Persistencia de pesticidas en el suelo

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO FACULTAD DE FARMACIA DEPARTAMENTO DE BRCJ-1ATOLOGIA-TOXICOLOGIA Y ANALISIS QUIMICO APLICAOO PERSISTENCIA DE PESTICIDAS EN EL SUELO Memoria presentada en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago de Compostela para optar al Grado de Doctor en Farmacia, por ROSALIA DIAZ GONZALEZ D. JESUS SIMAL LOZANO, Catedrático de Análisis Químico Aplicado y Bromatología-Toxicología de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Santiago, CERTIFICA: Que la tesis doctoral Persistencia de pesti cidas en el suelo~ ha sido realizada bajo su dirección en el Departamento de Bromatología-Toxicología y Análisis Químico Aplic~ do de la Facultad de F rmacia de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, abril de mil novecientos setenta y seis. - --~----------------·~--~-- -- - Deseo expresar mi agradecimiento a Zas profesores D. Jesus SimaZ Lozano~ por su dirección y a D. Aniceto Charro Arias y D. e.Tosé Ma Creus VidaZ por su continua orientación y colaboración. También a mis compañeros~ su inestimable ayuda. A Z Departamento de Edafo logia de Za Fac;u Ztad de Farmacia~ dirigido por eZ Frof. Dr. D. Fra~ cisco Guitián Ojea y aZ Frof. D. Francisco Diaz-Fierros Viqueira~ por Za colaboración pre~ tada en eZ análisis de Za estructura~ textura y composición deZ suelo. Asi mismo hago constar mi gratitud aZ Ministerio de Educación y Ciencia por Za Beca de Formación de Personal Investigador. 1 N D 1 C E 1.- INTRODUCCION 1.1.- Procedencia de los pesticidas del suelo y cosecha. l. 2.- Factores que afectan a la persistencia 1.3.- Control de resíduos 1.4.- Plan de trabajo 2.- ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS 2.1.- Extracción 2.2.- Purificación 2.3.- Técnicas de análisis 2.3.1.- Cromatografía de gases 2.3.1.1.- Técnicas de confirmación en GLC 2.3.2.- Actividad anticolinesterasica 2.3.2.1.- Técnicas de identificación de pesticidas inhibidores de la colinesterasa. 2.4.- Análisis cuantitativo 2.4.1.- Métodos de cálculos en GLC 2.4.2.- Métodos de cálculo de la actividad anticolinesterásica. 3.- PARTE EXPERIMENTAL 3.1.- Aparatos y Material 3.2.- Reactivos 3.3.- Muestras 3.3.1.- Toma de muestras 3.3.2.- Conservación de las muestras 3.3.3.- Localización y descripción de la parcela de terreno objeto de estudio. 3.3.4.- Preparación de las muestras. 3.4.- Organigrama del proceso analítico seguido 3.5.- Extracción: elección de solvente y estudio de la recuperación 3.5.1.- Maceración con acetonitrilo. 3.5.1.1.- Muestras con humedad superior al 75% 3.5.1.2.- Muestras con humedad inferior al 75% 3.5.1.3.- Suelos 3.5.2.- Reparto en acetonitril/eter de petroleo 3.5.3.- Reparto en acetonitrilo/diclorometano 3.6.- Purificación de extracto etereo 3.6.1.- Estudio de la recuperación en el proceso de purificación 3.6.2.- Normalización del florisil 3.7.- Análisis cualitativo del extracto etereo 3.7.1.- .Condjciones de trabajo en cromatografía de gases. 3.7.2.- Detectores empleados. 3.7.3.- Preparación del detector termoiónico 3.7.4.- Compración de respuesta entre los diferen tes detectores 3.7.5.- Introducción de las muestras 3.7.6.- Criterios de identificación y confirmación 3.7.6,1.- Tiempos de retención relativos al Aldrín 3.7.6.2.- Empleo de la columna de florisil 3.7.6.3.- Uso de distintas columnas en GLC 3.7.6.4.- Uso de los detectores FID, ECD y CKlTD 3.7.6.5.- Valores "p" 3.7.6.6.- Radjaciones ultravioleta 3.7.6.7.- Pruebas químicas. 3.7.6.7.a.- Confirmaciñ de pp'DDT 3.7.6.7.b.- Confirmación de pp'DDE 3.7.6.7.c.- Confirmación de Aldrín 3.7.6.7.d.- Confirmación de Dieldrín 3.7.6.7.e.- Confirmación de PCB's 3. 7. 7.- Interpretación cualitativa de los croma t ogr~ mas. 3.8.- Análisis cuantitativo del extracto etereo 3.8.1.- Influencia del volumen inyectado 3.8.2.- Zona de respuesta lineal del detector 3.8.3.- Otros factores: temperatura, envejecimiento de la columna 3.8.4.- Interferencias 3.8.5.- Límites de detección: absolutos y relativos a a las muestras. a) Influencia de la estructura del pesticida: Las características físico-químicas del pe~ ticida como posibles factores que afectan su ad sorción por el suelo, han sido consideradas por diversos autores. REINOLDS y METCALF (1), comprueban que el desplazamiento del pesticida en el terreno está directamente relacionado con la solubilidad en agua del mismo, lo que está de acuerdo con Ja influencia generalmente aceptada de la cantidad de agua que atraviesa el suelo. EDWARDS (2), estudia la influencia de la presión de vapor, de gran importancia sobre todo cuando el pesticida se encuentra en capas su perficiales. LAMBERT (3), encuentra una relación entre la adsorción del pesticida por el suelo y el nú mero de puntos que en la molficula pueden formar enlaces de hidrógeno. HARRIS (4), en un estudio comparativo de movilidades, indica que fistas son mínimas en el caso de los organoclorados y máxima en Jos herbicidas derivados del ácido benzoico. BOBBY L. GLAS (5), llega a la conclusión -16- de que los pesticidas electronegativos pueden ser susceptibles de degradación en condiciones anaerobias, mediante captura de electrones proporc.ionados por la materia orgánica con el i6n ferroso como intermediario. b) Naturaleza del suelo: Todas las características del pesticida que puedan intervenir en su adsorción hay que considerarlas en interacción con el suelo. Así la conclusión hallada por LAMBERT (3), solo se cumple cuando el principal adsorbente es la ma teria orgánica. El suelo influye en la absorción producida por las cosechas. Como cabe esperar es más rápida en suelos arenosos que en suelos con al to contenido en materia orgánica, y así lo pudo demostrar HARRIS y SAND (6). Esta relación no se puede generalizar en toda clase de pesticidas aun dentro de una estructura similar. BEALLY y NASH (7) señalan que la absorci6n de heptaclor, dieldrín y DDT por el maiz y alfalfa está relacionada con el conte nido en materia orgánica y en cambio, ésta no afecta a la del Endrín que por otra parte está -17- influenciada por el contenjdo en limo. WOLCOTT(8), demuestra que la materia orgánica es el componente que más afecta a la fijación, existiend~ una estrecha relación entre és ta y la interacción coloide orgánico - coloide mineral (9) . Esta influencia de la materia orgánica está sujeta a variaciones (10) originadas en unos casos por la humedad que se interpone entre la superficie de adsorción y el pesticida hidrófobo, así como por el grado de humidificación del material orgánico con el cual crece la adsorción de los pesticidas no iónicos. En estudios hechos con pesticidas iónicos (ácidos 2-4 D, ácidos clorofénicos ... ), FARMEP. (11), encuentra que los catiónicos son fuertemente adsorbidos por suelos con alto contenido en arcilla y materia orgánica ya que éstas contienen más cargas negativas que positivas, sie~ do sin embargo la fijación más débil para pesti cidas aniónicos. Hay un factor del suelo, el pH, que en relación con la constante de disociación del pesticida, puede determinar el que se produzca la fijación mediante enlaces de hidrógeno, lo que -lB- pudo comprobar FARMER (11) en estudios llevados a cabo con herbicidas. Sin embargo para pesticidas con estructura química más estable corno son los organoclorados Lindano y Aldrín, anteriormente, SWANSON y col. (12) y BOLLEN y col. (13), no encontraron relaci6n entre el pH y la adsorci6n. e) Vegetaci6n: La absorci6n por las plantas además de co~ siderarla corno una vía eventual de desaparici6n del pesticida cuyo destino era el suelo, hemos de considerarla tarnbi€n, por su transcendencia cuando se trata de alimentos, corno vía de penetraci6n de pesticidas a ellas dirigidos. Sea cual fuere la intenci6n de la aplicaci6n ha de tenerse en cuenta que en relaci6n con la distribuci6n del pesticida en la planta CARO (14) en un trabajo hecho con rnaiz, llega a la conclusi6n de que las hojas superiores tienen menor cantidad de pesticida, no solo porque son las mas j6venes y estuvieron menos tiempo expuestas sino tarnbien debido a que la densidad de vapor del pesticida es superior en las capas de aire cercanas al suelo y se presenta una acu -19- mulación del mismo en esta zona. Esta circunstan cia es necesario considerarla ya que, si bien el contenido en pesticida de las plantas procede en parte de la absorción por las raices, el principal mecanismo de acumulación es debido al depósi to de pesticida en fase vapor (15). Pero no solo las plantas absorben el pesticida del suelo sino que incluso pueden modificar el que se encuentra en él, como demostró BURGE (16), al comprobar la descomposición anaerobia del DDT, que en el suelo pasa a DDD, por los com ponentes volátiles de la alfalfa. d) Fauna: WAY y SCOPER (17), han estudiado la influen cia de la fauna en la persistencia de los pesticidas y ha comprobado que ésta se puede aumentar si previamente el terreno es tratado para exterminar la fauna; es un hecho que a menor escala se pudiera dar realmente por el constante uso de estos productos. GISH (18) ha estudiado la relación entre el contenido de pesticidas organoclorados en tie . - rras y diferentes organismos: caracol, lombriz, escarabajo, ......... y ha observado que es supe- -20- rior en los invertebrados que en la tierra (a e~ cepción del escarabajo). La cantidad de insecticida en lombrices, varía directamente con la can tidad en suelo independientemente del cultivo o tipo de suelo. Tambien se ha observado que ciertos pestici das producen un aumento de población en algunas especies de invertebrados por ir dirigida su efectividad no a estos sino a los de depredadores (19) . 3.- CONTROLES DE RESIDUOS: Con el fín de paliar o soslayar estos riesgos inherentes a la utilización de pesticidas, se han propuesto diferentes medidas a tomar: uti lización de pesticidas menos persisten~es y uso de sustancias que reduzcan sus niveles. En este último sentido se ha comprobado la eficacia del carbón que permite el cultivo en suelos altamente contaminados (20). Son muy útiles tambien los estudios sobre degradación de pesticidas tanto en suelos como en plantas y la determinación de sus productos -21- de transformación, a veces de una toxicidad mil veces menor, como en el caso del lindano que da lugar al pentacloro ciclohexano, pero en ocasiones de toxicidad todavía mayor. Investigaciones de este tipo han permitido conocer la vida media de cada pesticida y con ello determinar el tiempo aconsejable que ha de transcurrir entre la aplicación y la recogida de la cosecha según que haya sido aplicado al suelo o a la planta. Es, sin embargo, este valor un dato de poca significación, ya que la persistencia y metabolismo de cualquier pesticida, como se ha señalado, depende de una gran variedad de factores. Una forma de conocer la contaminación por resíduos sin tener en cuenta todos estos factores es el estudio realizado por CARRASCO y col. (21), sobre la contaminación por plaguicidas de los alimentos constituyentes de la dieta media española, a fín de poder calcular la ingestión de resíduos diarios por persona, la cual ha esta blecido 78 ~g. de DDT (op'-DDT + pp'-DDT y pp'- DDE) y de 13,8 ~g. de yHCH. Esta contaminación calculada a partir de alimentos del mercado de Valencia debe de ser su perior a la media nacional y es de igual orden aunque algo superior a la encontrada en EE.UU. -22- (SS ~g/día de DDT y 3 ~g/día de y HCH), en Ingl~ terra (44 ~g/día de DDT y 6,6 ~g/día de y HCH) según SMITH (22) y ABBOTT y col. (23) respectiva mente. No aparecen sin embargo otros pesticidas de gran toxicidad presentes en las cosechas de EE.UU. e Inglaterra. Los valores encontrados son muy inferiores a los considerados por la FAO/OMS (24) como mix! mos admisibles para estos pesticidas (250 ~g/día de DDT y 500 ~g/día de y HCH) para personas de 50 Kg. de peso. Por otro lado, en este Departamento se han llevado a cabo estudios sobre la contaminaci6n por pesticidas de aguas y moluscos de la Ría de Arosa, y los valores encontrados fueron 1/100 a 1/5000 para el lindano y 1/100 a 1/150 para el total de DDT respecto a los niveles señalados co mo máximos razonables por la Fede~al Comittee on Wate~ Quality C~ite~ia (5,0 y 0,5 ppb). 