos los es ados miemb os, pa iendo de las legislaciones nacionales o gene ando nue as disposiciones a pa i de los conocimien os cien í icos exis en es. Las no ma i as son de obligado cumplimien o en odos los es ados pe enecien es a la Unión Eu opea. La p ime a di ec i a ma co sob e ma e iales y a ículos en con ac o con alimen os (89/109/CEE, ac ualmen e de ogada po el Reglamen o nº 1935/2004) es ablecía el p incipio de “na u aleza ine e” de los ma e iales y la “pu eza” de las sus ancias alimen icias, diciendo que: Los ma e iales y a ículos en con ac o con alimen os no deben ans e i al alimen o componen e alguno en can idades ales que pudie a “pe judica la salud humana” y/o “lle a algún cambio inacep able en la composición del alimen o o bien un de e io o en las p opiedades o ganolép icas ca ac e ís icas”. Desde la adopción de es a di ec i a han su gido una se ie de nue as cues iones que debían se enidas en cuen a en la legislación, así, se han ealizado impo an es a ances ecnológicos en el ámbi o del en asado de alimen os, y se ha de ga an iza mejo la azabilidad y el e ique ado de los ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con alimen os. El p incipal obje i o del en asado de alimen os es p o ege lo con a los iesgos ísicos, biológicos y químicos. T adicionalmen e se han desa ollado ma e iales de en asado pa a e i a in e acciones con los alimen os y en pa icula , pa a educi al máximo la libe ación de sus componen es (“mig ación”) en los 23 Capí ulo I mismos. En consecuencia, la legislación comuni a ia en igo has a la inco po ación del nue o eglamen o ma co, pedía que se aumen ase al máximo la ine cia de los ma e iales en con ac o con alimen os y que se edujese al máximo la con aminación de los mismos. Los ma e iales de en asado no podían ocasiona modi icaciones inacep ables en la composición de los alimen os o en las ca ac e ís icas o ganolép icas de és os. Es e sigue siendo el p incipio básico del ac ual eglamen o, pe o en él se han inco po ado los “ma e iales y obje os ac i os en con ac o con alimen os”, que a di e encia de los ma e iales y obje os adicionales en con ac o con alimen os, no son ine es po su diseño, y po lo an o pueden modi ica la composición o las p opiedades o ganolép icas de los alimen os, pe o únicamen e si es as modi icaciones cumplen la legislación igen e ela i a a alimen os, como po ejemplo, la legislación de adi i os alimen a ios. En la an e io di ec i a ma co (89/109/CEE) ambién se es ablecía el p incipio de las lis as posi i as de sus ancias au o izadas y de los g upos de ma e iales y obje os que debe ían se egulados median e medidas especí icas. También se es ablecían los p ocedimien os y los c i e ios que debían segui se en la elabo ación y la adopción de medidas de aplicación, incluida la e aluación de sus ancias po el comi é cien í ico de la alimen ación humana. El nue o eglamen o es ablece p ocedimien os más de allados pa a la e aluación de la segu idad y la au o ización de las sus ancias que debe án u iliza se en la ab icación de los ma e iales en con ac o con alimen os. Al elabo a una lis a posi i a, el p ocedimien o p opues o en el eglamen o puede esumi se de la siguien e o ma: Los in e esados en come cializa una nue a sus ancia pa a un ma e ial des inado a en a en con ac o con alimen os deben solici a lo a la au o idad compe en e. Es a au o idad in o ma a la AESA y la es a es la enca gada de in o ma a odos los es ados miemb os así como a la Comisión. En un plazo de inido la AESA emi e un dic amen y lo hace público. En la siguien e abla se esume la legislación al espec o, incluyendo an o las Di ec i as Comuni a ias de ogadas como la legislación ac ualmen e en igo . 24 In oducción DIRECTIVAS CONTENIDO REGLAMENTO MARCO 1935/2004 Sob e los ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con alimen os y po el que se de ogan las Di ec i as 80/590/CEE y 89/109/CEE. DIRECTIVAS MARCO DEROGADAS 80/590/CEE De e minación del símbolo que puede acompaña a los ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 89/109/CEE Ap oximación de las legislaciones de los Es ados Miemb os sob e los ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. DIRECTIVAS ESPECÍFICAS 82/711/CEE Es ablece las no mas de base necesa ias pa a la e i icación de la mig ación de los cons i uyen es de los ma e iales y obje os de ma e ia plás ica des inados a en a en con ac o con los p oduc os alimen icios. 84/500/CEE Ap oximación de las legislaciones de los Es ados Miemb os sob e obje os de ce ámica des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 85/572/CEE De e mina la lis a de los simulan es que se deben u iliza pa a con ola la mig ación de los componen es de los ma e iales y obje os de plás ico des inados a en a en con ac o con los p oduc os alimen icios. 93/8/CEE Se modi ica la Di ec i a 82/711/CEE que es ablece las no mas de base necesa ias pa a la e i icación de la mig ación de los componen es de los ma e iales y obje os de ma e ia plás ica des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 93/10/CEE Rela i a a los ma e iales y obje os de película de celulosa egene ada des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 93/111/CE Se modi ica la Di ec i a 93/10/CEE ela i a a los ma e iales y obje os de película de celulosa egene ada des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 97/48/CE Se modi ica po segunda ez la Di ec i a 82/711/CEE del Consejo que es ablece las no mas de base necesa ias pa a la e i icación de la mig ación de los componen es de los ma e iales y obje os de ma e ia plás ica des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 2002/72/CE Rela i a a los ma e iales y obje os plás icos des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 2004/14/CE Se modi ica la Di ec i a 93/10/CEE ela i a a los ma e iales y obje os de película de celulosa egene ada des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 2004/1/CE Se modi ica la Di ec i a 2002/72/CE en lo ela i o a la suspensión de la u ilización de la azodica bonamida como agen e expanso . 2004/19/CE Se modi ica la Di ec i a 2002/72/CE ela i a a los ma e iales y obje os plás icos des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. Tabla I.1: Resumen de la legislación aplicable a ma e iales des inados a en a en con ac o con alimen os. 25 Capí ulo I DIRECTIVAS CONTENIDO DIRECTIVAS DEROGADAS POR LA 2002/72/CE 90/128/CEE Rela i a a los ma e iales y obje os plás icos des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 92/39/CEE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. 93/9/CEE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. 95/3/CEE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. 96/11/CEE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. 99/91/CE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. 2001/62/CE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. 2002/17/CE Se modi ica la Di ec i a 90/128/CEE. SUSTANCIAS ESPECÍFICAS 78/142/CEE Ap oximación de las legislaciones de los Es ados Miemb os sob e ma e iales y obje os que con engan clo u o de inilo monóme o, des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 80/766/CEE Rela i a a la de e minación de clo u o de inilo en el p oduc o acabado. 81/432/CEE Es ablece el mé odo comuni a io de análisis pa a el con ol o icial del clo u o de inilo cedido po los ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 93/11/CEE Rela i a a la cesión de N-ni osaminas y de sus ancias N-ni osables po las e inas y chupe es de elas óme os o caucho. 2002/16/CE Rela i a a la u ilización de de i ados epoxídicos en ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. 2004/13/CE Po la que se modi ica la Di ec i a 2002/16/CE ela i a a la u ilización de de e minados de i ados epoxídicos en ma e iales y obje os des inados a en a en con ac o con p oduc os alimen icios. Tabla I.1 (con inuación): Resumen de la legislación aplicable a ma e iales des inados a en a en con ac o con alimen os. I.3.2 La legislación es adounidense En los Es ados Unidos, los ma e iales pa a el en asado de alimen os se clasi ican gene almen e como adi i os alimen a ios (al igual que muchas de las sus ancias añadidas in encionadamen e a los alimen os), ya que pueden pasa a se componen es de los alimen os po medio de p ocesos no males de di usión. Los adi i os alimen a ios es án suje os a una e aluación con espec o a su inocuidad p e ia su come cialización. 