Interacciones neuroendocrinas en los procesos inflamatorios articulares: efecto de la leptina sobre la NOS tipo II en condrocitos

Universidad de Santiago de Compostela Departamento de Medicina Interacciones Neuroendocrinas en los Procesos Inflamatorios Articulares: Efecto de la leptina sobre la NOS tipo II en condrocitos. Miguel Otero Adrán Don Oreste Gualillo, investigador contratado del Fondo de Investigación Sanitaria del Instituto Carlos III en el Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, y D. Juan J. Gómez-Reino Carnota, profesor titular del departamento de Medicina de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, Director y co-Director respectivamente del doctorando D. Miguel Otero Adrán, CERTIFICAN QUE: La presente Tesis Doctoral, titulada “Interacciones Neuroendocrinas en los Procesos Inflamatorios Articulares: Efecto de la Leptina sobre la NOS tipo II en condrocitos”, ha sido realizada por el doctorando bajo su dirección en el departamento de Medicina en la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada por el candidato para optar al grado de Doctor en Biología. Y para que conste, firmamos la presente autorización en Santiago de Compostela, Septiembre de 2005. El Director El Co-Director Fdo: Oreste Gualillo Fdo: Juan J. Gómez-Reino Carnota Fdo: Miguel Otero Adrán Gracias, A Oreste y Juan, por darme la oportunidad de trabajar con vosotros, por permitirme empezar en esto de la investigación, por vuestros consejos. A Rocío y Rudy, porque sois buenos compañeros y, sobre todo, muy buena gente. Por la alegría que le dais al laboratorio. A todos los que están y han estado en los laboratorios de investigación. Todos ellos han sabido crear un excelente ambiente laboral y personal. Ha sido una suerte coincidir con vosotros. A los que hemos empezado juntos, o casi. A Roberto (¿qué tal todo, bien?), Chus (qué sería de los laboratorios sin ti, Chusilla), Eva (que todo te vaya bien, guapa, te lo mereces) e Isa (menos mal que nos “separaron”, que si no...), por la amistad, la ayuda, los buenos y malos momentos juntos...en definitiva, por estos cinco años. A los miembros del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico, en especial a Myriam y Juan, por su ayuda con las cuestiones clínicas (ahora, al menos, sé algo...poco pero mucho más que antes de conoceros) y sobre todo por dejarme gorronear café, por las conversaciones y las risas, por su amistad. A la gente del departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina. A todos, por aguantarme cada vez que aparecía por ahí dando la lata, y especialmente a Sulay, Sisi, Eduardo y Rubén que, además de a trabajar con bichos, me han enseñado mucho a todos los niveles. A mi familia. Somos muchísimos y no quiero parecer Almodóvar recitando el santoral en los Oscars, así que os doy las gracias por vuestro apoyo así, en comuna, y ya luego os besuqueo y hago la pelota de forma individual. A Mercedes, mi madrina, por ser como eres, me encantas, y a Sara, mi ahijada, que me quiere a pesar de ser un desastre como padrino. A mis amigos. En estos años me las he apañado para engañar a un buen número de gente para que me aguanten. A todos, gracias por vuestra amistad. Es una suerte poder llamaros amigos. A Ana, Toni, Antía, Fernando, Verónica (mi prima pero, sobre todo, una excelente amiga), Alberto, Rocío, Brais y Marcos, que me espabilan cuando lo necesito, que aguantan mis neuras y rarezas sin estrangularme; gracias. A mis hermanos, Alex y Jose. Tengo mucho que aprender de vosotros, tengo demasiado que agradeceros. Gracias por ser como sois. A mis padres. Gracias por vuestra paciencia infinita, gracias por apoyarme en todo momento, gracias, en definitiva, por todo. ÍNDICE I. INTRODUCCIÓN 1. La inflamación en el cartílago articular: los condrocitos en los procesos inflamatorios. 1 1.a El cartílago articular. 5 1.b Los condrocitos. 7 1.c Mediadores de la inflamación articular: las citoquinas y el óxido nítrico. 8 1.c.1 Las citoquinas pro-inflamatorias. 9 1.c.1.a La Interleuquina-1. 11 1.c.1.b El Interferon-gamma. 13 1.c.2 El Óxido Nítrico y la Nitróxido Sintasa tipo II. 16 1.c.2.a La Nitróxido Sintasa tipo II. 17 2. El tejido adiposo como órgano endocrino, la obesidad como condición inflamatoria: las adipocitoquinas. 22 3. La leptina. 24 3.a El receptor de leptina. 28 3.b Acciones de la leptina. 33 3.b.1 La leptina en la regulación de la homeostasis energética. 33 3.b.2 Leptina y reproducción. 36 3.b.3 Acciones de la leptina sobre el eje HPA. 37 3.b.4 Acciones de la leptina sobre la secreción de la GH. 38 3.b.5 La leptina en la respuesta inmune y en los procesos inflamatorios. 39 3.b.5.1 La leptina en la respuesta inmune. 39 3.b.5.2 La leptina en la respuesta inflamatoria. 41 3.c La leptina en el cartílago articular. 43 II. OBJETIVOS Objetivos 49 III. MATERIALES Y MÉTODOS 1. Cultivos celulares. 53 1.a La línea celular ATDC5. 53 1.a.1 Diferenciación de las células ATDC5. 55 1.b Aislamiento y cultivo primario de condrocitos humanos. 55 2. Tratamientos: concentraciones y tiempos. 57 2.a Concentraciones. 57 2.b Tiempos. 59 3. Determinación de nitritos: ensayo colorimétrico de Griess. 59 4. Extracción de ARN mediante TRIzol®. 62 5. Retrotranscripción (RT). 63 6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 64 7. PCR en tiempo real. 66 8. Western Blot. 68 9. Análisis estadístico. 71 10. Reactivos. 71 IV. RESULTADOS 1. Expresión de la forma larga del receptor de leptina (Ob-Rb) en la línea celular ATDC5. 77 2. Efecto sinérgico de la leptina con el interferon-gamma. 79 2.a La leptina induce, en acción sinérgica con el IFN-γ, la producción de nitritos en la línea celular condrogénica ATDC5 de forma dosis dependiente. 79 2.b La producción de nitritos inducida por leptina e IFN-γ en las células ATDC5 está mediada por la activación de la nitróxido sintasa tipo II. 81 2.c La activación de NOS tipo II está inhibida por el tyrphostin AG490 en células ATDC5. 83 2.d Efecto de la Wortmannina y el LY294002, inhibidores de PI-3K, sobre la producción de nitritos inducida por la leptina y el IFN-γ en las células ATDC5. 84 2.e Efecto del PD098059, inhibidor de MEK-1, sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IFN-γ en células ATDC5. 86 2.f Efecto del SB203580, inhibidor de la p38K, sobre la producción de nitritos inducida por la leptina y el IFN-γ en células ATDC5. 87 2.g Análisis del patrón de expresión a nivel de ARNm y proteína de NOS tipo II inducida por leptina e IFN-γ en células ATDC5. 88 2.h Inducción sinérgica de la NOS tipo II por parte de la leptina y el IFN-γ en células ATDC5 diferenciadas. 90 2.i La leptina induce, en acción sinérgica con el IFN-γ, la producción de nitritos en un cultivo primario de condrocitos humanos de forma dosis dependiente. 91 3. Efecto sinérgico de la leptina con la interleuquina-1. 94 3.a La leptina induce, en acción sinérgica con la IL-1, la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II en la línea celular condrogénica ATDC5. 94 3.b La Aminoguanidina bloquea la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en las células ATDC5. 95 Introducción disminución de masa corporal inducida por un desequilibrio metabólico que implica un metabolismo acelerado y un incremento en la degradación proteica (32-36). Estas anormalidades metabólicas están asociadas con el incremento en la producción de citoquinas inflamatorias (33) y alteraciones en el sistema endocrino (37), en especial en el equilibrio entre factores orexigénicos y anorexigénicos. Se sabe, por ejemplo, que las citoquinas inflamatorias inducen la producción de moduladores anorexigénicos, como la leptina (38, 39). Así, esta hormona podría estar implicada en el desarrollo y la regulación de la caquexia inflamatoria. Dentro de los factores orexigénicos, la ghrelina, el “antagonista funcional” de la leptina, podría estar igualmente participando en el desarrollo de este síndrome. La ghrelina es el secretagogo endógeno de la hormona de crecimiento (GH); capaz, además, de estimular la ingesta independientemente de la secreción de GH (40). Se ha comprobado que la ghrelina disminuye la pérdida de masa corporal en modelos de caquexia asociada a fallo cardíaco crónico (41) y en ratones con caquexia asociada al cáncer (42). Además, los niveles de ghrelina circulante están modulados por la inflamación crónica, tanto en pacientes con AR como en ratas con AR inducida por adyuvante de Freund completo (43). Es posible, por tanto, que esta hormona esté participando en el desarrollo de la caquexia inflamatoria, enfrentando sus acciones a la de factores anorexigénicos como la leptina. Así, podemos ver que la artritis reumatoide es una enfermedad compleja que implica, además de distintas alteraciones sistémicas, un profundo daño articular. Por tanto podemos concluir que, tanto en patologías localizadas únicamente a nivel articular, como la OA, como en patologías autoinmunes complejas de afectación sistémica, como la AR, el cartílago articular sufre un gran número de cambios, alteraciones, que acaban dañando su estructura y función de forma, a veces, irreversible. 4 Introducción A continuación haremos un breve resumen de la estructura del cartílago, las alteraciones que sufre durante los procesos inflamatorios y nos centraremos en los condrocitos, las células encargadas de sintetizar la matriz extracelular y mantener la estabilidad y la estructura del cartílago, y los mediadores de los procesos inflamatorios que implican daño en el cartílago articular. 1.a El cartílago articular. El cartílago articular es un tejido conectivo especializado que cubre las superficies expuestas a estrés mecánico en la articulación (44, 45). En ellas, el cartílago favorece la baja fricción, aporta estabilidad, facilita la rapidez de movimientos y contribuye a la estabilidad articular (44, 45). Estructuralmente, el cartílago articular es un tipo especial de cartílago hialino caracterizado por su apariencia translúcida. Es un tejido completamente aislado dentro de la articulación y muy poco vascularizado: todo el riego que recibe procede de la difusión desde el hueso subcondral y el fluido sinovial (44, 45). En cuanto a su composición, más del 70% del cartílago es agua y está formado por un único tipo celular, los condrocitos, que aparecen en muy bajo porcentaje: entre el 2 y el 5 por ciento del cartílago articular (44, 45). El cartílago articular maduro es, en apariencia, un tejido muy homogéneo. Sin embargo, se trata de un tejido altamente heterogéneo, en el cual se pueden diferenciar con claridad cuatro zonas (44, 45, 46): 1) superficial: con finas fibras de colágeno formando una red en la que se asocian una elevada concentración de decorina y una baja concentración de agrecano; 2) media: esta zona supone entre el cuarenta y el sesenta por ciento del peso total del cartílago, está formada por condrocitos rodeados por fibras de colágeno más gruesas que las anteriores; 3) profunda: con menor concentración de 5 Introducción colágeno y mucha mayor concentración de agrecano; con niveles decrecientes de condrocitos desde la zona más superficial a la más profunda y 4) calcificada: con presencia de condrocitos hipertróficos y colágeno tipo X, esta zona sirve de tampón, protección mecánica, entre el cartílago articular no calcificado y el hueso subcondral. La mayor parte del cartílago articular está constituida por su matriz extracelular, formada mayoritariamente por colágeno tipo II y agrecano (un noventa por ciento del peso seco) y otros tipos de proteglicanos, los cuales juegan un papel esencial en la organización de la matriz extracelular (tabla 2) (44, 45, 47). COLÁGENOS Tipo II Tipo VI Tipo IX Tipo XI Tipo XII Tipo XIV PROTEOGLICANOS Agrecano Versicano Fibromodulina Biglicano Decorina Condroadherina PROT. DE MEMBRANA CD44 Syndecan-3 Anexina V Integrinas OTRAS MOLÉCULAS Acido hialurónico Fibronectina YKL-40 Matrilin-3 Tabla 2. Componentes de la matriz extracelular COLÁGENOS Tipo II Tipo VI Tipo IX Tipo XI Tipo XII Tipo XIV PROTEOGLICANOS Agrecano Versicano Fibromodulina Biglicano Decorina Condroadherina PROT. DE MEMBRANA CD44 Syndecan-3 Anexina V Integrinas OTRAS MOLÉCULAS Acido hialurónico Fibronectina YKL-40 Matrilin-3 COLÁGENOS Tipo II Tipo VI Tipo IX Tipo XI Tipo XII Tipo XIV PROTEOGLICANOS Agrecano Versicano Fibromodulina Biglicano Decorina Condroadherina PROT. DE MEMBRANA CD44 Syndecan-3 Anexina V Integrinas OTRAS MOLÉCULAS Acido hialurónico Fibronectina YKL-40 Matrilin-3 Tabla 2. Componentes de la matriz extracelular La matriz extracelular o, más exactamente, la interacción entre el colágeno, el agrecano y los distintos proteoglicanos que la forman, confiere al cartílago articular sus funciones y propiedades físicas y mecánicas, siendo un tejido altamente resistente a la deformación por fuerzas compresivas (44, 45). Esta resistencia a la deformación se asocia principalmente con su capacidad de eliminar el agua que hidrata a los proteoglicanos mientras está sometido a presiones para, posteriormente, recaptarla por ósmosis y recuperar sus dimensiones y forma originales (48). 6 Introducción En situaciones patológicas se observa, de forma muy similar a lo observado durante los procesos de envejecimiento del cartílago, un incremento en la degradación de los componentes de la matriz extracelular y una disminución en la síntesis de los mismos (2, 28). Se ha visto, además, que los condrocitos sintetizan óxido nítrico (NO) de forma normal (49, 50) y que la estimulación de los condrocitos con citoquinas inflamatorias incrementa esta producción de óxido nítrico (51). Debido a que el NO modula procesos inflamatorios articulares, actuando sobre los condrocitos (52, 53), esta producción puede acabar resultando dañina para la configuración óptima del cartílago articular. 1.b Los condrocitos. Los condrocitos son el único tipo celular presente en el cartílago articular, representando entre el dos y el cinco por ciento de su volumen (44, 45). Su función en el cartílago articular es la de sintetizar y mantener la estabilidad de las macromoléculas que componen la matriz extracelular (2, 45, 46) (tabla 2). Desde un punto de vista ontogénico, los condrocitos proceden de una célula precursora de origen mesenquimal, la cual expresa de forma diferencial colágeno tipo I e hialuronano, componentes implicados en la formación de la matriz extracelular. A medida que la célula se diferencia, varía su fenotipo y expresa los distintos tipos de genes marcadores de formación de matriz. Así, hablamos de una célula condroprogenitora, inmediatamente posterior a la precursora mesenquimal, que expresa tenascin y colágeno tipo IIA; condrocitos proliferativos (que expresan colágenos tipo II, IX y XI además de agrecano) y condrocitos hipertróficos (colágeno tipo X, osteocalcin, fosfatasa alcalina y MMP-13) (54, 55). Este proceso de maduración, diferenciación, está modulado y dirigido en cierta medida por un gran número de factores reguladores, 7 Introducción activos en los distintos estados de diferenciación de los condrocitos. Entre estos se encuentran el TGF-β, el IGF-1, la BMP-6, la BMP-4 o el VEGF (56, 57). Durante el envejecimiento y durante patologías como la artritis reumatoide o la artrosis, los condrocitos desempeñan un papel esencial en los procesos de degradación del cartílago articular: en estas patologías, el delicado equilibrio que permite que los condrocitos sinteticen y estabilicen la matriz extracelular del cartílago articular se altera, el porcentaje de degradación de colágenos y proteoglicanos excede al de síntesis, de tal forma que el proceso de degradación acaba siendo irreversible (2, 28, 53, 58). La degeneración del cartílago se debe, en parte, a la acción de los distintos mediadores inflamatorios que provocan que los condrocitos entren en apoptosis, sufran procesos de des-diferenciación e incrementen la producción de distintas proteasas de matriz (53, 59). 1.c. Mediadores de la inflamación articular: las citoquinas y el óxido nítrico. El desarrollo de inflamación conlleva la expresión y producción de un amplísimo rango de mediadores que regulan la vasodilatación, el incremento en la permeabilidad vascular y la función de las células implicadas en los procesos inflamatorios. Dentro de estos mediadores se encuentran las prostaglandinas, distintas enzimas lisosómicas, la histamina, quimiocinas, citoquinas o el óxido nítrico, entre otros (17-27). En este apartado nos centraremos dichos mediadores, en las citoquinas inflamatorias, atendiendo especialmente al interferon-gamma y a la interleuquina-1, y en el óxido nítrico, por el papel fundamental que desempeñan en la regulación de los procesos inflamatorios degenerativos (20, 23, 25, 26, 52, 53, 58, 59). 8 Introducción 1.c.1 Las citoquinas pro-inflamatorias. Las citoquinas son glico-proteínas solubles (de 8 a 80 kDa) producidas por una gran variedad de células, con funciones pro- y anti-inflamatorias (60-64). Tabla 3. Citoquina Funciones principales IL-1 Regulación de la inflamación, apetito, fiebre IL-5 Coordinación de inflamación originada en eosinófilos IL-6 Acciones pro- y anti-inflamatoria. Altamente pleiotrópica IL-7 Regulación pleiotrópica de células TH. IL-8 Quimiotáctica para neutrófilos y basófilos. IL-12 Regula inmunidad celular. Induce producción de IFN-γ. IL-13 Inhibe la expresión de IL-1, TNF e IL-6. IFN-γ Activación de macrófagos. Regula inflamación e inmunidad TGF-β Quimiotáctica para leucocitos, los inhibe si están activados. TNF-α Mediador para- y endocrino de inflamación e inmunidad Tabla 3. Citoquina Funciones principales IL-1 Regulación de la inflamación, apetito, fiebre IL-5 Coordinación de inflamación originada en eosinófilos IL-6 Acciones pro- y anti-inflamatoria. Altamente pleiotrópica IL-7 Regulación pleiotrópica de células TH. IL-8 Quimiotáctica para neutrófilos y basófilos. IL-12 Regula inmunidad celular. Induce producción de IFN-γ. IL-13 Inhibe la expresión de IL-1, TNF e IL-6. IFN-γ Activación de macrófagos. Regula inflamación e inmunidad TGF-β Quimiotáctica para leucocitos, los inhibe si están activados. TNF-α Mediador para- y endocrino de inflamación e inmunidad Una misma citoquina puede ser sintetizada por distintos tipos celulares y actuar también sobre distintos tipos celulares, de distintas formas en función de las condiciones; poseen por tanto funciones pleiotrópicas (61, 65). Distintas citoquinas poseen, además, actividades muy similares, redundantes, y muchas otras actúan de forma sinérgica, en combinación, sobre las distintas células diana (65). Estamos, por tanto, ante una amplia y compleja red de factores (Tabla 3) fundamentales a la hora del funcionamiento normal y la integración de la respuesta inmune e inflamatoria. 9 Introducción Las citoquinas actúan tanto sobre las células que las producen como sobre células próximas a éstas: ejercen, por tanto, acciones autocrinas y paracrinas (61, 62). Algunas citoquinas, como es el caso de la IL-1, pueden llegar a actuar de forma endocrina, modulando la actividad del sistema endocrino (66) o actuando directamente sobre el hipotálamo, incrementando la síntesis de prostaglandina E2 (PGE2) y causando fiebre (67). Inflamación aguda IL-8 IL-16 G-CSF Inflamación crónica Figura 1. Citoquinas implicadas en la respuesta inflamatoria aguda y crónica. IL-1 IL-6 IL-11 IL-17 TNF-α IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-7 IL-9 IL-10 IL-12 IFNs TGF-β TNF-β Inflamación aguda IL-8 IL-16 G-CSF Inflamación crónica Figura 1. Citoquinas implicadas en la respuesta inflamatoria aguda y crónica. IL-1 IL-6 IL-11 IL-17 TNF-α IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-7 IL-9 IL-10 IL-12 IFNs TGF-β TNF-β IL-8 IL-16 G-CSF IL-1 IL-6 IL-11 IL-17 TNF-α IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-7 IL-9 IL-10 IL-12 IFNs TGF-β TNF-β Las citoquinas ejercen su función uniéndose a receptores específicos, situados en las membranas de distintos tipos de células diana, activando así rutas de señalización específicas que incluyen a distintas enzimas y factores de transcripción que, al final, acaban induciendo o inhibiendo la expresión de distintos genes (64, 65). Podemos, dentro de las citoquinas inflamatorias, hacer una distinción dentro de aquellas que tienen un papel importante dentro de la fase aguda (IL-16 o IL-8 entre otras) de un proceso inflamatorio o dentro de la inflamación crónica (IL-2, IL-10 o interferones [IFNs]) (68) (figura 1). Como toda división, ésta tiende a ser artificial ya 10 Introducción que muchas de las citoquinas que actúan durante la primera fase participan también del proceso crónico, como es el caso de, por ejemplo la IL-1 o el TNF-α (tumor necrosis factor alpha) (69). 