Estudio de la migración de distintos componentes de los materiales plásticos a los alimentos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DE LOS MATERIALES PLÁSTICOS A LOS ALIMENTOS Memoria presentada para optar al Grado de Doctor RAQUEL SENDÓN GARCÍA Santiago de Compostela, Febrero de 2005 PILAR BERMEJO BARRERA, DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMA: Que Dña. Raquel Sendón García presenta el trabajo titulado “ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DE LOS MATERIALES PLÁSTICOS A LOS ALIMENTOS” realizado bajo la dirección del Dr. Perfecto Paseiro Losada y de la Dra. Mª Concepción Pérez Lamela, en los laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Fdo. Dra. Dña. Pilar Bermejo Barrera Santiago de Compostela, Febrero de 2005 PERFECTO PASEIRO LOSADA, PROFESOR TITULAR DEL ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y Mª CONCEPCIÓN PÉREZ LAMELA, DOCTORA EN FARMACIA E INVESTIGADORA PARGA PONDAL DE LA UNIVERSIDAD DE VIGO AUTORIZAN a Dña. Raquel Sendón García a presentar la Tesis titulada “ESTUDIO DE LA MIGRACIÓN DE DISTINTOS COMPONENTES DE LOS MATERIALES PLÁSTICOS A LOS ALIMENTOS” para optar al Grado de Doctor, la cual ha sido realizada bajo nuestra dirección en los laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela en Febrero de 2005. Fdo. Dr. Perfecto Paseiro Losada Fdo. Dra. Mª Concepción Pérez Lamela. Fdo. Dña. Raquel Sendón García. AGRADECIMIENTOS Me gustaría expresar mi más sincero agradecimiento, en primer lugar a los directores de esta Tesis, que han hecho posible la realización de este trabajo, al Prof. Dr. Perfecto Paseiro Losada por haberme dado la oportunidad de descubrir el mundo de la investigación y por haberme enseñado esos principios, mitad ciencia mitad sentido común; a la Dra. Concepción Pérez Lamela por haber estado ahí, por su apoyo incondicional y sobre todo por haberme entendido en todo momento. A los demás profesores del departamento, que siempre han estado dispuestos a ayudarme en todo, y por haberme apoyado siempre. Todos han participado en mi formación lo cual ha sido una gran suerte. A todos aquellos que han pasado por este departamento desde mis inicios, a la Dra. Ana Rodríguez y muy especialmente, por todo lo que le ha tocado vivir, y aún así, estar siempre dispuesta a tenderme una mano, a la Dra. Sarah Pastorelli. Muchos más han pasado por aquí, y también a ellos les agradezco todos los buenos momentos que me han hecho pasar; incluso a aquellos que se han empeñado en amargar el buen ambiente que siempre ha habido, porque también me han ayudado a hacerme más fuerte. A los que ahora están aquí, a los que trabajan codo con codo conmigo, a los “niños” y a los demás, siempre haciéndolo todo mucho más fácil. A los dos pilares fundamentales que me han sustentado estos últimos años, que han hecho posible que todavía me quede algo de cordura, y sobre todo en este último año tan especial, que se han encargado de que no me desmoronase; muchas gracias a la “cDra.” María Punín y a la Dra. Ana Teresa Sanches. A mis amigas de toda la vida; creo que es uno de los mejores tesoros que una persona pueda tener, la amistad incondicional durante estos ya más de quince años, por todo lo que hemos vivido juntas, lo bueno y lo malo, muchas gracias chicas! VII A mi familia, que siempre está ahí, pase lo que pase, que siempre me ayudan y que han sido mi punto de partida, por haberme permitido llegar hasta aquí, muchas gracias. A Eusebio, su confianza, su apoyo, su vida, tantas cosas.... ya se han hecho imprescindibles en mi vida. En fin, a todos los que estuvieron y están ahí, a mi lado. Por último me gustaría agradecer el financiamiento económico que ha hecho posible parte de este trabajo: A la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología, CICYT y a la Comisión Europea por la concesión del proyecto: Desarrollo de una metodología analítica para la optimización y verificación de materiales plásticos de uso alimentario. Aplicaciones en la industria fabricante, 1FD97-2167-C02-01. A la Comisión Europea por la concesión del proyecto: FOODMIGROSURE, Modelling migration from plastics into foodstuffs as a novel and cost efficient tool for estimation of consumer exposure from food contact materials, QLRT-2001-02390. VIII A mis padres, a mi hermano Y a la persona que ha decidido compartir su vida conmigo ÍNDICE DE TABLAS I. Introducción. Tabla I.1: Resumen de la legislación aplicable a materiales destinados a entrar en contacto con alimentos. 25 II. Determination of Compounds from Epoxy Resins in Food Simulants by HPLC-Fluorescence. Table II.1: Summary migration results for all BADGE related compounds expressed as mg BADGE dm-2. 46 Table II.2: Results for BADGE derivatives and oligomers migration expressed as mg BADGE dm-2. 50 III. Determination of Bisphenol A Diglycidyl Ether and its Hydrolysis and Chlorohydroxy Derivatives by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Table III.1: Selected ions for quantification. 61 Table III.2: Possible structures of other fragments. 66 Table III.3: Method validation parameters. 67 IV. Determination of Bisphenol F Diglycidyl Ether and its Related Compounds by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Table IV.1: Chemical structures of selected ions for quantification purposes (only para, para isomers are showed). 80 Table IV.2: Method validation parameters. 87 V. Migration survey of bisphenol A diglycidyl ether and bisphenol F diglycidyl ether from canned fish and seafood, in Spanish market during last years. Table V.1: Summary of results of BADGE and BFDGE survey. 99 XV VI. Compilation of Analytical Methods to Determine Migration of Additives and Monomers from Plastics to Foodstuffs. Table VI.1: Chemical and physical properties of Irganox 1076. 115 Table VI.2: Chemical and physical properties of DPBD. 117 Table VI.3: Chemical and physical properties of Chimassorb 81. 118 Table VI.4: Chemical and physical properties of Uvitex OB. 118 Table VI.5: Chemical and physical properties of ε-caprolactam. 119 Table VI.6: Chemical and physical properties of benzophenone. 120 Table VI.7: Chemical and physical properties of diphenyl phthalate. 121 Table VI.8: Chemical and physical properties of DEHA. 122 Table VI.9: Results of preliminary experiments. 129 Table VI.10: Guideline suggested for the analysis of eight selected model migrants. 130 Table VI.11: HPLC methods for Irganox 1076 analysis. 131 Table VI.12: GC methods for Irganox 1076 analysis. 131 Table VI.13: SPE (Supercritical Fluid Chromatography) methods for Irganox 1076. 132 Table VI.14: HPLC-UV methods for Chimassorb 81 and Uvitex OB analysis. 132 Table VI.15: GC methods for Chimassorb 81, Uvitex OB and benzophenone analysis. 133 Table VI.16: GC-FID methods for DEHA analysis. 133 Table VI.17: GC-MS methods for DEHA analysis. 134 VII. State of the Art of Analytical strategies to Evaluate Different Migrants from Food Packaging Materials. Table VII.1: Chemical structures. 149 Table VII.2: Chemical and physical information. 151 Table VII.3: Results of preliminary experiments. 166 XVI Table VII.4: Suggestions to prepare analytical methods to determine migrants in foods. 170 VIII. Determination of Diphenylbutadiene by Liquid Chromatography-UV- Fluorescence in Foodstuffs. Table VIII.1: Method validation parameters. 188 Table VIII.2: DPBD recoveries at different concentrations for orange juice, chicken breast and Gouda cheese obtained with an ultraviolet detector. 190 Table VIII.3: DPBD recoveries at different concentrations for orange juice, chicken breast and Gouda cheese obtained with a fluorescence detector. 190 XVII ÍNDICE DE FIGURAS II. Determination of Compounds from Epoxy Resins in Food Simulants by HPLC-Fluorescence. Figure II.1: Compounds of low Molecular weight in BADGE / NOGE series. 41 Figure II.2: Chemical structures of BADGE, p,p-BFDGE and its derivatives. 42 Figure II.3: Chromatograms of Bisphenol A epoxy resin (A), NOGE resin (C) and all derivatives obtained from BADGE and BFDGE standards (B and D). 47 Figure II.4: HPLC-MS chromatogram of a sample without post cured treatment extracted with 90% acetonitrile acquired in single ion recording mode: mass 951(A), mass 666 (B) and mass 382 (C). 48 Figure II.5: Chromatograms of samples without post cured treatment: 3% acetic acid (A), olive oil (B) and 90% acetonitrile (C). 49 III. Determination of Bisphenol A Diglycidyl Ether and its Hydrolysis and Chlorohydroxy Derivatives by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Figure III.1: Chemical structures of BADGE and its derivatives. 59 Figure III.2.1: MS spectra of BADGE (A), BADGE.HCl (B) and BADGE.2HCl (C). 63 Figure III.2.2: MS spectra of BADGE.H2O (D), BADGE.H2O.HCl (E) and BADGE.2H2O (F). 64 Figure III.3: MS chromatograms in APCI (+) of BADGE.HCl (A), BADGE.H2O (B) and BADGE (tR: 17.3) and BADGE.2HCl (tR: 16.0) (C) at a concentration of 0.8 mg/l. 68 Figure III.4: MS chromatograms in APCI (-) of BADGE.H2O.HCl (A) and BADGE.2H2O (B) at a concentration of 0.8 mg/l. 68 IV. Determination of Bisphenol F Diglycidyl Ether and its Related Compounds by High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Figure IV.1: Compounds of low molecular weight in NOGE series. 76 Figure IV.2: Chemical structures of A: p,p bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE, Mw: 312,36); B: p,p bisphenol F (2,3-dihydroxypropyl) glycidyl ether (BFDGE.H2O); C: p,p bisphenol F (3-chloro-2-hydroxypropyl) glycidyl ether (BFDGE.HCl); D: p,p bisphenol F bis(2,3-dihydroxypropyl) ether (BFDGE.2H2O); 77 XIX E: p,p bisphenol F bis(3-chloro-2-hydroxypropyl) ether (BFDGE.2HCl); F: p,p bisphenol F (3-chloro-2-hydroxypropyl) (2,3-dihydroxypropyl) ether (BFDGE.H2O.HCl, Mw:366,84). Figure IV.3 A: APCI mass spectra of BFDGE at a concentration of 10 mg/L. 82 Figure IV.3 B: APCI mass spectra of BFDGE.2H2O at a concentration of 10 mg/L. 83 Figure IV.3 C: APCI mass spectra of BFDGE.2HCl at a concentration of 10 mg/L. 83 Figure IV.4: MS chromatograms using APCI (+) of a mixture of BFDGE.HCl and BFDGE (A and B) using m/z 390 and 354 respectively; and a mixture of BFDGE.H2O and BFDGE (C and D) using m/z 372 and 354 respectively, at a concentration of 20 mg/L (expressed as the sum of all derivatives). 84 Figure IV.5: MS chromatograms using APCI (-) of a mixture of BFDGE.2HCl (A), BFDGE.H2O.HCl (B) and BFDGE.2H2O (C) using m/z 383+385, 365 and 347 respectively, at a concentration of 20 mg/L (expressed as the sum of all derivatives). 85 Figure IV.6: MS chromatograms in APCI (+) of a mixture of NOGE (commercial standard); NOGE 4-rings of m/z 678 (A), NOGE 3-rings, using m/z 516 (B), and BFDGE, using m/z 354 (C) at a concentration of 50 mg/L (expressed as the sum of all compounds). 86 V. Migration survey of bisphenol A diglycidyl ether and bisphenol F diglycidyl ether from canned fish and seafood, in Spanish market during last years Figure V.1: Chromatogram of mussels in pickled sauce with a concentration of 1.43 mg BFDGE /kg of foodstuff. 99 Figure V.2: Chromatogram of tuna in oil with a concentration of 1.2 mg BADGE /kg of foodstuff 100 Figure V.3: Chromatogram of mussels in pickled sauce with a concentration of all BADGE derivatives of 0.16 mg/kg foodstuff. 101 Figure V.4: Chromatogram of tuna in oil with a concentration of BADGE below 0.1 mg/kg of foodstuff, but with oligomers of high molecular weight. 102 Figure V.5: Chromatogram of tuna in oil with a concentration of BFDGE of 0.4 mg/kg of foodstuff. 103 XX VIII. Determination of Diphenylbutadiene by Liquid Chromatography-UV- Fluorescence in Foodstuffs. Figure VIII.1: HPLC chromatogram of a DPBD standard solution (1 µl/ml) A: Signal of UV detection at a wavelength of 330 nm and B: Fluorescence detection at excitation and emission wavelengths of 330 and 375 nm respectively. 187 Figure VIII.2: HPLC chromatogram of an orange juice sample spiked with DPBD (1 µl/ml) A: Signal of UV detection at a wavelength of 330 nm and B: Fluorescence detection at excitation and emission wavelengths of 330 and 375 nm respectively. 189 XXI ABREVIATURAS ABS Acrilonitrilo/Butadieno/Estireno ADI Aceptable Daily Intake (Ingesta Diaria Admisible) AESA Agencia Española de Seguridad Alimentaria APCI Atmospherical Presure Chemical Ionization (Ionización Química a Presión Atmosférica) ATBC Tri-n-butil citrato BADGE Bisfenol A diglicidil éter BFDGE Bisfenol F diglicidil éter BHT Hidroxitolueno Butilado Bp Boiling Point (Punto de Ebullición) BSE Bovine Spongifrom Encephalopathy (Encefalopatía Espongiforme Bovina) CAS Chemical Abstracts Service Da Daltons DEHA Bis 2-diethylehxyl adipate DIPN Diisopropilnaftaleno DPBD Dipheynilbutadiene DMF Dimetilformamida E/VA Etileno/Acetato de Vinilo EFSA European Food Safety Authority (Agencia Europea de Seguridad Alimentaria) Em Emisión ESI Electrospray Ionization EUFIC European Food International Council (Consejo Europeo sobre la Alimentación) EVOH Etileno/Alcohol Vinílico Ex Excitación FAO Food And Agriculture Organization of the United Nations (Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación) XXIII Resumen europea sobre recubrimientos basados en resinas epoxi y materiales en contacto con alimentos. En el capítulo II (Determination of compounds from epoxy resins in food simulants by HPLC-fluorescence) de esta Tesis Doctoral se describe el desarrollo de un método analítico de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con detector de fluorescencia que permite la separación y cuantificación de bisfenol A diglicidil éter (BADGE), bisfenol F diglicidil éter (BFDGE) y sus derivados clorados e hidroxilados, así como de los oligómeros del BADGE y de los novolac glicidil éteres (NOGE). El método desarrollado ha sido aplicado al análisis de una resina de tipo epoxi destinada a su uso como recubrimiento para envases alimentarios. A esta resina se le aplicaron dos métodos de curado diferentes, uno a temperatura ambiente durante 24 horas y otro a 100ºC durante una hora. Los ensayos de migración se han realizado en tres simulantes alimentarios, establecidos por la legislación europea y que son: ácido acético al 3 % (p/v), (simulante para alimentos ácidos acuosos) etanol al 10 % (v/v) (simulante para alimentos con un contenido en etanol menor al 10 %) y aceite de oliva rectificado (simulante para los alimentos grasos). Los simulantes acuosos han sido analizados directamente, mientras que para llevar a cabo el análisis de los extractos de aceite de oliva, se aplicó un método de extracción rápido y sencillo. También se realizaron ensayos de extracción con acetonitrilo, comparando estos resultados con los obtenidos para los simulantes. La cuantificación de los distintos compuestos se ha llevado a cabo utilizando la calibración externa, y los parámetros de caracterización del