Validación y estudio de la implicación de los genes ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 y ATP6V0E en el carcinoma oral de células escamosas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

FACULTADE DE MEDICINA E ODONTOLOXÍA Departamento de Estomatoloxía VALIDACIÓN Y ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE LOS GENES ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 Y ATP6V0E EN EL CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS MEDIANTE PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL TESIS DOCTORAL EVA MARÍA OTERO REY Santiago de Compostela, enero de 2006 FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA VALIDACIÓN Y ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE LOS GENES ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 Y ATP6V0E EN EL CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS MEDIANTE PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL Autora: EVA MARÍA OTERO REY Santiago de Compostela, 20 de Enero de 2006. D. ABEL GARCÍA GARCÍA, Profesor Titular de Cirugía Oral y Maxilofacial de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela; D. FRANCISCO BARROS ANGUEIRA, Doctor en Biología y Jefe de Laboratorio de la Fundación Pública Galega de Medicina Xenómica del Sergas; y D. JOSÉ MANUEL SOMOZA MARTÍN, Doctor en Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN: Que la presente Tesis Doctoral titulada “VALIDACIÓN Y ESTUDIO DE LA IMPLICACIÓN DE LOS GENES ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 Y ATP6V0E EN EL CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS MEDIANTE PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL”, ha sido elaborada por Dña. EVA MARÍA OTERO REY bajo nuestra dirección, y hallándose concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser defendida ante el Tribunal correspondiente. Y para que así conste, se expide la presente certificación en Santiago de Compostela, a 20 de Enero de 2006. Prof. Dr. D. Abel García García Dr. D. Francisco Barros Angueira Dr. D. José Manuel Somoza Martín El presente trabajo de investigación ha sido realizado en el contexto del proyecto de investigación: EXPRESIÓN GENÉTICA DIFERENCIAL EN CÉLULAS EPITELIALES DE LESIONES PREMALIGNAS Y CARCINOMAS EPIDERMOIDES DE LA CAVIDAD ORAL Financiación: Xunta de Galicia (PGIDT01PXI20804PR) Director del proyecto e investigador principal: Prof Abel García García (Universidad de Santiago de Compostela) AGRADECIMIENTOS: Al Profesor Abel García García, por ser el promotor de esta investigación y por la amistad, confianza y cariño que me ha demostrado a lo largo de estos años. Al Dr. Francisco Barros Angueira, por su inestimable ayuda y aportación a esta Tesis Doctoral y por su dedicación a la investigación. Al Dr. José Manuel Somoza Martín, por su apoyo en este y otros trabajos realizados, así como por su paciencia y ayuda constante. Al Profesor José Manuel Gándara Rey, por su gran aportación docente a mi formación y por su continua dedicación a la enseñanza. Al Profesor Andrés Blanco Carrión, una de las mejores personas que conozco y con la que tengo la suerte de trabajar día a día. A Manuel Peñamaría Mallón, compañero y amigo, que ha estado siempre dispuesto a prestar su ayuda de forma desinteresada. A todos mis compañeros del Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e ÍNDICE 10 2.- Bases moleculares del cáncer 41 2.1. La maquinaria de proliferación celular 41 2.1.1. Ciclo celular 42 2.1.2. Regulación del ciclo celular 44 2.2. Oncogenes, genes supresores tumorales 46 2.3. Adaptaciones celulares, lesión y muerte celular 51 2.4. La maquinaria de muerte celular 59 2.4.1. Apoptosis 60 2.4.2. Genes reguladores de la apoptosis 61 2.5. Diferencias entre las células normales y las células cancerosas 62 2.6. Carcinogénesis 64 2.7. Angiogénesis 66 2.8. Técnicas de biología molecular 68 3.- Bases moleculares del carcinoma oral de células escamosas 75 3.1. Carcinoma oral de células escamosas y microarrays de ADN 76 3.2. Genes sobreexpresados en el carcinoma oral de células escamosas según un estudio con el array Atlas Glass Human 3.8 I Microarray 78 10 ÍNDICE 11 4.- Validación de los resultados obtenidos con microarrays de ADN 107 4.1. PCR cuantitativa en tiempo real 108 II. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS 113 III. MATERIAL Y MÉTODO 117 1.- Selección de pacientes 119 1.1. Edad y sexo 119 1.2. Consumo de tabaco 119 1.3. Localización del tumor 120 1.4. Estadio del tumor 120 2.- Selección de los genes a estudio 121 3.- Metodología de trabajo 122 3.1. Obtención de las muestras 122 3.2. Procesado de las muestras 123 3.3. Cuantificación por PCR en tiempo real 124 4.- Normalización de datos 127 5.- Análisis del nivel de expresión 129 6.- Estudio estadístico 129 11 ÍNDICE 12 IV. RESULTADOS 131 1.- Estudio de los genes 133 1.1.- ADRBK2 (adrenergic, beta, receptor kinase 2) 133 1.2.-ADRB1 (adrenergic, beta-1-, receptor) 135 1.3.-ADRA2B (adrenergic, alpha-2B-, receptor) 137 1.4.- AXIN 2 139 1.5.- ATP6V1C1(ATPase, H+ transporting, lysosomal 42KDa, V1 subunit C, isoform 1) 141 1.6.-ATP6V0E (ATPase, H+ transporting, lysosomal 9KDa, V0 subunit e) 143 2.- Normalización de datos 145 2.1.- ADRBK2 (adrenergic, beta, receptor kinase 2) 145 2.2.-ADRB1 (adrenergic, beta-1-, receptor) 146 2.3.-ADRA2B (adrenergic, alpha-2B-, receptor) 147 2.4.-AXIN 2 148 2.5.-ATP6V1C1(ATPase, H+ transporting, lysosomal 42KDa, V1 subunit C, isoform 1) 149 2.6.-ATP6V0E (ATPase, H+ transporting, lysosomal 9KDa, V0 subunit e) 150 12 ÍNDICE 13 3.- Análisis del nivel de expresión 151 V. DISCUSIÓN 155 VI. CONCLUSIONES 177 VII. BIBLIOGRAFÍA 181 VIII. ANEXOS 209 13 15 JUSTIFICACIÓN 16 JUSTIFICACIÓN 17 Cada año más de 300.000 nuevos casos de carcinoma oral de células escamosas (COCE) son diagnosticados en todo el mundo (1). De éstos, aproximadamente 50.000 casos ocurren en Estados Unidos y Europa (2). En España, la incidencia del cáncer oral es de 12 a 15 casos/100.000 habitantes/año en varones y de 2 a 4 casos/100.000 habitantes/año en mujeres, y representa entre el 2 y el 3% de todas las muertes por cáncer en nuestro país (3). Estudios epidemiológicos recientes (4) han demostrado un aumento de la mortalidad anual por cáncer oral, de un 25% para los hombres y de un 9% para las mujeres, durante el período de 1975-1994, lo que hace que el cáncer oral deba ser considerado un problema de salud pública en España (5). Desafortunadamente, los rasgos clínico-patológicos de la enfermedad son la única medida disponible para predecir su pronóstico, guiar el tratamiento y aconsejar a los pacientes. El tratamiento convencional, ya sea con cirugía, radioterapia y/o quimioterapia, está asociado con una elevada morbilidad afectando el habla, la deglución y, en general, la calidad de vida del paciente. Pese a los avances en estas intervenciones, la recurrencia de la enfermedad se observa en más del 50% de los pacientes con altas tasas de mortalidad asociada (6). Esto viene acompañado del hecho de que mientras nuestra habilidad para controlar localmente la enfermedad ha progresado, la tasa total de supervivencia a los 5 años no ha mejorado significativamente en las pasadas tres décadas. El COCE, como enfermedad neoplásica de etiología multifactorial, es una de las enfermedades más heterogéneas. Aunque existen diversos factores de 17 JUSTIFICACIÓN 18 riesgo, los más importantes son el tabaco y el alcohol, potenciando su acción cuando se consumen conjuntamente. Sin embargo, pese a los esfuerzos para identificar biomarcadores, ningún marcador específico puede ser usado con confianza en la detección precoz o como indicador de prognosis. El estadiaje de la enfermedad se basa en la actualidad únicamente en los hallazgos clínicos de localización, con atención a complicaciones locales, regionales y a distancia. Aunque el estadiaje tiene un fuerte valor predictivo con respecto a la probabilidad de supervivencia, los problemas asociados a su aplicación ponen en evidencia la necesidad de un refinamiento del sistema y de la identificación de factores pronósticos adicionales. Son las limitaciones de las características clínicas en pacientes con cáncer oral las que han llevado a la búsqueda de biomarcadores de pronóstico por parte de diversos grupos de investigación. Inicialmente los esfuerzos se centraron en marcadores individuales, como p53, queratinas o p16, pero su utilidad es limitada dada su penetrancia incompleta y expresión variable (7). Es por ello que los esfuerzos recientes se han centrado en el análisis de los cambios de expresión génica global con la esperanza de identificar cambios asociados con la carcinogénesis en estos tumores, y de identificar firmas genéticas específicas que permitan predecir las consecuencias de la enfermedad (8). El proyecto Genoma Humano ha sido el catalizador para el desarrollo de tecnologías de alta productividad que han permitido mapear y secuenciar genomas complejos. En los últimos años tales tecnologías se han extendido hasta permitir la medida de la expresión relativa de miles de genes simultáneamente en un único experimento. La plataforma con mayor responsabilidad en esta nueva frontera de la investigación genómica es la de microarrays de ADN, también conocida como chip de ADN o chip génico. Actualmente existe una gran variedad de tipos de microarrays de ADN en el mercado, pero todos se basan en el principio de tomar una librería representativa de fragmentos de ADN de un 18 JUSTIFICACIÓN 19 genoma complejo e imprimir dichos productos a intervalos regularmente espaciados sobre una superficie sólida. La lista de productos que pueden imprimirse varía desde segmentos específicos de cromosomas y librerías de ADN complementario (ADNc) hasta librerías de promotores. En el caso de los microarrays de ADNc, la mayoría de las metodologías se basan en el diferente marcaje fluorescente de dos grupos de ARN mensajeros (uno del tumor y otro del mismo tejido sano) mediante transcripción reversa para generar ADNc marcado. Estas moléculas de ADNc se hibridan a ADNc inmovilizados sobre la superficie del microarray, permitiendo el análisis en paralelo de cientos o miles de genes impresos sobre un único microarray. Se logra así una herramienta poderosa para observar cambios en la expresión génica a lo largo de genomas completos. Es conocido que distintas plataformas y metodologías de arrays pueden proporcionar resultados diferentes, incluso contradictorios. Estos extremos se exacerban por el uso de tamaños muestrales pequeños, consecuencia natural del alto coste de las técnicas. Pese a todo, la evidencia sugiere que el empleo de plataformas de microarrays con una metodología similar proporciona datos seguros y reproducibles de la expresión génica diferencial (9). Es por ello que se ha impuesto la necesidad de confirmar los resultados por una metodología más robusta a la hora de medir diferencias de expresión, entre las que destaca la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) (10). Nosotros realizamos un estudio previo en nuestra unidad acerca del análisis de la expresión génica diferencial del COCE en relación al tejido oral normal mediante microarrays de ADN (11). Decidimos centrarnos en los genes que muestran un aumento de actividad o sobreexpresión en el tejido tumoral y dentro de éstos, seleccionamos 6 de ellos que cumplen una serie de parámetros estadísticos y que pueden ser interesantes dada su función biológica. Los genes seleccionados son: ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 y ATP6V0E. 19 INTRODUCCIÓN 26 dímeros de pirimidina. Otros factores ambientales y la exposición a diversos virus como el virus del herpes simple tipo 1 (VHS-1) (29), el papilomavirus humano (PVH) y el virus de Epstein-Barr pueden producir o promover el cáncer de la cavidad oral y de la nasofaringe. El virus de Epstein-Barr está asociado al linfoepitelioma de nasofaringe (carcinoma indiferenciado de nasofaringe), encontrándose títulos de IgA elevados frente a dicho virus en pacientes que padecen esta enfermedad. En cuanto al PVH, se ha detectado su ADN en las células del carcinoma oral (13), del de amígdalas y de laringe. Los tipos más frecuentemente relacionados con estos tumores son PVH-16 y PVH-18. Estos virus poseen entre sus genes oncogenes y un gen que codifica una proteína (E6) que bloquea la actividad reguladora del gen p53 (30, 31, 32, 33, 34, 35). La aparición de tumores de la cavidad oral en pacientes jóvenes y en pacientes no fumadores sugiere el papel de una predisposición genética. En estos casos se han detectado mutaciones en genes supresores tumorales como p53, gen en el que con mayor frecuencia aparecen mutaciones asociadas con el cáncer (34, 35, 36, 37). A pesar de que conocemos la implicación de todos los factores etiológicos mencionados, el desarrollo del COCE es un proceso multifactorial con gran variabilidad entre unos individuos y otros. Hoy sabemos que el desarrollo del cáncer en el hombre está determinado por una compleja sucesión de eventos que normalmente tienen lugar a lo largo de muchos años. Parece claro que los factores genéticos y moleculares son decisivos en la carcinogénesis; por ello, se espera que un mejor conocimiento de los determinantes moleculares de la carcinogénesis oral mejore el diagnóstico, tratamiento y control de la enfermedad. El conocimiento de la historia natural del COCE es fundamental para comprender su evolución, diagnóstico, tratamiento y pronóstico. Se trata de una 26 INTRODUCCIÓN 27 neoplasia maligna que deriva del epitelio poliestratificado plano que tapiza la cavidad oral. Inicialmente se localiza en el propio epitelio (carcinoma in situ). Con el tiempo, sobrepasa la membrana basal invadiendo el tejido conjuntivo y destruyendo estructuras vecinas como músculos, hueso, glándulas salivales, etc. Este proceso de crecimiento y de invasión se desarrolla generalmente durante varios meses desde un tumor localizado de pocos milímetros, hasta una masa de importantes dimensiones que destruye estructuras vecinas (13). Durante este período de crecimiento localizado, el tumor produce metástasis en los ganglios linfáticos cervicales, generalmente en los más próximos al tumor, extendiéndose progresivamente a otras estructuras cervicales vecinas. Cuanto mayor es el tumor primario y más larga su evolución, mayor es la posibilidad de que presente afectación de los ganglios linfáticos cervicales. Sin embargo, esto no quiere decir que tumores pequeños y de corta evolución no produzcan metástasis ganglionares, ni que tumores de larga evolución se hayan limitado a un crecimiento local sin la producción de este tipo de metástasis. En ocasiones, la presencia de una metástasis en un ganglio cervical puede ser el primer síntoma de un COCE, aunque esto suele ser más frecuente en tumores de hipofaringe o nasofaringe (13). Pueden producir metástasis a distancia, a cualquier órgano de la economía, pero ésta no es la causa más frecuente del fallecimiento de los pacientes; sino que suele ser la afectación local por el tumor primario y la afectación regional a nivel del cuello (13). 