4.- PLAN DE TRABAJO: Por todo lo comentado hemos pretendido esta blecer niveles residuales de pesticidas orgánicos (organoclorados, fosforados y carbamatos) -23- --------~-------------·---- en el suelo de un campo de cultivo en el que se recogen maíz, patatas, grelos y judías que sola mente han sido sometidas a tratamientos muy el~ mentales con estas sustancias 1 de acuerdo con los consejos dados por las oficinas de Extensi8n Agraria. Para este estudio ha sido necesario en primer lugar, poner a punto diferentes métodos analíticos requeridos en las diferentes etapas del complejo a análisis de multiresíduosque lleva i~ plícito la utilización, por una parte de la cromatografía gaseosa con detector de ionización de llama de hidrógeno, captura de electrones y un detector análogo al termoiónico elaborado personalmente para la detección de fosforados, y por otro lado, la utilización de técnicas potenciomf tricas para la comprobación de pesticida inhibidor de la colinesterasa, algunos de los cuales, no pueden ser detectados directamente en las con diciones habituales de la cr, y es necesario el empleo de estas otras técnicas. -24- II,- ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS Los pesticidas, como se ha indicado, han dado lugar a numerosas publicaciones sobre las más diversas facetas: efectividad, forma de apll caci6n, toxicidad, legislaci6n, persistencia, etc. Y sobre todo las relacionadas con la problemática de su análisis cuali y cuantitativo, por lo que antes de proceder a la descripción de los métodos utilizados en la parte experimental es conveniente estudiar los antecedentes de las diferentes etapas que implica es te análisis: extracci6n, purificaci6n, análisis cualitativo y análisis cuantitativo. 1.- EXTRACCION: Los métodos de extracción de los pesticidas han sufrido modificaciones sucesivas tanto en la forma de realizarla, como en el disolvente o disolventes utilizados. Hoy se ha llegado a una forma de extracci6n casi única o m~s genera~ lizada que es la extracci6n por maceración y agl -25- ---~---~- - algunos disolventes, entre los aue el acetonitri lo da unos valores intermedios pero con la vent~ ja de extraer pocas sustancias interferentes. Al igual que en los métodos de ~ILLS para alimentos, la humedad es de gran importancia en suelos y se ha podido comprobar (51) que la recu peración es mala si no se añade al suelo secado al aire un 20%, o si es orgánico un 80%, de agua. Operando de esta forma la desorción del pesticida es tan grande, que otros posibles efectos tales como los debidos al método o al tiempo de contacto entre la muestra y el disolvente, son menos n~ torios. En este estudio se señala también que la rec upe ración es mayor cuando la tierra se ha secado al aire y permanece seca desde la fotifica ción hasta el análisis. LICHTENSTEIN y col. (52, 53), utilizan ac~ tonitrilo en la extracción de pesticidas del suelo. SAHA (54) compara varios métodos de extrae ción para resíduos de clordano en suelos y llega a la conclusión de que las mejores circunstancias para una buena recuperación se obtienen con la adición de un 20% de agua, un tiempo de contacto de 24 b.or,as y la utilización de la mezcla hexano- -32- acetona (1 :1). Además señala que la adición de agua por encima de un 40% disminuye la recuperación, siendo el margen de aumento el de 3040%. 2.- PURIFICACION: A veces, un simple reparto entre dos disolventes como señala BONELLI (55), extrayendo Aldrín con una mezcla de hexano-benceno, es suficiente si los niveles de resíduos son relativa mente altos. Esta misma circunstancia ha podido ser probada por nosotros como consecuencia del naufragio del Erkowit que cedió varias toneladas de Dieldrín en aguas de Galicia (56). No obstante, si los niveles de resíduos son inferiores a ppm hacen falta métodos más rigurosos que los de partición entre dos solventes no miscibles. En el caso de muestras con alto contenido en grasa y ceras, un método de purificación es la precipitación de estas en acetona a -70°C, s~ parándolas luego por filtración. GRUSSENDORF y col. (57) combinan este método con la utilización del florisil como adsorbente. Las sustancias interferentes, también pueden ser reducidas o eliminadas por métodos quími -33- ---· -~~~--~~~~~~~~- cos tal corno hacen BEROZA y col. (58) saponificando las grasas con KOH alcohólica, aunque este tratamiento también modifica algunos pesticidas (veáse más adelante 3.7.6.7.). Sin ernbargo,la técnica más frecuentemente empleada es la de poner en contacto el extrae to con una sustancia adsorbente tal corno el florisil, silicagel, alúmina, carbón o mezcla de es tos. Con frecuencia los adsorbentes fueron uti lizados simplemente para separar los productos interferentes. En este sentido BECKMAN (59), emplea florisil para retener impurezas haciendo p~ sar simplemente una porción alícuota del extracto a través de una columna de este adsorbente. CAREY (60), purifica extractos de semillas y de vegetales, haciéndolos pasar a través de una columna rellena con la mezcla: magnesia activada/tierra de diatomeas (1 :1). CULLEN y STANOVICK (61), emplean una agitación con el adsorbente cuando tratan de eliminar interferencias en un extracto de cosecha. Actualmente estos materiales son usados corno fase estacionaria en un crornatógrafo líqui -34- do-sólido, dentro de un proceso de purificación previo al análisis por cromatografía de gases ya que no solo permiten separar los pesticidas de los coextractivos sino tambien los pesticidas e~ tre si. Un ejemplo de esta última aplicación as~ ciada a la anterior es el trabajo de JOHNSON (32) que separa Dieldrín y Endrín de otros pesticidas clorados usando florisil y eluyendo primero con 200 cm3 de la mezcla eter etílico/eter de petróleo al 6% (v/v) y luego con 200 cm3 de eter etílico/eter de petróleo al 15% (v/v). Como se ha indicado, son varios los adsor bentes que se han usado con esta finalidad,y parece lógico hacer un comentario de cada uno: Carbón.- McLEOD y col. (62), utilizan columna de carbón para separar pesticidas órganoclorados y organofosforados y eluyen la muestra primero con acetonitrilo-hexano (1,5%), v/v, después con cloroformo y por último con benceno. De esta for ma logran separar en el primer eluato: Lindano, Heptaclor, Aldrín, Tiodán, pp'DDE, Dieldrín, Ca~ tan y los isómeros del DDT. En el segundo, la m~ yoría de los fosforados y en el tercero Daconil y Dyrene. La utilización de carbón como adsorbe~ te es particularmente aconsejable cuando se trata de separar pesticidas organofosforados ya que -35- algunos de ellos, solo en este adsorbente, tienen una recuperación superior al 70% (63). Alúmina.- Otro adsorbente, la alúmina, es usado con éxito en purificación. Se pensó que la alúmina, que es de naturaleza polar, mezclada con otra sustancia apolar como la parafina, podría servir para separar ambas clases de pesticidas; organoclorados y organofosforados. Así lo hizo ERWIN y col. (64), utilizando como eluyente sol:!:!_ ción acuosa de acetonitrilo (35%), obtuvieron buenos resultados en cuanto a la separación de impurezas procedentes de la muestra. El único inconveniente de éste modo de operar era que la parafina se desvía parcialmente Para subsanar aquel inconveniente, HOSKINS y col. (65), sustituye la parafina por polietileno insoluble en el eluyente usado. Así mismo BLIN y col (66) empleando también alúmina, eluyen primero con n-hexano y lu~ go con cloroformo para separar resíduos de Aldrín y Dieldrín en el suelo. LAWS y WEBLEY (SO), combinan ambos métodos de purificación, alúmina y carbón, en extrae tos de pYantas que contienen pesticidas organo- -36- fosforados previa separación de éstos en dos fracciones: solubles en eter de petróleo y solu bles en agua. La fracción de eter de petróleo es cromatografiada sobre óxido de alúmina y la otra sobre carbón. Comparando la efectividad de las columnas de alúmina y carbón, ADA\1S y col. (67), observan que en la columna de carbón obtienen una eficacia inferior debido a que deja pasar más sustancias interferentes. Silicagel.- El ácido silícico o silicagel, Si0 2H2 0, aunque menos usado que los anteriores, también es descrito por varios autores como adsorbente adecuado en algunas purificaciones. KADOUN (68) empleando Silicagel y eluyendo con una cantidad de benceno comprendida entre 12-240 ml., logra buena recuperación exepto para Malatión y Diazinon que necesitan 8% de acetato de etilo en Benceno. Mezclas.- En un itento de obtener capacidades adsorbentes adecuadas también se ha experimentado con mezclas de distintos adsorbentes. En este sentido BOWMAN y JOUNG (69), purifican extractos de cereales en columna de florisil-celita, eluye~ -37- ------------ ~----- do con hexano. Algunos autores emplean cuatro o más adsorbentes distintos, lo oue hace engorrQ so este tipo de procedimientos~ebido además a la necesidad de verificar la capacidad de adsorción en cada lote de adsorbente. Florisil.