1.c.1.a La Interleuquina-1. A finales de los años 80 se localizaron los genes que codifican la IL-1 α y β, citoquinas muy parecidas funcional y estructuralmente (70-73) . Las moléculas secretadas tienen un tamaño aproximado de 17.5 kDa (figura 2) y sus principales “dianas” celulares son las células fagocíticas mononucleares, los fibroblastos y los linfocitos T y B (74). Figura 2. La Interleuquina 1Figura 2. La Interleuquina 1 Desde un principio se supo que la IL-1 era una citoquina con un papel fundamental en la evolución de la respuesta inflamatoria, de ahí que sus primeros nombres reflejasen esa importancia: antes de ser llamada IL-1 se la conocía como Pirógeno Endógeno [una de las funciones de IL-1 α y β es provocar fiebre incrementando la síntesis de la PGE2 en el hipotálamo (67, 75-78)], Factor de células mononucleares o Factor activador de linfocitos. 11 Introducción La IL-1 desempeña un papel fundamental en patologías inflamatorias articulares como la artritis reumatoide (75, 79). En la articulación, se ha comprobado que tanto los condrocitos como células de línea ósea sintetizan y secretan IL-1 (80). Asimismo, se ha comprobado que la IL-1 es un potentísimo inductor de enzimas destructoras del cartílago (81-83). Debido a su potente efecto destructor de la matriz del cartílago, la IL- 1 es una citoquina inflamatoria de especial importancia en el estudio de la artrosis (2, 58, 84). La IL-1 lleva a cabo sus funciones mediante su unión específica con un receptor trans-membrana tipo I (IL-1RI), con una fracción C-terminal intracelular, un dominio trans-membrana individual y una fracción N-terminal extracelular (85, 86), el cual pertenece a la superfamilia de receptores de IL-1 también conocida como receptores similares a Toll (TLR, Toll-like receptors) (87). En un principio se descubrió que Toll, un gen de Drosophila que codifica una proteína esencial para la ontogenia y la resistencia antimicrobiana (88, 89), presentaba homologías entre su dominio intracelular y el del IL-1R (90). MEK-1 ERK-1/2 Figura 3. La IL-1 transduce señal a través de un receptor específico, IL-1RI, perteneciente a la familia Toll-like receptor. En la ruta de transducción de IL-1 participan, de forma fundamental, las quinasas p38K y ERK-1/2. La PI-3K también partic ipa en esta vía de transducción, siendo esencial para la activación del factor de transcripción NF-κB. MEK-1 ERK-1/2 MEK-1 ERK-1/2 Figura 3. La IL-1 transduce señal a través de un receptor específico, IL-1RI, perteneciente a la familia Toll-like receptor. En la ruta de transducción de IL-1 participan, de forma fundamental, las quinasas p38K y ERK-1/2. La PI-3K también partic ipa en esta vía de transducción, siendo esencial para la activación del factor de transcripción NF-κB. 12 Introducción Posteriormente se descubrieron homólogos de Toll en ratones y humanos, capaces de inducir señales de activación de la respuesta inmune adaptativa (91). Finalmente fueron secuenciados y clonados un gran número de receptores similares a Toll, entre los que están los receptores para la IL-18 o lipopolisacáridos de pared bacteriana (LPS) (85, 87). Todos ellos comparten un dominio Toll-IL-1 receptor (TIR) (85) y activan el mismo tipo de quinasas en la cascada de señalización desencadenada por la unión de la IL-1 al IL-1RI (85) (figura 3). El mecanismo de señalización intracelular se desencadena tras la unión de la IL- 1 a un dímero de IL-1RI, provocando el reclutamiento de proteínas accesorias (IL- 1RAcP), moléculas adaptadoras (MyD88) y quinasas asociadas al IL-1R (IRAK) (85). Esto provoca la activación de distintas rutas de señalización en las que participan, entre otras, las quinasas, p38K y p42/p44 (Erk-1/2) (85, 87). Además de las mencionadas, muchas otras quinasas, como la fosfatidil inositol 3 quinasa (PI-3K), resultan esenciales para, por ejemplo, la activación del NF-κB (nuclear factor κ Β ) y la inducción de la NOS tipo II a través del IL-1R (92). 1.c.1.b El Interferon-gamma. Entre los años 1980 y 1982 se clonaron los genes que codifican para un grupo de citoquinas con potente actividad anti-viral: los interferones (IFNs) (93-99 ). El IFN-γ pertenece a los IFNs de tipo II (93, 100-102). Este tipo de IFN se sintetiza en respuesta a estímulos inmunes e inflamatorios (69, 100-102) fundamentalmente en linfocitos T activados y en células NK (natural killer) (69, 103- 106). El IFN-γ es una citoquina homodimérica de funciones pleiotrópicas (100-102, 107), formada por monómeros de entre 20 a 25 kDa y codificado en un gen situado en el cromosoma 12 de humanos. 13 Introducción Se sabe que la dexametasona modula la expresión del ARNm de la NOS tipo II de forma muy efectiva (132, 143-148); sin embargo, y a pesar de la gran cantidad de información existente al respecto, los mecanismos por los que dicha regulación tiene lugar todavía no han sido completamente esclarecidos. Se han estudiado los mecanismos de transcripción de NOS tipo II en distintos tipos celulares y bajo distintos estímulos. Se ha observado que distintas vías de señalización participan en la inducción de NOS tipo II (figura 8). Las vías activadas dependen tanto del estímulo empleado como del tipo celular (132). En ellas participan una gran variedad de quinasas y factores transcripcionales, entre los que se encuentran las Janus quinasas (142) , proteín quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) (149), el factor nuclear kappa-B (92, 150) así como reguladores negativos de los TLR, como la fosfoinositol-3-quinasa (151), que es fundamental en la inducción de la NOS tipo II (92). Se ha demostrado, además, que la región promotora del gen de NOS tipo II contiene regiones de unión a distintos factores de transcripción, como el NF−κB o STATs y que el promotor de NOS tipo II en humanos contiene secuencias homólogas a estas regiones (131, 132). Por otra parte, se ha comprobado que la sobre-expresión de SOCS-1 (supressor of cytokine signaling-1) en respuesta a la presencia de citoquinas bloquea ruta Jak/STAT e inhibe la expresión de NOS tipo II (152, 153) Dentro de los estímulos que participan activamente en la inducción de NOS tipo II y la producción de NO se encuentran distintas citoquinas inflamatorias, entre ellas la IL-1 (92) y el IFN-γ (142). Ambas citoquinas utilizan al NO como uno de los principales mediadores de sus acciones inflamatorias (52, 53) (figura 8). La IL-1 induce, a través de la vía del NF-κB (85, 92), la expresión de distintos genes entre los que se encuentran la ciclooxigenasa-2 (COX-2) o la NOS tipo II, 20 Introducción esenciales para las respuestas inmune e inflamatoria (92, 150). El NF-κB se encuentra inactivo en el citosol, formando un complejo IκB-NFκB. Frente a determinados estímulos, la IκB quinasa (IKK) fosforila y, posteriormente, ubiquitina el complejo IκB- NFκB con lo que ésta se degrada y libera al NF-κB, que transloca al núcleo y activa la expresión de distintos genes (92, 132, 150). El NF-κB es, además, un factor de transcripción fundamental para la inducción de NOS tipo II por parte de muchas otras citoquinas (154). 21 Introducción 2. El tejido adiposo como órgano endocrino, la obesidad como proceso inflamatorio: las adipocitoquinas. Tradicionalmente, el tejido adiposo se consideraba únicamente una reserva pasiva de energía y un sistema de protección frente a la pérdida de calor. Hoy en día, sin embargo, este enfoque resulta demasiado limitado (155). Podemos dividir el tejido adiposo en dos tipos fundamentales: blanco y pardo. El primero, mayoritario, se consideraba un mero depósito de triglicéridos mientras que el segundo se entendía como un tejido productor de calor en mamíferos de pequeño tamaño y, en humanos, en los recién nacidos (156-158). Leptina Adiponectina Resistina Visfatina IL-6 TNF-α Figura 8. El tejido adiposo sintetiza y secreta una gran variedad de moléculas, agrupadas bajo el nombre genérico de adipocitoquinas. Dentro de las moléculas sintetizadas en el tejido adiposo se encuentran algunas de síntesis específica o, al menos, mayoritaria en los adipocitos (como la leptina o la adiponectina) así como otras moléculas, citoquinas, expresadas por un amplio número de tipos celulares (como la IL-6 o el TNF-α). Leptina Adiponectina Resistina Visfatina IL-6 TNF-α Figura 8. El tejido adiposo sintetiza y secreta una gran variedad de moléculas, agrupadas bajo el nombre genérico de adipocitoquinas. Dentro de las moléculas sintetizadas en el tejido adiposo se encuentran algunas de síntesis específica o, al menos, mayoritaria en los adipocitos (como la leptina o la adiponectina) así como otras moléculas, citoquinas, expresadas por un amplio número de tipos celulares (como la IL-6 o el TNF-α). Aunque se sabía que los adipocitos secretaban distintos tipos de moléculas como el colesterol, hormonas esteroideas o, fundamentalmente, ácidos grasos (155), la visión de este tejido como órgano endocrino ha cambiado radicalmente el descubrimiento, en el año 1994, de la leptina, una proteína sintetizada por el tejido adiposo blanco (159). 22 Introducción Actualmente se sabe que el tejido adiposo blanco sintetiza y secreta una amplia variedad de moléculas, muy distintas en cuanto a estructura y función, conocidas por el nombre genérico de adipocitoquinas (155, 160). Entre estas moléculas se encuentran citoquinas clásicas (como la IL-6 o el TNF-α), factores de crecimiento (como el TGF-β) o proteínas reguladoras del metabolismo de lípidos (como la proteína de unión al retinol) (155, 160). Además de estas moléculas ya conocidas y sintetizadas por otros tipos celulares, el tejido adiposo sintetiza otras proteínas, como la leptina, la adiponectina (161, 162), la visfatina (163) o la resistina (164), sintetizadas mayoritariamente por los adipocitos (160) (figura 9). Dichas moléculas son secretadas al torrente sanguíneo desde donde pueden ejercer sus funciones en órganos y tejidos muy distantes, actuando por tanto de forma endocrina (155, 160, 165). Debido a que el tejido adiposo produce por igual factores endocrinos y citoquinas, se ha reforzado la hipótesis que considera al tejido adiposo como un órgano esencial en la regulación de los procesos inflamatorios (155, 166) y a la obesidad como una condición inflamatoria en sí misma (165-168). 23 Introducción 3. La Leptina. En el año 1994, Zhang et al. (159) descubrieron que el gen ob (obesity), localizado en el cromosoma 7 de humanos y 6 de ratones, codificaba una proteína altamente conservada entre especies: la leptina. La etimología procede del griego (leptos, delgado) debido a que su principal función consistía en inhibir la ingesta, “informar” al cerebro de las reservas de tejido adiposo del organismo y producir sensación de saciedad e inhibir la ingesta. Figura 10. Estructura de la leptina. La leptina es una molécula no glucosilada de 16 kDa de estructura similar a la de otros miembros de la familia de citoquinas de la IL-6. Figura 10. Estructura de la leptina. La leptina es una molécula no glucosilada de 16 kDa de estructura similar a la de otros miembros de la familia de citoquinas de la IL-6. La leptina es una proteína de 16 kDa (figura 10), sintetizada principalmente en el tejido adiposo blanco (169), que se ha mantenido notablemente conservada a lo largo de la evolución; guardando una elevada homología entre especies (159, 170, 171). Por su estructura, la leptina recuerda a las citoquinas de la familia de la IL-6, a la que pertenecen la propia IL-6, la IL-11, la IL-12 o la oncostatina-M (OSM) (172, 173). Por tanto, la leptina es una molécula dual, hormona y citoquina, tanto a nivel estructural como funcional (174, 175). Los niveles circulantes de leptina están directamente relacionados con la acumulación de masa grasa. Se ha observado que los animales alimentados ad libitum presentaban niveles de expresión del ARNm de leptina y concentraciones de leptina 24 Introducción plasmática directamente proporcionales a la cantidad de masa grasa y el tamaño de los adipocitos y, además, se comprobó que las personas obesas también tenían una mayor expresión del ARNm y de la leptina circulante que los individuos delgados (176-178). Sin embargo, se descubrió que la expresión y la secreción de la leptina también está regulada por distintos estados fisiológicos. Durante el ayuno, e independientemente de la cantidad de masa grasa, se observa una disminución de los niveles de leptina (179, 180), los cuales se ven incrementados horas después de la ingesta (181, 182). Esta regulación de la secreción y síntesis de leptina a nivel “nutricional” está mediada, al menos en parte, por la insulina (183-185). Además de por el “estado nutricional”, la cantidad de tejido adiposo o la insulina, la liberación de leptina por los adipocitos está directamente regulada por distintas hormonas y factores reguladores como, por ejemplo, los glucocorticoides (186) o las citoquinas inflamatorias (38, 187-189). También se ha comprobado que existe una regulación “dependiente del sexo”, ya que mientras la testosterona inhibe la expresión de la leptina (190), los esteroides ováricos la incrementan (191). Se sabe, además, que en el promotor del gen ob se encuentran varios elementos necesarios para la unión de distintos factores de transcripción, como glucocorticoides o factores dependientes de AMPc (170, 171) que, junto con el estado nutricional, son los responsables de determinar la expresión de la leptina y, por tanto, su concentración plasmática. Además de en el tejido adiposo blanco, la leptina se sintetiza en otros tejidos como la placenta (192), los osteoblastos (193), el estómago (194) o en el cartílago articular (11). Se ha demostrado, además, que la leptina ejerce distintas funciones en esos tejidos periféricos. Así, se ha observado que después de un tratamiento con glucosamina los niveles de leptina se incrementan en el músculo esquelético (195). En el estómago, la expresión de leptina está estimulada por la ingesta, la gastrina y la 25 Introducción colecistoquinina (196). En la placenta, la expresión de la leptina está estimulada por la hipoxia y elevada durante la eclampsia, lo cual sugiere una participación de la leptina en el desarrollo fetal (197, 198). En los osteoblastos, se ha demostrado que la leptina promueve la mineralización ósea (193). Se ha descrito, además, que la leptina está presente en el líquido sinovial, al que fluye desde el plasma (199) y que, además, se sintetiza en los condrocitos articulares (11), incrementándose su expresión tras la administración de leptina exógena (11, 200). Por otra parte, se ha descrito que en algunos núcleos cerebrales se produce síntesis de novo de leptina (201, 202), lo cual sugiere una acción autocrina o paracrina de esta hormona aunque no exista una clara evidencia del papel fisiológico de la leptina producida localmente, si bien existen resultados que sugieren que la leptina producida en el cerebro podría estar remodelando las conexiones neuronales del núcleo arcuato (203). Así, atendiendo a la gran variedad de funciones ejercidas por la leptina, se puede entender la gran cantidad de alteraciones que presentan los individuos con mutaciones que implican un déficit en la función de la leptina. En humanos, muy rara vez se encuentran mutaciones en el gen ob que impliquen pérdida de funcionalidad (169). Al estudiar familias que presentan estas mutaciones, se ha comprobado que presentan alteraciones similares a las observadas e ratones ob/ob (hiperfagia, obesidad mórbida, hipogonadismo hipotalámico y déficit inmune) (159), aunque los efectos de la deficiencia de leptina en ratones implican alteraciones no observadas en los humanos: en humanos no se ha descrito que el déficit en leptina implique un incremento de los glucocorticoides, un desequilibrio de la termo-regulación o el desarrollo de resistencia a la insulina y diabetes (184). Una vez secretada, la leptina circula en el plasma de forma libre o unida a proteínas plasmáticas (169), entre ellas la isoforma corta del receptor de leptina (204, 26 Introducción 205). Estas proteínas son, posiblemente, las responsables del transporte de la leptina al interior del Sistema Nervioso Central (SNC) (206, 207). Allí ejerce sus funciones a nivel de regulación de la homeostasis energética uniéndose a un receptor específico, funcional, en el hipotálamo (208). Sin embargo, se ha demostrado que la leptina ejerce distintas funciones en numerosos tejidos periféricos que expresan la isoforma funcional del receptor de leptina, en los que además de actuar de forma endocrina, también actúa de forma paracrina e, incluso, autocrina ( 209-213). 27 Introducción 3.a El Receptor de Leptina La leptina actúa a través de un receptor específico (Ob-R) codificado por el gen db (diabetes). Este receptor se aisló por primera vez del plexo coroideo de ratones, siguiendo una estrategia de expresión clonal (214). El receptor de leptina pertenece a la superfamilia de receptores de citoquinas de clase I por compartir grandes similitudes con los receptores de la IL-6, la oncostatina, la prolactina o el factor inhibidor de leucemia (LIF) entre otros (204, 215). Aún cuando no esté presente el ligando, el Ob-R forma homodímeros que sólo son activos mediante cambios conformacionales inducidos por la unión con el ligando (216). Existen distintas isoformas del receptor (figura 11), seis en total, generadas por un procesamiento (splicing) alternativo a partir del mismo transcrito del gen db (204, 217). Figura 11. Isoformas del Receptor de Leptina. Todas las isoformas conocidas mantienen intacto su domino extracelular, en el que se localiza un dominio igual al de algunos receptores de citoquinas (DRC). Sin embargo, sólo la isoforma larga, Ob-Rb, mantiene intacto el domino intracelular, con sus tres motivos intracelulares consenso (Box 1, 2 y 3) y la capacidad de transducir señales. Ob-Rb Ob-Ra Ob-Rc Ob-Rd Ob-Re Ob-Rf Box 1 Box 1 Box 1 Box 1 Box 1 Box 2 Box 3 DRC DRC DRC DRC DRC DRC Figura 11. Isoformas del Receptor de Leptina. Todas las isoformas conocidas mantienen intacto su domino extracelular, en el que se localiza un dominio igual al de algunos receptores de citoquinas (DRC). Sin embargo, sólo la isoforma larga, Ob-Rb, mantiene intacto el domino intracelular, con sus tres motivos intracelulares consenso (Box 1, 2 y 3) y la capacidad de transducir señales. Ob-Rb Ob-Ra Ob-Rc Ob-Rd Ob-Re Ob-Rf Box 1 Box 1 Box 1 Box 1 Box 1 Box 2 Box 3 DRC DRC DRC DRC DRC DRC Cuatro de las isoformas cortas (Ob-Ra, Ob-Rc, Ob-Rd y Ob-Rf) conservan los dominios extracelular y transmembrana intactos, además de parte del dominio 28 Introducción intracelular, con uno de los dominios consenso, “Box1”. Estas isoformas del receptor tienen un papel fundamental en la internalización de la leptina, su transporte a través de la barrera hematoencefálica y su degradación (204, 206, 209, 217); no obstante, en ratas Koletsky, se ha demostrado que el transporte de leptina a través de la barrera hematoencefálica es independiente de los receptores de leptina (218). Se ha descrito que algunas de esas isoformas cortas del receptor, sin la región intracelular completa, son capaces de reclutar Jaks y activar ciertas rutas de señalización (219). La otra isoforma corta (Ob-Re) sólo conserva el dominio extracelular; circula como “receptor soluble” y une la leptina plasmática con gran afinidad, por lo cual se cree que participa en la regulación de los niveles de leptina libre, activa, en el plasma (220-222). Sólo la isoforma larga del receptor de leptina, Ob-Rb, es completamente funcional. Esta es la forma completa del receptor, con sus tres dominios completos, capaz de unir leptina y transducir señales y expresada fundamentalmente en el hipotálamo (220). Además de en el hipotálamo, el Ob-Rb se expresa en muchos otros órganos y tejidos periféricos, como el estómago, los islotes pancreáticos o el cartílago articular (194, 223-226). Ateniéndonos a la estructura del receptor en su forma larga y a su capacidad de transducir señales, podemos diferenciar una región extracelular del Ob-R, que consta de cuatro dominios de Fibronectina tipo III y dos dominios de receptor de citoquina (216, 227). La función de esta región es la de la unión específica con el ligando, la leptina. En su región intracelular se encuentran todos los dominios necesarios para la transducción de señal. El receptor de leptina no contiene un dominio tirosín-quinasa intrínseco en su región intracelular, pero sí contiene dominios de unión a tirosín-quinasas citoplasmáticas, Jak-2 fundamentalmente (216, 227). 