Nuevas aportaciones al estudio del minisatélite humano MsH42, filogenia, digestión y paradojas

 Nuevas aportaciones al estudio del minisatélite humano MsH42: Filogenia, Digestión y Paradojas MiguelGonzálezBlanco Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Facultad de Biología Universidad de Santiago de Compostela TESIS DOCTORAL Mayo de 2005 Jaime Gómez Márquez, Catedrático de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, y Francisco Boán Fernández, Doctor en Biología e Investigador del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela, certifican: Que la presente Tesis Doctoral, con el título: “Nuevas aportaciones al estudio del minisatélite humano MsH42: Filogenia, Digestión y Paradojas”, presentada por el Licenciado en Biología D. Miguel González Blanco, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Facultad de Biología de la Universidad de Santiago de Compostela y que, hallándose concluida, autorizamos su presentación para que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos el presente certificado en Santiago de Compostela, a 20 de Mayo de 2005. Dr. Jaime Gómez Márquez Dr. Francisco Boán Fernández A mis padres Agradecimientos Resulta curioso que la escritura de este epígrafe, tanto por ubicación como por importancia en una Tesis Doctoral, se reserve casi por convención justo para el final. En estas líneas me gustaría mostrar mi reconocimiento a aquellas personas que de una u otra forma han contribuido al desarrollo de esta Tesis y a aquellas que de una u otra forma la han sufrido. Como no, el primero de estos agradecimientos recae en mis Directores, el Dr. Jaime Gómez Márquez y el Dr. Francisco Boán Fernández, quienes después de aceptarme en su grupo de investigación me han inculcado tanto la pasión como los conocimientos necesarios y capacidad de sacrificio para poder llegar hasta este punto, prestándome siempre su consejo, apoyo y, sobretodo, amistad. También quiero mencionar a todas aquellas personas del Departamento que han puesto su granito de arena tanto para la consecución de este trabajo como para hacer el día a día más llevadero en nuestro microcosmos. Paula, Jorge, Fran, Juan, Ana, Amparo, Macamen, Luís, Mónica, Susana, Mercedes, Manolo, Alicia, Begoña… y perdón a los que se me quedan en el tintero. Los aludidos saben que cuentan con unas cañas y lo que haga falta…También quisiera reseñar el gran saber y mejor trato que me brindó el Dr. José González Castaño y su equipo durante mi estancia en su laboratorio en el Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” de la UAM-CSIC. Debo además agradecer la gentileza de todos aquellos que han aportado diferentes materiales para la realización de esta tesis: al Dr. J. L. B. Caeiro por sus muestras de DNA genómico de diversas poblaciones humanas africanas; a los Drs. J. Bertranpetit, S. Pääbo, A. Blancher, J. Bullerdiek, P. Rogalla, W. Schempp y R. Wimmer por cedernos muestras de DNA genómico de diversos primates; a la Dra. M. Delclaux y a sus colaboradores del Zoo de Madrid por suministrarnos muestras de sangre de diversos primates; al Dr. F. Domínguez por la protimosina α recombinante y al Dr. Gregor Meiss por la endonucleasa G recombinante. Por último y mención aparte, gracias a todos los que afortunadamente viven ajenos a este mundillo de la Biología Molecular, mi familia y amigos, por ser estímulo, aliciente y válvula de escape tanto a las duras como a las maduras. Carmen, Álex, David, Anxo, Lemon, Toño, Rubio, Montes, Martín, Moncho, Borja, Aníbal, Manuela, Tino, Ana y el GC en general, gracias por aguantarme cuando estoy y por saber disculparme cuando no puedo estar. A todos un abrazo. Durante el desarrollo de esta tesis he disfrutado de una beca para realización de estudios de tercer ciclo de la Xunta de Galicia (Octubre 2001-Diciembre 2002) y de una beca del Programa de Formación de Profesorado Universitario del Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (Enero 2003- presente). Esta tesis ha sido financiada por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte (BMC2001-3242). Resumen MsH42 es una secuencia de tipo minisatélite del genoma humano localizada en la banda cromosómica 15q25.1. Este minisatélite presenta un bajo polimorfismo y ha sido previamente relacionado con procesos recombinatorios in vitro. En esta Tesis Doctoral nos hemos propuesto conocer el origen e historia evolutiva de este locus, así como la caracterización de posibles puntos de corte de doble cadena (DSB) que pudiesen estar promoviendo los procesos recombinatorios descritos. Hemos descubierto que MsH42 es un minisatélite específico de primates que se originó durante las primeras etapas de la evolución de este grupo, antes de la divergencia entre monos del Nuevo y del Viejo Mundo, hace aproximadamente 40 millones de años. El polimorfismo existente en las poblaciones humanas actuales podría haber surgido a partir de una forma alélica ancestral común a gorilas, chimpancés y seres humanos. Por otro lado, hemos mostrado que la región MsH42 (minisatélite y secuencias flanqueantes) es degradada por endonucleasas específicas en ensayos de corte (ensayos DSB). En estos experimentos hemos detectado una actividad dependiente de Mg2+ que produce DSBs en tramos de guaninas, tratándose muy probablemente de la endonucleasa G. También hemos observado actividades independientes de Mg2+ que cortan la región MsH42, aunque no podemos afirmar de qué enzima(s) se trata. Durante estos ensayos DSB, hemos puesto de manifiesto que la relación DNA/proteína es la principal responsable de las diferencias entre los ensayos de unión de extremos de DNA (DNA end-joining) y los ensayos DSB, es decir, del predominio de los eventos de ligación sobre los de degradación. ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 17 Aproximadamente tres mil cien millones es el número de pares de bases que constituyen el manual de instrucciones a partir del cual se desarrolla un ser humano. Durante años se pensó que esta abrumadora cifra de nucleótidos escondía un número de genes codificadores de proteínas relativamente grande, en torno a 100000. Sin embargo, ya con las estimas derivadas de los primeros borradores del genoma humano (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Venter et al., 2001) esta cifra disminuyó a unos 30000 genes, cantidad que actualmente se ha visto reducida a tan sólo 20000- 25000 tras la publicación del último borrador del genoma humano, que cubre más del 99% de nuestra secuencia eucromatínica (International Human Genome Sequencing Consortium, 2004). Hay que indicar que en esta cifra no se incluyen numerosos genes conocidos que no codifican proteínas, como los de los RNA transferentes, RNA ribosómicos, RNA pequeños nucleolares, microRNAs, etc. (Storz, 2002; Bartel, 2004). Sin embargo, un dato que apenas se ha modificado desde la primera versión de la secuencia del genoma humano es que más de un 50% de nuestro DNA es de carácter repetitivo. ¿Qué tipo de secuencias constituyen este DNA repetitivo? ¿Por qué existe esta enorme cantidad de material genético aparentemente inerte? En esta Tesis Doctoral abordaremos el análisis de algunas facetas de una pequeña parte del genoma humano que contiene secuencias repetitivas y que denominamos MsH42. El DNA repetitivo La existencia de secuencias repetitivas en el genoma fue inicialmente propuesta a partir de los experimentos de cinética de reasociación de cadenas de DNA (Britten & Kohne, 1968). En los siguientes años se profundizó en el conocimiento de la estructura de este DNA repetitivo y su localización concreta, manteniéndose la controversia de su posible función e influencia en la dinámica de los genomas. El DNA repetitivo fue considerado por muchos investigadores como una especie de DNA basura, un lastre genético o DNA egoísta que permanecía como remanente de genomas virales u otro tipo de secuencias que se comportaban de forma parásita, sin ello suponer una desventaja fenotípica severa (Doolittle & Sapienza, 1980; Orgel & Crick, 1980). Sin embargo, investigaciones con diversas clases de DNA repetitivo realizadas posteriormente, han permitido llegar a la conclusión de que muchas de estas secuencias, lejos de ser una carga en el genoma, están implicadas en importantes procesos biológicos como la transcripción, la estabilidad de los cromosomas o la impronta genética (Vergnaud & Denoeud, 2000). Desde un punto de vista funcional, las secuencias presentes en el genoma humano se pueden subdividir en dos grandes bloques: las secuencias génicas y las extragénicas. Dentro de este último grupo, se incluye la mayor parte del DNA repetitivo, aunque hay que señalar que esta clase de DNA también puede encontrarse en las regiones génicas. En la Figura 1 se muestra un esquema general de los distintos tipos de secuencias que componen el genoma (Brown, 1999). Este tipo de DNA puede clasificarse en dos categorías según la disposición de las unidades repetitivas: repeticiones en tándem o dispersas a lo largo del genoma. Dentro del DNA repetitivo disperso podemos realizar una segunda subdivisión de las secuencias, basada principalmente en su mecanismo de transposición: ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 18 1) Retroelementos o transposones de RNA: caracterizados por la existencia de un RNA intermediario que se retrotranscribe previamente a la reintegración en el genoma. 1.1) Elementos LTR (long terminal repeats): se caracterizan por la presencia de largas repeticiones terminales en sus extremos. Aquí se incluyen: GENOMA HUMANO Genes y secuencias relacionadas DNA extragénico DNA no codificador DNA codificador Pseudogenes Fragmentos génicos Transposones de DN A DNA repetitivo DNA único y de bajo número de co p ias DNA microsatélite DNA satélite DNA repetido en tándem Repeticiones dispersas por el genoma DNA minisatélite S INE s LINEs Elementos LTR Intrones, leaders, trailers Figura 1. Clasificación de los distintos tipos de secuencias que componen el genoma humano (Adaptado de Brown, 1999). Se resalta la posición de los minisatélites en esta clasificación. La flecha azul indica la presencia de DNA repetitivo en algunas regiones génicas. De hecho, el minisatélite que nos ocupará en este trabajo, MsH42, se encuentra situado en el intrón 5 del gen Q9ULM1 (flecha roja). MsH42 ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 19 1.1.1) Retrovirus. Virus de RNA en fase lisogénica con plena capacidad de generar nuevas partículas infectivas. 1.1.2) Retrovirus endógenos (ERVs) y elementos tipo retrovirus (RTVLs). Similares en estructura al grupo anterior, se diferencian de ellos en que la mayoría han perdido su capacidad para formar nuevos virus. 1.1.3) Retrotransposones. De estructura similar a los ERVs, son especialmente abundantes en invertebrados y plantas. En determinados vegetales incluso llegan a forman agrupaciones en tándem y pueden representar hasta el 50% del genoma. 1.2) Retroposones: se diferencian básicamente del grupo anterior en la ausencia de repeticiones terminales largas en sus extremos. Hay dos grandes clases: 1.2.1) LINEs (long interspersed nuclear elements). Los elementos nucleares dispersos largos poseen un gen tipo transcriptasa inversa probablemente asociado con su transposición. 1.2.2) SINEs (short interspersed nuclear elements). Los elementos nucleares dispersos cortos carecen de una transcriptasa inversa propia y utilizan aquella que es producida por otros retroelementos para su retrotranscripción. El ejemplo más destacable es la familia Alu, derivada del RNA 7SL y con un número de copias por genoma haploide humano próximo al millón. 2) Transposones de DNA: Estos elementos, mucho menos abundantes que los transposones de RNA en los eucariotas, utilizan una transposasa para realizar una interacción directa DNADNA entre el transposón donante y el lugar aceptor, bien de forma conservativa o replicativa. Por otro lado tenemos las secuencias formadas por unidades repetitivas dispuestas en tándem, poco abundantes en procariotas, pero muy comunes en eucariotas. Atendiendo al tamaño de la unidad que se repite, pueden distinguirse tres tipos principales entre estas secuencias: a) DNA satélite. Esta clase de DNA se caracteriza por la repetición de bloques de más de 100 pb, llegando a comprender regiones de hasta 100 Mb. Estas secuencias reciben su nombre de los primeros experimentos donde el DNA genómico fragmentado se sometía a centrifugación en gradientes de densidad. El DNA satélite, dada su peculiar composición en G+C comparado con el resto del genoma y, por tanto, su diferente densidad de flotación, aparecía separado de la banda principal formando un grupo de bandas “satélite”. Uno de los casos más estudiados de este tipo de DNA, el DNA satélite alfoide, forma parte de los centrómeros de los cromosomas humanos. b) DNA minisatélite. Por analogía con el DNA satélite, se denominan minisatélites a las secuencias de DNA constituidas por unidades de repetición entre 6 y 100 pb, aunque estos márgenes son relativamente arbitrarios y pueden variar en función de cada autor. Los minisatélites habitualmente comprenden desde ~ 0.5 hasta varios miles de kb. c) DNA microsatélite. De forma análoga al DNA minisatélite, los microsatélites se definen como las secuencias DNA compuestas por la repetición en tándem de bloques de 1-5 pb, abarcando normalmente entre 100-200 pb. ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 20 El DNA minisatélite Una vez presentados los distintos tipos de DNA repetitivo, profundizaremos algo más en las características del DNA minisatélite, en el que se incluye el locus MsH42, hilo conductor de este trabajo. El término minisatélite fue empleado por primera vez en 1985 para referirse a secuencias formadas por la repetición de bloques cortos de DNA, ricos en G+C, muy polimórficos y con una secuencia consenso similar al motivo recombinogénico Chi de procariotas (Jeffreys et al., 1985a). Posteriormente, este término se universalizó abarcando un conjunto mucho más amplio de secuencias de DNA repetidas en tándem que pueden ser tanto muy polimórficas (revisado en Vogt, 1990; Bois & Jeffreys, 1999; Vergnaud & Denoeud, 2000), como poco polimórficas (Boán et al., 1997) o incluso monomórficas (Ali & Wallace, 1988), además de minisatélites ricos en A+T (Berg & Olaisen, 1993; Ellsworth et al., 1995; Yu et al., 1997; Jobling et al., 1998). Desde su descubrimiento (Wyman & White, 1980), el alto grado de polimorfismo de muchos minisatélites, también llamados VNTRs -Variable Number Tandem Repeats- (Nakamura et al., 1987) debido a las diferencias en el número de unidades repetitivas que los componen (Bell et al., 1982), los convirtió en valiosos marcadores moleculares. En este sentido, las secuencias minisatélite han sido empleadas en el desarrollo de las técnicas de DNA fingerprinting o huella genética para estudios de identificación personal (Jeffreys et al., 1985b), así como también en la construcción de mapas genéticos de ligamiento (O´Connell et al., 1987). En Monomórfismo Polimorfismo en el número de unidades repetitivas Polimorfismo en la secuencia de unidades repetitivas Polimorfismo en el número y secuencia de unidades repetitivas Figura 2. Diferentes tipos de polimorfismo presentes en las secuencias minisatélite. Cada bloque representa una unidad repetitiva. Los colores diferentes indican variantes de la unidad repetitiva. Según esta clasificación, MsH42 pertenecería al grupo de minisatélites con polimorfismo en el número y secuencia de sus unidades repetitivas. ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 21 algunos casos, el alto nivel de polimorfismo que presentan estas secuencias se encuentra asociado a una elevada tasa de mutación, que puede llegar hasta un 20% por locus y gameto, constituyendo así unas de las regiones más hipervariables del genoma (Jeffreys et al., 1988; revisado en Bois, 2003). La variabilidad de los minisatélites puede venir dada no sólo por cambios en el número de sus unidades repetitivas, sino también por variaciones en la secuencia de las mismas y en el orden en que se disponen (Jeffreys et al., 1990). A estas variantes se las denominó MVRs (Minisatellite Variant Repeats) y para su discriminación se han desarrollado técnicas como la MVR-PCR (Jeffreys et al., 1991). En la Figura 2 se muestran de forma esquemática los diferentes tipos de polimorfismo que se pueden encontrar entre las secuencias tipo minisatélite. Se ha postulado que los principales procesos que llevan a la generación del polimorfismo que presentan muchos minisatélites son el entrecruzamiento desigual y el deslizamiento de cadena durante la replicación o slippage. El entrecruzamiento desigual es un mecanismo propuesto, en principio, para explicar la evolución de cualquier tipo de secuencia de DNA repetida en tándem (Smith, 1976). Consiste en un alineamiento imperfecto de la región repetitiva entre las cromátidas hermanas en mitosis o entre cromosomas homólogos en meiosis. Este tipo de alineamiento incorrecto puede provocar un entrecruzamiento entre repeticiones no equivalentes, lo que concluye con una duplicación y el consiguiente alargamiento del minisatélite o con una delección y, por tanto, con el acortamiento del mismo (Figura 3A). Por otro lado, el slippage implica la aparición de emparejamientos imperfectos entre las dos hebras del dúplex de DNA que se está replicando y, de este modo, la generación de bucles de cadena sencilla. Éstos podrían dar lugar a delecciones o duplicaciones de la secuencia dependiendo de si el deslizamiento se ha producido en la hebra que sirve como molde o en la de nueva síntesis, respectivamente (Figura 3B). Este es posiblemente uno de los procesos más importantes que determinan la generación y evolución del DNA repetitivo en tándem (revisado en Levinson & Gutman, 1987). Otros mecanismos como la conversión génica también pueden contribuir a la generación de polimorfismo en los minisatélites (Jeffreys et al., 1994). Existen secuencias tipo minisatélite en una gran variedad de organismos, incluyendo levaduras (Andersen & Nillson-Tillgren, 1997), hongos (Giraud et al., 1998), plantas (Dallas, 1988) y animales (Jeffreys et al., 1985, 1987; Burke & Bruford, 1987; Jeffreys & Morton, 1987; Buitkamp et al., 1991; Canestro et al., 2002). Su ubicación cromosómica es dispersa, hallándose distribuidos en toda su longitud (Figura 4), aunque en el genoma humano se ha constatado una concentración de aproximadamente el 90% en las regiones subteloméricas, valor que desciende al 66% en el cerdo, 30% en la rata y 15% en el ratón (Royle et al., 1988; Amarger et al., 1998; Bois et al., 1998). ¿Cuáles son las funciones que pueden desempeñar en las células las secuencias minisatélite? Se ha demostrado que algunos minisatélites son reconocidos específicamente por proteínas celulares (Collick & Jeffreys, 1990; Wahls et al, 1991; Wahls & Smith, 1994; Fukuda et al., 2001; Enokizono et al., 2003), apoyando la implicación de este tipo de secuencias en determinadas