Metabolismo energético en el tejido marrón de conejo y rata sometido a diferentes condiciones experimentales de ayuno y frío

TESIS DE DOCTORADO METABOLISMO ENERGÉTICO EN EL TEJIDO MARRÓN DE CONEJO Y RATA SOMETIDO A DIFERENTES CONDICIONES EXPERIMENTALES DE AYUNO Y FRÍO. Zuriñe López Ibarra ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN BÁSICA Y APLICADA EN CIENCIAS VETERINARIAS. SANTIAGO DE COMPOSTELA / LUGO AÑO 2019 AGRADECIMIENTOS Probablemente una de las partes más complicadas de escribir de una tesis sean los agradecimientos, ya que son muchas las personas que tiene que intervenir para que el trabajo de tesis llegue a su fin. En este sentido, a las primeras personas que quiero agradecer toda su dedicación, consejos y cariño, que estuvieron siempre siguiendo los experimentos y la escritura de esta tesis es a mis directores. Los profesores Antonio González Cantalapiedra, Vicente Lahera y Antonio López Farré. Evidentemente sin ellos este trabajo de tesis no hubiera podido realizarse. También me gustaría agradecer toda su ayuda a mis compañeros del laboratorio y muy especialmente a José Zamorano-León y Begoña Larrea. Ellos han hecho muy fácil mi estancia en el laboratorio, además de su infinita paciencia para enseñarme las técnicas necesarias para realizar los experimentos. Agradecer su ayuda a mis compañeros de trabajo, en especial a mi querida Amelie, que siempre tiene una palabra de ánimo para todos los proyectos que pasan por mi cabeza. Finalmente quiero agradecer todo su esfuerzo, ayuda y comprensión a mi familia. A mis padres Antonio y Zuriñe, a mi hermano Ignacio por su cariño, apoyo constante. Tampoco quiero olvidarme de mis abuelos que siempre me apoyan en todo momento. A Eduardo, que siempre conté con su apoyo incondicional y que sin él este trabajo hubiera sido imposible de realizar, por su paciencia y cariño, gracias. En general agradecer a todas aquellas personas que me han aportado un poco de su tiempo en este trabajo y que han hecho posible que llegue a su fin todo este trabajo, en este momento de transición y cambio de país. GRACIAS INDICE Resumen / Sumary 13 1. RESUMEN La termogénesis no temblorosa es importante para mantener de la temperatura corporal en neonatos de muchas especies de mamferos, además de en los mamferos hibernantes. El tejido adiposo blanco (TAB) es un órgano compuesto fundamentalmente de adipocitos llenos de lípidos. El tejido adiposo marrón (TAM) está formado por adipocitos marrones y, a diferencia del tejido adiposo blanco, tiene un gran número de mitocondrias. En el tejido adiposo marrón la generación de calor se produce por la activación de la proteína desacoplante 1 (UCP-1) que desacopla la cadena respiratoria mitocondrial. La norepinefrina ha sido considerada único estimulador de la activación de UCP-1. Sin embargo, diferentes estudios han demostrado la ineficacia de los agonistas de los receptores β-adrenérgicos para producir pérdida de peso y termogénesis. Objetivos: Esta tesis analiza si el metabolismo energético durante el periodo de ayuno a temperatura fisiológica es igual en el tejido adiposo blanco que en el tejido adiposo marrón en lagomorfos. En la segunda parte de la tesis se analizó si realmente la norepinefrina es el único responsable de los cambios en el metabolismo enzimático en el tejido adiposo marrón en condiciones de reducción de temperatura Métodos: El estudio comparativo del metabolismo de TAB y TAM se realizó en conejos New Zealand machos mantenidos previamente a la obtención de los tejidos durante 24 horas en ayuno, con libre acceso al agua y a 232ºC de temperatura ambiente. Para analizar el efecto de la temperatura y norepinefrina sobre el metabolismo del TAM, este se obtuvo de ratas Wistar macho incubándose una vez aislado durante 24 horas a 37ºC o 32ºC. Se realizaron experimentos adicionales incubando TAM a 32ºC con norepinefrina (10-6 mol/L). La expresión de las proteínas se determinó por Western blot y las actividades enzimáticas o el contenido de lactato se determinaron mediante kits comerciales. Resultados: En los tejidos grasos de los conejos se observó que el nivel de expresión de carnitina palmitoiltransferasa (CPT) -I y CPT-II, transportadores mitocondriales de ácidos grasos, y la enzima relacionada con la oxidación de ácidos grasos β, acil CoA deshidrogenasa, fue mayor en TAM que en TAB. La expresión de lactato deshidrogenasa y el contenido de lactato fue también mayor en TAM que en TAB. ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 14 En el análisis del efecto de la norepinefrina y reducción de temperatura en TAM aislado se observó que en el TAM incubado a 32ºC aumentó los niveles de expresión proteica de CPT-I, CPT-II y de UCP-1 además de la expresión y actividad de lactato deshidrogenasa. La expresión mitocondrial de la cadena α de la F1-ATP sintasa disminuyó a 32ºC en comparación con 37ºC. La presencia de norepinefrina en TAM incubado a 32ºC mantuvo una expresión de UCP-1 y cadena-α F1-ATP sintasa semejantes a las observadas en TAM incubando solamente a 32ºC sin norepinefrina. Conclusiones: Las conclusiones principales fueron que en conejos New Zealand sometidos a 24 horas de ayuno y temperatura fisiológica, el TAM tiene una maquinaria enzimática mayor para el transporte mitocondrial de ácidos grasos y su β-oxidación, además de parecer utilizar el metabolismo anaeróbico en mayor medida que el TAB. También en los experimentos in vitro con TAM se observó que la reducción de temperatura, independientemente de norepinefrina, estimula la expresión de UCP-1 y reduce la de la subunidad alfa de la ATP-sintasa. Esto sugiere que la reducción de la temperatura per se induce modificaciones en la expresión de proteínas asociadas a reducción en la generación de ATP, sugiriéndose la generación de calor sin norepinefrina. Resumen / Sumary 15 2. SUMMARY Non-trembling thermogenesis is important for maintaining body temperature in neonates of many mammalian species, as well as in hibernating mammals. The white adipose tissue (TAB) is an organ composed mainly of adipocytes full of lipids. Brown adipose tissue (TAM) is formed by brown adipocytes and, unlike white adipose tissue, has a large number of mitochondria. In brown adipose tissue, the generation of heat is produced by the activation of decoupling protein 1 (UCP-1) that uncouples the mitochondrial respiratory chain. Norepinephrine has been considered the sole stimulator of UCP-1 activation. However, different studies have shown the ineffectiveness of β-adrenergic receptor agonists to produce weight loss and thermogenesis. Objectives: This thesis analyzes whether the energy metabolism during the fasting period at physiological temperature is the same in white adipose tissue as in brown adipose tissue in lagomorphs. In the second part of the thesis it was analyzed whether norepinephrine is the only one responsible for the changes in the enzymatic metabolism in brown adipose tissue under conditions of temperature reduction. Methods: The comparative study of the metabolism of TAB and TAM was carried out in male New Zealand rabbits maintained before obtaining the tissues during 24 hours in fasting, with free access to water and at 23±2ºC of room temperature. To analyze the effect of temperature and norepinephrine on TAM metabolism, this was obtained from male Wistar rats being incubated once isolated for 24 hours at 37° C or 32° C. Additional experiments were performed incubating TAM at 32° C with norepinephrine (10-6 mol / L). The expression of the proteins was determined by Western blot and the enzymatic activities or the lactate content were determined by commercial kits. Results: In the fatty tissues of rabbits we observed that the expression level of carnitine palmitoyltransferase (CPT)-I and CPT-II, mitochondrial fatty acid transporters, and the enzyme related to the oxidation of fatty acids β, acyl CoA dehydrogenase , was higher in TAM than in TAB. Lactate dehydrogenase expression and lactate content was also higher in TAM than in TAB. ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 16 In the analysis of the effect of norepinephrine and temperature reduction in isolated TAM, it was observed that in the TAM incubated at 32º C, the protein expression levels of CPT-I, CPT-II and UCP-1 were increased in addition to the expression and activity of lactate dehydrogenase. The mitochondrial expression of the α chain of F1-ATP synthase decreased at 32° C compared to 37° C. The presence of norepinephrine in TAM incubated at 32° C maintained an expression of UCP-1 and α-F1-ATP synthase chain similar to those observed in TAM incubating only at 32° C without norepinephrine. Conclusions: The main conclusions were that in New Zealand rabbits subjected to 24 hours of fasting and physiological temperature, the TAM has a greater enzymatic machinery for the mitochondrial transport of fatty acids and its β-oxidation, in addition to apparently using the anaerobic metabolism in greater as the TAB. Also in the in vitro experiments with TAM it was observed that the reduction of temperature, independently of norepinephrine, stimulates the expression of UCP-1 and reduces that of the alpha subunit of ATP-synthase. This suggests that the reduction of the temperature per se induces modifications in the expression of proteins associated with reduction in the generation of ATP, suggesting the generation of heat without norepinephrine. INTRODUCCIÓN Introducción 19 3. TERMOGÉNESIS EN ANIMALES PEQUEÑOS La temperatura corporal se controla mediante el mantenimiento del equilibrio entre la producción y la pérdida de calor. La pérdida de calor, y en particular la velocidad de esta pérdida, en los organismos va a ser dependiente de dos factores fundamentales que son la velocidad de conducción del calor hasta la piel y la velocidad de conducción del calor desde la piel al entorno exterior. Esta pérdida de calor al entorno se produce por radiación, conducción y evaporación. La pérdida de calor por radiación se hace en forma de rayos infrarrojos ya que todos los objetos radian ondas infrarrojas. Dependiendo si la temperatura corporal es mayor o menor al entorno se radiaran rayos infrarrojos hacia fuera o hacia dentro del cuerpo. La pérdida de calor por conducción se hace por contacto directo con un objeto mientras que la pérdida de calor por convección se debe al movimiento del aire. El aire más cercano a la superficie de la piel se calienta por conducción y cuando este aire se retira, la piel conduce calor a la nueva capa de aire que no se ha calentado. La evaporación es también un mecanismo de pérdida de calor cuando la temperatura es alta. Cuando se evapora agua, por cada gramo de esta que pasa a estado gaseoso se pierden 0,58 calorías de calor. En este sentido, los animales capaces de perder calor por evaporación pueden llegar a ser este mecanismo el responsable de hasta el 22% de la pérdida de calor del cuerpo. Cuando el organismo está demasiado frío, se estimulan los sistemas de producción y conservación del calor. Entre ellos los principales serían: la vasoconstricción de los vasos sanguíneos de la piel, lo que disminuye la transferencia de calor desde el cuerpo, la piloereción que eleva el vello para atrapar aire próximo a la piel creando una capa de aire aislante. Este mecanismo es más frecuentemente utilizado en animales que tienen pelo. Podríamos definir, por lo tanto, la termorregulación como el mantenimiento de una temperatura corporal relativamente constante para asegurar unas óptimas funciones fisiológicas y para la supervivencia, a pesar de los cambios ambientales que puedan ocurrir en la temperatura. La temperatura esta captada por receptores específicos, unos de tipo periférico superficial y otros en ubicación nuclear, que envían información a un centro termorregulador que es el hipotálamo. En este sentido, el ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 20 hipotálamo desempeña un papel clave en la regulación de la temperatura. Así, en el área preóptica se desarrolla el centro termolítico (disminución de la temperatura), y en el hipotálamo dorsolateral hay un centro termogénico (aumento de la temperatura). Es obvio que los animales, al igual que el ser humano, tienen que regular su temperatura corporal, y para ello pueden utilizar diferentes mecanismos en función de las características de cada animal. Sirva como ejemplo que muchos animales regulan su temperatura corporal mediante el comportamiento, como buscar el sol o la sombra, o amontonarse para compartir calor. El calor corporal de un animal puede provenir de dos fuentes fundamentales que además sirve a su vez para poder clasificarlos (1): 1.- Animales endotermos: La endotermia es el mecanismo de obtención de calor corporal por producción interna. Los animales endotermos presentan mecanismos metabólicos que generan calor (termogénesis). Estos mecanismos requieren gastos energéticos y alimenticios elevados. 2.- Animales ectotermos: La ectotermia ocurre en animales que obtienen el calor corporal del ambiente, tomando el sol (heliotermia) o colocándose cerca de fuentes de calor como rocas calentadas por el sol (tigmotermia), etc. Al no gastar energía en generar calor, sus requerimientos energéticos son más bajos y no necesitan alimentarse tan a menudo como lo necesitan los endotermos. En este sentido, los animales endotérmicos tienen que mantener temperaturas corporales elevadas dentro de un rango estrecho mediante la producción de calor a través de procesos metabólicos. Así, el índice metabólico de los animales endotérmicos es varias veces mayor que el de los ectotérmicos y su producción de calor dependerá de las fluctuaciones de la temperatura ambiental (2). Aves y mamíferos serían animales endotermos (generan calor metabólico) y homeotermos (su temperatura es constante) mientras que reptiles, anfibios y el resto de animales serían ectotermos (obtienen calor de fuentes externas) y poiquilotermos, su temperatura varía con la del ambiente. No obstante, existen excepciones a esta clasificación y entre ellas podemos considerar la heterotermia que ocurre en animales que pueden pasar de la endotermia a la ectotermia. Ésta se suele dar en aves y mamíferos pequeños, con tasas metabólicas altas (muy activos y con requerimientos Introducción 21 energéticos altos) que reducen su temperatura durante períodos de inactividad. Estos períodos de inactividad pueden ser anuales o diarios. Los períodos de inactividad anuales son conocidos como hibernación (o estivación si se dan en verano). La hibernación la suelen llevar a cabo mamíferos típicamente endotermos como las ardillas, pequeños primates, erizos y muchos marsupiales. Los osos aunque también hibernan y disminuyen su metabolismo, no sufren un descenso tan brusco de temperatura corporal (ésta solo disminuye uno o dos grados). Ya hemos anteriormente comentado de forma breve que la termogénesis es el fenómeno fisiológico por el que los animales pueden generar calor y esta puede a su vez clasificarse en: 1.1. Termognesis temblorosa, en la que la generación extra de calor se debe a contracciones repetidas involuntarias del músculo esqueltico. Este temblor produce descenso del flujo sanguíneo periférico y se la considera también como la “termognesis rápida”. 1.2. Termognesis no temblorosa, también llamada termogénesis facultativa, cuyo responsable sería el tejido adiposo marrón. Es una termogénesis química, de origen hormonal por la que se produce calor mediante el metabolismo energético activo en el tejido marrón reduciendo la eficiencia energética del metabolismo de los nutrientes. La termogénesis temblorosa es la respuesta más temprana y primitiva para aumentar la producción de calor (3). Esta forma de termogénesis consume grandes cantidades de energía y no es efectiva durante frío severo (por ejemplo 4-6ºC para roedores) o durante exposiciones prolongadas al frío, interfiriendo con la actividad normal del animal. Por lo tanto, es comprensible que las especies homeotérmicas disponen de un mecanismo de termogéneis no temblorosa que utiliza mecanismos metabólicos para generar calor (4). En este sentido, la termogénesis no temblorosa es especialmente importante en el mantenimiento de la temperatura corporal en los neonatos de muchas especies de mamferos, incluida la especie humana, además de en los mamferos hibernantes. Tambin, la termogénesis no temblorosa tiene un papel fundamental en la regulación de la temperatura corporal de los adultos de muchas especies con relación a la temperatura ambiental, pudiéndose modificar en función de los cambios puntuales de la temperatura exterior ambiental, y por la exposición crónica al frío. Introducción 29 Figura 4.