Obtención y estudio de concentrados de proteínas séricas y subproductos de clarificación procedentes de suero de quesería y suero desproteinizado de origen ovino

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE CIENCIAS CAMPUS DE LUGO Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Área de Tecnología de los Alimentos OBTENCIÓN Y ESTUDIO DE CONCENTRADOS DE PROTEÍNAS SÉRICAS Y SUBPRODUCTOS DE CLARIFICACIÓN PROCEDENTES DE SUERO DE QUESERÍA Y SUERO DESPROTEINIZADO DE ORIGEN OVINO Carlos Dias Pereira TESIS DOCTORAL Lugo, 2005 U UN NI IV VE ER RS SI ID DA AD D D DE E S SA AN NT TI IA AG GO O D DE E C CO OM MP PO OS ST TE EL LA A F FA AC CU UL LT TA AD D D DE E C CI IE EN NC CI IA AS S C CA AM MP PU US S D DE E L LU UG GO O D De ep pa ar rt ta am me en nt to o d de e Q Qu uí ím mi ic ca a A An na al lí ít ti ic ca a, , N Nu ut tr ri ic ci ió ón n y y B Br ro om ma at to ol lo og gí ía a Á Ár re ea a d de e T Te ec cn no ol lo og gí ía a d de e l lo os s A Al li im me en nt to os s OBTENCIÓN Y ESTUDIO DE CONCENTRADOS DE PROTEÍNAS SÉRICAS Y SUBPRODUCTOS DE CLARIFICACIÓN PROCEDENTES DE SUERO DE QUESERÍA Y SUERO DESPROTEINIZADO DE ORIGEN OVINO M Me em mo or ri ia a q qu ue e p pa ar ra a o op pt ta ar r a al l g gr ra ad do o d de e D Do oc ct to or r e en n C Ci ie en nc ci ia a e e I In ng ge en ni ie er rí ía a d de e l lo os s A Al li im me en nt to os s p pr re es se en nt ta a e el l L Li ic ce en nc ci ia ad do o C Ca ar rl lo os s D Dí ía as s P Pr r e er re ei ia a S Se ep pt ti ie em mb br re e d de e 2 20 00 05 5 D. Ángel Cobos García y Dña. Olga Díaz Rubio, Profesores Titulares del Área de Tecnología de los Alimentos del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela HACEN CONSTAR: Que la Tesis Doctoral titulada “Obtención y estudio de concentrados de proteínas séricas y subproductos de clarificación procedentes de suero de quesería y suero desproteinizado de origen ovino”, presentado por el Licenciado en Medicina Veterinaria D. Carlos Dias Pereira para optar al Grado de Doctor, ha sido realizada en la Facultad de Ciencias del Campus de Lugo, bajo la dirección conjunta de los abajo firmantes. Y para que conste su autorización para la presentación de la misma, se expide la presente en Lugo, a catorce de septiembre de dos mil cinco. Fdo. Ángel Cobos García Fdo. Olga Díaz Rubio El doctorando, Carlos Dias Pereira AGRADECIMIENTOS A la Universidad de Santiago de Compostela y, en concreto a la Facultad de Ciencias de Lugo, por acogerme y permitirme desarrollar los estudios de Tercer Ciclo y la realización de esta Tesis Doctoral. Deseo expresar mi agradecimiento a los Doctores Angel Cobos García y Olga Díaz Rubio por permitirme realizar la tesis bajo su dirección y por todo el apoyo que me han prestado en todo momento. A los miembros del laboratorio Feder, Lucía Medina y Albina Castro por todo el apoyo prestado en la realización del trabajo analítico. A todos mis compañeros del Departamento de Tecnología Alimentar de la Escuela Superior Agrária de Coimbra por su colaboración en muchas de las tareas ejecutadas en la planta piloto de productos lácteos. Un agradecimiento especial a David Gomes, Ivo Rodrigues, Jorge Arede, Jorge Viegas, Paula Oliveira, Helena Santa, Adélia Vaz y Lurdes Pires. A los alumnos de proyecto del curso de Ingenieria Alimentaria de ESAC, que han colaborado en los trabajos- Sylvain Piegay, Sónia Fernandes, Carla Jorge y Filipa Guimarães. A todos los miembros de Aula de Productos Lácteos por su apoyo y amistad. A la Consellería de Educación y Ordenación Universitaria de la Xunta de Galicia por la financiación de este trabajo con el proyecto de Investigación XUGA26202B97. A la “Fundação para a Ciência e Tecnologia” por la beca doctoral del programa PRAXIS XXI que me ha permitido la realización de los trabajos en España. A todos los amigos que me han hecho sentir como si Galicia y España fueron mi pueblo. Especial agradecimiento a Isa, Carmen, Gloria, Santi y a mis compañeras de piso Ana y Pachi que, se quedarán siempre como hermanas mías. ÍNDICES I I. INTRODUCCIÓN 1 I.1. ORIGEN E IMPORTANCIA DEL LACTOSUERO 2 I.2. COMPOSICIÓN DEL LACTOSUERO 5 I.2.1. Tipos de lactosuero y composición general 5 I.2.2. Principales proteínas 6 I.2.3. Lípidos 11 I.3. VALOR NUTRITIVO DE LOS COMPONENTES DEL LACTOSUERO 13 I.4. TECNOLOGÍA DEL APROVECHAMIENTO DEL LACTOSUERO Y APLICACIONES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 15 I.4.1. Introducción 15 I.4.2. Aprovechamiento del lactosuero sin modificar 17 I.4.3. Obtención y aplicaciones de productos derivados del lactosuero 21 I.4.4. Obtención de concentrados de proteínas de suero 23 I.4.5. Procesos de separación por membranas aplicados en la obtención de concentrados de proteínas de suero 28 I.4.5.1. Aspectos generales 28 I.4.5.2. Selectividad de las membranas y tipos de procesos 30 I.4.5.3. Materiales de membrana 33 I.4.5.4. Configuración de las membranas 34 I.4.6. El problema de la colmatación de las membranas en el tratamiento del lactosuero 38 I.4.6.1. Polarización de la concentración 38 I.4.6.2. Ensuciamiento o colmatado por obturación de los poros 39 I.4.7. Aplicaciones de los concentrados de proteínas de suero en la industria alimentaria 46 I.4.7.1. Productos lácteos 46 I.4.7.2. Productos cárnicos y pesqueros 48 I.4.7.3. Salsas, cremas y sopas 49 I.4.7.4. Productos de panadería, pastelería, confitería y aperitivos 49 I.4.7.5. Bebidas 50 I.4.7.6. Obtención de películas comestibles 51 I.4.7.7. Alimentos para grupos con necesidades nutritivas especiales 51 I.4.7.8. Aplicaciones en alimentos funcionales 52 I.4.7.9. Aplicaciones de productos de proteínas de suero modificadas 55 I.5. PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS DEL LACTOSUERO Y DE LOS CONCENTRADOS DE PROTEÍNAS DE SUERO 56 I.5.1. Solubilidad 57 I.5.2. Propiedades emulsionantes 59 I.5.3. Propiedades espumantes 62 I.5.4. Formación de geles 65 ÍNDICES II I.6. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS DEL TRABAJO 68 II. MATERIALES Y MÉTODOS 72 II.1. MATERIAL GENERAL DE LABORATORIO Y REACTIVOS DE USO GENERAL_73 II.1.1. Material 73 II.1.2. Reactivos 73 II.2. ORIGEN DE LAS MUESTRAS 74 II.3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS 76 II.3.1. Recepción de los sueros de queso y de suero desproteinizado (sorelho) 76 II.3.2. Clarificación de los sueros: precipitación termocálcica-microfiltración 78 II.3.3. Ultrafiltración de los sueros 80 II.3.4. Deshidratación de los productos líquidos 82 II.4. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN GENERAL 82 II.4.1. Análisis de los productos líquidos de los sueros de queso y de sorelho 82 II.4.1.1. Determinación del contenido de proteína y grasa 82 II.4.1.2. Determinación del extracto seco 83 II.4.1.3. Determinación del contenido de cenizas 83 II.4.1.4. Determinación del contenido de calcio 83 II.4.1.5. Determinación del pH 84 II.4.2. Análisis de los productos en polvo de los sueros de queso y de sorelho 84 II.4.2.1. Determinación del contenido de proteína total 85 II.4.2.2. Determinación del contenido de grasa 85 II.4.2.3. Determinación del extracto seco 86 II.4.2.4. Determinación del contenido de cenizas 86 II.4.2.5. Determinación del contenido de calcio 86 II.4.2.6. Determinación del contenido de fósforo 87 II.4.2.7. Determinación del contenido de cloruros 87 II.5. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN NITROGENADA DE LOS PRODUCTOS EN POLVO 88 II.5.1. Determinación de la composición proteica 88 II.5.2. Determinación del contenido de componentes nitrogenados no proteicos y de proteína verdadera 89 II.6. EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DE LOS PRODUCTOS EN POLVO 90 II.6.1. Determinación de la solubilidad proteica 90 II.6.2. Determinación de las propiedades emulsionantes 91 II.6.2.1. Determinación de la capacidad emulsionante 91 II.6.2.2. Determinación de la estabilidad de la emulsión 92 II.6.3. Determinación de las propiedades espumantes 93 ÍNDICES III II.6.4. Estudio de la capacidad gelificante 94 II.6.4.1. Preparación de los geles 94 II.6.4.2. Determinación de las propiedades reológicas de los geles 94 II.6.4.3. Estudio de la microestructura de los geles 95 II.7 ELABORACIÓN Y ANÁLISIS DE QUESOS DE SUERO ADICIONADOS DE DESHIDRATADOS DE RETENIDOS DE ULTRAFILTRACIÓN Y DE MICROFILTRACIÓN 95 II.7.1. Elaboración de quesos de suero 95 II.7.2. Análisis realizados en los quesos de suero 96 II.7.2.1. Determinación del contenido en extracto seco 96 II.7.2.2. Determinación de los rendimientos de fabricación 96 II.7.2.2.1. Rendimiento bruto 96 II.7.2.2.2. Rendimiento corregido 97 II.7.2.2.3. Recuperación de extracto seco 97 II.7.2.3. Determinación de la firmeza 97 II.7.2.4. Determinación del color 97 II.7.2.5. Estudio de la microestructura de los quesos de suero 98 II.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 98 III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 99 III.1. MANUSCRITOS 100 Manuscrito I 101 Manuscrito II 113 Manuscrito III 124 Manuscrito IV 137 III.2. DISCUSIÓN GENERAL 160 IV. CONCLUSIONES 170 V. BIBLIOGRAFÍA 172 ÍNDICES IV PRINCIPALES ABREVIATURAS EMPLEADAS EN EL TEXTO APS: aislados de proteínas de suero CPS: concentrados de proteínas de suero DF: diafiltración DFR: retenido de diafiltración líquido procedente de suero DFRP 0.20: retenido de diafiltración en polvo procedente de suero clarificado usando una membrana de microfiltración de 0,20 µm DFRP 0.65: retenido de diafiltración en polvo procedente de suero clarificado usando una membrana de microfiltración de 0,65 µm EAI: índice de actividad emulsionante ED: electrodiálisis ESR: estabilidad de la emulsión FCV: factor de concentración volumétrica FE: expansión de la espuma FS: estabilidad de la espuma MF: microfiltración MFF: filtrado de microfiltración líquido procedente de suero MFR: retenido de microfiltración líquido procedente de suero MFRP 0.20: retenido de microfiltración en polvo procedente de suero, usando una membrana de microfiltración de 0,20 µm MFRP 0.65: retenido de microfiltración en polvo procedente de suero, usando una membrana de microfiltración de 0,65 µm NF: nanofiltración OI: ósmosis inversa pI: punto isoeléctrico S: sorelho SDFR: retenido de diafiltración líquido procedente de sorelho SDFRP 0.20: retenido de diafiltración en polvo procedente de sorelho clarificado usando una membrana de microfiltración de 0,20 µm SDFRP 0.65: retenido de diafiltración en polvo procedente de sorelho clarificado usando una membrana de microfiltración de 0,65 µm SMFF: filtrado de microfiltración líquido procedente de sorelho ÍNDICES V SMFR: retenido de microfiltración líquido procedente de sorelho SMFRP 0.20: retenido de microfiltración en polvo procedente de sorelho, usando una membrana de microfiltración de 0,20 µm SMFRP 0.65: retenido de microfiltración en polvo procedente de sorelho, usando una membrana de microfiltración de 0,65 µm SS: sorelho desnatado SUFF: filtrado de ultrafiltración líquido procedente de sorelho SUFR: retenido de ultrafiltración líquido procedente de sorelho SUFRP: retenido de ultrafiltración en polvo procedente de sorelho SW: suero desnatado UF: ultrafiltración UFF: filtrado de ultrafiltración líquido procedente de suero UFR: retenido de ultrafiltración líquido procedente de suero UFRP: retenido de ultrafiltración en polvo procedente de suero W: suero WPC: whey protein concentrates WPI: whey protein isolates INTRODUCCIÓN α-lactalbúmina, inmunoglobulinas, la seroalbúmina y péptidos de bajo peso molecular, algunos de ellos derivados de la proteolisis de las caseínas (sobre todo de la β caseína). Además, contiene otras proteínas y varios enzimas, localizados sobre todo en la membrana del glóbulo graso (Walstra y Jenness, 1987; Walstra y col., 2001; Ye y col., 2002). La tabla I.2 recoge el contenido y ciertas propiedades de las principales proteínas séricas. Tabla I.2. Principales proteínas del suero bovino y algunas de sus propiedades. Adaptado de Morr y Ha (1993), Riera y col. (1996a) y Kilara y Vaghela (2004). % de las proteínas Leche Lactosuero Concentración en suero (gL-1) Peso molecular (kDa) pI β-lactoglobulina 7-12 48-50 3,0 18,3 5,1 α-lactalbúmina 2,5 13-19 0,7 14,2 4,2-4,5 Seroalbúmina 0,7-1,3 6 0,3 66,0 4,7-4,9 Inmunoglobulinas 1,9-3,3 8 0,6 15,0-100,0 5,5-8,3 Proteosa peptona* 2-6 20 1,4 4,0-80,0 - * Incluye proteosa peptona, caseína residual y proteínas menores. La leche de oveja tiene una mayor concentración en sólidos totales debido a su mayor contenido en grasa (6-8,5%) y en proteínas (5-5,5%) que la leche de vaca. Respecto a las proteínas séricas, la más abundante es la β-lactoglobulina, siendo los contenidos aproximados sobre el total de las proteínas más abundantes en el suero del 74% para la β-lactoglobulina, 14,8% para la α-lactalbúmina, 7,3% para la inmunoglobulina G y 4,1% para la seroalbúmina (Casper y col., 1998). La β-lactoglobulina es la proteína más abundante en el lactosuero de los rumiantes. Es una proteína globular constituida por 162 aminoácidos, con un peso molecular de 18.300. Existen diversas variantes genéticas, aunque las que suelen estar presentes con más frecuencia son las formas A y B, que son las más abundantes en los preparados comerciales (Hambling y col., 1992). Sus moléculas difieren en la sustitución de una glicina en la variante B por ácido aspártico en la variante A. Las características de procesado de la leche y las propiedades de los productos derivados están claramente asociadas con las diferentes respuestas a los tratamientos térmicos que se observan en las distintas variantes genéticas. Además, la molécula posee dos enlaces disulfuro y un grupo sulfhidrilo libre, y no contiene fósforo (Swaisgood, 1982; Creamer y 7 INTRODUCCIÓN Sawyer, 2003). Por debajo de pH 3,0 y por encima de pH 8,0, esta proteína existe en forma monomérica. Entre pH 3,1 y 5,1 a baja temperatura y alto contenido proteico se asocia formando octámeros. A otros valores de pH, incluido el de la leche, la β-lactoglobulina forma dímeros. Dada su abundancia en la leche bovina, muchas de las propiedades de productos como los concentrados de proteínas de este origen están directamente relacionadas con las propiedades de esta proteína (Kilara y Vaghela, 2004). Todavía no está clara la función biológica de la β-lactoglobulina y parece no ser esencial para muchas especies; así, por ejemplo, se encuentra en la leche de los rumiantes, de los babuinos y los macacos, mientras que está ausente en la leche de roedores, lagomorfos y humana. Dado que posee una zona muy hidrofóbica capaz de formar un enlace muy efectivo con el retinol, esta unión pueda tener un efecto regulador en la glándula mamaria. También esta proteína podría tener un papel nutricional (Creamer y Sawyer, 2003; Kilara y Vaghela, 2004). La α-lactalbumina es la segunda proteína más abundante en el suero lácteo. Tiene un peso molecular de 14.186, está constituida por 123 restos aminoacídicos, incluyendo ocho cisteínas que forman cuatro enlaces disulfuro, y no contiene grupos fosfato. Es una metaloproteína que fija fuertemente 2 átomos de Ca2+. Cerca del 10% de la α-lactalbumina bovina son glicoproteínas, aunque parece que esta característica no está relacionada con su función, ya que el grado de glicosilación varía mucho con la especie (Zhang y Brew, 2003). Existen dos variantes genéticas de la α-lactalbúmina, pero en las razas bovinas europeas sólo aparece la variante B (Walstra y Jenness, 1987). Esta proteína tiene un papel importante en la síntesis de la lactosa, modificando la actividad de la enzima galactosil transferasa (Brew y Grobler, 1992). Presenta además una secuencia aminoacídica coincidente en un 40% con la lisozima y un 20% más de los residuos muestran una estructura similar. Sin embargo, su actividad no afecta a los mismos sustratos y no está relacionadas antigénicamente (Kilara y Vaghela, 2004). La α-lactalbumina presenta la peculiaridad de que es más estable al calor en la presencia de calcio que cuando éste está ausente. En la mayoría de las proteínas el calcio promueve la formación de enlaces iónicos intermoleculares, que mantienen las moléculas proteicas cerca unas de otras y aumentan la posibilidad de agregación en el calentamiento. La 8 INTRODUCCIÓN α-lactalbumina emplea el calcio para formar enlaces iónicos intramoleculares, que tienden a hacer a la molécula resistente al desplegamiento térmico. Bajo condiciones favorables de concentración de calcio y pH, esta proteína puede permanecer soluble incluso después de someterla a temperaturas superiores a 100ºC (Swaisgood, 1996). La seroalbúmina presente en la leche es idéntica a la que se encuentra en el suero sanguíneo, apareciendo en ella por transporte pasivo desde el torrente sanguíneo a través de la célula secretora de la glándula mamaria. Tiene un peso molecular de 69.000, posee 17 enlaces disulfuro y un grupo sulfhidrilo libre; no contiene fósforo (Kilara y Vaghela, 2004). En la sangre tiene como funciones el mantenimiento de la presión osmótica coloidal y del pH, actuando también como proteína de reserva y como transportadora de ácidos grasos de cadena larga, hormonas esteroideas, bilirrubina e iones metálicos (Haggarty, 2003). Su capacidad para unir moléculas hidrofóbicas podría también desarrollarse en la leche, aunque su papel biológico en la leche no está claro y probablemente tenga poca importancia desde el punto de vista fisiológico (Walstra y Jenness, 1987; Haggarty, 2003). Las inmunoglobulinas (Ig) están presentes en el calostro y la leche de todos los mamíferos. Existen cuatro clases de inmunoglobulinas en la leche: IgG1, IgG2, IgA e IgM; todas ellas muestran una estructura básica similar, estando compuestas por cuatro cadenas peptídicas, dos ligeras de pesos moleculares de 20.000-25.000 y dos pesadas, de 50.000-70.000 (Swaisgood, 1982). La concentración de los distintos tipos de inmunoglobulinas varía en función de la especie, raza, edad, etapa de lactación y salud del animal; en la leche de vaca predomina la IgG. Su función biológica es proporcionar protección inmunológica a la cría contra microorganismos y toxinas, así como proteger a la glándula mamaria de infecciones (Marnila y Korhonen, 2003). Las inmunoglobulinas pueden afectar al procesado de la leche; así, cuando están presentes en elevadas concentraciones (por ejemplo en leches mamíticas o con calostro) inhiben o retardan la actividad de los coagulantes bacterianos y ralentizan las fermentaciones. Estas proteínas también contribuyen al desnatado por aglutinación de los glóbulos grasos, acción que se evita mediante tratamiento térmico o agitación (Marnila y Korhonen, 2003). Las proteosas peptonas se han definido como aquellas proteínas que permanecen en solución después de que la leche haya sufrido un calentamiento a 95ºC durante 20 minutos y se acidifique hasta pH 4,7 con 12% de ácido tricloroacético (Swaisgood, 1982). Esta fracción se puede dividir en cuatro componentes principales, aunque también hay otros minoritarios. El 9 INTRODUCCIÓN componente 3 de la proteosa peptona (también denominado lactoforina) se encuentra sólo en el lactosuero, no está asociado con la caseína y se ha sugerido que su origen es la membrana del glóbulo graso (Girardet y Linden, 1996). Es una fosfoglicoproteína y es en realidad una proteína nativa, por lo que el nombre de proteosa peptona no es del todo apropiado. Su peso molecular es de 28.000, correspondiendo 15.200-15.300 a la apolipoproteína; se ha detectado en leche de vaca y cabra. Desde el punto de vista biológico, esta proteína parece tener una función de defensa antimicrobiana y estimula el crecimiento de las bifidobacterias, entre otras actividades, aunque todavía su función biológica exacta se desconoce (Haggarty, 2003). Otras proteosas peptonas, como los componentes 5 y 8, están asociadas con la fracción caseínica de la leche, siendo en el caso concreto de estas dos en realidad productos de la proteolisis de la β-caseína (Swaisgood, 1982). Otro componente de carácter proteico presente en el suero y que proviene de la hidrólisis de una caseína es el caseinomacropéptido o glucomacropéptido. Procede de la escisión de la κ-caseína por acción de la quimosina y, por lo tanto, sólo está presente en los sueros dulces, los cuales proceden de quesos de cuajada total o parcialmente enzimática. El peso molecular del monómero varía entre 6.000 y 8.000, presentándose de esta forma a valores de pH inferiores a 4, mientras que por encima se polimeriza hasta alcanzar pesos moleculares de 50.000 (Riera y col., 1996a). El glucomacropéptido es capaz de suprimir el apetito por medio del estímulo de la liberación de la colecistoquinina pancreática, altera la producción de pigmento por los melanocitos, actúa como prebiótico y presenta acciones inmunomodulatorias, aunque su actividad biológica depende de su glicolisación (U.S.D.E.C., 2004a). Asimismo, inhibe la agregación plaquetaria y se ha empleado en alimentación infantil y de personas que padecen fenilcetonuria (Riera y col., 1996a). Existen también en el suero lácteo otras proteínas minoritarias que tienen importantes funciones y aplicaciones en la actualidad. Una de ellas es la lactoferrina o lactotransferrina, que es una glicoproteína capaz de enlazar hierro y cuya concentración varía mucho con la especie, estando presente en la leche de otros mamíferos en cantidades bastante más bajas que en la leche humana (1,48 g/l en la leche humana frente a 0,0012 g/l en la leche de vaca). Su acción antimicrobiana se encuentra ligada a su capacidad de secuestrar el hierro, reduciendo su disponibilidad para las bacterias (Fox y Flynn, 1992; Jovaní y col., 2001). Además es antioxidante, incrementa la biodisponibilidad de hierro, estimula el sistema inmunológico y modula la microflora intestinal. Precisamente debido a estas actividades, esta proteína se 10 INTRODUCCIÓN emplea en alimentos infantiles, funcionales y para deportistas. En cuanto a sus propiedades tecnológicas, la lactoferrina no se ve afectada por un tratamiento de pasterización estándar, aunque sí que pierde actividad antimicrobiana con los tratamientos UHT. Esta proteína parece proteger a los ácidos grasos insaturados frente a la oxidación y puede contribuir al incremento de la vida útil de alimentos enriquecidos con hierro y alto contenido graso (Korhonen y Marnila, 2003). Diversas proteínas minoritarias del lactosuero proceden de la membrana de los glóbulos grasos de la leche, representando alrededor del 1% de la masa del glóbulo (0,3-0,4 g/l de leche) (Keenan y Patton, 1995): la xantina oxidasa (Pm = 155.000), la butirofilina (Pm= 66.000) y la lactoperoxidasa (Pm = 78.000). Además de estas proteínas, en la membrana se encuentran muchas otras fracciones nitrogenadas con pesos moleculares comprendidos entre 13.500 y 208.000, y más de 25 enzimas (Walstra y Jenness, 1987). Entre estas enzimas asociadas a la membrana del glóbulo graso merece destacar la lactoperoxidasa. Es una glicoproteína con un peso molecular de 77.500. Ejerce como un agente antimicrobiano natural y está presente en el lactosuero dulce en una concentración de aproximadamente 30 mg/litro. Esta proteína presenta un amplio espectro antimicrobiano constituyendo, junto con dos cofactores (peróxido de hidrógeno y tiocianato) el sistema lactoperoxidasa. La efectividad del sistema depende de condiciones ambientales tales como el pH, la temperatura y la densidad celular. La presencia natural de la lactoperoxidasa puede utilizarse como un sistema de conservación de la leche durante un período corto de tiempo. Recientemente se ha añadido a yogures para prevenir la producción adicional de ácido durante el almacenamiento. También se emplea en la protección de la flora intestinal y para prevenir infecciones neonatales y también como antibacteriano en cosméticos (Bjorck, 1992; U.S.D.E.C., 2004a). I.2.3. Lípidos El 95% de los lípidos de la leche se encuentran en forma de glóbulos grasos, siendo al menos el 95% de ellos triglicéridos. La casi totalidad del 5% restante de lípidos está disperso en el suero de la leche y lo componen fosfolípidos (30-45%) y triglicéridos (40-55%) (Walstra y Jenness, 1987). 11 INTRODUCCIÓN Como aparece en la tabla I.1, el lactosuero presenta un contenido graso muy variable, dependiente sobre todo del tipo de leche, del tipo de queso y de la eficiencia del proceso de fabricación. Aunque la presencia de estos lípidos, que luego aparecen residualmente en productos derivados del lactosuero como los concentrados de proteínas, afecta de forma importante a las propiedades funcionales de las proteínas y a su utilización, se conoce poco acerca de ellos (Vaghela y Kilara, 1996b). Parece ser que una considerable proporción de los lípidos del suero se deriva de la presencia de glóbulos grasos de pequeño tamaño, aunque también tienen una gran importancia los fragmentos de la membrana del glóbulo graso que permanecen dispersos en una forma coloidal estable (Joseph y Mangino, 1988a,b; Hwang y Damodaran, 1995). La membrana que recubre los glóbulos grasos de la leche se forma en las células epiteliales de la glándula mamaria. Los materiales de la membrana constituyen el 2-6% de la masa total del glóbulo graso; esta variación en la proporción se debe al método empleado en su aislamiento (McPherson y Kitchen, 1983; Keenan y Dylewski, 1995). Tal como sucede en otras membranas biológicas, la membrana del glóbulo graso está formada principalmente por proteínas, lípidos y carbohidratos, en una relación aproximada de 4:3:1 (Deeth, 1997). El material lipídico consta de lípidos neutros, sobre todo triglicéridos, y de lípidos complejos, fosfolípidos y glicolípidos, en una proporción de aproximadamente 2:1. Los componentes de la membrana están íntimamente asociados unos a otros formando complejos, a menudo unidos covalentemente. De este modo, algunas proteínas son glicoproteínas y parte de ellas están unidas fuertemente a fosfolípidos y/o lípidos neutros (Deeth, 1997), formando lipoproteínas. La composición proteica es muy compleja, habiéndose detectado más de 40 polipéptidos diferentes, de los cuales al menos 8 son glicoproteínas, existiendo además diversas enzimas (buterofilina, xantín oxidasa, fosfatasas ácida y alcalina, etc.) (McPherson y Kitchen, 1983; Ye y col., 2002). La presencia de fragmentos de membranas de glóbulos grasos, junto con las características antes mencionadas de los lípidos que no forman parte de los glóbulos grasos, puede explicar que los fosfolípidos representen entre el 20 y el 30% de los lípidos totales (Baumy y col., 1990; Pierre y col., 1993). Los fosfolípidos predominantes en los sueros son la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina y la esfingomielina (Baumy y col., 1990; Vaghela y Kilara, 1996b), coincidiendo con los más abundantes en la membrana del glóbulo graso (McPherson y Kitchen, 1983). 