funciones celulares. Veamos algunos ejemplos que ilustran la implicación del DNA ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 22 minisatélite ran la implicación del DNA 7 6 5 4 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Alineamiento correcto Alineamiento incorrecto 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 8 9 10 1 2 3 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 104 5 6 7 Entrecruzamiento igual Entrecruzamiento desigual Replicación Deslizamiento de la hebra molde Deslizamiento de la hebra de nueva síntesis Delección Duplicación Entrecruzamiento desigual Deslizamiento de cadena Figura 3. Mecanismos generadores de polimorfismo en secuencias repetidas en tándem. A. Modelo de entrecruzamiento desigual. Las X señalan los lugares de entrecruzamiento. B. Modelo de deslizamiento de cadena durante la replicación. Los cilindros y las flechas discontinuas representan la polimerasa y el sentido de la síntesis de DNA. Los bloques que representan las unidades repetitivas se hallan numerados para facilitar el seguimiento de los procesos. Las flechas rojas indican grupos de repeticiones duplicadas. A B ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 23 minisatélite en algunos procesos minisatélite en algunos procesos biológicos. Se sabe que en la región 5´ del gen de la insulina existe un minisatélite (Bell et al., 1982) cuyo polimorfismo parece estar relacionado con la diabetes mellitus insulinodependiente, puesto que algunas variantes alélicas de este minisatélite influyen en el descenso de la transcripción de este gen en el timo (Bennet et al., 1995; Kennedy et al., 1995). Este descenso del nivel de producción de insulina en el timo se traduciría en una presentación antigénica insuficiente de esta proteína por parte de las células dendríticas, con la consiguiente supervivencia de los linfocitos T autoinmunes capaces de reconocer a la insulina al no llevarse a cabo el proceso de selección negativa de los mismos. Tales linfocitos T autoinmunes son los causantes del desarrollo de la patología al mediar en la destrucción de las células β del páncreas (Pugliese et al., 1997; Vafiadis et al., 1997; Anjos & Polychronakos, 2004). Otros genes cuya expresión puede estar influida por la presencia de minisatélites en su entorno son el proto-oncogen HRAS1 (Phelan et al., 1996), los genes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas (Trepicchio & Krontiris, 1993) o el gen de la cistatina B, que se considera involucrado en la aparición de epilepsia mioclónica progresiva tipo 1 (Lalioti et al., 1997). Algunos minisatélites se encuentran en regiones codificantes y su polimorfismo es capaz de generar variantes alélicas de una proteína. En este sentido, expansiones o contracciones en el número de las unidades repetitivas provocan la aparición o desaparición de un determinado número de aminoácidos en la cadena polipeptídica y, por tanto, la aparición de distintas alozimas con propiedades bioquímicas diferentes. Ejemplos de este tipo son los genes de las apolipoproteínas (Boguski et al., 1986) o el receptor D4DR de la dopamina (Van Tol et al., 1992; Lichter et al., 1993), donde el polimorfismo de los minisatélites asociados a estos genes se ha relacionado con la generación de diferentes variantes alélicas que muestran cambios en su afinidad por la unión a lípidos y a la dopamina, respectivamente. En este último caso, se ha establecido una correlación entre dichas variaciones en la interacción receptor-ligando y determinados trastornos cognitivos y emocionales (Ebstein et al., 1996; Benjamin et al., 1996). Otros minisatélites han sido Figura 4. Esquema de la distribución de los distintos tipos de DNA repetitivo en tándem a lo largo de un cromosoma humano. La cantidad relativa de cada color no refleja la abundancia real de cada tipo de secuencia. Telómeros / Minisatélites Minisatélites Centrómero / Satélites Microsatélites DNA de copia única ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 24 Figura 5. Representación de los principales procesos biológicos en los que pueden estar implicados los minisatélites. Variabilidad genética Transcripción Recombinación Estructura DNA Lugares frágiles cromosómicos Impronta genética Minisatélites Ninguna función Otros procesos localizados en intrones, estando algunos de ellos relacionados con procesos que pueden afectar al splicing (Turri et al., 1995). También se ha descrito que algunos minisatélites pueden estar implicados en el control de la impronta genética de determinados loci (Chaillet et al., 1995; Neumann et al., 1995). Asimismo, la expansión de determinados minisatélites, especialmente los ricos en A+T, ha sido asociada con la aparición de puntos frágiles infrecuentes en los cromosomas (Handt et al., 2000) y, de hecho, se conoce la existencia de minisatélites cerca de lugares donde se dan rupturas que generan translocaciones cromosómicas de forma recurrente, así como en los lugares donde ocurre la recombinación de cambio de clase isotípica en los genes de la cadena pesada de las inmunoglobulinas (Brusco et al., 1999). Finalmente, se ha demostrado que determinados minisatélites tanto hipervariables como no hipervariables pueden potenciar la recombinación homóloga in vitro (Wahls et al., 1990; Boán et al., 1998; Wahls & Moore, 1998), lo que sugiere que estas secuencias puedan estar funcionando como hotspots de recombinación in vivo, es decir, lugares donde la tasa de recombinación es mayor que la media del resto del genoma (Wahls, 1998). La Figura 5 sintetiza este conjunto de funciones propuestas para los minisatélites. La asociación entre determinadas secuencias minisatélite y la recombinación es muy estrecha, existiendo trabajos que, en este sentido, relacionan la generación del polimorfismo de minisatélites y su inestabilidad genética con procesos recombinatorios. Algunas de estas investigaciones se han basado en el análisis de nuevas variantes alélicas generadas en gametos individuales, lo ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 25 cual ha sido posible gracias al desarrollo de técnica de la SP-PCR (small-pool PCR) (Jeffreys et al., 1994). La combinación de MVR-PCR y SP-PCR, así como la introducción de minisatélites humanos en los genomas del ratón y de la levadura, ha permitido la investigación pormenorizada de los procesos de inestabilidad tanto somática como germinal en algunos minisatélites hipervariables (revisado en Jeffreys et al., 1999). Algunas de las conclusiones más relevantes de estos estudios son: i) en determinados loci minisatélite, la tasa de mutación en línea germinal entre los distintos sexos es diferente, siendo generalmente más elevada la masculina (Buard & Vergnaud, 1994; May et al,. 1994; Jeffreys et al., 1998); ii) la existencia de una polaridad dentro de algunos minisatélites para la aparición de nuevas mutaciones, tanto en su zona 5’ (Jeffreys et al., 1994, 1998) como 3’ (Armour et al., 1993); iii) el tamaño y el grado de homogeneidad de los alelos de un minisatélite es un factor determinante de su grado de inestabilidad, principalmente de aquella debida a reorganizaciones intralélicas (Buard et al., 1998); iv) la tasa de generación de mutantes de tamaño aumenta con el grado de divergencia entre los alelos parentales (He et al., 2002; Jauert & Kirkpatrick, 2005); v) existen elementos cercanos a los minisatélites que pueden regular en cis su nivel de inestabilidad (Monckton et al, 1994; Andreassen et al, 1996; He et al, 1999; Debrauwère et al., 1999). Además, en algunos de estos estudios también se han descrito alelos mutantes que parecen originarse mediante eventos recombinatorios más complejos que los representados en la Figura 3, incluyendo conversión génica con o sin duplicaciones adyacentes asociadas, conversión génica seguida de reorganizaciones internas o duplicaciones intralélicas múltiples. Para explicar estas reorganizaciones complejas, se han propuesto diversos modelos que combinan deslizamiento de cadena en la replicación y recombinación, iniciados por cortes del DNA dentro del minisatélite (Bois & Jeffreys, 1999; Buard et al., 2000; Boán et al., 2002) o en su entorno (Debrauwère et al., 1999; He et al., 2002). El minisatélite humano MsH42 El aislamiento y caracterización estructural del minisatélite MsH42 tuvo lugar en nuestro laboratorio a finales de los años 80. Los antecedentes fueron los experimentos realizados a principios de esa década donde se demostraba la existencia de secuencias homólogas entre determinadas regiones del genoma de mamíferos y de algunos miembros de la familia de los Herpesvirus (Puga et al., 1982; Peden et al., 1982; Heller et al., 1982). La hibridación de una genoteca de ratón con la sonda SmaIA obtenida del virus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1), muy rica en G+C (75%) y que contiene parte de una de las repeticiones terminales del genoma viral, produjo una serie de clones positivos con secuencias que presentaban un alto contenido en G+C y estructura repetitiva (Gómez- Márquez et al., 1985). Posteriormente, ya en nuestro laboratorio, se empleó este mismo fragmento viral para sondear una genoteca de hígado fetal humano. El análisis de los insertos de tres de los fagos recombinantes positivos mostró que la homología con la sonda viral se debía a repeticiones en tándem ricas en G+C (González, 1993), al igual que ocurría con los clones murinos, mencionados anteriormente. De entre estos clones positivos, uno de ellos denominado λ42, englobaba un fragmento EcoRI de ~ 4 kb que estaba implicado en la hibridación detectada con la sonda SmaIA viral. Este fragmento fue subclonado en pUC18, ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 32 otra copia del minisatélite, el gen de resistencia a ampicilina, el origen de replicación oriC, pero no lacZ, por lo que generarán colonias bacterianas blancas. Esto permite distinguirlas de las colonias transformadas con los plásmidos originales, que al poseer lacZ, podrán realizar la α-complementación y formarán colonias azules en presencia de IPTG y X-Gal. Las colonias blancas se analizan mediante la digestión del DNA plasmídico con el enzima de restricción adecuado. Si el entrecruzamiento se realiza entre secuencias perfectamente alineadas, el fragmento de restricción que contiene al minisatélite mantendrá su tamaño original, mientras que si el alineamiento fue inexacto, dicho fragmento tendrá un tamaño diferente al esperado. Las colonias azules se transfieren a una placa nueva y se hibridan con una sonda para el minisatélite MsH42 lo que permite distinguir entre aquellas producidas por los plásmidos que contienen a MsH42 de las producidas por los plásmidos control. Gracias a esta metodología pudo comprobarse que la región MsH42 es una secuencia que potencia fuertemente la recombinación homóloga intramolecular in vitro cuando se compara con una secuencia control no repetitiva (Boán et al., 1998). El alelo largo se mostró como el más recombinogénico de los tres detectados, con una tasa de potenciación media de aproximadamente 12 veces, frente a las 3.6 veces obtenidas con los alelos mediano y corto, que parecen comportarse de forma similar en este sentido (Boán et al., 2002). En presencia de las regiones flanqueantes, los tres alelos promueven una elevada tasa de entrecruzamientos iguales (73-78%), mientras que el alelo largo sin sus regiones flanqueantes presenta valores de sólo un 31%, por lo que dichas secuencias influyen en la precisión con la que ocurre el emparejamiento de las cadenas de DNA. Además, el alelo largo del minisatélite MsH42 en presencia de sus regiones flanqueantes produce tasas Figura 11. Estrategia seguida en los experimentos de recombinación llevados a cabo con los sustratos plasmídicos. A. Esquema de un ensayo donde se incuban conjuntamente un plásmido portador de dos copias de uno de los alelos de la región MsH42 (plásmidos con relleno amarillo) y un plásmido que lleva dos copias de una secuencia no repetitiva de 850 pb empleada como control (plásmidos con relleno verde). El mismo número de moléculas de cada uno de estos plásmidos se incuban conjuntamente con un extracto proteico nuclear de testículo de rata que aporta la maquinaria recombinatoria. Los plásmidos recombinantes que portan la secuencia MsH42 se muestran con relleno rojo (viable) y naranja (no viable) y los plásmidos recombinantes que portan la secuencia no repetitiva se muestran con relleno azul (viable) y morado (no viable) B. El proceso de recombinación intramolecular entre las dos secuencias homólogas de cualquiera de los plásmidos (se muestra el que contiene dos copias de la secuencia MsH42) concluye con la generación de dos nuevos plásmidos. Uno de ellos permitirá la formación de colonias resistentes a ampicilina, pero incapaces de realizar αcomplementación (rojo), mientras que el otro no puede propagarse en las bacterias al carecer de origen de replicación (naranja). C. Tras transformar bacterias competentes con los productos purificados del ensayo, los plásmidos originales que no han sufrido alteración alguna darán lugar a colonias azules al poseer tanto resistencia a ampicilina como capacidad de α-complementación, mientras que los plásmidos recombinantes viables darán lugar a colonias blancas. Para saber si las colonias azules proceden del plásmido portador de la secuencia minisatélite o del plásmido control, estás se transfieren a una membrana de nylon y se realiza una hibridación con una sonda para el minisatélite. Por su parte, para determinar el origen de los plásmidos recombinantes, estos se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción. En el gel de la parte inferior se muestran los patrones obtenidos con PstI a partir del plásmido pMsH42Lac (flecha amarilla), que contiene dos copias del alelo largo de la región MsH42, y de algunos recombinantes obtenidos a partir de él (recombinante igual, punto rojo; recombinantes no iguales, rombos rojos), así como del plásmido p5´MsH42Lac (flecha verde), con dos copias de la secuencia control 5´MsH42 y de un recombinante originado a partir de él (punto azul). ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 33 de recombinación totales 4.3 veces más Incubación Recombinación X ori RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA INTRAMOLECULAR RESOLUCIÓN PP ori P P Amp LacZ Tet Amp Tet LacZ Plásmido Recombinante P P ori Plásmido Recombinante P P Amp Tet LacZ Sustratosplasmídicos Extractoproteico        + Extracción y precipitación Transformación de E.coli Plásmido α-complementación Azules →Plásmidos originales Blancas →Plásmidos recombinantes Colonias azules Colonias blancas Minipreparados del DNA plasmídico Resiembra en otra placa Transferencia a membrana de nylon Hibridación con sonda para el minisatélite MsH42 Identificación de plásmidos recombinantes Digestión con PstI y electroforesis en gel de agarosa A B C ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 34 de recombinación totales 4.3 veces más altas que en ausencia de ellas, mientras que experimentos con las regiones control no repetitivas que presentan diferencias de tamaño similares sólo muestran variaciones de 1.8 veces en la tasa de recombinación. Por tanto, las regiones flanqueantes también influyen en la capacidad recombinatoria global de la región MsH42, hecho que no puede explicarse solamente por la diferencia de tamaño entre las secuencias homólogas dentro del plásmido. Es interesante señalar que el descenso en la recombinación global detectado en ausencia de dichas secuencias flanqueantes se produce principalmente a expensas de la caída en el número de recombinantes iguales, lo que refuerza su importancia en el emparejamiento exacto de las secuencias homólogas (Boán et al., 2002). Este conjunto de datos nos ha permitido proponer una hipótesis según la cual los eventos de recombinación observados en la región MsH42 obedecen a una combinación de diferentes rutas bioquímicas (Boán et al., 2002). Por un lado, existiría una ruta iniciada por un corte de doble cadena (DSB) en el DNA flanqueante de MsH42, seguido de la formación de una unión de Holliday que se resolvería dentro de la zona repetitiva de MsH42, generando recombinantes iguales. Este modelo es similar a otros ya propuestos anteriormente (Wahls, 1998; Vergnaud & Denoeud, 2000) y permitiría explicar aproximadamente el 75% de los sucesos de recombinación detectados. Para el 25% restante, sugerimos una segunda vía de recombinación basada en la hibridación de cadena sencilla dependiente de síntesis (SDSA). Este mecanismo se iniciaría esencialmente por un DSB dentro de MsH42. La resección de los extremos 5´ generados tras el corte conlleva la generación de extremos 3´ de cadena sencilla con capacidad invasiva sobre el dúplex homólogo intacto. La naturaleza repetitiva del minisatélite favorecería entonces emparejamientos erróneos de la hebra invasiva o la generación de sucesos de slippage durante el proceso de síntesis reparadora. Este modelo se representa gráficamente en la Figura 12. Figura 12. Modelo de recombinación que explica la generación de los recombinantes con variaciones en el minisatélite MsH42, partiendo de un alineamiento perfecto de ambas copias homólogas. A. Se produce un corte de doble cadena en uno de los dúplex, indicado con puntas de flecha de color negro, que hemos situado entre las repeticiones 3ª y 4ª. B. La degradación de los extremos 5´ deja extremos 3´ de cadena sencilla y uno de ellos invade el dúplex homólogo, dando lugar a una unión de Holliday. C-E. Slippage en la cadena molde que producirá una delección en la hebra de nueva síntesis. El bucle de cadena sencilla (color negro) será eliminado por los sistemas de reparación, capaces de corregir bucles grandes de DNA (Kirkpatrick & Petes, 1997). F-I. Slippage en la cadena de nueva síntesis, dando lugar a una duplicación en el minisatélite. El corte de la hebra molde (punta de flecha negra) permite la extensión del bucle que será utilizado para completar la otra hebra, dando lugar a una duplicación directa dentro del minisatélite (flechas huecas). En ambos casos la resolución de las dos uniones de Holliday generará productos de recombinación derivados de un entrecruzamiento o de una conversión génica. Nuestro sistema de recombinación in vitro solamente detecta los originados por entrecruzamiento. ______________________________Introducción______________________________ ___________________________________________________________________ 35 + 5´ 3´ 3´ 5´ + B A C A1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5 Acortamiento del minisatélite Alargamiento del minisatélite CA1 BA2 B A C A1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5 B A C A1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2 A5CA1 BA2 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 B A C A C A A3 A4B2A2AA5 B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2 A5CA1 BA2 B A C A C A A3 A4A C A B2A2 AA5 B A C A C A A3 A4B2A2AA5 B AA A C A B A C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2AA5CA1 BA2 C A C A C A A3 A4C A B1 A A C A B2A2 C A C A B1 A A C A B2A2 A5CA1 BA2B AA B A C A C A A3 A4A C A B2A2 AA5 B A C A C A A3 A4B2A2AA5 A C A B A C A C A A3 A4A C A B2A2 AA5 B A C A C A A3 A4B2A2AA5A C A I H G F E D C B A Objetivos ______________________________Objetivos_________________________________ ___________________________________________________________________ 39 Los anteriores estudios realizados en nuestro laboratorio dejaron abiertos dos aspectos de la biología de MsH42 que consideramos de interés y que han sido el objetivo fundamental de esta Tesis. El primero de ellos es el establecimiento del origen evolutivo de la secuencia MsH42 y de su polimorfismo en humanos. En esta dirección, son todavía muy pocos los trabajos realizados sobre la evolución de minisatélites y todos ellos tratan sobre minisatélites hipervariables o altamente polimórficos (Gray & Jeffreys, 1991; Charlesworth et al., 1994; Haber & Louis, 1998; Taylor & Breden, 2000). Sin duda, el estudio de un minisatélite no hipervariable como MsH42 podría aportar nuevos datos sobre la evolución de este tipo de secuencias. El segundo punto que nos propusimos investigar fue la generación de cortes de doble cadena dentro de la región MsH42. Puesto que en los experimentos de recombinación con el alelo largo se habían obtenido tasas de formación de recombinantes próximas al 1%, era plausible suponer que al menos un 1% de los plásmidos substrato estarían sufriendo DSBs. En este trabajo hemos intentado localizar estos puntos de corte a lo largo de la región MsH42 y determinar si existe algún tipo de secuencia que pueda estar promoviendo la aparición de estos cortes. Los objetivos fundamentales de esta Tesis Doctoral son: 1.