- Composición celular del tejido adiposo El tejido adiposo se localiza principalmente bajo la piel, pero también se encuentra rodeando los órganos internos. También se forma y acumula tejido adiposo graso en la zona del abdomen. La grasa abdominal tiene un perfil metabólico diferente, siendo más propensa a inducir una resistencia a la insulina. Esto se relaciona con que la obesidad central es un marcador para el defecto de tolerancia a la glucosa y es un factor de riesgo para la enfermedad cardiovascular. El adipocito tiene su origen a partir de células precursoras o preadipocitos, las cuales, bajo el estímulo de diferentes hormonas, citoquinas, factores de crecimiento y nutrientes, inician un proceso de diferenciación morfológica y funcional hasta convertirse en un adipocito maduro, lo que se conoce como adipogénesis (14), proceso que ocurre durante toda la vida de los mamíferos. En este sentido, es importante recordar que el tejido adiposo blanco no sólo es un órgano de reservorio de energía sino también un órgano secretor de ciertas moléculas que tienen una acción endocrina, paracrina y autocrina (15,16). Algunas de estas moléculas secretadas por los adipocitos están implicadas en la regulación del peso corporal (leptina, adiponectina) (17), en la respuesta inflamatoria generada localmente en una situación de obesidad (citoquinas como: TNF- alfa, IL-6 e IL-1β) (18), en la función vascular (angiotensina II) (19) o incluso reproductora (20) (Figura 5). Introducción 31 respuesta a la irisina podría ser una característica selectiva de las células beige localizadas en el interior de los depósitos de tejido adiposo blanco subcutáneo (26,27). 8. TEJIDO ADIPOSO Y ALMACENAJE DE TRIGLICÉRIDOS El adipocito es la célula de almacenamiento de triglicéridos, la forma de acumularse los lípidos. Los triglicéridos están sometidos a un constante flujo de síntesis y degradación dependiente del momento en el ciclo ayuno/saciedad. Es decir, este flujo de síntesis y degradación en los periodos de ingesta de alimentos y ayuno, se regula a través de las hormonas pancreáticas, insulina y glucagón. Cuando la insulina se infunde a concentraciones fisiológicas elevadas, ocurre una inhibición completa de la liberación de ácidos grasos no esterificados desde el tejido adiposo. Este fenómeno se produce mediante una doble acción: a) inhibición de la lipasa sensible a hormona que degrada triglicéridos mediante la defosforilación de esta enzima y b) reesterificación de ácidos grasos. Por el contrario, la movilización de los ácidos grasos necesita la activación de la lipasa sensible a hormona por fosforilación. La fosforilación de esta enzima ocurre por la proteína quinasa A. También para este proceso se necesita la fosforilación de la perilipina, una proteína que se localiza alrededor de la gota lipídica y que debe moverse de allí para que permita la accesibilidad de la lipasa sensible a hormona para que se puedan catabolizar los triglicéridos (Figura 6). La activación aguda de la lipolisis puede ocurrir también por la acción de catecolaminas (Figura 6), que actúan a través de receptores betaadrenérgicos, aunque en situaciones de ayuno durante la noche, cuando la lipolisis aumenta de manera constante, la estimulación beta adrenérgica no parece que este implicada. Otros mediadores generados en el propio tejido adiposo, como por ejemplo factores inflamatorios o incluso del estrés oxidativo, y procesos fisiológicos como el ejercicio, van a participar también en el proceso de acumulación y degradación de los triglicéridos en el tejido adiposo. Introducción 33 de triglicéridos es la dihidroacetona fosfato que se produce en la glicolisis, lo que significa que el adipocito necesita glucosa. En el adipocito la glucosa se capta fundamentalmente a través del receptor GLUT4. La síntesis de glicerol ocurre mediante la enzima glicerol 3-P deshidrogenasa que necesita gastar una molécula de NADH. En el tejido adiposo, tras obtenerse el L-glicerol-P, las enzimas acil transferasas transfieren dos grupos acilos de ácidos grasos activados (Acil-CoA), a los hidroxilos del glicerol, dando lugar al ácido fosfatídico. Este proceso requiere un gasto energético de 4 ATP. El ácido fosfatídico puede dirigirse a la síntesis de triacilglicéridos, gastando ~2ATP más en la activación del Acil-CoA restante. 9. REGULACIÓN HORMONAL DE LA LIPOGÉNESIS Y LIPOLISIS EN EL TEJIDO ADIPOSO BLANCO En el tejido adiposo, al igual que ocurre en el muscular, la insulina estimula la traslocación de los transportadores GLUT4 desde compartimientos intracelulares a la membrana plasmática de los adipocitos (células del tejido adiposo), con la finalidad de que se capte mayor cantidad de glucosa y así disminuya su concentración en la sangre (28). Sin embargo, como ya anteriormente se indicó, en el tejido adiposo la insulina no promueve el almacenamiento de glucosa en forma de glucógeno, sino que estimula la síntesis de triglicéridos y la lipogénesis. Por eso, se ha considerado inicialmente que la estimulación de la glicolisis en el tejido adiposo blanco no va dirigida a la obtención de energía, sino que fundamentalmente tiene como objetivo obtener dihidroacetona fosfato. A partir de la dihidroacetona fosfato se producirá el proceso de la formación de nuevos triglicéridos, ya que se generaría glicerol-3 fosfato por la actividad glicerol-3 fosfato deshidrogenasa (Figura 7). ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 34 Figura 7.- Formación de glicerol 3-fosfato desde dihidroxiacetona fosfato. El glicerol 3-fosfato también se obtiene por la vía gluconeogénica mediante sustratos de la gluconeogénesis, como lo es el piruvato. Para la obtención de piruvato también se estimula, por parte de la insulina, la captación y metabolismo de la glucosa en el tejido adiposo blanco. Un efecto opuesto a la insulina sobre el metabolismo del tejido adiposo tienen las catecolaminas. Durante el ejercicio físico o en los periodos de ayuno, las catecolaminas estimularán la lipolisis en el tejido adiposo blanco (29). Las catecolaminas se unen a sus receptoresβ-adrenérgicos y estimulan la actividad de la adenilato ciclasa, lo que hace que aumente la concentración intracelular de AMP cíclico y se produce entonces la activación de la proteína quinasa a (PKA). En los periodos de alimentación, la insulina activa diferentes fosfodiesterasas que degradan el AMP cíclico, inhibiendo así la lipolisis. Se ha sugerido que la actividad lipolítica en respuesta a las catecolaminas es diferente según la localización de la grasa blanca. Así, la actividad más alta de las catecolaminas se encuentra sobre la grasa visceral, en segundo lugar en la grasa subcutánea abdominal, y en tercer lugar, con actividad más baja, la grasa subcutánea de tejidos periféricos. El glucagón es otra hormona que tiene una importancia fundamental en la estimulación de la lipolisis. El glucagón hace, como las catecolaminas que aumente el AMP cíclico y se active la PKA (30). La PKA fosforila a unas lipasas sensibles a hormonas, activándolas (31). Como hemos indicado anteriormente, las lipasas catalizan la degradación de los triglicéridos contenidos en los adipocitos generándose los ácidos grasos y glicerol. Los ácidos grasos saldrán desde el adipocito a la sangre llegando a través de ella a los tejidos, principalmente al músculo para, mediante la ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 36 por nucleótidos aumentando así la conductancia y captación de los protones (35). Hay más datos en la literatura que parecen apuntar hacia la importancia que pueden tener los ácidos grasos libres en la activación de UCP1. Por ejemplo, en roedores la producción de termogénesis parece estar asociada con el mantenimiento de un pool suficiente de ácidos grasos libres, y con la activación de la entrada de estos ácidos grasos a través de sus transportadores mitocondriales CPT-I y II. Así, inhibidores del CPT-I inhiben la estimulación del consumo de oxígeno y de la captación de glucosa por adipocitos marrones estimulados con catecolaminas (36). Esta misma disminución se ha observado en tejido adiposo marrón depleccionado de ácidos grasos libres o en situaciones donde la lipolisis está disminuida. Además, la disrupción genética de la acil-CoA deshidrogenasa, enzima involucrada en la -oxidación de los ácidos grasos, produce intolerancia al frío (37,38). Además de los ácidos grasos libres, se han identificado otros activadores de UCP-1 incluyendo al anión superóxido lo que podría sugerir también la relación de la actividad UCP- 1 con los radicales libres (39). 11. ASOCIACIÓN ENTRE LA NOREPINEFRINA Y LA ESTIMULACIÓN DE UCP-1 EN TEJIDO ADIPOSO MARRÓN El tejido adiposo marrón es un tejido muy inervado. En este sentido, y según los datos hasta el momento publicados, la activación de UCP-1 por el frío se ha asociado de forma totalmente dependiente de la liberación de norepinefrina. Por lo tanto, la norepinefrina sería la catecolamina que estimularía la termogénesis en el tejido adiposo marrón. La presencia de norepinefrina estimula el metabolismo del adipocito marrón unas 10 veces produciendo calor. Se ha calculado que el calor producido por norepinefrina sobre un adipocito marrón es de alrededor de 3 nanowatts, que corresponden aproximadamente a 300 watts por kilogramo de tejido. En el tejido adiposo marrón, la norepinefrina se une a los receptores Introducción 37 β3-adrenérgicos induciendo la activación de UCP-1. En este sentido, la activación de los receptores β3-adrenérgicos por la norepinefrina en el tejido adiposo marrón se ha asociado con estimulación de lipólisis y la generación de calor (40,41). Además, la infusión de norepinefrina en conejos New Zealand se asoció con un aumento del consumo de oxígeno en el tejido adiposo marrón. Este efecto fue acompañado por un aumento de los niveles circulantes de ácidos grasos libres y glicerol, junto con una producción de calor rápida y sostenida (41). Esta y otras observaciones similares han apoyado que la respuesta metabólica a la reducción de la temperatura en el tejido adiposo marrón estaba completamente mediada por la norepinefrina. Como hemos indicado, el efecto termogénico de la norepinefrina ocurre a través de su unión a receptores adrenrgicos de tipo β3. Estos receptores están acoplados a proteínas Gs. La infusión de norepinefrina estimula a través de estas proteínas la actividad adenilato ciclasa y, con ello, la formación de AMP cíclico y la activación de la PKA. En este sentido, la termogénesis puede ser simulada en el tejido adiposo marrón mediante activadores de la adenilato ciclasa como la forskolina, lo que aumentará la producción de AMP cíclico. Por otro lado, la inhibición de la actividad PKA mediante el empleo de un inhibidor específico como es el H-89, inhibe los efectos de la norepinefrina sobre la termogénesis del adipocito marrón. Todas estas observaciones apoyarían la teoría de que a través de la estimulación de la PKA la norepinefrina estimularía la activación de UCP-1 en el tejido adiposo marrón, produciendo calor. En este sentido, y tomando en conjunto lo expuesto hasta este momento, la norepinefrina estimularía la liberación de ácidos grasos desde los triglicéridos mediante la activación de las lipasas (42). Los ácidos grasos serán transportados al interior de las mitocondrias y servirán de sustrato para la respiración mitocondrial y por lo tanto para la generación del gradiente de protones. Los ácidos grasos libres también se unirán a la UCP- 1 estimulándola y promoviendo su actividad lo que induce la conductancia de protones. La disipación de los protones por UCP-1 puede aumentar el índice de respiración mitocondrial para producir más calor (Figura 9). ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 44 de temperatura son independientes de norepinefrina. 13. OBJETIVOS 1.- Analizar en condiciones de ayuno y termonormalidad rutas metabólicas del metabolismo aeróbico y anaeróbico en el tejido adiposo blanco de conejos. Específicamente, analizar el metabolismo de la glucosa, la beta-oxidación de ácidos grasos y la lanzadera aspartato-malato relacionada con la gluconeogénesis. 2.- Estudiar en condiciones de ayuno y termonormalidad las mismas rutas metabólicas del objetivo 1 pero en el tejido adiposo marrón de conejos. 3.- Comparar en condiciones de ayuno y termonormalidad las rutas metabólicas de los dos objetivos anteriores entre los tejidos adiposos marrón y blanco en conejos. 4.- Determinar en un modelo in vitro, si la presencia y ausencia de norepinefrina durante la reducción de temperatura en el tejido adiposo marrón modifica de forma similar la expresión de proteínas relacionadas con el transporte de ácidos grasos de cadena larga en la mitocondria. 5.- Estudiar en el mismo modelo in vitro del objetivo 4, si la presencia y ausencia de norepinefrina durante la reducción de temperatura en el tejido adiposo marrón modifica de forma similar la expresión de proteínas relacionadas con la fosforilación oxidativa mitocondrial. MATERIALES Y METODOS Materiales y Métodos 47 14. MODELOS EXPERIMENTALES Para la realización de los experimentos, se utilizaron dos modelos experimentales en conejo y rata. 14.1 MODELO EN CONEJO NEW ZEALAND Para el estudio comparativo del metabolismo de la grasa blanca y marrón se realizó en conejos New Zealand machos (n=10; Granja Cunicular, Navarra, Spain) de peso 2.35 ± 0.023 kg. Los conejos se mantuvieron durante 8 semanas con libre acceso al agua. Los conejos fueron alimentados de forma controlada con una dieta estándar (80-100 g/día; SF412 PANLAB SLU, Barcelona, Spain). La tabla 1 muestra la composición de la dieta. Los conejos fueron mantenidos bajo temperatura fisiológica (23±2 ºC) en ciclos de noche día estándares de 12 horas de duración cada uno de ellos (12 horas luz/12horas noche). La comida de los conejos se retiró 24 horas antes de obtener la grasa parda y blanca. Composición Nutricional (%) Proteínas 12.0 Minerales 6.5 Humedad 10.0 Lípidos 3.0 Fibra 16.0 Tabla 1. Composición de la dieta utilizada para alimentar a los conejos Para la obtención de la grasa blanca y marrón de los conejos se realizó eutanasia mediante sobredosis de pentobarbital sódico (100-300 mg/kg peso corporal), que se administró a través de la vena marginal de la oreja. Los conejos fueron exsanguinádos. Después de ser sacrificados, la grasa blanca se obtuvo de la región lumbar. Es importante señalar que los diferentes depósitos de grasa blanca pueden tener diferencias en su actividad metabólica. No obstante, se ha demostrado que la grasa blanca de la parte superior del cuerpo, incluida la región lumbar, proporciona la mayor cantidad de ácidos grasos no esterificados a nivel sistémico, lo que sugiere una mayor actividad metabólica. Los paquetes de grasa se pesaron y lavaron con solución salina y se congelaron a -80ºC hasta su procesado. ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 48 El tejido adiposo marrón se obtuvo de la región interescapsular. Estos depósitos de grasa están anatómicamente bien definidos y son disecados fácilmente. Una vez obtenidos los fragmentos de grasa marrón, se lavaron con suero salino, se pesaron y se congelaron a -80ºC hasta su procesado para realizar las determinaciones moleculares. 