26 In oducción Exis en p ocesos de pe ición y no i icación (que se aplican es ic amen e a los adi i os que es án en con ac o con los alimen os, incluyendo los en ases) es ipulados po las leyes pa a se i como medios pa a la e aluación de inocuidad po pa e de la FDA. La “Polí ica de Umb al de Regulación” pe mi e la exención de la necesidad de desa olla una eglamen ación pa a una sus ancia pa a se usada en con ac o con los alimen os, cuando la exposición dia ia es imada en la die a del consumido , con espec o al uso p e is o de es a sus ancia, es é po debajo del alo umb al. La “Polí ica de Cons i uyen es” se aplica a las impu ezas cance ígenas que es én en los adi i os alimen a ios no conside ados como cance ígenos en sí mismos. Aunque las leyes de los EE.UU. p ohíben que cualquie sus ancia conside ada cance ígena cuando se consuma po humanos o animales se ap uebe como adi i o alimen a io, las impu ezas cance ígenas se pueden alo a median e p ocedimien os de e aluación cuan i a i a del iesgo, siemp e que el adi i o no sea cance ígeno. I.3.3 La legislación en el MERCOSUR A endiendo al concep o de ap i ud sani a ia, pa a la ab icación de en ases y equipamien os alimen a ios, sólo se pe mi e el uso de sus ancias que es én enume adas en las llamadas lis as posi i as. Es as sus ancias son an o ma e iales básicos, como adi i os y o os componen es meno es. En es as lis as posi i as pueden especi ica se es icciones en el uso de cie os componen es de los ma e iales de en asado. Es as es icciones pueden adop a la o ma de lími es de composición, lími es de mig ación especí ica, p ohibiciones de usa de e minadas sus ancias pa a con ac o con un ipo de alimen os, o au o izaciones pa a usa de e minadas sus ancias sólo en cie os ma e iales de en asado. O o ac o a ene en cuen a es el lími e de mig ación o al o global, pa a lo cual se ealizan ensayos de cesión en los que se cuan i ica la can idad o al de componen es que se han ans e ido al simulan e del alimen o. Finalmen e se es ablece que los ma e iales de en asado no deben modi ica los ca ac e es senso iales de los p oduc os que con ienen. 27 Capí ulo I I.4.- LA MIGRACIÓN DE COMPONENTES DESDE EL ENVASE AL ALIMENTO De las di e en es in e acciones que ienen luga en el sis ema en ase/alimen o/en o no, la mig ación de dis in os componen es del ma e ial de en ase alcanza una pa icula impo ancia, po su incidencia en la calidad y segu idad de los alimen os en asados. Pa a ca ac e iza el enómeno de la mig ación se dis ingue po un lado la mig ación global, que se e ie e a la suma de odos los componen es del en ase que se ans ie en al alimen o y po o o la mig ación especí ica, que ep esen a la can idad de una sus ancia conc e a e iden i icable p esen e en el ma e ial que se ans ie e al alimen o bajo cie as condiciones. Po es e mo i o en la Unión Eu opea, exis e legislación de obligado cumplimien o, que de ine los lími es máximos de mig ación global y mig ación especí ica, pa a en ases plás icos en con ac o con alimen os. Las in es igaciones cien í icas elacionadas con la mig ación po encial y con el compo amien o de los ma e iales de en asado han demos ado que la di usión y la mig ación pueden se enómenos p e isibles y en p incipio desc i os ma emá icamen e. Así, si se es ablece un modelo de mig ación ísico-química que pueda desc ibi ma emá icamen e los p ocesos de mig ación desde los plás icos a los alimen os eales, se ía de ines imable u ilidad: Como una única he amien a pa a es ima la exposición del consumido , en cuan o a la mig ación den o del ma co con encional de condiciones del sis ema de egulación alimen a ia de la Unión Eu opea, aplicando el peo caso posible de exposición. Jun o con los da os es adís icos ob enidos del consumo alimen a io y de los es udios de en ases plás icos alimen a ios pa a es ima una eal, o peo caso posible, exposición del consumido en cualquie si uación. Se log a ía a a és de la lexibilidad del cálculo de la p opo ción de la mig ación en cualquie alimen o, desde cualquie plás ico, en con ac o en cualquie condición. 28 Obje i os I.5.- OBJETIVOS 1.- Desa olla un mé odo mul i esiduo basado en HPLC-FL, pa a la sepa ación y cuan i icación de BADGE, BFDGE, sus de i ados y oligóme os del BADGE y NOGE en simulan es de alimen os que pe mi a e alua la con o midad del ecub imien o con la legislación eu opea. 2.-Desa ollo de un mé odo analí ico basado en HPLC-MS, pa a iden i ica y cuan i ica los de i ados del BADGE p oceden es de ecub imien os epoxi empleados en en ases alimen a ios. 3.-Aplica y op imiza el mé odo c oma og á ico an e io pa a iden i ica y cuan i ica BFDGE, sus de i ados y NOGEs de peso molecula mayo . 4.-Cuan i ica la mig ación de BADGE y BFDGE en mues as eales e iden i ica o os de i ados, median e la aplicación de los mé odos c oma og á icos an e io men e op imizados. 5.- Realiza una ex ensa e isión bibliog á ica de las p opiedades ísicas y químicas de 18 compues os seleccionados po el p oyec o FOODMIGROSURE. Lle a a cabo además, una e isión bibliog á ica de odos los mé odos analí icos disponibles pa a cada compues o en políme os, simulan es y alimen os. 6.- Desa olla un mé odo analí ico basado en c oma og a ía líquida de al a esolución en ase e e sa con de ec o es de ul a iole a y luo escencia pa a de e minación de los ni eles de mig ación del di enilbu adieno en es alimen os con p opiedades ísico-químicas muy di e sas: zumo de na anja, pechuga de pollo y queso gouda. 29 Publicado en: Ch oma og aphia, 2003, 58 (5/6) 337-342. P esen ado como pós e en: Fi s In e na ional Symposium in Sepa a ion and cha ac e iza ion o Na u al and Syn he ic Mac omolecules, Áms e dam, Holanda, 5-7 de eb e o, 2003. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II I: : D DE ET TE ER RM MI IN NA AT TI IO ON N O OF F C CO OM MP PO OU UN ND DS S F FR RO OM M E EP PO OX XY Y R RE ES SI IN NS S I IN N F FO OO OD D S SI IM MU UL LA AN NT TS S B BY Y H HP PL LC C- - F FL LU UO OR RE ES SC CE EN NC CE E De e mina ion o compounds om epoxy esins in ood simulan s by HPLC- luo escence ABSTRACT A luo ime ic-de ec ion RP-HPLC me hod is de eloped o he sepa a ion and quan i ica ion o bisphenol A diglycidyl e he (BADGE), bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE), i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es, and NOGE and BADGE oligome s. This me hod was applied o es an epoxy esin used as a coa ing o ood con ac packaging ma e ials wi h wo di e en hea ea men s in he cu ing p ocess. Mig a ion o hese compounds was e alua ed in h ee ood simulan s: 3% (w/ ) ace ic acid, 10% ( / ) e hanol, ec i ied oli e oil and also in ace oni ile. A simple ex ac ion p ocedu e was also applied o ob ain oli e oil ex ac s. Quan i ica ion was pe o med by using ex e nal calib a ion, and co ela ion coe icien s we e g ea e han 0,996 and he limi o de ec ion (LOD) was 0.02 mg L-1 o all subs ances. HPLC-MS me hod was applied o con i m de i a i es and oligome s iden i y. KEYWORDS HPLC-Fluo escence, bisphenol A diglycidyl e he (BADGE) and de i a i es, bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE) and de i a i es, NOGE and BADGE oligome s, epoxy esins. 39 Capí ulo II II.1.- INTRODUCTION Epoxy esins a e used as in e nal su ace coa ing o ood cans (sea p oduc s, ege ables, bee , so d inks, powde milk), big s o age essels (wine, wa e ) and o a ious ypes o ood con aine s. The success o hese epoxy o mula ions as coa ings is due o i s desi able la ou - e aining cha ac e is ics, i s excellen chemical esis ance, and i s ou s anding mechanical p ope ies. Main esins used a e Bisphenol A epoxy esins and/o Epoxy No olacs esins; bo h a e a complex mix u e o chemical species and he chemical exp ession ha be e de ines hese oligome ic se ies a e shown in Figu e II.1. This igu e also show he eigh compounds o a molecula weigh less han 1000 Da. Bisphenol A epoxy esins a e mainly condensa ion p oduc s o Bisphenol A wi h epichlo hyd in and Epoxy No olacs a e made by condensing o maldehyde wi h phenol, ollowed by epoxida ion [1]. They a e s a ing subs ances used o manu ac u e su ace coa ings. I eac ion p ocess o cu e condi ions we e no applied in a p ope way, and/o inished coa ing is no co ec ly c osslinked, componen s o Bisphenol A epoxy esins o Epoxy No olacs esins and i s eac ion p oduc s could mig a e o ood [2]. Recen ly, many a icles ha e epo ed he sa e y o he use o BADGE (Bisphenol A diglycidyl e he ), BFDGE (Bisphenol F diglycidyl e he ), NOGE (No olac glycidyl e he s) and i s de i a i es in ma e ials in con ac wi h oods u s. This in e es ha e also been no ed in Eu opean Legisla ion; o his eason Di ec i e 2002/16/CE [3] es ablishes ha he sum o he mig a ion le els o BADGE, BADGE.H2O, BADGE.HCl, BADGE.2HCl, BADGE.H O.HCl and BADGE.2H 2 2O shall no exceed he limi o 1 mg Kg-1 -2 in oods u s o in ood simulan s (o 1 mg 6 dm in he ma e ial es ed [4]). The same speci ic mig a ion limi is es ablished o BFDGE and i s espec i e de i a i es (Figu e II.2). Conce ning o he use o NOGE (Figu e II.1), he quan i y o i s componen s shall no be de ec able in ood con ac ma e ials a he de ec ion limi o 0.2 mg 6 dm-², since Ma ch 2003 [3]. Fu he mo e o mig a ion o abo e men ioned compounds, i is also possible he mig a ion in o ood o unknown and po en ially oxic subs ances. This p oblem has been epo ed by some esea che s who show ch oma og ams wi h uniden i ied componen s a e mig a ion assays in ood simulan s [5, 6] o in ood p oduc s [7, 8]. Analy ical p oblems inc ease when hese compounds eac wi h ood componen s [9], due o i s iden i ica ion becomes mo e di icul s ill. 40 De e mina ion o compounds om epoxy esins in ood simulan s by HPLC- luo escence Figu e II.1: Compounds o low Molecula Weigh in BADGE / NOGE se ies. Addi ionally, quan i ica ion o NOGE is no easy because o he high numbe o componen s [10]. Apa om ha , mig a ion p ocesses depend on many ac o s and some au ho s ha e s udied kine ics mig a ion o BADGE esins in aqueous ood simulan s [11, 12] and oli e oil [13]. Usually, ood indus ies pu chase he packaging ma e ial al eady coa ed wi h hese esins and hey do no know exac ly he epoxy coa ings composi ion. So, i is con enien o de elop me hods o analyse mig an compounds and he e o e o gua an ee he compliance o epoxy esins based coa ings wi h ood packaging Eu opean Legisla ion. 41 Capí ulo II O CH3 OO CH3O BADGE OCH3 OO CH3 Cl OH BADGE.HCl OCH3 OO CH3 OH OH BADGE.H2O Cl OH CH3 OO CH3 Cl OH BADGE.2HCl Cl OH CH3 OO CH3 OH OH BADGE.H2O.HCl OH OH CH3 OO CH3 OH OH Figu e II.2: Chemical s uc u es o BADGE, p,p-BFDGE and i s de i a i es. O O O O H H OO O H H Cl OH OO O H H OH OH OO H H Cl Cl OH OH OO H H Cl OHOH OH OO H H OH OHOH OH BADGE.2H2O BFDGE BFDGE.HCl BFDGE.H2O BFDGE.2HCl BFDGE.H2O.HCl BFDGE.2H2O 42 De e mina ion o compounds om epoxy esins in ood simulan s by HPLC- luo escence II.2.