Estudio de modificaciones químicas en Capsicum annuum, L. durante su conservación

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología ESTUDIO DE MODIFICACIONES QUÍMICAS EN Capsicum annuum, L. DURANTE SU CONSERVACIÓN MARÍA JOSÉ ORUÑA CONCHA 1996 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Nutrición y Bromatología ESTUDIO DE MODIFICACIONES QUÍMICAS EN Capsicum annuum, L. DURANTE SU CONSERVACIÓN Memoria presentada por María José Oruña Concha en la Universidad de Santiago de Compostela para optar al Grado de Doctor. Santiago de Compostela, Diciembre de 1996 JESÚS SIMAL LOZANO, CATEDRÁTICO DE ANÁLISIS QUÍMICO APLICADO, BROMATOLOGÍA Y TOXICOLOGÍA Y JULIA LÓPEZ HERNÁNDEZ, PROFESORA TITULAR DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA AUTORIZAN a Dña María José Oruña Concha, Licenciada en Farmacia, a presentar la Tesis titulada "ESTUDIO DE MODIFICACIONES QUÍMICAS EN Capsicum annuum, L. DURANTE SU CONSERVACIÓN " para optar al Grado de Doctor en Farmacia, la cual ha sido realizada bajo nuestra dirección en los Laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, se expide la presente en Santiago de Compostela, en Diciembre de mil novecientos noventa y seis. Fdo: Prof. Dr. D. J. Simal Lozano Fdo. Dra. Dña J. López Hernández RAFAEL CELA TORRIJOS, DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMA que Dña María José Oruña Concha presenta el trabajo titulado "ESTUDIO DE MODIFICACIONES QUÍMICAS EN Capsicum annuum, L. DURANTE SU CONSERVACIÓN" realizado bajo la dirección de los Dres. D. Jesús Simal Lozano y Dña Julia López Hernández, en los Laboratorios de Bromatología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela. Fdo. Dr. D. Rafael Cela Torrijos Santiago de Compostela, Diciembre de 1996 __________________________________________________________Indice general ABREVIATURAS INDICE DE TABLAS INDICE DE FIGURAS 1.- INTRODUCCIÓN . 1.1.- DEFINICIÓN 1.2.- CONSERVACIÓN 1.3.- NOTAS DE LOS PARÁMETROS ESTUDIADOS 1.3.1.- HUMEDAD 1.3.2.- PIGMENTOS 1.3.3.- AROMA 1.3.4.- CAPSAICINOIDES 1.3.5.- VITAMINA C 1.3.6.- ÁCIDOS ORGÁNICOS 1.3.7.- CARBOHIDRATOS 1.3.8.- ÁCIDOS GRASOS 2.- OBJETIVOS 3.- PARTE EXPERIMENTAL 3.1.- MUESTREO 3.2.- DETERMINACIONES ANALÍTICAS 3.2.1.- HUMEDAD 3.2.2.- PIGMENTOS 3.2.3.- COMPUESTOS AROMÁTICOS 3.2.4.- CAPSAICINOIDES 3.2.5.- ÁCIDOS ORGÁNICOS Y VITAMINA C 3.2.6.- CARBOHIDRATOS 3.2.6.1.- AZÚCARES, ALMIDÓN Y PECTINAS 3.2.6.2.- FIBRA INSOLUBLE 3.2.7.- ÁCIDOS GRASOS 4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1.- METODOS ANALÍTICOS 4.1.1.- CAPSAICINOIDES 4.1.2.- ÁCIDOS ORGÁNICOS Y VITAMINA C 4.2.- COMPOSICIÓN I III VII 3 6 8 9 11 15 17 18 19 22 27 31 33 34 37 42 44 46 49 51 57 58 59 __________________________________________________________Indice general 4.3.- CONSERVACIÓN 4.2.1.- EVOLUCIÓN DE LOS PIGMENTOS 4.2.2.- EVOLUCIÓN DE LOS COMPONENTES DEL AROMA 4.2.3.- EVOLUCIÓN DE LOS CAPSAICINOIDES 4.2.4.- EVOLUCIÓN DE LA VITAMINA C Y ÁCIDOS ORGÁNICOS 4.2.5.- EVOLUCION DE LOS CARBOHIDRATOS 4.2.6.- EVOLUCIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS 5.- CONCLUSIONES 6.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 72 78 97 100 108 114 126 131 ___________________________________________________________Abreviaturas I ABREVIATURAS A: Absorbancia AIS: Alcohol Insoluble Solids ANOVA: Analysis Of Variance Art: Artículo BOE: Boletin Oficial del Estado col: colaboradores DOCE: Diario Oficial de las Comunidades Europeas FAME: Fatty Acid Methyl Esters FID:Flame Ionization Detector Fig: Figura GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry Hg: Mercurio HPLC: High Performance Liquid Chromatography M: Molar m.f. : muestra fresca m.s. : muestra seca N: Normalidad p/v: Peso/volumen RRT: Relative Retention Time RSD: Relative Standard Desviation UV/VIS: Ultravioleta/visible Indice de Tablas I TABLA I.- Composición química del pimiento común o dulce según diferentes autores. TABLA II.- Programa de gradiente empleado para la separación de los pigmentos. TABLA III.- Composición química del pimiento tipo Padrón. TABLA IV .- Evolución del contenido en clorofila“a” en pimientos envasados manualmente y a vacío congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA V .- Evolución del contenido en clorofila“b” en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA VI.- Evolución del contenido en luteína en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA VII.- Evolución del contenido en β-caroteno en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA VIII.- Relación de los compuestos volátiles identificados en el pimiento tipo Padrón fresco (entero (F) y triturado (T)), congelado, con y sin vacío (V y N, respectivamente), y liofilizado (L). TABLA IX.- ANOVA correspondiente a los “frutos enteros” (Frescos y congelados, con y sin vacío). TABLA X.- ANOVA correspondiente a los “frutos triturados” (Frescos y Liofilizados). TABLA XI.- ANOVA correspondiente a los “frutos frescos” (Enteros y Triturados). TABLA XII .- Evolución del contenido en vitamina C en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA XIII .- Evolución del contenido en ácido málico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA XIV.- Evolución del contenido en ácido oxálico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA XV. - Evolución del contenido en ácido quínico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA XVI .- Evolución del contenido en ácido cítrico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA XVII .- Evolución del contenido en ácido fumárico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) TABLA XVIII.- Evolución del contenido en fructosa en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) TABLA XIX .- Evolución del contenido en glucosa en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) TABLA XX .- Evolución del contenido en almidón en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) 5 35 60 74 75 76 77 86 88 89 90 102 103 104 105 106 107 109 110 111 Indice de Tablas II TABLA XXI .- Evolución del contenido en pectinas en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) TABLA XXII .- Evolución del contenido en fibra insoluble en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) TABLA XXIII.- Evolución del contenido en ácido palmítico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) TABLA XXIV .- Evolución del contenido en ácido esteárico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) TABLA XXV .- Evolución del contenido en ácido araquídico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) TABLA XXVI .- Evolución del contenido en ácido oleico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) TABLA XXVII.- Evolución del contenido en ácido linoleico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) TABLA XXVIII .- Evolución del contenido en ácido linolénico en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) 112 113 118 119 120 121 122 123 _______________________________________________________________ Tabla I.- Composición química del pimiento común o dulce según diferentes autores. COMPONENTE UNIDADES (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) HUMEDAD g/100g m.f. 91.0 92.8 91.0 94 92 94 93.4 92.8 91 PROTEINAS “0.9 1.2 1.2 0.9 1.10 0.90 1.20 1.10 0.90 GRASA “0.2 0.2 0.33 0.4 0.20 00.30 0.30 0.20 HC TOTALES “3.7 5.3 4.7 -2.90 2.2 3.4 3.5 3.7 FIBRA “1.2 1.4 2.2 2.2 0.70 -1.4 1.40 1.2 CALCIO mg/100g m.f. 12 9 -9-9-9 12 MAGNESIO “11 12 -----13 11 HIERRO “0.5 0.4 0.6 0.4 -0.40 -0.70 0.5 SODIO “0.5 4.2 ---2-50.5 POTASIO “210 186 -----205 210 FÓSFORO “25 25 -----26 25 VITAMINA C “131 128 128 100 -100 128 126 131 RIBOFLAVINA “0.04 -0.08 - - 0.03 0.08 0.05 0.04 TIAMINA “0.05 -0.06 - - 0.08 0.08 0.06 0.05 LUTEINA “- - - - - - 40.8 - - β-CAROTENO “0.4 0.25 0.25 -4.9 -13.4 - - (1) SECHI, G. (1967) (2) DIEM, K. y LENTER, C. (1975) Documento Geigy (1975) (3) PRIMO YUFERA, E. (1979) (4) HAWTHORN, J. (1983) (5) RICO AVILA, J. (1983) (6) BUSS, D. y col. (1987) (7) BELITZ, H.D. y GROSCH, W. (1988) (8) FEINBERG, M. y col. (1991) (9) MATAIX, J. (1993) _______________________________________________________________ 1.2.- CONSERVACIÓN Los productos de origen vegetal se caracterizan por su estacionalidad y por ser especialmente perecederos, sufriendo a partir de su recolección un rápido deterioro de su calidad a la temperatura ambiente. Por la dinámica de la sociedad actual nos vemos obligados a consumir dichos alimentos algún tiempo después de su adquisición, por lo que debemos someterlos a una correcta conservación para impedir no sólo su deterioro sino el mínimo de pérdidas de nutrientes. La conservación se realiza mediante técnicas diferentes, siendo la más usual el frío, mediante los procesos de congelación y liofilización, entre otros. 1.2.1.- Conservación en frío: congelación Consiste en bajar la temperatura por debajo del punto de congelación en el núcleo del alimento (en frutas y verduras oscila entre -0.3 y -3ºC (Rodríguez Hurtado, 1983), para bloquear así toda posibilidad de desarrollo microbiano y limitar la acción de las principales enzimas y la mayoría de reacciones químicas. Seguidamente el alimento se almacena a -18ºC (DOCE de 21 de Diciembre de 1988), temperatura que debe mantenerse hasta el momento de su utilización. En lo que afecta al valor nutricional y calidades organolépticas, se considera la congelación como una de las mejores técnicas de conservacion. No obstante, hay datos que evidencian la pérdida considerable del contenido final en nutrientes, como consecuencia de factores tales como la calidad del alimento a congelar, técnicas empleadas, tiempo de conservación y las fases finales de descongelación, recalentamiento o cocción, durante las que se producen fenómenos de oxidación y solubilización. Como regla general, si el alimento fresco está en buen estado, el producto congelado será de buena calidad siempre que se conserve durante un tiempo razonable a temperatura adecuada, ya que al cabo de unos meses de estancia en el congelador, el contenido en vitaminas tiende a disminuir y las grasas a hacerse rancias. Asi mismo, la descongelación debe hacerse rápidamente, ya que, aunque es prácticamente imposible la proliferación microbiana a esas temperaturas tan extremas, puede no obstante, conservar algunos microorganismos tales como esporas de anaerobios y ciertos coliformes. _______________________________________________________________ 1.2.2.- Conservación por liofilización La liofilización o criodeshidratación, se basa en la propiedad de que una solución congelada se puede sublimar en ciertas condiciones: el hielo, al vacío y a temperatura inferior a -30ºC, pasa del estado gaseoso al de vapor sin pasar por el estado líquido. Las ventajas de este sistema de conservación son las siguientes: - Todo el proceso se realiza a bajas temperaturas lo que permite realizar la desecación de numerosos productos termolábiles, incluso a temperatura ambiente, como es el caso de un gran número de materiales biológicos. - La baja volatilidad de un gran número de compuestos a las temperaturas a las que se realiza el proceso. Por esta razón en los productos liofilizados van a permanecer la mayor parte de las sustancias volátiles presentes en el producto inicial. -Ausencia de espuma, que es uno de los principales problemas de la desecación a vacío. Esto se debe a que se trabaja con producto congelado. - Rápida dispersión del producto liofilizado, es decir, el producto inicial se obtiene casi de manera instantánea por simple adición de agua. - Ausencia de crecimiento bacteriano: En los productos liofilizados no se desarrollan microorganismos debido a que la humedad residual es muy pequeña. Este costoso procedimiento (la inversión de capital en maquinaria es importante) se emplea principalmente en la conservación de productos de alto precio tales como las vacunas. No obstante, el sistema tiende a extenderse para la conservación de alimentos: polvos de setas que conservan todo el aroma al ser mezclados en las sopas, leches infantiles, zumos de frutas, frutos, legumbres, huevos, extractos de café, té, infusiones,... e incluso carnes y pescado. Despúes de una rehidratación, su valor nutritivo y sus cualidades organolépticas son prácticamente las mismas que las del alimento fresco (Belitz y Grosch, 1988). _______________________________________________________________ 1.3.