método fueron satisfactorios. Debido a que no existen patrones comerciales de los oligómeros del BADGE y NOGE, se han construido dos rectas de calibración usando BADGE y BFDGE, que han sido usadas para cuantificar sus oligómeros. Con estas rectas de calibración hechas con los patrones comerciales puros (de BADGE y BFDGE) se obtuvieron en todos los casos coeficientes de determinación mayores a 0,996 y límites de detección de adecuados. La concentración del BFDGE ha sido calculada como la suma de sus tres isómeros. Para la cuantificación de los derivados del 4 Estudio de la migración de distintos componentes de los materiales plásticos a los alimentos BADGE y BFDGE el procedimiento usado es similar. De esta manera todos los resultados están expresados como BADGE y BFDGE asumiendo que los factores de respuesta de estos derivados son similares a los de los patrones puros. La preparación de los derivados clorados e hidroxilados del BADGE y BFDGE se ha realizado aplicando dos procesos diferentes para cada uno, para así poder identificar los derivados obtenidos. La preparación de los derivados hidroxilados se ha llevado a cabo mediante una disolución de los patrones en agua y su posterior mantenimiento a una temperatura elevada. Los derivados clorados se obtienen mediante la adición de ácido clorhídrico a una disolución concentrada de los patrones. En el caso del BFDGE la existencia de tres isómeros dificulta mucho esta identificación. Experimentalmente se comprobó que 2 horas son suficientes para la obtención de los derivados hidroxilados (BADGE.H2O, BADGE.2H2O, BFDGE.H2O, BFDGE.2H2O) y 20 minutos son suficientes para la obtención de los derivados clorados (BADGE.H2O.HCl, BADGE.2HCl, BFDGE.H2O.HCl, BFDGE.2HCl). Para la confirmación positiva de la identidad de los derivados y oligómeros se ha empleado la cromatografía liquida en fase reversa con detector de espectrometría de masas. Se comprobó que el recubrimiento analizado era del tipo BADGE, no se encontró ningún derivado tipo NOGE o BFDGE y los únicos derivados cuantificados después de los ensayos de migración fueron derivados hidroxilados y oligómeros del BADGE. A pesar de que estaban presentes oligómeros con M>1000 Da, estos no fueron cuantificados porque no eran objeto de este estudio. El comportamiento de la migración ha sido el esperado ya que en los simulantes acuosos, el BADGE se hidroliza después de haber migrado a estos simulantes. No se han detectado oligómeros del BADGE en estos simulantes, debido a su baja solubilidad. En cambio, los extractos de aceite de oliva contenían oligómeros del BADGE y en ellos no se detectaron cantidades significativas de los derivados hidroxilados. Los extractos de acetonitrilo contenían los mismos compuestos epoxi que el aceite de oliva, lo cual confirmó los datos obtenidos en el ensayo de migración con este último. Los datos obtenidos muestran que el recubrimiento epoxídico analizado cumple la legislación europea. Pero cuando se usa el ensayo alternativo con el acetonitrilo y el recubrimiento no ha sido sometido a un tratamiento posterior a alta 5 Resumen temperatura, la cantidad total de sustancias migrantes (incluidos los oligómeros del BADGE) es más alta que en el ensayo de migración para el aceite de oliva. Se ha observado también que para todas las muestras sometidas a un proceso posterior a alta temperatura, se obtienen valores de migración menores. El objetivo del capítulo III (Determination of BADGE and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives by LC-MS) ha consistido en desarrollar un método que permita tanto la cuantificación como la identificación positiva del BADGE y de todos sus derivados usando un método de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa acoplada a un espectrómetro de masas vía una sonda de ionización química a presión atmosférica (APCI). La legislación europea establece que la suma del BADGE, sus derivados hidroxilados (BADGE.H2O y BADGE.2H2O) y clorados (BADGE.HCl, BADGE.2HCl y BADGE.H2O.HCl) no debe exceder el límite de migración específica de 1 mg/kg de alimento o simulante. La cuantificación de estas sustancias se ha llevado a cabo usando el modo SIR (“single ion recording”) después de haber seleccionado los fragmentos más característicos en los espectros de masa obtenidos. Así para el BADGE y BADGE.H2O se optó por el modo APCI (+) y los fragmentos seleccionados se corresponden con los “clusters” formados por el propio analito y una molécula de acetonitrilo [M+CH3CNH]+. Para el BADGE.2H2O se seleccionó el modo APCI (-) y el fragmento correspondiente al ión cuasi molecular ha sido considerado el más selectivo. Para el BADGE.HCl el fragmento más abundante corresponde al [M+CH3CNH]+. El caso del BADGE.2HCl es más difícil de explicar porque el fragmento más abundante y simultáneamente más específico podría corresponder a un cluster similar al que forma el BADGE. El BADGE.H2O.HCl se ha determinado usando APCI (-) en vez de (+) debido a la imposibilidad de separarlo cromatográficamente del BADGE.H2O. De esta forma se seleccionó un fragmento muy selectivo correspondiente a [M-H]-. El método ha sido evaluado en acetonitrilo al 90% (v/v) y en agua. En ambos casos se obtienen para todas las sustancias coeficientes de determinación 6 Estudio de la migración de distintos componentes de los materiales plásticos a los alimentos mayores a 0,99 y límites de detección satisfactorios, comparándolos con los límites de migración específica establecidos en la legislación. Una vez optimizado el método, se han realizado análisis aleatorios con latas vacías, extrayéndolas con acetonitrilo. No se ha encontrado ninguna de las sustancias citadas, lo cual demuestra la garantía de inocuidad de las latas evaluadas. Estos ensayos de extracción son actualmente utilizados por varios autores ya que el acetonitrilo es un buen disolvente de extracción y se consigue así, tener una idea de la seguridad de estos materiales antes de ser usados como envases para alimentos. En el capítulo IV (Determination BFDGE and its related compounds by HPLC-MS), al igual que en el anterior, se describe la puesta a punto de un método analítico basado en la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa acoplada a un espectrómetro de masas y usando la ionización química a presión atmosférica (APCI) para la separación, cuantificación e identificación del bisfenol F diglicidil éter y sus derivados hidroxilados y clorados. La legislación europea relacionada con el uso de determinados compuestos epoxídicos como materiales en contacto con alimentos, establece que la suma de los niveles de migración del BFDGE y sus derivados no debe exceder el valor de 1 mg/kg de alimento o simulante (o 1 mg/6dm2 en el material evaluado). Para el NOGE se establece (desde marzo de 2003), que la cantidad de estos componentes con más de dos anillos aromáticos, y con al menos un grupo epoxi, y sus derivados con moléculas de cloro, y un peso molecular menor de 1000 Da, deben ser no detectables a niveles inferiores a 0,2 mg/6dm2. Así, una vez optimizadas todas las condiciones analíticas y para establecer los parámetros de cuantificación, se han realizado ensayos iniciales con disoluciones concentradas de estos compuestos para obtener la máxima información posible de sus espectros de masas. En la producción de BFDGE, la condensación entre el fenol y el formaldehído puede ocurrir en las posiciones orto y para del anillo fenólico. Esta es la razón por la que este compuesto está formado por tres isómeros y puede estar acompañado por compuestos de tres o más anillos. Esto hace que su separación cromatográfica tenga una mayor dificultad si la comparamos con la del BADGE. 7 Resumen Además, también es importante destacar que sólo hay disponibles en el mercado tres patrones comerciales (BFDGE, BFDGE.2H2O y BFDGE.2HCl); así para los que no existen estos patrones es necesario preparar mezclas que contengan los demás derivados (BFDGE.H2O, BFDGE.HCl y BFDGE.H2O.HCl) tal y como se describe en el capítulo II, pero la separación cromatografica y la identificación individual es por tanto, realmente difícil. La ionización de estos compuestos tiene un perfil similar a la observada en el capítulo III para el BADGE. Una vez seleccionados los iones más selectivos se han construido las rectas de calibrado (sólo para aquellos compuestos disponibles en el mercado como patrones puros). Se han obtenido en todos los casos coeficientes de determinación mayores de 0,99 y límites de detección adecuados, teniendo en cuenta el límite de migración específica. En cuanto al NOGE, únicamente es posible la cuantificación de los derivados de hasta cuatro anillos aromáticos, pero la única restricción de este método es el límite de detección, inconveniente que puede solucionarse usando un paso previo de concentración. La principal ventaja de este método es que al utilizar el modo SIR (“selecting ion recording”) se consigue diferenciar mezclas complejas. Durante los últimos años, el sector de la industria conservera ha demostrado una evidente preocupación por la posible contaminación de sus productos por los compuestos anteriormente citados. Esto ha hecho posible el estudio descrito en el capítulo V (Migration survey of BADGE and BFDDGE from canned fish and seafood, in Spanish market during last years). Se han evaluado los niveles de BADGE y BFDGE en 389 muestras de conservas de pescado suministradas directamente por industrias nacionales durante los últimos seis años. Para dicha evaluación se ha utilizado un sencillo método de extracción de las muestras, y el método de análisis cromatográfico descrito en el capítulo II. En todas las muestras se ha realizado un análisis cuantitativo del BADGE y BFDGE, y también se han identificado otros derivados. Los resultados encontrados muestran una evolución en la concentración de estos compuestos epoxídicos. Así, en el año 1999, se detectaron niveles de BADGE en casi un 50 % de las muestras, pero siempre en niveles inferiores a los límites establecidos en la legislación. En cuanto al BFDGE se encontraron valores 8 Estudio de la migración de distintos componentes de los materiales plásticos a los alimentos que excedían los límites legales en un 4 % de las muestras. Desde este año (1999) y hasta finales del 2001, sólo un 1 % de las muestras superó el límite de 1 mg/kg, y en los siguientes tres años (2002-2004) ninguna muestra alcanzó este valor. Comparando estos datos con los obtenidos previamente en nuestro laboratorio, se puede concluir que estos compuestos se encuentran en concentraciones inferiores a las que se obtenían a finales de los años 90. En la Unión Europea existe legislación de obligado cumplimiento, que define los límites máximos de migración global y migración específica, para envases plásticos en contacto con alimentos. Las investigaciones científicas relacionadas con la migración potencial y con el comportamiento de los materiales de envasado han demostrado que la difusión y la migración pueden ser fenómenos previsibles y en principio descritos matemáticamente. Sin embargo, la escasa información relativa al comportamiento de muchas sustancias potencialmente migrantes y la creciente importancia que tienen los temas de seguridad alimentaria, ha suscitado el interés de esta por los materiales plásticos en contacto con alimentos. Entre las acciones que la Unión Europea ha decidido iniciar está el financiamiento de un proyecto de investigación llamado “FOODMIGROSURE”, que actualmente siendo desarrollado en varios centros europeos de investigación, entre los incluido está incluido nuestro laboratorio. El principal objetivo de este proyecto es proporcionar una herramienta novedosa y económica para la estimación de la exposición del consumidor a sustancias migrantes que provengan de los materiales en contacto con alimentos. Esta herramienta está basada en un modelo de migración físico-química que describe matemáticamente los procesos de migración desde los plásticos a alimentos reales, bajo cualquier condición de contacto previsible. Dentro de este proyecto europeo existen tres secciones principales. - La primera incluye la definición y selección de los materiales plásticos objeto de estudio, sustancias modelo y alimentos representativos de cada grupo. - La segunda hace referencia al trabajo de investigación experimental que enfocado a obtener los datos físico-químicos de los migrantes modelo seleccionados. - La tercera, pretende hacer una evaluación multidisciplinar e interactiva, así como llevar a cabo la ejecución del trabajo. 9 Resumen Incluidos en la segunda sección del plan de trabajo del proyecto existen dos módulos diferenciados. En el primer módulo se distinguen tres partes: el desarrollo de métodos analíticos y el diseño experimental para las dos siguientes partes; los estudios de cinética de migración desde filmes plásticos a alimentos y los estudios de procesos de transporte y partición de los migrantes modelo en los alimentos. Los capítulos VI, VII y VIII recogen el trabajo integrado en el primer módulo en la sección correspondiente al desarrollo de los métodos analíticos y diseño experimental. Así, una vez que el proyecto ha seleccionado los materiales plásticos de referencia, se han elegido también migrantes modelo de diferentes propiedades físicas y químicas que han sido estudiadas en los capítulos VI y VII. En el capítulo VI (Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers from plastics to foodstuffs), las sustancias evaluadas fueron: Irganox 1076®, difenilbutadieno, Chimassorb 81®, Uvitex OB®, caprolactama, benzofenona, difenil ftalato y bis (2-dietilhexil) adipato (DEHA). En primer lugar se ha realizado una extensa revisión bibliográfica de las propiedades físicas y químicas de los compuestos seleccionados. Debido a que muchos de estos datos estaban incompletos, algunas de estas propiedades se evaluaron en nuestro laboratorio. Para cada sustancia se recopilaron los diferentes datos y las propiedades disponibles como el número CAS, la fórmula y el nombre químico, peso molecular, punto de fusión y ebullición, solubilidad en agua y en varios solventes, estructura química, uso, coeficiente de reparto y propiedades espectrales, todas ellas consideradas importantes para el posterior desarrollo de métodos analíticos. También se ha llevado a cabo una revisión bibliográfica de todos los métodos analíticos disponibles para cada compuesto en polímeros, simulantes y alimentos. La bibliografía relacionada con este tema, es escasa y da más énfasis al contenido total del migrante en polímeros y a la migración en simulantes, que a la migración en alimentos. Además, los métodos analíticos disponibles están aún en fase de desarrollo, no habiendo por tanto métodos de aprobación general. Por 10 Estudio de la migración de distintos componentes de los materiales plásticos a los alimentos último, se ha verificado que algunos de los protocolos encontrados en la bibliografía no están descritos con suficiente detalle de forma que permitan su repetición en otros laboratorios. Esta es una situación común cuando una metodología analítica se encuentra en su fase inicial de desarrollo. En conclusión, actualmente, no están disponibles, protocolos analíticos para la determinación de gran mayoría de los migrantes potenciales. Para completar esta revisión se realizaron estudios preliminares para conocer experimentalmente las características de estas sustancias. Estos consistieron en el estudio de las propiedades de ultravioleta y de fluorescencia, y la posibilidad del uso de la cromatografía líquida con detector de espectroscopía de masas y de la cromatografía gaseosa. Los compuestos evaluados en el capítulo VII (State of the art of analytical strategies to evaluate different migrants from food packaging materials) han sido: estireno, bisfenol A, 1-octeno, limoneno, di-isopropilnaftaleno (DIPN), laurolactama, triacetin, tri-n-butilacetil citrato (ATBC), hidroxitolueno butilado (BHT) y triclosan. Al igual que en el capítulo anterior se ha revisado la bibliografía disponible sobre los métodos analíticos en polímeros, simulantes de alimentos y alimentos, y aunque escasa, se ha encontrado más información basada en el análisis de simulantes y polímeros que en alimentos. Se evaluaron también en el laboratorio diferentes propiedades espectroscópicas, ya que en la mayoría de los casos, estas no estaban recogidas en la bibliografía y realmente se consideran el punto de partida en el desarrollo de los métodos analíticos. En ambos capítulos se sugieren y discuten unas guías generales para la determinación de estos compuestos en alimentos teniendo en cuenta las propiedades de cada molécula. Varios métodos analíticos han sido desarrollados en el marco del proyecto “FOODMIGROSURE”. En el capítulo VIII (Determination of DPBD by LC-UV- Fluorescence in foodstuffs) se describe uno de ellos, concretamente el desarrollado para el análisis del difenilbutadieno (DPBD). 