Contribución a la mejora del tratamiento biológico de aguas residuales de la industria de curtidos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Ingeniería Química Contribución a la mejora del tratamiento biológico de aguas residuales de la industria de curtidos. Memoria presentada por: Priscila Artiga Acuña Para optar al grado de Doctor por la Universidad de Santiago de Compostela Santiago de Compostela, junio de 2005 Serie: Tesis Doctorales. Grupo de Ingeniería Ambiental y Bioprocesos - USC Foto de portada: Saltos del Petrohue.Los Lagos.CHILE Reservados todos los derechos. Está prohibido, bajo sanciones penales y el resarcimiento civil previsto en las leyes, reproducir, registrar o transmitir esta publicación, íntegra o parcialmente por cualquier sistema de recuperación y por cualquier medio, sea mecánico, electrónico, magnético, electroóptico, por fotocopiaoporcualquierotro,sinlaautorizaciónpreviaporescritodelautor. ©Priscila Artiga Acuña, 2005 Departamento de Ingeniería Química Universidade de Santiago de Compostela Imprime: Lápices4 Av. da Coruña 4 Santiago de Compostela A Coruña - SPAIN Depósito legal: C-1555-05 ISBN: 84-609-6311-X Impreso en España Título: Contribución a la mejora del tratamiento biológico de aguas residuales de la industria de curtidos UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Departamento de Ingeniería Química Ramón J. Méndez Pampín, Catedrático de Ingeniería Química y Juan Manuel Garrido Fernández, Profesor contratado de Ingeniería Química, ambos de la Universidad de Santiago de Compostela, Informan: Que la presente memoria titulada “Contribución a la mejora del tratamiento biológico de aguas residuales de la industria de curtidos” presentada por Priscila M. Artiga Acuña para optar al grado de Doctor, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que conste, firman en Santiago de Compostela, junio de 2005 Fdo. Ramón Méndez P. Fdo. Juan M. Garrido F. Esta memoria fue presentada el 3 de junio de 2005 en la Escola Técnica Superior de Enxeñería (ETSE) de la Universidad de Santiago de Compostela, ante un tribunal constituido por los doctores: Sebastián Delgado Díaz, del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de La Laguna. Francesca Malpei, del Departamento de Hydraulic, Environmental, Transportation and Surveying del Politécnico de Milano, Italia. Rosario Oliveira, del Departamento de Engenharia Biológica de la Universidade do Minho, Braga, Portugal. Manuel Soto Castiñeiras, del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de A Coruña. Francisco Omil Prieto, del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Santiago de Compostela. Recibió la calificación Sobresaliente Cum Laude, y el reconocimiento como “Doctorado Europeo” dentro del programa de Doctorado “Ingeniería Química y Ambiental” (2149-03-1) que tiene concedida la Mención del Calidad por el Ministerio de Educación. AGRADECIMIENTOS En estas líneas quiero expresar mis agradecimientos a todos los profesores que forman parte de este grupo de investigación y que colaboraron de una u otra forma en la realización de esta tesis doctoral, en especial a Ramón Méndez y Juan M. Lema. A la Universidad de la Frontera-Temuco (Chile) que por medio del profesor Cristian Bornhardt me ha dado la posibilidad de disfrutar de una beca de la red Alfa BI-EURAM. A la Universidad de Santiago de Compostela (España) por financiar una parte de esta investigación y a los Ministerios Español e Italiano por financiar la estancia de investigación en el Politécnico di Milano-Italia a través de la Acción Integrada Ref. (HI2002-0138). A Maribel Reyero, por la disponibilidad para proporcionarme la alimentación para mis reactores y cualquier ayuda que necesitara. Un ringraziamento speciale a Elena Ficara per la disponibilità dimostrata nel corso della ricerca en Italia. A ti Francesca, per la grande sensibilitá dimostrata ne mio confronti, il mio piú sincero GRAZIE . Un ricordo speciale alla memoria del Prof. Alberto Rozzi. No puedo dejar de hacer una mención especial a mis directores de tesis Ramón Méndez Pampín y Juan M. Garrido Fernández. A Moncho Pampín, por el apoyo en esta investigación y por esa gran calidad humana reflejada en su preocupación en aquello momentos no tan fáciles. A Juan, polo apoio científico, pola súa amistade e por escoitar os meus agobios, sólo decirles misión cumplida ... A mis compañeros del grupo de investigación: de la Facultad de Química, del IIT y de la ETSE (disculpad por no nombrar a cada uno de vosotros, pero en estos años han sido muchos con los que he compartido y cada uno ha sido de una u otra forma especial para mi ... y no quisiera olvidar a nadie), sólo agradecerles el buen ambiente de trabajo que me habéis brindado, los maravillosos momentos compartidos durante estos años y la paciencia por soportar en algunos momentos los olores de mis aguas. En especial quiero agradecer a Vinka por la ayuda prestada en mis comienzos en el laboratorio. Así mismo, a José Manuel Loureiro por cargar tantas veces con mis bidones con agua y a Belén Arrojo por recordarse de mis caprichitos de Italia y por su especial compañerismo. A Mar Orge, por esas gratas horas de comida y a Rosa Arcos por los agradables momentos compartidos en la Facultad. A Maribel y Xurxo por vuestra amistad. A Marga y Pedro por el ánimo y ayuda que me han brindado en este último tiempo ... a Pedrito y Eva por ese cariño y dulzura entregada que alegraron muchas veces los primeros minutos de tantas mañanas. A Anuska, por los kilómetros caminados y los pendientes, por todas aquellas veces en las que sus comentarios hicieron que todo trabajo quedara mejor. A José Luis, pola súa grande disposición para votarme unha man, polos consellos no traballo e por esas xornadas de analise no Plaza. A mis amigas, Ana Maceiras y Ana Costa, por todos estos años de amistad, por disfrutar de mis logros y por todo el cariño brindado. A Moncho Blanco, agradecer todas aquellos detalles que has tenido con esta “ chilenita”. A mis “viejas amigas” : Ana Julia, Waleska y en especial a ti Ernita por continuar cultivando esa amistad, aunque a muchos kilómetros de distancia. A los míos, aunque ellos ya lo saben ... A papá por el infinito apoyo en mis decisiones, aunque se lo difícil que te resulta tenerme lejos. A Natalia por escuchar mis penas y alegrías. A mis tíos Lola y Miguel por el cariño y fuerza que me han entregado y a mi querido Beni por confiar en mi en todo momento y por el infinito apoyo y amor entregado que ha hecho este caminar más feliz. “No hay proyectos de envergadura que sean de una sola persona” R.M. i-1 ÍNDICE Resumo Resumen Abstract R-1 R-3 A-1 0. Objetivos 0-1 1. Introducción 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.3.1. 1.1.3.2. 1.1.3.3. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4. 1.3. Resumen Aspectos ambientales de la industria de curtidos Situación actual de la industria de curtidos Caracterización de las aguas residuales Tecnologías convencionales para el tratamiento de las aguas residuales de curtiembres Tratamientos físico-químicos Tratamientos biológicos Nuevas Tecnologías: biorreactores de membrana Métodos empleados en la caracterización de la actividad microbiana de la biomasa Métodos químicos Métodos calorimétricos Métodos respirométricos Métodos de titulación Referencias 1-1 1-2 1-2 1-6 1-9 1-10 1-14 1-22 1-27 1-27 1-28 1-32 1-35 1-42 2. Determinación de actividades amonio oxidantes mediante un sistema de titulación a pH constante 2.1. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.2.1. 2.2.2.2. 2.2.2.3. 2.2.3. 2.2.3.1. 2.2.3.2. 2.2.3.3. Resumen Introducción Materiales y métodos Equipo empleado (pH-stat) y procedimiento utilizado Ensayos realizados Determinación de actividades amonio oxidantes de biomasa en suspensión Ensayos de inhibición sobre biomasa en suspensión, ejercicio de intercalibración Ensayos de inhibición sobre biopelículas Cálculo de las actividades Cálculo de la actividad amonio oxidante Cálculo del porcentaje de inhibición Estimación de la concentración inhibitorio al 50% (IC 50 ) 2-1 2-2 2-4 2-4 2-6 2-6 2-7 2-8 2-9 2-9 2-9 2-10 Resumen R-4 nitrificación y además realizar ensayos en condiciones anóxicas. Los valores de Ks de 0,34-0,68 mg N-NH 4+ /L obtenidos para la biomasa amonio oxidante y 0,23-0,40 mg N-NO 2- /L para la nitrito oxidante indican una buena afinidad por el sustrato, a diferencia de la biomasa proveniente del reactor SHARON para la que se obtuvo un Ks de 15,4-17,7 mg N-NH 4+ //L. Para las muestras de biomasa desnitrificante autótrofa se obtuvo una actividad de 51,04 ± 9,24 mg N-NO 3- /(g SSV·h), siendo las constantes de afinidad para cada sustrato 1,30 ± 0,14 mg N- NO 3- /L y 32,4 ± 3,04 mg S-S 2 O 32- /L. Respecto a los resultados de inhibición para las etapas amonio y nitrito oxidante, se obtuvo un IC 50 de 4,46 g sales de cromo/L para las bacterias amonio oxidante y de 7,45 g sales de cromo/L para las bacterias nitrito oxidante. Para la mezcla de NaCl y Na 2 SO 4 se obtuvo un IC 50 de 0,011 y 0,029 mol de sales/L para las bacterias amonio y nitrito oxidante, respectivamente. Los resultados obtenidos en los experimentos realizados en MARTINA muestran una buena repetibilidad y precisión. El capítulo 4, esta centrado en la evaluación de diferentes alternativas de tratamiento biológico para las aguas residuales de la industria de curtidos a escala de laboratorio, con el objeto de contribuir en la mejora de la operación de la planta de tratamiento industrial. En una primera etapa se analizó la oxidación de materia orgánica y amonio en una unidad de lodos activos de 2 L. En una segunda etapa, a la unidad utilizada anteriormente se le acopló una unidad anóxica de 1 L, evaluándose la eliminación conjunta de materia orgánica y nitrógeno. Finalmente, en una tercera etapa, se evaluó una estrategia de operación alternando ciclos aerobios y anóxicos utilizando dos unidades de lodos activos semicontinuos similares a las de la primera etapa. Los principales resultados de la primera etapa indican que la eficacia de la nitrificación aumenta hasta un 95% al adicionar entre 0,7 y 1 g HCO 3- /L, obteniéndose concentraciones de amonio en el efluente inferiores a 10 mg N-NH 4+ /L, no variando ésta con la disminución del TRH. Se alcanzó un 83% de eliminación de materia orgánica y el lodo presentó buena sedimentabilidad. Los resultados de la segunda etapa, mostraron la necesidad de adición de una fuente externa de carbono para lograr una adecuada desnitrificación, ya que sin esta adición, se obtenía solo un 15% de desnitrificación, debido a la baja relación DQO/N que presentan estas aguas residuales. Para incrementar el porcentaje de desnitrificación se adicionó metanol como fuente de carbono. Se evaluaron relaciones DQO/N adicionadas a la alimentación (DQO A /N t ) de 1 y 3 g/g, alcanzándose porcentajes de desnitrificación del 30 y 50%, respectivamente y además una eliminación de materia orgánica del 85%. En la tercera etapa, se evaluó el efecto de la adición de diferentes fuentes de carbono suplementarias adicionada durante el ciclo anóxico. Se emplearon como fuente de carbono metanol y agua residual de la corriente de ribera con o sin sulfuros a relaciones DQO A /N t comprendidas entre 1 y 7 g/g. Los mejores resultados se obtuvieron tanto con metanol como con agua residual de la corriente de ribera desprovista Resumen R-5 de sulfuros a relaciones DQO A /N t de 5 g/g, alcanzándose una eliminación de nitrógeno del 75% y concentraciones de 5-20 mg N-NO 3 /L y 10 mg N-NH 4+ /L en el efluente. En el capítulo 5, se indican los resultados a escala de laboratorio de la operación de un biorreactor de membrana con módulos de filtración de fibra hueca (Zenon, ZW-1) acoplada externamente a un reactor híbrido de lecho circulante (RLC) con biomasa en suspensión y biopelícula. El sistema se operó en dos etapas, que se diferencian por el TRS de la biomasa en suspensión. En la primera etapa, el sistema no se purgó para favorecer el crecimiento e incrementar la concentración de biomasa, alcanzándose VCN y VCO de 1,2 kg N-NH 4+ /(m 3 ·d) y 4,5 kg DQO/(m 3 ·d), respectivamente. Al final de esta etapa, se obtuvo un 95% de eliminación de materia orgánica y un 80% de nitrificación. En la segunda etapa se modificó el TRS de la biomasa en suspensión entre 10 y 1 d, observándose que para TRS menores de 5 d el porcentaje de nitrificación disminuía, incrementándose la concentración de amonio en el efluente de 5 a 10 mg N-NH 4+ /L. La variación del TRS y el incremento de la VCO en el sistema apenas afectaron a la DQO del efluente, obteniéndose una eficacia de eliminación de materia orgánica en torno al 95% y una concentración de materia orgánica promedio en los efluentes de 50 mg DQO/L. Se alcanzó una capacidad de nitrificación de 1,6 kg N-NH 4+ /(m 3 ·d), debido a la presencia de las biopelículas y una capacidad de oxidación de materia orgánica de 3,5 kg DQO/(m 3 ·d) debido a la presencia la biomasa en suspensión, que se vio favorecida al disminuir el TRS. En el capítulo 6, se presentan los resultados obtenidos con un biorreactor de membrana a escala piloto (Zenon, ZW-10), tratando agua residual de vinazas y de la industria de curtidos. Se alcanzaron VCO de 2,2 kg DQO/(m 3 ·d) y 1,5 kg DQO/(m 3 ·d), respectivamente, obteniéndose porcentajes de eliminación de materia orgánica siempre muy elevados, 97% para las vinazas y un 86% para las aguas de curtidos, independientemente de la VCO aplicada. Se obtuvieron rendimientos aparentes de 0,14 g SSV/g DQO y 0,16 g SSV/g DQO empleando como alimentación aguas residuales de vinazas y de curtiembres, respectivamente. Los efluentes obtenidos fueron de excelente calidad, libres de sólidos y con una baja concentración de materia orgánica soluble, en torno a 50 mg DQO/L. El aumento de la concentración de biomasa afectó negativamente a la transferencia de oxígeno, sobre todo a concentraciones superiores 8 g SSV/L, siendo necesario incrementar el flujo de aire al aumentar la concentración microbiana. Se estudiaron además distintos protocolos de limpieza de membrana, siendo destacable que la realización de un lavado químico externo de la membrana permite lograr un 91% de recuperación de la permeabilidad de la membrana respecto al valor inicial de 207 L/(m 2 ·h·bar). Resumen R-6 Las diversas modificaciones en la estrategia de operación y en la configuración de los reactores permiten mejorar los rendimientos de eliminación de nitrógeno y materia orgánica de los sistemas de tratamiento biológico convencionales que tratan aguas residuales de curtiembres. La estrategia de operación en semicontinuo del sistema de lodos activos es la alternativa sugerida como modificación a la actual EDAR industrial, ya que ligeras variaciones en la operación del proceso permiten obtener elevadas eficacias de eliminación de nutrientes y el uso del agua residual de la corriente de ribera como fuente externa de carbono permite disminuir costes de operación. La utilización de tecnologías de membranas son una buena alternativa para tratar aguas residuales de curtiembres especialmente para aquellas industrias en las cuales se deba construir una planta de tratamiento. Aunque los costes de tratamiento del agua residual (~0,4 €/m 3 ) sean más elevados que un sistema convencional, el efluente obtenido presenta una excelente calidad en términos de sólidos y materia orgánica, pudiendo ser apto para su posible reutilización. Abstract A -1 ABSTRACT In this dissertation, different studies referred to the biological treatment of wastewaters from tanneries are presented. These are focussed fundamentally in three topics: 1) study of the microbial activity and toxicity by means of titration systems; 2) Alternatives for the improvement of the biological treatment with suspended biomass systems; and 3) A proposal for the application of new biological membrane bioreactors for the treatment of the industrial wastewaters. In Chapter 1, it is shown, in a first section, a general overview of the systems usually used to characterize the biomass in terms of maximum substrate consumption rate (V max ), saturation constant (Ks) and the inhibitory effect that might cause a specific compound on the activity of the biomass. In a second section, it is realised a description of the different physical-chemical and biological processes applied to the treatment of effluents generated in the process of tanning. Finally, in a third section, some of the main applications of advanced system for the treatment tannery wastewater are described. In Chapter 2, the results obtained by means of a titration system named ANITA are indicated. The principle of operation is based on the addition of a titration solution to maintain the pH of a biological system of treatment of wastewater to a value of optimal pH. The tests were focussed on the determination of the nitrifying activity and in the evaluation of the inhibitory effects of some compounds used in tanneries, either on suspended or biofilm biomass. Intercalibration tests of this method which others laboratories took part were realised in order to verify the reliability of the methodology applied in the inhibition tests. The results obtained by the 9 participant laboratories were compared, obtaining an IC 50 of 0.41±0.27 mg ATU/L, 4.97±1.76 mg Aniline/L and 11.83±6.23 mg Ag + /L. Besides, for the validation of method, the results obtained by the partners were compared with obtained by means of norm ISO 9509E of the Standard Methods. On the other hand, the effect of two compound used in the tannery industry, NaCl and quebracho extract, on the ammonium oxidizing activity of biofims was determined. Values of IC 50 for NaCl and quebracho extract of 10.2 g NaCl/L and and 8.5 g/L quebracho extract, respectively were obtained. In chapter 3, the tests of characterization of biomass by means of the determination of kinetic parameters of nitrifying biomass, ammonium oxidizing (SHARON) and autotrophic denitrification samples are presented. The tests were developed in a new titration system (MARTINA). This system has a pH probe and a oxygen probe, which it allows to determine the activity of each stage of the nitrification process. Besides with this system is possible to perform tests under anoxic conditions. Values of Ks of 0.34-0.68 mg NH 4+ -N/L and 0.23-0.40 mg NO 2- -N/L for ammonium oxidizing and nitrite oxidizing biomass, respectively were Abstract A -2 obtained. These values indicated a good affinity by the substrates, unlike of the biomass that comes from of the SHARON reactor that presented values of Ks of 15.4-17.7 mg NH 4+ -N/L. For the autotrophic denitrification samples, values of activity of 51.04 ± 9.24 mg NO 3- -N/(g VSS·h) and values of affinity constants for each substrate 1.30 ± 0.14 mg NO 3- -N/L and 32.4 ± 3.04 mg S 2 O 32- -S/L were obtained. With regard to the results of inhibition for the stages ammonium and nitrite oxidizing, values of IC 50 of 4.46 g chromium salts/L for the ammonium oxidizing biomass and 7.45 g chromium salts/L for nitrite oxidizing biomass, were obtained. For the mixture of NaCl and Na 2 SO 4 , values of IC 50 of 0.011 and 0.029 mol of salts/L for the ammonium and nitrite oxidizing biomass, respectively, were determined. The results obtained in the experiments using MARTINA system show good repeatability and precision. The objective of Chapter 4 is the evaluation of different alternatives for the biological treatment of wastewater from tanneries at laboratory scale. The main aim was to improve the operation of an industrial treatment plant. In a first stage, the organic matter and ammonium oxidation was analysed in an unit activated sludge of 2 L. In a second stage, to the unit previously used was coupled to an anoxic system of 1 L. Both, the organic matter and nitrogen removal were evaluated. Finally, in a third stage, the operational strategy alternating aerobic and anoxic cycles using two semicontinuous activated sludge units similar to those of the first stage were evaluated. The main results of the first stage indicated that the efficiency of the nitrification increase until a 95%, when a concentration of bicarbonate between 0.7 and 1 g/L is added. Ammonium concentrations in the effluent lower than 10 mg NH 4+ -N/L were obtained. The decrease of HTR did not affect the ammonium concentration in the effluent. 83% organic matter removal was achieved and a good sedimentability of sludge was observed. The results of the second stage shows the necessity of the addition of an external carbon source to obtain a good denitrification percentage, since without this addition only 15% of denitrification was obtained. This low denitrification percentage may be consequence of the low COD/N ratio that presented this kind of wastewater. In order to increase the percentage of denitrification, methanol was added as carbon source. Tests with COD/N ratios of 1 and 3 g/g added to feeding were assayed. 30 and 50% organic matter removal were achieved for COD A /N t of 1 and 3 g/g, respectively. 85% of organic matter removal was obtained. In the third stage, the effect of different additional carbon sources added during the anoxic cycle was evaluated. Methanol and wastewater from beamhouse stream with or without sulphides to rations COD A /N t between 1 and 7 g/g were used as carbon sources. The best results were obtained for the COD A /N t ratio of 5 g/g using methanol or wastewater from beamhouse stream without sulphides. 