1.4. CLÍNICA Clínicamente el COCE se presenta en estadios precoces con un aspecto variado, asemejándose a una leucoplasia, eritroplasia o eritroleucoplasia. Con la 27 INTRODUCCIÓN 28 evolución de la lesión, ésta tiende a ulcerarse, presentando un carácter infiltrativo, dando lugar a una lesión mal delimitada, endurecida y de superficie granulosa. En algunas ocasiones la lesión puede presentar un carácter exofítico o mixto (38). Haya-Fernández y cols. (39) encuentran que el 19,6% de los pacientes con COCE presentan una leucoplasia asociada a la lesión primaria en el momento del diagnóstico. La presencia de leucoplasia asociada al tumor primario se correlaciona con tumores en estadios más tempranos. Las manifestaciones clínicas del COCE son muy diversas dependiendo del tamaño y de su localización. Entre ellas nos encontramos la presencia de una úlcera (generalmente de mucho tiempo de evolución), dolor, disfagia, hemorragia, disfonía, movilidad y pérdida dentaria, parestesia y trismus, entre otras (13). 1.5. DIAGNÓSTICO En cuanto al diagnóstico, hay que tener en cuenta dos aspectos: la estirpe tumoral (que sea un COCE), y la extensión del tumor (según la clasificación TNM, que comentaremos más adelante). 1.5.1. DIAGNÓSTICO HISTOLÓGICO Y ULTRAESTRUCTURAL Para determinar la estirpe tumoral es preciso realizar un estudio histológico del mismo, mediante el estudio de una biopsia representativa del tejido neoplásico. Aunque el COCE es, en la mayoría de los casos, bastante característico desde el punto de vista clínico, la existencia de otros muchos procesos similares clínicamente hace necesario en todos los casos que el diagnóstico se confirme por medio del análisis anatomopatológico. Para ello, se realiza una toma de biopsia de forma convencional siendo necesario incluir tejido tumoral, margen de la lesión y 28 INTRODUCCIÓN 29 tejido sano. Habitualmente se emplea una tinción de hematoxilina y eosina. El estudio con microscopía de luz sigue siendo la base fundamental del diagnóstico histopatológico de la mayoría de las lesiones orales, incluido el COCE. Las atipias celulares, las alteraciones epiteliales en su estructuración de estratos, mitosis anormales en cuanto a número, forma y localización y las modificaciones de la queratinización, son características comunes en el diagnóstico histopatológico del carcinoma. Se determinará también el grado de invasión del tumor según haya atravesado o no la membrana basal (carcinoma in situ o carcinoma invasivo), así como la diferenciación tumoral. Existen diferentes variantes en cuanto al grado de diferenciación, dependiendo del parecido que presente el tumor con la arquitectura normal del epitelio. Los carcinomas que producen cantidades importantes de queratina y muestran algún signo de maduración desde la capa basal a la capa córnea, se denominan bien diferenciados. Los que no producen queratina, pero sí es posible reconocer cierto grado de estratificación, a pesar de su desviación de la estructura normal, se denominan moderadamente diferenciados. Cuando no producen queratina, y su aspecto apenas muestra semejanza con una estructura epitelial normal, además de observarse anomalías celulares frecuentes, se denominan poco diferenciados (13). Sin embargo, el diagnóstico del tumor no ofrece toda la información necesaria para su seguimiento y tratamiento. Durante muchos años se viene observando que tumores idénticos desde el punto de vista histológico tienen una evolución clínica muy diferente, por ejemplo, en cuanto a su capacidad de producir metástasis. Además, en muchos casos de tumores pobremente diferenciados es imposible por medio de microscopía óptica conseguir un diagnóstico exacto. Por todo ello, es necesario estudiar estos tumores con mayor profundidad, por medio de técnicas más avanzadas que permiten obtener información más detallada de su 29 INTRODUCCIÓN 30 comportamiento. La principal limitación de la microscopía óptica es su escasa capacidad de magnificación. Aunque permite visualizar la morfología de las células y sus estructuras principales (núcleo, nucleolo, citoplasma...), no permite la identificación de estructuras más reducidas (desmosomas, membranas, microvellosidades ...). En estos casos recurriremos a la microscopía electrónica, cuyo poder de magnificación es mucho mayor. Las muestras para microscopía electrónica se fijan en glutaraldehído y posteriormente se incluyen en resinas sintéticas, para poder realizar cortes ultrafinos (10 veces más delgados que los de microscopía de luz). La tinción se realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo, tetróxido de osmio o acetato de uranilo, que permiten un contraste adecuado del tejido bajo el haz de electrones. Los cortes se montan sobre grillas de cobre, se tiñen y se observan al microscopio electrónico. Para documentar los hallazgos es necesario obtener fotografías en blanco y negro de las preparaciones. En la microscopía electrónica de transmisión, la preparación es atravesada por un haz de electrones, proporcionando la imagen sobre una pantalla. El microscopio electrónico de transmisión es capaz de generar un haz de electrones a alta tensión (80kV) y concentrarlo sobre la preparación mediante un sistema de campos electromagnéticos equivalentes a las lentes en el microscopio de luz. La microscopía electrónica de transmisión es especialmente útil en oncología, desde el punto de vista investigador, fundamentalmente en el diagnóstico de neoplasias malignas, ya que permite identificar la estirpe o diferenciación celular de una neoplasia. Con la microscopía electrónica de transmisión es posible distinguir elementos de diferenciación celular no apreciables con microscopía de luz. Por ejemplo, la observación de desmosomas en un tejido tumoral nos orienta al diagnóstico de carcinoma; las microvellosidades bien desarrolladas sugieren que 30 INTRODUCCIÓN 31 podemos estar ante un adenocarcinoma; la aparición de melanosomas indican un posible melanoma; el hallazgo de gránulos densos rodeados por membranas, nos orientan hacia un carcinoma neuroendocrino; etc. La microscopía electrónica de barrido permite el estudio de superficies celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un haz electrónico ultrafino. Las señales generadas se recolectan, amplifican y captan en un tubo de rayos catódicos. Se utiliza de forma rutinaria en el estudio de múltiples enfermedades, como por ejemplo en las enfermedades del tallo piloso. 1.5.2. INMUNOHISTOQUÍMICA A pesar de la gran utilidad de estas técnicas, el estudio de un tumor no puede centrarse exclusivamente en el análisis morfológico de las células y sus componentes. Existen otros muchos factores importantes para su diagnóstico y tratamiento. Por un lado, es fundamental para el diagnóstico de muchas neoplasias indiferenciadas, conocer su estirpe celular por medio de la identificación de proteínas y antígenos de superficie. Éste es el objetivo primordial de las técnicas inmunohistoquímicas. Por otro lado, el comportamiento clínico del tumor está dictado fundamentalmente por el genotipo de sus células, las alteraciones moleculares existentes en su genoma, la presencia de oncogenes, mutaciones genéticas, alteración de genes supresores tumorales, expresión génica anormal, etc. Todas estas alteraciones están tomando mayor relevancia día a día, como consecuencia de la evolución de las técnicas de biología molecular. La inmunohistoquímica engloba un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar la presencia de una gran variedad de antígenos en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la 31 INTRODUCCIÓN 32 capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción se hace visible mediante el marcado de los anticuerpos con sustancias que absorben o emiten luz. Se ha visto que la inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en la identificación de marcadores pronósticos de diversas neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificación de los productos de oncogenes y de genes supresores tumorales con anticuerpos monoclonales, como c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53. También es posible la identificación de marcadores de diferenciación como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1 para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leucocitos (linfomas) (40, 41). Aunque el diagnóstico histológico del COCE casi siempre se realiza mediante la microscopía óptica convencional, la aplicación de la inmunohistoquímica mediante marcadores para citoqueratinas puede ser útil en distinguir tumores pobremente diferenciados o indiferenciados de otras lesiones malignas (38). Existen diferentes opiniones en la literatura en relación a la utilización de la inmunohistoquímica para la identificación de marcadores tumorales en el COCE con el objetivo de predecir su comportamiento y evolución clínica, por lo que hay una acuciante necesidad de investigación de nuevos indicadores pronósticos, a fin de valorar la agresividad biológica de las lesiones propias de cada paciente. 1.5.3. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Existen numerosas técnicas para estudiar directamente el ADN tumoral, tanto en el propio tejido, como mediante la manipulación previa del mismo. Entre las más difundidas encontramos la hibridación in situ, la técnica Southern Blot (que puede ser considerada como una de las precursoras de los microarrays), Northern Blot, PCR (reacción en cadena de la polimerasa), y las técnicas de secuenciación automática. Más adelante comentaremos algunas de estas técnicas. 32 INTRODUCCIÓN 33 1.6. ESTADIAJE El estadio del cáncer oral depende del tamaño de la lesión primaria y de la diseminación regional o a distancia de la enfermedad. El estadio es importante, ya que tiene influencia sobre el plan de tratamiento y el pronóstico del cáncer oral. Dentro de las clasificaciones más utilizadas se encuentra la TNM, propuesta por el American Joint Committee on Cancer (AJCC) (42) (Tablas 1 y 2). 33 INTRODUCCIÓN 34 TAMAÑO DEL TUMOR PRIMARIO (T) TX Tumor primario no puede ser valorado T0 No existe evidencia de tumor primario Tis Carcinoma in situ T1 Lesión menor de 2 cm en su máximo diámetro T2 Lesión mayor de 2 cm y menor de 4 cm en su máximo diámetro T3 Lesión mayor de 4 cm en su máximo diámetro T4 Lesión mayor de 4 cm que invade estructuras adyacentes (ej. seno maxilar, huesos maxilares, músculos pterigoideos, base de lengua o piel) GANGLIOS LINFÁTICOS REGIONALES (N) NX Adenopatía cervical no puede ser valorada N0 No hay adenopatías cervicales clínicamente positivas N1 Un solo ganglio homolateral clínicamente positivo con 3 cm o menos de diámetro N2 Un solo ganglio homolateral clínicamente positivo mayor de 3 cm y menor de 6 cm de diámetro; o múltiples ganglios homolaterales clínicamente positivos menores de 6 cm de diámetro; o ganglios bilaterales o contralaterales clínicamente positivos, ninguno mayor de 6 cm de diámetro N2a Un solo ganglio homolateral clínicamente positivo mayor de 3 cm y menor de 6 cm de diámetro N2b Múltiples ganglios homolaterales clínicamente positivos menores de 6 cm de diámetro N2c Ganglios bilaterales o contralaterales clínicamente positivos, ninguno con más de 6 cm de diámetro N3 Un ganglio clinicamente positivo con más de 6 cm de diámetro METÁSTASIS A DISTANCIA (M) MX Metástasis a distancia no puede ser valorada M0 No existe metástasis a distancia M1 Existe metástasis a distancia Tabla 1. Clasificación TNM. Extensión del tumor primario (T); Ausencia o presencia de afectación de ganglios linfáticos regionales (N); Ausencia o presencia de metástasis a distancia (M) 34 INTRODUCCIÓN 35 ESTADIOS T N M Estadio 0 Tis N0 M0 Estadio I T1 N0 M0 Estadio II T2 N0 M0 Estadio III T3 T1 T2 T3 N0 N1 N1 N1 M0 M0 M0 M0 Estadio IVA T4 T4 Cualquier T N0 N1 N2 M0 M0 M0 Estadio IVB Cualquier T N3 M0 Estadio IVC Cualquier T Cualquier N M1 Tabla 2. Estadiaje clínico. Extensión del tumor primario (T); Ausencia o presencia de afectación de ganglios linfáticos regionales (N); Ausencia o presencia de metástasis a distancia (M) 1.7. PRONÓSTICO Pese a los avances significativos en las técnicas quirúrgicas, la radioterapia y la quimioterapia, las tasas de mortalidad no han sufrido mejorías durante estas últimas décadas. 35 INTRODUCCIÓN 42 carcinogénesis oral. El descontrol del ciclo celular es una marca fundamental de la progresión del cáncer (58). Muchas de las alteraciones moleculares que causan el comportamiento anormal de las células neoplásicas se basan en alteraciones del ciclo celular (59). 2.1.1. CICLO CELULAR El ciclo celular es el período de tiempo y el conjunto de modificaciones que sufre una célula desde su formación, por división de otra preexistente, hasta que se divide originando dos células hijas, idénticas entre sí y a ella misma (60). Así, el período entre dos divisiones mitóticas define el ciclo de la célula somática. El tiempo que transcurre desde el final de una mitosis hasta el comienzo de la siguiente se llama interfase. El período de la división real, correspondiente a la mitosis visible, se denomina fase M (61). Por tanto, el ciclo celular comprende interfase y mitosis. Para dividirse, una célula somática debe doblar su masa y repartir sus componentes de forma igualitaria entre las dos células hijas. Doblar el tamaño es un proceso continuo a lo largo de un ciclo celular que resulta de la transcripción y traducción de los genes que codifican las proteínas que constituyen el fenotipo particular de la célula. Por el contrario, la reproducción del genoma se lleva a cabo exclusivamente en el período específico de la síntesis de ADN que recibe el nombre de fase de síntesis o fase S (61). Este período S va precedido y seguido por dos fases que reciben respectivamente los nombres de fase G1 y G2 (se refieren a los dos “gaps” o espacios del ciclo celular en los que no existe síntesis de ADN). Por consiguiente, la interfase comprende los períodos G1, S y G2. La mitosis, en conjunto, recibe el nombre de fase M. Así, un ciclo celular típico posee cuatro fases sucesivas: G1, S, G2, M (60) (Figura 1). 