11 Resumen Este compuesto es un absorbedor de la luz ultravioleta incorporado en un amplio rango de materiales poliméricos. Su función es, una vez que ha sido añadido al material, absorber los rayos ultravioletas de la luz y cederlos como luz azul. Esta luz azul interactúa con el color amarillo y le da al material la apariencia de ser más blanco. Para poder determinar los niveles de migración en alimentos, se ha desarrollado un método analítico para determinar el DPBD en tres alimentos con propiedades físico-químicas muy diversas: zumo de naranja (alimento acuoso, ácido y con un contenido medio de hidratos de carbono), pechuga de pollo (alimento sólido con un alto contenido en proteínas) y queso gouda (alimento sólido con un alto contenido en grasa). El método analítico está basado en la cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con detectores de ultravioleta y fluorescencia, obteniéndose una buena linearidad. La determinación de este compuesto en los alimentos se ha llevado a cabo mediante la extracción con hexano y posterior cambio de solvente compatible con la técnica analítica empleada. Para la identificación positiva de esta sustancia se ha empleado la cromatografía gaseosa con detector de espectrometría de masas. Para evaluar la precisión del método se han analizado muestras de los tres alimentos conteniendo tres niveles diferentes de concentración de DPBD. Las recuperaciones obtenidas han sido satisfactorias. Se han realizado estudios con otros alimentos para evaluar la posibilidad de aplicar este mismo método. Los alimentos analizados son: compota de manzana, leche UHT, ketchup, cola, margarina, leche condensada, chocolate, pan tostado, harina, arroz y miel. No se han encontrado en ningún caso interferencias al tiempo de retención del DPBD. 12 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I I: : I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N Capítulo I variable. La celulosa tiene una estructura lineal o fibrosa, en la que se establecen múltiples puentes de hidrógeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa, haciéndolas impenetrables al agua, y originando fibras compactas que constituyen la pared de las células vegetales. Estas fibras se agrupan entre ellas en haces, y estos dan lugar a la fibra de papel. Al papel se le llama por lo general cartón cuando su densidad es mayor a los 224 g/m2 (ILSI 2004). Papel y cartón pueden ser usados en contacto con alimentos de maneras muy diversas, tanto directamente como indirectamente, y también solo o laminado con otros materiales como plásticos o papel de aluminio. Entre los varios tipos que se usan hoy en día en el envasado alimentario tenemos: ¾ Envase de papel: natural o blanqueado, recubierto o asociado con otros materiales, puede encontrarse en forma de bolsa. ¾ Envase de cartón: Se puede encontrar como cajas para productos de pastelería o como recipiente. Es el envase más utilizado en productos dirigidos directamente al consumidor, como comida congelada o como recipiente para alimentos líquidos. ¾ Cartón ondulado: Marrón o blanco, resistente a la humedad o a la compresión, estos estuches constituyen el mayor volumen de papel y cartón usado para aplicaciones en contacto con alimentos. Ha habido un significante aumento del uso de estos materiales en los últimos 50 años, debido a varias razones: es sólido y adaptable, es práctico, se recicla fácilmente y está hecho de materia renovable (ILSI 2004). I.2.2 Materiales plásticos Los materiales plásticos son compuestos macromoleculares orgánicos obtenidos por polimerización, policondensación, poliadición o algún otro proceso similar, a partir de moléculas de peso molecular inferior o por modificación química de macromoléculas naturales. En su formulación intervienen los monómeros de partida, así como otros compuestos habitualmente de bajo peso molecular que se adicionan intencionadamente como coadyudantes del proceso de fabricación, o 20 Introducción modificadores de las características del producto final; “aditivos” destinados a conseguir determinados efectos técnicos (plastificantes, antioxidantes, colorantes...). Según sus características termodinámicas, los plásticos pueden clasificarse en (Sarria Vidal 1999): 9 Termoplásticos:  Poliolefinas: como el polietileno (PE), el etileno/acetato de vinilo (E/VA), el etileno/alcohol vinílico (E/AL o VEO), el polipropileno (PP), el polibuteno (PB) y el polimetilpenteno (PMP).  Plásticos de Poliestireno: como el poliestireno (PS), el estireno/acrilonitrilo (SAN), estireno/butadieno (SB) o PS de alto impacto (HIPS) y el acrilonitrilo/butadieno/estireno (ABS).  Plásticos clorados: como el policloruro de vinilo rígido (PVC) y el policloruro de vinilideno (PVDC).  Plásticos fluorados: como el polifluoretileno o teflón (PTFE).  Plásticos tipos éster: como el politereftalato de etileno (PET) y el policarbonato (PC).  Plásticos con grupos de nitrógeno (poliamidas): Como las poliamidas alifáticas semicristalinas (PA), las poliamidas semiaromáticas cíclicas o el poliacrilonitrilo (PAN). 9 Plásticos termoestables:  Fenoplastos o plásticos fenólicos (PF).  Aminoplastos.  Resinas Poliéster.  Resinas epoxi. 9 Elastómeros 9 Plasticos de altas prestaciones Los recubrimientos son materiales plásticos que proporcionan una protección necesaria y suplementaria al material base y al producto. Estos materiales 21 Capítulo I de recubrimiento se aplican sobre una superficie formando una fina película continua, con el fin de aumentar la inercia envase-alimento. Estos recubrimientos ya se utilizaban en la prehistoria, estando compuestos en aquel momento por sustancias como grasa de animales, tierras coloreadas y carbón. Aunque esto no se corresponde con nuestra noción de un recubrimiento moderno, están basados en el mismo principio. En la mayoría de los casos, el recubrimiento se aplica directamente sobre una hojalata u otro material base antes de la formación del envase. El recubrimiento interior de las latas es muy importante porque previene la reacción de los metales con los ingredientes del alimento enlatado. El exterior de la lata es pintado para prevenir la corrosión y por razones decorativas. I.2.3 Otros El vidrio es un material duro, frágil y transparente. A pesar de comportarse como sólido, es un líquido sobreenfriado y amorfo (sin estructura cristalina). Los recipientes de vidrio se conocen desde la más remota antigüedad, y alcanzaron su gran difusión en la época del imperio romano, al difundirse las técnicas de soplado con caña, pero el uso de estos recipientes como envases, garantizando la conservación de alimentos y bebidas durante largo tiempo, y facilitando su transporte, es mucho más reciente. Los envases de primera fabricación (los que se obtienen por conformación del vidrio fundido, cuya composición básica es silicato de sodio y calcio) son los más comúnmente usados para alimentos y bebidas. El uso de cerámicas esmaltadas en envases para conservar alimentos y bebidas es infrecuente, aunque crece día a día; es muy común en cambio, su uso en vajilla para cocinar y servir, en recipientes para consumo rápido y equipamientos del más diverso tipo. A diferencia de los envases de vidrio, la composición química de los esmaltes utilizados es muy variable y se emplean variadas tecnologías para su fabricación (Catalá y Gavara, 2002). 22 Introducción I.3.- ASPECTOS LEGISLATIVOS DE LOS MATERIALES EN CONTACTO CON ALIMENTOS El contacto existente entre el envase y el alimento introduce la posibilidad de transferir constituyentes procedentes del envase a éstos. Con el fin de asegurar que este fenómeno no produzca ningún daño en la salud del consumidor, los materiales destinados a entrar en contacto con alimentos están sometidos a investigación y a legislaciones específicas. I.3.1 La legislación Europea La legislación de la Unión Europea (UE) tiene como objetivo final, la total armonización en todos los estados miembros, partiendo de las legislaciones nacionales o generando nuevas disposiciones a partir de los conocimientos científicos existentes. Las normativas son de obligado cumplimiento en todos los estados pertenecientes a la Unión Europea. La primera directiva marco sobre materiales y artículos en contacto con alimentos (89/109/CEE, actualmente derogada por el Reglamento nº 1935/2004) establecía el principio de “naturaleza inerte” de los materiales y la “pureza” de las sustancias alimenticias, diciendo que: Los materiales y artículos en contacto con alimentos no deben transferir al alimento componente alguno en cantidades tales que pudiera “perjudicar la salud humana” y/o “llevar algún cambio inaceptable en la composición del alimento o bien un deterioro en las propiedades organolépticas características”. Desde la adopción de esta directiva han surgido una serie de nuevas cuestiones que debían ser tenidas en cuenta en la legislación, así, se han realizado importantes avances tecnológicos en el ámbito del envasado de alimentos, y se ha de garantizar mejor la trazabilidad y el etiquetado de los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos. El principal objetivo del envasado de alimentos es protegerlo contra los riesgos físicos, biológicos y químicos. Tradicionalmente se han desarrollado materiales de envasado para evitar interacciones con los alimentos y en particular, para reducir al máximo la liberación de sus componentes (“migración”) en los 23 Capítulo I mismos. En consecuencia, la legislación comunitaria en vigor hasta la incorporación del nuevo reglamento marco, pedía que se aumentase al máximo la inercia de los materiales en contacto con alimentos y que se redujese al máximo la contaminación de los mismos. Los materiales de envasado no podían ocasionar modificaciones inaceptables en la composición de los alimentos o en las características organolépticas de éstos. Este sigue siendo el principio básico del actual reglamento, pero en él se han incorporado los “materiales y objetos activos en contacto con alimentos”, que a diferencia de los materiales y objetos tradicionales en contacto con alimentos, no son inertes por su diseño, y por lo tanto pueden modificar la composición o las propiedades organolépticas de los alimentos, pero únicamente si estas modificaciones cumplen la legislación vigente relativa a alimentos, como por ejemplo, la legislación de aditivos alimentarios. En la anterior directiva marco (89/109/CEE) también se establecía el principio de las listas positivas de sustancias autorizadas y de los grupos de materiales y objetos que deberían ser regulados mediante medidas específicas. También se establecían los procedimientos y los criterios que debían seguirse en la elaboración y la adopción de medidas de aplicación, incluida la evaluación de sustancias por el comité científico de la alimentación humana. El nuevo reglamento establece procedimientos más detallados para la evaluación de la seguridad y la autorización de las sustancias que deberán utilizarse en la fabricación de los materiales en contacto con alimentos. Al elaborar una lista positiva, el procedimiento propuesto en el reglamento puede resumirse de la siguiente forma: Los interesados en comercializar una nueva sustancia para un material destinado a entrar en contacto con alimentos deben solicitarlo a la autoridad competente. Esta autoridad informa a la AESA y la esta es la encargada de informar a todos los estados miembros así como a la Comisión. En un plazo definido la AESA emite un dictamen y lo hace público. En la siguiente tabla se resume la legislación al respecto, incluyendo tanto las Directivas Comunitarias derogadas como la legislación actualmente en vigor. 24 Introducción DIRECTIVAS CONTENIDO REGLAMENTO MARCO 1935/2004 Sobre los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con alimentos y por el que se derogan las Directivas 80/590/CEE y 89/109/CEE. DIRECTIVAS MARCO DEROGADAS 80/590/CEE Determinación del símbolo que puede acompañar a los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 89/109/CEE Aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros sobre los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. DIRECTIVAS ESPECÍFICAS 82/711/CEE Establece las normas de base necesarias para la verificación de la migración de los constituyentes de los materiales y objetos de materia plástica destinados a entrar en contacto con los productos alimenticios. 84/500/CEE Aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros sobre objetos de cerámica destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 85/572/CEE Determina la lista de los simulantes que se deben utilizar para controlar la migración de los componentes de los materiales y objetos de plástico destinados a entrar en contacto con los productos alimenticios. 