12 INTRODUCCIÓN En cuanto a la composición en ácidos grasos de los lípidos de los lactosueros dulces y ácidos, los saturados representan aproximadamente el 63-67%, los monoinsaturados entre 28 y 30%, y los poliinsaturados 3,2-4,7% (Boyd y col., 1999; U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, 2004; Danish Institute of Food and Veterinary Research, 2005). Dentro de los ácidos grasos saturados, los más abundantes son el palmítico y el esteárico, tanto en los lípidos totales como en la fracción de triglicéridos. Sucede igual en la de fosfolípidos, aunque también hay cantidades considerables de C-22:0 y C-24:0. El ácido oleico es el más abundante de los monoinsaturados y el linoleico lo es de los poliinsaturados tanto entre los triglicéridos como entre los fosfolípidos. No obstante, en éstos también se detecta la presencia de otros poliinsaturados que no aparecen en los glicéridos, como son C-18:3, C-20:3 y C-20:4 (Boyd y col., 1999). I.3. VALOR NUTRITIVO DE LOS COMPONENTES DEL LACTOSUERO Las proteínas del suero poseen un valor biológico muy alto, superior al de otras proteínas de la dieta, debido a su contenido en aminoácidos esenciales. El alto contenido en aminoácidos azufrados (cisteína, metionina) parece relacionado con el incremento en la inmunidad y la capacidad antioxidante a través de la modulación del tripéptido glutatión. Además, el aporte elevado de algunos aminoácidos esenciales (Lys, Met, Thr, Ile) hace que suplementen de forma efectiva a las proteínas vegetales (Renner, 1992; Walzem y col., 2002). De hecho, exceden las recomendaciones nutritivas realizadas por la FAO/OMS tanto para niños como para adultos (Glass y Hedrick, 1976). Las proteínas de suero poseen también la cantidad más elevada de aminoácidos de cadena ramificada (Ile, Leu, Val) de todas las fuentes proteicas. Estos compuestos deben estar presentes en las células musculares para promover la síntesis proteica y además se pueden transformar en energía en el propio músculo, de forma que favorecen la recuperación tras un ejercicio intenso y retrasan la fatiga durante el mismo (Pasin y Miller, 2000). Por otra parte, durante la digestión, una cantidad importante de las proteínas de suero salen del estómago en forma intacta, mientras que otras sólo se hidrolizan a polipéptidos, y pasan al intestino con rapidez, donde se absorben así, a diferencia de las caseínas que se hidrolizan más (Boirie y col., 1997). La absorción de grandes moléculas en cantidades biológicamente activas se considera que tiene un papel importante en las diferentes respuestas fisiológicas e inmunológicas que contribuyen a su buena tolerancia. Aunque el principal papel de 13 INTRODUCCIÓN las proteínas del suero desde el punto de vista nutritivo es proporcionar compuestos nitrogenados a la dieta, hay varios efectos fisiológicos que poseen alguna de las proteínas mayoritarias y ciertos péptidos minoritarios, como son proporcionar protección pasiva frente a infecciones, modular los procesos digestivos y metabólicos y actuar como factores de crecimiento de células, tejidos y órganos (Walzem, 2004). Estos aspectos se tratarán con más detalle en el apartado I.4.7.8. La lactosa es otro de los componentes del suero de importancia desde el punto de vista nutricional. Su contenido varía bastante con el derivado de suero de que se trate; así, los sueros líquidos de partida contienen 4,2-4,8%, el lactosuero en polvo 68-73%, y los concentrados de proteínas oscilan entre el 46% de aquéllos que tienen un 40% de proteína, y un 5% de los que poseen una concentración proteica del 80% (Renner, 1992). La lenta hidrólisis de la lactosa durante la digestión da lugar a una generación prolongada de energía. Además incrementa la absorción de calcio, cinc y magnesio, y forma un sustrato útil para la microflora intestinal, estimulando el crecimiento de lactobacilos que generan ácido láctico en el intestino, de tal forma que inhiben a microorganismos menos beneficiosos; por lo tanto puede actuar como prebiótico (Renner, 1992; Walzem y col., 2002; Walzem, 2004). Las vitaminas hidrosolubles que están en la leche permanecen en el lactosuero de quesería en proporciones variables: 40-70% de la vitamina B12, 55-75% de la B6 y el ácido pantoténico, 70-80% de la riboflavina y biotina, y proporciones mayores de tiamina, ácido nicotínico, fólico y ascórbico, aunque este último se reduce mucho durante el procesado posterior (Reif y col., 1976; Walzem, 2004). La vitamina A es la más abundante de las liposolubles, y tanto ella como la D, E y K se retienen durante la ultrafiltración del suero. En cuanto a las del grupo B, sólo se retienen en el concentrado el ácido fólico y la vitamina B12 (Renner, 1992). Los sueros ácidos son más ricos en minerales, particularmente en calcio, fósforo y magnesio, que los dulces, algo que se traslada a los productos derivados de ellos. Sin embargo, las concentraciones pueden verse alteradas durante el procesado del lactosuero. Durante la ultrafiltración para fabricar concentrados (ver apartado I.4.4), los minerales unidos a proteínas se retienen junto a ellas, mientras que los solubles pasan al permeado, en el cual aparecen en concentraciones elevadas sodio, potasio y citrato. Las concentraciones de minerales se reducen 14 INTRODUCCIÓN mediante electrodiálisis y diafiltración, con el fin de mejorar las propiedades funcionales de los derivados del suero, aunque incide en el aspecto nutritivo (Renner, 1992; Walzem, 2004). I.4. TECNOLOGÍA DEL APROVECHAMIENTO DEL LACTOSUERO Y APLICACIONES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA I.4.1. Introducción El lactosuero constituye, debido a su composición y propiedades, una fuente de materias primas de gran valor económico y de enorme versatilidad. Esto, unido al alto poder contaminante que posee, ha hecho que se apliquen diversas tecnologías para aprovechar sus constituyentes. Sin embargo, también cabe utilizar el lactosuero como tal, sin grandes modificaciones, para otros usos. Un esquema de las principales tratamientos y los productos obtenidos a partir del lactosuero se recoge en la figura I.1. 15 INTRODUCCIÓN LACTOSUERO USO DIRECTO: Alimentación animal Fertilizante CONCENTRACIÓN DE COMPONENTES FRACCIONAMIENTO DE COMPONENTES CONVERSIÓN DE LA LACTOSA Fermentación Hidrólisis Ósmosis inversa Evaporación Deshidratación LACTOSUERO EN POLVO RECUPERACIÓN DE LACTOSA LACTOSA DESMINERALIZACIÓN REQUESÓN (calentamiento) LACTOSUERO EN POLVO DESMINERALIZADO Ultrafiltración Intercambio Iónico Otras técnicas CONCENTRADOS DE PROTEÍNAS DE SUERO Deshidratación AISLADOS DE PROTEÍNAS DE SUERO LACTOPEROXIDASA LACTOTRANSFERRINA α -LACTOALBÚMINA β -LACTOGLOBULINA INMUNOGLOBULINAS RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS Deshidratación BEBIDAS DE SUERO SUSTRATO DE FERMENTACIONES LACTOSUERO USO DIRECTO: Alimentación animal Fertilizante CONCENTRACIÓN DE COMPONENTES FRACCIONAMIENTO DE COMPONENTES CONVERSIÓN DE LA LACTOSA Fermentación Hidrólisis Ósmosis inversa Evaporación Deshidratación LACTOSUERO EN POLVO RECUPERACIÓN DE LACTOSA LACTOSA DESMINERALIZACIÓN REQUESÓN (calentamiento) LACTOSUERO EN POLVO DESMINERALIZADO Ultrafiltración Intercambio Iónico Otras técnicas CONCENTRADOS DE PROTEÍNAS DE SUERO Deshidratación AISLADOS DE PROTEÍNAS DE SUERO LACTOPEROXIDASA LACTOTRANSFERRINA α -LACTOALBÚMINA β -LACTOGLOBULINA INMUNOGLOBULINAS RECUPERACIÓN DE PROTEÍNAS Deshidratación BEBIDAS DE SUERO SUSTRATO DE FERMENTACIONES Figura I.1. Diagrama de procesado del lactosuero y principales productos obtenidos. 16 INTRODUCCIÓN disminuir la cantidad de Na, K, Cl y P. Si se pretende aplicar el suero a la elaboración de helados, es necesario reducir en un 50-70% los minerales para evitar la aparición de sabores salados. Las principales tecnologías empleadas para obtener este producto son la electrodiálisis y el intercambio iónico. La nanofiltración se suele utilizar como paso previo a este último método (Burling, 2003) y se tratará, al ser una técnica de separación por membranas y junto con la electrodiálisis, en el apartado I.4.5.2. El intercambio iónico es un tipo de cromatografía que consiste en hacer pasar el líquido a tratar (en este caso el lactosuero) a través de una columna que contiene resinas cargadas de iones que intercambian con los iones del líquido. Después de que la capacidad de intercambio iónico ha sido agotada, los iones adsorbidos deben eliminarse mediante una solución de regeneración apropiada. Las resinas modernas son materiales poliméricos porosos en forma de pequeñas perlas de unos 0,3-1,2 mm de diámetro. Químicamente actúan con ácidos o bases insolubles que cuando se convierten en sales permanecen en este mismo estado. Mediante esta técnica se puede conseguir una desmineralización del suero de 90-98%, permaneciendo en el mismo sin ser retenidas tanto la lactosa como las proteínas, las cuales no sufren desnaturalización (Burling, 2003; Smith, 2004). I.4.4. Obtención de concentrados de proteínas de suero Dentro de los productos derivados del suero destacan aquéllos en los que, aplicando diferentes tecnologías que eliminan lípidos, minerales y lactosa, se ha conseguido incrementar el contenido proteico o bien separar los diferentes tipos de proteínas séricas. Las proteínas del suero poseen un alto valor nutritivo y se emplean como emulsionantes, gelificantes o espumantes en numerosos alimentos; además, actualmente se aplican también como nutracéuticos. Los aspectos de funcionalidad de estas proteínas se abordarán en el apartado I.5. Los principales productos con alto contenido en proteínas séricas son los concentrados de proteínas de suero (CPS o “whey protein concentrates”, WPC), con 25-80% de proteína, y aislados de proteínas de suero (APS o “whey protein isolates”, WPI), con contenidos iguales o superiores al 90% (Foegeding y col., 2002). Los productos comerciales se obtienen a partir de lactosuero bovino. En la actualidad se pueden emplear para su obtención diferentes técnicas de filtración por membranas, tales como la microfiltración, la ultrafiltración, la nanofiltración y la ósmosis inversa, así como la electrodiálisis. Además, para la fabricación de aislados se utilizan técnicas de adsorción como el intercambio iónico (Foegeding y Luck, 2003). 23 INTRODUCCIÓN La figura I.2 recoge los pasos generales de la obtención comercial de CPS procedentes de sueros dulces, los más abundantes. Los pasos iniciales son semejantes a los seguidos en la obtención de lactosueros en polvo (apartado I.4.3). Tras la recepción del suero, y antes de someterlo al proceso de ultrafiltración (UF), es necesario eliminar los finos de caseína que pueda contener, así como grasa y cierta cantidad de microorganismos. Para ello se utilizan filtros rotatorios y separadoras centrífugas. Después el suero se pasteriza, con tratamientos de 72ºC durante 15 segundos o similar, y tras esto puede almacenarse en refrigeración hasta que se efectúe el procesado posterior, de forma que se minimice el deterioro bioquímico y microbiológico de las proteínas. El lactosuero ácido no suele pasterizarse, ya que el tratamiento térmico aplicado al pH de este suero (aproximadamente 4,6) puede producir una gran desnaturalización proteica. En ocasiones el suero ácido se almacena a temperaturas superiores a 52ºC, resultando suficientemente inhibitorio para los microorganismos y menos perjudicial para las proteínas (Hobman, 1992). Después el suero suele someterse a diversos pretratamientos alternativos antes de la ultrafiltración, tales como desmineralización, modificaciones enzimáticas o eliminación de grasa no eliminada por centrifugación. Estos restos de grasa están formados en gran parte por fosfolipoproteínas, capaces de colmatar las membranas de UF con rapidez, y su eliminación implica realizar ajustes de pH y/o temperatura, adición de calcio o agentes acomplejantes del mismo, y centrifugación o microfiltración, de manera que se eviten problemas durante los tratamientos posteriores y se logren CPS de elevadas propiedades funcionales (Hobman, 1992; Anónimo, 2005b). Tanto la colmatación como las técnicas de filtración por membranas se tratarán con mayor amplitud en el apartado I.4.5. A continuación el suero se somete a ultrafiltración con el fin de incrementar su contenido en sólidos, particularmente de proteínas. Cuando se desea producir CPS hasta un 70% de proteínas sólo se necesita ultrafiltrar, mientras que si se quiere un producto con un 80% es necesario efectuar una diafiltración del retenido, eliminando mayor cantidad de lactosa y minerales (Anónimo, 2005b). El retenido de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) se somete más tarde a un nuevo tratamiento de pasterización, pasando después a la etapa de evaporación. Suelen utilizarse evaporadores tubulares a vacío de película descendente y varios efectos, y las condiciones se seleccionan para minimizar el daño térmico de las proteínas del suero, empleando temperaturas de alrededor de 50ºC (Smith, 2004). Actualmente la etapa de evaporación puede eliminarse si se diseñan adecuadamente los equipos de UF, obteniendo 24 INTRODUCCIÓN concentrados con un nivel de sólidos apropiado para pasar a la etapa de deshidratación directamente (Hobman, 1992; Anónimo, 2005b). LACTOSUERO Eliminación de finos Desnatado Pasterización 72ºC, 15 s Pretratamientos Ajuste de temperatura a 50ºC UF / DF Agua Retenido Permeado o filtrado Enfriamiento a 4ºC Pasterización 65-72ºC, 15 s Evaporación hasta 25-50% sólidos totales Enfriamiento a 50ºC Deshidratación por atomización Agua Agua Envasado LACTOSUERO Eliminación de finos Desnatado Pasterización 72ºC, 15 s Pretratamientos Ajuste de temperatura a 50ºC UF / DF Agua Retenido Permeado o filtrado Enfriamiento a 4ºC Pasterización 65-72ºC, 15 s Evaporación hasta 25-50% sólidos totales Enfriamiento a 50ºC Deshidratación por atomización Agua Agua Envasado Figura I.2. Diagrama de elaboración de concentrados de proteínas de suero lácteo (adaptado de Hobman, 1992). 25 INTRODUCCIÓN La deshidratación del retenido se suele realizar en secadores por atomización, empleando aire caliente con una temperatura de entrada de 160-180ºC y de salida inferior a 80ºC. A veces se emplea después un secador de lecho fluidizado para finalizar la deshidratación. Debido a que el polvo obtenido es fino y poco denso, y puede perderse en gran cantidad en el aire de salida, además de dos separadores ciclónicos suele ser necesario colocar un filtro textil después del primero de ellos (Hobman, 1992; Anónimo, 2005a). La tendencia actual es producir CPS aglomerado y lecitinado de disolución instantánea (Anónimo, 2005a). Finalmente el CPS se envasa en sacos constituidos por varias capas de papel y polietileno, de unos 20-25 kg, directamente desde el último ciclón o bien desde silos de almacenamiento (Hobman, 1992). Los aislados de proteínas de suero contienen como mínimo un 90% de proteínas, un 4,0-5,5% de agua y el resto principalmente minerales. El método más utilizado en la obtención de APS es la cromatografía de intercambio iónico, que proporciona un nivel adicional de selectividad sobre el uso de membranas. El producto obtenido presenta mejores propiedades funcionales que los CPS, aunque también su precio es más elevado (Foegeding y Luck, 2003). La tabla I.3 muestra la composición de CPS y APS comerciales. Las variaciones en la composición y, por lo tanto, en sus propiedades funcionales, se deben a varios factores, tales como la composición de la leche y las condiciones de elaboración de los quesos. Estas condiciones son principalmente la pasterización de la leche, la adición de cloruro cálcico, el tipo de cultivo iniciador empleado, el agente coagulante y su concentración, el trabajo aplicado a la cuajada (corte, cocción y desuerado), el pH y la temperatura (Schmidt y col., 1984). También se ha señalado la influencia del procesado de los concentrados proteicos en la composición y propiedades, como los pretratamientos aplicados, el tratamiento térmico, la deshidratación o los procesos de membrana (Morr y Ha, 1993). Sin embargo, parece que los principales responsables de las variaciones en las proteínas (el componente responsable de la funcionalidad de estos productos) son los factores relacionados con la obtención del queso en los sueros dulces, o de la caseína ácida en los sueros ácidos, más que el propio procesado de los CPS y APS (De la Fuente y col., 2002). 26 INTRODUCCIÓN Tabla I.3. Composición de concentrados y aislados de proteínas de suero comerciales (% extracto seco). a Morr y Foegeding (1990); b Foegeding y Luck (2003); c U.S.D.E.C. (2004a). CPS a CPS 35% b,c CPS 80% b,c APS a APS b,c Composición general Humedad 4,1-6,0 3,0-4,5 3,0-4,5 2,4-5,6 4,0-5,5 Proteína 72,0-76,6 34,0-36,0 80,0-82,0 88,6-92,7 90,0-96,0 Nitrógeno no proteico 0,93-4,6 - - 0,29-0,34 - Lactosa 2,1-5,8 48,0-54,5 4,0-8,0 0,42-0,46 0,5-2,0 Lípidos totales 3,3-7,4 3,0-5,0 4,0-8,0 0,39-0,67 0,4-1,0 Fosfolípidos 0,80-1,5 - - 0,11-0,31 - Cenizas 2,5-6,0 3,1-8,0 3,0-4,0 1,4-2,2 2,0-3,4 Sodio 0,15-1,7 - - 0,36-0,42 - Calcio 0,23-1,1 - - 0,20-0,24 - Composición proteica β-lactoglobulina 40,4-76,9 - - 67,6-74,8 - α-lactalbúmina 14,5-24,8 - - 8,3-17,5 - Inmunoglobulinas 3,8-15,4 - - 5,9-7,5 - Seroalbúmina 5,8-19,6 - - 7,2-10,9 - En cuanto a otros productos de proteínas de suero, la lactalbúmina es el más antiguo. Este producto contiene un mínimo del 80% de proteína y se obtiene por calentamiento del suero hasta desnaturalizar, coagular y precipitar las proteínas. Después se separa el precipitado por decantación o centrifugación, se lava para eliminar el exceso de sales y lactosa, y finalmente se deshidrata. Debido al fuerte calentamiento, las propiedades funcionales de las proteínas se ven muy afectadas, por lo que este producto se emplea en alimentos en los que se desea incrementar su contenido proteico y donde no importa la funcionalidad, por ejemplo en galletas y productos horneados (Pearce, 1992). La aplicación de diversas técnicas, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la electroforesis, la ultrafiltración, la cristalización y la precipitación, permiten aislar proteínas 27 INTRODUCCIÓN individuales, no sólo las mayoritarias (α-lactalbúmina y β-lactoglobulina), sino también otras minoritarias, como la lactoperoxidasa, la lactotransferrina, las inmunoglobulinas, y otros productos como los péptidos biológicamente activos, obtenidos por modificación enzimática o química de las proteínas, con aplicaciones alimentarias o farmacéuticas (Castillo y col., 1996). Así, de forma habitual, tanto la α-lactalbúmina como la β-lactoglobulina se concentran mediante cromatografía de permeación en gel, procesado por membranas, intercambio iónico y precipitación selectiva (Idolo-Imafidon y col., 1997; Huffman y Harper, 1999). Los productos enriquecidos en inmunoglobulinas se obtienen mediante precipitación con sulfato amónico, intercambio iónico y procesado por membranas, mientras que la lactoferrina y la lactoperoxidasa se producen con un alto grado de pureza mediante intercambio iónico (Huffman y Harper, 1999). I.4.5. Procesos de separación por membranas aplicados en la obtención de concentrados de proteínas de suero Como ya se ha mencionado en el apartado anterior, muchos de los procesos de transformación del suero necesitan que los componentes proteicos del suero sean previamente aislados y purificados. Para el proceso de separación y purificación de las proteínas séricas, la centrifugación y, sobre todo, las tecnologías de membrana son las más utilizadas (Bramaud y col., 1997; Timmer y Van der Horst, 1998; Kiesner y col., 2000). I.4.5.1. ASPECTOS GENERALES Los procesos de membrana se emplean para concentrar o fraccionar un líquido, haciéndolo pasar a través de una membrana semipermeable, consiguiendo dos corrientes de diferente composición: la porción del mismo que contiene moléculas que no son capaces de atravesar dicha membrana, denominado retenido o concentrado, y otra porción líquida que contiene los compuestos que sí son capaces de atravesarla, el permeado o filtrado. Por lo tanto, el proceso de separación se basa en la permeabilidad selectiva hacia los diferentes componentes del líquido inicial. La permeación selectiva es el resultado además de una fuerza conductora, la aplicación de presión hidrostática; en función del tipo de separación que se realice se aplicará una presión más o menos elevada. Los mecanismos que gobiernan el transporte de masa en los diferentes procesos de membrana varían en función del tipo de membrana, las condiciones de proceso y la configuración del equipo. Habitualmente los distintos tipos de 28 INTRODUCCIÓN membrana se describen haciendo referencia a su tamaño de poro o a su punto de corte respecto a la masa molecular (Rosenberg, 1995; Singh y Heldman, 2001; Smith, 2004). Durante un proceso de filtración clásica, la suspensión a tratar se conduce perpendicularmente al medio filtrante. En estas condiciones, se produce una acumulación de materiales, formando una capa que disminuye la porosidad y, en consecuencia, el caudal de filtración (Cuperus y Nijhuis, 1993). La evolución del proceso no permite un trabajo de duración aceptable para las necesidades industriales. Los procesos de filtración frontal se mejoran mediante la introducción de un tercer componente, en forma de gradiente de velocidad paralelo a la superficie de la membrana. Este nuevo vector del proceso actúa a nivel del lado del fluido a concentrar. Así, la filtración tangencial es un proceso de membrana bajo la acción de un gradiente de presión, en el cual la membrana es barrida tangencialmente por el líquido que contiene las sustancias que se van separar. Este líquido ha de ser impulsado por una bomba, que crea el gradiente de presión suficiente para que el filtrado o permeado atraviese la membrana (Cohen-Maurel, 1990). El concentrado o retenido corresponde a la parte del líquido de alimentación que no atraviesa la membrana y en el que uno o varios de sus componentes aumentan su concentración respecto a la del líquido de alimentación. El flujo de filtración corresponde al caudal de permeado que pasa a través de una determinada superficie de membrana y normalmente se expresa en litros/hora m2. En los últimos treinta años, la evolución de los procesos de filtración y su expansión generalizada han estado condicionadas a la evolución de las membranas. Desde las primeras membranas fabricadas en acetato de celulosa, hasta la tercera generación de membranas minerales se han observado importantes avances. Los principales cambios de las membranas, que han permitido la expansión de las tecnologías de filtración fueron: la mejora de su permeabilidad selectiva y de la resistencia a temperaturas elevadas y a valores de pH extremos, la mayor resistencia mecánica, la disminución del volumen muerto, la facilidad de sustitución y la reducción del coste por m2 (Lewis, 1996; Cheryan, 1998; Saboya y Maubois, 2000). Las membranas existentes en el mercado, pueden ser clasificadas según diferentes criterios, tales como selectividad, naturaleza química, estructura, modo de funcionamiento y configuración geométrica. 29 INTRODUCCIÓN I.4.5.2. SELECTIVIDAD DE LAS MEMBRANAS Y TIPOS DE PROCESOS Según su selectividad se pueden distinguir los siguientes tipos de membranas y procesos que se aplican al procesado del suero y a la obtención de CPS: microfiltración, ultrafiltración, nanofiltración, ósmosis inversa y electrodiálisis. La microfiltración (MF) es un proceso que utiliza membranas con diámetros internos de poro de 0,1-20 µm y que separa partículas con pesos moleculares mayores de 200 kDa (Rosenberg, 1995). En función del tamaño del poro se pueden separar componentes del suero como restos de caseínas, fosfolipoproteínas o componentes de la leche desnatada tales como, células somáticas, bacterias y esporas (Fauquant y col., 1988; Trouvé y col., 1991; Maubois, 1997). Las presiones de trabajo utilizadas son inferiores a 0,2 MPa (Glover, 1985). La ultrafiltración (UF) es un proceso de membrana que separa componentes basándose en un filtrado molecular (Kelly, 2003). Las membranas poseen un tamaño de poro entre 0,015 y 0,10 µm, permitiendo separar moléculas con una masa molecular entre 1 y 200 kDa (Mistry y Maubois, 1993). En el caso de la UF del suero de quesería, la lactosa, el nitrógeno no proteico, las vitaminas hidrosolubles y las sales pasan a través de la membrana, mientras que se retienen las proteínas y la grasa. La elección del diámetro de los poros dependerá de la masa molecular y de la conformación de las moléculas que se pretenden separar (más concretamente de su radio de Stokes). Las presiones de trabajo utilizadas son menores de 1 MPa (Glover, 1985). La diafiltración (DF) se emplea para incrementar la recuperación de solutos permeables a través de la membrana durante procesos de UF o MF. El proceso de diafiltración consiste en diluir el concentrado, usualmente con agua, y después continuar la separación hasta lograr un grado satisfactorio de eliminación del soluto (Rosenberg, 1995). Permite, por ejemplo, lograr CPS con menor contenido en lactosa y minerales y mayor concentración proteica. La nanofiltración (NF) es un proceso de separación por membranas a presión elevada que es capaz (al igual que la ósmosis inversa) de invertir los efectos osmóticos de los líquidos. La NF está gobernada por fenómenos de transferencia de masa, consistentes en la difusión y flujo a través de los poros; se pueden emplear también membranas cargadas eléctricamente, de manera que se puedan seleccionar aún más los iones que pueden atravesarlas (Rosenberg, 30 INTRODUCCIÓN 1995). Además de servir para concentrar, las membranas de NF son parcialmente permeables a iones minerales y otros componentes de bajo peso molecular (dejan pasar compuestos con una masa molecular de entre 30 y 1000 Da), empleándose para desmineralizar (Kelly, 2003). Los iones monovalentes normalmente pasan al permeado mientras que los divalentes se concentran en el retenido (Bird, 1996). Los diámetros de poro se situan entre 0,001 y 0,015 µm. Las presiones de trabajo utilizadas se sitúan en el rango 0,7-3,5 MPa (Glover, 1985). Este proceso empieza a ser aplicado en la industria láctea con el objetivo de obtener retenidos con bajas concentraciones en sales, aunque en algunos casos también se reduce algo el contenido en lactosa (Kelly, 2003). La ósmosis inversa (OI) es un proceso en el que la membrana separa el solvente (en general agua) y solutos con pesos moleculares inferiores a 150 Da, de los restantes componentes de la solución. Esta separación se consigue aplicando presiones externas superiores a la presión osmótica, de forma que se logra un flujo de agua a través de la membrana contrario al que se produciría de forma natural (Singh y Heldman, 2001). Se puede considerar un caso puro de concentración de todos los solutos presentes. Los diámetros de poro son inferiores a 0,001µm. Las presiones de trabajo utilizadas se sitúan entre 4-8 MPa (Glover, 1985). Una de sus aplicaciones es la concentración del lactosuero mediante la eliminación de agua y minerales ionizados (Rosenberg, 1995). La electrodiálisis (ED) es un proceso de separación electroquímico por el cual se transportan ciertos iones a través de una o varias membranas selectivas permeables bajo la influencia de una corriente eléctrica continua, separándose así de compuestos no cargados eléctricamente (Batchelder, 1999; Bazinet, 2005). Por lo tanto es un método basado en el movimiento selectivo de iones en solución, de forma que las membranas de ED pueden ser permeables a aniones o a cationes, y no permiten en cambio el paso de agua a través de ellas (Singh y Heldman, 2001). Así, el proceso permite la separación de electrólitos de no-electrólitos, la concentración o la reducción de electrólitos en soluciones y el intercambio de iones entre soluciones. La principal aplicación de esta técnica en los sueros es la desmineralización, con el objetivo de producir CPS con un 25-90% menos de cenizas; las mayores reducciones se aplican en sueros destinados a la elaboración de alimentos infantiles (Grandison y Lewis, 1996; Batchelder, 1999). 