14.2 MODELO EN RATA WISTAR Con el fin de analizar si los efectos de la reducción de temperatura en la grasa marrón son o no totalmente dependientes de norepinefrina, se realizó un modelo de incubación in vitro donde evidentemente no puede existir estimulación adrenérgica a no ser que la noradrenalina se añada al medio de incubación. Para la realización de esta aproximación experimental se obtuvo tejido graso marrón de rata Wistar (214 ± 10 g de peso), de cuatro meses de edad. Los animales fueron eutanasiados por sobredosis intravenosa de pentobarbital sódico (100 mg/kg peso corporal) y exsanguinádos mediante punción cardiaca. Después de ser sacrificados, se obtuvo la grasa marrón de los depósitos interescapsulares. Los paquetes de grasa marrón aislados se lavaron con suero salino y se mantuvieron en una solución de Krebs–Henseleit que contenía: glucosa 5.5 mmol/L, KH2PO4 1.2 mmol/L, NaCl 135 mmol/L, KCl 5 mmol/L, MgSO4 1.2 mmol/L, CaCl2 2 mmol/L, NaHCO3 25 mmol/L, 0.25% albumina, 2x10-5 U/L penicilina y 2x10–5 g/L streptomicina con un pH 7.4. El tejido adiposo marrón obtenido de las ratas se dividió en fracciones y cada una de ellas se incubó durante 24 horas en un incubador de células bajo atmósfera de 95% de O2 /5% C02 a 37ºC o a 32ºC. También se incubaron segmentos de grasa marrón a 37ºC con norepinefrina 10-6 mol/L. Esta concentración de norepinefrina se ha utilizado previamente por otros investigadores en células de grasa aisladas, e incluso para establecer líneas celulares con expresión elevada de UCP en las mitocondrias, y estimulación de adipogénesis en células de grasa marrón (51,52). Todas las determinaciones moleculares se realizaron en 6 experimentos diferentes bajo condiciones estériles. Terminado el periodo de incubación, los segmentos de tejido graso marrón se congelaron rápidamente a una temperatura de -80ºC hasta su procesado. Ambos estudios se realizaron siempre bajo la normativa Ética de la Institución y de la Comunidad Europea. Además ambos estudios forman Materiales y Métodos 49 parte de un estudio general más amplio en el que se analiza el efecto de los polifenoles sobre la grasa y que fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad Complutense (Anexo I) (número de código ES280790000086). 15. DETERMINACIÓN EN CONEJOS DE PARÁMETROS METABÓLICOS CIRCULANTES. Se obtuvieron muestras de sangre a través de un catéter insertado en la arteria marginal de la oreja de los conejos despiertos. La sangre se obtuvo en tubos de plástico que una vez obtenida la muestra se dejaron 10 minutos a temperatura ambiente hasta la formación del coágulo. Después, se centrifugaron los tubos a 1.500 g, y el suero se recolectó transfiriéndolo a tubos de polipropileno, almacenándose a -80ºC hasta que se realizaran las determinaciones analíticas. En el suero se determinó como variables analíticas: colesterol total, LDL-colesterol y HDL-colesterol mediante kits (Vitros Fusion 5,1, OrthoClinical Diagnostics, Johnson & Johnson, NJ, USA) basados en técnicas espectrofotométricas enzimáticas de colorimetría siguiendo las especificaciones de los fabricantes (SPINREACT, S.A. /S.A.U., Gerona, Spain y Biosystems. Barcelona, España)). ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 50 16. DETERMINACIÓN DEL NIVEL DE EXPRESIÓN DE LAS DIFERENTES PROTEÍNAS ANALIZADAS MEDIANTE WESTERN BLOT. El nivel de expresión de las diferentes proteínas en los dos modelos experimentales se analizaron mediante Western blot. Para ello, las diferentes porciones de grasa se homogenizaron utilizando un Ultra-Turrax T8 (IKA-Werke;GmbH & Co, Staufen, Germany) en un tampón que contenía 50 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl2, 10% glycerol, 1% Triton- X-100 y una mezcla comercial de antiproteásicos (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). Las muestras de tejido graso homogeneizadas se centrifugaron a 10.000 g durante 10 minutos y los sobrenadantes se almacenaron a una temperatura de -80ºC hasta su análisis. Para su análisis por Western blot, se cuantificó la cantidad de proteína de cada muestra mediante el método del reactivo de ácido bicinconínico, siguiendo las especificaciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL). Las muestras fueron entonces sometidas a electroforesis desnaturalizante, como ha publicado previamente nuestro grupo (53,54,55). Para ello se realizaron geles de policacrilamina SDS-PAGE 15% (w/v) en los que se cargó 20 g de proteína de cada muestra en cada pocillo, solubilizadas en tampón Laemmli que contenía con un pH final de 6,8: 4% dodecil sulfato sódico (SDS), 20% glicerol, 10% 2- mercaptoetanol, 0,004 % azul de bromofenol y 125 mmol/L Tris-HCl. Básicamente, el SDS confiere carga positiva a todas las proteínas El agente detergente SDS dota a todas las proteínas en un intervalo regular, confiriendo a cada proteína la misma carga negativa total. Así conseguimos separar las proteínas por su tamaño y no por su carga. Por otro lado, el 2- mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro y permite que la proteína adquiera una conformación primaria y pueda entrar en el gel para su separación. El motivo de añadir azul de bromofenol es contar con una molécula de muy bajo peso molecular que permite que se cree un frente al aplicar la corriente en la cubeta de electroforesis y podamos conocer cuando llega al final del gel para la terminación de la separación de las Materiales y Métodos 51 proteínas. Una vez separadas las proteínas en el gel, estas se transferirán a una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas se transfieren mediante electrotransferencia semihúmeda desde el gel de poliacriamida a una membrana -P, Millipore). Para ello, se utilizó un tampón de transferencia que contenía: 250 mmol/L de glicina, 15% de metanol, 25 mmol/L de Tris-HCl y agua destilada. Tras realizar el blotting se bloquearon mediante la incubación con albumina de suero bovino (5% peso/volumen) en tampón Tris Buffered Saline-Tween (TBS-Tween-20) que contenía: 20 mmol/L Tris-HCl (pH 5,2), 137 mmol/L NaCl y 0,1% Tween-20. La incubación se realizó durante toda la noche a 4ºC. Mediante esta maniobra se evita que cuando los anticuerpos se incubaran con las membranas estos se unan de forma inespecífica a la membrana de nitrocelulosa. Tras el periodo de incubación, las membranas se lavaron dos veces con tampón TBS y se incubaron con los diferentes anticuerpos específicos de cada una de las proteínas que se determinaron. En la tabla 2 se resumen los anticuerpos primarios y secundarios empleados. Para la determinación del peso molecular de las bandas detectadas, se utilizaron también marcadores de peso molecular pre-teñidos (Sigma, St. Louis, MO). Las membranas se lavaron con PBS al 0.5% de Tween (tres veces durante 5 minutos) para eliminar el anticuerpo primario no unido y, después, fueron incubadas con anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente, que reconocían de forma específica una región concreta del anticuerpo primario. Los anticuerpos secundarios fueron de origen animal: Ig G anti-ratón, anti-conejo o anti-cabra, conjugados con HRP (peroxidasa de rábano) (Tabla 2). La unión antígeno anticuerpo se detectó mediante quimioluminiscencia y se valoraron mediante densitometría. Para ello, se utilizó el sistema ECL(Amersham Biosciences). Este sistema contiene un sustrato Lumigen PS-3 que es convertido en un éster de acridinio cuando es catalizado por la peroxidasa de rábano. El éster reacciona con el peróxido en condiciones alcalinas y emite luz. ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 52 Tabla 2. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados Anticuerpo Primario Tipo Dilución final Código Anticuerpo conjugado con peroxidasa Dilución final Anti-CPT-I Policlonal 1:1000 SC20670 IgG anti-conejo 1:2000 Anti-CPT-II Policlonal 1:1000 SC20526 IgG anti-cabra 1:2000 1,6 bifosfato aldolasa Policlonal 1:1000 SC12061 IgG anti-cabra 1:2000 Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa Mooclonal 1:1000 SC47724 IgG anti-ratón 1:2000 Malato deshidrogenasa mitocondrial Monoclonal 1:1000 SC166687 9 IgG anti-conejo 1:2000 Malato deshidrogenasa citosólica Policlonal 1:1000 SC49234 IgG anti-cabra 1:2000 Acil CoA deshidrogenasa Policlonal 1:1000 SC1304 IgG anti-cabra 1:2000 Piruvato deshidrogenasa Policlonal 1:1000 SC7140 IgG anti-cabra 1:2000 Lactato deshidrogenasa Monoclonal 1:1000 SC133123 IgG anti-ratón 1:2000 UCP-1 Policlonal 1:1000 ab23841 IgG anti-conejo 1:2000 NADH deshidrogenasa Monoclonal 1:1000 ab181848 IgG anti-conejo 1:2000 Citocromo C oxidasa Monoclonal 1:1000 SC58613 IgG anti-ratón 1:2000 F1 ATP sintasa Monoclonal 1:1000 Ab14705 IgG anti-ratón 1:2000 -actina Monoclonal 1:1500 A5441 IgG anti-ratón 1:2500 Nota: Todos los anticuerpos con código comenzando con el prefijo SC son de la casa comercial Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA. Los anticuerpos con prefijo AB son de la casa comercial Abcam, Cambridge, UK y el de prefijo A de la casa comercial Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. Como anteriormente se comentó, las imágenes se analizaron mediante densitometría que nos permite evaluar la cantidad relativa de la proteína a medir y cuantificar el resultado en términos de las unidades de medida internacional de densitometría (Unidades Arbitrarias de Densitometría (U.A.)) utilizando el software Quantity One, Laboratorios Bio-Rad. Dicho software permite la adquisición, cuantificación y análisis de imágenes. Materiales y Métodos 53 17. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE LACTATO Y DE LAS ACTIVIDADES ACONITASA, LACTATO DESHIDROGENASA Y MALATO DESHIDROGENASA. Como habíamos publicado previamente por nuestro laboratorio (56,57,58), el contenido de lactato en los tejidos grasos y las actividades de aconitasa, lactato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa se determinaron mediante el uso de kits comerciales. Los kits comerciales utilizados fueron de la casa comercial BioVision Research Products, Mountain View, CA, USA. El kit para determinar la actividad lactato deshidrogenasa fue el de referencia K-726, para la actividad aconitasa el de referencia K-716 y para la actividad malato deshidrogenasa el de referencia K-654. La determinación del contenido de lactato se realizó con el kit K-627. Todos los kits fueron colorimétricos y se siguió para su realización las especificaciones del fabricante. 18. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados se expresaron como media ± error estándar de la media. El test estadístico empleado fue el test de Mann-Whitney para datos no paramétricos. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0.05. El estudio estadístico se realizó con el programa SPSS (SPSS for Windows; SPSS Inc, Chicago, IL, USA; versión 22.0). ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 60 Figura 11.- Western blots representativos que muestran la expresión de enzimas implicadas en la glicólisis en tejido adiposo marrón (TAM) y tejido adiposo blanco (TAB) obtenidos de conejos New Zealand. En la parte superior se muestra un Western blots representativo de cada una de las proteínas estudiadas: 1,6 bifosfato aldolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa en TAM y TAB. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga de cantidad de proteína. En la parte inferior, los gráficos de barras muestran el análisis densitométrico de todos los Western blots en unidades arbitrarias de densitometría (A.U.). Los resultados densitométricos se representan como media ± error estándar de la media de 10 conejos diferentes. * P <0,05 respecto a la expresión en TAM. El nivel de expresión a nivel de proteína de los dos transportadores de ácidos grasos mitocondriales, CPT -I y CPTII, también se determinó en los dos tejidos adiposos. En el TAM se observaron niveles más elevados de expresión de ambas proteínas, CPT-I y CPT-II, en comparación con el TAB (Figura 12). Además, el nivel de expresión de acil-CoA deshidrogenasa, enzima implicada en la β-oxidación de ácidos grasos, también fue mayor en TAM que en TAB (Figura 12). 48 Kda Piruvato deshidrogenasa TAM TAB 1,6-bifosfato aldolasa 40 Kda 145 Kda Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 1,6-bifofato aldolasa (AU) TAM TAB Gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa (AU) 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 * TAM TAB 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 * Piruvato deshidrogenasa (AU) TAM TAB 42 Kda b-actina Resultados 61 Figura 12.- Western blots representativos que muestran la expresión de los dos transportadores mitocondriales de ácidos grasos, CPT-I y CPT-II, y acil CoA deshidrogenasa, enzima implicada en la β-oxidación de lo ácidos grasos en TAM y TAB. También se muestra la expresión de β-actina como control de carga de las proteínas en los geles. En la parte inferior, los histograma de barras muestran el análisis densitométrico de todos los Western blots en unidades arbitrarias. Los resultados densitométricos se representan como media ± error estándar de la media de 10 conejos diferentes. * P <0,05 respecto al TAM. Como muestra la figura 13, la expresión de malato deshidrogenasa citosólica fue mayor en tejido adiposo blanco que en el marrón, lo que se acompañó con una mayor actividad de malato deshidrogenasa en TAB en comparación con TAM (Figura 14). No hubo diferencias estadísticamente significativas en la actividad aconitasa, enzima perteneciente al ciclo de Krebs, entre ambos tejidos adiposos (Figura 14). TAM TAB 75 Kda CPT-I 56 Kda Acil CoA deshidrogenasa 67 Kda CPT-II 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Unidades Arbitrarias de densitometría TAM TAB CPT-I CPT-II * # 0 5 10 15 20 25 30 35 40 TAM TAB * Acil CoA deshidrogenasa Carnitin palmitoiltransferasa 42 Kda b-actina Unidades Arbitrarias de densitometría ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 62 Figura 13.- Western blot representativo de la expresión de malato deshidrogenasa citosólica en TAM y TAB. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga de proteína en los geles. En la parte derecha de la figura se muestran los resultados densitométricos de todos los Western blots de los diferentes animales representados en unidades arbitrarias de densitometría (A.U.). Los resultados densitométricos se expresan como media ± error estándar de la media de 10 conejos diferentes. * P <0,05 respecto al TAM. Figura 14.- Los histogramas muestran las actividades enzimáticas de aconitasa y malato deshidrogenasa en TAM y TAB. Los resultados se representan como media ± error estándar de la media de 10 conejos diferentes. * P <0,05 respecto TAM. ACTIVIDAD MALATO DESHIDROGENASA 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 * mmol/min/ proteina mg TAM TAB 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00 ACTIVIDAD ACONITASA nmol/min/ proteina mg TAM TAB Malato deshidrogenasa 36 Kda TAM TAB 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 EXPRESIÓN MALATO DESHIDROGENASA * A.U. TAM TAB 42 Kda b-actina ACTIVIDAD MALATO DESHIDROGENASA 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 * mmol/min/ proteina mg TAM TAB 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00 ACTIVIDAD ACONITASA nmol/min/ proteina mg TAM TAB Malato deshidrogenasa 36 Kda TAM TAB 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 EXPRESIÓN MALATO DESHIDROGENASA * A.U. TAM TAB 42 Kda b-actina Resultados 63 22. METABOLISMO ANAERÓBICO EN LA GRASA MARRÓN Y EN LA GRASA BLANCA A continuación se analizaron enzimas relacionadas con el metabolismo anaeróbico. Para ello se determinó la expresión de lactato deshidrogenasa. Como se muestra en la figura 15, la expresión de lactato deshidrogenasa fue mayor en TAM que en TAB. Figura 15.- Western blot representativo de la expresión de lactato deshidrogenasa en TAM y TAB. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga de proteína en el gel. A la derecha se representan los valores medios densitométricos en unidades arbitrarias de densitometría (A.U.) de la grasa obtenida de todos los conejos. Los resultados se representan como media ± error estándar de la media de 10 conejos diferentes. * P <0,05 respecto TAM. Este aumento en la expresión de lactato deshidrogenasa se vió acompañado con una mayor acumulación de lactato en TAM que en TAB (Figura 16). Sin embargo, la actividad lactato deshidrogenasa fue similar en ambos tejidos adiposos (Figura 16). TAM TAB Lactato deshidrogenasa 35 Kda 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 EXPRESION LACTATO DESHIDROGENASA * TAB TAM A.U. 42 Kda b-actina ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 64 Figura 16.- Los histogramas muestran el contenido de lactato y la actividad enzimática de lactato deshidrogenasa en TAM y TAB. Los resultados se representan como media ± error estándar de la media de 10 conejos diferentes. * P <0,05 respecto TAM. 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 CONTENIDO DE LACTATO TAM TAB mmol/mg proteina * 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 ACTIVIDAD LACTATO DESHIDROGENASA nmol/min/proteina mg TAB TAM Resultados 65 23. EFECTO COMPARATIVO DE LA NOREPINEFRINA Y LA REDUCCIÓN DE TEMPERATURA SOBRE EL METABOLISMO ENERGÉTICO EN LA GRASA MARRÓN. 23.1 EFECTO DE LA REDUCCIÓN DE TEMPERATURA (32ºC) EN TEJIDO GRASO MARRÓN Si lo comparamos con el tejido adiposo marrón incubado a 37ºC, el TAM incubado a 32ºC demostró tener una expresión significativamente mayor de los dos transportadores de ácidos grasos al interior de la mitocondria (CPT-I y CPT-II) que el TAM incubado a 37ºC (Tabla 4 y Figura 17). Figura 17.- Westerns blots representativos de la expresión de proteínas implicadas en el transporte de ácidos grasos al interior de la mitocondria (CPT-I y CPT-II), de la malato deshidrogenasa mitocondrial y de la lactato deshidrogenasa. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga de proteína en el gel. Abreviaciones: CPT: carnitin palmitoiltransferasa; NOR: norepinefrina El nivel de expresión proteica de la malato deshidrogenasa mitocondrial no alcanzó diferencias significativas entre las muestras de TAM incubadas a ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 66 37ºC que las incubadas a 32ºC (Figura 17 y Tabla 4). Tabla 4.- Efecto en tejido adiposo marrón (TAM) de la reducción de temperatura en presencia y ausencia de 10-6 mol/L norepinefrina (NOR) sobre la expresión de proteínas asociadas al metabolismo energético. Variable Incubación a 37º C Incubación a 32º C -NOR -NOR +NOR CPT-I 23.78±2.45 49.66±6.51* 17.55±3.64† CPT-II 10.44±2.80 31.83±5.99* 14.75±3.96† Malate deshidrogenasa mitocodrial 21.25±3.65 27.30±8.23 73.29±9.20*† Lactato deshidrogenasa 25.41±3.69 43.23±6.43* 23.12±2.75† Nota: Los datos expresan unidades arbitrarias de densitometría como media ± error estándar de la media de seis experimentos diferentes. * p<0.05 respecto a TAM incubado a 37º C-. † p<0.05 en relación a TAM incubado a 32ºC en ausencia de norepinefrina. Abreviaciones: CPT: carnitin palmitoiltransferasa; NOR: nnorepinefrina. La expresión de lactato deshidrogenasa fue significativamente mayor en TAM incubado a 32ºC comparado con el TAM incubado a 37ºC (Figura 17 y Tabla 4). Esto se acompañó de una actividad lactato deshidrogenasa mayor en el TAM incubado a 32ºC que el incubado a 37ºC (Figura 18). Figura 18.- Actividad lactato deshidrogenasa en el tejido adiposo marrón (TAM). Los datos se representan como media ± error estándar de la media de seis experimentos diferentes. * p<0.05 respecto a TAM incubado a 37º C-. † p<0.05 en relación a TAM incubado a 32ºC en ausencia de norepinefrina. Resultados 67 También se analizaron los posibles cambios en el nivel de expresión de enzimas relacionadas con la cadena respiratoria mitocondrial. Si lo comparamos con el TAM incubado a 37ºC, el TAM incubado a 32ºC mostró una expresión mayor de UCP-1 y una menor expresión de la cadena  de la F1 ATP sintasa (Figura 19 y Tabla 5). Figura 19.- Westerns blots representativos de la expresión de proteínas implicadas en la cadena respiratoria mitocondrial en tejido graso marrón incubado a 37ºC o a 32ºC en presencia o ausencia de norepinefrina (10-6 mol/L, NOR.) Los niveles de expresión de la enzima citocromo c oxidasa y de la NADH deshidrogenasa (Complejo I de la cadena respiratoria, NADH:ubiquinona oxidoreductasa, MT-ND1) fueron similares entre el tejido graso marrón incubado a 37ºC y el incubado a 32ºC. 23.2 COMPARACIÓN ENTRE TEJIDO ADIPOSO MARRÓN INCUBADO A 37ºC Y EL INCUBADO A 32ºC CON NOREPINEFRINA. Con el fin de determinar si la presencia de norepinefrina en el tejido adiposo marrón ejercía algún adicional a la reducción de temperatura, realizamos una serie de experimentos incubando TAM a 32ºC con norepinefrina (10-6 mol/L). Los niveles de expresión de CPT-I y CPT-II no fueron significativamente diferentes entre el TAM incubado a 37ºC y el incubado a 32ºC con norepinefrina (Figura 17 y Tabla 4). El nivel de expresión de ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 68 la lactato deshidrogenasa también fue similar entre el TAM incubado a 37ºC y el incubado a 32ºC con 10-6 mol/L norepinefrina (Figura 17 y Tabla 4). Sin embargo, la actividad de lactato deshidrogenasa fue ligeramente mayor, alcanzó significación estadística, en el TAM expuesto a 32º C con norepinefrina que el incubado a 37ºC (Figura 18). Los segmentos de TAM incubados a 32ºC con norepinefrina demostraron tener una expresión mayor de malato deshidrogenasa mitocondrial que los incubados a 37ºC (Figura 17 y Tabla 4). Posteriormente se compararon los niveles de expresión de las enzimas relacionadas con la cadena respiratoria mitocondrial. En comparación con los experimentos realizados a 37ºC, las muestras de TAM incubadas con 32ºC y norepinefrina (10-6 mol/L) mostraron una expresión mayor de UCP-1 y una expresión menor de la cadena  de la F1 ATP sintasa (Figura 19 y Tabla 5). Tabla 5.- Efecto en tejido adiposo marrón (TAM) de la reducción de temperatura en presencia y ausencia de 10-6 mol/L norepinefrina (NOR) sobre la expresión de proteínas asociadas al metabolismo energético. Variable Incubación at 37º C Incubación a 32º C -NOR -NOR +NOR MT-ND1 11.35±2.23 10.58±2.14 9.86±2.64 Citocromo C oxidasa 21.19±4.18 15.82±6.27 12.02±2.56* F1 ATP sintasa mitocondrial cadena α 53.59±7.64 25.66±4.63* 22.66±6.21* UCP-1 241.19±98.08 352.84±129.58* 421.62±137.90* Los datos expresan unidades arbitrarias de densitometría como media ± error estándar de la media de seis experimentos diferentes. * p<0.05 respecto a TAM incubado a 37º C-. † p<0.05 en relación a TAM incubado a 32ºC en ausencia de norepinefrina. Abreviaciones: MT-ND1: NADH deshidrogenasa o NADH:ubiquinona oxidoreductasa. La expresión de citocromo c oxidasa estaba reducida en los TAM incubados a 32ºC con norepinefrina en comparación con los incubados a 37ºC (Figura 19 y Tabla 5). La expresión de NADH deshidrogenasa fueron similares entre el tejido graso marrón incubado a 37ºC y el incubado a 32ºC con norepinefrina (Figura 19 y Tabla 5). Resultados 69 23.3 COMPARACIÓN ENTRE LOS EXPERIMENTOS REALIZADOS A 32ºC EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE NOREPINEFRINA. Como la figura 17 y la tabla 4 muestran, la expresión de CPT-I y CPT-II fueron significativamente mayores en TAM incubado a 32ºC sin norepinefrina que las incubadas a 32ºC pero con norepinefrina (10-6 mol/L). La expresión y la actividad de la lactato deshidrogenasa fueron significativamente mayores en TAM expuesto a 32º C que en los expuestos a 32º C incubados con norepinefrina (Figuras 17 y 18 y Tabla 4). Sin embargo, el nivel de expresión de la malato deshidrogenasa mitocondrial en TAM expuesto a 32ºC y norepinefrina fue significativamente mayor que en los incubados a 32ºC sin norepinefrina (Figura 17 y Tabla 4). En cuanto a los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con la cadena respiratoria mitocondrial, los niveles de expresión de UCP-1 y de la cadena  de la F1 ATP sintasa fueron similares entre los dos grupos experimentales (Figura 19 y Tabla 5). Por otra parte, el nivel de expresión de la NADH deshidrogenasa (MT-ND1) también fue similar entre los TAM incubados a 32ºC en presencia o ausencia de norepinefrina (Figura 19 y Tabla 5). El nivel de expresión de la citocromo c oxidasa fue similar en las muestras de TAM incubadas en presencia o ausencia de norepinefrina, aunque el TAM incubado a 32ºC y norepinefrina mostró una reducción significativa de la expresión de citocromo C oxidas respecto al TAM incubado a 37ºC (Figura 19 y Tabla 5). ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 76 ácidos grasos como combustible energético para la actividad del TAM durante periodos de ayuno y temperatura normal, sea menos importante que lo que inicialmente podríamos haber pensado. Por lo tanto, aunque en estas condiciones de ayuno y temperatura fisiológica TAM esté preparado desde el punto de vista de la maquinaria metabólica enzimática para una activa oxidación de los ácidos grasos, TAM utilice en estas condiciones el metabolismo anaeróbico mejor que el aeróbico para producir energía. No obstante, el hecho de que diferentes proteínas implicadas en la oxidación de los ácidos grasos estén aumentadas en su nivel de expresión en TAM puede reflejar también que este tejido esté preparado para rápidamente utilizar esta vía metabólica cuando lo requiera, por ejemplo, en condiciones de frío. En este sentido, ha sido publicado por varios investigadores que la activación simpática del TAM regula al alza la oxidación de ácidos grasos aumentando la lipolisis y la actividad de los transportadores de ácidos grasos a la mitocondria (96,97). También hay que señalar que es bien conocido que el proceso de la termogénesis en el adipocito marrón puede ser mimetizado simplemente añadiendo ácidos grasos (97). Por lo tanto, la activación de la lipolísis podra ser un “disparador” suficientemente potente para iniciar el proceso de la termogénesis en el adipocito marrón. En este sentido, es también posible que bajo condiciones de temperatura fisiológica (232ºC) y ayuno, y para mantener un adecuado nivel del almacén intracelular de triglicéridos, el TAM utilice el lactato para formar nuevos ácidos grasos que pudieran ser esenciales durante la activación de TAM. De acuerdo con esta hipótesis, previamente se ha publicado que en TAM el lactato puede convertirse en ácidos grasos en ratas sometidas a ayuno-realimentación (98). 26. LA GLUCOSA EN EL TAM Y EN EL TAB La glucosa es un componente esencial del metabolismo del tejido adiposo (99,100). En nuestro estudio, en los conejos sometidos a 24 horas de ayuno y temperatura fisiológica, en su TAB se observó una expresión mayor de una de las principales enzimas implicadas en la glicolisis, la gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa, que la expresión de esta enzima observada en el TAM. Además, como se ha mencionado anteriormente, la expresión de Discusión 77 piruvato deshidrogenasa también fue significativamente mayor en TAB que en TAM. En conjunto, estos resultados pueden sugerir inicialmente que bajo condiciones de temperatura fisiológica y de ayuno, TAB puede tener una tasa mayor de degradación de la glucosa que TAM. Además, este posible favorecimiento del catabolismo oxidativo de la glucosa en TAB en condiciones de ayuno podría ser subsecuente a una aceleración de la lipolisis, ya que es bien conocido que la lipolísis está estimulada en TAB durante condiciones de ayuno (10). No obstante, estudios previos han sugerido que en condiciones de ayuno en animales de experimentación, TAB muestra una reducción reversible de los transportadores de glucosa estimulados por insulina, lo que reduce la oxidación de la glucosa. Es interesante aquí señalar que se ha publicado que la unión de insulina al adipocito del TAB aumenta en condiciones de ayuno (102). Los resultados de nuestro trabajo también pueden sugerir que en el TAB obtenido de conejos bajo condiciones de temperatura fisiológica y ayuno, el ciclo del ácido tricarboxílico (ciclo de Krebs) estaba aumentado al compararlo con el TAM. En este sentido, aunque la actividad aconitasa, enzima implicada en el ciclo del ácido tricarboxílico, fue similar en TAB y TAM, sin embargo, se observó un aumento en la expresión de malato deshidrogenasa y de su actividad en TAB respecto al TAM. No obstante, la malato deshidrogenasa no solo tiene un papel importante en la formación de citrato en el ciclo del ácido tricarboxílico en el interior de la mitocondria. En el tejido adiposo, y en otros tejidos, existe otra actividad malato deshidrogenasa que está localizada en el citoplasma del adipocito, y que tiene como función reducir en el citoplasma el oxalacetato a malato liberando NAD+ (Figura 20). Figura 20.- Lanzadera del malato. Abreviatura: MDH: malato deshidrogenasa ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 78 En el citoplasma, la malato deshidrogenasa forma parte de la lanzadera malato-aspartato que está implicada en la gluconeogénesis (103). En nuestros experimentos se utilizó un anticuerpo que específicamente reconocía la región N-terminal de la isoforma malato deshidrogenasa citosólica. Es decir, la diferencia de expresión observada en la malato deshidrogenasa entre el TAB y el TAM fue debida a cambios en la isoforma de la malato deshidrogenasa citosólica que participa en la lanzadera malatoaspartato. Si consideramos entonces en su conjunto los resultados obtenidos, estos sugieren que la lanzadera malato-aspartato estaría aumentada en TAB respecto al TAM, en condiciones normales de temperatura y en el periodo de 24 horas de ayuno. La pregunta que entonces surge ante estos resultados es ¿por qué en TAB está aumentada la expresión de la isoforma malato deshidrogenasa citosólica y la actividad total de malato deshidrogenasa después de 24 horas de un periodo de ayuno y en condiciones de temperatura fisiológica?. La malato deshidrogenasa participa en sacar oxalacetato fuera de la mitocondria, ya que el oxaloacetato no puede dejar la mitocondria. Esto es potencialmente importante porque muchas de las enzimas gluconeogénicas están localizadas en el citoplasma de la célula. Además, en el citoplasma, el oxalacetato puede ser convertido a malato, pero también convertirse en fosfoenolpiruvato (104) y ser utilizado en la vía gluconeogénica, participando así en la síntesis de glucosa (Figura 21). Es importante aquí señalar, que en los resultados obtenidos la enzima gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa estaba aumentada en TAB respecto al TAM. La enzima gliceraldehído-3 fosfato deshidrogenasa está implicada tanto en la glicolisis como en la gluconeogénesis. Además, el nivel de expresión de 1,6 bifosfato aldolasa, enzima también implicada en ambas vías metabólicas, glicolisis y gluconeogénesis, tendió a ser mayor su expresión en TAB con respecto a TAM, aunque las diferencias no alcanzaron significación estadística. Evidentemente, todos estos resultados abrirían la pregunta sobre su significado fisiológico. Discusión 79 Figura 21.- Conversión de oxalacetato en fosfoenolpiruvato para ser dirigido hacia la vía gluconeogénica Se ha demostrado previamente, y está bien establecido, que cuando la disponibilidad de glucosa aumenta la oxidación de los ácidos grasos disminuye y viceversa (105,106). Por lo tanto, se podría especular, en relación a los resultados obtenidos, que después de 24 horas de un periodo de ayuno, se podría favorecer el proceso de gluconeogénesis en el TAB como mecanismo compensador del aumento de la degradación de triglicéridos y, por lo tanto, de la depleción de sus depósitos en el TAB. Como resumen de esta primera parte de resultados de este trabajo podríamos decir que se describe, en nuestro conocimiento por primera vez, que en conejos sometidos a temperatura fisiológica y un periodo de ayuno de 24 horas, el TAM parece tener favorecida la formación de lactato, lo que sugeriría un metabolismo anaeróbico como fuente de energía. Esto ocurriría a pesar de tener también una marcada expresión de enzimas relacionadas con el transporte de los ácidos grasos a la mitocondria, además de la enzima acil-CoA deshidrogenasa, enzima implicada en la -oxidación de los ácidos grasos de cadena larga. Por otro lado, en el TAB, de estos mismos conejos, parece existir un aumento en la expresión enzimática de la lanzadera malato-aspartato y la vía gluconeogénica. ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 80 27. ¿SON SIMILARES LOS EFECTOS DE LA NOREPINEFRINA Y LA REDUCCIÓN DE TEMPERATURA SOBRE EL METABOLISMO DEL TEJIDO ADIPOSO MARRÓN? Como hemos comentado en la introducción, las modificaciones en el TAM relacionadas con la termogénesis sin temblor se habían relacionado de forma directa con la liberación y acción de la norepinefrina sobre el TAM. Por lo tanto, en la segunda parte de este trabajo de tesis analizamos las diferencias y similitudes que la reducción de temperatura y la norepinefrina producen sobre el TAM. Este grupo de experimentos se realizaron en TAM obtenidos de rata Wistar macho e incubados in vitro a 37ºC y 32ºC en presencia de norepinefrina. En nuestro conocimiento, los experimentos realizados in vitro de este trabajo de tesis sugieren por primera vez que, independientemente de la norepinefrina, la reducción de la temperatura por sí misma promueve cambios en los niveles de expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo energético. Además, la presencia de norepinefrina en el TAM expuesto a la reducción de la temperatura también indujo cambios en la expresión de enzimas relacionadas con el metabolismo energético que en algunos casos fueron diferentes a las producidas por la reducción de temperatura en presencia de norepinefrina. 27.1 EFECTOS DE LA REDUCCIÓN DE TEMPERATURA EN LA EXPRESIÓN DE ENZIMAS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO ENERGÉTICO EN TAM La reducción de temperatura en el TAM obtenido de rata Wistar aumentó el nivel de expresión de los transportadores de ácidos grasos mitocondriales, CPT-I y CPT-II, que como anteriormente hemos señalado, son dos pasos obligatorios para la oxidación mitocondrial de ácidos grasos de cadena larga. Está suficientemente bien establecido que el TAM está densamente contenido con mitocondrias y que se requiere oxidación de ácidos grasos para alimentar la generación de calor (107). Estudios previos habían demostrado que la exposición al frío del TAM causa captación de Discusión 81 ácidos grasos no esterificados en plasma y lipólisis, lo que aumenta el suministro de ácidos grasos para su oxidación (108). En este sentido, la importancia que los transportadores de ácidos grasos mitocondriales y la oxidación de ácidos grasos tienen para estimular la producción de calor bajo condiciones de reducción de temperatura en el TAM está apoyada por el hecho de que ratones deficientes de CPT-II (CPT2A - / -) no pueden generar calor y/u oxidar ácidos grasos en el TAM (109). En relación con esta observación, se ha demostrado que los ácidos grasos libres son uno de los principales estimuladores de UCP-1 para promover termogénesis (110,111). La capacidad de los ácidos grasos de desacoplar la fosoforilación oxidativa fue inicialmente descrita por Pressman y Lardy en el año 1956 (111). Sin embargo, el mecanismo por el que los ácidos grasos estimulan a la UCP-1 no está bien establecido. Hay autores que sugieren que los ácidos grasos actúan como sustrato de UCP-1 y otros sostienen que son cofactores de esta enzima (97,111,112,113). Incluso se ha considerado que los ácidos grasos cambian la conformación de UCP-1, estimulando su actividad (114). El aumento en la expresión de CPT-I y CPT-II que se observó al incubar el TAM a una temperatura menor (32ºC) puede sugerir un aumento en el transporte de ácidos grasos libres a las mitocondrias, lo que podría estar asociado con la expresión aumentada de la proteína UCP-1, y por lo tanto relacionado con la capacidad estimuladora de los ácidos grasos sobre la UCP-1 (112,113,114). El diseño experimental de este trabajo de tesis no nos permite determinar los mecanismos por los cuales la reducción de la temperatura aumentó la expresión de UCP-1 en el TAM, de forma independiente de norepinefrina. Sin embargo, es probable que esté relacionado con un mayor transporte y oxidación de ácidos grasos mitocondriales comentado anteriormente. Sin embargo, es también importante señalar que no podemos descartar que otros mecanismos puedan estar implicados en la estimulación de la expresión de UCP-1 en el TAM, después de la reducción de temperatura, en el TAM de forma no dependiente a norepinefrina. Como ejemplo, Ma et al demostraron en ratones que, independientemente de la estimulación con norepinefrina, el UCP-1 se expresaba más por aumento en el TAM del receptor específico transitorio de melastatina-8 (TRPM8) (115). El TRPM8 puede ser activado por frío (116,117). Así, ratones que no expresan TRPM8 tienen una respuesta deficiente al frio, lo que indicaría que esta proteína juega un papel fisiológico importante en la detección y respuesta a reducción de temperatura en mamíferos (116,117,118). Son, no ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 82 obstante, necesarios más estudios para analizar con mayor profundidad los mecanismos involucrados en los cambios ejercidos sobre la expresión de UCP-1 por la reducción de temperatura sin norepinefrina en el TAM. Como anteriormente se explicó, está bien establecido en la literatura publicada que el UCP-1 activo disipa el gradiente de protones a través de la membrana mitocondrial interna, lo que conduce a la producción de calor a expensas de reducción en la síntesis de ATP (119,120). Sin embargo, en nuestro conocimiento, se ha estudiado en menor medida si en el TAM la reducción de la temperatura puede modificar el nivel de expresión de proteínas que formen parte de la cadena respiratoria mitocondrial. A este respecto, una observación interesante derivada de nuestros resultados fue que, además de aumentar la expresión de UCP-1, la exposición de TAM a menor temperatura produjo un descenso significativo de la expresión de la proteína ATP sintasa mitocondrial F1. Esta proteína es la encargada de generar ATP de tal forma que de cada 3 protones generados en la cadena respiratoria se genera una molécula de ATP (121,122). La reducción de ATP sintasa mitocondrial F1 en condiciones de menor temperatura (32ºC) probablemente ocurre para facilitar más la fuga de protones hacia la actividad UCP-1 y producir calor, en lugar de ser utilizado a través de la ATP sintasa mitocondrial para generar ATP. Es importante aquí también señalar que en ratones knock-out para UCP-1 sus consecuencias se han atribuido casi exclusivamente sobre la termogénesis. No obstante, puede haber otras consecuencias sobre la biología y funcionalidad mitocondrial y, particularmente, sobre la generación de radicales libres del oxígeno (ROS). Por ejemplo, Kazak y cols (123) exploraron las diferencias moleculares inducidas por frío en TAM que carecía de UCP-1. En este estudio se demostró que el almacenamiento de calcio mitocondrial se ve comprometido a través de la producción de ROS de una manera dependiente de UCP-1, lo que demuestra que la eliminación de UCP-1 afecta a más funcionalidades celulares, además de a la termogénesis (123). 27.2 EFECTOS DE LA COMBINACIÓN NOREPINEFRINA+REDUCCIÓN DE TEMPERATURA Estudios previos han señalado que los efectos estimulantes de la exposición al frío en TAM se imitaban mediante la estimulación eléctrica de los nervios simpáticos en el TAM. Por lo tanto, existe la noción de que hay una total dependencia de la estimulación simpática en el efecto termogénico en el TAM (71,124,125). Sin embargo, en este trabajo de tesis donde los Discusión 83 experimentos se realizaron in vitro con el TAM aislado, y por lo tanto sin inervación, los resultados obtenidos sugieren que la reducción de la temperatura en el TAM produce algunos efectos sobre los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con el metabolismo energético, diferentes cuando los experimentos se realizaron en presencia o en ausencia de norepinefrina. En este sentido, hubo una serie de diferencias en la expresión de proteínas relacionadas con el metabolismo energético en el TAM después de la reducción de temperatura por la presencia y ausencia de la noradrenalina: La primera de estas observaciones fue el efecto diferente de la reducción de temperatura sobre la expresión de CPT-I y CPT-II en función de que la norepinefrina estuviera presente o no en el medio de cultivo. En la mitocondria, la proteína CPT-I está localizada en la membrana externa mitocondrial. Como CPT-I es la primera etapa limitante en la entrada de ácidos grasos libres en la mitocondria, y como hemos comentado anteriormente para completar el transporte de los ácidos grasos al interior mitocondrial es necesaria la participación del CPT-II localizado en la membrana interna mitocondrial. La observación de que la estimulación con norepinefrina del TAM expuesto a 32ºC redujo la expresión de CPT-I y CPT-II, en comparación con la expresión observada en los experimentos realizados con reducción de la temperatura en ausencia de norepinefrina podría inicialmente parecer un resultado paradójico. Particularmente esto se debe a que diferentes trabajos han asociado la activación adrenrgica con un aumento de la βoxidación de los ácidos grasos en la mitocondria (126). Sin embargo, la mayoría de estas conclusiones se obtuvieron de estudios experimentales realizados in vivo en los que evidentemente no se disociaron los efectos de la exposición en fro del TAM con la estimulación del sistema βadrenérgico y, por lo tanto, del efecto de la norepinefrina. Además, en los estudios in vivo, otros factores podrían estar influyendo en los resultados. Sin embargo, los trabajos publicados también respaldaron la importancia de una mayor expresión de CPT-I para aumentar la actividad mitocondrial con el fin de producir calor mediante la activación del TAM (127). Tomado en conjunto estos datos y antecedentes, se podría especular que, durante la reducción de la temperatura, la norepinefrina puede, de alguna manera, modular la absorción prolongada de ácidos grasos por parte de la mitocondria, incluso reduciéndola. Para entender esta especulación, es importante primero analizar los resultados obtenidos en los ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 84 experimentos de este trabajo de tesis sobre las proteínas relacionadas con la cadena respiratoria mitocondrial. La presencia de norepinefrina durante la reducción de temperatura en el TAM mantuvo la expresión aumentada de UCP-1 y la menor expresión de la subunidad F1 ATP sintasa mitocondrial que ya se había observado cuando el TAM fue incubado con una menor temperatura (32ºC) pero sin norepinefrina. Además, la presencia de norepinefrina durante la exposición del TAM a la reducción de la temperatura también disminuyó el nivel de expresión de la proteína de la cadena respiratoria citocromo c oxidasa con respecto a la expresión de esta proteína observada en el TAM incubado a 37ºC. En condiciones fisiológicas, la enzima citocromo c oxidasa actúa como paso limitante de la cadena respiratoria. Así, la hipótesis de Kadenbach establece que la regulación del potencial de membrana y la formación de ROS en las mitocondrias están determinadas por la inhibición alostérica de citocromo C oxidasa inducida por ATP, y representa un mecanismo para el control respiratorio mitocondrial (128,129). En este sentido, se ha postulado que, en condiciones de estrés máximo, como la que se produciría en el TAM por la presencia de norepinefrina, cuando la temperatura se reduce aumenta el potencial de membrana mitocondrial, lo que incrementaría la formación de ROS por la mitocondria (130,131). En este punto hay que señalar que existe la duda sobre si durante el proceso de la termogénesis en el TAM, los ROS actúan como reguladores de la función termogénica o meramente es un epifenómeno. Sin embargo, algunos estudios con ratones knockout para la isoforma de superóxido dismutasa mitocondrial, superóxido dismutasa 2, señalan que el aumento de ión superóxido en estos ratones aumenta el desacoplamiento mitocondrial, favoreciendo la formación de calor (132). Por lo tanto, en el TAM expuesto a reducción de temperatura, el efecto de la norepinefrina reduciendo la expresión de citocromo C oxidasa puede actuar como un mecanismo de protección para reducir la capacidad de producción de ROS mitocondrial por la cadena respiratoria. En este sentido, se ha demostrado que la activación de la termogénesis en TAM aumenta los niveles de producción de ROS mitocondrial, y apoya la termogénesis dependiente de UCP-1 mejor que de la generación de norepinefrina (130,131). El hecho de que la expresión de la isoforma malato deshidrogenasa mitocondrial aumentó en TAM estimulado por norepinefrina e incubado a 32ºC, en comparación con el TAM expuesto solamente a reducción de Discusión 85 temperatura pero sin norepinefrina, puede estar reflejando que en condiciones de estrés máximo, es decir, reducción de temperatura + norepinefrina, el ciclo tricarboxílico podría intentar mantener un aumento en el suministro continuo de protones para ser usado por la actividad UCP- 1 y poder mantenerse así la generación de calor; aún más cuando la enzima citocromo C oxidasa está regulada negativamente por norepinefrina. Además de los ácidos grasos libres, en condiciones de temperatura reducida, la glucosa es otra fuente importante para producir calor en el TAM. Se ha demostrado que la utilización de glucosa por el TAM se mejoró notablemente después de la administración de agonistas betaadrenérgicos (133,134). Es importante señalar que estos estudios han confirmado que la estimulación de los agonistas beta-adrenérgicos de la utilización de glucosa por el TAM dependía de la activación de UCP-1 (133,134). De hecho, se demostró que la activación de UCP-1 mejoró la tolerancia a la glucosa. Esto no solamente ocurre en el TAM sino también en el músculo esquelético (135). Si consideramos en conjunto los resultados obtenidos, y en forma especulativa, es posible que después de la reducción de temperatura exista una expresión y/o actividad incrementada de UCP-1. En este momento, el metabolismo de los ácidos grasos puede ser la fuente principal de suministro de NADH y FADH2 a la cadena respiratoria oxidativa mitocondrial. Sin embargo, cuando se libera norepinefrina, la fuente metabólica para mantener el calor es posible que se modifique hacia la vía de la glucosa. Por lo tanto, cuando la norepinefrina está ausente, los ácidos grasos libres soportarían la producción de calor por UCP-1 acompañada de una expresión y actividad de lactato deshidrogenasa aumentada. Sin embargo, cuando la norepinefrina está presente durante la reducción de la temperatura, puede estar ocurriendo un segundo paso, cambiando la fuente de producción de calor hacia el metabolismo de la glucosa y hacia el ciclo tricarboxílico. En este sentido, al reducirse la temperatura y aumentar la norepinefrina se favorecería el metabolismo de la glucosa por el ciclo tricarboxílico y para ello, se reduciría la expresión y actividad de lactato deshidrogenasa. Esto diferenciaría de forma importante el efecto del descenso de temperatura en ausencia o presencia de norepinefrina. ZURIÑE LÓPEZ IBARRA 92 temperatura (32ºC) tanto en ausencia como en presencia de norepinefrina, aumentaron los niveles de expresión proteica de UCP-1 y se redujo la expresión proteica de la cadena α de la ATP sintasa mitocondrial en comparación con el tejido adiposo marrón incubado a 37ºC. 9.-Aunque tanto el TAM incubado a 32ºC en presencia o ausencia de norepinefrina mostraron una reducción de la expresión de citocromo C oxidasa respecto al TAM incubado a 37ºC, solamente el incubado con norepinefrina y reducción de temperatura alcanzó significación estadística respecto al TAM incubado a 37ºC. 10.- En comparación con el tejido adiposo marrón incubado a 37ºC, en ausencia de norepinefrina, la reducción de la temperatura aumentó el nivel de expresión de la proteína y la actividad de lactato deshidrogenasa. 11.- La presencia de norepinefrina en el tejido adiposo marrón expuesto a 32ºC redujo la expresión de lactato deshidrogenasa a niveles similares a los encontrados en tejido adiposo marrón incubado a 37ºC. 