Evaluación in situ de la actividad antimicrobiana de la clorhexidina al 0,2 %, administrada en enjuagues a diferentes posologías

Tesis Doctoral EVALUACIÓN IN SITU DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA CLORHEXIDINA AL 0,20%, ADMINISTRADA EN ENJUAGUES A DIFERENTES POSOLOGÍAS Seila María Torres Landín DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 Tesis Doctoral EVALUACIÓN IN SITU DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA CLORHEXIDINA AL 0,20%, ADMINISTRADA EN ENJUAGUES A DIFERENTES POSOLOGÍAS Firmado: Seila María Torres Landín DEPARTAMENTO DE ESTOMATOLOGÍA FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 AUTORIZACIÓN DE LOS DIRECTORES Dr. Pedro Diz Dios, profesor del Departamento de Estomatología de la Universidad de Santiago de Compostela Dra. Inmaculada Tomás Carmona, profesora del Departamento de Estomatología de la Universidad de Santiago de Compostela Como Directores de la Tesis Doctoral titulada “EVALUACION IN SITU DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LA CLORHEXIDINA AL 0,20%, ADMINISTRADA EN ENJUAGUES A DIFERENTES POSOLOGÍAS” presentada por la Licenciada en Odontología Dña. Seila María Torres Landín Autorizan la presentación de la tesis indicada, considerando que reúne los requisitos exigidos en el artículo 34 del reglamento de Estudios de Doctorado, y como Directores de la misma consideran que no incurre en causas de abstención establecidas en la ley 30/1992. Dr. P. Diz Dios Dra. I. Tomás Carmona Santiago de Compostela, septiembre de 2015 Agradecimientos Mi más sincero agradecimiento a los directores de esta tesis, los profesores Pedro Diz e Inmaculada Tomás, por haberme brindado la oportunidad de desarrollar este proyecto, por dirigirlo de forma encomiable y por su paciencia inagotable. De forma especial, quisiera expresar mi gratitud a Lucía García- Caballero, por la generosidad que ha demostrado al transmitirme su experiencia sobre este tema y porque su tesis doctoral ha representado un referente imprescindible. También es ineludible reconocer el trabajo de Mercedes Rivas Cascallar (técnica de microscopía confocal) y de Isabel Martínez (especialista en bioestadística). No quisiera dejar de mencionar a los participantes en el estudio por su colaboración desinteresada, y a todos los compañeros de la Unidad de Pacientes Especiales por su constante apoyo y disponibilidad. También me gustaría agradecer esta tesis a mi familia. A mi madre, por ser siempre incondicional y porque sus buenos consejos que me guiaron durante toda mi vida. A mi padre, por haberme enseñado que con esfuerzo, trabajo y constancia todo se consigue. A Silvia, Touri y Candela por el apoyo que me brindan día a día. A mis amigos, compañeras de trabajo y familiares por estar siempre que los necesito. A Javi, a él le dedico especialmente esta Tesis, por su comprensión y apoyo, por entender mis malos momentos y sobre todo porque me equilibra cuando más lo necesito. Y por último, a Elba, porque tu llegada coincidió con el final de este trabajo y me ayudaste a darle el empujón necesario para terminarlo. ÍNDICE 9 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 13 1.1. EL BIOFILM ORAL ................................................................................. 15 1.1.2. Propiedades del biofilm oral ............................................................ 17 1.1.3. Agentes anti-biofilm oral ................................................................. 19 1.1.3.1. Agentes antibacterianos inespecíficos........................................... 19 1.1.3.2. El papel regulador de las adhesinas .............................................. 21 1.1.3.3. Inhibidores de las enzimas sortase ................................................ 21 1.1.3.4. Inhibidores del quorum sensing .................................................... 23 1.1.3.5. Péptidos antimicrobianos sintéticos .............................................. 23 1.2. INFECCIONES PRODUCIDAS POR EL BIOFILM ORAL .................. 25 1.2.1. Infecciones locales ........................................................................... 25 1.2.1.1. Caries y enfermedad periodontal .................................................. 25 1.2.1.2. Alveolitis ....................................................................................... 26 1.2.2. Infecciones focales ........................................................................... 29 1.2.2.1. Endocarditis bacteriana y otras enfermedades cardiovasculares ... 29 1.2.2.2. Infecciones respiratorias ............................................................... 32 1.3. PROFILAXIS ANTIMICROBIANA DE LAS INFECCIONES PRODUCIDAS POR EL BIOFILM ORAL .............................................. 37 1.3.1. Profilaxis de las infecciones locales ................................................ 37 1.3.1.1. Profilaxis de la alveolitis con clorhexidina ................................... 37 1.3.1.2. Profilaxis de la alveolitis con antibióticos .................................... 44 1.3.2. Profilaxis de las infecciones focales ................................................ 49 1.3.2.1. Profilaxis de las infecciones cardiovasculares de origen oral con clorhexidina ......................................................................... 49 1.3.2.2. Profilaxis de las infecciones cardiovasculares de origen oral con antibióticos sistémicos ......................................................... 54 1.3.2.3. Profilaxis de las infecciones respiratorias de origen oral (neumonía nosocomial asociada a ventilación mecánica) con clorhexidina ................................................................................ 57 1.3.2.4. Profilaxis de las infecciones respiratorias de origen oral (neumonía nosocomial asociada a ventilación mecánica) con antibióticos ................................................................................. 63 2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 69 3. MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................ 73 SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 16 acondicionadas por la saliva, favorecen la agregación de otras especies bacterianas y facilitan las relaciones simbióticas (Foster y Kolenbrander, 2004). Con la adhesión de cada nueva especie bacteriana, se genera una nueva superficie que favorece la adhesión de otras bacterias, resultando en una progresión de superficies y de cambios, inherentes a la heterogeneidad de las especies implicadas. Esta dinámica de crecimiento y adhesión, confirma la existencia de comunicación inter- e intraespecies (Kolenbrander et al, 2002). En el proceso de formación del biofilm oral se han descrito 5 fases bien diferenciadas (Marsh, 2004):  La formación de la película adquirida. Consiste en el recubrimiento acelular de la superficie del esmalte por elementos de la saliva mucina, glicoproteínas, proteínas ricas en prolina, histidina y enzimas (Frías y Alsina, 2001), así como por constituyentes bacterianos como la fructosiltransferasa o la glucosiltransferasa, que representan una importante fuente de receptores para los colonizadores primarios (Kolenbrander et al, 2002).  La adhesión de colonizadores primarios. Los principales géneros bacterianos pioneros son Streptococcus spp. y Actinomyces spp. (Kolenbrander, 2000). Los Streptococcus spp. representan el 60-90% de las bacterias que colonizan el diente en las primeras horas después de efectuar una remoción mecánica profesional de la placa, y dentro de este género destacan por su frecuencia las especies mitis, sanguinis, oralis y gordonii (Kolenbrander et al, 1999). Aunque su relevancia es menor, también se consideran colonizadores pioneros: Capnocytophaga spp., Eikenella spp., Haemophilus spp., Prevotella spp. y Veillonella spp. (Kolenbrander et al, 2002). El ensamblaje entre estas bacterias pioneras y la película salival que recubre la superficie del esmalte se denomina “película de unión” (Busscher et al, 1995).  La coadhesión de colonizadores tardíos. Las bacterias de la flora oral se conectan mediante polisacáridos (Bowden y Li, 1997), que actúan como auténticos mecanismos de cooperación (Kolenbrander et al, 2002). A medida que la placa va madurando, se incrementa la población de microorganismos Gram-negativos (Landa et al, 1997), entre los que cabe destacar Fusobacterium nucleatum, ya que puede coadherirse tanto a los colonizadores pioneros como a los tardíos.  Fase de proliferación bacteriana. En esta fase, los microorganismos adheridos se multiplican por un proceso de división celular. Es en este momento cuando se produce la coagregación selectiva con otras 1. INTRODUCCIÓN 17 especies bacterianas (Socransky y Haffajee, 2002) y cuando se conforma definitivamente la compleja matriz extracelular.  Estabilidad y desprendimiento. El biofilm es finalmente mucho más estable, de naturaleza mixta, está espacialmente organizado y es funcional. Las bacterias adheridas, en respuesta a los estímulos ambientales, pueden desprenderse y colonizar nuevos hábitats, hasta formar un nuevo biofilm de características similares al original (Socransky y Haffajee, 2002). La “arquitectura del biofilm” se define como un patrón delimitado espacialmente y compuesto por una distribución variable de microcolonias bacterianas y agregados celulares envueltos en una matriz densa de exopolisacáridos, surcados por canales abiertos de agua que permiten el paso de nutrientes y la salida de desechos (Stewart, 2003; Barcat, 2005). La manipulación de esta estructura morfológica puede alterar la transferencia de masa líquida al conjunto del biofilm y puede facilitar el acceso a los agentes terapéuticos (Robinson et al, 2006). En la placa dental se reproduce la arquitectura de los biofilms generados in vitro (Wood et al, 2000; Zaura-Arite et al, 2001), con canales y poros tapizados por material celular muerto por los que se incorporan nutrientes especialmente sustratos endógenos a los que acceden directamente los microorganismos vivos (Socransky y Haffajee, 2002) por un proceso de difusión simple (Stewart, 2003). 1.1.2. Propiedades del biofilm oral  Resistencia a antimicrobianos. La susceptibilidad reducida de las bacterias de la placa dental a los agentes antimicrobianos en comparación con sus equivalentes planctónicas, probablemente constituye su propiedad más relevante (Pratten y Wilson, 1999). Para explicar este fenómeno se han esgrimido numerosas hipótesis, como: la densidad de las microcolonias, y las interacciones entre células y matriz (Wood et al, 2000); interacciones iónicas o reacciones químicas entre la matriz extracelular y el agente antimicrobiano teoría de la difusión-reacción (Marsh, 2005); el ritmo lento de crecimiento de las bacterias que conforman la placa dental (Costerton et al, 1999); la edad del biofilm, ya que las estructuras maduras ofrecen mayor resistencia a los agentes antimicrobianos que los biofilms jóvenes (Millward y Wilson, 1989); el microambiente desfavorable de las profundidades del biofilm o la capacidad de la matriz para atrapar enzimas neutralizadoras (Gilbert et al, 2002); por último, también se ha sugerido que podría responder a la expresión de un fenotipo de resistencia a los antimicrobianos, compartido entre las bacterias que forman parte de un mismo biofilm (Socransky y Haffajee, 2002). SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 18  Expresión genética alterada. Las bacterias planctónicas de un cultivo puro monoespecie son fenotípicamente muy diferentes de las que crecen en un biofilm aunque compartan el mismo genotipo y por lo tanto también diferirán en términos de actividad metabólica, adhesión y resistencia a los antimicrobianos (Costerton y Lewandowski, 1997). La plasticidad estructural y funcional de las bacterias, les permite adaptaciones fenotípicas rápidas en base a la disponibilidad de nutrientes, ritmo de crecimiento, condiciones ambientales como la temperatura y el pH, o exposición a concentraciones subterapéuticas de antimicrobianos. El fenotipo modificado puede incorporar modificaciones de la membrana o de la matriz extracelular (Gilbert et al, 1997).  El quorum sensing. La comunicación entre microorganismos quorum sensing es esencial para la colonización inicial y la posterior formación de la placa dental (Kolenbrander et al, 2002). Los mecanismos de comunicación son básicamente dos: por medio de señales químicas (Jayaraman y Wood, 2008) o intercambiando material genético (Marsh, 2005). En el primero, el receptor transmembrana histidín-quinasa actúa como un sensor para la adaptación al entorno biológico del biofilm (Scheie y Petersen, 2004) y se ha confirmado que existe tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas. Con respecto al intercambio de material genético, la comunicación interbacteriana se lleva a cabo a través de la difusión de pequeñas moléculas denominadas autoinductores (Marsh, 2004), que en situaciones de estrés ambiental hacen que las bacterias modifiquen su expresión genética para optimizar sus factores de virulencia, aumentar su supervivencia y facilitar su proliferación (Jayaraman y Wood, 2008); en el contexto de la cavidad oral, muchos Streptococcus spp. y algunos patógenos periodontales Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia y Fusobacterium nucleatum (Frias et al, 2001) se comunican por medio del quorum sensing (Scheie y Petersen, 2004).  Heterogeneidad fisiológica. El biofilm oral es multiespecie y está conformado por bacterias que ocupan micronichos entre los que existen interacciones físicas, metabólicas y moleculares, imprescindibles para la adhesión, el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos, incluso en ambientes hostiles (Marsh, 2004). Esta distribución en nichos, explica la coexistencia de bacterias con requerimientos metabólicos contradictorios y además proporciona otras ventajas, entre las que destacan: la coexistencia de especies con un rango muy amplio de necesidades para su crecimiento, permitiendo por ejemplo que determinadas bacterias consumidoras de oxígeno como Neisseria spp. creen unas condiciones ambientales adecuadas para la colonización de anaerobios estrictos (Bradshaw et al, 1996); una mayor eficacia metabólica, que permite la degradación de determinadas macromoléculas complejas del 1. INTRODUCCIÓN 19 huésped, resistentes a la acción de las bacterias aisladas (Bradshaw et al, 1994); un aumento de la resistencia a las agresiones del entorno, los antimicrobianos y los mecanismos de defensa del huésped (Marsh, 2005); y un “sinergismo patogénico”, que aúna diferentes factores de virulencia (van Steenbergen et al, 1984).  Capacidad adaptativa. Como hemos señalado, para mantener la estructura y la tasa de crecimiento del biofilm es imprescindible una gran capacidad de adaptación morfológica y fisiológica, que permita responder adecuadamente a las agresiones ambientales (Serrano-Granger y Herrera, 2005). En condiciones extremas, las bacterias empaquetan su ADN, minimizan su metabolismo y llegan a reducir su tamaño hasta dos tercios, iniciando un estado de latencia que puede perdurar durante años, lo cual justificaría la discrepancia en términos de sensibilidad antimicrobiana cuando estas bacterias están en estado letárgico o en estado activo (ten Cate, 2006). Cuando vuelve a optimizarse el ambiente, con nutrientes en cantidades adecuadas y buenas condiciones de pH y temperatura, las bacterias desempaquetan su ADN y reinician su actividad (Slavkin, 1997). 1.1.3. Agentes anti-biofilm oral Existe una relación fundamental entre la estructura del biofilm y su función in situ (Costerton et al, 1995). Una vez formada, la placa dental se mantiene estable gracias a la denominada homeostasis microbiana, que es el resultado de un balance dinámico en las interacciones microbianas de sinergismo y antagonismo (Sanders y Sanders, 1984). La homeostasis se puede alterar, produciéndose cambios en la composición de la microflora que podrían inducir la aparición de patología (Marsh, 1994). La flora residente en un biofilm estable tiene una función de protección frente a especies exógenas (McFarland, 2000) y por ello el tratamiento para combatir la placa va más encaminado a controlarla que a eliminarla por completo (Marsh, 1994). 1.1.3.1. Agentes antibacterianos inespecíficos En base a su actividad antimicrobiana los antisépticos orales se consideran: de muy baja potencia como el timol o el cetilpiridinio, de baja potencia como el fluoruro sódico y de alta potencia como la clorhexidina o la sanguinaria. La sustantividad de un colutorio antiséptico se define como la adherencia prolongada a las superficies orales (dientes y mucosas) y su liberación lenta a dosis eficaces que garanticen la persistencia de la actividad antimicrobiana (Manau-Navarro y Guasch-Serra, 2005). Los agentes antisépticos con escasa sustantividad se denominan de primera generación; a este grupo pertenecen los compuestos de SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 20 amonio cuaternario, los compuestos fenólicos, los agentes oxidantes y los fluoruros. Los agentes de alta sustantividad como las biguanidas, cuyo principal representante es la clorhexidina se consideran de segunda generación. La incorporación al mercado de nuevos productos como el decapinol, ha obligado a establecer una nueva categoría de colutorios antisépticos los de tercera generación, cuyo mecanismo de acción fundamental es la inhibición de la adherencia bacteriana (Kornman, 1990). En estudios in vitro, la clorhexidina fue la que mostró mayor actividad antibacteriana, seguida de un grupo de antisépticos entre los que se incluyen los aceites esenciales, la octenidina, el fluoruro estañoso y la hexetidina; la eficacia antiséptica del triclosán y los extractos de hierbas resultó muy escasa. En modelos in vivo, la clorhexidina y los aceites esenciales son los que mejor penetran la biopelícula y presentan mayor efecto antibacteriano (Serrano y Calsina, 2005). La clorhexidina es una molécula ambifática con grupos hidrófilos e hidrófobos, que se denomina 1,6-bis-4-clorofenildiguanidohexano (Lang y Brecx, 1986). Por tratarse de una base poco hidrosoluble, habitualmente se emplea en forma de sal, fundamentalmente diacetato, diclorhidrato o digluconato (Franch et al, 2005). De ellas, la sal de digluconato es la más soluble en agua y alcoholes (Arévalo et al, 1998), por lo que es la que se incorpora en la mayor parte de los colutorios, geles y barnices. La noción de “diana” que se utiliza para explicar el mecanismo de acción de los antibióticos también es aplicable a la clorhexidina, aunque a diferencia de éstos no descompone la pared bacteriana (Maris, 1995). A bajas concentraciones, la clorhexidina reduce la permeabilidad de la membrana citoplasmática, alterando su capacidad metabólica, de osmorregulación y su contenido enzimático (Al-Tannir y Goodman, 1994). Esta alteración de la integridad de la membrana constituye su efecto bacteriostático y es de carácter reversible (Franch et al, 2005). A concentraciones más elevadas de clorhexidina las interacciones son más severas, provocando la cristalización de la membrana, que finalmente pierde su integridad estructural y permite la salida catastrófica del material celular (Chawner y Gilbert, 1989a; Chawner y Gilbert, 1989b). Esta es la esencia del efecto bactericida de la clorhexidina, que produce la precipitación o coagulación del citoplasma bacteriano, lo que paradójicamente provoca una disminución de la salida de componentes a través de la membrana, que finalmente conduce a la muerte celular. Después de dos décadas de grandes esfuerzos investigadores y de casi 250.000 publicaciones, todavía no se ha comercializado un producto anti-biofilm definitivo. Se busca un principio activo basado en el efecto anti-adhesión, en la disrupción del quorum sensing o en la eliminación selectiva de especies bacterianas (Chen L y Wen YM, 2011). 