- Estudiar el origen (nacimiento) y la historia evolutiva de la región MsH42 mediante su búsqueda y análisis en primates y otras especies disponibles en las bases de datos genómicas. 2.- Estudiar la generación de DSBs en la región MsH42, su distribución y las posibles moléculas implicadas en este proceso. Para ello, se desarrollará un sistema para la detección de DSBs en el DNA y su posterior análisis. Procedimientos  Experimentales ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 48 dializó durante 3 horas frente a 50 vol de tampón de diálisis, tras lo cual fue alicuoteado, congelado en nitrógeno líquido y almacenado a -70ºC. La concentración de los extractos citoplásmicos fue de 1.90 µg/µl para testículo de rata y de 5.50 µg/µl para hígado de rata. Figura 14. Esquema del ensayo DSB. Un fragmento de DNA empleado como sustrato (se muestra el f42P) se mezcla con un extracto proteico nuclear y se incuba a 37ºC. Los productos de la reacción (multímeros del fragmento f42P, productos de degradación –DSBs– y recombinantes) se purifican y posteriormente se analizan mediante electroforesis en geles de agarosa. El DNA de menor peso molecular que el del sustrato inicial fue extraído del gel de agarosa y clonado en el vector pGem3Z. El clonaje de las moléculas recombinantes se efectuó usando este plásmido linearizado con PstI, mientras que para el de los fragmentos generados por un DSB se empleó el plásmido digerido con PstI y SmaI. Finalmente, los plásmidos recombinantes se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción y se secuenciaron. P, PstI; S, SmaI; LCM, lugar de clonaje múltiple; Amp y Lac Z, igual que en Figura 6. Fragmentof42P Extractoproteico MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42         Extracción de las proteínas Incubación MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 M Electroforesis f42P Purificación del DNA MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 M pGem3Z Amp La cZ LCM SP PstI SmaI PstI Clonaje de Recombinantes Clonaje de productos DSB Secuenciación Multímero Recombinante DSB DSB DSB ENSAYO DSB _______________________Procedimientos Experimentales______________________ ________________________________________________________________ 49 Ensayos de corte de doble cadena (DSB) del DNA Los ensayos DSB, esquematizados en la Figura 14, se realizaron en un volumen final de 50 µl de tampón DSB (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 0.l mM de cada dNTP), conteniendo 12 µg de extracto proteico y como sustrato 1.5 µg de DNA (~ 2.8 pmol para los fragmentos f42E, f42P y f42S y ~ 48.6 pmol para los oligonucleótidos de 50 pb). Estas condiciones fueron consideradas como estándar, con un tiempo típico de incubación de 30 min a 37ºC, aunque en función del tipo de extracto o de sustrato los tiempos de incubación oscilaron entre 2 min y 4 h. A continuación, las reacciones se pararon mediante un enfriamiento rápido en hielo y posterior congelación a -70ºC, seguida de una extracción con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 25:24:1, una con cloroformo: alcohol isoamílico 24:1 y precipitación del DNA con 0.1 vol de Tabla 2. Condiciones de reacción en los ensayos DSB. Reacción MgSO4 (mM) dNTPs (mM) ATP (mM) NaCl (mM) KCl (mM) ddNTPs (mM) EDTA (mM) EGTA (mM) NEM (mM) Preincubación extracto (5 min)* Estándar 10 0.1 1 - - - - - - - Sin Mg - 0.1 1 - - - - - - - Mg variable 0.5-7.5 0.1 1 - - - - - - - Sin ATP 10 0.1 0 - - - - - - - Sin dNTPs 10 - 1 - - - - - - - Sin dNTPs/ con ddNTPs 10 - 1 - - 0.1 - - - - Con KCl/ con Mg 10 0.1 1 - 10-40 - - - - - Con KCl/ sin Mg - 0.1 1 - 10-40 - - - - - Con NaCl/ con Mg 10 0.1 1 10-40 - - - - - - Con NaCl/ sin Mg - 0.1 1 10-40 - - - - - - Con EGTA/ con Mg 10 0.1 1 - - - - 1-50 - - Con EGTA/ sin Mg - 0.1 1 - - - - 1-50 - - Con EGTA/ con Mg 10 0.1 1 - - - - - 0.5-50 - Con EGTA/ sin Mg - 0.1 1 - - - - - 0.5-50 - Preincubación/ con Mg 10 0.1 1 - - - - - - 50 ó 60ºC Preincubación/ sin Mg - 0.1 1 - - - - - - 50 ó 60ºC El tiempo de incubación estándar fue en todos los casos de 30 min, a menos que se indique lo contrario. En todas las reacciones el tampón empleado fue Tris-HCl pH 7.5 a una concentración de 20 mM, y se añaden 1.5 µg de DNA (habitualmente el fragmento f42P) y 12 µg de extracto proteico nuclear. * La preincubación se realizó antes de la adición del sustrato a la reacción. ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 50 acetato sódico 3M pH 5.2 y 2 vol de etanol 96%. Las muestras se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% en tampón 1X TAE, para el caso de las reacciones que utilizaban los fragmentos f42E, f42S, f42P, f5´MsH42 y fLacZ, o en geles de poliacrilamida (29:1) al 18% en 1X TBE (90 mM Tris-borato, 1 mM EDTA, pH 8.3) en el caso de los experimentos realizados con los oligonucleótidos de 50 pb. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) y se visualizaron empleando un transiluminador GelDoc2000 (BioRad). Hay que tener en cuenta que a igual cantidad de oligonucleótido de 50 pb que de sustrato f42P (1.5 µg) el número de moléculas del primero es aproximadamente 17 veces mayor, por lo que será necesario que un mayor número de moléculas de sustrato sean cortadas para poder apreciar los productos DSB con una intensidad equivalente a la observada en los ensayos estándar. Debido a esto, los experimentos usando oligonucleótidos de 50 pb tuvieron que incubarse durante tiempos considerablemente más largos de lo habitual (2-4 h). En otros experimentos se añadió [α-32P]- dCTP (3000 Ci/mmol) (Amersham Biosciences) para verificar si existía incorporación de este isótopo en el DNA. En estos casos, el experimento, tras ser analizado mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, fue transferido mediante capilaridad a una membrana de nylon Hybond-N (Amersham Biosciences) durante 12 horas usando 20X SSC (3M NaCl, 0.3M citrato trisódico) como tampón para la transferencia. A continuación, la membrana se lavó suavemente en 2X SSC y se secó en un horno a 80ºC durante 2 h para fijar el DNA, tras lo cual se realizó su autorradiografía con películas Biomax MS (Kodak) en casettes con pantallas intensificadoras Hyperscreen (Amersham Biosciences). En algunas reacciones se modificaron una o varias de las condiciones estándar del ensayo DSB, cambios que se encuentran resumidos en la Tabla 2. Una de estas variantes fue la supresión del MgSO4 del tampón DSB (reacciones sin Mg2+) o su reducción a valores inferiores al 10 mM estándar (entre 0.5 y 7.5 mM). Otras variaciones consistieron en no añadir dNTPs o ATP al tampón DSB, añadir 2´,3´-dideoxirribonucleótidos (ddNTPs) a una concentración final de 0.1 mM, adición de NaCl o KCl (10 y 40 mM), adición de EDTA o EGTA (1, 10 y 50 mM), preincubación del extracto con N-etilmaleimida (NEM) a distintas concentraciones (0.5-50 mM) o preincubación del extracto a 50ºC o 60ºC. Ensayos DSB / end-joining En esta serie de experimentos se pretendía establecer las condiciones que determinaban si el ensayo sería de tipo DSB (generación de moléculas de menor peso molecular que el sustrato inicial) o de tipo end-joining (predominio de eventos de ligación de extremos del DNA, generándose multímeros o moléculas circulares a partir del sustrato). Para ello, se añadieron al ensayo DSB distintas concentraciones (10-1000 ng) de alguna de las siguientes proteínas: histona H1 (H1), histona H3 (H3), una mezcla de histonas (H1, H2A, H2B, H3 y H4) o poli-arginina, así como protimosina α (ProTα) recombinante (Vega et al., 1998). Esta última proteína fue amablemente cedida por el Dr. F. Domínguez de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela. Todas las histonas y la poliarginina se obtuvieron de Roche Applied Science. Cuando se realizaron los experimentos donde se incorporaron H1 y ProTα conjuntamente al ensayo DSB, ambas proteínas se preincubaron juntas en el tampón DSB durante 15 min a 37ºC, antes de la adición del extracto _______________________Procedimientos Experimentales______________________ ________________________________________________________________ 51 nuclear y del sustrato. En estos ensayos se emplearon como sustrato tanto el fragmento f42P como f42S y los productos fueron procesados y analizados de forma idéntica a la de los ensayos DSB estándar. En otro grupo de experimentos se varió la concentración inicial del sustrato de DNA, manteniendo constante la cantidad de extracto proteico, para observar el efecto que tiene sobre el ensayo DSB la alteración de la relación DNA/proteína. En estos casos, el fragmento f42E se marcó terminalmente con [γ-32P]-ATP (3000 Ci/mmol) (Amersham Biosciences) mediante la reacción de intercambio de la T4 polinucleótido kinasa (Amersham Biosciences), siguiendo las instrucciones del fabricante. En estas reacciones el sustrato de DNA fue una mezcla de 3 ng (5.6 fmol) del fragmento f42E marcado radiactivamente (~ 84000 cpm) y cantidades variables (0-2.8 pmol) de fragmento f42E no marcado. El análisis de los productos de esta variante del ensayo se realizó por electroforesis en geles de agarosa al 2%, seguida de transferencia a una membrana de nylon Hybond-N y autorradiografía, de manera idéntica a la descrita en el apartado anterior. Clonaje de los productos del ensayo DSB Los fragmentos de DNA producidos en algunos ensayos DSB fueron purificados de los geles de agarosa utilizando el QIAEXII Gel Extraction Kit (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del fabricante. En algunos casos, estos fragmentos se ligaron en el vector pGEM-3Z, digerido con PstI para el aislamiento de los recombinantes o con PstI y SmaI para el clonaje de los productos DSB (Figura 14). Antes de la ligación, el vector fue defosforilado con fosfatasa alcalina intestinal de ternera (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante, siendo purificado en gel para aislarlo de moléculas no cortadas, así como de los fragmentos liberados en la doble digestión PstI/SmaI. Las ligaciones de los productos del ensayo DSB en pGEM-3Z se realizaron a 4ºC durante toda la noche con T4 DNA ligasa (Promega) y empleando relaciones vector: inserto variables (desde ~ 5:1 a ~ 1:5 en volumen) puesto que la cantidad de moléculas potencialmente clonables era desconocida. La cantidad típica de vector plasmídico en estas ligaciones fue de 50 ng. Con los productos de la ligación se transformaron bacterias E. coli DH5α competentes y se sembraron en placas de 90 mm de diámetro de LB con agar (1.5% w/v), ampicilina (50 µg/ml) y sobre cuya superficie se habían extendido anteriormente 100 µl de 100 mM IPTG (Promega) y 20 µl de 50 mg/ml X-Gal (Promega) para detectar las colonias bacterianas capaces de llevar a cabo la α-complementación. Las placas se incubaron 12-16 h a 37ºC y se almacenaron a 4ºC. Las colonias blancas recombinantes se inocularon en 3 ml de medio LB con 50 µg/ml de ampicilina y se dejaron crecer toda la noche con agitación (250 rpm) a 37ºC. El DNA plasmídico fue purificado mediante un protocolo de lisis alcalina y analizado mediante digestión con enzimas de restricción (PstI para recombinantes y EcoRI/HindIII para moléculas surgidas de un DSB) para verificar el tamaño de los insertos. El DNA plasmídico de los clones positivos se purificó mediante el protocolo de maxipreparado o de minipreparado especial para secuenciación. Amplificaciones por PCR Los distintos experimentos de PCR se llevaron a cabo sistemáticamente en un volumen de 50 µl conteniendo 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.01% v/v Tween-20, 0.3 µM de ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 52 cada cebador, 0.2 mM de cada dNTP, 0.02 U/µl de Taq DNA polimerasa (Roche Applied Science) y una cantidad variable de DNA molde. Las amplificaciones se realizaron en un termociclador PTC-200 (MJ Research). Para el análisis de los productos de PCR se emplearon alícuotas de 10 µl de la mezcla de reacción y se separaron en geles de agarosa del 1-2% en 1X TAE, en función del tamaño de los fragmentos de amplificación. Los oligonucleótidos empleados como cebadores en los diferentes experimentos de PCR se muestran en la Tabla 3. La generación de moléculas recombinantes en el ensayo DSB se verificó mediante PCR. Para ello, los fragmentos de DNA originados en dichos ensayos y purificados a partir de las bandas extraídas del gel de agarosa (~ 1 ng) se amplificaron con los oligonucleótidos PS1 y PS2 (Tabla 3), empleando las siguientes condiciones: 29 ciclos de 95ºC (30 s), 60ºC (40 s), 72ºC (1 min), y un ciclo final con una extensión de 5 min. Este ciclo adicional con extensión de 5 min se ha aplicado en todos los programas de PCR, por lo que en adelante no se hará mención a él. La amplificación de la región MsH42 a partir de DNA genómico de humanos y primates se efectuó con las parejas de oligonucleótidos PS1/PS2, P1/P2 o PC1/PC2 (Tabla 3) en función de la especie. Las condiciones de amplificación para estas tres parejas fueron idénticas a las ya descritas para PS1/PS2, pero con una temperatura de Tabla 3. Secuencia de los oligonucleótidos empleados en PCR Nombre Secuencia PS1 CTGCAGCAATGGACTCAAAA PS2 CTGCAGACTCCAAATCCTAA P1 CTTGGGCACTCTAGGACACC P2 CACAGCTCTGGCTACAAGAG PC1 GGGCAGTGTTGAGAGTGAGC PC2 TATCTTCATGAACTCACACT E5.1 TTTGCTCTGGGATTTAAGGC E5.2 CAACAAGCCATTGGAGCCAT E6.1 ATCAAGGACGTTGTGGGCTA E6.2 TTGCAGTCTTGCCTGGGCTT Ps1Sma CCCGGGCTGCAGCAATGGACTCAAAA Ps2Sma CCCGGGCTGCAGACTCCAAATCCTAA PF1 GCCTCTCCCAGCTCTCCCAGCCTT Todos los oligonucleótidos se muestran en dirección 5´-3´. _______________________Procedimientos Experimentales______________________ ________________________________________________________________ 53 hibridación de 62ºC para P1/P2 y de 56ºC para PC1/PC2. Además, con esta última pareja el tiempo de extensión se redujo a 40 s. Los exones 13 y 14 (anteriormente 5 y 6) del gen Q8WUJ3, que flanquean al intrón donde se encuentra la región MsH42, se amplificaron empleando los cebadores E5.1/E5.2 y E6.1/E6.2, respectivamente (Tabla 3). Las condiciones de amplificación del exón 13 fueron 95ºC (30 s), 58ºC (15 s), 72ºC (20 s) durante 29 ciclos, siendo iguales para el exón 14, con la salvedad de la temperatura de hibridación, que fue de 60ºC. Finalmente, las amplificaciones con los cebadores E5.1/PS2 se realizaron a 95ºC (1 min), 54ºC (40 s), 72ºC (2 min) durante 29 ciclos. Las condiciones de amplificación de la región MsH42 clonada en pRep42 con los cebadores PS1Sma y PS2Sma, fueron idénticas a las empleadas para la pareja de cebadores PS1 y PS2. Los productos de PCR de la región MsH42 en los distintos primates se clonaron en el vector pGEM-T Easy (Promega) para su posterior secuenciación, de forma análoga a lo descrito para la generación del plásmido pPSSma. Secuenciación del DNA La secuenciación de los fragmentos de DNA clonados en el plásmido pGEM-3Z fue realizada de manera manual o automática empleando los cebadores universales de M13 (Sambrook et al., 2001). El DNA se preparó por el protocolo de maxipreparado o de minipreparado especial para secuenciación. Para la secuenciación manual se empleó el T7 Sequenase Quick-Denature Plasmid Sequencing Kit v2.0 (Amersham Biosciences), siguiendo las indicaciones del fabricante. Los productos de la secuenciación se separaron en geles desnaturalizantes (7M urea) de poliacrilamida (19:1) al 8% en 1X TBE. La electroforesis se llevó a cabo a 2000 V durante 90 min a 55ºC, tras lo cual el gel se lavó y fijó con dos baños de 15 min en una solución de 10% ácido acético y 10% etanol. Posteriormente el gel se secó en un horno a 80ºC durante 45 min y se autorradiografió sobre películas Hyperfilm MP (Amersham Biosciences). Para la secuenciación automática cíclica se utilizó el dGTP BigDye Terminator v3.0 Sequencing Kit (Applied Biosystems), siguiendo las especificaciones del fabricante, pero realizando las reacciones a la mitad del volumen final indicado. El DNA plasmídico se preparó del mismo modo que para la secuenciación manual, empleándose los cebadores universales de M13 en las reacciones. La secuenciación automática se realizó además directamente con productos de PCR. Para ello, las reacciones de PCR se trataron enzimáticamente con exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (Exo/Sap-It, USB) para eliminar el resto de dNTPs y cebadores. Las condiciones de secuenciación fueron 96ºC (10 s), 68ºC (2 min) durante 25 ciclos, en todos los casos, realizándose la incubación en un termociclador PTC- 200 (MJ Research). A continuación, los productos de la reacción fueron purificados mediante precipitación con 2 vol de etanol 96% y 0.1 vol de acetato sódico 3M pH 4.6 y analizados en un secuenciador ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer). El análisis de los datos de secuenciación se llevó a cabo empleando el paquete de software BioEdit (Hall, 1999), disponible en www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html Ensayos de DNasaI footprinting El footprinting empleando DNasaI es una técnica que permite identificar la secuencia de un fragmento de DNA, marcado terminalmente en una de sus ______________________Estudio del minisatélite MsH42_______________________ _________________________________________________________________ 54 hebras, que es reconocida por una proteína de modo específico (Galas & Schmitz, 1978). Se fundamenta en que la unión de una proteína a un fragmento de DNA bicatenario protege a la secuencia a la cual se une de la acción de la DNasaI. Por el contrario, en ausencia de dicha protección, el enzima introducirá mellas aleatoriamente por todo el fragmento de DNA. La desnaturalización y posterior separación mediante electroforesis de los fragmentos de diferentes tamaños originados por la acción de la DNasaI, permite comparar el patrón de fragmentos obtenido en ausencia y en presencia de proteína. Cada una de las bandas que se obtiene representa una población de fragmentos de DNA monocatenario generados por un corte en un nucleótido determinado. Por lo tanto, la desaparición de un subconjunto de bandas en la autorradiografía implica que una proteína se ha unido a una secuencia determinada de la sonda, la cual queda protegida de la acción de la DNasaI, evitando así la generación de los fragmentos correspondientes. En estos ensayos se utilizaron como sondas dos fragmentos de la región del alelo largo del locus MsH42. Las sondas FP1a y FP1b se obtuvieron partiendo de la amplificación por PCR de la región MsH42 del alelo largo con los cebadores PS1 y P2, en las mismas condiciones que para la pareja P1/P2 (ver Amplificaciones por PCR). El producto de PCR fue digerido con el enzima DdeI para obtener un fragmento de 283 pb que contiene la región flanqueante 5´ y las 16 primeras repeticiones del minisatélite. Este fragmento fue purificado y empleado como DNA molde para una amplificación por PCR con los cebadores PS1 y PF1, realizada en las mismas condiciones que para la pareja PS1/PS2 (ver Amplificaciones por PCR). El producto obtenido, un fragmento de 214 pb, se clonó en ambas direcciones en el vector pGEM-T (Promega). Los plásmidos generados, que denominamos pFP1a (orientación 5´→3´) y pFP1b (orientación 3´→5´), fueron digeridos con SacII y NotI, para producir los fragmentos FP1a y FP1b, respectivamente. Ambos fragmentos fueron marcados utilizando Klenow con [α-32P]-dCTP y [α-32P]-dGTP (6000 Ci/mmol). El protocolo seguido fue el siguiente: 1 µg de DNA fue incubado con 5 U de enzima Klenow en 20 µl de volumen de reacción (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM MgSO4, 0.1 mM DTT, 20 µg/ml BSA), que contenía 20 µCi de [α-32P]-dCTP de 6000 Ci/mmol (Amersham Biosciences), 20 µCi de [α- 32P]-dGTP de 6000 Ci/mmol (Amersham Biosciences) y 50 µM de cada uno de los dNTPs no marcados. La mezcla fue incubada durante 15 min a 30ºC y, una vez finalizada la reacción de marcaje, se añadieron 2 µl de una mezcla 5 mM de todos los dNTPs, prosiguiendo la incubación durante 5 min a 30ºC para asegurar que los extremos fuesen rellenados completamente. La reacción se detuvo mediante una incubación de 10 min a 75ºC. Las sondas fueron purificadas con el QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAGEN), según las indicaciones proporcionadas por el fabricante, presentando una actividad específica de 3 × 108 cpm/µg. Como consecuencia del marcaje realizado, en la sonda FP1a quedaría marcada la cadena 5´→3´, mientras que en la sonda FP1b quedaría marcada la 3´→5´. Por su parte, las sondas FP2a y FP2b fueron generadas a partir del fragmento de 260 pb, que comprende las 9 repeticiones del extremo 3´ del alelo largo del minisatélite y la secuencia flanqueante 3´. Este fragmento fue obtenido partiendo de la digestión con DdeI del producto de amplificación con los cebadores P1/P2 de la región MsH42 del alelo largo. Posteriormente, se incubó 1 µg del mismo con Taq DNA polimerasa en las mismas condiciones de una _______________________Procedimientos Experimentales______________________ ________________________________________________________________ 55 reacción de PCR, pero incubando durante 30 min a 72ºC. Dado que la Taq DNA polimerasa añade una adenina en los extremos 3’ de los fragmentos de DNA producidos, pudimos clonar el fragmento en el vector pGemT, en ambas orientaciones. El resto del proceso para producir las sondas FP2a y FP2b fue similar al descrito para la preparación de las sondas FP1a y FP1b. Estas sondas fueron también purificadas con el QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAGEN), según las indicaciones proporcionadas por el fabricante, presentando una actividad específica de 2 × 108 cpm/µg. Las reacciones de footprinting fueron llevadas a cabo siguiendo el protocolo del SureTrack Footprinting Kit (Amersham Biosciences). Las reacciones tuvieron lugar en 50 µl de tampón de unión (10mM Tris-HCl pH 7.5, 4% glicerol, 50 mM NaCl, 25 mM MgCl2, 0.5 mM DTT), conteniendo 50 µg de extracto proteico nuclear, 3 µg de poli(dI-dC)•poli(dI-dC) y 250 ng de DNA de timo de ternera sonicado. La reacción se incubó durante 7 min a temperatura ambiente y después se le añadieron 0.25 ng (~50000 cpm) de sonda, manteniéndola durante otros 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se añadió DNasaI y se incubó a temperatura ambiente. La cantidad de enzima y el tiempo de tratamiento con DNasaI varían dependiendo del extracto proteico nuclear empleado (hígado de rata, 0.1 U, 1 min; cerebro de rata, 0.1 U, 1min; testículo de rata, 1.5 U, 1.5 min; sin extracto, 0.1 U, 1.5 min). Las reacciones fueron detenidas añadiendo 140 µl de solución de parada para la DNasaI (192 mM acetato sódico, 32 mM EDTA, 0.14% SDS, 64 µg/ml de RNA de levadura). A continuación, añadimos a cada reacción 2 µg de proteinasa K y las incubamos durante 30 min a 42ºC. Finalmente, fueron extraídas y precipitadas, para ser resuspendidas en 3 µl de tampón de carga. En cada experimento se incluyeron dos controles: uno con la sonda pero sin extracto y otro con la sonda incubada con BSA. Con cada sonda ensayada preparamos una reacción de secuenciación química de Maxam y Gilbert (Maxam & Gilbert, 1977) para las bases púricas (G+A), que al ser cargada en el mismo gel que las reacciones de footprinting de esa sonda, nos permite determinar la zona de la sonda que está siendo protegida de la digestión con DNasaI. El análisis de los experimentos se realizó mediante electroforesis, bajo las mismas condiciones descritas para los geles de secuenciación manual. Análisis filogenéticos Las secuencias de DNA empleadas en los análisis filogenéticos se alinearon usando el programa Clustal W, empleando los alelos HUM(S), CHI1 y GOR1 como representantes de la región MsH42 en la especie humana, chimpancé y gorila, respectivamente. Estos análisis están basados en los métodos de neighbour-joining (NJ), máxima parsimonia (MP) y máxima verosimilitud (ML), disponibles en el programa PAUP* versión 4 (Swofford, 1998). La homogeneidad de los conjuntos de datos de secuencia se evaluó con el test de incongruencia de diferencias de longitud. El modelo que mejor se ajusta a la topología estándar del árbol de los primates fue seleccionado mediante el test de la ratio de verosimilitud disponible en Modeltest versión 3.0. Todos estos métodos analíticos se encuentran revisados por Thornton & DeSalle (2000). Los valores de verosimilitud para la topología estándar de primates y de las topologías observadas se compararon con el test paramétrico de Kishino-Hasegawa (Kishino & Hasegawa, 1989). ResultadosyDiscusión ______________________Evolución del minisatélite MsH42_____________________ ________________________________________________________________ 64 pertenece a un grupo de secuencias diferentes de los minisatélites, puede ilustrar los procesos responsables de la variación de las secuencias repetidas en tándem. Sin embargo, se sabe poco acerca de la evolución de los minisatélites poco variables, como es el caso de MsH42. Existe un estudio que emplea una secuencia relativamente parecida a la nuestra, el minisatélite del gen de la tiopurina metiltransfera, con una unidad repetitiva de 17-18 pb (Alves et al., 2002). Este trabajo hace un análisis poblacional detallado en gorila, chimpancé y humanos, concluyendo que dentro del minisatélite las distintas unidades repetitivas pueden ser más o menos tendentes a sufrir cambios y condicionando así la evolución de todo el conjunto. Sin embargo, este trabajo no profundiza en el origen del minisatélite en cuestión y su origen evolutivo permanece incierto. En esta Tesis, nos propusimos investigar la existencia del minisatélite MsH42 en otros primates y en las especies modelo cuyo genoma ha sido secuenciado para, de este modo, poder establecer su posible origen (nacimiento) e historia evolutiva. Origen evolutivo de MsH42 La búsqueda de la región MsH42 (minisatélite y secuencias adyacentes) en otras especies de primates se realizó mediante amplificación de muestras de DNA genómico por PCR, utilizando las parejas de cebadores PS1/PS2, P1/P2 y PC1/PC2 (Tabla 3), que se encuentran localizados en las secuencias flanqueantes de MsH42 (Figura 17). Los cebadores PS1/PS2 produjeron productos de amplificación en chimpancé, gorila, orangután y gibón (Figura 18). En el caso de gorila, los productos de la PCR fueron muy débiles, probablemente debido cambios en la secuencia de alguno de los cebadores, por lo que debió efectuarse una segunda ronda de amplificación. En esta reamplificación, se empleó como sustrato el DNA purificado de la banda del gel de agarosa que habíamos obtenido inicialmente. Tanto en chimpancés como en gorilas se detectó la presencia de bandas de tamaños diferentes, indicando que la región MsH42 presenta variabilidad en estas especies. Los cebadores PS1 y PS2 no produjeron amplificación cuando se empleó DNA genómico de monos del Viejo Mundo (macaco y mandril), del Nuevo Mundo (tamarindo) o de prosimios (Eulemur, Lemur y Varecia). Con estas especies se probó la pareja de oligonucleótidos P1/P2, localizados más cerca del minisatélite, pero que todavía permiten la amplificación de una porción Figura 17. Localización de los cebadores de PCR empleados en el análisis de MsH42. Se muestra la ubicación de estos cebadores (flechas) en el gen Q8WUJ3. En la parte superior se destaca la zona del gen donde se encuentra el intrón 13 que incluye a la región MsH42. E9-E18 indican los exones del gen. La caja azul señala la región MsH42, que comprende al minisatélite MsH42 (caja naranja). Se indican además las regiones que ocupan los fragmentos FP1 y FP2, empleados en los experimentos de DNasaI fooprinting. PS1 PS2P1 P2 E5.1 E5.2 E6.1 E6.2 PC1 PC2 MsH42 E13 E14 Intrón 13 Gen Q8WUJ3 E9 E11 E12 E13 E14 E17E15 E18E16E10 FP1 FP2 PF1 ____________________________Resultados y Discusión________________________ ___________________________________________________________________ 65 importante de las secuencias flanqueantes del mismo. Con estos cebadores obtuvimos amplificaciones para macaco y tamarindo (Figura 18), pero no fueron capaces de producir amplificación a partir del DNA de mandril y lemures. Los tres macacos analizados (dos individuos de la especie Macaca nigra y uno de Macaca mulatta) generaron bandas del mismo tamaño, por lo que aparentemente este locus puede ser monomórfico en este género. El DNA de mandril pudo ser amplificado con los cebadores PC1/PC2 (Figura 18), diseñados a partir de dos zonas especialmente conservadas de la región MsH42 y que comentaremos más adelante. Tampoco con estos cebadores se obtuvo amplificación a partir del DNA genómico de lemures. Todos los productos resultantes de esta serie de experimentos de PCR se clonaron en pGEM-T Easy para su posterior secuenciación. Para asegurarnos de que las amplificaciones que estábamos observando en los diferentes primates se correspondían con una secuencia homóloga al minisatélite humano, es decir que comparte el mismo origen evolutivo, se realizaron una serie de experimentos de PCR en los que usaron los cebadores E5.1/PC2 para amplificar las muestras de DNA genómico. Dado que E5.1 se localiza en el extremos 5´ del exón 13 del gen Q8WUJ3 y PC2 en la secuencia flanqueante 3´ del minisatélite, una amplificación positiva del tamaño esperado indicaría que el minisatélite que hemos detectado en estos primates se encuentra ubicado en una posición equivalente a la que ocupa en humanos. Los resultados de estos experimentos confirmaron la localización de MsH42 en el intrón equivalente del gen Q8WUJ3 (Figura 19). En la Tabla 4 se resumen los tamaños de los fragmentos de PCR obtenidos para cada especie. PS1/PS2 P1/P2 PC1/PC2 HUM CHI GOR ORA GIB MAC TAM MMDR M 500 pb 250 pb Figura 18. Amplificación de la región MsH42 en primates. Se muestra el análisis electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de amplificación de la región MsH42 en diversos primates (HUM, humano; CHI, chimpancé; GOR, gorila; ORA, orangután; GIB, gibón; MAC, macaco; TAM, tamarindo; MDR, mandril). En la parte superior se especifican las distintas parejas de cebadores empleadas en la PCR. Hay que señalar que las diferencias en tamaño se deben parcialmente al uso de distintas parejas de cebadores. La imagen de la amplificación de mandril procede de un experimento distinto a los demás. En el caso de humano, chimpancé y gorila, las bandas mostradas se corresponden con los alelos HUM(L), CHI1 y GOR1, respectivamente. La amplificación de macaco fue obtenida de un individuo de la especie Macaca mulatta y fue idéntica a la obtenida con individuos de la especie Macaca nigra. M, marcador XIII, con bandas cada 50 pb (Roche Applied Science). ______________________Evolución del minisatélite MsH42_____________________ ________________________________________________________________ 66 La imposibilidad para amplificar secuencias relacionadas con la región MsH42 en lemures indicaba que MsH42 podría ser exclusivo de primates. Entonces, para averiguar si existía una secuencia similar a MsH42 en los genomas de especies filogenéticamente más distantes, realizamos una búsqueda in silico en las bases de datos de los genomas de las siguientes especies: ratón (Mus musculus), rata (Rattus norvegicus), pollo (Gallus gallus), sapo (Xenopus laevis), pez cebra (Danio rerio) y la mosca del vinagre (Drosophila melanogaster), así como en los borradores de los genomas de la vaca (Bos taurus) y la zarigüeya (Monodelphis domestica). No pudimos encontrar ninguna secuencia ortóloga a MsH42 en ninguno de estos genomas. No obstante, sí hallamos evidencia de la existencia de un gen ortólogo a Q8WUJ3, aunque solamente en mamíferos (datos no mostrados). Este conjunto de datos, i) la presencia en mamíferos de los dos exones del gen Q8WUJ3 que flanquean a la región MsH42 en humanos, ii) la ausencia del minisatélite en los genomas de mamíferos no primates analizados, iii) la incapacidad para obtener una amplificación de la región MsH42 en lemures con cualquiera de las combinaciones de cebadores empleadas y iv) la existencia del minisatélite en todos los platirrinos y catarrinos ensayados, sugiere que el origen de esta secuencia tuvo lugar durante una fase temprana de la evolución de los primates, antes de la divergencia entre monos del Nuevo y del Viejo Mundo. HUM CHI GOR ORA GIB MAC TAM LEM MDR M 3 kb 2 kb C 4 kb Figura 19. Demostración de la localización de MsH42 y sus ortólogos para diversos primates en el gen Q8WUJ3. Se muestra el análisis electroforético en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación obtenidos con el DNA genómico de diversos primates empleando los cebadores E5.1 y PC2. La imagen muestra el negativo de una fotografía del gel para facilitar la observación de los productos menos intensos. En el caso de gibón, macaco y mandril, los productos de amplificación fueron muy débiles (puntas de flecha blancas), probablemente debido a la existencia de mutaciones en la secuencia de alguno de los cebadores. C, reacción control sin DNA molde; M, marcador de 1kb (Invitrogen). Los acrónimos para las diferentes especies son los mismos que en la Figura 18, con excepción de LEM, lemur (Varecia variegata). ____________________________Resultados y Discusión________________________ ___________________________________________________________________ 67 Estructura de MsH42 en primates Para estudiar la organización de la región MsH42 en los primates, los productos de PCR se secuenciaron y compararon entre sí. La Figura 20 muestra el alineamiento de un alelo representativo de cada especie con respecto a la secuencia del alelo corto humano de MsH42. Las diferencias de tamaño de las secuencias mostradas se deben en parte a la pareja de cebadores con las que fueron amplificadas. En la Tabla 4 se muestran el número y tipo de unidades repetitivas que componen el minisatélite en cada una de las especies y también utiliza el código de letras que emplearemos en adelante para representar cada unidad repetitiva de MsH42. Este código se modificó con respecto al anteriormente descrito por Boán et al. (1997, 1998, 2002) (Figura 9). La razón de esta modificación fue para acomodar mejor los nuevos datos evolutivos y agrupar de forma más coherente algunas de las variantes repetitivas. Un análisis detallado de la organización del minisatélite reveló una serie de características interesantes. Así, el minisatélite de tamarindo, cuyo origen evolutivo se remonta a ~ 40 millones de años, presenta dos variantes repetitivas comunes al minisatélite humano (A y C), intercaladas con otras variantes similares exclusivas de esta especie, constituyendo una secuencia que aunque guarda cierta semejanza con el minisatélite MsH42 humano, muestra una organización interna claramente diferente. Esta variante del minisatélite pudo originarse a partir de una secuencia progenitora que contenía las unidades repetitivas primigenias (A y C) o unas muy similares a ellas, que comenzaron a sufrir mutaciones y a expandirse en una fase temprana de la evolución de los primates. El minisatélite que encontramos en los monos de la familia Cercopithecidae (divergencia con la familia Hominidae estimada en unos 25 millones de años), macaco y mandril, consta de siete unidades repetitivas con la misma organización en ambas especies, exceptuando una transición Humano Chimpancé Gorila Orangután Gibón Macaco Mandril Tamarindo HUM(L) HUM(M) HUM(S) CHI1 CHI2 GOR1 GOR2 GOR3 Alelos Tamaño (pb) 863 806 758 728 690 742 800 1010 657 680 308 145 386 Cebadores PS1/PS2 " " " " " " " " " P1/P2 PC1/PC2 P1/P2 ORA GIB MDR TAM MAC Unidades repetitivas 36 30 25 22 18 23 29 51 13 16 7 7 19 Organismo Variantes de las unidades repetitivas a AA1 A2 A3 A4 A5 B B1 B2 B3 B4 C C2C1 C4 C3 C5 C6 D A6-A10 C7-C13 + + + ++++++ +++ +++++++ +++ +++++++ +++ ++++++ + + ++++++ ++ +++++++ + + +++++++ + +++++++ + +++++ ++++++ +++ + +++ + ++ + + +++ NOTA.