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Anexo I ANEXO II Metabolic differences between white and brown fat from fasting rabbits at physiological temperature ZLo ´pez-Ibarra 1 , J Modrego 2 , M Valero-Mun ˜oz 3 , P Rodrı ´guez-Sierra 2 , J J Zamorano-Leo ´n 2 , A Gonza ´lez-Cantalapiedra 1 , N de las Heras 2,3 , S Ballesteros 2,3 , V Lahera 2,3 and AJLo ´pez-Farre ´ 2,4 1 Surgery Department, Hospital Universitario ROF-Codina, Lugo, Spain 2 Instituto de Investigacion Sanitaria del Hospital Clı ´nico San Carlos (IdISSC), Madrid, Spain Departments of 3 Physiology, and 4 Medicine, School of Medicine, Universidad Complutense de Madrid, Madrid 28040, Spain Correspondence should be addressed to A J Lo ´pez-Farre ´or V Lahera Emails [email protected] or [email protected] Abstract It has been suggested that activated brown adipose tissue (BAT) shows increased glucose metabolic activity. However, less is known about metabolic activity of BAT under conditionsoffasting andnormaltemperature.Theaimofthisstudy wastocomparethepossible differences in energetic metabolism between BAT and white adipose tissue (WAT) obtained from rabbits under the conditions of physiological temperature and 24 h after fasting conditions.ThestudywascarriedoutonNewZealand rabbits (nZ10) maintainedforaperiodof 8 weeks at 23G28C. Food was removed 24 h before BAT and WAT were obtained. Protein expression levels of the glycolytic-related protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and pyruvate dehydrogenase were higher in WAT than that in BAT. The expression level of carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) and CPT2, two fatty acid mitochondrial transporters, andthefattyacidb-oxidation-related enzyme, acyl CoA dehydrogenase,was higher in BAT than in WAT. Cytosolic malate dehydrogenase expression and malate dehydrogenase activity were higher in WAT than in BAT. However, lactate dehydrogenase expression and lactate content were significantly higher in BAT than in WAT. In summary, this study for the first time, to our knowledge, has described how under fasting and normal temperature conditions rabbit BAT seems to use anaerobic metabolism to provide energetic fuel, as opposed to WAT, where the malate–aspartate shuttle and, therefore, the gluconeogenic pathway seem to be potentiated. Key Words "adipose tissue "energetic metabolism "gluconeogenesis Journal of Molecular Endocrinology (2015) 54, 105–113 Introduction Adipose tissue is well recognized as an organ designed to store excessive carbon in the form of fatty acids esterified to glycerol (triglycerides). Adipose tissue is also now recognized as the organism’s main contributor to crucial survival mechanisms including the maintenance of body temperature (Lean 1989). In rodents, thermogenesis is dependent upon brown adipose tissue (BAT), while white adipose tissue (WAT) has been identified as the greatest reserve of triglycerides in the body (Dawkins & Hull 1964). The two main metabolic processes of WAT are lipogenesis and lipolysis. In this regard, WAT accommodates caloric excess by expanding to store triglycerides and compensates for caloric deficit through the mobilization of free fatty acids. Free fatty acids derived from WAT Journal of Molecular Endocrinology Research ZLO ´PEZ-IBARRA and others Adipose tissue energetic metabolism 54:2 105–113 http://jme.endocrinology-journals.org Ñ2015 Society for Endocrinology DOI: 10.1530/JME-14-0255 Printed in Great Britain Published by Bioscientifica Ltd. Downloaded from Bioscientifica.com at 11/21/2018 10:17:01AM via free access lipolysis are the principal source of lipid fuel in the fasting state. In addition to its role as fatty acid stock, WAT is needed for normal glucose homeostasis and is involved in other processes such as inflammation and various endocrine functions (Trayhurn & Beattie 2001). Glucose is an essential component for adipose tissue metabolism, primarily to provide glycerol-3-phosphate to form the backbone of triacylglycerol (Athenstaedt & Daum 2006). In this regard, fasting has profound effects on in vivo glucose metabolism, because starvation results in low circulating insulin levels, promoting a state of glucose intolerance (Szepesi & Berdanier 1971). Moreover, increased free fatty acid availability has been associated with stimulation of gluconeogenesis, involving, in organs such as the liver, regulation of key metabolic pathways such as the aspartate–malate shuttle, although the situation in the adipose tissue requires better investigation. Unlike WAT, BAT is a mitochondria-rich tissue and expresses uncoupling protein 1 (UCP1). Sympathetic activation of BAT activates lipase-mediated triacylglycerol hydrolysis releasing fatty acids. Lipolysis-derived fatty acids are directed to the mitochondria where UCP1 promotes mitochondrial uncoupled respiration, resulting in heat generation without ATP synthesis (Lin & Klingenberg 1980,Cannon & Nedergaard 2004). In this regard, BAT should potentially have a marked ability to oxidize fatty acids and glucose, probably toward aerobic metabolism, due to its high mitochondrial content. Indeed, it was well established that under activated thermogenesis, BAT is a plasma-lipid-and glucose-clearing organ in rodents (Festuccia et al.2009,Bartelt et al.2011). In this regard, feeding with concomitantly elevated plasma insulin levels seems to increase glucose uptake by BAT (Bukowiecki 1989). However, although several works have focused on studying the energetic metabolism in BAT under cold or diet-induced thermogenesis (Rothwell & Stock 1983, Festuccia et al. 2009,Bartelt et al. 2011), less is known about BAT metabolism in the fasting state and the possible differences between WAT and BAT metabolism under conditions of fasting and physiological environmental temperature. Therefore, this study aimed to compare the possible differences in energetic metabolism between BAT and WAT obtained from rabbits under the conditions of physiological temperature and 24 h after fasting. Specifically, this study investigated for the first time, to our knowledge, the possible differences between BAT and WAT in glucose metabolism, fatty acid b-oxidation, and the gluconeogenesis-associated aspartate–malate shuttle. Materials and methods Experimental animals The study was carried out in New Zealand rabbits (nZ10; Granja Cunicular, Navarra, Spain) weighing 2.35G 0.023 kg. The rabbits were maintained during 8 weeks with free access to tap water and control-fed with a standard diet (80–100 g/day; SF412 PANLAB SLU, Barcelona, Spain). Table 1 gives the composition of the diet. Rabbits were maintained under conditions of physiological temperature (23G28C) with a standard 12 h light:12 h darkness cycle. Food was removed 24 h before BAT and WAT were obtained. The experimental protocol and procedures were approvedbytheAnimalCareandUseCommittee of Universidad Complutense, according to the guidelines for ethical care of experimental animals of the European Community. The rabbits were killed with an intravenous overdose (60–65 mg/kg bw) of pentobarbitone sodium (Dolethal, Vetoquinol S.A., France) and exsanguination. After being killed, WAT was obtained from the lumbar region. In this regard, although the different depots may have different importance in the metabolic activity of WAT, it has been reported that upper-body WAT, including that from the lumbar region, provides the major proportion of systemic nonesterified fatty acid indicating a high metabolic activity (Martin & Jensen 1991). BAT was obtained from the interscapular depot. These fat pads are anatomically well defined and whole masses can be easily dissected. Fat pads were then weighed, washed in saline solution, dried and immediately frozen, and stored at K80 8Cuntilthe molecular determinations were performed. Circulating metabolic parameters Blood samples were collected through a catheter inserted into the ear arteries of concious rabbits. After 15 min of centrifugation at 1500 g, the serum was transferred to polypropylene tubes and frozen at K80 8C until lipids were assayed. In order to measure plasma concentrations of total cholesterol, HDL-cholesterol, and triglycerides, Table 1 Diet composition of rabbits Nutritional composition (%) Proteins 12.0 Minerals ash 6.5 Moisture 10.0 Lipids 3.0 Fibers 16.0 Journal of Molecular Endocrinology Research ZLO ´PEZ-IBARRA and others Adipose tissue energetic metabolism 54:2 106 http://jme.endocrinology-journals.org Ñ2015 Society for Endocrinology DOI: 10.1530/JME-14-0255 Printed in Great Britain Published by Bioscientifica Ltd. Downloaded from Bioscientifica.com at 11/21/2018 10:17:01AM via free access spectrophotometric colorimetric techniques were used, according to the manufacturer’s instructions (Vitros Fusion 5,1, OrthoClinical Diagnostics, Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA). LDL-cholesterol was also measured using an enzymatic colorimetric assay (SPINREACT, S.A./S.A.U., Gerona, Spain). Expression of energy-metabolism-related proteins Protein expression levels of 1,6-biphosphate aldolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, cytosolic malate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, carnitine palmitoyltransferase 1 (CPT1) and CPT2, acyl CoA dehydrogenase, and UCP1 were analyzed by western blotting. In brief, homogenized BAT and WAT were solubilized in Laemmli buffer containing 2-mercaptoethanol. The proteins obtained were separated on denaturing SDS–PAGE 15% (w/v) polyacrylamide gels. Equal amounts of proteins (20 mg/lane), estimated using bicinchoninic acid reagent (Pierce, Rockford, IL, USA), were loaded into the gels. Proteins were blotted onto nitrocellulose (Immobilion-P; Millipore, Madrid, Spain) and the blots were blocked overnight at 4 8C with 5% (w/v) nonfat dry milk as reported (previously Modrego et al. 2013). The membranes were then incubated with different antibodies against each of the aforementioned proteins. For this purpose, 1,6-biphosphate aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase were determined using a polyclonal antibody and a MAB respectively (sc-12061 and sc-47724 respectively, Santa Cruz Biotechnology, Inc., 1:1000). Lactate dehydrogenase was determined using a MAB (sc-133123, Santa Cruz Biotechnology, Inc., 1:100). Pyruvate dehydrogenase and cytosolic malate dehydrogenase were determined by using a polyclonal antibody (sc-7140 and sc-49234, Santa Cruz Biotechnology, Inc., 1:1000). CPT1 and CPT2 were determined using polyclonal antibodies at a dilution of 1:1000 purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (sc-20670 and sc-20526 respectively). Acyl CoA dehydrogenase was determined by using a polyclonal antibody (ACAD-10 sc-1304 dilution 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). UCP1 was determined by using a polyclonal antibody (UCP1 sc-6529 dilution 1:1000,SantaCruzBiotechnology,Inc.).Thesame samples were also incubated with a monoclonal anti-b- actin antibody as a loading control. After incubations, nitrocellulose membranes were washed and incubated with a peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibody (for pyruvate dehydrogenase, cytosolic malate dehydrogenase, acyl CoA dehydrogenase, CPT2, and UCP1), a peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody (for CPT1), and with an anti-mouse IgG antibody (for glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, and b-actin), and developed with ECL reagents (GE Healthcare, Little Chalfont Buckinghamshire, UK). Chemoluminiscence was evaluated by densitometry using Kodak Software (Kodak Gel Logic 2200, Imaging system densitometric Software). Prestained protein markers (Sigma) were used for molecular mass determinations. Determination of lactate content and, aconitase, lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase activities Lactate content in adipose tissues and aconitase, lactate dehydrogenase, and malate dehydrogenase activities were determined by using the commercial colorimetric assay kits (BioVision Incorporated, Milpitas, CA, USA) following the manufacturer’s instructions. To determine both lactate content and enzymatic activities, 80 mg of each homogenized adipose tissue was used. Statistical analyses Statistical differences were analyzed using the Mann– Whitney’s test. Results are expressed as meanGS.E.M. APvalue !0.05 was considered to be statistically significant. All data were analyzed using the SPSS Software Package (SPSS for Windows; SPSS, Inc., version 15.0). Results Table 2 lists the circulating metabolic characteristics of the rabbits. As was previously described, UCP1 was expressed in BAT but it was almost unexpressed in WAT, confirming the purity of the tissues used (Fig. 1). Table 2 Lipid and glycolic circulating metabolic characteristics of the rabbits. Results represent the meanGS.E.M. of ten rabbits Lipid metabolism LDL-cholesterol (mmol/l) 0.15G0.04 HDL-cholesterol (mmol/l) 0.42G0.02 Total cholesterol (mmol/l) 0.66G0.09 Triglycerides (mmol/l) 0.82G0.08 Glycolic metabolism Glucose (mmol/l) 5.03G0.22 Insulin (mU/l) 8.73G0.97 HOMA index 1.99G0.25 HOMA, homeostasis model assessment. Journal of Molecular Endocrinology Research ZLO ´PEZ-IBARRA and others Adipose tissue energetic metabolism 54:2 107 http://jme.endocrinology-journals.org Ñ2015 Society for Endocrinology DOI: 10.1530/JME-14-0255 Printed in Great Britain Published by Bioscientifica Ltd. Downloaded from Bioscientifica.com at 11/21/2018 10:17:01AM via free access Expression of proteins related to glucose and fatty acid metabolism in BAT and WAT Protein expression levels of fructose 1,6-biphosphate aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, two glycolytic enzymes, were determined in BAT and WAT. The protein expression level of glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase was significantly higher in WATthaninBAT(Fig. 2). The expression level of 1,6-biphosphate aldolase also tended to be higher in WAT than in BAT, although it did not reach statistical significance (Fig. 2). Moreover, the expression level of pyruvate dehydrogenase, an enzyme that yields acetyl-CoA from pyruvate, was also significantly higher in WAT than in BAT (Fig. 2). The protein expression level of the two fatty acid mitochondrial transporters, CPT1 and CPT2, was also determined in the both adipose tissues. BAT showed significantly higher expression levels of both CPT1 and CPT2 than WAT (Fig. 3). Moreover, the expression level of acyl CoA dehydrogenase, an enzyme involved in fatty acid b-oxidation, was also higher in BAT than in WAT (Fig. 3). Malate dehydrogenase, aconitase, and lactate complex Cytosolic malate dehydrogenase expression and activity were higher in WAT than in BAT (Fig. 4). There were no significant differences in aconitase activity between the two adipose tissues (Fig. 4). There was markedly higher expression and activity of lactate dehydrogenase in BAT in comparison with WAT (Fig. 5). However, lactate dehydrogenase activity was similar in both adipose tissues (Fig. 5). UCP1 33 kDa 42 kDa UCP1 (AU) BAT 300.00 250.00 200.00 150.00 100.00 50.00 0.00 BAT WAT * WAT β-actin Figure 1 Representative western blot showing UCP1 expression in BAT and WAT. The expression of UCP1 protein was used to assess the purity of the tissues used. b-actin was used as a loading control. At the bottom, the bar graphs show the results of densitometric analysis of all the western blots in arbitrary units (AU). The densitometric results represent the meanGS.E.M.of ten different rabbits. *P!0.05 with respect to BAT. BAT WAT 40 kDa 145 kDa 48 kDa 42 kDa Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1,6-Biphosphate aldolase Pyruvate dehydrogenase 40.00 40.00 20.00 ** 15.00 10.00 5.00 0.00 30.00 20.00 10.00 0.00 30.00 20.00 10.00 0.00 BAT WAT BAT WAT BAT WAT β-actin 1,6-Biphosphate aldolase (AU) Pyruvate dehydrogenase (AU) Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (AU) Figure 2 Representative western blots showing the expression of glycolytic