29 Introducción observa un incremento en la expresión de genes que median la termogénesis adaptativa, como las proteínas desacoplantes (UCP, uncoupling protein) 1 y 3 (259, 262-264). Además de con los péptidos anteriormente mencionados, se ha descrito una relación directa entre los niveles de leptina e insulina por lo que se ha postulado, incluso, que la hiperleptinemia podría ser indicativa de resistencia a insulina (265, 266). Según lo descrito, al igual que la presencia de niveles altos de leptina es percibida como una señal de saciedad, su déficit actúa como una señal de ayuno que conduce a mecanismos compensatorios como la hiperfagia, la disminución de la actividad metabólica o la modulación de los niveles de distintos péptido para, así, equilibrar la homeostasis energética (256, 257). 3.b.2 Leptina y reproducción. Desde el momento de su descubrimiento, se entendió que la leptina podría ser un elemento de unión entre el tejido adiposo y el hipotálamo; algo que, a nivel de desarrollo reproductivo, podría confirmar las hipótesis que relacionaban la menarquia con el alcance de un determinado peso corporal y no con la edad, siendo en este caso el tejido adiposo el factor clave para el inicio de la pubertad (267-269). Se ha comprobado que existen diferencias significativas entre los niveles de leptina de ratas hembras y machos (270) lo cual parece indicar que la leptina podría estar afectando de alguna forma la función gonadal y que la administración de leptina exógena solventa las disfunciones reproductivas, relacionadas con un hipogonadismo hipotalámico, que sufren los ratones ob/ob (271, 272). Asimismo, se ha comprobado que la leptina regula tanto la secreción de LH (luteinizing hormone) como el desarrollo normal de la pubertad (273, 274). Se ha demostrado además que el bloqueo de leptina endógena detiene el ciclo estral normal de la rata e implica un retraso en la apertura 36 Introducción vaginal (274, 275). Estos resultados evidencian la importancia de la leptina en el desarrollo sexual, la pubertad y los ciclos reproductivos (276). Se ha comprobado, además, que el estradiol induce un incremento en la expresión de la leptina (277), con lo cual, además de por las variaciones de peso corporal que inducen las hormonas gonadales, se evidencia un efecto directo sobre la regulación de la leptina. 3.b.3 Acciones de la leptina sobre el eje HPA. Existen evidencias que indican que la leptina controla el eje hipotalámicohipofisario-adrenal (HPA) independientemente de su papel en el balance energético (278). Se ha demostrado que la deficiencia o insensibilidad a la leptina está asociada con un incremento de los niveles de glucocorticoides (186) y que los niveles de corticosterona decrecen tras la administración de leptina exógena (279-281). Por otra parte, se sabe que la leptina inhibe la actividad del eje adrenal mediante la regulación de la expresión de la CRH (corticotropin-releasing hormone), lo cual no resulta sorprendente teniendo en cuenta la elevada expresión de Ob-R en las neuronas CRH del núcleo paraventricular (282-287). La interacción entre la leptina y el eje HPA va más allá de la regulación de la expresión de los niveles de los glucocorticoides y las distintas moléculas que en él participan. Resultados recientes han demostrado que la administración de leptina a ratones ob/ob, con proporciones de sinapsis excitadoras e inhibidoras tanto del NPY como de la POMC alteradas con respecto a los ratones wt (203), recupera la densidad sináptica normal con gran rapidez seis horas después de ser administrado, sugiriendo que la leptina media la plasticidad neuronal del hipotálamo de ratones ob/ob (203). 37 Introducción 3.b.4 Acciones de la leptina sobre la secreción de la GH. Se han encontrado numerosas evidencias que relacionan los niveles de leptina con la regulación de la secreción de la hormona de crecimiento y viceversa. Los niveles de leptina están aumentados, posiblemente debido al incremento de la masa grasa, en modelos deficientes en GH (288); por otra parte, se ha demostrado que la administración de GH induce la expresión de la leptina en individuos deficientes en GH (289). Otros trabajos han demostrado que la leptina regula, in vivo, la expresión de la GH (290) interactuando con el NPY (291). Además, la leptina, junto con la ghrelina, regula la expresión del receptor de GH en el núcleo arcuato de ratas (292). Se ha demostrado que, a pesar de que la leptina y la ghrelina actúan como “antagonistas funcionales” a distintos niveles (293, 294), la leptina aumenta la respuesta de la GH a sus secretagogos GHRP6 (growth hormone releasing peptide 6) y GHRH (growth hormone releasing hormone) (295). La secreción de GH está disminuida en humanos obesos y, teniendo en cuenta que la leptina está incrementada durante la obesidad, se postuló que es esta hormona la encargada de regular negativamente la secreción de GH. Se ha comprobado, sin embargo, que la inhibición de la secreción de GH presente en individuos obesos no depende de las acciones de la leptina (296). Por otra parte, se han co-localizado el STAT-3 y el Ob-R con la hormona secretora de la hormona de crecimiento (GHRH) y la somatostatina (297, 287), lo cual evidencia la interacción estrecha y directa que existe entre la leptina y el eje somatotropo. 38 Introducción 3.b.5 La leptina en la respuesta inmune y en los procesos inflamatorios. Como hemos comentado, la leptina recuerda estructuralmente a una citoquina de cadena helicoidal larga. Por su dualidad hormona-citoquina, desde un primer momento se postuló que la leptina podría estar integrando dos sistemas capitales: el sistema neuroendocrino y el sistema inmunitario. El hecho de que los niveles de leptina aumenten durante procesos infecciosos e inflamatorios sugirió que, efectivamente, la leptina podría estar formando parte de la compleja red de citoquinas encargadas de modular dichos procesos. A continuación pasaremos a ver el papel de la leptina en la respuesta inmune así como su participación en la regulación y el desarrollo de procesos inflamatorios en distintos sistemas. 3.b.5.1 La leptina en la respuesta inmune. La leptina está regulada durante la respuesta de fase aguda, siguiendo el mismo patrón que aquellos reactantes de fase aguda en condiciones caracterizadas por la síntesis y secreción de, entre otros, el TNF, la IL-1 y la IL-6 (38, 187, 188). Los niveles de leptina se incrementan de forma considerable durante los procesos infecciosos e inflamatorios en respuesta a distintos estímulos, como puedan ser los lipopolisacáridos de pared bacteriana, la turpentina o distintas citoquinas (298, 299). En la inmunidad innata, la leptina promueve la activación de los monocitos y la activación de los procesos fagocíticos de macrófagos (299). En ratones control, las altas dosis de leptina elevan los niveles de citoquinas producidas por macrófagos, así como su actividad fagocítica, inducida por el LPS (175, 176). Se ha comprobado, además, que la leptina modula la actividad y la función de los neutrófilos de forma directa, en ratones (300-302), o a través de una ruta mediada por el TNF, en humanos (303). Además, se ha demostrado que la leptina aumenta la 39 Introducción citotoxicidad de las células NK (304-306). En concordancia con esos resultados, la deficiencia en leptina incrementa el número de monocitos circulantes en ratones ob/ob, (307) los cuales, además, presentan una actividad fagocítica alterada (299). En cuanto a las acciones de la leptina sobre la respuesta inmune adaptativa, se sabe que la leptina induce la activación y proliferación de los linfocitos T, al mismo tiempo que los protege frente a la apoptosis (308). Al mismo tiempo, la leptina polariza la diferenciación de las células T hacia la respuesta Th1 (308), influyendo, por tanto, en el patrón de secreción de citoquinas. También se ha demostrado que la leptina interacciona con los antígenos co-estimuladores de las células T, CD28, CTLA-4 y CD26 (309) en la inducción de respuesta inmune. Con respecto a la actuación de la leptina como citoquina reguladora de los procesos inmunes, merece ser destacado el trabajo de Lohmus et al. en el cual demuestran que la leptina induce la proliferación de linfocitos T en aves (310). Este resultado, además de concordar con los estudios realizados en mamíferos, resalta la importancia de la leptina como inmuno-modulador a lo largo de la cadena evolutiva. Además de su acción sobre los linfocitos T, la leptina participa en la respuesta inmune regulando la expresión de distintas citoquinas (311-313) las cuales, a su vez, regulan la síntesis y secreción de la leptina (38, 187, 188). Por otro lado, la leptina regula la activación de los monocitos, la fagocitosis, la expresión de moléculas de adhesión y el estrés oxidativo en células endoteliales (314, 315). En neutrófilos, la leptina inhibe distintas vías apoptóticas, bloqueando la acción de distintas proteínas inductoras de la apoptosis (316). Se ha postulado, además, que la administración de leptina podría ser empleada como un tratamiento en condiciones de inmunosupresión (317). Estudios recientes parecen confirmar esa hipótesis (318, 319). 40 Introducción 3.b.5.2 La leptina en la respuesta inflamatoria Resulta casi imposible separar las respuesta inmune de las inflamatoria ya que esta última está fuertemente vinculada con la primera. Así, es fácil entender que la leptina regula el componente inmune de las respuestas inflamatorias, actuando como ya hemos detallado en el punto anterior y como ha sido ampliamente revisado (174, 175). En este apartado, centraremos nuestra atención en el papel de la leptina como modulador de los procesos inflamatorios. Se ha demostrado que los niveles plasmáticos de leptina y la expresión de su ARNm están regulados por distintas moléculas pro-inflamatorias (38, 187, 188). Además, los niveles circulantes de leptina están elevados en modelos experimentales de inflamación aguda (188), aunque este incremento no se observe siempre en los humanos (320). La regulación de la expresión y los niveles circulantes de leptina por parte de estímulos pro-inflamatorios sugirió la participación de esta adipocitoquina en el desarrollo de los procesos inflamatorios. Estudios posteriores en distintos modelos de inflamación autoinmune confirmaron que, efectivamente, la leptina desempeñaba un papel importante en la regulación de la respuesta inflamatoria. Se ha demostrado que los ratones ob/ob son resistentes o, como mínimo, menos susceptibles a desarrollar una serie de patologías inflamatorias. Así, se comprobó que los ratones deficientes en leptina no desarrollaban, o lo hacían de forma menos severa, artritis inducida por colágeno, hepatitis experimental, colitis (tanto en su forma aguda como crónica) o encefalomielitis (304, 321-323). En los modelos experimentales mencionados, la deficiencia en leptina implicaba una reducción en la severidad de la inflamación y, en todos los casos estudiados, la administración de leptina exógena conllevaba la recuperación de la secreción normal de 41 Introducción todos los mediadores de la inflamación, así como un incremento de la susceptibilidad al desarrollo de la patología (304, 321-323). Recientemente se ha demostrado que la leptina aumenta la susceptibilidad a la hepatotoxicidad mediante la regulación de la producción de citoquinas y la activación de las células T (305). Además, se ha observado que la administración de leptina incrementa los niveles de la proteína C reactiva y la selectina-P al mismo tiempo que induce la activación y agregación plaquetaria durante la deprivación calórica (324). Se han descrito, además, numerosas implicaciones de la leptina en distintas patologías inflamatorias en humanos. Así, se ha comprobado que la leptina está implicada en el desarrollo de la caquexia inflamatoria en patologías asociadas a la inflamación intestinal o en la recuperación de peso una vez superadas dichas patologías (325-328). La leptina parece estar modulando los procesos inflamatorios en pacientes con esclerosis múltiple en fase de relapso, en los que aumenta la secreción de citoquinas de las células mononucleares de la sangre periférica (329). Se ha observado, además, que los niveles plasmáticos de leptina y de su receptor soluble están elevados en individuos con insuficiencia cardiaca crónica en estado avanzado así como en individuos jóvenes con presión arterial elevada. En estos sujetos, los niveles de leptina están relacionados con niveles altos de proteína C reactiva y con un índice de masa corporal elevado; además, es posible que las elevadas concentraciones plasmáticas de TNF-α sean las responsables del incremento de la expresión de leptina (330, 331). Por tanto, tal y como queda reflejado por los modelos y resultados mencionados, la leptina desempeña un papel fundamental en el desarrollo de la respuesta inflamatoria, actuando de igual forma que la de las citoquinas pro-inflamatorias clásicas. 42 Introducción 3.c La leptina en el cartílago articular. Los condrocitos, las células mayoritarias en el cartílago articular maduro, se mantienen en un delicado equilibrio entre la síntesis y la degradación de los componentes de la matriz extracelular del cartílago articular (2); equilibrio que se rompe en patologías con afectación articular, como la artritis reumatoide o la artrosis (2, 28, 53). En el año 2001, Figenschau et al. descubrieron que los condrocitos del cartílago articular humano expresaban la isoforma funcional del receptor de leptina (225) y que, además, los condrocitos tratados con leptina proliferaban y sintetizaban los componentes de la matriz extracelular a mayor velocidad (225). Así, se describía una nueva función periférica de la leptina y, por primera vez, un efecto directo de esta hormona sobre el componente principal del cartílago articular: los condrocitos. En estudios posteriores se confirmó la implicación de la leptina en la proliferación de los condrocitos (332, 333) y se descubrió que la leptina, a través de la modulación de la angiogénesis, regula la osificación endocondral (334) e incrementa la expresión del receptor de IGF-1 (insulin-like growth factor-1) en los condrocitos, actuando así como un factor de crecimiento en las placas de crecimiento (335). Además, la leptina revierte el efecto de la restricción calórica en el crecimiento longitudinal, aumentando el tamaño de la placa de crecimiento e induciendo un incremento en la velocidad de proliferación y diferenciación de los condrocitos (336). Los cultivos primarios de condrocitos de ratones ob/ob tratados con leptina presentan una reducción de su tasa de mineralización (337); asimismo, la leptina altera la expresión de colágeno tipo X y reduce la tasa de apoptosis y la calcificación de la matriz en la línea murina ATDC5 (337). Se descubrió, además, que los condrocitos expresaban y secretaban leptina (11). 43 Introducción Sin embargo, aún cuando las funciones de la leptina como molécula proinflamatoria y reguladora de la respuesta inmune han sido ampliamente demostradas y descritas (174, 175), poco se sabe acerca de los efectos directos de esta adipocitoquina sobre los condrocitos en los procesos degenerativos e inflamatorios con afectación articular. Aunque la participación de la leptina en patologías con afectación articular, como la artritis reumatoide o la artrosis, ha sido postulada, no existían hasta la actualidad pruebas concretas sobre el papel de esta adipocitoquina a nivel condrocitario. En la artritis reumatoide, se ha observado que los niveles circulantes de la leptina, y de otras adipocitoquinas, están aumentados independientemente de la acumulación de tejido adiposo (38, 187, 188, 338). Sin embargo, en un estudio reciente se sugiere que la inflamación crónica podría estar provocando una disminución en los niveles plasmáticos de leptina (339). No obstante, en este estudio los autores no muestran diferencias significativas entre los niveles circulantes de leptina de los individuos control y los pacientes con AR. Tampoco aciertan a mostrar variaciones en los niveles de leptina después del tratamiento con anti-TNF, a pesar de que sí observan que este tratamiento implica una disminución significativa de los parámetros de la inflamación (339). En el año 2003, Bokarewa et al. (199) determinaron los niveles de leptina, plasmática y sinovial, en pacientes con AR en comparación con los de individuos sanos. Encontraron que los niveles de leptina eran significativamente mayores en el plasma que en la sinovia, estando las mayores diferencias en los pacientes con artritis no erosiva (199). Por tanto, los autores concluyeron que la leptina plasmática fluye a la articulación y protege al cartílago articular durante la AR (199). A pesar de que esos datos resultan muy interesantes para comprender el papel de la leptina en la artritis reumatoide, hay que tener en cuenta que dichos resultados necesitan ser confirmados e interpretados de forma rigurosa, ya que la población de pacientes 44 Introducción seleccionada para el estudio había sido tratada con fármacos que pueden alterar de forma significativa los niveles circulantes de la leptina (340). Existe una clara relación entre la obesidad y algunos tipos de artrosis (5, 8-10, 341-345). Muchos estudios han sugerido que la leptina, debido a sus acciones proinflamatorias (174) y a su relación directa con la acumulación de tejido adiposo (176- 178), podría explicar dicha relación (346). Así, se ha sugerido que durante la menarquia la leptina podría estar mediando las acciones del tejido adiposo sobre el entorno óseo e influenciando el desarrollo de la osteoporosis y la artrosis (347). También se ha sugerido que la disminución de los niveles de leptina plasmática puede ser una de las razones por las que la pérdida de peso mejora las funciones motoras de los pacientes con artrosis (348). Recientemente, Dumond et al. (11) han demostrado que los condrocitos artrósicos expresan mayor cantidad de leptina que los condrocitos normales y que, además, la administración intra-articular de leptina inducía un aumento de expresión de la hormona en el cartílago articular. Además, mostraron resultados en los que se reflejaba que la administración de leptina estimulaba las funciones anabólicas de los condrocitos (11). En este estudio, los autores observan que la leptina auto-regula positivamente su expresión y sugieren que esta hormona puede participar en la fisiopatología de la artrosis (11) siendo, por tanto, el enlace entre la artrosis y la obesidad (11, 200). Sin embargo, Dumond et al. no consiguen mostrar ninguna evidencia, directa o indirecta, de que el papel de la leptina en los condrocitos articulares, normales o artrósicos, sea pro- o anti-inflamatorio. 45 Objetivos 52 Materiales y Métodos 1.Cultivos celulares 1.a Línea celular ATDC5 La línea celular condrogénica murina ATDC5 ha sido una aportación del Dr. Agamemnon E. Grigoriadis (Dept of Craniofacial Development King’s College, London Guy’s Hospital, London Bridge, London SE1 9RT, UK). Esta línea celular se aisló en el año 1990 a partir de un cultivo de teratocarcinoma con características fenotípicas fibroblásticas durante su fase de crecimiento (349). Posteriormente, se observó que la insulina (a una concentración de 10µg/ml), sin alterar la velocidad de división de las células, permitía el crecimiento celular aún después de la fase de confluencia e inducía la formación de agregados similares a los nódulos que se forman en el cartílago (350). Al teñir esta línea celular con azul alcián se comprobó que sintetizaba proteoglicano y colágeno tipo II, ambos marcadores específicos de condrogénesis (350). Así, se llegó a la conclusión de que esta línea celular es un modelo óptimo para el estudio de los procesos de diferenciación condrocítica. Otros estudios demostraron que las células ATDC5 expresaban el receptor para la hormona paratiroide (PTH) sólo en su estado diferenciado, y que la unión específica de la PTH a las células aumentaba con la formación de nódulos; en su estado condrogénico, las células no expresaban dicho receptor (351). Además, se descubrió que las células ATDC5 se volvían hipertróficas cuando el crecimiento celular se detenía (350). La hipertrofia de los condrocitos va acompañada de la expresión de colágeno tipo X y el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina; ese proceso también tenía lugar en las células hipertróficas de la línea ATDC5 (350, 351). Por otro lado, se descubrió que la expresión de c-fos inhibía la diferenciación de la línea ATDC5 a condrocitos 53 Materiales y Métodos (352) y que las células ATDC5 hipertróficas expresan, además de colágeno tipo X, osteopontina, un marcador de diferenciación condrocítica terminal (353). Por tanto, se ponía de manifiesto que la línea ATDC5 era un modelo óptimo para el estudio de los procesos de diferenciación del cartílago ya que permitía estudiar de forma controlada y, de ser necesario, regulada, el estado de diferenciación celular. El hecho de poder trabajar con una misma línea en tres estados distintos de diferenciación (condrogénico – condrocito maduro – condrocito hipertrófico) hizo que ésta fuese la línea seleccionada para llevar a cabo la mayoría de los experimentos de este trabajo. Con esta línea se realizaron estudios en los que se buscó mimetizar el estado de los condrocitos en el cartílago articular sometido a inflamación crónica, en el que la gran mayoría de los condrocitos han perdido su fenotipo (52, 53), y, posteriormente, confirmar que los resultados obtenidos eran reproducibles en condrocitos maduros e hipertróficos, asegurándonos así de que los resultados obtenidos no dependían del estado de diferenciación. Para su mantenimiento, las células se cultivaron en medio DMEM/F12 Hams’ suplementado con el 5% de Suero Fetal Bovino (FBS), antibiotico (50U/ml penicilina y 50µg/ml estreptomicina), apo-transferrina (10µg/ml) y selenito sódico (3X10-8). Para sucesivos pases y mantenimiento en cultivo, las células se despegaron una vez alcanzado el 80% de confluencia, aproximadamente cada 2-3 días. Para ello se retiró el medio de cultivo, se lavaron las células con 3 ml de Tampón Fosfato Salino 1X (PBS: NaCl 8g/l, KCl 2g/l, Na2HPO4 1.44g/l, KH2PO4 0.24g/l) y se despegaron usando 1 ml deTripsina/0.5% EDTA por cada placa Petri. Las células se dejaron unos 5 minutos a 37ºC después de lo cual se resuspendieron en medio con suero y sembraron a una densidad de 3x105 células por placa Petri. 