75% of nitrogen removal and concentrations in the effluent of 5-20 mg NO 3 -N/L y 10 mg NH 4+ -N/L were obtained. Abstract A -3 In chapter 5, the results at laboratory scale of the operation of a membrane biorreactor with hollow fibber filtration modules (Zenon, ZW-1) connected externally to a hybrid circulating bed reactor (CBR) with suspended biomass and biofilm are indicated. The operation of system has been divided in two stages, with a different SRT of the suspended biomass fraction. In the first stage, the system was not purged to promote the increase of the biomass concentration, NLR and OLR of 1.2 kg NH 4+ -N/(m 3 ·d) and 4.5 kg COD/(m 3 ·d) were obtained, respectively. At the end of this stage, 95% of organic matter removal and 80% of nitrification were obtained. In the second stage the SRT of the suspended biomass modified between 10 and 1 days. For SRT lower than 5 days the nitrification percentage decreased, the ammonium concentration in the effluent increase from 5 to 10 mg NH 4+ -N/L. The variation of the SRT and the increase of the OLR in the system hardly affected the COD content of effluent. Efficiency of organic matter removal about 95% and organic matter average concentrations of organic matter in the effluents of 50 mg COD/L were obtained. A nitrification capacity of 1.6 kg NH 4+ -N/(m 3 ·d), due to the presence of biofilms and organic matter oxidation capacity of 3.5 kg COD/(m 3 ·d) due to the presence of suspended biomass were achieved. The organic matter oxidation capacity was favoured when the SRT decrease. In chapter 6, the results obtained with a membrane biorreactor at pilot scale (Zenon, ZW-10), treating winery and tannery wastewater are presented. OLR of 2.2 kg COD/(m 3 ·d) and 1.5 kg COD/(m 3 ·d) were achieved using winery and tannery wastewaters, respectively. Organic matter removal percentages were always very high, 97% for winery wastewater and 86% for tannery wastewater. These percentages obtained did not depended of the OLR applied. Apparent biomass yield was estimated in 0.14 g VSS/g COD and 0.16 g VSS/g COD, for winery and tannery wastewater, respectively. Effluents presented often an excellent quality, free of solids and low organic matter concentrations, around 50 mg COD/L. The increase of the concentration biomass affected negatively the oxygen transference. Concentrations higher than 8 g VSS/L caused a drop of the oxygen capacity of the reactor, being necessary to increase the air flow when the microbial concentration increased. Different cleaning protocols for the membrane were studied, being notably the chemical external washing of the membrane. This washing allowed to recover 91% of the permeability of the membrane with regard to the initial value of 207 L/(m 2 ·h·bar). The different modifications in the operation strategy and the configuration of the reactors made feasible to improve the nitrogen and organic matter removal of the conventional systems used during the biological treatment of tannery wastewaters. The semicontinuous operation strategy of the activated sludge systems is the suggested alternative to the studied industrial WWTP. With this Abstract A -4 strategy small modifications of the operational process make feasible to obtain high efficiency of nutrient removal. Furthermore, the use of wastewater from beamhouse stream as carbon source may decrease the operational costs. The use of membrane technologies is also a good alternative for the tannery wastewater treatment, specially for factories that required to build the WWTP. Although the costs of wastewater treatment by membrane technologies (~0,4 €/m 3 ) is higher than those of conventional systems, the effluent obtained presented an excellent quality in terms of solid and organic matter, that could made feasible a possible reuse of the water. Objetivos 0-1 OBJETIVOS Los objetivos de la presente memoria de investigación se relacionan con el estudio de los fundamentos y aplicación de sistemas biológicos para el tratamiento de aguas residuales de curtidurías, dividiéndose dicha investigación en los tres tópicos siguientes: 1.- Estudio de la actividad y toxicidad microbiana mediante sistemas de titulación, 2.- Evaluación de alternativas de tratamiento biológico con sistemas de biomasa en suspensión y 3.- Uso de nuevos reactores de filtración de membranas para el tratamiento de estas aguas industriales. En el Capítulo 1, en la primera parte, se realiza una revisión del proceso de curtido y de las diferentes tecnologías aplicadas al tratamiento de los efluentes generados en este proceso. Posteriormente se revisan algunas de las principales aplicaciones de sistemas avanzados para el tratamiento de aguas residuales de curtidurías. En la segunda parte, se realiza una revisión de los sistemas más utilizados para determinar parámetros cinéticos como son la velocidad máxima de consumo de substrato (V max ) y constante de saturación (Ks) que caracterizan a la biomasa mediante el seguimiento de la concentración de sustrato o producto así como el efecto inhibitorio que puede causar un determinado compuesto sobre la biomasa. En el Capítulo 2, se presentan diversos ensayos que permitieron caracterizar la actividad de biomasas tanto en suspensión como en biopelícula, centrándose el estudio en la determinación de la actividad nitrificante. Para ello se evaluó el funcionamiento y fiabilidad de un nuevo sistema de determinación de la actividad microbiana, basada en el uso de un equipo de titulación de pH-stat (ANITA) (Figura 0.1). Figura 0.1: Fotografía del sistema de titulación pH-stat (ANITA). Objetivos 0-2 Los datos extraídos de este sistema de titulación proporcionan información sobre parámetros cinéticos y efectos inhibitorios de diversos compuestos. Se validó una nueva metodología para determinar el efecto inhibitorio de compuestos químicos sobre la biomasa desarrollada especialmente para ser aplicada en este sistema. Para ello, se realizaron diversos ensayos de intercalibración sobre biomasa nitrificante en suspensión empleando soluciones de aliltiourea, anilina y sulfato de plata, los resultados obtenidos se compararon entre los 9 laboratorios participantes. Se investigó además el efecto de algunos compuestos presentes en las aguas residuales de curtidurías (NaCl, extractos de quebracho, sales de cromo) sobre biopelículas. En el Capítulo 3, se presentan los resultados obtenidos al mejorar los sistemas de titulación de pH mediante la incorporación de una sonda adicional de oxígeno. Esto permite determinar parámetros cinéticos, como velocidad máxima de consumo de sustrato y constante media de saturación en diversos procesos biológicos que tienen lugar en serie (actividad amonio oxidante y nitrito oxidante), así como desnitrificante, usando el sistema de titulación pH-DO-stat llamado MARTINA (Figura 0.2). Figura 0.2: Fotografía del sistema de titulación pH-DO-stat (MARTINA). El capítulo 4, se ha centrado en el estudio de alternativas al proceso que en la actualidad se aplica en una industria local de curtidos, que consta de un reactor de lodos activos para el tratamiento biológico de las aguas y que aunque en general cumple criterios de vertido, presenta esporádicamente niveles altos de nitrógeno nítrico y amoniacal y sólidos en suspensión en el efluente. El sistema de tratamiento biológico más habitual utilizado para depurar las aguas de curtiembres es el de lodos activos. En la Figura 0.3 se muestra el diagrama de flujo actual del tratamiento a que son sometidas las diferentes corrientes generadas en el proceso de curtido. Objetivos 0-3 Figura 0.3: Diagrama de Flujo de la Planta de Aguas Residuales. Las aguas residuales generadas en el proceso de curtido, proceden de dos corrientes: una proveniente de la etapa de ribera y la otra corriente una mezcla de las etapas de curtición y recurtición. Ambas corrientes, en forma paralela, son sometidas a un pretratamiento en la que se hace pasar el agua a través de tamices con el objeto de retener sólidos de gran tamaño que podrían causar problemas en el proceso de depuración. Las aguas provenientes de la etapa de ribera van a un reactor donde mediante aireación se consigue la oxidación del sulfuro a sulfato, transcurriendo la reacción bajo la presencia de un catalizador a base de manganeso (óxido de manganeso). Posteriormente, se juntan las dos corrientes en un estanque de homogenización que está constantemente agitado mediante aireación, lográndose una reducción de materia orgánica y un licor de mezcla homogéneo para su posterior depuración. Mediante un tratamiento físicoquímico posterior se logra eliminar completamente del agua el cromo y parte de las materias coloidales y disueltas que precipitan. La siguiente etapa, corresponde al tratamiento biológico, reactor de lodos activos de mezcla completa, donde tiene lugar la oxidación de la materia orgánica y el amonio por medio de los microorganismos en presencia de oxígeno. Con objeto de mejorar el posible funcionamiento del reactor, se estudiaron en el laboratorio diversas alternativas: a) Mejora de la nitrificación (Figura 0.4), para su posible implantación industrial b) Incorporación de la etapa de desnitrificación (Figura 0.5) y Capítulo 1 1-4 se puede representar en cuatro etapas (Figura 1.3) que requieren un elevado consumo de agua, generando asimismo gases contaminados, efluentes líquidos y residuos sólidos, siendo las descargas líquidas las de mayor importancia. Las cuatro etapas de un proceso convencional de curtido son: ribera (remojo, apelambrado, desencalado y rendido), curtición (piquelado y curtido al cromo), recurtición y acabado (teñido, secado y acondicionamiento). En la etapa de ribera tiene lugar la limpieza y rehidratación de la piel conjuntamente con la eliminación de los pelos al ser tratada en un baño de sulfuro sódico en medio alcalino. Una vez finalizado el pelambre, éste es extraído del fulón y sometido a varios lavados. En función de las características del cuero se procederá a la separación de las orillas y el tejido celular. En la etapa de curtido se realiza el acondicionamiento de la piel eliminando el exceso de cal y sometiendo la piel a baños de sales de cromo en medio ácido para aumentar la solubilidad de estas sales y mejorar la penetración en la estructura celular, obteniéndose el cuero curtido o wet blue. El cuero en estado wet blue se introduce en un fulón donde tiene lugar un recurtido y el teñido. Curtición Recurtición Acabado 63 m 3 agua 442 kg productos químicos 58 m 3 efluente 696 kg residuos sólidos 1000 kg piel 500 kg cuero Ribera Figura 1.3: Balance de materia global representativo de un proceso de curtido en el cual se emplea como base de cálculo 1 t de piel salada y húmeda. (Konrad et al . 2002). Introducción 1-5 En el balance global mostrado en la Figura 1.3, se observa que a partir de una tonelada de piel salada y húmeda se obtiene como producto final del proceso sólo 500 Kg de cuero. El 50% restante corresponde a los residuos sólidos generados, dentro de los cuales se debe diferenciar entre los residuos sin curtir y los ya curtidos, de características diferentes, ya que, el contenido de cromo será diferente dependiendo de la etapa de la cual proceden los residuos (Raghava et al. 2002). Respecto a la cantidad de compuestos químicos utilizados, éstos son disueltos en el agua empleada en el proceso, generándose un efluente no sólo con un elevado contenido de carga orgánica, sino también de compuestos inorgánicos. Cada etapa del proceso va generando diferentes corrientes con distintos grados de contaminación. Estas se caracterizan por elevados contenidos de carga orgánica y compuestos inorgánicos como cromo, cloruro, amonio, sulfuro y sulfato, que dificultan su gestión y tratamiento (Tünay et al . 1995; Jochimsen y Jekel, 1997; Ates et al . 1997). Respecto a las emisiones gaseosas, las dos descargas potencialmente significativas son los materiales particulados de la etapa de acabado y el sulfuro de hidrógeno proveniente de las operaciones de pelambre. Los malos olores, como consecuencia de inadecuadas prácticas de limpieza, también afectan a la calidad del aire. Las emisiones de amoníaco y vapores solventes procedentes del desencalado y acabado crean otro problema de contaminación. Debido a la gran diversidad de las tenerías, dependiendo de la materia prima procesada, del proceso aplicado, de las sales curtientes empleadas y de las especificaciones del producto final, las características del agua residual serán diferentes y por tanto, el tratamiento a aplicar también. El agua residual de las curtiembres es uno de los mayores problemas en estas instalaciones. La tecnología utilizada en la depuración de sus aguas residuales ha evolucionado desde la utilización de tratamientos físico-químicos hasta la aplicación de nuevas tecnologías como puede ser el empleo de biorreactores de membranas. En los años 70 se comenzaron se construir depuradoras industriales en Italia, el país más importante en Europa en el sector de la piel. El procedimiento aplicado inicialmente era un tratamiento físico-químico del efluente global, mediante la dosificación de floculantes, previo ajuste del pH de la mezcla, con el que se lograba la eliminación de sólidos en suspensión y una importante reducción del contenido de materia orgánica, aunque se requerían elevadas dosis de cal y floculante (Cl 3 Fe o sales de aluminio) aumentando por tanto la conductividad del agua residual tratada y la cantidad de fango generado. Capítulo 1 1-6 En los años 80 se comenzó a aplicar el tratamiento oxidativo de los baños de pelambre separados para transformar los sulfuros en sulfatos y evitar así el desprendimiento de sulfídrico. A partir del año 1985 comienza a aplicarse el procedimiento de depuración biológica, con buenos resultados, un ejemplo de ello es la planta de Montebello en Arzignano, en la que se trataban las aguas de diversas tenerías que habían sido previamente desulfuradas (Vila, 2002). Una importante parte de la contaminación de las aguas de curtidos es eminentemente orgánica y biodegradable, las pieles son proteínas, queratinas, grasas, etc., la parte insoluble es la piel que se curte (el colágeno) y la parte que se solubiliza pasa a las aguas residuales en las diferentes fases del proceso. Parte de los procesos usados en la curtición utilizan compuestos de naturaleza orgánica (curtientes, sintéticos, grasa, colorantes) y el resto sales minerales (sal para conservación, sulfuros, sal de cromo), dependiendo de la concentración en las aguas residuales estos compuestos podrían tener un efecto inhibitorio en la actividad de la biomasa presente en el sistema biológico. Prácticamente en este momento la mayoría de las plantas de tratamiento tienen como base una depuración biológica con tratamientos previos de desulfuración y homogeneización y en algún caso un tratamiento terciario para una mayor eliminación de DQO y color debido a la presencia de algún colorante o producto curtiente de baja biodegradabilidad. 1.1.2.- Caracterización de las aguas residuales El proceso de curtido es una cadena de varios procesos en discontinuo, caracterizándose las aguas residuales generadas por un alto contenido de sustancias orgánicas: lo que se traduce en altas concentraciones de DQO y DBO 5 y alto contenido de nitrógeno, así como una adecuada concentración de sales inorgánicas como cromo, amonio, cloruro, sulfuros y sulfatos además de una alta concentración de sólidos en suspensión (Jochimsen et al. 1997). El contenido de aceites y grasas suele ser despreciable. En la práctica dependiendo de las características del producto deseado y del proceso aplicado, los efluentes presentan diversas concentraciones de los compuestos contaminantes. En la Tabla 1.1 se muestran valores de la concentración de diferentes parámetros de muestras de aguas residuales brutas que se comparan con las concentraciones obtenidas para muestras de agua residual que se sometieron a un proceso de recuperación de pelo, cromo y desulfuración. Se aprecia una considerable reducción del contenido de materia orgánica y sólidos en suspensión. Introducción 1-7 Tabla 1.1: Caracterización de la composición de efluentes globales de la industria de curtidos (Vila, 2002). Parámetro (mg/L) Efluentes generales Efluentes sometidos a recuperación de pelo, cromo y desulfuración DQO DBO NH 3 SS SST SSV NTK Cr 3+ S 2- SO 42- Cl - 7.000-8.000 4.000-4.500 200-250 3.500-4.000 - - - 200-300 200-250 1.800 5.000-6.000 5.000-5.500 3.000-3.500 <200 2.500-3.000 - - - 80-100 <2 1.800 5.000-6.000 Los requerimientos de calidad para la descarga del efluente harán necesario el estudio y la caracterización de las diferentes corrientes para la aplicación del tratamiento adecuado, ya que dependiendo de los compuestos presentes en las diferentes corrientes, algunos tratamientos se verán inhibidos o se obtendrá un mayor rendimiento, por ejemplo:  Las sales y la alta conductividad producida por las mismas, son difícilmente eliminables y dificultan, cuando están en exceso, el proceso biológico de degradación de la materia orgánica y el proceso de decantación.  Materia orgánica soluble , provienen de la misma piel y son la base de la DQO y la DBO biodegradable, pudiéndose alcanzar una reducción de un 99% con una buena depuración biológica.  Sulfuros , son eliminables mediante oxidación a sulfatos previa al tratamiento biológico.  Nitrógeno amoniacal y total , provienen de la misma piel o de los productos de amonio añadidos. La vía de eliminación puede ser la biológica, mediante los procesos de nitrificación y desnitrificación.  Cromo trivalente , proviene de los curtientes no fijados, estando presente generalmente en su forma insoluble, ya que precipita a valores de pH superiores a 5,5. Su presencia no afecta excesivamente al tratamiento biológico, pero su presencia en los lodos generados no permiten su uso en la agricultura por lo que se debe recuperar en lo posible y procurar fijarlo lo máximo posible en la piel. La concentración de los diversos compuestos contaminantes dependerá de la corriente evaluada. En términos de materia orgánica, la etapa de ribera es la que Capítulo 1 1-8 aporta la mayor concentración de DQO, ya que el aporte de materia orgánica de las operaciones de recurtido, tintura y engrase es pequeña. Las aguas residuales de la etapa de ribera también presentan un elevado contenido de sólidos, nitrógeno y compuestos de azufre (S 2- ) incrementándose la presencia de contaminantes con los sulfatos y el amonio proveniente de la corriente de la etapa de curtido. Las operaciones de piquelado y curtido, tienen una mayor influencia en la toxicidad del efluente ya que en ellas se generan metales pesados, principalmente Cr 3+ , empleados como agentes curtientes (Abdel-Shafy et al . 1995; Genschow et al . 1997). De acuerdo a los límites actuales establecidos en la legislación, el principal problema es aplicar una tecnología adecuada de manera que se logre una importante reducción de este parámetro en el efluente. La Tabla 1.2, resume en porcentaje los principales contaminantes presentes en las diferentes corrientes, aunque como el proceso de curtidos es discontinuo las características y la concentración de los compuestos presentes en el agua residual pueden variar en instalaciones distintas. Tabla 1.2: Rangos típicos de los parámetros más importantes en los efluentes de las diferentes corrientes del proceso de curtido (IUE/IULTCS, 2001). Los vertidos están expresados como toneladas de cuero de vacuno en bruto. Parámetros (Kg./t) Ribera Curtición Post-Curtición Acabado Total Volumen (m 3 /t) 20-25 1-3 3-8 1 24-37 DQO 120-160 10-20 15-40 10 145-230 DBO 5 40-60 3-7 5-15 4 48-86 SS 70-120 5-10 10-20 5 85-155 Cr 3+ - 2-5 1-2 - 3-7 S 2- 8-12 - - - 8-12 Nitrógeno 10-20 - 1-2 - 11-22 Cloruros 120-200 50-60 5-10 - 175-270 Sulfatos 5-20 30-50 10-40 - 45-110 Introducción 1-9 1.1.3.- Tecnologías convencionales para el tratamiento de las aguas residuales de curtiembres. Idealmente, en el proceso de transformación de la piel en cuero, las aguas residuales generadas podrían estar separadas en distintas corrientes agrupadas de acuerdo a determinadas características, facilitando el tratamiento y la reutilización de éstas, aunque esto no es lo más frecuente debido a que implica un coste adicional de gestión. Si en la industria no se separan las diferentes corrientes del agua residual, se deben considerar los siguientes puntos de interés al decidir un tratamiento (Wiegant et al . 1999).  Alto contenido de cromo (principalmente Cr 3+ , pero en algunos casos Cr 6+ ), reduciendo la posibilidad de reutilización del lodo y del efluente en la agricultura  Alto contenido de contaminantes orgánicos, necesitándose una etapa de pre o post tratamiento.  Alto contenido de sulfato, requiriéndose una dilución del agua residual para aplicar un tratamiento anaerobio aunque el rendimiento de biogás disminuye.  Alto contenido de sólidos, que llevará a una alta producción de lodos. Considerando las dificultades mencionadas anteriormente, el tratamiento de las aguas residuales especialmente si se pretende su reutilización, debería considerar los siguientes aspectos:  Utilización del cromo recuperado, reduciendo las salidas de cromo en un 95- 100%, generándose así un lodo que podría ser usado como fertilizante.  Aplicación de un pretratamiento físico-químico que reduzca el contenido de sólidos en suspensión en el agua residual, facilitando el mantenimiento de las conducciones y reduciendo el volumen del sistema de tratamiento biológico.  