- El florisil, silicato magn€sico sint~ tico, es probablemente el adsorbente más usado con fines de purificación en análisis de resíduos y la información que de su uso puede encontrarse es muy extensa. Recogiendo algunos trabajos aplicados a suelos, citaremos: LICHTENSTEIN y SCHULZ (70), purifican extractos de suelos tratados con Aldrín, también por cromatografía sobre florisil. Separan el Aldrín del Dieldrín eluyendo primero con n-hexano y luego con benceno-n-hex~no al 25% (v/v). MILLS (31), utiliza la columna de florisil con éxito en la purificación con varios pestici das, entre ellos los isómeros del DDT, BHC, HE~ TACLOR, Heptaclor epóxido, etc ... , usando la mezcla de eter etílico/eter de petróleo al 6% (v/v) como eluyente. No encuentran eluyente idó neo para separar Dieldrín y Endrín. JOHNSON (32), separa el Dieldrín y Endrín eluyendo con la mezcla eter etílico/eter de pe- -38- tróleo al 15% (v/v). De esta forma los pesticidas organoclorados más frecuentes, pueden ser . . separados en dos fracciones: eluibles en la mez cla del 6% (v/v) (1°eluato) y eluibles en la mez cla del 15% (v/v) (2°eluato). Este método con p~ queñas modificaciones es aplicado a muestras con un contenido en grasa igual o inferior al 2% y da buenas recuperaciones en los 21 organoclorados estudiados por MILLS y col. (34). Hay cierta variación en la forma de activar el florisil. LANGLOIS y col. (71), lo calientan a 140° durante 12-14 horas y lo desactivan luego parcialmente ron un 5% de agua dejando pasar 48 horas antes de su uso. BURQUE Y MALONE (72), aconsejan el uso de florisil calcinado a 1250°F (670-680°C). durante tres horas. MILLS y col. (73), describen un método rápi do para determinar la capacidad de adsorción del florisil, basado en la adsorción del ácido láuri co de una solución de hexano. Con esta medida es fácil determinar el peso de florisil necesario para una correcta purificación. En los métodos oficiales de purificación de la Food And Drug Administration (FDA) (74), se -39- recomienda la activación a 650°C durante tres horas seguida de una estancia en recipiente cerrado a 130°C durante cinco horas corno mínimo. El florisil así activado se mantiene en la oscu ridad y puede conservarse durante dos días al cabo de los cuales es necesario volver a calentar a 130°C. Aconsejan que en cada lote activado, se determine antes de su uso el grado de a~ sorción, y de acuerdo con este, se ajuste la ca~ tidad de florisil en la columna por el anterior método de MILLS. HALL (75), obtiene buenas recuperaciones para varios pesticidas organoclorados y organofosforados aplicando el anterior método de Mills a 10 lotes distintos de florisil. En general el flcrisil es un adsorbente excelente para la purificación con organoclorados. No obstante hay algunos organo-fosforados eluibles por el método de MILLS y col. (34) en el 1 o y 2° eluatos y algunos en el 3° eluato obtenido con eter etílico eter de petróleo al 50% corno de muestra WESSEL (76). El método de MILLS y col. ( 34) es oficial en la Association Official Agricultura! Chernists (AOAC), 1.975 (77) para 14 organo clorados, 7 or ganofosforados y ningún carbarnato. -40- -~~- ------------ 2.3.- Técnicas de análisis: Dado el número elevado de pesticidas utilizados actualmente, para el análisis de resíduos se han propuesto técnicas de detección múl tiple entre las que merecen destacar la cromato grafía de gases y la medida de la actividad anticolinesterásica auxiliadas de diferentes pru~ bas de confirmación. 2.3.1.- Cromatografia de gases: La cromatogratía de gases es el método más idóneo para la determinación de insecticidas clorados y fosforados. Como es sabido, en este método de análisis, los componentes se separan y distribuyen entre una fase estacionaria constituída por un líquido no volátil, y un gas móv]l inerte, encontrándose la fase estacionaria sobre un soporte inerte sólido. Este método, cuya sensibilidad varía con el tipo de detector,_ permite poner de manifie~ to en ocasiones cantidades de pesticida del orden de picogramos, ha sido ampliamente descrito y utilizado. BURKE y JOHNSON (78) usan la GLC con el detector microcolumétrico y determinan el tiem- -41- ----------- ~).- Consideraciones en torno a la fuente de colinesterasa y substrato emoleado: En cuanto a la elección de la enzima, teniendo en cuenta que el poder inhibidor depende en gran manera de la fuente enzimática, se ha demostrado que algunos pesticidas inhiben en m~ yor proporción las colinesterasas del grupo I (colinesterasa que actúa específicamente sobre la acetil colina) y otros las del grupo II (colinesterasas no específicas de la acetil colina). Así se ha podido comprobar (101) que el sevin, por ejemplo, inhibe por igual la colinesterasa del plasma humano y de caballo (grupo II) que la de eritrocitos bovinos (Grupo I). El malatión, sin embargo, inhibe fuertemente la estearasa pr~ sente en los eritrocitos de algunas especies de mamíferos (colinesterasa del grupo I) pero es ca si inefectiva su habilidad para inhibir la estea rasa del suero bovino (colinesterasa del grupo II). De ello se deduce que la acetilcolina no puede considerarse como un substrato absoluto y. si a esto unimos el aue aún dentro de un mismo grupo de colinesterasas, no todas son igualmente inhibidas por un determinado pesticida, variando la afinidad, con la procedencia animal de la enzima, se ~ace compleja la elección. -48- ---------- En la literatura son mencionados el uso de hígado homogenizado de bovino (102) o hígado de conejo (103), extractos salinos de cabeza de abe ja, (104), reactivos todos ellos en general de dificil obtención. B).- Métodos propuestos en la literatura para la medida de la actividad colinesterásica: Entre los muchos métodos que se han propuesto para la valoración de la actividad de la colinesterasa figuran: a) Métodos de cambio de pH.- La colinesterasa se hace actuar sobre la acetilcolina en presencia de una solución buffer durante un período de tiempo de 1-2 horas y el cambio de pH durante un determinado tiempo (generalmente 6 PH/hr) debido al acético liberado, es una medida de la actividad enzimática (105). MESTRES (106) utiliza este método en la búsqueda de insecticidas colinesterásicos en vinos. b) Métodos volumétricos.- Se determina el ácido acético liberado, por titulación con lejía alcalina a pH constante. En esta valoración puede usarse un indicador ácido-base (107), u otro mé- -49- todo electrométrico, titulador conductimétrico o potenciométrico. La ventaja de este método so bre los de variación de pH es que la medida de la actividad no está directamente influenciada por la fuerza buffer de la solución siendo sin embargo el pH constante. Cuando este método es usado en técnicas microtitrimétricas se han obtenido muy buenas sensibilidades (108). e) Métodos manométricos.- El primero, es descri to por AMMON (109). Es un procedimiento, que como los anteriores se basa en el ácido acético li berado. Aquí se mide manométricamente el anhídri do carbónico desprendido el reaccionar el ácido con una disolución de bicarbonato. d) Métodos calorimétricos.~ Unos se basan como los anteriores en el ácido acético liberado. Siguiendo este método BEGGS y col. (110) usan el azul de bromotimol para medir el cambio en la absorbancia experimentado por la producción de ácido acético. Otros se fundan en la acetilcolina remanente después de la hidrólisis. HESTRIN (111) usa la hidroxilamina para reaccionar con la acetilco lina sobrante y formar ácido acetilhidroxámico, que en presencia de iones férrico forma un com- -50- piejo coloreado cuya intensidad se mide a 540 nm. 2.3.2.1.- Técnicas para identificación de pesticidas inhibidores de la colinesterasa: Debido a la falta de especificidad del método an terior se hacen necesarias técnicas de identificación. En este sentido se ha visto: a) Posibilidad de utilizar distintos enzimas.- Los pesticidas no tienen igual especificidad por estearasas que procedan de distinta fuente. Asi se ha co~probado (112) que el iazinon, sevin, systox, trition, phorate y otros presentan igual grado de inhibición frente al plasma de caballo que frente al humano, sin embargo el Malatión y el Paratión tienen una capacidad de inhibición mayor frente al plasma humano que frente al de caballo. De esto se deduce que el uso de ambos tjpos de plasma serviria para diferenciar malatión de tritión o mejor todavia mal~ tién de sevin u otro que no sea detectable en GLC. PACK y col. (113) han usado un método similar para determinar pequeñas cantidades de Di- -51- rom en presencia de DDVP, usando plasma humano y colinesterasa cristalina purificada de eritro citos bovinos. Por otra parte YU y col. (114) estudian la relación que puede tener la estructura molecular con la actividad anticolinestera sa y llega a la conclusión de que en los compue~ tos fenil N-alquil carbamatos, las sustituciones en N de cadena larga resultaban más inhibidoras cuando se usaba colinesterasa de eritrocitos de bovino mientras que las sustituciones de cadena corta presentaban mayor grado de inhibición sobre colinesterasa de insectos. De todos modos, la ayuda que este procedimiento proporciona a la identificación no son suficientes y resultan de complicada internreta ción. b) Cromatografia en capa fina.- MENDOZA y col. (115) emplean la técnica de TLC-inhibición enzimática para determinación de carbamatos y fosforados averiguando los niveles de detección para varios de ellos frente a distintas estearasas. MELVIN y STANLEY (116) han usado una técnica similar pero utilizando papel, en la identifi cación de fosforados. -52- MENDOZA y SHIELDS (117) estudian los factores que afectan a la sensibilidad y especificación de ambos tipos de pesticidas en este método de identificación y llega a la conclusión de que no solo afecta la fuente de estearasa sino también la dilución de esta y la oxidación del pesticida. Dichos informes, si bién contribuyen a aumentar la sensibilidad en determinados casos, llevan a la conclusión de que no son eficaces en una identificación rápida de un problema de~ conocido. Lo mismo sucede con la utilización de diferentes enzimas, de aquí que se prefiera la utilización de distintos líquidos de desarrollo y el empleo de diferentes reactivos cromogénicos. FISCHER (118) y FISCHER y PLUNGER (119) en la determinación de fosforados usan silicagel G y como líquido de desarrollo, cloroformo: aceto na: n-hexano (1:1 :1). En este último sentido también RM1ASANY (120) ha obtenido buenos resultados en la deter minación conjunta de fosforados y carbamatos. -53- 2.4.- Análisis cuantitativo: Son dos los tipos de m€todos a considerar en la valoración cuantitativa: los aplicables a ~LC y los empleados en la determinación de la actividad anticolinesterásica. 2.4.1 .