54 Materiales y Métodos 1.a.1 Diferenciación de las células ATDC5 Para los ensayos de diferenciación, las células se sembraron a una densidad de 6x104 células por cm2. Se mantuvieron en cultivo durante 21 días. El medio, con un suplemento de insulina (10µg/ml), se cambió cada 2/3 días durante los primeros 21 días. Una vez pasado este tiempo, las células ya se habían diferenciado a condrocitos (a partir del día 15 ya expresaban los distintos marcadores que las distinguen como tales); en ese momento se sustituyó el medio estándar (DMEM/F12 Hams + Antibiótico + Insulina (10µg/ml) + Apo-transferrina + Selenito Sódico + 5% FBS) por DMEM α-modificado + Antibiótico + Insulina + Apo-transferrina + Selenito Sódico + 5% FBS si lo que se quería era obtener condrocitos maduros hipertróficos. 1.b Aislamiento y cultivo primario de condrocitos humanos: Todas las muestras humanas han sido obtenidas previa firma del preceptivo consentimiento informado por parte de los pacientes. Dicho consentimiento informado se realizó según la declaración de Helsinki y el proyecto fue aprobado y revisado por el Comité Ético de Galicia de Investigación Clínica. Se necesitó, además, conocer parte del historial clínico de los pacientes de tal forma que se descartaron las muestras de pacientes tratados con glucocorticoides u otros fármacos que pudieran afectar a los experimentos llevados a cabo con los condrocitos primarios. En la artroplastia, se extrajo el cartílago articular procurando seleccionar y separar el cartílago normal, “sano”, del cartílago artrósico. El cartílago se incluyó, siempre en condiciones estériles, en medio sin suero: DMEM/F12 + Antibiótico (50U/ml penicilina y 50µg/ml estreptomicina). 55 Materiales y Métodos Se troceó el cartílago y se incubó en una solución de Pronasa (1 mg/ml en DMEM/F12 + Antibiótico + 10% FBS) durante 30 minutos a 37ºC en agitación continua. Pasado ese tiempo, se retiró la solución de Pronasa y se el cartílago se lavó dos veces con PBS 1X. A continuación se incubó el cartílago ya lavado en una solución de Colagenasa P (1 mg/ml en DMEM/F12 + Antibiótico + 10% FBS) toda la noche (entre 12 y 15 horas) a 37ºC en agitación constante. Después de la incubación con Colagenasa P, la suspensión se pasó a través de un filtro de 40-70 µm. Después de filtrar, se centrifugó la suspensión durante 8-10 minutos a 200xg. Después de la centrifugación, se realizaron dos lavados en PBS 1X (centrifugar nuevamente durante 8-10 minutos, 200xg después de cada lavado) y un lavado en DMEM/F12 + Antibiótico + 10% FBS. Finalmente, se contaron las células, distinguiendo células vivas de células muertas mediante Tripan Blue, y se sembraron a la densidad deseada en medio completo (DMEM/F12 + Antibiótico + 10% FBS). Para su mantenimiento en cultivo, se renovó el medio de cultivo a los condrocitos primarios cada dos días. En caso de ser necesario realizar pases a los condrocitos, se empleó 1ml de Tripsina/0.5% EDTA después de haber retirado el medio de cultivo y lavado las células con PBS. Una vez añadida la tripsina, las células se dejaron a 37ºC durante unos 5 minutos para, posteriormente, resuspender las células en medio completo y sembrarlas a la densidad deseada, bien para la realización de experimentos bien para su mantenimiento en cultivo. 56 Materiales y Métodos Todos los experimentos se llevaron a cabo con condrocitos primarios con menos de tres pases. 2. Tratamientos: concentraciones y tiempos. Las distintas concentraciones y tiempos de tratamiento empleados en los experimentos realizados en este trabajo se fijaron realizando distintos experimentos de dosis y tiempo respuesta. Así, se optimizaron unas condiciones en cuanto a concentraciones, de citoquinas o inhibidores, y tiempos de tratamiento. 2.a Concentraciones Para la determinación de la concentración óptima de leptina se realizaron experimentos de dosis respuesta (100, 200, 400, 600 y 800 nM) que permitieron fijar las dosis de leptina a utilizar en 400nM para los experimentos con IFN-γ y 800 nM para aquellos realizados en presencia de IL-1. Después de experimentos dosis respuesta con IFN-γ (0.1, 0.25, 0.5 y 1 ng/ml), la concentración óptima se fijó en 0.5 ng/ml. De manera análoga, la concentración de IL-1 se fijó en 0.025ng/ml después de distintos experimentos dosis respuesta en los que se habían probado concentraciones de 0.01, 0.025 y 0.05 ng/ml de IL-1. Con esta dosis obteníamos respuesta en cuanto a producción de nitritos y dicha producción no era tan elevada como para solapar el efecto de la leptina. Se emplearon dos inhibidores de la NOS tipo II, la Aminoguanidina y el L- NAME. Después de experimentos con distintas dosis para ambos (0.25, 0.5 y 1 mM para la Aminoguanidina; 25, 50, 100 y 200 µM para el L-NAME ) se fijaron las dosis a 57 Materiales y Métodos emplear en los sucesivos experimentos en 1 mM para la Aminoguanidina y el 100 µM para L-NAME. El D-NAME, isómero inactivo empleado como control negativo, se empleó a la misma concentración que el L-NAME. En los ensayos llevados a cabo para confirmar que la producción de nitritos observada se debía a la inducción de la síntesis de NOS tipo II y no sólo a la inducción de la actividad de la enzima ya sintetizada, se empleó un glucocorticoide inhibidor de la síntesis de novo de la NOS, la Dexametasona. Después de haber probado distintas concentraciones (1, 2, 5 y 10 µM), se estableció una concentración de Dexametasona 5 µM para los distintos experimentos. Para delinear la ruta de señalización implicada en la inducción de NOS tipo II se emplearon inhibidores específicos para distintas kinasasa: Jak-2 (Tyrphostin AG490 y Tkip), PI-3K (Wortmannin y LY 294002), MEK1 (PD 098,059) y p38K quinasa (SB 203580). Se realizaron pruebas con distintas concentraciones (1, 5, 10 y 20 µM) de Tyrphostin AG490 fijándose la concentración 10 µM como aquella a emplear en los distintos experimentos. El Tkip (WLVFFVIFYFFR), un péptido mimético del supresor de señalización de citoquinas (SOCS)-1 que inhibe la auto-fosforilación de Jak-2 (354), ha sido una amable aportación del Dr. Howard M Johnson (Institute of Food and Agricultural Science, Deprtment of Microbiology and Cell Science, University of Florida, Gainesville, USA). Todos los experimentos de producción de nitritos en presencia de Tkip serían reflejados como experimentos dosis dependientes (1, 5, 20 y 50 µM) fijándose la dosis de 50 µM como aquella a emplear en los experimentos de Western blot. 58 Materiales y Métodos Igualmente, los otros inhibidores empleados en la ruta de señalización se añadieron siempre a distintas dosis en los experimentos de producción de nitritos (Wortmannin [1, 2.5, 5 y 10 µM]; LY 294002 [ 1, 2.5, 5 y 10 µM]; PD 098,059 [ 1, 5, 10, 20 y 30µM] y SB 203580 [1, 5, 10, 20 y 30µM]) empleándose las dosis máximas de cada uno de ellos en los experimentos de Western blot y PCR en tiempo real. 2.b Tiempos Con el fin de establecer tiempos experimentales óptimos se realizaron experimentos en los que se estudiaba la respuesta, en cuanto a la inducción de la NOS tipo II o la producción de NO, en función del tiempo en el que se trataron los cultivos celulares. Los tiempos a los que se realizaron los experimentos fueron 6, 12, 24, 48 y 72 horas. Finalmente, en función de la respuesta observada, se fijaron los siguientes tiempos: -Experimentos de producción de nitritos: 24 y 48 horas. -Experimentos de PCR cuantitativa y Western blot: 24 horas. 3. Determinación de nitritos: ensayo colorimétrico de Griess. Para los experimentos en los que se realizó la determinación de la producción de óxido nítrico por parte de los condrocitos primarios o de la línea celular ATDC5, las células se sembraron en placas de 24 pocillos, 80.000 células por pocillo en 1 ml de medio de cultivo (en los experimentos realizados con ATDC5 diferenciadas, las células se diferenciaron previamente para lo cual se sembraron a una densidad de 6x104 células por cm2 y se mantuvieron en cultivo durante, al menos, 15 días). 59 Materiales y Métodos Una vez que las células estuvieron adheridas de forma estable (aproximadamente 8 horas después de sembradas) se serodeprivaron durante 6-8 horas. Con la serodeprivación se buscaba detener y sincronizar el ciclo de crecimiento y la actividad metabólica de las células, eliminar los distintos componentes del suero para evitar posibles interferencias con nuestros tratamientos y liberar a los distintos receptores de membrana de sus respectivos ligandos. Pasado ese tiempo, se realizaron los distintos tratamientos, tanto con los inhibidores farmacológicos empleados como con las distintas citoquinas a las dosis previamente fijadas. Una vez pasadas 24 o 48 horas, el tiempo fijado mediante los experimentos preliminares, se retiró el medio de cultivo. 1) 2) COLORANTE DIAZOICO Figura 13. Reacción de Griess.En la determinación colorimétrica de nitritos según Griess, los nitritos (ácido nitroso) reaccionan con la sulfanilamida dando ácido 4-diazobencenosulfónico [1]. Éste se condensa con la α-naphtylamina formando un colorante rojo-violeta, ácido diazoico [2]. 1) 2) COLORANTE DIAZOICO 1) 2) 1) 2) COLORANTE DIAZOICO Figura 13. Reacción de Griess.En la determinación colorimétrica de nitritos según Griess, los nitritos (ácido nitroso) reaccionan con la sulfanilamida dando ácido 4-diazobencenosulfónico [1]. Éste se condensa con la α-naphtylamina formando un colorante rojo-violeta, ácido diazoico [2]. 60 Materiales y Métodos Se centrifugó el medio de cultivo para eliminar la presencia de células en él y se pasó a la determinación de la producción de óxido nítrico por parte de las células. Dicha determinación se realizó de forma indirecta, a través de la presencia de nitritos en el medio de cultivo mediante el ensayo colorimétrico de Griess. Para ello se emplearon dos reactivos [Sulfanilamida 1% en ácido fosfórico al 5% en agua (P/V) y α-naphtylamina al 0.1% en agua (P/V)] mezclados en una relación 1:1. Posteriormente se mezclaron volúmenes iguales del reactivo de Griess y el medio de cultivo en el que determinábamos la cantidad de nitritos: se mezclaron 100µl de medio y 100µl de solución de trabajo por cada uno de los distintos tratamientos. Se hicieron mediciones en duplicado por cada uno de los puntos. El medio sin suero se utilizó como blanco. Se dejó reposar 5-10 minutos a temperatura ambiente. Los nitritos, el ácido nitroso, reaccionan con la sulfanilamida formando ácido 4- diazobencenosulfónico, el cual reacciona con la α-naphtylamina dando lugar a un colorante rojo-violeta, sal de diazonio. La intensidad de color es mayor cuanta mayor es la cantidad de nitrito en el medio de cultivo. Una vez pasados 5-10 minutos, se determinó la cantidad de nitrito midiendo la absorbancia a 520-550 nm en un lector de ELISA evitando la formación de burbujas que alterasen las lecturas de absorbancia dentro de los pocillos. A partir de las absorbancias obtenidas y, debido a la relación linear existente entre la absorbancia y la concentración descrita por Lambert-Beer, es posible extrapolar la concentración de nitritos presente en el medio de cultivo interpolando las absorbancias obtenidas en una curva estándar, previamente realizada a partir de distintas diluciones de nitrito sódico (0 - 0.0625 - 0.125 - 0.25 - 0.5 – 1 – 2 – 4 – 6 µg/ml). 61 Materiales y Métodos principio) fuese 0 y todos los resultados obtenidos en comparación con éste partiesen de ese punto. 8. Western Blot. Mediante esta técnica se analizó la expresión diferencial de la proteína de NOS tipo II en las células ATDC5 y el cultivo primario de condrocitos humanos al ser tratados con las distintas citoquinas e inhibidores específicos. Para ello, las células se sembraron en placas petri a una densidad de 1x106 células por placa. Se dejaron pegar completa y establemente. Posteriormente las células fueron serodeprivadas durante 8 horas, después de las cuales se trataron con los distintos inhibidores y citoquinas durante 24 horas. Pasado ese tiempo se lisaron las células para la extracción de proteína total. Se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS 1X a 4- 8ºC. Una vez lavadas, las células se despegaron raspando y usando 200µl de tampón de lisis (Triton, Tris 1M pH 7.5, PMSF 100M, NaVO4 0.1M, Pirofosfato sódico 100mM, EDTA 0.5 M, Aprotinina, Leupeptina, NaF 1X). Los lisados se transfirieron a tubos de micro-centrífuga de 1.5ml y se incubaron durante 15-20 minutos en hielo, pipeteando arriba y abajo cada 5 minutos para favorecer la lisis. Los lisados se centrifugaron a 21470xg durante 15 minutos a 4ºC. El sobrenadante, que contiene el lisado celular total, se transfirió a tubos de micro-centrífuga de 1.5ml. Una vez obtenido el lisado celular, se cuantificó la cantidad total de proteína mediante el método colorimétrico de Bradford que, enfrentando la absorbancia de una 68 Materiales y Métodos muestra desconocida con la de un muestra con una cantidad de proteína conocida, nos permitió extrapolar la cantidad de proteína en nuestras muestras. La recta estándar se preparó partiendo de albúmina bovina sérica (BSA) a una concentración de 1mg/ml y reactivo Biorad 1X (obtenido diluyendo el reactivo comercial, 5X, en agua destilada). A partir de esa concentración de BSA, mediante diluciones seriadas, se obtuvo la recta estándar (1, 2.5, 5, 10, 15 y 20 µg/ml de BSA) que nos permitió extrapolar la cantidad de proteína en las muestras. Se midieron las absorbancias, de la recta estándar y las muestras, a 595nm y se extrapoló la concentración de proteína de las muestras. La separación por electroforesis de las proteínas, previamente desnaturalizadas, (20µg de proteína en tampón de carga [Glicerol, Azul de bromofenol y βmercaptohetanol] 4X) se realizó en un gel de acrilamida al 10% de SDS-PAGE (agua destilada; acrilamida 30%; SDS 10%; Tris 1M, pH 8.8; persulfato amónico 10% y TEMED) empleando como tampón de migración el formado por Tris Base, Glicina y SDS al 10%. Una vez separadas, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana se hidrató usando metanol (10 segundos), agua (5 minutos) y dejándola en tampón de transferencia (Tris Base, Glicina, Metanol 20% y agua) hasta su uso. El gel se equilibró en tampón de transferencia 1X durante, aproximadamente, 5 minutos. La transferencia se realizó empleando un aparato de transferencia semi-seca TRANS-BLOT Semi-Dry Transfer Cell. En la base de dicho aparato se colocó papel Whatman hidratado en tampón de transferencia 1X. A continuación, se colocó la membrana ya hidratada. Sobre la membrana se depositó el gel y, finalmente, sobre el gel de electroforesis, se colocó 69 Materiales y Métodos papel Whatman, también hidratado en tampón de transferencia 1X. Se eliminaron las burbujas de aire entre el gel y la membrana y se procedió a la transferencia (aplicando un voltaje fijo de 12V durante 30 minutos). Una vez transferida, la membrana se bloqueó (tampón de bloqueo: 5% de lactosa en TBS-T [NaCl 150mM; Tris 20mM, pH 7.6; Tween 0.1%]) durante 2 horas, a temperatura ambiente y con agitación continua. Una vez bloqueada, la membrana se lavó en TBS-T (3 lavados, 10 minutos cada uno) y se incubó con el anticuerpo primario anti-NOS tipo II (1µg/ml en tampón de bloqueo) toda la noche a 4ºC en agitación continua. Una vez pasado el tiempo de incubación, la membrana se lavó en TBS-T (3 lavados de 10 minutos cada uno, a temperatura ambiente y en agitación continua) y se incubó con el anticuerpo secundario (α-rabbit) durante 1 hora, a temperatura ambiente y agitación continua, en tampón de bloqueo a una dilución 1:5000. La membrana se lavó en TBS-T (3 lavados, 10 minutos cada uno) y se incubó con ECL (1 minuto, temperatura ambiente) para, posteriormente, revelarla mediante auto-radiografía. Posteriormente, la membrana se liberó del anticuerpo para posteriores hibridaciones con los controles de carga: anti-alfa-actina (α-actina) y anti-beta-actina (β-actina. Para ello se empleó un tampón con SDS 10%; Tris-HCl 2M, pH 6.8; β- Mercaptoetanol y agua. El tampón se precalentó a 55ºC y, posteriormente, la membrana se incubó en ese tampón durante 30 minutos a 55ºC. Finalmente, se lavó la membrana 3 veces, 10 minutos cada lavado, en TBS-T. Se bloqueó nuevamente la membrana en una solución al 5% de lactosa en TBS- T (2 horas a temperatura ambiente, en agitación continua). Posteriormente, la membrana se lavó en TBS-T y se incubó con el anticuerpo primario (anti-α-actina / anti-β-actina, 70 Materiales y Métodos toda la noche a 4ºC y en agitación continua) a una dilución 1:200 en tampón de bloqueo. Posteriormente, la membrana se lavó en TBS-T y se incubó con el anticuerpo secundario (α-rabbit si habíamos usado α-actina, α-mouse para detectar la β-actina) durante 1 hora, a temperatura ambiente y agitación continua, en tampón de bloqueo a una dilución 1:5000. Finalmente, se lavó la membrana en TBS-T, se incubó con ECL y introdujo en un casete de autorradiografía de tal forma que se obtuvo el patrón de expresión de la α/β-actina. 9. Análisis estadístico. Los resultados obtenidos en este trabajo se expresaron como medias ± desviaciones estándar media (SEM) de al menos tres experimentos independientes y fueron analizados mediante un programa de análisis estadístico (Instat – GraphPad Software Inc.) en el que se usó un análisis de varianza (ANOVA) seguido de un test de comparación múltiple Student-Newman-Keuls o, en su lugar, Bonferroni. Un valor de P menor de 0.05 (P <0.05) se consideró significativo. 