Dilución del agua residual, lo que disminuye la concentración de sulfato, alcanzándose concentraciones que permitan su tratamiento anaerobio.  El tratamiento anaerobio de un agua residual concentrada usará menos equipamiento y energía que un tratamiento aerobio como un sistema de lodos activos.  Un post-tratamiento en un sistema de aireación simple permitirá obtener un efluente que cumpla con los niveles de concentración requeridos de los parámetros DQO, DBO 5 , SST. Por estas razones, para el tratamiento de éste tipo de aguas residuales se aplican diferentes tratamientos, principalmente físico-químico y biológicos. En muchos casos una combinación de ambos permite mejorar la calidad del Capítulo 1 1-10 efluente, alcanzándose eliminaciones eficientes de la mayoría de los contaminantes. 1.1.3.1.- Tratamientos físico-químicos. Debido a que las aguas residuales generadas son muy complejas, se requiere un fuerte pretratamiento antes de ser sometidas a un tratamiento biológico. Dentro de los tratamientos físico-químico, las operaciones iniciales más frecuentes son: desbastes de gruesos y finos, eliminación de arenas y grasas, homogeneización y sedimentación de sólidos en suspensión, aunque generalmente para este tipo de aguas residuales ni las arenas ni las grasas constituyen un aporte importante. Desbaste: Es la operación de separación física mediante rejas o tamices de materias sólidas arrastradas o en suspensión. El tamaño de estas materias sólidas oscila entre pequeñas y grandes partículas. Eliminación de sulfuros: Suelen eliminarse mediante la oxidación con aire, aunque también se pueden utilizar oxidantes más enérgicos. La reacción mayoritaria que se produce a pH 11 y con suficiente aireación es: 2Na 2 S + 2O 2 + H 2 O Na 2 S 2 O 3 + 2NaOH (Ecuación 1.1) Solo en el caso en que no exista déficit de oxígeno, la oxidación conduce a mezclas de tiosulfato y sulfito (dos tercios y un tercio respectivamente).Como la reacción avanza muy lentamente es recomendable utilizar algún catalizador siendo uno de los más eficaces el óxido de manganeso (Eye y Clement, 1972). Este proceso permite alcanzar fácilmente concentraciones de sulfuro inferiores a 1 mg/L y no produce residuos sólidos que luego deberían ser eliminados, lo cual es la ventaja del sistema. En plantas modernas, generalmente, se incorpora esta alternativa de tratamiento, pero solamente en aquellos casos de descarga indirecta. Aparte del aire, la oxidación de los sulfuros puede hacerse con otros agentes oxidantes, como el O 2 , HClO, Cl 2 , H 2 O 2 y O 3 . El oxígeno actúa según el mismo mecanismo que el aire aunque es significativamente más caro, pudiéndose justificar su uso cuando la aireación es insuficiente. El hipoclorito o el cloro gas tienen el inconveniente de reaccionar con otras sustancias presentes en el efluente que pueden empeoran la calidad del agua. El peróxido de hidrógeno tiene muchas ventajas. A pH neutro o ácido, predomina la oxidación a azufre, mientras que a pH alcalinos (superiores a 8) como se acostumbra a tener, se forman sulfatos, siendo su limitación el coste, por lo que si se utiliza H 2 O 2 se recomienda hacerlo después de la oxidación catalítica aire/Mn 2+ para eliminar las Introducción 1-11 concentraciones remanentes de sulfuro, cuando éstos alcanzan los 2-10 mg/L. Un efecto análogo al del peróxido de hidrógeno, se obtiene con el uso del ozono. Los sulfuros y especialmente el sulfuro de hidrógeno, son tóxicos para muchas especies microbianas, y pueden causar problemas en la biomasa en un sistema biológico, aunque se ha demostrado que una concentración de sulfuros de 50 mg/L (incluso 100 mg/L) no inhiben los procesos de la oxidación biológica de materia orgánica. Este punto es muy importante ya que la oxidación total con aire puede exigir tiempos muy largos, en cambio resulta práctico someter las aguas de calero a una desulfuración catalítica con aire y después acabar con un tratamiento biológico aerobio que oxide el sulfuro residual y los tiosulfatos hasta sulfatos. De esta manera el contenido de la materia orgánica para esta corriente de agua residual es muy bajo, debiendo evitar las zonas anaerobias en el tratamiento de lodos activos que podrían volver a reducir los sulfatos (Ylla y May 2000). Para conseguir una adecuada desulfuración de las aguas residuales generadas en el proceso de curtidos se suelen aplicar también los siguientes procedimientos:  Llevar los baños de pelambre a un depósito de homogeneización provisto de agitadores sumergidos y difusores de aire donde tendrá lugar la oxidación de sulfuro a sulfato.  Recuperación del H 2 S mediante acidificación a pH 3-4 en atmósfera cerrada. Las proteínas precipitan y se desprende H 2 S (gas) que se fija haciéndolo pasar por una solución de NaOH en una torre de absorción.  Tratamiento con los gases de combustión de las calderas, el que consiste en hacer borbotear los gases de combustión a través de los baños alcalinos que contienen sulfuro. El CO 2 del gas neutraliza la alcalinidad y el SO 2 proveniente del azufre del combustible oxida los sulfuros.  Precipitación del S 2- con Fe +3 ; proceso físico-químico bastante eficaz, pero presenta el inconveniente de generar un precipitado negro de sulfuro de hierro. Homogeneización: Operación de mezclado del residuo líquido para obtener una mezcla uniforme, ya que el caudal y la concentración de contaminantes en los vertidos son variables, lo que podría afectar la operación de la planta de tratamiento biológica. Por tanto, para un buen funcionamiento es necesario un caudal de trabajo constante y una composición química regular. Esto se consigue mediante un depósito de homogeneización instalado después del desbaste y antes de la depuración biológica. Decantación primaria: La decantación es la opción tradicional para separar sólidos de una fase líquida. En los decantadores se hace fluir el líquido a una velocidad inferior a la de sedimentación de las partículas que interesa eliminar, Capítulo 1 1-12 las cuales se depositan en forma de lodos. A través de éste tipo de decantación es posible disminuir las concentraciones de DBO 5 , DQO y materias en suspensión, sin necesidad de la adición de productos químicos. Song et al . (2000) alcanzaron porcentajes de eliminación de un 75 y 76,1% de sólidos en suspensión; 37,7 y 41,5% de DQO; 25,9 y 30,3% de DBO y 71,2 y 83,2% de cromo en ensayos realizados en una columna de sedimentación para tiempos de 1 y 3 h. Separación por flotación: Constituye otra alternativa para la eliminación de sólidos en suspensión. En vez de sedimentarlos, se les hace ascender hasta la superficie. Se presuriza agua saturándola con aire disuelto para a continuación reducir la presión del agua a la entrada de la cámara de flotación, produciéndose al descomprimir infinidad de burbujas que al adherirse con los flóculos hacen que éstos tienden a flotar en vez de sedimentar. Los rascadores de barrido de la superficie acumulan estos lodos y los vierten a un canal receptor. Coagulación - Flotación: En las aguas residuales, además de tener partículas sólidas que pueden ser eliminadas con un proceso de decantación primaria, existen sustancias coloidales, que son difícilmente sedimentables debido al hecho de que al estar cargadas electrostáticamente con iones del mismo signo, se repelen entre ellas manteniéndolas en movimiento constante que les impide sedimentar. Para desestabilizar estas suspensiones hay que neutralizar el potencial Z, mediante coagulantes tales como el sulfato de aluminio, sales de hierro y también de cromo. Con esta desestabilización, las materias no disueltas y las coloidales se precipitan y, tras la decantación, el líquido queda clarificado. El uso de procesos de coagulación ha sido ampliamente investigado en la depuración de las aguas de curtidurías. Orhon et al. (1998) alcanzaron una mayor reducción del contenido de materia orgánica y una mejora de la velocidad de eliminación del material particulado lentamente biodegradable, al tratar las aguas residuales en una primera etapa mediante una sedimentación primaria y posteriormente un tratamiento químico de flotación con sales aluminio y de hierro, usando además como coagulante un polietectrolito aniónico. Existen diversas citas de ensayos de coagulación y floculación con diferentes electrolitos para este tipo de aguas. Talinli (1994) evaluó las características del efluente después de ser sometido a un tratamiento de coagulación y floculación cloruro de aluminio y hierro además de la adición de un polielectrolito, obteniéndose porcentajes de eliminación de 63% DQO, 58% DBO 5 , 33% sulfato y 97% cromo, obteniéndose un efluente con unas características para ser tratado posteriormente mediante un tratamiento biológico. La producción de lodo biológico y químico fue de 2,5 kg/m 3 de agua tratada. Introducción 1-13 Tünay et al. (1994) realizaron ensayos en discontinuo para determinar las concentraciones adecuadas a adicionar de FeCl 3 como floculante en distintas muestras de aguas de curtidos. La oxidación del sulfuro presente en las muestras fue catalizada previamente con MnSO 4 a una concentración de 200 mg/L. Garrote et al . (1995) aplicó un método de coagulación floculación empleando FeCl 3 como agente floculante y Ca(OH) 2 como base precipitante, logrando mediante dos ciclos del tratamiento reducir la DQO del efluente un 87%, eliminando simultáneamente Cr 3+ , S 2- y estabilizando el pH. Estos sistemas de coagulación-floculación también se han utilizado para recuperar el cromo. Wiegant et al . (1999) utilizaron un sistema para precipitar las sales curtientes de cromo con óxido de magnesio en rango de pH 8 a 9. El lodo formado fue separado del licor de mezcla disuelto en H 2 SO 4 . El licor resultante fue reutilizado. Las medidas empleadas en la práctica para disminuir el contenido de cromo en el efluente son:  La reducción del contenido de cromo en el proceso, es decir, un alto agotamiento o reciclaje de licor de cromo.  Una medida externa de control de cromo en los efluentes es la precipitación de éste en forma de hidróxido con un álcali, separándose el precipitado y posteriormente la redisolución con ácido sulfúrico. En el caso en que no se realiza el proceso de curtido con cromo y se emplean taninos, las aguas residuales procedentes del curtido vegetal dan al efluente un color pardo al final de la etapa biológica. Este color tiene su origen principalmente al empleo de taninos difícilmente biodegradables. La precipitación con sales de aluminio o de hierro permite reducir esta coloración en un 80% y reducir la DQO en aproximadamente un 50%. La necesidad de dicha precipitación como, postratamiento depende de la relación del curtido al cromo con el curtido vegetal. Los lodos formados en la coagulación y floculación han de ser sedimentados. Si la dosificación de reactivos ha sido correcta el agua quedará bien clarificada. Del fondo del decantador han de ser extraídos los lodos para su posterior espesamiento y secado, con un contenido de sólidos entre un 3% y 5% que corresponde a 20-50 g SST/L. Espesamiento y secado de los lodos: Para que los lodos puedan ser vertidos y el coste de transporte disminuya es necesario concentrarlos mediante una etapa de espesamiento por gravedad, previa adición de reactivos. Tras el espesamiento, el porcentaje de sólidos aumenta entre un 8-15%, para incrementar el porcentaje de sólidos en el fango se suelen efectuar alguno de los Capítulo 1 1-20 Tabla 1.5: Porcentajes de eliminación de diferentes parámetros al aplicar diversos tratamientos Parámetros (%) DQO DBO 5 SS Cromo S 2- NTK Pretratamientos Flotación de grasas Oxidación sulfuro Precipitación cromo 20-40 10 90-99 90 Tratamientos Primarios Mezclado+sedimentación Mezclado+trat.químico+ sedim Mezclado+trat.químico+flotación 25-35 50-65 55-75 25-35 50-65 55-75 50-70 80-90 80-95 20-30 20-50 20-50 2-10 2-5 25-35 40-50 40-50 Tratamiento Biológico Primario o químico + ... ... aireación ... nitrificación desnitrificación ... lagunas aerobias facultativas tratamiento anaerobio (UASB) 85-95 85-95 80-90 65-75 90-97 90-97 85-95 60-70 90-98 90-98 85-90 50-80 <1 <1 <1 <2 <1 <1 <1 50 80-90 50 20-30 Fuente: European IPPC Bureau, Mayo (2001) Tratamiento de lodos La producción promedia de lodos generados en las curtiembres en Europa es alrededor de 400.000 t/año. Alrededor del 5 a 10% del lodo total generado es producido durante el tratamiento primario con un contenido de humedad del 95- 97% (COTANCE, 2002). La forma más apropiada para el tratamiento de lodos depende de varias condiciones, tales como la disponibilidad de espacio y el relieve del terreno, las condiciones climáticas, el uso proyectado del lodo, etc.. Previo a la aplicación de un tratamiento es necesario la deshidratación de éstos con el objeto de disminuir el coste de transporte y reducir su volumen. Para la etapa de deshidratación se pueden utilizar varios dispositivos como filtros de bandas, filtros prensa, centrifugas y otros. Previo a la etapa de deshidratación se realiza un acondicionamiento del lodo añadiendo sales de hierro y cal, así como con agentes polielectrolíticos. El fango de curtidos puede llevar un contenido de materia orgánica del orden del 60-70% de materia seca y un 3-5% de nitrógeno siendo el contenido de potasio muy bajo. La cantidad y las características del lodo producido dependen directamente del proceso y del tratamiento de aguas residuales aplicado. Para la eliminación o reducción del efecto contaminante del lodo existen varias alternativas: Introducción 1-21 Vertido del lodo , al optar por esta alternativa se deben considerar las limitaciones con relación al nivel de humedad y toxicidad de los lodos. Actualmente esta posibilidad cada día se reduce por la nueva legislación ambiental y por la disponibilidad de vertederos. En la Unión Europea el vertido de lodos con cromo trivalente está permitido previo tratamiento de estabilización evitando así la presencia de este compuesto en los posibles lixiviados generados. Sin embargo, el cromo hexavalente debe ser reducido y ser tratado de acuerdo al reglamento de residuos peligroso (Directiva 91/156/CEE) que indica la reducción del cromo hexavalente a cromo trivalente y su precipitación como hidróxido. Como agente reductor se utiliza el bisulfito sódico (NaHSO3), metasulfito sódico (Na2S2O5) y sulfato ferroso (FeSO4 · H2O), llevándose a cabo las reacciones a pH ácido (1-3). Digestión anaerobia, la digestión anaerobia de residuos orgánicos no es una técnica común hoy en día, ya que esta técnica requiere de una cuidadosa planificación y desarrollo para obtener resultados beneficiosos, por lo que otras opciones se han utilizado preferentemente. La digestión anaerobia tiene la ventaja desde un punto de vista económico del aprovechamiento del biogás. Aplicación del lodo en la agricultura, esta opción es una alternativa utilizada en Europa, teniendo como principal restricción, las limitaciones legales derivadas de los límites de permisibles de la contaminación de los suelos con cromo, pesticidas, microorganismos patógenos y otros contaminantes y saturación de nutrientes en el suelo. La legislación ambiental presenta límites de metales pesados como cadmio, mercurio, cobre, Zinc y níquel en los lodos, no especificando aún los límites de cromo y otros metales pesados. Si en el proceso de curtidos se ha realizado una buena recuperación del cromo, éste podría utilizarse como abono agrícola, ajustando las cantidades aplicadas a las necesidades del cultivo al que se apliquen, considerando el suelo como un reactor donde tiene lugar una biodegradación y la inmovilización de los constituyentes del lodo. El efecto es doble, corrección del suelo y provisión de sustancias nutritivas para las plantas. Un problema habitual en la gestión de fangos de curtiduría lo constituye la presencia ocasional de concentraciones elevadas de cromo en el lodo, por lo que las únicas salidas serían la deposición en el vertedero o la incineración para aprovechar el poder calorífico del fango. Compostaje aerobio, este método de producción de abono orgánico es otra de las alternativas para tratar los residuos sólidos, incluidos los lodos. El tratamiento vía compostaje tiene un coste cercano a 10US$/t para una curtiembre cuya producción será de 600 cueros/día, al compararlo con el coste de los vertederos, 10 a 20 US$/t, el compostaje surge como opción válida en términos económicos en países que sea legalmente aceptado el uso de ese compost (CONAMA, 1999). Capítulo 1 1-22 Tratamiento térmico de lodos , la incineración, gasificación o pirólisis de lodos como medida para recuperar energía y/o reducir el volumen de residuos a manipular ha sido objeto de investigaciones frecuentes. Sin embargo, esta opción resulta interesante principalmente cuando las posibilidades de vertido son caras y restrictivas. La incineración de lodos presenta un coste asociado debido a la necesidad de abatimiento de las emisiones gaseosas y a los límites de emisiones a la atmósfera que depende de la calidad del lodo que se pretende tratar. Un estudio realizado en Austria indicó que la incineración requiere un alto consumo de energía para alcanzar temperaturas sobre 800 ºC. Por otro lado, en Bélgica se ha estimado que el 17% de los lodos generados en la industria de curtidos son incinerados con un coste de 125 Euros/t (BREF, 2003). 1.1.3.3.- Nuevas Tecnologías: biorreactores de membrana Debido al rápido desarrollo de los sistemas de membranas, a los buenos rendimientos que presentan y a la reducción continuada de su coste, la aplicación de esta tecnología en la industria del curtido está en aumento. La ventaja de los biorreactores de membrana (BRM) sobre los sistemas tradicionales de biomasa en suspensión son la alta concentración de sólidos en suspensión volátiles (mayores a 20 g SSV/L) con los que se pueden operar reduciendo considerablemente la producción de lodos debido a los altos tiempos de retención de sólidos. Otra ventaja, es la calidad del efluente, ya que dependiendo del proceso de filtración aplicado diversas partículas quedan retenidas favoreciendo la degradación en el sistema (Figura 1.9). Introducción 1-23 Figura 1.9: Técnicas de separación y componentes retenidos (Dairy Processing Handbook, 1995). Existen dos configuraciones básicas de los reactores de membrana: sistemas de membranas sumergidas y sistemas de membranas externas (Figura 1.10). Los biorreactores de membrana sumergida operan a menores presiones transmembrana (PTM) (50-500 mbar) y solo es posible alcanzar flujos de permeado entre 10 y 60 L/(h·m 2 ), se utilizan principalmente para el tratamiento de aguas residuales urbanas. Por el contrario, los biorreactores de membrana externa operan a PTM entre 0,5 y 5 bar, en esta configuración es posible alcanzar flujos de permeado de hasta 120 L/(h·m 2 ), la principal aplicación es el tratamiento de aguas residuales industriales. (Gander et al. 2000; Côté y Thompson, 2000). Oyanedel (2002) describe en forma mas detalla las principales características de estas configuraciones. Capítulo 1 1-24 Influente Bioreactor Recirculación de lodos Membrana Efluente (a) Efluente Influente Bioreactor (b) Figura 1.10: Configuraciones de las unidades de membranas: (a) módulo de membrana externa, (b) módulo de membrana sumergida. Los sistemas de membrana sumergida han sido utilizados como sistemas para lograr una alta nitrificación en el tratamiento de diversas aguas residuales (Müller et al. 1995; Fan et al. 1996). Yamamoto y Win (1991) emplearon membranas de fibra hueca para el tratamiento de aguas de curtidos. Se han realizado algunas aplicaciones a escala industrial con unidades de ultrafiltración en varias industrias de curtidos, para el tratamiento de sus efluentes, separación de aceites o grasas de las disoluciones de desengrase acuoso y reciclado de baños de proceso de remojo y calero, habiéndose utilizado también la microfiltración de flujo cruzado para el reutilización y/o recuperación de licores de cromo de la curtición de piel. A pesar de estas aplicaciones, estas tecnologías están todavía en fase de prueba, ya que debido al alto coste de instalación y operación estos sistemas no son lo bastante atractivos. Algunas de las investigaciones que se están llevando a cabo están enfocadas al estudio de la economía y fiabilidad técnica de diversos tipos y configuraciones de membranas, en las siguientes aplicaciones:  Recuperación y reciclado de licores usados en el proceso de curtidos, en particular de pelambre (Reyes 1999).  Aplicación de los sistemas con membranas para el tratamiento de efluentes difíciles que presentan, en particular aceites, grasas, metales y una DBO elevada así como sólidos en suspensión finos (Sutton et al ., 1994; Chuichulcherm et al ., 2001).  