93/8/CEE Se modifica la Directiva 82/711/CEE que establece las normas de base necesarias para la verificación de la migración de los componentes de los materiales y objetos de materia plástica destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 93/10/CEE Relativa a los materiales y objetos de película de celulosa regenerada destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 93/111/CE Se modifica la Directiva 93/10/CEE relativa a los materiales y objetos de película de celulosa regenerada destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 97/48/CE Se modifica por segunda vez la Directiva 82/711/CEE del Consejo que establece las normas de base necesarias para la verificación de la migración de los componentes de los materiales y objetos de materia plástica destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 2002/72/CE Relativa a los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 2004/14/CE Se modifica la Directiva 93/10/CEE relativa a los materiales y objetos de película de celulosa regenerada destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 2004/1/CE Se modifica la Directiva 2002/72/CE en lo relativo a la suspensión de la utilización de la azodicarbonamida como agente expansor. 2004/19/CE Se modifica la Directiva 2002/72/CE relativa a los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. Tabla I.1: Resumen de la legislación aplicable a materiales destinados a entrar en contacto con alimentos. 25 Capítulo I DIRECTIVAS CONTENIDO DIRECTIVAS DEROGADAS POR LA 2002/72/CE 90/128/CEE Relativa a los materiales y objetos plásticos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 92/39/CEE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. 93/9/CEE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. 95/3/CEE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. 96/11/CEE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. 99/91/CE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. 2001/62/CE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. 2002/17/CE Se modifica la Directiva 90/128/CEE. SUSTANCIAS ESPECÍFICAS 78/142/CEE Aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros sobre materiales y objetos que contengan cloruro de vinilo monómero, destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 80/766/CEE Relativa a la determinación de cloruro de vinilo en el producto acabado. 81/432/CEE Establece el método comunitario de análisis para el control oficial del cloruro de vinilo cedido por los materiales y objetos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 93/11/CEE Relativa a la cesión de N-nitrosaminas y de sustancias N-nitrosables por las tetinas y chupetes de elastómeros o caucho. 2002/16/CE Relativa a la utilización de derivados epoxídicos en materiales y objetos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. 2004/13/CE Por la que se modifica la Directiva 2002/16/CE relativa a la utilización de determinados derivados epoxídicos en materiales y objetos destinados a entrar en contacto con productos alimenticios. Tabla I.1 (continuación): Resumen de la legislación aplicable a materiales destinados a entrar en contacto con alimentos. I.3.2 La legislación estadounidense En los Estados Unidos, los materiales para el envasado de alimentos se clasifican generalmente como aditivos alimentarios (al igual que muchas de las sustancias añadidas intencionadamente a los alimentos), ya que pueden pasar a ser componentes de los alimentos por medio de procesos normales de difusión. Los aditivos alimentarios están sujetos a una evaluación con respecto a su inocuidad previa su comercialización. 26 Introducción Existen procesos de petición y notificación (que se aplican estrictamente a los aditivos que están en contacto con los alimentos, incluyendo los envases) estipulados por las leyes para servir como medios para la evaluación de inocuidad por parte de la FDA. La “Política de Umbral de Regulación” permite la exención de la necesidad de desarrollar una reglamentación para una sustancia para ser usada en contacto con los alimentos, cuando la exposición diaria estimada en la dieta del consumidor, con respecto al uso previsto de esta sustancia, esté por debajo del valor umbral. La “Política de Constituyentes” se aplica a las impurezas cancerígenas que estén en los aditivos alimentarios no considerados como cancerígenos en sí mismos. Aunque las leyes de los EE.UU. prohíben que cualquier sustancia considerada cancerígena cuando se consuma por humanos o animales se apruebe como aditivo alimentario, las impurezas cancerígenas se pueden valorar mediante procedimientos de evaluación cuantitativa del riesgo, siempre que el aditivo no sea cancerígeno. I.3.3 La legislación en el MERCOSUR Atendiendo al concepto de aptitud sanitaria, para la fabricación de envases y equipamientos alimentarios, sólo se permite el uso de sustancias que estén enumeradas en las llamadas listas positivas. Estas sustancias son tanto materiales básicos, como aditivos y otros componentes menores. En estas listas positivas pueden especificarse restricciones en el uso de ciertos componentes de los materiales de envasado. Estas restricciones pueden adoptar la forma de límites de composición, límites de migración específica, prohibiciones de usar determinadas sustancias para contacto con un tipo de alimentos, o autorizaciones para usar determinadas sustancias sólo en ciertos materiales de envasado. Otro factor a tener en cuenta es el límite de migración total o global, para lo cual se realizan ensayos de cesión en los que se cuantifica la cantidad total de componentes que se han transferido al simulante del alimento. Finalmente se establece que los materiales de envasado no deben modificar los caracteres sensoriales de los productos que contienen. 27 Capítulo I I.4.- LA MIGRACIÓN DE COMPONENTES DESDE EL ENVASE AL ALIMENTO De las diferentes interacciones que tienen lugar en el sistema envase/alimento/entorno, la migración de distintos componentes del material de envase alcanza una particular importancia, por su incidencia en la calidad y seguridad de los alimentos envasados. Para caracterizar el fenómeno de la migración se distingue por un lado la migración global, que se refiere a la suma de todos los componentes del envase que se transfieren al alimento y por otro la migración específica, que representa la cantidad de una sustancia concreta e identificable presente en el material que se transfiere al alimento bajo ciertas condiciones. Por este motivo en la Unión Europea, existe legislación de obligado cumplimiento, que define los límites máximos de migración global y migración específica, para envases plásticos en contacto con alimentos. Las investigaciones científicas relacionadas con la migración potencial y con el comportamiento de los materiales de envasado han demostrado que la difusión y la migración pueden ser fenómenos previsibles y en principio descritos matemáticamente. Así, si se establece un modelo de migración físico-química que pueda describir matemáticamente los procesos de migración desde los plásticos a los alimentos reales, sería de inestimable utilidad: Como una única herramienta para estimar la exposición del consumidor, en cuanto a la migración dentro del marco convencional de condiciones del sistema de regulación alimentaria de la Unión Europea, aplicando el peor caso posible de exposición. Junto con los datos estadísticos obtenidos del consumo alimentario y de los estudios de envases plásticos alimentarios para estimar una real, o peor caso posible, exposición del consumidor en cualquier situación. Se lograría a través de la flexibilidad del cálculo de la proporción de la migración en cualquier alimento, desde cualquier plástico, en contacto en cualquier condición. 28 Objetivos I.5.- OBJETIVOS 1.- Desarrollar un método multirresiduo basado en HPLC-FL, para la separación y cuantificación de BADGE, BFDGE, sus derivados y oligómeros del BADGE y NOGE en simulantes de alimentos que permita evaluar la conformidad del recubrimiento con la legislación europea. 2.-Desarrollo de un método analítico basado en HPLC-MS, para identificar y cuantificar los derivados del BADGE procedentes de recubrimientos epoxi empleados en envases alimentarios. 3.-Aplicar y optimizar el método cromatográfico anterior para identificar y cuantificar BFDGE, sus derivados y NOGEs de peso molecular mayor. 4.-Cuantificar la migración de BADGE y BFDGE en muestras reales e identificar otros derivados, mediante la aplicación de los métodos cromatográficos anteriormente optimizados. 5.- Realizar una extensa revisión bibliográfica de las propiedades físicas y químicas de 18 compuestos seleccionados por el proyecto FOODMIGROSURE. Llevar a cabo además, una revisión bibliográfica de todos los métodos analíticos disponibles para cada compuesto en polímeros, simulantes y alimentos. 6.- Desarrollar un método analítico basado en cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa con detectores de ultravioleta y fluorescencia para determinación de los niveles de migración del difenilbutadieno en tres alimentos con propiedades físico-químicas muy diversas: zumo de naranja, pechuga de pollo y queso gouda. 29 Publicado en: Chromatographia, 2003, 58 (5/6) 337-342. Presentado como póster en: First International Symposium in Separation and characterization of Natural and Synthetic Macromolecules, Ámsterdam, Holanda, 5-7 de febrero, 2003. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II I: : D DE ET TE ER RM MI IN NA AT TI IO ON N O OF F C CO OM MP PO OU UN ND DS S F FR RO OM M E EP PO OX XY Y R RE ES SI IN NS S I IN N F FO OO OD D S SI IM MU UL LA AN NT TS S B BY Y H HP PL LC C- - F FL LU UO OR RE ES SC CE EN NC CE E Determination of compounds from epoxy resins in food simulants by HPLC-fluorescence ABSTRACT A fluorimetric-detection RP-HPLC method is developed for the separation and quantification of bisphenol A diglycidyl ether (BADGE), bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE), its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives, and NOGE and BADGE oligomers. This method was applied to test an epoxy resin used as a coating for food contact packaging materials with two different heat treatments in the curing process. Migration of these compounds was evaluated in three food simulants: 3% (w/v) acetic acid, 10% (v/v) ethanol, rectified olive oil and also in acetonitrile. A simple extraction procedure was also applied to obtain olive oil extracts. Quantification was performed by using external calibration, and correlation coefficients were greater than 0,996 and the limit of detection (LOD) was 0.02 mg L-1 for all substances. HPLC-MS method was applied to confirm derivatives and oligomers identity. KEYWORDS HPLC-Fluorescence, bisphenol A diglycidyl ether (BADGE) and derivatives, bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE) and derivatives, NOGE and BADGE oligomers, epoxy resins. 39 Capítulo II II.1.- INTRODUCTION Epoxy resins are used as internal surface coating for food cans (sea products, vegetables, beer, soft drinks, powder milk), big storage vessels (wine, water) and for various types of food containers. The success of these epoxy formulations as coatings is due to its desirable flavour-retaining characteristics, its excellent chemical resistance, and its outstanding mechanical properties. Main resins used are Bisphenol A epoxy resins and/or Epoxy Novolacs resins; both are a complex mixture of chemical species and the chemical expression that better defines these oligomeric series are shown in Figure II.1. This figure also show the eight compounds of a molecular weight less than 1000 Da. Bisphenol A epoxy resins are mainly condensation products of Bisphenol A with epichlorhydrin and Epoxy Novolacs are made by condensing formaldehyde with phenol, followed by epoxidation [1]. They are starting substances used to manufacture surface coatings. If reaction process or cure conditions were not applied in a proper way, and/or finished coating is not correctly crosslinked, components of Bisphenol A epoxy resins or Epoxy Novolacs resins and its reaction products could migrate to food [2]. Recently, many articles have reported the safety of the use of BADGE (Bisphenol A diglycidyl ether), BFDGE (Bisphenol F diglycidyl ether), NOGE (Novolac glycidyl ethers) and its derivatives in materials in contact with foodstuffs. This interest have also been noted in European Legislation; for this reason Directive 2002/16/CE [3] establishes that the sum of the migration levels of BADGE, BADGE.H2O, BADGE.HCl, BADGE.2HCl, BADGE.H O.HCl and BADGE.2H 2 2O shall not exceed the limit of 1 mg Kg-1 -2 in foodstuffs or in food simulants (or 1 mg 6 dm in the material tested [4]). The same specific migration limit is established for BFDGE and its respective derivatives (Figure II.2). Concerning to the use of NOGE (Figure II.1), the quantity of its components shall not be detectable in food contact materials at the detection limit of 0.2 mg 6 dm-², since March 2003 [3]. Furthermore of migration of above mentioned compounds, it is also possible the migration into food of unknown and potentially toxic substances. This problem has been reported by some researchers who show chromatograms with unidentified components after migration assays in food simulants [5, 6] or in food products [7, 8]. Analytical problems increase when these compounds react with food components [9], due to its identification becomes more difficult still. 40 Determination of compounds from epoxy resins in food simulants by HPLC-fluorescence Figure II.1: Compounds of low Molecular Weight in BADGE / NOGE series. Additionally, quantification of NOGE is not easy because of the high number of components [10]. Apart from that, migration processes depend on many factors and some authors have studied kinetics migration of BADGE resins in aqueous food simulants [11, 12] and olive oil [13]. Usually, food industries purchase the packaging material already coated with these resins and they do not know exactly the epoxy coatings composition. So, it is convenient to develop methods to analyse migrant compounds and therefore to guarantee the compliance of epoxy resins based coatings with food packaging European Legislation. 41 Capítulo II O CH3 OO CH3O BADGE OCH3 OO CH3 Cl OH BADGE.HCl OCH3 OO CH3 OH OH BADGE.H2O Cl OH CH3 OO CH3 Cl OH BADGE.2HCl Cl OH CH3 OO CH3 OH OH BADGE.H2O.HCl OH OH CH3 OO CH3 OH OH Figure II.2: Chemical structures of BADGE, p,p-BFDGE and its derivatives. O O O O H H OO O H H Cl OH OO O H H OH OH OO H H Cl Cl OH OH OO H H Cl OHOH OH OO H H OH OHOH OH BADGE.2H2O BFDGE BFDGE.HCl BFDGE.H2O BFDGE.2HCl BFDGE.H2O.HCl BFDGE.2H2O 42 Determination of compounds from epoxy resins in food simulants by HPLC-fluorescence II.2.