- EXPERIMENTAL II.2.1 Reagen s Ace oni ile was HPLC g ade and he o he sol en s used (e hanol, ace ic acid and e ahyd o u an) we e analy ical g ade. All we e supplied by Me ck (Da ms ad , Ge many) and pu i ied wa e was ob ained om a Milli-Q wa e pu i ica ion sys em (Millipo e, Bed o d, MA, USA). Rec i ied oli e oil was used as a a y ood simulan . S anda ds o Bisphenol A diglycidyl e he (BADGE, CAS: 1675- 54-3, (≥97%)) and Bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE, CAS: 2095-03-6, ( o al o h ee isome s (≥97%): o ho-o ho, pa a-pa a, o ho-pa a) we e pu chased om Fluka Chemie AG (Buch s, Swi ze land). Poly (phenyl glycidyl e he )-co- o maldehyde (NOGE, A e age M ca. 605) and Poly (Bisphenol A -co- epichlo ohyd in) glycidyl end-capped (BADGE oligome s, A e age M ca. 1075) we e om Sigma-Ald ich (S einheim, Ge many). II.2.2 S anda ds Two di e en s ock solu ions o BADGE and BFDGE con aining 1000 mg L-1 we e p epa ed in e ahyd o u an. In he same way, NOGE and BADGE oligome s we e dissol ed in e ahyd o u an a a concen a ion o 1000 mg L-1 espec i ely. In e media e s anda ds solu ions we e p epa ed by dissol ing app op ia e amoun s o all compounds in 90% ( / ) ace oni ile o yield a concen a ion o 1 mg L-1. O and BADGE.2H Hyd olysis p oduc s, BADGE.H2 2O we e ob ained by dissolu ion o 1 mL o BADGE s ock solu ion in 50 mL o wa e and s o ing his lask o 2 hou s a 60ºC. Chlo ohyd ins o BADGE we e ob ained by adding o 5 mL o he s ock solu ion 0.25 mL o HCl 0.05N. A e 20 min, an in e media e solu ion was p epa ed by illing o he ma k wi h 250 mL o 90% ace oni ile. This in e media e solu ion con ains a mix u e o BADGE, BADGE.HCl and BADGE.2HCl. The hyd olysis p oduc o BADGE chlo ohyd in (BADGE.H2O.HCl) was ob ained by dissol ing 5 mL o chlo ohyd ins s ock solu ions in 250 mL o wa e and s o ing his solu ion o 2 hou s a 60ºC. Hence, all BADGE de i a i es we e p epa ed. 43 Capí ulo II The same p ocedu e was ollowed o ob ain all BFDGE de i a i es (BFDGE.H O, BFDGE.HCl, BFDGE.2H O, BADGE.H O.HCl and BFDGE.2HCl). 2 2 2 Hyd olysis and chlo ohyd ins compounds ob ained om BADGE and p,p- BFDGE a e shown in Figu e II.1. II.2.3 Appa a us and condi ions Ch oma og aphic measu emen s we e pe o med wi h a Hewle Packa d (Waldb onn, Ge many) sys em comp ised o a HP1100 liquid ch oma og aph i ed wi h a qua e na y pump, an au osample , a column o en, a luo escence a ay de ec o and HP Chems a ion da a analysis so wa e ( e sion A.06.01). A K omasil 100 C18 column (5µm i.d., 150mm x 40mm) om Teknok oma (Ba celona, Spain) was used o he sepa a ion. Ch oma og aphic condi ions we e de eloped in a p e ious a icle [5]. The mobile phase consis ed o ace oni ile/wa e 30:70 ( / ) in an isoc a ic mode o wo minu es, ollowed by a g adien o 80% ace oni ile o eigh een min, ano he g adien o 100% ace oni ile o h ee min and inally an isoc a ic elu ion du ing se en min. The low a e was 1 mL min-1. The injec ion olume was 50 µL. The column o en empe a u e was kep a oom empe a u e. Fluo escence de ec ion was pe o med wi h exci a ion and emission wa eleng hs o 225 nm and 305 nm, espec i ely. Iden i ica ion o selec ed compounds was ca ied ou using a mass spec ome e (VG Pla o m II, Fisons) in posi i e mode by a mosphe ic p essu e chemical ionisa ion (APCI). The ollowing ins umen pa ame e s we e applied: p obe empe a u e: 500 ºC, ionisa ion sou ce empe a u e: 130 ºC, cone ol age: 30 V, elec on mul iplie ol age: 700 V, shea h gas ni ogen a 200 L h-1 and d ying gas ni ogen a 250 L h-1. II.2.4 Tes samples The polyme coa ing es ed was an epoxy pain in ended o use as a coa ing in o oods u s. Glass discs, each wi h an a ea o 1.22 dm2, we e pain ed wi h he polyme coa ing on wo sides. All o hem we e cu ing o 24 h a oom empe a u e. Se e al o hem we e also subjec ed o a pos cu ing ea men o 1 h a 100ºC. 44 De e mina ion o compounds om epoxy esins in ood simulan s by HPLC- luo escence II.2.5 Analysis o samples All discs pain ed we e imme sed in 100 mL o each aqueous simulan (3% (w/ ) ace ic acid and 10% ( / ) e hanol) and in 100 g o a y simulan ( ec i ied oli e oil) in o he me ic glass cells. All o hem we e s e ilized o 30 min a 121ºC ollowing mig a ion assays condi ions desc ibed in Eu opean Legisla ion [14]. Al e na i e analysis we e ca ied ou by imme sing pain ed discs in 100 mL o 90% ace oni ile in he me ic glass cells main ained a 40ºC o 24 h. All mig a ion es s we e pe o med by duplica e. Aqueous simulan s (3% (w/ ) ace ic acid and 10% ( / ) e hanol) and 90% ace oni ile ex ac s we e il e ed h ough a PTFE 0.45 µm 13 mm sy inge il e , and injec ed in o he ch oma og aph. Oli e oil simulan was ex ac ed acco ding o he p ocedu e desc ibed in a p e ious wo k [15]: 5 mL o hep ane we e added o 5 g o oli e oil and mixed. Then, 10 mL o 90% ace oni ile we e added and he mix u e was shaken igo ously o 1 min and subsequen ly was cen i uged o 5 min a 1500 pm. Ace oni ile phase was aken up, il e ed h ough a PTFE 0.45 µm 13 mm sy inge il e and injec ed. II.3.- RESULTS AND DISCUSSION Ch oma og aphic p o ocol [5] has been p olonged in 5 min in o de o imp o e he sepa a ion o subs ances wi h a highe molecula weigh (e.g. NOGE and BADGE oligome s). This me hod has been success ully applied o he sepa a ion o Bisphenol A epoxy esins, NOGE and i s de i a i es as is shown in Figu e II.3. As indi idual s anda ds o NOGE and BADGE oligome s (n≥1) a e no comme cially a ailable, wo di e en calib a ion lines o BFDGE and BADGE we e used o quan i y NOGE and BADGE oligome s, espec i ely. These calib a ion lines we e cons uc ed using BADGE and BFDGE (pu e s anda ds) and had co ela ion coe icien s ( ) g ea e han 0.996. The concen a ion o BFDGE was calcula ed as he sum o i s h ee isome s. To quan i y all BADGE and BFDGE de i a i es a simila p ocedu e was ollowed. Hence, esul s we e exp essed in BADGE o all BADGE 45 Capí ulo II REFERENCES [1] Ullmann’s Encyclopedia o Indus ial Chemis y. Volume A22. A pe, H.-J., Ed, New Yo k, 1996. [2] Simal Gánda a, J.; Paz Abuín, S.; Ah né, L. C i . Re . Food Sci. Nu . 1998, 38 (8), 675-688. [3] EU, Commission o he Eu opean Communi ies 2002/16/EC; O . J. Eu . Commun. 2002, L51/27. [4] EU, Commission o he Eu opean Communi ies 2002/72/EC; O . J. Eu . Commun. 2002, L220/18. [5] Pasei o Losada, P.; Pé ez Lamela, C.; López Fabal, M.F.; Sanma ín Fenolle a, P.; Simal Lozano, J. J. Ag . Food Chem. 1997, 45, 3493-3500. [6] Pasei o Losada, P.; López Fabal, M.F.; Pé ez Lamela, C.; Sanma ín Fenolle a, P.; Paz Abuín, S. 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Uni e si y o San iago de Compos ela. 1999. 52 De e mina ion o compounds om epoxy esins in ood simulan s by HPLC- luo escence [16] Rau e , W.; Dickinge , G.; Zihla z, R.; Lin schinge , J. Z. Lebensm. Un e s. Fo sch. A 1999, 208, 208-211. [17] Pé ez Lamela, C.; Pasei o Losada, P.; Co izas Cas o, D.; Rod íguez He gue a, A.; Simal Lozano, J. In . J. Anal. Chem. 2002, 82 (3), 123-132. [18] Biede mann, M.; B onz, M.; Bü chle , B.; G ob, K.; Kelle , F.; Neukom, H. P.; Richa d, N.; Spinne C. Mi . Lebensm. Hyg. 1999, 90 (2), 177-194. [19] Biede mann, M.; B onz, M.; Bü chle , B.; G ob, K.; Kelle , F.; Neukom, H. P.; Richa d, N.; Spinne C. Mi . Lebensm. Hyg. 1999, 90 (2), 195-210. [20] Be ge , U.; Oehme, M. J AOAC In . 2000, 83 (6), 1367-1376. 53 Publicado en: Jou nal o Ch oma og aphy A, 2004, 1032 (1/2) 37-43. P esen ado como pós e en: 27 h In e na ional Symposium on High Pe o mance Liquid Phase Sepa a ion and Rela ed Techniques. Niza, F ancia, 15-19 de junio, 2003. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II II I: : D DE ET TE ER RM MI IN NA AT TI IO ON N O OF F B BI IS SP PH HE EN NO OL L A A D DI IG GL LY YC CI ID DY YL L E ET TH HE ER R A AN ND D I IT TS S H HY YD DR RO OL LY YS SI IS S A AN ND D C CH HL LO OR RO OH HY YD DR RO OX XY Y D DE ER RI IV VA AT TI IV VE ES S B BY Y L LI IQ QU UI ID D C CH HR RO OM MA AT TO OG GR RA AP PH HY Y- -M MA AS SS S S SP PE EC CT TR RO OM ME ET TR RY Y De e mina ion o BADGE and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es by LC-MS ABSTRACT Eu opean Legisla ion es ablishes ha he sum o he mig a ion le els o bisphenol A diglycidyl e he (BADGE), i s hyd olysis (BADGE.H2O and BADGE.2H2O) and chlo ohyd oxy (BADGE.HCl, BADGE.2HCl and BADGE.H2O.HCl) de i a i es shall no exceed he limi o 1 mg/Kg in oods u s o ood simulan s. A e e sed phase high pe o mance liquid ch oma og aphic me hod combined wi h mass spec ome y de ec ion (HPLC-MS) using he a mosphe ic p essu e chemical ionisa ion (APCI) is de eloped o he sepa a ion, quan i ica ion and iden i ica ion o he in e es ing compounds. Quan i ica ion o he analy es was ca ied ou in he single ion eco ding mode (SIR), once hei cha ac e is ic masses we e selec ed om hei ull spec a, by using an ex e nal calib a ion. The op imised me hod was sui able o he mig a ion e alua ion o hese compounds in di e en samples. KEYWORDS HPLC-MS; Bisphenol A diglycidyl e he (BADGE); Hyd olysis p oduc s; Chlo ohyd oxy de i a i es. 57 Capí ulo III III.1.- INTRODUCTION Epoxy esins a e used o make in e nal su ace coa ings o ood cans (sea p oduc s, ege ables, bee , so d inks, powde milk), big s o age essels (wine, wa e ) and a ious ypes o ood con aine s. Bisphenol A epoxy esins a e mainly condensa ion p oduc s o Bisphenol A wi h epichlo hyd in [1]. I he eac ion p ocess o cu e condi ions we e no applied in a p ope way, and inished coa ing is no co ec ly c osslinked, componen s o Bisphenol A epoxy esins and eac ion p oduc s o med could mig a e o ood [2], and in some cases eac wi h ood componen s gi ing new compounds. Recen s udies abou he oxici y o hese compounds [3-5], ha e demons a ed ha he geno oxic e ec o bisphenol A diglycidyl e he (BADGE) was s onge han he geno oxic e ec o BADGE.H2O and BADGE.2H2O. Rega ding BADGE.HCl, i s geno oxic e ec was compa able o hose ob ained o BADGE.H2O. These s udies suppo he hypo hesis ha he deg ee o oxici y o epoxy compounds depends mainly o he concen a ion o un eac ed epoxy g oups, al hough he case o BADGE.2HCl is di e en because i does no p esen any epoxy g oup, bu i s geno oxici y is p obably due o he p esence o Cl g oups. BADGE can also be used in o ganosols in o de o emo e hyd ochlo ic acid, which esul s in o ma ion o BADGE.HCl, BADGE.2HCl and BADGE.H2O.HCl [6]. BADGE may easily hyd olyse in con ac wi h aqueous and acidic ood o ming BADGE.H2O and BADGE.2H2O [7] (Figu e III.1). Eu opean Legisla ion es ablishes ha he sum o he mig a ion le els o BADGE, i s hyd olysis (BADGE.H2O and BADGE.2H2O) and chlo ohyd oxy (BADGE.HCl, BADGE.2HCl and BADGE.H2O.HCl) de i a i es shall no exceed he limi o 1 mg/Kg in oods u s o in ood simulan s o 1 mg/6dm2 in he ma e ial es ed (con en ional con e sion ac o ha exp esses he ela ionship be ween he su ace a ea o ma e ials and he quan i y o oods u s in con ac he ewi h [8,9]). The mos widely used echniques o he analysis o BADGE a e no mal and e e se phase high pe o mance liquid ch oma og aphy (NPLC and RP-HPLC) wi h luo escence de ec ion [10-18], as well as i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es [12,16,19-21]. Se e al esea ches ha e applied gas ch oma og aphy (GC) coupled wi h mass spec ome y de ec ion o de e mine hese compounds [22- 58 De e mina ion o BADGE and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es by LC-MS 25]. Mos o he imes his echnique was used jus o con i m posi i ely he p esence o hese compounds a e HPLC quan i ica ion wi h luo escence de ec ion [11,14,21,26]. O CH3 OO CH3 O OCH3 OO CH3 Cl OH OCH3 OO CH3 OH OH Cl OH CH3 OO CH3 Cl OH Cl OH CH3 OO CH3 OH OH OH OH CH3 OO CH3 OH OH BADGE BADGE.HCl BADGE.H 2 O BADGE.2HCl BADGE.H 2 O.HCl BADGE.2H 2 O Figu e III.1: Chemical s uc u es o BADGE and i s de i a i es. Some wo ks a e ocused on he iden i ica ion o hese subs ances and o he oligome s o highe molecula weigh using HPLC wi h de ec ion by a mosphe ic p essu e chemical ionisa ion (APCI) [27-30], he mosp ay mass 59 Capí ulo III spec ome y (TSP) [31] and elec osp ay ionisa ion (ESI) [29,32]. The cha ac e iza ion o BADGE hyd olysis p oduc s has also been desc ibed by o he au ho s [33]. Ve y ew wo ks a e ocused on he quan i ica ion using an HPLC-MS echnique [34], bu his las case is limi ed o BADGE and BADGE.2H2O. The objec i e o his wo k is o de elop a me hod ha allows bo h, he quan i ica ion and posi i e iden i ica ion o BADGE and i s de i a i es using an RP- HPLC-MS echnique (APCI), a e i s majo i y cha ac e is ic masses we e selec ed. This will acili a e he mig a ion s udies in complex ood o in ood simulan s, once his way possible in e e ences a e minimized. III.2.- EXPERIMENTAL III.2.1. Chemicals and eagen s Ace oni ile was HPLC g ade, supplied by Me ck (Da ms ad , Ge many) and ul apu e wa e was p epa ed using a Milli-Q il e sys em (Millipo e, Bed o d, MA, USA). S anda ds o Bisphenol A diglycidyl e he (BADGE, CAS No. [1675-54-3], (≥97%)), Bisphenol A (2,3-dihyd oxyp opyl) glycidyl e he (BADGE.H2O, CAS No. [76002-91-0], (≥97%)), Bisphenol A bis(2,3-dihyd oxyp opyl) e he (BADGE.2H2O, CAS No. [5581-32-8], (≥97%)), Bisphenol A (3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) glycidyl e he (BADGE.HCl, CAS No. [13836-48-1], (≈95%)), Bisphenol A bis(3-chlo o-2- hyd oxyp opyl) e he (BADGE.2HCl, CAS No. [4809-35-2], (≥99%)) and Bisphenol A (3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) (2,3-dihyd oxyp opyl) e he (BADGE.H2O.HCl, CAS No. [227947-06-0], (≥98%)) we e all pu chased om Fluka Chemie AG (Buch s, Swi ze land). Indi idual s ock solu ions o all compounds con aining 1000 mg/l, we e p epa ed in ace oni ile and we e kep a -20ºC. In e media e s anda ds solu ions in 90% ( / ) ace oni ile and wa e we e p epa ed by dissol ing app op ia e amoun s o all compounds o yield a concen a ion o 10 mg/l. Calib a ion solu ions in wa e and 90% ( / ) ace oni ile we e p epa ed om hese in e media e solu ions. In e media e solu ions in 90% ace oni ile we e kep a 4ºC and in e media e solu ions in wa e we e kep a -20ºC. 60 De e mina ion o BADGE and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es by LC-MS III.2.2. Equipmen The HPLC–MS sys em comp ised a Spec a-Physics Se ies P200 liquid ch oma og aph equipped wi h a 50μl injec ion loop Rheodyne, and a Fisons VG Pla o m mass de ec o (VG Bio ech, Al incham, UK), con olled by VG Mass Lynx so wa e (all om SP The mo Sepa a ion P oduc s, Al incham, UK). The column was a K omasil 100 C 18 (15 × 0.4 cm I.D., 5μm pa icle size) (Teknok oma, Ba celona, Spain). III.2.3. Ch oma og aphic condi ions Elu ion condi ions we e de eloped in a p e ious a icle [16]. The mobile phase was ace oni ile-wa e 30:70 ( / ) in an isoc a ic mode o wo min, ollowed by a g adien o 80% ace oni ile o eigh een min, ano he g adien o 100% ace oni ile o h ee min and inally an isoc a ic elu ion du ing se en min. The low a e was 1.0 ml/min. De ec o se ings: posi i e o nega i e a mosphe ic p essu e chemical ionisa ion (APCI) mode, p obe empe a u e 500ºC, ionisa ion sou ce empe a u e 130ºC, cone ol age +30 o -30 V, elec on mul iplie ol age 700 V, d ying gas ni ogen a 425 l/h, APCI shee gas ni ogen a 175 l/h, ull-scan mode de ec ion ange m/z 100–500 and selec ed ion eco ding (SIR) (Table III.1). APCI (+) APCI (-) Analy e Selec ed Ion (+ m/z) O he ions Selec ed Ion (- m/z) O he ions BADGE 382a191 BADGE.HCl 418a382 BADGE.2HCl 382*191 BADGE.H2O 400a209 BADGE.H2O.HCl 393b283,227 BADGE.2H2O 375b301,227 a F agmen co esponding o [M+CH3CNH]+ b F agmen co esponding o [M-H]- * Unknown agmen Table III.1: Selec ed ions o quan i ica ion. 61 Capí ulo III A B C Figu e III.3: MS ch oma og ams in APCI (+) o BADGE.HCl (A), BADGE.H2O (B) and BADGE ( R: 17.3) and BADGE.2HCl ( R: 16.0) (C) a a concen a ion o 0.8 mg/l. A B Figu e III.4: MS ch oma og ams in APCI (-) o BADGE.H2O.HCl (A) and BADGE.2H2O (B) a a concen a ion o 0.8 mg/l. 68 De e mina ion o BADGE and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es by LC-MS In conclusion, he de eloped me hod is app op ia e o he simul aneous analysis o all hese compounds in ace oni ile ex ac s and in wa e (o icial ood imulan ). This p ocedu e is also a powe ul echnique ha allows he posi i e con i ma ion o he p esence o hese compounds, no being necessa y ano he echnique s o i s quan i ica ion. 69 Capí ulo III REFERENCES [1] Ullmann’s Encyclopedia o Indus ial Chemis y. Volume A18. Ed. Hans-Jü gen A pe, New Yo k, 1996. [2] J. Simal-Gánda a, S. Paz-Abuín, L. Ah né, C i . Re . Food Sci. Nu . 38 (1998) 675. [3] S. Sua ez, R. A. Suei o, J. Ga ido, Mu a ion Resea ch, 470 (2000) 221. [4] R. A. Suei o, M. A aujo, S. Sua ez, J. Ga ido, Mu agenesis, 16 (2001) 303. [5] H. Nakazawa, A. Yamaguchi, K. Ionue, T. Yamazaki, K. Ka o, Y. Yoshimu a, T. Makino, Food Chem. Toxic. 