1. INTRODUCCIÓN 21 1.1.3.2. El papel regulador de las adhesinas La secuencia de crecimiento del biofilm protege a las bacterias adheridas frente a los ataques ambientales; en consecuencia, los componentes activos de un agente antimicrobiano deberían penetrar en la placa para alcanzar a las bacterias adheridas en los estadios iniciales de su formación, ya que son las que unen la placa madura a la superficie del esmalte (Landa et al, 1997). Los patógenos colonizan diferentes lugares del organismo porque expresan múltiples adhesinas; se trata de proteínas que reconocen receptores específicos en diferentes localizaciones. Por ejemplo, para el Staphylococcus epidermidis, la adhesión inicial a una superficie está mediada por la adhesina polisacárido (PS/A), cuya expresión está controlada por el operón intercelular de adhesión (Ica) (Tojo et al, 1988; Zhang et al, 2003). En cambio, en el Streptococcus mutans, la adhesina SpacP (PAc) es de vital importancia para facilitar su adhesión a la superficie del diente, optimizándose el proceso en presencia de sacarosa o cuando existen otros biofilms previos (Nobbs et al, 2009). Aunque el Streptococcus mutans se conoce fundamentalmente como una bacteria oral y por ser el agente etiológico primordial de la caries, también se le relaciona con el desarrollo de bacteriemias y de endocarditis infecciosa. Presumiblemente, en la adhesión del Streptococcus mutans a diferentes tejidos participarían diferentes adhesinas. En base a la composición química de los polisacáridos de serotipo específico, el Streptococcus mutans se clasifica en los serotipos: c, e, f y k. En la cavidad oral, aproximadamente el 70-80% de las cepas son del serotipo c, seguidas por un 20% del serotipo e, mientras que el porcentaje de los serotipos f y k es inferior al 5%. El serotipo k es el que predomina en el Streptococcus mutans identificado en muestras de endocarditis, posiblemente como consecuencia de una alteración en la cadena lateral de la glucosa. Estos hallazgos sugieren que el Streptococcus mutans puede realizar interacciones de superficie con diferentes tejidos, siendo el serotipo k el que potencialmente tendrá una mayor participación en el desarrollo de infecciones sistémicas (Nakano et al, 2004). 1.1.3.3. Inhibidores de las enzimas sortase En la actualidad, se están estudiando numerosas proteínas de superficie identificadas a partir de diferentes especies microbianas, como adhesinas candidatas para desarrollar agentes anti-adhesión. Las múltiples interacciones adhesina-receptor que expresan diferentes afinidades, representan algunas de las dificultades más importantes que se han encontrado hasta el momento en la caracterización de las adhesinas. SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 22 Para minimizar este inconveniente, los investigadores están concentrando sus esfuerzos en las reacciones compartidas por la mayoría de las proteínas de superficie, en lugar de trabajar con adhesinas muy específicas. Las sortases son enzimas de membrana que catalizan los enlaces covalentes de los peptidoglicanos de las proteínas de superficie (Marraffini et al, 2006; Mazmanian et al, 1999); el análisis del genoma bacteriano indica que la sortase es una enzima común entre las bacterias Gram positivas. En experimentos realizados con S. aureus sobre 20 sustratos diferentes, se identificaron sortase en cada cepa secuencial, incluyendo la proteína A (Spa), fibronectinas de unión a proteínas (FnbpA, FnbpB), factores de unión (ClfA, Club), adhesina colágeno (Can), hemoproteínas de unión (IsdC, IsdB, IsdA) y otras proteínas de superficie (Marraffini et al, 2006). Lo mismo ocurre para otros Gram positivos, como S. epidermidis y S. mutans. La sortase A (srtA) muta sin mostrar todas las proteínas de superficie, mientras que este fenotipo podría ser rescatado por un plásmido que lleva el gen de tipo salvaje. En modelos de estudio animales con sepsis, abscesos, artritis séptica y endocarditis, se demostró que la srtA mutada era menos virulenta que las cepas de tipo salvaje (Jonsson et al, 2003; Weiss et al, 2004; Gianfaldoni et al, 2009). Curiosamente, se han descrito dos cepas clínicas de S. mutans que contienen mutaciones en el gen srtA de la sortase: el S.mutans Ingbritt contiene una supresión de 11 pares de bases en el srtA ORF que genera una interrupción prematura del codón (Igarashi, 2004), y el S. mutans NG5 es portador de una mutación errónea en el gen srtA, que resulta en la formación de enzimas no funcionales (Lee y McGavin, 2004). Ambas cepas segregan PAc y son incapaces de adherirse a la hidroxiapatita y de agregarse en presencia de saliva. En base a estos hallazgos, algunos investigadores han sugerido que la sortase podría constituir una buena diana para impedir la adhesión. Como la sortase es un factor de virulencia universal para los Gram positivos, los inhibidores sortase podrían tener un amplio espectro de aplicaciones clínicas. Incluso antes de la identificación definitiva de estas adhesinas, se insinuó que algunos compuestos como el metano-tiosulfonato y el ácido p-hidroxi- mercurio-benzoico presente en la naturaleza en las hojas del Cocullus trilobus y del Coptis chinensis actuaban como inhibidores de las sortase al bloquear el Cys184 de la sortase A, evitando así la adhesión de las bacterias a la fibronectina que recubre la superficie, aunque su aplicación terapéutica está limitada por su toxicidad (Kim et al, 2002; Maresso y Scheneewind, 2008).Otros inhibidores de sortase que son objeto de estudio en la actualidad son la diacetona y la clorometil-acetona (Maresso y Scheneewind, 2008). 1. INTRODUCCIÓN 23 1.1.3.4. Inhibidores del quorum sensing La interrupción de este sistema de comunicación puede mantener a las células en fase planctónica, por lo que los inhibidores del quorum sensing pueden constituir potenciales agentes terapéuticos. Desde su descubrimiento en 1960 (Tomasz, 1965), se han identificado y caracterizado varios sistemas principales de quorum sensing (Asad y Opal, 2008): el AHL (Gram negativos), el 4-quinolonas (Gram negativos), el péptido AgrD (Gram positivos), el AI2/LuxS (Gram positivos y Gram negativos) y el farnesol (hongos). Entre un número considerable de inhibidores del quorum sensing, destacan por su relevancia los furanones y el péptido inhibidor del ARN III (RIP). Los primeros han sido ampliamente estudiados por su eficacia contra los sistemas AHL y AI2. Además, algunos furanones carentes de efectos inhibitorios de crecimiento, pueden aumentar la susceptibilidad de las biofilms a antibióticos y detergentes (Pan y Ren, 2009). En modelos animales, se ha demostrado que los furanones también podrían actuar como facilitadores del sistema inmunológico para eliminar las infecciones (Wu et al, 2004). Después de conjugar AHL con proteínas portadoras, se han generado anticuerpos anti-AHL que podrían tener aplicaciones prometedoras en el control de la enfermedad (Kaufmann et al, 2006). Por último, en experimentos efectuados con Staphylococcus spp. (Balaban et al, 2003; Balaban et al, 2007), se ha demostrado que determinados péptidos inhibidores del ARN III en su forma amida (RIP; YSPWTNF-NH) reducen la virulencia del microorganismo, la formación de biofilm y la resistencia a antibióticos, aunque de momento no puede especularse sobre sus aplicaciones clínicas debido a su escasa estabilidad in vivo y por su toxicidad. 1.1.3.5. Péptidos antimicrobianos sintéticos Los tratamientos con antimicrobianos convencionales de amplio espectro atacan de forma indiscriminada a una subpoblación del biofilm, pudiendo ocasionar nuevos problemas con la eliminación de determinadas especies comensales. Una de las estrategias esgrimidas para llegar a conseguir un biofilm libre de patógenos se fundamenta en la selección de “péptidos antimicrobianos sintéticos dirigidos específicamente” (siglas en inglés, STAMP). Se trata de una versión mejorada de tercera generación de los péptidos antimicrobianos (AMPs) que están en la naturaleza y que juegan un papel muy importante en la inmunidad innata En general, los AMPs son moléculas catiónicas, grandes, con aproximadamente un 50% de terminales hidrófobos, cuyo mecanismo de acción consiste en cargar negativamente las moléculas estructurales de la membrana SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 24 microbiana. Estos péptidos tienen un amplio espectro de actividad antimicrobiana y las resistencias son muy poco frecuentes; desafortunadamente, su producción masiva es difícil y muy costosa, y además son sensibles a las proteasas digestivas. Modificando estos péptidos, se han desarrollado los denominados péptidos antimicrobianos sintéticos (siglas en inglés, SAMPs), que conservan la eficacia de los primeros pero mejoran sus propiedades farmacocinéticas, aunque su principal inconveniente es que todavía se consideran de amplio espectro. Este problema se solucionó con los STAMPs. Los STAMPs representan una nueva opción terapéutica, ya que eliminan patógenos de comunidades multiespecie y/o marcos clínicos específicos (Eckert et al, 2006). Un STAMP típico contiene un campo obligatorio específico que facilita la unión con un péptido diana; por ejemplo, los péptidos diana específicamente obligatorios del S. mutans se derivan de feromonas bacterianas como la CSP (SGS-LSTFFRLFNRSFTQALGK). Recientemente, se ha diseñado un STAMP con dos campos de especies-diana, que permite abordar simultáneamente a Streptococcus mutans y Pseudomonas spp. en un cultivo multiespecie. En un modelo in vitro de biofilm dinámico, se demostró que después de la eliminación selectiva de S. mutans con un STAMP, el biofilm remanente es resistente a la recolonización de nuevos agregados de esta especie (Li et al, 2010; He et al, 2009). Por lo tanto, los STAMPs tienen un gran potencial terapéutico, pudiendo eliminar patógenos selectivamente, mientras preservan los beneficios asociados a la flora comensal saludable. 1. INTRODUCCIÓN 25 1.2. INFECCIONES PRODUCIDAS POR EL BIOFILM ORAL 1.2.1. Infecciones locales 1.2.1.1. Caries y enfermedad periodontal La caries y la enfermedad periodontal son las enfermedades más comunes de la boca generadas por el biofilm oral. Ambas son consecuencia de un desequilibrio en las poblaciones bacterianas de los considerados “biofilms naturales”, que normalmente son compatibles con un estado de salud (Teles et al, 2006). Factores como la especificidad y la patogenicidad bacterianas, así como la susceptibilidad individual, pueden condicionar el inicio, el patrón de progresión y las características clínicas de las enfermedades orales asociadas al biofilm. La caries es una enfermedad multifactorial que se caracteriza por la destrucción de los tejidos del diente como consecuencia de la desmineralización provocada por los ácidos que genera la placa bacteriana. Es indispensable entender el funcionamiento y la complejidad de los biofilms, para poder explicar las dificultades que a menudo hay que afrontar para efectuar un tratamiento clínico adecuado de la caries. La remoción de la estructura dental desmineralizada e infectada, no modifica el proceso de infección primaria de la caries (Featherstone, 2002; Feathrstone, 2003). Un biofilm saludable puede estar formado por más de 700 especies bacterianas, de las que menos del 1% son bacterias potencialmente cariogénicas; esta biopelícula actúa, paradójicamente, como una primera línea defensiva para ayudar a proteger la cavidad oral de una infección. Un cambio de pH puede favorecer la proliferación de determinadas especies patógenas acidófilas y acidogénicas -como los estreptococos mutans y los lactobacilos spp.- tomando el control del biofilm y produciendo efectos muy negativos en el tejido dental (Marsh, 1989; Busscher et al, 1995). La enfermedad periodontal comienza por un sobrecrecimiento de ciertas especies bacterianas, prioritariamente Gram negativas y anaerobias, que proliferan en localizaciones subgingivales. La presencia de patógenos orales origina una respuesta inflamatoria persistente y la destrucción de los tejidos de soporte, lo que proporciona la expresión clínica de la enfermedad (Kornman et al, 1997; Kinane, 2000). SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 32 concluyeron que los individuos con enfermedad periodontal tenían un riesgo 1,14 veces mayor de desarrollar enfermedad coronaria que los que no tenían periodontitis; en los estudios de casos y controles (1.423 pacientes) el riesgo aumentó a 2,2 y en los estudios transversales (17.724 pacientes) fue de 1,59. Por su parte, Mustapha el al (Mustapha et al; 2007) seleccionaron 12 estudios de cohortes y 7 transversales, y efectuaron un análisis estratificado en base a la presencia de enfermedad coronaria, ictus y engrosamiento de la pared carotidea; su conclusión fue que la enfermedad periodontal se asocia a eventos cardiovasculares y favorece la aterogénesis. En definitiva, las revisiones sistemáticas con meta-análisis coinciden en que la enfermedad periodontal aumenta ligeramente el riesgo de enfermedad cardiovascular (Meurman et al, 2003; Bahekar et al, 2007; Mustapha et al, 2007). Cuando se ajustan los factores demográficos, otros autores han demostrado que no existe una asociación significativa entre periodontitis -determinada en base a la pérdida de inserción clínica- y calcificación de las arterias coronarias (Nakib et al, 2004). Sin embargo, se ha descrito una relación significativa entre el estado periodontal -pérdida de inserción y/o profundidad de las bolsas periodontales- y el infarto agudo de miocardio (Cueto et al, 2005). Estos hallazgos, aparentemente contradictorios, pueden expresar diferencias en la propia evaluación del estado periodontal. La mayoría de los estudios en los que la periodontitis constituye un factor de riesgo relevante para las enfermedades cardiovasculares, suelen evaluar el estado periodontal en base a la pérdida ósea alveolar, en lugar de recurrir a la pérdida de inserción y/o la profundidad de sondaje (Persson et al, 2003; Engebretson et al, 2005; Geismar et al, 2006; Rech et al, 2007). Beck et al (Beck et al 2005), confirmaron que los signos clínicos (sangrado al sondaje, profundidad de sondaje, nivel de inserción) no son representativos del impacto de los efectos acumulativos de la periodontitis en la salud sistémica. Además, se han descrito otras variables que pueden condicionar las tasas de prevalencia de periodontitis y en consecuencia los resultados de estos estudios, como la edad, la etnia o la ubicación demográfica. 1.2.2.2. Infecciones respiratorias En el año 2004, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica representó la cuarta causa de muerte en EE.UU., al alcanzar una tasa de 43,3 decesos por cada 100.000 habitantes (National Center for Health Statistics, 2005). Ese mismo año, la incidencia de las neumonías adquiridas en la comunidad fue de 11,6 casos/1.000 adultos (Marrie y Huang, 2005). Anualmente se registran en EE.UU. 500.000 hospitalizaciones relacionadas con la neumonía (Centers for Disease Control and Prevention, 2005), que conllevan unos costes de atención 1. INTRODUCCIÓN 33 ambulatoria y de hospitalización de aproximadamente 385 millones y 8,4 billones de dólares, respectivamente (Amin et al, 2004). La neumonía es el segundo tipo más común de infección nosocomial (Loesche y Lopatin, 1998; Centers for Disease Control and Prevention, 2005) y representa el 15% de todas las infecciones adquiridas en medio hospitalario (Centers for Disease Control and Prevention, 2005). La incidencia de neumonía nosocomial se ha estimado en 25-44 casos por cada 10.000 personas mayores de 60 años, con tasas de mortalidad del 21-70% en las unidades de cuidados intensivos (Loesche y Lopatin, 1998). Los principales agentes causales de las neumonías adquiridas en la comunidad son Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae (Marik, 2001), mientras que en el medio hospitalario los microorganismos más frecuentes son Staphylococcus aureus y Enterobacter spp. (Amin et al, 2004). Scannapieco (Scannapieco, 1999), describió 4 posibles mecanismos para explicar el papel potencial de las bacterias orales en la patogénesis de las infecciones respiratorias, particularmente de las adquiridas en el entorno hospitalario:  Los microorganismos que colonizan la placa dental pueden ser patógenos pulmonares. Se ha sugerido que la cavidad oral puede ser un reservorio para los patógenos respiratorios responsables de la neumonía por aspiración en pacientes de alto riesgo (Scannapieco et al, 1992; Fourrier et al, 1998; Russell et al, 1999; Didilescu et al, 2005). Algunos investigadores, después de analizar el aspirado pulmonar de pacientes con neumonía por aspiración, han proporcionado nuevas pruebas de la participación de los microorganismos periodontales (Bartlett y Finegold, 1974). A partir de colecciones purulentas procedentes de abscesos pulmonares, se han aislado una gran variedad de anaerobios orales y bacterias facultativas, entre las que se identificaron: Porphyromonas gingivalis, Bacteroides gracilis, Bacteroides oralis, Bacteroides buccae, Eikenella corrodens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium necrophorum, Peptostreptococcus spp., Clostridium spp. y Actinomyces spp. (Goldstein et al, 1979; Suwanagool et al, 1983; Joshi et al, 1991; Zijlstra et al, 1992; Mahomed et al, 1992; Brook y Frazier, 1993; Lorenz y Weiss, 1994; Morris y Sewell, 1994; Yuan et al, 1994; Chen et al, 1995).  