- CARACTERISTICAS DE LOS PARÁMETROS ESTUDIADOS. 1.3.1.- HUMEDAD La humedad o contenido en agua de las hortalizas, es normalmente, alta, oscilando entre el 75 y el 95% (Primo Yúfera, 1979); en algunos casos, como el pepino y la lechuga, esta cifra se acerca al 95%, si bien, en otros casos, apenas supera el 50%, tal es el caso de los tubérculos amiláceos (Wills y col., 1984). El contenido en agua de una determinada hortaliza puede variar considerablemente, incluso dentro de la misma especie, y si existen variaciones diurnas de temperatura oscilará también a lo largo del día; esto debe tenerse en cuenta a la hora de proceder a la recolección del vegetal, pues éste resulta más crujiente cuando el contenido en agua es más elevado (Wills y col., 1984). Constituye el medio en el que se verifican las reacciones químicas y participa como sustrato en las de hidrólisis (Belitz y Grosch, 1988). En las hortalizas, está presente en distintos estados: - agua libre o solvente, conservando las propiedades del agua pura, - agua capilar y agua adsorbida en la superficie constituyendo formas intermedias, medianamente activas, - agua de constitución, intimamente unida a los otros compuestos bioquímicos de los que no puede separarse más que por técnicas severas. Este agua ha perdido sus propiedades y no ejerce presión de vapor. Desde el punto de vista químico y biológico, el concepto esencial es lo que se conoce como “actividad de agua (aw)”, que se define como la disponibilidad del agua para intervenir en reacciones de cualquier tipo y es el cociente entre la presión de vapor del alimento y la del agua pura, a la que arbitrariamente se le atribuye el valor uno. Por regla general, las reacciones químicas ocurren a actividades de aguas bajas, de 0.2 a 0.4; las reacciones enzimáticas comienzan a niveles del orden de 0.4 ó 0.5; la proliferación delevaduras y mohos a 0.7 y la de las bacterias a partir de 0.9 (Adrian y Frangne, 1990). La humedad puede ser determinada por diferentes métodos tales como: desecación en estufa (Simal-Lozano y col., 1986; AOAC, 1990), desecación en estufa de vacío (Moreno y col., 1983; Ranganna 1986), desecación en horno microondas (García Villanova y col., 1988), destilación con solventes inmiscibles (Moreno Martin y De La Torre Boronat, 1983; Simal-Lozano y col., 1986), desecación por liofilización (Simal-Lozano y col., 1986), método de Karl-Fisher (Ranganna, 1986), radiación infrarroja y resonancia magnetica nuclear (Ranganna, 1986), entre otros. _______________________________________________________________ 1.3.2.- PIGMENTOS El color es un carácter organoléptico de suma importancia en los alimentos, pudiéndose usar como criterio de calidad, ya que los pigmentos responsables pueden verse muy modificados con distintas operaciones de procesado (Chen y col., 1995). Las frutas y las verduras son los productos que contienen la mayor concentración de pigmentos (Badui Dergal, 1981), siendo los carotenoides los más importantes de origen vegetal. Se encuentran localizados en el protoplasma de las células vegetales. 1.3.2.1.- Carotenoides Los carotenoides, junto con las clorofilas, están presentes en la mayoría de los vegetales fotosintéticos, ya que absorben luz al igual que éstas. Se pueden dividir en dos grandes grupos: carotenos, que son estrictamente hidrocarburos, y xantofilas, forma oxigenada de los carotenos. Los carotenoides predominantes en los vegetales verdes son la luteína y el ß-caroteno (Heinonen y col.,1989). En los vegetales verdes, debido a que la clorofila es más abundante y más intensa en color, los carotenoides suelen estar enmascarados, de ahí que se distingan mejor en plantas jóvenes cuando la clorofila aún no está desarrollada en grandes concentraciones. Son compuestos liposolubles de color amarillo, naranja y rojo, ampliamente distribuídos en la naturaleza y solubles en disolventes orgánicos apolares. El interés de los carotenoides se ha incrementado recientemente no sólo como precursor de la vitamina A (esencial para la visión con poca luz y mantener sanos la piel y los tejidos superficiales) (Buss y col., 1987), sino también como posible inhibidor de cáncer (Harris y col., 1991) y úlceras (Mozsik y col., 1984). Su destrucción reduce el valor nutritivo de los alimentos, e induce una decoloración y una pérdida de sus características organolépticas (Badui Dergal, 1981). 1.3.2.2.- Clorofilas La clorofila es el pigmento verde que se localiza en los cloroplastos de las plantas y a través del cual se realiza la fotosíntesis, proceso de mucha importancia en la vida de todos los organismos, ya que es el principal mecanismo por el cual se sintetizan los diferentes carbohidratos que se encuentran en la naturaleza.. En los vegetales verdes, las clorofilas predominantes son las clorofilas a y b, que generalmente se encuentran en la proporción 3:1 en plantas superiores (Belitz y Grosch, 1988). _______________________________________________________________ Este pigmento tiene una estructura porfirínica con un átomo de magnesio y una molécula de fitol que se esterifica con una molécula de ácido propiónico. Dicha estructura es fácilmente alterable, lo que origina cambios tales como (Badui, 1981): a) la sustitución del grupo magnesio por hidrógeno (feofitinización) que se traduce en una desaparición del color verde originándose unos pigmentos denominados feofitinas, de color verde oliva pardo. b) la eliminación de la cadena de fitol, originando la transformación de la feofitina en el feofórbido correspondiente. Señalar que los feofórbidos también se pueden originar a partir de la clorofila por la eliminación primero del grupo fitol, dando lugar a los clorofilidos, de igual color y propiedades espectroscópicas que la clorofila, seguido de la eliminación del magnesio. c) la ruptura del anillo tetrapirrólico con la consecuente pérdida total del color. La aparición de feofitinas ocurre en medio ácido, intensificándose si está acompañado o precedido por un tratamiento térmico que desnaturaliza la propoteína ligada a la clorofila, favoreciendo así la actuación de los ácidos orgánicos de los vegetales. Si el calentamiento es excesivo, se producen ácidos orgánicos, tales como el ácido acético, responsables ahora de dicha transformación. Su formación se ha intentado evitar adicionando al agua de cocción pequeñas cantidades de bicarbonato sódico, pero dichas condiciones alcalinas repercuten negativamente sobre la textura, sabor y aroma de los vegetales, además de favorecer la pérdida de vitamina C, por lo que es más habitual el empleo de sales cúpricas para formar clorofilinas cúpricas que no se destruyen por el calor en medio ácido y que son las responsables del color “verde luminoso” característico de algunas conservas vegetales. Sin embargo, las sales cúpricas también han dejado de usarse por razones toxicológicas (Primo Yúfera, 1979). La acción de la enzima clorofilasa provoca la pérdida del grupo fitol, originándose los clorofílidos correspondientes. Este fenómeno sucede durante la maduración y almacenamiento de vegetales frescos (Primo Yúfera, 1979). La clorofila también puede ser degradada por la acción de los hidroperóxidos formados durante la oxidación de las grasas insaturadas y por las radiaciones (Badui Dergal, 1981). Los cambios de color se utilizan como índice de calidad, y por lo tanto la relación de clorofila a feofitina se puede emplear como medida de deterioro en los vegetales (Badui Dergal, 1981). . Desde el punto de vista nutritivo, las clorofilas son importantes por su aporte de magnesio a la dieta (Buss y col., 1988). _______________________________________________________________ Entre los métodos para la determinación de pigmentos vegetales destacan métodos espectroscópicos (White y col., 1972; Ranganna, 1986; Yoder y Daley, 1990) y cromatográficos, desde la cromatografía en capa fina (Sievers y Hynninen, 1977; Padula y Rodríguez-Amaya, 1987) hasta la cromatografía líquida de alta resolución (Granado y col., 1992; López-Hernández y col., 1993; Saitoh y col., 1995), que es actualmente la técnica más empleada. 1.3.3.- AROMAS El aroma, junto con el sabor, está reconocido como uno de los atributos de calidad más importantes de los alimentos, ya que la especie humana, al igual que otras especies animales, han seleccionado su alimentación desde los tiempos más remotos, tanto por su aspecto visual como por la sensación agradable o desagradable producida en los órganos receptores del olor y del sabor (Alberola e Izquierdo, 1979), más que por su contenido vitamínico. Los órganos de los sentidos responsables de la detección del gusto y del aroma (sensaciones colectivamente englobadas en el término inglés ″flavour″), han evolucionado para desempeñar una función esencial, establecer qué es y qué no es apto como alimento (Coultate, 1984). Este atributo de calidad, conocido desde tan antiguo, ha tardado mucho tiempo en ser analizado científicamente, y, a pesar de los avances analíticos, el origen químico de algunos componentes del aroma y sabor es todavía desconocido. Esto es debido, a que algunas sustancias estan presentes en proporciones realmente bajas, que por sí solas no tienen ni un aroma ni un sabor intenso, y que pasan desapercibidas para el analista, pero que tienen una gran influencia sobre el aroma y sabor final del alimento. Las sustancias aromáticas, a diferencia de los compuestos responsables del sabor (normalmente polares, solubles en agua y poco o nada volátiles), son compuestos volátiles, se perciben por los receptores del olor del órgano olfatorio y poco polares que provocan una amplia gama de sensaciones. En ocasiones, el concepto de sustancias aromáticas se utiliza laxamente, ya que un compuesto puede contribuir al olor o sabor típico de un alimento, en tanto que en otro alimento puede causar un olor o sabor anormal, o ambos. Entre los compuestos no volátiles de los alimentos, algunos tienen incidencia, no sólo como precursores de aromas (azúcares, aminoácidos, vitaminas) sino también como sabores propios (Medina y col., 1994). _______________________________________________________________ El aroma típico de un fruto viene dado por la proporción de mezcla de determinados compuestos, más que por la presencia de sustancias características, ya que se encuentran prácticamente los mismos componentes en frutas diferentes, pero en distintas proporciones (Luthi, 1958). El aroma va a permitir comparar las características organolépticas de distintas variedades (Paillard, 1967), seguir la evolución de la calidad en función del almacenamiento en atmósfera controlada (Willaert y col., 1983), e incluso predecir la fecha óptima de cosecha para frutos que van a ser almacenados posteriormente (Dirinck y col., 1989). Según Medina y col., 1994, la formación de compuestos volátiles en los alimentos tiene lugar a partir de: a) Los procesos enzimáticos y de fermentación que intervienen en los alimentos en estado natural. Las enzimas juegan un papel muy importante en las propiedades organolépticas de los alimentos, especialmente en los productos lácteos, bebidas fermentadas (vino, cerveza...), carnes, frutas y legumbres (zumos, purés, jarabes) y productos cocinados. Señalar también que en el curso de tratamientos de secado, de almacenamiento, etc, los alimentos pierden sus cualidades olfativas y gustativas, las cuales pueden minorizarse añadiendo enzimas o microorganismos apropiados. b) Reacciones de Maillard, que se producen cuando los alimentos a distintos tratamientos con el fin de prepararlos o conservarlos. Globalmente esta reacción tiene como precursores a los aminoácidos y a los azúcares reductores. Las diferentes etapas conducen, por una parte, a la formación de compuestos volátiles que constituyen el aroma propiamente dicho; y por otra, a la formación de pigmentos pardos (melanoidinos). Las principales características de las sustancias responsables del aroma de los alimentos son: la volatilidad, la elevada solubilidad en disolventes orgánicos y la relativa baja solubilidad en agua, y en ellas se apoyan la mayoría de los métodos desarrollados para analizar este tipo de sustancias (Mateos y Carbonell, 1990). Si se quiere conocer la naturaleza química de los constituyentes volátiles, son necesarias cuatro etapas perfectamente definidas (Alberola e Izquierdo, 1979): 1) Separación de la fracción volátil del material no volátil. 