40 (2002) 1827. [6] L. Hamma ling, H. Gus a sson, K. S ensson, A. Oska sson, Food Addi . Con am. 17 (2000) 937. [7] P. Pasei o-Losada, J. Simal-Lozano, S. Paz-Abuín, P. Lopez-Mahia, J. Simal Gánda a, J. Anal. Chem. 345 (1993) 527. [8] EU, Commision o he Eu opean Communi ies 2002/16/EC, O . J. Eu . Commun. L51 (2002) 27. [9] EU, Commision o he Eu opean Communi ies 2002/72/EC, O . J. Eu . Commun. L220 (2002) 18. [10] M. Sha man, C. A. Honeybone, S. M. Jickells, L. Cas le, Food Addi . Con am. 12 (1995) 779. [11] M. Biede mann, M. B onz, B. Bü chle , K. G ob, F. Kelle , H.P. Neukom, N. Richa d, C. Spinne , Mi . Lebensm. Hyg. 90 (1999) 177. [12] W. Rau e , G. Dickinge , R. Zihla z, J. Lin schinge , Z Lebensm. Un e s. Fo sch. A 208 (1999) 208. [13] W. Summe ield, A. Goodson, I. Coope , Food Addi . Con am. 15 (1998) 818. [14] C. Simoneau, A. Theobald, P. Hannae , P. Ronca i, A. Ronca i, T. Rudolph, E. Anklam, Food Addi . Con am. 16 (1999) 189. [15] P. Pasei o-Losada, P. López-Mahia, L. Vazquez-Odé iz, J. Simal-Lozano, J. Simal-Gánda a, J. Assoc. O . Anal. Chem. 74 (1991) 925. 70 De e mina ion o BADGE and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es by LC-MS [16] P. Pasei o-Losada, C. Pé ez-Lamela, M. F. López-Fabal, P. Sanma ín- Fenolle a, J. Simal-Lozano, J. Ag ic. Food Chem. 45 (1997) 3493. [17] J. 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Chem 52 (1980) 2242. 72 En iado pa a su publicación P esen ado como pós e en: 8 h In e na ional Symposium on Hyphena ed Techniques in Ch oma og aphy and Hyphena ed Ch oma og aphic Analyze s. B ujas, Bélgica, 4-6 de eb e o, 2004. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I IV V: : D DE ET TE ER RM MI IN NA AT TI IO ON N O OF F B BI IS SP PH HE EN NO OL L F F D DI IG GL LY YC CI ID DY YL L E ET TH HE ER R A AN ND D I IT TS S R RE EL LA AT TE ED D C CO OM MP PO OU UN ND DS S B BY Y H HI IG GH H P PE ER RF FO OR RM MA AN NC CE E L LI IQ QU UI ID D C CH HR RO OM MA AT TO OG GR RA AP PH HY Y- -M MA AS SS S S SP PE EC CT TR RO OM ME ET TR RY Y De e mina ion o BFDGE and i s ela ed compounds by HPLC-MS ABSTRACT A e e sed phase high pe o mance liquid ch oma og aphic me hod combined wi h mass spec ome y de ec ion (HPLC-MS) using a mosphe ic p essu e chemical ionisa ion (APCI) is de eloped o he sepa a ion, quan i ica ion and iden i ica ion o bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE) and o he de i a i es (epoxy and chlo ohyd oxy ela ed compounds). These compounds a e employed in o mula ions in ended o be used o co e inne su aces o ood cans. Quan i ica ion o he analy es was ca ied ou in he single ion eco ding mode (SIR), once hei cha ac e is ic masses we e selec ed om hei ull spec a, by using an ex e nal calib a ion. No olac glycidyl e he (NOGE) oligome s can be also iden i ied by his me hod. KEYWORDS Bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE); No olac glycidyl e he s (NOGE), ood can coa ings, HPLC-MS. 75 Capí ulo IV IV.1.- INTRODUCTION The in e nal su ace o ood cans and o he ypes o ood con aine s a e usually coa ed wi h an epoxy esin. One ype o hese esins a e epoxy no olac o mula ions which a e made by condensing o maldehyde wi h phenolic subs ances in an acid medium, ollowed by epoxida ion [1]. NOGEs (No olac glycidyl e he s) a e complex mix u es o wo o mo e a oma ic ings and he e o e wi h a a iable weigh composi ion. Bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE) is he lowes molecula weigh componen o NOGE se ies and mo eo e , he e a e o he oligome s o a ious means o molecula weigh s [2]. BFDGE and NOGE a e o en con used. The echnical p oduc used o ood can coa ings is NOGE (Figu e VI.1). n Name Mw 0 BFDGE 312.4 1 NOGE 3 ings 474.5 2 NOGE 4 ings 636.7 3 NOGE 5 ings 798.4 4 NOGE 6 ings 961.1 Figu e IV.1: Compounds o low molecula weigh in NOGE se ies. NOGE has been also used as addi i e o poly inyl based dispe sions (o ganosols) con aining mainly poly inyl chlo ide and inyl ace a e as monome s [3]. In hese ma e ials hey se e as sca enge s o he hyd ochlo ic acid o med du ing he hea ea men o he coa ing p ocedu e, which esul s in o ma ion o chlo ohyd oxy de i a i es. I i is added only as an addi i e and he e o e no c osslinked in he inished coa ing, i can mo e easily mig a e in o ood ma ix and may easily hyd olyse in con ac wi h aqueous and acidic ood. 76 De e mina ion o BFDGE and i s ela ed compounds by HPLC-MS Eu opean Legisla ion ela ed on he use o ce ain epoxy de i a i es as ood con ac ma e ials es ablishes ha he sum o he mig a ion le els o BFDGE, and i s hyd olysis and chlo ohyd oxy de i a i es (Figu e IV.2) shall no exceed he limi o 1 mg/kg in oods u s o in ood simulan s [4, 5] o 1 mg/6dm2 in he ma e ial es ed [6], (con en ional con e sion ac o ha exp esses he ela ionship be ween he su ace a ea o ma e ials and he quan i y o oods u s in con ac he ewi h). Conce ning o he use o NOGE o ood con ac ma e ials, i es ablishes since Ma ch 2003, he quan i y o NOGE componen s wi h mo e han wo a oma ic ings and a leas one epoxy g oup, as well as hei de i a i es con aining chlo ohyd in unc ions and ha ing a molecula mass less han 1000 Dal ons, should no be de ec able a le els highe han 0.2 mg/6dm2. 77 O O O O H H OO O H H OH OH O Cl O O H H OH OO H H OH HO HO OH O Cl O Cl H H HO OH O Cl O OH H H HO OH H2O H2O H2O HCl HCl A B D C E F Figu e IV.2: Chemical s uc u es o A: p,p bisphenol F diglycidyl e he (BFDGE, Mw: 312,36); B: p,p bisphenol F (2,3-dihyd oxyp opyl) glycidyl e he (BFDGE.H2O, Mw: 330,37); C: p,p bisphenol F (3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) glycidyl e he (BFDGE.HCl, Mw: 348,82); D: p,p bisphenol F bis(2,3-dihyd oxyp opyl) e he (BFDGE.2H2O, Mw: 348,39); E: p,p bisphenol F bis(3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) e he (BFDGE.2HCl, Mw: 385,28); F: p,p bisphenol F (3-chlo o-2-hyd oxyp opyl) (2,3-dihyd oxyp opyl) e he (BFDGE.H2O.HCl, Mw: 366,84). Capí ulo IV In case o he in e media e de i a i es, as BFDGE.H2O, he agmen co esponding o he clus e [M+CH + CNH] 3 was selec ed o iden i y i due o i s selec i i y compa ing wi h he o he agmen s obse ed (Table IV.1, Figu e IV.4 C). 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 100 % 15.26 15.42 0 100 % 14.73 15.21 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 100 % 15.05 15.42 0 100 % BFDGE039 2SIR 4Ch l 15.42 15.05 BFDGE.HCl BFDGE BFDGE BFDGE.H2O BFDGE A D C B Figu e IV.4: MS ch oma og ams using APCI (+) o a mix u e o BFDGE.HCl and BFDGE (A and B) using m/z 390 and 354 espec i ely; and a mix u e o BFDGE.H2O and BFDGE (C and D) using m/z 372 and 354 espec i ely, a a concen a ion o 20 mg/L (exp essed as he sum o all de i a i es). 84 De e mina ion o BFDGE and i s ela ed compounds by HPLC-MS Fo BFDGE.H2O.HCl, APCI (-) was chosen, and he mo e cha ac e is ic agmen obse ed was [M-H]- (Table IV.1, Figu e IV.5 B). Ioniza ion o BFDGE.HCl has showed an m/z ion ha was no iden i ied (Figu e IV.4 A). Simila di icul y was ound in he analysis o BADGE and i s ela ed compounds employing he same echnique [23]. Figu e IV.5: MS ch oma og ams using APCI (-) o a mix u e o BFDGE.2HCl (A), BFDGE.H As has been explained be o e, he 2- ing p oduc o NOGE is bisphenol F diglycidyl ysis, he ch oma og aphic sepa a ion o he indi idual compone 2O.HCl (B) and BFDGE.2H2O (C) using m/z 383+385, 365 and 347 espec i ely, a a concen a ion o 20 mg/L (exp essed as he sum o all de i a i es). e he (BFDGE). The e a e h ee isome s o BFDGE, se en o 3- ing NOGE and 27 o 4- ing NOGE [18]. Rega ding i s anal n s wi h mo e han ou ings has no achie ed due o he la ge numbe o isome s. Fo he compounds wi h h ee and ou ings, APCI in posi i e mode was chosen. F agmen s conside ing mo e cha ac e is ic we e analogous as o BFDGE, hus, clus e s o med wi h a molecule o ace oni ile (Table IV.1, Figu e IV.6). Compa able ammonium adduc s we e ound by o he au ho o BFDGE, NOGE 3- 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 100 % 4.34 3.16 5.54 0 100 % BFDGE055 SIR 3 Ch l 10.41 9.91 9.65 10.56 0 100 % 14.52 10.38 9.86 9.02 4.31 10.99 28.93 14.68 26.24 BFDGE.2HC BFDGE.H2O.HCl BFDGE.2H2O A C B 85 Capí ulo IV ings and NOGE-4 ings [8], bu o he au ho s [17] ha e obse ed ha hese s ong ions only a e o med by compounds o molecula weigh less han 400 Dal ons and wi h mo e han one epoxy g oup (such as BFDGE). Figu e IV.6 shows he ch oma og am ob ained o a solu ion o NOGE, in which he agmen s analyzed co espond o he clus e s o med wi h a molecule o ace oni ile. A B C BFDGE NOGE 3- in g s NOGE 4- in g s Figu e IV.6: MS ch oma og ams in APCI (+) o a mix u e o NOGE (comme cial s anda d IV.3.2. Ch oma og aphy l has been op imised p e iously in o de o imp o e hic condi ions we e employed o analyze BADGE, i s chlo o ); NOGE 4- ings using m/z 678 (A), NOGE 3- ings, using m/z 516 (B), and BFDGE, using m/z 354 (C) a a concen a ion o 50 mg/L (exp essed as he sum o all compounds). Ch oma og aphic p o oco he sepa a ion o hese subs ances. No all BFDGE de i a i es ha e esponse in he same ionisa ion mode, so wo injec ions we e always necessa y in nega i e and posi i e mode. Figu es IV.4 and IV.5 show ch oma og ams acqui ed in bo h posi i e and