-Métodos de cálculo en GLC: La valoración cuantitativa de los resultados encontrados en la cromatografía de gases pue de hacerse en función de los diferentes parámetros de los cromatogramas. De los muchos m€todos que se citan en la de terminación cuantitativa de los pesticidas, casi todos ellos están basados en la determinación de la altura o del área de los picos producidos por soluciones standard que contienenlos mismos componentes de la muestra. En la determinación de la altura es necesario construir la línea base, buscar el centro del pico y trazar la vertical desde la zona centro de la base. Este es un m€todo menos sujeto que otros al error del operador y recomendable sobre todo para picos estrechos, es decir los primeros del cromatograma. Varios autores sin em -54- bargo y entre ellos BURCHFIELD y STORRS (121) manifiestan que la altura es un parámetro muy sensible a cualquier variación en las condiciones de trabajo por lo que éstas han de ser estre chamente controladas cuando las medidas se hagan por este procedimiento. Para picos anchos es recomendable hallar el área. SCOTT y GRANT (122) describen tres métodos: a) un método, el más general, válido para toda curva gausiana consiste en considerar el área proporcional a. la altura del pico multiplicada por la anchura en la semialtura. Este mét~ do no exige la construcción geométrica de la base prolongando la línea-base. Por tanto resultará altamente reproducible. b) En el método de triangulación se considera el área, proporcional a la altura por la mitad de la anchura en la base del pico. Este exige la construcción geométrica de un triángulo con la línea base y las tangentes por ambos lados a los puntos de inflexión. En este procedimiento la influencia de una mala línea ba se, es grande y además requiere un extremo cuidado en la construcción de las tangentes. -55- e) El método planimétrico,semimecánico, consistente en medir las susperficies de los picos con un planímetro, da las áreas reales. Tiene el inconveniente de no ser muy útil en un análisis de rutina. BARRY y col. (123) en un estudio comparativo entre dichos métodos de triangulación, altura, altura por ancho del pico a la semialtura e inte grador de disco,(siendo este un método mecánico cuyo fundamento es la transformación simultánea del desplazamiento de la aguja en un movimiento oscilatorio con una frecuencia tanto mayor cuanto más alta sea 1~ desviación de la aguja),encuentran que por este último método se obtienen resultados superiores a los reales, careciendo los demás métodos de diferencias significativas. Un problema que se presentacon frecuencia, es hallar el área de picos no resueltos. MUNNIK y FABRIE (124) aplican el método de la altura por el ancho a la semialtura. Cuando se puede construir un triángulo equilátero,aunque uno de sus lados sea casi imaginario, ambos parámetros quedan fijados. Cuando uno de los lados del triángulo, apenas se insinua sobre otro triáng~ lo mayor, la altura queda determinada por el segmento de perpendicular (siendo ésta trazada -56- de la cresta a la línea base) que queda comprendido entre el centro del pico y el lado imaginario del pico mayor. El ancho en la sernialtura se puede calcular teniendo en cuenta el ancho del pico anterior y el del posterior al pico problema. 2.4.2.- Métodos de cáZcuZo de Za actividad anticoZinesterásica: La valoraci6n cuantitativa de esta actividad viene determinada por el método de análisis elegido corno puede verse en 2.3.2. (B) llaman porcentaje de inhibición DTo - D1 O, O 1 . DTo' siendo DT 0 y D1 las variaciones de pH sufridas por testigo y muestra respectivamente durante un determinado tiempo. variaciones de pH sufridas por testigo y muestra respectivamente durante un determinado tiempo. En los métodos oficiales de Association of Official Analitycal Chernistry (125), basado en la reacción colorirnétrica de la acetilcolina rema nente, con la hidroxilarnina y el i6n férrico, se determina el porcentaje de inhibición por la f6rrnula: 100100. ~:~ = ~ -57- -- ------------------- 3.2.- REACTIVOS: Consideraciones generales: Los disolventes y otros reactivos usados en el análisis de resíduos de pesticidas tienen que estar libres de sustancias que causen degra dación, adsorción del pesticida y en general in terferencias en sus etapas de identificación y valoración. Para investigar la posible presencia de sustancias interferentes hemos empleado el método seguido por la FDA (3S) concentrando 300 cm3 de disolvente a ensayar en un KudernaDanish hasta S cm3 e inyectando S ~1 del canee~ trado en el cromatógrafo de gases con detector de captura de electrones. En las condiciones de trabajo, no debe producir un pico mayor de 1 mm. en la línea base durante 2-60 minutos despues de la inyección para que el disolvente se considere libre de sustancias interferentes. Para investigar la posible presencia de sustancias que pueden degradar los pesticidas aan cuando no produ~ can interferencias, se somete al proceso total de análisis cantidades conocidas de organoclorados y organofosforados en ausencia de muestra (los solventes con oxidantes son causantes de de gradaciones notables sobre todo en fosforados y especialmente en el carbofenotión). -64- La purificación de reactivos, llevada a cabo para eliminar estas impurezas, han sido dis tintas y son mencionadas en cada caso. Reactivos empleados: - Acetonitrilo: Fluka, de p.e = 79-82°C Eter de petróleo: CM1PSA de p.e. 30-60°C puri ficado por redestilación con columna Snyder a pesar de lo cual no se eliminan algunas impurezas como hemos podido comprobar. - Agua bidestilada en presencia de permanganato potásico para eliminar la materia orgánica e interferencias en análisis por cromatografía gaseosa (126). - Cloruro sódico. - Sulfato sódico anhidro para deshidratación de los estractos previamente purificados por lavado con eter de petróleo y posterior desecación en estufa a 180°C durante 12 horas .. - Eter etílico Abelló, purificado por destilación en presencia de sodio metálico para elimi -65- nac1on de peróxidos. Para comprobar esta circunstancia, se añaden a 10 cm 3 del destilado, 1 cm3 de solución de IK al 10% (p/v) recién preparada, no debiendo observarse el color del yodo en ninguna de las dos capas formadas; en caso contrario, la purificación no habrá si do efectiva. - Florisil Fluka de 60-100 mallas, activado como se indica en 3.6. - Acido láurico. - Disolución alcohólica de fenolftaleina al 1%. Hidróxido sódico para preparación de solución 0,1N, utilizada en la determinación del índice de ácido láurico y de la actividad enzimáti ca. - Cloruro potásico para la preparación del dete~ tor termoiónico de cloruro potásico (KClTD) y BrK para los microcomprimidos de espectrofotometria de IR. - Hidróxido potásico. - Alcohol metílico. -66- - Anhídrido crómico - Acido acético glacial - Benceno redestilado - Peróxido de hidrógeno al 30% (p/p) - Acido sulfúrico - Bisulfato sódico - Carbonato sódico - Cloruro de zinc anhidro - Acido clorhídrico cocentrado - Etanol absoluto - n-hexano - Diclorometano. - Solución de polietilenglicol-400 al 1% (v/v) en diclorometano. - Plasma de caballo, obtenido de sangre recién -67- recogida sobre heparina (0,2 mg/100 cm3), en el matadero municipal y centrifugada a 2. 500 rpm durante 30-45 minutos. - Acetilcolina - Líquidos de desarrollo para la cromatografía en capa fina: acetona, n-hexano y cloroformo - Nitrato de plata - Monoetanolamina Todos estos productos utilizados fueron de la casa Merck, a excepción de aquellos en los que se indica su procedencia. - Solución patrón de pesticidas organoclorados y fosforados empleada en el estudio de la recup~ ración del proceso de purificación y en la puesta a punto del detector termoiónico de clo ruro potásico. Heptaclor . . . . . . . .. . ...... o' 1 2 ppm Malation 1 '20 " ..... . . . . . . . . . . . . Heptaclor-epóxido 0,20 " ........ Dieldrín 0,28 " ..... . . . . . . . . . . . . Etion 0,80 " ....... . . . . . . . . . . . . . Trition 1 ,40 " ........... . . . . . . . -68- 3. 3.- MUESTRAS: Las muestras objeto de estudio son: tierra del suelo de una parcela recogida periódicamente a lo largo de cinco. años y sus diferentes cultivos: patatas, maiz, grelos, repollo y alubias. 3.3.1 .-Toma de muestras: Para el muestreo del suelo, se ha utilizado un toma muestras usual en este tipo de análisis (Fig. 1), que permite obtener una muestra representativa del suelo de hasta unos 20 cm. de profundidad. Por otro lado, de los diferentes nroduc tos recolectados, se ha utilizado la parte comestible. 3.3.2.- Conservación de las muestras: Las muestras fueron guardadas en nevera y bolsas de polietileno, a fín de garantizar el man tenimiento de la humedad y el contenido en pesticidas hasta el comienzo del análisis en las 24 ho ras siguientes, dando preferencia a las muestras de grelos, repollo y patatas, y dentro del proceso analítico, a la extracciónyanálisis de organQ_ fosforados. -69- ~~~""-""~ Las muestras de suelo sobrantes, fueron secadas al aire y luego guardadas en bolsas de polietileno con el objeto del mejor mantenimiento de pesticidas (51), para posibles repeticiones de análisis. Es de destacar que la naturaleza de las bol sas es de suma importancia debido a su variada composici6n y su posible contenido en policlorobi fenilos (PCB's) como sustancias plastificantes. Por ello hemos llevado un control de las bolsas de almacenaje mediante espectrofotometría de I.R. en el que obtuvimos en la mayoría de los casos (fig. Zb y Zc) la estructura del polietileno de la fig. Za, reproducida de Perkin-Elmer Infrared Aplications Study (127). Sin embargo, la obtención de cromatogramas muy distintos (Fig. 3a y 3b) para diferentes tierras, nos ha hecho pensar en la cesi6n oor algunos plásticos de sustancias que podrian ser de la naturaleza de los PCB's composici6n que se puede comprobar (fig. 3a) por las pruebas ouímicas de estas sustancias (véase más adelante 3.7.6.7.e) · Tanto aquellas muestras que presentaban PCB's, como aquellas en las que no sucedía esto, estaban contenidas en bolsas cuyos espectros res -70- ~.:-·'} ?·G 3-C_; ~.:c-=:~-;~··t; ~.~:<· 5·0 . . _:,___.._._. _ _.,_ L.•-- _..__,_;_ __ _;_ -- •---·- ·:--J~~j::"'"~ ~~-j 1\J·:·J· _ _.¿_._ __ .... _______ .->---:------~~~- -'·-·:-::--·· ... ! .·' 1 e .. 1· --~--L- . b -··--¡ :·-: 1 a F r r:¡•p \ )) l '¡' C J l S u e Ct i" r: ~ el C' 1 ~l ~ lw 1 ~. ~' ~. V 111 p 1 C :¡da~ en c1 éil~accnaje. -71- ponden a los de la fig. 2. Sometiendo las bolsas a un proceso analítico igual al de las muestras, se pone de relieve por GLC la existenciA de dos plásticos diferentes (fig. 4a y 4b) responsables de los cromatogramas del suelo 3a y 3b respectivamente. Por otra parte se ha comprobado que en aqu~ llas bolsas de plástico con cromatograma 4a, no había cesión a lo largo del tiempo de ningún componente interferente en GLC (fig. Sa y Sb) y ello no obstante haber en estos cromatogramas de plásticos pequefias cantidades de sustancias (fig. Se) 3.3.3.- Localización y descri~ción de la paree!~ de terreno objeto de es~udio: Está situada en la provincia de LA CORU~A en el municipio del Valle del Dubra, lugar de Niveiro (*),con una orientación que puede observar se en la figura 6. La dimensión aproximada de la parcela utili zada es de unos 10.000 m2, terreno llano y con una pendiente de un 3% hacia el sur. El terreno (*).-Aprovechamos estas Zineas para agradecer a su propietario D. JuZio Gándara Nión, Za autorización y facilidades dadas en Za reco gida de muestras. -73- a las muestras de suelos, las hemos designado con la inicial de su nombre (S), seguida de la letra A o B, según que corresponda a una u otra zona de muestreo y de números correspondientes a la fecha de recogida, vease cuadro rr. En las muestras de los productos agricolas recolectados en la parcela a lo largo de este tiempo, análogamente se les asignó la letra ini cial de su nombre seguida de la fecha de rec6g! da, vease esta asignación en el cuadro II y en la fig. 7. 3.3.4.- Preparación de las mUestras: En todos los casos ha sido necesaria una preparación previa de la muestra: Suelos: fueron sometidos a tamizaci6n con una abertura de 0,1 mm. de luz al objeto de separar piedras, hierbas, etc. Patatas: después de privadas de la piel fueron dislaceradas en una homogenizadora Hulti-bat. -80- CUAflRO 1I NOMENCLATURA UTILIZADA PARA i.AS '·lUloS'i'R,\S 1 -_-_r __ -~ __ CHl\S l ___ s_uE_L,O_s ___ +_G_RE_L_n_s_-ti_R_c_·o_·_L_O \ PATny,.-~;;-r-::-~ 1 :::::::1 '' r P-9~~, l e~.:~r~"":~ 1 iS-10-71 1 1 M-lí!-71 ¡ /\--10-?J 1 15-2-72 1 R-2-72 ; ! 