31 INTRODUCCIÓN 32 Las figuras I.3 y I.4 muestran el espectro de separación de los componentes de la leche que poseen los distintos procesos de membrana según el tamaño de las moléculas y el diámetro de poro de las membranas empleadas en ellos. Figura I.3. Espectro de aplicación de los procesos de separación por membranas en la industria láctea (Alfa Laval/Tetra Pak, 1995). Figura I.4. Utilización de los sistemas de membrana para la separación de componentes de la leche, en función del tamaño de poro y de la presión de trabajo aplicada (Alfa Laval/Tetra Pak, 1995). INTRODUCCIÓN principal responsable del descenso del flujo de filtración, debido a la resistencia hidrodinámica. Cuando la concentración de solutos de la capa de gel alcanza el punto de sobresaturación, el ensuciamiento o colmatación de la membrana se inicia (Pal, 1993). También se atribuyen los efectos de la polarización de la concentración al incremento en la presión osmótica. Sin embargo, se considera que el efecto de la presión osmótica debe aplicarse a solutos de pequeños tamaños (< 100 kDa), mientras que la limitación ocasionada por la capa de gel es más probable con solutos de gran tamaño (Kelly, 2003). La polarización de la concentración se suele minimizar favoreciendo la turbulencia de la disolución (por aumento de la velocidad de desplazamiento o mediante un diseño adecuado del módulo de filtración), aunque también disminuye bajando la concentración de la alimentación (Pal, 1993; Rodríguez y col., 2002). 1.4.6.2. ENSUCIAMIENTO O COLMATADO POR OBTURACIÓN DE LOS POROS El ensuciamiento de las membranas es un factor limitante muy importante en los procesos por membranas, especialmente en UF y MF. Este fenómeno es irreversible, ocasionado por la deposición de partículas sólidas, macromoléculas, sales, etc., sobre la superficie o el interior de la membrana. Esto ocasiona un descenso del flujo de filtrado, generalmente rápido en las etapas iniciales y más lento posteriormente (Mulder, 1991). El ensuciamiento se atribuye a (Pal, 1993): - la acumulación o adsorción de macromoléculas o partículas coloidales, como proteínas, lípidos, microorganismos y/o sales inorgánicas, sobre la superficie de la membrana; - la precipitación de solutos permeables, tales como azúcares y sales, en los poros de la membrana. El fenómeno del ensuciamiento es muy complejo y depende de muchos factores físicos y químicos: concentración, temperatura, pH, fuerza iónica e interacciones específicas (enlaces de hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo) (Mulder, 1991). El ensuciamiento no sólo reduce el flujo, sino que también hace que las operaciones de limpieza sean más difíciles y caras. a) Ensuciamiento por deposición de proteínas En general se considera que la deposición de proteínas sobre la membrana juega un papel muy importante en el ensuciamiento. En la UF de sueros se ha observado que la βlactoglobulina y la seroalbúmina forman hojas de proteína sobre la superficie de la membrana, 39 INTRODUCCIÓN sobre todo cerca de la entrada a los poros, uniéndose además componentes de gran tamaño, como microorganismos, γ-globulinas, polímeros y complejos proteicos para formar una estructura de reja, en cuyos huecos quedan atrapadas proteínas más pequeñas (Lee y Merson, 1975, 1976). Las proteínas también se depositan en los poros de las membranas, aunque en mayor cantidad en las de MF, dado su mayor tamaño, que en las de UF; de cualquier forma, es mayor la deposición en la superficie, y ésta es la que domina el comportamiento de la membrana. Las proteínas adsorbidas están fuertemente unidas a la superficie y sólo pueden elimnarse mediante limpieza. Sobre ellas se sitúan muchas capas de proteína, más débilmente unidas. Cambios en la hidrofobicidad de la membrana y la diferencia de carga entre la membrana y la proteína pueden reducir la cantidad de proteína adsorbida; sin embargo, lo que más afecta al flujo de filtrado es la cantidad de proteína depositada y la porosidad de la multicapa proteica. Estos parámetros se pueden controlar modificando las propiedades de la corriente de alimentación, como el pH, la fuerza iónica, el contenido en calcio y el grado de agregación proteica (Marshall y Daufin, 1995). b) Ensuciamiento por minerales: La precipitación de calcio y fosfatos sobre la membrana produce un ensuciamiento importante. En el caso del tratamiento del lactosuero, cuando calcio y fosfato están presentes y las condiciones de operación son favorables (pH y temperatura elevados, concentración de calcio y fosfato, etc.) se produce la precipitación y este tipo de ensuciamiento prevalece, aunque con la participación de las proteínas siendo la capa formada densa y poco permeable. Si el contenido en iones de calcio y fosfato disminuye por efecto de un pretratamiento adecuado (por ejemplo, la agregación termocálcica, que elimina también fosfolipoproteínas), las proteínas son el principal constituyente de la capa de colmatación y ésta es más permeable (Daufin y col., 1992, 1993). c) Ensuciamiento por lípidos: Aunque no hay evidencias directas de que los lípidos del suero produzcan ensuciamiento, se han propuesto diversos pretratamientos del mismo con el fin de reducir su contenido lipídico que han mejorado los flujos de permeado (Muller y Harper, 1979; Fauquant y col., 1985; Maubois y col., 1987; Rinn y col., 1990). Sin embargo, no es posible determinar si estas mejoras se deben a la reducción lipídica o a cambios en el estado físico-químico de las 40 INTRODUCCIÓN proteínas y minerales debido a los pretratamientos. Es posible que la baja concentración de lípidos que suelen poseer los lactosueros corrientes haga destacar la influencia de los otros componentes en el ensuciamiento, ya que cuando los lactosueros poseen alto contenido lipídico se produce un colmatado muy severo y hace necesario reducirlo lo más posible con un pretratamiento (Marshall y Daufin, 1995). Los fosfolípidos presentes en el suero (0,2-0,4 g/l para la leche de vaca) (Christie y col., 1987) no se pueden separar mediante centrifugación debido a su íntima asociación con materiales proteicos (58% de ellos entran en la composición de la membrana del glóbulo graso y el restante 48% está asociado a proteínas como son la butirofilina o la xantinoxidasa) (Patton y Keenan, 1971). Su presencia origina problemas en el procesado posterior del suero y en los productos deshidratados obtenidos. Los fosfolípidos, que proceden de las membranas de los glóbulos grasos, se concentran durante las etapas del proceso de producción de deshidratados. Se ha señalado que la presencia de fosfolípidos en los CPS y en el suero antes de su concentración es negativa por varias razones. En primer lugar porque algunas de las propiedades funcionales y organolépticas de los CPS se ven alteradas (especialmente las propiedades espumantes) (Maubois, 1984; Maubois y col., 1987; Pearce y col., 1991); y, en segundo lugar y como ya se ha dicho respecto a los lípidos en general, porque afectan negativamente a los flujos de permeado durante la UF, por lo que el coste de producción de CPS se incrementa de forma significativa (Hiddink y col., 1981; Maubois, 1984; Muller y Harper, 1979). Este último efecto se debe a que, prácticamente de forma independiente al tipo de membranas que se utilicen en la concentración, las características anfifílicas de las fosfolipoproteínas hacen que éstas se absorban fácilmente sobre la superficie de las membranas (Lee y Merson, 1976; Maubois y col., 1987; Marshall, 1982). Debido a la complejidad del fenómeno de ensuciamiento o colmatación, los métodos para reducir este fenómeno son diversos (Mulder, 1991): 1) Pretratamiento del fluido a filtrar: El ensuciamiento de las membranas debido a los componentes de la leche y del lactosuero es extremadamente dependiente de las propiedades físicas y químicas del fluido tratado. El objetivo general de los pretratamientos es eliminar o inactivar los componentes químicos implicados en el ensuciamiento (Pouliot y Jelen, 1995). Los pretratamientos generales 41 INTRODUCCIÓN aplicados al fluido a tratar por membranas incluyen tratamientos térmicos, ajuste del pH, adición de agentes complejantes (EDTA, etc.), clarificación química, pre-microfiltración y preultrafiltración (Mulder, 1991). Actualmente se están proponiendo otros métodos de mejora del funcionamiento de las membranas en el tratamiento de fluidos lácteos, como altas velocidades de flujo cruzado, flujos cruzados pulsantes, inversión de la presión transmembranaria, promotores de turbulencia, ultrasonidos, módulos vibratorios o campos eléctricos (Brans y col., 2004). Por supuesto, los tratamientos aplicables dependerán fundamentalmente del tipo de fluido que se desee tratar. A la hora de elegir un pretratamiento, en concreto de un fluido lácteo, la selección de uno o varios procedimientos se basa en el conocimiento de sus factores de composición, analizando éstos de forma secuencial. La figura I.9 recoge un esquema de decisión básico. En el caso concreto de la obtención industrial de CPS, se suelen emplear uno o más procesos de UF; su desarrollo depende de forma muy importante de las propiedades físicas y químicas de la alimentación. Los pretratamientos disponibles para el suero suelen ser efectivos sólo para uno de los agentes responsables del ensuciamiento, y además deben adecuarse al diseño del sistema de membranas usado. Las proteínas séricas en forma nativa poseen una fuerte tendencia a adsorberse en los materiales poliméricos, como polisulfonas o poliamidas. Aunque no se conocen exactamente los mecanismos de la adsorción, se ha visto que en este tipo de membranas los tratamientos térmicos suaves disminuyen la colmatación. Para eliminar los fosfatos es necesario, bien precipitar o eliminarlos mediante EDTA o desmineralización, o bien disminuir el pH para asegurar su solubilidad. Sin embargo, este tratamiento puede no ser compatible con CPS con buena funcionalidad. En cuanto a los lípidos residuales, la única opción es eliminarlos (Pouliot y Jelen, 1995). Por lo tanto, siempre es recomendable algún tipo de pretratamiento del suero, sobre todo para aumentar el flujo de permeado en la UF, ya que el suero contiene muchos compuestos que ensucian de forma importante las membranas. Gran parte de los pretratamientos tenían como objetivo reducir el ensuciamiento de las membranas por la disminución del contenido en sales cálcicas mediante tratamientos térmicos (asociación de Ca2+ y proteínas) (Lee y Merson, 1976; de Boer y Hiddink, 1980; Merin y Cheryan, 1980), adición de complejantes y secuestrantes, eliminación de grasa y eliminación de caseína por filtración o decantación (Marshall, 1982). También se ha estudiado la utilidad de emplear quitosano en la eliminación de los lípidos residuales (Hawng y Damodaran, 1995). 42 INTRODUCCIÓN ¿PRESENCIA DE PARTÍCULAS EN SUSPENSIÓN? SÍ PREFILTRACIÓN NO ¿PRESENCIA DE COMPUESTOS RESIDUALES? LÍPIDOS PÉPTIDOS ENZIMAS CENTRIFUGACIÓN/ AGREGACIÓN CALENTAMIENTO Y / O PRETRATAMIENTO QUÍMICO NO ¿SISTEMA IÓNICO SOBRESATURADO? SÍ NO PROCESADO POR MEMBRANAS LACTOSUERO SÍ SÍ SÍ ¿PRESENCIA DE PARTÍCULAS EN SUSPENSIÓN? SÍ PREFILTRACIÓN NO ¿PRESENCIA DE COMPUESTOS RESIDUALES? LÍPIDOS PÉPTIDOS ENZIMAS CENTRIFUGACIÓN/ AGREGACIÓN CALENTAMIENTO Y / O PRETRATAMIENTO QUÍMICO NO ¿SISTEMA IÓNICO SOBRESATURADO? SÍ NO PROCESADO POR MEMBRANAS LACTOSUERO SÍ SÍ SÍ Figura I.9. Diagrama de decisión para la selección de pretratamientos que minimicen el ensuciamiento a largo plazo (Adaptado de Pouliot y Jelen, 1995). Los pretratamientos propuestos para la eliminación de los fosfolípidos han sido variados aunque algunos de ellos resultan muy costosos o bien inadecuados para la naturaleza alimentaria del producto final (Aragoza y col., 1996). Otros métodos conducen a la obtención de CPS de pH muy bajo, lo que limita su posterior utilización (de Wit y de Boer, 1975; Melachouris, 1977). 43 INTRODUCCIÓN Entre todos los pretratamientos, el método de precipitación termocálcica propuesto por Fauquant y col. (1985) ha sido el de mayor éxito. Se basa en la posibilidad de formación de compuestos fosfocálcicos bastante insolubles, del tipo CaHPO4.2H2O, Ca8H2(PO4)6.5H2O y Ca5OH(PO4)3 (hidroxiapatita), a temperaturas moderadas y pH próximo a la neutralidad. El método se basa en la modificación de una patente registrada en EEUU por Atterbery en 1971. La técnica consiste en ajustar la concentración de calcio a 1,2 g/l, el pH a 7,3-7,5 y calentar a 50ºC por 8 minutos. Con estas condiciones los fosfolípidos se agregan y precipitan con las proteínas que llevan asociadas (Baumy y col., 1990). La agregación producida permite que las sales fosfocálcicas queden retenidas en el concentrado cuando son sometidas a un proceso de microfiltración previo a la UF o puedan ser separadas por centrifugación como propusieron Wasen y Lehman (1989). Las reducciones de calcio y fósforo después del tratamiento son de alrededor del 60- 70%, mientras que se disminuye el contenido en nitrógeno en un 10%. Existe una extensa lista de trabajos en que la técnica basada en la precipitación termocálcica seguida de microfiltración o de centrifugación ha sido utilizada con el objetivo de optimizar la separación de los fosfolípidos y de mejorar las condiciones de procesado del suero y las características funcionales de los deshidratados obtenidos (Baumy y col., 1990; Rinn y col., 1990; Daufin y col., 1993; Gésan y col., 1993, 1995; Pierre y col., 1994; Karleskind y col., 1995a; Aragoza y col., 1996). Por otro lado, algunos autores han destacado las potenciales propiedades funcionales de las lipoproteínas extraídas (Joseph y Mangino, 1998a,b; Maubois, 1984; Maubois y Ollivier 1991). Así, la precipitación termocálcica seguida de MF se presenta como una técnica que permite mejorar mucho el rendimiento de la UF. Maubois y col. (1987) refieren mejoras en los flujos de ultrafiltración del orden de 1,8 veces, utilizando membranas de MF de 0,25 µm. Más recientemente, Martínez-Hermosilla y col. (2000) han estudiado un pretratamiento que combina agregación termocálcica, adición de EDTA y microfiltración de flujo cruzado de dos fases gas-líquido, tras lo cual efectuaban una ultrafiltración. Este pretratamiento mejora los flujos de UF, aunque se retiene una cantidad considerable de proteínas en el retenido de MF, disminuyendo su contenido en el concentrado de proteínas final. No obstante, concluyen que en caso de que este retenido de MF pueda ser aprovechado en otros productos o fines (contiene altos niveles de seroalbúmina e inmunoglobulinas), el pretratamiento podría tener aplicación práctica. 44 INTRODUCCIÓN 2) Propiedades de la membrana: Un cambio en las propiedades de la membrana puede reducir el ensuciamiento. Las membranas más susceptibles a un ensuciamiento más severo son las porosas (MF, UF), mientras que lo son menos las densas (OI). Así, un tamaño de poro estrecho puede reducir el fenómeno. Por otro lado, el uso de membranas hidrofílicas en vez de hidrofóbicas también puede disminuirlo, ya que las proteínas tienen más afinidad por estas últimas (Mulder, 1991). 3) Condiciones del módulo y del procesado: El fenómeno del ensuciamiento disminuye cuando se reduce la polarización por concentración. Por ello es efectivo el incremento de la turbulencia para prevenirlo (Mulder, 1991). 4) Limpieza: Aunque se emplee alguno de los métodos ya mencionados, siempre es necesario realizar una limpieza frecuente de las membranas. Hay tres métodos de limpieza, y la elección del más adecuado depende de la configuración del módulo, la resistencia de la membrana y el tipo de agente colmatante (Mulder, 1991): - Limpieza hidráulica: incluye la inversión del flujo, alternancia de compresióndescompresión y cambios de la dirección del flujo. - Limpieza mecánica: sólo posible en sistemas tubulares utilizando bolas de esponja de gran tamaño. - Limpieza química: es el método más importante y se emplean diferentes compuestos químicos por separado o combinados. Los más importantes son los ácidos (perclórico, cítrico), álcalis (hidróxido sódico), detergentes (alcalinos, no iónicos), enzimas, agentes complejantes (EDTA) y desinfectantes (peróxido de hidrógeno). 45 INTRODUCCIÓN I.4.7. Aplicaciones de los concentrados de proteínas de suero en la industria alimentaria Los concentrados y aislados de proteínas de suero presentan muchas aplicaciones en la industria alimentaria debido a sus excelentes propiedades nutritivas y funcionales: poseen un alto contenido en aminoácidos esenciales, son solubles en un amplio rango de pH, presentan propiedades emulsionantes, espumantes y gelificantes, entre otras; además su coste es relativamente bajo (Kilara y Vaghela, 2004). Por lo tanto se utilizan en la elaboración de productos lácteos, cárnicos, salsas, productos de panadería y confitería, bebidas y alimentos para deportistas, entre otros. A continuación se describen sus efectos en estos y otros productos. I.4.7.1. PRODUCTOS LÁCTEOS Las proteínas séricas pueden incorporarse a los quesos elaborados de manera tradicional, tanto en forma nativa como desnaturalizada, por diferentes métodos (Lawrence, 1993). Desde hace bastante tiempo se están añadiendo a la leche de quesería concentrados de suero líquidos obtenidos por UF con las proteínas desnaturalizadas por el calor, con el fin de incrementar el rendimiento y el valor nutritivo, aunque en ocasiones pueden aparecer sabores y texturas poco agradables (Jameson y Lelievre, 1996). Más recientemente se han desarrollado estudios sobre la adición de CPS a diversos tipos de quesos (Lucey y Gorry, 1994; Santoro y Faccia, 1996), así como de CPS y APS con proteínas particuladas, sometiendo estos productos a calentamiento y agitación simultáneos, obteniendo quesos con sabores normales o algo ácidos y con texturas más blandas lo que puede permitir desarrollar nuevas variedades de estos productos lácteos (Hinrichs, 2001). Los CPS también se añaden a quesos procesados y quesos cremosos para extender, incrementando la unión de agua y grasa sin afectar al sabor (de Wit, 1989). Se ha visto además que mejoran la textura, siendo más cremosa y con más cuerpo, mejoran el color y apariencia e incrementan el valor nutritivo al aumentar el contenido proteico y de calcio. Las cantidades empleadas varían con el tipo de producto de lactosuero: 4-8% de suero dulce en polvo, 1-5% de CPS ó 0,5-1% de APS (Young, 1999a). Los efectos del uso de CPS como sustituto parcial de la leche en polvo desnatada en la fortificación de la leche durante la elaboración de yogur son bastante variables sobre todo en la 46 INTRODUCCIÓN textura, ya que algunos autores afirman que no tiene apenas efecto en la firmeza (Jelen y col., 1987; Morris y col., 1995), mientras que otros han observado una disminución de la misma y mayor suavidad (Modler y Kalab, 1983; Guzmán-González y col., 1999; Remeuf y col., 2003); incluso en otros casos se ha señalado un incremento de la firmeza de los yogures (Lucey y col., 1999; Puvanenthiran y col., 2002). Estos diferentes resultados se pueden deber a los diferentes instrumentos y tests utilizados para medir la fuerza del gel o bien a las variaciones en la preparación de los CPS utilizados (Puvanenthiran y col., 2002). Por otro lado, parece que el uso de CPS reduce la sinéresis del yogur (de Wit, 1989; Hugunin, 1999; Puvanenthiran y col., 2002). Los concentrados de proteínas de suero convencionales solos o mezclados con proteínas de suero microparticuladas, cuando se emplean como reemplazantes de la grasa en yogures bajos en calorías, proporcionan una textura similar a la de los yogures enteros (Sandoval-Castilla y col., 2004). La industria elaboradora de helados ha buscado productos que puedan reemplazar parte de los sólidos provenientes de la leche desnatada empleada normalmente con el fin de ajustar los costes de elaboración (de Wit, 1989). Habitualmente se añaden a las fórmulas para fabricar helados un 10% de sólidos lácteos no grasos; cuando se añaden derivados del lactosuero se recomienda añadir 1,5-3% de CPS con 34% de proteína ó 0,5-2% de CPS con el 80%, e incluso cantidades menores para los APS, y aproximadamente el 7% de sólidos lácteos no grasos. Se pueden además obtener productos bajos en grasa. Proporcionan mayor estabilidad a la descongelación, sirven de sustitutos de otros emulsionantes e incrementan la incorporación de aire (Young, 1999b). Los productos con proteínas de suero, tanto concentrados como los permeados de UF obtenidos durante su elaboración, pueden utilizarse también para estandarizar el contenido proteico de la leche de partida para fabricar productos lácteos (Jelen, 1998; Tong, 2004). Además, en función del producto elegido, se podrá incrementar en mayor o menor medida el contenido en lactosa, aspecto que en algunos productos lácteos puede ser interesante (por ejemplo si se desea modificar el punto de congelación o el sabor dulce). En cualquier caso, esta estandarización no debería modificar apenas la relación natural caseínas:proteínas del suero y también es preciso controlar los posibles cambios en el contenido de nitrógeno no proteico, dada su influencia en el valor nutritivo y las propiedades funcionales (Tong, 2004). 47 INTRODUCCIÓN I.4.7.2. PRODUCTOS CÁRNICOS Y PESQUEROS El uso de ingredientes lácteos para reemplazar o suplementar la funcionalidad de las proteínas cárnicas es muy común. En los productos cárnicos, las proteínas han de poseer dos propiedades funcionales principales: la capacidad de retener agua y la capacidad de formar y estabilizar emulsiones. Además en algunos productos, como los tratados por el calor, es importante la facultad de formar geles por calentamiento (de Wit, 1989, 2003; Keaton, 1999). Los CPS, en concentraciones del 0,25%, incrementan tanto la capacidad emulsionante como la estabilidad de las emulsiones cárnicas, como se ha comprobado en carnes de diferentes especies (Kurt y Zorba, 2005). Además mejoran las características de loncheado, reducen las pérdidas por cocinado y los costes de fabricación, permitiendo sustituir en parte a las proteínas cárnicas y a otros componentes, como proteínas de soja y ciertos estabilizantes (almidón, alginatos, etc.) (Keaton, 1999). Así mismo, son útiles en la elaboración de jamones cocidos, siendo incluídos en la salmuera de inyección (de Wit, 2003). También se emplean en la fabricación de carnes reestructuradas, donde actúan en la unión de los trozos de carne especialmente durante el calentamiento al que se puedan someter durante su elaboración o previo a su consumo, debido a la capacidad de formar geles por calor (Keeton, 2004). Además actúan como “mimetizadores" de grasa, permitiendo fabricar productos cárnicos como hamburguesas o salchichas tipo Frankfurt con contenido graso reducido, añadiéndoles 3-4% de CPS (a veces combinado con carragenatos), con buenas características sensoriales y menores pérdidas por cocinado (Johnson, 2000b; Keeton, 2004). Mediante la adición de CPS se puede reducir el contenido graso de los productos por debajo del 10% (Mangino, 1999). También se ha utilizado un reemplazante de la grasa sólido, constituido por gel de proteínas de suero (enriquecido en β-lactoglobulina) particulado junto con hidrocoloides y cierta cantidad de grasa emulsionada, obteniéndose productos muy similares a los convencionales. Además se incluye en las líneas de fabricación sin problema y sólo es un poco más caro que la grasa (Pearce y col., 1998). También pueden resultar útiles en la fabricación de productos con contenido de sal reducido, empleando APS precalentados, presentando capacidades de retención de agua más altas, menores pérdidas por calentamiento y mejoras de textura sobre todo con un contenido en sal menor del 1,5% (Hongsprabhas y Barbut, 1999). La utilización de CPS en los productos pesqueros, en concreto los derivados del surimi, es básicamente como modificador de la textura, debido a su capacidad gelificante, y como 48 INTRODUCCIÓN Existen además compuestos no nitrogenados en el suero y sus derivados que son bioactivos. La lactosa es un prebiótico que promueve el crecimiento de bacterias beneficiosas y es precursor de otros compuestos bioactivos, como la lactulosa o el ácido lactobiónico (Walzem y col., 2002). Aunque la concentración de lípidos suele ser baja en el suero, las bioactividades de la esfingomielina y el ácido linoleico conjugado son de potencial interés sobre la salud. Los esfingolípidos complejos y sus productos de digestión, las ceramidas y esfingosinas, son compuestos con efectos en la regulación celular (Vesper y col., 1999). El impacto del ácido linoleico conjugado, dado su papel en la modulación del metabolismo de macronutrientes, se centra en aspectos como la prevención del cáncer, la obesidad, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares (Belury, 2002). I.4.7.9. APLICACIONES DE PRODUCTOS DE PROTEÍNAS DE SUERO MODIFICADAS En la actualidad se están realizando numerosas investigaciones relacionadas con productos derivados de las proteínas del lactosuero bovino modificadas, aunque en algunos casos ya existen productos comerciales. Uno de estos productos se elabora a partir de proteínas séricas sometidas en disolución a un tratamiento térmico de 70-90ºC durante 5-60 min, de manera que se sufran una desnaturalización pero sin que aparezca una agregación inmediata. Ésta se consigue posteriormente en frío mediante la adición de sales. Los productos obtenidos son útiles como reemplazantes de otros gelificantes y espesantes habitualmente empleados en la elaboración de productos cárnicos, postres o salsas (Bryant y McClements, 1998; Johnson, 2000b). También se está trabajando en el campo de la hidrólisis enzimática de las proteínas del lactosuero bajo condiciones controladas, que parece mejorar sus propiedades espumantes y emulsionantes, permitir la formación de geles sin aplicación de calor, e incrementar la estabilidad frente a los tratamientos térmicos; incluso se mejora la absorción intestinal en relación a la proteína intacta y puede reducir los fenómenos alérgicos (Doucet y col., 2001). Por otra parte, ya se encuentran en el mercado productos de proteínas del suero modificados, como los CPS extruidos, con un contenido proteico del 50%, que se aplican, con el fin de mejorar su textura y propiedades nutritivas, en barritas proteicas, cereales y en productos cárnicos (Foegeding y Luck, 2003). 