nega i e mode. The same ch oma og ap hyd oxy de i a i es and oligome s [23], al hough spec ome ic condi ions we e di e en , he employ o RP-HPLC coupled o a MS spec ome e ia i s APCI 86 De e mina ion o BFDGE and i s ela ed compounds by HPLC-MS in e ace seems o be a powe ul ool o quan i y simul aneously BADGE and BFDGE ela ed compounds. IV.3.3. Me hod alida ion As all indi idual s anda ds a e no a ailable, only o hose ha we e comme cially a ailable, he calib a ion lines we e cons uc ed. Thus, s anda ds in 90% ace oni ile (in case o BFDGE and BFDGE.2HCl) and wa e (in case o BFDGE.2H2O) o known concen a ions we e used. The ela ionship be ween known concen a ions and measu ed a eas (exp essed as he sum o he h ee isome s o each compound) was assessed by linea eg ession ( ou calib a ions poin s), and he linea i y ob ained indica es ha he me hod would be app op ia e o quan i ica ion o hese compounds (Table IV.2). De ec ion limi s (DLs), (de ined as signal h ee imes he heigh o he noise le el) we e calcula ed in acco dance wi h Ame ican Chemical Socie y [24] and a e shown in Table IV.2. The lowe DL co esponds o BFDGE and BFDGE.2H2O, and al hough lowe le els can be eached employing luo escence de ec ion, in his case, no posi i e con i ma ion would be necessa y. Ne e heless, compa ing he es ablished SMLs in he Eu opean Legisla ion [4], he de ec ion limi s ob ained o he h ee compounds p o ide well enough pe o mance. De ec ion Limi Linea ange Linea i y 2) (mg/L) (mg/L) ( BFDGE 0.2-2.0 0.9950 0.05 BFDGE.2HCl 0.2-2.0 0.9945 0.1 BFDGE.2H O 0.2-2.0 0.9929 0.05 2 Table IV.2: Me hod alida ion pa ame e s. Eu opean Legisla ion es ablishes he mig a ion limi o NOGE compounds a he de ec ion limi o 0,2 mg/6dm² [4]. Taking in o accoun ha he p oduc s used o ood cans ypically con ained 30-40% o 2- ing NOGE (BFDGE) and dec easing p opo ions o 3- ing o 8- ing componen s i is achie able o quan i y NOGE up o 87 Capí ulo IV ou ings in BFDGE. The only limi a ion o his p ocedu e would be he de ec ion limi o hese compounds ha could be sol ed using a p e ious concen a ion s ep. Ano he ad an age o his me hod is ha o employ cha ac e is ic m/z makes possible o di e en ia e complex mix u es. In conclusion, he op imised me hod is app op ia e o de e mine he chlo o and hyd oxy de i a i es o BFDGE in a ange be ween 0.2 mg/L– 2 mg/L. Calib a ion a e is app op ia e o gua an ee he compliance o hese coa ings wi h ood packaging Eu opean Legisla ion. NOGE (2, 3 and 4- ings) could be also quan i ied using his me hod. This p ocedu e is a po en ial echnique ha allows he posi i e con i ma ion o he p esence o hese compounds, no being necessa y ano he echnique o i s quan i ica ion. 88 De e mina ion o BFDGE and i s ela ed compounds by HPLC-MS REFERENCES [1] H.-J. A pe (Ed.), Ullmann’s Encyclopedia o Indus ial Chemis y, ol A18, New Yo k, 1996. [2] Wagne C, G ob K, Biede mann M. Mi . Lebensm. Hyg. 2000; 91: 146-157. [3] Be ge U, Oehme M, Gi a din L. F esenius J Anal. Chem. 2001; 369: 115-123. [4] EU, Commission o he Eu opean Communi ies 2002/16/EC. O . J. Eu . Commun. 2002; L51: 27. [5] EU, Commission o he Eu opean Communi ies 2004/13/EC. O . J. Eu . Commun. 2004; L27; 46. 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The canned ish and sea ood p oduc s samples (n=389) we e supplied by di e en Spanish indus ies. In 1999-2001 only 1 % o samples exceeded he speci ic mig a ion limi and in he las h ee yea s (2002-2004) he amoun o all mig an s analyzed was negligible. The esul s ob ained a e compa ed wi h p e ious su eys in Spain and in Eu ope. I could be concluded ha he concen a ion o hese compounds is qui e lowe ha hose ound a he end o 90’s. KEYWORDS BADGE, BFDGE, mig a ion, can coa ings, canned ish 93 Capí ulo IV In 2000, only one sample exceeded he SML o BADGE, i s ch oma og am is showed in Figu e V.2. O he wise, he p esence o BFDGE was negligible in he samples es ed. mi n 02.5 57.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 LU 0 200 400 600 800 1000 15.629 17.591 17.757 BADGE Figu e V.2: Ch oma og am o una in oil wi h a concen a ion o 1.2 mg BADGE /kg o oods u . Conce ning 2001, and conside ing only he p esence o BADGE, none o samples showed a concen a ion highe han 0.1 mg/kg and only in a low pe cen age o samples his compound was de ec able, and mos co esponding o samples o mussels in pickled sauce. Howe e , in one sample, he chlo ode i a i es o BADGE we e ound (Figu e V.3). In his case he alue is a ound 0.1 mg/kg, exp essed as mg BADGE /kg o oods u . BFDGE was ound only in one sample. In 2002, 2003 and 2004 he numbe o canned p oduc s es ed dec eased (n=29) due o p oduce s s a ed o supply emp y cans o es i s sa e y be o e o use hem as ood cans. Ne e heless, in all ood p oduc s es ed along he las h ee yea s no sample has exceeded he quan i ica ion limi o 0.1mg/kg and only wo 100 Mig a ion su ey BADGE and BFDGE om canned ish and sea ood, in Spanish ma ke samples had esul s o BADGE below 0.1 mg/kg. BFDGE was no de ec able in any sample. mi n 0 5 10 15 20 25 LU 0 100 200 300 400 500 9.127 9.522 14.324 14.848 15.385 15.967 16.394 17.864 18.067 BADGE BADGE.HCl BADGE.2HCl Figu e V.3: Ch oma og am o mussels in pickled sauce wi h a concen a ion o all BADGE de i a i es o 0.16 mg/kg oods u . This e olu ion is in acco dance wi h p e ious s udies ca ied ou in ou labo a o y. Da a ob ained be ween 1996 and 1998 (Co izas Cas o, 1999) showed a wo se scena io ega ding BADGE and BFDGE, bu wi h a dec ease o he concen a ions ound a he end o his pe iod. In his s udy, he mean alues ound a he end o 1996 we e 2.14 mg/kg o BADGE and 2.17 mg/kg o BFDGE. A he beginning o 1997 he mean concen a ions ound we e 0.17 mg/kg and 3.25 mg/kg o BADGE and BFDGE espec i ely. Hamma ling e al. (2000), in a p e ious su ey done in Swedish in 1997, ound also highe alues o BADGE (up o 5.1 mg/kg). Simoneau e al. (1999) epo ed, in a su ey in he Eu opean Union ha abou 3% o canned ish in oil exhibi ed a concen a ion highe han he SML es ablished by he Eu opean Legisla ion, which is a highe alue han he one ound in his s udy. Theobald e al. (2000) asce ained simila esul s in a BFDGE su ey. 101 Capí ulo IV mi n 0 5 10 15 20 25 LU 20 40 60 80 100 120 140 16.306 18.267 18.436 20.250 21.934 24.147 25.084 25.812 26.779 28.951 BADGE BADGE n=1 BADGE n=2 BADGE n=3 Figu e V.4: Ch oma og am o una in oil wi h a concen a ion o BADGE below 0.1 mg/kg o oods u , bu wi h oligome s o high molecula weigh . The cases ound hese las yea s, o which he mig a ion is highe , gene ally come om one sample con aining a high concen a ion a he han a la ge numbe samples wi h lowe concen a ions. Mo eo e , BADGE oligome s (which a e no included in Eu opean Legisla ion) we e ound in some samples (Figu e V.4). These oligome s we e al eady ound in canned oily ood by Biede mann e al. (1997). So, i is necessa y o emphasize ha al hough mig a ion le els o BADGE and BFDGE (and also i s ela ed compounds o low molecula weigh ) a e nowadays lowe han las yea s, new p oblems a e a ising. Figu es V.2, V.3 and V.5 showed ha new subs ances ( e en ion imes be ween 17.5 and 18.0 minu es) a e mig a ing o oods. 102 Mig a ion su ey BADGE and BFDGE om canned ish and sea ood, in Spanish ma ke Al hough hese unknown compounds a e much less han hose obse ed in o he p e ious wo ks (G ob e al., 1999), i should be ma ked ha esea ch on his ield should con inue o y o iden i y new mig an s om ood packaging ma e ials and hence, o ensu e consume s’ sa e y. mi n 0 5 10 15 20 25 LU 0 50 100 150 200 250 13.739 14.257 14.687 17.896 18.088 BFDGE Figu e V.5: Ch oma og am o una in oil wi h a concen a ion o BFDGE o 0.4 mg/kg o oods u . This s udy shows he e olu ion o he con amina ion o canned ood ega ding hese epoxy compounds in he las yea s, and i could be concluded ha he concen a ion o hese compounds is qui e lowe han hose ound a he end o 90’s. This means ha bo h, can and ish ood p oduce s a e mo e conce ned o gua an ee he consume s’ sa e y, ega ding he mig a ion compounds om epoxy esins in canned oods. 103 Capí ulo IV REFERENCES Be ge , U. and Oehme, M. (2000) Iden i ica ion o De i a i es o Bisphenol A Diglycidyl E he and No olac Glycidyl E he in Can Coa ings by Liquid Ch oma og aphy/Ion T ap Mass Spec ome y. J. AOAC In . 83 (6), 1367-1376. Biede mann, M., B onz, M., G ob, K., G elle , H., Schmid, J. P. (1997) BADGE and i s accompanying compounds in canned oily oods: Fu he esul s. Mi . Gebie e Lebensm. Hyg. 88, 277-292. Co izas-Cas o, D. (1999) Cha ac e iza ion and quan i ica ion o epoxy compounds o con ol especi ic mig a ion. Doc o al Thesis. Analy ical Chemis y, Nu i ion and B oma ology Depa men . 