2) Concentración de la fracción volátil. 3) Fraccionamiento de dicha fracción en los distintos componentes. 4) Identificación de los componentes separados. _______________________________________________________________ Los métodos de aislamiento y concentración son muy variados ya que están en función, no sólo de las características fisico-químicas de los compuestos volátiles (presión de vapor, solubilidad, polaridad, tamaño, etc.), sino también de la naturaleza del alimento, de su composición y de su consistencia. Entre las técnicas empleadas para tal fin se encuentran: a) Destilación de la muestra, pudiéndose realizar ésta un un sistema abierto (a presión atmosférica, a presión reducida, o a alto vacío), con arrastre de vapor, fraccionada o con entrada de un gas auxiliar (aire o nitrógeno) (Sagrero-Nieves y col., 1989). b) Extracción sólido-líquido, siendo el carbón activo uno de los adsorbentes más utilizados (Pérez y col., 1993), ahora cada vez más sustituído por los polímeros porosos tales como Tenax o Porapak (Sauri y col., 1988). Se aplican principalmente en muestras acuosas. c) Extracción líquido-líquido con disolventes tales como: hexano (Gómez y col., 1993), isopentano, diclorometano (Barbeni y col., 1990), éter-pentano (Brunke y col., 1989; Kerrola y col., 1994), freón, sulfuro de carbono y dióxido de carbono, entre otros, ya que es difícil encontrar un disolvente universal. d) Arrastre con gas inerte (He, N2, CO2,...) de forma continua sin alcanzar el equilibrio, seguido de una posterior concentración de los volátiles mediante condensación criogénica o por atrapamiento mediante adsorción e incluso absorción. El proceso de recuperación es generalmente largo ( Naik y col., 1989; Kerrola y col., 1994). e) Técnicas de espacio de cabeza, lo cual implica la inyección directa de la fase gaseosa en equilibrio con la muestra en un espacio confinado. La composición de los vapores en espacio de cabeza dependerá en gran medida de la presión de vapor del componente y de la naturaleza del sustrato matriz. Estas técnicas permiten mostrar la importancia relativa de un compuesto específico en el conjunto de la percepción, pero, debido a que el volumen inyectado en el espacio de cabeza es muy pequeño, sólo aquellos compuestos que por su concentración y volatilidad relativa estén presentes en cantidades suficientes para dar respuesta en el detector, podrán ser controlados (Nísperos-Carriedo y Shaw, 1990; Shinohara y col., 1991; Wilson y col., 1992; Ohsumi y col., 1993; Buttery y col., 1994; Luning y col., 1994; Van Ruth y col., 1995). f) Desmixtura: es decir, la formación de dos fases a partir de una mezcla homogénea de agua y un disolvente orgánico miscible por adición de sales minerales. g) Inyección directa de la muestra. Especialmente indicada para aquellos compuestos cuya concentración sea superior a 10mg/L. Presenta el inconveniente de introducir simultáneamente componentes poco o nada volátiles (azúcares, sales minerales,...) que podrían dar depósitos en el inyector. _______________________________________________________________ Los métodos de fraccionamiento e identificación, por su parte, deben ser sensibles y selectivos, ya que los aromas alimentarios son mezclas muy complejas. Las técnicas más utilizadas en esta ocasión son: 1) Cromatografía de Gases: utilizada no solamente para separar compuestos volátiles, sino también para determinar la calidad de los aromas. Han de ser considerados los tipos de columna y naturaleza de su fase estacionaria, caudal del gas portador, temperatura, cantidad de muestra y uso de separador. El detector más utilizado es el de ionización de llama (FID) acoplado a la espectrometría de masas (MS) (Chitwood y col., 1983; Shinohara y col., 1991; Wilson y col., 1992; Shiota, 1993; Gómez y col., 1993; Van Ruth y col., 1994; Luning y col., 1994; Van Ruth y col., 1995). Es el método más adecuado para llevar a cabo estos análisis, ya que permite obtener una alta resolución en estas mezclas tan complejas como son los aromas alimentarios. 2) Cromatografía Líquida: técnica complementaria de la cromatografía gaseosa, que, aunque actualmente en auge, sin embargo, requiere un tiempo de análisis largo, no disponiéndose de detectores universalmente sensibles y siendo el acoplamiento con la espectrometría de masas aún complicado. Se presta particularmente al análisis de los compuestos olorosos menos volátiles (Barron, 1991). 3) Cromatografía de Fluídos Supercríticos: especialmente indicada para compuestos poco volátiles con un alto punto de ebullición. La fase móvil utilizada más frecuentemente es el CO2 ya que tiene la particularidad de no interferir con la mayoría de los métodos de detección (Sinha y col., 1992; Reverchon y Senatore, 1994). 1.3.4.- CAPSAICINOIDES Los compuestos químicos responsables del sabor picante de los pimientos que han hecho que estos frutos sean conocidos en todo el mundo se denominan capsaicinoides. Su acumulación en los frutos de las especies del género capsicum está relacionado con la edad, tamaño, estado de desarrollo y contenido en carotenoides de los mismos (Sakamoto y col., 1979). Los capsaicinoides son un grupo de alcaloides derivados estructuralmente de la amida ácida de la vainillilamina de ácidos grasos C9-C11 ramificados. Han sido identificados y cuantificados cinco capsaicinoides presentes de forma natural en las especies del género capsicum: capsaicina, _______________________________________________________________ por carbono, oxígeno e hidrógeno y en ciertos casos también pueden contener fósforo y nitrógeno. Todos tienen la particularidad de ser solubles en disolventes orgánicos, e insolubles en agua. Además de su valor nutritivo, los lípidos contribuyen en muchos aspectos a la textura de los alimentos, sirven como vehículo de las vitaminas liposolubles e influyen en el sabor de distintos productos alimenticios (Badui Dergal, 1981; Buss y col., 1987). Las principales fuentes de aceites y grasas son los tejidos animales y las semillas oleaginosas, ya que los frutos y los vegetales contienen en general muy bajas concentraciones, oscilando normalmente entre 0.1 y 0.3 % (Primo Yúfera, 1979). Los ácidos grasos son los componentes más abundantes de los lípidos. La mayoría son lineales monocarboxilados que varían en el número de átomos de carbono y de dobles enlaces. Normalmente contienen un número par de átomos de carbono. Se dividen en saturados e insaturados, dependiendo de la presencia o ausencia de dobles enlaces en su molécula (Buss y col., 1987). Los ácidos grasos insaturados, a diferencia de los saturados, son altamente inestables debido a la presencia de dobles enlaces en su molécula, lo que les permite reaccionar con el oxígeno del aire y producir el enranciamiento de la grasa. Este proceso reduce el valor nutricional del alimento y favorece la formación de olores y sabores desagradables. Esta reacción de oxidación es acelerada por el calor, la luz y la presencia de iones metálicos(cobre y hierro principalmente). Asi pues, una forma de evitar dicha reacción de oxidación, sería almacenando los alimentos a bajas temperaturas, en la oscuridad y envasados a vacío o en atmósfera inerte. Otro mecanismo de oxidación es a través de la enzima lipooxigenasa, que realiza una oxigenación en lugar de una oxidación, sobre los ácidos grasos insaturados que contienen como mínimo una unidad de cis-cis-1,4-pentadieno. Los ácidos grasos esenciales linoleico y linolénico son muy susceptibles a esta enzima ya que contienen respectivamente 1 y 2 de estas unidades. Esta enzima, que es muy activa, está presente de forma natural en los tejidos de las plantas. Hay que destacar la importancia de los ácidos grasos linoleico, linolénico y araquidónico, denominados ácidos grasos esenciales ya que no pueden ser sintetizados por el hombre y son necesarios en pequeñas cantidades para mentener la salud. Anteriormente se denominaron "vitamina F" y deben estar presentes en la dieta en cantidad suficiente para aportar el 1-2% de la energía consumida (Buss y col., 1987). Los ácidos linoleico y linolénico, son necesarios para la síntesis de la prostaglandinas, además de ser parte constitutiva de la membrana de diferentes tejidos vegetales; estos ácidos son también precursores del ácido araquidónico, que se requiere para dar rigidez a la mitocondria de las células. Otras funciones biológicas incluyen la estimulación del crecimiento en el humano, el mantenimiento de la piel y _______________________________________________________________ el pelo, la regulación del metabolismo y el colesterol, la actividad lipotrópica y el mantenimiento del sistema reproductivo (Anderson y col., 1987; Buss y col., 1987). A causa de la importancia de los ácidos grasos en la dieta, se han desarrollado numerosos métodos para su determinación en los alimentos. Así encontramos métodos volumétricos (AACC, 1984), gravimétricos (AOAC, 1990), colorimétricos (Murray y Moss, 1990), espectroscópicos ( Lanser y col., 1991) y cromatográficos bien por HPLC (Chaytor, 1987; Senatore, 1990), bien por GC (Bakir y col., 1993; Park y Washington, 1993; López-Hernández y col., 1996d). De todos ellos la Cromatografía gaseosa es la técnica más empleada en la determinación de ácidos grasos. 2. OBJETIVOS _______________________________________________________________ Los objetivos marcados en el presente trabajo son: 1.- Determinar la composición química del pimiento tipo Padrón (Capsicum annuum, L.), para lo cual, ha sido necesario poner a punto los métodos analíticos de ácidos orgánicos, capsaicinoides y componentes del aroma . El resto de los parámetros se han determinado aplicando métodos analíticos puestos a punto en el Departamento. 2.- Estudiar la evolución de las modificaciones que sufre el pimiento de Padrón en su composición química después de someterle a diferentes procesos de conservación. La metodología a seguir es la siguiente: 1.- Recogida de muestras. 2.