1 24-3-72 1 1 23-4-72 1 25-5-72 1 124-ti-72 1 17-9--72 ! SA-9-72 SB-9-72 ,. 1 14-10-72 Sfo-10-72 SB-10-72 l 1 ;S-ll-72 SA-ll-72 SB-ll-/21 1 R-11-72 1 21 12-72 j Si\-1?-72 !)B-1?-77. l 1 1 5-J-i"J 1 SA-3-7:\ SP.-3-73 ! G-3-73 ~,- 1 2-4-73 S/1-4-73 SB-4-73 j G-4-73 16-S-73 SA-5-73 SB-S-73 ¡ 1 1 1 1 117-67 SA-C-73 :.B-6-73 1 18-7-73 1 SA-7-73 ~>B-7-73 1 1 1 1 1 1 \t.-111--73 1 Sl\-10-73 SB-10-73; 1 P-9-72 i i "í-S-72 1 i ~1--; 0-72 ~~-5-73 P-lv-73 M-10-73 ! A.-10i2 1 , A-ln-73 110-11-73 ~ SA-11-73 SB-11-73! G-ll-i3 ! R-11-73 1 1 21-12-73 1 Sf-.-12--73 SB-~2-73 ¡ ! ;' : 2f.- 2-74 ! SA -?-74 SS-2-74 ~ J : 1 ll ____ l _____ l----+----~----\1--------~-------_j ________ ~ 5-10-74 SA-10-74 SB-10-74 1 J R-10-71, ?-10-7-; · !H0--74 · r-:C-:4 1 ' 7-lo-¡'• SB-11-74 G-ll-7F, 1 i ¡ : , -~~-t,.¡~- 1 SA-4-.75 1 Sll-1•-7~ __ j ___ j _____ L_ ______ L_ _____ ; -En- Maiz: se toma una muestra representativa despues de ser triturado en molino de percusión y pasado por un tamiz de 1 mm. de luz. Grelos y repollo: después de cortados finamente, fueron dislacerados al igual que las patatas. En todas las muestras se ha determinado la humedad por desecación con el objeto de elegir el proceso de extracción adecuado en cada caso y también a fín de conseguir una expresión constante del resultado en materia seca (cuadro III). 3.4.- ORGANIGRM1A del proceso analítico seguido: Con objeto de apreciar de forma inequívoca los resíduos de los más diversos pesticidas, se ha seguido el proceso indicado en la figura 8. 3.5.- EXTRACCION: Elección de solventes y estudio de la recuperación. En esta etapa del análisis de resíduos, como es lógico, ha sido nuestro propósito emplear un disolvénte eficaz para un mayor número de pes- -82- ~--5UELO hUMEDAD (%) E' 24,20 2 27,00 1 1 SA-4-72 25-81 1 1 SA-5-72 19,73 1 1 SA-6-72 20,15 1 i SA-9-72 16,40 1 1 SA-10-72 24,60 s,;-JJ-72 26,20 SA-12-72 22,00 SA-3-73 27.50 SA-t;-73 26,20 S/\-5-93 28,10 Sf,-6-73 20,60 SA-7-63 21,62 SA-10-73 24 33 . s~-11-n 26,28 1 SA-12-73 22,00 SA-2-74 23,80 SA· 4 -74 1 27,7 SA-10-75 26,2 1 1 COI\TENJDO EN AGUA Dr: LAS ~11JESTP..AS AMLIZ.\DAS 74,9 SB-4-72 80,37 SB-5-72 79,85 SB-6-72 83,6 53-9-72 75,4 SB-10-62 73,8 SB-11-72 78,0 SB-12-72 72,5 SB-3-73 73,8 SB-4-73 71,9 >B-5-73 79,4 SB-6-73 78,38 SB-7-73 75 67 SB-10-73 7:J,72 ¡ 1 SB-11-73 78,00 1 SB-12-73 "·' i 50·2·74 -- ----- 72,~~ SB-10-74 73,8 1 SB-1;-15 CUADRO Ili 1 1 1 1 25,72 22,11 19,80 18,21 21,70 27,20 23,011 28,50 26,5 26,80 21.02 2: 'ó)lj 2?,57 27,01 20,0 74,38 77,089 80,2 81,79 78,3 72,8 76,92 71,5 73,5 73,2 79,98 7fl,5 77,43 72,97 0,0 a,1n 7,9 ----- -- 27,00 1 78,00 24,80 L2~-- -83M-10-71 A-10-71 G-2-72 R-2-72 M-5-72 P-9-72 M-10-72 A-10-72 R-11-72 G-3-73 G-4-n 1·1-57 3 P--10-73 A-10-73 15,42 10,50 91,17 91,9 12,09 74,41 16,31 ¡-· - ... n,oa 90,93 p.f;,79 13,15 16,08 73,98 11.02 9,07 11,21 B6,85 83,92 2(,,02 88.98 1 ¡ 1 i i 1 1 '¡ R-11-73 91,5 1 8,4 G-11-73 L90,8 9,2 1 ---;_:-;-~~ 1 ;;,~-;;--t-;-, ~- 1'-10-74 ! 1 7S,22 24,7R 1 1 ::::: 9,89 ~í-10-i'/-; 1 A-!0-74 ~-7'· __ 90,11 ll,03 O R G A N I l. R A 11 A [ EXTR:\CCION aceración con ace~onitrilo 3.5.- 3.5.1.., !.:un fJorisil j l'URIF!C:,\CI~'t\ L :;_¡:, - ~.h.2. ----¡--- :\NALISIS CUALITATIVO DEL FXTR:\CTO ETEREO: -Cromatogrnfia Jc gasts ·Pruebas de conliTilwciún :;.7.- 3.7.6. _ _j 1 1 :N'A' 1"1" ··u'"TI"'\-~ 0 \'0 L .\, L " .-, L "" lt • DEL EXTRACTO ETEREO 3. 8. -84REPARTO 1 L __ a_c_e_t_o_n_i,t_r_i_l_o_:_d_i_c_l_o __ ll rornetano 3. S. 3. r---''---, ~lrD TOA PllTE:-JC:10~1E TRICA DE LA ACTTVI fli\D AYfTCOL I NESTE::- RASICA. 3.9.- 3.9.4. 1 1 IDENTIFICACION DE 1 PESTICIDAS EN ~iUES TRAS CON INIHBJCI[i"N ~-10.- 3.10.2. FICUH,'·- 8 ticidas a la vez que válido para los distintos tipos de muestras y en este sentido hem~s optado por el acetonitrilo, disolvente común en el análisis de los resíduos procedentes de las distintas muestras. En las muestras de los productos recolect~ dos en la parcela se han seguido los métodos ofi ciales de la AOAC (1. 970) (45) para nroductos no grasos ya que ninguna de las muestras sobrepasa el 4% de grasa, y cambios en los métodos oficiales de la AOAC (128) para aquellos productos secos o de bajo contenido en agua. El disolvente utilizado es el acetonitrilo o acetonitrilo-agua, dependiendo del contenido en agua de la muestra. En cuanto a los pesticida~ procedentes del suelo, se ha seguido en lo fundamental el mismo método anterior pero con la introducción de variantes de acuerdo con la bibliografía ya anteriormente citada (51) y (54). El líquido orgánico procedente de esta primera fase de la extracción, se divide en dos volú menes iguales para someterlos a las etapas 3.5.2. y 3.5.3. Con el primero, se pretende hacer el análisis por cromatografía de gases y se contínúa para ello la extracción por el método oficial antes citado. Con el segundo se pretende determi- -85- nar la actividad anticolinesterásica por no ser la GLC suficiente ya aue pesticidas como dipterex y carbaril contenidos en las pulverizaciones apli cadas en la parcela, objeto de este estudio, no son detectados. Para ello, esta segunda mitad del extracto, se somete a partición con cloruro de metileno, selección hecha por los siguientes motivos: 1.- Es un buen disolvente para los dos grupos de pesticidas citados, caroamatos y fosforados (45), (49) y (SO) y da buenos resultados de recuperación en el reparto con acetonitrilo. 2.- Disponer de un proceso más para eliminar sus tancias interferentes, y 3.- El tener los resíduos disueltos en un disolvente mucho más volátil que el acetonitrilo, lo que es una ventaja para la obtención del resíduo seco necesario en la determinación de la actividad anticolinesterásica. Para la elección de estos métodos de extrae ción se ha llevado a cabo un sondeo de la recuperación para todo tipo de muestras en la obtención del extracto de diclorometano, y la recuperación en la obtención del extracto etéreo, solo para -86- las muestras de suelo por estar en las demás suficientemente estudiado. Para ello se toma la muestra preparada como se ha indicado, se sobrecarga con una cantidad de disolución patrón y después de eliminar por concentración a vacío el disolvente, se procede a su extracción siguiendo los métodos elegidos. Se han hecho por duplicado para cada 50 g. de muestra cargadas con distintas cantidades de pesticidas y los correspondientes ensayos en blanco. Las disoluciones patrón empleadas para los organoclorados fué: Lindano . . . 0,05 p.p.m . Heptaclor 0,05 " . Aldrín o' 1 " Dieldrín O, 1 S " .. Endrín O, 1 S " Los resultados encontrados uueden verse en el cuadro IV. Análogamente se ha efectuado un estudio de la recuperación mediante la técnica de la colinesterasa (véase el capítulo correspondiente 3.9) empleando una disolución de Dipterex ... Sevin . -8750 P.P.m. 20 " l:I:CUPER.\C;o:-¡ DF LOS PESTiCIDAS ORG.\NOCLORADOS PROCT:l1: :;-; l'S DEL SUELO 1 ,g RECUP~:lJ\005 1 ECU>ClON OE l;¡;:-~-;;,¡,¡,c~c-::-1 -----~~0~ Kg. RECTLI. : MECIA ('¿). __ ! 1 ' 0,80 ; ~ 1 ¡ i 1 1,67 ¡y=O,i'\50 >:i 0,155; 73,5 1 ' O ?O 1 1 ' 1 ~·1 • 1 l 1--- ~ J.J9 AÑADiDOS ~t PO: Kg 1 ~ 2 o ~ 1 ,d \ -1-------f--------+---- --- -+ -----¡ 0:: o ...... '-' ~ 1--- 0.. w :r: z ~ 0:: o ...... <( ---¡ z 1 0:: 1 o -' w ~ 1 o 1 1 1 z 0:: o 1 z w 1 ¡ 0,67 1 i ! 1 1 i 2 o 1 o ! ' l 1,5 ¡y=0,7500 x-Cl02óF.) 75 1 1 ' -----+¡1 ::-:: 1·0,775~~00~3~-:.-5---, 1 1 2 4 o ¡---------+- ----¡- 1 2,35 3 6 o o \ 1 5,03 y=0,83-33 x0.05191 ----+' 2,20 ----t--------- 3 6 4,10 o o -88y=0,7333 x01166S/ ! 1 ¡ 73,:; -- ______ L ____ _ CUADRO fv 3.5.1.- Maceración con acetonitrilo: La maceración y agitación con el ácetonitri lo para los distintos tipos de muestra, tiene lu gar de la siguiente forma: 3.5.1 .1.- Muestras con humedad superior al 75%: patatas, repollo y grelos. 100 g. de la muestra preparada como se seña ló anteriormente, se agitan mecánicamente con 200 cm 3 de acetonitrilo durante dos minutos. Seguidamente, se filtran por algodón a una probeta de 500 cm 3. La muestra se extrae dos veces más con porciones de 50 cm3 de acetonitrilo cada una, fil trándolas a su vez para la probeta. El extracto total se divide en dos partes iguales, una para GLC con la que se continúa como en 3.5.2., y otra para la determinación de la actividad anticolinesterásica con la aue se sigue como en 3.5.3. 3.5.1 .2.- Muestras con humedad inferior al 75%: maíz, alubias. 50 g. de la muestra debidamente prenarada, se agitan con 200 cm3 de acetonitrilo con un 35% de agua, durante 10 minutos. Se filtra el extrae to para una probeta de 500 cm 3, y se extrae la -89- 1 e::::::::::::_ ______ _j <7-- . r - ~ -·-------- ------- -- - ----- ___ _J ·=·-~:::~~~~==~~ -~~-~=--! 'i~ -·· (b) --y-----===.::. -~~::.r~~-=-=-=~.;.-::.:.,;.._.;.:.=t":,:..""::-:":--===::-=~-=--=-.::.•=~-=--=~:'"f.:=,~--= ";<"" =~~~0~=.~~ ~~ ... -.~- -~_:::~~~.:.. _,. . ..,.,_._..,,' ~ ' .:::-------- ___________ __) ------:;;e~"~ ,:_---=---==-- ______________ --_--___ - ______ ~ ....--=::-:~-=::---=-~--=-=-=-:...-~ _ _,~==--=---_- --:::---~-·-_-_.:_-_ -- ---~ ----------===--=-.::-~ -- - - ~~~~=~~-~-"~--~-~-·--(~-~- ~:.-==- --~- -~= -~~ FIGURA 9. · Cromatorir:1mas ohtt•niU.ns c0n l:1 c;nliJciAn patrón mixta ut i 1 i 'ando los clPrcctorC"s de ECD y KClTfl: a) Cromatogr:ti7la ~{: 1:1 solución p:tt:rón mixta b) Cromatogfa:na del primer elUillo e) Cromatograma del serundo eluato -96- . AREAS EN cm2 DE LOS PICOS DE PESTICIDAS DE LA SOLUCION PATRON HIXTA HfPTAl HEP. MALATION OIELDRIN ET!ON TRITION INYECCION _ _j:LO~PO~ID9_ -~~~ KClTD EC EC KClTD EC KClTO , EC r EC 1 - ¡o 1,65 2,29 0,68 1,26 3,03 2,17 2, 31 5,07 5,25 20 1,67 2,24 0,68 1,24 3,01 2,10 2,27 \ 5,01 2,14 30 1,58 2,18 0,64 1. 21 2,92 1,99 2,14 4,8 1,92 40 1,63 2,21 0,69 1,34 2,92 2,10 2,38 4,9 2,18 so 1,45 1,95 0,61 1,30 2. 75 1,98 2,21 4,58 1,97 60 1,S6 2,13 0,66 1,35 2,81 2 2,17 4,66 2,03 ]O 1,56 2,13 0,64 1,29 2,82 1,97 2,17 4,64 1,99 8' 1,58 2, !3 0,68 1,31 2,88 2,04 2,17 4,69 1,94 go 1. 56 2,16 0,66 1, 37 2,90 2,02 2,14 4,67 1,94 lOO 1,58 2,16 0,66 1,35 2,86 2,02 2,14 4, 77 2,04 x 1 1,58 2,15 0,66 1,30 2,89 2,04 2,21 4,77 2,04 S 1 0,0608 0,0900 0,0225. 0,0514 0,0867 0,064' o ,0829 o ,1677 0,1115 1 Coeficien 1 1 te de va:- 3,81· 4, !8 3,86 3,95 3,00 3,16 3, 75 3,51 5,46 1 d.olóo ; Amplitud 1,451,95- ; o, 611,212,751,972,144,581,921,67 2,29 0,6' 1,37 3,03 2. 17 2,38 5,07 2,25 ! ( ng) 0,57 0,96 5,76 1,441 1,34 3,84 0,96 6,72 1,68 CUADRO V -97- INYECCION ¡o 20 30 40 so 60 ]O 8o 9o 10° fiRI'AS DE LOS I'ESTICII'AS 1\ J()< liU\Tl'S 1° y:' fl'- 1.·\ SnLIJr 1 o•; 1',\rR(i\ '11 XTA 1er EL ~1rrÁ:T __ CLDR. ECO 1,34 1,38 1,38 1,36 - ---;!-1' ---------- ---------------------: UATO 1 2' ELIJ,',T() 1 ~~~rooL~~_::~-~~~~:~~:1~~~~ T~~~~i;~;~: ~~:~-~~~~~·_;] ECO _l~~- 1 , KClT~~-~~--t -~~_v __ L ~~-~~:_~e~"'---~-~:-~-~~?_: ~ 1 ! : ; 1,97 0,64 1 1.24 i 2,R8: 2,J5 \2,'"J ¡ 4,53 l,iO ¡ 2,02 0,66 1.27 1 2,88 1 1.99 j 2,20 •'l,t-4 1,78 . 1 2,02 0,67 1,?9 2,92 1 2,06 ¡2.23 4,<.;' 1.:6 i 1 'J , 3 2,06 0,63 1,23 2,92 j 2,02 ¡e,. 4,SS 1,70 1,36 1 ,38 1,38 1 1,39 1,39 1,96 0,(9 l,3S i 2,% 1 2,r:6 ¡ 2,1P. 4,:fi 1,/S 2,02 0,68 1,27 1 2,90 1 2,06 ! ?.11 4,SF 1.64 1,98 o,69 1.2s l z,r.a ¡ 2.ot. ¡z,13 4,56 ¡,es ' :::: ' :::: 1 :::: 1 ;::: 1 ::::: ! :::: :::: :::: 1,4 1------ ---- 2,05 ~ 0,61 ! 