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C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V VI I: : C CO OM MP PI IL LA AT TI IO ON N O OF F A AN NA AL LY YT TI IC CA AL L M ME ET TH HO OD DS S T TO O D DE ET TE ER RM MI IN NE E M MI IG GR RA AT TI IO ON N O OF F A AD DD DI IT TI IV VE ES S A AN ND D M MO ON NO OM ME ER RS S F FR RO OM M P PL LA AS ST TI IC CS S T TO O F FO OO OD DS ST TU UF FF FS S Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s… ABSTRACT Re e ence plas ics as well as model mig an s o di e en chemical and physical p ope ies ha e been selec ed o ca y ou a s udy o he mig a ion kine ics om plas ics o oods u s. On he basis o hei ep esen a i eness and hei ele ance o ood con ac ma e ials, I ganox 1076®, diphenylbu adiene, Chimasso b 81®, U i ex OB®, cap olac am, benzophenone, diphenyl ph hala e and bis (2- die hylhexyl) adipa e (DEHA) ha e been selec ed o his s udy. A ailable li e a u e on analy ical me hods in polyme s, ood simulan s and oods u s was e iewed in de ail, al hough mos o he imes i was sca ce, and mo e in o ma ion was ound on analysis in simulan s and polyme s han on ood analysis. P elimina y expe imen s we e pe o med in o de o e alua e in e es ing spec oscopic p ope ies, as hese p ope ies a e gene ally una ailable in he o dina y bibliog aphy and hey a e a key poin o begin he de elopmen o analy ical me hods. Gene al guidelines o he de e mina ion o he selec ed mig an s in oods we e sugges ed and discussed aking in accoun all he p ope ies o each molecule. KEYWORDS Mig a ion, oods u s, plas ics, mig an s, ood packaging. 109 Capí ulo VI In o de o ca y ou hei unc ion, an ioxidan s a e consumed du ing he polyme deg ada ion p ocess, and he amoun o un eac ed an ioxidan in he polyme ic ma e ial is an indica o o he s a e o he oxida ion p ocess. Since he concen a ion o an ioxidan s added is low (usually be ween 100-1000 ppm depending on he applica ion and p ocessing condi ions) (Wang 2000) and ends o dec ease wi h ime in he polyme ic ma e ials, he e is a need o analy ical me hods which ha e e y low de ec ion limi s (Molande e al. 1999). Se e al ch oma og aphic me hods ha e been desc ibed o he iden i ica ion and quan i ica ion o phenolic an ioxidan s. Tables VI.11 o VI.13 (pages 131-132) esume some o he me hods a ailable in he bibliog aphy. The mos used me hods a e gas ch oma og aphy and liquid ch oma og aphy. Howe e , supe c i ical luid ch oma og aphy (SFC) has also been used in o de o a oid limi a ions o con en ional echniques. Less common me hods like elec ochemical (Agüí e al. 1995), py olysis-gas ch oma og aphy (Py- GC) (Wang 2000) o coupled echniques like HPLC-NMR-MS (high-pe o mance- liquid ch oma og aphy- nuclea magne ic esonance- mass spec ome y) and HPLC- FT-IR (high pe o mance liquid ch oma og aphy- Fou ie ans o m-IR spec oscopy) (Ludlow e al. 1999) ha e also been epo ed. VI.3.1.2. DPBD Diphenylbu adiene (DPBD) is a luo escen whi ening agen added o a ma e ial o abso b ul a iole ays in sunligh and elease hem as blue ays. These blue ays will hen in e ac wi h he yellowish colo and gi e he plas ic he appea ance o being whi e . DPBD is a ligh yellow c ys alline powde , soluble in many o ganic sol en s, wi h high lipophilici y (Calcula ed Log Kow (oc anol-wa e ) = 5.29) (EPI). DPBD has been inco po a ed in o polye hylene ilm o ac as a e e ence ma e ial BCR.593 in he es me hod o he de e mina ion o a y con ac (EN 14481). In o de o de e mine he DPBD mig a ion le el om plas ics o oods u s, an HPLC-UV me hod was de eloped in h ee selec ed oods ha ep esen h ee ypes o oods u s wi h di e en physical and chemical p ope ies: aqueous and acidic ood (o ange juice), non a y ood (chicken b eas ), and a y ood (gouda cheese) (Sendón Ga cía e al. 2004). 116 Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s… Table VI.2: Chemical and physical p ope ies o DPBD. DPBD CAS Nº 538-81-8 Fo mula C16H14 Chemical Name Diphenylbu adiene MW 206 mp (ºC) 153 Bp/Fp (ºC) 350/- Wa e solubili y (mg l-1) 0.5-1.2 Solubili y e y soluble in: benzene, e hanol and e he Applica ion Fluo escen addi i e S uc u e Spec al Da a UV: 319 nm (cyhex) Fl: Ex:320, Em:375 nm (hex) VI.3.1.3. Chimasso b 81 and U i ex OB O he wo subs ances selec ed by he FOODMIGROSURE p ojec a e Chimasso b 81, an ul a iole abso be , and U i ex OB, an op ical b igh ening agen . These chemical addi i es a e used o enhance he li e ime o plas ics, since hey minimize pho o-chemical p ocesses and, he e o e, polyme deg ada ion (Va go and Olson 1985). Like o he addi i es/monome s a ge ed in his p ojec , hey we e chosen because hey p esen di e en ac i e g oups, ha e di e en unc ions wi hin he polyme and a e used in ood con ac ma e ials (polys y enes and polyole ins) (Quin o-Fe nandez e al. 2003). Rega ding he analy ical me hods o de e mina ion o hese addi i es, hin- laye ch oma og aphy (Law ence and Ducha me 1980) has been subs i u ed by high pe o mance liquid ch oma og aphy (HPLC). Table VI.14 p esen s se e al HPLC-UV me hods used o de e mine hese addi i es. Owing o he ad an ages o HPLC echnique, like he highe esolu ion, capaci y o handle la ge samples, eliable quan i ica ion de ec ion, no need o clean-up s ep o in e nal s anda ds o co ec o poo eco e y o ins umen al e o s, his is he mos used me hod (Quin o-Fe nandez e al. 2003). 117 Capí ulo VI Table VI.3: Chemical and physical p ope ies o Chimasso b 81. Chimasso b 81 Re . Nº 61600 CAS Nº 1843-05-6 Fo mula C21H26O3 Chemical Name 2-Hyd oxy-4-n-oc yoxybenzophenone MW 326 mp (ºC) 48-49 Bp/Fp (ºC) >400/>200 Wa e solubili y (mg l-1) < 0.03 Solubili y (g x 100g solu ion-1) Ace one: 43; benzene:72; chlo o o m:61; e hanol: 3.5; e hyl ace a e: 44; n-hexane: 12; me hanol: 1.7; MEK: 65; me hylene chlo ide: 67; oluene: >50; wa e : < 0.01 Applica ion UV abso be / s abilise S uc u e Spec al Da a UV: 290, 243 nm (e hanol) MS peaks: 213 (100), 214 (39) 326(19) 325 (14) 43 (11) 77 (10) 41 (10) 215 (7). SML (mg kg-1) 6 TDI (mg kg-1) 0.1 Table VI.4: Chemical and physical p ope ies o U i ex OB. U i ex OB Re . Nº 38560 CAS Nº 7128-64-5 Fo mula C26H26N2O2S Chemical Name 2,5- Bis(5- e -bu yl-2-benzoxazolyl hiophene MW 431 mp (ºC) 196-203 Bp/Fp (ºC) -/>350 Wa e solubili y (mg l-1) <0.03 Solubili y (g x 100g solu ion-1) Ace one: 0.2; dioxane: 2; DMF: 0.8; e hanol: 0.1; e hyl ace a e:1 ; n-hexane: 12; me hanol: 0.05; MEK: 1; oluene. 5; e ahyd o u an:5; xylene: 5; wa e : < 0.01 Applica ion UV s abilise ; op ical b igh ene ; luo escen whi e agen S uc u e Spec al Da a Fl: Ex: 375; Em: 435 nm SML (mg kg-1) 0.6 TDI (mg kg-1) 0.01 118 Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s… U i ex OB, has also been de e mined by spec o luo ime y hanks o i s high and cha ac e is ic exci a ion and emission wa eleng hs (Quin o-Fe nandez e al. 2003). The de e mina ion o hese compounds has also been pe o med by gas ch oma og aphy (Table VI.15). VI.3.1.4. Cap olac am Cap olac am is a monome o polyamide (nylon). Table VI.5 summa ises he p ope ies o his molecule. Du ing he eac ion o polyme iza ion o cap olac am, abou 90% o he monome is consumed, lea ing a esidue o monome and low molecula weigh oligome s. The esidue can ei he be emo ed by il a ion o acuum ea men o he polyme mel , al hough he e is always a small % ha emains in he polyme (Ba kby and Lawson 1993). Se e al ch oma og aphic me hods ha e been used o quan i y he amoun o ee cap olac am and i s oligome s in he polyme . Mos o hem include LC me hods wi h UV (Ba kby and Lawson 1993, K ajnik e al. 1982) o RI de ec ion (Boni aci e al. 1991). Table VI.5: Chemical and physical p ope ies o ε-cap olac am. ε-Cap olac am Re . Nº 14200 CAS Nº 105-60-2 Fo mula C6H11NO Chemical Name Aza-2-cyclohep anone MW 113 mp (ºC) 70-72 Bp/Fp (ºC) 267/125 Wa e solubili y (mg l-1) > 700000 Solubili y (g x 100g solu ion-1) soluble in wa e , e hanol, benzene, chlo o o m, cyclohexane, ace one and dime hylsul oxide Applica ion Monome S uc u e Spec al Da a MS peaks: 55(100) 113 (87) 30(81) 56(66) 84(60) 85(57) 42(51) 41(33). UV: 198 nm (H2O) SML (mg kg-1) 15 TDI (mg kg-1) 0.25 119 Capí ulo VI VI.3.1.5. Benzophenone Benzophenone is he mos commonly employed pho o-ini ia o o inks and a nishes cu ed wi h ul a iole ligh . Also i is a we ing agen as i inc eases he low o inks by ac ing as a eac i e sol en (Ande son and Cas le 2003, Papilloud and Baud az 2002, Choi e al. 2002). Al hough benzophenone is applied o he ou side o he packaging ma e ial (o en pape o ca onboa d), owing o i s low molecula weigh , i can pene a e h ough he packaging ma e ial s uc u e and mig a e o oods packaged wi h hese ma e ials (Ande son and Cas le 2003). F equen ly, he pape packaging ma e ials a e coa ed wi h polyme ic ma e ials (like polye hylene, polyp opylene o polye hylene e eph hala e) which ac as a ba ie agains mois u e and ood con amina ion (Song e al. 2003). Howe e , he e iciency o his coa ing depends on i s hickness and s o ing packaging condi ions (Choi e al. 2002). Se e al pape s ha e al eady de e mined his pola , wa e soluble su oga e. GC- (FID o MS) has been he mos used echnique (see able VI.15). Table VI.6: Chemical and physical p ope ies o benzophenone. Benzophenone Re . Nº 38240 CAS Nº 119-61-9 Fo mula C13H10O Chemical Name Diphenylme anone MW 182 mp (ºC) 48 Bp/Fp (ºC) 305/- Wa e solubili y (mg l-1) 137 Solubili y (g x 100g solu ion-1) wa e :1; e hanol:4; die hyl e he : 4; ace one:4; benzene: 3; chlo o o m:4; ace ic