- a Código de las variantes de las unidades repetitivas. A: TGGGAGAGGC, A1: TGACAGAGGC, A2: TGGGAAAGGC, A3: TGGGAGAGAC, A4: TGGGAAAGAC, A5: TGGGAAAGGT, B: TGGGATTGC, B1: TGTGATTGC, B2: TGAGATTGC, B3: TGGAATTGC, B4: CGAGATTGC, C: TGGGAGAGC, C1: TGGGAAAGA, C2: TGTGAGAGC, C3: TGGGAAAGC, C4: TGGGAGAC, C5: TAGGAGAGC, C6: TGGGAGGGC, D: TCAGAGAC, A6: TGGGAGAAGG, A7: TGGGAGATGG, A8: TAGGGGAGGC, A9: TGGGAGAGGG, A10: TGGGGGAGGC, C7: TGGGGGAGC, C8: TGGGAGAAC, C9: TGGGGAAGC, C10: TCGGAGAGA, C11: TAGGAGACC, C12: TGGAAGAGC, C13: TGAGAGAGA. Este código ha sido modificado con respecto al empleado en trabajos previos (Boán et al. 1998, 2002). HUM(L), HUM(M) y HUM(S) son los alelos largo, mediano y corto de MsH42, respectivamente, CHI1, CHI2, GOR1, GOR2, y GOR3 representan distintos alelos encontrados en las especies de chimpancé y gorila. Tabl a 4. Alelos de MsH42 en primates ______________________Evolución del minisatélite MsH42_____________________ ________________________________________________________________ 68 G→A en la sexta repetición. Esto concuerda con la estrecha relación filogenética que existe entre estas ambas especies. Además, en estos primates el minisatélite MsH42 presenta por primera vez una característica que se mantendrá constante en todas las demás especies: las unidades repetitivas A y C1 marcan el principio (5´) y el final (3´) del minisatélite (tomando como orientación 5´- 3´ la misma que la del gen donde se encuentra incluido). En el gibón (divergencia estimada hace ~ 18 millones de años), el minisatélite adquiere una organización relativamente peculiar, constando de 16 unidades repetitivas, siendo cuatro de ellas distintas a las que se encuentran en humanos. Además, una de estas repeticiones (D) es exclusiva de esta especie. Otra peculiaridad del gibón es que aparecen por primera vez las repeticiones tipo B, que se mantendrán en adelante a lo largo de la evolución de MsH42. En el análisis de los póngidos, los primates más próximos a la especie humana, el orangután (12-16 millones de años), ya presenta una composición en repeticiones muy similar a la de los humanos, aunque todavía su organización interna es sustancialmente diferente. De entre las trece repeticiones que lo componen sólo una (B4) no está presente en el minisatélite MsH42, siendo aparentemente exclusiva de esta especie. En los póngidos africanos, chimpancé (4-6 millones de años) y gorila (6-8 millones de años), el minisatélite ya se encuentra organizado de manera similar a la del locus humano. El análisis de las muestras de gorila reveló la existencia de al menos tres alelos de 23 (GOR1), 29 (GOR2) y 51 (GOR3) unidades repetitivas, con una única variante (C2) ausente en los alelos humanos. Estos tres alelos del gorila comparten entre sí un grupo de 9 repeticiones (A-B-A-C-A1- B-A2-C-A) en el extremo 5´ del minisatélite y otro grupo de 5 repeticiones en el extremo 3´ (A-C-A- A3-C1), por lo que el polimorfismo observado se debe a variaciones en su porción central. En el chimpancé los dos alelos detectados CHI1 y CHI2, de 22 y 18 repeticiones respectivamente, también presentan una organización homóloga a la del alelo corto humano, con la salvedad de dos repeticiones (B3 y C2), que no se encuentran en humanos. La unidad C2 está presente tanto en gorilas como en chimpancés, mientras que B3 parece una variante infrecuente originada por un SNP. En este sentido, nuestros resultados concuerdan con la hipótesis de que los póngidos africanos están más relacionados con los humanos que con los orangutanes asiáticos (Miyamoto et al., 1987; Pääbo, 2003). Gracias a las comparaciones entre los alelos de los distintos primates se puede afirmar que: i) las repeticiones A4 y B1 son exclusivas de los humanos, ii) las repeticiones A y C deben de ser las más antiguas, porque ya se encuentran en tamarindo, iii) las repeticiones A y C1 marcan los extremos del minisatélite desde hace al menos 25 millones de años Figura 20. Alineamiento de las secuencias obtenidas a partir de los diferentes primates para la región MsH42 (minisatélite MsH42 y secuencias adyacentes 5´ y 3´) y los exones 13 y 14. Las secuencias humana, de chimpancé y de gorila están representadas por los alelos HUM(S), CHI1 y GOR1 debido a su mayor similitud en tamaño. En el resto de primates se muestra el único alelo conocido. Para facilitar las comparaciones entre alelos, el alineamiento del minisatélite se ha esquematizado con el código de una letra empleado en la Tabla 4. Las cajas 5´HCS y 3´HCS, resaltadas en amarillo, indican las secuencias altamente conservadas donde se encuentran los cebadores PC1 y PC2 (subrayados) y los footprints de DNasaI 5f1 y 3f1. Las cajas chi contienen el motivo de recombinación de procariotas Chi (GCTGGTGG). En el alineamiento del exón 13, las cajas delimitan dos codones que codifican para metionina en casi todos los primates no humanos y para treonina y valina en humanos. ____________________________Resultados y Discusión________________________ ___________________________________________________________________ 69 y iv) existe un bloque de repeticiones muy bien conservado en todas las especies de la familia Hominidae (C-A- B/B2/B4-A2-C) que sugieren que su presencia podría haber sido necesaria para la construcción del minisatélite. La comparación de secuencias genómicas entre especies distantes es una herramienta de gran utilidad para detectar la presencia de elementos GGCACAAGAATGGCTGGTGGCAGGGGCATAGGCCTTGGGCACTCTAGGACACCCAGCAGGGCAGTGTTGAGAGTGAGCATCCTGGCAGGGCTGGAGGC •••••••••G•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••T••••••••••••• ••••••••••••••••••••••••••••G••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••C•••• ••T•••••••••••••••••••••••••G•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••C••••••••••C•••• •••••••••••••••••••••••••••••CA•••••••••C••C• ••••CA••••••A••−−−C• ••C•••••••••••A••••••••••••••CA••GC•C•••C•••T AGGGGGAAGC •••••••••• •••••••••T ••••A••••• •••••••••T HUM CHI GOR ORA GIB MAC MDR TAM *20 *40 *60 *80 *100 chi Secuencia flanqueante 5´ 5´HCS 5f1 ABACA1 BA2 CACAB1 AACAB2 A2 CACAA3A4C1 HUM ABACA1 BA2 CAC2 AACAB2 A2 CACAA3 C1 CHI ABACA1 BA2 CAC2 AAACAB2 A2 CACAA3 C1 GOR AAACAB4 A2 CAAAA C1 ORA ABA2 DCBC3 CABA2 CCC4 A5 C1 GIB A A C5 AC6 AC1 MAC A A C5 ACAC1 MDR C7 CC8 C9 C10 AC11 AC12 A6 CA7 A8 CCCA9 A10 C13 TAM Minisatélite MsH42 GGCCACTGCTTCTTCACGGAAGATGGGCCGGAGGAACGCAACACTT TTGACCACTGTCTTGGCCTCCTTGTCAAGTCTGGAACCCTCCTCCCCTCGGACC •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••••••••••••A•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••G•••••••••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••••••••••••A•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••••••••••••A•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••C•••••••••••••••••A•••• •••••••••••••••••••••••••••••A•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••C•••••••••••••••••A•••• ••••••••••••••••••••G••C•••••••••••G••••••••C••••••••••••••G•••••••••••••••••C•••••••••••G•••••C•••• 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______________________Evolución del minisatélite MsH42_____________________ ________________________________________________________________ 70 reguladores en las regiones no codificadoras del genoma (Boffelli et al., 2003). Por esta razón, llevamos a cabo el análisis de las secuencias flanqueantes 5´ y 3´ de MsH42. Los resultados obtenidos demostraron que hay una importante conservación entre dichas secuencias en los distintos primates (Figura 20). Concretamente, detectamos a ambos lados del minisatélite la presencia de dos secuencias altamente conservadas que denominamos 5´HCS y 3´HCS (highly conserved sequences). La secuencia 5´HCS comprende 29 pb y sólo presenta dos cambios nucleotídicos en el tamarindo. Por su parte, la secuencia 3´HCS, de 26 pb, sólo muestra dos transiciones A→G en el macaco. Aunque no pudimos analizar directamente las HCS en el mandril, como los oligonucleótidos PC1/PC2 con los que se obtuvo su amplificación están diseñados sobre estas secuencias, el hecho de obtener una amplificación con estos cebadores indica que en esta especie también deben hallarse bien conservadas. Asimismo, cabe destacar la alta conservación de las dos secuencias Chi de recombinación en procariotas presentes a ambos lados del minisatélite. Interacción de las HCS con proteínas La conservación específica de las secuencias no codificadoras puede implicar una determinada función, con la consiguiente presión selectiva y ralentización de las tasas de mutación de las mismas (Ludwig, 2002). Estrategias como la huella filogenética (Tagle et al., 1988; Gumucio et al., 1992) y el sombreado filogenético (Boffelli et al., 2003) han sido utilizadas para identificar potenciales elementos reguladores altamente conservados, mediante el alineamiento de secuencias procedentes de numerosas especies poco o muy emparentadas filogenéticamente. Esta alta conservación evolutiva puede estar reflejando una función de estas secuencias probablemente dentro del gen Q8WUJ3. Para profundizar más en el análisis de esta región del genoma, nos planteamos estudiar si estas secuencias HCS serían reconocidas por proteínas nucleares, lo que estaría manifestando una evidencia más a favor de una posible función de las mismas. En nuestro laboratorio, se habían detectado previamente interacciones DNA-proteína en esta región mediante experimentos de band shifting (Boán et al., 1997), lo que refuerza la hipótesis de que las regiones conservadas interactúan de forma preferencial con proteínas de unión al DNA. Para intentar averiguar qué secuencias concretas eran las que estaban siendo específicamente reconocidas por proteínas, se realizaron experimentos de footprinting con DnasaI. En estos experimentos se emplearon las sondas FP1 y FP2. FP1 comprende las 127 pb de la región flanqueante 5´ contiguas al minisatélite, incluyendo el 5´HCS, y las nueve primeras repeticiones de MsH42. FP2, por su parte, posee las últimas nueve repeticiones de MsH42 y las siguientes 175 pb de la región flanqueante 3´, incluyendo por lo tanto el 3´HCS. Los resultados obtenidos con ambas orientaciones de la sonda FP1 (FP1a y FP1b) y extractos nucleares de tejidos somáticos (cerebro e hígado) demostraron la presencia de dos zonas protegidas, 5f1 y 5f2, localizadas en la región flanqueante 5´ del minisatélite MsH42 (Figura 21). Análogamente, los experimentos realizados con las dos orientaciones de la sonda FP2 (FP2a y FP2b) pusieron de manifiesto la existencia de otras dos zonas protegidas, 3f1 y 3f2, en la región flanqueante 3´ cuando se empleaba el extracto de hígado de rata. Hay que destacar que las regiones 5f1 y 3f1 incluyen respectivamente a las secuencias 5´HCS ____________________________Resultados y Discusión________________________ ___________________________________________________________________ 71 y al 3´HCS (Figura 20), lo que demuestra la existencia de una o varias proteínas que interactúan con estas secuencias conservadas, por lo que dicha conservación estaría verdaderamente marcando footprints filogenéticos. Teniendo en cuenta que el locus MsH42 se encuentra situado dentro de un intrón, se podría especular con que estas HCS pudiesen desempeñar una posible función reguladora dentro del gen Q8WUJ3. G+A Hígado Cerebro Testículo Control G+A Hígado Cerebro Testículo Control G+A Hígado Testículo Control G+A Hígado Testículo Control Orientación 5´→3´ Orientación 3´→5´ Orientación 5´→3´ Orientación 3´→5´ FP1a FP1b FP2a FP2b Figura 21. Análisis de footprinting de DNasaI con las sondas FP1 y FP2. Se muestran las autorradiografías correspondientes a los experimentos realizados con las dos orientaciones posibles de cada sonda (FP1a y FP2a, 5´→3; FP1b y FP2b, 3´→5´). FP1 comprende parte de la región flanqueante 5´ y el principio de MsH42, mientras que FP2 abarca el final del minsatélite y parte de la región flanqueante 3´ contigua. En los dos casos se detectaron regiones de footprint (5f1, 5f2, 3f1 y 3f2), cuya secuencia se muestra en la parte inferior de la figura. 5f1 y 3f1 se incluyen dentro de las regiones conservadas 5´HCS (línea vertical azul) y 3´HCS (línea vertical roja), respectivamente (Figura 19). G+A, reacciones de secuenciación G+A de Maxam & Gilbert; Control, reacciones con BSA; Hígado, Cerebro y Testículo indican los distintos extractos proteicos nucleares empleados en las reacciones. ______________________Evolución del minisatélite MsH42_____________________ ________________________________________________________________ 72 Análisis filogenético de los datos de secuencia Para comparar la dinámica evolutiva de la región MsH42 localizada dentro del intrón 13 del gen Q8WUJ3 con respecto a las secuencias codificantes más próximas, amplificamos y secuenciamos los exones vecinos (13 y 14) utilizando para ello los cebadores E5.1/E5.2 y E6.1/E6.2, respectivamente (Figura 17). El exón 13 se amplificó en todos los primates estudiados, excepto en los lemúridos, siendo la mayoría de los cambios con respecto a la secuencia humana se daban en la tercera posición TAM MDR MAC GIB ORA GOR CHI HUM 40 30 20 10 0 Figura 22. Comparación entre el árbol filogenético estándar de los primates (A) y el obtenido en nuestro estudio (B). En la parte inferior de la topología estándar de primates se muestra la escala temporal aproximada en millones de años (tomada de Goodman, 1999 y Pääbo, 2003). Nuestro árbol filogenético fue obtenido por neighbour-joining a partir del conjunto total de datos (región minisatélite y exones). Las distancias se estimaron bajo criterio de máxima verosimilitud, generándose mil versiones a partir de combinaciones de los datos originales mediante boostrapping para evaluar el soporte de los nodos. Los números en cursiva indican los valores de bootstrapping, mientras que los números normales indican los valores de distancia de Tamura-Nei. La secuencia de tamarindo se usó como grupo externo para enraizar el árbol. La barra de escala representa 0.01 unidades de distancia. A B ____________________________Resultados y Discusión________________________ ___________________________________________________________________ 73 de los codones y eran sinónimos (Figura 20). Existe, sin embargo, un codón que codifica para metionina en todos los primates, excepto en humanos donde codifica treonina, suprimiéndose así un codón de iniciación potencial dentro de la pauta de lectura. Quizás este hipotético codón de iniciación podría servir para producir más de una proteína a partir del mismo mRNA mediante un mecanismo que implicase la iniciación de la traducción en lugares internos de unión del ribosoma (Oh & Sarnow, 1993). El exón 14 pudo amplificarse en todos los primates con la excepción del tamarindo. En este caso todos los cambios con respecto al exón humano resultaron ser sinónimos (Figura 20). Para estudiar si los datos experimentales se adecuaban a la filogenia estándar de primates (Miyamoto et al., 1987; Goodman et al., 1998), se realizó un análisis filogenético empleando las secuencias de la región minisatélite y de los exones 13 y 14. Los resultados obtenidos al aplicar el test de diferencias en la incongruencia de longitud indicaron que había una congruencia significativa de las secuencias (P=1), lo cual permitió la reconstrucción de una topología por neighbour-joining a partir del conjunto total de datos (Figura 22). El árbol filogenético obtenido de esta forma reproduce las relaciones filogenéticas entre los primates generalmente aceptadas (Miyamoto et al., 1987). Bajo criterios de parsimonia, los datos de todas las secuencias tomadas en su conjunto, así como los de las secuencias flanqueantes de MsH42 por separado, también reflejan el árbol de primates aceptado generalmente (Tabla 5). Sin embargo, se obtuvieron topologías alternativas a partir de los datos de secuencia de los exones y del minisatélite (datos no mostrados), aunque los valores del índice de consistencia, así como del test de Kishino-Hasegawa indican que dichos datos de secuencia pueden ser consistentes con la topología estándar de los primates (Tabla 5). La concordancia entre el árbol de los primates y el estimado a partir del minisatélite MsH42 sugiere que los eventos mutacionales observados en MsH42 son similares a los acaecidos en otras secuencias no Tabla 5. Evaluación de los árboles filogenéticos generados a partir de las secuencias obtenidas de los distintos primates con respecto a la topología estándar establecida para este grupo. Exones 13 y 14 Secuencias flanqueantes de MsH42 Minisatélite MsH42 Conjunto de todas las secuencias -lnL de la Topología estándar de primates d 631.216 475.945 Señal Filogenética (-g 1 ) -0.890 -1.019 -0.997 Número de Caracteres Incluidos 336 495 1074 Caracteres Informativos (Parsimonia) 15 51 207 Longitud del árbol: Topología MP Observada Índice de Consistencia 28 a 0.893 135 b 0.963 293 c 0.761 456 b 0.829 Longitud del árbol: Topología Estándar d Índice de Consistencia 28 0.893 293 0.761 Diferencia de Longitud 0 0 -lnL de la Topología ML Observada 631.216 a 1109.097 b 473.966 e 2289.185 b a Topología observada: (TAM, ((MAC, MDR),(ORA, GIB, (CHI, GOR, HUM)))). b Topología observada idéntica a la topología estándar de primates. c Topología observada: (TAM, (MAC, MDR), (ORA, (GIB, (HUM, (CHIM, GOR))))). d Topología estándar de primates: (TAM, ((MAC, MDR), (GIB, (ORA, (GOR,(CHIM, HUM)))))). e Topología observada: (TAM, (GIB, ((HUM, CHI, GOR), (ORA, (MAC, MDR))))). MP, máxima parsimonia; ML, máxima verosimilitud. -1.075 243 164 ∆lnL 01.979 P (Test Kishino-Hasegawa) 1.0 0.304 ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 80 cuyos extremos estaban marcados radiactivamente. Puede observarse como tras la incubación con el extracto, las moléculas que forman el patrón DSB permanecen marcadas, lo que descartaría la actividad exonucleásica como la causante de la aparición de estas bandas (Figura 25B). En este experimento el sustrato empleado fue f42E, fragmento equivalente al f42P, pero con extremos EcoRI (Figura 13A). La elección de este sustrato se debió a que el marcaje terminal mediante T4 polinucleótido kinasa es más efectivo sobre extremos 5´ protuberantes. Por otra parte, no observamos diferencia alguna en los ensayos DSB al emplear los fragmentos f42E, f42S y f42P, lo que indica que la generación del patrón DSB no se ve influido por el tipo de extremos (protuberantes 5´, romos y protuberantes 3´, respectivamente) del sustrato (datos no mostrados). En algunos ensayos, se empleó el extracto citosólico S-100 de testículo de rata en lugar del extracto proteico nuclear. En estos experimentos, el DNA no sufrió alteración alguna sugiriendo la probable localización nuclear de la actividad detectada (Figura 25C). Cuando se emplearon sustratos alternativos a la región minisatélite, f5´MsH42 o fLacZ, se formó como era de esperar un patrón DSB diferente (datos no mostrados), aunque con la misma característica de la existencia de parejas de bandas que suman aproximadamente el tamaño del sustrato original. Esto apunta a que cualquier DNA puede ser sustrato de la actividad endonucleásica del ensayo DSB, siempre y cuando contenga las dianas adecuadas para esta enzima. Esta serie de resultados demuestran que existe una actividad endonucleolítica en nuestro ensayo DSB capaz de generar cortes de manera específica en secuencias concretas a lo largo de la región MsH42. f42P Extracto DNasaI M N1 N2 N3 N4 N5/n5 - ++ + - --- - + 45´ 15´ 30´ 45´ 45´ Tiempo * * * * * * * * * n4 