- EXPERIMENTAL II.2.1 Reagents Acetonitrile was HPLC grade and the other solvents used (ethanol, acetic acid and tetrahydrofuran) were analytical grade. All were supplied by Merck (Darmstadt, Germany) and purified water was obtained from a Milli-Q water purification system (Millipore, Bedford, MA, USA). Rectified olive oil was used as a fatty food simulant. Standards of Bisphenol A diglycidyl ether (BADGE, CAS: 1675- 54-3, (≥97%)) and Bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE, CAS: 2095-03-6, (total of three isomers (≥97%): ortho-ortho, para-para, ortho-para) were purchased from Fluka Chemie AG (Buchts, Switzerland). Poly (phenyl glycidyl ether)-co-formaldehyde (NOGE, Average M ca. 605) and Poly (Bisphenol A -co- epichlorohydrin) glycidyl end-capped (BADGE oligomers, Average M ca. 1075) were from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany). II.2.2 Standards Two different stock solutions of BADGE and BFDGE containing 1000 mg L-1 were prepared in tetrahydrofuran. In the same way, NOGE and BADGE oligomers were dissolved in tetrahydrofuran at a concentration of 1000 mg L-1 respectively. Intermediate standards solutions were prepared by dissolving appropriate amounts of all compounds in 90% (v/v) acetonitrile to yield a concentration of 1 mg L-1. O and BADGE.2H Hydrolysis products, BADGE.H2 2O were obtained by dissolution of 1 mL of BADGE stock solution in 50 mL of water and storing this flask for 2 hours at 60ºC. Chlorohydrins of BADGE were obtained by adding to 5 mL of the stock solution 0.25 mL of HCl 0.05N. After 20 min, an intermediate solution was prepared by filling to the mark with 250 mL of 90% acetonitrile. This intermediate solution contains a mixture of BADGE, BADGE.HCl and BADGE.2HCl. The hydrolysis product of BADGE chlorohydrin (BADGE.H2O.HCl) was obtained by dissolving 5 mL of chlorohydrins stock solutions in 250 mL of water and storing this solution for 2 hours at 60ºC. Hence, all BADGE derivatives were prepared. 43 Capítulo II The same procedure was followed to obtain all BFDGE derivatives (BFDGE.H O, BFDGE.HCl, BFDGE.2H O, BADGE.H O.HCl and BFDGE.2HCl). 2 2 2 Hydrolysis and chlorohydrins compounds obtained from BADGE and p,p- BFDGE are shown in Figure II.1. II.2.3 Apparatus and conditions Chromatographic measurements were performed with a Hewlett Packard (Waldbronn, Germany) system comprised of a HP1100 liquid chromatograph fitted with a quaternary pump, an autosampler, a column oven, a fluorescence array detector and HP Chemstation data analysis software (version A.06.01). A Kromasil 100 C18 column (5µm i.d., 150mm x 40mm) from Teknokroma (Barcelona, Spain) was used for the separation. Chromatographic conditions were developed in a previous article [5]. The mobile phase consisted of acetonitrile/water 30:70 (v/v) in an isocratic mode for two minutes, followed by a gradient to 80% acetonitrile for eighteen min, another gradient to 100% acetonitrile for three min and finally an isocratic elution during seven min. The flow rate was 1 mL min-1. The injection volume was 50 µL. The column oven temperature was kept at room temperature. Fluorescence detection was performed with excitation and emission wavelengths of 225 nm and 305 nm, respectively. Identification of selected compounds was carried out using a mass spectrometer (VG Platform II, Fisons) in positive mode by atmospheric pressure chemical ionisation (APCI). The following instrument parameters were applied: probe temperature: 500 ºC, ionisation source temperature: 130 ºC, cone voltage: 30 V, electron multiplier voltage: 700 V, sheath gas nitrogen at 200 L h-1 and drying gas nitrogen at 250 L h-1. II.2.4 Test samples The polymer coating tested was an epoxy paint intended to use as a coating into foodstuffs. Glass discs, each with an area of 1.22 dm2, were painted with the polymer coating on two sides. All of them were curing for 24 h at room temperature. Several of them were also subjected to a post curing treatment for 1 h at 100ºC. 44 Determination of compounds from epoxy resins in food simulants by HPLC-fluorescence II.2.5 Analysis of samples All discs painted were immersed in 100 mL of each aqueous simulant (3% (w/v) acetic acid and 10% (v/v) ethanol) and in 100 g of fatty simulant (rectified olive oil) into hermetic glass cells. All of them were sterilized for 30 min at 121ºC following migration assays conditions described in European Legislation [14]. Alternative analysis were carried out by immersing painted discs in 100 mL of 90% acetonitrile in hermetic glass cells maintained at 40ºC for 24 h. All migration tests were performed by duplicate. Aqueous simulants (3% (w/v) acetic acid and 10% (v/v) ethanol) and 90% acetonitrile extracts were filtered through a PTFE 0.45 µm 13 mm syringe filter, and injected into the chromatograph. Olive oil simulant was extracted according to the procedure described in a previous work [15]: 5 mL of heptane were added to 5 g of olive oil and mixed. Then, 10 mL of 90% acetonitrile were added and the mixture was shaken vigorously for 1 min and subsequently was centrifuged for 5 min at 1500 rpm. Acetonitrile phase was taken up, filtered through a PTFE 0.45 µm 13 mm syringe filter and injected. II.3.- RESULTS AND DISCUSSION Chromatographic protocol [5] has been prolonged in 5 min in order to improve the separation of substances with a higher molecular weight (e.g. NOGE and BADGE oligomers). This method has been successfully applied for the separation of Bisphenol A epoxy resins, NOGE and its derivatives as is shown in Figure II.3. As individual standards of NOGE and BADGE oligomers (n≥1) are not commercially available, two different calibration lines of BFDGE and BADGE were used to quantify NOGE and BADGE oligomers, respectively. These calibration lines were constructed using BADGE and BFDGE (pure standards) and had correlation coefficients (r) greater than 0.996. The concentration of BFDGE was calculated as the sum of its three isomers. To quantify all BADGE and BFDGE derivatives a similar procedure was followed. Hence, results were expressed in BADGE for all BADGE 45 Capítulo II REFERENCES [1] Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. Volume A22. Arpe, H.-J., Ed, New York, 1996. [2] Simal Gándara, J.; Paz Abuín, S.; Ahrné, L. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1998, 38 (8), 675-688. [3] EU, Commission of the European Communities 2002/16/EC; Off. J. Eur. Commun. 2002, L51/27. [4] EU, Commission of the European Communities 2002/72/EC; Off. J. Eur. Commun. 2002, L220/18. [5] Paseiro Losada, P.; Pérez Lamela, C.; López Fabal, M.F.; Sanmartín Fenollera, P.; Simal Lozano, J. J. Agr. Food Chem. 1997, 45, 3493-3500. [6] Paseiro Losada, P.; López Fabal, M.F.; Pérez Lamela, C.; Sanmartín Fenollera, P.; Paz Abuín, S. Ciencia y Tecnología Alimentaria 1999, 2 (4), 202- 209. [7] Theobald, A.; Simoneau, C.; Roncari, P.; Roncari, A.; Anklam, E. Deut. Lebensm-Rundsch. 1999, 95 (5), 186-191. [8] Simoneau, C.; Theobald, A.; Hannaert, P.; Roncari, P.; Roncari, A.; Rudolph, T.; Anklam, E. Food Addit. Contam. 1999, 16 (5), 189-195. [9] Berger, U.; Oehme, M.; Girardin, L. Fresen. J Anal. Chem. 2001, 369, 115-123. [10] Wagner, C.; Grob, K.; Biedermann, M. Mitt. Lebensm. Hyg. 2000, 91, 146-157. [11] Paseiro Losada, P.; Simal-Lozano, J.; Paz Abuín, S.; López Mahía, P.; Simal Gándara, J. J. Anal. Chem. 1993, 345, 527-532. [12] Philo, M.R.; Damant, A.P.; Castle, L. Food Addit. Contam. 1997, 14 (1), 75-82. [13] Simoneau, C.; Theobald, A.; Roncari, P.; Hannaert, P.; Anklam, E. Food Addit. Contam. 2002, 19 (suppl), 73-78. [14] EU, Commission of the European Communities 82/711/EEC; Off. J. Eur. Commun. 1982, L297/26 (and amendments). [15] Cortizas Castro, D. Doctoral Thesis. University of Santiago de Compostela. 1999. 52 Determination of compounds from epoxy resins in food simulants by HPLC-fluorescence [16] Rauter, W.; Dickinger, G.; Zihlarz, R.; Lintschinger, J. Z. Lebensm. Unters. Forsch. A 1999, 208, 208-211. [17] Pérez Lamela, C.; Paseiro Losada, P.; Cortizas Castro, D.; Rodríguez Hergueta, A.; Simal Lozano, J. Int. J. Anal. Chem. 2002, 82 (3), 123-132. [18] Biedermann, M.; Bronz, M.; Bürchler, B.; Grob, K.; Keller, F.; Neukom, H. P.; Richard, N.; Spinner C. Mitt. Lebensm. Hyg. 1999, 90 (2), 177-194. [19] Biedermann, M.; Bronz, M.; Bürchler, B.; Grob, K.; Keller, F.; Neukom, H. P.; Richard, N.; Spinner C. Mitt. Lebensm. Hyg. 1999, 90 (2), 195-210. [20] Berger, U.; Oehme, M. J AOAC Int. 2000, 83 (6), 1367-1376. 53 Publicado en: Journal of Chromatography A, 2004, 1032 (1/2) 37-43. Presentado como póster en: 27th International Symposium on High Performance Liquid Phase Separation and Related Techniques. Niza, Francia, 15-19 de junio, 2003. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I II II I: : D DE ET TE ER RM MI IN NA AT TI IO ON N O OF F B BI IS SP PH HE EN NO OL L A A D DI IG GL LY YC CI ID DY YL L E ET TH HE ER R A AN ND D I IT TS S H HY YD DR RO OL LY YS SI IS S A AN ND D C CH HL LO OR RO OH HY YD DR RO OX XY Y D DE ER RI IV VA AT TI IV VE ES S B BY Y L LI IQ QU UI ID D C CH HR RO OM MA AT TO OG GR RA AP PH HY Y- -M MA AS SS S S SP PE EC CT TR RO OM ME ET TR RY Y Determination of BADGE and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives by LC-MS ABSTRACT European Legislation establishes that the sum of the migration levels of bisphenol A diglycidyl ether (BADGE), its hydrolysis (BADGE.H2O and BADGE.2H2O) and chlorohydroxy (BADGE.HCl, BADGE.2HCl and BADGE.H2O.HCl) derivatives shall not exceed the limit of 1 mg/Kg in foodstuffs or food simulants. A reversed phase high performance liquid chromatographic method combined with mass spectrometry detection (HPLC-MS) using the atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) is developed for the separation, quantification and identification of the interesting compounds. Quantification of the analytes was carried out in the single ion recording mode (SIR), once their characteristic masses were selected from their full spectra, by using an external calibration. The optimised method was suitable for the migration evaluation of these compounds in different samples. KEYWORDS HPLC-MS; Bisphenol A diglycidyl ether (BADGE); Hydrolysis products; Chlorohydroxy derivatives. 57 Capítulo III III.1.- INTRODUCTION Epoxy resins are used to make internal surface coatings for food cans (sea products, vegetables, beer, soft drinks, powder milk), big storage vessels (wine, water) and various types of food containers. Bisphenol A epoxy resins are mainly condensation products of Bisphenol A with epichlorhydrin [1]. If the reaction process or cure conditions were not applied in a proper way, and finished coating is not correctly crosslinked, components of Bisphenol A epoxy resins and reaction products formed could migrate to food [2], and in some cases react with food components giving new compounds. Recent studies about the toxicity of these compounds [3-5], have demonstrated that the genotoxic effect of bisphenol A diglycidyl ether (BADGE) was stronger than the genotoxic effect of BADGE.H2O and BADGE.2H2O. Regarding BADGE.HCl, its genotoxic effect was comparable to those obtained to BADGE.H2O. These studies support the hypothesis that the degree of toxicity of epoxy compounds depends mainly of the concentration of unreacted epoxy groups, although the case of BADGE.2HCl is different because it does not present any epoxy group, but its genotoxicity is probably due to the presence of Cl groups. BADGE can also be used in organosols in order to remove hydrochloric acid, which results in formation of BADGE.HCl, BADGE.2HCl and BADGE.H2O.HCl [6]. BADGE may easily hydrolyse in contact with aqueous and acidic food forming BADGE.H2O and BADGE.2H2O [7] (Figure III.1). European Legislation establishes that the sum of the migration levels of BADGE, its hydrolysis (BADGE.H2O and BADGE.2H2O) and chlorohydroxy (BADGE.HCl, BADGE.2HCl and BADGE.H2O.HCl) derivatives shall not exceed the limit of 1 mg/Kg in foodstuffs or in food simulants or 1 mg/6dm2 in the material tested (conventional conversion factor that expresses the relationship between the surface area of materials and the quantity of foodstuffs in contact therewith [8,9]). The most widely used techniques for the analysis of BADGE are normal and reverse phase high performance liquid chromatography (NPLC and RP-HPLC) with fluorescence detection [10-18], as well as its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives [12,16,19-21]. Several researches have applied gas chromatography (GC) coupled with mass spectrometry detection to determine these compounds [22- 58 Determination of BADGE and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives by LC-MS 25]. Most of the times this technique was used just to confirm positively the presence of these compounds after HPLC quantification with fluorescence detection [11,14,21,26]. O CH3 OO CH3 O OCH3 OO CH3 Cl OH OCH3 OO CH3 OH OH Cl OH CH3 OO CH3 Cl OH Cl OH CH3 OO CH3 OH OH OH OH CH3 OO CH3 OH OH BADGE BADGE.HCl BADGE.H 2 O BADGE.2HCl BADGE.H 2 O.HCl BADGE.2H 2 O Figure III.1: Chemical structures of BADGE and its derivatives. Some works are focused on the identification of these substances and other oligomers of higher molecular weight using HPLC with detection by atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) [27-30], thermospray mass 59 Capítulo III spectrometry (TSP) [31] and electrospray ionisation (ESI) [29,32]. The characterization of BADGE hydrolysis products has also been described by other authors [33]. Very few works are focused on the quantification using an HPLC-MS technique [34], but this last case is limited to BADGE and BADGE.2H2O. The objective of this work is to develop a method that allows both, the quantification and positive identification of BADGE and its derivatives using an RPHPLC-MS technique (APCI), after its majority characteristic masses were selected. This will facilitate the migration studies in complex food or in food simulants, once this way possible interferences are minimized. III.2.