acid:4; me hanol:3; ca bon sulphu :4 Applica ion Ligh s abilise S uc u e Spec al Da a MS peaks: 105 (100) 77(49) 182 (32) UV: 33, 252 nm (me hanol) SML (mg kg-1) 0.01 TDI (mg kg-1) 0.6 120 Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s… VI.3.1.6. Diphenyl Ph hala e and DEHA Acco ding o he In e na ional Union o Pu e and Applied Chemis y (IUPAC), a plas icize is a subs ance o ma e ial inco po a ed in a ma e ial (plas ic, o ins ance) o inc ease i s lexibili y, wo kabili y o s e chabili y (Cano e al. 2002, Page and Lac oix 1995). Howe e , plas icize s can also ac as lub i ican s, lame e a dan s o he mal s abilize s (Wang 2000). Plas icize s like ph hala es, adipa es, phospha es, ci a es and sebaca es a e widely used in ood packaging ma e ials (Van Lie op and Van Veen 1988), o en in signi ican amoun s (some imes exceed 20% by weigh o he polyme ) (S a in e al. 1987, Goulas e al. 1998). The p ope ies o he plas icized polyme depend on he chemical na u e and concen a ion o he plas icize (Cano e al. 2002). Table VI.7: Chemical and physical p ope ies o diphenyl ph hala e. Diphenyl Ph hala e CAS Nº 84-62-8 Fo mula C20H14O4 Chemical Name 1,2-Benzenedica boxylic acid, diphenyl es e MW 318 mp (ºC) 73 Bp/Fp (ºC) 405/224 Wa e solubili y (mg l-1) 0.08 Solubili y (g x 100g solu ion-1) wa e :1; e hanol:2; die hyl e he :2; e e:2 Applica ion Plas icize S uc u e Spec al Da a MS peaks: 94(100) 28(83) 225(32) UV: 225nm (me hanol) Gene ally plas icize s ha e low molecula weigh , he e o e, hey end o mig a e om packaging ma e ial o he w apped ood and become indi ec ood addi i es (Goulas e al. 1998). The speci ic mig a ion limi o DEHA is 3 mg dm-2 (Pe e sen e al. 1997). Rega ding diphenyl ph hala e, which is an alkyl-subs i u ed 121 Capí ulo VI ph hala e, i s iden i ica ion by mass spec a is no an easy ask, once all he subs ances which belong o his amily do no gi e an in ense pa en ion and p esen common majo agmen s (Wang 2000). Table VI.8: Chemical and physical p ope ies o DEHA. DEHA Re . Nº 31920 CAS Nº 103-23-1 Fo mula C22H42O4 Chemical Name Adipic acid, bis(2-e hylhexyl) es e MW 371 mp (ºC) <-70 Bp (ºC) 417 Wa e solubili y (mg l-1) 0.78 Applica ion Plas icize S uc u e Spec al Da a MS peaks: 129, 57, 112, 147. SML (mg kg-1) 18 The key o he co ec analy ical app oach o plas icize s equi es no only he knowledge o hese plas ics addi i es bu also he comp ehensi e unde s anding o he polyme , once he plas icize s a e homogeneously blended wi h he polyme molecules (Wang 2000). Tables VI.16 and VI.17 e e o GC me hods o he de e mina ion o DEHA. VI.3.2. Sample p epa a ion o he analysis o model mig an s VI.3.2.1. In polyme ma e ials In gene al, he i s s ep o he de e mina ion o mig an s in plas ics is hei sepa a ion om he polyme ic ma ix. The wo mos widely me hods used a e he ex ac ion wi h sol en s and he use o sol en s ha swell and/o dissol e bo h, selec ed compound and polyme . 122 Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s… VI.3.2.1.1. Ex ac ion wi h sol en s I is b oadly accep ed ha he sol en used should dissol e he a ge compound and also swell he polyme ic ma ix. Polyme swelling da a a e widely a ailable in he li e a u e, bu he solubili ies o he selec ed mig an s in ex ac ion sol en s a e incomple ely documen ed and mus be es ima ed on he basis o he na u e o analy e and ex ac an . Se e al combina ions sol en /analy e/polyme has been used. Dichlo ome hane has been used o de e mine I ganox 1076 and DEHA in mul ilaye ma e ials (PP/EVA/EVOH) and PVC (poly inylchlo ide); ace oni ile o Chimasso b 81 and I ganox 1076 in PET (polye hylene e eph hala e), e ahyd o u an o Chimasso b 81 and U i ex OB in HDPE (high densi y polye hylene) and PP (polyp opylene); iso-oc ane o DEHA in PVC and die hyl e he o I ganox 1076 and DEHA. Ex ac ion p ocedu es a e usually ca ied ou by hand shaking, al hough some imes ul asonic mace a ion o Soxhle a e used o imp o e he p ocess (Va go and Olson 1985, Ulsake and Teien 1992, Ne in e al. 1996, O’ B ien e al. 1997, Ma que e al. 1998, Mon ei o e al. 1998, Speci ic mig a ion, Pe e sen e al. 2004). Rega ding o he ood con ac ma e ials, benzophenone was ex ac ed om pape and boa d wi h absolu e e hanol (Summe ield and Coope 2001, T ian a yllou e al. 2002). Ex ac ions wi h supe c i ical luid o mic owa e- assis ed we e used o I ganox 1076 and chimasso b 81 in PE (Sala anca e al. 1999), and DEHA in PVC (Cano e al. 2002, Gue a e al. 2002). VI.3.2.1.2. Use o sol en s ha swell and/o dissol e bo h selec ed compound and polyme , ollowed by p ecipi a ion o he polyme Toluene has been used o polyole ins con aining I ganox 1076 ollowed by p ecipi a ion o he polyme wi h me hanol (Speci ic Mig a ion) while DEHA was de e mined by o al dissolu ion o polyme s wi h chlo o o m and hen p ecipi a ing wi h me hanol (O’ B ien e al. 1997). VI.3.2.2. In ood simulan s VI.3.2.2.1. Aqueous o icial ood simulan s Usually hey a e di ec ly injec ed when he analysis is ca ied ou by e e se phase- HPLC (RP-HPLC). DEHA and I ganox 1076 we e de e mined ollowing his me hodology (O’B ien e al. 1997, Howe and Bo odinsky 1998), and 123 Capí ulo VI Chimasso b 81 and cap olac am a e dilu ion wi h miscible o ganic sol en s (Spy opoulos 1998, Speci ic mig a ion). Some imes a concen a ion s ep o change o sol en is necessa y be o e he ch oma og aphic analysis. Fo ins ance, I ganox 1076 and DEHA we e ex ac ed wi h hexane (Simoneau and Hannae 1999), Chimasso b 81 wi h dichlo ome hane (Ne in e al. 1996), U i ex OB wi h chlo o o m and DEHA wi h hep ane (O’ B ien e al. 1997). Benzophenone was ex ac ed using an ac i a ed silica-bound-phase ca idge, which was elu ed wi h a me hanolic solu ion (Papillound and Baud az 2002). VI.3.2.2.2. O icial a y ood simulan s In some cases he a simulan is dilu ed wi h a sol en ollowed by di ec injec ion in a ch oma og aphic sys em. Fo ins ance, ace one was used in he de e mina ion o he he mig a ion o I ganox 1076 (Helm o h e al. 2002; O’B ien e al. 1997), dichlo ome hane o e ahyd o u an we e used o de e mine Chimasso b 81 (Ne in e al. 1996, Spy opoulos 1998) and hep ane and ace oni ile we e he sol en s when mig a ion o DEHA was e alua ed (O’ B ien e al. 1997, Speci ic mig a ion). Ex ac ion wi h immiscible sol en s can also be pe o med. Fo example, ace oni ile was used o ex ac DEHA and I ganox 1076 (Simoneau and Hannae 1999), and me hanol o ex ac Chimasso b 81 (Spy opoulos 1998), al hough e y poo eco e y was achie ed. Fo ola ile subs ances speci ic echniques we e applied. A Tenax adso p ion column ollowed by ex ac ion wi h hexane has been employed o de e mine DEHA (Van Lie op and Van Veen 1988). Also, DEHA was ex ac ed wi h e hyl ace a e/ oluene and ex ac s we e injec ed in a GPC column (Biobeads S-X3) o p oceed o he clean-up s ep (Pe e sen and B eindahl 1998). VI.3.2.2.3. Subs i u e a simulan s Rega ding his ype o simulan s, di ec injec ion o he simulan i is commonly used in a ch oma og aphic sys em, a e mig a ion es s. This me hod has been used o de e mine he mig a ion o I ganox 1076, Chimasso b 81, U i ex OB and ε-cap olac am (Speci ic mig a ion) and Chimasso b 81 a e dilu ion wi h e ahyd o u an (Spy opoulos 1998). On he o he hand, e apo a ion o he simulan 124 Compila ion o analy ical me hods o de e mine mig a ion o addi i es and monome s… o d yness ollowed by dissolu ion in chlo o o m o ace oni ile, was used o de e mine I ganox 1076 (Ga de e al. 2001) and benzophenone (Papillound and Baud az 2002), espec i ely and ex ac ion wi h hexane/wa e was used o de e mine DEHA and I ganox 1076 in e hanol 95% (Simoneau and Hannae 1999). VI.3.2.3. Foods u s Due o he complexi y o ood samples, he p ocedu e mo e b oadly used wi h simulan s, by di ec injec ion, is no he mos app op ia e o e alua e mig a ion in oods. In spi e o he lack o abundan bibliog aphic suppo , he a ailable in o ma ion ela ed wi h he s udy o mig a ion in o oods u s e eals ha he scien i ic communi y ocuses mainly on he h ee app oaches: ex ac ion wi h sol en s, solid phase ex ac ion and size exclusion ch oma og aphy o gel pe mea ion ch oma og aphy. VI.3.2.3.1. Ex ac ion wi h sol en s This p ocedu e is one o he mos gene ally used, as much o a y oods as non- a y oods. Fo ins ance, DEHA was ex ac ed om se e al ood i ems wi h cyclohexane-dichlo ome hane (1:1) o hexane-dichlo ome hane (10:1) (Lau and Wang 1996, Page and Lac oix 1995). Benzophenone was ex ac ed om se e al oods wi h a mix u e o ace oni ile and dichlo ome hane (1:1). Occasionally, a e sol en ex ac ion a clean-up s ep, like solid phase ex ac ion, size exclusion ch oma og aphy o gel pe mea ion ch oma og aphy may be necessa y. VI.3.2.3.2. Solid phase ex ac ion I was used in sample p epa a ion o DEHA and o he plas icize s in a y ood (animal issues, a s and high a con en cheese) a e blending wi h dichlo ome hane and passing he ex ac h ough a Flo isil column (Page and Lac oix 1995). I was also used o analyse DEHA in wa e samples (B ossa e al. 2002). VI.3.2.3.3. Size exclusion ch oma og aphy o gel pe mea ion ch oma og aphy 125