Utilización de las membranas en el tratamiento biológico con el objeto de retención y oxigenación de la biomasa (Pankhania et al ., 1994; Parameshwaran et al ., 1999). Con la utilización de las tecnologías de membranas en el proceso de curtición se consigue una reducción del consumo más del 80% de productos químicos empleados en el proceso de curtidos, una disminución del consumo de agua y por tanto menor generación de efluentes. Cuando se aplican estos sistemas con Introducción 1-25 membranas en el tratamiento de efluentes se pretende mejorar el rendimiento y minimizar la producción de lodos. Goltara et al . (2003) compararon a escala de laboratorio las eficacias de eliminación de materia orgánica y nitrógeno empleando aguas de la corriente de ribera con oxidación previa de sulfuro en un reactor SBR convencional y otro con membrana de fibra hueca interna. Con el sistema SBR convencional se alcanzaron porcentajes de eliminación de nitrógeno de un 90%, mientras que en el sistema provisto de un módulo de membrana se obtuvieron porcentajes de eliminación de nitrógeno del 100% y de eliminación de materia orgánica de un 90%. Yamamoto y Win (1991) emplearon a escala de laboratorio un reactor de fibra hueca para el tratamiento de aguas residuales de curtidos, evaluándose la operación a diferentes tiempos de retención sólidos (TRS) aplicando velocidades de carga orgánica de 3, 5 y 10 kg DQO/(m 3 ·d). Krauth (1996) trabajó con un biorreactor aerobio de 2,5 m 3 presurizado a 3 bares con una membrana de ultrafiltración de área 1,32 m 2 y una unidad de nanofiltración de 2,4 m 2 en el tratamiento de aguas residuales provenientes de la industria textil y de curtidos. El flujo aplicado a través de la membrana de ultrafiltración fue entre 100 y 200 L/(m 2 ·h) y para la membrana de nanofiltración de 0,05 L/(m 2 ·h), observando que al retornar el concentrado retenido en la unidad de nanofiltración al biorreactor aumentaba la biodegradabilidad y mejoraba la calidad del efluente. Sin embargo, la concentración de material no biodegradable y sales retenidas en la membrana se incrementó con el tiempo observándose un efecto negativo sobre la degradación biológica y sobre la permeabilidad a través de la membrana. Esta tecnología podría ser económicamente competitiva para el tratamiento de aguas residuales si la energía consumida para la filtración a través de la membrana se puede reducir a 1 kWh/m 3 de agua residual. Uno de los inconvenientes del tratamiento con membranas es el ensuciamiento de éstas, ya que afectan a la eficiencia del sistema e influyen en el coste de operación, debido principalmente a la disminución de la permeabilidad. Los tres mecanismos que afectan al bioensuciamiento incluyen la adsorción de polímeros extracelulares solubles o en suspensión sobre la superficie o en los poros de la membrana, la obstrucción de los poros de la membrana por finas partículas coloidales y la adhesión y/o deposición de una capa de lodo sobre la superficie de la membrana. El diseño del módulo de membrana, las condiciones hidrodinámicas, las condiciones de operación de los módulos de membrana, el material de éstas, la naturaleza del licor de mezcla son factores dominantes que afectan al ensuciamiento (Liao et al . 2004). Capítulo 1 1-26 La formación de una capa de lodo sobre la superficie de la membrana es el tipo de ensuciamiento más frecuente (Figura 1.11). Éste habitualmente se controla con aireación, ya que genera un adecuado movimiento de la fibras eliminando la capa de lodo presente sobre la superficie o bien evitando su formación. Figura 1.11: Ensuciamiento de una membrana Se han propuesto varias expresiones empíricas para correlacionar el flujo o la permeabilidad de la membrana con distintos parámetros. Fane et al. (1981), Sato y Ishii (1991) han encontrado diversas relaciones lineales o no lineales entre la resistencia a la filtración y la concentración de sólidos. Otros autores han obtenido correlaciones con la distribución del tamaño de partículas (Cicek et al. 1999) o el carbono orgánico disuelto y DQO (Sato y Ishii, 1991). Se ha intentado correlacionar la permeabilidad con la concentración de sustancias poliméricas extracelulares que se cree son las primeras responsables del ensuciamiento de las membranas (Chang et al. 2001). En la Figura 1.12, se observa como la estructura de una membrana nueva y como se encuentra ésta transcurrido un año de operación. (a) (b) Figura 1.12: Imagen (X4000) mediante barrido electrónico de una membrana (a) nueva y (b) después de un año de operación (Kimura et al. 2000). Introducción 1-27 1.2.- MÉTODOS EMPLEADOS EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD MICROBIANA DE LA BIOMASA. La caracterización de los parámetros cinéticos de la biomasa presente en los sistemas biológicos da una información importante para evaluar la capacidad del sistema y establecer las condiciones adecuadas de operación. Mediciones simples de la actividad de la biomasa proporcionan información acerca de las velocidades específicas de diferentes reacciones biológicas y de la biodegradabilidad de los diversos componentes del sustrato. Otro factor importante a evaluar es el efecto inhibitorio que pueden producir diversos compuestos presentes en las corrientes de aguas residuales sobre la biomasa. Se han desarrollado diferentes métodos para la caracterización de la actividad microbiana, ejemplo de ello son los métodos químicos, calorimétricos, respirométricos y de titulación. 1.2.1.- Métodos químicos La monitorización del consumo de un determinado sustrato y/o la aparición de un determinado producto mediante el seguimiento de la concentración en el tiempo permite determinar la velocidad de consumo y/o producción de éste. Entre los procesos que se pueden seguir con estas técnicas se encuentran las reacciones biológicas de nitrificación y desnitrificación. La variación de la concentración de amonio o nitrito con el tiempo permite determinar la velocidad de nitrificación. El seguimiento de la producción de nitrato mediante ensayos en discontinuo es una de las metodologías más utilizadas en la determinación de la velocidad de nitrificación en muestras de lodos activados (Kristensen et al . 1992; Arvin et al . 1994; Eilersen et al . 1994; Copp y Murphy, 1995). En este tipo de metodología es necesario el muestreo regular y el análisis químico de amonio y nitrito en las muestras para poder determinar las velocidades de consumo. Para procesos de desnitrificación, la actividad puede ser determinada por monitorización del consumo de NO 3- (Kristensen et al . 1992; Harremoës y Sinkjaer, 1995), o bien, mediante el seguimiento de amonio y nitrato usando un sistema de análisis de inyección de flujo (FIA) (Isaacs y Temmink, 1996). Beaubien y Jolicoeur (1985) correlacionaron la velocidad de producción de gas con la velocidad de consumo de NO 3- , obteniéndose buenos resultados, por lo que la velocidad de producción de gas es un método alternativo para la monitorización de la desnitrificación. En este sentido Buys et al . (2000) han usado la medición de la presión y de la composición del gas como medida de la actividad microbiana de la desnitrificación. Capítulo 1 1-28 1.2.2.- Métodos calorimétricos El estudio de los procesos metabólicos de los microorganismos empleando sistemas calorimétricos se basa en la aplicación de balances de materia y energía, que relacionan el calor generado durante la fase de crecimiento con la actividad microbiana, lo que permite correlacionar la medida experimental de energía intercambiada con las distintas reacciones biológicas que transcurren en serie o en paralelo. Los calorímetros se clasifican en dos grandes grupos: calorímetros adiabáticos y calorímetros de flujo de calor. En los calorímetros adiabáticos se evita el intercambio de calor entre el entorno y la vasija calorimétrica, por lo que, el calor que se desprende o absorbe durante la reacción producirá una variación en la temperatura de la vasija calorimétrica. Dependiendo del rango de medido, los calorímetros de flujo pueden ser definidos como calorímetros y microcalorímetros. Las diferencias más significativas entre los calorímetros y los microcalorímetros, están referidas a la sensibilidad de la potencia térmica del equipo, siendo en torno a 1 µW en los microcalorímetros y superiores a 1 W en los calorímetros. Además el volumen de muestra requerida en los calorímetros es superior a la empleada en los microcalorímetros, (Figura 1.13) entre 1-5 ml. En estos equipos se trabaja con cantidades muy pequeñas de muestra siendo la capacidad de la vasija calorimétrica de unos mililitros y por tanto, las unidades de calor y potencia térmica detectada son del orden de mJ y µW, respectivamente. Figura 1.13: Esquema de un microcalorímetro de flujo (equipo 2277 Thermal Activity Monitor, Ramos,1996). Introducción 1-29 La medida cuantitativa de la actividad biológica se obtiene a partir de las curvas potencia-tiempo en combinación con una o más técnicas analíticas específicas. Una de las principales ventajas que presenta este método es que se puede aplicar a múltiples medidas y evaluaciones biológicas tanto en condiciones aerobias como anaerobias (Jolicoeur et al . 1988; Wadsö, 1995). Una de las principales fuentes de error de éstos sistemas, al realizar ensayos con sistemas biológicos, es la correcta calibración de los equipos, para poder garantizar la fiabilidad de las mediciones realizadas, recomendándose la realización de calibraciones químicas que complementen las calibraciones en las que se usan sistemas eléctricos insertados en los equipos. La idea de utilizar la calorimetría para ensayos microbiológicos apareció hacia 1970. Algunos ensayos realizados han tenido por objeto obtener datos termodinámicos de diversos procesos biológicos (Von Stockar y Marison 1989; Van Kleeff et al . 1993). Experimentos sobre procesos de biodegradación en suelos se realizaron por Critter y Airoldi, (2001). Weppen et al . (1991) utilizaron la calorimetría para la estimación directa de la demanda biológica de oxígeno. Otras aplicaciones de estos sistemas sobre la actividad biológica fueron los ensayos de inhibición o toxicidad de diversas sustancias sobre biomasa heterótrofa, nitrificante y desnitrificante (Aulenta et al . 2002). Fortier et al . (1980) evaluaron el efecto tóxico de componentes como cianuro, cadmio, cromo, cobre y fenol sobre muestras de lodos activos, encontrando resultados similares al comparar dichos resultados con los obtenidos empleando técnicas respirométricas. Ramos (1996) aplicó la calorimetría de flujo para evaluar el efecto del fenol y paraformaldehído sobre biomasa en suspensión nitrificante, observando una reducción del flujo de calor durante las fases de oxidación de amonio y nitrito a medida que se incrementaba la concentración de tóxico durante la experimentación (Figura 1.14). La medida de flujo de calor en presencia de inhibidores puede servir como una base para evaluar los efectos de los compuestos contaminantes sobre la biomasa. Dada la sensibilidad de algunos equipos microcalorimétricos se ha podido trabajar incluso con suspensiones de hasta 10 4 células/cm 3 con un tiempo de respuesta de aproximadamente un minuto, pudiendo emplearse prácticamente para todo tipo de microorganismos, sustratos y contaminantes o tóxicos (Beaunien y Jolicoeur, 1984). La monitorización en línea de un proceso biológico usando calorimetría proporciona información acerca de las reacciones cinéticas de la actividad que tiene lugar. Jolicoeur et al . (1988) monitorizaron la actividad biológica de dos procesos diferentes de tratamiento de aguas residuales: tratamiento aerobio de un efluente de una industria de textil y un tratamiento anaerobio de fermentación para un efluente proveniente de la industria de quesos. Menert et Capítulo 1 1-36 constituido por aquellos microorganismos que de acuerdo a la reacción que tenga lugar son capaces de transformar un sustrato generando H + o OH - , siendo empleados como agentes titulantes disoluciones ácidas o alcalinas. Los sistemas DO-stat utilizan una sonda de oxígeno para evaluar la variación de la concentración de oxígeno debida a la actividad de los microorganismos aerobios, empleándose una disolución diluida de H 2 O 2 como agente titulante para mantener dicho parámetro constante. Sistemas pH-stat El principio de operación de estos sistemas de titulación consiste en la adición controlada de una disolución diluida ácida o alcalina, con el objeto de mantener un valor constante de pH en el sistema (Figura 1.16). Bajo estas condiciones, la velocidad de titulación es proporcional a la velocidad de reacción (Massone et al . 1995a, Ficara et al . 2001), por tanto, esta técnica puede ser aplicable a reacciones biológicas y físico-químicas en las que se produce consumo y/o producción de protones o iones hidroxilo. Unidad de titulación OH - o H + BIOMASA sustrato H2O OH - o H + sonda pH Figura 1.16: Esquema general de un sistema pH-stat. Introducción 1-37 Existen diferentes biorreacciones de interés ambiental en las que tienen lugar la liberación o consumo de H + (Tabla 1.7). La determinación de la actividad nitrificante, es una de las principales aplicaciones de estos sistemas, ya que aunque el concepto de pH-stat fue primeramente desarrollado por Ramadori et al . (1980) con el objeto de evaluar la actividad de los microorganismos responsables de la primera etapa de la nitrificación, el procedimiento fue posteriormente mejorado para poder medir la concentración de amonio en cualquier instante de la nitrificación (Beccari et al . 1980; Massone et al . 1995b, 1996; Gernaey et al , 1997, 1998) y posteriormente patentado por Rozzi et al . (1999) como A.NIT.A (Ammonium NITrification Analyser). Aunque en estos sistemas solo es posible cuantificar la actividad amonio oxidante, ésta puede ser considerada como la actividad nitrificante en los casos en que la etapa de oxidación de amonio a nitrito sea la limitante, (Alleman, 1985; Nowak et al. 1995). En muchos casos, además los efectos inhibitorios de diferentes sustancias son mayores sobre las bacterias amonio oxidantes (Gernaey et al . 1999; Ficara et al . 2000a). Tabla 1.7: Resumen de las aplicaciones de los sistemas de titulación pHstat Reacción Sustrato Producto Solución titulante Referencias Nitrificación NH 4+ H + NaOH Beccari et al . (1980) Massone et al . (1995b) Massone et al . (1996) Gernaey et al . (1997) Gernaey et al . (1998) Rozzi et al . (1999) Desnitrificación NO 3- ; DQOrb OH - HCl Massone et al . (1996) Rozzi et al . (1997a) Bogaert et al . (1997) Rozzi et al . (2000) Foxon et al . (2002) Una ventaja frente a los métodos respirométricos, es que las mediciones de pH también se pueden realizar bajo condiciones anóxicas lo que permite también la monitorización de procesos de desnitrificación. En dichos ensayos se pone en contacto materia orgánica rápidamente biodegradable (DQOrb) y nitrato en condiciones anóxicas siguiendo la evolución de la reacción mediante el consumo de agentes titulantes ácidos. En estos sistemas se suele usar un electrodo redox para verificar el final de la reacción mediante los cambios de potencial que se suelen producir (Massone et al . 1996; Rozzi et al . 1997a, Bogaert et al .1997; Rozzi et al . 2000; Foxon et al . 2002). Un ejemplo de sistemas de titulación para la monitorización de plantas de tratamiento de lodos activos es el DECADOS (DEnitrification CArbon source DOSage System), que consiste en un sistema Capítulo 1 1-38 provisto de una sonda de pH y otra de potencial de oxidación reducción (POR) (Bogaert et al . 1997). El sistema DECADOS ha sido utilizado en el control de la adición de una fuente de carbono externa fácilmente biodegradable, en una balsa de desnitrificación que trataba un efluente con una baja relación C/N (Yuan et al . 1997). La producción y/o consumo de H + y/o OH - debido a reacciones biológicas no es el único causante del cambio del pH del sistema. La modificación del equilibrio CO 2 /HCO 3- /CO 3= , por ejemplo, también trae como consecuencia variaciones del pH que han de tenerse en cuenta a la hora de realizar ensayos. Autores como Rozzi et al . (2001, 2002) utilizaron este tipo de bioensayos en condiciones anóxicas para determinar la actividad acetoclástica metanogénica mediante el bicarbonato producido. Remigi et al . (2002) evaluaron la velocidad máxima de crecimiento de biomasa acetoclástica, y además adaptaron el sistema pHstat para poder determinar parámetros cinéticos como velocidad máxima de consumo de sustrato (V max ) y constante de saturación media (Ks) para microorganismos Anammox. Los sistemas de titulación se han utilizado por diferentes autores para medir los efectos inhibitorios sobre las bacterias nitrificantes, lo que puede ser de gran utilidad para evaluar el efecto del potencial de toxicidad del influente en las plantas de tratamiento. Gernaey et al . (1999), Ficara y Rozzi, (2001a,b) cuantificaron el efecto de bajas concentraciones de compuestos tóxicos sobre la capacidad amonio oxidante en muestras de lodos activos. En procesos anaerobios, Rozzi et al . (1997b) han empleado estos sistemas para evaluar el efecto de diferentes concentraciones de ácidos grasos volátiles (AGV) en la digestión anaerobia. Ficara et al . (2003) desarrollaron una metodología con objeto de identificar posibles interferencias o problemas de estos sistemas, en la cual compararon las velocidades de titulación experimental y teórica para validar el modelo matemático presentado que da respuesta a las reacciones de consumo o producción de protones, CO 2 , bicarbonato y carbonato que puedan influir en la eficacia de estos sistemas definida como la relación entre la velocidad de titulación y la velocidad de reacción. Las principales interferencias que afectan a los sistemas de titulación son producidas por las sustancias que afectan al pH del licor de mezcla, por ejemplo:  Sustancias que afectan el K L a (en sistemas abiertos)  Compuestos tóxicos que afectan la velocidad de producción específica de CO 2 del lodo  Compuestos tóxicos que pueden activar la respiración exógena, así como sustancias orgánicas fácilmente biodegradables. Introducción 1-39  Disoluciones altamente alcalinas o disoluciones tamponadas  Cambios de temperaturas que afectan al K L a, la concentración de CO 2 de saturación y la velocidad de producción específica de CO 2 del lodo en condiciones endógenas. Cuando se desea evaluar mediante estos sistemas de titulación el efecto de una sustancia sobre una actividad, es conveniente realizar ensayos previos en blanco para verificar cualquier interferencia debido a la variación del pH producto de alguna reacción química y no biológica. En sistemas abiertos, cuando tiene lugar la transferencia de masa gas/líquido, la velocidad de titulación es proporcional a la velocidad de reacción sólo si la titulación ocurre después que el CO 2 ha alcanzado su equilibrio en la fase gas. La adición de solución titulante para equilibrar el CO 2 (stripping o redisolución) ha de ser tenida en cuenta. Sistemas DO-stat Los sistemas en los que se monitoriza la concentración de oxígeno en el licor de mezcla son conocidos como DO-stat y se desarrollaron para aumentar las aplicaciones de la unidad pH-stat mediante la incorporación de una sonda de oxígeno. Una combinación de ambas unidades, pH-stat y DO-stat, es utilizado para determinar la actividad biológica de sistemas en los cuales hay variación del pH o de la concentración de oxígeno disuelto, lo cual puede facilitar información complementaria, como por ejemplo en sistemas en los que existan reacciones en serie o paralelo, aparte de las monitorizadas con el pH-stat, que no produzcan o consuman protones y sí oxígeno. Una de las principales aplicaciones es la determinación de las actividades amonio y nitrito oxidantes mediante una doble titulación, empleando como disoluciones titulantes NaOH para el ajuste de pH y H 2 O 2 para mantener la concentración de oxígeno disuelto en la fase líquida constante. En los sistemas pH-stat sólo es posible determinar la actividad amonio oxidante (AO), ya que la oxidación de amonio a nitrito produce protones, en cambio, en los sistemas DO-stat es posible determinar la actividad amonio oxidante (AO) y la actividad nitrito oxidante (NO) ya que la cantidad estequiométrica de oxígeno consumido es diferente en las dos etapas de la nitrificación (ecuaciones 1.6, 1.7). NH 4+ + 1.5 O 2 Æ NO 2- + H 2 O + 2 H + (Ecuación 1.6) NO 2- + 0.5 O 2 Æ NO 3- (Ecuación 1.7) Capítulo 1 1-40 En los sistemas DO-stat la actividad es cuantificada mediante el volumen de una disolución diluida de peróxido de hidrógeno adicionada para alcanzar un valor constante pre-establecido de oxígeno disuelto en la fase líquida. El H 2 O 2 es utilizado como fuente de O 2 , ya que según la ecuación 1.8, el H 2 O 2 se disocia fácilmente produciendo agua y oxígeno mediante la acción de la catalasa, enzima celular producida durante el metabolismo oxidativo de sistemas aerobios como respuesta al stress oxidativo (Hosetti y Frost, 1994; Schellhorn, 1994). catalasa 2 H 2 O 2 2 H 2 O +O 2 (Ecuación 1.8) Houtmeyer et al. (1977) compararon dos unidades de lodos activos, una oxigenada con aire y la otra unidad controlada con adiciones de H 2 O 2. Se observó que después de algunos días de operación empleando H 2 O 2 como fuente de oxigeno la capacidad de eliminación de materia orgánica no se vio afectada, pero se apreció un incremento de la actividad de la catalasa en el fango, teniendo por tanto un efecto perjudicial sobre la capacidad nitrificante. Se observó un efecto positivo sobre la sedimentabilidad del fango, ya que se obtuvo una mejora del índice volumétrico de lodo. En recientes estudios se investigó la inhibición del H 2 O 2 sobre las bacterias nitrificantes. Ficara et al . (2000b) observaron que al adicionar 150 mg H 2 O 2 -O 2 /L se obtuvo una completa oxidación de 33 mg N-NH 4+ /L a una velocidad de 0,65 mg O 2 /(L·min) causando menos de un 10% de inhibición para las amonio y nitrito oxidantes. Diversos ensayos de inhibición, realizados para verificar si la adición de H 2 O 2 no interfiere sobre la actividad NO y AO, mostraron que el efecto del H 2 O 2 es despreciable para una concentración de biomasa mayor de 1,5 g SSV/L (Chin y Hicks, 1970, Tusseau- Vuillemin et al . 