55 INTRODUCCIÓN I.5. PROPIEDADES FUNCIONALES DE LAS PROTEÍNAS DEL LACTOSUERO Y DE LOS CONCENTRADOS DE PROTEÍNAS DE SUERO Las proteínas juegan un papel vital en la expresión de los atributos sensoriales de muchos alimentos debido a las propiedades físico-químicas únicas que poseen y que suelen denominarse propiedades funcionales. Existen numerosas definiciones de propiedades funcionales. Las propiedades funcionales de las proteínas se pueden definir como aquellos atributos físico-químicos que hacen que sean útiles en los alimentos, o bien como aquellas propiedades físicas y químicas que afectan al comportamiento de las proteínas en sistemas alimentarios durante el procesado, almacenamiento, preparación y consumo (Damodaran, 1996). Sin embargo, hay otros aspectos a tener en cuenta, además de estas propiedades fundamentales, para que un ingrediente proteico pueda ser utilizado: debe estar libre de componentes tóxicos y factores antinutritivos, de sabores, aromas y colores extraños, y ser compatible con otros ingredientes de la formulación, así como con los procesos a los que pueda ser sometido durante la elaboración del alimento (Morr, 1979; Kilara y Vaghela, 2004). Las propiedades funcionales de las proteínas se relacionan con sus propiedades físicas, químicas y estructurales intrínsecas. Éstas incluyen el tamaño, forma, composición y secuencia aminoacídica, carga neta y distribución de la carga, y relación hidrofobia/hidrofilia. Las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria, los enlaces inter- e intrapeptídicos (enlaces disulfuro), la rigidez o flexibilidad molecular en respuesta a los cambios ambientales, y la naturaleza y extensión de las interacciones con otros componentes son también importantes (Damodaran, 1996). Cuando se aplican en la elaboración de alimentos, las propiedades funcionales de los CPS se ven además influidas por su propia composición, la composición del alimento al que se añaden, y por las condiciones requeridas para la fabricación de éste. Por ejemplo, su funcionalidad está afectada por el pH y la composición iónica, la concentración de azúcares, estabilizantes, emulsionantes y lípidos en el alimento, además de por los tratamientos que sufre el mismo: tratamientos térmicos, congelación, concentración, deshidratación, etc. (Morr y Ha, 1993). Además las propiedades intrínsecas de las proteínas de suero están influidas por la fuente de suero, el pretratamiento y las condiciones de procesado; sin embargo, parece que las diferencias en funcionalidad en los CPS están más relacionadas con la modificación proteica durante la fabricación de queso o caseína ácida que el propio proceso de elaboración de los concentrados (De la Fuente y col., 2002). 56 INTRODUCCIÓN Existen diversas propiedades funcionales de las proteínas de interés: interacciones proteína-agua (incluye solubilidad, viscosidad, capacidad de unir agua), propiedades espumantes y emulsionantes, capacidad de formar geles, etc. La mayoría de los alimentos procesados son geles, emulsiones o espumas, y la capacidad de las proteínas de desarrollar estas estructuras está muy relacionada con su solubilidad (Damodaran, 1996; Zayas, 1997). A continuación describiremos las principales propiedades funcionales de las proteínas del suero en relación a sus aplicaciones en la industria alimentaria. I.5.1. Solubilidad La solubilidad es a menudo considerada como un prerrequisito para el desarrollo de otras funcionalidades y para que se pueda aplicar en la elaboración de numerosos alimentos (Kinsella, 1976). Las proteínas del suero nativas son altamente solubles, especialmente si se las compara con los caseinatos o la proteína de soja, en un amplio intervalo de concentraciones, valores de pH, temperatura, actividad de agua y condiciones iónicas (Morr, 1989). La solubilidad proteica tiene muchas definiciones, ya que las proteínas, en un medio acuoso, pueden formar soluciones verdaderas o coloidales, o suspensiones de partículas insolubles (Borderías y Montero, 1988). Desde el punto de vista termodinámico, la solubilidad de una proteína es la concentración de dicha proteína en el disolvente en un sistema con una o dos fases (solución proteica en fases líquido-líquido o líquido-sólido) en el estado de equilibrio (Vojdani, 1996). La solubilidad de las proteínas séricas está influida, además de por factores intrínsecos de las moléculas, por el pH de disolución, la fuerza iónica del medio y el efecto del calentamiento. La solubilidad de las proteínas del suero es pH-dependiente, de forma que la solubilidad disminuye a medida que desciende el pH hacia su punto isoeléctrico que se sitúa alrededor de 4-5 (Morr y Ha, 1993), aunque aún en este caso siempre es superior al 68% (Hung y Zayas, 1992). De hecho, la β-lactoglobulina es casi soluble al 90% a su pI en solución acuosa (1mg/ml en agua, pH 5,1) y la α-lactalbúmina en un 68% a pH 5,0 a la misma concentración (Vojdani, 1996). Esto hace que puedan ser empleadas en alimentos con pH ácido sin problemas, aunque la solubilidad de las proteínas del suero en CPS comerciales puede ser relativamente baja incluso a pH neutro y presenta una gran variabilidad; se han citado valores que oscilan entre el 35 y el 91% (de Wit y col., 1986; Liao y Mangino, 1987). Esta variación se ha atribuído a los 57 INTRODUCCIÓN tratamientos aplicados durante la obtención de CPS y APS, que pueden a veces producir cierto grado de desnaturalización, tendiendo a disminuir la solubilidad. Ésta no suele verse alterada por la ultrafiltración o la deshidratación por atomización, aunque sí por los tratamientos térmicos que puede sufrir el suero (Singh, 2003). El pH y la temperatura presentan una gran interacción entre ambos a la hora de influir en la solubilidad proteica (Pelegrine y Gasparetto, 2005). La temperatura es el factor más importante que afecta a la solubilidad de las proteínas de suero y sus derivados. En general la solubilidad aumenta al incrementarse la temperatura entre 0 y 40-50ºC. El incremento de la temperatura desordena progresivamente las moléculas de proteína y disolvente mediante la rotura de enlaces iónicos y de hidrógeno, que desestabiliza la estructura proteica y causa desplegamiento, reversible o irreversible. Cuando se produce el desplegamiento, los grupos hidrofóbicos (como los enlaces sulfhidrilo) inicialmente ocultos en el interior, interaccionan y reducen la unión con el agua. Si es irreversible, las interacciones proteína-proteína se intensifican y se produce agregación y precipitación (Robin y col., 1993; Vojdani, 1996). La β-lactoglobulina es muy sensible a la desnaturalización por el calor, aunque el grado de desnaturalización de ésta y otras proteínas del suero depende de otros factores, siendo mayor alrededor de su pI y disminuye con la concentración proteica (de Wit y Klarenbeek, 1984). El efecto de los tratamientos térmicos que puede sufrir el suero durante la fabricación de los CPS es fuente de contradicción entre diversos autores. La pasterización del suero puede causar hasta un 20% de desnaturalización con la consecuente pérdida de solubilidad según algunos (Singh, 2003), mientras que otros afirman que afecta muchísimo más el calentamiento del retenido de UF (Morr, 1987a); así, la solubilidad de los CPS no disminuye con un tratamiento a 65ºC 30 minutos (Schmidt y col., 1986), pero la pasterización del retenido a 72ºC 15 segundos la disminuye (Mangino y col., 1987). También una desnaturalización parcial, bien durante la obtención de los CPS o bien en el procesado de los alimentos a los que se añade, hace a la solubilidad de las proteínas mucho más sensible a los efectos del pH y de las sales (de Wit, 1984). En cuanto al efecto de la presencia de sales y la fuerza iónica, la solubilidad de las proteínas globulares se incrementa cuando lo hace la concentración de las sales neutras (salting-in) hasta alcanzar un máximo, a partir del cual si aumenta aún más la concentración disminuye la solubilidad (salting-out). En este punto hay una competencia entre la proteína y los iones de la sal por unirse al agua (Vojdani, 1996). Los CPS con alto contenido en cenizas suelen 58 INTRODUCCIÓN mostrar una baja solubilidad; en el otro extremo se encuentran los APS, obtenidos por intercambio iónico, que poseen un 95% de contenido proteico con valores cercanos al 100% de solubilidad (Morr, 1987b). En concreto, el contenido en calcio está correlacionado negativamente con la solubilidad. La solubilidad mejora si se sustituyen por iones sodio antes de la UF y la deshidratación, sobre todo a valores de pH entre 4,5 y 5,5 (Zayas, 1997). La solubilidad de los CPS se ve poco afectada por la adición de NaCl (Renner y Abd El-Dalam, 1991). La disolución de la proteína de los CPS implica una serie de fenómenos: a) dispersión de las partículas de polvo en el disolvente para permitir la hidratación; b) disociación de los solutos de pequeño tamaño y los complejos moleculares de proteínas mediante el debilitamiento de los enlaces inter- e intramoleculares; y c) reorganización de las estructuras de las moléculas proteicas mediante la rotura de enlaces electrostáticos y puentes de hidrógeno, para permitir que los residuos hidrofílicos se proyecten dentro de la solución, pero manteniendo los enlaces hidrofóbicos de forma que los residuos hidrofóbicos estén protegidos del ambiente acuoso (Morr y Ha, 1993). En la mayoría de los alimentos procesados, la elaboración se simplifica y la consistencia del producto mejora cuando se emplean ingredientes solubles y fáciles de dispersar. La solubilidad elevada es especialmente importante en bebidas y en sopas y salsas, de manera que no se formen precipitados o sedimentos. En otros productos, como productos cárnicos picados, aderezos de ensaladas, productos lácteos y de panadería, son más importantes otras propiedades funcionales, pero igualmente éstas se ven afectadas por la solubilidad proteica (Burrington, 2004b) I.5.2. Propiedades emulsionantes Un grupo muy importante de propiedades funcionales son las de superficie, que incluyen las propiedades emulsionantes y espumantes. Se deben a la habilidad de las proteínas para reducir la tensión interfacial entre componentes hidrofóbicos e hidrofílicos en los alimentos, y están estrechamente relacionadas con la solubilidad de la proteína (Bech, 1981). No obstante, las proteínas no sólo disminuyen dicha tensión, sino que también inhiben activamente la coalescencia mediante la alteración de las propiedades viscoelásticas de la interfase. El material adsorbido puede también prevenir la aproximación de las gotas de aceite (en las emulsiones aceite en agua) haciendo que las superficies tengan suficiente carga para repelerse o creando 59 INTRODUCCIÓN una capa superficial extendida, que también dificulta el acercamiento. Cuando las proteínas se adsorben en una interfase aceite-agua, las regiones hidrofóbicas de su molécula se sitúan, o posiblemente se disuelven de forma parcial, en la fase de aceite, mientras que las regiones hidrofílicas se disponen hacia la fase acuosa (Dalgleish, 2004). Una vez adsorbidas, algunas proteínas son capaces de interactuar químicamente formando enlaces disulfuro intermoleculares, como ocurre con la β-lactoglobulina o la α-lactalbúmina, (Dickinson y Matsumura, 1991; Damodaran y Anand, 1997) aunque esta reacción no ocurre en solución a menos que las proteínas estén desnaturalizadas por el calor (Foegeding, 1989). La desnaturalización superficial de las proteínas adsorbidas es parcialmente reversible en la α-lactalbúmina, pero causa cambios irreversibles en la β-lactoglobulina (Dalgleish, 2004). Cuando se habla de las propiedades emulsionantes, se emplean a menudo dos expresiones: capacidad emulsionante y estabilidad de la emulsión. La capacidad emulsionante es la cantidad de aceite que puede ser emulsionada por cierta cantidad de proteína antes de que se produzca una inversión de fase o que la emulsión se colapse. La estabilidad de la emulsión es la habilidad de una proteína para formar una emulsión y que ésta permanezca sin cambios por un cierto período de tiempo y bajo determinadas condiciones (Hill, 1996). Además se suele manejar otro concepto, el de actividad emulsionante, que se refiere a máxima área interfacial por unidad de proteína de una emulsión estabilizada en sistemas bien definidos (de Wit y col., 1988). En general, la capacidad emulsionante de los CPS es baja en relación a su actividad emulsionante y a la estabilidad de las emulsiones que forma (Renner y Abd El-Salam, 1991). La concentración de proteína, el tipo de la proteína, el pH y la concentración en sales afectan la capacidad emulsionante de una solución proteica (Klemaszewski y col., 1992; Cayot y Lorient, 1998). Otros factores que afectan la capacidad emulsionante son la competencia entre proteínas (Dalgleish y col., 1991) o entre proteínas y otras moléculas (p.ej. fosfolípidos) (Dickinson y Tanai, 1992) para la adsorción en la interfase. Se ha observado que la capacidad emulsionante de la β-lactoglobulina es superior a la de la α-lactalbúmina y la seroalbúmina (Klemaszewski y col., 1992; Zayas, 1997); esto se explica por el hecho de que las dos últimas poseen una integridad estructural (debida a la presencia de puentes disulfuro) que les impide una rápida dispersión en la interfase, lo que origina una película más débil. La β-lactoglobulina es más flexible y produce gotículas más pequeñas, 60 INTRODUCCIÓN películas más fuertes y, por consecuencia, emulsiones más estables. La disminución de la fuerza iónica hace aumentar la cantidad de aceite emulsionado para todas estas proteínas, lo que indica la importancia de las interacciones electrostáticas en la reducción de la coalescencia. En cuanto a la concentración de proteína, se ha observado que cuando ésta aumenta, el tamaño de las gotas de grasa disminuye (Pearce y Kinsella, 1978) y que la estabilidad de la emulsión se ve incrementada al facilitar que exista mayor cantidad de proteína adsorbida (Zayas, 1997). Cerca del pI de las proteínas del suero (entre pH 4 y 5) se observa una disminución de sus propiedades emulsionantes debido al descenso de su solubilidad. Sin embargo, existen otros factores por los que en el pI la capacidad emulsionante pueda aumentar, como es el aumento de enlaces hidrofóbicos entre lípidos y proteínas (Borderías y Montero, 1988). En el caso de las proteínas del suero, Klemaszewski y col. (1992) comprobaron que con excepción de la βlactoglobulina, el comportamiento emulsionante es independiente del pH. Lorient y col. (1991) refieren que las proteínas del suero presentan buenas propiedades emulsionantes excepto a valores de pH entre 4 y 5 si se presentan desnaturalizadas por acción térmica. También estos autores han observado que a valores de pH entre 3 y 5 la α-lactalbumina predomina sobre la βlactoglobulina en la superficie de las gotículas de grasa de las emulsiones, mientras que, con valores de pH entre 7 y 9 la β-lactoglobulina predomina sobre todas las otras proteínas séricas. Por su parte, Walstra y col. (2001) refieren que las proteínas séricas desnaturalizadas por el calor son poco eficaces en estabilizar emulsiones, pero también afirman que la desnaturalización con valores de pH elevados no es tan perjudicial. El comportamiento frente al pH es algo diferente en las proteínas de suero individuales en relación a los CPS, ya que éstos presentan buenas propiedades emulsionantes en aderezos para ensaladas con un valor de pH de 4,0 y en emulsiones cárnicas (de Wit, 1984). El incremento en la fuerza iónica disminuye las interacciones entre proteínas basadas en la carga y consecuentemente produce el mismo efecto que los cambios de pH hacia el pI (Robin y col., 1993). La pasterización de la leche para la fabricación de queso o el suero que se produce durante la misma no parece afectar negativamente a las propiedades emulsionantes, aunque sí que disminuye la capacidad emulsionante de una manera clara si se pasteriza el retenido de UF (Mangino y col., 1987), al igual que sucede con la solubilidad. A diferencia de lo que sucede con 61 INTRODUCCIÓN otras proteínas, el calentamiento de la β-lactoglobulina produce un descenso de la hidrofobicidad superficial comparado con la que presenta la proteína nativa, lo que da lugar a un empeoramiento de las propiedades emulsionantes (Damodaran, 1996). Los efectos desestabilizantes de las moléculas de lípidos sobre la capacidad emulsionante de las proteínas fueron demostrados sobre todo para fosfolípidos y monoglicéridos. Este hecho se debe a su capacidad de reducir la cantidad de proteína adsorbida en la interfase con las gotículas de grasa (Yamanchi, 1980). Cayot y Lorient (1998) afirman que, con la adición de mono y diglicéridos a una emulsión estabilizada por proteínas séricas no desnaturalizadas térmicamente, se observa una disminución de la cantidad de proteína adsorbida sin que se modifique el tamaño de las gotículas de grasa. Así, sugieren que en estas condiciones, la separación no se ve afectada por las modificaciones en la reología del medio dispersante. Los lípidos y surfactantes de baja masa molecular también afectan la formación de espumas porque compiten con la proteína en los locales de adsorción en las interfases (Vaghela y Kilara, 1996a). Karleskind y col. (1996) observaron que el contenido en fosfolípidos de los CPS se correlacionaba positivamente con el tamaño de las gotículas de la emulsión y con la intensidad de separación de la grasa, y que CPS con bajos contenidos en lípidos presentan emulsiones más estables. El contenido en cenizas de CPS se correlaciona positivamente con sus propiedades emulsionantes. Blecker y col. (1997) observaron mejoras en las propiedades emulsionantes y espumantes de CPS a pH 7 y 4, después de hidrólisis enzimática de la grasa residual. Patel y Kilara (1990) refieren que la grasa libre y ligada se correlacionan negativamente con las propiedades emulsionantes y espumantes de CPS mientras que las cenizas, el calcio y la entalpía de desnaturalización de las proteínas se correlacionan positivamente con aquellas propiedades. La información recogida por estos autores confirma el interés en utilizar técnicas de eliminación de la grasa residual en el proceso de producción de CPS. I.5.3. Propiedades espumantes Una espuma es un sistema coloidal que contiene burbujas de aire dispersas en una fase acuosa continua; estas burbujas pueden ser esféricas o poliédricas (Damodaran, 2005). La formación de una espuma puede describirse como la creación y estabilización de burbujas de gas en un líquido. Un factor esencial para la formación de espumas a partir de soluciones proteicas es la difusión rápida de las proteínas a la interfase aire-agua para reducir la tensión 62 INTRODUCCIÓN superficial, seguida del desplegamiento parcial de la proteína, orientándose los grupos hidrofílicos e hidrofóbicos hacia la fase acuosa y no acuosa, respectivamente. Esto da lugar al encapsulamiento de las burbujas y a la asociación de las moléculas proteicas, a veces con una desnaturalización parcial y coagulación, dando lugar a un film cohesivo intermolecular con un cierto grado de elasticidad (de Wit y col., 1988; Zayas, 1997). Usualmente se distingue entre capacidad espumante, que es el volumen de espuma formado por volumen de dispersión proteica; y estabilidad de la espuma, que es la habilidad de la espuma para mantener su volumen máximo durante cierto período de tiempo (Renner y Abd El-Salam, 1991); usualmente para determinarla se expresa como el volumen de líquido drenado de la espuma o el descenso de volumen de la misma por unidad de tiempo (Robin y col., 1993). Las espumas más estables se forman con proteínas solubles que pueden interaccionar y formar películas viscosas gruesas. Existe una clara correlación entre la solubilidad de las proteínas y sus propiedades espumantes (Zayas, 1997). La capacidad espumante tiene una correlación positiva con la hidrofobicidad media de las proteínas (Damodaran, 2005). Las proteínas del suero poseen excelentes propiedades espumantes porque son molecularmente solubles y estabilizan las espumas mediante el incremento de la viscosidad. En estado nativo, la β-lactoglobulina, la α-lactalbúmina y la seroalbúmina muestran una adsorción similar en la interfase gas/agua (Zayas, 1997). Numerosos factores influyen en las propiedades espumantes: concentración de proteína, nivel de desnaturalización, fuerza iónica, tratamiento térmico previo y presencia de lípidos (Singh, 2003). Generalmente, la capacidad espumante se incrementa con la concentración de proteína hasta un valor máximo, a partir del cual decrece; para las espumas obtenidas con CPS el máximo se observa con concentraciones de 8-12% de proteína. La estabilidad de las espumas puede incrementarse mediante la apertura de las estructuras globulares de la α-lactalbúmina y la β-lactoglobulina, y la exposición de grupos –SH, aunque no mejora la capacidad espumante (Zayas, 1997). Así, la desnaturalización parcial por calor de las proteínas incrementa las propiedades espumantes de los CPS, con mayor efecto en la estabilidad de la espuma que en la capacidad espumante. Sin embargo, una excesiva desnaturalización y agregación de las proteínas tiene un efecto negativo sobre las espumas (Singh, 2003; Damodaran, 2005). La desnaturalización parcial de la β-lactoglobulina durante la homogeneización puede mejorar sus propiedades espumantes (Zayas, 1997). 63 INTRODUCCIÓN Los lípidos en general y, en particular, la presencia de fosfolípidos y ácidos grasos insaturados, puede romper las espumas, como resultado de su mayor actividad superficial y el efecto adelgazante de la película proteica que ejercen (Singh, 2003). La hidrofobicidad superficial de las proteínas se relaciona negativamente con el contenido de lípidos porque éstos compiten por los lugares de unión de las proteínas. Si los grupos hidrofóbicos están ocupados por los lípidos, están bloqueados y no participan en otras interacciones hidrofóbicas (Zayas, 1997). La eliminación de lípidos residuales de los sueros incrementa de forma importante las propiedades espumantes de los CPS (Pearce y col., 1991; Karleskind y col., 1995c). El pH de la solución afecta significativamente a las propiedades de las espumas influyendo en la carga neta de la proteína y a la formación de la película y sus propiedades. El desarrollo de presión superficial, las interacciones proteína-proteína, el espesor de la película y las propiedades viscoelásticas se ven afectadas por la carga neta (Phillips y col., 1994). La máxima capacidad espumante y estabilización de la espuma se ha observado a valores de pH de 4-6 (Phillips y col., 1990; Singh, 2003). Esto se atribuye a la formación de una película proteica más cohesiva en la interfase aire-agua, debido a la reducción de las repulsiones electrostáticas, que alcanzan el máximo en el pI de las proteínas, de forma que se adsorben más proteínas en la interfase (Zayas, 1997; Singh, 2003). No está claro el efecto que ejercen los iones y el contenido en cenizas sobre las propiedades espumantes. Mientras que algunos autores han observado correlaciones positivas entre la capacidad espumante y el contenido en calcio, cloruro sódico y cenizas (Halling, 1981; Patel y Kilara, 1990), otros detectan peores propiedades cuando existe una elevada cantidad de NaCl (Phillips y col., 1991). Zhu y Damodaran (1994) han señalado que los cationes divalentes Ca2+ y Mg2+ influyen significativamente en las propiedades espumantes de los APS. Parece que la agregación lenta que inducen los cationes produce una película viscoelástica mejor que retarda el drenaje del líquido mediante la prevención del adelgazamiento del film. La hidrólisis parcial de las proteínas del suero mediante proteasas incrementa el volumen de espuma pero reduce su estabilidad (Zayas, 1997). Sin embargo, la hidrólisis limitada de los CPS combinada con un calentamiento a 55-70ºC proporciona unas excelentes capacidad espumante y estabilidad, siempre que el pH se encuentre entre 7 y 8 antes de la formación de la espuma (Singh, 2003). 64 INTRODUCCIÓN Teniendo en cuenta estas premisas, el principal fin de esta Tesis Doctoral ha sido la obtención y estudio de concentrados de proteínas séricas de oveja elaborados mediante precipitación termocálcica y microfiltración seguida de ultrafiltración/diafiltración a partir del suero de queso y suero desproteinizado obtenido en la fabricación de queso de suero (requeijão), con lo cual se aprovecharían estos dos subproductos. Este fin se ha desarrollado en los siguientes objetivos parciales: 1. Estudiar la viabilidad de la precipitación termocálcica y microfiltración utilizando dos membranas de tamaño de poro diferentes (0,65 y 0,20 µm) y su efecto en los correspondientes flujos de ultrafiltración, comparándolos con los medidos en el proceso realizado en sueros sin clarificar. 2. Determinar la composición química general y la composición nitrogenada de los concentrados obtenidos por clarificación o sin ella, con el fin de determinar la membrana de microfiltración más adecuada para obtener productos de alta concentración proteica, y de establecer la posible relación con sus propiedades funcionales. 3. Estudiar las principales propiedades funcionales (solubilidad, propiedades emulsionantes y espumantes, capacidad gelificante) de los deshidratados de retenidos de ultrafiltración/diafiltración y compararlos con los retenidos de ultrafiltración convencionales. 4. Efectuar las mismas determinaciones en los retenidos de microfiltración (subproductos de la clarificación) para evaluar su posible utilidad en la elaboración de alimentos, lo que aumentaría el interés de aplicar el tratamiento de clarificación. 5. Realizar un primer aprovechamiento de proteínas séricas de oveja en la elaboración de alimentos; en este caso, utilizando tanto los deshidratados de retenidos convencionales de ultrafiltración como los de microfiltración en la elaboración de un queso de suero (requeijão), y estudiar si aumentan el rendimiento de fabricación y si afectan a ciertas características del producto como la textura, la microestructura y el color del producto. 71 II. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS II.1. MATERIAL GENERAL DE LABORATORIO Y REACTIVOS DE USO GENERAL II.1.1. MATERIAL Las pesadas se realizaron en balanzas analíticas de las marcas Mettler, modelo AE-200, Haereus, modelo ADP 360, y AND, modelo HR-120. Se utilizaron baños termostatados de las marcas Grant, Kottermann y Selecta. Se utilizaron agitadores magnéticos y baños de calentamiento de las marca Bibby, modelo HC-502 y SBS. Para las determinaciones del pH se utilizaron un pHmetro de mesa Crison modelo GLP 21, y otro portátil Metrohm, modelo 704 pHmetrom, ambos dotados de sondas termométricas. En las determinaciones de extracto seco se emplearon estufas de las marcas Indelab y Memmert y en las de cenizas un horno mufla Naber. La destilación del agua necesaria para realizar las extracciones y para la preparación de las disoluciones acuosas se realizó en un aparato “Millipore” mod. Rios 5. II.1.2. REACTIVOS Todos los productos químicos utilizados en este trabajo fueron de calidad analítica, suministrados por las firmas Merck, Panreac, Riedel de Haen y Sigma. 73 MATERIALES Y MÉTODOS II.2. ORIGEN DE LAS MUESTRAS Los sueros de queso y sorelhos procedían de la elaboración de queso Serra da Estrela y de requeijão. El queso Serra da Estrela es el más conocido de los quesos tradicionales portugueses y fue el primero en beneficiarse del estatuto de queso con Denominación de Origen Protegida. Su nombre se relaciona con la región de Serra da Estrela, la montaña más alta de Portugal. Se produce en 18 ayuntamientos siendo los de mayor producción: Celorico da Beira, Gouveia, Guarda, Manteigas, Oliveira do Hospital y Seia. El queso se obtiene por coagulación de la leche cruda de oveja con un extracto de la flor de cardo (Cynara cardunculus L.). De acuerdo con el estándar legal (NP-1922, 1985 y Decreto 42/85), el producto tiene la forma de un cilindro bajo, sin bordes salientes. Tiene un diámetro de 15-20 cm y una altura de 4-6 cm y pesa entre 1 y 1,7 Kg. Las caras laterales son convexas. La corteza es fina, uniforme y de color amarillo-paja. La masa es de color marfil, con pocos agujeros y de textura blanda, que se deforma rápidamente y de forma espontánea al corte. Su aroma es fuerte y ligeramente ácido. El contenido de humedad en el queso libre de materia grasa se deberá situar entre 61 y 69% y el contenido de grasa en el extracto seco deberá estar comprendido entre 45 y 60%. Su fabricación es artesanal. La producción anual es de aproximadamente 2.000 Tm y su valor comercial se sitúa en torno a los 15-20 €/kg. Como ya se mencionó en la Introducción (apartado I.4.2), el requeijão es un queso de suero ovino tradicionalmente, al que se le añade cierta cantidad de leche de oveja y que se obtiene por calentamiento y sin acidificación. Se obtiene además un subproducto, el sorelho, que contiene menos proteínas que el lactosuero. En la figura II.1 se presenta un diagrama de flujo del proceso de elaboración habitual del queso Serra da Estrela junto con el proceso de producción de requeijão. 74 MATERIALES Y MÉTODOS en cuboen cubo SalSal Recepción de la leche Calentamiento a la temperatura de coagulación (28-30ºC) Filtración de la leche Coagulación (45-60 min) Corte de la cuajada (horizontal y vertical, s de 2 cm de lado) Trabajo de la cuajada (agitación lenta) Prensado (facultativo) Desuerado y moldeo ado externo (facultativo) Maduración 1ª fase (15 días): 6-10ºC, 90-95% H.R. 2ª fase (30 días): 10-14ºC, 80-90% H.R. QUESO SERRA DA ESTRELA Adición de la solución coagulante: Cardo (Cynara cardunculus L.), 0,2-0,3 g/l leche Adición de NaCl (7-20 g/l leche) en caso de salado en leche o mixto SUERO Leche de oveja, cabra o vaca (≈10% v/v) Calentamiento y agitación (90-95ºC, 10-30 min) Recuperación de agregados y envasado Enfriamiento (6-8ºC) REQUEIJÃO SORELHO Recepción de la leche Calentamiento a la temperatura de coagulación (28-30ºC) Filtración de la leche Coagulación (45-60 min) Corte de la cuajada (horizontal y vertical, s de 2 cm de lado) Trabajo de la cuajada (agitación lenta) Prensado (facultativo) Desuerado y moldeo ado externo (facultativo) Maduración 1ª fase (15 días): 6-10ºC, 90-95% H.R. 2ª fase (30 días): 10-14ºC, 80-90% H.R. QUESO SERRA DA ESTRELA Adición de la solución coagulante: Cardo (Cynara cardunculus L.), 0,2-0,3 g/l leche Adición de NaCl (7-20 g/l leche) en caso de salado en leche o mixto SUERO Leche de oveja, cabra o vaca (≈10% v/v) Calentamiento y agitación (90-95ºC, 10-30 min) Recuperación de agregados y envasado Enfriamiento (6-8ºC) REQUEIJÃO SORELHO Figura II.1. Diagrama de los procesos de fabricación del queso Serra da Estrela y de Requeijão. Adaptado de Rodrigues y col. (2000). 75 MATERIALES Y MÉTODOS II.3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS II.3.1. RECEPCIÓN DE LOS SUEROS DE QUESO Y DE SUERO DESPROTEINIZADO (SORELHO) El lactosuero ovino y el suero desproteinizado o sorelho fueron suministrados por la Asociación de Criadores de Ovejas “Serra da Estrela” (ANCOSE, Portugal). La preparación de las muestras fue similar en ambos productos. El suero y el sorelho se refrigeraron inmediatamente después de la producción de queso o de requeijão y fueron transportados rápidamente en recipientes metálicos a temperatura ambiente a la planta piloto, donde se mantuvieron en refrigeración hasta su uso. Entre la recogida y el inicio del procesado en planta piloto no transcurrieron más que 3 horas. Inmediatamente después de la recepción en planta piloto, los productos se desnataron en una centrífuga Westfalia tipo ADB. Se utilizaron aproximadamente 100 litros de producto en cada prueba, los cuales se dividieron en dos porciones de 50 litros, una para ser usada en la ultrafiltración convencional, y otra para ser sometida a precipitación termocálcica (PT) y microfiltración (MF), seguido de ultrafiltración (UF) y diafiltración (DF). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. La figura II.2 muestra el esquema de los pasos seguidos en el tratamiento de suero y sorelho y de obtención de las muestras líquidas y en polvo analizadas en la presente Tesis Doctoral. 76 MATERIALES Y MÉTODOS SUERO / SORELHO SUERO / SORELHO DESNATADO 100 litros Ultrafiltración FCV = 10 Microfiltración (0,20 ó 0,65 µm) FCV = 5 Desnatado Agregación termocálcica: -pH = 7,3-7,5 -CaCl 2 1,2 g/l -50ºC, 8 min Retenido 5 litros Liofilización CPS de suero / Sorelho pretratado Filtrado 40 litros Retenido 10 litros Ultrafiltración FCV = 10 Retenido 4 litros Diafiltración Retenido 4 litros Liofilización Retenidos de microfiltración de suero / Sorelho (0,20 ó 0,65 µm) Liofilización CPS de suero / Sorelho sin pretratar UFR / SUFR Filtrado 45 litros UFF / SUFF Filtrado 36 litros Filtrado 36 litros W / S SW / SS MFF / SMFF MFR / SMFR DFR / SDFR Agua 36 litros SUERO / SORELHO SUERO / SORELHO DESNATADO 100 litros Ultrafiltración FCV = 10 Microfiltración (0,20 ó 0,65 µm) FCV = 5 Desnatado Agregación termocálcica: -pH = 7,3-7,5 -CaCl 2 1,2 g/l -50ºC, 8 min Retenido 5 litros Liofilización CPS de suero / Sorelho pretratado Filtrado 40 litros Retenido 10 litros Ultrafiltración FCV = 10 Retenido 4 litros Diafiltración Retenido 4 litros Liofilización Retenidos de microfiltración de suero / Sorelho (0,20 ó 0,65 µm) Liofilización CPS de suero / Sorelho sin pretratar UFR / SUFR Filtrado 45 litros UFF / SUFF Filtrado 36 litros Filtrado 36 litros W / S SW / SS MFF / SMFF MFR / SMFR DFR / SDFR Agua 36 litros UFRP / SUFRP MFRP / SMFRP DFRP / SDFRP UFRP / SUFRP MFRP / SMFRP DFRP / SDFRP Figura II.2. Diagrama de obtención de las muestras de suero y sorelho ovinos. En color azul se señalan las abreviaturas correspondientes a los productos líquidos y en color rojo las de los productos deshidratados. 77 MATERIALES Y MÉTODOS II.3.2. CLARIFICACIÓN DE LOS SUEROS: PRECIPITACIÓN TERMOCÁLCICA - MICROFILTRACIÓN Tras la determinación del contenido en calcio inicial de suero y sorelho por el método que se describe en el apartado II.4.1.4., la precipitación termocálcica se llevó a cabo siguiendo el método descrito por Fauquant y col. (1985): el contenido en calcio se ajustó a 1,2 g/l con una solución de CaCl2 10N. A continuación el pH se llevó a valores de 7,3-7,5 con NaOH 10N y se calentó rápidamente a 50ºC, manteniendo esta temperatura durante 8 minutos. Finalmente se refrigeró a 4-6ºC y así se mantuvo hasta el día siguiente. La microfiltración del producto sometido a la precipitación termocálcica se realizó de forma discontinua en una planta piloto equipada con membranas de fibra hueca con poros de 0,20 µm (diámetro interno de 1mm y 0,8 m2 de superficie, modelo CFP-2-E-35 A) y de 0,65 µm (diámetro interno de 0,75 mm y 1,0 m2 de superficie, modelo CFP-6-D-35 A), suministradas por A/G Technology Corporation. El proceso se llevó a cabo a una presión transmembranaria de 1,6- 1,8 bares y con un flujo de recirculación de producto de 2000 l/h. El volumen final de retenido fue del 20% del volumen inicial de la alimentación, es decir, se aplicó un factor de concentración volumétrica de 5 (FCV=5). La temperatura inicial de la alimentación fue de 8-10ºC. La figura II.3 presenta la unidad piloto utilizada en los procesos de separación por membranas, tanto los de microfiltración como los de ultrafiltración de los sueros, efectuando cuando fue necesario el cambio de las membranas. En la figura II.4 se muestra un detalle de la planta piloto con una membrana de microfiltración instalada. En la figura II.5 se pueden observar las características de las membranas de MF utilizadas. 78 MATERIALES Y MÉTODOS 79 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Figura II.3. Unidad piloto para efectuar las separaciones por membranas. (1) Tanque de alimentación de 50 litros. (2) Bomba centrífuga de alimentación. (3) Bomba centrífuga de recirculación. (4) Panel de control. (5) Manómetro para determinación de presión a la entrada del módulo. (6) Manómetro para determinación de presión a la salida del módulo. (7) Caudalímetro para medición de caudal de alimentación. (8) Caudalímetro para medición de caudal de permeado. (9) Permutador tubular para control de la temperatura de alimentación; (10) Módulo de placas de UF (Pleiade UFP 10 BIO); opcionalmente, los módulos de membranas de fibras huecas para MF de 0,65 µm y 0,20 µm (A/G Technology Corporation). MATERIALES Y MÉTODOS Figura II.5. Detalle de una de las membranas de microfiltración empleadas. Figura II.4. Membrana de microfiltración instalada en la unidad piloto. II.3.3. ULTRAFILTRACIÓN DE LOS SUEROS La ultrafiltración del suero y sorelho desnatados no clarificados se realizó de forma discontinua usando un módulo de placa y marco Pleiade UFP 10 BIO, (Figura 17) equipado con una membrana orgánica (copolímero de acrilonitrilo) IRIS de Rhône Poulenc Tech-Sep (1,1 m2 de superficie y 35 kDa de punto de corte) instalado en la unidad piloto que se muestra en la 80 MATERIALES Y MÉTODOS II.4.2.6. Determinación del contenido de fósforo El contenido de fósforo se determinó de acuerdo con el método colorimétrico de la AOAC (1996b). La muestra se preparón de la misma manera que para la determinación del contenido en calcio. A 10 ml de solución de muestra se añadieron 10 ml de reactivo de molibdovanadato (60 g de molibdato de amonio tetrahidratado en 1 litro de agua + 1,5 g de metavanadato de amonio disuelto en 700 ml de agua y 300 ml de HNO3) y, después del desarrollo del color, su absorbancia se leyó a 400 nm. El resultado se refirió a una recta patrón previamente obtenida a partir de varias concentraciones de una solución patrón de H3PO4. Las determinaciones se efectuaron por duplicado y los resultados se expresaron en porcentaje de extracto seco. II.4.2.7. Determinación del contenido de cloruros El contenido de cloruros de las muestras líquidas se determinó mediante un método colorimétrico, siguiendo el procedimiento nº 461 y empleando el kit comercializado por Sigma diagnostics. Este método se basa en que los iones cloro desplazan cuantitativamente a los iones tioacianato del tiocianato mercúrico. El tiocianato liberado forma un complejo de color rojo al reaccionar con iones férricos, presentando una absorbancia máxima a 460 nm. La intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de cloruro en la muestra. Las reacciones que se producen son las siguientes: 2 Cl- + Hg(SCN)2 HgCl2 + 2(SCN)- 3(SCN)- + Fe3+ Fe(SCN)3 El reactivo para la determinación se suministraba listo para su uso y se componía de cloruro mercúrico (0,74 mmol/l), nitrato mercúrico (72,5 µmol/l), tiocianato mercúrico (1,7 mmol/l), nitrato férrico (22 mmol/l), ácido sulfúrico (10 mmol/l), ácido nítrico (30 mmol/l) y estabilizantes. Además se dispuso de una solución estándar que contenía 100 mEqu/l de cloruro, también suministrada por Sigma. Se preparó una serie de tubos identificados como blanco, estándar y muestras. En cada tubo se colocó 1 ml del reactivo y se añadieron 10 µl de agua deionizada (blanco), de estándar o 87 MATERIALES Y MÉTODOS de la muestra, según el caso, se mezcló y los tubos se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se realizó la medida de la absorbancia a 460 nm en un espectrofotómetro UV/VIS Zuzi. La absorbancia obtenida en el blanco se restó de los valores correspondientes a las muestras y el estándar para determinar el cambio en absorbancia debido a los cloruros (∆A). El contenido en cloruros de las muestras se calculó según la ecuación siguiente: Cl- (mEq/l)= (∆A muestra/∆A estándar) x concentración del estándar Los resultados se expresaron finalmente como porcentaje de extracto seco. Todas las determinaciones se hicieron por duplicado. II.5. ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN NITROGENADA DE LOS PRODUCTOS EN POLVO Las determinaciones de la composición nitrogenada se realizaron en la Facultad de Ciencias de Lugo. Todas ellas se efectuaron por duplicado. II.5.1. DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN PROTEICA El contenido de α-lactalbúmina, β-lactoglobulina y seroalbúmina bovina, las tres proteínas implicadas en la funcionalidad de los productos derivados del lactosuero, se determinó mediante HPLC de fase reversa, siguiendo el método propuesto por Kim y col. (1987) y utilizando el gradiente de elución descrito por González de Llano y Santa María (1997). Todos los reactivos utilizados fueron de grado HPLC; los patrones de las distintas proteínas procedían de Sigma. Se prepararon disoluciones al 3% (p/v) de las muestras de los productos en polvo en 0,1% de ácido trifluoroacético en agua Milli-Q, así como varias disoluciones de distinta concentración de cada uno de los patrones de proteína con el fin de realizar las rectas patrón. A continuación se inyectaron en el cromatógrafo 20 µl de muestras y estándares tras previa filtración utilizando filtros Millipore de 0,45 µm de diámetro de poro. 88 MATERIALES Y MÉTODOS Los análisis por RP-HPLC se realizaron en un cromatógrafo líquido Beckman System Gold, equipado con un módulo de bombas programable modelo 126, y con un detector de diodo array modelo 168. La separación de las proteínas se llevó a cabo utilizando una columna C4 de 300 Å de poro y 250 x 4,6 mm Supelcosil LC-304, suministrada por Supelco. Como eluyente A se empleó ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) en agua Milli-Q, y el eluyente B fue ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v) en acetonitrilo. Los eluyentes se desgasificaron en un baño de ultrasonidos Selecta, modelo Ultrasons-H durante 15 minutos. La separación se realizó a temperatura ambiente. El gradiente empleado, expresado en proporción de eluyente B, fue el siguiente: entre el minuto 0 y el 1, 35%; entre el minuto 1 y el 8, 38%; entre el minuto 8 y el 16, 42%; entre el minuto 16 y el 22, 46%; 100% entre el minuto 22 y el 22,5, 100%; entre el minuto 22,5 y el 23,5, 35%. El flujo fue de 1 ml/min y la detección se efectuó a 210 nm. La identificación se hizo teniendo en cuenta los tiempos de retención comparados con los de los estándares utilizados (β-lactoglobulina, α-lactalbúmina y seroalbúmina). La cuantificación se realizó mediante el método de estándar externo. Se prepararon 6 soluciones patrón de cada proteína a concentraciones comprendidas entre 0,05 y 8 mg/ml y se inyectaron en el cromatógrafo, efectuando la separación en las condiciones descritas anteriormente. Con las áreas obtenidas y las concentraciones correspondientes se realizó una recta patrón por cada proteína a determinar. Las concentraciones de cada proteína en las muestras se calcularon por extrapolación en la recta patrón correspondiente. Los resultados finales se expresaron como gramos de proteína por 100 g de producto en polvo. II.5.2. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE COMPONENTES NITROGENADOS NO PROTEICOS Y DE PROTEÍNA VERDADERA El contenido de nitrógeno no proteico se determinó por el método Kjeldahl, tal y como se describe en el apartado II.4.2.1. El nitrógeno no proteico se definió como el nitrogeno soluble en ácido tricloroacético al 12%, y los componentes nitrogenados no proteicos se calcularon multiplicando el nitrógeno no proteico por un factor de 3,60. La proteína verdadera se determinó de la siguiente manera: Proteína verdadera = (Nitrógeno total – Nitrógeno no proteico) x 6,45 89 MATERIALES Y MÉTODOS Los factores de conversión 3,60 y 6,45 utilizados son los recomendados por Karman y Van Boekel (1986) para los compuestos nitrogenados no proteicos y las proteínas de suero dulce, respectivamente. Los resultados se expresaron en gramos de proteína verdadera o de nitrógeno no proteico por 100 g de producto en polvo. II.6. EVALUACIÓN DE LAS PROPIEDADES FUNCIONALES DE LOS PRODUCTOS EN POLVO Las determinaciones de la funcionalidad de los productos liofilizados se realizaron en la Facultad de Ciencias de Lugo. II.6.1. DETERMINACIÓN DE LA SOLUBILIDAD PROTEICA La solubilidad de la proteína a pH 4 y 7 se determinó por triplicado utilizando el método descrito por Morr y col. (1985). Aproximadamente 500 mg de muestra se disolvieron en 40 ml de NaCl 0,1M. Inmediatamente después de obtener una dispersión completa se ajustó el pH a 4,0 o 7,0 con soluciones de HCl o NaOH 0,1N según el caso. Las dipersiones se agitaron durante 1 hora en un agitador magnético a una velocidad que apenas permitía la formación de remolino; a lo largo de este período se controló el pH y se ajustó siempre que fue necesario. A continuación la dispersión se transfirió a un matraz aforado de 50 ml, diluyendo hasta la marca con la solución de NaCl 0,1M. Una alícuota de la dipersión se centrifugó a 20.000 x g durante 30 minutos en una ultracentrífuga Kontron, modelo Centrikon T-2070, a 15 ºC. A continuación, el sobrenadante se filtró con papel de filtro Whatman nº 1. Los contenidos de proteína del filtrado y de la dispersión inicial se determinaron por el método del biuret. Se tomó 1 ml de disolución de muestra al cual se le añadieron 4 ml de reactivo de biuret (1,5 g de SO4Cu.5H2O + 6 g de tartrato sódico-potásico tetrahidratado en 500 ml de agua destilada, a los cuales se añadieron 300 ml de NaOH al 10% (m/v) y se llevó todo a 1 litro con agua destilada). Tras agitarlo, se dejó la mezcla en reposo 30 minutos y se leyó después la absorbancia a 550 nm contra un blanco sin proteína (agua + reactivo). Como en cualquier técnica colorimétrica y cuantitativa, es necesario referir los resultados obtenidos a una recta patrón realizada de antemano, utilizando en este caso la seroalbúmina bovina como proteína 90 MATERIALES Y MÉTODOS patrón empleando distintas concentraciones. Las determinaciones espectrofotométricas se efectuaron en un espectrofotómetro ultravioleta/visible (UV/VIS) Zuzi. La solubilidad de la proteína se calculó con la siguiente fórmula: Solubilidad proteica (%) = [SPC x 50 / SW x (SP / 100)] x 100 donde, SPC = concentración de proteína verdadera en el sobrenadante (mg/ml); SW = peso de la muestra (mg); SP = concentración de proteína verdadera en la muestra (%). II.6.2. DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES EMULSIONANTES II.6.2.1. Determinación de la capacidad emulsionante La capacidad emulsionante de los productos liofilizados se determinó según el procedimiento turbidimétrico de Pearce y Kinsella (1978), modificado por Patel y Kilara (1990). Las determinaciones se hicieron por duplicado. Se preparó una disolución al 2% (m/v) de los deshidratados en tampón fosfato 0,1 M a pH 7. Esta solución se mantuvo en agitación durante una hora. Con el uso de un picnómetro Duran se determinó su densidad a 20ºC, después de eliminar los gases disueltos en un baño de ultrasonidos Selecta. Una alícuota se desecó en una estufa a 120ºC durante una hora para determinar su extracto seco. A 75 ml de la solución de cada uno de los deshidratados (fase continua) se añadieron 25 ml de aceite de oliva (fase dispersa). La mezcla se emulsionó en homogeinizador Polytron modelo 15/30 PT, dotado de un vástago PTA 20 TS (Kinematica Ag), a 17.200 r.p.m. durante 3 minutos. Seguidamente, se retiró una alícuota que se diluyó 500 veces con una solución 0,1% (m/v) de dodecil sulfato de sodio (SDS) en tampón fosfato a pH 7, y se midió su absorbancia a 500 nm en un espectrofotómetro UV/VIS Zuzi. Una alícuota de la emulsión se desecó en estufa a 120º C una hora para determinarse su extracto seco. La densidad del aceite de oliva también se determinó con un picnómetro Duran. 91 MATERIALES Y MÉTODOS La capacidad emulsionante, expresada como “índice de actividad emulsionante” (EAI, emulsifying activity index) se calculó con la siguiente fórmula: EAI (m2/g) = (2 x 2,303 x A500) / ( Φ x L x C) donde, A500 = absorbancia de la emulsión diluída a 500 nm; Φ = fracción volúmica de la fase dispersa; L = anchura de la celda (m) C = peso de producto por unidad de volumen de la dispersión de producto (g/m3) La fracción volúmica de la fase dispersa se calculó de la siguiente forma: Φ = Wd x ( E - W1 ) / Wd + W1 [ ( (1 + E) x Do ) / Dm ) - E ] donde: Wd = (peso de la emulsión desecada/ peso de la emulsión); E = concentración de solutos de la dispersión (masa/ unidad de masa de solvente); W1 = (pérdida de peso de la emulsión durante el desecado/peso de la emulsión); Do = densidad del aceite de oliva; Dm = densidad de la solución de deshidratado. II.6.2.2. Determinación de la estabilidad de la emulsión La estabilidad de la emulsión (ESR, emulsifying stability rating) se determinó mediante el método de Tornberg y Hermansson (1977) con la modificación de Kim y col. (1989), usando alícuotas de las emulsiones preparadas como se ha descrito en el apartado II.6.2.1. Las determinaciones se hicieron por duplicado. Inmediatamente después de la emulsificación se separaron dos alícuotas: una que correspondía a la emulsión original (E0), y otra que se transfirió a un embudo de decantación y se mantuvo a 4ºC durante 24 horas. Pasado ese periodo, se retiró la fracción inferior del embudo (E24). En ambos casos se determinó el contenido en grasa por el método de Gerber. En un butirómetro Gerber para leche entera se introdujeron 10 ml de H2SO4 al 90-91% y se agregaron 11 ml de la fracción E24. A continuación se añadió 1 ml de alcohol isoamílico. Seguidamente se cerró el butirómetro y se agitó hasta completar la mezcla. Los butirómetros se sometieron a centrifugación a 1.200 r.p.m. en una centrifuga Gerber calentada a 65ºC. La grasa 92 MATERIALES Y MÉTODOS separada se midió directamente en la escala del butirómetro. En el caso de la fracción E0, se utilizó un butirómetro para nata, al cual se añadieron 5 ml de la fracción y 5 ml más de agua destilada. La estabilidad de la emulsión (ESR) se calculó como sigue: ESR (%) = ( GE 24 / GE 0 ) x 100 donde: GE 0 = Contenido en grasa de la emulsión en el momento de la preparación (% v/v); GE 24 = Contenido en grasa de la emulsión a las 24 horas (% v/v). II.6.3. DETERMINACIÓN DE LAS PROPIEDADES ESPUMANTES La expansión de la espuma (FE) y la estabilidad de la espuma (FS) de las muestras en polvo se determinaron utilizando dispersiones con un 1% (m/v) de concentración de proteína a pH 7,0. Las determinaciones se hicieron por duplicado. Las muestras deshidratadas se añadieron lentamente a vasos de precipitados conteniendo 250 ml de agua destilada, colocados en un agitador magnético en condiciones que originaron un vortex profundo. La agitación se mantuvo 30 minutos. De igual forma se preparó una dispersión de ovoalbúmina, proteína que se utilizó como referencia. Después de disueltas, las dispersiones se transfirieron al recipiente de una batidora Braun, modelo MR550, y batida a la velocidad máxima (10.000 r.p.m.) durante 5 minutos, utilizando el accesorio de batido. De acuerdo con el método descrito por Patel y col. (1988), la espuma se transfirió rápidamente a una probeta de 2 litros, la cual, mantenida en la vertical, se sometió a dos rápidos movimientos de descenso, con el objetivo de eliminar las bolsas de aire presentes. Inmediatamente se midió el volumen total de la espuma. Ésta se dejó en reposo 30 minutos a temperatura ambiente y después se midió el volumen de líquido drenado de la siguiente manera: para volúmenes de líquido por encima de la marca de los 200 ml la lectura se hizo directamente de la probeta. Cuando los volúmenes de líquido quedaron por debajo de la marca de los 200 ml, se midió la distancia h (cm), entre la marca de los 250 ml y el menisco del líquido. El volumen V (ml) se determinó usando la siguiente fórmula: V = π x ( D / 2 ) 2 x h, siendo D el diámetro interno de la probeta. 93 MATERIALES Y MÉTODOS La expansión de la espuma se calculó como sigue: FE (%) = [(FV – 250) / 250] x 100 donde FV es el volumen inicial de la espuma. La estabilidad de la espuma se calculó de la siguiente manera: FS (%) = 100 – [(volumen de líquido drenado después de 30 min / 250) x 100] II.6.4. ESTUDIO DE LA CAPACIDAD GELIFICANTE II.6.4.1. Preparación de los geles Se prepararon disoluciones de las muestras en polvo en agua destilada a concentraciones de 20, 10 y 5% en vasos de precipitados de 100 ml. Las dispersiones se sometieron a agitación durante 1 hora a temperatura ambiente, procediendo al ajuste del pH a 7 o 4 con NaOH o HCl 0,1N. Los geles se obtuvieron por calentamiento a 90ºC durante 30 minutos en un baño termostatado. Depués se procedió a enfriarlos inmediatamente en agua con hielo hasta que alcanzaron 8ºC. Finalmente, con el objetivo de permitir la maduración de los geles, se dejaron 15 horas a 8ºC hasta su análisis reológico. II.6.4.2. Determinación de las propiedades reológicas de los geles Las pruebas reológicas dinámicas se realizaron en un reómetro de stress controlado Haake Rheostress, modelo RS 100 (Fisons), equipado con sistema de medición, unidad electrónica de control para el sistema de medidas, sistema de termostatación y ordenador para el manejo del sistema y análisis de datos. Las medidas se realizaron trabajando en modo oscilatorio y empleando un dispositivo de medición cono-plato C35/4 (con un ángulo de 4º y 35 mm de diámetro de cono). En primer lugar, se realizaron barridos de tensión (stress sweep) a la frecuencia de 1 Hz con el objetivo de determinar la zona de comportamiento viscoelástico lineal de la muestra. A continuación, se determinaron el módulo de almacenamiento (G’) y el módulo de pérdida (G’’) en el intervalo de frecuencias de 0,428-42,8 s-1 a 20 Pa para los geles con 20 y 10% de concentración de polvo, y a 10 Pa para los geles con un 5% de concentración, siempre dentro de la zona viscoelástica lineal. 