10. Reactivos. • Aminoguanidina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Anticuerpo anti-NOS tipo II – Upstate USA, Inc. 706 Forest Street, Charlottesville, Virginia, USA • Anticuerpo anti-rabbit – Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Bukinghamshire, UK 71 Materiales y Métodos • Aparato de transferencia semiseca – Bio-Rad Laboratories, Alfred Nobel Drive, Hercules, California, USA • apoTransferrina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Aprotinina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Cloruro de Magnesio – Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Colagenasa P – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Dexametasona – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • D-NAME – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • dNTPs - Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Insulina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Instat, programa de análisis estadístico – GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA. • Interferon gamma humano recombinante – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Interferon gamma murino recombinante – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Interleukina-1 humana recombinante – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Interleukina-1 murina recombinante- Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Lector de ELISA Multiscan EX – Thermo Labsystems, East Forge Parkway, Franklin, MA, USA • Leptina humana recombinante – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Leptina murina recombinante – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • L-NAME – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • LY 294002 – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Medio DMEM α -modificado – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Medio DMEM/F12 Hams’ – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 72 Materiales y Métodos • Membranas de nylon Hybond-N+ - Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Bukinghamshire, UK • β -Mercaptohetanol – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • M-MLV – Gibco-BRL, Life Technologies- Grand Island- NY USA • α -Naphtylamina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • N-laurylarcosina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • PD 098059 – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Penicilina/Streptomicina – Biowhittaker Inc., 8830 Biggs Ford Rd., Walkersville, USA • Pronasa – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Reactivo de Biorad para medición de proteínas – Bio-Rad Laboratories, Alfred Nobel Drive, Hercules, California, USA • RNAase out – Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • SB 203580 – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • SDS – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Selenito Sódico – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Seroalbúmina bovina – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Sistema de electroforesis de geles de acrilamida – Bio-Rad Laboratories, Alfred Nobel Drive, Hercules, California, USA • Sistema de electroforesis de geles de agarosa – Bio-Rad Laboratories, Alfred Nobel Drive, Hercules, California, USA • Sistema de PCR en Tiempo Real (Mx3000PTM Real-Time PCR System ) – Stratagene, North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, USA • Suero Fetal Bovino – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Sulfanilamida – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 73 Materiales y Métodos • Tampón de PCR 10X – Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Tampón de retrotranscripción 5X – Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Taq DNA Polimerasa – Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Termocicladores – Primus 96 plus – MWG Biotech • Tripsina/EDTA 0.5% - Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Tris Base – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Triton X100 – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • TRIzol – Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Ave, Carlsbad, CA, USA • Typhoon 9410 documentation system – Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont Bukinghamshire, UK • Tyrphostin AG490 – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA • Wortmannin – Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA 74 Materiales y Métodos 75 RESULTADOS Materiales y Métodos Materiales y Métodos 76 76 Resultados En este trabajo hemos estudiado los efectos de la leptina como mediador de la inflamación en condrocitos. Para ello, hemos empleado para ello una línea condrogénica murina, la línea ATDC5, que nos ha permitido realizar experimentos en condrocitos en distintos estados de diferenciación, maduración. Asimismo, hemos realizado experimentos en cultivos primarios de condrocitos humanos, de tal forma que hemos podido comprobar que los resultados obtenidos no se ciñen exclusivamente a la línea celular anteriormente mencionada. Se ha seleccionado el óxido nítrico sintetizado por la NOS tipo II como marcador del efecto de la leptina por tratarse este mediador de un importante efector de procesos inflamatorios en los condrocitos. 1. Expresión de la forma larga del receptor de leptina (Ob-Rb) en la línea celular ATDC5. En primer lugar, mediante RT-PCR, se estudió la expresión de la forma larga, funcional, del receptor de leptina (Ob-Rb) en la línea celular condrogénica murina ATDC5 (figura 14) para así comprobar que dicha línea celular presentaba las mismas características que los condrocitos primarios, que sí expresaban dichos receptores, y que podrían, por tanto, responder a los efectos de la administración de leptina. Se usó para ello una pareja de cebadores específica con la cual, como se puede ver en la figura 13, se obtuvo un único producto de 647pb (calles 1 y 2). Como control positivo de presencia de receptor de leptina se usó ARNm de la línea J774.1, línea de macrófagos de ratón (calle 5). Para confirmar la calidad del ARNm, y como control de carga, se amplificó el gen GAPDH de ratón (calles 3 y 4). 77 Resultados capital en la ruta de señalización desencadenada por las dos proteínas (108, 227, 229). Para estudiar su papel en la inducción de NOS tipo II mediada por leptina e IFN-γ se empleó el tyrphostin AG490, inhibidor especifico de la activación de la tyrosin kinasa Jak2. La administración de AG490 (10µM) 1 hora antes del estímulo con citoquinas inhibía la acumulación de nitritos inducida por leptina más interferon-gamma (figura 18A). Este resultado se confirmó por RT-PCR, mediante la cual se mostraba una inducción significativa de la expresión del ARNm de NOS tipo II en las células estimuladas con leptina e interferon-gamma. La inhibición de la quinasa Jak-2, mediante el pretratamiento con Tyrphostin AG490, provocaba la inhibición de la síntesis del ARNm de la NOS tipo II en condrocitos tratados con leptina e interferongamma (figura 18B). Se observó, además, que la inducción de NOS tipo II por leptina e interferongamma se inhibía en presencia de dexametasona, un inhibidor clásico de la síntesis de novo que no afecta ni a la enzima constitutiva ni a la inducible pre-expresada (143-148). Dicha inhibición se veía reflejada tanto a nivel de producción de nitritos (figura 18A) como a nivel de expresión de ARNm (figura 18B). 2.d Efecto de la Wortmannina y el LY294002, inhibidores de PI-3K, sobre la producción de nitritos inducida por la leptina y el IFN- γ en las células ATDC5. A continuación se estudió el papel de la PI-3K en la ruta de señalización de la inducción de NOS tipo II desencadenada por leptina e interferon-gamma (figura 19). Esta quinasa se seleccionó como candidata a estar participando en esta vía de señalización por la existencia de estudios en los que se sugiere que la PI-3K, u homólogos de esta quinasa, están participando en la activación de la NOS tipo II (92). 84 Resultados Para estudiar el papel de PI-3K en la inducción de NOS tipo II mediada por el sinergismo entre leptina e IFN-γ se emplearon dos inhibidores específicos de esta kinasa, la Wortmannina y el LY294002, a distintas concentraciones ((Wortmannin [1, 2.5, 5 y 10 µM]; LY 294002 [ 1, 2.5, 5 y 10 µM]). Ninguno de los inhibidores causaba efectos por sí mismo; sin embargo, al tratar las células ATDC5 con la Wortmannina (figura 19A) o con el LY294002 (figura 19B) 1 hora antes del tratamiento con leptina e interferon-gamma se observaba una disminución significativa y dosis dependiente en la producción de nitritos . CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 Wortmannin1 OB + IFN Wortmannin2.5 Wortmannin5 OB+IFN+Wort1 OB+IFN+Wort2.5 OB+IFN+Wort5 CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng LY 294002 1 OB + IFN LY 294002 5 OB+IFN+LY 2.5 OB+IFN+LY 5 Wortmannin10 0 10 20 30 40 50 *** ### *** *** *** OB+IFN+LY 10 LY 294002 10 LY 294002 2.5 OB+IFN+LY 1 0 10 20 30 40 *** ### ** AB Figura 19. El tratamiento con Wortmannina y LY 294002, inhibidores de PI-3K, inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos por parte de las células ATDC5 tratadas con leptina e IFN. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero.Los inhibidores se añadieron 1 h antes del tratamiento con citokinas A. Efecto dosis dependiente de la Wortmannina (Wort) sobre la producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. B. El LY 294002 inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos inducida por leptina e IFN. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. **p<0.01 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml Nitrito (µM) Nitrito (µM) CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 Wortmannin1 OB + IFN Wortmannin2.5 Wortmannin5 OB+IFN+Wort1 OB+IFN+Wort2.5 OB+IFN+Wort5 CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng LY 294002 1 OB + IFN LY 294002 5 OB+IFN+LY 2.5 OB+IFN+LY 5 Wortmannin10 0 10 20 30 40 50 *** ### *** *** *** OB+IFN+LY 10 LY 294002 10 LY 294002 2.5 OB+IFN+LY 1 0 10 20 30 40 *** ### ** AB Figura 19. El tratamiento con Wortmannina y LY 294002, inhibidores de PI-3K, inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos por parte de las células ATDC5 tratadas con leptina e IFN. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero.Los inhibidores se añadieron 1 h antes del tratamiento con citokinas A. Efecto dosis dependiente de la Wortmannina (Wort) sobre la producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. B. El LY 294002 inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos inducida por leptina e IFN. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. **p<0.01 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml Nitrito (µM) Nitrito (µM) 85 Resultados 2.e Efecto del PD098059, inhibidor de MEK-1, sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IFN- γ en células ATDC5. 0 10 20 30 40 *** ### *** *** ** * CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+PD 20 PD098,059 1 PD 098,059 20 OB 400nM+ IFN 1ng PD 098,059 5 PD 098,059 10 OB+IFN+PD 1 OB+IFN+PD 5 OB+IFN+PD 10 PD 098,059 30 OB+IFN+PD 30 Figura 20. Efecto dosis dependiente del PD098059 (PD), inhibidor de MEK-1, sobre la producción de nitritos. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. **p<0.01 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml *p<0.05 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. Nitrito (µM) 0 10 20 30 40 *** ### *** *** ** * CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+PD 20 PD098,059 1 PD 098,059 20 OB 400nM+ IFN 1ng PD 098,059 5 PD 098,059 10 OB+IFN+PD 1 OB+IFN+PD 5 OB+IFN+PD 10 PD 098,059 30 OB+IFN+PD 30 Figura 20. Efecto dosis dependiente del PD098059 (PD), inhibidor de MEK-1, sobre la producción de nitritos. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. **p<0.01 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml *p<0.05 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. 0 10 20 30 40 *** ### *** *** ** * 0 10 20 30 40 *** ### *** *** ** * CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+PD 20 PD098,059 1 PD 098,059 20 OB 400nM+ IFN 1ng PD 098,059 5 PD 098,059 10 OB+IFN+PD 1 OB+IFN+PD 5 OB+IFN+PD 10 PD 098,059 30 OB+IFN+PD 30 Figura 20. Efecto dosis dependiente del PD098059 (PD), inhibidor de MEK-1, sobre la producción de nitritos. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. **p<0.01 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml *p<0.05 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+PD 20 PD098,059 1 PD 098,059 20 OB 400nM+ IFN 1ng PD 098,059 5 PD 098,059 10 OB+IFN+PD 1 OB+IFN+PD 5 OB+IFN+PD 10 PD 098,059 30 OB+IFN+PD 30 CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+PD 20 PD098,059 1 PD 098,059 20 OB 400nM+ IFN 1ng PD 098,059 5 PD 098,059 10 OB+IFN+PD 1 OB+IFN+PD 5 OB+IFN+PD 10 PD 098,059 30 OB+IFN+PD 30 Figura 20. Efecto dosis dependiente del PD098059 (PD), inhibidor de MEK-1, sobre la producción de nitritos. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. **p<0.01 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml *p<0.05 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. Nitrito (µM) Las MAP quinasas Erk-1 y Erk-2 participan en los procesos de pérdida de fenotipo de los condrocitos tratados con NO (52). Para estudiar la posible implicación de MEK-1, la MAPKK implicada en la fosforilación/activación de Erk-1/Erk-2, en la señalización de la inducción de NOS tipo II en nuestro modelo experimental, se empleó un inhibidor específico de MEK-1, el PD098059. 86 Resultados El PD098059 se administró a distintas dosis (1, 5, 10 y 30 µM) una hora antes del tratamiento con leptina e IFN-γ. Como se puede comprobar en la figura 20, la adición de este inhibidor causaba una disminución significativa y dosis dependiente de la producción de nitritos inducida por el efecto sinérgico de las citoquinas empleadas. 2.f Efecto del SB203580, inhibidor de la p38K, sobre la producción de nitritos inducida por la leptina y el IFN- γ en células ATDC5. Por último, hemos estudiado el papel de la p38K en la inducción sinérgica de NOS tipo II ya que se ha demostrado que esta quinasa participa en los procesos de apoptosis de condrocitos inducida por NO (52). 0 10 20 30 40 *** ## *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+SB 20 SB 203580 1 SB 203580 20 OB 400nM+ IFN 1ng SB 203580 5 SB 203580 10 OB+IFN+SB 1 OB+IFN+SB 5 OB+IFN+SB 10 SB 203580 30 OB+IFN+SB 30 Figura 21. El inhibidor de p38K, SB 203580 (SB), inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos inducida por leptina e interferon-gamma. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml Nitrito (µM) 0 10 20 30 40 *** ## *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+SB 20 SB 203580 1 SB 203580 20 OB 400nM+ IFN 1ng SB 203580 5 SB 203580 10 OB+IFN+SB 1 OB+IFN+SB 5 OB+IFN+SB 10 SB 203580 30 OB+IFN+SB 30 Figura 21. El inhibidor de p38K, SB 203580 (SB), inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos inducida por leptina e interferon-gamma. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml 0 10 20 30 40 *** ## *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+SB 20 SB 203580 1 SB 203580 20 OB 400nM+ IFN 1ng SB 203580 5 SB 203580 10 OB+IFN+SB 1 OB+IFN+SB 5 OB+IFN+SB 10 SB 203580 30 OB+IFN+SB 30 0 10 20 30 40 *** ## *** *** *** *** 0 10 20 30 40 *** ## *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+SB 20 SB 203580 1 SB 203580 20 OB 400nM+ IFN 1ng SB 203580 5 SB 203580 10 OB+IFN+SB 1 OB+IFN+SB 5 OB+IFN+SB 10 SB 203580 30 OB+IFN+SB 30 Figura 21. El inhibidor de p38K, SB 203580 (SB), inhibe de forma dosis dependiente la producción de nitritos inducida por leptina e interferon-gamma. Producción de nitritos (en unidades µM) en ATDC5 estimuladas y no estimuladas. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml Nitrito (µM) 87 Resultados Para estudiar la implicación de esta kinasa en la inducción de la NOS tipo II por leptina e IFN-γ se empleó el SB203580, un inhibidor específico de p38K. El tratamiento de las células ATDC5 con distintas dosis de SB203580 (1, 5, 10 y 30µM) inhibía significativamente y de forma dosis dependiente la producción de nitritos observada en los tratamientos con leptina e interferon-gamma (figura 21). De esta forma se podía concluir que la p38K estaba implicada en la ruta de señalización de la inducción de NOS tipo II activada por la acción sinérgica, conjunta, de la leptina y el interferon gamma. 2.g Análisis del patrón de expresión a nivel de ARNm y proteína de NOS tipo II inducida por leptina e IFN- γ en células ATDC5. Para comprobar si los efectos que habíamos observado en cuanto a producción de nitritos se correspondían con variaciones a nivel de expresión del ARNm y de la proteína, se analizó la expresión de la NOS tipo II, tanto a nivel de ARNm (figura 22) como a nivel proteico (figura 23) en células ATDC5 tratadas con leptina e IFN-γ y en presencia de los distintos inhibidores enzimáticos a sus dosis máximas. Para confirmar, de forma cuantitativa, que la producción o inhibición de la producción de nitritos se debía a un incremento o disminución de la expresión del ARNm de NOS tipo II, se llevó a cabo una RT-PCR en tiempo real más un análisis cuantitativo comparativo en el cual, tomando el control no estimulado como referencia, se calculaban las cantidades relativas de ARNm de NOS tipo II expresado en las células ATDC5 no diferenciadas usando distintos tratamientos. Como se puede observar en la figura 22, la expresión del ARNm de NOS tipo II se incrementaba de forma significativa con respecto al control cuando las células se trataban con leptina e IFN-γ. Esta inducción de la expresión se bloqueaba al emplear el inhibidor de Jak-2, el Tyrphostin AG490, y se reducía, de forma altamente significativa 88 Resultados con respecto al tratamiento con leptina e IFN-γ, al tratar las células en presencia de Wortmannina, LY 294002, PD 098059 y SB 203580. Cantidad Relativa (dRN) (vs control) 0 5 10 15 20 25 30 35 ### *** *** *** *** *** 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 22. Cuantificación comparativa de la expresión del ARNm de NOS tipo II inducida por el tratamiento con leptina e IFN-γfrente al control no tratado. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas. 1: OB 400nM; 2: IFN-γ1ng/ml; 3: OB + IFN-γ; 4: OB + IFN-γ+ Tyrphostin AG 490 10µM; 5: OB + IFN-γ+ Wortmannin 10µM; 6: OB + IFN-γ+ LY 203580 10µM; 7: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 8: OB + IFN-γ + SB 203580 30µM. ###p<0.001 vs IFN-γ1ng/ml ;*** p<0.001 vs OB 400nM + IFN-γ1ng/ml Cantidad Relativa (dRN) (vs control) 0 5 10 15 20 25 30 35 ### *** *** *** *** *** 1 2 3 4 5 6 7 8 Cantidad Relativa (dRN) (vs control) Cantidad Relativa (dRN) (vs control) 0 5 10 15 20 25 30 35 ### *** *** *** *** *** 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 30 35 ### *** *** *** *** *** 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 22. Cuantificación comparativa de la expresión del ARNm de NOS tipo II inducida por el tratamiento con leptina e IFN-γfrente al control no tratado. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas. 1: OB 400nM; 2: IFN-γ1ng/ml; 3: OB + IFN-γ; 4: OB + IFN-γ+ Tyrphostin AG 490 10µM; 5: OB + IFN-γ+ Wortmannin 10µM; 6: OB + IFN-γ+ LY 203580 10µM; 7: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 8: OB + IFN-γ + SB 203580 30µM. ###p<0.001 vs IFN-γ1ng/ml ;*** p<0.001 vs OB 400nM + IFN-γ1ng/ml La expresión de la proteína de NOS tipo II se analizó mediante Western-blot (figura 23). Mediante esta técnica pudimos comprobar cómo también los resultados a nivel de expresión proteica se correspondían con los obtenidos en cuanto a producción de nitritos y expresión de ARNm. Como se observa en la figura 23, las células control no tratadas no mostraban presencia de NOS tipo II mientras las células tratadas con leptina e IFN-γ expresaban abundantemente NOS tipo II; la expresión de la proteína disminuía notablemente con el pretratamiento con los distintos inhibidores. 89 Resultados Figura 23. Patrones de expresión proteico de la nitróxido sintasa inducible en células A se su IF S TDC5 no diferenciadas tratadas y sin tratar con leptina e interferon gamma. Las células deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin ero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas 1: control; 2: OB + N-γ; 3: OB + IFN-γ+ LY 294002 10µM; 4: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 5: OB + IFN-γ+ B 203580 30µM. 1 2 3 4 5 α-NOS2 α−actina Figura 23. Patrones de expresión proteico de la nitróxido sintasa inducible en células ATDC5 no diferenciadas tratadas y sin tratar con leptina e interferon gamma. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas 1: control; 2: OB + IFN-γ; 3: OB + IFN-γ+ LY 294002 10µM; 4: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 5: OB + IFN-γ+ SB 203580 30µM. 1 2 3 4 5 α-NOS2 α−actina 1 2 3 4 5 α-NOS2 α−actina 2.h Inducción sinérgica de la NOS tipo II por parte de la leptina y el IFN- γ en células ATDC5 diferenciadas. CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 OB+IFN+SB 30 OB+IFN+LY 10 OB+IFN+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IFN 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 OB+IFN+SB 30 OB+IFN+LY 10 OB+IFN+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IFN AB Fig ura 24. Efectos del tratamiento con leptina e IFN-γy de distintos inhibidores sobre la oducción de nitritos inducida por leptina e IFN-γen células ATDC5 diferenciadas ante 15 y 21 días. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos ATDC5 tratados no tratados. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) e realizaron en medio sin suero. A. Efecto sinérgico de la leptina y el IFN-γe inhibición de cho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 15 días. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. ** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. B. Efecto sinérgico de la leptina y el IFN-γe nhibición de dicho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 21 días. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. Nitrito (µM) Nitrito (µM) CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 OB+IFN+SB 30 OB+IFN+LY 10 OB+IFN+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IFN CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 OB+IFN+SB 30 OB+IFN+LY 10 OB+IFN+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IFN 0 pr dur y s di * i 10 20 30 40 *** ### *** *** *** 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** 10 20 30 40 *** ### *** *** *** 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 OB+IFN+SB 30 OB+IFN+LY 10 OB+IFN+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IFN CONTROL DMSO OB 400nM IFN 1ng OB+IFN+Wort10 OB+IFN+SB 30 OB+IFN+LY 10 OB+IFN+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IFN AB ura 24. Efectos del tratamiento con leptina e IFN-γy de distintos inhibidores sobre la oducción de nitritos inducida por leptina e IFN-γen células ATDC5 diferenciadas ante 15 y 21 días. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos ATDC5 tratados no tratados. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) e realizaron en medio sin suero. A. Efecto sinérgico de la leptina y el IFN-γe inhibición de cho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 15 días. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. ** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. B. Efecto sinérgico de la leptina y el IFN-γe nhibición de dicho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 21 días. ### p<0.001 vs control, IFN y OB. *** p<0.001 vs OB 400nM + IFN 1ng/ml. Nitrito (µM) Nitrito (µM) Fig pr dur y s di * i 90 Resultados Para confirmar que los resultados obtenidos en las células ATDC5 no diferenciadas no dependían del estado de diferenciación de la línea celular, se repitieron los experimentos en condrocitos maduros y condrocitos hipertróficos (figura 24); es decir: en células ATDC5 diferenciadas durante 15 días (figura 24A) y 21 días respectivamente (figura 24B). El patrón de producción de nitritos inducida por leptina e IFN-γ observado tanto en células diferenciadas 15 días (figura 24A) como 21 días (figura 24B) resultó ser idéntico al observado en células ATDC5 no diferenciadas, condrogénicas. El efecto de los distintos inhibidores empleados para delinear la ruta de señalización, también seguía el mismo patrón observado en la línea no diferenciada. De esta forma se comprobó que la inducción sinérgica de NOS tipo II por parte de leptina e interferon-gamma no depende del estado de diferenciación de los condrocitos y procede a través de la misma ruta de transducción. 2.i La leptina induce, en acción sinérgica con el IFN- γ , la producción de nitritos en un cultivo primario de condrocitos humanos de forma dosis dependiente. Por último, para confirmar que nuestros resultados no eran exclusivos de la línea celular ATDC5, se repitió el tratamiento con distintas dosis de leptina en un cultivo primario de condrocitos. Como se puede observar en la figura 25A, los resultados obtenidos en el cultivo primario de condrocitos humanos se correspondían con los ya observados en la línea ATDC5: las distintas dosis de leptina (OB, 100, 200 y 400nM) no causaban ningún incremento en la producción de nitritos con respecto al control no tratado; el IFN-γ, por sí mismo, provocaba un incremento mínimo en la producción de nitritos. Sin embargo, 91 Resultados al tratar los condrocitos primarios con una mezcla de leptina e IFN-γ, se observó una inducción de la producción de nitritos sinérgica y dependiente de la dosis de leptina. Figura 25. A. Dosis respuesta de leptina: efectos sobre la producción de nitritos en un cultivo primario de condrocitos humanos. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos humanos tratados con distintas dosis de leptina (OB). Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero. 1: control; 2: IFN-γ1ng/ml; 3: OB 100nM; 4: OB 200nM; 5: OB 400nM; 6: OB 100 + IFN-γ; 7: OB 200 + IFN-γ; 8: OB 400 + IFN-γ*** p<0.001 vs. control, IFN y OB. B. Efecto de los inhibidores de PI-3K, MEK-1 y p38K sobre la producción de nitrititos inducida por la leptina y el IFN-γen un cultivo primario de condrocitos. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citoquinas 1: control; 2: OB + IFN-γ; 3: OB + IFN-γ+ LY 294002 10µM; 4: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 5: OB + IFN-γ+ SB 203580 30µM *** p<0.001 vs. OB+IFN ### p<0.001 vs control. C. Patrones de expresión proteico de la nitróxido sintasa inducible en un cultivo primario de condrocitos tratado y sin tratar con leptina e interferon gamma. 1: control; 2: OB + IFN-γ; 3: OB + IFN-γ+ LY 294002 10µM; 4: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 5: OB + IFN-γ+ SB 203580 30µM. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas. 0,0 5,0 10,0 15,0 *** *** *** Nitrito (µM) Nitrito (µM) 0 2 4 6### *** *** *** 1 2 3 4 5 A. B. 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 25. A. Dosis respuesta de leptina: efectos sobre la producción de nitritos en un cultivo primario de condrocitos humanos. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos humanos tratados con distintas dosis de leptina (OB). Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero. 1: control; 2: IFN-γ1ng/ml; 3: OB 100nM; 4: OB 200nM; 5: OB 400nM; 6: OB 100 + IFN-γ; 7: OB 200 + IFN-γ; 8: OB 400 + IFN-γ*** p<0.001 vs. control, IFN y OB. B. Efecto de los inhibidores de PI-3K, MEK-1 y p38K sobre la producción de nitrititos inducida por la leptina y el IFN-γen un cultivo primario de condrocitos. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citoquinas 1: control; 2: OB + IFN-γ; 3: OB + IFN-γ+ LY 294002 10µM; 4: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 5: OB + IFN-γ+ SB 203580 30µM *** p<0.001 vs. OB+IFN ### p<0.001 vs control. C. Patrones de expresión proteico de la nitróxido sintasa inducible en un cultivo primario de condrocitos tratado y sin tratar con leptina e interferon gamma. 1: control; 2: OB + IFN-γ; 3: OB + IFN-γ+ LY 294002 10µM; 4: OB + IFN-γ+ PD 098059 30µM; 5: OB + IFN-γ+ SB 203580 30µM. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas. 0,0 5,0 10,0 15,0 *** *** *** Nitrito (µM) Nitrito (µM) 0 2 4 6### *** *** *** 1 2 3 4 5 A. B. 1 2 3 4 5 6 7 8 0,0 5,0 10,0 15,0 *** *** *** 0,0 5,0 10,0 15,0 *** *** *** Nitrito (µM) Nitrito (µM) 0 2 4 6### *** *** *** 1 2 3 4 5 A. B. 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 C. α-NOS2 1 2 3 4 5 C. α-NOS2 Se comprobó igualmente que los inhibidores de PI-3K (LY294002), MEK-1 (PD098059) y p38K (SB203580) actuaban de igual forma sobre la producción de 92 Resultados nitritos (figura 25B) y la inducción de la proteína NOS tipo II (figura 25C) en el cultivo primario de condrocitos humanos. Como se puede comprobar en la figura 25B, los distintos inhibidores empleados confirmaron los resultados obtenidos en la línea celular ATDC5 ya que todos ellos reproducían el efecto anteriormente observado sobre la producción de nitritos: los inhibidores de PI-3K, MEK-1 y p38K inhibían la producción de nitritos inducida por la leptina y el interferon gamma en un cultivo primario de condrocitos humanos. Al estudiar el patrón de expresión de NOS tipo II mediante Western blot (figura 25C) nos encontramos que, al igual que habíamos observado en la células ATDC5, los inhibidores LY294002, PD098059 y SB203580 inhibían la expresión de NOS tipo II inducida por la co-estimulación del cultivo primario de condrocitos humanos con leptina e IFN-γ. 93 Resultados Para estudiar la participación de la PI-3K en la ruta de señalización implicada en la inducción sinérgica de NOS tipo II se emplearon dos inhibidores específicos de esta kinasa, la Wortmannina (figura 30) y el LY294002 (figura 31), a distintas concentraciones ((Wortmannina [1, 2.5, 5 y 10 µM]; LY 294002 [ 1, 2.5, 5 y 10 µM]). Como observa en la figura 30, la Wortmannina inhibía de forma dosis dependiente la acumulación de nitritos en el sobrenadante de cultivo de las células ATDC5. OB - + + + + IL-1 - + + + + LY - - + + + LY (µM) 1 5 10 α−NOS2 α−actina B Figura 31. El LY294002 inhibe la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. El LY294002 (LY) se añadió 1 hora antes del tratamiento con citokinas A. Producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. Las estimulaciones (48 horas) se realizaron en medio sin suero. La producción de nitritos se expresa en unidades µM. ### p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml ***p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml + OB 800nM. B. Análisis Western-blot de la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Las células ATDC5 se trataron con leptina 800nM, IL-1 0.025ng/ml y LY294002 1, 5 y 10µM. 0 10 20 30 40 50 60 ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml LY 294002 1 OB +IL-1 LY 294002 5 OB+IL+LY 5 LY 294002 10 LY 294002 2.5 OB+IL+LY 10 OB+IL+LY 2.5 OB+IL+LY 1 A Nitrito (µM) OB - + + + + IL-1 - + + + + LY - - + + + LY (µM) 1 5 10 α−NOS2 α−actina B OB - + + + + IL-1 - + + + + LY - - + + + LY (µM) 1 5 10 α−NOS2 α−actina B Figura 31. El LY294002 inhibe la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. El LY294002 (LY) se añadió 1 hora antes del tratamiento con citokinas A. Producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. Las estimulaciones (48 horas) se realizaron en medio sin suero. La producción de nitritos se expresa en unidades µM. ### p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml ***p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml + OB 800nM. B. Análisis Western-blot de la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Las células ATDC5 se trataron con leptina 800nM, IL-1 0.025ng/ml y LY294002 1, 5 y 10µM. 0 10 20 30 40 50 60 ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml LY 294002 1 OB +IL-1 LY 294002 5 OB+IL+LY 5 LY 294002 10 LY 294002 2.5 OB+IL+LY 10 OB+IL+LY 2.5 OB+IL+LY 1 A Nitrito (µM) 0 10 20 30 40 50 60 ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml LY 294002 1 OB +IL-1 LY 294002 5 OB+IL+LY 5 LY 294002 10 LY 294002 2.5 OB+IL+LY 10 OB+IL+LY 2.5 OB+IL+LY 1 A Nitrito (µM) 100 Resultados Al emplear el otro inhibidor de PI-3K, el LY294002 (añadido, al igual que la Wortmannina, 1 hora antes del tratamiento con las citoquinas) se observó el mismo efecto inhibitorio en la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1, efecto que también resultó ser dosis dependiente (figura 31A). Realizando un análisis Western blot para estudiar la expresión proteica de NOS tipo II, comprobamos que la inhibición de NOS tipo II también tenía lugar a nivel proteico cuando empleábamos el LY294002 (figura 31B). 3.e Efecto del PD098059, inhibidor de MEK-1, sobre la inducción sinérgica de NOS tipo II mediada por la leptina y la IL-1 en células ATDC5. 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml PD098059 1 OB +IL-1 OB+IL+PD 10 OB+IL+PD 20 OB+IL+PD 5 OB+IL+PD 1 OB+IL+PD 30 PD098059 5 PD098059 10 PD098059 20 PD098059 30 A Figura 32. El inhibidor de MEK-1, el PD098059, inhibe la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. El PD098059 (PD) se añadió 1 hora antes del tratamiento con citokinas A. Producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. Las estimulaciones (48 horas) se realizaron en medio sin suero. La producción de nitritos se expresa en unidades µM. ### p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml ***p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml + OB 800nM. B. Análisis Western-blot de la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Las células ATDC5 se trataron con leptina 800nM, IL-1 0.025ng/ml y PD098059 1, 10 y 30µM. OB - + + + + IL-1 - + + + + PD - - + + + PD (µM) 1 10 30 B α−NOS2 α−actina Nitrito (µM) 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml PD098059 1 OB +IL-1 OB+IL+PD 10 OB+IL+PD 20 OB+IL+PD 5 OB+IL+PD 1 OB+IL+PD 30 PD098059 5 PD098059 10 PD098059 20 PD098059 30 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml PD098059 1 OB +IL-1 OB+IL+PD 10 OB+IL+PD 20 OB+IL+PD 5 OB+IL+PD 1 OB+IL+PD 30 PD098059 5 PD098059 10 PD098059 20 PD098059 30 CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml PD098059 1 OB +IL-1 OB+IL+PD 10 OB+IL+PD 20 OB+IL+PD 5 OB+IL+PD 1 OB+IL+PD 30 PD098059 5 PD098059 10 PD098059 20 PD098059 30 A Figura 32. El inhibidor de MEK-1, el PD098059, inhibe la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. El PD098059 (PD) se añadió 1 hora antes del tratamiento con citokinas A. Producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. Las estimulaciones (48 horas) se realizaron en medio sin suero. La producción de nitritos se expresa en unidades µM. ### p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml ***p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml + OB 800nM. B. Análisis Western-blot de la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Las células ATDC5 se trataron con leptina 800nM, IL-1 0.025ng/ml y PD098059 1, 10 y 30µM. OB - + + + + IL-1 - + + + + PD - - + + + PD (µM) 1 10 30 B α−NOS2 α−actina OB - + + + + IL-1 - + + + + PD - - + + + PD (µM) 1 10 30 B α−NOS2 α−actina Nitrito (µM) 101 Resultados Empleando el PD098059 se estudió la posible implicación de MEK-1, la MAPKK implicada en la fosforilación/activación de Erk-1/Erk-2, en la señalización de la inducción de NOS tipo II por leptina e IL-1. Al emplear este inhibidor a distintas concentraciones (1, 5, 10 y 30 µM) una hora antes del tratamiento con leptina e IL-1 se observó que producía una disminución dosis dependiente de la producción de nitritos inducida por el tratamiento con las citoquinas (figura 32A). Se observó, además, que el PD098059 provocaba una inhibición de la expresión de la NOS tipo II inducida por leptina e IL-1 cuando las células se trataban en presencia del inhibidor (figura 32B). 3.f Efecto del SB203580, inhibidor de la p38K, sobre la inducción sinérgica de NOS tipo II mediada por la leptina y la IL-1 en células ATDC5. Para estudiar la implicación de la p38K en la inducción de NOS tipo II por leptina e IL- 1 se empleó el SB203580, un inhibidor específico, a distintas dosis de (1, 5, 10 y 30µM). El tratamiento de las células ATDC5 con las distintas dosis de SB203580 (añadidas 1 hora antes del tratamiento con citoquinas) inhibía significativamente y de forma dosis dependiente la producción de nitritos observada en los tratamientos con leptina e IL-1 (figura 33A). Al analizar cualitativamente la expresión de NOS tipo II mediante Western blot, comprobamos que la adición de SB203580 también inhibía la expresión de la proteína inducida por el tratamiento con leptina e interleuquina-1 (figura 33B) 102 Resultados . 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml SB203580 1 OB +IL-1 OB+IL+SB 10 OB+IL+SB 20 OB+IL+SB 5 OB+IL+SB 1 OB+IL+SB 30 SB203580 5 SB203580 10 SB203580 20 SB203580 30 A OB - + + + + IL-1 - + + + + SB - - + + + SB (µM) 1 10 30 α−NOS2 α−actina B Figura 33. El SB203580, inhibidor de p38K, inhibe la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. El SB203580 (SB) se añadió 1 hora antes del tratamiento con citokinas A. Producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. Las estimulaciones (48 horas) se realizaron en medio sin suero. La producción de nitritos se expresa en unidades µM. ### p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml ***p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml + OB 800nM. B. Análisis Western-blot de la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IFN-γ. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Las células ATDC5 se trataron con leptina 800nM, IL-1 0.025ng/ml y SB203580 1, 10 y 30µM. Nitrito (µM) 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml SB203580 1 OB +IL-1 OB+IL+SB 10 OB+IL+SB 20 OB+IL+SB 5 OB+IL+SB 1 OB+IL+SB 30 SB203580 5 SB203580 10 SB203580 20 SB203580 30 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** 0 10 20 30 40 50 60 *** ### *** *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml SB203580 1 OB +IL-1 OB+IL+SB 10 OB+IL+SB 20 OB+IL+SB 5 OB+IL+SB 1 OB+IL+SB 30 SB203580 5 SB203580 10 SB203580 20 SB203580 30 CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml SB203580 1 OB +IL-1 OB+IL+SB 10 OB+IL+SB 20 OB+IL+SB 5 OB+IL+SB 1 OB+IL+SB 30 SB203580 5 SB203580 10 SB203580 20 SB203580 30 A OB - + + + + IL-1 - + + + + SB - - + + + SB (µM) 1 10 30 α−NOS2 α−actina B OB - + + + + IL-1 - + + + + SB - - + + + SB (µM) 1 10 30 α−NOS2 α−actina B Figura 33. El SB203580, inhibidor de p38K, inhibe la producción de nitritos y la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IL-1. Las células fueron serodeprivadas 8h antes de la estimulación. El SB203580 (SB) se añadió 1 hora antes del tratamiento con citokinas A. Producción de nitritos en células ATDC5 tratadas y no tratadas. Las estimulaciones (48 horas) se realizaron en medio sin suero. La producción de nitritos se expresa en unidades µM. ### p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml ***p<0.001 vs IL-1 0.025ng/ml + OB 800nM. B. Análisis Western-blot de la expresión de NOS tipo II inducida por leptina e IFN-γ. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Las células ATDC5 se trataron con leptina 800nM, IL-1 0.025ng/ml y SB203580 1, 10 y 30µM. Nitrito (µM) 3.g Cuantificación de la expresión del ARNm de la NOS tipo II inducida por la acción sinérgica de la leptina y la IL-1 en células ATDC5 no diferenciadas. Mediante PCR en tiempo real, hemos cuantificado la variación en la expresión del ARNm de NOS tipo II inducido por el efecto sinérgico de la leptina y la IL-1. Asimismo, hemos cuantificado la disminución de la expresión de NOS tipo II provocada por el pretratamiento con los distintos inhibidores. Para ello se realizó un análisis cuantitativo comparativo en el cual se calcularon las cantidades relativas del 103 Resultados ARNm de NOS tipo II con respecto a la NOS tipo II expresada por las células control, no tratadas. Como se puede observar en la figura 34, la expresión del ARNm de NOS tipo II se incrementaba de forma significativa con respecto al control cuando las células se trataban con leptina e IL-1. Esta inducción de la expresión se bloqueaba al emplear el inhibidor de Jak-2, el Tyrphostin AG490, y se reducía, de forma altamente significativa con respecto al tratamiento con leptina e IL-1, al tratar las células en presencia de Wortmannina, LY 294002, PD 098059 y SB 203580. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 *** *** *** *** *** ### Cantidad Relativa (dRN) (vs control) 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 34. Cuantificación comparativa de la expresión del ARNm de NOS tipo II inducida por el tratamiento con leptina e IL-1 frente al control no tratado. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas. 1: OB 800nM; 2: IL-1 0.025ng/ml; 3: OB + IL; 4: OB + IL + Tyrphostin AG 490 10µM; 5: OB + IL + Wortmannin 10µM; 6: OB + IL + LY 203580 10µM; 7: OB + IL + PD 098059 30µM; 8: OB + IL + SB 203580 30µM. ### p<0.001 vs IL-l 0.025mg/ml ;*** p<0.001 vs OB 800nM + IL-1 0.025ng/ml 0 5 10 15 20 25 30 35 40 *** *** *** *** *** ### Cantidad Relativa (dRN) (vs control) 1 2 3 4 5 6 7 8 0 5 10 15 20 25 30 35 40 *** *** *** *** *** ### 0 5 10 15 20 25 30 35 40 *** *** *** *** *** ### Cantidad Relativa (dRN) (vs control) Cantidad Relativa (dRN) (vs control) 1 2 3 4 5 6 7 8 Figura 34. Cuantificación comparativa de la expresión del ARNm de NOS tipo II inducida por el tratamiento con leptina e IL-1 frente al control no tratado. Las células se deprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (24h) se realizaron en medio sin suero. Los inhibidores se añadieron 1h antes del tratamiento con citokinas. 1: OB 800nM; 2: IL-1 0.025ng/ml; 3: OB + IL; 4: OB + IL + Tyrphostin AG 490 10µM; 5: OB + IL + Wortmannin 10µM; 6: OB + IL + LY 203580 10µM; 7: OB + IL + PD 098059 30µM; 8: OB + IL + SB 203580 30µM. ### p<0.001 vs IL-l 0.025mg/ml ;*** p<0.001 vs OB 800nM + IL-1 0.025ng/ml 104 Resultados 3.h La leptina induce, de forma sinérgica con la IL-1, la producción de nitritos en células ATDC5 diferenciadas. Una vez estudiado el efecto sinérgico de leptina e IL-1 en células ATDC5 en estado condrogénico, no diferenciadas, se repitieron los experimentos en en células ATDC5 diferenciadas durante 15 días (figura 35A) y 21 días (figura 35B); es decir, en condrocitos maduros e hipertróficos respectivamente. De esta forma nos asegurábamos de que nuestros resultados no dependiesen del estado de diferenciación. 0 10 20 30 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL 0 10 20 30 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL 40 Figura 35. Efectos del tratamiento con leptina e IL-1 y de distintos inhibidores sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en células ATDC5 diferenciadas durante 15 y 21 días. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos ATDC5 tratados y no tratados. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. A. Efecto sinérgico de la leptina y la IL-1 e inhibición de dicho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 15 días. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB. *** p<0.001 vs OB 800nM + IL-1 0.025ng/ml. B. Efecto sinérgico de la leptina y la IL-1 e inhibición de dicho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 21 días. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB. *** p<0.001 vs OB 800nM + IL-1 0.025ng/ml. AB Nitrito (µM) Nitrito (µM) 0 10 20 30 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL 0 10 20 30 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 400nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL CONTROL DMSO OB 400nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL 40 Figura 35. Efectos del tratamiento con leptina e IL-1 y de distintos inhibidores sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en células ATDC5 diferenciadas durante 15 y 21 días. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos ATDC5 tratados y no tratados. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Los tratamientos (48h) se realizaron en medio sin suero. A. Efecto sinérgico de la leptina y la IL-1 e inhibición de dicho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 15 días. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB. *** p<0.001 vs OB 800nM + IL-1 0.025ng/ml. B. Efecto sinérgico de la leptina y la IL-1 e inhibición de dicho efecto sobre ATDC5 diferenciadas durante 21 días. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB. *** p<0.001 vs OB 800nM + IL-1 0.025ng/ml. AB Nitrito (µM) Nitrito (µM) Al igual que en células ATDC5 no diferenciadas, la leptina inducía un incremento en la producción de nitritos provocada por la IL-1, tanto en células maduras (figura 35A) 105 Resultados como hipertróficas (figura 35B. Los tratamientos con los distintos inhibidores provocaron un efecto idéntico al observado en células ATDC5 no diferenciadas, tanto en células maduras (figura 35A) como hipertróficas (figura 35B). Los resultados obtenidos sugieren que ni la inducción sinérgica de NOS tipo II ni la ruta de señalización empleada en dicha inducción dependen del estado de diferenciación de los condrocitos. 3.i La leptina induce, en acción sinérgica con la IL-1, la producción de nitritos en un cultivo primario de condrocitos humanos. 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL Figura 36. Efectos del tratamiento con leptina e IL-1 y de distintos inhibidores sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en un cultivo primario de condrocitos humanos. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos humanos. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB *** p<0.001 vs. OB 800nM + IL-1 0.25ng/ml Nitrito (µM) 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL Figura 36. Efectos del tratamiento con leptina e IL-1 y de distintos inhibidores sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en un cultivo primario de condrocitos humanos. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos humanos. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB *** p<0.001 vs. OB 800nM + IL-1 0.25ng/ml 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** 0 10 20 30 40 *** ### *** *** *** CONTROL DMSO OB 800nM IL-1 0.025ng/ml OB+IL+Wort10 OB+IL+SB 30 OB+IL+LY 10 OB+IL+PD 30 PD 098,059 30 LY 294002 10 Wortmannin10 SB 203580 30 OB + IL Figura 36. Efectos del tratamiento con leptina e IL-1 y de distintos inhibidores sobre la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en un cultivo primario de condrocitos humanos. Producción de nitritos (en unidades µM) en condrocitos humanos. Las células se serodeprivaron 8h antes de la estimulación. Las estimulaciones (48h) se realizaron en medio sin suero. ### p<0.001 vs control, IL-1 y OB *** p<0.001 vs. OB 800nM + IL-1 0.25ng/ml Nitrito (µM) 106 Resultados Para confirmar que el efecto sinérgico entre la leptina y la IL-1 no era exclusivo de la línea celular murina ATDC5, se repitió el tratamiento en un cultivo primario de condrocitos humanos. Como se puede observar en la figura 36, la leptina incrementaba la producción de nitritos inducida por IL-1 en condrocitos primarios humanos. Se estudió también el efecto de los distintos inhibidores empleados en las células ATDC5 (Wortmannina 10µM, LY 294002 10µM, PD 098059 30µM y SB 203580 30µM) y se observó que tenían el mismo efecto que en la línea murina: todos ellos inhibían, de forma significativa, la producción de nitritos inducida por leptina e IL-1 en el cultivo primario de condrocitos humanos (figura 36). 107 Resultados 108 Resultados 109 DISCUSIÓN Discusión quinasas. Por ello, para estudiar el papel de Erk-1/2 hemos empleado un inhibidor específico de MEK-1, el PD098059. En nuestro modelo experimental, la inhibición de MEK-1 reduce significativamente la actividad y la expresión de la NOS tipo II, sugiriendo que las quinasas Erk-1/2 desempeñan un papel fundamental en la transducción de señales mediada por la leptina y el IFN-γ. Nuestros resultados concuerdan con estudios previos en los que se demostró la asociación entre la activación de Erk-1/2 y la inducción de la NOS tipo II en distintos tipos celulares (142, 375-377). A continuación, hemos estudiado el papel de la p38K en la inducción sinérgica de la NOS tipo II mediada por la leptina y el IFN-γ. En nuestras condiciones experimentales, la inhibición de la actividad de la p38K (mediante un inhibidor farmacológico específico, el SB203580) suponía una reducción significativa de la expresión y la actividad de la NOS tipo II en condrocitos tratados con leptina e IFN-γ. Se ha demostrado que la p38K está implicada en los procesos de inducción de apoptosis en los condrocitos articulares tratados con NO (52) y en la inducción de la NOS tipo II en el cartílago articular (378). Además, distintos trabajos han relacionado la actividad de la p38K con la inducción de la NOS tipo II en macrófagos y células neuronales (379- 381). Nuestros resultados concuerdan a la perfección con los anteriormente mencionados, sugiriendo la participación de la p38K en la inducción sinérgica de la NOS tipo II en condrocitos (356). Finalmente, hemos comprobado que la inducción sinérgica de la NOS tipo II y las quinasas implicadas en dicha inducción no dependen del estado de diferenciación de la línea murina ATDC5 o de la línea celular empleada. Para ello, hemos reproducido los experimentos en células ATDC5 maduras e hipertróficas así como en un cultivo primario de condrocitos humanos. En ambos casos, los resultados concordaban con los obtenidos en las células ATDC5 pre-condrogénicas (356). 116 Discusión Podemos concluir, por tanto, que la leptina induce, de forma sinérgica con el interferon-gamma, la expresión de la NOS tipo II en condrocitos, a través de una ruta de señalización en la que están implicadas las quinasas Jak-2, PI-3K, Erk-1/2 y p38K (355, 356). 2. Efecto sinérgico de la leptina y la interleuquina-1 sobre la NOS tipo II en condrocitos. A continuación se buscó confirmar el papel pro-inflamatorio de la leptina sobre condrocitos en cultivo y estudiar su efecto sinérgico, en combinación con otras citoquinas, sobre la NOS tipo II. Para ello, hemos seleccionado a la interleuquina-1 por 1) ser una citoquina pro-inflamatoria fundamental en la artrosis (75, 82-84), patología de afectación primaria del cartílago (2, 3, 6, 7) con una clara asociación con la obesidad (341-345), y 2) poseer un receptor totalmente distinto a los receptores de IFN-γ y leptina (85-87). Así pues, en esta parte del trabajo hemos investigado el efecto de la leptina sobre la expresión y la actividad de la NOS tipo II inducida por la IL-1 en condrocitos. Hemos encontrado que la leptina tiene un efecto sinérgico sobre la NOS tipo II inducida por la IL-1, en la línea celular condrogénica murina ATDC5, en condrocitos ATDC5 maduros e hipertróficos y en condrocitos humanos primarios, mediante una ruta de señalización en la que están implicadas las quinasas Jak-2, PI-3K, MEK-1 y p38K (357). En condiciones patológicas, la IL-1 llega a la articulación procedente del plasma (363) y, además, de los propios condrocitos (80), de la sinovia inflamada y la grasa periarticular (382). Por otra parte, cabe destacar que las células multipotenciales del estroma de la grasa infrapatelar producen leptina (365) y que la administración de leptina a las articulaciones de rata induce una sobre-expresión de la hormona en los 117 Discusión condrocitos articulares (11). Además, los niveles plasmáticos de leptina aumentan en condiciones inflamatorias (38, 187, 188, 199, 338) y la producción de leptina es mayor en los condrocitos artrósicos que en los normales (11). Así, los individuos aquejados de sinovitis o artrosis presentarán un micro-ambiente único en el cartílago articular, en el que los niveles de leptina e IL-1, debido tanto a la producción local como a un incremento sistémico, serán mayores que los determinados en el plasma en condiciones normales. En estas condiciones, la leptina estaría desempeñando un papel proinflamatorio, actuando de forma directa sobre los condrocitos articulares, tal y como los resultados ahora presentados evidencian (357). Anteriormente habíamos establecido que la activación de la quinasa Jak-2 suponía el paso inicial en la inducción sinérgica de la NOS tipo II por la leptina y el IFN-γ en condrocitos (355). En esta ocasión hemos investigado el papel de la Jak-2 en la inducción de la NOS tipo II por la leptina y la IL-1. Para ello, hemos bloqueado nuevamente la actividad de la Jak-2 mediante el pre-tratamiento con el Tyrphostin AG490. El Tyrphostin AG490 inhibía de forma significativa la respuesta a la estimulación con la leptina y la IL-1, lo cual sugiere que la leptina está actuando de forma sinérgica con rutas de señalización convergentes a la IL-1 (357). No obstante, la interpretación de este resultado necesita de un análisis más profundo ya que, hasta la fecha, no se ha confirmado la existencia de una relación directa entre la Jak-2 y la transducción de señales a través del receptor de la IL-1 (85- 87); así, esperaríamos que el Tyrphostin AG490 afectase tan sólo a la porción sumatoria de la leptina y no al global de la expresión y la actividad de la NOS tipo II. En nuestro modelo experimental, sin embargo, el AG490 bloquea no sólo el efecto de la leptina sobre la NOS tipo II inducida por la IL-1 sino también la respuesta de los condrocitos a la IL-1 (357). 118 Discusión Este resultado, aunque concordante con los obtenidos por otros grupos de investigación (354, 383), necesitaba ser confirmado. Por ello, se decidió bloquear la acción de la Jak-2 empleando un inhibidor distinto, el Tkip. El Tkip es un péptido lipofílico de 12 aminoácidos (WLVFFWIFYFFR) que inhibe la autofosforilación de Jak-2 (354, 384). En nuestro modelo experimental, el pre-tratamiento con el Tkip inhibía tanto la acción sinérgica de la leptina con la IL-1 como la acción de la IL-1 sobre la inducción de la NOS tipo II. Es decir: la acción del Tkip sobre la inducción de la NOS tipo II era similar a la del AG490. En nuestras condiciones experimentales, el Tkip inhibe la actividad del receptor de la IL-1 posiblemente por su actividad mimética de SOCS-1 (suppressor of cytokines signalling-1). Se ha demostrado que el SOCS-1, un regulador negativo de la activación de macrófagos inducida por lipopolisacárido (152, 385), se une a quinasas asociadas al receptor de IL-1 (385, 386) bloqueando así la ruta de señalización a través del NF-κB e inhibiendo, por tanto, la inducción de la NOS tipo II (138, 147, 154). Por otra parte, se ha demostrado que el Tyrphostin AG490, en concentraciones que inhiben la expresión de la NOS tipo II, inhibe la activación de NF-κB inducida por IL-1 (354). Así, estos resultados sugieren que la actividad de la Jak-2 es necesaria para la activación de NF-κB que, a su vez, media la inducción de NOS tipo II por parte de la IL-1. Para comprender mejor el mecanismo empleado por la leptina para, en acción sinérgica con la IL-1, inducir la expresión de la NOS tipo II, hemos estudiado el papel que distintas quinasas podrían estar desempeñando en la mencionada acción sinérgica. Hemos estudiado, en primer lugar, el papel de la PI-3K en la ruta de señalización implicada en la activación sinérgica de la NOS tipo II en condrocitos. En nuestro diseño experimental, los condrocitos pre-tratados con los inhibidores específicos de la 119 Discusión PI-3K (Wortmannina y LY294002) muestran una reducción significativa de la actividad y la expresión de la NOS tipo II inducida por la leptina y la IL-1 (357). Habíamos mencionado con anterioridad la controversia existente en torno a la función de la PI-3K en la inducción de la NOS tipo II, en la que unos estudios sugieren que la PI-3K inhibe la actividad de la NOS tipo II (151) mientras que otros apoyan que la PI-3K induce la actividad de la NOS tipo II (371-373). Nuestros resultados sugieren que la actividad de la PI-3K induce la expresión de NOS tipo II en condrocitos tratados con leptina e IL-1. Estos resultados concuerdan tanto con los estudios realizados en otros tipos celulares (371-373) como con nuestros resultados en condrocitos, en los que habíamos demostrado la participación de la PI-3K en la inducción sinérgica de la NOS tipo II por la leptina y el IFN-γ en condrocitos (356). Es posible, por tanto, que las diferencias reseñadas en cuanto a la actividad de la PI-3K en la inducción de la NOS tipo II se deban a los distintos tipos celulares empleados (151, 356, 357, 371-373); es decir: que la interacción entre la PI-3K y la NOS tipo II sea distinta en distintos tejidos. Posteriormente, hemos estudiado la implicación de las MAP quinasas en la inducción de la NOS tipo II en nuestro modelo experimental, centrando nuestra atención en Erk-1/2 y p38K, fundamentales en la señalización de distintos procesos desencadenados por el NO en el cartílago articular (52). Nuestros resultados sugieren que las quinasas Erk-1/2 y p38K participan en la ruta de señalización implicada en la inducción de la NOS tipo II por leptina e IL-1 en condrocitos (357). Hemos observado que la inhibición de Erk-1/2 (realizada bloqueando la actividad de MEK-1 con un inhibidor específico, el PD098059) implicaba una reducción significativa de la inducción de la NOS tipo II. Este resultado concuerda con estudios realizados por otros grupos, en los que demostraban la asociación de la activación de Erk-1/2 con la inducción de NOS tipo II en distintos tipos celulares (142, 120 Discusión 375-377), así como con nuestros resultados antes presentados, obtenidos en condrocitos tratados con leptina e IFN-γ (356). Así pues, el resultado ahora presentado sugiere la participación de Erk-1/2 en la inducción sinérgica de la NOS tipo II en condrocitos tratados con leptina e IL-1 (357). Por último, hemos observado que la inhibición de la p38K reducía de forma significativa la inducción de NOS tipo II en condrocitos tratados con leptina e IL-1 (357). Ese resultado se corresponde con el anteriormente presentado, en el que observábamos que la p38K participaba en la inducción de NOS tipo II por parte de la leptina y el IFN-γ (356) y, además, concuerda con otros estudios, en los que se relaciona la actividad de la p38K con la inducción de la NOS tipo II en distintos tipos celulares (379-381). Podemos concluir, por tanto, que la leptina induce, de forma sinérgica con la IL- 1, la expresión de la NOS tipo II en condrocitos, a través de una ruta de señalización en la que están implicadas las quinasas Jak-2, PI-3K, Erk-1/2 y p38K (357). N O Efectos Centrales •Homeostasis energética •Regulación hormonal. Respuesta Inmune •Activación de neutrófilos •Inducción de citoquinas •Activación de macrófagos •Citotoxicidad de células NK •Estimulación de Th1 •Inhibición de Th2 Tejido Adiposo Blanco Inflamación: condrocitos LEPTINA IFN-γ Figura 37. La leptina induce, de forma sinérgica con el IFN-γy la IL-1 NOS tipo II en ndrocitos. La leptina es una hormona pleiotrópica que, además de sus efectos a nivel central, egula la respuesta inmune y participa en los procesos inflamatorios actuando como una citoquina pro-inflamatoria sobre la inducción de NOS tipo II. / IL-1 SINERGISMO iNOS N O Efectos Centrales •Homeostasis energética •Regulación hormonal. Respuesta Inmune •Activación de neutrófilos •Inducción de citoquinas •Activación de macrófagos •Citotoxicidad de células NK •Estimulación de Th1 •Inhibición de Th2 Tejido Adiposo Blanco Inflamación: condrocitos LEPTINA co r IFN-γ/ IL-1 SINERGISMO iNOS N O N O Efectos Centrales •Homeostasis energética •Regulación hormonal. Respuesta Inmune •Activación de neutrófilos •Inducción de citoquinas •Activación de macrófagos •Citotoxicidad de células NK •Estimulación de Th1 •Inhibición de Th2 Tejido Adiposo Blanco Inflamación: condrocitos LEPTINA IFN-γ Figura 37. La leptina induce, de forma sinérgica con el IFN-γy la IL-1 NOS tipo II en ndrocitos. La leptina es una hormona pleiotrópica que, además de sus efectos a nivel central, egula la respuesta inmune y participa en los procesos inflamatorios actuando como una citoquina pro-inflamatoria sobre la inducción de NOS tipo II. / IL-1 SINERGISMO iNOS co r 121 Discusión Considerando el global de los resultados aquí presentados podemos concluir que la leptina se comporta como una citoquina pro-inflamatoria en los condrocitos (figura 37), en los que induce, de forma sinérgica con la interleuquina-1 y el interferon-gamma, la expresión de la NOS tipo II a través de una ruta de señalización convergente, común en ambos casos, que implica a las quinasas Jak-2, PI-3K, Erk-1/2 y p38K (355-357). Se confirma, por tanto, una acción pro-inflamatoria directa de la leptina en los procesos inflamatorios articulares, abriéndose así nuevas vías de estudio en la relación existente entre la obesidad y distintas patologías inflamatorias, entre ellas la artrosis (11, 174, 200). Es necesario, no obstante, un estudio más detallado de los mecanismos implicados en la acción sinérgica aquí descrita. Entre otros, resultaría especialmente interesante el estudio detallado de la relación entre la actividad del factor nuclear-κB (NF-κB) en la señalización de la inducción de NOS tipo II en condrocitos tratados con leptina y otras citoquinas pro-inflamatorias. 122 Discusión CONCLUSIONES 123 Discusión Discusión 124 124 Conclusiones 1. La leptina induce, de forma sinérgica con el Interferon-gamma y la Interleuquina-1, la expresión de la Nitróxido Sintasa tipo II en condrocitos. 2. La inducción sinérgica de la Nitróxido Sintasa tipo II en condrocitos estimulada por la leptina, en combinación con la interleuquina-1 o el interferon-gamma, implica una vía de señalización común, en la que participan las quinasas Jak-2, PI-3K, MEK-1 y p38K. 125 Bibliografía 43. Otero M, Nogueiras R, Lago F, Dieguez C, Gomez-Reino JJ, Gualillo O. Chronic inflammation modulates ghrelin levels in humans and rats. Rheumatology (Oxford). 2004;43(3):306-10 44. Poole AR. Cartilage in health and disease. In Koopman WJ (ed): Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, 14th ed. Philadelphia , Lippincort, Williams & Wilkins, 2001, pp 226-284. 45. Goldring MB. The musculoskeletal system. B. articular cartilage. In Klippel JH, Crofford LJ, Stone JH and Weyand CM (ed): Primer on the Rheumatic Diseases. Atlanta, Arthritis Foundation, 2001; pp 10-16. 46. Stockwell RA and Meaching G. The chondrocytes. In Freeman MAR (ed): Adult Articular Cartilage. Tunbridge Wells, England, Pitman Medical, 1979; pp 69-114. 47. Poole AR, Pidoux I, Reiner A, Rosenberg L. An immunoelectron microscope study of the organization of proteoglycan monomer, link protein, and collagen in the matrix of articular cartilage. : J Cell Biol. 1982;93(3):921-37. 48. Schmidt MB, Mow VC, Chun LE, Eyre DR. Effects of proteoglycan extraction on the tensile behavior of articular cartilage.J Orthop Res. 1990;8(3):353-63. 49. Hayashi T, Abe E, Yamate T, Taguchi Y, Jasin HE. Nitric oxide production by superficial and deep articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 1997;40(2):261-9. 50. Stefanovic-Racic M, Stadler J, Georgescu HI, Evans CH. Nitric oxide and energy production in articular chondrocytes. J Cell Physiol. 1994;159(2):274-80. 51. Vuolteenaho K, Moilanen T, Al-Saffar N, Knowles RG, Moilanen E. Regulation of the nitric oxide production resulting from the glucocorticoid-insensitive expression of iNOS in human osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 2001;9(7):597-605. 52. Kim SJ, Ju JW, Oh CD, Yoon YM, Song WK, Kim JH et al. ERK-1/2 and p38 kinase oppositely regulate nitric oxide-induced apoptosis of chondrocytes in association with p53, caspase-3, and differentiation status. J Biol Chem. 2002 11;277(2):1332-9. 53. Goldring M.B. and Berenbaum F. The regulation of chondrocyte function by proinflammatory mediators: prostaglandins and nitric oxide. Clin Orthop Relat Res. 2004;427:S37-46 54. Hall BK, Miyake T. All for one and one for all: condensations and the initiation of skeletal development. Bioessays. 