enzymes in BAT and WAT obtained from rabbits. At the top, representative western blots showing the expression of 1,6-biphosphate aldolase, glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase, and pyruvate dehydrogenase in BAT and WAT. b-actin was used as a loading control. Each protein image corresponds to different gels with respect to the other proteins shown in the figure. At the bottom, the bar graphs show the results of densitometric analysis of all the western blots in arbitrary units. The densitometric results represent meanGS.E.M. of ten different rabbits. *P!0.05 with respect to BAT. Journal of Molecular Endocrinology Research ZLO ´PEZ-IBARRA and others Adipose tissue energetic metabolism 54:2 108 http://jme.endocrinology-journals.org Ñ2015 Society for Endocrinology DOI: 10.1530/JME-14-0255 Printed in Great Britain Published by Bioscientifica Ltd. Downloaded from Bioscientifica.com at 11/21/2018 10:17:01AM via free access Discussion This study showed for the first time, to our knowledge, that, after 24-h fasting at physiological temperature, the expression and activities of proteins associated with gluconeogenesis are increased in WAT compared with BAT. However, BAT showed a greater expression of both of the two main mitochondrial fatty acid transporters, CPT1 and CPT2, and also of an enzyme involved in fatty acid b-oxidation, acyl CoA dehydrogenase, than WAT. In addition, BAT showed higher lactate dehydrogenase expression and lactate content compared with WAT, indicating that under these experimental conditions the Malate dehydrogenase BAT WAT 42 kDa 36 kDa Malate dehydrogenase expression 20.00 15.00 25.00 Malate dehydrogenase activity Aconitase activity * 800.00 700.00 600.00 500.00 400.00 300.00 200.00 100.00 0.00 200.00 250.00 150.00 100.00 50.00 μmol/min per mg protein nmol/min per mg protein Arbitrary units 0.00 10.00 5.00 0.00 BAT WAT BAT WAT BAT WAT * β-actin Figure 4 Proteinexpressionofcytosolicmalatedehydrogenase andenzymaticactivities of aconitase and malate dehydrogenase inBATand WAT. At the top left, there is a representative western blot of cytosolic malate dehydrogenase expression in BAT and WAT. b-actin was used as a loading control. At the top right the densitometric results of all the western blots in arbitrary units are shown. At the bottom, histograms show the enzymatic activities of aconitase and malate dehydrogenase in BATand WAT. The results are represent the meanGS.E.M.of ten different rabbits. *P!0.05 with respect to BAT. BAT CPT1 75 kDa 67 kDa 56 kDa 42 kDa CPT2 20 CPT1 CPT2 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Arbitrary units Arbitrary units 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0BAT WAT BAT WAT * * * Acyl CoA dehydrogenase Carnitine palmitoyltransferases Acyl CoA dehydrogenase β-actin WAT Figure 3 Representative western blots of the two fatty acid mitochondrial transporters, CPT1 and CPT2, and acyl CoA dehydrogenase, an enzyme involved in fatty acid b-oxidation, in BAT and WAT. At the left, a representative western blot showing the protein expression of fatty acid b-oxidation-related proteins. b-actin was used as a loading control. Each protein image corresponds to different gels with respect to the other proteins shown in the figure. At the middle and right, the bar graphs show the results of densitometric analysis of all the western blots in arbitrary units. The densitometric results are represent the meanGS.E.M.often different rabbits. *P!0.05 with respect to BAT. Journal of Molecular Endocrinology Research ZLO ´PEZ-IBARRA and others Adipose tissue energetic metabolism 54:2 109 http://jme.endocrinology-journals.org Ñ2015 Society for Endocrinology DOI: 10.1530/JME-14-0255 Printed in Great Britain Published by Bioscientifica Ltd. Downloaded from Bioscientifica.com at 11/21/2018 10:17:01AM via free access attributed to norepinephrine stimulation. However, other studies have reported inefficiency of b 3 -adrenergic receptor agonists, even at high doses, to induce weight loss and thermogenesis (Redman et al. 2007, Cypess et al. 2012,Wu et al. 2014). Moreover, in UCP-1-knockout mice, the stimulatory effect of norepinephrine on glucose utilisation, another metabolic way to generate heat by BAT, disappeared completely. This observation suggests that the increased glucose utilisation by BAT after cold stimulation is dependent on UCP-1 better than on norepinephrine alone (Inokuma et al. 2005). Taken together, these data open the question about if all the energetic metabolic effects derived from temperature reduction in BAT are really dependent of adrenergic stimulation of BAT. Therefore, the present work was designed to in vitro analyse if the presence and the absence of norepinephrine during temperature reduction in rat BAT similarly affect the expression level of proteins related to long-chain fatty acids b-oxidation and mitochondrial oxidative phosphorylation, including UCP-1. Materials and methods Experiments were carried out in BAT samples from male Wistar rats (214 ± 10 g) of four months age. All procedures performed in the rats were in accordance with ethical standards of the institution. Indeed, the study forms part of a large study to analyse the effect of polyphenols in rat BAT that was approved by the Animal care and Use Committee of Complutense University (Code number ES280790000086). Rats were euthanised with intravenous overdose of pentobarbitone sodium (100 mg/kg bw) and exsanguinated. After being sacrificed, BAT pad was obtained from interscapular depot. Isolated BAT pads were washed in saline solution and then maintained in a modified Krebs–Henseleit solution containing: glucose 5.5 mmol/L, KH 2 PO 4 1.2 mmol/L, NaCl 135 mmol/L, KCl 5 mmol/L, MgSO 4 1.2 mmol/L, CaCl 2 2 mmol/ L, NaHCO 3 25 mmol/L, 0.25% albumin, 2 10 5 U/L penicillin, and 2 10–5lg/L streptomycin at pH 7.4. BAT portions from each rat were incubated for 24 h in a cell-cultured incubator under atmosphere of 95% O 2 /5% CO 2 either at 37 Cor32 C in the absence or presence of 10 6 mol/L norepinephrine. This norepinephrine concentration have been previously used in isolated fatty cells and even to establish cell lines with high UCP expression, mitochondrial content, and adipogenesis (Kozak and Kozak 1994, Shaughnessy et al. 2000). All procedures were performed in six different experiments under sterile conditions. At the end of the incubation period, BAT samples were immediately frozen at –80 C until molecular parameters were determined. Expression of energy metabolism-related enzymes Protein expression of mitochondrial malate dehydrogenase, CPT-I, CPT-II, mitochondrial malate dehydrogenase, lactate dehydrogenase, cytochrome C oxidase, mitochondrial F 1 ATP synthase a-chain, and UCP-1 was analysed by Western blot. As we have previously reported, the different BAT portions were homogenised with an Ultra-Turrax T8 (IKA-Werke; GmbH & Co, Staufen, Germany) in a buffer containing HEPES (50 mM), NaCl 2 (150 mM), glycerol (10%), Triton-X-100 (1%), and a protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). The homogenised BAT samples were then centrifuged at 10,000gfor 10 min and the supernatant stored at –80 C until analysis. Protein quantifications were done with bicinchoninic acid reagent (Pierce, Rockford, IL). As previously we have reported (Modrego et al. 2012, L opez-Ibarra et al. 2015), proteins were separated on denaturing SDS-PAGE 15% (w/v) polyacrylamide gels by loading 20 lg/lane protein solubilised in Laemmli buffer containing 2-mercaptoethanol. After electrophoresis, proteins were blotted onto nitrocellulose membranes (Immobilion-P; Millipore, Billerica, MA), and then blocked overnight at 4 C with 5% (w/v) albumin. Nitrocellulose membranes were then incubated with different antibodies against each of the aforementioned proteins. Indeed, CPT-I and CPT-II were determined using polyclonal antibodies (sc-20670 and sc-20526, respectively, dilution 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Mitochondrial malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase were determined using monoclonal antibodies (sc-1666879 and sc-133123, dilution 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). UCP-1 was determined using a polyclonal antibody (ab23841 dilution 1:1000, Abcam, Cambridge, UK). The core subunit of the mitochondrial membrane respiratory chain NADH dehydrogenase (MT-ND1), cytochrome c oxidase and mitochondrial F 1 ATP synthase a-chain were determined using monoclonal antibodies (ab181848, Abcam, Cambridge, UK; sc-58613, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA; ab14705 Abcam, Cambridge, UK, respectively; dilution 1:1000). Nitrocellulose was also incubated with a monoclonal anti-b-actin antibody (A-5441, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, dilution 1:1500) used as loading control. After incubation, nitrocellulose membranes were washed twice and incubated with a peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibody (for CPT-II), a peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG antibody (for CPT-I, mitochondrial malate dehydrogenase, MT-ND1, and UCP1) and with an anti-mouse IgG antibody (for lactate dehydrogenase, cytochrome c oxidase, mitochondrial F 1 ATP synthase a-chain and b-actin). After washed twice, nitrocellulose membranes were incubated with enhancing chemo-luminescence reagents (ECL; GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Chemo-luminescence was quantified by densitometry (Kodak Gel Logic 2200, Imaging System Densitometry Software, Kingsport, TN), Pre-stained protein markers (Sigma, St. Louis, MO) were used for molecular mass determinations. Determination of lactate dehydrogenase activity As previously we have reported (Modrego et al. 2012), lactate dehydrogenase activity was determined in the BAT samples (100 lg protein each sample) using a commercial kit (K-726-500; BioVision Research Products, Mountain View, CA) based on a colorimetric assay where lactate dehydrogenase reduces NAD to NADH, which then interacts with a probe to ARCHIVES OF PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY 55 produce a colour. The assay was performed following the manufacturer's recommendations. Statistical analysis Results are expressed as mean ± SEM. Unless was specified in the text; the expression of each protein was performed in six different BAT samples from six different rats that in vitro were incubated under the different experimental conditions. Statistical differences were analysed using Wilcoxon’s test. A pvalue <.05 was considered statistically significant. All data were analysed using SPSS software package (SPSS for Windows; SPSS Inc., Chicago, IL; version 15.0). Results Effects of temperature reduction (32 C) in BAT As compared with 37 C-incubated BAT, 32 C-exposed BAT showed a significant higher protein expression level of the two fatty acid mitochondrial transporters, CPT-I and CPT-II (Table 1 and Figure 1). The protein expression level of mitochondrial malate dehydrogenase did not reach statistical significance with respect to 37 C-incubated BAT (Table 1). The expression level of lactate dehydrogenase was significantly higher in 32 C-exposed BAT as compared with that in 37 C-exposed BAT (Table 1 and Figure 1). It was accompanied with higher lactate dehydrogenase activity in 32 C- exposed BAT than in those exposed at 37 C(Figure 2). Possible changes in the level of expression of proteins associated with mitochondrial respiratory chain were also analysed. As compared with 37 C-incubated BAT, 32 C-incu- bated BAT showed significant higher UCP-1 expression and reduced expression of mitochondrial F1 ATP synthase a-chain (Table 2 and Figure 3). The expression level of cytochrome c oxidase and the core subunit of the mitochondrial membrane respiratory chain NADH dehydrogenase (complex I, MT-ND1) was similar between 32 C and 37 C-incubated BAT (Table 2). Effect of norepinephrine on 32 C-incubated BAT The expression levels of CPT-I and CPT-II were not significantly different between 37 C-incubated BAT and 32 C- exposed BAT that was incubated with norepinephrine (10 6 mol/L) (Table 1 and Figure 1). The expression level of lactate dehydrogenase was also similar between norepinephrine-32 C-exposed BAT and 37 C-exposed BAT (Table 1 and Figure 1). However, lactate dehydrogenase activity was slightly higher in 32 C-exposed BAT with norepinephrine than in 37 C-incubated BAT (Figure 2). Addition of norepinephrine to 32 C-exposed BAT markedly increased mitochondrial malate dehydrogenase with respect to that observed at 37 C-exposed BAT (Table 1 and Figure 1). Comparing with the experiments performed at 37 C, the samples of BAT exposed to 32 C and 10 6 mol/L norepinephrine increased the protein expression level of UCP-1 and reduced the expression level of mitochondrial F1 ATP Table 1. Effect in rat BAT of temperature reduction in the presence and absence of 10 –6 mol/L norepinephrine (NOR) on the expression level of proteins associated with energetic metabolism. Incubation at 37 CIncubation at 32 C Variable –NOR –NOR þNOR CPT-I 23.78 ± 2.45 49.66 ± 6.5117.55 ± 3.64 † CPT-II 10.44 ± 2.80 31.83 ± 5.9914.75 ± 3.96 † Mitochondrial malate dehydrogenase 21.25 ± 3.65 27.30 ± 8.23 73.29 ± 9.20 † Lactate dehydrogenase 25.41 ± 3.69 43.23 ± 6.4323.12 ± 2.75 † CPT: carnitine palmitoyltransferase; NOR: norepinephrine. Data are expressed in densitometry arbitrary units as mean ± SEM of six different experiments. p<.05 with respect to 37 C-incubated BAT. †p<.05 with respect to 32 C-incubated BAT in the absence of norepinephrine. 32°C37°C −NOR +NOR−NOR 75 Kda 36 Kda 67 Kda CPT-I Mitochondrial malate dehydrogenase CPT-II Lactate dehydrogenase 35 Kda β-Actin 42 Kda Figure 1. Representative bands of Western blots determining the expression level of proteins involved in free fatty acid transport into the mitochondria, mitochondrial malate dehydrogenase and lactate dehydrogenase. The bands are only representative of the expression mean obtained with all samples of each experimental group. b-Actin expression was used as loading control. CPT: carnitine palmitoyltransferase; NOR: norepinephrine. 0 1 2 3 −NOR +NOR−NOR Lactate dehydrogenase acvity (nmol/min) * *† 32°C37°C Figure 2. Enzymatic activity of lactate dehydrogenase. Results are represented as mean ± SEM. p<.05 with respect to 37 C-incubated BAT. †p<.05 with respect to 32 C-incubated BAT in the absence of norepinephrine. NOR: norepinephrine. 