42 INTRODUCCIÓN 43 Figura 1. Fases del ciclo celular La cantidad de ADN no es igual durante todo el ciclo: después de la fase M las células recién formadas comienzan la interfase (ingresan en el período G1) y la actividad biosintética, que se reduce durante la mitosis, aumenta notablemente. Durante este período la célula posee el ADN recibido de su progenitora. La fase S comienza cuando se inicia la síntesis del ADN nuclear y termina cuando éste se ha duplicado. Por tanto, después de la fase S, los cromosomas tendrán una doble constitución, estando formados por dos cromátidas hermanas. Esta situación se mantendrá durante toda la fase G2 y hasta que la célula dé origen a otras dos por división (60). Las diferentes células de un organismo pluricelular tienen ciclos de distinta duración. En los organismos unicelulares la duración de los ciclos se ve limitada principalmente por la disponibilidad de nutrientes. En los seres pluricelulares cada tipo celular debe existir sólo en determinado número, por lo que las distintas células poseen ciclos de diferente duración, incluso en células del mismo tejido. La fase de duración más variable es la G1: en un organismo hay células que están en fase G1 unos días, otras años, e incluso las hay que no se dividen. 43 INTRODUCCIÓN 44 Además, cuando una célula se detiene dentro de su ciclo celular lo hace siempre en G1. Según se ha podido demostrar, esta situación se debe a la existencia, dentro de la fase G1, del denominado punto de restricción o punto R, una vez superado el cual, las células se ven obligadas a realizar las fases S, G2 y M (60). La progresión del ciclo celular requiere la actuación coordinada de una compleja red de proteínas reguladoras que funcionan como interruptores bioquímicos que controlan sus principales fases e integran señales intracelulares y del medio extracelular, mitogénicas o antiproliferativas, para adecuar la división celular a las necesidades celulares o tisulares (60). La transición de una fase del ciclo celular a la siguiente es controlada en “puntos de control o restricción” antes de que el ciclo pueda progresar. Cuando existe un daño del ADN, los genes que controlan estos puntos de control detienen el ciclo celular para facilitar la reparación del ADN. La detención en la fase G1 previene la replicación del ADN dañado y la detención en la fase G2 permite la segmentación de los cromosomas dañados (60). 2.1.2. REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR Los principales reguladores del ciclo son heterodímeros constituidos por una proteína, denominada genéricamente ciclina y una proteína-kinasa perteneciente a las llamadas kinasas dependientes de ciclinas o CDKs (kinasas ciclina-dependientes). Estos complejos, a su vez, se hayan regulados por otras kinasas y fosfatasas. La kinasa se compone de una subunidad catalítica y de una pareja reguladora que es la ciclina. Actualmente se conocen dos grandes grupos de ciclinas: las ciclinas mitóticas, que regulan el tránsito de G2 a M, y las ciclinas de G1, que son requeridas para superar el punto de restricción y pasar de G1 a S (60). El que una célula sobrepase o no el punto R determinará el que la misma 44 INTRODUCCIÓN 45 entre en división o no. Por ello, las células pueden detenerse en su ciclo celular y quedar en un estado de "reposo" sin superar el punto R y, por tanto, sin dividirse. Entonces se considera que la célula se encuentra en la llamada fase G0 del ciclo celular (60). Cierto tipo de células se pueden estimular para que abandonen G0 y entren de nuevo en un ciclo celular. Abandonar o reentrar en el ciclo celular puede ocurrir antes del punto de restricción o punto R. Diversos parámetros influencian la habilidad de una célula para tomar la decisión básica de dividirse, incluyendo la respuesta a los estímulos externos (como el aporte de nutrientes) y un estudio de si la masa celular es suficiente para soportar un ciclo de división. Por regla general, una célula se divide con una masa que no es absoluta pero está determinada por un control que en sí mismo responde a una tasa de crecimiento (61). El principio y el final de la fase S son puntos importantes en el ciclo celular. Una célula debe saber cuándo está lista para iniciar la replicación y, por tanto, debe contar con algún método de reconocimiento de una replicación completa satisfactoria. Esto podría determinarse mediante un examen del estado del ADN. Los inhibidores de la replicación del ADN pueden bloquear el ciclo celular. No se conoce cómo bloquean la activación de la kinasa de la fase M. En general, se acepta que el ciclo celular queda regulado en función de los distintos momentos en que se activan los complejos ciclina-CDK y por la localización de cada uno de estos complejos dentro de la célula (60). El control de la división celular es esencial en los seres pluricelulares para mantener la forma y la función del organismo. Existen mecanismos para regular las divisiones celulares que funcionan como un sistema de retroalimentación. Un ejemplo típico son los hepatocitos: estas células comienzan a dividirse sólo si es necesario un incremento en el número de células, como ocurre cuando se extirpa una parte del hígado. Existe 45 INTRODUCCIÓN 46 una sustancia elaborada por las propias células que, a altas concentraciones, mantiene inhibidas las divisiones celulares y sólo si su concentración desciende los hepatocitos comienzan a dividirse (60). Son conocidos otros sistemas de control mitótico que parecen estar directamente relacionados con la posición ocupada por las células en el tejido. Así, en el epitelio estratificado de la epidermis las células de la capa basal se dividen para ir renovando dicho epitelio, mientras que en los estratos superiores no existen divisiones. Cuando una célula del estrato basal se desplaza a los estratos superiores deja de dividirse. Esto parece indicar que la existencia o no de divisiones depende de la situación ocupada por la célula (60). Todos estos controles están mediados por hormonas y factores de crecimiento que pueden ser proteínas o moléculas de menor tamaño que actúan por vía sanguínea como mediadores químicos locales. En las células cancerosas el control normal de la división está alterado; así, las células cancerosas no presentan el fenómeno de la inhibición por contacto, requieren para sobrevivir y dividirse en un cultivo menos factores de crecimiento que las normales y, una vez iniciado dicho cultivo, poseen un crecimiento indefinido, al contrario de lo que ocurre con los cultivos de células normales que, pasado un número determinado de divisiones, toda la población celular deja de dividirse y el cultivo envejece y muere (60). 2.2. ONCOGENES, GENES SUPRESORES TUMORALES - ONCOGENES Se ha descrito la existencia de genes relacionados con la aparición de tumores cancerígenos a los que se ha llamado oncogenes. Éstos son genes cuyos 46 INTRODUCCIÓN 47 productos se asocian con la transformación neoplásica, puesto que producen proteínas que promueven el crecimiento celular y tumoral. La mutación de los genes normales a partir de los cuales se originan (proto-oncogenes) produce cambios en la función y expresión de los mismos, que conlleva la aparición de células cancerígenas. Todos los proto-oncogenes localizados hasta el momento pertenecen a uno de los siguientes grupos: factores de crecimiento, receptores para factores de crecimiento, transductores de señales o proteínas ligadoras de ADN, habiéndose relacionado todos ellos con el control del ciclo celular (60). Muchos trabajos apuntan a que el oncogén sería el responsable no sólo del fenotipo del tumor, sino también de la capacidad invasiva y grado de malignidad del mismo (62). Diversos oncogenes han sido asociados con la carcinogénesis oral. Se cree que la expresión aberrante de los oncogenes receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR/c-erb 1) y CCND1/ciclina D1 contribuyen al desarrollo del cáncer oral (63). Las funciones de los proto-oncogenes están estrechamente ligadas a fenómenos esenciales del correcto comportamiento celular (64). En algunas circunstancias los proto-oncogenes sufren alteraciones que modifican su función normal y les dotan de capacidad transformante. Estos genes transformantes son genéricamente denominados oncogenes y pueden residir desde el inicio en el cromosoma celular (c-onc) o integrarse en el genoma de la célula procedentes del exterior, vehiculizados por un virus (v-onc) (18). Los proto-oncogenes se descubrieron inicialmente como “pasajeros” en el interior del genoma de retrovirus transformantes agudos, que causan la inducción rápida de tumores en animales y que también pueden transformar in vitro células animales (65). Hoy día se conoce la secuencia de bases que confecciona un gen 47 INTRODUCCIÓN 48 responsable de la producción de proteínas de crecimiento celular, el cual puede alterarse en cualquier momento provocando su activación en la edad adulta. Este hecho daría lugar a la síntesis de una proteína que actuaría no ya favoreciendo el crecimiento embriogénico y la maduración celular, sino la multiplicación del clon celular fuera de control. A los oncogenes se les denomina con tres letras: ras, SRC, rel, myb, myc, erb, mos, fms, fps, yes, ros, abl, fes... (62). Se conocen al menos 40 oncogenes diferentes integrados en el cromosoma humano que, tras su activación, dan lugar al inicio y/o progresión del tumor, aunque sin duda deben existir numerosos mecanismos de seguridad que prevengan la fácil activación de un oncogén (18). Los oncogenes codifican muchas de las proteínas transmisoras de señales por las cuales las células responden a señales de crecimiento externas. Las células normales, con oncogenes normales, no dan inicio al proceso de replicación del ADN y división celular sin el estímulo de señales externas. Sin embargo, cuando existen mutaciones en los oncogenes, las oncoproteínas mutadas pueden enviar un estímulo de crecimiento desde el citoplasma hacia el núcleo mismo en ausencia de señalización externa. De esta manera, la proliferación autógena de las células que poseen oncogenes mutados da como resultado la aparición de tumores. - GENES SUPRESORES TUMORALES Son múltiples los mecanismos por los que un gen activado de forma anormal puede contribuir al desarrollo de un tumor. Sin embargo, en el genoma humano existen genes que se comportan como transformantes exclusivamente cuando no son activos. Estos genes reciben el nombre de antioncogenes o genes de supresión tumoral y sólo ejercen un efecto oncogénico cuando los dos alelos cromosómicos (uno en cada cromosoma de la misma pareja) se alteran o deleccionan; es decir, se comportan como genes recesivos desde el punto de vista 48 INTRODUCCIÓN 49 de su expresión, así, la alteración exclusiva de un solo alelo no tiene consecuencia alguna (18). Los productos de los genes supresores del cáncer actúan frenando la proliferación celular. La función fisiológica del gen consiste en regular el crecimiento celular y no en evitar la formación de tumores (65). El gen del retinoblastoma (Rb) constituye uno de los ejemplos mejor conocidos de oncogenes recesivos (18). Actúa como un freno al progreso de la célula desde la fase G1 a la fase S del ciclo celular. Cuando la célula recibe el estímulo de los factores de crecimiento, la proteína Rb se inactiva, por lo que el freno desaparece y la célula atraviesa el punto de control G1-S (65). Si falta la proteína Rb o si una mutación altera su capacidad, el freno molecular del ciclo celular desaparecerá y la célula avanzará hacia la fase S. La pérdida del control normal del ciclo celular es esencial para la transformación maligna (65). Aunque no hay una relación clara entre la mutación de Rb y un peor pronóstico, Pavelic y cols. (66) han sugerido que su subexpresión se correlaciona con una peor supervivencia. En la inmensa mayoría de los cánceres humanos existe una mutación de al menos uno de los cuatro reguladores clave del ciclo celular (p16, ciclina D, CDK4, Rb) (65). El gen p53, el otro gen supresor del cáncer, actúa impidiendo la propagación de células genéticamente dañadas. El p53 es imprescindible cuando se requiere la aplicación de “frenos de emergencia”, como cuando la radiación, la luz ultravioleta o las sustancias químicas mutágenas dañan el ADN (67). Las mutaciones en p53 aparecen asociadas a muchos tipos de tumores; se estima que un 50% de los tumores humanos carecen de un gen p53 funcional. La proteína p53 es un regulador transcripcional que se activa en respuesta a la 49 INTRODUCCIÓN 50 presencia de daños en el ADN y que desempeña un papel doble. Por un lado, impide la progresión del ciclo celular hasta que hayan sido reparados los daños en el ADN. Por otro lado, en determinadas circunstancias induce la muerte celular por apoptosis (muerte celular programada) (68). En ausencia de un gen p53 funcional, la ruta apoptótica en la que participa p53 no se activa, y el ciclo celular progresa aunque no hayan sido reparados los daños. La falta de este punto de control provoca un aumento generalizado en la frecuencia de mutaciones, reorganizaciones cromosómicas y aneuploidías; de este modo, se incrementa la probabilidad de que ocurran otras mutaciones activadoras de la proliferación celular o inhibidoras de la apoptosis (57). El gen p53 bloquea también la angiogénesis (69). Ésta se relaciona con el grado y estado del tumor y con el pronóstico del cáncer. Se demostró que tejidos normales y adenomas poseen una angiogénesis baja, mientras que en el cáncer la angiogénesis aumenta en relación al estado y grado del tumor (70). Esta pausa permite que la célula tenga tiempo para reparar la lesión del ADN. Además, p53 ayuda a este proceso de manera directa, induciendo la transcripción de una proteína (GADD45) que interviene en la reparación del ADN. Si la reparación del ADN es satisfactoria, p53 activará un gen (mdm2) cuyo producto se une e inhibe a la propia p53, levantando así el bloqueo del ciclo celular. Si no se logra reparar la lesión del ADN, la proteína p53 normal activará los genes promotores de la apoptosis (71). Existen mecanismos que pueden inactivar las funciones del gen p53, lo que conduce a la proliferación celular incontrolada (72). Las proteínas transformadoras de virus de ADN, como la proteína E6 de los virus del papilomavirus humano (73), el virus de Epstein-Barr y el virus del Herpes simple tipo 6 y 8, pueden unirse y degradar a p53 (67). Las mutaciones de p53 causantes de tumores se han observado 50 INTRODUCCIÓN 51 principalmente en células somáticas. Las mutaciones de la línea germinal de p53 son responsables de un trastorno canceroso hereditario conocido como síndrome de Li-Fraumeni (LFS: Li-Fraumeni syndrome) (74). Este raro síndrome se transmite de forma autosómica dominante e implica carcinomas de mama y colon, sarcomas de tejidos blandos, osteosarcomas, tumores cerebrales, leucemias y carcinomas adrenocorticales (75). Estos tumores suelen manifestarse a edad precoz en los miembros de familias con LFS y en los individuos afectados se observan, por lo general, múltiples tumores primarios. La demostración de constantes mutaciones de p53 en el ADN constitucional de los pacientes con LFS confirmó el papel etiológico de este gen. Como en el gen del retinoblastoma, la herencia de un gen p53 mutado aumenta en gran medida la susceptibilidad del individuo a una posterior transformación celular y desarrollo tumoral. El gen p73 en condiciones adecuadas, de igual manera que el gen p53, puede detener el ciclo celular y provocar la apoptosis (65). 