Las enzimas salivales favorecen la colonización del tracto respiratorio. Algunas enzimas presentes en la saliva como la proteasa, pueden modificar la superficie de las mucosas promoviendo la adhesión y la colonización de los patógenos respiratorios (Johanson et al, 1972; Johanson et al 1980; Woods SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 34 et al, 1981). El origen de estas enzimas se ha atribuido a las bacterias (Nakamura y Slots, 1983; Zambon et al, 1985; Loesche et al, 1987; Wikstrom y Linde, 1986; Frandsen et al, 1987) o a los leucocitos polimorfonucleares que alcanzan la saliva a través del surco gingival (Cimasoni et al, 1977). En la placa bacteriana de algunos pacientes con enfermedad periodontal son especialmente abundantes determinadas bacterias que producen grandes cantidades de proteasas, como Porphyromonas gingivalis y espiroquetas.  Efecto enzimático hidrolítico. Las enzimas hidrolíticas, cuya concentración aumenta en los individuos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, pueden modificar la mucina, y la capacidad de adhesión y aclaramiento de los patógenos (Davies et al, 1995; Barsum et al, 1995; Reddy et al, 1997). Algunas enzimas asociadas a la enfermedad periodontal pueden destruir la película salival que recubre las bacterias patógenas, alterando la adhesión de determinadas bacterias como Haemophilus influenzae a las secreciones mucosas.  Acción de citoquinas proinflamatorias de origen periodontal. Se ha sugerido que la liberación de citoquinas proinflamatorias (como la interleuquina 8) podría explicar los daños detectados en el epitelio respiratorio de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, provocando una infiltración de neutrófilos, y la subsecuente liberación de enzimas proteolíticas y de radicales libres de oxígeno (Durum y Oppenheim, 1993; Khair et al, 1996). Los mecanismos de liberación de estas citoquinas a partir del epitelio respiratorio pueden ser consecuencia directa de la adhesión de patógenos respiratorios -como Haemophilus influenzae- (Hakansson et al, 1996) o de los productos secretados por las células epiteliales. En la enfermedad periodontal no tratada, los patógenos orales estimulan continuamente las células del periodonto (células epiteliales, endoteliales, fibroblastos, macrófagos y leucocitos), que liberan una gran variedad de citoquinas como interleuquinas-1α, -1β, -6, y -8, factor de necrosis tumoral alfa y otras moléculas biológicamente activas (Reddi et al, 1996; Wilson et al, 1996). Se ha especulado que éstas citoquinas originales de los tejidos periodontales podrían alterar el epitelio respiratorio y promover la infección por patógenos respiratorios. La existencia de una posible asociación entre salud oral y neumonía ha sido objeto de numerosas publicaciones (Mojon et al, 1997; Fourrier et al, 1998; Langmore et al, 1998; Terpenning et al, 2001; El-Solh et al, 2004). Langmore et al (Langmore et al, 1998), efectuaron un seguimiento a 189 personas de edad avanzada durante un período de 4 años, y concluyeron que la existencia de caries activas y el grado de dependencia para las prácticas de higiene oral, se asociaban con una mayor prevalencia de neumonías. Terpenning et al (Terpenning et al, 1. INTRODUCCIÓN 35 2001), en un estudio de características similares, evaluaron a 358 ancianos durante 9 años y comprobaron que la presencia de caries, la flora cariogénica y los patógenos periodontales, representaban factores de riesgo significativos de neumonía por aspiración. En general, la mayoría de los autores coinciden en que la carga bacteriana cariogénica y periodontopatógena, representan factores de riesgo potenciales para el desarrollo de neumonías (Mojon et al, 1997; Langmore et al, 1998; Terpenning et al, 2001). En estudios realizados en pacientes hospitalizados, se ha sugerido incluso que la placa dental puede actuar como un reservorio de patógenos bacterianos respiratorios (El Attar et al, 2010; Zuannazi et al, 2010). La relación entre salud oral y enfermedad pulmonar obstructiva crónica ha sido objeto de numerosos estudios transversales, en el marco de las National Health and Nutrition Examination Surveys (NHANES I y III). Aunque algunos autores sostienen que esta relación es poco consistente (Hayes et al, 1998; Scannapieco et al, 1998; Scannapieco y Ho, 2001), otras publicaciones más recientes han revelado que una salud periodontal pobre, con edentulismo e índices de placa elevados, empeora la calidad de vida de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Zou et al, 2011). En este sentido, se ha demostrado que la periodontitis crónica -especialmente la pérdida de inserción periodontal severaes común en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y que el compromiso respiratorio se agrava con un nivel de higiene oral deficiente y cuando aumenta el número de localizaciones con sangrado gingival (Leuckfeld et al, 2008; Deo et al, 2009). Se han publicado varios ensayos clínicos en los que se practicaron intervenciones dirigidas a mejorar la salud oral para analizar su repercusión en la aparición y/o la progresión de neumonías; los métodos utilizados en estos estudios incluyeron: tratamiento odontológico profesional, enjuagues con clorhexidina al 0,12%, aplicaciones tópicas de clorhexidina en gel al 0,2% y aplicaciones tópicas de soluciones antibióticas; en general, la implementación de estas medidas disminuyó la carga bacteriana oral y la prevalencia de neumonías nosocomiales, particularmente en pacientes sometidos a ventilación mecánica (Yoneyama et al, 1996; Fourrier et al, 2000; Bergmans et al, 2001; Genuit et al, 2001). Existen al menos 2 revisiones sistemáticas en las que se analizó la posible asociación entre enfermedades respiratorias y salud oral (Scannapieco et al, 2003; Amir y James, 2006). Scannapieco et al (Scannapieco et al 2003) seleccionaron 11 estudios de casos-controles y de cohortes (1.413 pacientes) y 9 ensayos clínicos aleatorizados (1.759 pacientes); aunque sólo pudieron incluir 5 para efectuar un meta-análisis y los resultados no fueron del todo concluyentes, los autores señalaron que existe una asociación entre enfermedad periodontal y neumonía, y una posible asociación entre enfermedad periodontal y enfermedad pulmonar SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 36 obstructiva crónica; además, advirtieron que la incidencia de neumonía nosocomial se reducía en un 40% cuando se aplicaban medidas de desinfección química o mecánica de la cavidad oral, así como con la administración de antibióticos. Amir y James (Amir y James, 2006) identificaron 9 trabajos de casoscontroles y de cohortes, en los que se examinaba la relación entre neumonía y enfermedad pulmonar obstructiva crónica con el estado de salud oral; también encontraron 9 ensayos clínicos en los que se comprobó cómo la mejora de los indicadores de salud oral conllevaba una reducción de la incidencia de neumonías. 1. INTRODUCCIÓN 37 1.3. PROFILAXIS ANTIMICROBIANA DE LAS INFECCIONES PRODUCIDAS POR EL BIOFILM ORAL 1.3.1. Profilaxis de las infecciones locales 1.3.1.1. Profilaxis de la alveolitis con clorhexidina Debido a la compleja etiopatogénesis de la alveolitis, se han estudiado numerosas modalidades terapéuticas para desestructurar el biofilm oral, resultando de especial interés la clorhexidina (CHX), por su contrastado potencial antimicrobiano. La CHX es un antiséptico de amplio espectro, eficaz contra patógenos aerobios y anaerobios, con un escaso índice de resistencias y pocos efectos secundarios. No existe un criterio unánime con respecto a la concentración, la posología o la forma galénica de presentación de la CHX, cuando se utiliza como antiséptico para la prevención de la alveolitis (Caso et al, 2005; Hedström y Sjögren, 2007; Minguez-Serra et al, 2009). En la década de los 70 se publicaron los primeros estudios sobre la aplicación de la CHX para prevenir la aparición de la alveolitis postexodoncia. En 1971, Macgregor (MacGregor y Hart, 1971) afirmó que un enjuague preoperatorio con CHX al 0,2% no era efectivo como antiséptico en los procedimientos de cirugía oral. Legarth (Legarth, 1977) estudió el efecto de la CHX al 0,2% en 60 pacientes y, en contraste con estos resultados, observó una reducción de la frecuencia de alveolitis del 45%. Tjernberg (Tjernberg, 1979) encontró un solo caso de alveolitis en un grupo experimental de 30 pacientes que se enjuagaron con CHX al 0,2%, frente a 5 casos en 30 pacientes del grupo control. En un estudio publicado en 1986 por Krekmanov y Nordenram, (Krekmanov y Nordenram, 1986), se detectó una disminución del 11 % en la prevalencia de alveolitis entre los pacientes que realizaban enjuagues con CHX al 0,2%, con respecto a los que no empleaban el antiséptico. El primer estudio clínico aleatorizado y controlado que demostró la eficacia de la CHX al 0,2% en la prevención de la alveolitis fue publicado por Field en 1988 (Field et al, 1988). Los participantes fueron distribuidos en tres grupos: el primero no recibió ningún tipo de irrigación, en el segundo se realizó una irrigación preoperatoria del surco gingival con solución salina y el tercer grupo recibió una irrigación también preoperatoria del área crítica peridentaria con CHX al 0,2%. Los resultados demostraron una tendencia hacia la disminución SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 38 de casos de alveolitis en el grupo tratado con CHX, aunque las diferencias entre los resultados obtenidos en los tres grupos no alcanzaron significación estadística. En 1990, Berwick y Lessin (Berwick y Lessin, 1990) fueron los primeros que utilizaron la CHX con fines profilácticos al 0,12%. Estos autores realizaron un estudio en 80 pacientes a los que se les iban a exodonciar los terceros molares y los distribuyeron en 4 grupos: al primero le administraron un enjuague preoperatorio de CHX al 0,12% durante un minuto, irrigando el alveolo después de la exodoncia con 15 ml de CHX diluida en 15ml de suero salino; al segundo grupo se le aplicó el mismo protocolo pero cambiando la CHX por cetilpiridinio; el tercer grupo recibió un protocolo similar al primero, salvo que la irrigación postexodoncia se realizó solamente con suero salino; por último, al cuarto grupo no se le realizó ningún tipo de enjuague preoperatorio. En base a los resultados de este estudio, los autores concluyeron que ni la CHX ni el cetilpiridinio eran más eficaces que la irrigación postexodoncia con suero salino en términos de prevención de la alveolitis. En 1991, Ragno et al (Ragno y Szkutnik, 1991) publicaron un estudio a doble ciego en el que se incluyeron 80 pacientes con 160 terceros molares programados para exodoncia. Los 40 pacientes del grupo experimental realizaron un enjuague preoperatorio con 15ml de CHX al 0,12% durante 30 segundos; una vez realizada la exodoncia se les irrigó el alveolo con la misma solución; a partir del día siguiente la aplicaron en colutorio, enjuagándose dos veces al día durante 7 días. El grupo control realizó el mismo protocolo pero con una sustancia placebo. Este estudio fue el primero en el que se evaluó la eficacia de la CHX como tratamiento postoperatorio para la prevención de la alveolitis, confirmándose que esta práctica reducía el riesgo de su aparición después de una exodoncia del tercer molar. Ese mismo año, Larsen (Larsen, 1991) publicó un estudio en un grupo de 139 pacientes a los que distribuyó en dos subgrupos: los del primero, recibieron enjuagues con CHX al 0,12% dos veces al día durante la semana anterior y la posterior a la exodoncia, mientras que el otro subgrupo siguió el mismo régimen de tratamiento pero con una solución placebo. Justo antes de la exodoncia todos los participantes realizaban un enjuague con CHX o placebo, y al finalizar el procedimiento quirúrgico se irrigaba el alveolo con 40ml de agua estéril. La prevalencia de alveolitis fue de 8,3% en el subgrupo de CHX versus 20,9% en el de placebo. Estos resultados demostraron que la CHX aplicada durante una semana antes y después de una exodoncia, reducía la frecuencia de alveolitis postexodoncia. En 1992, Fotos et al (Fotos et al, 1992) publicaron un estudio controlado a doble ciego, en el que se incluyeron 70 pacientes programados para exodoncias bilaterales de los terceros molares. En este trabajo, se evaluó el grado de 1. INTRODUCCIÓN 39 disconfort de los pacientes y no la aparición de alveolitis. El alveolo de la primera exodoncia se irrigó con una solución salina, mientras que en el contralateral se aplicó una solución de CHX al 0,1% o al 0,2% diluida en agua estéril (esta solución se impregnaba en una esponja de gelatina y se colocaba dentro del alveolo). Se evaluó a los pacientes al sexto día del postoperatorio, y se comprobó que la solución de CHX al 0,2% reducía significativamente las complicaciones y el grado de disconfort, mientras que los resultados con CHX al 0,1% no mostraron diferencias estadísticamente significativas con respecto al control. Bonine (Bonine, 1995), realizó un estudio en 371 pacientes con 654 terceros molares incluidos. En un primer grupo, los pacientes no recibieron ningún tratamiento pre- o postoperatorio de higiene oral; en el segundo, después de la cirugía realizaron enjuagues de CHX al 0,12% cada 12 horas durante 14 días; finalmente, en el tercero, los pacientes realizaron un único enjuague prequirúrgico con CHX al 0,12%. Los resultados demostraron una reducción significativa en la frecuencia de alveolitis en los pacientes que efectuaron enjuagues con CHX durante dos semanas, mientras que un único enjuague antes de la exodoncia resultó ineficaz. En 1998, Hermesch et al (Hermesch et al, 1998) publicaron un estudio controlado a doble ciego, que incluyó 279 pacientes a los que se iba a efectuar la exodoncia de al menos un molar. Los pacientes recibieron CHX al 0,12% o una sustancia placebo dos veces al día durante la semana previa y la posterior a la cirugía. Los resultados confirmaron la eficacia de la CHX al 0,12% en la prevención de la alveolitis después de una exodoncia. La prevalencia de alveolitis fue del 29,6% en el grupo placebo versus 18,4% en el grupo de la CHX, lo que supuso una reducción del 38% en la frecuencia de alveolitis. Delibasi et al (Delibasi et al, 2002) evaluaron la eficacia de la CHX al 0,2% sola y en combinación con un antibiótico. Para ello, diseñaron un estudio con 177 pacientes a los que distribuyeron en tres grupos: el grupo 1 realizó un enjuague de CHX al 0,2% antes de la cirugía, una vez realizada la exodoncia se irrigó el alveolo con una solución de CHX diluida en suero salino y en el período postquirúrgico los pacientes se enjuagaron con CHX dos veces al día durante 7 días; el grupo 2 realizó el mismo protocolo que el grupo 1, pero además, después de la cirugía se les prescribió Amoxicilina/Ácido Clavulánico a dosis de 500/125mg dos veces al día durante 5 días; el tratamiento del grupo 3 fue similar al del grupo 1, pero se sustituyó la CHX por una solución de suero salino (ClNa 0,09%). Los autores de este trabajo no encontraron diferencias en la aparición de alveolitis entre los grupos 1 y 3, pero sí la hubo con respecto al grupo 2. Su conclusión fue que la CHX sola no disminuye la frecuencia de alveolitis postexodoncia, mientras que sí es eficaz cuando se combina con un antibiótico B- lactámico. SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 40 En 2006, Metin et al (Metin et al, 2006) llevaron a cabo un estudio clínico randomizado con 99 pacientes tratados con enjuagues de CHX al 0,2%. Un grupo se enjuagó dos veces al día desde una semana antes y hasta una semana después de efectuar la exodoncia, mientras que el otro grupo solamente se enjuagó la semana posterior al procedimiento quirúrgico. Los pacientes fueron evaluados a los 7 días y los resultados no mostraron diferencias en la prevalencia de alveolitis en base al régimen aplicado. Torres-Lagares et al (Torres-Lagares et al, 2006), publicaron un estudio randomizado y a doble ciego, en el que evaluaron la eficacia de un gel bioadhesivo de CHX al 0,2%. Después de completar la exodoncia, al grupo experimental constituido por 53 pacientes se le colocó el gel de CHX en el interior del alveólo, mientras que al grupo control 50 pacientes se le aplicó un placebo de características similares. Los resultados revelaron diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia de aparición de alveolitis, disminuyendo desde el 30% en el grupo control al 11% en el grupo que recibió la CHX. Los autores concluyeron que el gel bioadhesivo de CHX es una buena alternativa para la prevención de la alveolitis. En esta misma línea sobre la eficacia de la CHX en gel, Hita-Iglesias et al (Hita-Iglesias et al, 2008), compararon un gel de CHX al 0,2% con enjuagues de CHX al 0,12%. El estudio incluyó 41 pacientes a los que se aplicó el gel y 32 que recibieron el enjuague. Los resultados demostraron una reducción estadísticamente significativa en la prevalencia de alveolitis en el grupo tratado con el gel de CHX. En 2009, Smith (Smith, 2009) publicó un estudio con un diseño muy parecido, donde también comparó el gel de CHX al 0,2% con los enjuagues de CHX al 0,12%. En el grupo experimental conformado por 41 pacientes se aplicó el gel en el alveolo durante una semana después de la cirugía, mientras que en el grupo control 32 pacientes se realizaron enjuagues de CHX al 0,12%. La conclusión del trabajo fue que en el grupo que utilizó el gel de CHX, había un 70% menos de alveolitis. En 2010, Torres-Lagares et al (Torres-Lagares et al, 2010) realizaron un estudio con las mismas características que el que habían publicado 4 años antes, pero en pacientes con discrasias sanguíneas. Las conclusiones de ambas trabajos coincidieron, ya que se demostró que en los pacientes con estas alteraciones una única aplicación intraalveolar de gel de CHX al 0,2% tras la exodoncia de un tercer molar, también reducía la aparición de alveolitis. Sridhar et al (Sridhar et al, 2011) desarrollaron una investigación clínica en la que evaluaron la eficacia de los enjuagues de CHX para prevenir la alveolitis después de exodonciar un tercer molar. El estudio consistió en efectuar 1. INTRODUCCIÓN 41 exodoncias bilaterales a 50 pacientes; en la