56 B. SOPE ~ NA ET AL. synthase a-chain (Table 2 and Figure 3). The expression of the cytochrome c oxidase protein was reduced in 32 C- exposed BAT incubated with 10 6 mol/L norepinephrine with respect to that found in BAT exposed to 37 C(Table 2 and Figure 3). The expression level of MT-ND1 was not changed in 32 C-exposed BAT incubated with norepinephrine as compared with those exposed at 37 C(Table 2). Comparison between experiments performed at 32 Cin the presence and absence of norepinephrine As Table 1 and Figure 1 show, CPT-I and CPT-II expression levels were significantly higher in 32 C-incubated BAT without norepinephrine than in 32 C-exposed BAT with norepinephrine (Table 1 and Figure 1). Lactate dehydrogenase expression and activity were significantly higher in 32 C-exposed BAT than in 32 C-exposed BAT incubated with norepinephrine (Table 1 and Figures 1 and 2). However, the expression level of mitochondrial malate dehydrogenase in 32 C-exposed BAT incubated with norepinephrine was significantly higher than that in 32 C-incubated BAT without norepinephrine (Table 1 and Figure 1). The expression levels of UCP-1 and mitochondrial F1 ATP synthase a-chain were similar between the two experimental groups (Table 2). Moreover, MT-ND1 expression level was also similar between 32 C-exposed BAT incubated with and without norepinephrine (Table 2). The expression level of cytochrome c oxidase was similar in 32 C-exposed BAT incubated in the presence and absence of norepinephrine (Table 2 and Figure 3). Discussion Several works have previously suggested that the metabolic changes produced on BAT by low temperature exposition are mediated by norepinephrine. In our knowledge, the present descriptive in vitro study suggests for the first time that independently of norepinephrine, temperature reduction by itself also promotes changes in the expression levels of energetic metabolism-related enzymes. On the other hand, in BAT exposed to temperature reduction norepinephrine also induced changes on the expression of energetic metabolismrelated enzymes that in some cases were different than those elicited by temperature reduction alone. Effects of temperature reduction on the expression of energy metabolism-related enzymes in BAT Temperature reduction in BAT increased the expression level of the mitochondrial fatty acids transports, CPT-I and CPT-II, two obligatory steps for mitochondrial long chain fatty acid oxidation. It is well recognised that BAT contains high mitochondria number and requires fatty acid oxidation as fuel for heat generation (Ellis et al. 2010). Indeed, previous studies have demonstrated that cold exposure of BAT causes plasma non-esterified fatty acid uptake and lipolysis, thereby increasing the supply of fatty acids for oxidation (Saito et al. 2009). The importance that mitochondrial fatty acid transporters and fatty acids oxidation have for stimulating heat production promotes by temperature reduction in BAT is also supported by the fact that mice unexpressing CPT-II were not able to generate heat and/or oxidise fatty acids in BAT (Jieun et al. 2015). Free fatty acids were shown as the main stimulators of UCP-1 to promote thermogenesis (Rial and Gonz alez-Barroso 2001). Indeed, defective thermogenesis was demonstrated in mice lacking lipolytic adipose triglyceride lipase (Zimmermann et al. 2004). In this regard, the observed increased expression of CPT-I and CPT-II by incubating BAT at 32 C may suggest an increased free fatty acids transport into the mitochondria that it could also be associated with the observed enhanced expression of UCP-1 protein. The present experimental design does not allow us to determine the mechanisms by which, independently to norepinephrine, temperature reduction could increase UCP-1 expression in BAT. Indeed, as above-mentioned, it is probably may be related to an increased fatty acid transport and oxidation in the mitochondria. However, we could not rule out Table 2. Effect in rat BAT of temperature reduction in the presence and absence of 10 –6 mol/L norepinephrine (NOR) on the expression level of proteins involved in mitochondrial respiratory chain. Incubation at 37 CIncubation at 32 C Variable –NOR –NOR þNOR MT-ND1 11.35 ± 2.23 10.58 ± 2.14 9.86 ± 2.64 Cyt C oxidase 21.19 ± 4.18 15.82 ± 6.27 12.02 ± 2.56 Mitochondrial F 1 ATP synthase a-chain 53.59 ± 7.64 25.66 ± 4.6322.66 ± 6.21 UCP-1 241.19 ± 98.08 352.84 ± 129.58421.62 ± 137.90 UCP: uncoupling protein; MT-ND: mitochondrial-NADH dehydrogenase. Data are expressed in densitometry arbitrary units as mean ± SEM of six different experiments. p<.05 with respect to 37 C-incubated BAT. 60 Kda 33 Kda 40 Kda F1 ATP synthase α-chain UCP-1 Cytochrome C oxidase MT-ND1 36 Kda β-Actin 42 Kda 32°C37°C −NOR +NOR−NOR Figure 3. Representative bands of Western blots determining the expression level of proteins involved in mitochondrial respiratory chain. The bands are only representative of the expression mean obtained with all samples of each experimental group. b-Actin expression was used as loading control. UCP-1: mitochondrial-uncoupling protein-1; NOR: norepinephrine. ARCHIVES OF PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY 57 that other mechanisms may be involved in the non-depend- ent norepinephrine up-expression of UCP-1 after temperature reduction. In this regard, Ma et al demonstrated in mice that, regardless of norepinephrine stimulation, UCP-1 was up-expressed in BAT through a specific cold-sensing transient receptor potential melastatin-8 (Ma et al. 2012). Further studies are then needed to analyse this and other possible mechanisms. As above-mentioned, it is well established that active UCP-1 dissipates the proton gradient across the inner mitochondrial membrane, thus leading to heat production at the expense of reducing ATP formation. However, in our knowledge, less is known if in BAT temperature reduction may modify the protein expression level of other proteins involved in mitochondrial respiratory chain. An interesting observation derived from our results was that in addition to increase UCP-1 expression, exposure of BAT to lower temperature significantly reduced mitochondrial F1 ATP synthase a-chain protein expression. This probably takes place to further promote proton leakage to UCP-1, thus producing heat better than using protons to generate ATP by the ATP synthase. Effects of the combination of norepinephrine and temperature reduction Previous studies have reported that the stimulatory effects of cold exposure on BAT were mimicked by electrical stimulation of sympathetic nerves into BAT (Vallerand et al. 1990, Saito et al. 2009). However, the present in vitro study suggests that temperature reduction in BAT has some different effects in the presence and absence of norepinephrine on the expression levels of proteins related to energetic metabolism. In this regard, the main differences observed between temperature reduction in the presence and absence of norepinephrine were: (1) CPT-I and CPT-II expression was significantly higher in 32 C-exposed BAT incubated without norepinephrine; (2) as compared with 37 C and 32 C-exposed BAT, mitochondrial malate dehydrogenase, enzyme in the tricarboxylic acid cycle catalyses the conversion of malate into oxaloacetate, was significantly increased by norepinephrine in 32 C-exposed BAT; (3) in the presence and absence of norepinephrine, the protein expression level of UCP-1 was increased and the expression of mitochondrial F1 ATP synthase a-chain reduced with respect to 37 C-incubated BAT. Moreover, the presence of norepinephrine also reduced cytochrome c oxidase expression in 32 C-exposed BAT; (4) as compared with 37 C-incu- bated BAT, in the absence of norepinephrine temperature reduction increased the protein expression level and activity of lactate dehydrogenase, but the presence of norepinephrine in 32 C-exposed BAT reduced lactate dehydrogenase expression to similar levels than those found in 37 C-incu- bated BAT. However, norepinephrine maintained very slightly an increased lactate dehydrogenase activity in 32 C with respect to 37 C-incubated BAT but significantly reduced it with respect to 32 C-incubated BAT. CPT-I is located on the outer mitochondrial membrane, and is the first and rate-limiting step of the entry of free fatty acids into mitochondria, followed by free fatty acids transport by CPT-II across the inner mitochondrial membrane. The observation that norepinephrine incubation of 32 C-exposed BAT reduced CPT-I and CPT-II expression as compared with temperature reduction alone seems to be initially paradoxical. It is because several works have reported that adrenergic activation was associated with increased mitochondrial b-oxidation (Richard and Picard 2011). However, most of these conclusions were obtained from experimental in vivo studies where it is not possible to dissociate the effects of cold exposure of BAT from norepinephrine stimulation. In addition, in in vivo studies other factors could be influencing the results. However, reports have also supported the importance of an increased expression of CPT-I to increase mitochondrial activity to produce heat by BAT (Townsend et al. 2013). Taken together, it could be speculated that during temperature reduction norepinephrine may be, in some way, modulating long fatty acid uptake by the mitochondria even reducing it. To understand this speculation, it is first important to analyse the results obtained on the mitochondrial respiratory chain. The presence of norepinephrine during temperature reduction in BAT maintained UCP-1 up-expression and mitochondrial F1 ATP synthase a-chain down-expression observed by reducing temperature alone. In addition, the presence of norepinephrine during exposition of BAT to reducing temperature also diminished the protein expression level of cytochrome c oxidase with respect to 37 C-incubated BAT. Under normal physiological conditions, cytochrome c oxidase acts as rate-limiting step of respiratory chain. In this regard, Kadenbach's hypothesis states that the regulation of the membrane potential and ROS formation in mitochondria are determined by the ATP-induced allosteric inhibition of cytochrome c oxidase and represents a mechanism for respiratory control (Kadenbach et al. 2009). Under maximal stress conditions, as it may occur in BAT by the presence of norepinephrine during temperature reduction, cytochrome c oxidase losses its allosteric inhibition by ATP and cytochrome c oxidase activity remained increased. In addition, under these conditions the mitochondrial membrane potential was also increased favouring mitochondrial ROS formation (Vogt et al. 2016). Therefore, in BAT exposed to temperature reduction, the down expression of cytochrome c oxidase by norepinephrine may act as protective mechanism to reduce mitochondrial ROS generation through the mitochondrial respiratory chain. In this regard, activated thermogenesis in BAT was demonstrated to increase mitochondrial ROS production levels (Chouchani et al. 2016). The fact that the expression of mitochondrial malate dehydrogenase was increased in norepinephrine-stimulated 32 C-exposed BAT as compared with BAT exposed to temperature reduction without norepinephrine may be reflexing that at maximal stress conditions, i.e. temperature reduction þnorepinephrine, the tricarboxylic cycle may be trying to maintain an increased continuous proton supply for UCP-1 to produce heat; even more when cytochrome c oxidase was down-regulated by norepinephrine. In addition to free fatty acids, glucose is another important source for producing heat in cold-exposed BAT. Glucose 58 B. SOPE ~ NA ET AL. utilisation in BAT was markedly enhanced after b-adrenergic agonist administration (Shimizu et al. 1991, Chernogubova et al. 2004). Studies have also supported that b-adrenergic agonists stimulation of glucose utilisation by BAT was dependent of UCP-1 activation. Indeed, it was demonstrated that UCP-1 activation improved glucose tolerance, which it was reported not only in adipose tissue but also in skeletal muscle despite of lipid accumulation (Han et al. 2004). Taken together, it is possible to speculate that after temperature reduction there exist an increased expression/activity of UCP- 1 and then, fatty acid metabolism may be the main source for NADH and FADH 2 supply to mitochondrial oxidative respiratory chain. However, when norepinephrine is released, the metabolic source to maintain heat shifts towards glucose metabolism. Therefore, when norepinephrine is absent, free fatty acids support heat production by UCP-1 and then, aerobic glycolysis produces increased lactate dehydrogenase expression and activity. However, when norepinephrine is present during temperature reduction, the second step could be occurring shifting the source of heat production from free fatty acids towards glucose metabolisms. In this regard, probably to favour glucose metabolism throughout the tricarboxylic cycle, in the presence of norepinephrine, lactate dehydrogenase expression and activity were reduced in norepinephrine-incubated 32 C-exposed BAT as compared with those in 32 C-exposed BAT alone. However, specific experiments are needed and warranted to analyse this hypothesis. Study considerations and limitations Different in vivo studies, in denervated experimental animals, have suggested that catecholamines are responsible of UCP- 1 up-expression and then of thermoregulation in BAT (Desautels et al. 1986, Scarpace and Matheny 1998, Denjean et al. 1999). However, there are contradicting results about whether the sympathetic system is the only system involved in thermoregulation or whether other non-dependent norepinephrine/b-adrenergic receptor systems may be also associated with the thermoregulation processes (Festuccia 2010, Ye 2013). In this regard, it was also demonstrated increased UCP-1 expression in denervated animals was exposed to cold conditions (Festuccia 2010). Interestingly, a recent study described that independently of norepinephrine, cold-expos- ure was able to activate thermogenic genes in isolated white and beige adipocytes (Ye 2013). Although we are aware that the in vitro studies may not represent a strict physiological system, the in vitro studies in BAT, as we have shown here, may help to better analyse isolated molecular and biochemical mechanisms associated with thermoregulation. Adipose tissue contains a heterogeneous array of cells including resident inflammatory macrophages, which depending on the physiological status and environmental conditions can lead to constitute up to 40% of the adipose cell population (Neels and Olefsky 2006). It has been recently described that in the adipose tissue macrophages have the ability to secrete catecholamines, promoting in BAT the upexpression of thermogenic-related gene. In this regard, interleukin (IL)-4 stimulation in BAT promotes norepinephrine and tyrosine hydrolase expression in endogenous resident macrophages (Nguyen et al. 2011). Our experimental design does not allow discerning of endogenous norepinephrine produced by the resident macrophages in BAT which may contribute to the observed changes in the energetic metabolism-related proteins. However, it is plausible that the amount of endogenously produced norepinephrine may not be enough to induce changes in the expression protein profile in BAT. In this regard, a recent study has suggested in response to IL-4 resident macrophages did not synthesise relevant amounts of catecholamines and hence, it did not had a direct role in adipocyte metabolism or adaptive thermogenesis (Fischer et al. 2017). Another point to be commented is the measurement of LDH activity as determination of anaerobia metabolism. LDH release has been associated with cell damage and loss of cell viability. However, in the present study, LDH activity was performed in the tissue and not in the BAT supernatants. Moreover, LDH activity levels were reduced in conditions that initiate more stresses would exist, i.e. 32 C-exposed BAT in the presence of norepinephrine, as compared with 32 C- exposed BAT alone. Taken together these results may discard that LDH activity may reflex alteration in tissue viability. Conclusions In conclusion, this descriptive work shows for the first time that independently of norepinephrine, temperature reduction increases by itself the expression level of proteins associated with fatty acid transport into the mitochondria, lactate dehydrogenase, UCP-1 and decreased the mitochondrial F1 ATP synthase a-chain. A better understanding of the energetic metabolic processes in BAT could be used to design specific therapeutic approaches for treating metabolic disorders, including obesity. Acknowledgements The authors thank Bego~ na Larrea for secretarial assistance. Disclosure statement The authors report no declaration of interest. Funding This work was supported by Redes Tem aticas de Investigaci on Cooperativa (RETICs) RD12/0042/0040 and RD12/0042/0033, Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Fondos FEDER). References Bukowiecki, L.J., et al., 1981. Metabolic relationships between lipolysis and respiration in rat brown. Respiration, 256, 12840–12848. ARCHIVES OF PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY 59 Cannon, B., Houstek, J., and Nedergaard, J., 1998. Brown adipose tissue. More than an effector of thermogenesis? Annals of the New York academy of sciences, 856, 171–187. Chernogubova, E., Cannon, B., and Bengtsson, T., 2004. 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