- Almacenamiento de las muestras mediante diferentes procesos de conservación: congelación normal y a vacío, y liofilización. 3.- Extracción y/o separación, teniendo en cuenta la naturaleza de las muestras, realizándose un estudio de las técnicas de extracción más adecuadas para cada uno de los parámetros a analizar. 4.- Purificación y concentración, siempre y cuando sea necesario. 5.- Análisis de los componentes de interés, una vez extraídos, estableciéndose los eluyentes, columnas cromatográficas y sistemas de detección más idóneos para su correcta separación y cuantificación. 6.- Puesta a punto de los métodos, estudiando la precisión, exactitud y recuperación de los mismos. 7.- Análisis periódico de las muestras a analizar, previamente congeladas y liofilizadas, una vez seleccionado el método de análisis más adecuado. 8.- Tratamiento de datos que permitirá comprobar si hay diferencias significativas para cada parámetro según la pocedencia de la muestra, realizándose a continuación un estudio comparativo entre los distintos métodos de conservación a fin de determinar si hay diferencias entre ellos y así poder elegir el más adecuado. 3. PARTE EXPERIMENTAL _______________________________________________________ -Página 31- 3.1.-MUESTREO Y PRESERVACIÓN Para la realización del presente trabajo, las muestras de pimientos tipo Padrón (Capsicum annum, L.) tienen diferente procedencia, según el fin de su utilización. Así hay que diferenciar entre: 1.- Las muestras que han permitido la puesta a punto del método de determinación de ácidos orgánicos, asi como determinar su composición química (humedad, hidratos de carbono, fibra, ácidos orgánicos y pigmentos) procedentes de los supermercados de la ciudad. 2.- Las muestras que han permitido por un lado la puesta a punto del método de determinación de capsaicinoides y la evolución de los mismos durante la cosecha, y por otro lado, la puesta a punto del método de determinación de los componentes responsables de su aroma y el estudio de las modificaciones sufridas un mes después de someterle a los procesos de congelación, con y sin vacío, y de liofilización, en este caso procedentes de la finca de la Doctora Julia López Hernández, situada en Bugallido (Ames). 3.- Las muestras que han permitido estudiar las modificaciones de su composición química (humedad, hidratos de carbono, fibra, ácidos orgánicos y pigmentos) después de someterle a diferentes procesos de conservación (congelación normal y a vacío, y liofilización), en esta ocasión suministradas por el Servicio de Extensión Agraria de Padrón y Vilagarcía en la primavera del 1994. Para este último estudio, el mismo día de la recolección de las muestras y una vez en el laboratorio, se sometieron a un análisis en fresco para determinar la composición inicial de los parámetros de interés, referencia necesaria en este estudio. Antes de su procesado, se procedió a la eliminación del pedúnculo. Seguidamente fueron divididos en treinta porciones de 200g cada una y se procedió de la siguiente manera: a) Diez porciones de pimientos fueron secadas mediante liofilización (Liolabore 3 Telstar; 0.01mm de Hg durante 2 días; temperaturas de -40ºC a +30ºC) y luego almacenados a temperatura ambiente en frascos de cristal libres de aire y guardados en la oscuridad. b) Diez porciones de pimientos fueron empaquetadas en bolsas de polietileno expulsando manualmente el aire en la medida de lo posible y luego almacenados en un arcón congelador a -22ºC. c) Diez porciones de pimientos fueron empaquetadas a vacío (Henkovac 1900; 40 mm Hg durante 16 seg) en bolsas de polietileno y luego almacenados en un arcón congelador a -22ºC. Para los análisis se tomaron muestras periódicas a los 1, 2, 3, 5, 7, 9 y 12 meses de almacenamiento. _______________________________________________________ -Página 32- 3.2.- DETERMINACIONES ANALÍTICAS 3.2.1.- DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD La técnica utilizada para determinar la humedad ha sido la liofilización. 3.2.1.1.- Material y aparatos - Recipientes de aluminio (22 × 14 × 3 cm) - Arcón congelador Edesa de 1000 litros de capacidad. - Liofilizador LIOLABORE 3 TELSTAR. 3.2.1.2.- Preparación de la muestra Una vez homogeneizada la muestra, se coloca en recipientes de aluminio previamente tarados (P1) con sus tapas correspondientes y se pesan (P2), realizándo a continuación el proceso de liofilización propiamente dicho (0.01mm de Hg durante 2 días; temperaturas de -40ºC a +30ºC). Una vez finalizado, se pesan de nuevo los recipientes, con sus tapas (P3). Por diferencia de peso antes y después de la liofilización se conoce la pérdida de agua. 3.2.1.3.- Cálculos P2 - P3 % de humedad = _______ × 100 P2 - P1 P1 = Peso del recipiente vacío. P2 = Peso del recipiente con la muestra fresca. P3 = Peso del recipiente con la muestra liofilizada. _______________________________________________________ -Página 33- 3.2.2. DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS Este análisis se ha llevado a cabo mediante el método de López-Hernández y col., 1993, puesto a punto en nuestro Departamento. Los RSD del método, obtenidos sometiendo 10 porciones de la misma muestra al proceso completo de análisis, fueron de 2.45, 3.30, 3.27 y 2.32 para la luteína, clorofila b, clorofila a y βcaroteno, respectivamente. 3.2.2.1.- Reactivos -Patrones de los pigmentos: -Clorofila a. SIGMA Art. C-5753. -Clorofila b. SIGMA Art. C-5878. -All-trans-luteina. SIGMA Art. X-6250. -All-trans-ß-caroteno. SIGMA Art. C-9750. -Solventes de Grado para HPLC: -Metanol. SCHARLAU Art. Me-306. -Acetonitrilo. SCHARLAU Art. Ac-329. -Diclorometano. SCHARLAU Art. Cl-335. -Hexano. SCHARLAU Art. He-231. -Solventes de grado para análisis: -Acetona SCHARLAU Art. Nv-011. -Eter de petróleo SCHARLAU Art. Nv-140. - Reactivos de grado para análisis: - Arena de mar lavada. PANREAC Art. 211160. - Carbonato cálcico. MERCK Art. 2066. - Sulfato sódico anhidro. PROBUS Art. 175120. 3.2.2.2.- Material y aparatos -Cromatógrafo de líquidos Spectra-Physics, equipado con una bomba SP8800 y bucle de inyección de 20 µL, Rheodyne. -Detector UV-VIS Spectra Focus Forward Optical Scanning. -Columna Spherisorb ODS2 (C18) de 250 x 4.6 mm y un tamaño de partícula de 5 µm, con precolumna Adsorbosphere C18 (5 µm, 20 x 4.6 mm). -Ordenador 386 IBM con 4 MB de memoria RAM, con el sistema operativo “Operating System/2” versión 1.2 -Software FOCUS de Spectra-Physics versión 1.3 para la adquisición y tratamiento de los datos. _______________________________________________________ -Página 34- -Harvard Graphics, versión 3.0 para realizar las figuras. 3.2.2.3.- Preparación de la muestra Se pesan 10 g de muestra (1 g en el caso de muestra liofilizada), se le añade 1 g de carbonato cálcico, se desintegra el tejido añadiendo arena de mar y 20 g de sulfato sódico anhídrido; a continuación se añaden pequeñas porciones de una mezcla acetona: éter de petróleo (1:1) filtrando de cada vez a vacío hasta que no quede color en el residuo, se juntan todos los filtrados llevándolos a un volumen total de 100 mL. Del extracto resultante se toma una alícuota de 10 mL y se evapora bajo corriente de nitrógeno en un baño de agua a 37 ºC hasta obtener un residuo seco que se redisuelve en 2 mL de hexano, se filtra a través de un filtro Millipore de 0.45 µm para eliminar las partículas no solubles y se inyecta en el cromatógrafo. 3.2.2.4.- Preparación de los patrones Se prepara una solución madre de pigmentos en 10 mL de acetona. De aquí se toman las porciones necesarias para establecer una escala, de tal forma que las concentraciones de los pigmentos en la muestra queden en el rango de la escala establecida. La acetona se evapora bajo corriente de nitrógeno y se redisuelven las porciones en hexano, para luego ser inyectadas en el cromatógrafo. 3.2.2.5.- Procedimiento cromatográfico El eluyente utilizado para llevar a cabo la separación analítica se compone de una mezcla de metanol , acetonitrilo y diclorometano/hexano 1:1, con una composición inicial que se mantiene durante los 9 primeros minutos, para luego comenzar un gradiente que termina a los 16 minutos (ver Tabla II). El flujo es constante (0.8 mL/min). Al final de cada inyección la columna es reequilibrada con la mezcla inicial isocrática durante 20 minutos a un flujo de 2 mL/min. Tabla II.- Programa de gradiente empleado para la separación de los pigmentos. Tiempo (min) Flujo mL/min Metanol Diclorometano- Hexano Acetonitrilo 00.8 15 75 10 9.0 0.8 15 75 10 16.0 0.8 15 40 45 24.0 0.8 15 40 45 24.0 2.0 15 75 10 44.0 2.0 15 75 10 La absorción visible de los mismos se mide en modo “full scan” siendo tres las longitudes de ondas seleccionadas en función de los máximos de absorbancia de los espectros registrados de cada componente. _______________________________________________________ -Página 35- 3.2.2.6.- Identificación y cuantificación La identificación de los pigmentos de las muestras se basa en la comparación de sus tiempos de retención y espectros visibles, registrados con el Sistema Spectra Focus, con los de los patrones correspondientes. Las longitudes de onda seleccionadas para la cuantificación fueron: 430nm para la clorofila a, 450 nm para la luteína y el ß-caroteno y 460 nm para la clorofila b. 3.2.2.7.- Cálculos Para la cuantificación de los pigmentos, se establece una recta de calibrado en función de la relación de las áreas de los picos con las concentraciones de los correspondientes patrones. 3.2.3.- DETERMINACIÓN DE COMPUESTO AROMÁTICOS 3.2.3.1.- Material y aparatos - Dispositivo de purga térmica CL/Purgue-1 (CROMLAB) - Unidad Impingeer TOURÓN (ref. Q.1223/1 y Q.1223/2) - Baño de agua Tectrón 3473100 - Desorbedor térmico Rektorik, MW-1A - Cromatógrafo de gases GC 8000 series (Fisons Instruments) - Espectrómetro de Masas MD 800 (Fisons Instruments) - Cartuchos de adsorción: cartucho R-010R (carbón grafitizado) cartucho R-010B (carbón activo) - Columna capilar: DB-5, 30 m x 0.25 mm ID (J&W Scientific). - Gas portador Helio N-50 - Nitrógeno N-50 - Ordenador Dell 486X, con 8 MB de memoria RAM y con coprocesador matemático, con el sistema operativo MS-DOS versión 6.2, en el entorno Windows 3.11 para trabajo en grupo. - Ordenador HP VECTRA VE (Pentium), con 8 MB de memoria RAM y con coprocesador matemático 486DX, con el sistema operativo MS-DOS versión 6.2, en el entorno Windows 3.11 para trabajo en grupo. - Software de adquisición de datos (MS) MASSLAB versión 1.2 - Biblioteca de espectros Wiley. - SPSS para Windows para el tratamiento estadístico de los datos. _______________________________________________________ -Página 31- 3.2.5.1.6.- Cálculos Se establece para cada una de las sustancias su recta de calibrado, calculando a partir de la misma la concentración de cada componente en la muestra. 3.2.6.- DETERMINACIÓN DE HIDRATOS DE CARBONO La determinación de azúcares y almidón se ha llevado a cabo mediante el método de López- Hernández y col., 1994, las pectinas se han determinado siguiendo el método de Vázquez-Blanco y col., 1995 y para la fibra insoluble se ha seguido el método de López-Hernández y col., 1996 c, todos ellos puestos a punto en nuestro Departamento. El RSD del método seguido para la determinación de azúcares y almidón, obtenido sometiendo 10 porciones de la misma muestra al proceso completo de análisis, fue de 2.77, 1.55 y 2.05 para la fructosa, glucosa y almidón, respectivamente. Así mismo, el RSD del método seguido para la determinación de las pectinas y fibra insoluble fue de 0.55 y 1.38, respectivamente. 3.2.6.1.- DETERMINACIÓN DE AZÚCARES, ALMIDÓN Y PECTINA. 3.2.6.1.1.