2002). Tusseau-Vuillemin et al . (2002) emplearon el peróxido de hidrógeno como una técnica alternativa de re-oxigenación en experimentos respirométricos, eliminándose perturbaciones en la señal debido a la adhesión a los electrodos de oxígeno de finas burbujas producto de la aireación. Ficara et al . (2000b) y Young y Kuss (2000), de manera independiente utilizaron estas propiedades para desarrollar un biosensor DO-stat basado en la adición de H 2 O 2 como fuente de oxígeno. La Figura 1.17, muestra una curva típica de titulación obtenida en un sistema pH-DO-stat, empleando dos disoluciones titulantes de NaOH y H 2 O 2 con objeto de mantener constante el pH y la concentración de oxígeno disuelto, respectivamente. En la curva donde se emplea H 2 O 2 como solución titulante, se observa que durante el primer periodo, antes de la adición de algún sustrato, el consumo de H 2 O 2 se debe al consumo endógeno de la biomasa. Después de la adición de sustrato, en este caso nitrito, el volumen de disolución titulante (H 2 O 2 ) Introducción 1-41 adicionado es proporcional a la actividad nitrito oxidante. Transcurrido un determinado tiempo se adicionó amonio como sustrato, obteniéndose la actividad amonio oxidante a partir de la pendiente del volumen de peróxido consumido en el tiempo y la relación estequiométrica correspondiente. Una vez consumido todo el amonio la pendiente indica la actividad nitrito oxidante más la actividad endógena. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 306090120150 Tiem po (m in) Titulante (ml) 10 mg N-NO 2 - /l 3.1 mg N-NH 4 + /l act. endog. act. NO act. AO act. AO V H 2 O 2 V NaOH H 2 O 2 NaOH Figura 1.17: Perfiles de titulación para la determinación de la actividad amonio oxidante (AO) y nitrito oxidante (NO), empleando NaOH y H 2 O 2 como disoluciones titulantes. En la curva donde se emplea NaOH como titulante, antes de adicionar sustrato el consumo de NaOH se debe al metabolismo endógeno. Al adicionar nitrito como sustrato no se observó un cambio de pendiente, lo que se debe a que en esta reacción no tiene lugar la producción de protones, observándose sin embargo un cambio de pendiente al adicionar amonio como sustrato, lo que indica que solo es posible cuantificar la actividad amonio oxidante debido a la disminución del pH producto de la reacción en curso. Otras aplicaciones donde se ha utilizado este tipo de sistemas han sido en determinar la cinética de degradación de sustratos orgánicos simples como glucosa y etanol, ya que el consumo de oxígeno y la producción de CO 2 es detectado por el sistema de titulación de H 2 O 2 y NaOH (Ficara y Rozzi, 2002). Capítulo 1 1-42 1.3.- REFERENCIAS Abdel-Shafy H. (1995) Fate of heavy metals in the leather tanning industrial wastewater using an anaerobic process. Environmental management and health, an international journal. 6(2), 28-33. Alleman J.E. (1985) Elevated nitrite occurrence in biological wastewater treatment systems. 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(1980) con objeto de evaluar la actividad de los microorganismos responsables de la primera etapa de la nitrificación y posteriormente fue mejorado para poder medir la concentración de amonio en algún instante de la nitrificación (Beccari et al. 1980; Massone et al. 1995b, 1996; Gernaey et al. 1997, 1998), siendo patentado uno de dichos dispositivos por Rozzi et al. (1999a) como ANITA (Ammonium NITrification Analyser). Mediante estos sistemas de titulación se pueden realizar ensayos de actividad microbiana tanto en condiciones anaerobias, aerobias o anóxicas, utilizando ligeras modificaciones, como puede ser la utilización de diversos medios de gasificación, o la introducción, o no, de diferentes accesorios complementarios como sonda de oxígeno en los tests de actividad aerobia, o una sonda redox para ensayos en condiciones anaerobias o anóxicas (Gernaey et al. 2001). La primera generación de estos sistemas de titulación se desarrolló para aplicaciones a escala de laboratorio relacionadas con la determinación de la actividad de la biomasa. Posteriormente en una segunda generación se enfocó a la monitorización on line del funcionamiento de las plantas de tratamiento de aguas residuales, mediante el control de la actividad de la biomasa y del efecto inhibitorio que sobre ésta pueden presentar algunas sustancias presentes en las aguas residuales a ser tratadas por sistemas biológicos (Rozzi et al. 2000). Como ejemplo representativo de la utilización de estos sistemas se pueden citar los ensayos realizados en discontinuo a escala laboratorio empleando biomasa proveniente de diferentes plantas de tratamiento que se utilizaron para determinar la actividad amonio oxidante (Ficara, 2001). En estos ensayos el sistema se mantiene constantemente aireado, con una concentración elevada de oxígeno disuelto (O.D.) en el licor de mezcla, lo que permite realizar los ensayos sin limitaciones de oxígeno, al contrario de lo que sucede en los ensayos respirométricos tradicionales. Diversos autores han estudiado el efecto de diversos compuestos tóxicos sobre la capacidad amonio oxidante en muestras de lodos activos mediante un sistema pH-stat (Gernaey et al . 1999; Ficara y Rozzi, 2001). Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-3 Ficara y Rozzi (2001) estudiaron el efecto de la concentración de biomasa nitrificante sobre la inhibición por cadmio a dos concentraciones (15 y 20 mg Cd/L), observando que al aumentar la concentración de biomasa desde 0,5 g SSV/L a 3,5 g SSV/L el porcentaje de inhibición disminuía desde un 80% hasta un 20% de inhibición. Dicho efecto fue constatado asimismo por Rozzi et al. (1999b) al utilizar un sistema de titulación para caracterizar aguas residuales de industrias textiles. En los ensayos de inhibición la relación compuesto inhibitorio/concentración de biomasa es un parámetro importante en los sistemas de titulación pH-stat. Rozzi et al. (1997b) han utilizado los sistemas de titulación para determinar también el efecto de diferentes concentraciones de ácidos grasos volátiles (AGV) en la digestión anaerobia. La utilización de nuevos sistemas para la caracterización de la biomasa nitrificante y desnitrificante basados en sistemas de control de pH, son una buena alternativa frente a otros métodos. Uno de los inconvenientes de estos sistemas son las posibles interferencias no contempladas que puedan afectar a los tests, por lo que es conveniente que previamente a los ensayos de inhibición se realicen ensayos en blanco para verificar alguna interferencia del compuesto evaluado debido a una variación del pH, producto de alguna reacción química y no biológica. La utilización de un inhibidor selectivo de la oxidación de amonio es una alternativa para verificar al final del ensayo posibles interferencias de los compuestos empleados en los ensayos de inhibición. Se ha comprobado que la aliltiourea (ATU) inhibe completamente la primera etapa de la nitrificación (Benes et al. 2002). En cuanto a la segunda aplicación de estos sistemas, monitorización de plantas de tratamiento, Gernaey et al. (1997, 1998) siguieron el funcionamiento de diversas plantas de tratamiento a escala piloto y industrial mediante determinaciones de la actividad nitrificante de la biomasa. Rozzi y Malpei (2003) determinaron la actividad de la biomasa presente en un biorreactor de membrana piloto usando el sistema de titulación ANITA. El control del proceso de desnitrificación en plantas de lodos activos ha sido monitorizado por el sistema de titulación llamado DECADOS (Denitrification Carbon source Dosage System) utilizando una sonda de pH y otra de potencial redox (Bogaert et al. 1997). Yuan et al . (1997) utilizaron un sistema de titulación a pH constante para controlar la adición de una fuente de carbono con el fin de alcanzar una completa desnitrificación en un sistema industrial de tratamiento de aguas residuales. Los principales objetivos de este capitulo han sido los siguientes: 1. Determinación de la actividad amonio oxidante de la biomasa en suspensión. Capítulo 2 2-4 2. Validación de la metodología desarrollada por el Politécnico de Milán para determinar efectos inhibitorios sobre la biomasa con un pH-stat, mediante ensayos de intercalibración, en los que participación diversos laboratorios, utilizando dicha técnica. 3. Determinación de la actividad amonio oxidante y ensayos de inhibición de biomasa adherida usando el sistema de valoración de pH. 2.2.- MATERIALES Y MÉTODOS 2.2.1.- Equipo empleado (pH-stat) y procedimiento utilizado Los experimentos han sido realizados en una unidad pH-stat conocida como ANITA (Ammonium NITrification Analyser) desarrollado por el Politécnico de Milán en cooperación con la compañía Italiana Austep. Este sistema de titulación esta constituido principalmente por un vaso termostatizado (0,5-2 L) donde tiene lugar la reacción, un electrodo de pH, una sonda de temperatura, un sistema automático de adición de las soluciones titulantes correspondientes, un sistema de aireación y de agitación (Figura 2.1) Todas estas unidades se encuentran conectadas a un ordenador donde se almacenan y tratan los datos experimentales. Figura 2.1: Fotografía del sistema de titulación empleado en los ensayos de actividad. 1,2,3 recipientes para las disoluciones titulantes; 4 termostato; 5 sonda de pH; 6 sonda de temperatura; 7 vaso de reacción; 8 sistema de aireación; 9 agitador magnético. Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-5 El sistema está preparado para poder operar con 3 disoluciones titulantes diferentes, pero durante los ensayos realizados sólo se ha empleado uno en el que se almacena una disolución alcalina. Antes de la realización de las series experimentales se realiza sistemáticamente la calibración de las sondas de pH y temperatura y la calibración de las electroválvulas. Sonda de temperatura: La medida de temperatura durante los ensayos no solo sirve para monitorizar este parámetro, sino para corregir la lectura del pHmetro de forma automática. Para ello se calibra dicha sonda introduciéndola en una solución de agua y hielo a 0ºC y agua hirviendo a 100ºC. Sonda de pH: Los ensayos se realizaron en un intervalo de pH entre 8 y 8,5, por lo que en la calibración de la sonda se emplearon disoluciones tamponantes de pH 7,0 y 10. Electroválvulas: La adición del agente titulante se controla mediante uso de electroválvulas, que se abren durante períodos de 2,5 segundos durante los cuales se adiciona un volumen determinado de disolución titulante. Antes de la realización de los ensayos se cuantificó el volumen adicionado por impulso. Una vez puesto a punto el equipo se procede a la preparación de la disolución titulante alcalina de NaOH con una normalidad de 0,05 N. La composición exacta de la disolución de NaOH 0,05±0,001 N se realizó por valoración de la muestra con una disolución patrón de H 2 SO 4 (0,1 N). La determinación comienza transfiriendo la muestra de lodo al vaso del equipo y adicionando el sustrato correspondiente. El sistema detecta la variación de pH del licor de mezcla respecto al pH de equilibrio (pH eq ) previamente establecido, lo cual activa la adición de la disolución titulante con objeto de contrarrestar la variación de pH producto de la producción de H + o OH - . En el ordenador se almacenan los valores de pH y el volumen de disolución titulante adicionada a lo largo del ensayo. Por otro lado, el termostato activa la resistencia que se utiliza para mantener la temperatura del licor de mezcla cuando ésta disminuye por debajo del intervalo de temperatura establecida como referencia, desactivándose cuando se alcanza la temperatura requerida. La agitación y la aireación en el sistema durante los experimentos se mantienen mediante un difusor. Capítulo 2 2-6 2.2.2.- Ensayos realizados 2.2.2.1.- Determinación de actividades amonio oxidantes de biomasas en suspensión Se realizaron ensayos con muestras de lodo provenientes de la planta depuradora de aguas residuales urbanas de Bertamiráns (A Coruña - España). Durante la realización de los ensayos el lodo se mantuvo almacenado en condiciones anóxicas a una temperatura de 4ºC por un periodo inferior a 3 semanas. Antes de realizar las pruebas de determinación de actividad las muestras de fango se lavaron con una disolución de lavado según el procedimiento descrito por Ficara y Rozzi (2001). La disolución de lavado está compuesta por 950 ml de agua desionizada, 50 ml de solución de Winogradsky (Tabla 2.1) y 0,3 g NaHCO 3 /L. El objetivo de este lavado es evitar eventuales interacciones sinérgicas o antagónicas debido a la presencia de substancias químicas disueltas e igualar la respuesta del fango en los ensayos mejorando la repetibilidad de las pruebas. Tabla 2.1: Composición de las disoluciones utilizadas para el lavado del fango. DISOLUCIÓN DE OLIGOELEMENTOS DISOLUCIÓN DE WINOGRADSKY Martinotti et al . (1999) Componentes g Componentes g K 2 MoO 4 0,05 KH 2 PO 4 5 Na 3 BO 3 0,05 MgSO 4 2,5 Fe(ClO 4 ) 3 0,01 NaCL 2,5 CoN 2 O 6 0,05 Fe 2 (SO 4 ) 3 0,05 CdSO 4 0,05 MnSO 4 0,05 CuSO 4 0,05 Sol.Oligoelementos 1 mL ZnSO 4 0,05 Agua destilada 1 L MnSO 4 0,05 Agua destilada 1 L Después del lavado, el fango se resuspende en 1 L de disolución de lavado, se adiciona una concentración de 10 mg N-NH 4+ /L y se mantiene durante 24 h en aireación a temperatura ambiente con objeto de restablecer la actividad de las muestras del lodo activo después del periodo de almacenamiento. Posteriormente, se transfiere el licor de mezcla al vaso del equipo midiendo el pH hasta que éste alcanza el pH de equilibrio (pH eq ). Cuando la velocidad de producción de CO 2 , debido a la respiración endógena de las bacterias se iguala a la velocidad de stripping del CO 2 debido a la aireación. Se considera que se alcanza el pH eq cuando los valores promedios de pH calculados durante 1 ó 2 Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-7 minutos no presentan una variación mayor de 0,05 durante un periodo de 20 minutos. Normalmente son necesarias 2 h para que la suspensión alcance el pH eq . Una vez alcanzado el pH eq , la muestra se mantiene constantemente aireada y agitada. Los experimentos se desarrollaron a un temperatura de 25±1°C, con unas concentraciones de biomasa comprendidas entre 2 y 3 g SSV/L y un pH eq entre 7,0 y 7,5. Para determinar la actividad amonio oxidante, transcurridos 20 minutos, se adiciona a la suspensión una concentración de 30 mg N-NH 4+ /L, activándose la adición de disolución titulante para compensar la producción de H + producidos por oxidación de NH 4+ . 2.2.2.2.- Ensayos de inhibición sobre biomasa en suspensión; ejercicio de intercalibración. Con objeto de validar la metodología y el sistema de titulación desarrollado por el Politécnico de Milán, en la determinación de los efectos inhibitorios de diversas sustancias usando ANITA, se realizó un ejercicio de intercalibración en el que participaron los siguientes laboratorios: Plantas de tratamientos de Bulgarograsso y Valmadrera, Acueducto di Firenze, Centro de investigación Ispra, Las universidades Italianas: Università degli Studi di Trento, Università degli Studi di Cagliari, Università degli Studi di Milano, Università degli Studi della Basilicata, además participaron la University of Natal (Sudáfrica), Universidad de Santiago de Compostela (España), Politécnico de Milano y GlaxoSmithKline (Reino Unido). Los participantes en el estudio utilizaron lodos con una actividad entre 1,5 y 6,5 mg N-NH 4+ /(g SSV·h). En nuestro caso los ensayos de intercalibración, se realizaron también con muestras de lodo en suspensión procedentes de la EDAR citada anteriormente. Al igual que en los ensayos anteriores, el lodo se mantuvo almacenado en condiciones anóxicas a una temperatura de 4ºC por un periodo inferior a 3 semanas. El procedimiento seguido es el mismo que en el apartado anterior. Una vez establecido el pH eq entre 7,0-7,5, los experimentos se realizaron a una temperatura de 25±1°C con aireación y agitación constantes, las concentraciones de biomasa variaron entre 1 y 2 g SSV/L. Transcurridos los primeros 20 minutos en condiciones endógenas, se adicionan 30 mg N-NH 4+ /L y se emplea una disolución de NaOH (0,05 N) como titulante. A intervalos de aproximadamente 20 minutos se adicionan a la suspensión una alícuota del compuesto evaluado. Como regla general, se añadieron cinco volúmenes de Capítulo 2 2-8 concentraciones de compuestos inhibitorios. La adición de la disolución a evaluar no debe incrementar el volumen del licor de mezcla en más de un 10% (Ficara y Rozzi, 2001). En la tabla 2.2, se muestran las concentraciones utilizadas en los ensayos para los tres compuestos evaluados, que eran desconocidos durante la realización del ensayo. Tabla 2.2: Concentraciones adicionadas en los ensayos de inhibición S1 (mg/L) S2 (mg/L) S3 (mg/L) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 2 4 8 16 3 6 12 24 36 S1: ATU; S2: anilina; S3:sulfato de plata La selección de los tres compuestos se basó en el cumplimiento de los siguientes objetivos:  Evaluar de sustancias orgánicas e inorgánicas  Comparar los datos obtenidos con valores que aparecen en la literatura  Cubrir un amplio intervalo de IC 50  Fácil manipulación de compuesto, evitando así efectos tóxicos para el analista 2.2.2.3.- Ensayos de inhibición sobre biopelículas Se realizaron otra serie de ensayos con muestras de biomasa adherida a un soporte granular plástico de polietileno, que se desarrolló en un reactor de lecho circulante flotante (Lazarova y Manem, 1996, Garrido et al. 2000). El reactor se alimentó con agua residual conteniendo una concentración de amonio de 600 mg N-NH 4+ /L y una concentración de materia orgánica de 200 mg DQO/L con una velocidad de carga de amonio de 0,5 kg N-NH 4+ /(m 3 ·d). En el momento en que se realizaron los experimentos la concentración de la biopelícula era de 2,2 g proteina/L soporte y la actividad específica determinada en un respirómetro era de 0,4 g N-NH 4+ /g SSV (BOM, Yellow Spring instrument YSI 5331). Para cada ensayo, se toma un volumen aproximado de 100 mL de biopelícula del reactor de lecho circulante. Las muestras se enjuagan con la disolución de lavado descrita anteriormente y posteriormente se resuspenden en la disolución de Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-9 lavado hasta alcanzar un volumen de 250 mL. Se transfieren al reactor del sistema determinándose el pH eq . Los experimentos se desarrollan a un temperatura de 25±1°C y un pH eq entre 7,0 y 7,5. Transcurridos 20 minutos, se agrega una concentración inicial de 30 mg N-NH 4+ /L a la suspensión, activándose la adición de NaOH (0,05 N) para compensar los H + producidos en la reacción biológica. Posteriormente, se inyecta la disolución que contiene el compuesto inhibitorio. Cada 15 ó 20 minutos se adicionan concentraciones crecientes del compuesto evaluado hasta alcanzar la máxima concentración, cuidando que el volumen total adicionado no incremente el volumen del licor de mezcla en más de un 10%. Después de 20 min. de la adición de la última concentración de la disolución tóxica, se adiciona 5 mg ATU/L que inhibe completamente la etapa amonio oxidante con lo que se verifica si existe alguna interferencia por la adición del compuesto o disolución evaluada. Transcurridos 20 minutos de la adición de ATU, se finaliza el ensayo. 2.2.3.- Cálculo de las actividades 2.2.3.1.- Cálculo de la actividad amonio oxidante El cálculo de la velocidad específica amonio oxidante para la biomasa se determina mediante la ecuación (2.1). [] )1.2( *2 60*14** 0 Ecuación SSV Mmm AO ATU − = Donde; AO m 0 m ATU M SSV : Corresponde a la actividad amonio oxidante (mg N-NH 4+ /g SSV·h) : Corresponde a la velocidad máxima de adición de agente titulante obtenida después de adicionar sustrato (mL/min) : Corresponde a la velocidad de adición del agente titulante después de adicionar ATU (mL/min) : Molaridad de la solución alcalina : Concentración de sólidos en suspensión volátiles en el ensayo (g/L) 2.2.3.2.- Cálculo del porcentaje de inhibición El porcentaje de inhibición se determina a partir de la relación entre la velocidad de adición de la disolución titulante medida en presencia de una determinada Capítulo 2 2-10 concentración de la sustancia evaluada y la medida después de la adición del sustrato, que corresponde a la actividad amonio oxidante (ecuación 2.2). )2.2(100*(%) 0 0 Ecuación mm mm I ATU i i − − = Donde; I i (%) m o m i m ATU : Porcentaje de inhibición relativo a la concentración C i de la sustancia : Velocidad máxima de adición de agente titulante después de la adición de NH 4 Cl (mL/min) : Velocidad de adición del agente titulante en presencia de una determinada concentración de la sustancia a evaluar (mL/min) : Velocidad de adición de agente titulante después de adicionar ATU (mL/min) Si después de la adición de ATU el sistema adiciona disolución ácida, en vez de solución alcalina, la velocidad de adición podría considerarse negativa lo que indica una completa inhibición de la biomasa amonio oxidante. La velocidad de flujo (m 0 ), se calcula por regresión lineal sobre la serie de volumen de disolución titulante adicionada en el tiempo. La velocidad de flujo relativa a la sustancia inhibitoria evaluada (m i ) se calcula determinando la velocidad de adición de agente titulante obtenida en el intervalo comprendido entre dos adiciones sucesivas de solución inhibitoria. 