94 MATERIALES Y MÉTODOS Las medidas se realizaron a temperaturas de 15ºC y 60ºC, después de calentar y mantener las muestras a estas temperaturas durante 3 horas, con el fin de estudiar la dependencia de la temperatura de los parámetros medidos. Todas las determinaciones se realizaron por duplicado. II.6.4.3. Estudio de la microestructura de los geles La microestructura de los geles producidos como se describe en el apartado II.6.4.1 se estudió mediante microscopía electrónica de barrido. Las muestras se tomaron a las 24 horas de preparación de los geles y consitieron en cubos de 5 mm de lado, los cuales se conservaron en una solución acuosa de triclorometano al 10% (v/v) hasta su análisis. La muestras de geles se deshidrataron secuencialmente mediante sucesivos tratamientos en soluciones acuosas de etanol (30, 50, 70, 90, 100%). Después el etanol se sustituyó por acetona al 100% y se realizó un secado por punto crítico con CO2 en un equipo Bal-Tec, modelo CPD 020. Después las muestras se metalizaron con un fina capa de iones de oro (300 Å, a 1.200 V y 10mA) en un equipo Jeol, modelo JFC-1100. Las observaciones de la microestructura se realizaron en un microscopio electrónico de barrido Jeol, modelo JSM-T220 A, a 1.500 aumentos y operando a 15 kV. Las imágenes se recogieron utilizando una cámara fotográfica acoplada al microscopio electrónico. II.7. ELABORACIÓN Y ANÁLISIS DE QUESOS DE SUERO ADICIONADOS DE DESHIDRATADOS DE RETENIDOS DE ULTRAFILTRACIÓN Y DE MICROFILTRACIÓN II.7.1. ELABORACIÓN DE QUESOS DE SUERO Se elaboraron diecinueve lotes de quesos de suero (requeijão). El lote control se fabricó con 900 g de suero de queso y 100 g de leche bovina; dicha leche se estandarizó al 12,2% de extracto seco, 3,1% de proteína y 3,5% de materia grasa. Los dieciocho lotes restantes se elaboraron añadiendo los retenidos de ultrafiltración (UFRP) y de microfiltración (MFRP 0,65 y MFRP 0,20) de suero y los procedentes del sorelho (SUFRP, SMFRP 0,65 y SMFRP 0,20). A la mezcla de suero y leche se le añadieron los productos deshidratados con tasas de incorporación de 0,5, 1,0 y 1,5% (p/p). 95 MATERIALES Y MÉTODOS Las mezclas preparadas se introdujeron en recipientes de acero inoxidable y se calentaron bajo agitación constante. Se controló la temperatura y cuando se detectó el inicio de la ebullición, se añadieron aproximadamente 20 ml de agua fría y se mantuvo la temperatura a 95ºC durante 10 minutos. A continuación, las mezclas se introdujeron en sacos de desuerado previamente pesados y se llevaron rápidamente a una cámara de refrigeración a 2ºC, en la cual se dejaron desuerar 24 horas. Transcurrido este tiempo se pesaron los sacos con el producto con el fin de calcular el rendimiento de fabricación y los correspondientes quesos de suero se extrajeron de los sacos y se conservaron durante 5 días en una cámara de refrigeración a 2ºC. El experimento se repitió cuatro veces, elaborando cada vez tres requesones del lote control y uno de cada uno de los otros lotes. La fabricación de los requeijãos se realizó en la Escuela Superior Agraria de Coimbra. II.7.2. ANÁLISIS REALIZADOS EN LOS QUESOS DE SUERO Las determinaciones del extracto seco, de la firmeza, de los parámetros de color y los rendimientos de fabricación se realizaron en la Escuela Superior Agraria de Coimbra. El estudio de la microestructura se efectuó en las instalaciones del Campus de Lugo. II.7.2.1. Determinación del contenido en extracto seco El extracto seco de cada queso se determinó por duplicado tras 1, 3 y 6 días de la coagulación, tal y como se describe en el apartado II.4.1.2., usando en este caso una muestra de 3 g. II.7.2.2. Determinación de los rendimientos de fabricación II.7.2.2.1. Rendimiento bruto El rendimiento bruto se determinó del siguiente modo: Rendimiento bruto (%) = [Peso del queso de suero / Peso incial de suero+leche+polvo] x 100 96 calcium content of the skimmed products was adjusted to 1.2 g L 1 with CaCl 2 10 n, the pH adjusted to 7.3–7.5 with NaOH 10 nand the temperature rapidly raised to 501C and maintained at this value for 8 min. Finally, the whey products were cooled to 4–61C and kept overnight prior to MF. Microfiltration was performed in batch conditions, starting with a feed recirculation flow rate of 2000 L h 1 in order to maintain the transmembrane pressure in the range 1.6–1.8 bar. A pilot unit, equipped with hollow fiber membranes of 0.20 mm or 0.65 mm diameter pore sizes, was used. The 0.20 (1.0 mm internal diameter, and 0.8 m 2 surface area, model CFP-2-E-35 A) and the 0.65 mm (0.75 mm internal diameter, and 1.0 m 2 surface area, model CFP-6-D-35 A) membranes were supplied by A/GtTechnology Corporation. The final volume of retentate was 20% of the initial volume of the feed (volumetric concentration factor (VCF)=5). The initial temperature of the feed was in the 8–101C range. Ultrafiltration of skimmed non-clarified by-products was performed in batch conditions using a PLEIADEt UFP 10 BIO plate and frame system equipped with an IRIStorganic (acrylonitrile copolymer) membrane (1.1 m 2 surface area, 35 kDa MW cut-off) (Rh# one Poulenc Tech-Sep). The ultrafiltration process started with a feed recirculation flow rate of 2000 L h 1 and at a transmembrane pressure of 1.9–2.1 bar. At the final stages of concentration, the feed recirculation was gradually reduced in order to maintain transmembrane pressure in the same range of values. A ten-fold volumetric concentration factor (VCF=10) of the retentate was applied. The initial temperature of the feed was in the 10–121C range. The microfiltration filtrates were submitted to ultrafiltration (VCF=10) in the same conditions, in order to compare fluxes with those of the non-clarified product. The pHs of the original whey and Sorelho were in the 5.2–5.6 range and the ones of microfiltration filtrates were in the 7.3–7.5 range. Subsequently, the ultrafiltration retentates of the microfiltration filtrates were diafiltrated by addition of O r i g i n al b y - p r odu c t * S ki mm e d b y - p r odu c t * 100 L M ic r o f il t r a t i on ( 0.20 a nd 0.65 µ m ) V C F = 5 U l t r a f il t r a t i on ( 35 k D a ) V C F = 10 R e t e n t a t e * 5 L F il t r a t e * 45 L F r ee z e d r yi ng ** R e t e n t a t e * 10 L F il t r a t e * 40 L U l t r a f il t r a t i on ( 35 k D a ) V C F = 10 F il t r a t e 36 L R e t e n t a t e 4 L D ia f il t r a t i on F r ee z e d r yi ng ** F r ee z e d r yi ng ** Thermocalcic precipitation - pH 7.3-7.5 - CaCl2 1.2 gL-1 -50 ºC, 8 min Skimming 36 L H2O F il t r a t e 36 L R e t e n t a t e * 4 L Fig. 1. Diagram of the process employed for the production of ultrafiltration retentate powders, microfiltration retentate powders and diafiltration retentate powders: (*) intermediate sampling steps of liquid products; (**) dry products. C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783 775 36 L of deionized water followed by concentration (VCF=10) in order to produce the final diafiltration retentates. Diafiltration working parameters were maintained as in the case of UF. The water permeation flux was measured at the beginning of each UF trial. The liquid ultrafiltration retentate, the microfiltration retentates and the diafiltration retentates (from the microfiltration filtrates) were freeze dried in a Lyph- Lockt(Labconco) freeze dryer for compositional analysis. Fig. 1 also shows the sampling steps in which aliquots of original and intermediate liquid products were taken for chemical analysis. 2.2. Compositional analysis Protein and fat of the liquid intermediate products were determined by infrared spectroscopy with the Lactoscopetmodel C3 (Delta Instruments). The equipment was calibrated with ovine cheese whey using the Kjeldahl and the gravimetric procedure of AOAC (AOAC, 1996a) as references for protein and fat, respectively. Values below 0.5% (w/v) were calculated based on their concentration in dry products. All the other compositional analyses of intermediate and final products were determined as follows: dry matter by oven drying at 1051C for 12 h; ash by incineration at 5501C for 6 h; protein by the Kjeldahl method (Kjeltec System 1003-Tecatort) (N*6.38); fat according to the gravimetric AOAC procedure (AOAC, 1996a); chloride by the Sigma Diagnostics kit (Sigma-Aldrich Chemical CO); Ca 2+ by atomic absorption spectrometry (Perkin Elmert, model 2380); PO 4 2 according to the colorimetric method of AOAC (1996b). All determinations were made in duplicate. 2.3. Statistical analysis The results were analyzed by one-way ANOVA and the means were compared using the least significant difference test with significance at pp0:05:All statistical analyses were implemented with the Statisticatpackage (StatSoft Inc. USA). 3. Results and discussion 3.1. Composition of ovine cheese whey and deproteinized whey (Sorelho) Table 1 shows the composition of original ovine cheese whey and of the corresponding deproteinized whey (Sorelho) resulting from whey cheese production. All cheese whey components showed higher values than those reported by Casper, Wendorff, and Thomas (1998) for Manchego-type cheese whey, except for the protein contents that were lower. Fat and ash concentrations were also higher than those found by Chianese et al. (1996) in ovine cheese whey. A similar observation can be made for Sorelho composition in comparison with data reported by the latter authors. Table 1 allows us to calculate the retention of solid components occurring in the manufacturing process of Requeij *ao. This process approximately reduces the dry matter of whey by 40%, nitrogen by 74% and fat by 60%. The recovery of protein in the manufacturing process of Requeij*ao coincides with data reported by Pintado, Macedo, and Malcata (2001) for whey cheeses made with incorporation of 10% (w/w) milk to the whey. 3.2. Processing parameters The evolution of UF permeation fluxes and VCF for the products clarified with the 0.20 mm and with the 0.65 mm MF membranes as well as those of non-clarified products are displayed in Fig. 2 ((A) ovine cheese whey; (B) Sorelho). The evolution of the temperature of the products during the ultrafiltration process followed a regular increase from 8–12 to 32–361C (average DTwas 0.311C min 1 from min 0 to min 75); it was not controlled until an anticipated maximum of 451C was reached. The ultrafiltration flux patterns were similar and not significantly different between skimmed whey and skimmed Sorelho (SW and SS) and between their respective MF filtrates (MFF and SMFF) obtained with both MF membranes. Ultrafiltration fluxes decreased from 0 to 15 min, as a result of the deposition of fouling materials on the surface of the membrane. Afterwards, except in Sorelho clarified products, the permeate flow rates were relatively constant probably due to the gradual increase in the temperature of the product. The permeate flow rates of Sorelho clarified products showed a constant decrease from the beginning, particularly the products obtained using a 0.20 mm membrane. At high volumetric concentration factors, the increased solids concentration of retentates started to affect UF filtrate fluxes negatively, as was clearly observed in the case of the clarified products. The improvements in flux for products clarified by TP/MF, calculated as the ratio between the volumes of permeate in clarified and non-clarified products collected until Table 1 Composition of original ovine cheese whey and of ‘‘deproteinized’’ ovine whey (Sorelho). Mean values and standard deviation (7)(n¼6) (%) Ovine cheese whey (7)Sorelho (7) Dry matter 11.35 (0.28) 6.71 (0.64) Protein 1.53 (0.45) 0.49 (0.09) Fat 1.11 (0.53) 0.53 (0.28) Ash 2.90 (0.34) 2.08 (0.11) C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783776 min 75, ranged from 1.4 to 1.7 for both MF membrane types. Fig. 3 ((A) ovine cheese whey; (B) Sorelho) shows UF fluxes as the % of water flux of the cleaned membranes at the beginning of each test. This type of presentation takes into account the variations noticed in the water permeation flux of the membrane from trial to trial. The positive effect of previous clarification of whey on subsequent UF fluxes is clearly observed. Clarified whey and Sorelho showed superior UF fluxes with clear advantages for the use of 0.20 mm MF. With this MF membrane an improvement in the relative filtrate flux (calculated as the ratio between the average of relative permeation fluxes of clarified and non-clarified products) of 3.2 times was observed in the case of whey, and of 2.4 times in the case of Sorelho. For the treatment with the 0.65 mm membrane, the improvements were 1.6 and 1.3 times, respectively for whey and Sorelho. In both types of TP/MF treatments, the respective permeation fluxes did not show significant differences. The values obtained with the 0.20 mm membrane were superior to the improvement factor of 1.8 times reported by Maubois et al. (1987) using a 0.25 mm MF membrane. However, one has to mention that previous clarification with the 0.20 mm membrane took significantly more time than the one with 0.65 mm pore size, due to lower average filtrate flow rates. In fact, the 0.65 mm membrane showed an average permeation rate of 31.175.6 L m 2 h 1 whereas the 0.20 mm one had permeation rates of 19.176.8 L m 2 h 1 . These values can be considered low in view of the needs of industrial processes. Although hollow fiber membranes show the best ratio surface area/volume and low dead volumes, they are more sensitive to fouling (Cheryan, 1986). The use of ceramic based multi-channel membranes and of equipment able to run with uniform and low Time (min) Permeate flux (Lm 2h-1); VCF 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 Time (min) Permeate flux (Lm 2h-1); VCF 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 0 153045607590105120135 (A) (B) Fig. 2. Experimental flux data obtained with UF trials: (A) Ovine cheese whey; (B) Sorelho. Permeate fluxes (L m 2 h 1 )(’) and volumetric concentration factor (VCF) (m) for UF of skimmed product (similar to that used in trials with 0.65 mm MF membrane, see below). Idem (&PF and (n) VCF) for skimmed product (similar as that used in 0.20 mm MF trials, see below). PF (E) and VCF (K) correspond to UF of MF filtrates obtained using 0.65 mm membrane. PF (B) and VCF (J) correspond to UF of MF filtrates obtained using 0.20 mm membrane. Mean; box: mean7standard error; whisker: mean7standard deviation (n¼3). Curve fit by distance weighted-least squares. C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783 777 transmembrane pressure by means of co-current recirculation of the filtrate could improve MF filtration rates significantly (Sandblom, 1974; Kessler, 1997). This aspect must be considered in a large-scale operation. 3.3. Compositional analysis of liquid products Fig. 4 (ovine cheese whey) and Fig. 5 (Sorelho)show the changes in the composition of the different liquid products along the processing steps employed. The most noticeable fact is the very high retention of protein by the 0.20 mm MF membrane. Appropriate mass balances (taking into account the volumes of microfiltration retentates (MFR) and microfiltration filtrates (MFF) produced) show that the 0.20 mm MF membrane retained 84.6% and 75.0% of the original protein found in skimmed ovine cheese whey and skimmed Sorelho, respectively. Therefore, in these cases, only 15.4% and 25.0% of the original proteins were further utilized for the production of diafiltrated powders. With the 0.65 mm MF membrane treatments, 47.5% and 40.8% of the original proteins found in skimmed ovine cheese whey and skimmed Sorelho, respectively, were filtered and further utilized. Even in this case, the values obtained can be considered low, if the intention is only to produce protein-rich diafiltration retentates powders. The ash content of liquid diafiltrated products showed significantly lower values than those observed in other liquid products. One must also point out the fact that the protein concentration factors of the retentates of conventional ultrafiltration (5.271.4 and 6.272.4 for whey and Sorelho, respectively) and of diafiltration (4.271.6 and 2.871.9 for whey and Sorelho, respectively) do not reflect the VCF 10 applied. This is probably due to: (1) the dilution of the volume of product with approximately 3 L of water retained in dead volumes; (2) a protein retention lower than 100%, presumably by loss of a-lactalbumin and lower molecular weight nitrogen compounds in the filtrate, owing to the relatively high Time (min) Permeate flux / water flux (%) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1530456075 Time (min) Permeate flux / water flux (%) 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1530456075 (A) (B) Fig. 3. Relative UF fluxes of non-clarified and clarified products: (A) Ovine cheese whey; (B) Sorelho.(B) Skimmed non-clarified products (n¼6); (&) clarified products previously microfiltrated through 0.20 mm membrane; (m) idem for 0.65 mm membrane. Mean; box: mean7standard error; whisker: mean7standard deviation (n¼3). Curve fit by distance weighted-least squares. C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783778 molecular weight cut-off of the membrane; (3) the high foaming capacity of MF filtrates—leading to protein losses in the balance tank during posterior UF and diafiltration. This latter cause evidences the better foaming capacity of clarified products already referred to by other authors (Pearce et al., 1991; Maubois, 1984), encouraging further research on this functional property. The changes in the fat content of the different liquid products during the processing steps are shown in Table 2. From the data presented, it can be concluded that, after centrifugation, around 5% (between 2.2% and 8.6%) of the original fat still remained in the skimmed products. Taking into account the volumes of each product, it can be observed that, on average, 15% (between 7.0% and 26.6%) and 11% (between 6.0% and 16.5%) of the lipids of the skimmed products were found in ultrafiltration retentates (UFR) and ultrafiltration filtrates (UFF), respectively. The low levels of this component detected in UFR resulted from the fact that, during processing, significant losses of fat in the retentate side occurred. These losses, most probably, were due to the adherence of fat to the walls of the equipment and to the surface of the membrane. This fact can also explain the low levels of this component found in whey and Sorelho ultrafiltration retentate powders (Tables 3 and 4, respectively). In the case of the MF treatments, around 63% of the fat detected in skimmed products was found in three types of MFF: for ovine cheese whey with a 0.65 mm membrane (62.6%), with a 0.20 mm membrane (63.2%) and for Sorelho with a 0.65 mm membrane (64.0%). In these cases, the MF membranes retained around 37% of the fat. For Sorelho with a 0.20 mm membrane, only 21.3% of fat was detected in MFF. However, the fat Liquid products Components % (wet basis) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 W SW UFR UFF MFR MFF DFR Liquid products Components % (wet basis) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 W SW UFR UFF MFR MFF DFR (A) (B) Fig. 4. Chemical composition of original and intermediate liquid ovine cheese whey products: (A) whey and whey products submitted to microfiltration with 0.65 mm membrane; (B) whey and whey products submitted to microfiltration with 0.20 mm membrane. W: ovine cheese whey; SW: skimmed whey; UFR: retentate of ultrafiltration; UFF: filtrate of ultrafiltration; MFR: retentate of microfiltration; MFF: filtrate of microfiltration; DFR: diafiltration retentate: (&), dry matter; (n), ash; (B), protein; (J), fat. Whisker: mean7standard deviation (n¼3). C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783 779 content of neither liquid nor solid MFR products reflected this retention due to the reasons already mentioned above concerning the UF retentates. The final diafiltration step of liquid MFF also caused losses of fat on the retentate side; so, the diafiltration retentates from ovine cheese whey (DFR) and Sorelho (SDFR) only showed between 1% and 3% of the fat contained in the skimmed products. Liquid products Components % (wet basis) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S SS SUFR SUFF SMFR SMFF SDFR Liquid products Components % (wet basis) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 S SS SUFR SUFF SMFR SMFF SDFR (A) (B) Fig. 5. Chemical composition of original and intermediate liquid Sorelho products: (A) Sorelho and Sorelho products submitted to microfiltration with 0.65 mm membrane; (B) Sorelho and Sorelho products submitted to microfiltration with 0.20 mm membrane. S: deproteinized whey (Sorelho); SS: skimmed Sorelho; SUFR: retentate of ultrafiltration; SUFF: filtrate of ultrafiltration; SMFR: retentate of microfiltration; SMFF: filtrate of microfiltration; SDFR: diafiltration retentate: (&), dry matter; (n), ash; (B), protein; (J), fat. Whisker: mean7standard deviation (n¼3). Table 2 Changes of the fat content (g L –1 ) of liquid cheese whey and Sorelho products during the successive steps of the filtration process Ovine cheese whey W (7)SW(7) UFR (7) UFF (7) MFR (7) MFF (7) DFR (7) A 6.97 (1.79) 0.60 (0.35) 0.70 (0.10) 0.11 (0.02) 0.61 (0.17) 0.47 (0.15) 0.25 (0.05) B 15.27 (3.80) 0.76 (0.25) 0.53 (0.06) 0.07 (0.06) 0.64 (0.14) 0.60 (0.01) 0.12 (0.03) Sorelho S(7)SS(7) SUFR (7) SUFF (7)SMFR(7) SMFF (7) SDFR (7) A 4.00 (0.35) 0.25 (0.04) 0.39 (0.11) 0.03 (0.06) 0.37 (0.15) 0.20 (0.17) 0.04 (0.00) B 6.67 (3.79) 0.15 (0.06) 0.40 (0.36) 0.01 (0.00) 0.35 (0.27) 0.08 (0.03) 0.06 (0.03) (A) Batches submitted to UF or clarification with 0.65 mm membrane. (B) Batches submitted to UF or clarification with 0.20 mm membrane. Mean values and standard deviation (7)(n¼3). Note: Ovine cheese whey (W); Sorelho (S); skimmed whey (SW); skimmed Sorelho (SS). Ultrafiltration retentate of whey (UFR) or of Sorelho (SUFR); ultrafiltration filtrate of whey (UFF) or of Sorelho (SUFF); microfiltration retentate of whey (MFR) or of Sorelho (SMFR); microfiltration filtrate of whey (MFF) or of Sorelho (SMFF); diafiltration retentate of whey (DFR) or of Sorelho (SDFR). C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783780 3.4. Compositional analysis of dry products Table 3 shows the chemical composition of dry products obtained from ovine cheese whey. Protein content of ultrafiltration retentate powder was lower than values reported by Casper et al. (1999), since our product was not diafiltrated. Consequently, ash concentration was higher in our product. Significant differences were observed between microfiltration retentate powders for protein contents, whereas fat, ash, Ca 2+ and PO 4 2 did not differ significantly. As expected, diafiltration retentate powders (DFRP) also showed significant differences in their protein contents. With the exception of DFRP 0.65 mm, that contained just about one-third of the ash content, all the other products showed no significant differences in this component. The calcium content of the DFRP products was, as expected, much lower than its content in microfiltration retentate powders and ultrafiltration retentate powder. This could have happened as a consequence of the diafiltration process. Maubois et al. (1987) also alluded to the fact that most of Ca 2+ added during thermocalcic precipitation could be retained with lipoproteins. This reduction in Ca 2+ in both DFRP might be one of the most important features of these products concerning the improvement of some aspects of their functionality (Karleskind, Laye, Mei, & Morr, 1995b; Mangino, 1992). Chloride accounted for a high proportion of the ash content of the powders, since the whey resulted from the production of a cheese in which half of the sodium chloride was added to the milk prior to coagulation. The composition of DFRP 0.65 mm powders clearly reflected the lower retention of proteins by the 0.65 mm pore size membrane. Dry products with less than 0.5% fat (% dry matter) and approximately 65% protein (% dry matter) could be obtained in this case. Although the improvement of UF filtration fluxes with TP/MF using the 0.65 mm membrane was lower than with the 0.20 mm membrane, the possibility of obtaining high protein— low Ca 2+ DFRP powders could support the choice of the 0.65 mm membrane. Table 4 shows the chemical composition of dry products obtained from Sorelho. Microfiltration retentate powders showed no significant differences in protein, fat, ash, Ca 2+ and PO 4 2 contents. The protein content of microfiltration retentate powders did not reflect the differences observed in the liquid products. Both diafiltration retentate powders (SDFRP) showed significant differences in protein and ash contents, reflecting the differences observed in liquid products. The protein content of the 0.65 mm SDFRP was lower than the ones reported by Comendador et al. (1996) for dry Scotta powders obtained by UF/DF. This fact can be explained by the higher MW cut-off of the membrane used, by the losses of protein in the balance tank due to Table 3 Chemical composition of dry ovine cheese whey products UFRP (7) MFRP 0.65 mm(7) MFRP 0.20 mm(7) DFRP 0.65 mm(7) DFRP 0.20 mm(7) Dry matter (%) 88.77 ab (0.32) 88.99 ab (1.05) 90.29 a (2.68) 86.90 b (1.05) 86.58 b (2.40) Protein (% DM) 40.61 a (4.29) 21.34 b (0.99) 35.80 a (5.77) 66.85 c (5.09) 22.39 b (1.01) Fat (% DM) 0.41 a (0.03) 0.52 a (0.11) 0.46 a (0.11) 0.44 a (0.05) 0.49 a (0.10) Ash (% DM) 30.08 a (0.12) 31.55 a (1.54) 28.08 a (3.52) 9.28 b (2.71) 28.93 a (3.77) Chloride (% DM) 10.45 a (0.33) 14.14 b (0.91) 13.09 b (1.35) 4.81 c (1.30) 12.21 ab (1.39) Ca 2+ (% DM) 0.73 a (0.04) 1.01 a (0.13) 0.99 a (0.24) 0.09 b (0.03) 0.06 b (0.02) PO 4 2 (% DM) 0.12 a (0.02) 0.11 a (0.01) 0.12 a (0.02) 0.13 ab (0.01) 0.16 b (0.01) a,b,c Means within the same row without the same superscript differ significantly (pp0.05). UFRP: ultrafiltration retentate powder, MFRP 0.65 mm; MFRP 0.20 mm: microfiltration retentate powders, DFRP 0.65 mm; DFRP 0.20 mm: diafiltration retentate powders. Mean values and standard deviation (7)(n¼3). Table 4 Chemical composition of dry Sorelho products SUFRP (7) SMFRP 0.65 mm(7) SMFRP 0.20 mm(7) SDFRP 0.65 mm(7) SDFRP 0.20 mm(7) Dry matter (%) 89.46 a (0.39) 91.32 b (0.50) 91.21 b (2.67) 85.47 a (0.22) 91.54 b (3.92) Protein (% DM) 32.52 ac (6.44) 18.82 b (2.31) 24.14 ab (5.07) 42.63 c (5.65) 21.59 b (9.29) Fat (% DM) 0.49 a (0.08) 0.54 a (0.03) 0.57 a (0.16) 0.54 a (0.03) 0.47 a (0.12) Ash (% DM) 30.46 a (0.46) 32.67 a (0.41) 30.35 a (0.82) 19.84 b (2.11) 29.92 a (5.30) Chloride (% DM) 16.94 a (0.57) 16.50 a (0.47) 15.61 ac (0.66) 10.08 b (1.63) 14.15 c (1.19) Ca 2+ (% DM) 0.79 a (0.24) 0.95 a (0.03) 0.83 a (0.40) 0.18 b (0.04) 0.24 b (0.05) PO 4 2 (% DM) 0.12 a (0.01) 0.16 a (0.05) 0.12 a (0.01) 0.14 a (0.04) 0.14 a (0.01) a,b,c Means within the same row without the same superscript differ significantly (po0.05). SUFRP: ultrafiltration retentate powder, SMFRP 0.65 mm; SMFRP 0.20 mm: microfiltration retentate powders, SDFRP 0.65 mm; SDFRP 0.20 mm: diafiltration retentate powders. Mean values and standard deviation (7)(n¼3). C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783 781 foam formation, or more probably, by the lower protein content of Sorelho (0.38%70.11) when compared to original Scotta (1.10%70.07). With the exception of the 0.65 mm SDFRP, that showed a lower ash content, no significant differences in this component were observed in the other products. As in ovine cheese whey, although the ash content of both liquid diafiltration retentates was not different, the lower levels of ash content in the 0.65 mm SDFRP are due to the higher content of dry matter of the 0.65 mm SDFR in relation to the 0.20 mm SDFR. The calcium content of the diafiltrated products was, as expected, much lower than its content in retentates of microfiltration and ultrafiltration. As mentioned above, chloride accounted for a high proportion of the ash contents. The low dry matter content of Sorelho that involves working with higher volumes and the lower protein content of most Sorelho dry products, when compared to whey products, may reduce the economical interest in the application of TP/MF to this product. Diafiltrated retentate powders using the 0.65 mmMF membrane of both by-products (whey and Sorelho) showed the highest protein content, which is in the range of commercial bovine whey protein concentrates (Mangino, 1992), and low fat and Ca 2+ concentrations. 