2.3. ADAPTACIONES CELULARES, LESIÓN Y MUERTE CELULAR Diversas adaptaciones celulares están inducidas por el estímulo directo de las células por factores producidos por las mismas células respondedoras o por otras circundantes. Otras se deben a la activación de diversos receptores celulares de superficie y de las vías de señalización subsiguientes. Las adaptaciones pueden asociarse con la inducción de una nueva síntesis proteica por las células diana y la inducción de proliferación celular. Éstas pueden implicar también un cambio celular desde la producción de un tipo de proteínas a otro o la hiperproducción marcada de una proteína (76). La lesión celular es el resultado de un estrés celular tan intenso que las 51 INTRODUCCIÓN 58 ácidos grasos libres. En la mitocondria, estos cambios producen defectos de permeabilidad, tales como los de transición de la permeabilidad de la mitocondria dando lugar a una lesión celular progresiva. * Pérdida de fosfolípidos de membrana. La lesión celular grave se asocia con una disminución en el contenido de fosfolípidos de membrana mediante un mecanismo de degradación debido, probablemente, a la activación de fosfolipasas endógenas por los niveles aumentados de calcio citosólico. La pérdida fosfolipídica también puede ocurrir secundariamente a una disminución de la reacetilación dependiente de ATP o a una disminución de la síntesis de novo de fosfolípidos. * Anormalidades citoesqueléticas. Los filamentos citoesqueléticos sirven como anclajes que conectan la membrana plasmática con el interior de la célula. La activación de proteasas por el aumento del calcio citosólico puede producir daño en los elementos del citoesqueleto. En presencia de tumefacción celular, este cambio da lugar al despegamiento de la membrana celular del citoesqueleto haciendo que ésta sea susceptible a la distensión y ruptura. * Especies de oxígeno reactivo. Los radicales libres de oxígeno parcialmente reducido causan lesión en las membranas celulares y en otros constituyentes celulares. * Productos de descomposición de los lípidos. Incluyen los ácidos grasos libres no esterificados, la acilcarnitina y los lisofosfolípidos, productos catabólicos que se sabe se acumulan en las células lesionadas como resultado de la degradación fosfolipídica. Tienen un efecto detergente sobre las membranas. Asimismo, pueden bien insertarse en la bicapa lipídica de la membrana o bien intercambiarse con los fosfolípidos de membrana, causando potencialmente cambios en la permeabilidad y alteraciones electrofisiológicas. 58 INTRODUCCIÓN 59 El daño en la membrana plasmática da lugar a pérdida del equilibrio osmótico y aflujo de líquidos e iones, así como a una pérdida de proteínas, enzimas, coenzimas y ácidos ribonucleicos. Las células también pueden perder metabolitos, que son vitales en la reconstitución del ATP, vaciando así aún más la carga neta de fosfatos intracelulares de alta energía. La lesión de las membranas lisosomales da lugar a la liberación de sus enzimas en el citoplasma y activación de las mismas. Los lisosomas contienen RNasas, DNasas, proteasas, fosfatasas, flucosidasas y catepsinas. La activación de esas enzimas da lugar a digestión enzimática de los componentes celulares, provocando la pérdida de la ribonucleoproteína, desoxirribonucleoproteína y glucógeno, y las células mueren por necrosis (76). 2.4. LA MAQUINARIA DE MUERTE CELULAR Algunos aspectos del control celular aparecen sólo en los organismos multicelulares. Para desarrollarse y mantenerse normalmente, los organismos multicelulares deben mantener un equilibrio adecuado del número de cada tipo celular en cada uno de sus diversos tejidos. Casi todos estos tipos celulares son somáticos, es decir, no contribuyen a la línea germinal. Desde un punto de vista de la propagación de las especies, la pérdida de células somáticas no supone ningún problema para el organismo, siempre que las células restantes de ese tipo proliferen para compensar la pérdida. Por otro lado, dado que las células defectuosas pueden ser extremadamente perjudiciales, se han desarrollado mecanismos para eliminar este tipo de células. El proceso se denomina muerte celular programada o apoptosis. Una cascada de enzimas conocidas como caspasas producen la muerte celular mediante la destrucción de numerosos sistemas estructurales y funcionales de la célula. Una vez que las células están muertas, los restos celulares son eliminados por los macrófagos (57). 59 INTRODUCCIÓN 60 2.4.1. APOPTOSIS El denominador común de diversos procesos neoplásicos es el crecimiento anárquico y autónomo de sus células. Este aumento se debe tanto a una proliferación celular intensa como a una muerte celular insuficiente (77, 78). Consecuentemente, mutaciones y otras alteraciones moleculares que impiden la apoptosis pueden jugar un importante papel en la patogenia y en la progresión de distintas neoplasias. La apoptosis es una forma de muerte celular programada genéticamente que se distingue por la activación de una familia de proteasas cisterna-aspartato (caspasas) que rompen varias proteínas originando cambios morfológicos y bioquímicos característicos de esta forma de muerte celular. Las aberraciones en este proceso, que conllevan una reducción de la muerte celular, podrían participar en la carcinogénesis favoreciendo la aparición de mutaciones transformantes (79). En los organismos multicelulares, se han desarrollado sistemas de eliminación de las células dañadas (células potencialmente perjudiciales) mediante un mecanismo de autodestrucción denominado muerte celular programada o apoptosis (57). La apoptosis es el punto final de una cascada de acontecimientos moleculares que conducen a la activación de las enzimas proteolíticas responsables de la muerte celular (65). Aunque este mecanismo de autodestrucción se activa en respuesta a una diversidad de circunstancias, el proceso de apoptosis sigue los mismos pasos independientemente de cuál haya sido la circunstancia determinante. Primero se produce la fragmentación del ADN cromosómico, la desorganización estructural de los orgánulos y la pérdida de la morfología normal de las células (las células apoptóticas se vuelven esféricas). Luego, las células se descomponen en fragmentos celulares pequeños denominados cuerpos apoptóticos que son fagocitados por los macrófagos (57). Los “motores” de la autodestrucción son unas proteasas denominadas 60 INTRODUCCIÓN 61 caspasas, que actúan dirigiendo otras proteínas. Las caspasas son proteínas con un elevado contenido de cisteínas que cuando se activan cortan en determinados residuos de aspartato de las proteínas diana. En las células normales, las caspasas se encuentran en un estado enzimáticamente inactivo denominado zimógeno. En términos generales, un zimógeno es una forma precursora inactiva de una enzima cuya longitud excede el tamaño final de la enzima activa. Para convertir la forma zimógeno en caspasa activa, es necesario que se elimine una parte del polipéptido mediante ruptura enzimática o proteolisis (57). Actualmente, se considera que existen dos tipos de caspasas: iniciadoras y ejecutoras. Se desconocen, sin embargo, los detalles relativos a cómo estos dos tipos de caspasas se organizan para producir la cascada proteolítica. Una posibilidad es que las caspasas iniciadoras sean activadas por proteolisis en respuesta a señales activadoras procedentes de otras clases de proteínas. Una vez activadas, las caspasas iniciadoras actuarían sobre las caspasas ejecutoras, que a su vez actuarían sobre otras proteínas, y así sucesivamente (57). 2.4.2. GENES REGULADORES DE LA APOPTOSIS Los genes que evitan o inducen la muerte celular programada son también variables importantes de la ecuación del cáncer; ya que el balance entre la proliferación, diferenciación y muerte celular determina el número de células en una población, así como el tamaño y el estado de un tumor. Uno de los genes reguladores de la apoptosis es el bcl-2, que protege a los linfocitos de la apoptosis; es decir, evita la muerte celular programada. Por el hecho de que alarga la supervivencia celular, la expresión excesiva de bcl-2 permite que sobrevengan otras mutaciones que afectan a los proto-oncogenes y a los genes supresores del cáncer (65). No está completamente aclarada la base bioquímica de la acción de bcl-2, 61 INTRODUCCIÓN 62 aunque diversos estudios sugieren que bcl-2 inhibe la apoptosis regulando una vía metabólica antioxidante (80). Otros genes reguladores de la apoptosis serían: bax, bad y bcl-xS, que favorecen la muerte celular programada (65). 2.5. DIFERENCIAS ENTRE LAS CÉLULAS NORMALES Y LAS CÉLULAS CANCEROSAS Un tumor maligno, o cáncer, es de naturaleza clonal. Un cáncer está compuesto por un agregado de células todas ellas derivadas de una célula fundadora aberrante que, a pesar de estar rodeado por células normales, ha dejado de estar integrado en ese medio ambiente. Las células cancerosas suelen distinguirse de las células normales que las rodean por la manifestación de una serie de cambios fenotípicos específicos, como una tasa rápida de división, la invasión de nuevos territorios celulares (las células cancerosas tienden a viajar al azar a través de los tejidos, penetrar en el torrente sanguíneo y ser transportadas por todo el cuerpo, donde constituyen nidos para numerosos crecimientos cancerosos nuevos), una tasa metabólica elevada, y una morfología anormal. Por ejemplo, cuando las células epiteliales normales se colocan en un medio de cultivo, sólo crecen si están adheridas a la superficie de la placa de Petri. Además, las células epiteliales normales se dividen hasta que constituyen una monocapa continua. Entonces, de alguna manera, reconocen que han formado una capa epitelial sencilla y dejan de dividirse. Por el contrario, las células malignas derivadas de tejido epitelial continúan proliferando y se apilan unas sobre otras. Claramente, los factores que regulan la diferenciación celular normal deben estar alterados (57). Ciertos cánceres también producen factores angiogénicos que determinan 62 INTRODUCCIÓN 63 la neoformación de muchos vasos sanguíneos en su interior, aportando de este modo los nutrientes necesarios para el desarrollo del cáncer (81), puesto que los tumores sólidos no pueden crecer entre 1 y 2 mm en diámetro sin inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos que les facilite el aporte de nutrientes necesarios. La conversión al estado maligno puede ocurrir en muchos tipos celulares diferentes. Parece que existe un mecanismo general común que consiste en la acumulación de múltiples mutaciones en una sola célula que provocan su proliferación descontrolada. Algunas de estas mutaciones pueden transmitirse de padres a hijos a través de la línea germinal, otras surgen de nuevo en el linaje celular somático de una célula determinada (57). Sólo una minúscula fracción de las células que mutan en el cuerpo originan un cáncer. Existen varias razones para ello (81): 1ª) La mayoría de las células que han sufrido una mutación tienen una capacidad de supervivencia menor que las células normales y, por tanto, sencillamente mueren. 2ª) Sólo unas pocas de las células mutadas que sobreviven se convierten en cancerosas, porque incluso la mayoría de estas células mutadas siguen teniendo controles de retroacción normales que evitan su crecimiento excesivo. 3ª) Las células potencialmente cancerosas suelen ser destruidas por el sistema inmunitario del cuerpo antes de que crezcan en un cáncer: la mayoría de las células mutadas producen en su interior proteínas anormales debido a la presencia de genes alterados; dichas proteínas estimulan al sistema inmunitario del cuerpo, apareciendo anticuerpos o linfocitos sensibilizados contra las células cancerosas y las destruyen. Así, las personas cuyos sistemas inmunitarios están suprimidos, como las que reciben fármacos inmunosupresores tras un trasplante 63 INTRODUCCIÓN 64 renal o cardíaco, tienen cinco veces mayor probabilidad de desarrollar cáncer. 4ª) Para provocar un cáncer suelen ser necesarios al mismo tiempo varios oncogenes activados diferentes. Uno de estos genes, por ejemplo, podría estimular la reproducción rápida de una línea celular, pero no se produciría un cáncer debido a la ausencia de un gen mutante simultáneo imprescindible para formar los vasos sanguíneos necesarios. 