2.2.3.3.- Estimación de la concentración inhibitorio en un 50% (IC 50 ). La estimación de la concentración de un compuesto inhibitorio que reduce la actividad en un 50% (IC 50 ) se obtiene empleando la ecuación 2.3. Esta ecuación modeliza la inhibición del proceso en función de la concentración del compuesto inhibitorio. Donde: )3.2(100* 1 1 1(%) Ecuación k C I s i i             + −= Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-11 I i (%) C i S, k : Porcentaje de inhibición relativo a la concentración de la sustancia inhibitoria : Concentración de la sustancia inhibitoria (g/L) : número de las diferentes concentraciones de la sustancia inhibitoria estudiadas en el ensayo : Parámetros de correlación entre la inhibición y la concentración de sustancia inhibitoria. La ecuación 2.3 se obtiene a partir de la ecuación empírica descrita por Kroiss et al . (1992) que considera que la inhibición es de tipo no competitivo y que la concentración de sustrato es significativamente mayor que la constante de afinidad por el sustrato. La representación gráfica del IC 50 , se obtiene ajustando los porcentajes de inhibición obtenidos experimentalmente para cada concentración de sustancia inhibitoria a la función sigmoidal que describe la ecuación 2.3 por medio de un programa informático ( Table Curve) . La Figura 2.2, muestra ejemplos de curvas descritas por la función sigmoidal que ajustan los valores experimentales de porcentaje de inhibición y concentración de compuesto inhibitorio obtenidos en varios ensayos. El valor de IC 50 se obtiene por interpolación en la curva correspondiente a una inhibición del 50%. 110 100 compuesto (g/L) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) Figura 2.2: Representación de la función sigmoidal obtenida a partir de los porcentajes de inhibición para cada concentración de compuesto inhibitorio. Capítulo 2 2-18 Ajustando los valores experimentales de porcentaje de inhibición y concentración de compuesto inhibitorio a la función sigmoidal, descrita en la ecuación 2.3, empleando el programa Table Curve se obtuvieron los perfiles de las curvas que permiten obtener los valores de IC 50 para cada substancia inhibitoria que se muestran en la Figura 2.6. El resumen de los resultados de los IC 50 para los tres compuestos evaluados se muestran en la Tabla 2.4. Tabla 2.4: Resumen estadístico de la repetibilidad de los experimentos realizados en la Universidad de Santiago de Compostela (USC). Parámetros ATU Anilina Sulfato de plata* IC 50 (mg/L) Des.Stand (mg//L) CV (%) Nº muestras 0,36 0,01 3,98 3 4,58 0,81 17,77 3 9,37 1,58 16,91 3 (*) expresado en mg Ag + /L Al comparar los resultados obtenidos con valores de la bibliografía (Tabla 2.5) se observa una variabilidad de los valores de IC 50 obtenidos dependiendo de la biomasa o la técnica empleada. El valor de IC 50 que se obtuvo para la ATU de 0,4 mg/L es menor que el citado por Ficara y Rozzi (2001) de 1,4 mg ATU/L, a pesar de que ambos se determinaron con el mismo sistema experimental y bajo condiciones de trabajo similares. Esta diferencia puede ser atribuida a la biomasa empleada que presentó una diferente respuesta al efecto de la ATU. Ensayos de inhibición realizados por otros autores muestran que la concentración de ATU para reducir la actividad amonio oxidante en un 50% varía entre 1,4 y 8,2 mg/L. Benes et al. (2002) sugieren utilizar una concentración de 10 mg/L para inhibir completamente la etapa amonio oxidante. El valor de IC 50 para la anilina que se obtuvo en estos ensayos de 4,6 mg/L fue similar al obtenido por Ficara y Rozzi (2001) de 4,9 mg anilina/L, diferente al de 1,2 mg/L obtenido por König (1998). El valor de IC 50 para el sulfato de plata fue de 9,4 mg Ag + /L con una pequeña desviación de 1,6%. Si se compara con otras referencias de valores de inhibición por metales pesados se observa que los valores de inhibición varían dependiendo del tipo de metal (Amor et al. 1999). Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-19 Tabla 2.5: Valores toxicidad de ATU y anilina sobre biomasa nitrificante Compuesto Concentración (mg/L) Inhibición (%) Referencia ATU 1,35-1,50 1,4 2 5 8,2 13,8 10 50 100 100 50 100 100 Hayes et al. (1998) Ficara and Rozzi(2001) Jönsson et al. (2001) Wood et al. (1981) König (1998) Ginestet et al. (1998) Benes et al . (2002) Anilina 1,2 4,9 König (1998) Ficara and Rozzi (2001) En los ensayos realizados el intervalo del coeficiente de variación (CV) para la estimación del IC 50 fue entre 4 y 18%, lo que indica una aceptable repetibilidad. Ficara y Rozzi (2001) obtuvo valores de CV para ATU y anilina de 11 y 38%, respectivamente, utilizando ANITA. Los ensayos de inhibición realizados por Kong et al. (1993) utilizando respirometría generaron valores del CV de 3-22%. La obtención de datos de inhibición/toxicidad con muy amplios coeficientes de variación es habitual a la hora de determinar dicho parámetro en microorganismos y en otros seres vivos. Whitehouse et al. (1996) encontraron variaciones del 33% en un 75% de los ensayos realizados con organismos invertebrados como Daphnia magna y Aca rtia tonsa y la especie de algas Skeketonema costatum y McFeters et al. (1983) obtuvieron coeficientes de variación entre el 1 y el 116% al evaluar 32 compuestos químicos en Microtox. Los ensayos de inhibición se realizaron con una concentración de biomasa entre 1,1 y 1,85 g SSV/L, de manera que la relación concentración de compuesto inhibitorio/concentración de biomasa no varió significativamente. Rozzi et al. (1999b) mencionan que debido a la alta sensibilidad de los sistemas de titulación la relación compuesto inhibitorio/biomasa es un parámetro importante que puede afectar a la respuesta de la actividad. Referente a la naturaleza de los tres compuestos evaluados, la aliltourea (ATU) y la anilina son sustancias químicas caracterizadas por ser inhibidores específicos de la nitrificación (McCarty, 1999). La aliltiourea se caracteriza por ser un compuesto difícilmente biodegradable que inhibe la etapa amonio oxidante, mientras que la anilina inhibe ambas etapas de la nitrificación. Xiong et al. (1998) indicaron que la biodegradabilidad de la anilina puede tener lugar después de un corto período de aclimatación de la biomasa, aunque otros autores mencionan que la anilina puede biodegradarse rápidamente bajo condiciones de salinidad relativamente bajas (0,85% NaCl (p/v)) y pH neutro (Oneill et al . 2000). Por tanto, las aguas residuales que contengan elevadas concentración de sal y un pH bajo pueden limitar la degradación de la anilina. Capítulo 2 2-20 El sulfato de plata, se empleó en estos ensayos debido que su efecto inhibitorio sobre la actividad nitrificante es menor que la ATU y la anilina, permitiendo estudiar su efecto inhibitorio en un mayor rango de concentraciones. Una vez determinados los valores de IC 50 para los tres compuestos (ATU, anilina y sulfato de plata), estos se compararon con los obtenidos por los demás participantes en los ensayos de intercalibración. En la Figura 2.7 se muestran los estudios comparativos entre los laboratorios participantes incluyendo nuestros resultados. Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-21 0,0 0,4 0,8 1,2 Imp Bulgaro Poli MI Uni TN Uni CA CCR USC Imp Valmadrera Uni MI Uni Bas (a) IC 50 (mg ATU/L) 0 2 4 6 8 10 Imp Bulgaro Poli MI Uni TN Uni CA CCR USC Imp Valmadrera Uni MI Uni Bas (b) IC 50 (mg Anilina/L) 0 8 16 24 32 Imp Bulgaro Poli MI Uni TN Uni CA CCR USC Imp V almadrera Uni MI Uni Bas (c) IC 50 (mg Ag/L) Figura 2.7: Resultados de IC 50 obtenidos por los diferentes laboratorios participantes (a) ATU, (B) anilina y (c) sulfato de plata, medida como concentración de ión Ag + . Capítulo 2 2-22 Los valores promedios de IC 50 obtenidos por los 9 laboratorios participantes para los tres compuestos evaluados fueron de 0,41±0,27 mg ATU/L, 4,97±1,76 mg Anilina/L y 11,83±6,23 mg Ag + /L. Al comparar los resultados de IC 50 obtenidos por cada laboratorio se observó una adecuada repetibilidad entre los ensayos ya que para cada compuesto evaluado las desviaciones estándar que se obtuvieron se encontraron en un rango de intervalo entre 0,02-0,19 mg/L para la ATU; 0,13-1,62 mg/L para la anilina y 0,5-5,4 mg/L para el sulfato de plata. La metodología de adiciones sucesivas del compuesto a evaluar se presentó como una alternativa a la ISO 9509 descrita en el Standard Methods (1997). Con objeto de comparar los resultados obtenidos por ambas metodologías se realizaron ensayos con los tres compuestos inhibitorios siguiendo la metodología mencionada en el Standard Methods en la que participaron 5 laboratorios. Los valores de IC 50 promedio obtenidos se muestran en la Figura 2.8 y se comparan con los obtenidos empleando la metodología propuesta por el Politécnico de Milán. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 ATU Anilina Ag+ Compuestos inhibitorios IC 50 (mg/L) Figura 2.8: Valores de IC 50 promedio de los laboratorios participantes para ATU, anilina y sulfato de plata empleando la metodología: () descrita en el Standard Methods y la () propuesta por el Politécnico de Milán. Se observa que los valores medios de IC 50 obtenidos por las dos metodologías aplicadas a cada compuesto son muy similares. Para el sulfato de plata se observa una mayor diferencia entre el IC 50 obtenido por la metodología propuesta en el Politécnico de Milán de 11,83 mg Ag + /L y la descrita en el Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-23 Standard Methods de 6,43 mg Ag + /L. Esta variabilidad puede ser atribuida a los altos valores de la desviación estándar. En la tabla 2.6 se muestran los valores obtenidos para cada compuesto inhibitorio analizado, empleando la metodología propuesta en el Standard Methods. Tabla 2.6: Resumen estadístico de la repetibilidad de los experimentos realizados por seis universidades participantes empleando la metodología descrita en el Standard Methods. Parámetros ATU Anilina Sulfato de plata (Ag + ) IC 50 (mg/L) Des.Stand (mg//L) CV (%) 0,29 0,24 83 5,47 1,98 36 6,43 3,64 97 2.3.3.- Ensayos de inhibición sobre biopelículas. En este apartado se analiza el efecto inhibitorio sobre la actividad amonio oxidante de biopelículas de dos compuestos (NaCl y extracto de quebracho) que se encuentran habitualmente presentes en las aguas residuales de la industria de curtidos. Debido a las características intrínsecas de los ensayos de actividad se verificó en primer lugar la posible interferencia que podrían presentar estos dos compuestos agregando ATU. En la Figura 2.9 se observa el comportamiento encontrado en los ensayos en el que se puede constatar que no existe adición de disolución alcalina tras la adición de ATU, lo que indicaría una inhibición de la primera etapa de la nitrificación. La adición del compuesto inhibitorio a ensayar no causó posteriormente ningún consumo de disolución alcalina, descartándose que estos compuestos interfieran en la determinación de la actividad, siendo posible la aplicación de la estrategia de adiciones sucesivas en un único ensayo. Capítulo 2 2-24 0 1 2 3 4 5 6 0 20406080100120 Tiempo (min) Disolución titulante adicionada (mL) ATU Compuesto tóxico AO Figura 2.9: Curva típica de titulación en la que se evalúa la posible interferencia de un compuesto en el ensayo de inhibición. Los ensayos de toxicidad se realizaron empleando 5 concentraciones crecientes de cada compuesto. Un experimento típico es presentado en la Figura 2.10, en la cual se observa un cambio de pendiente en la velocidad de consumo con el incremento de concentración de tóxico, siendo en promedio la duración de cada prueba de 3 horas, por lo que se puede descartar el efecto de aclimatación de la biomasa a estos compuestos durante los ensayos. 0 1 2 3 4 5 6 7 0 153045607590105 Tiempo (min) Disolución titulante adicionada (mL) Adición de compuesto inhibitorio Figura 2.10: Curva típica de titulación de un ensayo de inhibición adicionando cinco concentraciones de compuesto inhibitorio Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-25 En la Figura 2.11 se muestran los resultados extraídos a partir de las curvas de titulación que han sido obtenidas para las dos sustancias evaluadas en este trabajo. Todos los ensayos se han realizado por sextuplicado y cada uno indica el valor medio de la actividad conjuntamente con la desviación standard observada. La Figura 2.11a, muestra los resultados obtenidos en los ensayos con cloruro de sodio en los que se evaluaron concentraciones entre 0,6 y 12 g/L. Se encontró un IC 50 de 10,2 g NaCl/L, la desviación estándar no excedió de un 12% para cada concentración evaluada, lo que implica una buena reproducibilidad de los datos. De los resultados obtenidos se puede ver que el efecto inhibitorio sobre este tipo de biomasa es en algunos casos comparable con resultados obtenidos por otros autores empleando biomasa en suspensión. Campos et al. (2001) obtuvieron un 25% de la actividad máxima a concentraciones de NaCl de 8,7 g/L en un sistema de lodos activos nitrificante. Hunik et al. (1992) obtuvieron valores similares. Sin embargo, Panswad y Anan (1999) obtuvieron un 55% de inhibición en la nitrificación a una concentración de 20 g NaCl/L. El efecto de taninos vegetales sobre la actividad amonio oxidante se evaluó empleando extracto de quebracho (Figura 2.11b). La máxima concentración evaluada correspondió a 10 g/L. El valor de IC 50 obtenido para el extracto de quebracho fue de 8,5 g/L. La desviación standard que se obtuvo para estos ensayos dependió de la concentración aplicada fluctuando entre 5 y 22%, siendo mayor a partir de una concentración de 4 g/L. Esta mayor desviación es probablemente debido a la estructura compleja de este compuesto (anillo flavonoide) y a la formación de espuma a partir de los 4 g/L de extracto de quebracho en el vaso de reacción. Los valores obtenidos son más altos que los obtenidos por López-Fiuza et al. (2002) mediante ensayos realizados por el método respirométrico sobre biomasa nitrificante en suspensión, lo que indica que la biomasa inmovilizada presenta una mayor resistencia que la biomasa en suspensión. Los resultados experimentales indican que la metodología de adiciones sucesivas ha servido para determinar la actividad nitrificante, no solo en muestras de biomasa en suspensión, sino también en biopelícula. Capítulo 2 2-26 0 25 50 75 100 02468101214 NaCl (g/L) Inhibición (%) (a) 0 25 50 75 100 024681012 Extracto de quebracho (g/L) Inhibición (%) (b) Figura 2.11: Efecto inhibitorio de las formulaciones de (a) NaCl y (b) extracto de quebracho sobre la actividad nitrificante de una biopelícula. Las barras representan las desviaciones observadas a partir de los ensayos por sextuplicado. Empleo de un sistema de titulación pH-stat 2-27 0.1 110 100 NaCl (g/L) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) (a) 0.1 110 100 Ext. quebracho (g/L) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) (b) Figura 2.12: Determinación de IC 50 sobre la actividad amonio oxidante para (a) cloruro de sodio y (b) extracto de quebracho. Capítulo 3 3-2 3.1.- INTRODUCCIÓN La incorporación de una sonda de oxígeno a la unidad pH-stat (ANITA) ha dado origen a un nuevo sistema denominado MARTINA (Multiple Analyte Reprogrammable Titration Analyser). Este nuevo equipo permite realizar el seguimiento de diversas reacciones en las que exista consumo de oxígeno, caracterizándose las dos etapas del proceso de nitrificación: oxidación de amonio a nitrito por medio de bacterias amonio oxidante y la oxidación de nitrito a nitrato llevada a cabo por bacterias nitrito oxidantes. Además, las medidas de oxígeno disuelto realizadas en paralelo permiten minimizar y/o eliminar algunas interferencias que afectaban a la unidad pH-stat (Ficara et al . 2000, Yuan y Bogaert, 2001). Frecuentemente la cinética global del proceso de nitrificación, la oxidación directa de amonio a nitrato, se estudia simplemente considerando los parámetros cinéticos de la primera etapa del proceso, oxidación de amonio a nitrito. Esta aproximación es aceptable si la velocidad de oxidación de amonio es apreciablemente menor que la oxidación de nitrito, no existiendo por tanto acumulación de nitrito. Sin embargo, hay casos en que la cinética de la segunda etapa de la nitrificación es más lenta que la oxidación del amonio, acumulándose nitrito (Alleman, 1985; Nowak et al . 1995). Diversos investigadores han realizado determinaciones de los parámetros cinéticos de bacterias nitrificantes mediante ensayos respirométricos discontinuos o continuos (Ćech et al . 1984; Chudoba et al . 1985; Drtil et al. 1993; Surmacz- Gorska et al . 1996, Young y Bogaert, 2001). Los datos obtenidos de la variación de la concentración con el tiempo han sido linealizados e integrados ajustándolos al modelo de Monod (Corman y Pave, 1983; Grady et al. 1999). MARTINA se ha utilizado en ensayos de titulación que combinan las medidas de pH y oxígeno disuelto (Rozzi et al . 2000). La velocidad máxima de oxidación (V max ) y la constante de afinidad (Ks) de las bacterias amonio oxidantes y nitrito oxidantes se han determinado utilizando los datos de consumo de disolución titulante y los correspondientes coeficientes estequiométricos para cada una de las etapas de la nitrificación. Una ventaja de estos sistemas de titulación, con respecto a los métodos respirométricos convencionales, es la posibilidad de realizar ensayos en condiciones aerobias y anóxicas. En estos sistemas de titulación es posible realizar ensayos de inhibición empleando diversos compuestos, evaluando además el efecto sobre cada etapa de la nitrificación. Völsch et al . (1990) propusieron un método respirométrico para determinar la velocidad de degradación del amonio y del nitrito utilizando inhibidores específicos para determinar las actividades de cada etapa de la nitrificación. Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-3 El NaClO 3 es un inhibidor de la oxidación de NO 2- a NO 3- a concentraciones en torno a 20 mM (Belser y Mays, 1980; Hynes y Knowles, 1983), presentando también efectos negativos sobre la oxidación de amonio. Su efecto inhibitorio sobre las bacterias amonio oxidantes es detectable solo después de 30 minutos debido a la conversión del NaClO 3 a NaClO 2 (Hynes y Knowlws, 1983). La ATU es un inhibidor selectivo de la oxidación de amonio por bacterias amonio oxidante y se utiliza a concentraciones en torno a 5 mg/L (Wood et al . 1981). Los objetivos planteados en este capitulo son: 1. Comparar los valores de la actividad amonio oxidante obtenidos mediante medidas de pH y oxígeno disuelto para dos muestras de lodo nitrificante, procedentes de dos plantas diferentes. 2. Estimación de los parámetros cinéticos a partir de los perfiles de concentración de las especies nitrogenadas obtenidos de los datos experimentales empleando el modelo de Monod, para diferentes muestras de lodo (nitrificante, amonio oxidante y desnitrificante). 3. Determinación del efecto inhibitorio sobre bacterias amonio y nitrito oxidantes de sales de cromo y una mezcla de NaCl y Na 2 SO 4 , mediante las dos unidades de titulación. 3.2.- MATERIALES Y MÉTODOS 3.2.1.- Equipo pH-DO-stat y procedimiento utilizado. El sistema MARTINA (Multiple Analyte Reprogrammable Titration Analyser) combina medidas de pH y de concentración de oxígeno disuelto, este sistema ha sido desarrollado por el Politecnico di Milano en cooperación con SPES (Fabriano, AN, Italia). En la Figura 3.1, se observa una fotografía del sistema, donde se aprecia la posibilidad de la conexión de diversos actuadores o sondas. (a) (b) Figura 3.1: Fotografía del instrumento (a) frontal y (b) posterior Capítulo 3 3-4 El equipo básico de titulación está constituido por un recipiente donde tiene lugar la reacción, sondas de oxígeno y temperatura, electrodo de pH, agitador magnético y un sistema automático de adición de las disoluciones titulantes correspondientes (NaOH o HCl para la corrección de pH y H 2 O 2 para mantener el oxígeno disuelto en la concentración deseada) (Figura 3.2). Todas las sondas se encuentran conectadas a un ordenador donde se recopilan los datos experimentales. Reactor MARTINA NaOH 1 2 3 4 Sistema de adquisición de datos H 2 O 2 Figura 3.2: Esquema de la unidad de titulación, sondas: (1) potencial redox, (2) temperatura (Pt100), (3) pH y (4) oxígeno. Adicionalmente es posible además conectar a un canal del sistema una sonda de medida del potencial de oxidación-reducción, que facilita información adicional de las condiciones en las que se realiza el ensayo, ya que esta medida no proporciona información directa sobre la actividad. La adquisición de los datos se realiza transformando la señal eléctrica analógica obtenida en la prueba en una señal digital, mediante el paso de esta señal a través de un convertidor analógico digital. Éste envía la señal transformada al ordenador donde un programa diseñado especialmente almacena las medidas (Figura 3.3). Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-5 Señal convertida ENSAYO ACTUADORES ADQUISICION DE DATOS ENSAYO PC Programa Comando actuador Algoritmo de control INICIO DEL COMANDO Figura 3.3: Funcionamiento del sistema controlado automáticamente Dependiendo del ensayo a realizar, el sistema puede operar en dos modalidades diferentes fijando o bien un límite superior (Figura 3.4a) o inferior (Figura 3.4b) respecto a los valores de los parámetros de referencia pre-establecidos (pH y O.D). La elección de la modalidad de operación viene dada por las características de la reacción que tendrá lugar. Figura 3.4: Esquema de las modalidades de control respecto al valor de referencia (a) desviación superior, control de pH mediante adición de ácido (b) desviación inferior al control de pH y de O.D, ajuste del pH mediante la adición de álcali y control de oxígeno mediante la adición de H 2 O 2 . Los ensayos de nitrificación se realizaron en la modalidad en la que se fija un valor límite superior de pH y O 2 (Figura 3.4b). Esto significa que si el valor de la señal es menor que el valor de referencia preestablecido se adiciona disolución titulante, con objeto de alcanzar el valor de referencia. Previa a la utilización del instrumento se realizaron las calibraciones de las diferentes sondas utilizadas. El procedimiento de calibración del pH-metro y de la Capítulo 3 3-6 sonda de temperatura se realiza una vez por semana y se controla diariamente según se describe en el apartado 2.2.1 del capitulo 2. La calibración de la sonda de oxígeno disuelto y las electroválvulas se describen a continuación:  Sonda de O.D.: Se calibra con aire saturado con agua, colocándola próxima a la superficie de un recipiente con agua.  Electroválvulas: se mide el volumen de la disolución de titulante adicionada en un determinado tiempo de apertura y cierre de la válvula para cuantificar la cantidad media adicionada. Después de realizar pruebas de calibración en las dos electroválvulas para las disoluciones titulantes a diferentes tiempos de apertura y de cierre se establecieron los siguientes tiempos. La electroválvula que adiciona NaOH se programó con un tiempo de apertura de 1 segundo y de cierre 1,5 segundos y para la electroválvula que adiciona H 2 O 2 el tiempo de apertura se fijo en 2 segundos y el tiempo de cierre en 3 segundos. Dichas actuaciones garantizan que durante los períodos de cierre de las electroválvulas se produzca la correcta mezcla de los reactivos en el reactor y la disociación completa del H 2 O 2 , antes de que se realice una nueva adición de este reactivo. La sonda de potencial redox no necesitó una calibración especial ya que la señal generada corresponde a una señal eléctrica proporcionada por la sonda y el interés de la medida reside más en las variaciones de dicho potencial redox que en su valor absoluto. 3.2.2.- Ensayos realizados 3.2.2.1.- Determinación de actividades nitrificantes de lodos activados Las muestras de lodo utilizados en los ensayos nitrificación se obtuvieron en dos EDARs: Planta de tratamiento de aguas residuales industriales San Giuliano (Milano) y planta de tratamiento de aguas residuales municipales Peschiera del Garda (Verona). Las muestras de fango de la planta de Peschiera del Garda (Verona) se almacenaron a 4°C en condiciones anóxicas durante un periodo inferior a un mes. Con objeto de restablecer la actividad del lodo nitrificante después del período de almacenamiento se dejaron las muestras a temperatura ambiente en aireación durante toda la noche, y se adicionó una concentración de 10 mg N- NH 4+ /L. Antes de la realización de las pruebas, las muestras de lodo se lavaron con la correspondiente disolución descrita anteriormente y de acuerdo al procedimiento descrito por Ficara y Rozzi (2001). Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-7 Una muestra de lodo nitrificante (0,25-0,5 L), en fase de respiración endógena se transfirió al vaso del sistema donde se mantuvo agitada (Figura 3.5). Los experimentos se desarrollaron a una temperatura de 25±1°C. La concentración de biomasa presente en el reactor se fijo alrededor de 2-3 g SST/L. Los valores de pH eq y la concentración de oxígeno disuelto en el licor de mezcla establecidos como referencia se determinaron previamente; en este caso se fijaron un pH eq de 8,3, valor medio característico del lodo, y una concentración de oxígeno disuelto de 8,3 mg O 2 /L, para asegurar la realización de los ensayos en condiciones de saturación. Figura 3.5: Fotografía de un ensayo en condiciones aerobias Se realizaron ensayos conjuntos de actividad amonio y nitrito oxidante, en los que tras 30 minutos sin sustrato se adicionó nitrito para obtener una concentración inicial de 10 mg N-NO 2- /L y después de un intervalo de tiempo se adicionó amonio para obtener en el reactor una concentración inicial de 3,5 mg N-NH 4+ /L. Se escogieron las concentraciones de sustrato mencionadas anteriormente, ya que los lodos empleados en los ensayos tenían constantes de afinidad bajas, y la adición de mayores concentraciones de sustrato incrementaría el tiempo del ensayo. 3.2.2.2.- Determinación de actividades amonio oxidantes de biomasa proveniente de un reactor SHARON. Se determinó la actividad amonio oxidante de muestras de lodos tomadas de un reactor SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite) de 5 L alimentado con influente sintético (1 g N-NH 4+ /L y 20 g NaCl/L) que operó Capítulo 3 3-8 con un tiempo de retención hidráulico (TRH) de 1 día, 34ºC, pH 7,0-7,5 y una concentración de oxígeno 3 mg O 2 /L (Mosquera-Corral et al ., 2005). Los ensayos se desarrollaron agregando cada 20 minutos los correspondientes volúmenes de sustrato (cloruro de amonio) hasta alcanzar la máxima concentración deseada. Se adicionaron secuencialmente concentraciones de 5, 10, 30, 50, 80, 120 y 170 mg N-NH 4+ /L. Los experimentos se desarrollaron a 30ºC con una concentración de biomasa comprendida entre 2 y 3 g SSV/L. 3.2.2.3.- Estimación de parámetros cinéticos de una biomasa desnitrificante autótrofa. Para los ensayos de actividad desnitrificante se utilizaron muestras de biomasa desnitrificante autótrofa. El proceso de desnitrificación autótrofa se ajusta a la reacción descrita en la ecuación 3.1. La biomasa oxida tiosulfato para reducir el NO X- a N 2 gas. Las principales características de operación del reactor del que se extrajeron las muestras están descritas por Kleerebezem y Méndez (2002). 0,84S 2 O 32- + NO 3- + 0,35CO 2 + 0,09HCO 3- + 0,09NH 4+ + 0,43H 2 O ↔ 1,7SO 42- + 0,5N 2 + 0,09C 5 H 7 O 2 N + 0,069H + (Ecuación 3.1) Antes de la realización de los ensayos, las muestras de biomasa desnitrificante se lavaron con la disolución de lavado indicada anteriormente y se gasificó con N 2 durante 20 min para asegurar condiciones anóxicas (Figura 3.6). Los ensayos se realizaron a 30ºC con un volumen total de 0,25 L y una concentración de biomasa menor a 1 g SSV/L. Se empleó la sonda de potencial redox para verificar las condicones anóxicas del sistema. Figura 3.6: Ensayo en condiciones anóxicas, empleando MARTINA. Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-9 Se determinaron los parámetros cinéticos de la biomasa desnitrificante autótrofa realizando en duplicado 3 ensayos, en los que se emplearon diferentes concentraciones y relaciones de N-NO 3- y S-S 2 O 32- (Tabla 3.1). Tabla 3.1. Experimentos desarrollados con las muestras de biomasa de desnitrificación autótrofa. Concentración de sustrato en el licor de mezcla Ensayos mg N-NO 3- /L mg S-S 2 O 32- /L g SSV/L pH eq Temperatura (ºC) A B* C * 3,2 10 100 12 100 10 0,5-0,8 0,5-0,8 0,5-0,8 8,0 8,0 8,0 30 30 30 (*) Los ensayos B y C se realizaron con muestras de biomasa desnitrificante almacenadas por un periodo dos semanas. En el ensayo A, se determinó la velocidad específica máxima de consumo de sustrato utilizando la relación estequiométrica S/N de 3,7 encontrada experimentalmente por Oh et al ., (2000). Los valores de la constante de afinidad (Ks) para cada sustrato se obtuvieron a partir de los ensayos B (10 mg N-NO 3- /L y 100 mg S-S 2 O 32- /L) y C (100 mg N-NO 3- /L y 10 mg S-S 2 O 32- /L), en los que el sustrato limitante será el nitrato para el ensayo B y el sulfato en el ensayo C. Los ensayos para la determinación de los parámetros cinéticos finalizaron cuando el sustrato limitante se ha consumido, que corresponde a la disminución de la pendiente a valores correspondientes a condiciones endógenas. 3.2.2.4.- Ensayos de inhibición sobre biomasa nitrificante Los ensayos de inhibición se realizaron con el lodo proveniente de la planta industrial de tratamiento de San Giuliano (Italia). Se determinó el efecto inhibitorio de dos formulaciones comúnmente empleadas y presentes en las aguas residuales de curtiembres (sales de cromo y una mezcla de cloruro de sodio y sulfato de sodio) sobre las bacterias amonio y nitrito oxidante. Las sales de cromo utilizadas se caracterizan por ser sales autobasificantes, constituidas principalmente por sulfato de cromo, correspondiendo un 27-33% (p/v) de Cr 2 O 3 . Para estudiar el efecto de las sales de cloruro de sodio y sulfato de sodio se utilizó una relación Cl - /SO 42- de 1,67 que corresponde a la que típicamente Capítulo 3 3-10 presentan las aguas residuales tratadas en la planta real de donde proviene el lodo. Para poder determinar el efecto inhibitorio que presentan estas formulaciones sobre las bacterias amonio y nitrito oxidantes, se realizaron ensayos en paralelo utilizando dos reactores de manera que los datos obtenidos se complementen (Figura 3.7). En el reactor 1, se adicionó como sustrato inicialmente una disolución de NaNO 2 para alcanzar una concentración en el vial de 12 mg N-NO 2- /L, transcurridos 30 minutos se añadió una disolución de NH 4 Cl para alcanzar una concentración de 10 mg N-NH 4+ /L y posteriormente cada 20 minutos se adicionaron diferentes volúmenes de disolución inhibitoria a evaluar hasta alcanzar la máxima deseada, 8 g/L para las sales de cromo y 0,04 mol/L de la mezcla de sales de NaCl y Na 2 SO 4 . A partir de la curva de consumo de disolución alcalina se obtuvo solo el efecto inhibitorio de los compuestos sobre la actividad amonio oxidante en la que se produce H + . Con la curva de adición de H 2 O 2 se determinó el efecto inhibitorio sobre las actividades amonio oxidante y nitrito oxidante. Reactor-1 Reactor-2 Figura 3.7: Esquema de la metodología aplicada para los ensayos de inhibición con sales de cromo y la mezcla de sales En el reactor 2, inicialmente solo se adicionó una disolución de nitrito de sodio hasta alcanzar en el vial una concentración de 24 mg N-NO 2- /L como sustrato, posteriormente se agregó con intervalos de 20 minutos la misma concentración de compuesto inhibitorio adicionada al reactor 1, de acuerdo a la metodología descrita en el capitulo 2 (apartado 2.2.2.2). Por tanto, en el reactor 2, solo se determinó el efecto inhibitorio de las soluciones sobre la actividad nitrito oxidante a partir de la curva de consumo de H 2 O 2, ya que por las características de la reacción no hay variación de pH . 12 mg N-NO 2- / L 10 mg N-H 4+ /L 24 mg N-NO 2- / L MARTINA Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-11 Al final de cada ensayo con objeto de verificar una posible interferencia del compuesto se adicionaron 10 mg ATU/L con objeto de inhibir las bacterias amonio oxidantes y 10 mg ClO 3- /L para inhibir tanto las bacterias amonio y nitrito oxidantes. 3.2.3.- Cálculo de parámetros cinéticos 3.2.3.1.- Biomasa nitrificante Para estimar los parámetros cinéticos, velocidad máxima y constante de afinidad de biomasa nitrificante, se emplearon los datos obtenidos experimentalmente de la cantidad de disolución titulante adicionada en función del tiempo. A partir de estos datos con los respectivos coeficientes estequiométricos se obtuvieron los perfiles de sustrato consumido. Se determinaron además, las correspondientes velocidades de consumo en función de la concentración y se ajustaron los datos de velocidad de consumo frente a la concentración de sustrato usando la ecuación de Monod (ecuación 3.2), estimándose de esta forma parámetros como V max y Ks utilizando como criterio de aceptación el método del mínimos cuadrados (Ficara et al. 2000).         + = S maxesp KS S VV * (Ecuación 3.2) donde; V esp : velocidad específica de consumo de sustrato (g sustrato/g SSV·h) V max : velocidad máxima de consumo de sustrato (g sustrato/g SSV·h) K S : constante de afinidad por el sustrato (g sustrato/L) S: concentración de sustrato (g sustrato/L) 3.2.3.2.- Biomasa desnitrificante autótrofa Los parámetros cinéticos de la biomasa desnitrificante autótrofa se determinaron utilizando una función doble de Monod (ecuación 3.3), que tiene en cuenta el efecto de la concentración de cada uno de los dos sustratos empleados (NO 3- y S 2 O 32- ).         +         + = SSS S SNN N esp KS S KS S VV * max (Ecuación 3.3) donde; V esp : velocidad específica de consumo de sustrato (g sustrato/g SSV·h) Capítulo 3 3-18 El lodo de la EDAR municipal muestra una actividad amonio oxidante (1,7-1,5 mg N-NH 4+ /(g SST·h)) mayor que la nitrito oxidante (1 mg N-NO 2- /(g SST·h)), indicando que en condiciones de sobrecarga se podría tener acumulación de nitrito. En cambio, para las muestras de lodo industrial la etapa limitante es la amonio oxidante, ya que los valores de actividad amonio oxidante (2,4 y 2,5 mg N-NH 4+ /(g SST·h)) son menores a la actividad nitrito oxidante 2,8 mg N-NO 2- /(g SST·h) por lo que no debería haber problemas de acumulación de nitrito. 3.3.2.- Parámetros cinéticos de biomasa del reactor SHARON El proceso SHARON es un sistema amonio oxidante de alta carga en que se logra una nitrificación parcial de amonio a nitrito (Van Dongen et al . 2000). La estimación de los parámetros cinéticos, V max y Ks para las muestras de lodo amonio oxidante del sistema SHARON se resumen en la tabla 3.4. Tabla 3.4: Parámetros cinéticos de biomasa amonio oxidante V max (mg N-NH 4+ /(g SST·h)) Ks (mg N-NH 4+ /L) NaOH H 2 O 2 15,7±4,2 11,8±6,9 15,4±0,1 17,7±10,4 Al comparar los valores de los parámetros cinéticos obtenidos, se observa que la actividad amonio oxidante obtenida a partir de los datos con NaOH presenta una variación de un 25% superior a la actividad estimada con H 2 O 2 , siendo la variación de Ks de un 13% superior a la obtenida de los datos de titulación con NaOH. Los valores de Ks obtenidos para este tipo de biomasa son bastante más altos que los obtenidos con las muestras de biomasa nitrificante de las EDARs. 3.3.3.- Parámetros cinéticos de una biomasa desnitrificante autótrofa Los ensayos realizados fijando una relación S/N en 3,7 similar a la estequiométrica, han servido para determinar la velocidad específica máxima de las bacterias desnitrificantes autótrofas, determinándose una actividad de 51,04 ± 9,24 mg N-NO 3- /(g SSV·h). Las constantes de afinidad para el nitrato y el tiosulfato se obtuvieron a partir de dos ensayos B y C, con una concentración para el ensayo B de 10 mg N-NO 3- /L y 100 mg S S 2 O 32- /L y para el ensayo C una concentración de 10 mg S S 2 O 32- /L y 100 mg N-NO 3- /L. En la Tabla 3.5 se indican los resultados de los parámetros cinéticos obtenidos en los ensayos, donde K SS indica el coeficiente de afinidad del S-S 2 O 32- y K SN el coeficiente de afinidad por N-NO 3- . Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-19 Tabla 3.5: Resumen de los parámetros cinéticos para biomasa desnitrificante autótrofa. Ensayo Parámetros cinéticos A Vmax [mg N-NO 3- /(g SSV·h)] 51,04 ± 9,24 B Vmax [mg N-NO 3- /(g SSV·h)] Ks [mg N-NO 3- /L] 25,5 ± 0,6 1,30 ± 0,14 C Vmax [mg S-S 2 O 32- /(g SSV·h)] Ks [mg S-S 2 O 32- /L] 150,2 ± 32,6 32,4 ± 3,04 Al comparar los valores de la constante de afinidad del nitrógeno (K SN ) obtenidos en los ensayos con valores de la bibliografía se observa que se encuentran dentro del orden obtenido por otros autores con ensayos realizados en discontinuo. Claus et al. (1985), Kim y Son (2000), Oh et al. (2000) obtuvieron valores de K SN de 0,2 mg N-NO 3- /L, 7 mg N-NO 3- /L y entre 3-10 mg N-NO 3- /L, respectivamente. No se ha podido comparar los valores de la constante de afinidad del azufre K SS al no haberse encontrado esta información en la bibliografía. 3.3.4.- Ensayos de inhibición Se realizaron ensayos de inhibición con lodo industrial utilizando sales de cromo y mezcla de sales de cloruro de amonio y sulfato de amonio que habitualmente se encuentran en las aguas de curtidurías. La Figura 3.11 muestra los valores promedios obtenidos de los ensayos de inhibición con sales de cromo sobre las bacterias amonio y nitrito oxidantes. En ella se puede observar el efecto inhibitorio sobre las dos poblaciones de biomasa nitrificante para una determinada concentración de sales de cromo. Los ensayos se realizaron monitorizando la variación de oxígeno disuelto, por tanto, los resultados se obtuvieron a partir de los volúmenes consumidos de la disolución de peróxido de hidrógeno, ya que el cambio de pH producto de la adición de una disolución de álcali hace que las sales de cromo precipiten en forma de Cr(OH) 3 . Capítulo 3 3-20 0 25 50 75 100 12468 Sales de cromo (g/L) Inhibición (%) Figura 3.11: Porcentajes de inhibición para diferentes concentraciones de sales de cromo para las bacterias() amonio oxidante y () nitrito oxidante. La Figura 3.12 muestra los valores de IC 50 (concentración del compuesto evaluado que reduce la actividad en un 50%) calculados a partir de la función sigmoidal (ecuación 2.3) descrita en el capítulo anterior, que relaciona el porcentaje de inhibición con la concentración de sustancia inhibidora. Se obtuvo un valor de IC 50 para las bacterias nitrito oxidante de 7,45 g sales de cromo/L equivalentes a 1,3 mol Cr +3 /L y para las bacterias amonio oxidante de 4,46 g sales de cromo/L equivalentes a 0,8 mol Cr +3 /L. Los resultados muestran que para la misma concentración de sales de cromo el porcentaje de inhibición es mayor en las bacterias amonio oxidante con respecto a las bacterias nitrito oxidante, lo que concuerda con lo mencionado por diversos autores que las bacterias amonio oxidante muchas veces son más sensibles al efecto de diversos compuestos tóxicos que las bacterias nitrito oxidante. El IC 50 de la biomasa heterótrofa no se determinó, ya que para una concentración de 8 g sales de cromo/L solo se alcanzó un 45% inhibición. Esto estaría en línea con la información dada por diferentes autores que indican que las bacterias heterótrofas son más resistentes al efecto inhibitorio de diferentes compuestos que las bacteria nitrificantes (Blum y Speece, 1991; Kong et al. 1996; Tendaj et al . 1992). Sin embargo, otros autores opinan lo contrario, como una regla general mencionan que las bacterias nitrificantes no son más sensibles a sustancias tóxicas que otras bacterias presentes en las plantas de tratamiento (Henze et al . 1996). Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-21 0.1 110 100 sales de cromo (g/L) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) (a) 0.1 110 100 sales de cromo (g/L) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) (b) Figura 3.12: Determinación del IC 50 sobre la biomasa (a) amonio oxidante y (b) nitrito oxidante empleando sales de cromo Capítulo 3 3-22 Se obtuvieron valores de IC 50 para la biomasa nitrificante y de “IC 45 ” para las bacterias heterótrofas más elevados que las concentraciones de cromo total presente en las aguas residuales de la corriente de curtidos y recurtidos, ya que estas corrientes presentan concentraciones en torno a 0,015-4,9 g cromo total/L (Rivela et al. 2003). Orhon et al. (2000) encontraron valores de 136 mg cromo total/L en el agua residual de un estanque de homogenización previa a ser sometida a un pretratamiento físico-químico que tiene por objeto la precipitación del cromo. Hay que tener en cuenta que la corriente de curtido suele mezclarse con las otras corrientes que se generan en el proceso, lo que hace disminuir la concentración de estos compuestos, y por tanto disminuye cualquier posible efecto sobre el lodo. Mezcla de sales de cloruro de sodio y sulfato de sodio Al igual que para las sales de cromo, se determinó el IC 50 para las bacterias nitrito y amonio oxidante, mediante el ajuste del porcentaje de inhibición y la concentración de la mezcla de sales empleando la función sigmoidal. En la Figura 3.13, se observan los porcentajes de inhibición para diferentes concentraciones de sales. Se obtuvo un IC 50 para las bacterias amonio oxidante y nitrito oxidante de 0,011±0,004 mol/L y 0,029±0,007 mol/L, respectivamente. Una concentración de 0,04 mol/L causó una reducción del 35% de la actividad heterótrofa, por tanto, no se observó un efecto significativo de la mezcla de sales sobre la biomasa heterótrofa. Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-23 00.02 0.04 0.06 0.08 0.1 me zc la s a les (m ol/L ) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) (a) 00.02 0.04 0.06 0.08 0.1 m ezc la sa le s (m o l/L ) 0 25 50 75 100 Inhibición (%) (b) Figura 3.13: Estimación IC 50 empleando cloruro de sodio y sulfato de sodio en una relación Cl - /SO 42- de 1,67 sobre (a) biomasa amonio oxidante y (b) nitrito oxidante. Capítulo 3 3-24 Diferentes autores han obtenido reducciones entre un 20-50% de la eficacia de oxidación de amonio a concentraciones de NaCl similares al agua de mar. Hunik et al. (1992) realizaron ensayos de inhibición empleando sales como NaCl y KCl, observándose para cada sal utilizada el mismo efecto de inhibitorio sobre la biomasa. La similitud de los resultados puede deberse al efecto de la presión osmótica a altas concentraciones de sales y no a la composición de la sal. Al analizar los coeficientes de variación para cada concentración de la mezcla de sales se observa una aceptable repetibilidad (Tabla 3.6). En efecto, al analizar el CV del IC 50 para la serie de 5 muestras se observa que los coeficientes de variación obtenidos en estos ensayos fueron similares a los obtenidos por Ficara y Rozzi (2001) en ensayos de inhibición empleando un sistema de titulación. Tabla 3.6: Resumen del porcentaje de inhibición sobre bacterias amonio y nitrito oxidantes de una serie de 5 ensayos. Amonio oxidante Nitrito oxidante Concentración mezcla de sales (x 10 -3 mol/L) Promedio Desv. Stand CV (%) Promedio Desv. Stand CV (%) 1,3 2,67 5,33 10,7 21,3 42,7 22 33 37 44 59 75 8,9 10,6 11,2 10,5 4,4 6,0 39,6 32,4 30,2 23,8 7,4 8,0 16,6 20,4 25,4 34,2 47,3 55,4 8,8 5,8 6,7 8,3 5,4 3,5 52,8 28,3 26,3 24,3 11,5 6,3 IC 50 (mol/L) 0,011 0,004 35,4 0.029 0,007 24,8 Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-25 3.4.