- Reactivos -Patrones de azúcares: -Fructosa. MERCK Art. 5323 -Glucosa. MERCK Art. 8337 -Acido galacturónico. SIGMA Art. G-2125 -Solventes de grado para HPLC: -Acetonitrilo. SCHARLAU Art. 263092 -Agua ultrapura MILI-Q -Acido glacial acético. SCHARLAU Art. Ac-344. -Solventes de grado para análisis: -Etanol. SCHARLAU Art. Nv-120 -Reactivos de grado para análisis: -Acido cítrico. MERCK Art.244 -Hidrógeno fosfato de sodio. SIGMA Art. S-0876 -Hidróxido sódico 0.1N. PANREAC Art. 141687 -Acetato de sodio. MERCK Art. 6267 _______________________________________________________ -Página 32- -Enzima amiloglucosidasa (E.C.3.2.1.3) from Aspergillus niger. BOEHRINGERMANHEIN Art. 208469. -Enzima pectinasa (EC 3.2.1.15) from Aspergillus niger. SIGMA Art. P-9932 -Enzima celulasa (EC 3.2.1.4) from Penicilliun funicolosum. SIGMA Art. C-9750. 3.2.6.1.2.- Material y aparatos - Bomba Spectra Physics 8700 XR, bucle de inyeción de 20 µL Rheodyne. - Detector de Indice de Refracción Shodex RI-71. - Columna Spherisorb NH2 de 5 µm y 250 x 4.6 mm. - Calentador de columna Spectra-Physics SP 8792. - Estufa de incubación. - Agitador rotativo ATOM-80 - Refrigerante a reflujo. - Placa calefactora. - Integrador Spectra Physics 4290 comunicado vía Labnet a un ordenador personal TANDY 1000L equipado con los programas DOUBLE DOS y WINner para tratamiento de datos, con el sistema operativo MS-DOS ver. 3.2 - Ordenador HP VECTRA VE (Pentium), con 8 MB de memoria RAM y con coprocesador matemático 486DX, con el sistema operativo MS-DOS versión 6.2, en el entorno Windows 3.11 para trabajo en grupo. -Harvard Graphics, versión 3.0 para realizar las figuras. 3.2.6.1.3.- Preparación de la muestra Se pesan 30 g de muestra (3 g en el caso de muestra liofilizada) y se pone a reflujo durante 45 min. con 160 mL de alcohol del 80% (v/v). A continuación este extracto se filtra a vacío y se lava con un pequeño volumen de alcohol caliente. El residuo obtenido se seca en una estufa a 37 ºC durante 12 h., obteniéndose el material insoluble en alcohol (AIS) que se utilizará para la determinación posterior del almidón y las pectinas y la solución obtenida, que contiene los azúcares simples, se lleva a un volumen de 200 mL. Una alícuota de 5 mL de esta solución se purificacan mediante una extracción en fase sólida con una SEP-PAK C18. La porción resultante se pasa a través de una membrana filtrante de 0.45 µm para luego ser inyectada en el cromatógrafo. Para la determinación del almidón, se pesan 700 mg de AIS en un erlenmeyer, se añaden 40 mL de agua y se hierve a reflujo durante 2 h. para gelatinizar el almidón. Al cabo de este tiempo se para la ebullición, se deja enfriar a 40ºC, se adicionan 40 mL de solución tampón citrato/fosfato (pH=4.6) y 20 mg (120 unidades) de amiloglucosidasa, se tapa el erlenmeyer con papel de aluminio y se incuba durante 16 h. a 55-58ºC para hidrolizar el almidón a glucosa. Para la determinación de pectinas a 300 mg de _______________________________________________________ -Página 33- (MIA) se le añaden 30 mL de agua destilada y 1 mL de hidróxido sódico 0.1 N (pH 9.5), se agita vigorosamente y se incuba durante 20 h a 4ºC. Transcurrido este tiempo se ajusta el pH a 4.5 con ácido acético glacial diluído, se añaden 60 mg (400 unidades) de celulasa y 1 mL de pectinasa (64 unidades) y se incuba durante 20 h. a 55ºC, para hidrolizar la pectina a ácido galacturónico. Estas mezclas se enfrían y se enrasan con 100 y 50 mL de agua el almidón y la pectina respectivamente. A continuación se filtra una alicuota a través de papel (Whatman nº 541), y las soluciones resultantes se filtran de nuevo a través de una membrana filtrante de 0.45 µm, para luego ser inyectada en el cromatógrafo. 3.2.6.1.4.- Preparación de los patrones Se prepara una solución madre de los azúcares en alcohol del 80% y de aquí se toman las porciones necesarias para confeccionar una escala, de tal manera que la concentración de los azúcares presentes en la muestra quede en el rango de la escala establecida. Se prepara una escala con el patrón de glucosa disuelto en agua de tal modo que la concentración de glucosa, obtenida por hidrólisis del almidón presente en la muestra, quede dentro del rango de la escala establecida. Se prepara una solución madre de ácido galacturónico en agua y se confecciona una escala de tal manera que la concentración de ácido galacturónico, obtenido por hidrólisis de las pectina presente en al muestra, quede dentro del rango de la escala establecida. 3.2.6.1.5.- Condiciones de trabajo Azúcares y almidón: - Fase móvil: acetonitrilo: agua (90:10) - Flujo: 1.4 mL/min - Columna Spherisorb NH2 de 5 µm y 250 x 4.6 mm, termostatizada a 28ºC - Detección: Indice de Refracción Pectinas: - Fase móvil: Acetato de Sodio 0.1M llevado a pH 4.6 con ácido glacial acético. - Columna Spherisorb NH2 de 5 µm y 250 x 4.6 mm. - Flujo: 0.8 mL/min. - Detección: Indice de Refracción 3.2.6.1.6.- Cálculos. Con la escala de patrones se establece una recta de calibrado a partir de la cual se calcula la concentración de las sustancias en la muestra. _______________________________________________________ -Página 34- 3.2.6.2.- FIBRA INSOLUBLE 3.2.6.2.1.- Reactivos -Solución acuosa neutrodetergente formada por: -Acido etilendiamin-tetracético (EDTA). SCHARLAU Art. Ac-940 -Borato de sodio decahidratado (BORAX). SIGMA Art. S-9640 -Dodecyl sulfato sódico. MERCK Art. 13760 -2-etoxietanol. SCHARLAU Art. Et-182 -Hidrógeno fosfato de sodio anhidro. SIGMA Art. S-0876 -Sulfato sódico anhidro. PANREAC Art. 131716 -n-Octanol. MERCK Art. 991 -Acetona. NORMASOLV Art. Nv-010 3.2.6.2.2.- Material y aparatos -Unidad de extracción "Dosi-Fiber" (ver Fig. 5) -Crisoles con filtro de porosidad nº 2 (40-70 µm) -Estufa -Horno Figura 5.- Unidad de extracción “Dosi-Fiber”. _______________________________________________________ -Página 31- 3.2.6.2.3.- Procedimiento Para la determinación de la fibra insoluble se pesa 1 g de muestra seca en los crisoles y se lleva a la unidad de extracción. A continuación se añaden 100 mL de solución neutrodetergente, previamente calentada a 95-100ºC, una punta de espátula de sulfato sódico anhidro y 2-3 gotas de n-octanol.Se enciende el calefactor hasta 80-90ºC y se extrae durante 1 h. Al finalizar el tiempo de extracción se abre el grifo de la trompa de agua y se aspira. Seguidamente se lavan las paredes con agua caliente y con acetona. Una vez completada la filtración se sacan los crisoles de la unidad de extracción y se llevan a una estufa a 100ºC durante 8 h. para secar el residuo. Al cabo de este tiempo se lleva a un desecador a temperatura ambiente durante 45 min. y se pesa. Este residuo está constituido por celulosa, hemicelulosa, lignina, cutina, silica y cenizas insolubles. Para descartar estas cenizas insolubles se incinera el residuo durante 3 h. a 550ºC, se lleva a un desecador y se pesan. De la diferencia de ambas pesadas se calcula la cantidad de fibra presente en las muestras. 3.2.6.2.4.- Cálculos Para calcular la cantidad de fibra de la muestra se sigue la fórmula: % Fibra = A - B/ C x 100 donde: -A: Peso de la muestra desecada (fibra + cenizas insolubles) -B: Peso de la muestra incinerada (cenizas insolubles) -C:Peso de la muestra 3.2.7.- DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS La determinación de los ácidos grasos se ha realizado siguiendo el método de López Hernández y col., 1996 d, puesto a punto en nuestro Departamento. Este método se basa en la separación y determinación por cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama de los ésteres metílicos de los ácidos grasos. Los RSD del método, obtenidos sometiendo 10 porciones de la misma muestra al proceso completo de análisis, fueron de 1.30, 1.60, 2.07, 0.93, 2.10 y 3.61 para los ácidos grasos palmítico, esteárico, oleico, linoleico, linolénico y araquídico, respectivamente. _______________________________________________________ -Página 31- 3.2.7.1.- Reactivos -Patrones de ácidos grasos: -Mirístico. SIGMA Art. M-3128 - Palmítico. SIGMA Art. P-5917 -Heptadecanico. SIGMA Art. H-4515 (patrón interno) -Esteárico. SIGMA Art. S-4751 -Oleico. SIGMA Art. O-3879 - Linoleico. SIGMA Art. L-1376 -Linolénico. SIGMA Art. L-2376 -Araquídico. SIGMA Art. A-3631 -Solventes para análisis de trazas: n-Hexano. MERCK Art. 4371 --Reactivos de grado para análisis: -Metanol. SCHARLAU Art. Me 306 -Acido sulfúrico.NORMASOLV Art. Nv 037 3.2.7.2.- Material y aparatos - Cromatógrafo de gases Perkin-Elmer 8700, equipado con inyector splitsplitless, con software para adquisición y tratamiento de datos, y con detector de ionización de llama (FID). - Columna capilar SGL-1000 de 25 m x 0.25 mm y 0.25µm y temperatura máxima de 240ºC - Impresora EPSON LX- 800, conectada directamente a la puerta en serie del GC. - Gas portador N-50 - Hidrógeno N-50 - Aire comprimido. Compresor Ingersoll-Rand 270627 3.2.7.3.- Extracción de los lípidos Para el análisis, 2 g de muestra liofilizada se someten a una extracción contínua en el soxhlet con hexano durante 4 h (Spitzer y col., 1991; Ajewole y Adeyeye, 1993). Transcurrido este tiempo se evapora el hexano con precaución y las últimas trazas del solvente son eliminadas bajo una corriente de nitrógeno. 3.2.7.4.- Preparación de los ésteres metílicos de los ácidos grasos La obtención de los ésteres metílicos se lleva a cabo utilizando el extracto obtenido en el apartado anterior con metanol sulfúrico al 1.5% durante 30 min. Transcurrido este tiempo los ésteres metílicos se extraen con 50 mL de hexano en 3 etapas (20+20+10) y 5 mL de este extracto son evaporados a sequedad bajo una corriente de nitrógeno. El residuo obtenido se redisuelve en 1 mL de hexano y se filtra a través de una membrana filtrante de 0.45 µm, se sobrecarga con una cantidad conocida de estándar interno y se inyecta en el cromatógrafo. _______________________________________________________ -Página 31- 3.2.7.5.- Preparación de los patrones Se prepara una solución madre de ácidos grasos, se someten al proceso de metilación y se toman las porciones necesarias para confeccionar una escala de tal manera que la concentración de los ácidos grasos presentes en la muestra quede en el rango de la escala establecida. 3.2.7.6.- Condiciones de trabajo -Temperatura del inyector: 230ºC. -Temperatura del detector: 230ºC. - Temperatura de la columna programada de 100 a 230ºC. -Cantidad de muestra inyectada: 1 µL -Flujo del gas portador: 0.81 mL/min. -Relación de split: 1:37 -Técnica de la inyección: La inyección se realiza con una temperatura de la columna de 100ºC, manteniéndose de forma automática la válvula del divisor de muestra cerrada. Transcurrido el primer minuto se abre automáticamente dicha válvula al mismo tiempo que empieza la temperatura programada con un gradiente de 18ºC/min hasta alcanzar una temperatura de 160ºC, transcurrido lo cual continúa una nueva rampa con un gradiente de 1.5ºC/min hasta 210ºC. 3.2.7.7.- Identificación y cuantificación Los ésteres metílicos de los ácidos grasos fueron identificados por comparación de sus tiempos de retención corregidos (RRT) con los correspondientes a los estandares. La cuantificación se realizó usando el éster metílico del ácido heptadecanoico (C17:0) como estandar interno. 