2.6. CARCINOGÉNESIS El desarrollo del cáncer en el hombre está determinado por una compleja sucesión de eventos que normalmente tienen lugar a lo largo de muchos años (82). Durante este proceso el genoma de células neoplásicas incipientes adquiere alelos mutantes de proto-oncogenes, genes supresores de tumores y otros genes que controlan directa o indirectamente la proliferación celular. En el genoma de diversos tipos de neoplasias se han encontrado diferentes combinaciones de estos alelos mutantes, así como en el mismo tipo de neoplasia en distintos pacientes. Los experimentos de transfección de ADN revelan que ningún oncogén solo (ej. myc, ras) puede inducir la transformación completa de células in vitro pero que ras y myc juntos pueden transformar fibroblastos. Esta cooperación es necesaria porque cada oncogén está especializado en inducir parte del fenotipo necesario para la transformación completa. Así, en este ejemplo, el oncogén ras induce a las células a secretar factores de crecimiento y les permite crecer sin anclaje a un sustrato normal, mientras que el oncogén myc vuelve a las células más sensibles a factores de crecimiento e inmortaliza células. Myc y bcl-2 también cooperan en la transformación neoplásica (65). Prácticamente todos los tumores de las células somáticas se deben a una serie de mutaciones específicas que se acumulan dentro de la célula. Se ha visto 64 INTRODUCCIÓN 65 que estas mutaciones pueden clasificarse en unas cuantas categorías principales: las que aumentan la capacidad proliferativa de las células, las que disminuyen la susceptibilidad de una célula a la apoptosis, o las que producen un incremento en la tasa general de mutación de la célula, aumentando así la probabilidad de que ocurran mutaciones que afecten a la proliferación o a la apoptosis (57). El número de genes implicados en los distintos pasos de la transformación neoplásica aumenta a medida que se investiga sobre el tema. Recientes estudios sobre la transformación experimental de células humanas indican que la alteración de un limitado número de vías reguladoras celulares es suficiente para que una amplia variedad de células normales adquieran un fenotipo tumoral. Estos resultados sugieren una serie de principios genéticos y celulares que pueden gobernar muchos de los distintos tipos de cáncer humano (83). Actualmente se acepta que la mayoría de los tumores sólidos resultan de un proceso de múltiples pasos de acumulación de alteraciones genéticas que implican la activación de varios oncogenes y la pérdida de dos o más genes supresores de cáncer (84, 85). Estas dos alteraciones representan un paso crucial en la progresión desde una célula normal hasta un tumor maligno. Un ejemplo de la adquisición creciente de un fenotipo maligno sería el estudio del carcinoma de colon. Se cree que estas lesiones evolucionan a través de una serie de etapas identificables morfológicamente: hiperplasia epitelial de colon, formación de adenomas que crecen progresivamente y que terminan por sufrir la transformación maligna. El modelo molecular de la evolución de este tipo de cáncer comenzaría por la inactivación del gen supresor del tumor APC, seguida de la activación de ras y terminando por la pérdida de los genes ddc y p53 (aunque se considera menos importante el orden de mutación que su acumulación total, pudiendo en algunos casos invertirse el orden de mutaciones anteriormente descritos) (65). Sabemos que muchas mutaciones subyacen a la carcinogénesis, pero no 65 INTRODUCCIÓN 66 sabemos si las numerosas mutaciones de las células cancerosas surgen independientemente o si son el resultado de la lesión genética de uno o más “genes mutadores” clave. Existe un gen en el cromosoma 2p15-16 que de alguna forma regula o influye sobre las mutaciones en cientos o posiblemente miles de otros loci. Este gen se descubrió en el cáncer de colon hereditario no vinculado a poliposis y se ha denominado gen del cáncer de colon familiar (fcc: familiar colon carcinoma). Se ha visto que aproximadamente el 13% de los cánceres de colon esporádicos muestran también mutaciones de fcc y que el producto del gen fcc está involucrado en la reparación del ADN. Cuando se está copiando un filamento de ADN, la proteína de fcc parece actuar como un “corrector ortográfico”. Si existe un error que determina un emparejamiento erróneo de bases (ej. el emparejamiento de G con T, en vez del normal de A con T), el producto del gen fcc dirige a la maquinaria de reparación del ADN para que lo corrija. Sin este corrector ortográfico se acumulan lentamente errores en varios genes, incluyendo los que regulan el crecimiento celular (65). 2.7. ANGIOGÉNESIS El término angiogénesis significa crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Todos los tejidos del cuerpo tienen que tener un suministro constante de sangre, la cual proporciona oxígeno y nutrientes esenciales para sobrevivir. Cada vez que se dañan los vasos sanguíneos, desde la concepción hasta la muerte, proteínas y moléculas especiales llamadas factores de crecimiento se dirigen al sitio dañado para promover el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos. Irónicamente, la angiogénesis, que es esencial para la vida misma, se ha convertido en un blanco fundamental en la lucha contra el cáncer. Los tumores necesitan también un suministro de sangre confiable para sobrevivir, y los mismos 66 INTRODUCCIÓN 67 factores angiogénicos que ayudan a mantener a los tejidos vitales también ayudan a mantener a los tejidos cancerosos. La angiogénesis se produce principalmente en respuesta a factores angiogénicos liberados por los tejidos isquémicos, tejidos que crecen rápidamente o tejidos con tasas metabólicas excesivas. El proceso consta de múltiples pasos que parecen estar regulados tanto por factores estimulantes como por factores inhibidores. Los factores angiogénicos mejor caracterizados son el factor de crecimiento de células endoteliales, el factor de crecimiento fibroblástico y la angiogenina. Para que un tumor crezca, tiene que liberar más factores estimulantes que factores inhibidores en el tejido circundante. El hecho de que los tumores también produzcan inhibidores angiogénicos resulta ser muy importante para explicar la metástasis, que es la propagación del cáncer a otras partes del cuerpo y la principal razón de las muertes relacionadas con esta enfermedad. Frecuentemente, metástasis pequeñas, microscópicas, en áreas del cuerpo alejadas del tumor primario, permanecen inactivas durante años y empiezan a crecer sólo después que el tumor primario es extirpado. Esto sucede porque el tumor primario ha estado liberando inhibidores angiogénicos en el torrente sanguíneo y cuando estos inhibidores desaparecen los tumores microscópicos empiezan a crecer. Los investigadores esperan que evitando la angiogénesis ellos puedan evitar que estas metástasis microscópicas crezcan. Además, si un tumor no se ha propagado a otras áreas y ha sido tratado efectivamente con agentes antiangiogénicos es menos probable que ocurra la metástasis, debido a que hay menos vasos sanguíneos disponibles para que las células cancerosas se diseminen desde el tumor. El crecimiento tumoral está asociado con una actividad celular elevada donde el aumento del soporte sanguíneo es crucial para la continuación de su desarrollo. Los pasos críticos para la neovascularización incluyen la degradación 67 INTRODUCCIÓN 74 Mediante el uso de arrays de ADN se pueden analizar de cientos a miles de variantes genéticas (polimorfismos o mutaciones) simultáneamente. El material o soporte físico sobre el que se va a generar la matriz es un componente fundamental del proceso. Dependiendo de su composición y resistencia, se podrán llevar a cabo determinados procesos de lavado y eliminación de uniones inespecíficas, podrán o no ser reutilizados, y soportarán diferentes mecanismos de revelado. Además, el tipo de soporte físico utilizado, puede condicionar de forma muy importante el coste de fabricación del array. La actividad de cada gen en el microarray puede ser comparada en dos poblaciones celulares diferentes (A y B). Esto es muy útil en el estudio de tumores malignos ya que permite comparar las diferencias de expresión génica que aparecen en el tejido tumoral en relación al tejido sano. En la actualidad, los arrays en general, y en particular los arrays de ADN, constituyen una herramienta fundamental en la investigación genética. Sus aplicaciones son innumerables, entre las que se destacan la monitorización de la expresión génica, detección de mutaciones y polimorfismos, secuenciación, diagnóstico clínico, screening y aplicaciones farmacológicas, seguimiento de terapia, medicina preventiva, etc. 74 INTRODUCCIÓN 75 3.- BASES MOLECULARES DEL CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS Aunque ya existen modelos preliminares de progresión molecular para la carcinogénesis del cáncer oral, como los descritos por Califano y cols. (99) en 1996, y por Ha y cols. en 2003 (100), todavía desconocemos las vías concretas y las reacciones moleculares precisas que acontecen durante la progresión de estos tumores. Califano y cols. en 1996 (99), y Mao en 1997 (101), demostraron la asociación de alteraciones cromosómicas estructurales con la aparición del cáncer oral; entre ellas, la asociación existente entre displasia y alteraciones en las regiones cromosómicas 9p21, 3p21 y 17p13; entre carcinoma in situ y alteraciones en 11q13, 13q21 y 14q31; y entre carcinoma invasivo y alteraciones en 4q26-28, 6p, 8p y 8q. Recientemente, se ha producido una gran revolución en el estudio de la expresión génica en el cáncer oral. Sin embargo, sólo un pequeño conjunto de genes ha podido ser implicado, de forma consistente, con la carcinogénesis del cáncer oral. Algunos genes han demostrado una fuerte asociación con el desarrollo del carcinoma oral, como p53 (asociado con el 90% de los carcinomas orales de células escamosas); p16 (asociado con el 70%); o el gen APC (implicado en el 50%) (101). Además, los tres están localizados en regiones asociadas con el desarrollo de estos tumores: 17p13 en el caso de p53; 9p21 en el caso de p16 y 5q21-22 en el caso de APC. Otras anomalías moleculares, como la 75 INTRODUCCIÓN 76 alteración en la expresión de DOC-1 y RAR-ß, no asociadas a alteraciones cromosómicas estructurales, también han sido asociadas con el cáncer oral (102). Scully y cols. en 2000 (103, 104, 105), publicaron una revisión muy detallada de los factores genéticos y moleculares asociados al carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, incluyendo las rutas metabólicas de la carcinogénesis, los factores que intervienen en la reparación del ADN, las alteraciones en el ciclo celular y las anomalías cromosómicas, así como las aplicaciones clínico-patológicas derivadas de la identificación de todas estas anomalías. Han visto que son múltiples las aberraciones genéticas asociadas a tumores observadas en la displasia oral y en el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, y que es evidente que el cáncer es un proceso en múltiples pasos que implica una serie de eventos moleculares aberrantes que afectan a una serie de genes, cuyo resultado final es un crecimiento celular desordenado (104). Pero parece claro que es el acúmulo de eventos genéticos el que determina la progresión a la malignidad (99). 3.1. CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS Y MICROARRAYS DE ADN Para conseguir identificar la expresión génica asociada al COCE, muchos investigadores han combinado técnicas de hibridación de arrays de ADN, con otras técnicas moleculares que permiten examinar la expresión génica diferencial. Los arrays de ADN son una tecnología muy reciente cuya historia se remonta a mediados de los años 80 (106, 107). Las primeras referencias en la literatura sobre su desarrollo hay que buscarlas a principios de la década de los noventa (108, 109), donde encontramos los primeros artículos sobre el descubrimiento y utilidad de los chips de ADN, terminología que ha ido perdiendo uso en favor del término arrays de ADN. 76 INTRODUCCIÓN 77 Aunque existen algunas publicaciones al respecto entre los años 1994 y 1997, es en 1998 cuando la experimentación con arrays despega definitivamente y en tan sólo 5 años han aparecido numerosos artículos bibliográficos que describen estudios basados en esta tecnología. Entre ellos, los relacionados con el estudio del cáncer ocupan un lugar destacado, siendo muy numerosos los trabajos relacionados sobre todo con cánceres de mama y colon, pero también con linfomas, cáncer de próstata y cáncer de pulmón (110, 111, 112, 113, 114, 115). En 1998, Chang y cols. (116) publicaron el primer artículo de microarrays aplicados al estudio del cáncer oral. En este artículo, se refiere por primera vez el uso de microarrays de ADN para caracterizar los genes que sufren transformaciones durante la progresión del cáncer oral. Encontraron 69 genes con alteraciones en su expresión en líneas celulares de COCE y de queratinocitos orales inmortalizados por medio de infección con el virus del papiloma humano. Sin embargo, todavía hubo que esperar hasta el año 2000 para empezar a encontrar de forma habitual referencias bibliográficas sobre el uso de arrays de ADN como herramienta en el estudio del COCE (8, 117, 118, 119). En la actualidad, son múltiples los estudios acerca de microarrays y el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y, concretamente, con el COCE (120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130). La mayoría de estos estudios establecen la hipótesis de una posible asociación entre un número variable de genes y el carcinoma de células escamosas. Muchos de ellos son genes conocidos y previamente descritos, mientras que otros nunca han sido analizados con detenimiento y se desconoce su función biológica. A partir de estos estudios con arrays de ADN, estos nuevos genes pueden ser investigados individualmente para descifrar su naturaleza y función. 77 INTRODUCCIÓN 78 3.2. GENES SOBREEXPRESADOS EN EL CARCINOMA ORAL DE CÉLULAS ESCAMOSAS SEGÚN UN ESTUDIO CON EL ARRAY ATLAS GLASS HUMAN 3.8 I MICROARRAY Uno de los trabajos acerca de microarrays y el cáncer oral es el realizado por nuestro grupo de investigación (11), en el que se estudian 5 pacientes con COCE y se analiza la expresión génica diferencial del COCE mediante el array Atlas Glass Human 3.8 I Microarray (AGHM). Este microarray consta de 3.757 oligonucleótidos y 9 genes housekeeping, así como controles hasta completar un total de 3.888 spots. Los genes seleccionados son genes conocidos y bien caracterizados que abarcan un rango amplio de funciones biológicas. Somoza y cols. (11) encuentran 426 genes que presentan diferencias estadísticamente significativas entre tejido tumoral y tejido normal. De éstos, 322 (75,58%) aparecen inducidos o sobreexpresados y 104 (24,41%) reprimidos o subexpresados. Basándonos en la función que cada gen desempeña en las células, en la Tabla 3 se muestran las distintas categorías funcionales así como el porcentaje de los 426 genes que presentan alteraciones de expresión. En la Tabla 4 aparecen los grupos funcionales más significativos en los 322 genes sobreexpresados en el tumor, y en la Tabla 5 los grupos funcionales más significativos en los 104 genes subexpresados en el tumor. 78 INTRODUCCIÓN 79 CATEGORÍAS FUNCIONALES % proteínas implicadas en el metabolismo celular 18.77% transductores y moduladores intracelulares 12.44% proteínas y factores de transcripción 12.20% proteínas reguladoras del tráfico celular 9.15% receptores celulares 8.92% proteínas de canal y transportadores de membrana 6.33% proteínas de traducción 6.10% proteínas asociadas al citoesqueleto 5.86% proteínas modificadoras 5.16% proteínas de adhesión celular 5.16% proteínas de comunicación extracelular 4.46% proteínas de modificación post-traducción 4.22% proteínas transportadoras extracelulares 3.99% proteínas cuya función no ha sido descrita 3.99% proteínas de respuesta al estrés 3.28% proteínas implicadas en la síntesis, recombinación y reparación del ADN 2.58% proteínas de procesamiento, modificación y transporte de ADN 2.58% oncogenes y genes supresores tumorales 2.58% proteínas de la matriz extracelular 1.87% proteínas del sistema inmunológico 1.87% antígenos de superficie celular 1.87% proteínas asociadas a la apoptosis 1.40% proteínas de unión a ADN y a cromatina 1.17% proteínas asociadas al ciclo celular 0.70% Tabla 3. Distribución funcional y porcentual de los 426 genes con cambios en su expresión normal (11) 79 INTRODUCCIÓN 80 CATEGORÍAS FUNCIONALES % Proteínas implicadas en el metabolismo celular 21.11% Transductores y moduladores intracelulares 11.18% Proteínas y factores de transcripción 10.24% Receptores celulares 10.24% Tabla 4. Grupos funcionales más significativos en los 322 genes sobreexpresados en el tumor (11) CATEGORÍAS FUNCIONALES % Proteínas y factores de transcripción 18.26% Transductores y moduladores intracelulares 16.34% Proteínas implicadas en el metabolismo celular 11.53% Proteínas reguladoras del tráfico celular 10.57% Tabla 5. Grupos funcionales más significativos en los 104 genes subexpresados en el tumor (11) En el Anexo I se muestra la relación de los genes sobreexpresados en el tejido tumoral según Somoza y cols. (11). De lo antes expuesto se concluye que aparecen una gran cantidad de genes sobreexpresados en el tejido tumoral cuya función no está claramente determinada. Aunque sería interminable enumerar todos aquellos y sus características diferenciadoras, nos vamos a referir exclusivamente a los genes que han tenido una relación directa con el objetivo de nuestro trabajo, como son: ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 y ATP6V0E, que describiremos a continuación. 