- EXPERIMENTAL III.2.1. Chemicals and reagents Acetonitrile was HPLC grade, supplied by Merck (Darmstadt, Germany) and ultrapure water was prepared using a Milli-Q filter system (Millipore, Bedford, MA, USA). Standards of Bisphenol A diglycidyl ether (BADGE, CAS No. [1675-54-3], (≥97%)), Bisphenol A (2,3-dihydroxypropyl) glycidyl ether (BADGE.H2O, CAS No. [76002-91-0], (≥97%)), Bisphenol A bis(2,3-dihydroxypropyl) ether (BADGE.2H2O, CAS No. [5581-32-8], (≥97%)), Bisphenol A (3-chloro-2-hydroxypropyl) glycidyl ether (BADGE.HCl, CAS No. [13836-48-1], (≈95%)), Bisphenol A bis(3-chloro-2- hydroxypropyl) ether (BADGE.2HCl, CAS No. [4809-35-2], (≥99%)) and Bisphenol A (3-chloro-2-hydroxypropyl) (2,3-dihydroxypropyl) ether (BADGE.H2O.HCl, CAS No. [227947-06-0], (≥98%)) were all purchased from Fluka Chemie AG (Buchts, Switzerland). Individual stock solutions of all compounds containing 1000 mg/l, were prepared in acetonitrile and were kept at -20ºC. Intermediate standards solutions in 90% (v/v) acetonitrile and water were prepared by dissolving appropriate amounts of all compounds to yield a concentration of 10 mg/l. Calibration solutions in water and 90% (v/v) acetonitrile were prepared from these intermediate solutions. Intermediate solutions in 90% acetonitrile were kept at 4ºC and intermediate solutions in water were kept at -20ºC. 60 Determination of BADGE and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives by LC-MS III.2.2. Equipment The HPLC–MS system comprised a Spectra-Physics Series P200 liquid chromatograph equipped with a 50μl injection loop Rheodyne, and a Fisons VG Platform mass detector (VG Biotech, Altrincham, UK), controlled by VG Mass Lynx software (all from SP Thermo Separation Products, Altrincham, UK). The column was a Kromasil 100 C 18 (15 × 0.4 cm I.D., 5μm particle size) (Teknokroma, Barcelona, Spain). III.2.3. Chromatographic conditions Elution conditions were developed in a previous article [16]. The mobile phase was acetonitrile-water 30:70 (v/v) in an isocratic mode for two min, followed by a gradient to 80% acetonitrile for eighteen min, another gradient to 100% acetonitrile for three min and finally an isocratic elution during seven min. The flow rate was 1.0 ml/min. Detector settings: positive or negative atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) mode, probe temperature 500ºC, ionisation source temperature 130ºC, cone voltage +30 or -30 V, electron multiplier voltage 700 V, drying gas nitrogen at 425 l/h, APCI sheet gas nitrogen at 175 l/h, full-scan mode detection range m/z 100–500 and selected ion recording (SIR) (Table III.1). APCI (+) APCI (-) Analyte Selected Ion (+ m/z) Other ions Selected Ion (- m/z) Other ions BADGE 382a191 BADGE.HCl 418a382 BADGE.2HCl 382*191 BADGE.H2O 400a209 BADGE.H2O.HCl 393b283,227 BADGE.2H2O 375b301,227 a Fragment corresponding to [M+CH3CNH]+ b Fragment corresponding to [M-H]- * Unknown fragment Table III.1: Selected ions for quantification. 61 Capítulo III A B C Figure III.3: MS chromatograms in APCI (+) of BADGE.HCl (A), BADGE.H2O (B) and BADGE (tR: 17.3) and BADGE.2HCl (tR: 16.0) (C) at a concentration of 0.8 mg/l. A B Figure III.4: MS chromatograms in APCI (-) of BADGE.H2O.HCl (A) and BADGE.2H2O (B) at a concentration of 0.8 mg/l. 68 Determination of BADGE and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives by LC-MS In conclusion, the developed method is appropriate for the simultaneous analysis of all these compounds in acetonitrile extracts and in water (official food imulant). This procedure is also a powerful technique that allows the positive confirmation of the presence of these compounds, not being necessary another technique s for its quantification. 69 Capítulo III REFERENCES [1] Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. Volume A18. Ed. Hans-Jürgen Arpe, New York, 1996. [2] J. Simal-Gándara, S. Paz-Abuín, L. Ahrné, Crit. Rev. Food Sci. Nut. 38 (1998) 675. [3] S. Suarez, R. A. Sueiro, J. Garrido, Mutation Research, 470 (2000) 221. [4] R. A. Sueiro, M. Araujo, S. Suarez, J. Garrido, Mutagenesis, 16 (2001) 303. [5] H. Nakazawa, A. Yamaguchi, K. Ionue, T. Yamazaki, K. Kato, Y. Yoshimura, T. Makino, Food Chem. Toxic. 40 (2002) 1827. [6] L. Hammarling, H. Gustavsson, K. Svensson, A. Oskarsson, Food Addit. Contam. 17 (2000) 937. [7] P. Paseiro-Losada, J. Simal-Lozano, S. Paz-Abuín, P. Lopez-Mahia, J. Simal Gándara, J. Anal. Chem. 345 (1993) 527. [8] EU, Commision or the European Communities 2002/16/EC, Off. J. Eur. Commun. L51 (2002) 27. [9] EU, Commision or the European Communities 2002/72/EC, Off. J. Eur. Commun. L220 (2002) 18. [10] M. Sharman, C. A. Honeybone, S. M. Jickells, L. Castle, Food Addit. Contam. 12 (1995) 779. [11] M. Biedermann, M. Bronz, B. Bürchler, K. Grob, F. Keller, H.P. Neukom, N. Richard, C. Spinner, Mitt. Lebensm. Hyg. 90 (1999) 177. [12] W. Rauter, G. Dickinger, R. Zihlarz, J. Lintschinger, Z Lebensm. Unters. Forsch. A 208 (1999) 208. [13] W. Summerfield, A. Goodson, I. Cooper, Food Addit. Contam. 15 (1998) 818. [14] C. Simoneau, A. Theobald, P. Hannaert, P. Roncari, A. Roncari, T. Rudolph, E. Anklam, Food Addit. Contam. 16 (1999) 189. [15] P. Paseiro-Losada, P. López-Mahia, L. Vazquez-Odériz, J. Simal-Lozano, J. Simal-Gándara, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 74 (1991) 925. 70 Determination of BADGE and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives by LC-MS [16] P. Paseiro-Losada, C. Pérez-Lamela, M. F. López-Fabal, P. Sanmartín- Fenollera, J. Simal-Lozano, J. Agric. Food Chem. 45 (1997) 3493. [17] J. Lintschinger, W. Rauter, Eur. Food Res. Technol. 211 (2000) 211. [18] C. Nerín, M. R. Philo, J. Salafranca, L. Castle, J. Chromatogr. A 963 (2002) 375. [19] M. Biedermann, M. Bronz, K. Grob, H. Gfeller, J. P. Schmid, Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 88 (1997) 277. [20] S. Cottier, A. Feigenbaun, P. Mortreuil, A. Reyner, P. Dole, A. M. Riquet, J Agric. Food Chem. 46 (1998) 5254. [21] Y. Uematsu, K. Hirata, K. Suzuki, K. Iida, K. Saito, Food Addit. Contam. 18 (2001) 177. [22] M. Bierdermann, K. Grob, P. Bobler, H. R. Widmer, Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg., 89 (1998) 529. [23] J. Salafranca, R. Batle, C. Nerín, J. Chromatogr. A, 864 (1999) 137. [24] C. Brede, I. Skjvrak, H. Herikstad, E. Anensen, R. Austvoll, T. Hemmingsen, Food Addit. Contam. 19 (2002) 483. [25] J. L. Vilchez, A. Zafra, A. Gonzalez-Casado, E. Hontoria, M.del Olmo, Anal. Chim. Acta 431 (2001) 31. [26] A. Theobald, C. Simoneau, A. Roncari, E. Anklam, Dtsch. Lebensm.-Rundsch. 98 (2002) 249. [27] U. Berger, M. Ochme, J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 83 (2000) 1367. [28] U. Berger, M. Ochme, L. Girardin, Fresenius J. Anal. Chem. 369 (2001) 115. [29] U. Fuchslueguer, K. Rissler, H. Stephan, H. J. Grether, M. Grasserbauer, J. Appli. Polym. Sci. 72 (1999) 913. [30] M.R. Philo, A.P. Damant, L. Castle, Food Addit. Contam. 14 (1997) 75. [31] J. Simal Gándara, S. Paz Abuín, P. López Mahía, P. Paseiro Losada, J. Simal Lozano, Chromatographia 34 (1992) 67. [32] S. Cottier, A. M Riquet, A. Feigenbaun, B. Pollet, C. Lapierre, P. Mortreuil, J. Chromatogr. A 771 (1997) 366. 71 Capítulo III [33] C. Pérez Lamela, P. Paseiro Losada, D. Cortizas Castro, A. Rodríguez Hergueta, J. Simal Lozano, Int. J. Anal. Chem. 82 (2002) 123. [34] K. Inoue, A. Yamaguchi, M. Wada, Y. Yoshimura, T. Makino, H. Nakazawa, J. Chromatogr. B 765 (2001) 121. [35] J. Velisek, M. Dolezal, C. Crews, T. Dvorak, Czech J. Food Sci. 20 (2002) 161. [36] American Chemical Society (ACS), Subcommite of Environmental Analytical Chemistry, Anal. Chem 52 (1980) 2242. 72 Enviado para su publicación Presentado como póster en: 8th International Symposium on Hyphenated Techniques in Chromatography and Hyphenated Chromatographic Analyzers. Brujas, Bélgica, 4-6 de febrero, 2004. C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O I IV V: : D DE ET TE ER RM MI IN NA AT TI IO ON N O OF F B BI IS SP PH HE EN NO OL L F F D DI IG GL LY YC CI ID DY YL L E ET TH HE ER R A AN ND D I IT TS S R RE EL LA AT TE ED D C CO OM MP PO OU UN ND DS S B BY Y H HI IG GH H P PE ER RF FO OR RM MA AN NC CE E L LI IQ QU UI ID D C CH HR RO OM MA AT TO OG GR RA AP PH HY Y- -M MA AS SS S S SP PE EC CT TR RO OM ME ET TR RY Y Determination of BFDGE and its related compounds by HPLC-MS ABSTRACT A reversed phase high performance liquid chromatographic method combined with mass spectrometry detection (HPLC-MS) using atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) is developed for the separation, quantification and identification of bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE) and other derivatives (epoxy and chlorohydroxy related compounds). These compounds are employed in formulations intended to be used to cover inner surfaces of food cans. Quantification of the analytes was carried out in the single ion recording mode (SIR), once their characteristic masses were selected from their full spectra, by using an external calibration. Novolac glycidyl ether (NOGE) oligomers can be also identified by this method. KEYWORDS Bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE); Novolac glycidyl ethers (NOGE), food can coatings, HPLC-MS. 75 Capítulo IV IV.1.- INTRODUCTION The internal surface of food cans and other types of food containers are usually coated with an epoxy resin. One type of these resins are epoxy novolac formulations which are made by condensing formaldehyde with phenolic substances in an acid medium, followed by epoxidation [1]. NOGEs (Novolac glycidyl ethers) are complex mixtures of two or more aromatic rings and therefore with a variable weight composition. Bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE) is the lowest molecular weight component of NOGE series and moreover, there are other oligomers of various means of molecular weights [2]. BFDGE and NOGE are often confused. The technical product used for food can coatings is NOGE (Figure VI.1). n Name Mw 0 BFDGE 312.4 1 NOGE 3 rings 474.5 2 NOGE 4 rings 636.7 3 NOGE 5 rings 798.4 4 NOGE 6 rings 961.1 Figure IV.1: Compounds of low molecular weight in NOGE series. NOGE has been also used as additive to polyvinyl based dispersions (organosols) containing mainly polyvinyl chloride and vinyl acetate as monomers [3]. In these materials they serve as scavengers for the hydrochloric acid formed during the heat treatment of the coating procedure, which results in formation of chlorohydroxy derivatives. If it is added only as an additive and therefore not crosslinked in the finished coating, it can more easily migrate into food matrix and may easily hydrolyse in contact with aqueous and acidic food. 76 Determination of BFDGE and its related compounds by HPLC-MS European Legislation related on the use of certain epoxy derivatives as food contact materials establishes that the sum of the migration levels of BFDGE, and its hydrolysis and chlorohydroxy derivatives (Figure IV.2) shall not exceed the limit of 1 mg/kg in foodstuffs or in food simulants [4, 5] or 1 mg/6dm2 in the material tested [6], (conventional conversion factor that expresses the relationship between the surface area of materials and the quantity of foodstuffs in contact therewith). Concerning to the use of NOGE for food contact materials, it establishes since March 2003, the quantity of NOGE components with more than two aromatic rings and at least one epoxy group, as well as their derivatives containing chlorohydrin functions and having a molecular mass less than 1000 Daltons, should not be detectable at levels higher than 0.2 mg/6dm2. 77 O O O O H H OO O H H OH OH O Cl O O H H OH OO H H OH HO HO OH O Cl O Cl H H HO OH O Cl O OH H H HO OH H2O H2O H2O HCl HCl A B D C E F Figure IV.2: Chemical structures of A: p,p bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE, Mw: 312,36); B: p,p bisphenol F (2,3-dihydroxypropyl) glycidyl ether (BFDGE.H2O, Mw: 330,37); C: p,p bisphenol F (3-chloro-2-hydroxypropyl) glycidyl ether (BFDGE.HCl, Mw: 348,82); D: p,p bisphenol F bis(2,3-dihydroxypropyl) ether (BFDGE.2H2O, Mw: 348,39); E: p,p bisphenol F bis(3-chloro-2-hydroxypropyl) ether (BFDGE.2HCl, Mw: 385,28); F: p,p bisphenol F (3-chloro-2-hydroxypropyl) (2,3-dihydroxypropyl) ether (BFDGE.H2O.HCl, Mw: 366,84). Capítulo IV In case of the intermediate derivatives, as BFDGE.H2O, the fragment corresponding to the cluster [M+CH + CNH] 3 was selected to identify it due to its selectivity comparing with the other fragments observed (Table IV.1, Figure IV.4 C). 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 100 % 15.26 15.42 0 100 % 14.73 15.21 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 100 % 15.05 15.42 0 100 % BFDGE039 2SIR f4Ch l 15.42 15.05 BFDGE.HCl BFDGE BFDGE BFDGE.H2O BFDGE A D C B Figure IV.4: MS chromatograms using APCI (+) of a mixture of BFDGE.HCl and BFDGE (A and B) using m/z 390 and 354 respectively; and a mixture of BFDGE.H2O and BFDGE (C and D) using m/z 372 and 354 respectively, at a concentration of 20 mg/L (expressed as the sum of all derivatives). 84 Determination of BFDGE and its related compounds by HPLC-MS For BFDGE.H2O.HCl, APCI (-) was chosen, and the more characteristic fragment observed was [M-H]- (Table IV.1, Figure IV.5 B). Ionization of BFDGE.HCl has showed an m/z ion that was not identified (Figure IV.4 A). Similar difficulty was found in the analysis of BADGE and its related compounds employing the same technique [23]. Figure IV.5: MS chromatograms using APCI (-) of a mixture of BFDGE.2HCl (A), BFDGE.H As has been explained before, the 2-ring product of NOGE is bisphenol F diglycidyl ysis, the chromatographic separation of the individual compone 2O.HCl (B) and BFDGE.2H2O (C) using m/z 383+385, 365 and 347 respectively, at a concentration of 20 mg/L (expressed as the sum of all derivatives). ether (BFDGE). There are three isomers of BFDGE, seven of 3-ring NOGE and 27 of 4-ring NOGE [18]. Regarding its anal nts with more than four rings has not achieved due to the large number of isomers. For the compounds with three and four rings, APCI in positive mode was chosen. Fragments considering more characteristic were analogous as for BFDGE, thus, clusters formed with a molecule of acetonitrile (Table IV.1, Figure IV.6). Comparable ammonium adducts were found by other author for BFDGE, NOGE 3- 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 0 100 % 4.34 3.16 5.54 0 100 % BFDGE055 SIR f 3 Ch l 10.41 9.91 9.65 10.56 0 100 % 14.52 10.38 9.86 9.02 4.31 10.99 28.93 14.68 26.24 BFDGE.2HC BFDGE.H2O.HCl BFDGE.2H2O A C B 85 Capítulo IV rings and NOGE-4 rings [8], but other authors [17] have observed that these strong ions only are formed by compounds of molecular weight less than 400 Daltons and with more than one epoxy group (such as BFDGE). Figure IV.6 shows the chromatogram obtained for a solution of NOGE, in which the fragments analyzed correspond to the clusters formed with a molecule of acetonitrile. A B C BFDGE NOGE 3-rin g s NOGE 4-rin g s Figure IV.6: MS chromatograms in APCI (+) of a mixture of NOGE (commercial standard IV.3.2. Chromatography l has been optimised previously in order to improve hic conditions were employed to analyze BADGE, its chloro ); NOGE 4-rings using m/z 678 (A), NOGE 3-rings, using m/z 516 (B), and BFDGE, using m/z 354 (C) at a