primera no se aplicaba ningún tipo de profilaxis, pero para realizar la exodoncia contralateral el paciente se enjuagaba dos veces al día durante 8 días con CHX al 0,2% (desde el día previo a la cirugía hasta 7 días después). La prevalencia de alveolitis fue del 8% cuando los pacientes no aplicaron la CHX y por el contrario no se registró ningún caso tras aplicar el protocolo antiséptico. Babar et al (Babar et al, 2012), también publicaron un estudio para determinar la eficacia de la CHX en forma de gel colocada en el alvéolo después de completar la exodoncia para prevenir la alveolitis. Se intervino a 100 pacientes; a 50 se les aplicó una dosis de gel y los otros 50 constituyeron el grupo control. Entre los primeros se detectaron 4 casos de alveolitis (8%) frente a 14 casos (28%) entre los controles Rodríguez-Pérez et al (Rodríguez-Pérez et al, 2013) compararon la eficacia del gel de CHX intraalveolar al 0,2% versus 1%. A los 88 pacientes que conformaron el grupo de estudio se les colocó un gel de CHX al 0,2% en el alvéolo después de la exodoncia, pero después se distribuyeron en dos subgrupos en los que, dos veces al día y durante 7 días, unos pacientes aplicaban el gel al 0,2% y otros al 1%. El resultado fue que no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre ambos protocolos. Recientemente, Haraji et al (Haraji et al, 2013) publicaron un estudio donde demostraron la reducción de la frecuencia de alveolitis tras la aplicación intraalveolar de una esponja de gelatina empapada en un gel de CHX al 0,2%. A 80 pacientes se les exodonciaron dos terceros molares; en un alvéolo se aplicó CHX y en el contralateral un placebo. Se constató una diferencia significativa en la prevalencia de alveolitis que fue del 11,3% y del 32,6%, respectivamente. La aplicación de CHX para prevenir la alveolitis es un tema de especial auge en la actualidad, como demuestra el hecho de que en los tres últimos años se hayan publicado hasta 5 revisiones bibliográficas sobre el tema (Bowe et al, 2011; Yengopal y Mickenautsch, 2012; Richards, 2012; Daly et al, 2012; Dodson, 2013), frente a sólo dos en las tres décadas previas (Caso et al, 2005; Hedstrom y Sjogren, 2007). Los resultados de los trabajos más relevantes publicados hasta la fecha de la profilaxis de la alveolitis con CHX se detallan en la tabla 1. SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 48 Tabla 2. Profilaxis de la alveolitis con antibióticos sistémicos Autor (año) Pacientes Intervención Resultados casos/total Conclusiones Curran (1974) G1= 33 G2= 35 1 millón IU Penicilina G im (4 días antes a 4 después de la cirugía) Sin profilaxis 5/33 5/35 No hay diferencias estadísticamente significativas Barclay (1987) G1= 45 G2= 50 400mg Metronidazol vo (1h antes de la cirugía y después cada 8h durante 3 días) Placebo 8/45 17/50 No hay diferencias estadísticamente significativas Bystedt (1980) G1= 80 G2= 60 Azitromicina, Eritromicina, Clindamicina o Doxiciclina Placebo 3/80 5/60 El antibiótico puede ser eficaz sólo en exodoncias traumáticas Ritzau (1992) G1= 135 G2= 135 1 gr Metronidazol vo (30 min. antes de la cirugía) Placebo 6/135 5/135 No hay diferencias estadísticamente significativas Monaco (1999) G1= 66 G2= 75 2 gr Amoxicilina vo (5 días después de la exodoncia) Sin profilaxis 2/66 4/75 No hay diferencias estadísticamente significativas Krekmanov y Hallander (1980) G1= 40 G2= 40 800mg Penicilina V antes de la exodoncia Sin profilaxis 2/40 13/40 El antibiótico reduce significativamente el número de alveolitis Krekmanov 1981) G1= 50 G2= 48 800mg Penicilina V antes de la exodoncia Sin profilaxis 2/50 15/48 El antibiótico reduce significativamente el número de alveolitis Bergdahl y Hedstrom (2004) G1= 59 G2= 60 1600mg Metronidazol (45min antes de la exodoncia) Placebo 10/59 13/60 No hay diferencias estadísticamente significativas Poeschl (2004) G1= 176 G2= 180 G3= 172 500/125 mg AMX/CLV (5 días postexodoncia) 300 mg Clindamicina (5 días postexodoncia) Sin profilaxis 8/176 7/180 8/172 No hay diferencias estadísticamente significativas Lacasa (2007) G1= 75 G2= 75 G3= 75 2.000/125 mg AMX/CLV (antes de la exodoncia) 2.000/125 mg AMX/CLV (5 días postexodoncia) Placebo 4/75 2/75 12/75 El antibiótico reduce significativamente el número de alveolitis e infecciones Arteagoitia (2005) G1= 231 G2= 259 500/125 mg AMX/CLV (cada 8h durante 5 días postexodoncia) Placebo 0/231 2/259 No hay diferencias estadísticamente significativas Graziani (2005) G1= 20 G2= 10 500 mg Azitromicina (3 días antes de la cirugía) Placebo 0/20 1/10 No hay diferencias estadísticamente significativas Kaczmarzyk (2007) G1= 31 G= 28 G3= 27 600mg Clindamicina (1h antes de la exodoncia) 600mg Clindamicina (1h antes y durante 5 días postexodoncia) Placebo pre- y postexodoncia 1/31 2/28 4/27 No hay diferencias estadísticamente significativas Halpern y Dodson (2007) G1= 59 G2= 59 15 UI/kg Penicilina o 600mg clindamicina iv en alérgicos (1h antes de la exodoncia) Placebo 0/59 0/59 No hay diferencias estadísticamente significativas López-Cedrún (2011) G1= 39 G2= 44 G3= 40 2 grs Amoxicilina (2h antes de la cirugía) 500 mg Amoxicilina (5 días postexodoncia) Placebo 0/39 0/44 0/40 No hay diferencias estadísticamente significativas Bezerra (2011) G1=34 G2= 34 1 gr Amoxicilina (1h antes de la exodoncia) Placebo 0/34 0/34 No hay diferencias estadísticamente significativas G= Grupo de tratamiento; im= vía intramuscular; vo= vía oral; iv= vía intravenosa; AMX/CLV= Amoxicilina/Ácido Clavulánico 1. INTRODUCCIÓN 49 1.3.2. Profilaxis de las infecciones focales 1.3.2.1. Profilaxis de las infecciones cardiovasculares de origen oral con clorhexidina Desde que en la década de los 70 se publicaron los primeros trabajos sobre la eficacia antimicrobiana de la CHX, éste ha sido el antiséptico más investigado hasta el momento en relación a su efecto en la prevalencia de bacteriemias secundarias a manipulaciones dentales, aunque los resultados reflejados en la literatura son bastante heterogéneos. En 1984, Macfarlane et al (Macfarlane et al, 1984) encontraron una prevalencia de bacteriemias postexodoncia en los pacientes sometidos a irrigación del surco gingival con CHX al 1% o povidona yodada al 1% (reteniendo la solución antiséptica en la boca durante 2 minutos), significativamente inferior que en un grupo irrigado exclusivamente con suero salino (los porcentajes de hemocultivos positivos fueron 25, 40 y 80%, respectivamente); este resultado ratificó la importancia de la actividad bactericida del antiséptico frente al efecto mecánico del lavado. Al igual que otros autores, estos investigadores recomendaron la irrigación del surco gingival con clorhexidina al 1% o povidona yodada al 1% como complemento de la profilaxis antibiótica. En 1991, Lofthus et al (Lofthus et al, 1991) publicaron un trabajo en el que evaluaban el efecto de la irrigación profiláctica del surco gingival con CHX al 0,12% durante 20 segundos, en la prevalencia de bacteriemias provocadas por un curetaje y alisado radicular; de los 30 participantes en el estudio (distribuidos en 3 grupos de 10), 9 presentaron hemocultivos positivos postmanipulación: 3 eran controles, 4 habían sido irrigados con agua estéril y 2 con CHX. En consecuencia, estos autores concluyeron que la irrigación subgingival con clorhexidina al 0,12% no reducía la prevalencia de bacteriemias secundarias a un curetaje y alisado radicular. Por el contrario, Allison et al (Allison et al, 1993) demostraron que la aplicación a nivel subgingival de una solución de CHX al 0,12% antes y durante la práctica de un curetaje subgingival con ultrasonidos, disminuía el porcentaje de bacteriemias producidas por este procedimiento. Rahn et al (Rahn et al, 1995), investigaron en un grupo de 120 individuos si la irrigación del surco gingival con povidona yodada al 10% o con CHX al 0,2% condicionaba la prevalencia de las bacteriemias asociadas a determinadas manipulaciones dentales (inyección intraligamentosa o exodoncia de un molar); en este estudio, se produjo una reducción significativa en la frecuencia de bacteriemias postinyección intraligamentosa y postexodoncia después de la irrigación con povidona yodada (27%), en contraste con los resultados obtenidos tras la irrigación con agua estéril (52%) o con CHX (45%). En base a estos SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 50 hallazgos, los autores señalaron que el método más eficaz de aplicación de un antiséptico para disminuir la prevalencia de bacteriemias postmanipulación dental era la irrigación del surco gingival previa al tratamiento odontológico; coincidiendo con otros investigadores, sugirieron que la reducción en la prevalencia de bacteriemias postmanipulación dental se debía a la acción bactericida de los antisépticos más que al efecto de lavado mecánico que implica la irrigación, y que la povidona presentaba mayor actividad antiséptica que la CHX. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la povidona se aplicó a una concentración 50 veces superior a la de la CHX. En 1996, Peter Lockhart (Lockhart, 1996) investigó la prevalencia y la etiología de las bacteriemias postexodoncia en un grupo de adultos sometidos a 2 enjuagues “enérgicos” consecutivos con 10 ml de hidrocloruro de CHX al 0,2%, y en otro grupo de pacientes que se enjuagaron con una solución placebo. Su principal conclusión fue que los enjuagues previos con CHX no ejercían un efecto significativo en la prevalencia de hemocultivos postexodoncia, ya que en el “grupo CHX” ésta fue del 84% y en el “grupo placebo” del 94%. Para explicar estos hallazgos, este autor señaló que el enjuague con el antiséptico no penetraba más de 3 mm en el surco gingival y en consecuencia no alcanzaba la zona crítica por la que las bacterias acceden al torrente circulatorio. Brown et al (Brown et al, 1998), investigaron el efecto de un único enjuague de hidrocloruro de CHX al 0,12% en la prevalencia e intensidad de las bacteriemias secundarias a la remoción de puntos de sutura; el colectivo de estudio lo conformaron 61 pacientes a los que se efectuaron exodoncias de los terceros molares, cerrando el lecho quirúrgico con al menos 8 puntos de sutura; transcurridos 7 días, los pacientes se distribuyeron en un “grupo de control” y otro que recibió un enjuague con CHX durante 1 minuto antes de proceder a la retirada de los puntos; la prevalencia total de bacteriemias asociada a la remoción de suturas fue del 18% en el “grupo CHX” y del 15% en los controles. Los autores justificaron estos hallazgos argumentando que la práctica de enjuagues orales de carácter “activo” podía provocar bacteriemias y que la corta duración del enjuague (1 minuto) impedía que el antiséptico ejerciera su actividad antibacteriana. Por su parte, Erverdi et al (Erverdi et al, 2001) investigaron la prevalencia de bacteriemias asociadas a la colocación y retirada de bandas de ortodoncia después de efectuar un enjuague con gluconato de CHX al 0,25% durante 1 minuto, contrastando los resultados con los publicados en investigaciones previas; al finalizar la inserción de las bandas, los porcentajes de hemocultivos positivos fueron 7,5% en los controles y 2,5% en los sometidos al enjuague con CHX, y tras su retirada estos porcentajes fueron 6,6% y 2,5% respectivamente. En 2007, Tomás et al (Tomás et al, 2007) realizaron un estudio acerca de la prevalencia, la duración y la etiología de las bacteriemias secundarias a 1. INTRODUCCIÓN 51 exodoncias. Un total de 106 pacientes fueron distribuidos en 2 grupos: a uno se le administró un enjuague de CHX al 0,2% durante 30 segundos antes de la manipulación, mientras que al grupo control no se le proporcionó ningún tratamiento. Se recogieron muestras de sangre a los 30 segundos, 15 minutos y una hora después de la exodoncia. La prevalencia de bacteriemias en el grupo control y en el grupo CHX fue respectivamente del 96 y 79% a los 30 segundos, del 64 y 30% a los 15 minutos, y del 20 y 2% a la hora. Los autores concluyeron que el enjuague rutinario de CHX antes de una exodoncia reducía el riesgo de aparición y especialmente la duración de las bacteriemias postextracción. Estos resultados no concuerdan con los obtenidos recientemente por Maharaj et al (Maharaj et al, 2012), cuando evaluaron diferentes regímenes de profilaxis antibacteriana para la prevención de bacteriemias tras una exodoncia. En el ensayo participaron 140 pacientes que se clasificaron en 4 grupos: grupo control, grupo que realizó un enjuague de 10 ml de CHX al 0,2% antes de la cirugía, grupo al que se les administraron 3 gr de amoxicilina 1 hora antes de la exodoncia, y grupo al que se les proporcionaron 600 mg de clindamicina también una hora antes. La proporción de pacientes que presentaron bacteriemias en los 4 grupos fueron respectivamente, 35, 40, 7,5 y 20%. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos amoxicilina y control, así como entre los grupos amoxicilina y CHX. Recientemente, Barbosa et al (Barbosa et al, 2015) investigaron la aparición de bacteriemias postexodoncia después de la administración profiláctica de CHX. Para ello distribuyeron aleatoriamente a 201 participantes en 4 grupos de estudio: grupo control, grupo que se enjuagó con un colutorio de CHX al 0,2% antes de la manipulación dental, grupo en el que el enjuague se complementó con una irrigación subgingival con CHX al 1%, y un último grupo en el que el enjuague se complementó con una irrigación supragingival también con CHX al 1%. Sus conclusiones fueron que el enjuague con CHX reducía significativamente la duración de las bacteriemias, mientras que la irrigación limitaba su eficacia, probablemente porque esta maniobra podría provocar bacteriemias per se. Los resultados de todos estos estudios sobre la eficacia antimicrobiana de la CHX para prevenir las bacteriemias después de una manipulación dental son muy heterogéneos, presumiblemente por la gran variabilidad metodológica, ya que se evalúan diferentes procedimientos odontológicos, diferentes técnicas de aplicación del antiséptico, y diferentes concentraciones y posologías de la CHX, por lo que es muy difícil comparar sus resultados. Las propuestas de los Comités de Expertos En 1997, la Asociación Americana de Cardiología (siglás en inglés, AHA) recomendó el uso de enjuagues con colutorios antisépticos que contuvieran CHX SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 52 o povidona yodada antes de ciertas manipulaciones dentales (Dajani et al, 1997). En la guía publicada en 2006 por la Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (siglas en inglés, BSAC), se afirmaba que “debería administrarse un enjuague preoperatorio con 10 ml de gluconato de CHX al 0,20% y que éste debía mantenerse en la boca durante un minuto” (Gould et al, 2006). En contraste, en los últimos protocolos publicados en conjunto por la Sociedad Europea de Cardiología (siglas en inglés, ESC) y la Sociedad Británica de Cardiología, no se hacía referencia al uso de antisépticos (Horstkotte et al, 2004). En esta misma línea, en el último consenso de la Asociación Americana de Cardiología tampoco se recomendó su utilización (Wilson et al, 2007). El Instituto Nacional para la Excelencia Clínica del Reino Unido, destacó entre sus recomendaciones que no se debe ofrecer un enjuague bucal de CHX como profilaxis de endocarditis infecciosa a personas con riesgo de padecerla, cuando éstan se someten a un procedimiento dental (NICE, 2008). En resumen, la realización de un enjuague de CHX antes de iniciar el tratamiento odontológico era una práctica recomendada por algunos comités de expertos hasta hace pocos años, aunque incomprensiblemente no se ha incluido en las últimas guías de profilaxis de la endocarditis infecciosa. Hasta la fecha no se ha demostrado que la administración de CHX pueda prevenir la endocarditis bacteriana, pero su aplicación reduce la carga bacteriana intraoral y, en consecuencia, la prevalencia y la duración de las bacteriemias secundarias a determinados procedimientos odontológicos, con la ventaja añadida de que su prescripción no tendría por que limitarse a los pacientes de riesgo. Sin embargo, recientemente se ha sugerido que el uso clínico indiscriminado de CHX puede facilitar la emergencia de nuevos clones bacterianos con susceptibilidad reducida a la CHX; además, la MHRA una agencia ejecutiva del Departamento de Salud del Reino Unido ha publicado una alerta sanitaria para productos medicinales que contengan CHX, en base al registro de numerosas reacciones anafilácticas provocadas por el empleo de este antimicrobiano (https://assets.digital.cabinetoffice.gov.uk/media/5485abd7e5274a4290000281/con197920.pdf). Los resultados de los trabajos más relevantes publicados hasta la fecha sobre la profilaxis de las bacteriemias secundarias a procedimientos odontologicos con clorhexidina se detallan en la tabla 3. 