80 INTRODUCCIÓN 81 • ADRBK2 (adrenergic, beta, receptor kinase 2) Este gen, también denominado GRK3 ó BARK2, se localiza en el brazo largo del cromosoma 22 en posición 11 (22q11). Es un receptor kinasa beta-adrenérgico que fosforila específicamente la forma agonista del beta-adrenérgico y se relaciona con los receptores unidos a la proteína G. Globalmente, la enzima ADRBK2 tiene un 85% de similitud de los aminoácidos con ADRBK1, con el dominio catalítico de la proteína kinasa teniendo un 95% de similitud. El ARNm de ADRBK2 es aproximadamente de 8 kilobases con una distribución similar a ADRBK1. Estos datos sugieren la existencia de una familia de receptores kinasas con una actividad reguladora de la función del receptor (131). Los receptores beta-adrenérgicos transducen señales de catecolaminas, norepinefrina y epinefrina, a la proteína G, que se activa en presencia de la proteína transmembrana adenilciclasa para producir el segundo mensajero AMPc (Figura 3). Éste activa a la proteína kinasa AMPc-dependiente (PKA o proteína kinasa A), la cual está implicada en numerosas cascadas de señalización paralelas altamente específicas. 81 INTRODUCCIÓN 82 Figura 3. Mecanismo de actuación de los receptores adrenérgicos. La distribución en los tejidos de ADRBK2 es fundamentalmente en el cerebro y el bazo, seguido del pulmón, corazón y riñón (131). Aparece altamente expresado en la vía dopaminérgica en el sistema nervioso central, y media la desensibilización homóloga de una variedad de neurotransmisores y hormonas mediante la fosforilación de receptores unidos a la proteína G (GPCRs) (132). Se piensa que este gen podría estar relacionado con la fosforilación y posiblemente la desensibilización de múltiples receptores ligados a adenilciclasa y que estaría implicado en la regulación de diversos receptores unidos a la proteína G (131, 133). Un polimorfismo en la región promotora de ADRBK2 se ha asociado a un ⊕ β1 o β2 recept ATP AMPc Gs β γ αs β γ GTP Adenil ciclasa inactiva γ β GTP Adenil ciclasa inactiva α 2rece p to r Gi β γ α i GTP αs GTP α X \ Adenil ciclasa ACTIVA 82 INTRODUCCIÓN 83 trastorno bipolar (132, 133). También se ha presentado ADRBK2 como un gen candidato que podría estar implicado en la expresión de desórdenes respiratorios durante el sueño (134). Este gen se ha encontrado en librerías de ADNc del Proyecto de Anatomía del Genoma del Cáncer (Cancer Genome Anatomy Project) (135) perteneciente a diversos tipos de tejidos: adiposo, células B, hueso, encéfalo, cartílago, cerebelo, cerebro, colon, endocrino, esófago, ojo, feto, tracto gastrointestinal, geniturinario, célula germinal, cabeza y cuello, corazón, riñón, hígado, pulmón, nódulo linfático, linforreticular, glándula mamaria, músculo, nervios, ovarios, páncreas, islotes pancreáticos, sistema nervioso periférico, placenta, próstata, retina, piel, bazo, célula madre, estómago, célula T, testículo, tiroides, tejido no caracterizado, útero y vascular. En el Anexo II se muestra la información referente a este gen y su distribución en los distintos tejidos del organismo, según la base de datos del Proyecto de Anatomía del Genoma del Cáncer (135), cuya primera meta ha sido recopilar un catálogo completo de todos los genes expresados en las células de diversos tumores. Se han descrito varias actividades funcionales según el Instituto Bioinformático Europeo (European Bioinformatics Institute) (135) (Tabla 6): 83 INTRODUCCIÓN 90 Actividades funcionales: -actividad adrenoceptor -actividad receptor alfa2-adrenérgico -actividad receptor -actividad receptor similar a rodopsina Tabla 8. Actividades funcionales del gen ADRA2B (135) • AXIN 2 Este gen, también conocido como conductin o axil, se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 en posición 24 (17q24) (163), región que frecuentemente muestra una pérdida de heterozigosidad en el cáncer de mama (164), neuroblastoma (165), carcinoma hepatocelular (166) y otros tumores. Juega un importante papel en la regulación de la estabilidad de betacatenina, como sus homólogos conductin en el ratón y axil en la rata. Se ha visto que ambos son reguladores negativos de la vía Wnt/beta-catenina (167), la activación de esta vía se ha relacionado directamente con la proliferación celular y la apoptosis (168), y con la carcinogénesis del cáncer de colon (169). En el ratón, conductin organiza un complejo multiproteico de poliposis adenomatosa de colon (APC), beta-catenina, GSK3B (kinasa serina/treonina) y conductin, que dirige la degradación de beta-catenina y regula los niveles citosólicos de ésta. La activación de la vía Wnt inhibe la actividad de GSK3B, causando un acúmulo de beta-catenina en el citoplasma y en el núcleo permitiendo la transcripción de diversos genes (168). Aparentemente, la desregulación de beta-catenina es un acontecimiento importante en la formación de ciertos tumores (163, 170). 90 INTRODUCCIÓN 91 La beta-catenina es una proteína con una función dual que interviene en dos procesos totalmente distintos: por un lado, es una proteína estructural que forma parte de las uniones entre células epiteliales vecinas y regula la adhesión célula-célula mediante la interacción con cadherina (proteína transmembrana), contactando así sus citoesqueletos y constituyendo un fuerte ensamblaje que conecta las células entre sí (Figura 4). Pero también esta proteína puede actuar como un coactivador transcripcional de genes implicados en la proliferación celular. La beta-catenina, como todas las proteínas, está sometida a una cinética de síntesis y degradación. Habitualmente la beta-catenina existe en el citoplasma, unida a cadherina, en una forma no fosforilada. La degradación de esta proteína queda determinada por su fosforilación, y es la maquinaria de fosforilación la que la célula utiliza para regular este proceso (170). Parece que la función principal del gen AXIN 2 es promover la fosforilación de beta-catenina mediante la kinasa serina/treonina GSK3B (163) (Figura 5). Cuando la velocidad de síntesis es mayor que la de degradación tenemos mayor disponibilidad de beta-catenina citoplasmática (no fosforilada), ésta puede translocarse en el núcleo y unirse a factores de transcripción que resultarán activados, determinando así la transcripción de una serie de genes específicos (ciclina D1, c-myc, etc) que se han relacionado con la carcinogénesis (171) (Figura 6). 91 INTRODUCCIÓN 92 Figura 4. Complejo adhesivo de cadherina y ß-catenina. Figura 5. Vínculo entre la adhesión celular y la vía de señalización de Wnt. Se observa la adhesión célula-célula mediante la interacción ß-catenina/cadherina, así como el papel de AXIN 2 en la vía de señalización de Wnt para promover la fosforilación de ß-catenina mediante GSK3B. 92 INTRODUCCIÓN 93 Figura 6. Movimiento de ß-catenina al núcleo determinando la transcripción de genes específicos. Mutaciones en este gen elevan los niveles de beta-catenina, proteína asociada al desarrollo del cáncer colorrectal. Liu y cols. (172) examinaron el ADN de 105 cánceres colorrectales, de los que 45 tenían errores celulares asociados a este gen. También se han asociado mutaciones en AXIN 2 con agenesias dentales familiares (173). Análisis mediante Northern blot han mostrado que AXIN 2 se expresa en 93 INTRODUCCIÓN 94 gran medida en órganos como el timo, la próstata, los testículos, el intestino delgado y los ovarios, pero se expresa levemente en el colon (163). Este gen se ha encontrado en librerías de ADNc del Proyecto de Anatomía del Genoma del Cáncer (135) perteneciente a diversos tipos de tejidos: corteza suprarrenal, cerebro, cartílago, cerebelo, colon, endocrino, ojo, feto, tracto gastrointestinal, geniturinario, célula germinal, corazón, riñón, hígado, pulmón, linforreticular, glándula mamaria, nervios, ovario, paratiroides, placenta, próstata, retina, célula madre, estómago, célula T, testículo, timo, tejido no caracterizado, útero y vascular. En el Anexo II se muestra la información referente a este gen y su distribución en los distintos tejidos del organismo, según la base de datos del Proyecto de Anatomía del Genoma del Cáncer (135). Se han descrito varias actividades funcionales según el Instituto Bioinformático Europeo (135) (Tabla 9): Tabla 9. Actividades funcionales del gen AXIN 2 (135) Actividades funcionales: -receptor de la vía de señalización de Wnt -desarrollo -transducción de señales -intracelular -actividad transducción de señales 94 INTRODUCCIÓN 95 • ATPasas Las enzimas ATPasas vacuolares (V-ATPasas) son complejas en su estructura, pero tienen una función primaria: emparejar la hidrólisis de ATP con la translocación de H+ a través de las membranas biológicas (174). Las H+-ATPasas vacuolares (V-ATPasas) tienen una estructura y un mecanismo de acción similar a las F-ATPasas. En las células eucarióticas las F- ATPasas están confinadas a las organelas semi-autónomas, cloroplastos y mitocondrias, que contienen sus propios genes que codifican algunas de las subunidades de las F-ATPasas. En contraste con las F-ATPasas, cuya función primaria en las células eucarióticas es formar ATP a expensas de la fuerza motivada por protones, las V-ATPasas funcionan exclusivamente como bombas de protones ATP-dependientes (175). El ATP es un compuesto químico lábil que está presente en todas las células. Es una combinación de adenosina, ribosa y tres radicales fosfato. Los últimos dos radicales fosfato están unidos al resto de la molécula por los llamados enlaces de alta energía. La liberación de cada uno de los dos radicales fosfato libera 12.000 calorías de energía. Después de que el ATP pierde un radical fosfato, este compuesto pasa a ser difosfato de adenosina (ADP), y tras la pérdida del segundo radical fosfato, se convierte en monofosfato de adenosina (AMP). El ATP está presente en cualquier punto del citoplasma y del nucleoplasma de todas las células, y prácticamente todos los mecanismos fisiológicos que necesitan energía para operar la obtienen directamente del ATP. A su vez, los alimentos se oxidan de forma gradual en la célula, y la energía liberada se utiliza para volver a formar ATP, manteniendo siempre un aporte de esta sustancia; toda esta transferencia de energía tiene lugar por medio de las reacciones acopladas. En resumen, el ATP es un compuesto intermediario que tiene la capacidad peculiar de participar en muchas reacciones acopladas: reacciones con el alimento para extraer la energía y reacciones con muchos mecanismos fisiológicos para proporcionar energía para su función. Por esta 95 INTRODUCCIÓN 96 razón, al ATP se le ha llamado “moneda de energía” del organismo, que puede ganarse y gastarse una y otra vez (176). La fuerza motivada por protones generada por las V-ATPasas en organelas y membranas de las células eucarióticas es utilizada como una fuerza de conducción por numerosos procesos de transporte secundario (174). Las V-ATPasas translocan protones a través de membranas de diversas organelas intracelulares (lisosomas, endosomas, gránulos secretores, etc.). Este transporte es electrogénico, y establece un gradiente de pH ácido y un potencial transmembrana positivo dentro de estos compartimentos intracelulares (177). La actividad de las V-ATPasas es esencial para muchos procesos celulares, incluyendo el tráfico de membrana intracelular, procesamiento y degradación de proteínas, y endocitosis mediada por receptores. Las V-ATPasas están también presentes en la membrana plasmática de células especializadas secretoras de protones (174). Las V-ATPasas fueron detectadas por primera vez en organelas conectadas con el sistema vacuolar. Éstas proporcionan la mayoría de la energía requerida para los procesos de transporte en varias organelas del sistema vacuolar de las células eucarióticas (174). La fuerza de conducción para el acúmulo de neurotransmisores en las vesículas sinápticas, es la fuerza motivada por protones generada por V-ATPasas. Estas enzimas también son vitales para las principales funciones de los endosomas y el aparato de Golgi (174). La fuerza motivada por Na+, producida por la ATPasa Na+/K+ fue ampliamente reconocida como el principal dador de energía de la membrana plasmática en las células animales. Recientemente se descubrió que las V- ATPasas son más importantes que las Na+/K+-ATPasas para proporcionar 96 INTRODUCCIÓN 97 energía a las membranas plasmáticas animales (174). La V-ATPasa usualmente se localiza de forma apical a las membranas plasmáticas de las células epiteliales, hacia el lado citoplasmático de la membrana, y bombea H+ hacia fuera. Este bombeo de protones permite siempre un voltaje trans-positivo, pero acompañado de diversos eventos este voltaje puede desaparecer y el transcompartimento puede volverse ácido, básico, o neutral, dependiendo de la naturaleza de canales paralelos o portadores que acompañan el protón (178). Por esta razón, las V-ATPasas pueden proporcionar energía a la membrana, regular el pH intracelular y causar una acidificación o alcalinización extracelular (174). La estructura, función, biogénesis y regulación de las V-ATPasas ha sido ampliamente revisada por Stevens y Forgac (179), por lo que explicaremos las subunidades estructurales de V-ATPasa según la nomenclatura propuesta por dichos autores. Se ha visto que las V-ATPasas son casi idénticas en la composición de sus subunidades en todas las células eucarióticas. Están compuestas por 2 estructuras distintas: un sector catalítico periférico (V1) y un sector de membrana hidrofóbico (V0). El sector catalítico está compuesto por 5 polipéptidos diferentes conocidos como subunidades A, B, C, D y E en orden decreciente, por el peso molecular de 72 a 33kDa, respectivamente. Recientes avances en el conocimiento acerca del mecanismo de acción de las F-ATPasas han clarificado las relaciones entre la función y la estructura de cada una de las subunidades individuales de las enzimas. A cada subunidad de la V-ATPasa se le asigna de una a cuatro partes de un complejo mecanoquímico (174) (Figura 7): 1.-Unidad catalítica 2.-Tronco o tallo 3.-Gancho 4.