4. RESULTADOS Y DISCURSIÓN _______________________________________________________ -Página 31- 4.1. - PUESTA A PUNTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS. 4.1.1. - DETERMINACIÓN DE CAPSAICINOIDES. Los niveles de capsaicinoides son realmente bajos o inexistentes al comienzo de este muestreo, por ello fue necesario poner a punto el método con variedades de pimienta de cayena comerciales (López- Hernández y col., 1996b). En el desarrollo del método se intentó aprovechar la solución resultante de la extracción del color formada por una mezcla de acetona:éter de petróleo (1:1), en la cual los capsaicinoides serían solubles, pero el cromatograma que se obtenía, apenas se identificaba ya que interferían otras sustancias presentes en este extracto. Se optó por purificar dicha solución con una minicolumna de alúmina pero los resultados seguían siendo no satisfactorios. La longitud de onda seleccionada para la medida fue de 280 nm. A esta longitud de onda los límites de detección siguiendo las normas ACS (1980) fueron de 0.89 y 0.57 µg/mL para la capsaicina y dehidrocapsaicina, respectivamente. A 200 nm si bien los límites de detección para ambos capsaicinoides eran más bajos (0.35 y 0.51 µg/mL para la capsaicina y dehidrocapsaicina respectivamente), pero se hacía más difícil su cuantificación ya que el cromatograma salía más sucio. Para la determinación de la precisión de la medida, una misma solución se inyectó seis veces. Los RSD fueron 1.38 para la capsaicina y 0.95 para la dehidrocapsaicina. Para la determinación de la precisión del método, una misma muestra fue sometida 10 veces al proceso completo de análisis, obteniéndose unos RSD de 2.33 y 1.02 para la capsaicina y la dehidrocapsaicina, respectivamente. Para evaluar la recuperación del método se sobrecargaron 10 muestras con soluciones estándard de concentraciones conocidas. La media de estas recuperaciones fue de 97.4% con un RSD de 3.05%. El método fue calibrado usando los patrones de ambos capsaicinoides. La regresión lineal del área de cada pico (y) en la concentración del estandar (x) dieron las siguientes ecuaciones: para la capsaicina y= -2493 + 331924 x, con un coeficiente de correlación r=0.9998 y para la dehidrocapsaicina y= -5296 + 235232 x, con un coeficiente de correlación de r=0.9997. _______________________________________________________ -Página 31- 4.1.2.- DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS Y VITAMINA C Esta determinación se ha llevado a cabo siguiendo el método de HPLC de Vázquez-Odériz y col., 1993, puesto a punto en nuestro departamento, con una pequeña modificación de la fase móvil. La composición inicial de la misma era agua de grado HPLC llevada a pH 2.2 con ácido sulfúrico. Esta fase provocaba una señal a 215 nm. Fue necesario la sustitución de este ácido por el ácido metafosfórico para conseguir el pH de 2.2 necesario para el análisis de estos compuestos. El RSD del método, obtenido sometiendo 10 porciones de la misma muestra al proceso completo de análisis, fue de 3.23, 2.11, 2.40, 3.90, 1.70 y 3.93 para el ácido oxálico, quínico, málico, cítrico, fumárico y vitamina C, respectivamente. 4.2.- COMPOSICIÓN QUÍMICA Este estudio ha sido objeto de una publicación en la revista Food Chemistry (López Hernández y col., 1996 a). En la Tabla III se recoge la composición química del pimiento tipo Padrón, obtenida a partir del presente estudio. El contenido en humedad que presenta este fruto, es muy similar a los datos reportados en la bibliografía para los pimientos comunes (ver Tabla I). Los cromatogramas de carotenoides y clorofilas correspondientes a un patrón y una muestra de pimiento tipo Padrón se recogen en las Figs. 6 y 7 respectivamente. Los espectros de los componentes a análisis aparecen reflejados en las Figs. 8 (xantofilas minoritarias), 9 (clorofilas), 10 (β-caroteno), y 11 (luteina). La luteína es la xantofila predominante con 1.6 mg/100g de muestra fresca, valor considerablemente inferior al reportado por Belitz y Grosch (1988). Señalar la presencia de otra xantofila identificada como criptoxantina por comparación de su espectro UV-VIS con la bibliografía (Chen y Yang, 1992) que no fue cuantificada ya que aparece en muy pequeña cantidad. El ß-caroteno fue el único caroteno detectado con 0.92 mg/100g de muestra fresca, valor notablemente más bajo al encontrado por Rico Ávila (1983) y Belitz y Grosch (1988), pero similar, aunque algo superior, al encontrado por otros autores en otro tipo de pimientos (Sechi, 1967; Diem y Lenter, 1975; Primo Yúfera, 1979). El contenido de clorofila a fue más alto que el contenido de clorofila b (7.9 frente a 3.4 mg/100g ). _______________________________________________________ -Página 36- nm Figura 11.- Espectro visible del ββ-caroteno _______________________________________________________ -Página 37- Tiempo (min) (1) Acido Oxálico, (2) Acido Quínico, (3) Acido Málico, (4) Vitamina C, (5) Acido Cítrico, (6) Acido Fumárico. A*: (unidades de Absorbancia) Figura 12.- Cromatograma de una solución patrón de vitamina C y ácidos orgánicos. _______________________________________________________ -Página 38- Tiempo (min) (1) Acido Oxálico, (2) Acido Quínico, (3) Acido Málico, (4) Vitamina C, (5) Acido Cítrico, (6) Acido Fumárico. A*: (unidades de Absorbancia) Figura 13.- Cromatograma de vitamina C y ácidos orgánicos correspondiente a una muestra fresca de pimiento tipo Padrón. _______________________________________________________ -Página 39- (a) (b) Figura 14.- Determinación de azúcares. (a) Cromatograma de una solución patrón de azúcares, (b) Cromatograma de azúcares correspondiente a una muestra de pimientos tipo Padrón. _______________________________________________________ -Página 40- (a) Tiempo(min) (b) Tiempo(min) Figura 15.- Determinación de Almidón. (a) Cromatograma de una solución patrón de glucosa, (b) Cromatograma de almidón (como glucosa) correspondiente a una muestra de pimientos tipo Padrón. _______________________________________________________ -Página 31- (1) Acido Galacturónico Figura 16.- Determinación de pectinas. (a) Cromatograma de una solución patrón de ácido galacturónico, (b) Cromatograma de pectinas (como ácido galacturónico) correspondiente a una muestra de pimientos tipo Padrón. _______________________________________________________ -Página 32- 4.3.- CONSERVACIÓN 4.3.1.- EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO EN PIGMENTOS (Xantofilas, Carotenos y Clorofilas) La evolución de las clorofilas a y b, luteína y ß-caroteno en pimientos tipo Padrón congelados, envasados con y sin sellado a vacío, ha sido objeto de una publicación en la revista Z Lebemns Unters For (Oruña-Concha, y col., 1996 c). Los datos correspondientes a dicha evolución se recogen en las Figs. 17 (clorofila a), 18 (clorofila b), 19 (luteína) y 20 (β-caroteno) (Tablas IV,V,VI y VII, respectivamente). Al margen de las oscilaciones observadas, en el caso de la congelación tanto manual como a vacío, todos los pigmentos mostraron una tendencia a mantenerse con respecto al valor inicial durante los 12 meses que duró el estudio. Cuando se aplica el “Test de Diferencia entre Pares” para comparar ambos tipo de empaquetado, sólo se observan diferencias significativas (p ≤ 0.05) en la clorofila a, obteniéndose mejores resultados con el empaquetado a vacío. La evolución de la clorofila a, clorofila b, luteína y ß-caroteno en estos pimientos tipo Padrón sometidos al proceso de liofilización ha sido objeto de una publicación en la revista Deutsche Lebensmittel- Rundschau (González-Castro y col., 1996 d). La liofilización supuso un descenso de todos los pigmentos: 2.0, 13, 17 y 57 % para clorofila a, clorofila b, luteína y ß-caroteno respectivamente. Al mes de almacenamiento el descenso se acentuó en la clorofila a (80%) y luteína (26%) con respecto al valor recién liofilizado. El contenido en ß-caroteno no se vio modificado al 1º mes de almacenamiento, pero sí al 2º mes, experimentando una disminución del 62%. Durante los 12 meses de análisis los valores de los pigmentos tendieron a mantenerse con respecto al 1º mes de almacenamiento, a excepción del ß-caroteno que se mantuvo con respecto al 2º mes. Al aplicar el “Test de Diferencia entre Pares” para comparar la congelación y la liofilización, se observó que, en todos los casos existían diferencias significativas (p ≤ 0.05), favoreciéndose la conservación de todos los pigmentos bajo estudio con la congelación. _______________________________________________________ -Página 33- Tabla IV.- Evolución del contenido en CLOROFILA “a” en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 05.52 5.92 5.80 16.75 6.36 1.23 25.45 6.27 0.33 33.98 6.59 0.75 55.00 4.83 1.08 73.69 5.16 1.92 94.61 6.70 1.22 12 4.35 6.93 1.86 _______________________________________________________ -Página 31- Tabla V.- Evolución del contenido en CLOROFILA “b” en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 02.66 2.66 2.41 13.04 2.83 2.60 21.62 2.65 2.18 32.44 2.94 2.52 52.47 2.32 1.59 72.06 2.58 2.23 93.05 2.95 2.05 12 2.32 2.87 2.83 Tabla VI.- Evolución del contenido en LUTEINA en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 01.27 1.27 1.17 11.49 1.66 0.86 21.42 1.53 0.91 31.19 1.61 0.87 51.02 1.36 0.59 70.94 1.48 0.74 91.81 1.31 0.82 12 0.97 1.40 0.89 _______________________________________________________ -Página 32- Tabla VII.- Evolución del contenido en β-CAROTENO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 00.51 0.51 0.30 10.83 0.86 0.26 20.87 0.53 0.10 30.28 0.88 0.06 50.33 0.46 0.05 70.46 0.54 0.16 91.23 1.13 0.09 12 0.39 0.89 0.19 _______________________________________________________ -Página 36- Figura 22.- TIC-Cromatograma de los compuestos volátiles del pimiento tipo Padrón fresco: (a) Fruto Entero y (b) Fruto Triturado. _______________________________________________________ -Página 37- Figura 23- TIC-Cromatograma de los compuestos volátiles del pimiento tipo Padrón: (a) Fruto Fresco Triturado y (b) Fruto Liofilizado. _______________________________________________________ -Página 38- TABLA VIII.- Relación de los compuestos volátiles identifcados en el pimiento tipo Padrón fresco (F), triturado (T), congelado, con y sin vacío (V y N, respectivamente), y liofilizado (L). Nº rt COMPUESTO VOLÁTIL FTVNLTIPO (*) Nº ENTRADA WILEY 11.359 Ciclobutanol + + 1 118760 21.459 1-Propene +10 59 31.609 1-3, Butadiene +10 118317 41.717 Etanol +1 94 51.901 1- Pentene + + + + 10 350 61.926 (Z) 2-Pentene +10 351 71.934 Pentano + + + + 10 118774 82.009 Isopreno + + + + + 10 118589 92.126 (E) 1,3-Pentadiene + + 10 118584 10 2.243 1,3-Ciclopentadiene +10 259 11 2.626 1-Hexene +10 119201 12 2.686 3-Metil-2-heptanol +1 7458 13 2.712 Hexano + + + + + 10 1018 14 2.912 Furán-2-Metil + + + 8 663 15 2.968 1-Hexine + + 10 119077 16 3.043 1,3-Pentadiene, 3-Metil (E) + + 10 683 17 3.043 2,4-Hexadiene +10 678 18 3.360 2-Hexen-4-ine (Z) +10 600 19 3.418 Butanal,3-metil=Isovaleraldehido +2 119356 20 3.643 Benceno + + + + + 10 119006 21 3.810 1-Penten-3-ol + + + 1 974 22 4.094 3-Pentanona +3 119370 23 4.110 Ciclopentanol + + + 1 119406 24 4.196 Heptano + + + 10 120425 25 4.253 Furán-2-etil + + 8 1503 26 4.378 1,4-Dioxano + + + + 8 119546 27 4.477 Ciclohexanona +3 120065 28 4.854 Metil ciclohexano +10 120140 29 4.861 1-Nonanol + + + + + 1 125281 30 5.146 1-H-Pirrol, 1-metil + + + + + 9 119054 31 5.346 Disulfuro de Dimetilo + + + 11 119805 32 5.653 1-Pentanol + + 1 1169 33 5.753 2-Penten-1-ol (Z) + + 1 975 34 5.897 Metil benceno + + + + 10 1321 35 6.346 Etil-2-Hexene-1 +10 3570 36 6.639 Hexanal + + + + + 2 120294 37 8.396 2-Hexenal (E) + + + + + 2 1687 38 8.483 3-Hexen-1-ol (Z) + + + + + 1 120364 39 8.866 1-Hexanol + + + + + 1 2364 40 9.150 o-Dimetil benceno + + + 8 2699 41 10.415 2,4-Hexadienal (E,E) +2 1487 42 10.790 Isocitronellen + + 5 9653 43 11.242 1,7-Octadien-2,6-Dimetil (E,Z) +10 9645 44 11.268 Tricicleno + + + 5 124417 45 11.640 α-Pineno + + + + 5 124388 46 11.807 1,6-Octadiene, 3,7-Dimetil +10 9644 47 12.266 1,4,6-Heptatriene, 2,3,6-trimetil +10 8984 48 12.599 Tolueno-p-etil + + 10 5057 49 12.957 Fenol + + 7 1389 50 13.119 p-Ment-2-ene-trans +5 9707 _______________________________________________________ -Página 39- 51 13.569 β-Pineno + + 5 9740 52 13.699 Furán-2-pentil +8 9517 53 13.966 Decano + + 10 125045 54 13.994 Benceno (1,3,3-trimetilnonil) + + 10 55891 55 14.458 Carane + + 5 124650 56 15.162 Mesitileno +10 5060 57 15.476 DL-Limoneno + + + + + 5 124342 58 15.550 1,8-Cineol + + 5 126660 59 15.987 Delta-3-Careno + + + + + 5 124411 60 16.850 Dihidro mircenol + + + 5 16451 61 17.631 Benzil alcohol, α,α dimetil +1 124244 62 17.897 Linalol + + + 5 126535 63 18.002 Undecano +10 126867 64 18.206 nonanal + + 2 125003 65 18.461 Acido Isobutirico, hexil ester + + 4 23227 66 19.282 2,4,6-Octatriene,2,6-dimetil (E,Z) +++10 9113 67 19.729 Ac. Butanoico,3-Hexenil ester (Z) + + 4 22325 68 20.373 trans-2-Tridecenal +2 34000 69 21.347 2-isobutil-3-metoxipirazina + + + 6 20259 70 22.002 nonano +10 123225 71 22.196 Salicilato de metilo + + + + 8 14253 (*) : (1) Alcohol, (2) Aldehido, (3) Cetona, (4) Ester, (5) Terpeno, (6) Pirazina, (7) Fenol, (8) Éter, (9) Pirrol, (10) Hidrocarburo y (11) Azufrado. (+): Presencia. ( ): No Detectado _______________________________________________________ -Página 40- TABLA IX.