1. INTRODUCCIÓN 53 Tabla 3. Profilaxis de las bacteriemias secundarias a procedimientos odontológicos con clorhexidina (CHX) Autor (año) Pacientes Intervención Resultados casos/total Conclusiones Macfarlane (1984) G1= 20 G2= 20 G3= 20 Irrigación del surco gingival con CHX 1% Irrigación del surco gingival con PY 1% Irrigación del surco gingival con suero 5/20 8/20 16/20 CHX disminuye la prevalencia de bacteriemias (p< 0,001) Lofthus(1991) G1= 10 G2= 10 G3= 10 Irrigación subgingival con CHX 0,12% Irrigación subgingival con agua estéril Ninguna irrigación 2/10 4/10 3/10 No hay diferencias estadísticamente significativas Allison (1993) G1= 12 G2= 12 Irrigación subgingival con CHX 0,12% Ninguna irrigación 3/12 9/12 CHX disminuye la prevalencia de bacteriemias (p< 0,05) Rahn (1995) G1= 40 G2= 40 G3= 40 Irrigación del surco gingival con CHX 0,2% Irrigación del surco gingival con PY 10% Irrigación del surco gingival con agua estéril 18/40 11/40 21/40 No existen diferencias estadísticamente significativas entre el grupo CHX y el control Lockhart (1996) G1= 36 G2= 34 2 enjuagues con CHX 0,2% previos a una exodoncia 2 enjuagues con un placebo 31/36 31/34 Los enjuagues de CHX no reducen la prevalencia de bacteriemias Brown (1998) G1= 31 G2= 24 2 enjuagues con CHX 0,12% antes de la remoción de puntos de sutura Ninguna profilaxis 4/31 2/24 No hay diferencias estadísticamente significativas Erverdi (2001) G1= 40 G2= 40 Enjuague con CHX 0,2% antes de colocar bandas Enjuague con CHX 0,2% antes de retirar bandas 1/40 1/40 Prevalencia de bacteriemias similar antes y después del procedimiento Tomás (2007) G1= 53 G2= 53 Enjuague con CHX 0,2% previo a una exodoncia Ninguna profilaxis 30 seg 15 min 1h 79% 30% 2% 96% 64% 20% Un enjuague de CHX reduce la prevalencia de bacteriemia (p= 0,008; p< 0,001; p= 0,005) Maharaj (2012) G1= 40 G2= 40 G3= 40 G4= 40 Enjuague con CHX 3g de Amoxicilina 600mg de Clindamicina Ninguna profilaxis 16/40 3/40 8/40 14/40 No existe diferencia entre el grupo control y el grupo CHX, pero sí con el de amoxicilina Barbosa (2015) G1= 50 G2= 51 G3= 48 G4= 52 Enjuague con CHX 0,2% previo a una extracción Enjuague con CHX 0,2% previo a una extracción + Irrigación subgingival CHX 1% Enjuague con CHX 0,2% previo a una extracción + Irrigación supragingival CHX 1% No profilaxis 30 seg 15 min 50% 4% 55% 10% 50% 27% 52% 23% El enjuague de CHX no disminuye la prevalencia de bacteriemias a los 30 seg pero sí a los 15 min (p= 0,005) G= Grupo de tratamiento; PY= povidona yodada; 30 seg, 15 min, 1 h = muestras recogidas a los 30 segundos, 15 minutos y 1 hora postmanipulación SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 54 1.3.2.2. Profilaxis de las infecciones cardiovasculares de origen oral con antibióticos sistémicos A pesar de que la conexión entre bacteriemias secundarias a manipulaciones odontológicas y las infecciones focales se sustenta en una evidencia débil, y no existe una relación probada causal entre los procedimientos odontológicos y el desarrollo de un episodio de endocarditis bacteriana, en la primera mitad del siglo XX numerosos investigadores propusieron medidas profilácticas bien de carácter local como la cauterización o bien sistémicas como las autovacunas para prevenir las bacteriemias de origen oral. En 1955, poco después de iniciarse la producción masiva de penicilina, la Asociación Americana de Cardiología (AHA) formuló las primeras directrices sobre administración de profilaxis antibiótica previa a procedimientos quirúrgicos entre los que se incluían las manipulaciones dentales, para prevenir la endocarditis bacteriana (AHA, 1955; Little, 1998). Desde entonces, numerosos comités de expertos han planteado diferentes pautas de profilaxis, entre las que además de las de la AHA, destacan por su impacto en la comunidad clínica las propuestas de la Sociedad Europea de Cardiología (ESC) y las de la Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC). Los protocolos de profilaxis antibiótica de la endocarditis bacteriana se han sometido a revisiones periódicas, cuya tónica general ha sido restringir progresivamente sus indicaciones, manteniendo exclusivamente las consideradas de “más alto riesgo” de generar una endocarditis (por ejemplo, la tasa de mortalidad de la endocarditis por Streptococcus del grupo viridans sobre válvula nativa se estima en un 5%, frente al 20% sobre válvula protésica) (Wilson et al, 2007; Habib et al, 2009). Los argumentos que sustentan esta política restrictiva son: por un lado, la incidencia y la mortalidad de la propia endocarditis, que no se han modificado en las últimas décadas; por otra parte, los cambios en la epidemiología de esta enfermedad, que afecta a una población más envejecida y se asocia al incremento en la utilización de técnicas invasivas, con una disminución de casos de etiología estreptocócica y un aumento de los que asientan en corazones estructuralmente normales (Moreillon y Que, 2004). En 1960, la AHA estableció una pauta de profilaxis que consistía en la administración de varias inyecciones intramusculares de penicilina desde 48 horas antes hasta 48 horas después de la sesión de tratamiento odontológico (AHA, 1960; Little, 1998). Desde entonces, se han modificado el antibiótico de elección y la vía de administración preferente. La administración por vía intramuscular o intravenosa de antibióticos como penicilina, vancomicina o gentamicina, se han ido reemplazando gradualmente hasta llegar a la dosis oral única de amoxicilina que se propone en la actualidad (Wilson et al, 2007; Habib et al, 2009). Para los pacientes alérgicos a la penicilina, inicialmente se recomendó eritromicina por vía 1. INTRODUCCIÓN 55 oral en dosis de 250 mg cada 6 horas (AHA, 1960; Little, 1998) pero a partir de 1990 se sustituyó por clindamicina, debido a la elevada prevalencia de efectos indeseables gastrointestinales provocados por la eritromicina (Simmons, 1990). Probablemente el principal argumento para oponerse a la administración de profilaxis antibiótica, es que hasta la fecha no se dispone de pruebas concluyentes sobre su eficacia para prevenir infecciones focales y concretamente la endocarditis bacteriana secundaria a procedimientos odontológicos en pacientes considerados “de riesgo” (Glenny et al, 2013). La amoxicilina continúa siendo el fármaco de elección para prevenir las bacteriemias de origen oral en los pacientes sin antecedentes de alergia a los betalactámicos; en ensayos clínicos aleatorizados se ha demostrado que este antibiótico reduce significativamente las bacteriemias provocadas por la manipulación dental, si bien no anula la posibilidad de que éstas se produzcan (Diz Dios et al, 2006). Por el contrario, no existe evidencia científica concluyente, de que otros antibióticos como la clindamicina reduzcan eficazmente la prevalencia de bacteriemias secundarias al tratamiento odontológico, aunque la mayoría de los estudios realizados con modelos experimentales han confirmado la eficacia de la profilaxis en estadios tardíos del desarrollo de la endocarditis. Otros argumentos contrarios a la administración de profilaxis son la alergia a los antibióticos beta-lactámicos y el desarrollo de resistencias bacterianas. Se ha sugerido que la administración de profilaxis con amoxicilina conlleva un riesgo elevado de reacciones alérgicas, pero realmente en la literatura se recogen muy pocos casos después de una dosis única; se estima que las reacciones alérgicas severas a la amoxicilina oral ocurren con una frecuencia de 0,9 casos por cada millón de pacientes, no conocemos ningún trabajo en el que se haya descrito una anafilaxis fatal tras la administración de amoxicilina por vía oral como profilaxis de la endocarditis y la frecuencia de reacciones adversas no-fatales se estima en torno a 22 casos por cada millón de prescripciones (Thornhill et al, 2015). La frecuencia de complicaciones es mucho mayor respecto a la clindamicina, con 13 reacciones fatales y 149 no-fatales por cada millón de prescripciones, en su mayoría secundarias a infecciones por Clostridium difficile (Thornhill et al, 2015). La emergencia de resistencia a los antibióticos constituye un serio problema de salud pública; se ha demostrado que la prescripción de antibióticos podría contribuir al desarrollo, selección y transmisión de resistencia bacteriana, pero solamente después de la administración consecutiva de varias dosis. Un último inconveniente es el relativo a los costes que la administración de profilaxis implica para el sistema de salud. Se han publicado resultados contradictorios sobre el coste/eficacia de la profilaxis antibiótica para pacientes de riesgo sometidos a tratamiento odontológico, probablemente por diferencias SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 56 sustanciales en los colectivos en los que se efectuaron las estimaciones sobre el riesgo basal de desarrollar una endocarditis (National Institute for Health and Clinical Excellence, 2008). En algunos países como EE.UU. se ha estimado que la profilaxis constituye un gasto considerable (Lockhart et al, 2013), pero sus resultados no son extrapolables a otros países como el nuestro en los que su administración a pacientes de alto riesgo sólo representa un porcentaje mínimo del total de antibióticos que prescriben los dentistas. En el contexto de la política restrictiva de la profilaxis antibiótica, el Instituto Nacional de Salud y Excelencia Clínica del Reino Unido (NICE) publicó en 2008 una nueva propuesta que sorprendió a la comunidad científica, al plantear que “la profilaxis antibiótica de la endocarditis bacteriana no se recomendaba para personas sometidas a tratamiento odontológico” (National Institute for Health and Clinical Excellence, 2008). Esta idea era aplicable incluso a los pacientes de “mayor riesgo”, independientemente del tipo de procedimiento odontológico al que fueran a someterse. Estos expertos sustentaron su recomendación sobre dos premisas principales: la primera fue la escasa evidencia disponible para determinar si la profilaxis antibiótica reduce la incidencia de endocarditis en los pacientes de riesgo; la segunda, más novedosa, fue que consideraban que ‘era biológicamente implausible que un procedimiento odontológico conllevara un mayor riesgo de endocarditis que el cepillado dental rutinario”. En este sentido, se ha confirmado el desarrollo de bacteriemias provocadas por actividades de la vida diaria como la masticación o el cepillado dental, y su prevalencia podría incluso estar subestimada, ya que es presumible que su intensidad difícilmente alcance el umbral de detección de las técnicas convencionales, pero la repercusión clínica de estas bacteriemias aún se desconoce. En una revisión sistemática reciente, hemos podido comprobar que la evidencia científica disponible a este respecto es exigua, y que la acumulación de placa bacteriana y el grado de inflamación gingival condicionan la prevalencia de bacteriemias secundarias al cepillado dental, lo que corrobora la importancia de la higiene oral como medida de prevención (Tomás et al, 2012). Después de la introducción de la propuesta del NICE, en el Reino Unido se constató una reducción significativa del número de prescripciones de profilaxis antibiótica (cifrada en un 78,6%); sin embargo, en estudios de carácter preliminar, no se detectó un gran incremento en la incidencia de nuevos casos o de defunciones por endocarditis bacteriana (Thornhill et al, 2011; Duval et al, 2012; Dayer et al, 2013). Paradójicamente, recientemente se ha publicado un estudio epidemiológico en la prestigiosa revista Lancet en el que se evalúan las consecuencias de la iniciativa propuesta por NICE, en el que se concluye que “aunque no puede establecerse una relación causal, las prescripciones de 1. INTRODUCCIÓN 57 profilaxis antibiótica has disminuido sustancialmente y la incidencia de endocarditis infecciosa ha aumentado significativamente en Inglaterra desde la introducción de las recomendaciones NICE en 2008” (Dayer et al, 2015). 1.3.2.3. Profilaxis de las infecciones respiratorias de origen oral (neumonía nosocomial asociada a ventilación mecánica) con clorhexidina Aproximadamente 1 de cada 3 pacientes que ingresan en una Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) requieren ventilación mecánica (VM). A pesar de que en algunas situaciones clínicas como la exacerbación de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica o el tratamiento de la insuficiencia respiratoria hipoxémica secundaria a edema agudo de pulmón se han propuesto algunas técnica alternativas como la ventilación no invasiva, muchos pacientes con insuficiencia respiratoria todavía requieren intubación orotraqueal y VM (Carvajal et al, 2010). El riesgo de infección es una de las complicaciones más importantes de la VM, ya que aumenta entre 6 y 10 veces las posibilidades de aparición de una neumonía (Chastre y Fagon, 2002). Esta complicación, denominada “neumonía asociada a ventilación mecánica” (NAVM), continúa entorpeciendo el curso clínico del 9-67% de los pacientes con VM, con tasas de 4,4 a 22,5 casos por 1.000 días de VM (Carbajal et al, 2010). Como factores de riesgo se han identificado los que contribuyen a la alcalinización gástrica, el acúmulo de secreciones en la vía aérea y la colonización bacteriana de la placa dental. Un mm³ de placa contiene más de 108 bacterias, un inóculo que representa el 80% de la materia sólida de la propia placa (Fourrier et al, 2005). Si bien la flora oral de una persona sana se compone básicamente de microorganismos Gram positivos, en la UCI pasan a predominar los Gram negativos, y se ha observado una importante concordancia entre las bacterias aisladas en la cavidad orofaríngea y los aspirados traqueales (Pineda et al, 2006). La colocación del tubo endotraqueal disminuye el reflejo tusígeno asociado al empleo de sedo-analgesia y ésto unido a que el aire administrado artificialmente no está caliente ni húmedo, dificulta considerablemente la depuración mucociliar y propicia la colonización de la orofaringe y el tracto gastrointestinal, favoreciendo la aparición de NAVM (Tantipong et al, 2008). Se han publicado diferentes guías de práctica clínica de medidas preventivas, en las que no existe una recomendación unánime sobre higiene oral en los pacientes sometidos a ventilación mecánica (Tablan et al; 2004; Adalja, 2010; Torres y Carlet, 2001). Diversas revisiones sistemáticas sobre el empleo rutinario de CHX en los cuidados orales para prevenir la NAVM han arrojado resultados heterogéneos (Pineda et al, 2006; Chan et al, 2007; Chlebicki y Safdar, SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 64 pacientes que requerían ventilación mecánica, aplicando cada 6 horas sulfato de polimixina B, sulfato de neomicina y vancomicina frente a un placebo. La aparición de neumonías fue mucho menos frecuente en el grupo tratado con antibióticos (16% versus 78%) pero no hubo diferencias en la mortalidad. También se observó que en el grupo experimental se prescribieron muchos menos antibióticos sistémicos y por lo tanto se redujo potencialmente el número de resistencias bacterianas. Casi de forma coetánea, Hammond et al (Hammond et al 1992) también evaluaron la descontaminación selectiva del tracto digestivo, pero combinando antibióticos tópicos (aplicados en la orofaringe y por vía enteral) y sistémicos. Sus resultados fueron muy discutidos, ya que se produjo una reducción en la prevalencia de infecciones secundarias pero no disminuyó la morbi-mortalidad, por lo que se cuestionó la eficacia de esta práctica en términos de riesgobeneficio. Ese mismo año, Gastinne et al (Gastinne et al, 1992) publicaron un estudio en 445 pacientes ingresados en la UCI que precisaban ventilación mecánica. Al grupo experimental se les aplicó una combinación de tobramicina, polimixina E y anfotericina B por vía tópica en la orofaringe y por vía enteral, durante todo el período de intubación; al grupo control se le administró un placebo. Los autores concluyeron que no existían diferencias estadísticamente significativas en la incidencia de neumonías entre ambos grupos. Esos resultados coinciden con los obtenidos por Wiener et al (Wiener et al, 1995), cuando compararon la eficacia de un preparado a base de polimixina E, gentamicina y nistatina frente a un placebo, concluyendo que la descontaminación selectiva no aportaba beneficios a los pacientes intubados en la UCI. En 1997, se realizó un estudio muy relevante en un colectivo de 660 pacientes qua precisaron ventilación mecánica al menos durante 48 horas, a los que se distribuyó en 3 grupos: al primero (grupo A) no se le aplicó ningún tipo de profilaxis; al segundo (grupo B), ofloxacino y anfotericina B por vía oral y enteral; al grupo C, polimixina E, tobramicina y anfotericina B. Además, el grupo C recibió ofloxacino y el C cefotaxima, ambos por vía sistémica y durante 4 días. Se detectó una reducción estadísticamente significativa del número de infecciones en los grupos B y C con respecto al A, pero los autores concluyen que también se produjo un aumento de las resistencias bacterianas (Verwaest et al, 1997). Otros autores como Bergmans et al (Bergmans et al, 2001), decidieron simplemente realizar una descontaminación a nivel local. Para ello, aplicaron una profilaxis antibiótica por vía tópica con gentamicina, colistina y vancomicina en la orofaringe de 87 pacientes; la aplicación se iniciaba a las 24 horas de la intubación y se realizaba 4 veces al día hasta un máximo de 21 días, salvo extubación previa 1. INTRODUCCIÓN 65 o en su caso el fallecimiento del paciente. El grupo control, lo conformaron 139 pacientes que se distribuyeron en 2 grupos: el primero (control A) recibió un placebo (sin antibióticos); el segundo grupo (control B), ingresado en otra UCI diferente, no recibió ningún tipo de tratamiento. El hallazgo más relevante fue que se observaron diferencias estadísticamente significativas en la prevalencia de NAVM entre el grupo de estudio y los controles. Por el contrario, Rocha et al (Rocha et al, 1992) compararon la eficacia combinada de los antibióticos por vía tópica y sistémica. Para ello, administraron 6 g/día de cefotaxima por vía parenteral los primeros 4 días post-intubación junto con un preparado a base de polimixina E, tobramicina y amfotericina B, y lo compararon frenta a un placebo. Obtuvieron resultados favorables en el grupo antibiótico pero subrayaron la necesidad de efectuar continuos controles bacteriológicos. Utilizando esta misma combinación antibiótica, en Ámsterdam se diseñó un ensayo aleatorizado para evaluar la aparición de resistencias a los antibióticos, que se completó con un seguimiento de más de 2 años después de finalizado el tratamiento; se demostró que la profilaxis reducía la mortalidad en la UCI y la colonización por bacterias aerobias Gram-negativas; ningún paciente fue colonizado por Staphylococcus aureus resistente a meticilina, sólo un 1% lo fue por Enterococcus spp. resistente a vancomicina, y un 16% y 26% (en descontaminación selectiva del tracto digestivo y controles, respectivamente) se aislaron bacterias Gram negativas resistentes a cefotaxima, ciprofloxacino, polimixina E y tobramicina (De Jonge, 2003). Krueger et al (Krueger et al, 2002), realizaron un estudio donde combinaron una profilaxis antibiótica por vía tópica y por vía intravenosa, para evaluar la incidencia de infección, la disfunción orgánica y la mortalidad, en personas ingresadas en la UCI como consecuencia de un procedimiento quirúrgico o de un traumatismo. Los pacientes recibieron 2 dosis diarias de ciprofloxacino durante 4 días, junto con un preparado tópico de gentamicina y polimixina por vía oral, nasal y enteral 4 veces al día durante toda su estancia en la UCI. El resultado más relevante es que hubo una reducción importante en la incidencia de infecciones, especialmente de las NAVM. En 2009, Liberati et al (Liberati et al, 2009) publicaron una revisión sistemática donde concluyeron que un protocolo basado en una combinación de antibióticos tópicos y sistémicos, reducía la aparición de infecciones en las vías respiratorias y la mortalidad en general. Recientemente, Silvestri et al (Silvestri et al, 2014), después de realizar una revisión sistemática con metaanálisis sobre la descontaminación selectiva del tracto digestivo con CHX en pacientes quirúrgicos ingresados en cuidados SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 66 críticos, concluyeron que esta práctica reducía la frecuencia de NAVM y las neumonías nosocomiales, pero sin afectar a la mortalidad. En consecuencia, en términos de riesgo-beneficio, no se han aclarado definitivamente las ventajas de los antibióticos frente a los antisépticos tópicos como la CHX. Los resultados de los trabajos más relevantes publicados hasta la fecha sobre la profilaxis de las infecciones respiratorias de origen oral tratadas con antibióticos se detallan en la tabla 5. Tabla 5. Profilaxis de las infecciones respiratorias de origen oral (neumonía nosocomial asociada a ventilación mecánica) con antibióticos. Descontaminación selectiva del tracto digestivo Autor (año) Pacientes Intervención Resultados casos/total Conclusiones Stoutenbeek (1987) G1= 63 G2= 59 Polimixina E + Tobramicina + Anfotericina B vo/ve + Cefotaxima iv Cefotaxima iv 5/63 12/59 La combinación de antibióticos es más eficaz que la cefotaxima sola (p< 0,001) Rodríguez- Roldan (1990) G1= 13 G2= 15 Desinfección + Polimixina E + Tobramicina o Netilmicina + Anfotericina B (cada 6 horas) Desinfección y un placebo 0/13 11/15 Existe una diferencia estadísticamente significativa p< 0,001 Pugin (1991) G1= 25 G2= 27 Polimixina B + Neomicina + Vancomicina + Dextrosa 5% (cada 4 horas) Dextrosa 5% 4/25 21/27 Hay diferencias estadísticamente significativas (p< 0,0001) Hammond (1992) G1= 114 G2= 125 Polimixina E + Tobramicina + Anfotericina B vo/ve + Cefotaxima iv Placebo + Cefotaxima iv 30/114 43/125 La eficacia de la combinación de antibióticos fue similar a la de la cefotaxima sola Gastinne (1992) G1= 220 G2= 225 Tobramicina + Anfotericina B + Polimixina E vo/ve Placebo 26/220 33/225 No hay diferencias estadísticamente significativas Rocha (1992) G1= 47 G2= 54 Polimixina E + Tobramicina + Anfotericina B vo/ve + Cefotaxima iv Placebo Sólo evaluaron infecciones respiratorias Hubo diferencias estadísticamente significativas p< 0,001 Laggner (1994) G1= 33 G2= 34 Gentamicina + Anfotericina B (cada 6 horas) + gel desinfectante + Aminopenicilina + Ácido clavulánico Igual al anterior pero en lugar de la Gentamicina un placebo 1/33 4/34 Existe una disminución pero no es estadísticamente significativa Wiener (1995) G1= 30 G2= 31 Solución de Polimixina E + Gentamicina + Nistatina cada 6 horas Placebo 8/30 8/31 No hay diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos Verwaest (1997) G1= 220 G2= 220 G3= 220 No profilaxis Ofloxacino + Anfotericina B vo/ve + Ofloxacino iv Polimixina E + Tobramicina + Anfotericina B + Cefotaxima iv Sólo evaluaron infecciones respiratorias Existe una reducción importante del nº de infecciones respiratorias pero aumenta el nº de resistencias bacterianas Bergmans (2001) G1= 87 G2= 78 G3= 61 Orabase con Polimixina E + Gentamicina + Vancomicina (cada 6 horas) Orabase con placebo Ningún tratamiento de profilaxis 9/87 24/78 14/61 Existe una reducción importante en el nº de NAVM de los pacientes tratados con respecto a los controles Pneumatikos (2002) G1= 30 G2= 31 Polimixima E + Tobramicina + Anfotericina B Solución placebo 5/30 16/31 Hay diferencias estadísticamente significativas (p< 0,01) 1. INTRODUCCIÓN 67 Autor (año) Pacientes Intervención Resultados casos/total Conclusiones Krueger (2002) G1= 265 G2= 262 Polimixina B + Gentamicina vo/ve/vn cada 6 horas + Ciprofloxacino iv Placebo NE NE De Jonge (2003) G1= 466 G2= 468 Polimixina E + Tobramicina + Anfotericina B vo/ve + Cefotaxima iv Ningún tratamiento de profilaxis 61/378 104/395 Hay diferencias estadísticamente significativas (p= 0,001) Stoutenbeek (2007) G1= 201 G2= 200 Polimixina E + Tobramicina + Anfotericina B vo/ve (cada 6 horas) + Cefotaxima Profilaxis antibiótica estándar que se aplica en cada centro 62/201 100/200 Disminución de infecciones respiratorias (30% vs 50%); sin diferencias significativas en la mortalidad De Smet (2009) G1= 2045 G2= 1904 G2= 1990 Polimixina E + Anfotericina B + Tobramicina (cada 6 horas) +Cefotaxima iv (durante 4 días)en orofaringe y estomago (DTD) Igual al anterior pero sólo en orofaringe (DSO) Cuidados orales básicos No estudiaron NAVM Reducción importante en la mortalidad de los pacientes ingresados en UCI al realizarle DSO G= Grupo de tratamiento; iv= vía intravenosa; vo= vía oral; ve= vía enteral; vn= vía nasal; DTD= Descontaminación del Tracto Digestivo; DSO= Descontaminación Selectiva de la Orofaringe; NAVM= Neumonía nosocomial Asociada a Ventilación Mecánica; NE= no especificado 2. OBJETIVOS 2. OBJETIVOS 71 1. Evaluar in situ la actividad antimicrobiana de la clorhexidina al 0,20% administrada en enjuagues con una posología convencional (cada 12 horas), sobre las bacterias del biofilm oral. 2. Evaluar in situ la actividad antimicrobiana de la clorhexidina al 0,20% administrada en enjuagues con una nueva posología (cada 8 horas), sobre las bacterias del biofilm oral. 3. Evaluar in situ la actividad antimicrobiana de la combinación antibiótica amoxicilina-ácido clavulánico (500/125mg) administrada por vía oral con una posología convencional (cada 8 horas), sobre las bacterias del biofilm oral. 3. MATERIAL Y MÉTODOS SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 80 campo se dividió en tres zonas o capas equivalentes: capa 1 o capa suprficial, capa 2 o capa intermedia, capa 3 o capa interna. Figura 5. Determinación del grosor máximo de un biofilm de placa dental (proyección lateral) en secciones de los ejes X-Z apiladas en el eje Y La cuantificación de la vitalidad bacteriana en series de imágenes x-y se determinó mediante el análisis del citofluorograma (Leica Confocal Software). En este análisis las imágenes de cada fluorocromo se describen como “canales” (SYTO 9 ocupa el “canal verde” y YP el “canal rojo”), obteniéndose valores de área (µm2) ocupada por cada canal, el área total ocupada por biofilm y el porcentaje correspondiente de vitalidad (Figura 6). Para el cálculo del porcentaje medio de vitalidad bacteriana de cada campo se incluyeron las secciones con un área mínima de biofilm de 250 µm2, y posteriormente se determinó el porcentaje medio de vitalidad bacteriana del biofilm de la totalidad de la muestra y de cada una de sus capas. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 81 Figura 6. Cuantificación de la vitalidad bacteriana analizando la emisión de fluorescencia en secciones de los ejes X-Y correspondientes a diferentes posiciones de Z (profundidad) A) Canal verde (muestra las membranas citoplasmáticas intactas); B) Canal rojo (muestra las membranas dañadas); C) Superposición de los canales verde y rojo; D) Fluorograma y segmentación; E) Cuantificación automática de los datos de una sección. Para cuantificar el porcentaje de superficie del sustrato cubierta por biofilm se utilizó el citofluorograma. Para ello, se superponen todos los planos capturados de cada uno de los campos analizados, y el área que ocupa la suma de todos los acúmulos bacterianos (vitales y no-vitales) se relativiza con respecto a la superficie total del campo (% de área ocupada). Aunque la composición y la estructura del biofilm que se forma sobre la superficie de los discos de cristal es presumiblemente muy parecida a la placa dental, al no tratarse de un sustrato de esmalte dentario en adelante emplearemos la denominación “biofilm de placa dental” (B-PD). SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 82 Para calcular el tamaño muestral a priori, considerando un efecto del tamaño de 0,35, un error alfa de 0,05 y un poder estadístico del 80%, se determinó que el grupo de estudio debía incluir a 15 participantes (se utilzó el programa G*Power 3.1.5). Los resultados fueron analizados con el programa estadístico SPSS versión 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.), por un experto en bioestadística que desconocía el diseño del estudio. La elección de un test paramétrico o no paramétrico dependió del tipo de distribución de los valores de la variable cuantitativa analizada (grosor del B-PD, porcentaje de vitalidad bacteriana y porcentaje de superficie ocupada del sustrato), que se determinó aplicando el test Kolmogorov-Smirnov. Todas las variables cuantitativas analizadas mostraron una distribución normal. Se aplicó el test de ANOVA (modelo de 1 factor con medidas repetidas) para las comparaciones intraintervención (diferenciando entre las 3 capas del B-PD), utilizando todas las muestras de B-PD. El test ANOVA (modelo de 3 factores, todos con medidas repetidas) también se aplicó para las comparaciones inter-intervención (diferenciando entre las 3 capas del B-PD), incluyendo todas las muestras de B- PD. Se efectuaron comparaciones por pares (con el ajuste de Bonferroni) para el análisis inter-enjuague (incluyendo la diferenciación entre las 3 capas del B-PD). Se consideró estadísticamente significativo un valor de p< 0,05. Para facilitar la interpretación de los resultados, se describirá consecutivamente el efecto de las 3 intervenciones realizadas sobre cada una de las 3 variables de respuesta analizadas grosor del B-PD, vitalidad bacteriana y superficie ocupada del sustrato. 4. RESULTADOS 4. RESULTADOS 85 4.1. GROSOR DEL BIOFILM DE PLACA DENTAL 4.1.1. Grosor del B-PD basal El grosor medio del B-PD de 4 días de evolución en condiciones basales fue de 20,85 μm (rango= 10,25-30,75 μm) (Tabla 6). Tabla 6. Grosor basal del biofilm de placa dental (μm) Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 10,25 18,33 20,17 20,85 24,17 30,75 4.1.2. Grosor del B-PD tras administrar clorhexidina 0,20% cada 12 horas durante 4 días El grosor medio del B-PD después de realizar los enjuagues con CHX 0,20% siguiendo una pauta convencional (cada 12 horas) fue de 6,05 μm (rango= 3,12-9,16 μm) (Tabla 7); este resultado fue significativamente inferior a la deteminación basal (p< 0,001) (Figura 7). Tabla 7. Grosor del biofilm de placa dental tras enjuagarse con clorhexidina 0,20% cada 12 horas (μm) Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 3,12 4,69 6,56 6,05 7,87 9,16 SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 86 Figura 7. Diagrama de cajas del grosor del biofilm de placa dental en condiciones basales (Basal) y tras administrar clorhexidina 0,20% cada 12 horas durante 4 días (CHX 12h) CHX 12h= clorhexidina 0,20% cada 12 horas; Basal= condiciones basales 4.1.3. Grosor del B-PD tras administrar clorhexidina 0,20% cada 8 horas durante 4 días El grosor medio del B-PD realizando enjuagues cada 8 horas fue de 3,74 μm (rango= 1,41-6,79 μm) (Tabla 8). Tabla 8. Grosor del biofilm de placa dental tras enjuagarse con clorhexidina 0,20% cada 8 horas (μm) Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 1,41 2,19 3,32 3,74 5,51 6,79 El grosor del B-PD obtenido tras completar el protocolo de enjuagues cada 12 horas resultó significativamente inferior que el grosor en condiciones basales (p< 0,001) (Figura 8). Sin embargo, al comparar el grosor del B-PD después de realizar los enjuagues cada 8 horas con el obtenido cuando los enjuagues se efectuaron cada 12 horas, no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (p> 0,05). 4. RESULTADOS 87 Figura 8. Diagrama de cajas del grosor del biofilm de placa dental en condiciones basales (Basal) y tras administrar clorhexidina 0,20% cada 8 horas durante 4 días (CHX 8h) CHX 8h= clorhexidina 0,20% cada 8 horas; Basal= condiciones basales Un hallazgo casual, fueron los resultados dispares obtenidos en un paciente al efectuar la lectura por la tarde, 8 horas después del último enjuague (a las 8:00 de la mañana), en lugar de la lectura habitual de los discos en horario matutino (último enjuague a las 24:00 horas de la noche anterior). En consecuencia, repetimos el experimento en todos los pacientes de la serie, pero realizando la lectura en horario de tarde. Cuando la medición se efectuó por la tarde, el grosor medio del B-PD fue de 4,98 μm (rango= 1,50-10,67 μm) (Tabla 9). Este resultado fue significativamente inferior al grosor basal (p< 0,001), pero similar al obtenido cuando la lectura se efectuó por la mañana (p> 0,05) y tras el regimen de enjuagues cada 12 horas (p> 0,05). Tabla 9. Grosor del biofilm de placa dental tras enjuagarse con clorhexidina 0,20% cada 8 horas, efectuando la lectura de los discos por la tarde (μm) Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 1,50 3,56 4,33 4,98 6,86 10,67 SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 88 4.1.4. Grosor del B-PD tras administrar amoxicilina-ácido clavulánico (500/125 mg) cada 8 horas durante 4 días El valor medio del grosor del B-PD tras completar el régimen antibiótico fue de 20,85 μm (rango= 10,25-30,75 μm) (Tabla 10). Tabla 10. Grosor del biofilm de placa dental tras administrar amoxicilina-ácido clavulánico (500/125 mg) cada 8 horas durante 4 días (μm) Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 10,25 18,33 20,17 20,85 24,17 30,75 Este resultado fue similar al obtenido en condiciones basales (p> 0,05), pero significativamente mayor al grosor del B-PD alcanzado tras realizar enjuagues con CHX 0,20% con una posología convencional cada 12 horas (p< 0,001). En la figura 9 se detallan gráficamente los grosores del B-PD obtenidos al completar los diferentes regímenes de intervención descritos. Figura 9. Diagrama de cajas del grosor del biofilm de placa dental tras diferentes intervenciones aplicadas durante 4 días Basal= condiciones basales; CHX 12h= clorhexidina 0,20% cada 12 horas; CHX 8hM, 8hT= clorhexidina 0,20% cada 8 horas leyendo los discos por la mañana (M) o por la tarde (T); AMXCLV= amoxicilina-ácido clavulánico (500/125 mg) cada 8 horas 4. RESULTADOS 89 4.2. VITALIDAD BACTERIANA DEL BIOFILM DE PLACA DENTAL 4.2.1. Vitalidad bacteriana del B-PD basal En condiciones basales, el valor medio de la vitalidad bacteriana en el B- PD fue de 49,13 % (rango= 35,8-67,46 %) (Tabla 11). Tabla 11. Vitalidad bacteriana basal en un biofilm de placa dental Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 35,08 % 42,58 % 48,03 % 49,13 % 54,98 % 67,46 % Como ya hemos señalado, el espesor del B-PD se analizó dividiéndolo en tres capas: superficial (capa 1), intermedia (capa 2) y profunda (capa 3). Al comparar los porcentajes de vitalidad de las diferentes capas, observamos diferencias estadísticamente significativas entre la capa 1 y la capa 2 (p< 0,001), entre la capa 1 y la capa 3 (p< 0,001), y entre la capa 2 y la capa 3 (p< 0,001) (Tabla 12 y Fig. 10). Tabla 12. Vitalidad bacteriana basal (%) a diferentes profundidades en un biofilm de placa dental Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil75 Máximo Capa 1 59,82 % 74,71 % 82,24 % 79,28 % 86,26 % 90,43 % Capa 2 30,78 % 44,85 % 53,35 % 52,56 % 57,47 % 77,90 % Capa 3 0,07 % 1,04 % 11,55 % 15,55 % 28,08 % 45,62 % SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 96 Figura 15. Imágenes de microscopía confocal de la vitalidad bacteriana en un biofilm de placa dental, tras diferentes intervenciones aplicadas durante 4 días Condiciones basales= tras 4 días de crecimiento; CHX= clorhexidina en colutorio; AMX-CLV= amoxicilina-ácido clavulánico por vía oral (500/125 mg) 4. RESULTADOS 97 4.3. ÁREA OCUPADA POR EL BIOFILM DE PLACA DENTAL 4.3.1. Área ocupada por el B-PD basal En condiciones basales, el porcentaje medio del área ocupada por el B-PD fue del 78,64% (rango= 35,33-93,64%) (Tabla 18). Tabla 18. Porcentaje del área ocupada por el biofilm de placa dental en condiciones basales Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 35,33 75,23 83,92 78,64 87,17 93,64 4.3.2. Área ocupada por el B-PD tras administrar clorhexidina 0,20% cada 12 horas durante 4 días El porcentaje medio de ocupación del B-PD después de realizar los enjuagues con CHX 0,20% siguiendo una pauta convencional (cada 12 horas) fue de 21,14% (rango= 1,70-61,85%) (Tabla 19); este resultado fue significativamente inferior a la deteminación basal (p< 0,001) (Figura 16). Tabla 19. Porcentaje del área ocupada por el biofilm de placa dental tras enjuagarse con clorhexidina 0,20% cada 12 horas Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 1,70 5,84 18,14 21,14 32,47 61,85 SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 98 Figura 16. Diagrama de cajas del área ocupada por el biofilm de placa dental en condiciones basales (Basal) y tras administrar clorhexidina 0,20% cada 12 horas durante 4 días (CHX 12h) CHX 12h= clorhexidina 0,20% cada 12 horas; Basal= condiciones basales 4.3.3. Área ocupada por el B-PD tras administrar clorhexidina 0,20% cada 8 horas durante 4 días El porcentaje medio del área ocupada por el B-PD al completar los 4 días de enjuagues con CHX cada 8 horas fue de 10,83% (rango= 0,13-41,69%) (Tabla 20). Se observó una reducción estadísticamente significativa con respecto al área ocupada por el B-PD en condiciones basales (p< 0,001) (Figura 17), pero no con respecto a la obtenida después de aplicar el régimen de enjuagues cada 12 horas (p> 0,05). Tabla 20. Porcentaje del área ocupada por el biofilm de placa dental tras enjuagarse con clorhexidina 0,20% cada 8 horas Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 0,13 1,37 2,14 10,83 15,90 41,69 4. RESULTADOS 99 Cuando la lectura de los discos se realizó por la tarde, 8 horas después del último enjuague (efectuado a las 8:00 de la mañana), el porcentaje medio de área ocupada fue del 13,11% (rango= 0,13-38,5%) (Tabla 21). Este porcentaje fue similar al obtenido en las lecturas matutinas tanto en el régimen de enjuagues cada 8 horas como cada 12 horas (p> 0,05 en ambos casos), y significativamente menor que el alcanzado en condiciones basales (p< 0,001) Tabla 21. Porcentaje del área ocupada por el biofilm de placa dental tras enjuagarse con clorhexidina 0,20% cada 8 horas, efectuando la lectura de los discos por la tarde Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 0,13 1,96 8,38 13,11 20,01 38,58 Figura 17. Diagrama de cajas del área ocupada por el biofilm de placa dental en condiciones basales (Basal) y tras administrar clorhexidina 0,20% cada 8 horas durante 4 días (CHX 12h) CHX 8h= clorhexidina 0,20% cada 8 horas; Basal= condiciones basales SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 100 4.3.4. Área ocupada por el B-PD tras administrar amoxicilina-ácido clavulánico (500/125 mg) cada 8 horas durante 4 días El valor medio del porcentaje del área ocupada por el B-PD tras completar el régimen antibiótico fue de 67,88% (rango= 18,42-90,92%) (Tabla 22). Tabla 22. Porcentaje del área ocupada por el biofilm de placa dental tras administrar amoxicilina-ácido clavulánico (500/125 mg) cada 8 horas durante 4 días Mínimo Percentil 25 Mediana Media Percentil 75 Máximo 18,42 54,10 77,07 67,88 83,51 90,92 Este resultado fue similar al obtenido en condiciones basales (p> 0,05), pero significativamente mayor al alcanzado tras realizar enjuagues con CHX 0,20% bien cada 12 horas (p< 0,001) o bien cada 8 horas (p< 0,001). En la figura 18 se detallan gráficamente los porcentajes de la superficie del sustrato ocupada por el B-PD, obtenidos al completar los diferentes regímenes de intervención descritos. Figura 18. Diagrama de cajas del área ocupada por el biofilm de placa dental tras diferentes intervenciones aplicadas durante 4 días Basal= condiciones basales; CHX 12h= clorhexidina 0,20% cada 12 horas; CHX 8hM, 8hT= clorhexidina 0,20% cada 8 horas leyendo los discos por la mañana (M) o por la tarde (T); AMXCLV= amoxicilina-ácido clavulánico (500/125 mg) cada 8 horas 5. DISCUSIÓN 5. DISCUSIÓN 103 5.1. DISCUSIÓN DE LA METODOLOGÍA A comienzos de los años 90, Watson et al (Watson 1991; Watson et al, 1992) sugirieron la posible aplicación de la Microscopía de Barrido Láser Confocal (siglas en inglés, CLSM) en la investigación clínica dental in vivo, y Netuschil et al (Netuschil et al, 1998), en 1998, fueron los primeros investigadores en utilizar este método no invasivo para analizar el grosor y la distribución de la vitalidad del B-PD humano no alterado. Más tarde, algunos autores diseñaron aparatos orales removibles especiales que incorporaban una serie de discos sobre los que crecía el B-PD (Auschill et al, 2001; Arweiler et al, 2004; Auschill et al, 2005). Este B-PD no alterado era a continuación analizado con CLSM, utilizando soluciones de fluorescencia (Auschill et al, 2001; Arweiler et al, 2004; Auschill et al, 2005). Actualmente, la comunidad científica considera que este diseño metodológico es la aproximación más adecuada para estudiar in vivo la arquitectura y la fisiología del B-PD, la formación del biofilm sobre los materiales dentales y el efecto antibacteriano de los antimicrobianos en esta estructura microbiana (Wood et al, 2000; Arweiler et al, 2004; Hanning y Hanning, 2009). Sin embargo, la implementación de variables metodológicas como el sustrato de los discos utilizados para recoger el B-PD, el tiempo ideal de formación del biofilm o la técnica de fluorescencia aplicada, pueden condicionar los resultados experimentales y por lo tanto exigen su abordaje en esta discusión. 