- CONCLUSIONES Al comparar la operación de los sistemas MARTINA y ANITA, la diferencia fundamental es que en el primer sistema es posible caracterizar reacciones en las cuales existe variación de pH o de la concentración de oxígeno disuelto, obteniendo mediciones en forma independiente. El sistema MARTINA puede ser usado para determinar simultáneamente los parámetros cinéticos de las dos etapas de la nitrificación, usando para ello los datos sobre el gasto de la disolución de peróxido de hidrógeno, consumido por ambas reacciones, y el gasto de NaOH, consumido por la etapa amonio oxidante. Al comparar los resultados de las actividades amonio oxidante obtenidos de los datos usando las dos unidades de titulación, éstos muestran una muy buena reproducibilidad. El sistema de titulación ha sido satisfactoriamente usado para determinar parámetros cinéticos como V max y Ks para cada etapa de la nitrificación, proporcionando una mayor información acerca de las características de la biomasa. Para el lodo industrial V max de 2,4-2,5 mg N-NH 4+ /(g SST·h) en la etapa amonio oxidante y 2,8 mg N-NO 2- /(g SST·h) nitrito oxidante, respectivamente. Para el lodo municipal V max de 1,5-1,7 mg N-NH 4+ /(/(g SST·h) en la etapa amonio oxidante y 1 mg N-NO 2- /(g SST·h) nitrito oxidante respectivamente. Valores de Ks para la etapa amonio oxidante 0,34-0,36 mg N-NH 4+ /L y nitrito oxidante 0,4 mg N-NO 2- /L del lodo industrial y para el lodo municipal para la etapa amonio oxidante 0,48-0,68 mg N-NH 4+ /L y nitrito oxidante 0,23 mg N-NO 2- /L, indicando los valores de Ks una buena afinidad por el sustrato. Con pequeñas modificaciones a MARTINA es posible caracterizar la biomasa de algunas reacciones de desnitrificación. El sistema se destaca por ser un método de alta posibilidad de adaptación para ajustar las condiciones de los ensayos, ya que es posible detectar pequeños cambios de pH. En la desnitrificación autótrofa, 0,069 moles de H + son producidos por mol de N-NO 3- . Los resultados experimentales confirman la aplicabilidad de este sistema de titulación para realizar ensayos de inhibición, especialmente determinar el efecto inhibitorio sobre los dos grupos de bacterias nitrificantes y sobre biomasa heterótrofa. Los valores de IC 50 obtenidos para las sales de cromo 4,46 g/L para las bacterias amonio oxidante y 7,45 g/L para las bacterias nitrito oxidante y para la mezcla de sales 0,011 mol/L para las bacterias amonio oxidante y 0,029 mol/L para las bacterias nitrito oxidante, estos valores se encuentran dentro del intervalo de las concentraciones habituales de estos compuestos presentes en las aguas residuales de curtiembres. Capítulo 3 3-26 Comparando la metodología empleada en estos ensayos con otros métodos convencionales, esta técnica es rápida, requiere una carga analítica mínima, los ensayos tanto de determinación de parámetros cinéticos como de inhibición son realizados en un período no superior a 2-3 horas y sus resultados son confiables. Además, dependiendo de las características de la reacción a seguir o de las propiedades de los compuestos inhibitorios es posible emplear de manera complementaria o independiente la sonda de pH o de oxigeno. Empleo de un sistema de titulación pH-DO-stat 3-27 3.5.- REFERENCIAS Alleman J.E. (1985) Elevated nitrite occurrence in biological wastewater treatment systems. Water Science Technology, 17(2-3), 409-419. Andreottola G., Canziani R. and Cossu R. (1990) Rimozione Biologica del Nutrienti dalle acque di scarico. Published by Istituto per l’Ambiente, Milano, pp. 59. Belser L.W. and Mays E.L. (1980) Specific inhibition of nitrite oxidation by chlorate and its use in assessing nitrification in soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 39, 505-510. Blum D.J.W. and Speece R.E. (1991) A database of chemical toxicity to environmental bacteria and its use in interspecies comparisons and correlations. Res. J. Water Pollut. Control Fed., 63, 198-207. Ćech J.S., Chudoba J. and Grau P. (1984) Determination of kinetic constants of activated sludge microorganisms. Water Science Technology, 17, 259-272. Claus G. and Kutzner H. J. (1985). 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Determinar la eficiencia de un sistema de lodos activos predesnitrificante para la eliminación de materia orgánica y compuestos de nitrógeno. 3. Estudiar la fiabilidad de sistemas de lodos activos de mezcla completa operados en semicontinuo en los que se alternan a lo largo del tiempo ciclos aerobios y ciclos anóxicos. Se evaluaron en cada etapa la influencia de diversas condiciones de operación, carga, relación DQO A /N t para diferentes fuentes de carbono externa y Tiempos de Retención de Sólidos (TRS) sobre la eliminación de nitrógeno. 4.2.- MATERIALES Y MÉTODOS 4.2.1.- Métodos analíticos  Fase líquida Determinación de la Demanda Química de Oxígeno (DQO) La DQO es una medida que indica el nivel de contaminación que presenta el agua residual debido a la materia orgánica y compuestos oxidables. Se define como la cantidad de oxígeno (mg O 2 /L) necesaria para la oxidación de toda la materia orgánica y compuestos oxidables contenidos en un volumen de muestra. La medición de este parámetro se ha llevado a cabo utilizando una modificación del método semi-micro 5220-D descrito en el Standard Methods (Soto et al . 1987, 1989). La muestra se centrifuga a 10.000 r.p.m. durante 10 min. y posteriormente es filtrada a través de un filtro Gelman de 0,45 µm de tamaño de poro para determinar la DQO soluble. La DQO total se determina sobre la muestra bruta. En ambos casos se hace la digestión de la muestra con una mezcla de dicromato de potásico y ácido sulfúrico durante dos horas a 150ºC, utilizando sulfato de plata como catalizador y sulfato de mercurio para eliminar posibles interferencias del ión cloruro, oxidándose la mayor parte de la materia orgánica contenida en la muestra. Tras esta fase de digestión, el dicromato en exceso se valora con sulfato amónico ferroso (FAS) utilizando como indicador ferroína. La DQO se calcula teniendo en cuenta un blanco o referencia, realizado con el mismo procedimiento sobre la muestra con agua destilada. El FAS se valora cada vez Evaluación de alternativas para la eliminación biológica de amonio y nitrógeno 4-5 que se realiza un grupo de determinaciones, puesto que su concentración sufre variaciones con el tiempo. Determinación de carbono total, inorgánico, y orgánico total La concentración de Carbono Total (CT), Carbono Inorgánico (CI) y Carbono Orgánico Total (COT) de muestras de agua filtrada se cuantificaron mediante un analizador de carbono Shimadzu modelo TOC-5000. Para la determinación del CT la muestra se inyecta en el equipo donde se calienta a 680 ºC y el CO 2 producido se transporta mediante un gas portador (150 mL/min. de aire de alta pureza). El gas pasa a través de un deshumidificador donde se enfría y se elimina la humedad, posteriormente pasa a través de una columna en la que eventualmente se eliminan los compuestos halogenados para evitar daños en la celda de detección. El gas se introduce en un detector de infrarrojos no dispersivo (NDIR) donde se cuantifica el dióxido de carbono. El CT esta compuesto por COT y CI. Para determinar el CI, la muestra se acidifica con una pequeña cantidad de ácido clorhídrico para desprender todo el CI en forma de dióxido de carbono que es arrastrado por el gas hacia el detector NDIR. La concentración de CI de la muestra se determina de forma similar a la de CT. El CI proviene principalmente de los carbonatos y bicarbonatos presentes. CT = 0,025· Área + 7,251 R2 = 0,999 CI = 0,023·Área + 3,059 R2 = 0,999 0 200 400 600 800 1000 0 10000 20000 30000 40000 Área m g C/l Figura 4.2: Calibrado de CT (z) y CI ({). Volumen de inyección = 25 µL. Las líneas corresponden a los ajustes lineales de cada calibrado. La cantidad de carbono total orgánico (COT) viene dada por la diferencia entre la determinación del carbono total (CT) y del CI. Las curvas de calibrado correspondientes al CT y al CI se presentan en Figura 4.2. Capítulo 4 4-6 Determinación de nitrito y nitrato por Electroforesis capilar Las concentraciones de nitrito y nitrato se determinan individualmente mediante electroforesis capilar (Waters Capillary Ion Analiyzer). Para la realización de los análisis las muestras se filtran previamente a través de filtros de membrana Gelman Suport 0,45µm. Se utilizó el método propuesto por Vilas-Cruz et al. (1994) en el que se emplea como electrolito sulfato de sodio (0,01 mol/L) añadiendo asimismo 50 mL/L de modificador electro-osmótico CIA-PakTM OFM Anión BT (Waters). La muestra se hace migrar por medio de la aplicación de una corriente eléctrica a través de un capilar a 25 ºC. Dependiendo de la carga y del tipo de ión, el tiempo de migración es diferente. El capilar empleado es de sílice fundida con una cubierta de poliimida, con una longitud de 60 cm y un diámetro interno de 75 µm. La detección de los iones se realiza mediante la lectura de la absorbancia en la región UV/Vis, en este caso a una longitud de onda de 214 nm empleando una lámpara de UV y aplicando un voltaje de 20 kV. La medida se realiza contrastando el área del pico de la muestra con el área de un patrón intercalado entre las muestras a analizar que contiene 100 mg/L de nitrito y nitrato (Figura 4.3). Figura 4.3: Electroforegrama obtenido por el método del Sulfato. Nitrato por espectrofotometría Esta medida se realiza siguiendo el método 4500-NO 3- -B propuesto en Standard Methods (APHA, 1998) midiendo la absorbancia de la muestra a 220 y 275 nm Evaluación de alternativas para la eliminación biológica de amonio y nitrógeno 4-7 en un espectrofotómetro Shimadzu UV-120. La medida se realiza frente a un patrón en el intervalo de concentración entre 0 y 17 mg NO 3- /L (Figura 4.4) NO 3 - = 18,612·Abs + 0,154 R 2 = 0,9996 0 4 8 12 16 20 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Abs (220-275 nm) NO 3 - (mg/L) Figura 4.4: Calibrado del nitrato (método espectrofotométrico). Nitrito por espectrofotometría Se determina utilizando el método basado en la reacción de este ión con ácido sulfanílico y N-(1 naftil)-etilendiamina dihidrocloruro, tal y como se propone en la norma 4500-NO 2- -B del Standard Methods (APHA, 1998). La medida de absorbancia se realiza a 543 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV-120. El calibrado se prepara con concentraciones entre 0 y 0,24 mg N-NO 2- /L (Figura 4.5). N-NO 2 - = 0,2604·Abs + 0,0018 R 2 = 0,9984 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Abs (543 nm) N-NO 2 - ( m g /L ) Figura 4.5: Calibrado del nitrito (Método espectrofotométrico). Capítulo 4 4-8 Determinación de amonio El método utilizado para la determinación de la concentración de amonio, es el del fenol-hipoclorito que se determina por espectrofotometría a 635 nm. Este método fue descrito por Wheatherburn (1967) y se basa en la reacción del NH 3 en un medio alcalino con fenol para producir una coloración azul (azul indofenol) en presencia de un agente fuertemente oxidante como puede ser el hipoclorito. La reacción puede realizarse a temperatura ambiente o puede ser acelerada calentándola a 35ºC o agregando como catalizador nitroprusiato de sodio. La presencia de iones calcio y magnesio puede causar problemas de precipitación durante el análisis, por lo que para prevenir esto se agrega una disolución de AEDTA al 5%. Muestras que presenten turbidez o color pueden llevar a resultados erróneos. Para eliminar la turbidez la muestra debe ser filtrada previamente a la realización del análisis, mientras que el color puede interferir siempre que sea absorbido en el mismo rango fotométrico. Previo a la medición de las muestras se realiza un calibrado con una solución patrón conocida en el intervalo entre 0-1 mg N-NH 4+ /L (Figura 4.6). El calibrado debe ser realizado cada vez que se reemplace un reactivo. N-NH 4+ = 1,388·Abs - 0,011 R 2 = 0,9965 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Abs (635 nm) N-NH 4+ (mg/L) Figura 4.6: Calibrado de amonio (método colorimétrico del fenol-hipoclorito). Determinación de pH Se realiza mediante un electrodo WTW Sentix 41-3 conectado a un medidor WTW pH/mV Multiline P4. Previamente a las medidas se realiza un calibrado usando disoluciones tampón WTW de pH 4 y 7 a 20 ºC. La sensibilidad del medidor es ±1 mV de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Evaluación de alternativas para la eliminación biológica de amonio y nitrógeno 4-9 Oxígeno Disuelto Se determina mediante un electrodo selectivo de oxígeno del tipo polarográfico WTW Cell Ox 325 conectado a un medidor de oxígeno WTW Multiline P4. Previa a su utilización el electrodo se calibra en la celda Oxi Cal–SL, de acuerdo a las especificaciones del fabricante.  Composición y actividad de la biomasa Sólidos en suspensión volátiles. Los sólidos totales incluyen los sólidos en suspensión y en disolución. Para su determinación se utilizan los métodos 2540-D y 2540-E, descritos en el Standard Methods (APHA, 1998). Los sólidos suspendidos totales (SST) se determinan por filtración de un volumen de muestra conocida sobre filtros de fibra de vidrio WHATMAN, de 4,7 cm GF/C (diámetro de poro de 1,2 µm) y posterior secado a 103-105ºC. La diferencia de pesos de los filtros antes y después de la filtración permite calcular el contenido de SST. Los sólidos suspendidos volátiles (SSV) se determinan a partir de la pérdida de peso tras la calcinación de la muestra a 550ºC durante 15 minutos. Determinación de la actividad de la microbiana La velocidad de consumo de oxígeno de la biomasa en presencia de diferentes sustratos: amonio, nitrito o fuentes de carbono orgánico se determinó utilizando un respirómetro (Modelo YSI 5300). En la Figura 4.7 se muestra un esquema del equipo experimental empleado. Este sistema está dotado de dos electrodos de oxígeno (sensores polarográficos de oxígeno, modelo Yellow Spring Instrument, YSI 5331, EEUU) que se encajan herméticamente en una celda dotada de un agitador magnético que contiene la muestra y esta termostatizada por medio de un baño termorregulado (25 ºC para este experimento). Las lecturas de los electrodos se envían a un amplificador, por medio de una tarjeta de adquisición (PCL-818L, PC-Lab Card). Los datos del porcentaje de saturación de oxígeno disuelto de la celda se envían al ordenador, siendo las medidas tratadas por un programa de adquisición de datos (LabTech Notebook & Control versión 10.12) Capítulo 4 4-10 Figura 4.7: Esquema del equipo empleado en la medición del consumo de oxígeno. 1 Celda de medición; 2 Soporte del electrodo; 3 Electrodo de oxígeno; 4 Camisa; 5 Amplificador; 6 Tarjeta de adquisición de datos PCL-818L; 7 Ordenador; 8 Agitador magnético; 9 Termostato. El método de determinación consta de los siguientes pasos: a) Se toma la muestra del reactor (aproximadamente un volumen que permita tener una concentración de biomasa en el vial de 1 g SSV/L) se resuspende la biomasa con una disolución tampón fosfato (Tabla 4.1) a pH 7,0 hasta alcanzar un volumen de 10 mL y se airea durante media hora. A continuación se introduce el electrodo de oxígeno en la celda, intentando evitar la formación de burbujas de aire en el interior de la celda. b) Se inyectan 0,5 mL de bicarbonato de sodio 50 mM a través de una pequeña ranura en el soporte del electrodo, se espera hasta que se estabilice la temperatura. Se inyecta un volumen exacto de sustrato inferior a 0,1 mL, siendo los sustrato generalmente adicionados sulfato de amonio o ácido acético para la determinación de la actividad amonio oxidante o heterótrofa, respectivamente. c) La concentración microbiana se expresa en términos de g SSV/L, que se determina mediante el protocolo descrito en el punto anterior. La actividad específica se obtiene relacionando la velocidad de consumo de oxigeno y la concentración de biomasa. El valor de las actividades específicas puede ser expresado en función del oxígeno consumido y también como miligramos de nitrógeno oxidado por unidad de tiempo y de biomasa, mediante los correspondientes coeficientes estequiométricos (4,57 g O 2 /g N-NH 4+ ). 4 2 3 1 5 6 7 8 9 Evaluación de alternativas para la eliminación biológica de amonio y nitrógeno 4-11 Tabla 4.1. Composición del tampón fosfato Componente Concentración (g/L) K 2 HPO 4 3,97 KH 2 PO 4 3,309 MgSO 4 *7H 2 O 1,84 MgCl 2 *10H 2 O 1,52 NaCl 0,8 Solución Trazas* 5 mL/L * según Vishniac y Santer (1957) En la Figura 4.8 se presenta un respirograma típico obtenido para estos ensayos. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 500 1000 1500 2000 Tiempo (seg) % saturación de oxígeno Consumo endógeno Consumo de sustrato Figura 4.8: Respirograma típico obtenido por el respirómetro. Determinación de la actividad desnitrificante Para medir la actividad desnitrificante de la biomasa, se ha empleado una metodología basada en el seguimiento de la desaparición de N-NO 3- en el tiempo, como resultado de la reducción de N-NO 3- a N 2 por los microorganismos desnitrificantes. Los ensayos se realizan en viales de 60 mL con un volumen ocupado por el líquido de 50 mL. El procedimiento incluye los siguientes pasos: a) Se introduce una cantidad de agua de dilución previamente calculada con una disolución tampón de fosfato 0,025 M fijando el pH en 7,5±0,2. b) Se adiciona un volumen de lodos desnitrificantes tal que la concentración final de SSV en el vial este en el rango deseado (1,5 – 3,0 g SSV/L). c) Se borbotea N 2 durante 10 minutos hasta obtener condiciones anóxicas. Capítulo 4 4-12 d) Se introduce el vial en un sistema termostatizado hasta alcanzar el equilibrio térmico a 37 ºC, manteniendo los viales agitados. e) Se adiciona las cantidades adecuadas de disoluciones concentradas de NaNO 3 y NaOOCCH 3 para alcanzar la concentración deseada de N-NO 3- y C- CH 3 COO - y la correspondiente relación C/N. f) Se sella el vial, se sigue la desaparición de nitrato con el tiempo. El valor de la actividad desnitrificante se calcula representando la concentración de nitrato presente en el vial frente al tiempo. De este gráfico se determina la pendiente máxima de desaparición de nitrato y este valor se divide por la concentración total de biomasa presente en el vial. 4.2.2.- Sistemas experimentales El plan de trabajo de este capítulo se desarrolló en tres etapas diferentes en los que se utilizan una unidad de lodos activos nitrificante, una unidad de predesnitrificación y unidades de lodos activos semicontinuos. A continuación se describen los equipos utilizados en cada una de las tres etapas: Etapa nitrificante Durante esta etapa se estudia la eficacia de la nitrificación y de la eliminación de materia orgánica en una unidad de lodos activos de laboratorio analóga a la utilizada en la planta de tratamientos de aguas residuales industriales. Efluente A g ua residual 1 2 3 4 Figura 4.9: Esquema experimental de la unidad nitrificante de lodos activos: 1.- tanque de aireación, 2.- decantador, 3.- bomba mamut, 4.- agitador. Evaluación de alternativas para la eliminación biológica de amonio y nitrógeno 4-13 En la Figura 4.9 se muestra el esquema de lodos activos utilizado durante la primera etapa experimental que comprende los primeros 90 días de operación. El sistema de lodos activos consta de un tanque de aireación de 2 L y un sedimentador externo que retiene la biomasa que se recircula al reactor mediante una bomba mamut. El sistema es alimentado por medio de una bomba peristáltica y el efluente se obtiene desde el sedimentador por rebose. El reactor es aireado por medio de una bomba de pecera, lográndose una mezcla adecuada mediante un agitador de paleta. Etapa desnitrificante Con objeto de evaluar la desnitrificación de las aguas industriales, se utilizó un sistema predesnitrificante en la segunda etapa experimental que comprende los días 90-230 de operación. El equipo utilizado consta de la unidad de lodos activos aerobio empleada durante la etapa anterior, y una cámara anóxica de 1 L que se acopló a la primera (Figura 4.10). La alimentación se almacena en un depósito de donde se suministra mediante una bomba peristáltica a la cámara anóxica, poniéndose en contacto con el lodo recirculado del sedimentador secundario. El licor de mezcla de esta cámara fluye hacia la cámara aerobia y de ahí al sedimentador, siendo por tanto un sistema clásico de predesnitrificación de lodos activos. Efluente Agua Residual + metanol 12 3 Recirculación lodo Figura 4.10: Esquema experimental de la unidad de predesnitrificación: 1.- tanque de aireación, 2.- decantador, 3.- cámara anóxica.