4. Conclusions The clarification of by-products from ovine cheese manufacture (cheese whey and deproteinized whey Sorelho) by thermocalcic precipitation followed by microfiltration improves posterior UF treatments significantly. The clarification was more efficient in what concerns filtration rates using the 0.65 mm MF membrane. Although the clarifications with this membrane showed lower effects on the improvement of posterior UF treatments, the diafiltrated product obtained in this case seems to be more appropriate for potential uses in the food industry due to its higher protein content. The poor MF flux performance and the high degree of protein retention observed with the 0.20 mm membrane lead us to conclude that, at least with the type of membranes used, the process is more feasible with the 0.65 mm MF membrane. The use of MF involves high capital and running costs. Therefore, the utilization of this technology can only be considered if the volume of the product to be treated versus the increase in UF permeation rates justify the investment. For the production of clarified and diafiltrated powders, the efficiency of the MF process should be improved using more adequate equipment in order to attain higher volumetric concentration factors and lower retention of proteins with the MF membrane. In any case, the functional properties of the dry products obtained deserve further investigation. Acknowledgements We thank S. Piegay for his technical support in the separation of cheese whey products. This work was supported by the ‘‘Conseller! ıa de Educaci! on e Ordenaci! on Universitaria da Xunta de Galicia’’ (XUGA26202B97). Funding for author C.D.P. was provided by a Ph.D. fellowship (BD 19672/99) issued within the framework ‘‘PRAXIS XXI’’, administered by JNICT, Portugal. Our thanks are extended to ANCOSE and In# es Milheirico for supplying the products used in the trials as well as to Dr. JoDee Anderson for the linguistic support she provided. References AOAC. (1996a). Fat in dried milk. In P. Cunliffe (Ed.), Official methods of analysis (16th ed.). Vol. II. AOAC, Maryland, USA. AOAC (1996b). Phosphorus in dried milk: colorimetric procedure. In P. Cunliffe (Ed.), Official methods of analysis (16th ed.). Vol. II. AOAC, Maryland, USA. Baumy, J. J., Gestin, L., Fauquant, J., Boyaval, E., & Maubois, J. L. (1990). Technologies de purification des phospholipides du lactos- ! erum. Process,1047, 29–33. Casper, J. L., Wendorff, W. L., & Thomas, D. L. (1998). Seasonal changes in protein composition of whey from commercial manufacture of caprine and ovine specialty cheeses. Journal of Dairy Science,81, 3117–3122. Casper, J. L., Wendorff, W. L., & Thomas, D. L. (1999). Functional properties of whey protein concentrates from caprine and ovine specialty cheese wheys. Journal of Dairy Science,82, 265–271. Cheryan, M. (1986). Ultrafiltration handbook. Lancaster: Technomic Publishing Company Inc.. Chianese, L., Laeze, P., Nicolai, M. A., Garro, G., D’Auria, R., Iametti, S., Bonomi, F., Orban, E., & Quaglia, G. B. (1996). Chemical composition and functional properties of ovine rennet whey and deproteinized whey. Milchwissenschaft,51(10), 569–573. Comendador, F. J., Nardo, N., Bertone, A., Maurizi, A., & Quaglia, G. (1996). Effetto dell’ultrafiltrazione sulle propriet" a funzionali della scotta ovina. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia,47(2), 103–112. Daufin, G., Michel, F., Labb! e, J. P., Quemerais, A., & Grangeon, A. (1993). Ultrafiltration of deffated whey: Improving performance by limiting membrane fouling. Journal of Dairy Research,60, 79–88. Fauquant, J., Vieco, E., Brule, G., & Maubois, J. L. (1985). Clarification des lactos! erums doux par agr! egation thermocalcique de la matiere grasse r! esiduelle. Le Lait,65, 1–20. Hambraeus, L. (1992). Nutritional aspects of milk proteins. In P. F. Fox (Ed.), Advanced Dairy Chemistry: Proteins, Vol. I (pp. 457– 490). London: Elsevier Science Publishers. Hiddink, J., De Boer, R., & Nooy, P. F. C. (1981). Effect of various pre-treatments on the ultrafiltration of sweet cheese whey at about 551C. Milchwissenschaft,36(11), 657–663. Joseph, M. S. B., & Mangino, M. E. (1998). The effect of milk fat globule membrane on the foaming and gelation properties of b Lactoglobulin solutions and whey protein concentrates. Australian Journal of Dairy Technology,43, 9–11. Karleskind, D., Laye, I., Mei, F. I., & Morr, C. V. (1995a). Chemical preatreatment and microfiltration for making delipidized whey protein concentrate. Journal of Food Science,60, 221–227. C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783782 Karleskind, D., Laye, I., Mei, F. I., & Morr, C. V. (1995b). Gelation properties of lipid-reduced and calcium-reduced whey protein concentrates. Journal of Food Science,60, 731–737. Karleskind, D., Laye, I., Mei, F. I., & Morr, C. V. (1995c). Foaming properties of lipid-reduced and calcium-reduced whey protein concentrates. Journal of Food Science,60, 738–741. Karleskind, D., Laye, I., Morr, C. V., & Schenz, T. W. (1996). Emulsifying properties of lipid-reduced and calcium-reduced whey protein concentrates. Journal of Food Science,61, 54–58. Kessler, H. G. (1997). Engineering aspects of currently available technological processes. IDF Bulletin,320, 16–25. Mangino, M. E. (1992). Properties of whey protein concentrates. In J. G. Zadow (Ed.), Whey and lactose processing (pp. 231–270). London: Elsevier Science Publishers. Maubois, J. L. (1984). Separation, extraction and fractionation of milk protein components. Le Lait,64, 485–495. Maubois, J. L., Pierre, A., Fauquant, J., & Piot, M. (1987). Industrial fractionation of main whey proteins. IDF Bulletin,212, 154–159. Morr, C. V., & Ha, E. Y. W. (1993). Whey protein concentrates and isolates: Processing and functional properties. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,33, 431–476. Muller, L. I., & Harper, J. W. (1979). Effects on membrane processing of pretreatments of whey. Journal of Agricultural and Food Chemistry,27(4), 862–864. Mulvihill, D. M. (1992). Production, functional properties and utilization of milk protein products. In P. F. Fox (Ed.), Advanced dairy chemistry: Proteins, Vol. I (pp. 369–404). London: Elsevier Science Publishers. Pearce, R. J., Marshall, S. C., & Dunkerley, J. A. (1991). Reduction of lipids in whey protein concentrates—effect on functional properties. IDF (Special Issue),9201, 118–129. Pierre, A., Le Graet, Y., Daufin, G., Michel, F., & G! esan, G. (1994). Whey microfiltration performance: Influence of protein concentration by ultrafiltration and of physicochemical treatment. Le Lait, 74, 65–77. Pintado, M. E., Lopes da Silva, J. A., & Malcata, F. X. (1996). Characterization of Requeij* ao and technological optimization of its manufacturing process. Journal of Food Engineering,30, 363–376. Pintado, M. E., Macedo, A. C., & Malcata, F. X. (2001). Review: Technology, chemistry and microbiology of whey cheeses. Food Science and Technology International,7(2), 105–116. Pizzichini, M., Zeddita, G., Comendador, F. J., Bertone, A., Maurizi, A., Nardo, N., & Quaglia, G. (1995). Recupero di sieroproteine e acqua depurata dalla scotta ovina com tecnologie di membrana. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia,46(6), 361–379. Rinn, J. C., Morr, C. V., Seo, A., & Surak, J. G. (1990). Evaluation of nine semi-scale whey pretreatment modifications for producing whey protein concentrate. Journal of Food Science,55(2), 511–515. Sandblom, R. M. (1974). Filtering process. Swedish Patent No. 7416257. C.D. Pereira et al. / International Dairy Journal 12 (2002) 773–783 783 Functional properties of ovine whey protein concentrates produced by membrane technology after clarification of cheese manufacture by-products Olga Dı ´az a , Carlos D. Pereira b , Angel Cobos a, * a Facultad de Ciencias de Lugo, Departamento de Quı ´mica Analı ´tica, Nutricio ´n y Bromatologı ´a, A ´rea de Tecnologı ´a de Alimentos, Universidad de Santiago de Compostela, 27002 Lugo, Spain b Escola Superior Agraria de Coimbra (ESAC/IPC), Bencanta, 3040-316 Coimbra, Portugal Received 28 February 2003; accepted 8 October 2003 Abstract Functionality (solubility, emulsifying and foaming properties) of ovine cheese whey and deproteinized whey (Sorelho) protein concentrates was evaluated. Both by-products of ovine cheese manufacture were clarified by thermocalcic precipitation and microfiltration using two pore size membranes (0.65 and 0.20 mm). Next, they were ultrafiltrated/diafiltrated, and then, the liophilization of the corresponding retentates was carried out. The functionality of these powders, as well as that of untreated ultrafiltrated whey protein concentrate (WPC) and microfiltration retentates powders, was evaluated. The clarification treatment increased solubility of the WPC produced from ovine whey and deproteinized ovine whey. Moreover, these products had foaming properties, whereas conventional WPC and microfiltration retentate powders (MFRP) were unable to produce foams. The whey product obtained after clarification using a 0.65 mm microfiltration membrane had the best foaming properties. The clarification treatment did not significantly increase emulsifying activity and stability, except for the Sorelho product obtained using a 0.65 mm membrane. MFRP from ovine whey and Sorelho, the by-products of the clarification procedure, showed similar solubility and higher emulsifying activity than conventional WPC, although their emulsion stability was lower. The clarification procedure studied, particularly when a 0.65 mm microfiltration membrane was used, improved some functional properties of the whey and Sorelho protein concentrates, and also generated microfiltration retentates for potential use in food manufacturing. q2003 Elsevier Ltd. All rights reserved. Keywords: Functional properties; Ovine cheese whey; Deproteinized whey; Whey clarification; Microfiltration 1. Introduction Whey protein concentrates (WPC) are ingredients widely used in the food industry in a variety of formulated products, such as dairy, bakery, meat, beverage and infant formula products (Morr, 1992) due to the excellent functional properties of their proteins (Kinsella & Whitehead, 1989). Moreover, WPC production represents the best means for the utilization of whey proteins (Morr & Foegeding, 1990). Ultrafiltration (UF) has proved to be the system of choice for preparing WPC with good functional properties; however, membrane fouling, caused by several whey components, is a drawback in UF (Zall, 1992). Among these compounds, phospholipids cause rapid decrease in membrane performance and seriously impair some functional properties of WPC (DeWit, 1984; Hiddink, De Boer, & Nooy, 1981; Karleskind, Laye, Mei, & Morr, 1995a; Pearce, Marshall, & Dunkerley, 1991). Several physico-chemical and biochemical (enzymic) treatments have been applied for the removal of these compounds (Blecker et al., 1997; Mangino, 1992; Rinn, Morr, Seo, & Surak, 1990); one of these treatments is based on the aggregation of the phospholipids with protein and calcium and removal of aggregates by microfiltration (Fauquant, Vieco, Brule, & Maubois, 1985; Timmer & Van der Horst, 1998). The extracted phospholipoproteins could 0268-005X/$ - see front matter q2003 Elsevier Ltd. All rights reserved. doi:10.1016/j.foodhyd.2003.10.003 Food Hydrocolloids 18 (2004) 601–610 www.elsevier.com/locate/foodhyd *Corresponding author. Tel.: þ34-982223325; fax: þ34-982285872. E-mail address: [email protected] (A. Cobos). The improvement in the foaming properties of WPC when pre-treatment is applied has been attributed to residual total lipid reduction by several authors (DeWit, 1984; Karleskind, Laye, Mei, & Morr, 1995c; Pearce et al., 1991; Zayas, 1997). However, untreated and clarified ovine powders used in our work showed similar total lipid content (Table 1) and untreated WPCs were unable to produce foams, while an acceptable foaming capacity was found in clarified WPCs. According to this, it is possible that lipids per se are not the most important antifoaming components, at least when they are present at very low concentrations in WPC. Lipoproteins impair the foaming properties of whey proteins by weakening the cohesive forces between the protein layers surrounding the air bubbles (Zayas, 1997). But it might be that the protein component of those lipoproteins was the responsible for this effect. Hawks, Phillips, Rasmussen, Barbano, and Kinsella (1990) improved foaming properties of WPI by microfiltration and concluded that a high molecular mass whey component was a foam depressant. In a previous work, Joseph and Mangino (1988) studied the effects of different amounts of milk fat globule membrane in foaming properties of blactoglobulin; the components of this membrane impaired foaming more than the addition of soy oil or lecithin. These authors concluded that it was possible for a protein fraction associated with the fat globule membrane to be a powerful anti-foaming agent. The methodology of whey clarification could have a great influence in enhancing the foaming properties of WPC. Thermocalcic precipitation following by centrifugation seems to have little effect on improving this property (Kim et al., 1989; Vaghela & Kilara, 1996). However, the combination of thermocalcic precipitation þmicrofiltration seems to improve foaming in WPC, such as we found in ovine WPC and is reported by other authors (Karleskind et al., 1995c; Rinn et al., 1990) in bovine WPC. The foaming capacity of ovine WPCs was lower than the bovine WPC analysed by Morr and Foegeding (1990), Rinn et al. (1990), and Vaghela and Kilara (1996). Only the DFRP 0.65 product showed similar values for this property. The values reported by Casper et al. (1999) for ovine WPC were also higher than those observed in our study. Nevertheless, it is important to note that we worked with whey from raw milk cheese manufacture (Serra da Estrela cheese), while the authors mentioned above studied the properties of WPC obtained from pasteurised milk cheese whey. Mangino, Liao, Harper, Morr, and Zadow (1987) reported that WPC produced from pasteurised milk cheese wheys produced significantly better foams, which were more stable. Sorelho WPC showed lower values in FE compared with ovine whey WPC, and lower values of FS in comparison with DFRP 0.65. It is known that mild heat treatment (to approximately 55 8C) enhances the foaming properties of WPC due to partial protein denaturation, while higher heating produces intense denaturation and adversely affects this property (Mangino et al., 1988; Karleskind et al., 1995c; Schmidt et al., 1984), particularly at neutral pH (Phillips, Schulman, & Kinsella, 1990). At high heating temperatures (60–100 8C) irreversible physicochemical changes induced by protein denaturation occur (DeWit & Klarenbeek, 1984), producing an excessive interaction that can cause protein aggregation and reduction of film formation (Zayas, 1997). As we mentioned above, Requeija ˜o is produced by heating ovine whey to 90 8C, 10 min and Sorelho is the by-product of its manufacture. Similar differences between ovine whey and deproteinized ovine whey WPCs (Scotta protein concentrate) have been reported by Chianese et al. (1996). However, heat treatment only decreased the foaming of SDFRP products, but this capacity was not eliminated. Probably the strongly denatured proteins would be retained by MF membranes during clarification procedure, and in clarificated powders only partially denatured and soluble proteins remained. This hypothesis agrees with our observations of protein composition and solubility. Whey and Sorelho diafiltrated powders after clarification using a 0.65 mm pore size MF membrane showed better FE values that the diafiltrated powders clarified using a 0.20 mm MF membrane. Some differences in composition have been found between these samples (Tables 1 and 2), that could be responsible for the different values obtained. Both DFRP 0.65 and SDFRP 0.65 showed higher proportion of b-lactoglobulin than DFRP 0.20 and SDFRP 0.20 (Table 2). Kim et al. (1987) observed that the b-lactoglobulin determined by HPLC was significantly correlated with whipped topping overrun. Lower ash and sodium chloride contents were found in DFRP 0.65 and SDFRP 0.65 products in comparison with their equivalents when a 0.20 mm MF membrane was used. The solutions for foaming determination of diafiltrated powders from whey clarified using 0.65 mm MF membranes showed ash contents of 0.20–0.42% (w/v) and a chloride concentration of 30–61 mM. The solutions of samples clarified using a 0.20 mm MF membrane contained 1.25–1.36% (w/v) ash and 149–183 mM chloride (values calculated from data of Table 1). It is important to note that the differences between samples are increased by the fact that it was necessary to dissolve different amounts of sample in order to reach a protein concentration of 1% (w/v) in solution [DFRP and SDFRP 0.65 at 2.5% (w/v) solids and DFRP and SDFRP 0.20 at 5% (w/v) solids]. As coincides with previous research, the effect of ash and sodium chloride in foaming is not clearly defined. Patel and Kilara (1990) found that the foaming capacity of WPC is positively correlated to calcium and ash content, and something similar has been reported (Halling, 1981) when sodium chloride is added. Karleskind et al. (1995c) did not find significant correlations between the foaming and sodium concentrations for WPC. However, the lower foaming expansion and FS that we found in samples with a high sodium chloride content agree with the results reported by Phillips, Yang, and Kinsella (1991) when 0.1 M NaCl was added to the WPI solutions prior to O. Dı ´az et al. / Food Hydrocolloids 18 (2004) 601–610608 foaming. The influence of these compounds in the foaming properties of ovine WPC needs further investigation. The obtaining of 1% protein concentration in DFRP 0.20 and SDFRP 0.20 made necessary the increase of total solids that also involved the presence of higher amounts of lipids, which could impair foaming properties of WPC (Phillips, Whitehead, & Kinsella, 1994; Zayas, 1997). 5. Conclusions Thermocalcic aggregation followed by microfiltration, particularly when the 0.65 mm microfiltration membrane was used, improved some of the functional properties studied (solubility and foaming) for ovine whey and Sorelho protein concentrates. Moreover, the MFRP obtained could also be of potential use in food manufacturing due to their acceptable emulsifying activity. In any case, other aspects of the functionality of ovine whey and Sorelho derived products deserve further investigation in order to determinate their practical applications in the food industry. Acknowledgements This work was supported by the “Consellerı ´ade Educacio ´n e Ordenacio ´n Universitaria da Xunta de Galicia” (XUGA26202B97). Autor C.D.P.’s funding was provided by a PhD fellowship (BD19672/99) issued within the framework “PRAXIS XXI”, administered by JNICT, Portugal. Our thanks to Dr JoDee Anderson for the linguistic support she provided. References Anand, K., Brody, E., Ward, G., & Landry, J. (1998). Custom denaturation of whey proteins: thermal effects. IDF (Special Issue),9804, 101–115. Blecker, C., Paquot, M., Lamberti, I., Sensidoni, A., Lognay, G., & Deroanne, C. (1997). Improved emulsifying and foaming of whey proteins after enzymic fat hydrolysis. Journal of Food Science,62, 48–52. 74. Casper, J. L., Wendorff, W. L., & Thomas, D. L. (1998). Seasonal changes in protein composition of whey from commercial manufacture of caprine and ovine specialty cheeses. Journal of Dairy Science,81, 3117–3122. Casper, J. L., Wendorff, W. L., & Thomas, D. L. (1999). Functional properties of whey protein concentrates from caprine and ovine specialty cheese wheys. Journal of Dairy Science,82, 265–271. Chianese, L., Laezza, P., Nicolai, M. A., Garro, G., D’Auria, R., Iametty, S., Bonomi, F., Orban, E., & Quaglia, G. B. (1996). Chemical composition and functional properties of ovine rennet whey and deproteinized whey. Milchwissenschaft,51(10), 569–573. Comendador, F. J., Nardo, N., Bertone, A., Maurizi, A., & Quaglia, G. (1996). Effetto dell’ultrafiltrazione sulle proprieta `funzionali della scotta ovina. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia,47(2), 103–112. Dalgleish, D. G., & Banks, J. M. (1991). The formation of complexes between serum proteins and fat globules during heating of whole milk. Milchwissenschaft,46, 75–78. DeWit, J. N. (1984). Functional properties of whey proteins in food systems. Netherland Milk and Dairy Journal,38, 71–84. DeWit, J. N., & Klarenbeek, G. (1984). Effect of various heat treatments on structure and solubility of whey proteins. Journal of Dairy Science,67, 2701–2710. Fauquant, J., Vieco, E., Brule, G., & Maubois, J. L. (1985). Clarification des lactose ´rums doux par agre ´gation thermocalcique de la matiere grasse re ´siduelle. Le Lait,65, 1–20. Foley, J., & O’Connell, C. (1990). Comparative emulsifying properties of sodium caseinate and whey protein isolate in 18% oil in aqueous systems. Journal of Dairy Research,57, 377–391. Gonza ´lez de Llano, D., & Santa-Marı ´a, G. (1997). Ana ´lisis of whey proteins during ripening of Afuega’l Pitu cheese by reversed phase HPLC. Food Science and Technology International,3, 445–449. Halling, P. J. (1981). Protein-stabilized foams and emulsions. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition,13, 155–203. Harper, W. J., & Man Lee, K. (1998). Functional properties of 34% whey protein concentrate. IDF (Special Issue),9804, 140–153. Hawks, S. E., Phillips, L. G., Rasmussen, R. R., Barbano, D. M., & Kinsella, J. E. (1990). Effect of processing treatment and cheesemaking parameters on foaming properties of whey protein isolates. Journal of Dairy Science,76, 2468–2477. Hiddink, J., De Boer, R., & Nooy, P. F. C. (1981). Effect of various pretreatments on the ultrafiltration of sweet cheese whey at about 55 8C. Milchwissenschaft,36(11), 657–663. Houlihan, A. V., Goddard, P. A., Nottigham, S. M., Kitchen, B. J., & Masters, C. J. (1992). Interactions between the bovine milk fat globule membrane and skim milk components on heating whole milk. Journal of Dairy Research,59, 187–195. Joseph, M. S. B., & Mangino, M. E. (1988). The effect of milk fat globule membrane protein on the foaming and gelation properties of a- Lactoglobulin solutions and whey protein concentrates. Australian Journal of Dairy Technology,43, 9–11. Karleskind, D., Laye, I., Mei, F. I., & Morr, C. V. (1995a). Chemical pretreatment and microfiltration for making delipidized whey protein concentrate. Journal of Food Science,60, 221–227. Karleskind, D., Laye, I., Mei, F. I., & Morr, C. V. (1995b). Gelation properties of lipid-reduced, and calcium-reduced whey protein concentrates. Journal of Food Science,60, 731–737. Karleskind, D., Laye, I., Mei, F. I., & Morr, C. V. (1995c). Foaming properties of lipid-reduced and calcium reduced whey protein concentrates. Journal of Food Science,60, 738–741. Karleskind, D., Laye, I., Morr, C. V., & Schenz, T. W. (1996). Emulsifying properties of lipid-reduced and calcium reduced whey protein concentrates. Journal of Food Science,61, 54–58. Karman, A. H., & Van Boekel, M. A. J. S. (1986). Evaluation of the Kjeldahl factor for conversion of the nitrogen content of milk and milk products to protein content. Netherlands Milk and Dairy Journal,40, 315–336. Kim, Y. A., Chism, G. W., III, & Mangino, M. E. (1987). Determination of the beta-lactoglobulin, alpha-lactalbumin and bovine serum albumin of whey protein concentrates and their relationship to protein functionality. Journal of Food Science,52, 124–127. Kim, S.-H., Morr, C. V., Seo, A., & Surak, J. G. (1989). Effect of whey pretreatment on composition and functional properties of whey protein concentrate. Journal of Food Science,54, 25–29. Kilara, A. (1984). Standardization of methodology for evaluating whey proteins. Journal of Dairy Science,67, 2734–2744. Kinsella, E., & Whitehead, D. M. (1989). Proteins in whey: chemical, physical and functional properties. Advances in Food and Nutrition Research,33, 343–438. Klemaszewski, J. L., Das, K. P., & Kinsella, J. E. (1992). Formation and coalescence stability of emulsions stabilized by different milk proteins. Journal of Food Science,57, 366–371, 379. Lee, S.-Y., Morr, C. V., & Ha, E. Y. W. (1992). Structural and functional properties of caseinate and whey protein isolate as affected by temperature and pH. Journal of Food Science,57, 1210–1213. 