1,2'i -¡ 2.88 ¡ z.rt- :2.111 4,5'~ ---- f¡ ---- ._ ----- ------¡------- -~ ---- 2,01 0,(,7 11,2<; :',P.9 1 .!J•/1 ! ?.11 4,n X, 1 ,37 1 1 " 0,0177 1 Coeficien te de va-:: 1,29 riación % Amplitud 1 ,341 ,4 ' x 1 ~ Recupera87\ 1 ción 0,0.137 O,o1d 0,01.~) o,nzllr,¡ O,'';·r.-,l n,rí.i"; (1,'11é ¡ r:,'>~¡j 1 1 1 ¡ 1,67 2,43 3,01 1,02 ! 1,7' 1 2,17 O,OH 13,0: 1,96l1 O,Gr.- 1 1,22- :?,P.6l¡,cc;_ , ~.¡-,_ "·"4il,f··12.0fi' 0,6gj 1,351 2,9;; 1 2,0: 1 2,23: 4,',:i i ¡ ,i'E: -~-~-~~-r' ~·3~-~-_::" __ ~"-,2·_"_('-''-1-'·" 1 ... o o n-, 1"0..,{> 10nl(lla7-clg ... l~~·g""-,cl 9.:>,3. 102_¡, ''•-· ··~-·-'·1 ::>,,,,.,,_,¡ 1 --' __ l ____ _j ___ l C! ;,\Jll(¡) \' ¡ -98- presa la recuperación en tanto por ciento (cuadro VI). Como puede observarse la recuperación encontrada es aceptable en todos los casos, ya que se alcanzan valores por encima del 87% y por debajo de 102, excluyendo el Tritión con de tector termoiónico aue resulta algo más bajo (83,2%). Todos estos datos permiten además realizar un estudio de precisión de la inyección, dado que cada serie obtenida tiene un coeficiente de variación inferior a 4 si se exceptúa el triti6n con detector KClTD. También pude observarse que cuando un componente da respuesta en dos detect~ res, el coeficiente de variación % es inferior en los resultados hallados con el detector de captura de electrones (vease Cuadros V y VI), lo que prueba la mayor estabilidad en la respuesta de este detector: 3.6.2.- Normalización del florisil: (*) NOTA.- Este cálculo es independiente de Zas cantidS:_ dades inyectadas dado que se admite han sido Zas mismas en ambas series de valores. -99- - --·------------ Una vez observado que, siguiendo este rnéto do de purificación y separación, el % de recuperación ha sido satisfactorio, se ha evaluado la capacidad de adsorción del florisil así activado utilizando el método propuesto por la, FD~- (!3~)_ __ basado en la adsorción ejercida por el florisil sobre el ácido !áurico que considerarnos interesante trascribir. Dicho procedimiento utiliza los siguientes reactivos: - Solución de ácido !áurico al 2% (p/v) en hexano - Solución de fenolftaleina al 1% (p/v) en alcohol. - Solución O,OSN de hidróxido sódico. Procedimiento: En un Erlenmeyer de 50 cm3, con tapón esmerilado se ponen 2 g. de florisil activado al que se añaden 20 cm3 de la solución~e ácido !áurico \ (400 mg.). Se tapa, se agita mecánicamente duran te 15 minutos. Se deja sedimentar y se pipetean 10 cm3 del sobrenadante para otro erlenmeyer de -100- 200 cm3. Se añaden a estos, 50 cm3 de etanol pre- . viamente neutralizados en presenciade fenolftaleína, valorándose seguidamente con sosa O,OSN, el ácido que ha quedado sin ser adsorbido. Se denomina valor de ácido láurico a los miligramos de ácido que han sido absorbidos por 1 g. de florisil. Calculando experimentalmente los mg. de ácido láurico que son neutralizados por 1 cm3 de la disoluci6n de sosa y llamando a este valor "a", el VALOR DE ACIDO LAURICO será igual a 200 - xa, siendo x el volumen de sosa gastado en valorar el ácido remanente. Los val~ res encontrados experimentalmente para este in~ dice han sido de 100 o muy pr6ximos a 100 cuando la determinaci6n se hace ar•segundo día de a~ tivar el florisil. La determinaci6n diaria de es te valor, permite conocer oue el florisil puede permanecer con el mismo grado de actividad hasta quince días después de su activaci6n, si es gua~ dado al resguardo de la luz y humedad en un fras co color topacio herméticamente cerrado. No obstante, despues de quince días se puede usar el mismo florisil aumentando la cantidad del mismo a poner en la columna (normalmente de 10 g.) cantidad que establecemos según un criterio semejante al seguido por la FDA (131), por -101- la siguiente fórmula: g. de florisil = 100 I d" ~ 1 o X 10 n 1ce ac. aur1co 3.7.- ANALISIS CUALITATIVO DEL EXTRACTO ETEREO: Una vez hecha la purificación, el extracto es sometido al análisis ror GLC así como a diver sas pruebas de conf]rmación. 3.7.1 .- Condiciones de trabajo en cromatografía gaseosa: . - Columnas: las descritas en 3.1. a base de DC-200 y QF-1 - Temperatura en la estufa - Temperatura en el bloaue de inyección . . . . . . . . . . . . . ..... 320°C - Temperatura en el detector de ca~ tura de electrones ........... 210°C - Voltaje del detector de cantura de electrones: 1 ,S v., óptima para la obtención de la mejor respuesta. - Sensibilidad de registro: -102- La señalada en los cromatogramas: En General e~ tre 1/S1/10 (2,S x 1o-11 -S x 1o-11A), para el ECD con la que se obtiene una respuesta de media escala inyectando 1,S ng de heptaclor epQ xido, y entre 1/SO - 1/100 (2,S x 1o-10 - S . 1o-10A), para el detector de KClTD, con la que se obtiene una respuesta de media escala inyectando 1 ,S ng. de malati6n. En el detector de F.I.D. se ha trabajado siempre con igual atenua ci6n que en el ECD. - Caudal de gas portador Ni t.r6geno N-47: 1 20 ml/mn, en el detector ECD 24 ml/mn, en el detector FIDKClTD . Hidrógeno N-39: 24 ml/mn Aire: 300 ml /mn. - Cantidad de muestra = 2-8 ~1. - Velocidad de papel de registro S mm/mn. - Detectores: FID - ECD y KClTD. -103~ 3.7.2.- Detectores utilizados: El análisis nor cromatografía de gases ha sido realizado empleando tres detectores: el de captura de electrones (ECD), específico de sustancias con electroafinidad (clorados y fosfora dos principalmente), sensible a cantidades del orden de ng o pg; el de ionización de llama (F.I.D.), detector de alta sensibilidad del orden de ~g, útil en la detección de sustancias orgánicas en general; y el detector termoiónico de cloruro potásico (KClTD) específico de sustancias conteniendo fósforo o nitrógeno a las que puede detectar a nivel de Pg . Otros pesti cidas orgánicos sin fósforo o nitrógeno, no son detectados. 3.7.3.- Preparación del detector termoiónico: Este detector se ha preparado utilizando el detector de llama (FID) del cromatógrafo PerkinElmer F-11. La modificación consiste en la incorporación de una sal alcalina de forma permanente a la llama, en este caso se ha escogido ClK ya oue esta sustancia, entre las muchas propuestas (S04Naz ClK, S04C~, etc.) al tener como anión un -104- halógeno consigue eliminar la respuesta de este detector a los pesticidas clorados. Aquella adaptación, produce un notable incremento•en la respuesta del detector altamente selectiva para algunos pesticidas. Esto es debi do a que cuando los compuestos que contienen ni trógeno o fósforo, arden en la atmósfera de la sal alcalina incandescente, producen una intensa respuesta eléctrica, lo cual hace aue este detector sea altamente selectivo para organQÍO~ forados y carbamatos. El detector se prepara siguiendo las instrucciones del AOAC (85), fundiendo el KCl sobre una espiral de platino aue luego se coloca con~ céntricamente en el mechero dei detector de ioni zación de llama de tal forma aue este auede rodeado por aquella espiral y a una distancia del mechero no superior a 2 mm. A mayor altura, parece reducirse la selectividad de este detector para los fosforados. Para su construcción hemos utilizado un hilo de platino de 12,4 mm. de largo x 0,35 mm. de diámetro con el que se hicieron 7 vueltas de diámetro igual al jet del detector. Cuatro de ellas quedan separadas unos 2 mm., de las otras tres oue permiten adaptar esta pieza al pequeñísimo mechero (fig. 10a). Para su im- -105- con una disolución acuosa de leido sulffirico y anhídrido crómico es de gran eficacia. (ojo, oue de atacarse el acero del émbolo y agujas). 3.7.6.- Criterios de identificación y confirmación: El extracto, en una primera etapa es inyectado en el cromatógrafo provisto de la columna DC-200, el detector de captura de electrones (ECD) y uno de los otros dos detectores. Cuando la cromatografía es efectuada corree tamente y no aparecen respuestas importantes en los cromatogramas de los dos eluatos obtenidos en la columna de florisil, indica ausencia de pesticidas por encima de los límites de detectación. No hay aue olvidar aue la presencia de pesticidas puede estar limitada por el método de extracción, preparación de eluatos y nor las con diciones de la GLC. La aparición de un pico en un cromatograma indica, en principio, la presencia de una sustan cia. La asignación a un pesticida reouiere una serie de confirmaciones oue se fundamentan en la utilización de los criterios y métodos siguientes: -112- - ------------------ 3.7.6.1 .-Tiempo de retención relativos al aldrin.- Una vez obtenido el cromatogr~ ma, el primer dato que orienta sobre su identidad es el tiempo de retención (Tr) dado que este valor es constante para cada columna, siempre que se opere en idénticas condiciones. Para mayor seguridad, se calcula el tiempo de retención relativo al aldrín (Trr) y además de compararlos con los aue figuran en la biblio grafía (35) se comparan con los obtenidos por inyección de soluciones patrón de los pesticidas sospechados en la muestra, ya aue hemos com probado ligeras diferencias entre estos valores y los relacionados en la bibliografía (vease cua dro VIII). Aun así, como puede observarse en el cuadro citado, los tiempos de retención de algunos pesticidas son muy próximos entre sí por lo que este criterio resulta insuficiente para asegurar la identidad de una sustancia. Para salir de duda en aquellos casos en que la hubiese y en todo momento para confirmar la sospecha con aquellos otros más claros es conveniente observar el comportamjento en las siguientes pruebas. -113- - -~ -~ --------------- VALORE.<; "P" Y TIDIPOS DF. RFTF.NCION DE PESTICIDAS ORGANOCLnRADOS Y ORGASOFOSFORADOS. PE<;TIC l!JA ELUATO Trr (DC-200) . ;:::[ Valor "P" Trr (QF-1 (OC2 00)Hexano/Etanol-90 C<-HCH 10 0,39 0,45 - Linda no 1 o 0,47 0,57 0,46 \ HC'ptaclor 10 0,82 0,80 0,72 ~blatiún 2" 0,93 1,46 0,16 Aldrín 1 o 1,0 1,0 0,77 l!t•pt,1c lar1" 1,28 1,45 0,60 epnx ido pp'DDF. ¡o 1,81, 1,85 0,73 Di,,JJrín 2" 1,87 2,22 0,59 End r in z• 2,04 2,54 0,69 1 op'DDT 1" 2,46 2,43 0,74 1 Et i0n 20 2,50 2,73 0,45 J 1 Tri t ion 20 2,85 3,R5 0,58 1 pp'DDT 1. 3,03 3,15 0,65 -- QJADRO VIII -114- 3.7.6.2.- Empleo de la colummde florisil.- Como ya se ha indicado, la columna de florisil, no so lo es una técnica de purificación sino que al mismo tiempo es una técnica de separación que permite obtener pesticidas de Tr muy próximos en eluatos diferentes (cuadro VIII). De esta forma se puede asegurar por ejemplo que el pico con Trr 1,84 en DC-200, correspondiente a un cromatQ grama de un primer eluato, no puede ser el Dieldrín ya que éste se eluye en el segundo (veánse más detalles de esta operación en 3.6). 3.5.6.2.- Uso de distintas columnas en GLC.