concentration of 50 mg/L (expressed as the sum of all compounds). Chromatographic protoco the separation of these substances. Not all BFDGE derivatives have response in the same ionisation mode, so two injections were always necessary in negative and positive mode. Figures IV.4 and IV.5 show chromatograms acquired in both positive and negative mode. The same chromatograp hydroxy derivatives and oligomers [23], although spectrometric conditions were different, the employ of RP-HPLC coupled to a MS spectrometer via its APCI 86 Determination of BFDGE and its related compounds by HPLC-MS interface seems to be a powerful tool to quantify simultaneously BADGE and BFDGE related compounds. IV.3.3. Method validation As all individual standards are not available, only for those that were commercially available, the calibration lines were constructed. Thus, standards in 90% acetonitrile (in case of BFDGE and BFDGE.2HCl) and water (in case of BFDGE.2H2O) of known concentrations were used. The relationship between known concentrations and measured areas (expressed as the sum of the three isomers of each compound) was assessed by linear regression (four calibrations points), and the linearity obtained indicates that the method would be appropriate for quantification of these compounds (Table IV.2). Detection limits (DLs), (defined as signal three times the height of the noise level) were calculated in accordance with American Chemical Society [24] and are shown in Table IV.2. The lower DL corresponds to BFDGE and BFDGE.2H2O, and although lower levels can be reached employing fluorescence detection, in this case, no positive confirmation would be necessary. Nevertheless, comparing the established SMLs in the European Legislation [4], the detection limits obtained for the three compounds provide well enough performance. Detection Limit Linear range Linearity 2) (mg/L) (mg/L) (r BFDGE 0.2-2.0 0.9950 0.05 BFDGE.2HCl 0.2-2.0 0.9945 0.1 BFDGE.2H O 0.2-2.0 0.9929 0.05 2 Table IV.2: Method validation parameters. European Legislation establishes the migration limit for NOGE compounds at the detection limit of 0,2 mg/6dm² [4]. Taking into account that the products used for food cans typically contained 30-40% of 2-ring NOGE (BFDGE) and decreasing proportions of 3-ring to 8-ring components it is achievable to quantify NOGE up to 87 Capítulo IV four rings in BFDGE. The only limitation of this procedure would be the detection limit of these compounds that could be solved using a previous concentration step. Another advantage of this method is that to employ characteristic m/z makes possible to differentiate complex mixtures. In conclusion, the optimised method is appropriate to determine the chloro and hydroxy derivatives of BFDGE in a range between 0.2 mg/L– 2 mg/L. Calibration rate is appropriate to guarantee the compliance of these coatings with food packaging European Legislation. NOGE (2, 3 and 4-rings) could be also quantified using this method. This procedure is a potential technique that allows the positive confirmation of the presence of these compounds, not being necessary another technique for its quantification. 88 Determination of BFDGE and its related compounds by HPLC-MS REFERENCES [1] H.-J. Arpe (Ed.), Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol A18, New York, 1996. [2] Wagner C, Grob K, Biedermann M. Mitt. Lebensm. Hyg. 2000; 91: 146-157. [3] Berger U, Oehme M, Girardin L. Fresenius J Anal. Chem. 2001; 369: 115-123. [4] EU, Commission of the European Communities 2002/16/EC. Off. J. Eur. Commun. 2002; L51: 27. [5] EU, Commission of the European Communities 2004/13/EC. Off. J. Eur. 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Chem. 1980; 52: 2242-2249. 90 C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V V: : M MI IG GR RA AT TI IO ON N S SU UR RV VE EY Y O OF F B BI IS SP PH HE EN NO OL L A A D DI IG GL LY YC CI ID DY YL L E ET TH HE ER R A AN ND D B BI IS SP PH HE EN NO OL L F F D DI IG GL LY YC CI ID DY YL L E ET TH HE ER R F FR RO OM M C CA AN NN NE ED D F FI IS SH H A AN ND D S SE EA AF FO OO OD D, , I IN N S SP PA AN NI IS SH H M MA AR RK KE ET T D DU UR RI IN NG G L LA AS ST T Y YE EA AR RS S. . Migration survey BADGE and BFDGE from canned fish and seafood, in Spanish market ABSTRACT Epoxy resins are the main coatings used in food industry. Bisphenol A diglycidyl ether (BADGE) is the lower molecular weight compound of bisphenol A epoxy resins and bisphenol F diglycidyl ether (BFDGE) is the lower molecular weight compound of novolac epoxy phenolic resins. This study evaluates the contamination of canned fish and sea products regarding BADGE, BFDGE and related compounds during the last six years. The canned fish and sea food products samples (n=389) were supplied by different Spanish industries. In 1999-2001 only 1 % of samples exceeded the specific migration limit and in the last three years (2002-2004) the amount of all migrants analyzed was negligible. The results obtained are compared with previous surveys in Spain and in Europe. It could be concluded that the concentration of these compounds is quite lower that those found at the end of 90’s. KEYWORDS BADGE, BFDGE, migration, can coatings, canned fish 93 Capítulo IV In 2000, only one sample exceeded the SML of BADGE, its chromatogram is showed in Figure V.2. Otherwise, the presence of BFDGE was negligible in the samples tested. mi n 02.5 57.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5 LU 0 200 400 600 800 1000 15.629 17.591 17.757 BADGE Figure V.2: Chromatogram of tuna in oil with a concentration of 1.2 mg BADGE /kg of foodstuff. Concerning 2001, and considering only the presence of BADGE, none of samples showed a concentration higher than 0.1 mg/kg and only in a low percentage of samples this compound was detectable, and most corresponding to samples of mussels in pickled sauce. However, in one sample, the chloroderivatives of BADGE were found (Figure V.3). In this case the value is around 0.1 mg/kg, expressed as mg BADGE /kg of foodstuff. BFDGE was found only in one sample. In 2002, 2003 and 2004 the number of canned products tested decreased (n=29) due to producers started to supply empty cans to test its safety before to use them as food cans. Nevertheless, in all food products tested along the last three years no sample has exceeded the quantification limit of 0.1mg/kg and only two 100 Migration survey BADGE and BFDGE from canned fish and seafood, in Spanish market samples had results of BADGE below 0.1 mg/kg. BFDGE was not detectable in any sample. mi n 0 5 10 15 20 25 LU 0 100 200 300 400 500 9.127 9.522 14.324 14.848 15.385 15.967 16.394 17.864 18.067 BADGE BADGE.HCl BADGE.2HCl Figure V.3: Chromatogram of mussels in pickled sauce with a concentration of all BADGE derivatives of 0.16 mg/kg foodstuff. This evolution is in accordance with previous studies carried out in our laboratory. Data obtained between 1996 and 1998 (Cortizas Castro, 1999) showed a worse scenario regarding BADGE and BFDGE, but with a decrease of the concentrations found at the end of this period. In this study, the mean values found at the end of 1996 were 2.14 mg/kg for BADGE and 2.17 mg/kg for BFDGE. At the beginning of 1997 the mean concentrations found were 0.17 mg/kg and 3.25 mg/kg for BADGE and BFDGE respectively. Hammarling et al. (2000), in a previous survey done in Swedish in 1997, found also higher values for BADGE (up to 5.1 mg/kg). Simoneau et al. (1999) reported, in a survey in the European Union that about 3% of canned fish in oil exhibited a concentration higher than the SML established by the European Legislation, which is a higher value than the one found in this study. Theobald et al. (2000) ascertained similar results in a BFDGE survey. 101 Capítulo IV mi n 0 5 10 15 20 25 LU 20 40 60 80 100 120 140 16.306 18.267 18.436 20.250 21.934 24.147 25.084 25.812 26.779 28.951 BADGE BADGE n=1 BADGE n=2 BADGE n=3 Figure V.4: Chromatogram of tuna in oil with a concentration of BADGE below 0.1 mg/kg of foodstuff, but with oligomers of high molecular weight. The cases found these last years, for which the migration is higher, generally come from one sample containing a high concentration rather than a larger number samples with lower concentrations. Moreover, BADGE oligomers (which are not included in European Legislation) were found in some samples (Figure V.4). These oligomers were already found in canned oily food by Biedermann et al. (1997). So, it is necessary to emphasize that although migration levels of BADGE and BFDGE (and also its related compounds of low molecular weight) are nowadays lower than last years, new problems are arising. Figures V.2, V.3 and V.5 showed that new substances (retention times between 17.5 and 18.0 minutes) are migrating to foods. 102 Migration survey BADGE and BFDGE from canned fish and seafood, in Spanish market Although these unknown compounds are much less than those observed in other previous works (Grob et al., 1999), it should be marked that research on this field should continue to try to identify new migrants from food packaging materials and hence, to ensure consumers’ safety. mi n 0 5 10 15 20 25 LU 0 50 100 150 200 250 13.739 14.257 14.687 17.896 18.088 BFDGE Figure V.5: Chromatogram of tuna in oil with a concentration of BFDGE of 0.4 mg/kg of foodstuff. This study shows the evolution of the contamination of canned food regarding these epoxy compounds in the last years, and it could be concluded that the concentration of these compounds is quite lower than those found at the end of 90’s. This means that both, can and fish food producers are more concerned to guarantee the consumers’ safety, regarding the migration compounds from epoxy resins in canned foods. 103 Capítulo IV REFERENCES Berger, U. and Oehme, M. (2000) Identification of Derivatives of Bisphenol A Diglycidyl Ether and Novolac Glycidyl Ether in Can Coatings by Liquid Chromatography/Ion Trap Mass Spectrometry. J. AOAC Int. 83 (6), 1367-1376. Biedermann, M., Bronz, M., Grob, K., Gfeller, H., Schmid, J. P. (1997) BADGE and its accompanying compounds in canned oily foods: Further results. Mitt. Gebiete Lebensm. Hyg. 88, 277-292. Cortizas-Castro, D. (1999) Characterization and quantification of epoxy compounds to control especific migration. Doctoral Thesis. 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C CA AP PÍ ÍT TU UL LO O V VI I: : C CO OM MP PI IL LA AT TI IO ON N O OF F A AN NA AL LY YT TI IC CA AL L M ME ET TH HO OD DS S T TO O D DE ET TE ER RM MI IN NE E M MI IG GR RA AT TI IO ON N O OF F A AD DD DI IT TI IV VE ES S A AN ND D M MO ON NO OM ME ER RS S F FR RO OM M P PL LA AS ST TI IC CS S T TO O F FO OO OD DS ST TU UF FF FS S Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers… ABSTRACT Reference plastics as well as model migrants of different chemical and physical properties have been selected to carry out a study of the migration kinetics from plastics to foodstuffs. On the basis of their representativeness and their relevance for food contact materials, Irganox 1076®, diphenylbutadiene, Chimassorb 81®, Uvitex OB®, caprolactam, benzophenone, diphenyl phthalate and bis (2- diethylhexyl) adipate (DEHA) have been selected for this study. Available literature on analytical methods in polymers, food simulants and foodstuffs was reviewed in detail, although most of the times it was scarce, and more information was found on analysis in simulants and polymers than on food analysis. Preliminary experiments were performed in order to evaluate interesting spectroscopic properties, as these properties are generally unavailable in the ordinary bibliography and they are a key point to begin the development of analytical methods. General guidelines for the determination of the selected migrants in foods were suggested and discussed taking in account all the properties of each molecule. KEYWORDS Migration, foodstuffs, plastics, migrants, food packaging. 109 Capítulo VI In order to carry out their function, antioxidants are consumed during the polymer degradation process, and the amount of unreacted antioxidant in the polymeric material is an indicator of the state of the oxidation process. Since the concentration of antioxidants added is low (usually between 100-1000 ppm depending on the application and processing conditions) (Wang 2000) and tends to decrease with time in the polymeric materials, there is a need for analytical methods which have very low detection limits (Molander et al. 1999). Several chromatographic methods have been described for the identification and quantification of phenolic antioxidants. Tables VI.11 to VI.13 (pages 131-132) resume some of the methods available in the bibliography. The most used methods are gas chromatography and liquid chromatography. However, supercritical fluid chromatography (SFC) has also been used in order to avoid limitations of conventional techniques. Less common methods like electrochemical (Agüí et al. 1995), pyrolysis-gas chromatography (Py- GC) (Wang 2000) or coupled techniques like HPLC-NMR-MS (high-performance- liquid chromatographynuclear magnetic resonancemass spectrometry) and HPLCFT-IR (high performance liquid chromatography- Fourier transform-IR spectroscopy) (Ludlow et al. 1999) have also been reported. VI.3.1.2. DPBD Diphenylbutadiene (DPBD) is a fluorescent whitening agent added to a material to absorb ultraviolet rays in sunlight and release them as blue rays. These blue rays will then interact with the yellowish color and give the plastic the appearance of being whiter. DPBD is a light yellow crystalline powder, soluble in many organic solvents, with high lipophilicity (Calculated Log Kow (octanol-water) = 5.29) (EPI). DPBD has been incorporated into polyethylene film to act as a reference material BCR.593 in the test method for the determination of fatty contact (EN 14481). In order to determine the DPBD migration level from plastics to foodstuffs, an HPLC-UV method was developed in three selected foods that represent three types of foodstuffs with different physical and chemical properties: aqueous and acidic food (orange juice), non fatty food (chicken breast), and fatty food (gouda cheese) (Sendón García et al. 2004). 