n3 n2 n1 1234 MTn Tc Tn Tc 20´ 30´ f42P Figura 25. Ensayo DSB en condiciones estándar (10 mM Mg2+). A. Ensayo DSB empleando extracto nuclear de testículo de rata y fragmento f42P a distintos tiempos (15, 30 y 45 min) y de una digestión de f42P con DNasaI. Se muestran las bandas N1-N5 y n1-n5 (asteriscos) que forman parejas cuyo tamaño suma aproximadamente el del sustrato original. B. Ensayo DSB con fragmento f42E marcado radiactivamente. Carriles 1 y 2, fragmento sin extracto; 3 y 4, reacciones con extracto de testículo. Se muestra el gel de agarosa teñido con bromuro de etidio (1 y 3) y el autorradiograma obtenido a partir de él (2 y 4). C. Ensayo DSB con extracto citosólico (Tc) o nuclear (Tn) de testículo de rata 20 y 30 min de incubación. El análisis electroforético de los productos del ensayo DSB se realizó en geles de agarosa al 2%. M es el marcador 100 bp ladder de Promega. A B C ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 81 Al emplear extractos proteicos nucleares procedentes de distintas fuentes (testículo, hígado, cerebro y riñón de rata, y cerebro de pollo) no encontramos diferencias cualitativas en la formación del patrón DSB, aunque sí observamos variaciones en el tiempo de incubación necesario para su generación. En concreto, los extractos de hígado de rata y cerebro de pollo resultaron ser especialmente rápidos en la generación del patrón DSB (Figura 26A), necesitando tan sólo 10-15 min frente a los 30 min requeridos por el extracto de testículo. Sin embargo, extractos como los de cerebro (Figura 26A) y riñón de rata (no mostrado) exhibieron una cinética de degradación del sustrato similar a la del testículo. Por el contrario, no fuimos capaces de detectar la formación del patrón DSB característico en extractos proteicos nucleares obtenidos a partir de bazo de rata (Figura 26B). Esto puede indicar que la proteína responsable de la formación de los DSBs se expresa poco o nada en este tejido. A B Figura 26. Ensayo DSB variando el extracto proteico nuclear o el sustrato empleado. A. Ensayo DSB con 12 µg de extracto nuclear procedente de distintos tejidos: hígado de rata (incubado 15 min), cerebro de rata (incubado 30 min) y cerebro de pollo (incubado 10 min). B. Ensayo DSB con extracto nuclear de bazo a 20 y 30 min de incubación. El análisis de los productos de los distintos ensayos DSB se realizó en geles de agarosa al 2%. F, fragmento sin extracto; T, reacciones con extracto nuclear de testículo. M, marcador 100 bp ladder de Promega. M20´ 30´ f42P Hígado rata Cerebro rata Cerebro pollo ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 82 f42P M1 M2 M3 M4 F15´ 30´ 45´ MM3X * * * * m4 m3 m2 m1 * * * * Tc Tn Tc Tn 30´ 45´ f42P Figura 27. Ensayo DSB sin Mg2+. A. Ensayos DSB sin Mg2+ con extracto nuclear de testículo a distintos tiempos de incubación, mostrando las bandas DSB de mayor tamaño, M1-M4 (marcadas por asteriscos). F, fragmento f42P sin extracto. B. Análisis de los productos de tres ensayos DSB sin Mg2+ con extracto nuclear de testículo de rata, cargados juntos en un mismo pocillo (3X) para poner de manifiesto las bandas DSB de menor tamaño, m1-m4 (marcadas por asteriscos). C. Ensayo DSB sin Mg2+ con extractos citosólicos (Tc) o nucleares (Tn) de testículo de rata, a tiempos de incubación de 30 y 45 min. M, marcador 100 bp ladder de Promega. A CB Influencia del Mg2+ en la actividad endonucleásica del ensayo DSB Para estudiar la posible influencia del Mg2+ sobre la actividad nucleásica responsable de la generación del patrón DSB, se realizaron una serie de ensayos DSB con un tampón de reacción que no contenía dicho catión (Tabla 2). La ausencia de Mg2+ provocó una alteración notable respecto a los resultados obtenidos en condiciones estándar (10 mM Mg2+), apareciendo un patrón de bandas completamente diferente (Figura 27A). También aquí pudimos comprobar, que las bandas de este patrón podían agruparse en parejas (M1/m1, M2/m2, M3/m3, M4/m4) cuyos tamaños sumaban aproximadamente el del fragmento de DNA f42P empleado como sustrato. Esto apuntaba a que su generación se debía a la acumulación de cortes en puntos concretos de las moléculas del sustrato como ocurría en presencia de Mg2+. Las bandas m1, m2, m3 y m4 son difíciles de apreciar dada su escasa intensidad, por lo que para visualizarlas fue necesario cargar varias reacciones en un mismo pocillo (Figura 27B). Al igual que en el caso del ensayo DSB en condiciones estándar, la actividad nucleásica sólo se detectó en los extractos nucleares, no pudiéndose apreciar productos de degradación cuando se emplearon extractos proteicos citosólicos (Figura 27C). La actividad independiente de Mg2+ fue observada en todos los extractos nucleares de rata analizados (datos no mostrados), incluido el extracto de bazo ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 83 que no mostraba la actividad dependiente de Mg2+ (Figura 28A), aunque tal actividad Mg2+-independiente no pudo detectarse en extractos de cerebro de pollo. Dado que la ausencia de Mg2+ en el tampón del ensayo DSB conducía a la generación de un patrón DSB diferente del obtenido bajo condiciones estándar, decidimos hacer una serie de experimentos en los que se incrementaba progresivamente la concentración de Mg2+ en el tampón. El incremento gradual de la concentración de Mg2+ desde 0 hasta 10 mM provocó una transición paulatina entre los dos patrones de bandas DSB descritos (Figura 28B). Puede observarse como determinadas bandas del patrón DSB en condiciones estándar (10 mM Mg2+) van desapareciendo a medida que disminuimos la concentración de Mg2+. De forma similar, las bandas que conforman el patrón DSB obtenido sin Mg2+ se difuminan a medida que aumenta la concentración de este catión. A concentraciones de 0.5 y 1 mM Mg2+ se aprecia la coexistencia de bandas características de ambos patrones. Después de descubrir el efecto de la ausencia de Mg2+, decidimos investigar si otros componentes del tampón DSB podían también influir en el resultado del ensayo DSB. Para ello, se realizaron ensayos DSB con un tampón que carecía de dNTPs o de ATP. Como se muestra en la Figura 28C, los productos obtenidos en un ensayo DSB sin dNTPs son idénticos a los procedentes de ensayos estándar, mientras que los originados en ensayos DSB sin ATP muestran una grado ligeramente mayor f42P - 0.25 0.5 1 2.5 5 10 Extracto Mg2+ (mM) +++++++ - - M 30´ 45´ Fstd Mg 2+ dNTP ATP Reacción sin M f42P Figura 28. Ensayos DSB sin Mg2+ y con otras variaciones del ensayo DSB con respecto a la reacción estándar. A. Ensayo DSB sin Mg2+ empleando extracto nuclear de bazo a 30 y 45 min de incubación. B. Ensayos DSB con extracto nuclear de testículo de rata y a diferentes concentraciones de Mg2+. Las flechas blancas señalan algunas de las bandas de DNA de los patrones DSB en ausencia como en presencia de 10 mM Mg2+ y que desaparecen de forma más evidente al variar la concentración de este catión C. Ensayo DSB estándar (std) con extracto de testículo de rata y otros realizados con un tampón DSB que carece de Mg2+, de dNTPs o de ATP. F, fragmento sin extracto. El análisis electroforético de los productos de esta serie de ensayos se realizó en geles de agarosa al 2%. M, marcador 100 bp ladder de Promega. A CB ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 84 de degradación, muy probablemente causado por la pérdida de la actividad ligasa que se reconstruye parte de las moléculas cortadas por la actividad endonucleásica. Sin embargo, de todos los componentes del tampón DSB, el Mg2+ fue el único cuya supresión tuvo como resultado un cambio cualitativo tan importante en la formación de productos de degradación. La generación de patrones DSB distintos provocados por la presencia o ausencia de Mg2+ podría explicarse mediante dos posibles hipótesis: i) la existencia de dos actividades enzimáticas diferentes (una Mg2+-dependiente y otra Mg2+- independiente) o la acción de una enzima cuya especificidad cambia en función de la concentración de Mg2+. En principio, la distinta distribución en tejidos y en vertebrados (murinos y pollo) de ambas actividades endonucleásicas apoyaría la existencia de dos actividades enzimáticas independientes. Caracterización de las actividades endonucleásicas en el ensayo DSB El ensayo DSB estaba mostrando la presencia de dos actividades independientes generadoras de DSBs en los extractos nucleares analizados, por lo cual nos propusimos caracterizar con mayor detalle tales actividades. Para ello, se llevaron a cabo una serie de ensayos DSB en los que se modificaron las condiciones experimentales respecto a la reacción estándar (Tabla 2). Uno de Tabla 6. Comparación de las dos actividades generadoras de DSBs. El efecto de las concentraciones de EGTA, NEM, NaCl y KCl y el calentamiento de los extractos nucleares antes del ensayo DSB fue determinado bajo condiciones estándar con Mg2+ o en ausencia de Mg2+. Ensayo con Mg2+ (10 mM) Ensayo sin Mg2+ 1 N L 10 N I EGTA (mM) 50 I I 0.5 I N 5 I N NEM (mM) 50 I N 10 N L NaCl (mM) 40 I I 10 N L KCl (mM) 40 I I 50ºC L N Calentamiento del extracto 60ºC I L N, actividad normal; L, actividad disminuida; I, actividad inhibida. ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 85 los ensayos consistió en la adición a la reacción de EGTA, un quelante específico de Ca2+, a concentraciones finales de 1, 10 y 50 mM. Este compuesto inhibió la actividad independiente de Mg2+, sugiriendo que esta actividad pueda requerir Ca2+, aunque su presencia apenas afectó a la Mg2+-dependiente. Otra diferencia destacable entre ambas actividades DSB se reveló mediante el tratamiento de los extractos nucleares con NEM, un agente alquilante de radicales sulfhidrilo capaz de modificar los residuos de cisteína de las proteínas. Así, la adición de NEM a una concentración de 0.5 mM eliminó la actividad formadora de DSBs dependiente de Mg2+, mientras que la actividad independiente de Mg2+ permaneció inalterada incluso a 50 mM. Otra característica que permitió distinguir ambas actividades fue su resistencia al calor. Así, los extractos se sometieron a una preincubación de 5 min a 50 ó 60ºC, antes de su adición al ensayo DSB. De esta forma, la actividad dependiente de Mg2+ resultó inactivada completamente por la preincubación a 60ºC, mientras que la Mg2+- independiente todavía se mantuvo activa. Los resultados de esta serie de ensayos DSB (resumidos en la Tabla 6) tomados en su conjunto reforzaron la existencia de dos actividades enzimáticas diferentes. La ausencia del patrón DSB correspondiente a la reacción independiente de Mg2+ en aquellos ensayos que sí contenían este catión era un tanto sorprendente si pensamos en dos actividades enzimáticas independientes. En este sentido, en las reacciones con 10 mM Mg2+ cabría esperar que se formase un patrón DSB compuesto por bandas procedentes de la actividad de ambas enzimas, mientras que en ausencia de este catión debería M NaCl (mM) KCl (mM) 10 40 ---- 10 40 -- -- 10 40 ---- 10 40 f42P 10 mM Mg 2+ Sin Mg 2+ Figura 29. Efecto de la fuerza iónica sobre las actividades generadoras de DSBs. Se muestra el análisis electroforético en geles del 2% de una serie de ensayos DSB en presencia de NaCl y KCl. En el panel de la izquierda se muestra el resultado de la adición de NaCl o KCl a las concentraciones indicadas en ensayos DSB estándar (10 mM Mg2+). En el de la derecha, se muestra el resultado de la incorporación de estas mismas sales a ensayos DSB sin Mg2+. M, marcador 100 bp ladder de Promega. ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 86 Secuenciación (determinación puntos DSB y recombinantes) MsH42      Fragmentof42P MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42  MsH42 Reparación Extractoproteico MsH42 MsH42 MsH42 MsH42  Corte protuberante Generación recombinantes MsH42 MsH42 42 M M42 MsH MsH42 sH42 M ** ** ** ** ** * * * * * * *** * * * ** * * Productos del ensayo Purificación a partir del gel de agarosa Corte romo PCR con los cebadores PS1 ( ) y PS2 ( ) ** Amplificación de las moléculas recombinantes Clonaje Amp MsH42 La cZ Plásmido con producto DSB Amp M42 La cZ Plásmido con recombinante Amp La cZ pGEM-3Z PstI Amp La cZ pGEM-3Z PstI / SmaI observarse la desaparición de aquellas bandas correspondientes a la actividad dependiente de Mg2+. Sin embargo, como se mostró en la Figura 28B, los patrones DSB cambian completamente en presencia (10 mM) o ausencia de Mg2+. ¿Podría ocurrir que los cambios que estábamos observando al retirar el ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 87 Mg2+ del tampón DSB se debiesen a que ambas actividades enzimáticas tuviesen una sensibilidad diferente al descenso de la fuerza iónica en la reacción? Para analizar esta posibilidad, realizamos un conjunto de ensayos DSB en los cuales se sustituía el 10 mM de Mg2SO4 del tampón de reacción por NaCl o KCl bien a la misma molaridad (10 mM) o a una concentración que se correspondiese con la misma fuerza iónica (40 mM). Estas mismas concentraciones de NaCl o KCl se añadieron a reacciones DSB estándar para ver su efecto sobre la reacción Mg2+-dependiente. Como se muestra en la Figura 29, la actividad independiente de Mg2+ se inhibía fuertemente por Na+ o K+ a concentraciones de 10 mM, siendo totalmente eliminada a 40 mM. Por el contrario, la actividad Mg2+-dependiente no mostraba alteraciones aparentes a una concentración 10 mM, aunque a 40 mM se encontraba muy inhibida. Estos resultados permitieron extraer las siguientes conclusiones acerca de estas dos actividades generadoras de DSBs: i) la actividad independiente de Mg2+ se inhibe fuertemente por un aumento en la fuerza iónica del tampón de reacción, lo que explica la no existencia de bandas generadas a partir de esta actividad en el ensayo estándar DSB (10 mM Mg2+); ii) el aumento de la fuerza iónica en una reacción sin Mg2+ no restaura el patrón DSB de la actividad dependiente de Mg2+, lo que verifica el requerimiento específico de este ión; iii) la actividad dependiente de Mg2+ es notablemente más tolerante a variaciones en la fuerza iónica del tampón de reacción que la actividad independiente de Mg2+. Hay que tener en cuenta que la actividad dependiente de Mg2+ soporta tanto la adición de concentraciones moderadas de NaCl o KCl (10 mM) en un tampón que ya de por sí contiene 10 mM de Mg2SO4, lo que equivaldría a una fuerza iónica un 25% mayor con respecto a la reacción estándar, como un descenso del Mg2SO4 a 2.5 mM, lo que implica una fuerza iónica un 75% menor que en las condiciones estándar (Figura 28A). Recapitulando acerca de las propiedades que hemos estudiado para las actividades generadoras de DSB observadas en nuestro ensayo (Mg2+-dependiente y Mg2+-independiente), hemos constatado que, además de en su dependencia por el Mg2+, se diferencian en las siguientes características: i) la distribución en tejidos y especies; ii) la susceptibilidad a NEM (existencia de grupos sulfhidrilo accesibles); iii) la susceptibilidad a EGTA (dependencia de Ca2+); iv) inhibición por NaCl y KCl y v) inactivación por calor. Este conjunto de datos apoya la hipótesis de que los patrones DSB observados en presencia y ausencia de Mg2+ son consecuencia de la acción de dos enzimas independientes entre sí. Figura 30. Estrategia seguida para la clonación de productos originados en el ensayo DSB con el fragmento f42P. Se asume que al menos una fracción de las moléculas originadas tras un DSB mantendrá uno de sus extremos PstI inalterado, mientras que el extremo generado por la actividad endonucleásica podría ser romo debido a la propia actividad endonucleásica o por el procesado de extremos protuberantes. Estas moléculas serían ligables en un vector con extremos PstI y SmaI. El caso de los recombinantes, se asume que algunos de ellos mantendrán sus extremos originales intactos. Esto permitirá su detección por dos métodos diferentes: i) Amplificación mediante los cebadores PS1 (asterisco morado) y PS2 (asterisco verde), cuya secuencia se halla en los extremos de la región MsH42 y ii) clonaje en un vector linearizado con PstI. El inserto de los plásmidos recombinantes se secuenció con los cebadores universales M13 para determinar tanto los puntos de corte en los productos DSB como la secuencia de los recombinantes. ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 88 Análisis de los productos DSB Actividad Mg2+-dependiente Una vez analizadas algunas de las propiedades de las dos actividades endonucleásicas detectadas en el ensayo DSB, nos planteamos la caracterización de los productos de digestión derivados de estas actividades enzimáticas para averiguar las secuencias que estaban siendo reconocidas específicamente. Para abordar este estudio, asumimos que al menos algunas de las moléculas originadas a partir de un único DSB sobre el sustrato f42P (en adelante, productos DSB) mantendrían su extremo PstI intacto, mientras que el punto de corte producido por la actividad endonucleásica sería romo, bien porque la propia actividad DSB genera este tipo de extremos o porque otras proteínas del extracto puedan procesarlo, eliminando extremos protuberantes (Figura 30). Los productos del ensayo DSB se purificaron a partir de las bandas correspondientes del gel de agarosa y se clonaron en el vector pGEM-3Z linearizado con PstI y SmaI (esta enzima genera extremos romos). Los clones recombinantes se secuenciaron para determinar el lugar exacto de corte. En la Figura 31, se muestra un mapa de la región MsH42 donde se indican los puntos de corte correspondientes a los clones recombinantes aislados a partir de ensayos DSB estándar y que, por lo tanto reflejan la actividad de la nucleasa Mg2+- dependiente. De los 28 puntos DSB analizados, 16 están localizados dentro del minisatélite y 12 en la región flanqueante 3´ de MsH42. Un número significativo de puntos DSB (~ 60%) estaban situados dentro o flanqueando motivos TGGG (Figura 31), especialmente abundantes en la secuencia minisatélite. Cabe destacar que varios DSBs localizados fuera del Figura 31. Distribución de los DSBs a lo largo de la región MsH42 generados en el ensayo DSB estándar. La caja anaranjada representa al minisatélite MsH42, cuya secuencia se muestra en negrita en la parte inferior. Los puntos de corte se representan como flechas sobre el esquema y como puntas de flecha sobre la secuencia. Los dianas PstI se indican en verde. MsH42 P P DSBs con Mg 2 + CTGCAG CAATGGACTCAAAAAGGGGGAAGCGGCACAAGAATGGCTGGTGGCAGGGGCATAGGCCTTGGG CACTCTAGGACACCCAGCAGGGCAGTGTTGAGAGTGAGCATCCTGGCAGGGCTGGAGGCTGGGAGAGGC TGGGATTGCTGGGAGAGGCTGGGAGAGCTGACAGAGGCTGGGATTGCTGGGAAAGGCTGGGAGAGCTGG GAGAGGCTGGGAGAGCTGGGAGAGGCTGTGATTGCTGGGAGAGGCTGGGAGAGGCTGGGAGAGCTGGGA GAGGCTGAGATTGCTGGGAAAGGCTGGGAGAGCTGGGAGAGGCTGGGAGAGCTGGGAGAGGCTGTGATT GCTGGGAGAGGCTGGGAGAGGCTGGGAGAGCTGGGAGAGGCTGAGATTGCTGGGAAAGGCTGGGAGAGC TGGGAGAGGCTGGGAGAGCTGGGAGAGGCTGGGAGAGACTGGGAAAGACTGGGAAAGATGGCATAGGCC TTGAGCCAGGAGTGTGAGTTCATGAAGATAGGCTGGGGGAGTGAGAGATGCGTGGGGCAAGAGGGAAGG CAGCAGTTCAGGGGTAGCCCATGGAGCTGTATCTGGAGCAGCCACGTGGGTCACTTCTACCCACAGTGG AGGTGGACTCTTGTAGCCAGAGCTGTGGACAACCTCTCAGAACCAGAAGACCCTTGCTGCCCTGTATGC CAAGGTCTCCTCCCGGCCTGGGTCTCAGGGATGCCAGCTGCAAACTGGGAGGGCCATTGTACAGACACT AGGTGGCTGAGGTACCAGTTACAGCCTGGTCTTGGTGGCCACATAGAGGTCCAGCCTCACTCAGCTTGA TGGCCAAGCTGGTGGGTTAGGATTTGGAGT CTGCAG ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 89 minisatélite también estaban asociados a motivos similares al TGGG. Concretamente, 4 de ellos se dieron en dos secuencias con más residuos de guanina (TGGGG y TGGGGG), que se encuentran situadas en la región flanqueante 3´ de MsH42 (Figura 31). El análisis de las secuencias de los puntos de corte detectados a lo largo de la región MsH42 para la actividad generadora de DSBs dependiente de Mg2+ indicaba que su diana estaba relacionada con motivos ricos en guanina. Para confirmar esta preferencia por secuencias ricas en guanina diseñamos una batería de oligonucleótidos de 50 pb que contienen el motivo TGGGG o variaciones de éste y de sus secuencias flanqueantes (Tabla 1). Estos oligonucleótidos se emplearon como sustrato en ensayos DSB para averiguar si dicho motivo era reconocido como diana por la actividad endonucleásica Mg2+-dependiente. En estos ensayos se empleó el extracto de cerebro de pollo por ser uno de los que produce un menor ruido de fondo y, por lo tanto, un patrón de bandas más definido. Cuando se realizó el ensayo DSB empleando el oligonucléotido F1, que contiene el motivo TGGGG en las posiciones 29-33 a partir de su extremo 5´, se generaron dos bandas prominentes (Figura 32, carril F1). Estas bandas presentaban la misma movilidad electroforética que los fragmentos de 19 y 31 pb producidos por la digestión con SmaI del oligonucléotido M16, que contiene un lugar de restricción para esta enzima en la posición 29-34 (carril M). Este resultado demuestra que el DSB está teniendo lugar principalmente entre los residuos segundo y tercero del motivo TGGGG en el oligonucleótido F1. Si se altera la posición de este motivo, como en el caso del oligonucleótido F2 donde el motivo TGGGG ocupa las posiciones 25-29 pb, el patrón de bandas generado se modifica no sólo en el tamaño de sus bandas, sino también en su definición (Figura 32, carril F2). Estos resultados ponen de manifiesto que el motivo TGGGG forma parte de la secuencia de reconocimiento de la actividad generadora de DSBs Mg2+-dependiente. El hecho de que la precisión en el corte sea menor cuando se desplaza la diana TGGGG en el oligonucleótido F2 sugiere que la actividad enzimática puede estar siendo influenciada por la composición del DNA adyacente a dicho motivo. Para analizar de qué manera influyen las variaciones en el TGGGG en la generación de los DSBs, se emplearon una serie de sustratos en los que se introdujeron determinadas mutaciones en su secuencia (Figura 32 y Tabla 1). Los resultados obtenidos en los ensayos con los oligonucleótidos M1-M5 mostraron que mutaciones en el extremo 3´ de este motivo reducían la actividad DSB de forma más eficaz que aquellas localizadas en su extremo 5´, lo que denota la existencia de una polaridad en el reconocimiento del motivo por parte de la actividad enzimática. Esta polaridad también se observó en los experimentos con los oligonucléotidos M11-M13, en los cuales se introdujeron dos mutaciones en el motivo TGGGG. Dos transversiones G→C en las dos primeras guaninas apenas redujeron la tasa de corte, mientras que si estos cambios se realizaban en la segunda y tercera o bien en la tercera y cuarta guanina, la actividad cae bruscamente (carriles M11-M13). También hay que destacar que el tipo de mutación en una posición determinada influye en la actividad formadora de DSBs. Así, los cambios G→C son más tolerados por esta actividad que los cambios G→T (comparar carriles M3 con M7 y M11 con M14), indicando que esta actividad puede verse favorecida por la existencia de residuos de guanina en ambas ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 96 10, donde existe un motivo TGGG, y de forma diferente en la zona de las 19 y 20 pb, donde la sustitución de CAG por TTT deshace un tramo de tres guaninas consecutivas. Otro prominente corte en la zona de las 36-38 pb también recae en un motivo rico en guaninas. En el caso de los oligonucleótidos S3, S6, S7 y S9, cabe destacar el corte que aparece en la zona de las 9 pb en S3, que se corresponde con un palíndromo EcoRI y otros más pequeños, y que se ve desplazado a 8 pb por una sustitución C→A que deshace este motivo en los otros tres. S3 muestra también un claro corte hacia las 31 pb, donde se encuentra el motivo TGGGG, corte que desaparece en S6, S7 y S9. Existe un punto de corte muy evidente en estos tres últimos sustratos en la zona de las 15 pb, que podría estar relacionado con secuencias ricas en adenina, pero no hemos observado este tipo de cortes en otros tramos de secuencia con esta misma composición. Finalmente, en todos los carriles hay una banda muy clara en la zona de 36-38 pb. Esta banda aparece tanto en S1 y S2 como en S3-S9. Puesto que la secuencia en dicha zona del sustrato es diferente para estos dos grupos de oligonucleótidos, puede que esta banda se trate de un producto inespecífico, lo cual no descarta que pueda estar enmascarando DSBs reales en esa misma porción del sustrato. Llegados a este punto, prácticamente habíamos descartado el que una S1 S2 S3 S4 S5MS6S7S8S9 50 40 31 19 10 50 40 31 19 10 50 40 31 19 10 S1 S3 S7 S9S2 S6 M S1 S3 S7S2 S6 S9 S1 S3 S7S2 S6 S9 S10 S3 M S9 M S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 50 40 31 19 10 Figura 36. Ensayos DSB en ausencia de Mg2+ con oligonucleótidos de 50 pb. A. Ensayo DSB con los oligonucleótidos S1-S9. B. Ensayo DSB con los oligonucleótidos S1, S2, S3, S6, S7 y S9 marcados radiactivamente en uno de sus extremos. Se muestra el gel teñido con bromuro de etidio (panel izquierdo) y su autorradiografía (panel derecho). C. Autorradiografía de un experimento similar al de B, pero con un tiempo de incubación de 60 min y un tiempo de exposición mayor para poner de manifiesto las bandas menos intensas. D. Ensayo DSB con los oligonucleótidos oligonucleótidos S10-S20, incluyendo a S3 y S9 como referencia. Todos los ensayos se han realizado con extracto de bazo de rata y tiempo de incubación de 30 min, excepto en C, 45 min. Las muestras se analizaron en geles de poliacrilamida al 18% y en B y C fueron autorradiografiados. La secuencia de todos estos oligonucleótidos se encuentra en la Tabla 1. M, marcador de peso molecular generado mediante la digestión de los oligonucleótidos M16 y M17 con SmaI. A B C D ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 97 actividad enzimática estuviese asociada específicamente a los motivos CAG, y por otra parte nos parecía evidente que existía una actividad que tenía afinidad por tramos de guaninas. Además, algunos resultados apuntaban hacia una enzima con afinidad por zonas de palíndromos. Por esta razón, diseñamos una nueva tanda de sustratos de 50 pb donde se colocaron secuencias palindrómicas únicas y variantes de las mismas, evitando la presencia de tramos de guaninas (S10-S20), con el fin de evitar la aparición de bandas debidas a la otra actividad. Los resultados de ensayos DSB con esta tanda de oligonucleótidos se muestran en la Figura 36C y, como puede verificarse en la imagen, nos aportaron muy poca información con respecto a esta posible actividad. El sustrato S10, que actuaba como control (no contenía secuencias palindrómicas) es degradado muy rápidamente por el extracto sin generar apenas bandas. Otros oligonucleótidos de esta serie muestran bandas débiles, pero que no se corresponden con los tamaños esperados. Hay que señalar que durante el proceso de purificación de la actividad dependiente de Mg2+ se intentó seguir paralelamente a esta otra actividad durante los fraccionamientos, pero la perdimos en los primeros pasos. Ensayos DSB con las fracciones más purificadas de la actividad Mg2+-dependiente realizados en ausencia del catión no produjeron degradación del fragmento (datos no mostrados), reforzando que se trate de proteínas diferentes. Como conclusión general con respecto a la actividad independiente de Mg2+, podemos decir que una buena la parte de los DSBs que se están detectando están siendo producidos por una actividad que tiene afinidad por residuos de guanina. Esta actividad parece distinta de Endo- G, pues ensayos con esta enzima en ausencia de Mg2+ no generan banda alguna (datos no mostrados). Ante la hipótesis de una posible actividad residual de Endo-G asociada a pequeñas cantidades de este catión en el extracto, cabría esperar una coincidencia del patrón obtenido tanto en presencia como en ausencia de Mg2+, hecho que no se da. Se han descrito otras actividades como Endo-SR (Evans & Aguilera, 2003), que es independiente de Mg2+ y muestra preferencia por tramos de guaninas o guaninas y adeninas. No tenemos datos hasta el momento que puedan confirmar o desmentir que sea esta la proteína implicada. Análisis de los productos recombinantes generados en los ensayos DSB Después de la identificación y caracterización de los productos generados por DSBs sobre la región MsH42, nos propusimos buscar moléculas cuyo origen fuese los procesos recombinatorios catalizados por la maquinaria de recombinación presente en el extracto nuclear. Para detectar estas moléculas tanto en el ensayo DSB estándar como en el realizado sin Mg2+, purificamos los fragmentos de DNA resultantes del ensayo DSB obtenidos del de agarosa (Figura 30). Este DNA fue utilizado como molde en amplificaciones con los cebadores PS1 y PS2, que se encuentran en los extremos del sustrato f42P. Si obteníamos productos de PCR que conservaran las secuencias del extremo del fragmento f42P al amplificarlo con PS1/PS2 y si eran de menor peso molecular que el fragmento original, entonces deberían ser moléculas recombinantes. En estas amplificaciones, el DNA procedente de las bandas N1, N2, N4 y N5 generó productos con el tamaño correspondiente a cada banda, indicando que además de moléculas DSB, en esas bandas de DNA existen moléculas recombinantes. Sin embargo, este procedimiento únicamente ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 98 se usó como método de detección de estas moléculas recombinantes, y sus productos no fueron clonados ni secuenciados puesto que podrían generarse artefactos durante la PCR por uniones de extremos imperfectas o jumping PCR (Pääbo et al., 1990). Para determinar la secuencia de los recombinantes, se clonaron directamente los productos de los ensayos DSB, estándar y sin Mg2+, en el vector pGEM- 3Z linearizado con PstI. De esta forma, sólo aquellos productos que mantuviesen intactos sus extremos PstI podrían ligarse en el vector y, puesto que el DNA purificado es de menor tamaño que el sustrato f42P original, deberían ser recombinantes. Con esta estrategia se obtuvieron varios clones positivos cuya secuenciación reveló la presencia de delecciones que oscilan entre 34 y 678 pb con respecto al fragmento original (Figura 37). De forma llamativa, 12 de las moléculas recombinantes presentaban tramos cortos de homología a ambos lados del punto de corte (Figura 37), sugiriendo que su formación estuvo guiada por microhomologías. Nos planteamos analizar si el mecanismo mediante el cual se estaban originando estos recombinantes precisaba de nueva síntesis de DNA, lo que indicaría que podrían estarse formando por mecanismos como HR o SSA. Para ello añadimos dCTP marcado radiactivamente a ensayos DSB estándar y sin Mg2+, con el fin de determinar si el sistema era capaz de realizar dicha síntesis de novo. El análisis de los MsH42 PP G AGGCTGGGAGAG TGGG Recombinantes aislados en ensayos con Mg 2+ GGA GG GAG GCTGGGAGAGGCTGGGAGAG TTGCTG CTGGGAG GCTGGGAGAG 283 pb 168 pb 199 pb 487 pb 160 pb 286 pb 436 pb 407 pb 238 pb 289 pb GGGA GCTGGGAGAGGCTGGGAGAGCTG Recombinantes aislados en ensayos sin Mg 2+ G 178 pb 34 pb 678 pb 508 pb MsH42 PP Figura 37. Recombinantes obtenidos en el ensayo DSB. El esquema representa el conjunto de las moléculas recombinantes obtenidas tanto en presencia como en ausencia de Mg2+, empleando extracto nuclear de testículo y el fragmento f42P (parte superior) como sustrato. Los recombinantes se muestran a escala con respecto a la región minisatélite. Las líneas punteadas denotan delecciones (se indica su tamaño) en la molécula recombinante con respecto al sustrato f42P original. Las cajas indican zonas de homología, cuya secuencia se muestra, flanqueando el punto de corte. ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 99 productos de estos ensayos mostró que los fragmentos DSB aparecían marcados en la reacción estándar (Figura 38), demostrando que efectivamente el nucleótido marcado se estaba incorporando al DNA en nuestro sistema in vitro. Por el contrario, no se observó marcaje en las reacciones sin Mg2+, lo que se puede explicar por la dependencia de este catión por parte de las DNA polimerasas. Aunque el extracto era capaz de realizar síntesis de DNA, todavía restaba por establecer si ésta era necesaria para la formación de las moléculas recombinantes detectadas en nuestro ensayo. Para ello realizamos experimentos en los que se eliminaron los dNTPs del tampón DSB, a la vez que se adicionaban ddNTPs, que bloquean la síntesis de DNA. La ausencia de incorporación de dCTP en el ensayo DSB puso de manifiesto que, bajo estas condiciones, la síntesis de novo está bloqueada (Figura 38), pero el patrón de bandas DSB fue igual al obtenido en condiciones estándar. El hecho de que se pudiesen obtener recombinantes a partir de los productos de los ensayos con y sin Mg2+ en condiciones en que la síntesis de DNA está fuertemente inhibida, es una sólida evidencia de que los procesos de síntesis de DNA no están implicados en la generación de, al menos, parte de las moléculas recombinantes originadas durante el ensayo DSB. El marcaje que detectamos en la reacción estándar era probablemente debido al relleno de extremos 3´-recesivos producidos por exonucleasas (Mason et al., 1996) o por procesos de nick translation. Si consideramos conjuntamente que para la formación de recombinantes no se requiere síntesis de DNA, la presencia de delecciones en la gran mayoría de las moléculas recombinantes y la existencia de secuencias homólogas cortas a ambos lados del punto de corte, podemos concluir que la HR no parece ser el mecanismo de formación de los Sin Mg 2+ -dNTPS + ddNTPs F std f42P f42P Figura 38. Síntesis de DNA en el ensayo DSB. Se realizaron una serie de experimentos donde se incorporó dCTP en ensayos DSB en condiciones estándar (std), en reacciones sin Mg2+ (-Mg2+) o en reacciones sin dNTPs y con ddNTPs (-dNTPs / +ddNTPs). F, fragmento f42P sin extracto. El panel superior muestra el gel teñido con bromuro de etidio y el inferior la autorradiografía obtenida a partir del mismo gel. ______________________DSBs en el minisatélite MsH42_______________________ ________________________________________________________________ 100 recombinantes detectados en nuestro ensayo, ya que ésta se caracteriza por la implicación de síntesis de novo de DNA y por dar lugar a productos recombinantes que son normalmente iguales a los originales. La actividad que da lugar a las moléculas recombinantes sería diferente a las descritas anteriormente en otros ensayos in vitro, donde sí se ha constatado el concurso de eventos de síntesis de DNA para la generación de moléculas recombinantes (Singleton & Jeggo, 1999; Pospiech et al., 2001). Las delecciones y la presencia de secuencias duplicadas a ambos lados del DSB podrían hacer pensar en mecanismos del tipo SSA (Göttlich et al., 1998) o NHEJ guiado por microhomologías (Boulton & Jackson, 1996) como responsables de la generación de los recombinantes detectados, pero la ausencia de requerimiento de síntesis de DNA descartaría en principio al primero de estos procesos. Por lo tanto, el modelo que mejor se ajusta a nuestras observaciones es el NHEJ, que se encontraría facilitado por pequeñas regiones de homología en las secuencias adyacentes al punto de generación del DSB. La naturaleza repetitiva de nuestra secuencia haría especialmente efectiva esta forma de recombinación, ya que la similitud entre las unidades repetitivas de MsH42 e incluso determinados motivos ricos en guanina de las secuencias adyacentes permite múltiples opciones de emparejamiento homólogo. No podemos descartar, sin embargo, que puedan estar ocurriendo otro tipo de procesos recombinatorios que hayan pasado inadvertidos en nuestro análisis. El sistema que acabamos de describir nos ha permitido el estudio de la generación de DSBs en la región MsH42 y de la formación de moléculas recombinantes por NHEJ. Hemos visto como los extractos nucleares poseen actividades endonucleásicas capaces de producir DSBs en un fragmento que comprende a la región MsH42 en condiciones tanto de presencia como de ausencia del catión Mg2+. La principal actividad endonucleásica en condiciones estándar muestra una gran preferencia por secuencias ricas en guanina y todos los indicios de que disponemos apuntan a que tal enzima es la endonucleasa G. La actividad independiente de Mg2+ parece deberse a un enzima distinto de la endonucleasa G, pero que no hemos sido capaces de identificar. Además, hemos detectado eventos recombinatorios en este mismo ensayo DSB, caracterizados esencialmente por la no necesidad de síntesis de DNA, por la aparición de delecciones en los recombinantes y por la presencia de regiones cortas de homología flanqueando a las delecciones en la mayoría de ellos. Estas propiedades apoyan la premisa de un mecanismo de tipo NHEJ favorecido por microhomologías como el responsable de la formación de las moléculas recombinantes observadas. Todo este conjunto de datos puede permitirnos explicar los resultados obtenidos anteriormente en nuestro laboratorio acerca de la capacidad recombinogénica de MsH42. ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 101 Una paradoja en los ensayos DSB Generación de DSBs vs. Ligación de extremos de DNA (end-joining) Desde hace años, el estudio de muchos de los procesos de reparación de DNA se ha venido realizando, entre otras metodologías, mediante ensayos de ligación de extremos de DNA (DNA end-joining) in vitro. Este tipo de experimentos consisten en la incubación de un determinado DNA lineal, empleado como sustrato, junto con proteínas que catalizan la ligación de sus extremos. Estas proteínas pueden añadirse ya purificadas a la reacción (Ramsden & Gellert, 1998; Van Dyck et al., 1999) o bien en forma de un extracto proteico crudo o nuclear (North et al., 1990; Nicolas & Young, 1994). En la Figura 39 se muestran esquemáticamente los resultados que se pueden obtener al incubar un sustrato de DNA con un extracto proteico nuclear. En un caso, que denominamos ensayo DSB, se produce mayoritariamente la degradación del DNA mientras que en el ensayo de end-joining tiene lugar la multimerización o circularización del sustrato inicial. Existen todo un conjunto de investigaciones que se basan en la adición de extractos poco o nada fraccionados a un DNA sustrato, y cuya aportación al conocimiento de los sistemas de reparación de DNA mediante NHEJ ha sido notoria. Un buen ejemplo es el trabajo de Baumann & West (1998), quienes desarrollaron el primer sistema de ligación de extremos de DNA in vitro donde se demostraba que la capacidad del ensayo para realizar NHEJ era dependiente de proteínas como Ku70, Ku80, la subunidad catalítica de la proteín-kinasa DNA dependiente (DNA-PKcs), la DNA ligasa IV y XRCC4. Estos factores son imprescindibles para el funcionamiento normal del NHEJ in vivo y la implicación de algunos de ellos en esta vía de reparación ya se había deducido por estudios genéticos previos (Blunt et al., 1995; Grawunder et al., 1997; Singleton et al., 1997). Posteriormente, el uso de una metodología similar permitió relacionar otras proteínas como BRCA-1 (Zhong et al., 2002), la DNA polimerasa α (Pospiech et al., 2001) o la polinucleótido kinasa humana (Chappell et al., 2002) con el NHEJ. Durante la puesta a punto del ensayo DSB, llamaron nuestra atención las profundas diferencias entre el tipo de resultados obtenidos en nuestro ensayo con respecto a los presentados por otros autores en trabajos basados en sistemas de end-joining in vitro, máxime teniendo en cuenta que las metodologías empleadas en ambos experimentos son esencialmente las mismas. En el ensayo DSB realizado en nuestro laboratorio, el DNA es degradado de una forma relativamente rápida y se detecta una baja formación de multímeros lineales o moléculas circulares (Figura 25). Por el contrario, en la mayoría de los ensayos de end-joining, las moléculas de DNA son ligadas de forma eficiente tanto intra como intermolecularmente, sin apenas degradación del DNA (Mason et al., 1996; Baumann & West, 1998; Sathees & Raman, 1999; Feldmann et al., 2000; Pospiech et al, 2001; Chappel et al., 2002; Odersky et al,. 2002; Zhong et al., 2002; Diggle et al., 2003). En la Tabla 7 se hace un análisis comparativo entre las características de los ensayos de end-joining realizados por varios autores y las de nuestro ensayo DSB. A primera vista, parece extraño que en ninguno de los ensayos arriba mencionados apenas se pudiese apreciar la actividad nucleásica endógena que con _______________________________Paradojas_______________________________ ________________________________________________________________ 102 toda seguridad deben poseer los extractos empleados y que nosotros observábamos con tanta claridad. Este hecho resultó aún más llamativo al constatar que en la mayoría de estos trabajos se incubaban cantidades en el rango de pocos ng de DNA con decenas de µg de proteína. Se nos planteaba de           Incubación Degradación del sustrato (Ensayo DSB) Generación de productos de ligación (Ensayo de End-Joining) Sustrato Productos de degradación Productos de ligación lineales SustratodeDNA Extractoproteico Productos de ligación circulares Figura 39. Comparación entre el ensayo DSB y el ensayo de end-joining. Se muestra una representación de estos dos tipos de experimentos. Ambos implican la incubación de un determinado sustrato de DNA con un extracto proteico. Sin embargo, los procesos que suceden en cada uno de ellos son diferentes, ya que los productos finales son totalmente opuestos. En el caso del ensayo DSB, el DNA es degradado generando un patrón de bandas característico. En los ensayos de end-joining, el DNA sufre procesos de ligación de extremos que conducen a su multimerización o la formación de moléculas circulares. En determinadas situaciones, pueden ocurrir simultáneamente la degradación y la multimerización del fragmento (panel derecho), indicando que ambos procesos no son excluyentes. ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 103 esta forma una paradoja para la que no teníamos una explicación evidente: ¿cómo era posible que cuando se incubaban cantidades relativamente elevadas de DNA con un extracto proteico, caso de nuestro ensayo DSB, el DNA se degradase mientras que si la cantidad de DNA era proporcionalmente mucho menor este DNA resistía ante la actividad nucleásica y era además ligado por sus extremos? Para dar respuesta a esta cuestión, decidimos investigar qué era lo que podría estar influenciando en la prevalencia de la actividad ligasa o nucleasa en cada caso. Tabla 7. Características de diversos ensayos de end-joining comparados con nuestro ensayo DSB. DNA sustrato Extracto proteico Fuente de los datos Tipo Tamaño (pb) Cantidad (ng) (fmol) Tipo* y origen Cantidad (µg) Relación D NA/proteína (fmol/µg) Principales productos obtenidos† Proporción relativa en nuestro ensayo‡ Baumann & West, 1998 pFB585 linearizado 7700 100.00 20.00 Crudo, línea linfoblastoide humana GM00558 68 0,29 Mult. 804.62 Sathees & Raman, 1999; Raghavan & Raman, 2004 pUC12 linearizado 2680 600.00 344.46 Crudo, testículo de ratón 60 5,74 Mult. 40.65 Feldmann et al., 2000 Derivado de pSP65 linearizado 3000 15.00 7.70 Crudo, línea CHO 70 0,11 OC, CCC 2121.27 Pospiech et al., 2001 Derivado de M13mp18 linearizado 7500 100.00 20.25 Crudo, HeLa 75 0,27 Mult. 864.22 Chappel et al., 2002 pACSG2 linearizado 5500 40.00 11.20 Crudo, línea linfoblastoide humana GM00558 80 0,14 Mult. 1666.71 Odersky et al., 2002 Derivado de pUC19 linearizado 2727 10.00 5.60 Crudo, línea CHO-K1 70 0,08 OC, CCC, Dim. 2916.75 Zhong et al., 2002 pBSK(+) linearizado 2960 9.62 5.00 Crudo, fibroblastos embrionarios de ratón 20 0,75 Mult. 311.12 Diggle et al., 2003 pGEM3zf+ linearizado 3200 20.00 9.60 Crudo, varias líneas y tejidos humanos 40 0,24 Mult. 972.25 Nuestro ensayo DSB estándar Fragmento lineal f42P 863 1500.00 2800.08 Nuclear, testículo de rata 12 233,34 Degradación 1.00 * Por crudo, se entienden extractos proteicos obtenidos a partir de la lisis de células completas sin fraccionamiento de ningún tipo. † Mult., multímeros lineales; OC, moléculas circulares relajadas; CCC, moléculas circulares covalentemente ligadas; Dim., dímeros lineales. ‡ Esta proporción se calcula como el cociente entre la relación DNA/proteína en nuestro ensayo DSB dividida por la relación DNA/proteína del ensayo en cuestión. _______________________________Paradojas_______________________________ ________________________________________________________________ 104 Efecto de la adición de histona H1 al ensayo DSB Uno de los primeros aspectos que necesitábamos dilucidar era si la escasa actividad de ligación que detectábamos en nuestros experimentos se debía a una carencia en DNA ligasas de nuestro extracto derivada del protocolo empleado para su preparación o bien si era consecuencia del propio método de ensayo. Para comprobar este punto, decidimos incorporar al ensayo DSB estándar cantidades crecientes (0.01-1 µg) de la histona H1 (H1), ya que se había descrito su capacidad para estimular la actividad de ligación intermolecular de la T4 DNA ligasa (Sobczac & Duguet, 1988) y de las DNA ligasas III y IV de mamíferos (Yamanaka et al., 2002). Como se observa en la Figura 40, la adición de H1 tuvo dos efectos notables en el resultado de nuestro ensayo DSB: i) se favoreció la multimerización del sustrato f42P, existiendo un óptimo de cantidad de H1 (600 ng) a partir del cual se produce una disminución de la tasa de ligación intermolecular; ii) se detectó una fuerte inhibición de la actividad nucleásica, que provocó una desaparición progresiva del patrón de bandas correspondientes a los productos originados por DSBs. Ambos hechos pusieron de manifiesto que la adición de H1 no sólo potenciaba la multimerización del sustrato sino que además impedía su degradación. Resultados previos han puesto de manifiesto la capacidad de H1 para formar complejos nucleproteicos largos que reúnen a las moléculas de DNA (Yamanaka et al., 2002), de modo que la resistencia a la degradación podría deberse a que el ácido nucleico es inaccesible para las nucleasas cuando se halla incluido en dichos complejos. En nuestro experimento puede apreciarse como la protección del DNA se va adquiriendo de forma gradual, desapareciendo progresivamente el patrón de bandas originadas por DSBs, hasta llegar a un punto donde la degradación es mínima y la multimerización máxima. A este nivel, las moléculas de DNA probablemente estarían recubiertas casi en su totalidad por H1, aunque existiendo suficiente margen en sus extremos como para facilitar la actividad de las ligasas. Si se continúa incrementando la cantidad de H1, la protección alcanza los extremos de los sustratos, con lo que se produce un descenso de la actividad ligasa y la consiguiente reducción en la multimerización del fragmento f42P. Estos resultados dan respuesta a la pregunta inicial, al demostrar la presencia de una actividad ligasa en el extracto que es plenamente funcional bajo las condiciones estándar del ensayo DSB. Para verificar que el efecto de H1 era específico de esta histona y no debido a una neutralización de las cargas de los fosfatos del DNA, decidimos comparar su efecto con el de otras histonas y el de una poliamina. Para ello, se realizaron una serie de reacciones estándar del ensayo DSB a las que se incorporaron separadamente distintas cantidades (6, 60 ó 600 ng) de H1, histona H3 (H3), poliarginina o de una mezcla equimolecular de las histonas H1, H2A, H2B, H3 y H4. Como se muestra en la Figura 41, la ligación intermolecular es mucho más elevada en el ensayo con 0.6 µg de H1 que con cualquiera de las otras proteínas ensayadas, coincidiendo con el mayor descenso en la degradación del fragmento f42P. La misma cantidad de H3 o de la mezcla de histonas apenas produjo un leve incremento en la cantidad de dímeros formados a partir de f42P con respecto a la reacción estándar. En estas mismas reacciones pudo apreciarse una cierta caída en la formación de productos generados por DSBs, aunque la actividad nucleásica no ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 105 resultó totalmente bloqueada. El efecto de 0.6 µg de poliarginina no pudo detectarse mediante este sistema ya que probablemente esta poliamina arrastrase consigo al DNA a la fase orgánica durante la extracción de los productos del experimento antes de la electroforesis. Como control adicional, también se utilizaron otras proteínas como BSA o IgG de ratón en un rango desde 0.01 hasta 10 µg por reacción, sin observarse alteración alguna del nivel de degradación del fragmento o de su multimerización (datos no mostrados). MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 Ensayo DSB Productos DSB Actividad nucleásica MsH42  H1 H1 H1 H1 H1 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 MsH42 La actividad nucleásica no es afectada por cantidades bajas de H1 Actividad DNA ligasa Multímeros del fragmento f42P Reducción de los multímeros 10 100 200 400 600 800 1000--H1 (ng) Extracto - ++++++++ El aumento de H1 bloquea la actividad nucleásica y favorece la multimerización Dímero Actividad nucleásica Niveles elevados de H1 bloquean la multimerización al cubrir los extremos del DNA M Productos DSB Productos DSB f42P Dímero Trímero Multímeros f42P MsH42 MsH42 MsH42 H1 MsH42  H1 H1 H1 MsH42  H1 MsH42 H1 H1 H1 H1 H1 H1   Extremo libre Extremo libre H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 Actividad DNA ligasa H1 H1 H1 H1 H1 MsH42 H1 H1 H1 H1 H1 H1 H1 Figura 40. Efecto de la adición de histona H1 al ensayo DSB. En la parte superior se muestra el resultado del análisis por electroforesis en gel de agarosa al 2% de los productos obtenidos en una serie de ensayos DSB a los cuales se han añadido las cantidades indicadas de H1. En la imagen pueden apreciarse las moléculas generadas a partir de DSBs (productos DSB), así como los dímeros, trímeros y multímeros lineales del sustrato f42P. En la parte inferior de la figura se presentan esquemas interpretativos de los resultados. Las tijeras representan proteínas con actividad endonucleásica y las esferas moradas representan moléculas de H1. _______________________________Paradojas_______________________________ ________________________________________________________________ 112 et al., 1981; Ruiz-Carrillo & Renaud, 1987; Gottlieb & Muzyczka, 1990; Evans & Aguilera, 2003). Además, estos cationes pueden potenciar la ligación de moléculas de DNA a concentraciones moderadas (~ 50 mM) (Sambrook & Russell, 2001). Para verificar si esta sería una aproximación útil, realizamos una serie de ensayos DSB con concentraciones crecientes de KCl. Como se muestra en la Figura 45A, el incremento en la concentración de KCl hasta niveles de ~ 50 mM KCl provoca una disminución de la degradación del sustrato y la potenciación de la ligación intermolecular. Por encima de este punto, la actividad de multimerización también se ve afectada y desciende progresivamente. Este resultado es bastante similar al obtenido con H1 (Figura 40), aunque en este caso el efecto está producido por una inactivación de las principales actividades nucleásicas del extracto por aumento de la fuerza iónica. También descubrimos que un modo de detectar los procesos de ligación frente a los de degradación en nuestro ensayo DSB era el de emplear tiempos de incubación muy cortos (2 min). En este intervalo de tiempo ya se ha producido una población considerable de dímeros y trímeros, mientras que apenas se han puesto en marcha los procesos de degradación (Figura 45B). A medida que se prolonga el tiempo de incubación, tanto el sustrato original como los sus multímeros son blanco de la actividad nucleásica que termina por degradarlos para dar lugar al patrón de bandas DSB. Los ensayos in vitro de DNA endjoining son un método sencillo y rápido que ha sido ampliamente utilizado para estudiar procesos de reparación del DNA, especialmente el NHEJ (Labhart, 1999). Actualmente siguen apareciendo nuevas variantes y refinamientos de este tipo de experimentos que permiten Productos DSB f42P OC Dímero Trímero Multímeros Fstd KCl (mM) F tiempo 6 12 24 48 72 96 120 2´ 10´ 20´ Figura 45. Ensayos DSB con distintas concentraciones de KCl o tiempos de incubación cortos. Se muestran los análisis electroforéticos en geles de agarosa al 2% de distintos ensayos DSB. A. Efecto de la concentración de KCl. B. Efecto del tiempo de incubación. Las condiciones de reacción fueron las estándar, incubando durante los tiempos indicados. F, fragmento sin extracto; std, reacción estándar; OC, monómero circular relajado. ____________________________Resultados y Discusión________________________ ________________________________________________________________ 113 nuevas variantes y refinamientos de este tipo de experimentos que permiten representar mejor los procesos de reparación del DNA in vivo (Ma et al., 2004; Pfeiffer et al., 2005). En este sentido, en un artículo reciente se conjuga la metodología de este tipo de ensayos con la gran sensibilidad de la PCR cuantitativa para aumentar el nivel de detección de los eventos de endjoining (Budman & Chu, 2005). En nuestro estudio hemos demostrado que uno de los parámetros de reacción, la relación DNA/proteína, puede condicionar de manera crucial cuál será el proceso bioquímico predominante en el experimento, degradación de las moléculas de sustrato o ligación de los extremos del mismo, tanto intramolecularmente como de manera intermolecular. Las soluciones concretas que hemos propuesto para mejorar la actividad de ligación en los ensayos podría ser útil en aquellos casos donde sea necesario trabajar con extractos que procedan de tejidos o líneas celulares con una fuerte actividad nucleásica endógena, como la línea linfoblastoide GM06315 (Baumman & West, 1998). A modo de conclusión, podemos decir que un ensayo DSB y un ensayo de endjoining son las dos facetas de un mismo experimento y que el factor crucial que lo modula, haciendo que el sistema que se decante en uno u otro sentido, es un bloqueo de la actividad nucleásica sobre el sustrato. En este trabajo hemos mostrado cuatro formas de cómo ejecutar este bloqueo: i) protección del sustrato mediante la adición de proteínas que se unan a él; ii) protección del sustrato mediante el mantenimiento de una relación DNA/proteína suficientemente baja; iii) inhibición directa de la actividad nucleásica, mediante un incremento en la concentración de KCl; iv) limitando el tiempo de actuación de la actividad nucleásica y aprovechando que, al menos en nuestro sistema, los procesos de ligación son más rápidos. Conclusiones ______________________________Conclusiones______________________________ ___________________________________________________________________ 117 De los resultados presentados en esta Tesis Doctoral, las principales conclusiones que hemos obtenido son: 1) MsH42 es un minisatélite que se originó durante la evolución de los primates antes de la divergencia entre platirrinos y catarrinos (~ 40 millones de años) dentro del intrón 13 del gen Q8WUJ3. Este minisatélite ha evolucionado probablemente mediante eventos como inserciones/delecciones, mutaciones sencillas y procesos de expansión y contracción mediados por entrecruzamiento desigual y/o deslizamiento de cadena durante la replicación. El polimorfismo de este minisatélite en las poblaciones actuales de gorila, chimpancé y del ser humano parece haberse generado a partir de un único alelo ancestral. 2) El minisatélite MsH42 es degradado por nucleasas específicas en ensayos DSB. Estos experimentos nos han llevado a caracterizar dos rutas para la generación de cortes en el fragmento de DNA empleado como sustrato. Una de estas vías implica la actuación de una nucleasa específica Mg2+-dependiente sobre los abundantes tramos de guaninas que existen en la región MsH42, tratándose muy probablemente de la endonucleasa G. La otra vía se basa en una actividad Mg2+- independiente que también es capaz de degradar la región minisatélite, pero que a diferencia de la anterior parece actuar principalmente fuera del minisatélite. 3) Las diferencias observadas en el resultado de los ensayos DSB y de end-joining, predominancia de eventos de degradación frente a los de ligación y viceversa, están influenciadas por la relación DNA/proteína que se emplea en el ensayo. Bibliografía _______________________________Bibliografía______________________________ ________________________________________________________________ 121 Abe, S., Katagiri, T., Saito- Hisaminato, A., Usami, S., Inoue, Y., Tsunoda, T. & Nakamura, Y. (2003a) Identification of CRYM as a candidate responsible for nonsyndromic deafness, through cDNA microarray analysis of human cochlear and vestibular tissues. Am. J. Hum. Genet. 72, 73-82. Abe, S., Usami, S. & Nakamura, Y. 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Además, hay un tercer artículo que se encuentra bajo revisión para su publicación: Blanco, M. G., Boán, F., Barros, P. & Gómez-Márquez, J. (2005) Analysis of DNA double-strand breaks generated by two independent enzymatic activities in nuclear extracts. En revision para J. Mol. Biol.