5.1.1. Aparatos removibles porta-discos para recoger el B-PD Se ha demostrado que los biofilms orales formados sobre las superficies mucosas son diferentes a aquéllos que asientan sobre los tejidos duros, y que la composición de la placa dental supragingival difiere de la placa subgingival (Palmer et al, 2001). Consecuentemente, estos factores deben tenerse en consideración al diseñar modelos para generar B-PD in vivo. Wood et al (Wood et al, 1999; Wood et al, 2000), Watson et al (Watson et al, 2005) y Robinson et al (Robinson et al, 2006), utilizaron el “Leeds in situ device”, un diseño descrito por Robinson et al (Robinson et al, 1997) en 1997, compuesto por un anillo de nylon que contenía un sustrato de esmalte sobre el cual crecía el B-PD. Estos aparatos se adherían a las superficies vestibulares de los primeros o segundos molares superiores por medio de una resina, proporcionando un lugar de estancamiento para la formación del B-PD. SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 104 El grupo de investigación dirigido por Palmer (Palmer et al, 2003; Diaz et al, 2006; Palmer et al, 2006; Chalmers et al, 2007), diseñó dos muelles mandibulares bilaterales, que abarcaban las superficies vestibulares de los premolares y del primer molar, conteniendo cada uno de ellos varios discos. Numerosos autores han utilizado diferentes tipos de férulas de acrílico individualizadas para recoger el B-PD (Auschill et al 2001; Arweiler et al 2004; Auschill et al, 2005; Al-Ahmad et al, 2007; Arweiler et al, 2008). Aplicando un diseño similar a los de estos trabajos, empleamos unas férulas individualizadas conformadas por dos láminas de vinilo en las que se alojaban los discos que entraban en contacto directo con la saliva a través de unas fenestraciones, evitando distorsiones del B-PD acumulado por la acción de los tejidos blandos adyacentes y durante la colocación o la retirada del dispositivo. Las ventajas de este particular diseño ya se han acreditado en una tesis doctoral previa (García- Caballero, 2012), aunque recientemente ha sido objeto de algunas modificaciones que intentan mejorar la estética, minimizar el disconfort y facilitar la higiene oral durante el tiempo que se prolongue la fase experimental de formación del B-PD (Prada-López et al, 2015a). 5.1.2. Sustratos para recoger el B-PD Se han utilizado un gran número de sustratos sólidos de diferentes características en los estudios publicados sobre el B-PD, incluyendo esmalte humano (Netuschil et al, 1998; Wood et al, 2000; Auschill et al, 2001; Palmer et al, 2003; Chalmers et al, 2007), esmalte bovino (Al-Ahmad et al, 2007; Arweiler et al, 2008; Jung et al, 2010), dentina bovina (Zaura-Arite et al, 2001; Jung et al, 2010), hidroxiapatita (Gu et al, 2005) y vidrio pulido (Netuschil et al, 1998; Arweiler et al, 2004; Auschill et al, 2005; Dige et al, 2009). Zaura-Arite et al (Zaura-Arite et al, 2001) emplearon discos de dentina bovina, con la novedad de que en su superficie practicaron 3 surcos paralelos entre si (cada uno de 200 µm de ancho y aproximadamente 500 µm de profundidad), con el fin de imitar la morfología de la superficie dentaria. Otros autores han descrito la formación del B-PD sobre materiales dentales de restauración, utilizando sustratos tan heterogéneos como amalgama de plata, oro, cerámica, composite, compómero, cemento de vidrio ionómero o polimetilmetacrilato (Auschil et al, 2002; Konishi et al, 2003; Perez Davidi et al, 2007). En estudios preliminares para establecer el diseño metodológico del presente trabajo, comprobamos que no existían diferencias significativas en el grosor ni la vitalidad bacteriana de un B-PD de 2 días, cuando utilizamos discos de vidrio o de hidroxiapatita. Sin embargo, cuando incorporamos discos de vinilo, el grosor del B-PD aumentó significativamente, pero a expensas de una masa 5. DISCUSIÓN 105 hipocelular difícilmente valorable (García-Caballero, 2012). Además, algunos autores ya habían recomendado el empleo de vidrio para evitar posibles alteraciones ópticas como consecuencia de la consabida autofluorescencia del esmalte (Netuschil et al, 1998; Dige et al, 2007). Basándonos en esta propuesta y en nuestros resultados preliminares, en la presente investigación utilizamos discos de vidrio para analizar el crecimiento in situ de un B-PD. 5.1.3. Período de formación del B-PD En la mayoría de los estudios publicados sobre B-PD, el tiempo durante el cual el aparato colector permanece en la cavidad oral está comprendido entre 4 horas (Palmer et al, 2003; Konisi et al, 2003; Diaz et al, 2006; Palmer et al, 2006) y 7 días (Watson et al, 2005; Robinson et al, 2006; Al-Ahmad et al, 2007), dependiendo del tipo de B-PD a analizar. Por ejemplo, Prates et al (Prates et al, 2007) en un estudio donde investigaron el efecto bactericida de una terapia fotodinámica, consideraron necesario un biofilm de al menos 24 horas. Auschill et al (Auschil et al, 2004) emplearon un biofilm de 48 horas para determinar si su grosor se alteraba por la localización del aparato removible dentro de la cavidad oral (región vestibular maxilar vs región vestibular mandibular) o por la posición del disco (distal vs mesial; derecha vs izquierda). Arweiler et al (Arweiler et al, 2004) también recurrieron a biofilms de 48 horas para determinar el impacto de la localización del disco en la cavidad oral sobre la vitalidad bacteriana. Por otra parte, Wood et al (Wood et al, 2000) observaron que la distribución de un B-PD de 4 días era heterogénea, con mayor grosor en la unión entre el sustrato y el elemento portadiscos, y menor en la zona central. En 2008, Arweiler et al (Arweiler et al, 2008) utilizan un modelo in vivo de B-PD de 5 días para estudiar la eficacia de un antiséptico y, en contraste a lo esperado, su grosor resultó similar al obtenido en estudios in vitro en un B-PD con menos tiempo de formación (Thurnheer et al, 2003). Sánchez et al (Sánchez et al, 2011) realizaron un estudio in vitro para determinar el patrón de crecimiento de un B-PD, empleando para ello bacterias propias de la microbiota subgingival; a las 12 horas, los primeros colonizadores ya se adhirieron a la superficie de los discos de hidroxiapatita; los colonizadores intermedios como el Fusobacterium nucleatum no fueron detectados hasta transcurridas 24 horas de incubación y los colonizadores tardíos no aparecieron antes de las 48 horas. Los autores concluyeron que el biofilm alcanzó una fase de estabilidad a las 72-96 horas y que la vitalidad bacteriana era mayor en la parte central de los discos que en la perifería. Basándonos en estos hallazgos y en los de otros investigadores que SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 112 acrílico individualizado, aumentaba de 14 ± 5 µm el primer día, hasta 49 ± 11 µm a los 7 días. Paradójicamente, se ha demostrado que este incremento del grosor del biofilm no es uniformemente progresivo (Al-Ahmad et al, 2007; Al-Ahmad et al, 2010). La influencia significativa del factor “edad” de la placa ha sido corroborada en estudios recientes, en los que se analizaron períodos cortos de exposición oral, como los publicados por Dige et al (Dige et al, 2009) (B-PD de 6 horas, 12 horas, 1 día y 2 días) y por Jung et al (Jung et al, 2010) (B-PD de 30 minutos, 2 horas y 6 horas). No obstante, se ha señalado que los acúmulos bacterianos a los 2 días -al igual que en estadios previosno tienen un grosor uniforme (Dige et al, 2007) y algunos autores han sugerido que no existen diferencias significativas en el grosor medio de un B-PD de 2 y 4 días (Prada López et al, 2015). El valor medio del grosor del B-PD de 4 días analizado en el presente estudio fue de 20 µm, y resultó similar al obtenido por otros autores como Jentsch et al (Jentsch et al, 2002), Arweiler et al (Arweiler et al, 2008) y Quintás et al (Quintás et al, 2015b), en un B-PD de 3, 4 y 5 días respectivamente. Sin embargo, este grosor resultó considerablemente inferior al registrado en otros trabajos que comentaremos a continuación (Wood et al, 2000; Auschill et al 2005; Shen et al, 2011; Gu et al, 2012). Wood et al (Wood et al, 2000), en un estudio in vivo utilizando un B-PD de 4 días de evolución, encontraron valores de grosor que oscilaban entre 35-215 µm en los bordes del dispositivo y 75-220 µm en el centro; una característica metodológica importante es que el análisis se realizó con microscopía electrónica de transmisión, con la que son frecuentes los artefactos especialmente en las estructuras que están rellenas de fluido, ya que requiere la fijación y el secado de la muestra. Shen et al (Shen et al, 2011) obtuvieron un biofilm de 57 µm de grosor a los 2 días, que continuó aumentando hasta alcanzar 155 µm a las 3 semanas, 190 µm a las 6 semanas y 201 µm a las 12 semanas. Sin embargo, estos resultados no son comparables a los del presente estudio, ya que si bien se trataba de un biofilm multiespecies derivado de placa dental, éste se recogió en discos de hidroxiapatita recubiertos de colágeno, se enriquecía con medios de cultivo específicos y se le incorporaban semanalmente nutrientes frescos. Auschill et al (Auschill et al 2005) y Gu et al (Gu et al, 2012), introdujeron una variante metodológica sustancial con respecto a nuestro estudio, ya que determinaron el grosor del B-PD en base al número de planos de 1 µm obtenidos mediante CLSM, independientemente de su perpendicularidad; en consecuencia, una mínima inclinación del sustrato podría provocar una sobrestimación del grosor del B-PD. En el presente estudio se evitó este sesgo potencial, ya que empleamos el soporte informático SPII del microscopio Confocal Leica para 5. DISCUSIÓN 113 determinar la distancia exacta entre el sustrato y el punto más alto del B-PD, en un plano perpendicular al del sustrato. 5.2.1.2. Vitalidad En algunos estudios, en los que se aplicaron técnicas convencionales de cultivo microbiológico y fluorescencia vital, se demostró que en la placa dental joven y escasa predominaba la materia muerta sobre los microorganismos vivos (Netuschil et al, 1995; Weiger et al, 1995; Weiger et al, 1997). En la misma línea, en 1998, Netuschil et al (Netuschil et al, 1998), analizando in vivo especímenes de B-PD de 1, 2 y 3 días mediante CLSM, localizaron bacterias vivas preferentemente en la parte superior de un estrato denso de material muerto. Por el contrario, Zaura-Arite et al (Zaura-Arite et al, 2001) observaron, en muestras de B-PD de 2 días, que los acúmulos de bacterias vivas se entremezclaban con material muerto; este hallazgo sustentaría la hipótesis de que las bacterias muertas, más que las vivas, se adhieren a superficies sólidas, aunque otra posible explicación radicaría en los factores antibacterianos presentes en la saliva humana y en sus efectos sobre el B-PD (Scannapieco, 1994; Kage y Bernimoulin, 1995; Tenovuo 1998; Weiger et al, 1999). Recientemente, Yan He et al (He et al, 2013), han replanteado la propuesta de que los microorganismos muertos predominan en los estratos más profundos del biofilm, argumentando la dificultad que tienen los nutrientes para alcanzar estas regiones internas. Los microorganismos vivos, localizados sobre estos estratos muertos o embebidos en ellos, pueden ser responsables del ulterior crecimiento de la placa (Netuschil et al, 1998). Las bacterias muertas proporcionan suplementos nutritivos que favorecen el rápido crecimiento de la flora viva (Critchley 1969; Wimpenny 1995; Netuschil et al, 1998) y la protegen contra los agentes antibacterianos del propio ecosistema oral (Auschill et al, 2001). En consecuencia, se ha determinado que el material celular muerto representa un componente primordial de la biomasa durante los estadios iniciales de acumulación y desarrollo del B-PD (Netuschil et al, 1998; Auschill et al, 2001). En estos biofilms se han descrito estructuras cavitadas (“agujeros negros”) rodeadas por bacterias vivas, lo que podría significar que estas bacterias tienen acceso directo a los nutrientes que difunden a través de poros y oquedades (Lawrence et al, 1991; de Beer et al, 1994; Singleton et al, 1997). En diversos estudios realizados in vivo en B-PD de 2-3 días de maduración, se alcanzó una vitalidad bacteriana media del 60-77% (Arweiler et al, 2004; Auschill et al, 2005; von Ohle et al, 2010; Gu et al, 2012; García- Caballero et al, 2013; Quintás et al, 2015a). Algunos autores han señalado que la vitalidad bacteriana aumenta a medida que lo hace el período de maduración del biofilm y consecuentemente su grosor (Auschill et al, 2001; Zaura-Arite et al, SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 114 2001). En el presente estudio, la vitalidad bacteriana media fue del 49%, resultando similar a la de otras series con B-PD de 4-5 días (Arweiler et al, 2008; Quintás et al, 2015b), confirmando que a diferencia del grosor la vitalidad bacteriana disminuye con la maduración del biofilm (Prada López et al, 2015b). Se han descrito grandes diferencias inter-individuales en la disposición de las bacterias vivas y muertas, por lo que no parece existir un patrón general de distribución de la vitalidad bacteriana (Zaura-Arite, 2001; von Ohle et al, 2010). Por el contrario, Arweiler et al (Arweiler et al, 2004) sugirieron que en cada participante en estos estudios existía un ambiente ecológico relativamente constante, lo que obviamente conduce a un patrón de identidad microbiana. En este sentido, estos investigadores (Arweiler et al, 2004) identificaron 3 patrones de vitalidad en un B-PD de 2 días: en el primero, un gran número de bacterias muertas (vitalidad baja) se acumulaban en las capas más próximas al sustrato, la vitalidad aumentaba en los estratos intermedios y terminaba nuevamente con valores bajos en los estratos más superficiales del biofilm; en el segundo patrón, cuando estas bacterias eran recubiertas por células vivas, o proliferaban algunas de las bacterias que todavía sobrevivían o eran cultivables, formaban una nueva capa de B-PD vital; en el tercer patrón, el biofilm exhibía valores elevados de vitalidad bacteriana en la capa próxima al sustrato, disminuyendo progresivamente hacia el exterior. Auschill et al (Auschill et al, 2001), observaron que la distribución de la vitalidad bacteriana en B-PD acumulados durante 5 días tenía un perfil similar al primer patrón descrito, ya que el porcentaje de bacterias vivas era más bajo en el área adyacente a la superficie del esmalte, aumentaba siguiendo el eje z hacia la zona central y disminuía nuevamente hacia los estratos más superficiales. Por el contrario, Arweiler et al (Arweiler et al, 2008) demostraron en un B-PD de 5 días, un patrón de vitalidad bacteriana más parecido al segundo de los que hemos descrito, con valores más bajos en los estratos inferiores y más altos en las capas superficiales, confirmando que las bacterias próximas al sustrato suelen ser metabólicamente inactivas (zonas latentes) (ten Cate y Marsh, 1994; Netuschil et al, 1998). Arweiler et al (Arweiler et al, 2004) describieron una gran variabilidad no sólo inter-individual sino también intra-individual (entre las diferentes capas del biofilm) en un B-PD de 2 días. Sin embargo, estos mismos autores (Arweiler et al, 2008), en un trabajo publicado posteriormente, no detectaron diferencias estadísticamente significativas en la vitalidad bacteriana entre las capas basal, intermedia y superficial de un B-PD de 5 días. En el presente trabajo, el promedio de vitalidad del B-PD después de 4 días de formación fue del 79% en las capas más superficiales y del 15% en los estratos más profundos, coincidiendo este hallazgo con el de otros estudios 5. DISCUSIÓN 115 previos (Netuschil et al, 1998). Este patrón se corresponde con uno de los descritos por Arweiler et al (Arweiler et al, 2004), refrenda la hipótesis de que las bacterias del estrato basal están en un estado de inactividad metabólica (Koo et al, 2006), y confirma la importancia del material celular muerto en los estadios iniciales del acúmulo y desarrollo del B-PD, favoreciendo particularmente su crecimiento y protegiéndolo de los agentes antimicrobianos del medio oral (Netuschil et al, 1998; Auschill et al, 2001). 