116 Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers… Table VI.2: Chemical and physical properties of DPBD. DPBD CAS Nº 538-81-8 Formula C16H14 Chemical Name Diphenylbutadiene MW 206 mp (ºC) 153 Bp/Fp (ºC) 350/- Water solubility (mg l-1) 0.5-1.2 Solubility very soluble in: benzene, ethanol and ether Application Fluorescent additive Structure Spectral Data UV: 319 nm (cyhex) Fl: Ex:320, Em:375 nm (hex) VI.3.1.3. Chimassorb 81 and Uvitex OB Other two substances selected by the FOODMIGROSURE project are Chimassorb 81, an ultraviolet absorber, and Uvitex OB, an optical brightening agent. These chemical additives are used to enhance the lifetime of plastics, since they minimize photo-chemical processes and, therefore, polymer degradation (Vargo and Olson 1985). Like other additives/monomers targeted in this project, they were chosen because they present different active groups, have different functions within the polymer and are used in food contact materials (polystyrenes and polyolefins) (Quinto-Fernandez et al. 2003). Regarding the analytical methods for determination of these additives, thinlayer chromatography (Lawrence and Ducharme 1980) has been substituted by high performance liquid chromatography (HPLC). Table VI.14 presents several HPLC-UV methods used to determine these additives. Owing to the advantages of HPLC technique, like the higher resolution, capacity to handle larger samples, reliable quantification detection, no need of clean-up step or internal standards to correct for poor recovery or instrumental errors, this is the most used method (Quinto-Fernandez et al. 2003). 117 Capítulo VI Table VI.3: Chemical and physical properties of Chimassorb 81. Chimassorb 81 Ref. Nº 61600 CAS Nº 1843-05-6 Formula C21H26O3 Chemical Name 2-Hydroxy-4-n-octyoxybenzophenone MW 326 mp (ºC) 48-49 Bp/Fp (ºC) >400/>200 Water solubility (mg l-1) < 0.03 Solubility (g x 100g solution-1) Acetone: 43; benzene:72; chloroform:61; ethanol: 3.5; ethyl acetate: 44; n-hexane: 12; methanol: 1.7; MEK: 65; methylene chloride: 67; toluene: >50; water: < 0.01 Application UV absorber/ stabiliser Structure Spectral Data UV: 290, 243 nm (ethanol) MS peaks: 213 (100), 214 (39) 326(19) 325 (14) 43 (11) 77 (10) 41 (10) 215 (7). SML (mg kg-1) 6 TDI (mg kg-1) 0.1 Table VI.4: Chemical and physical properties of Uvitex OB. Uvitex OB Ref. Nº 38560 CAS Nº 7128-64-5 Formula C26H26N2O2S Chemical Name 2,5- Bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl thiophene MW 431 mp (ºC) 196-203 Bp/Fp (ºC) -/>350 Water solubility (mg l-1) <0.03 Solubility (g x 100g solution-1) Acetone: 0.2; dioxane: 2; DMF: 0.8; ethanol: 0.1; ethyl acetate:1 ; n-hexane: 12; methanol: 0.05; MEK: 1; toluene. 5; tetrahydrofuran:5; xylene: 5; water: < 0.01 Application UV stabiliser; optical brightener; fluorescent white agent Structure Spectral Data Fl: Ex: 375; Em: 435 nm SML (mg kg-1) 0.6 TDI (mg kg-1) 0.01 118 Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers… Uvitex OB, has also been determined by spectrofluorimetry thanks to its high and characteristic excitation and emission wavelengths (Quinto-Fernandez et al. 2003). The determination of these compounds has also been performed by gas chromatography (Table VI.15). VI.3.1.4. Caprolactam Caprolactam is a monomer of polyamide (nylon). Table VI.5 summarises the properties of this molecule. During the reaction of polymerization of caprolactam, about 90% of the monomer is consumed, leaving a residue of monomer and low molecular weight oligomers. The residue can either be removed by filtration or vacuum treatment of the polymer melt, although there is always a small % that remains in the polymer (Barkby and Lawson 1993). Several chromatographic methods have been used to quantify the amount of free caprolactam and its oligomers in the polymer. Most of them include LC methods with UV (Barkby and Lawson 1993, Krajnik et al. 1982) or RI detection (Bonifaci et al. 1991). Table VI.5: Chemical and physical properties of ε-caprolactam. ε-Caprolactam Ref. Nº 14200 CAS Nº 105-60-2 Formula C6H11NO Chemical Name Aza-2-cycloheptanone MW 113 mp (ºC) 70-72 Bp/Fp (ºC) 267/125 Water solubility (mg l-1) > 700000 Solubility (g x 100g solution-1) soluble in water, ethanol, benzene, chloroform, cyclohexane, acetone and dimethylsulfoxide Application Monomer Structure Spectral Data MS peaks: 55(100) 113 (87) 30(81) 56(66) 84(60) 85(57) 42(51) 41(33). UV: 198 nm (H2O) SML (mg kg-1) 15 TDI (mg kg-1) 0.25 119 Capítulo VI VI.3.1.5. Benzophenone Benzophenone is the most commonly employed photo-initiator for inks and varnishes cured with ultraviolet light. Also it is a wetting agent as it increases the flow of inks by acting as a reactive solvent (Anderson and Castle 2003, Papilloud and Baudraz 2002, Choi et al. 2002). Although benzophenone is applied to the outside of the packaging material (often paper or cartonboard), owing to its low molecular weight, it can penetrate through the packaging material structure and migrate to foods packaged with these materials (Anderson and Castle 2003). Frequently, the paper packaging materials are coated with polymeric materials (like polyethylene, polypropylene or polyethylene terephthalate) which act as a barrier against moisture and food contamination (Song et al. 2003). However, the efficiency of this coating depends on its thickness and storing packaging conditions (Choi et al. 2002). Several papers have already determined this polar, water soluble surrogate. GC- (FID or MS) has been the most used technique (see table VI.15). Table VI.6: Chemical and physical properties of benzophenone. Benzophenone Ref. Nº 38240 CAS Nº 119-61-9 Formula C13H10O Chemical Name Diphenylmetanone MW 182 mp (ºC) 48 Bp/Fp (ºC) 305/- Water solubility (mg l-1) 137 Solubility (g x 100g solution-1) water:1; ethanol:4; diethyl ether: 4; acetone:4; benzene: 3; chloroform:4; acetic acid:4; methanol:3; carbon sulphur:4 Application Light stabiliser Structure Spectral Data MS peaks: 105 (100) 77(49) 182 (32) UV: 33, 252 nm (methanol) SML (mg kg-1) 0.01 TDI (mg kg-1) 0.6 120 Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers… VI.3.1.6. Diphenyl Phthalate and DEHA According to the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC), a plasticizer is a substance or material incorporated in a material (plastic, for instance) to increase its flexibility, workability or stretchability (Cano et al. 2002, Page and Lacroix 1995). However, plasticizers can also act as lubrificants, flame retardants or thermal stabilizers (Wang 2000). Plasticizers like phthalates, adipates, phosphates, citrates and sebacates are widely used in food packaging materials (Van Lierop and Van Veen 1988), often in significant amounts (sometimes exceed 20% by weigh of the polymer) (Startin et al. 1987, Goulas et al. 1998). The properties of the plasticized polymer depend on the chemical nature and concentration of the plasticizer (Cano et al. 2002). Table VI.7: Chemical and physical properties of diphenyl phthalate. Diphenyl Phthalate CAS Nº 84-62-8 Formula C20H14O4 Chemical Name 1,2-Benzenedicarboxylic acid, diphenyl ester MW 318 mp (ºC) 73 Bp/Fp (ºC) 405/224 Water solubility (mg l-1) 0.08 Solubility (g x 100g solution-1) water:1; ethanol:2; diethyl ether:2; ete:2 Application Plasticizer Structure Spectral Data MS peaks: 94(100) 28(83) 225(32) UV: 225nm (methanol) Generally plasticizers have low molecular weight, therefore, they tend to migrate from packaging material to the wrapped food and become indirect food additives (Goulas et al. 1998). The specific migration limit of DEHA is 3 mg dm-2 (Petersen et al. 1997). Regarding diphenyl phthalate, which is an alkyl-substituted 121 Capítulo VI phthalate, its identification by mass spectra is not an easy task, once all the substances which belong to this family do not give an intense parent ion and present common major fragments (Wang 2000). Table VI.8: Chemical and physical properties of DEHA. DEHA Ref. Nº 31920 CAS Nº 103-23-1 Formula C22H42O4 Chemical Name Adipic acid, bis(2-ethylhexyl) ester MW 371 mp (ºC) <-70 Bp (ºC) 417 Water solubility (mg l-1) 0.78 Application Plasticizer Structure Spectral Data MS peaks: 129, 57, 112, 147. SML (mg kg-1) 18 The key to the correct analytical approach of plasticizers requires not only the knowledge of these plastics additives but also the comprehensive understanding of the polymer, once the plasticizers are homogeneously blended with the polymer molecules (Wang 2000). Tables VI.16 and VI.17 refer to GC methods for the determination of DEHA. VI.3.2. Sample preparation for the analysis of model migrants VI.3.2.1. In polymer materials In general, the first step for the determination of migrants in plastics is their separation from the polymeric matrix. The two most widely methods used are the extraction with solvents and the use of solvents that swell and/or dissolve both, selected compound and polymer. 122 Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers… VI.3.2.1.1. Extraction with solvents It is broadly accepted that the solvent used should dissolve the target compound and also swell the polymeric matrix. Polymer swelling data are widely available in the literature, but the solubilities of the selected migrants in extraction solvents are incompletely documented and must be estimated on the basis of the nature of analyte and extractant. Several combinations solvent/analyte/polymer has been used. Dichloromethane has been used to determine Irganox 1076 and DEHA in multilayer materials (PP/EVA/EVOH) and PVC (polyvinylchloride); acetonitrile for Chimassorb 81 and Irganox 1076 in PET (polyethylene terephthalate), tetrahydrofuran for Chimassorb 81 and Uvitex OB in HDPE (high density polyethylene) and PP (polypropylene); iso-octane for DEHA in PVC and diethyl ether for Irganox 1076 and DEHA. Extraction procedures are usually carried out by hand shaking, although sometimes ultrasonic maceration or Soxhlet are used to improve the process (Vargo and Olson 1985, Ulsaker and Teien 1992, Nerin et al. 1996, O’ Brien et al. 1997, Marque et al. 1998, Monteiro et al. 1998, Specific migration, Petersen et al. 2004). Regarding other food contact materials, benzophenone was extracted from paper and board with absolute ethanol (Summerfield and Cooper 2001, Triantafyllou et al. 2002). Extractions with supercritical fluid or microwaveassisted were used for Irganox 1076 and chimassorb 81 in PE (Salafranca et al. 1999), and DEHA in PVC (Cano et al. 2002, Guerra et al. 2002). VI.3.2.1.2. Use of solvents that swell and/or dissolve both selected compound and polymer, followed by precipitation of the polymer Toluene has been used for polyolefins containing Irganox 1076 followed by precipitation of the polymer with methanol (Specific Migration) while DEHA was determined by total dissolution of polymers with chloroform and then precipitating with methanol (O’ Brien et al. 1997). VI.3.2.2. In food simulants VI.3.2.2.1. Aqueous official food simulants Usually they are directly injected when the analysis is carried out by reverse phase- HPLC (RP-HPLC). DEHA and Irganox 1076 were determined following this methodology (O’Brien et al. 1997, Howe and Borodinsky 1998), and 123 Capítulo VI Chimassorb 81 and caprolactam after dilution with miscible organic solvents (Spyropoulos 1998, Specific migration). Sometimes a concentration step or change of solvent is necessary before the chromatographic analysis. For instance, Irganox 1076 and DEHA were extracted with hexane (Simoneau and Hannaert 1999), Chimassorb 81 with dichloromethane (Nerin et al. 1996), Uvitex OB with chloroform and DEHA with heptane (O’ Brien et al. 1997). Benzophenone was extracted using an activated silica-bound-phase cartridge, which was eluted with a methanolic solution (Papillound and Baudraz 2002). VI.3.2.2.2. Official fatty food simulants In some cases the fat simulant is diluted with a solvent followed by direct injection in a chromatographic system. For instance, acetone was used in the determination of the the migration of Irganox 1076 (Helmroth et al. 2002; O’Brien et al. 1997), dichloromethane or tetrahydrofuran were used to determine Chimassorb 81 (Nerin et al. 1996, Spyropoulos 1998) and heptane and acetonitrile were the solvents when migration of DEHA was evaluated (O’ Brien et al. 1997, Specific migration). Extraction with immiscible solvents can also be performed. For example, acetonitrile was used to extract DEHA and Irganox 1076 (Simoneau and Hannaert 1999), and methanol to extract Chimassorb 81 (Spyropoulos 1998), although very poor recovery was achieved. For volatile substances specific techniques were applied. A Tenax adsorption column followed by extraction with hexane has been employed to determine DEHA (Van Lierop and Van Veen 1988). Also, DEHA was extracted with ethyl acetate/toluene and extracts were injected in a GPC column (Biobeads S-X3) to proceed to the clean-up step (Petersen and Breindahl 1998). VI.3.2.2.3. Substitute fat simulants Regarding this type of simulants, direct injection of the simulant it is commonly used in a chromatographic system, after migration tests. This method has been used to determine the migration of Irganox 1076, Chimassorb 81, Uvitex OB and ε-caprolactam (Specific migration) and Chimassorb 81 after dilution with tetrahydrofuran (Spyropoulos 1998). On the other hand, evaporation of the simulant 124 Compilation of analytical methods to determine migration of additives and monomers… to dryness followed by dissolution in chloroform or acetonitrile, was used to determine Irganox 1076 (Garde et al. 2001) and benzophenone (Papillound and Baudraz 2002), respectively and extraction with hexane/water was used to determine DEHA and Irganox 1076 in ethanol 95% (Simoneau and Hannaert 1999). VI.3.2.3. Foodstuffs Due to the complexity of food samples, the procedure more broadly used with simulants, by direct injection, is not the most appropriate to evaluate migration in foods. In spite of the lack of abundant bibliographic support, the available information related with the study of migration into foodstuffs reveals that the scientific community focuses mainly on the three approaches: extraction with solvents, solid phase extraction and size exclusion chromatography or gel permeation chromatography. VI.3.2.3.1. Extraction with solvents This procedure is one of the most generally used, as much for fatty foods as non-fatty foods. For instance, DEHA was extracted from several food items with cyclohexane-dichloromethane (1:1) or hexane-dichloromethane (10:1) (Lau and Wang 1996, Page and Lacroix 1995). Benzophenone was extracted from several foods with a mixture of acetonitrile and dichloromethane (1:1). Occasionally, after solvent extraction a clean-up step, like solid phase extraction, size exclusion chromatography or gel permeation chromatography may be necessary. VI.3.2.3.2. Solid phase extraction It was used in sample preparation of DEHA and other plasticizers in fatty food (animal tissues, fats and high fat content cheese) after blending with dichloromethane and passing the extract through a Florisil column (Page and Lacroix 1995). It was also used to analyse DEHA in water samples (Brossa et al. 2002). VI.3.2.3.3. Size exclusion chromatography or gel permeation chromatography 125