- ANOVA correspondiente a los “frutos enteros” (Frescos y congelados, con y sin vacío). MANOVA standari BY codigos(1 71) conserva(1 3) muestra(1 6) WITH fresco /NOPRINT PARAM(ESTIM) /METHOD=UNIQUE /ERROR WITHIN+RESIDUAL /ANALYSIS standari WITH fresco /DESIGN codigos conserva muestra codigos*conserva codigos*muestra conserva *muestra . * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e * * * * * * 1278 cases accepted. 852 cases rejected because of out-of-range factor values. 0 cases rejected because of missing data. 1278 non-empty cells. 1 design will be processed. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e -- design 1 * * Order of Variables for Analysis Variates Covariates STANDARI 1 Dependent Variable 0 Covariates - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e -- design 1 * * Tests of Significance for STANDARI using UNIQUE sums of squares Source of Variation SS DF MS F Sig of F WITHIN+RESIDUAL 2,4965E+14 700 3,566E+11 CODIGOS 3,0375E+14 70 4,339E+12 12,17 ,000 CONSERVA 6,0304E+12 2 3,015E+12 8,45 ,000 MUESTRA 4,9263E+12 5 9,853E+11 2,76 ,018 CODIGOS * CONSERVA 1,5942E+14 140 1,139E+12 3,19 ,000 CODIGOS * MUESTRA 1,9085E+14 350 5,453E+11 1,53 ,000 CONSERVA * MUESTRA 1,2602E+13 10 1,260E+12 3,53 ,000 (Model) 6,7758E+14 577 1,174E+12 3,29 ,000 (Total) 9,2723E+14 1277 7,261E+11 R-Squared = ,731 Adjusted R-Squared = ,509 _______________________________________________________ -Página 31- Tabla X.- ANOVA correspondiente a los “frutos triturados” (Frescos y Liofilizados). MANOVA standari BY codigos(1 71) conserva(5 6) /NOPRINT PARAM(ESTIM) /METHOD=UNIQUE /ERROR WITHIN+RESIDUAL /ANALYSIS standari /DESIGN codigos conserva codigos*conserva . * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e * * * * * * 852 cases accepted. 1278 cases rejected because of out-of-range factor values. 0 cases rejected because of missing data. 142 non-empty cells. 1 design will be processed. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e -- design 1 * * Order of Variables for Analysis Variates Covariates STANDARI 1 Dependent Variable 0 Covariates - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e -- design 1 * * Tests of Significance for STANDARI using UNIQUE sums of squares Source of Variation SS DF MS F Sig of F WITHIN+RESIDUAL 1,5448E+17 710 2,176E+14 CODIGOS 2,8862E+17 70 4,123E+15 18,95 ,000 CONSERVA 8,8363E+15 1 8,836E+15 40,61 ,000 CODIGOS * CONSERVA 2,4994E+17 70 3,571E+15 16,41 ,000 (Model) 5,4739E+17 141 3,882E+15 17,84 ,000 (Total) 7,0187E+17 851 8,248E+14 R-Squared = ,780 Adjusted R-Squared = ,736 _______________________________________________________ -Página 31- TABLA XI.- ANOVA correspondiente a los “frutos frescos” (Enteros y Triturados). MANOVA standari BY codigos(1 71) conserva(1 2) /NOPRINT PARAM(ESTIM) /METHOD=UNIQUE /ERROR WITHIN+RESIDUAL /ANALYSIS standari /DESIGN codigos conserva codigos*conserva . * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e * * * * * * 852 cases accepted. 1278 cases rejected because of out-of-range factor values. 0 cases rejected because of missing data. 142 non-empty cells. 1 design will be processed. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e -- design 1 * * Order of Variables for Analysis Variates Covariates STANDARI 1 Dependent Variable 0 Covariates - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - * * * * * * A n a l y s i s o f V a r i a n c e -- design 1 * * Tests of Significance for STANDARI using UNIQUE sums of squares Source of Variation SS DF MS F Sig of F WITHIN+RESIDUAL 1,3354E+17 710 1,881E+14 CODIGOS 2,6670E+17 70 3,810E+15 20,26 ,000 CONSERVA 1,0789E+16 1 1,079E+16 57,37 ,000 CODIGOS * CONSERVA 2,6689E+17 70 3,813E+15 20,27 ,000 (Model) 5,4438E+17 141 3,861E+15 20,53 ,000 (Total) 6,7791E+17 851 7,966E+14 R-Squared = ,803 Adjusted R-Squared = ,764 _______________________________________________________ -Página 32- Figura 24.- Perfil aromático del pimiento tipo Padrón fresco (a) y congelado, con y sin vacío (b y c, respectivamente). _______________________________________________________ -Página 33- Figura 25.- “Perfil aromático” del pimiento tipo Padrón fresco: (a) Fruto Entero y (b) Fruto triturado. _______________________________________________________ -Página 34- Figura 26.- “Perfil aromático” del pimiento tipo Padrón fresco triturado (a) y liofilizado (b). _______________________________________________________ -Página 41- 4.3.4.- EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO DE ÁCIDOS ORGÁNICOS Y VITAMINA C La evolución de la vitamina C en pimientos tipo Padrón congelados en bolsas selladas manualmente y a vacío, ha sido objeto de una publicación en la revista Journal of the Science of Food and Agriculture (Oruña-Concha y col., 1996 b), asi mismo, la influencia del proceso de liofilización sobre el contenido en vitamina C en este tipo de pimiento se recoge en la revista Deutsche lebensmittel- Rundschau (González-Castro y col., 1996 d). La evolución de la vitamina C en pimientos congelados, envasados con y sin sellado a vacío, y en pimientos liofilizados se recoge en la Fig. 32 (Tabla XII). Se observa, en los pimientos congelados, que al cabo del 1er mes se pierde la práctica totalidad de la vitamina C (97 %), tanto si se han sellado a vacío como si no. En cambio, en el caso de los pimientos liofilizados, ya se pierde prácticamente la totalidad de dicha vitamina C en el proceso de liofilización, debido probablemente a su oxidación catalizada por el enzima ascorbato oxidasa, que existe en casi todas las hortalizas. Para evaluar la duración de vida de los vegetales congelados y liofilizados pueden usarse como criterios pérdida del 50, 25 ó 10% de ácido ascórbico (Labuza, 1982). Adoptando el criterio menos estricto (50%), los pimientos crudos no son aceptables al mes de haber sido congelados, y los pimientos liofilizados tampoco lo son tras la liofilización. La evolución de los ácidos málico, oxálico, quínico, cítrico y fumárico en pimientos tipo Padrón congelados en bolsas selladas manualmente y a vacío ha sido objeto de una publicación en la revista Z Lebemns Unters For (González-Castro y col., 1996 b). Las Figs. 33, 34, 35, 36 y 37 (Tablas XIII, XIV, XV, XVI y XVII), recogen las modificaciones que experimentan los ácidos málico, oxálico, quínico, cítrico y fumárico en pimientos tipo Padrón congelados en bolsas selladas manualmente y a vacío, y liofilizados, respectivamente. Estas figuras indican, en el caso de la congelación, que el modo de sellado tiene poca influencia en el contenido en ácidos orgánicos. Se observó al cabo del 1er mes de haber sido congelados, descenso de los ácidos málico, oxálico y cítrico (37, 53, y 67 % respectivamente), aumento del ácido fumárico que quintuplica su valor, y 73% de aumento del ácido quínico convirtiéndose en el ácido orgánico mayoritario del pimiento en estado congelado. _______________________________________________________ -Página 42- Si se tiene en cuenta el periodo completo del estudio (12 meses), al margen de las oscilaciones observadas, puede admitirse que el contenido de cada uno de los ácidos orgánicos muestra una tendencia a mantenerse con respecto al valor que presentan al 1er mes de análisis. El proceso de liofilización, tal y como se recoge en el trabajo publicado en la revista Deutsche lebensmittel-Rundschau (González-Castro y col., 1996 d), supuso un descenso de los ácidos málico (20%) y oxálico (55%) mientras que el ácido cítrico aumentó un 80%, el ácido fumárico multiplicó por 6 su valor inicial y el ácido quínico, se vio incrementado en un 83%, convirtiéndose en el ácido orgánico más abundante en el estado liofilizado en el pimiento. Al margen de las fluctuaciones observadas, se puede decir que la tendencia general de todos los ácidos sugiere que hay pocos cambios durante el almacenaje con respecto al valor recién liofilizado. El “Test de Diferencia entre Pares” en este caso reveló que en ningún ácido orgánico existían diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre el empaquetado manual y a vacío, sin embargo al comparar la congelación y la liofilización se vio que en todos los ácidos exceptuando el ácido quínico existían diferencias significativas, obteniéndose mejores resultados en el caso de la congelación. La acidez total del pimiento tipo Padrón en estado fresco, expresada en mg de ácido málico/100 g de muestra fresca, fue de 674. Cuando se calculó la acidez total en las muestras congeladas se obtuvo un valor de 457. Por lo tanto, la acidez total disminuye un 32% con la congelación. Esta disminución en el contenido en ácidos orgánicos alifáticos en las verduras en estado congelado y liofilizado con respecto al estado fresco va a tener repercusión en las características organolépticas (aroma y sabor) del producto. El descenso que experimenta el ácido oxálico en verduras congeladas y liofilizadas sugiere que el consumo de estos (y posiblemente otros) vegetales conservados deberían ser recomendados para personas con ciertos problemas fisiológicos (en particular, hiperoxaluria) caracterizadas for la formación de cálculos renales compuestos mayoritariamente de oxalatos. _______________________________________________________ -Página 43- Tabla XII.- Evolución del contenido en VITAMINA C en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 041.7 41.7 0.47 10.48 0.30 0.44 20.49 0.47 0.69 30.48 0.44 0.57 50.14 0.40 0.49 70.26 0.28 0.34 90.31 0.27 0.69 12 0.53 0.60 0.74 _______________________________________________________ -Página 31- Tabla XIII.- Evolución del contenido en ÁCIDO MÁLICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 0 227 227 182 1 138 146 128 2 201 198 155 3 157 157 145 5 152 164 140 7 201 193 135 9 168 167 163 12 177 182 188 Tabla XIV.- Evolución del contenido en ÁCIDO OXÁLICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 0 226 226 101 1 112 107 79.3 2 126 140 109 3 116 116 96.3 5 107 108 78.5 7 129 128 104 9 120 146 102 12 122 114 94.0 _______________________________________________________ -Página 32- Tabla XV.- Evolución del contenido en ÁCIDO QUÍNICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 0 123 123 225 1 215 212 204 2 208 230 215 3 217 201 197 5 204 233 198 7 245 214 200 9 181 212 250 12 194 251 217 Tabla XVI.