5.2.1.3. Área ocupada Se ha demostrado que la morfología y la composición bacteriana de un B- PD varían sustancialmente entre el segundo y el cuarto día de maduración; simultáneamente, el área del sustrato cubierta por biofilm aumenta significativamente (Prada López et al, 2015b). En el presente trabajo, el área media ocupada en un B-PD de 4 días de evolución fue del 78%, aunque se detectó una gran variabilidad interindividual. Este porcentaje resultó similar al observado por otros autores también en un B-PD de 4 días, tanto in vitro, como en el estudio de Al-Ahmad et al (Al-Ahmad et al, 2008) con el 77%, como in situ, en consonancia con los trabajos de Prada López et al (Prada López et al, 2015b) con el 70% o Quintás et al (Quintás et al, 2015b) con el 75%. El área del sustrato cubierta por biofilm mantenía una correlación estadísticamente significativa con su grosor medio (p< 0,05), pero no con la vitalidad bacteriana. Aunque no hemos encontrado publicaciones específicas a este respecto en B-PD de 4 días in situ, este hallazgo podría expresar la capacidad adaptativa de los microorganismos del biofilm a las condiciones del entorno (Al- Ahmad et al, 2008). 5.2.2. Características del B-PD tras administrar clorhexidina 0,20% Aunque se han publicado numerosos trabajos sobre la actividad antimicrobiana de la CHX sobre el B-PD in vitro (Kinniment et al, 1996; Wilson, 1996; Pratten et al, 1998; Wilson et al, 1998; Pratten y Wilson ,1999; Hope y Wilson, 2004; Pan et al, 2010; Guggenheim y Meier, 2011), los estudios in situ sobre los efectos de los agentes antimicrobianos en el B-PD, aplicados durante intervalos de tiempo definidos, y evaluados mediante CLSM y técnicas de vitalidad bacteriana, son escasos. Estos trabajos pueden analizarse diferenciando entre los que investigan el efecto antimicrobiano de una aplicación única (Zaura- Arite et al, 2001; von Ohle et al, 2010, García-Caballero et al, 2013; Quintás et al, 2015a) y aquéllos que, al igual que en el presente estudio, cuantifican la SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 116 eficacia de múltiples aplicaciones (Auschill et al, 2005; Arweiler et al, 2008; Quintás et al, 2015b). 5.2.2.1. Grosor Se han publicado algunos estudios cuyo objetivo fue evaluar el efecto de la CHX sobre el biofilm oral in situ, que incurrieron en un problema metodológico común, ya que la placa dental se desestructuró para evaluar otros parámetros como la vitalidad bacteriana, por lo que en estos trabajos resultó inviable cuantificar el grosor del biofilm (Arweiler et al, 2006; Singh et al, 2013). En el presente estudio, el valor medio del grosor del B-PD tras 4 días de administración de CHX cada 12 horas fue de 6 µm, lo que supuso una reducción del 70% con respecto al grosor basal. Este resultado coincide con el obtenido recientemente por Quintás et al (Quintás et al, 2015b), que aplicaron la misma secuencia metodológica. En un estudio previo publicado en 2005 por Auschill et al (Auschill et al, 2005), en el que la CHX al 0,2% se utilizó durante 2 días, el porcentaje de reducción del grosor alcanzó el 89%. Por su parte, en 2008, Arweiler et al (Arweiler et al, 2008) también describieron una reducción significativa del grosor en torno al 57% en un B-PD de 5 días (grosor medio basal= 25 µm y tras la administración de CHX= 11 µm). Una variable poco analizada en la literatura es la posología de la CHX, en términos de concentración del principio activo y de la cadencia de su administración. Se ha descrito un grosor medio del B-PD tras la administración de CHX al 0,12% durante 3 ó 4 días, de 14 μm y 17 μm, respectivamente (Jentsch et al, 2002; Jentsch et al, 2013); este hallazgo parece sugerir que la reducción del grosor del B-PD es dosis-dependiente, aunque hay que tener en cuenta que en ambos artículos a diferencia del presente estudio las técnicas de microscopía empleadas para visualizar la microestructura de los biofilms fueron la TEM y la SEM. En nuestro trabajo, la cadencia de administración de la CHX (cada 12 horas versus cada 8 horas) no pareció condicionar significativamente su eficacia en términos de reducción del grosor del B-PD, aunque realizando los enjuagues cada 8 horas el grosor medio del B-PD fue de tan solo 3 μm; no hemos encontrado ninguna publicación hasta la fecha en la que se haya explorado esta variable, por lo que no podemos cotejar este resultado con los obtenidos por otros autores. 5.2.2.2. Vitalidad Los resultados de los estudios sobre vitalidad bacteriana están condicionados por el porcentaje de bacterias vivas detectado en el B-PD basal, que a su vez depende de múltiples factores ambientales como el aporte de nutrientes y metodológicos como los fluorocromos empleados; en consecuencia, 5. DISCUSIÓN 117 la diferencia porcentual entre la vitalidad bacteriana en condiciones basales y tras la aplicación de un antimicrobiano puede ser más relevante que los valores absolutos obtenidos. El primer artículo en el que se evaluó in vivo la actividad antibacteriana de la CHX al 0,2% fue publicado hace 10 años por Auschill et al (Auschill et al, 2005); en dicho trabajo, los participantes llevaron una férula intraoral con discos de vidrio durante 2 días y realizaron enjuagues con el antiséptico cada 12 horas; las bacterias vivas y muertas se cuantificaron mediante CLSM, utilizando como fluorocromos diacetato de fluoresceína y bromuro de etidio; los resultados demostraron una reducción de la vitalidad del B-PD del 65% (66% basal y 23% tras completar el ciclo del antiséptico). En esta misma línea, Arweiler et al (Arweiler et al, 2008) describieron una reducción de la vitalidad bacteriana del 62%, después de administrar CHX al 0,2% cada 12 horas durante 5 días; la vitalidad registrada en condiciones basales fue del 57% y cayó hasta el 22% con los enjuagues de CHX. En el presente estudio, la vitalidad bacteriana del B-PD disminuyó desde el 49% basal hasta el 13%, lo que representa un porcentaje de reducción del 73%. Este resultado es similar al obtenido recientemente por Quintás et al (Quintás et al, 2015b) aplicando la misma metodología; estos autores detectaron un 77% de reducción, con un 57% basal y un 13% al completar la administración de CHX. Los porcentajes de vitalidad observados tras la aplicación del antiséptico fueron inferiores a los de algunos estudios previos. Se ha sugerido que esta discrepancia podría deberse a diferencias metodológicas, como la realización de enjuagues activos frente a la inmersión de los discos en la solución antiséptica (Arweiler et al, 2008), con lo que desaparece la acción del lavado y de la musculatura perioral. En nuestro estudio, al analizar la vitalidad bacteriana del B-PD por capas al completar el período de administración de la CHX, encontramos valores del 18%, 14% y 8%, en las capas superficial, intermedia y profunda, respectivamente. Estos porcentajes son similares a los registrados recientemente por Quintás et al (Quintás et al, 2015b), con un 17%, 14% y 9%, respectivamente. En ambos trabajos el patrón de vitalidad del B-PD fue descendente desde la superficie hacia los estratos más profundos, reproduciendo el observado en el B-PD basal, pero sólo en nuestro estudio la diferencia porcentual de vitalidad bacteriana entre la capa superficial y la más profunda alcanzó significación estadística. En publicaciones previas, tras aplicar CHX, tampoco se observaron diferencias de la vitalidad bacteriana entre capas (Auschill et al, 2005; Arweiler et al, 2008). Paradójicamente, algunos de ellos señalaron que sobreviven más bacterias a la acción del antiséptico en los estractos superficiales que en los SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 118 profundos (Arweiler et al, 2008), lo cual nos obliga a plantear si la distribución arbitraria del B-PD en 3 capas es la más adecuada para proceder a su análisis. La administración de CHX con una posología nueva, cada 8 horas, proporcionó una excelente actividad antibacteriana, registrándose una reducción del 97% con respecto a la vitalidad del B-PD basal; el porcentaje de vitalidad por capas osciló entre 1 y 2%. Sin embargo, cuando el último enjuague se efectuó por la mañana y la lectura de los discos por la tarde, los resultados fueron similares a los obtenidos con la pauta de administración cada 12 horas (vitalidad media del B- PD= 13% y por capas= 12-14%). No hemos encontrado en la literatura ningún artículo previo con el que podamos comparar estos hallazgos. Se ha sugerido que despues de efectuar un único enjuague con CHX, la vitalidad bacteriana de un B- PD permanece estable durante 8-12 horas, independientemente del momento del día en el que se administra el antiséptico (Tomás et al, 2013). Esto permite especular en base a nuestros hallazgos, que si bien la cadencia de administración del antiséptico podría tener relevancia en términos de vitalidad bacteriana en un B-PD de novo, su eficacia está condicionada por variables relacionadas con el ritmo circadiano, como pueden ser la producción de saliva o la sustantividad del antiséptico en saliva durante la vigilia. 5.2.2.3. Área ocupada El porcentaje de superficie del sustrato cubierto por el B-PD tras la administración de un agente antimicrobiano ha sido objeto de muy pocas investigaciones, probablemente porque sólo puede analizarse con algunas técnicas de microscopía como el CLSM. Su interés radica en que este parámetro, junto con el grosor del B-PD, están directamente relacionados con la actividad antiplaca del antiséptico testado (Quintás et al, 2015b). Nosotros encontramos un 21% del área ocupada tras la administración de CHX al 0,2% cada 12 horas durante 4 días, lo que representa una reducción del 73%. Este resultado fue inferior al obtenido in vitro por Al-Ahmad et al (Al-Ahmad et al, 2008) con un 91% de reducción (77% en el control negativo versus 7% al completar la pauta de CHX), pero similar al reportado recientemente por Quintás et al (Quintás et al, 2015b), empleando una metodología similar a la del presente trabajo, con un 73% de reducción (75% en el control negativo versus 20% al completar la pauta de CHX). El área ocupada tras la administración del antiséptico cada 8 horas durante 4 días fue del 10%, lo que representa una reducción del 87% con respecto al porcentaje de cobertura basal y del 52% en relación a los resultados obtenidos con la aplicación cada 12 horas, aunque las diferencias observadas entre ambas pautas de administración no alcanzaron significación estadística. 5. DISCUSIÓN 119 No hemos encontrado en la literatura ninguna referencia con la que comparar nuestros resultados a este respecto. En cualquier caso, los resultados obtenidos en el presente estudio deben contrastarse con los derivados de estudios clínicos, basados en la aplicación de antisépticos durante períodos de tiempo variables. 5.2.3. Características del B-PD tras administrar amoxicilina/ácido clavulánico La administración pautada durante 4 días de una dosis terapéutica de AMX-CLV no produjo ningún efecto sobre el B-PD en relación a su grosor (20 µm), la vitalidad bacteriana (56%) ni el área del sustrato ocupada (67%). Los valores de todos estos parámetros fueron similares a los registrados en situación basal y a los obtenidos recientemente en el B-PD de un grupo control de individuos que efectuaron enjuagues cada 12 horas con agua estéril durante 4 días (Quintás et al, 2015b). El biofilm conservó su estructura habitual y, coincidiendo con la disposión del B-PD en situación basal, la vitalidad bacteriana disminuyó desde los estratos superficiales (74%) a los más profundos (32%). Hasta la fecha, no hemos encontrado ningún estudio clínico ni microbiológico en el que se haya analizado in vivo el efecto de un antibiótico sistémico sobre un B-PD maduro, por lo que no podemos comparar nuestros hallazgos con los de estudios previos. El primer argumento para justificar los resultados del presente trabajo es la propia farmacocinética de la combinación antibiótica administrada. Se ha sugerido que tanto AMX como CLV se distribuyen adecuadamente en la mayoría de los tejidos corporales, aunque los niveles que alcanzan en saliva son bajos; no hemos encontrado referencias a la concentración salival de CLV, pero los antibióticos beta-lactámicos como la AMX se clasifican entre los de “muy baja” distribución salival, con niveles que no llegan al 10% de su concentración sérica (Soriano y Rodríguez-Cerrato, 2002). En términos de fármacodinámica, en un grupo de niños con otitis media tratada con AMX-CLV, se demostró que las elevadas concentraciones locales detectadas en la orofaringe inmediatamente después de ingerir el antibiótico en suspensión, no alteraban sustancialmente la microflora regional (Lund et al, 2001). Aún obviando su farmacocinética, la eficacia del antibiótico en el B-PD estaría además condicionada por otros factores comunes a biofilms de distinta naturaleza, como: la dificultad para alcanzar las zonas profundas del biofilm, la resistencia que desarrollan las bacterias expuestas a dosis subletales del antibiótico, la activación de genes de resistencia por parte de las bacterias sésiles, SEILA MARÍA TORRES LANDÍN 120 el predominio de bacterias en forma quiescente en zonas profundas del biofilm por el aporte limitado de nutrientes y la protección que proporciona la matriz de exopolisacáridos (Donlan y Costerton, 2002; Socransky et al, 2013). Por último, la topografía de un biofilm multiespecie como el B-PD y el hecho de que ya entre en fase estacionaria a las 24 horas, le dotan de una resistencia a los antibióticos entre 10 y 100 veces mayor que el de un biofilm monoespecie (Park et al, 2014). Nuestros resultados obligan a replantear la eficacia del AMX-CLV para prevenir la aparición de infecciones locales y focales de origen oral, si la premisa inicial es su actividad antiplaca. La caries es consecuencia de un desequilibrio en las poblaciones bacterianas de los considerados “biofilms naturales” y la causa más frecuente de infección odontogénica con expresión clínica (Teles et al, 2006); aunque empíricamente se ha sugerido que AMX-CLV es la combinación antibiótica más activa para combatir la infección odontogénica en base a sus características de farmacocinética/farmacodinámica (Isla et al, 2008), hasta la fecha no hemos encontrado ningún estudio que avale su aplicación para prevenir la aparición de caries. Lo mismo ocurre con la enfermedad periodontal, a pesar de que AMXCLV esté incluida en la primera línea de antibioterapia para combatir las exacerbaciones de la periodontitis (Liébana et al, 2004), probablemente como consecuencia de la elevada prevalencia de especies productoras de betalactamasas en la flora subgingival (Rams et al, 2013); en términos de prevención, se han descrito fracasos de regeneración periodontal guiada con exposición y consiguiente contaminación bacteriana de la membrana, a pesar de la administración profiláctica postoperatoria de AMX-CLV (De Sanctis et al, 1996). Del análisis crítico de la literatura, se deduce que hay una evidencia moderada de que la profilaxis antibiótica con AMX-CLV reduzca el riesgo de alveolitis y otras complicaciones infecciosas postexodoncia (Lodi et al, 2012), pero en este caso el sustrato es un coágulo intraalveolar, sobre el que se desarrollará un biofilm cuya características estructurales y funcionales aún no se han descrito, pero que presumiblemente serán muy diferentes a las del B-PD; además, el antibiótico probablemente accede al lecho alveolar por vía hematógena y no vehiculizado por la saliva. La administración rutinaria de profilaxis antibiótica para reducir la incidencia de endocarditis en pacientes de riesgo todavía sigue siendo objeto de controversia (Diz Dios, 2014); recientemente, se ha sugerido que la combinación de AMX-CLV puede evitar la aparición de bacteriemias postexodoncia (Álvarez, 2014) una fase previa imprescindible para el desarrollo de endocarditis, aunque en este caso el antibiótico actúa presumiblemente a nivel del torrente circulatorio y de los órganos diana; sin embargo, un lavado preoperatorio de la cavidad oral con CHX al 0,2% disminuye significativamente la duración de las bacteriemias 5. DISCUSIÓN 121 secundarias a exodoncias (Barbosa et al, 2015), lo que obliga a pensar que reduce sustancialmente el inóculo bacteriano que conforma el B-PD. Se ha demostrado que la aplicación tópica de antisépticos como la CHX para descontaminar la cavidad oral, reduce la incidencia de neumonía nosocomial y de neumonía asociada a ventilación mecánica (Li et al, 2013; Silvestri et al, 2014); en algunos protocolos, para reducir las infecciones del tracto respiratorio también se incorporan antibióticos sistémicos, fundamentalmente en el marco de la “descontaminación selectiva del tracto digestivo”; cuando en los pacientes ingresados en unidades de cuidados intentivos la profilaxis tópica se complementa con antibióticos sistémicos, se reducen las infecciones respiratorias y la mortalidad (Liberati et al, 2009); sin embargo, no existen ensayos concluyentes sobre la eficacia de la profilaxis exclusivamente con antibióticos por vía sistémica y en los que se han publicado la combinación AMX-CLV no representa el antibiótico de elección (D’Amico et al, 2009). En definitiva, en las situaciones clínicas en las que se opta por la prescripción de AMX-CLV para prevenir complicaciones infecciosas, el antibiótico no actúa sobre el B-PD y por extensión sobre la placa dental, por lo que si se pretende reducir localmente el tamaño de este inóculo bacteriano, es imprescindible implementar la administración de un antimicrobiano eficaz por vía tópica como la CHX. 7. BIBLIOGRAFÍA 129 Adalja AA. Center for Biosecurity of UPMC comments on HHS action plan to prevent healthcare-associated infections. Biosecur Bioterror 2010; 8: 377- 378. Aimetti M, Romano F, Nessi F. Microbiologic analysis of periodontal pockets and carotid atheromatous plaques in advanced chronic periodontitis patients. J Periodontol 2007; 78: 1718-1723. Akota I, Alvsaker B, Bjørnland T. The effect of locally applied gauze drain impregnated with chlortetracycline ointment in mandibular third molar surgery. Acta Odontolol Scand 1998: 56; 25-29. 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