- De igual forma, los pesticidas con Tr iguales o muy próximos en la columna DC-200 de naturaleza apelar pueden presentar en la columna QF-1/DC-200, de naturaleza semipolar, Tr muy distintos, o a la inversa como sucede en el caso de el Malatión y Heptaclor epóxido. El Dieldrín y pp'DDE además de la se paración con el Florisil, quedan también diferen ciados haciendo uso de dos columnas de diferente polaridad. Además, la determinación cuantitativa de cada compuesto en ambas columnas, permite averiguar si en una de ellas existe alguna sus- -115- tancia. interferente. Como es lógico, sí en una de las columnas se obtiene una cantidad de pesti cida inferior a la calculada en la otra, dicha circunstancia sería explicada porque pesticida y sustancia interferente son cromatografiados sepa radamente entmas condiciones mientras que en las otras no. Existen sin embargo sustancias contami nantes interferentes, los policlorobifenilos (PCB) que tienen infinidad de componentes y alg~ nos de ellos con igual tiempo de retención al de muchos pesticidas, en ambas columnas. Este problema se resuelve· como luego veremos en la sección de pruebas químicas. 3.7.6.4.- Uso de los tres detectores (FID, ECD, y KClTD).- La identificación de los componentes separados por cromatografía de gases puede verse ayudada por la especificación de cada uno de estos detectores. Inicialmente se inyecta la muestra ' empleando simultáneamente los detectores de captura de electrones y el de ionización de llama de hidrógeno lo que permitirá observar que prescindiendo del disolvente que dará señal en am1-bos: -116- 1°.- Sí solo hay respuesta en el detector de 11~ ma de hidrógeno, la sustancia no tiene elec troafinidad y no tiene interés para este es tudio (ej.: Fig. 28). 2°.- Sí hay respuesta positiva en ambos detectores, es decir si aparece respuesta en los dos detectores con igual tiempo de retención, posiblemente no será una sustancia pesticida, pero habrá de confirmarse. 3°.- Sí solo hay respuesta en el detector de ca~ tura de electrones, puede asegurarse la pr~ sencia de una sustancia con electroafinidad y posiblemente de un pesticida. Igualmente habrá de confirmarse mediante otros criteriGs sefialados más adelante. Una vez obtenida la respuesta en aquellas condiciones se adapta una espiral de platino, i~ pregnada de ClK, al 'jet" del FID (vease 3.7.3) y despues de estabilizada la línea base, se procede a una nueva inyección. Los cromatogramas OQ tenidos ahora será~ por lo que se refiere al detector de captura de electrones, iguales a los anteriores. En tanto que los producidos por el detector termoiónico serán diferentes ya que al trabajarse a una sensibilidad al menos 100 veces menor, los picos antes detectados en llama pasa- -117- ran desapercibidos, pudiendo asegurarse sí aparece respuesta, la presencia de resíduos fosfora dos o carbamatos, los organoclorados, dada la p~ culiaridad de este detector, no dan ninguna respuesta (obsérvese este detalle en los cromatogr~ mas de la Figura 9). En caso de producirse respuesta positiva en el detector de KClTD, se vería refrendada por otra respuesta a igual tiempo de retención en el detector de captura de electrones y en todo caso por una prueba positiva de inhibición de ia colinesterasa. En el extracto de diclorometano (véase 3.9) y en consecuencia por las técnicas de confirmación usadas para estos pesticidas. ,. 3.7.6.5.- Valor "p".- Es un valor constante relacionado con el coeficiente de reparto, ~ue es determinado por distribución de un soluto (el pesticida) entre volúmenes iguales de dos fases inmiscibles previamente equilibradas (es decir saturadas una con otra) y a temperatura definida. Puede darse el caso de que un componente no pesticida, u otro distinto del sospechado, sea eluído de la segunda columna con el tiempo de re tención esperado para este. El problema menciona do se sub-sana hallando el valor "p" para los pi- -118- cos obtenidos en ambas columnas y en caso de correspond~al mismo pesticida, ha de dar un valor exactamente igual. Como es sabido, las cantidades de soluto que se distribuyen entre dos solventes no miscibles, es un valor constante a una determinada temperatura. Por la misma razón, la relación entre las áreas que en GLC determinan las cantidades de soluto que hay en uno de los solventes an tes y después de agitarlo con un volumen igual y equilibrado de otro solvente inmiscible, es también una constante, siempre que se opere en la zo na en que la respuesta es lineal. Esta razón se denomina en la literatura "pV" o valor "p", y permite la identificación de sustancias a nivel de nanogramo. Por nuestra parte, en la identificación de resíduos, hemos usado el sistema de solventes hexano-etanol 90. Procedimiento: En general se ha seguido el método propuesr to por la Food and Drug Administration (93). Se prepara una solución de diferentes pesticidas en hexano saturado de etanol (90%). S cm 3 de esta solución se agitan fuertemente durante 1' con -119- otros S cm 3 de etanol-90 previamente saturado de hexano y se dejan separar ambas fases. Se inyectan tres veces 4 ~1 de la solución patrón obteniendo una altura media "a" y a continuación otras tres veces, 4 ~1. de la fase superior (hexano) obteniéndose una altura media "b" lógicamente inferior. La razón "b/a" da directamente el valor "p", veanse los resultados en el Cuadro VIII. Estos valores han sido obtenidos operando con soluciones patrón que contenian: Heptaclor-epóxido 0,2 mg/1 Lindano Heptaclor Aldrín Dieldrín Endrín O,OS mg/1 o,os 0,1 0,1S O, 1 S 11 11 11 11 Malation Etion Trition pp 1 -:-DDE op 1 -DDE pp 1 -DDT 1 ' 2 0,8 1 '4 0,3 0,3 0,3 11 11 11 11 11 11 Estando por tanto dentro de los límites de la zona en que la respuesta del detector es función lineal ng/área. Cuando esta técnica se utiliza en la identi ficación de alguno de los picos ~e la muestra, es necesario: -120- -------- 1°.- Elegir el par de disolvente más adecuado; es decir, que si existe duda entre compuestos de Tr próximo ha de elegirse aquellos disol ventes que den un valor "p" bién diferenciable. En este sentido el par hexano:etanol de 90% (v/v) ha sido útil en la generalidad de los casos aun cuando a veces fué necesario recurrjr a otras mezclas. 2°.- Someter el extrato de la muestra a evaporación lenta para eliminar el eter de petró- \ leo, ya que este disolvente resultante de de la cncentración de un volumen muy superior, no presenta una composición definida constante y por ello no sixve para obtener los valores "p". Una vez obtenido el resíduo seco de los extractos se disuelven los resíduos en S cm3 de hexano saturado de etanol 90% operando de igual forma a como se ha indicado con la solución patrón. 3°.- Comprobar si el contenido en componente a in vestigar es tal que operando en las condicio nes indicadas existe una función concJárea lineal. De no ser así, se hace la dilución o concentración necesaria. -121- tiempo se enfría el tubo y se pasa a una ampolla de separación que contienen 20 ml. de agua desti lada y 20 cm 3 de eter de petróleo. Se agita, se dejan separar ambas capas y se retira la acuosa. Se lava la capa eptérea con otros 20 cm3 de agua • destilada, se recoge la etérea en un matraz·de 100 cm3, se deshidrata con so 4 Na 2 anhidro y se concentra hasta reducir el extracto a un volumen igual al primitivo. Si en la muestra solo había pp'-DDE*a la altura de este pico, una vez hecho este tratamiento~no quedará ningún pico con ese Trr, y aparecerá otro conrrespondiente a la diclorobnezofenona de Trr 0,89 (fig. 13). 3.7.6.7.c.- Confirmación del Aldrín: Aunque se han obtenido picos con tiempo de retención próxi mo a 1 en casi todas las muestras, en algunas de ellas por el tamaño alcanzado y por la ausencia de respuesta en FID no se podía admitir una procedencia natural. Por el Tr y la ausencia de respuesta en el dP.tector deKClTD parecía ser el Aldrín por lo que fué necesarja su confirmación, pues aunque se tratase de un caso esporádico que hacía pensar en una contaminación (dicho pesticida no lo contenían las aplicaciones), era importante poder descartar un coextractivo de esa importancia en las muestras. -128- 1 1. ' . i b ' 1. . i ¡. ' 1 e ' . ~ 1· 1 ¡ ,. 1 1. 1 ! ; i -,, -----¡- 1 1 T 1 .. -- . :. · .. L l. FIGURA 13.- a) Solución patrón de pp'DDI b) Solución pAtrón de pp'DDE dcspu6s del trat~micnto con ácido crómico. ~ .. l ¡ 1 ¡ 1 ' 1 ! -129- ': 1 ; :1 ! ¡' ¡ 1 ! i ! J .• ·-· •• ¡.,; 11 '1 i' . i 1 . '' ! -¡:_j;·c ¡. ! ' i ; . ¡ ... , . J' . ¡r. : 1 ; ¡ ; 1 ¡ ~= ' ! .~.; .. i ~ ¡ ' ' 1 ,_, ' . 1 . -- .-------1 ! . . h')J ¡. i i 1: j;., ' 1 1:; -- --1~ ; ¡;·· : --~-- j ~ 1 ''! . --- ----- j' . ' : . 1 ~~- -- ,. Procedimiento: Siguiendo el método empleado por NORF.N (90) se evapora una porción alícuota del extracto eté reo hasta 0,5-1 cm3 y el resíduo se pasa a un ma traz con 25 cm3 de benceno en el que se ponen a continuación: 2 cm3 de peróxido de hidrógeno al 30% (p/p), 1 cm 3 de ácido acético glacial y 1 cm3 de ácido sulfúrico concentrado. El matraz provisto de agitador magnético se tapa y se mantiene en un baño a 65° durante tres horas con agitación. Luego se pasa el contenido a una amp~ lla de separación de 125 cm3 lavando el matraz con pequeñas porciones de benceno. Los líauidos benc6nicos reunidos se lavan agitándolos con 25 cm3 de una disolución acuosa de sulfito ácido de sodio al 10% (p/v). Después de separar la capa acuosa, se lava la bencénica con otros 25 cm3 de una solución saturada de carbonato sódico y luego con porciones de 25 cm 3 de agua hasta aue esta quede neutra. La capa bencénica se deseca con sulfato sódico anhidro y se concentra a vacio y 35°C hasta obtención de una cantidad más o menos igual a la inicial aue a continuación se somete al análisis por cromatografía gaseosa. En caso de existir Aldrín en la muestra, el ácido peroxiacético a 65°C lo oxida a Dieldrín apareciendo este en el nuevo cromatograma obteni -130- 1 1 1 , n· 1 ~ 1 ! 1 J 1 . 1 - i \ 1 ! r --- ---):---- ;~-~-~ 7~~':~~3~==~=~~-~~~ - -f~=~-~- -~~~c-___ -_+j--.-_-l;C t=- --~ -- ______.,;::;::;.::::.3~ -¡ ' +-- -¡---¡-· . ----¡--:----. ' 1 1 i ·---¡---- -;··:--¡---t-.~- - ---:--- r . ·--¡-- t¡-- ···j·-~- _.__ __ ,______ 1 -¡- ., ... _ -:-C-----~ ~----~ --1-- J_:rJJ -¡-:~ ~- ~--:-~_:__ 1 1 1 ·:j. J:! ccl __ __, ___ --:-!--- r--i -- --r-·-- 1 - ----,--¡----¡----- ·;:- ~~--! ___ , -~--!_-----¡ __ ¡_ 11. ~- -- --~.---- --¡---- ----.---~ ---¡_ ---l~---1~-~:~-~~.-~ .. ¡-~- 1 ___ _¡_ ________ ......- ---- -1 ! ¡ ___ !_1 1 1 ., ___ j_J"---~----";" __ j ___ " 1 !~ ___ l __ _s:c ___ l ___ ó 1 o__~_ :. ___ ,:e ___ l .. ___ s 1 o_j __ o1 - .J--~~ ! : ! ~ , ~ , : . ! ~ r ! , ; ~ 1 --; -- __ ; ___ .-= ·---------··--------- -:---: -+·-' --!---~--~----- --T--~--: -]~~-e=-· ' 1 ~ 1 í ! ¡ j -·---- -- _' ___ ! ________ 1___ ~-. ___ ! __ . -------- ,----¡----------.--~---¡ ----'-¡-' -: ~~ -- 1 : ~~- ' 1 · 1 • T--¡ ' ' 1 1 ' ' 1 . ' ' ' . . .·-- -.: ~;- ~~=]:=-~~ ~~--}::±~i:--l~:t:~~=~=F=i:Zd __ : ___ - ' 1' 1 .~-\:¡ -----·-------! -·-- ·--·----- -·-- -·-----~--~ - ___________ ! ____ .,;. ___ _ :¡ 1 ,1:1~--:-¡ : 1 ' i , : 1 1 1 1 i . 1 1 ' .-1.:=rr:-~: ~=I~I:=-l_ -J-;J~-r- ·~~~s=J __ }il,= L ~~l_ . ! 1 : 1 i 1 __ -:-===~=--=~ __ i_l~"l_,·.'-~~-- , 1 1 1 • -::-. -"~ • ' 1 i ; 1 1 . 1 ' 1 ~ 1 10 1 '·· --=-~z~:=:-.~::~. : eo 1 7.0 1 EO ' 1 qo lC• r --·-~---· ~--<-;;-~:- ----;-----¡-e-:------;.·-¡--¡----¡---¡-- ::_ l -- ---: - - --- ¡_ . ' . . --l .. - .• 1- ... :: __ ~ ____ ¡_._,- . ___ ¡ __ 1 ~__ __ : _ ~~- -~ :r~=r ·-_-_ ;.. ' _ L:_J~~j __ ·_ ¡r __ ~--- 1: j 1 ! ',. l· 1 i !¡·1'! 