- Evolución del contenido en ÁCIDO CÍTRICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 063.1 63.1 113 118.4 23.0 39.0 224.5 24.9 76.5 336.1 29.7 116 534.8 34.0 133 731.2 35.7 27.3 921.5 15.4 14.8 12 14.3 29.1 77.8 _______________________________________________________ -Página 33- Tabla XVII.- Evolución del contenido en ÁCIDO FUMÁRICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados . (mg/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 00.37 0.37 2.33 12.38 1.91 1.28 22.05 1.78 1.19 31.97 1.47 1.18 51.84 2.26 1.12 75.51 4.68 2.29 91.55 1.92 1.41 12 2.05 1.92 1.20 4.3.5.- EVOLUCIÓN DEL CONTENIDO EN CARBOHIDRATOS (Azúcares solubles, Almidón, Pectinas y Fibra insoluble) El estudio de la evolución de los azúcares solubles, almidón, pectinas y fibra insoluble en pimientos tipo Padrón congelados en bolsas selladas manualmente y a vacío, ha sido objeto de una publicación en la revista Deutsche Lebensmittel-Rundschau (Oruña y col., 1996a). Las Figs. 38 y 39 (Tablas XVIII y XIX) recogen respectivamente la evolución del contenido en fructosa y glucosa en pimientos congelados en bolsas selladas manualmente y a vacío. En ambos casos el contenido de ambos azúcares no se vio modificado durante los 12 meses que duró el ensayo. Independientemente del tipo de empaquetado el almidón y la pectina no se vieron modificados durante el proceso de congelación (Figs. 40 y 41 respectivamnete) (Tablas XX y XXI). Por el contrario, el contenido en fibra insoluble (Fig. 42 y Tabla XXII), aunque inicialmente estable, aumentó hacia el 2º mes de congelación siendo este aumento más marcado en el caso del sellado a vacío (30%) que en el sellado manual (13%), manteniéndose estos valores prácticamente constantes durante los 12 meses de estudio. Al comparar los dos tipos de empaquetado, aplicando el “Test de Diferencia entre Pares”, sólo se observaron diferencias significativas (p ≤ 0.05) para la fibra insoluble, encontrándose valores más altos en el empaquetado a vacío. _______________________________________________________ -Página 34- El estudio de la influencia de la liofilización sobre todos estos carbohidratos se recoge en la revista Deutsche Lebensmittel-Rundschau (González-Castro y col., 1996 d). En el proceso de liofilización, los azúcares solubles (Figs. 41 y 42), la pectina (Fig. 44) y el almidón (Fig. 43) no se vieron afectados ni por el proceso en si, ni durante su posterior almacenamiento, aunque en el caso de los azúcares puede apreciarse un ligero aumento en las muestras liofilizadas que puede relacionarse con una mayor extractabilidad química de los azúcares cuando se parte de muestra seca. Sin embargo, aunque la fibra insoluble no se vio afectada por el proceso de liofilización, al 3º mes de almacenamiento experimentó un incremento del 27 %, que se mantuvo durante los 12 meses de análisis. Tabla XVIII.- Evolución del contenido en FRUCTOSA en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 00.582 0.582 0.700 10.670 0.632 0.780 20.580 0.629 0.770 30.635 0.636 0.740 50.638 0.645 0.680 70.666 0.618 0.690 90.667 0.575 0.650 12 0.633 0.607 0.720 _______________________________________________________ -Página 35- Tabla XIX.- Evolución del contenido en GLUCOSA en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 00.683 0.683 0.790 10.724 0.711 0.810 20.607 0.697 0.800 30.678 0.700 0.750 50.637 0.663 0.660 70.692 0.623 0.670 90.729 0.645 0.690 12 0.657 0.690 0.730 Tabla XX.- Evolución del contenido en ALMIDÓN en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 00.21 0.21 0.22 10.20 0.20 0.32 20.17 0.20 0.23 30.26 0.21 0.22 50.23 0.15 0.23 70.26 0.21 0.27 90.22 0.19 0.22 12 0.23 0.17 0.28 _______________________________________________________ -Página 36- Tabla XXI.- Evolución del contenido en PECTINAS en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 00.69 0.69 0.68 10.56 0.59 0.52 20.50 0.47 0.50 30.57 0.61 0.63 50.62 0.62 0.62 70.70 0.68 0.65 90.75 0.67 0.53 12 0.58 0.60 0.71 _______________________________________________________ -Página 37- Tabla XXII.- Evolución del contenido en FIBRA INSOLUBLE en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC y en pimientos liofilizados. (g/100g m.f.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 02.58 2.58 2.36 12.42 2.37 2.56 22.94 3.39 2.23 32.92 3.41 3.28 52.73 3.36 2.74 73.03 3.51 2.73 93.15 2.98 2.79 12 2.97 3.49 2.86 _______________________________________________________ -Página 33- Tabla XXVI.- Evolución del contenido en ÁCIDO OLEICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 010.8 10.8 10.8 18.22 7.69 9.55 28.61 7.46 13.0 310.1 8.92 13.7 58.31 7.98 13.2 713.3 12.4 16.1 99.14 10.4 10.7 12 8.60 9.60 10.2 Tabla XXVII.- Evolución del contenido en ÁCIDO LINOLEICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 0 385 385 385 1 341 331 382 2 273 260 256 3 338 347 268 5 307 309 273 7 309 343 246 9 299 325 242 12 286 291 257 _______________________________________________________ -Página 34- Tabla XXVIII.- Evolución del contenido en ÁCIDO LINOLÉNICO en pimientos envasados manualmente y a vacío, congelados a -22ºC, y en pimientos liofilizados. (mg/100g m.s.) Tiempo (meses) Pimientos congelados envasados sin vacío Pimientos congelados envasados con vacío Pimientos Liofilizados 0 244 244 244 1 219 205 227 2 159 157 94.7 3 186 209 95.0 5 178 178 88.4 7 142 182 109 9 187 168 114 12 185 191 107 5. CONCLUSIONES _______________________________________________________ -Página 31- 1.- SOBRE LOS MÉTODOS PUESTOS A PUNTO 1) Se propone un método de HPLC con detector UV-VIS para la determinación de la capsaicina y dehidrocapsaicina. Tras realizar una extracción a reflujo con acetona, la separación de dichos capsaicinoides se realizará utilizando una columna C8 como fase estacionaria y una mezcla de metanol:agua (65:35) como fase móvil, a un flujo de 1ml/min. La detección se llevó a cabo en un detector UV-VIS a 280nm. Las precisiones del método (RSD) fueron de 2.33 y 1.02 para la capsaicina y dehidrocapsaicina, respectivamente. En el estudio de la recuperación se obtuvo un valor de 97.4%, siendo el límite de detección para la capsaicina de 0.89 µg/mL y de 0.57 µg/mL para la dehidrocapsaicina. 2) Se propone un método de cromatografía de gases con detector de masas para la elaboración del perfil aromático del pimiento tipo Padrón. Después de su extracción en un sistema de purga térmica mediante N2, los compuestos volátiles quedan atrapados en los cartuchos de adsorción y a continuación se someten a una desorción térmica guiada por microondas. La separación se llevará a cabo en una columna DB-5, utilizando nitrógeno como gas portador a un flujo de 2.43 ml/min. 3) Se propone un método de HPLC para la determinación de los ácidos orgánicos (oxálico, quínico, málico, cítrico y fumárico) y de la vitamina C. La extracción se realiza con ácido metafosfórico y la separación tiene lugar en una columna C18 a un flujo de 0.5 mL/min. La detección es en la región del ultravioleta: 215 nm para los ácidos quínico, málico, cítrico y fumárico, y 245 nm para el ácido oxálico y la vitamina C. Las precisiones del método (RSD) estuvieron en el rango de 1.70- 3.93. 2.- CON RELACIÓN A LA COMPOSICIÓN QUÍMICA Después del agua, la fibra insoluble fue el componente mayoritario de los pimientos tipo Padrón (2.2 g/100g de muestra fresca). Respecto a los azúcares solubles, el contenido en glucosa fue superior a la fructosa, no detectándose presencia alguna de sacarosa. El ácido orgánico mayoritario fue el ácido málico (208 mg/100g de muestra fresca), encontrándose la vitamina C en muy pequeña cantidad (24 mg/100g de muestra fresca). Finalmente, la clorofila a (7.9 mg/100g de muestra fresca) predominó sobre el resto de los pigmentos responsables del color en esta especie del género capsicum. _______________________________________________________ -Página 32- 3.- CON RESPECTO A LOS MÉTODOS DE CONSERVACIÓN 1) La evolución de las clorofilas y de los carotenoides en pimientos tipo Padrón congelados, envasados con y sin sellado a vacío, fue la de mantenerse con respecto a su valor inicial durante los 12 meses que duró el estudio. En cambio, el proceso de liofilización supuso un descenso de todos ellos, descenso que se vio acentuado en el 1er mes de almacenamiento para la clorofila a y la luteína en un 80 y 26% respectivamente, mientras que el β-caroteno acusó una disminución del 62% en su 2º mes de almacenamiento. 2) En la elaboración del perfil aromático del pimiento de Padrón, el número de compuestos volátiles identificados es muy elevado, los cuales difieren según sea el tratamiento previo de la muestra (entera o triturada) asi como el tratamiento de conservación al que se someta (congelación, con y sin vacío, y liofilización). Analizados los resultados obtenidos puede concluirse que en principio sólo puede hablarse de un “perfil aromático característico” para las muestras analizadas en fresco, ya sean enteras o trituradas, y para las muestras liofilizadas, si bien en las muestras congeladas, independientemente del tipo de envasado, dicho perfil es bastante heterogéneo. 3) Durante los meses de máximo consumo de los pimientos tipo Padrón (Julio- Septiembre) no se detectaron niveles apreciables de capsaicinoides. Sin embargo, durante el mes de Octubre, coincidiendo con la madurez del fruto, se encuentran valores de 56 y 69 mg/Kg de muestra fresca para la capsaicina y dehidrocapsaicina respectivamente. 4) Los procesos de congelación, con y sin sellado a vacío, asi como la liofilización supusieron para la vitamina C una pérdida total de la misma, siendo más incipiente en la liofilización. Para el resto de los ácidos, un mes después de haber sido congelados e independientemente del tipo de sellado, se aprecia un descenso del 37, 53 y 67% para los ácidos málico, oxálico y cítrico, respectivamente, mientras que el ácido quínico experimenta un aumento del 73% y el ácido fumárico quintuplica su valor. La liofilización supuso, como hecho a destacar, un aumento importante en el contenido en ácido cítrico (80%) influyendo en el resto de los ácidos de forma similar a como lo hizo la congelación. Estos valores tenderán a mantenerse durante los 12 meses de estudio. 5) Los azúcares solubles encontrados en el pimiento tipo Padrón (fructosa y glucosa), asi como el almidón y la pectina, no sufrieron modificación alguna en los _______________________________________________________ -Página 33- procesos de congelación, con y sin sellado a vacío, y liofilización a los que fueron sometidos. La fibra, en cambio, experimentó un aumento hacia el 2º mes de congelación, siendo éste más acusado con el sellado a vacío (30%), y muy similar al detectado al 3er mes de haberse liofilizado (27%), valores estos que permanecerán prácticamente constantes hasta el final del estudio. 6) Con la liofilización, los ácidos grasos saturados (palmítico, esteárico y araquídico) y monoinsaturados (oleico), presentes en el pimiento tipo Padrón, prácticamente se mantuvieron estables a lo largo del estudio, si bien descendieron considerablemente al 1er mes de haber sido congelados, presentando en este caso una tendencia a mantenerse con respecto a éste valor. Por su parte, el contenido en ácidos grasos poliinsaturados (linoleico y linolénico), disminuye al 1er mes con la congelación y más acusadamente al 2º mes con la liofilización, a partir de los cuales mostrarán una tendencia a mantenerse durante los meses de estudio. 6. 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