2000;22(2):138-47. 55. Hall BK, Miyake T. Divide, accumulate, differentiate: cell condensation in skeletal development revisited.Int J Dev Biol. 1995;39(6):881-93. 56. Aigner T, Dudhia J. Phenotypic modulation of chondrocytes as a potential therapeutic target in osteoarthritis: a hypothesis. Ann Rheum 1997; 56:287-291. 132 Bibliografía 57. Reddi AH. Cartilage morphogenetic proteins: role in joint development, homoeostasis, and regeneration. Ann Rheum Dis. 2003;62:ii73-8. 58. Goldring S.R. and Goldring M.B. The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis. Clin Orthop Relat Res. 2004;(427):S27-36. 59. Goldring MB. Anticytokine therapy for osteoarthritis. Expert Opin Biol Ther. 2001;1(5):817-29. 60. Dinarello CA. Proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock.Chest. 1997;112:321S-329S. 61. Dinarello CA. Proinflammatory cytokines. Chest. 2000;118(2):503-8. 62. Elenkov IJ, Chrousos GP. Stress hormones, proinflammatory and antiinflammatory cytokines, and autoimmunity. Ann N Y Acad Sci. 2002;966:290-303. 63. Spate U, Schulze PC. Proinflammatory cytokines and skeletal muscle. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2004;7(3):265-9. 64. Hamilton TA, Ohmori Y, Tebo J. Regulation of chemokine expression by antiinflammatory cytokines. Immunol Res. 2002;25(3):229-45. 65. Bukowski RM, Olencki T, McLain D, Finke JH. Pleiotropic effects of cytokines: clinical and preclinical studies. Stem Cells. 1994;12:129-40. 66. Curti BD, Urba WJ, Longo DL, Janik JE, Sharfman WH, Miller LL, et al. Endocrine effects of IL-1 alpha and beta administered in a phase I trial to patients with advanced cancer. J Immunother Emphasis Tumor Immunol. 1996;19(2):142-8. 67. Warren JS. Interleukins and tumor necrosis factor in inflammation. Crit Rev Clin Lab Sci. 1990;28(1):37-59. 68. Feghali CA, Wright TM. Cytokines in acute and chronic inflammation. Front Biosci. 1997 2:d12-26. 69. Rankin JA. Biological mediators of acute inflammation. AACN Clin Issues. 2004 15(1):3-17. 70. Furutani Y, Notake M, Yamayoshi M, Yamagishi J, Nomura H, Ohue M, Furuta R, Fukui T, Yamada M, Nakamura S. Cloning and characterization of the cDNAs for human and rabbit interleukin-1 precursor. Nucleic Acids Res. 1985 26;13(16):5869-82. 71. Furutani Y, Notake M, Fukui T, Ohue M, Nomura H, Yamada M, Nakamura S. Complete nucleotide sequence of the gene for human interleukin 1 alpha. Nucleic Acids Res. 1986;14(8):3167-79. Erratum in: Nucleic Acids Res 1986;14(12):5124. 133 Bibliografía 72. Modi WS, Masuda A, Yamada M, Oppenheim JJ, Matsushima K, O'Brien SJ. Chromosomal localization of the human interleukin 1 alpha (IL-1 alpha) gene. Genomics. 1988;2(4):310-4. 73. Lafage M, Maroc N, Dubreuil P, de Waal Malefijt R, Pebusque MJ, Carcassonne Y, Mannoni P. The human interleukin-1 alpha gene is located on the long arm of chromosome 2 at band q13. Blood. 1989;73(1):104-7. 74. Dinarello CA. Interleukin-1. Cytokine Growth Factor Rev. 1997;8(4):253-65. 75. Dinarello CA. The IL-1 family and inflammatory diseases. Clin Exp Rheumatol. 2002;20:S1-13. 76. Dinarello CA, Bunn PA Jr. Fever. Semin Oncol. 1997;24(3):288-98. 77. Dinarello CA. Cytokines as endogenous pyrogens. J Infect Dis. 1999;179:S294- 304. 78. Dinarello CA, Gatti S, Bartfai T. Fever: links with an ancient receptor. Curr Biol. 1999 ;9(4):R147-50. 79. Dayer JM. The pivotal role of interleukin-1 in the clinical manifestations of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford). 2003;42:ii3-10. 80. Towle CA, Trice ME, Ollivierre F, Awbrey BJ, Treadwell BV. Regulation of cartilage remodeling by IL-1: evidence for autocrine synthesis of IL-1 by chondrocytes. J Rheumatol. 1987;14 Spec No:11-3. 81. Guerne PA, Desgeorges A, Jaspar JM, Relic B, Peter R, Hoffmeyer P, Dayer JM. Effects of IL-6 and its soluble receptor on proteoglycan synthesis and NO release by human articular chondrocytes: comparison with IL-1. Modulation by dexamethasone. Matrix Biol. 1999;18(3):253-60. 82. Sadowski T, Steinmeyer J. Modulation of the synthesis and activation of matrix metalloproteinases in IL-1-treated chondrocytes by antirheumatic drugs. Ann N Y Acad Sci. 1999;878:612-4. 83. Beekman B, Verzijl N, de Roos JA, TeKoppele JM. Matrix degradation by chondrocytes cultured in alginate: IL-1 beta induces proteoglycan degradation and proMMP synthesis but does not result in collagen degradation. Osteoarthritis Cartilage. 1998;6(5):330-40. 84. Blumenfeld I, Livne E. The role of transforming growth factor (TGF)-beta, insulinlike growth factor (IGF)-1, and interleukin (IL)-1 in osteoarthritis and aging of joints. Exp Gerontol. 1999;34(7):821-9. 85. Dunne A, O'Neill LA. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: signal transduction during inflammation and host defense. Sci STKE. 2003 25;2003(171):re3. 134 Bibliografía 86. Dinarello CA. Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor antagonist. Int Rev Immunol. 1998;16(5-6):457-99. 87. Muzio M, Mantovani A. The Toll receptor family. Allergy. 2001;56(2):103-8. 88. Anderson KV, Bokla L, Nusslein-Volhard C. Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll gene product. Cell. 1985;42(3):791-8. 89. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, Hoffmann JA. The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell. 1996;86(6):973-83. 90. Gay NJ and Keith FJ. Drosophila Toll and IL-1 receptors. Nature 1991; 351:355- 356 91. Mezhitov R, Preston-Hurlburt P, Janeway CA. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997;388:394- 397 92. Teshima S, Nakanishi H, Nishizawa M, Kitagawa K, Kaibori M, Yamada M, et al. Up-regulation of IL-1 receptor through PI3K/Akt is essential for the induction of iNOS gene expression in hepatocytes. J Hepatol. 2004;40(4):616-23. 93. Taya Y, Devos R, Tavernier J, Cheroutre H, Engler G, Fiers W. Cloning and structure of the human immune interferon-gamma chromosomal gene. EMBO J. 1982;1(8):953-8. 94. Brack C, Nagata S, Mantei N, Weissmann C. Molecular analysis of the human interferon-alpha gene family. Gene. 1981;15(4):379-94. 95. Hitzeman RA, Hagie FE, Levine HL, Goeddel DV, Ammerer G, Hall BD. Expression of a human gene for interferon in yeast. Nature. 1981;293(5835):717-22. 96. Lawn RM, Gross M, Houck CM, Franke AE, Gray PV, Goeddel DV. DNA sequence of a major human leukocyte interferon gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78(9):5435-9. 97. Edge MD, Green AR, Heathcliffe GR, Meacock PA, Schuch W, Scanlon DB, et al. Total synthesis of a human leukocyte interferon gene. Nature. 1981;292(5825):756- 62. 98. Degrave W, Derynck R, Tavernier J, Haegeman G, Fiers W. Nucleotide sequence of the chromosomal gene for human fibroblast (beta 1) interferon and of the flanking regions. Gene. 1981;14(3):137-43. 99. Derynck R, Remaut E, Saman E, Stanssens P, De Clercq E, Content J, Fiers W. Expression of human fibroblast interferon gene in Escherichia coli. Nature. 1980;287(5779):193-7. 135 Bibliografía 100. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. 2004;75(2):163-89. 101. Tilg H, Kaser A. Interferons and their role in inflammation. Curr Pharm Des. 1999;5(10):771-85. 102. Billiau A. Interferons and inflammation. J Interferon Res. 1987;7(5):559-67. 103. Sarzotti M, Landolfo S, Dianzani F. Immune (gamma) interferon production by a murine T cell lymphoma: requirements for macromolecular synthesis and lack of relationship with cell cycle.Infect Immun. 1983;41(2):624-30. 104. Reem GH, Cook LA, Vilcek J. Gamma interferon synthesis by human thymocytes and T lymphocytes inhibited by cyclosporin A. Science. 1983;221(4605):63-5. 105. Zhang G, Nichols RD, Taniguchi M, Nakayama T, Parmely MJ. Gamma interferon production by hepatic NK T cells during Escherichia coli infection is resistant to the inhibitory effects of oxidative stress. Infect Immun. 2003;71(5):2468-77. 106. Seki S, Osada S, Ono S, Aosasa S, Habu Y, Nishikage T, Mochizuki H, Hiraide H. Role of liver NK cells and peritoneal macrophages in gamma interferon and interleukin-10 production in experimental bacterial peritonitis in mice. Infect Immun. 1998;66(11):5286-94. 107. Boehm U, Klamp T, Groot M, Howard JC. Cellular responses to interferongamma. Annu Rev Immunol 1997; 15:749-795. 108. Bach EA, Aguet M, Schreiber RD. The IFN gamma receptor: a paradigm for cytokine receptor signalling. Annu Rev Immunol. 1997;15:563-91. 109. Tau G, Rothman P. Biologic functions of the IFN-gamma receptors. Allergy. 1999;54(12):1233-51. 110. Aguet M, Dembic Z, Merlin G. Molecular cloning and expression of the human interferon-gamma receptor. Cell. 1988;55(2):273-80. 111. Rashidbaigi A, Langer JA, Jung V, Jones C, Morse HG, Tischfield JA, Trill JJ, Kung HF, Pestka S. The gene for the human immune interferon receptor is located on chromosome 6. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(2):384-8. 112. Jung V, Rashidbaigi A, Jones C, Tischfield JA, Shows TB, Pestka S. Human chromosomes 6 and 21 are required for sensitivity to human interferon gamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987;84(12):4151-5. 113. Pernis A, Gupta S, Gollob KJ, Garfein E, Coffman RL, Schindler C, Rothman P. Lack of interferon gamma receptor beta chain and the prevention of interferon gamma signaling in TH1 cells. Science. 1995;269(5221):245-7. 136 Bibliografía 114. Bach EA, Szabo SJ, Dighe AS, Ashkenazi A, Aguet M, Murphy KM, Schreiber RD. Ligand-induced autoregulation of IFN-gamma receptor beta chain expression in T helper cell subsets. Science. 1995;270(5239):1215-8. 115. Briscoe J, Rogers NC, Witthuhn BA, Watling D, Harpur AG, Wilks AF, et al. Kinase-negative mutants of JAK1 can sustain interferon-gamma-inducible gene expression but not an antiviral state. EMBO J. 1996 15;15(4):799-809. 116. Heim MH. The Jak-STAT pathway: cytokine signalling from the receptor to the nucleus. J Recept Signal Transduct Res. 1999;19(1-4):75-120. 117. Moncada S. Nitric oxide. J Hypertens Suppl. 1994;12(10):S35-9. 118. Higashi Y, Yoshizumi M. New methods to evaluate endothelial function: method for assessing endothelial function in humans using a strain-gauge plethysmography: nitric oxide-dependent and -independent vasodilation. J Pharmacol Sci. 2003;93(4):399- 404. 119. Joyner MJ, Dietz NM. Nitric oxide and vasodilation in human limbs. J Appl Physiol. 1997;83(6):1785-96. 120. Stegbauer J, Vonend O, Habbel S, Quack I, Sellin L, Gross V, Rump LC. Angiotensin II modulates renal sympathetic neurotransmission through nitric oxide in AT2 receptor knockout mice. J Hypertens. 2005;23(9):1691-8. 121. Boeckxstaens GE, Pelckmans PA. Nitric oxide and the non-adrenergic noncholinergic neurotransmission. Comp Biochem Physiol A Physiol. 1997;118(4):925-37. 122. Sanders KM, Ward SM. Nitric oxide as a mediator of nonadrenergic noncholinergic neurotransmission. Am J Physiol. 1992;262:G379-92. 123. Guzik TJ, Korbut R, Adamek-Guzik T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol. 2003;54(4):469-87. 124. Korhonen R, Lahti A, Kankaanranta H, Moilanen E. Nitric oxide production and signaling in inflammation. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005;4(4):471-9. 125. Knowles RG, Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J. 1994 ;298 ( Pt 2):249-58. 126. Hauschka PV, Damoulis PD. Functions of nitric oxide in bone. Biochem Soc Trans. 1998;26(1):39-44. 127. Bredt DS. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and pathophysiology. Free Radic Res. 1999;31(6):577-96. 128. Wink DA, Miranda KM, Espey MG. Cytotoxicity related to oxidative and nitrosative stress by nitric oxide. Exp Biol Med (Maywood). 2001;226(7):621-3. 137 Bibliografía 129. Kroncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V. Nitric oxide: cytotoxicity versus cytoprotection--how, why, when, and where? Nitric Oxide. 1997;1(2):107-20. 130. Ischiropoulos H, Gow A. Pathophysiological functions of nitric oxide-mediated protein modifications. Toxicology. 2005 ;208(2):299-303. 131. Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001;357(Pt 3):593-615. 132. Aktan F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 2004;75(6):639-53. 133. Moncada S, Higgs A. The L-arginine-nitric oxide pathway. N Engl J Med. 1993;329(27):2002-12. 134. Mungrue IN, Bredt DS. nNOS at a glance: implications for brain and brawn. J Cell Sci. 2004;117(Pt 13):2627-9. 135. Sessa WC. eNOS at a glance. J Cell Sci. 2004;117(Pt 12):2427-9. 136. Fleming I, Busse R. Signal transduction of eNOS activation. Cardiovasc Res. 1999;43(3):532-41. 137. Chartrain NA, Geller DA, Koty PP, Sitrin NF, Nussler AK, Hoffman EP, et al. Molecular cloning, structure, and chromosomal localization of the human inducible nitric oxide synthase gene. J Biol Chem. 1994 ;269(9):6765-72. 138. Lee JY, Je JH, Jung KJ, Yu BP, Chung HY. Induction of endothelial iNOS by 4-hydroxyhexenal through NF-kappaB activation. Free Radic Biol Med. 2004 ;37(4):539-48. 139. Saldeen J, Welsh N. p38 MAPK inhibits JNK2 and mediates cytokine-activated iNOS induction and apoptosis independently of NF-KB translocation in insulinproducing cells. Eur Cytokine Netw. 2004;15(1):47-52. 140. Utaisincharoen P, Anuntagool N, Arjcharoen S, Limposuwan K, Chaisuriya P, Sirisinha S. Induction of iNOS expression and antimicrobial activity by interferon(IFN)-beta is distinct from IFN-gamma in Burkholderia pseudomallei-infected mouse macrophages. Clin Exp Immunol. 2004;136(2):277-83. 141. Salerno L, Sorrenti V, Di Giacomo C, Romeo G, Siracusa MA. Progress in the development of selective nitric oxide synthase (NOS) inhibitors. Curr Pharm Des. 2002; 8(3):177-200. 142. Blanchette J, Jaramillo M, Olivier M. Signalling events involved in interferongamma-inducible macrophage nitric oxide generation. Immunology. 2003;108(4):513- 22. 138 Bibliografía 143. Golde S, Coles A, Lindquist JA, Compston A. Decreased iNOS synthesis mediates dexamethasone-induced protection of neurons from inflammatory injury in vitro. Eur J Neurosci. 2003;18(9):2527-37. 144. Skimming JW, Nasiroglu O, Huang CJ, Wood CE, Stevens BR, Haque IU, Scumpia PO, Sarcia PJ. Dexamethasone suppresses iNOS yet induces GTPCH and CAT-2 mRNA expression in rat lungs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003;285(2):L484-91. 145. Shinoda J, McLaughlin KE, Bell HS, Swaroop GR, Yamaguchi S, Holmes MC, Whittle IR. Molecular mechanisms underlying dexamethasone inhibition of iNOS expression and activity in C6 glioma cells. Glia. 2003;42(1):68-76. 146. Matsumura M, Kakishita H, Suzuki M, Banba N, Hattori Y. Dexamethasone suppresses iNOS gene expression by inhibiting NF-kappaB in vascular smooth muscle cells. Life Sci. 2001;69(9):1067-77. 147. De Vera ME, Taylor BS, Wang Q, Shapiro RA, Billiar TR, Geller DA. Dexamethasone suppresses iNOS gene expression by upregulating I-kappa B alpha and inhibiting NF-kappa B. Am J Physiol. 1997;273(6 Pt 1):G1290-6. 148. Walker G, Pfeilschifter J, Kunz D. Mechanisms of suppression of inducible nitric-oxide synthase (iNOS) expression in interferon (IFN)-gamma-stimulated RAW 264.7 cells by dexamethasone. Evidence for glucocorticoid-induced degradation of iNOS protein by calpain as a key step in post-transcriptional regulation. J Biol Chem. 1997;272(26):16679-87. 149. Lahti A, Kankaanranta H, Moilanen E. P38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB203580 has a bi-directional effect on iNOS expression and NO production. Eur J Pharmacol. 2002;454(2-3):115-23. 150. Xia YF, Liu LP, Zhong CP, Geng JG. NF-kappaB activation for constitutive expression of VCAM-1 and ICAM-1 on B lymphocytes and plasma cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289(4):851-6. 151. Fukao T, Koyasu S. PI3K and negative regulation of TLR signaling. Trends Immunol. 2003;24(7):358-63. 152. Kubo M, Hanada T, Yoshimura A. Suppressors of cytokine signaling and immunity. Nat Immunol. 2003;4(12):1169-76. 153. Rao KM. Molecular mechanisms regulating iNOS expression in various cell types. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 2000;3(1):27-58. 154. Marks-Konczalik J, Chu SC, Moss J. Cytokine-mediated transcriptional induction of the human inducible nitric oxide synthase gene requires both activator protein 1 and nuclear factor kappaB-binding sites. J Biol Chem. 1998;273(35):22201-8. 155. Trayhurn P. The biology of obesity. Proc Nutr Soc. 2005;64(1):31-8. 139 Bibliografía 156. Markman B. Anatomy and physiology of adipose tissue. Clin Plast Surg. 1989;16(2):235-44. 157. Trayhurn P. Brown adipose tissue and nutritional energetics--where are we now? Proc Nutr Soc. 1989;48(2):165-75. 158. Cannon B, Nedergaard J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 2004;84(1):277-359. 159. Zhang, Y., Proenca, R., Maei, M., Barone, M., Leopold, L. and Friedman, J.M. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 1994 372, 425–432. 160. Fantuzzi G. Adipose tissue, adipokines, and inflammation. J Allergy Clin Immunol. 2005;115(5):911-9. 161. Nakano Y, Tobe T, Choi-Miura NH, Mazda T, Tomita M. Isolation and characterization of GBP28, a novel gelatin-binding protein purified from human plasma. J Biochem (Tokyo). 1996;120(4):803-12. 162. Yamauchi T, Kamon J, Waki H, Terauchi Y, Kubota N, Hara K, et al. The fatderived hormone adiponectin reverses insulin resistance associated with both lipoatrophy and obesity. Nat Med. 2001;7(8):941-6. 163. Fukuhara A, Matsuda M, Nishizawa M, Segawa K, Tanaka M, Kishimoto K, et al Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin. Science. 2005 ;307(5708):426-30. 164. Steppan CM, Bailey ST, Bhat S, Brown EJ, Banerjee RR, Wright CM, Patel HR, Ahima RS, Lazar MA. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 2001;409(6818):307-12. 165. Trayhurn P, Wood IS. Adipokines: inflammation and the pleiotropic role of white adipose tissue. Br J Nutr. 2004;92(3):347-55. 166. Trayhurn P. Adipose tissue in obesity--an inflammatory issue. Endocrinology. 2005;146(3):1003-5. 167. Lehrke M, Lazar MA. Inflamed about obesity. Nat Med. 2004;10(2):126-7. 168. Das UN. Is obesity an inflammatory condition? Nutrition. 2001;17(11-12):953-66. 169. Ahima, R.S. and Flier, J.S. Leptin. Annu. Rev. Physiol. 2000 62,413–437. 170. Gong DW, Bi S, Pratley RE, Weintraub BD. Genomic structure and promoter analysis of the human obese gene. J Biol Chem. 1996 23;271(8):3971-4. 171. He Y, Chen H, Quon MJ, Reitman M. The mouse obese gene. Genomic organization, promoter activity, and activation by CCAAT/enhancer-binding protein alpha. J Biol Chem. 1995;270(48):28887-91. 140 Bibliografía 172. Zhang F, Basinski MB, Beals JM, Briggs SL, Churgay LM, Clawson DK, et al. Crystal structure of the obese protein leptin-E100. Nature 1997 387:206-208 173. Zhang F, Chen Y, Heiman M, Dimarchi R. Leptin: structure, function and biology. Vitam Horm. 2005;71:345-72. 174. Otero M, Lago R, Lago F, Casanueva F.F., Dieguez C, Gómez-Reino J.J. and Gualillo O. Leptin, from fat to inflammation: old questions and new insights. FEBS Lett. 2005 ;579(2):295-301. 175. Matarese G, Moschos S, Mantzoros CS. Leptin in immunology. J Immunol. 2005 ;174(6):3137-42.. 176. Considine RV, Sinha MK, Heiman ML, Kriauciunas A, Stephens TW, Nyce MR, et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 1996 ;334(5):292-5. 177. Frederich RC, Hamann A, Anderson S, Lollmann B, Lowell BB, Flier JS. Leptin levels reflect body lipid content in mice: evidence for diet-induced resistance to leptin action. Nat Med. 1995;1(12):1311-4. 178. Maffei M, Halaas J, Ravussin E, Pratley RE, Lee GH, Zhang Y, et al. Leptin levels in human and rodent: measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects. Nat Med. 1995;1(11):1155-61. 179. Ahima RS, Prabakaran D, Mantzoros C, Qu D, Lowell B, Maratos-Flier E, Flier JS. Role of leptin in the neuroendocrine response to fasting. Nature. 1996;382(6588):250-2. 180. Zhang Y, Matheny M, Zolotukhin S, Tumer N, Scarpace PJ. Regulation of adiponectin and leptin gene expression in white and brown adipose tissues: influence of beta3-adrenergic agonists, retinoic acid, leptin and fasting. Biochim Biophys Acta. 2002;1584(2-3):115-22. 181. Kolaczynski JW, Ohannesian JP, Considine RV, Marco CC, Caro JF. Response of leptin to short-term and prolonged overfeeding in humans. Clin Endocrinol Metab. 1996;81(11):4162-5. 182. Wang J, Obici S, Morgan K, Barzilai N, Feng Z, Rossetti L. Overfeeding rapidly induces leptin and insulin resistance. Diabetes. 2001;50(12):2786-91. 183. Rentsch J, Chiesi M. Regulation of ob gene mRNA levels in cultured adipocytes. FEBS Lett. 1996 ;379(1):55-9. 184. Barr VA, Malide D, Zarnowski MJ, Taylor SI, Cushman SW. Insulin stimulates both leptin secretion and production by rat white adipose tissue. Endocrinology. 1997;138(10):4463-72. 141