2· l" -·-; ----- l . --~ .... ! f ~ t j ' : -= _ _::_.-:.. • ,--------·¡ ¡ -¡ !:·:-i:;.:,_,...:_.-'i:· . -!- : --1· ti .L.~ .. l ~--: 17- ~ .. ¡ t ' i ' ' ! ! . . " ! 1 ' : ¡ i : 11 " l ¡ _y ¡ ' ( ~ ;~--t~'--: :-.~-~-~=--=:==-..;==-: ---~---~~- --~- .. :==---1 ~--~7" ¡: .:·=[;;~' -. ;:_· FIGURA 14.- n; Cr0r1:1to;oraf!'l~l de ~!ddn oc :~\11 \IC i ÓO tr~; i~o bj (' rom.1 ti~:~~~il:::a de /. l<i r irJl~:-:: ;'UL·s d,• cpoxi.!.Jt.. ién e) CromJtO.'!-r:lrl::t de e: ,\•1¡- ';': d) Crom:ttr~~r:una tlr ~fj. (l• ~ z tlnpurs dl' ep~J i.!;IC i (•n -131- do (fig. 14). 3.7.6.7.d.- Confirmación del Dieldrín: Igualme~ te fué necesaria la confirmación química de uno de los componentes de los cromatogramas que, e~ porádicamente también, apareció en algunas mue~ tras y que por las demás pruebas parecía ser Dieldrín. Reactivo: 0,1 g. de Cl2Zn se disuelven en 2 cm3 de clorhídrico concentrado y se diluyen hasta 25 cm3 con etanol absoluto. Procedimiento: Siguiendo el método empleado por WIENCKE y BURQUE (91), una porción alícuota del extracto etéreo, conteniendo aproximadamente 0,1 ~g. de Dieldrín, se evapora a sequedad en un tubo de Kuderna y se disuelve el resíduo formado en 1 cm3 de eter de petróleo. Se añaden 0,5 cm 3 del reactivo y se agita para mezclar bien. Se coloca el tubo en un baño maría de tal forma que no entre agua y que el volumen sea reducido a no menos de 0,1 cm 3 en un tiempo no inferior a 10 minutos. Se saca el tubo del baño y se enfría a temperatura ambiente agitando a continuación con 1 cm 3 de eter de -132- petr6leo. Luego se añaden 2 ~3 cm 3 de agua, des·t,t lada y se agita de nuevo fuertemente durante 15 ' segundos. Por inyecci6n de la capa et@rea ten~ dremos un informe más de este componente que cromatografía con el Trr del Dieldrín (fig. 15). En caso de existir este, la ruptura del grupo ep6xido d~ lugar a la clorhidrina del dieldrin que tiene un Trr = 0,86. 3.7.6.7.e.- Confirmaci6n de PCB's: Tambi@n se ha dedicado atenci6n a estos componentes tan ~m pliamente distribuidos en la naturaleza (132) y cuya presencia en el suelo, aunque de escasa ~e ferencia ·, se sabe tiene muy lenta desaparici6n debido a la escasa presi6n de vapor que alean~ zan en la superficie de este medio (133).* Además de la utilizaci6n de las radiaciones ultravioleta, la utilización de las pruebas ~uímicas "a" y '~"para confirmación de pp'-DDT y pp'-DDE permiten poner de manifiesto la presencia de estos compuestos que (*) .- Estos contaminantes están constituidos por mez~ clas complejas de policlorobifenilos cuyas propiedades se parecen a las de los organoclorados relacionados con el DDT: son eluídos en el ¡er eluato en la columna de florisil y algunos de ellos tienen tiempos de retención coincidentPs con los isómeros del DDT. -133- 1 L i i --. r ¡------ 1 - L -=.:-.=::-_-- ------- -- ~-=~------- ,. ....::..:::::-:.:...~~-~::._ :..:.-:...-:-::· ___ _ -=.::.=;:_=~·::_-:__- - -134l..;r,.¡--:.!J ,¡,.,.,•!(•.:; .t .... , -..:.-:::.::: ---~~--_::;::::.:;.311>, ----~>- tr:-o taro¡ t•ntn .' - i": ~~ -~ - 1-~ ¡> 1 .--¡ 1 ¡::: '. no sufren alteración con dichas pruebas. Su investigación ha sido necesaria no solo por la posible procedencia natural sino también por la problemática del almacenaje en bolsas de plástico, ya comentada en 3.3.2. 3.7.6.8.- Espectrofotometria de I.R.- La espectrofotometría IR tan empleada en la caracterización de sustancias orgánicas, ha resultado de po ca utilidad para los extractos destinados a GLC, ya que los residuos encontrados en ellos pocas veces alcanzaron la concentración de 5-10 ~g. que se requiere para conseguir un espectro mediante la técnica de microcomprimidos. Para la obtención de microgramos es necesaria la utiliz~ ción de una gran cantidad de muestra y los coextraetivos diversos alcanzan valores tan altos, que dificulten la aplicación de esta técnica. Su utilización sería de interés sí después de seguir el proceso analítico normal, hubiese una respuesta posit~va en el detector de llama de hidrógeno, y como es sabido, esto solo ocurre cuando se encuentran en una cantidad del orden de microgramos. Aunque no hubo ocasión de utilizar esta técnica con el ~ropósito de identificar o confirmar pesticidas en los extractos de GLC, si se ha -135- ------~-------~----- ----- utilizado para confirmar la presencia, en suelos, de restos de fuel-oil (vease fig. 29). Esta técnica que no es viable en la identificación de los residuos que se determinan por GLC por trabajarse en ésta con una sensibilidad mayor, si es de gran valor en aouellas muestras con resultados altamente positivos en la inhibición de la colinesterasa, dado que el nivel de detección es de un orden parecido en ambos métodos analiticos. 3.7.7.- Interpretación cualitativa de los cromatogramas: A lo largo del análisis, empleando los cri terios y métodos expuestos, se han llegado a iden tificar la mayoria de los pi~os existentes en los cromatogramas. En los cuadros X, XI, XII, XIII, XIV y XV se expone el uso de los criterios de con firmación, figurando su aplicación al máximo núme ro de picos encontrado para cada tipo de muestra, aun cuando, alguno de ellos, solo se haya encontrado esporádicamente. Con la elucién sobre florisil, tiempos de retención en las dos columnas y uso de los tres detectores (Fig. 16, 17, 18, 19, 20 y 21) se pu~ -136- o .... o N Trr QF/DC 0,21 0,45 0,57 0,68 1 1,19 1,52 1,85 2,48 3,15 3,85 1--- 0,82 1,12 2,07 - Trr Resp !nc-2or FID 0,18 + 0,39 - 0,47 + 0,59 + 1 - 1,19 + 1,54 - 1,82 - 2,46 - 3,03 - ],58 - ---- 0,63 + 0,86 + ' 1,84 - 4,5 - SUELOS CRITERIOS DE IDE~TIFJCACION Resp PODRIA VALOR l'Rl1EBAS RESULTADO KClTD SER "p" -- - - i. -a-HCH - Sap .. ,nificación n-IICI! (1\0H) - Lindano 0,46 Saponificación Lind3no + (l\011) lmpt..rez.~ (eter -- - -C00'1 •t rPctivo n.ltur·a1 - Aldrin 0,77 Epo?<idaci0n A1dr1n (p.u:lci,t ico) Coextrac-tivo ---- n:aturnl ---- ('("'lpytractivo naru1·.11 0xid.1C. (.'ic .en pp'll!lE + FCB -pp'DDE 0,73 mico y r.1J .t;v -op'DDT 0,74 Sa¡;nn i f i (',,e i0n op'D!lT (KOil) . \ -pp'DDT 0,65 ~apf'nificélriñn pp'DPT + re a (KOil) Cr-<·xtracti\j ---- n;d ur:"' 1 -i ---- lr.;pure~a (eler1 ----Ir.-:pur(4 za (E:ter1 Clorhidrin2 ""' 1 - uieldrín 0,59 per.J~·~t i e o 1 DiE-ldr'ln j . ----Cnex L r'.'"- t 1. vo natura.i.. CUADRO X -137- r--- ----- 1 . ...; - ~ .. ~ i ' . ·-. L- . '1 FIGURA 17.- l"(a) y 2"(b) Eluatos en DC-200 (EC/FID) de muestras de rep0llo -144- --- ~~ ! ~;------: ! ..: )1 1 '¡ / ¡ l i. ¡·. ;-- 1 .. - .. ; ... i' \ , ,lo . l ( \. \' \. ) ~ ·, ..• --- r··- --- .. --~ --~~- ª '¡•"· 1 i i ' i i 1 1 ¡ . l. 1 i. ¡ ' 1 . ! . .. - ¡ i 1 ! 1 1 il: . 1 . : 1 1 1 +-~ ----j--~--+-- T ! T . 6? 7":' ___ . __ ":-.ft..- ' --.------ ·~ : ...!---~-----· -._-,__~--------- ------ --·--· .. -·-··----------------------- ,·~ ~ ' : -· 1 __ _[ _______ _ .... :J. ;f!-· : i . ' • .¡. ___ _ ! ="'--__.., ___ i:?-' ·===============-__;_ __ _ -:z:~~:;~~=-::·:- .. . - -· -- ------=-------- ,- ... Fff:URA 18.- ]0 (al y 2°(b) Eluatos en l!C-2110 (EC/FJD) de fllla'stras de grelos -145- ¡¡-____ . -'~--- : 1 ~ ----- -;-·· ---- _, --------~--- . ! --¡ -----l-•. --l---- . i ! 1·---L- ¡ i -- \ - - -· '¡ - -·- ¡ -- - --' . 1 - 1 ~:-:l---- --_' ~ ---~:..!.L__ -· ' ~- 1 '::1 __.->. ¡ ¡:. ---~~=---- 1·---~.f---___.:_=_====_===.,~===_=_=_=.=-~=============~=;::::::-·-:~___ :::;; __ :c,:==~-·-~:E, ·===. =====:1 .. z~ -- _<(-- .. L ·-- T---- ~- ·j·. -~. ·_ '( ¡.. ______ _ l ! '--~ . ¡ 1 .. ,. ··--·- ;- ! . ·-¡-- --; l __ _l __ _ -¡ 1 i 1 • --t ¡ 1 -- __ , -- ' ' ' 1 1 .1 1 l 1 ! • 1 - - t . --- • l - ' ---- 1 i • l. l .. _¡ ·-.'- : ¡-m··--_- ' 1 1' 1 ¡--· -i~ i -~-- ·¡li .. 'LIJ" e: .• --¡-- ! . 1 1 ' " 1 ¡ ; t -~ ____ ;_ ---l-- i . 1 ._J t,• ... . --~ -------==-r __ •---=~ccc=o=='"'"-"''==-===-=:.=:;:;::.:;::~,.-:--"'-1 --- ,---------------------------------- -------- --:--~-----·- --- ----- .. --- ~~--~-. -----,..~- -------- -~:"~--- ---:----~-----:-----:-··:-.·-~---~-:--.=:,-:.~==-----=-= :::-::::: _________ _ 1 -146- \ ! 1' _:¡ i .1 1 . - i. -147j. ! .. 1 1' ! ' 1 1 1 ,, 0 ' 1 ~ 1 ---- .• 1. ----------·~--·---Ji. . ., ' : f~: - ¡-· . t 1 ! . 1 : 1 1 -- -·' ¡ i 1 . ¡ : ' .. ! ¡ '¡ 1 i 1 ' : 1 , 1 , __ __1 _____ ; ___ .. L .. ___ L _ _j __ -----~-- ____ _ -~-:-·-··- ·r--·-····- .. 1 ' \. . ~ ' ~ 1 ~ ~ ¿ ~ ' 1 1 i - ! l 1 1 1 -148- ·..¡. 1 lQ') de deducir que algunos picos no son pesticidas y que otros es bastante probable que lo ~ean. En estos últimos se determina su valor "p" e incluso es necesario recurrir a las pruebas de confir mación en los siguientes casos: -En algunos casos se detectó Aldrín o Dieldrín y por la extrañeza de su procedencia, dichas muestras fueron sometidas a los tratamientos ya descritos para su confirmación (fig. 14 y 15). -En todas las muestras se ha hecho el tratamien to alcalino y oxidación crómica, pruebas con las que permanecen inalterables los PCB y son profu~ damente modificados los pesticidas. Mediante el tratamiento alcalino (Fig. 12), hemos llegado a la conclusión de que en algunas muestras de suelo, repollo y grelos, existe PCB coincidente con el pp'DDT (figs. 22b; 23 b y 24b) mientras que en las de patata, alubia y maiz (fig. 25b; 26b y 27b) carecian de este PCB. No obstante, en las muestras que lo contenian nunca llegó a ser un tercio del totaJ y fué descontado en el valor atribuído al pesticida. Mediante el tratamiento con el ácido crómico (Fig. 13), hemos comprobado que a excepción del repollo y maiz (Fig. 23c y 27c) las demás -149- --· •·····-·· ' ... ¡- - ••• 1 .. .... ,. o . i 1 1 1 , .. ¡;) .. t.---·- . ,., 1 t· i 1 :-. 1· ! . ·' :>:,\ --~-~-- í -· -~---··r--· • • ..~... .. 1 : . . . . . f \_. .. i 1 ·¡ t . 1 .. ¡ . -t ...... • .. • • • 1 • : 1 ; . ; ·----,_ __:,-. _ _¡ __________ • __ ·_ 1 ¡' ,f. .. , .. ' . ... ~ . - 1 --- ·" \ .:-; 5') 1 1 ¡-· -:-- --r __ !_ 6'J --~- .... : .. 1 i ---¡- : . -T--¡----¡-- --· 1 • -. -- ·-'--- 1 1 1 ,. 1 . ¡--~--- ... , ..... -. t - ~ •• ! ... ! . 1 ·¡ . ··:-•·. ¡ - .. 1 . ! --\ 10 :__------- ===:::::=--------~ ----------. --- ::=::J ---.-- ~ 1 ,· n 1 '-·- ·: i -150- r -·-T-]--1- .. ~..._ -- .!: ¡ ,] 1 ! ¡- - r-~-<-- ... 1 ¡ i .. ·- 1 "' ... .r··- ¡ . ---r~~+-· ~ l ----;---··¡·- ... L ¡ --¡-·· 1 1 1 --- ~-- 1 - a 1 : .-~ -, l!riiPA n .•• --- -- ~-. --_-- ,---· ,. 1 -· 1 í r<·:~,.,llnt ,· h 'r•·r 1 n In· lJ'Ifl; --- e {rrpnlln·.'Íc. -15111 J ... , .. rr6~ico) .J ! _, 1 lúO ., 1 ~- 1 ! 1 .. ; :i j ::e 1 ... ! .. :. l : ¡- . ¡ .. 1 --·- - _-1 ,. 1 . ! 1 J 1 1· .. i 1 r· ' 1· ·-·--·······: ¡-·.: 1 i 1 1---·t . . t· 1 1 . ·-····¡ 1 -· !• !···-· 1 1 ,. ·1· 1· 1 1 ·¡ ···! ... ¡ 1 ·! ·--- -------- ---- -152- . ·1 • '· 1 1 ¡ 1 : F'.J ····1 i ¡ ¡ : ~__:__ u 1(· l .-···- - ~. ¡· i •·· .. ' , ... ,. .. i i 1 1 ·¡ i .. ¡····· 1 1 .i. 1 l .. <::::::=::::::::~ .. ··; . .. l.... ¡. -···· .¡ .... :. ---- 1 ¡ : : ' !. t - -· ····------- - --·---r-----·.--------·--------t------- ... 1 1 1 ... o~ o . ~o "o 10 , ,, -.- -·- ••..• , -· 1 -.. • • . • . • • • • •. - --·l----1- --1--~·i·-·+·· ¡ - T·- ·:· -·-¡ ~- ~-----¡ 1 ··-¡--·-;·-··¡~:~--·- ·-==:·=· ···=· ===::::::__ ¡ ... ; ..... ··!- -:··------·¡--· :· ::> __ .L __ _l" ---~- -~----- ----~----- ~- --c-=c-- -153-