-Turbina 97 INTRODUCCIÓN 98 Figura 7. Subunidades estructurales de V-ATPasa. Distribución de varias subunidades en 4 partes funcionales de la enzima: Catalytic: unidad catalítica; Shaft: tronco o tallo; Hook: gancho; Turbine: turbina. La función principal del sector catalítico es unir ATP y catalizar la hidrólisis de ATP, mientras que la función principal del sector de membrana es conducir 98 INTRODUCCIÓN 99 protones a través de la membrana (174). La energía de estos dos procesos es capaz de catalizar cambios conformacionales inducidos por la vía mecanoquímica. De acuerdo con este concepto, Paul Boyer (180) propuso hace 2 décadas que la hidrólisis catalizada por las subunidades alfa y beta de F-ATPasa inducirán un momento de rotación en el tallo que rotará la turbina y las bombas de protones a través de la membrana. El gancho previene la rotación de la unidad catalítica (Figura 7). A continuación, analizaremos la estructura y función de las subunidades individualmente (174): 1.-Subunidades catalíticas 1A.- Subunidad A: peso molecular de 68kDa. Su función es unir ATP y catalizar su hidrólisis. 1B.- Subunidad B: tiene un peso molecular de 57kDa. Funciona como una subunidad reguladora que contiene el sitio de unión de ATP y, además, podría contribuir como remanente importante para la función catalítica de la subunidad A. 2.-Tallo o tronco 2A.- Subunidad D: peso molecular de 28kDa. Podría jugar un papel importante en la unión entre la hidrólisis de ATP y el bombeo de protones. Esta subunidad se comporta como el tallo rotatorio que adquiere su momento de rotación de cambios conformacionales en la subunidad A y da el torque a la turbina y los protones en el sector de membrana. 3.-Gancho 3A.- Subunidad E: peso molecular de 27kDa. La estructura de esta subunidad contiene alfa-hélices alongadas, por lo que se ha sugerido que podría 99 106 INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 107 4.- VALIDACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS CON MICROARRAYS DE ADN El análisis de la expresión génica mediante el uso de arrays de ADNc es claramente reproducible y fiable. Sin embargo, los resultados de estos ensayos, debido a la complejidad misma del proceso, pueden verse afectados por múltiples variables desde la preparación de la muestra al análisis de las imágenes finales. Entre otros problemas, la eficiencia de la reacción de retrotranscripción se ve afectada tanto por las enzimas empleadas como por los primers y estructuras secundarias del ARN mismo, con lo que esto puede afectar a la representación de los transcritos poco abundantes. Esto se une a que no existe un consenso sobre la significación de las diferencias en la intensidad de hibridación (10). Actualmente, la tecnología de arrays es fundamentalmente útil a la hora de establecer un patrón general de expresión génica y de llevar a cabo un screening previo de expresión génica diferencial. La validación de tales resultados requiere un método alternativo como el Northern blot. La PCR en tiempo real permite evaluar la acumulación de producto durante la fase logarítmica de la reacción de PCR y actualmente es la estrategia más segura y reproducible para la cuantificación génica, y el método más utilizado para validar los resultados de expresión génica obtenidos mediante la tecnología de arrays (10, 181, 182). Hasta ese momento, los genes seleccionados han de ser considerados como candidatos a estar realmente implicados en el proceso de estudio sirviendo como listado de partida para dichas comprobaciones, aunque en muchos de los estudios en los 107 INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 108 que se utiliza esta doble metodología, se demuestra que los resultados obtenidos con microarrays no difieren sustancialmente de los obtenidos con técnicas convencionales. 4.1. PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL La tecnología de la PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) es un método que permite la cuantificación de ácidos nucleicos con gran exactitud y fiabilidad. La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la amplificación de un fragmento de interés. Combina el método de amplificación de la PCR desarrollado por Mullis, con la utilización de moléculas de fluorocromo para poder monitorizar paso a paso y de manera cuantificable el proceso de amplificación de un segmento específico de ADN de interés. Esta técnica se realiza en un equipo que integra una PCR convencional y un espectrofluorímetro que determina la fluorescencia que se produce en el tubo de amplificación en todo momento a lo largo del proceso (Figura 8). El fluoróforo está presente constantemente en el medio de la reacción y la señal obtenida al final de cada ciclo de amplificación se representa en una gráfica frente al número de ciclos y se obtiene una curva que muestra el transcurso del proceso. El equipo utiliza un láser para emitir la luz que excita el fluoróforo y la tecnología de las cámaras de diodos computerizadas (CCD) para determinar la fluorescencia emitida a distintas longitudes de onda en función del fluoróforo que se utilice. La cámara CCD suele ser multicanal, lo que le permite realizar varios análisis simultáneos en el mismo tubo de PCR. Para llevar a cabo esta técnica se necesita un termociclador con capacidad para detectar y medir la fluorescencia. La exactitud y la precisión de los aparatos de RT-PCR se ven afectadas, en gran medida, por la razón señal o ruido, la cual 108 INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 109 depende del formato de detección (fluoróforos) y de la calidad del sistema óptico. Otro parámetro a tener en cuenta es la homogeneidad de la temperatura dentro del instrumento, ya que la menor desviación de la temperatura llevaría a una cuantificación errónea. Figura 8. PCR Cuantitativo ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. Applied Biosystems. Las estrategias de marcaje disponibles son múltiples (Figura 9), pero las más ampliamente utilizadas se basan en sondas Taqman o SYBR green. El SYBR-Green I (Figura 9a) es un fluoróforo específico de ADN bicatenario muy usado en la RT-PCR. Este fluoróforo se une con gran afinidad al surco menor del ADN bicatenario, aumentando su fluorescencia unas 1000 veces. Aunque de gran sensibilidad, es un marcador de ácidos nucleicos en general y por tanto no asegura la especificidad. Este formato de detección necesita una puesta a punto previa para que la PCR no amplifique productos inespecíficos que luego el fluoróforo detectaría, introduciendo errores en el posterior análisis de los resultados. Para detectar específicamente una secuencia se utilizan sondas de oligonucleótidos etiquetadas con fluoróforos con distintas formas de detección. La intensidad de la señal se relaciona con la cantidad de producto de PCR de dos formas: a) una disminución del amortiguamiento de la fluorescencia dependiente 109 INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 110 del producto, en la que el fluoróforo, la molécula delatora, y el amortiguador, quencher, se separan al unirse la sonda a la diana (Figura 9c, d, e, f); b) un incremento de la transferencia de energía resonante fluorescente, FRET, del donador al fluoróforo aceptor al quedar cercanos cuando se une la sonda a la diana (Figura 9b). Figura 9. Formatos de detección. D: donador; A: aceptor; R: delator (fluoróforo); Q: amortiguador. a) SYBR-Green I; b) sondas de hibridación; c) sondas “taqman”; d) balizas moleculares; e) sondas “Sunrise”; f) sondas escorpión 110 INTRODUCCIÓN __________________________________________________________________ 111 Para el análisis cuantitativo del producto, se analiza la curva de amplificación. El número de copias de la diana al inicio de la reacción se puede cuantificar con gran precisión a través del ciclo umbral (Ct). El Ct es el número de ciclos necesarios para que se produzca un aumento de fluorescencia significativo con respecto a la señal de base, y es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas molde. De esta manera, utilizando muestras patrones que contienen diluciones seriadas de concentraciones conocidas de la diana, se construye una recta de calibrado que relaciona los Ct con el logaritmo de la cantidad inicial de molde (N0). Extrapolando en esta recta los Ct obtenidos para las muestras problema, se puede estimar el valor de sus N0. La eficiencia de la reacción también se puede calcular a partir de los Ct de los patrones. Para lograr una cuantificación correcta, la eficiencia de patrones y muestras problema deben ser iguales, lo que implica una puesta a punto previa de la PCR. En caso de conocer la concentración absoluta de moléculas de molde en los patrones, los resultados serán absolutos. Pero la cuantificación absoluta no siempre es necesaria. Para analizar cambios relativos en la cantidad de transcritos se elige como patrón un transcrito de referencia que no varíe su expresión en los tratamientos a analizar, normalmente un gen de mantenimiento o housekeeping. Comparando los Ct del gen de referencia con el gen problema en muestras tratadas y sin tratar, se pueden determinar cambios relativos en la expresión del gen problema. 111 112 113 II. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS 114 HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS 115 -HIPÓTESIS DE TRABAJO: Los genes ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 y ATP6V0E se sobreexpresan en el COCE en relación a la mucosa oral normal. La confirmación o no de esta sobreexpresión puede informarnos acerca de los mecanismos moleculares en los que estos genes están implicados en la aparición y desarrollo del COCE. -OBJETIVOS: 1.- Estudiar mediante RT-qPCR en el COCE y en la mucosa oral normal la expresión de los genes ADRBK2, ADRB1 y ADRA2B, pertenecientes a la familia de los receptores adrenérgicos. 2.- Estudiar mediante RT-qPCR en el COCE y en la mucosa oral normal la expresión del gen AXIN 2. 3.- Estudiar mediante RT-qPCR en el COCE y en la mucosa oral normal la expresión de las ATPasas ATP6V1C1 y ATP6V0E. 115 MATERIAL Y MÉTODO 122 entre las diferentes muestras. Los valores de restricción utilizados son: z-score >1 y p< 0.05. Los genes seleccionados son: -3 genes pertenecientes a la familia de los receptores adrenérgicos: ADRBK2, ADRB1, ADRA2B. Estos 3 subtipos familiares están sobreexpresados sin existir previamente una relación clara documentada con el cáncer. -El gen AXIN 2, por ser previamente conocida su relación con el cáncer y la proliferación celular mediante la regulación de beta-catenina, ampliamente estudiado en el cáncer de colon. -Las ATPasas ATP6V1C1 y ATP6V0E, por ser 2 genes de la misma familia y cuya actividad como bomba de protones reguladora del pH ya ha sido descrita en relación al desarrollo y crecimiento del tumor en otros tipos de cáncer. Para el estudio del nivel de expresión de los genes seleccionados, se analiza cada gen por separado viendo las diferencias existentes entre la mucosa oral normal y el tejido tumoral en cada uno de los pacientes estudiados. 3.- METODOLOGÍA DE TRABAJO 3.1.- OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS A cada paciente se le practica una toma de biopsia del tumor y otra de tejido sano, siguiendo la técnica convencional. La toma de tejido sano se realiza de la misma región en la que se encuentra el tumor, pero en el lado contralateral de la boca. Las muestras se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido (temperatura de -195º C) tras la toma de la biopsia, y permanecen almacenadas a dicha temperatura hasta su procesado. 122 MATERIAL Y MÉTODO 123 3.2.- PROCESADO DE LAS MUESTRAS Las muestras congeladas siguen un proceso de extracción de ácidos nucleicos (ARN) y retrotranscripción para obtener ADNc. Todas las muestras son procesadas en el curso de una semana. En todos los casos el tejido tumoral y su correspondiente normal fueron procesados simultáneamente, todo ello para evitar diferencias en cuanto al almacenamiento o bien debidas al estado de los productos empleados que pudieran alterar la relación de cantidad y calidad entre ambos tejidos. Todo el experimento se realiza por duplicado. Los pasos a seguir son los siguientes: 1.- Homogeneización Se separa un fragmento de aproximadamente 30 mg de tejido congelado, que se tritura lentamente en un mortero en presencia de nitrógeno líquido hasta conseguir su pulverización completa. Entre muestra y muestra se lava cuidadosamente el mortero y todo el equipo con agua tratada con dietil pirocarbonato (DEPC). 2.-Extracción del ARN total A partir del tejido homogeneizado se obtiene el ARN total empleando el kit RNeasy minikit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo especificado. Este kit emplea una membrana para retener el ARN que, tras un lavado para eliminar impurezas, se eluye. La integridad del ARN se comprueba mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. 3.-Retrotranscripción 123 MATERIAL Y MÉTODO 124 A partir del ARN obtenido se procede a una reacción de retrotranscripción empleando la transcriptasa reversa AMV (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) y Random Primer (Roche). Las cantidades de producto para un volumen final de 20 microlitros vienen especificadas por el fabricante. Se incuba la mezcla a 37ºC durante una hora y tras la desnaturalización de la transcriptasa a 65ºC durante 10 minutos se almacena el ADNc obtenido a -20ºC hasta su utilización. Para comprobar la integridad y calidad del ADNc se realiza la amplificación del gen housekeeping Glucos-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) en el equipo de PCR en tiempo real "LigthCycler" (Roche). 3.3.- CUANTIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL Se cuantifica la presencia en las muestras de transcritos de los genes ADRBK2, ADRB1, ADRA2B, AXIN 2, ATP6V1C1 y ATP6V0E, mediante el empleo de sondas taqman. En los ensayos basados en la actividad 5’ nucleasa (Figura 10), una sonda oligonucleotídica específica hibrida con un secuencia situada entre los dos primers de amplificación. Esta sonda está marcada con un fluoróforo en su extremo 5’ llamado reporter y otro fluoróforo en el extremo 3’ llamado quencher. La sonda presenta una modificación en su extremo 3’ que impide su extensión durante la amplificación. La ruptura de la sonda por la actividad 5’-3’ exonucleasa de la Taq polimerasa durante la elongación de la cadena libera el reporter y, consiguientemente, de la proximidad del quencher 3’, incrementándose la intensidad de la emisión del reporter (Figura 10). El ciclo en el que la intensidad de la emisión de una muestra sobrepasa la 124 MATERIAL Y MÉTODO 125 línea de base (ruido de fondo), se conoce como ciclo umbral (Ct, threshold cycle) y es inversamente proporcional a la concentración de secuencias diana de la sonda: a mayor concentración de ADNc diana, menor es el número de ciclos de amplificación requeridos para detectarla. Cromo-4 (MJ Research, Cambridge, Estados Unidos) es un equipo de tiempo real que emplea placas de 96 pocillos. Durante la PCR la sonda taqman que hibrida con la secuencia diana se rompe debido a la actividad 5’ exonucleasa de la polimerasa, liberando el fluoróforo reporter (6-carboxi-fluoresceina, FAM) del quencher (6-carboxi-tetrametil-rodamina, TAMRA). Un láser excita los electrones de las moléculas del reporter, lo que se traduce en una emisión entre 500 y 600 nm que es capturada a través de cables de fibra óptica y focalizada en un detector. La señal es procesada y analizada por medio de un software instalado en el equipo. Las intensidades de las emisiones de las reacciones se miden secuencialmente cada pocos segundos, evaluándose la relación de intensidades entre los fluoróforos del reporter y del quencher. Dado que la intensidad del fluoróforo del quencher varía mínimamente durante la PCR, se puede emplear para normalizar las variaciones en la intensidad del reporter. Durante la PCR el software calcula un valor denominado Rn según la ecuación: Rn = (Rn+) – (Rn-). Rn+ es la intensidad del reporter dividida por la intensidad del quencher en el ciclo n de la PCR, y Rnes la intensidad del reporter dividida por la intensidad del quencher del ciclo n-1 previo de amplificación. Así, Rn representa la cantidad de sonda hibridada y rota por la actividad 5’ nucleasa. Un valor de Rn se calcula por cada ciclo durante la fase de elongación y se representa contra el número de ciclos en un diagrama, generándose así una curva de amplificación (Figura 11). 125 MATERIAL Y MÉTODO 126 Figura 10. Cuantificación por PCR en tiempo real. 126 MATERIAL Y MÉTODO 127 Los ensayos taqman para cada uno de los genes fueron diseñados por Applied Biosystems (Foster City, Estados Unidos), (Assay-by-design). Las mezclas provistas incluyen todos los reactivos necesarios salvo el ADNc de la muestra y funcionan con un protocolo único y común a todos. En la Figura 11 se muestra la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para uno de los genes estudiados, donde se representa la intensidad de señal del fluoróforo frente al número de ciclos. Esta curva mide la cuantificación del ARNm; es decir, el nivel de expresión de un gen. Figura 11. A la izquierda aparece la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para uno de los genes estudiados, donde la línea horizontal discontinua se corresponde con el Ct: ciclo en el que la intensidad de la emisión de una muestra sobrepasa la línea de base (ruido de fondo). La gráfica de la derecha representa la recta de calibrado del gen. El valor de r nos indica la calidad de la curva (su valor se comprende entre 0 y 1): cuanto más cercano sea a 1 la calidad de la curva es mayor. 4.- NORMALIZACIÓN DE DATOS Las curvas de expresión de cada gen se normalizan utilizando un gen housekeeping (GUS) que se expresa siempre y en una tasa constante en todas 127 MATERIAL Y MÉTODO 128 las células. Para hallar el incremento/disminución de la expresión del gen nos basamos siempre en los valores del gen GUS: si conocemos las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón del gen GUS y la cantidad de ADNc inicial para el gen estudiado en la muestra de mucosa normal, podemos establecer una relación para hallar la cantidad de ADNc que correspondería al gen estudiado en la muestra de tumor. Una vez realizada esta operación, hallamos la diferencia entre el valor que tenemos en la muestra tumoral del gen estudiado y el que hemos obtenido tras realizar los cálculos con los valores de referencia, y vemos si esta diferencia tiene un valor positivo o negativo: si el valor es positivo significa que se está expresando más en el tumor que en el tejido normal y viceversa si el valor es negativo. Con el resultado obtenido establecemos una nueva relación, con la que obtenemos el valor de expresión del gen expresado en porcentaje. Ejemplo: Muestras ADRBK2 GUS 1-Tumor 110,219 176,733 1-Normal 91,3999 175,449 175,449----------91,3999 176,733---------- X X= 92,07 110,219 - 92,07= +18,15 92,07----------100 18,15---------- X X= +19,71% 128 MATERIAL Y MÉTODO 129 5.- ANÁLISIS DEL NIVEL DE EXPRESIÓN Con los valores correspondientes al incremento/disminución de la expresión en porcentaje de cada gen en cada paciente obtenemos el nivel de expresión de cada gen. Los valores positivos se corresponden con sobreexpresión en la muestra tumoral y los valores negativos se corresponden con subexpresión en la muestra tumoral. 6.- ESTUDIO ESTADÍSTICO Para verificar la existencia de asociación entre la expresión del gen y el tumor, se utiliza la prueba de los signos. Dado que se intenta la confirmación de la sobreexpresión del gen se utilizan pruebas estadísticas de una cola (o unilaterales). Consideramos sobreexpresión del gen cuando hay un 5% ó más de expresión en el tumor que en el tejido sano. Para verificar la posible asociación entre las distintas variables estudiadas (edad, sexo, consumo de tabaco, localización del tumor y estadio del tumor) y el porcentaje de sobreexpresión del gen en el tejido tumoral, se utiliza la prueba U de Mann-Whitney. Se consideran significativos los valores de p< 0.05. 129 130 131 IV. RESULTADOS RESULTADOS 138 Réplica 1 Réplica 2 Type Label C(T) cantidad C(T) cantidad Sample 1-Tumor 30.266 72.5856 31.664 69.529 Sample 1-Normal 28.395 94.7455 27.092 100.331 Standard Ct-ADRA2B-1 35.171 1000 33.916 1000 Sample 2-Tumor 28.685 90.9024 29.473 85.367 Sample 2-Normal 31.149 64.0177 30.161 71.353 Standard Ct-ADRA2B-01 None 100 None 100 Sample 3-Tumor 27.979 100.516 26.825 120.238 Sample 3-Normal 25.692 139.187 24.516 155.940 Standard Ct-ADRA2B-050 None 20 38.508 20 Sample 4-Tumor 28.629 91.6309 28.667 85.420 Sample 4-Normal 31.214 63.4264 30.009 70.476 Standard Ct-ADRA2B-001 30.490 10 38.906 10 Sample 5-Tumor 29.473 81.2609 28.038 88.342 Sample 5-Normal 32.558 52.3815 33.122 47.789 Sample 6-Tumor 28.349 95.3634 27.695 102.749 Sample 6-Normal 29.042 86.4008 28.199 93.474 Sample 7-Normal 31.184 63.6967 30.479 75.446 Sample 7-Tumor 27.271 111.168 26.566 130.250 Sample 8-Normal 29.031 86.5388 28.121 92.637 Sample 8-Tumor 25.263 147.964 23.564 166.960 Tabla 16. Ct y cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor para el gen ADRA2B 138 RESULTADOS 139 En la Figura 14 se muestra la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen ADRA2B, donde se representa la intensidad de señal del fluoróforo frente al número de ciclos. Figura 14. A la izquierda aparece la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen ADRA2B, donde la línea horizontal discontinua se corresponde con el Ct. La gráfica de la derecha representa la recta de calibrado del gen. El valor de r nos indica la calidad de la curva. 1.4.- AXIN 2 En la Tabla 17 se muestran los Ct y las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor empleando la curva patrón de AXIN2 para todas las muestras de mucosa normal y tumoral en los 8 pacientes estudiados. Se observan los valores de las réplicas 1 y 2. 139 RESULTADOS 140 Réplica 1 Réplica 2 Type Label C(T) cantidad C(T) cantidad Sample 1-Tumor 30.190 40.9796 28.982 45.0456 Sample 1-Normal 29.746 46.818 28.526 52.0238 Standard Ct-AXIN2-1 28.100 1000 27.405 1000 Sample 2-Tumor 28.542 67.1992 27.646 68.691 Sample 2-Normal 30.158 41.3741 29.398 39.5065 Standard Ct-AXIN2-01 31.805 100 30.612 100 Sample 3-Tumor 28.622 65.594 27.750 66.4801 Sample 3-Normal 29.744 46.8465 28.989 44.9441 Standard Ct-AXIN2-050 34.302 20 33.471 20 Sample 4-Tumor 28.215 74.1231 27.525 71.3575 Sample 4-Normal 30.001 43.3691 29.306 40.6619 Standard Ct-AXIN2-001 35.684 10 34.492 10 Sample 5-Tumor 28.366 70.8411 27.692 67.6911 Sample 5-Normal 33.962 13.2075 33.123 12.1826 Sample 6-Tumor 28.784 62.4913 27.871 63.9762 Sample 6-Normal 31.041 31.7383 30.118 31.4708 Sample 7-Normal 28.857 61.1282 28.115 59.2402 Sample 7-Tumor 32.394 21.1481 31.583 19.814 Sample 8-Normal 32.896 18.189 32.161 16.5088 Sample 8-Tumor 29.086 57.0715 28.034 60.778 Tabla 17. Ct y cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor para el gen AXIN 2 140 RESULTADOS 141 En la Figura 15 se muestra la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen AXIN2, donde se representa la intensidad de señal del fluoróforo frente al número de ciclos. Figura 15. A la izquierda aparece la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen AXIN2, donde la línea horizontal discontinua se corresponde con el Ct. La gráfica de la derecha representa la recta de calibrado del gen. El valor de r nos indica la calidad de la curva. 1.5.- ATP6V1C1 (ATPase, H+ transporting, lysosomal 42KDa, V1 subunit C, isoform 1) En la Tabla 18 se muestran los Ct y las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor empleando la curva patrón de ATP6V1C1 para todas las muestras de mucosa normal y tumoral en los 8 pacientes estudiados. Se observan los valores de las réplicas 1 y 2. 141 RESULTADOS 142 Réplica 1 Réplica 2 Type Label C(T) cantidad C(T) cantidad Sample 1-Tumor 25.558 164.537 24.385 192.349 Sample 1-Normal 27.982 79.5055 26.596 95.7064 Sample 2-Tumor 27.132 102.587 26.097 112.016 Sample 2-Normal 30.559 36.6777 29.639 36.613 Sample 3-Tumor 26.151 137.711 25.177 149.772 Sample 3-Normal 29.505 50.33 28.504 52.3872 Sample 4-Tumor 25.571 163.902 24.804 168.524 Sample 4-Normal 28.737 63.3701 28.116 59.2237 Sample 5-Tumor 28.735 63.4133 27.600 69.6984 Sample 5-Normal 34.116 12.6141 33.749 9.99717 Standard Ct-ATP6V1C1-1 25.752 1000 24.671 1000 Sample 6-Tumor 27.856 82.5592 26.796 89.8478 Sample 6-Normal 30.057 42.6461 29.111 43.2452 Standard Ct-ATP6V1C1-01 29.745 100 28.764 100 Sample 7-Normal 28.601 66.0234 27.802 65.3902 Sample 7-Tumor 29.245 54.4144 28.320 55.5165 Standard Ct-ATP6V1C1-05 32.481 20 31.493 20 Sample 8-Normal 31.946 24.1935 31.168 22.5876 Sample 8-Tumor 26.386 128.344 25.637 129.555 Standard Ct-ATP6V1C1-001 33.174 10 32.290 10 Tabla 18. Ct y cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor para el gen ATP6V1C1 142 RESULTADOS 143 En la Figura 16 se muestra la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen ATP6V1C1, donde se representa la intensidad de señal del fluoróforo frente al número de ciclos. Figura 16. A la izquierda aparece la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen ATP6V1C1, donde la línea horizontal discontinua se corresponde con el Ct. La gráfica de la derecha representa la recta de calibrado del gen. El valor de r nos indica la calidad de la curva. 1.6.- ATP6V0E (ATPase, H+ transporting, lysosomal 9KDa, V0 subunit e) En la Tabla 19 se muestran los Ct y las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor empleando la curva patrón de ATP6V0E para todas las muestras de mucosa normal y tumoral en los 8 pacientes estudiados. Se observan los valores de las réplicas 1 y 2. 143 RESULTADOS 144 Réplica 1 Réplica 2 Type Label C(T) cantidad C(T) cantidad Sample 1-Tumor 22.364 429.158 21.530 473.835 Sample 1-Normal 23.444 310.357 22.354 365.305 Standard Ct-ATP6V0E-1 20.888 1000 20.245 1000 Sample 2-Tumor 25.501 167.398 24.637 177.622 Sample 2-Normal 27.049 105.19 26.309 104.778 Standard Ct-ATP6V0E-01 24.716 100 24.002 100 Sample 3-Tumor 24.960 196.9 24.102 210.316 Sample 3-Normal 25.707 157.373 25.007 158.061 Standard Ct-ATP6V0E-050 27.239 20 26.611 20 Sample 4-Tumor 23.793 279.508 22.857 311.606 Sample 4-Normal 26.333 130.393 25.707 126.7 Standard Ct-ATP6V0E-001 28.248 10 27.503 10 Sample 5-Tumor 27.073 104.446 26.093 112.175 Sample 5-Normal 30.609 36.1395 29.711 35.7895 Sample 6-Tumor 26.429 126.697 25.578 131.973 Sample 6-Normal 27.845 82.822 27.172 79.7857 Sample 7-Normal 26.717 116.211 26.057 113.443 Sample 7-Tumor 27.206 100.349 26.192 108.699 Sample 8-Normal 28.823 61.7532 28.210 57.486 Sample 8-Tumor 25.066 190.732 24.1251 200.669 Tabla 19. Ct y cantidades de ADNc inicial calculadas a partir de dicho valor para el gen ATP6V0E 144 RESULTADOS 145 En la Figura 17 se muestra la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen ATP6V0E, donde se representa la intensidad de señal del fluoróforo frente al número de ciclos. Figura 17. A la izquierda aparece la gráfica correspondiente a la RT-qPCR para el gen ATP6V0E, donde la línea horizontal discontinua se corresponde con el Ct. La gráfica de la derecha representa la recta de calibrado del gen. El valor de r nos indica la calidad de la curva. 2.- NORMALIZACIÓN DE DATOS 2.1.- ADRBK2 (adrenergic, beta, receptor kinase 2) En la Tabla 20 se muestran las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón de ADRBK2 en las muestras de mucosa tumoral y normal en comparación con las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón del gen GUS (gen housekeeping que se toma como referencia) en ambas muestras para los 8 pacientes, así como el incremento/disminución (I/D) de la expresión en porcentaje. 145 RESULTADOS 146 ADRBK2 GUS I/D (%) Pacientes Tumor Normal Tumor Normal 1 110.219 91.3999 176.733 175.449 +19,71% 2 137.05 78.0748 140.985 112.83 +40,48% 3 151.065 83.5296 159.067 99.417 +13,03% 4 161.979 110.512 178.046 121.863 +0,32% 5 94.0605 34.8502 114.481 62.0838 +46,37% 6 126.549 82.8851 146.632 112.26 +16,89% 7 83.8359 100.999 104.294 134.196 +6,8% 8 148.747 62.0617 152.554 82.3166 +29,32% Tabla 20. Cantidades de ADNc inicial de ADRBK2 y GUS en las muestras de mucosa tumoral y normal en los 8 pacientes estudiados y el incremento/disminución (I/D) de la expresión en porcentaje. 2.2.- ADRB1 (adrenergic, beta-1-, receptor) En la Tabla 21 se muestran las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón de ADRB1 en las muestras de mucosa tumoral y normal en comparación con las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón del gen GUS en ambas muestras para los 8 pacientes, así como el incremento/disminución de la expresión en porcentaje. 146 RESULTADOS 147 ADRB1 GUS I/D (%) Pacientes Tumor Normal Tumor Normal 1 67.5433 75.6448 176.733 175.449 -11,36% 2 73.0723 63.666 140.985 112.83 -8,15% 3 82.7999 98.2255 159.067 99.417 -47,32% 4 61.6401 63.5058 178.046 121.863 -33,56% 5 84.2826 48.2307 114.481 62.0838 -5,23% 6 70.7605 66.7175 146.632 112.26 -18,8% 7 69.4072 61.3584 104.294 134.196 +45,55% 8 137.912 76.0474 152.554 82.3166 -2,15% Tabla 21. Cantidades de ADNc inicial de ADRB1 y GUS en las muestras de mucosa tumoral y normal en los 8 pacientes estudiados y el incremento/disminución (I/D) de la expresión en porcentaje. 2.3.- ADRA2B (adrenergic, alpha-2B-, receptor) En la Tabla 22 se muestran las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón de ADRA2B en las muestras de mucosa tumoral y normal en comparación con las cantidades de ADNc inicial calculadas a partir del Ct empleando la curva patrón del gen GUS en ambas muestras para los 8 pacientes, así como el incremento/disminución de la expresión en porcentaje. 147