1229. O. Dı ´az et al. / Food Hydrocolloids 18 (2004) 601–610 609 Li-Chan, E. (1983). Heat-induced changes in the proteins of whey protein concentrate. Journal of Food Science,48, 47–56. Mangino, M. E. (1992). Properties of whey protein concentrates. In J. G. Zadow (Ed.), Whey and lactose processing (pp. 231–270). London: Elsevier Science Publishers. Mangino, M. E., Huffman, L. M., & Regester, G. O. (1988). Changes in the hydrophobicity and functionality of whey during the processing of whey protein concentrates. Journal of Food Science,53, 1684–1686. 1693. Mangino, M. R., Liao, S. W., Harper, W. J., Morr, C. V., & Zadow, J. G. (1987). The effects of heating during processing on the functionality of whey protein concentrates. Journal of Food Science,52, 1522–1524. Maubois, J. L., & Ollivier, G. (1991). Milk protein fractionation. IDF (Special Issue),9201, 15–22. Maubois, J. L., Pierre, A., Fauquant, J., & Piot, M. (1987). Industrial fractionation of main whey proteins. Bulletin of the IDF,212, 154–159. Morr, C. V. (1992). Whey utilization. In J. G. Zadow (Ed.), Whey and lactose processing (pp. 133–155). London: Elsevier Science Publishers. Morr, C. V., & Foegeding, E. A. (1990). Composition and functionality of commercial whey and milk protein concentrates and isolates: a status report. Food Technology,44, 100–112. Morr, C. V., German, B., Kinsella, J. E., Regenstein, J. M., Van Buren, J. P., Kilara, A., Lewis, B. A., & Mangino, M. E. (1985). A collaborative study to develop a standardized food protein solubility procedure. Journal of Food Science,50, 1715–1718. Morr, C. V., & Ha, E. Y. W. (1993). Whey protein concentrates and isolates: processing and functional properties. Critical Reviews in Food Science and Nutrition,33, 431–476. Patel, M. T., & Kilara, A. (1990). Studies on whey protein concentrates. 2. Foaming and emulsifying properties and their relationships with physicochemical properties. Journal of Dairy Science,73, 2731–2740. Patel, P. D., Stripp, A. M., & Fry, J. C. (1988). Whipping test for the determination of foaming capacity of protein: a collaborative study. International Journal of Food Science and Technology,23, 57–63. Pearce, K. N., & Kinsella, J. E. (1978). Emusifying properties of proteins: evaluation of turbidimetric technique. Journal of Agricultural and Food Chemistry,26, 716–722. Pearce, R. J., Marshall, S. C., & Dunkerley, J. A. (1991). Reduction of lipids in whey protein concentrates-effect on functional properties. IDF (Special Issue),9201, 118–129. Pereira, C. D., Dı ´az, O., & Cobos, A. (2002). Valorization of by-products from ovine cheese manufacture: clarification by thermocalcic precipitation/microfiltration before ultrafiltration. International Dairy Journal, 12(9), 773–783. Phillips, L. G., Schulman, W., & Kinsella, J. E. (1990). pH and heat treatment effects on foaming of whey protein isolate. Journal of Food Science,55, 1116–1119. Phillips, L. G., Whitehead, D. M., & Kinsella, J. E. (1994). Structurefunction properties of food proteins. San Diego: Academic Press. Phillips, L. G., Yang, S. T., & Kinsella, J. E. (1991). Neutral salt effects on stability of whey protein isolate foams. Journal of Food Science,56, 588–589. Pintado, M. E., Lopes da Silva, J. A., & Malcata, X. (1996). Characterization of requeijao and technological optimization of its manufacturing process. Journal of Food Engineering,30, 363–376. Pintado, M. E., Lopes da Silva, J. A., & Malcata, X. (1999). Comparative characterization of whey protein concentrates from ovine, caprine and bovine breeds. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie,32(4), 231–237. Rinn, J. C., Morr, C. V., Seo, A., & Surak, J. G. (1990). Evaluation of nine semi-scale whey pre-treatment modifications for producing whey protein concentrate. Journal of Food Science,55(2), 511–515. Schmidt, R. H., Packard, V. S., & Morris, H. A. (1984). Effect of processing on whey protein functionality. Journal of Dairy Science,67, 2723–2733. Timmer, J. M. K., & Van der Horst, H. C. (1998). Whey processing and separation technology: state-of-the-art and new developments. IDF (Special Issue),9804, 40–65. Tornberg, E., & Hermansson, A. M. (1977). Functional characterization of protein stabilized emulsions: effect of processing. Journal of Food Science,42, 468–472. Vaghela, M. N., & Kilara, A. (1996). Foaming and emulsifying properties of whey protein concentrates as affected by lipid composition. Journal of Food Science,61, 275–280. Van Boekel, M. A. J. S., & Walstra, P. (1995). Effect of heat treatment on chemical and physical changes to milkfat globules. IDF (Special Issue), 9501, 51–65. Zall, R. R. (1992). Sources and composition of whey and permeate. In J. G. Zadow (Ed.), Whey and lactose processing (pp. 1–72). Barking: Elsevier Science Publishers. Zayas, J. F. (1997). Funcionality of proteins in food. Berlin: Springer- Verlag. O. Dı ´az et al. / Food Hydrocolloids 18 (2004) 601–610610 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 124 Manuscrito III RESULTADOS Y DISCUSIÓN 125 milch wissen schaft Dielsweg 9 MILK SCIENCE INTERNATIONAL D-24105 Kiel, Germany Journal of Nutrition Research and Food Science Zeitschrift für Ernährungsforschung und Lebensmittelwissenschaften Scientific Editor: Prof. Dr. W.H. Heeschen Tel. +49 431 3 41 06 Fax +49 431 33 79 83 e-mail: heesch[email protected] June 1, 2005 Dr. Angel Cobos Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Facultad de Ciencias. USC 27002 Lugo Spain Re 367 (Please, use this reference number in all correspondence!) Dear colleague, Referring to our e-mail of May 3, 2005, I am glad to inform you that your paper “Rheological properties and microstructure of heat-induced gels of ovine whey protein concentrates obtained from clarified cheese whey” has been accepted for publication. The preparation of the manuscript must follow exactly the Instructions to Authors which are attached. In particular, please, take care of the following requirements: 1) The figures must be submitted in a width of exactly 80 mm (without outer frame) and inscriptions (first letter in the first word of a line upper case!) of about 2 mm (Arial type, not bold face). The size of the symbols and the strength of the curves must fit into the layout. Please, adjust the figures and the size of the symbols accordingly in order to reach a harmonized appearance. 2) Citation of references see Instructions to Authors (names of the authors not in capitals, but in small capitals). Please, send the manuscript in its final version to Dr. Karin Heeschen, Dielsweg 9, D-24105 Kiel, Germany, telefax: +49 431 33 89 73. email: [email protected]. Thank you very much again for your contribution and cooperation. Sincerely yours, Walther Heeschen RESULTADOS Y DISCUSIÓN 126 Rheological properties and microstructure of heat-induced gels of ovine whey protein concentrates obtained from clarified cheese whey O. DÍAZ a, C. D. PEREIRA a,b, A. COBOS a * a Facultad de Ciencias de Lugo. Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, Área de Tecnología de Alimentos. Universidad de Santiago de Compostela. 27002 Lugo. Spain. b Escola Superior Agraria de Coimbra (ESAC/IPC). Bencanta, 3040-316 Coimbra. Portugal. * Corresponding author. Fax: + 34-982285872 E-mail address: [email protected] RESULTADOS Y DISCUSIÓN 127 Abstract Rheological properties and microstructure in gels of ovine whey protein concentrates (WPC) were evaluated. The ovine whey was clarified by thermocalcic precipitation and microfiltration. Next, it was ultrafiltrated/diafiltrated, and then, the liofilization of the retentate was carried out. The study was done in heat-induced gels prepared with solutions from this powder as well as with untreated ultrafiltrated WPC and microfiltration retentate powders. Clarified WPC were able to gel at 10 and 5% (w/v) powder concentrations while only 20% solutions of untreated WPC and microfiltrate retentate powders formed gels. The pH values of the sample solutions influenced the rheological properties of the gels formed, since they became harder at pH 7 than at pH 4. The elastic moduli of the gels were not affected either by the pore size membrane (0.20 and 0.65 µm) used in the microfiltration step or the measuring temperature (15 and 60ºC). In the microstructural observations, clarified WPC gels showed larger and better defined protein aggregates than in the other samples, although their microstructure was influenced by pH value. 1. Introduction The bovine whey protein concentrates (WPC) are applied in food products because of the functionality of their proteins (11), and many of them because of to their tendency to form irreversible heat-induced gels (1). The information about the gelling properties of ovine WPC produced by ultrafiltration or other methods is very scarce although better gel strength of ovine WPC than that of bovine WPC has been reported (4, 15); moreover the thermocalcic aggregation has been never used as a clarification method of ovine whey. No RESULTADOS Y DISCUSIÓN 128 previous studies have been reported on the microstructural characteristics of ovine whey gels. In previous works (5, 14), we studied the technological feasability of the clarification of ovine cheese whey by thermocalcic precipitation followed by microfiltration and some functional properties (solubility, emulsifying and foaming properties) of the clarified and diafiltrated ovine WPCs and the microfiltration retentates. The objective of this work was to study the rheological properties and the microstructure of heat-induced gels prepared with solutions of conventional ultrafiltration, microfiltration and clarified ultrafiltration/diafiltration retentate powders from ovine cheese whey, in order to evaluate the possible utility of these products in food manufacture. Moreover, the influence of pH in WPC gelation, the measuring temperature and the use of two microfiltration membranes used in the clarification process were studied. 2. Materials and methods 2.1. Sample preparation Ovine cheese whey was obtained from the Association of Producers of Serra da Estrela Sheep (ANCOSE, Portugal). After skimming, approximately 100 L of whey were used in each of the three trials made; 50 L were submitted to conventional UF and the other 50 L to thermocalcic precipitation+microfiltration followed by UF and diafiltration. All experiments were made in triplicate. More details and a diagram of the process can be found in PEREIRA et al. (14). Two microfiltration pore size membranes (0.20 and 0.65 µm) were used in the clarification procedure. Membrane retentates were freeze dryed in a Lyph-Lock freeze dryer (Labconco Corporation, Kansas City, USA). Five products were obtained: the conventional ultrafiltration retentate powder (UFRP), the microfiltration retentate powder RESULTADOS Y DISCUSIÓN 129 using a 0.65 µm pore size MF membrane (MFRP 0.65), the microfiltration retentate powder using a 0.20 µm pore size MF membrane (MFRP 0.20), and the diafiltration retentate powders (from the diafiltration of microfiltration filtrates using the two MF membranes, DFRP 0.65 and DFRP 0.20). The chemical composition of ovine cheese whey is reported by PEREIRA et al. (14) and the protein composition is described in DÍAZ et al. (5). 2.2. Preparation of gels Sample solutions, at concentrations of 20, 10 and 5% (w/v), were prepared in 100 ml beakers by dispersing appropriate amounts of powder in doubled distilled water. The dispersions were stirred for 1 h at room temperature and eventually the pH of solutions was adjusted to pH 7 or 4 using NaOH or HCl. Gels were obtained by heating at 90ºC for 30 min in a water bath. Then they were immediately cooled in ice water to 8ºC. The gels were aged 15 h at 8ºC. 2.3. Rheological properties of gels The dynamic rheological tests were performed by a Haake Rheostress RS100 rheometer (Thermo Electron, Karlsruhe, Germany) fitted with a cone-and-plate device (angle of 4º and a cone diameter of 35 mm). Stress-sweep test were conducted at a frequency of 1 Hz to determine the linear viscoelastic range. The storage modulus (G’) and the loss modulus (G’’) were determined between frequencies of 0.428-42.80 s-1, at 20 Pa for gels with 20 and 10% powder concentrations, and 10 Pa for gels with 5% powder concentration, in the linear range. Measurements were made at 15ºC and at 60ºC, after heating and maintaining each of the samples at these temperatures for 3 h, in order to verify the temperature dependence of the parameters measured. All determinations were made in duplicate. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 130 2.4. Microstructure of gels Scanning electron microscopy (SEM) was used to study the microstructure of the gels produced as described above. The samples taken 24 h after gel manufacture consisted in 5 mm cubes, which were left in a 100ml/l thrichloromethane-water solution until analysis. Gel samples were sequentially dehydrated with successive treatments in aqueous ethanol solutions that progressively increased in ethanol concentration from 30 to 100%. Afterwards the ethanol was substituted by 100% acetone and a critical point drying was made in a Bal-Tec CPD 020 critical point dryer (Bal-Tec AG, Balzers, Liechtenstein). Dried specimens were fractured with a razor blade, mounted on stubbs and sputter coated with gold ions (300 Å at 1200 V and 10 mA) in a Jeol JFC-1100 ion sputtering device (Jeol Ltd., Tokyo, Japan), and examined by SEM in a Jeol JSM-T220A scanning electron microscope, operated at 15 kV. 3. Results and discussion 3.1. Rheological properties of gels Fig. 1 shows G´ and G´´ which vary according to the frequency of the gels prepared with solutions from UFRP and adjusted to pH 7. G´ showed little frequency dependence. This indicates the presence of a network not prone to rupture at junction zones within the frequencies used. G´´ had values about 5 times lower than G´, which means that gels mainly react elastically. Similar patterns were observed in the other gels and in those of unclarified ovine WPC gels studied by PINTADO et al. (15). The values of G´ of all the gels at the frequency of 4.28s-1 are shown in Fig. 2. The concentration needed in order to obtain a gel was different depending on the product. In this way, only UFRP, MFRP 0.65 and MFRP 0.20 20% solutions formed a gel, while 10% solutions could not produce gels. Interestingly enough both DFRP 0.65 and 0.20 were able RESULTADOS Y DISCUSIÓN 137 Manuscrito IV RESULTADOS Y DISCUSIÓN 138 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 139 Use of ovine whey protein concentrates and clarification by-products on whey 1 cheese: impact on yield and quality 2 3 Carlos D. Pereira a,b, Olga Díaz a, Angel Cobos a * 4 5 6 7 a Facultad de Ciencias de Lugo. Departamento de Química Analítica, Nutrición y 8 Bromatología, Área de Tecnología de Alimentos. Universidad de Santiago de 9 Compostela. 27002 Lugo. Spain. 10 11 b Escola Superior Agraria de Coimbra (ESAC/IPC). Bencanta, 3040-316 Coimbra. 12 Portugal. 13 14 15 * Corresponding autor. Tel.: + 34-982223996; Fax: + 34-982285872 16 E-mail address: [email protected] (A. Cobos) 17 Correspondence address: Dr. Angel Cobos 18 Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología 19 Facultad de Ciencias de Lugo. USC. 20 27002 Lugo. SPAIN 21 22 23 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 140 1 2 Abstract 3 4 The effects of the addition of whey protein concentrates and clarification by-5 products obtained from ovine cheese whey and deproteinized whey (Sorelho) on yield 6 and quality of a whey cheese (Requeijão) were evaluated. Whey protein concentrates 7 were obtained by ultrafiltration of skimmed wheys and Sorelhos. The clarification by-8 products were obtained after treatment of the skimmed wheys and Sorelhos by 9 thermocalcic precipitation and microfiltration with two membranes (0.20 and 0.65 10 µm pore size). Next, the liophilization of the corresponding retentates was carried out. 11 The addition of the powders caused higher yields of the whey cheeses mainly with 12 whey powders without affecting the strength of the products. The retention of water 13 and other components of whey and milk in the whey cheeses was influenced by the 14 protein composition of the powders. Some colour parameters (L and a values) and the 15 microstructure of the whey cheeses were influenced by the addition of the powders. 16 17 Keywords: Whey cheese; Ovine cheese whey; Deproteinized whey; Whey protein 18 concentrates; Yield; Quality parameters 19 20 1. Introduction 21 22 Whey cheese is a dairy product manufactured mainly from ovine whey in the 23 Mediterranean countries. The production of whey cheeses is important because the 24 heating process in the manufacture of this dairy product allows the recuperation of 25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 141 whey proteins from wheys. These cheeses have different names depending on the 1 country where they are elaborated. For example, in Italy, Spain and Portugal, the 2 whey cheeses obtained with ovine cheese whey are called Ricotta, Requesón and 3 Requeijão, respectively (Pintado, Macedo & Malcata, 2001). The latter product is 4 obtained by heating the whey at a temperature ranging from 90 to 100ºC for 15-30 5 min, with or without addition of 10-20% (v/v) of ovine/caprine/bovine milk. The 6 residual “deproteinized” whey called Sorelho, resulting from the manufacture of 7 Requeijão, contains approximately 60% of the original dry matter of the whey. 8 Lactose and minerals largely contribute to its dry mass, but residual fat and non-9 thermally precipitated nitrogen components are still present. Hence, attempts to 10 recover some of the solid components present before final disposal may be of interest 11 (Pereira, Díaz & Cobos, 2002). 12 In previous works (Pereira et al., 2002; Díaz, Pereira & Cobos, 2004, 2005), we 13 studied the composition and some functional properties of ultrafiltration retentate 14 powders obtained from ovine cheese whey and deproteinized whey (Sorelho). These 15 whey protein concentrates have different composition and functional properties 16 depending on their origin (whey or Sorelho). Moreover, in these studies, both by-17 products of ovine cheese manufacture were clarified by thermocalcic precipitation 18 and microfiltration using two pore size membranes (0.20 and 0.65µm). Next, the 19 filtrates were ultrafiltrated/diafiltrated and then, the corresponding retentates were 20 freeze dried. The clarification improved posterior ultrafiltration rates and improved 21 some functional properties of the whey and Sorelho protein concentrates and also 22 generated microfiltration retentates for potential use in food manufacturing. These 23 microfiltration retentates also showed interesting functional properties. 24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 142 Whey protein concentrates (WPC) have been widely used in the food industry in a 1 variety of products (Morr, 1992). One important use is in dairy products, such as 2 yoghurts, cheeses, etc. The addition of denatured whey proteins in cheese milk leads 3 to an increased yield attributed to an increased retention of serum in the cheese matrix 4 and to the incorporation of whey proteins, but it may also result in a slightly poorer 5 quality of cheese flavour and texture (Hinrichs, 2001). All the investigations have 6 been done with bovine whey proteins and in dairy products manufactured with bovine 7 milk. There are no studies about the effect of the addition of whey proteins in the 8 properties of ovine whey cheeses. This addition could increase the yield of the whey 9 cheeses as well as allow for the recuperation of more whey proteins. However, some 10 quality parameters of the whey cheeses (colour, texture) might be affected. 11 The objective of this work was to study the influence of the addition of 12 ultrafiltration retentate powders and clarification by-products (microfiltration 13 retentate powders) obtained from ovine cheese whey and deproteinized whey 14 (Sorelho) on some parameters (yields, dry matter content, texture, colour and 15 microstructure) of a whey cheese (Requeijão). 16 17 2. Materials and Methods 18 19 2.1. Sample preparation 20 21 Ovine cheese whey and deproteinized whey (Sorelho) were obtained from the 22 Association of Producers of Serra da Estrela Sheep (ANCOSE/Portugal). Sample 23 preparation was similar for both products. Immediately after reception, the products 24 were skimmed by means of a WestfaliaTM separator type ADB. Approximately 100 L 25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 143 of each product (cheese whey or Sorelho) were used in each trial; 50 L were 1 submitted to ultrafiltration and 50 L were used for thermocalcic 2 precipitation+microfiltration. All experiments were made in triplicate. More details 3 and a diagram of the process can be found in Pereira et al. (2002). 4 Two microfiltration pore size membranes (0.20 and 0.65 µm) were used in the 5 clarification procedure. Membrane retentates were freeze dryed in a Lyph-Lock 6 freeze dryer (Labconco Corporation, Kansas City, USA). Six different powders were 7 obtained: three from ovine whey and three from Sorelho. The three powders from 8 whey were: the ultrafiltration retentate powder (UFRP), the microfiltration retentate 9 powder using a 0.65 µm pore size MF membrane (MFRP 0.65) and the 10 microfiltration retentate powder using a 0.20 µm pore size MF membrane (MFRP 11 0.20). The other three powders were obtained from Sorelho using similar treatments: 12 SUFRP (ultrafiltration retentate powder), SMFRP 0.65 and SMFRP 0.20 13 (microfiltration retentate powders). 14 15 2.2. Whey cheese preparation 16 17 Nineteen different batches of whey cheeses were manufactured. The control batch 18 was elaborated with 900 g of cheese whey and 100 g of bovine milk standarized to 19 12.2% dry matter, 3.1% protein and 3.5% lipids. The whey was constituted by 20 11.35% dry matter, 1.53% protein, 1.11% lipids and 2.9% ash. The remaining 21 eighteen whey cheese batches were manufactured adding the three different powders 22 from ovine whey and the three powders from sorelho. Each powder was added in 23 three levels of incorporation: 0.5, 1.0 and 1.5% (w/w). The chemical and protein 24 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 144 composition of these powders is shown in Table 1 (adapted from Pereira et al., 2002 1 and Díaz et al., 2004). 2 The mixture was heated in a stainless steel kettle under smooth stirring 3 conditions. When it began to boil, 20 mL of cold water was added and the 4 temperature was maintained at 95ºC for 10 min. Afterwards, the mixture was poured 5 into cheesecloth bags so it could drain for 24h at 2ºC. Finally, the whey cheeses were 6 recovered from the bags and left for 5 days at 2ºC. 7 Three cheeses from the control batch and one cheese of the other batches were 8 manufactured and analysed in each experiment. This experiment was repeated four 9 times. 10 11 2.3. Dry matter content and whey cheese yields 12 13 Whey cheeses were analysed for dry matter by oven drying at 105ºC for 12 h. 14 All determinations were made in duplicate. 15 Whey cheese yield was determined by dividing the weight of the whey cheese by 16 the weight of the original mixture (whey, milk and powders) and multiplying by 100. 17 Yield adjusted to a 30% dry matter content was calculated as follows: 18 Adjusted yield = (% dry matter in whey cheese / 30) x whey cheese yield. 19 Dry matter recovery has been calculated as follows: 20 Dry matter recovery = [(weight of cheese (g) x % dry matter in cheese ) / (100 x 21 12.2 + 900 x 11.35 + weight of powder (g) x % dry matter in powder)] x 100 22 where 100 is the weight of added milk (g), 12.2 is the % of dry matter in added 23 milk, 900 is the weight of added whey (g) and 11.35 is the % of dry matter in added 24 whey. 25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 145 1 2.4. Strength of whey cheeses 2 3 The strength of the whey cheeses was measured using a Stevens LFRA 4 Texture Analyser (Stevens & Sons Ltd., UK) fitted with the cylindrical probe TA 24 5 (diameter of 4 mm). The whey cheeses were penetrated to a depth of 20 mm at a rate 6 of 10 mm s-1. The maximum force (g) required to penetrate the gel was taken as a 7 measure of the relative gel strength. The measurements were carried out at 1, 3 and 6 8 days after coagulation. All determinations were made in duplicate. 9 10 2.5. Colour coordinates 11 12 The colour of the samples was measured using a Minolta CR 200 colorimeter 13 (Minolta Camera Co., Osaka, Japan). All measurements were made in the Hunter Lab 14 colour space using the D65 standard illuminant and 10º standard observer. The 15 instrument was standardized with a white (L = 97,8, a = -0,6, b = 2,1) tile before 16 sample measurements. The colour values were expressed as L (lightness), a 17 (redness/greenness) and b (yellowness/blueness). Colour was tested at 1, 3 and 6 days 18 after coagulation. All determinations were made in duplicate. 19 20 2.6. Microstructure of whey cheeses 21 22 Scanning electron microscopy (SEM) was used to study the microstructure of the 23 whey cheeses. The samples taken 24 h after coagulation consisted in 5 mm cubes, 24 which were left in a 100ml/l thrichloromethane-water solution until analysis. 25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 146 Whey cheeses samples were sequentially dehydrated with successive treatments 1 in aqueous ethanol solutions that progressively increased in ethanol concentration 2 from 30 to 100 %. Afterwards the ethanol was substituted by 100% acetone and the 3 samples were dried with the critical point method under CO2 using a Bal-Tec CPD 4 020 critical point dryer (Bal-Tec AG, Balzers, Liechtenstein). Dried specimens were 5 fractured with a razor blade, mounted on stubbs and sputter coated with gold ions 6 (300 Å at 1200 V and 10 mA) in a JEOL model JFC-1100 ion sputtering device 7 (JEOL Ltd., Tokyo, Japan), and examined by SEM in a JEOL JSM-T220A scanning 8 electron microscope, operated at 15 or 20 kV. 9 10 2.7. Statistical analysis 11 12 One-way ANOVA with Dunnett´s Multiple Comparison Test (p<0.05) was 13 carried out to identify the differences between the control batch with the other 14 batches (SPSS 12.0S version 12.0.1 for Windows, 2003). 15 16 rendimento corrigido. 17 3. Results and discussion 18 19 3.1. Whey cheese yields and dry matter recovery 20 21 Table 2 shows the effects of the addition of ovine cheese whey and Sorelho 22 powders on yield, adjusted yield and dry matter recovery of the experimental whey 23 cheeses. The control whey cheeses showed a yield of 5.3%; this result was lower than 24 the typical yield of whey cheeses (6%) reported by Pintado et al. (2001). The lower 25 heating temperature used in our work and the fact that no ovine milk was added could 26 have influenced the differences observed. 27