Evaluación clínica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes cáncer de cabeza y cuello

TESIS DE DOCTORADO Evaluación clínica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello Paula Boñar Álvarez ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS ODONTOLÓGICAS SANTIAGO DE COMPOSTELA 2019 DECLARACIÓN DE LA AUTORA DE LA TESIS Evaluación clínica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello Dña. Paula Boñar Álvarez Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, 26 de Marzo de 2019 Fdo Paula Boñar Álvarez AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Evaluación clínica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello Dña. María Elena Padín Iruegas D. Mario Pérez-Sayás García D. Abel García García INFORMAN: Que la presente tesis, corresponde con el trabajo realizado por Dña. Paula Boñar Álvarez, bajo mi dirección, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, 26 de Marzo de 2019 Fdo. Dña. María Elena Padín Iruegas Fdo. D. Mario Pérez-Sayás García Fdo. D. Abel García García DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES Evaluación clínica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello Dña. Paula Boñar Álvarez, Declara no tener ningún conflicto de interés en relación con la tesis doctoral. En Santiago de Compostela, 26 de Marzo de 2019 Fdo Paula Boñar Álvarez 9 Agradecimientos Durante estos cinco años son muchas las personas que han hecho realidad este trabajo: a todos y cada uno de ellos, gracias. Quiero agradecer su apoyo al Profesor Dr. Mario Pérez Sáyans, porque durante este largo y duro camino, no sólo ha sido mi director sino que además se ha forjado una bonita amistad. Gracias por creer en mí desde el principio, por tu esfuerzo y dedicación incondicional durante todo este tiempo, donde no importaba ni el día ni la hora, siempre estuviste ahí. Sin duda has sido una fuente de inspiración y un ejemplo a seguir. Mario, sin ti no hubiese sido posible esta tesis doctoral. A la Profesora Dra. Elena Padín Iruegas, por sus horas en el laboratorio, sus ánimos y su constancia. Siempre los trayectos a Santiago valían la pena para trabajar al lado de una profesional como ella. Sin duda, ha sido uno de los pilares de este proyecto. A la Profesora Dra. Pilar Gándara Vila Díaz, por sus sabios consejos y desinteresada ayuda. Al Profesor Dr. Abel García García, por su confianza para llevar a cabo este proyecto. Al Profesor Dr. José Manuel Gándara Rey, por iniciarme en el campo de la medicina oral, por compartir sus conocimientos y por permitirme formar parte de este Máster. Al Profesor Dr. Andrés Blanco Carrión, por la inestimable aportación de pacientes de radioterapia. A mis compañeros de Máster, por estar ahí siempre que los he necesitado. 16 to radiotherapy, to check if there are any variations due to epigenetic changes, comparing them with what happens in healthy people, considered as controls. For this purpose, patients will be followed before, during and after treatment, analyzing different genes methylation pattern, using DNA samples of salivary rinses and their corresponding analysis by methylationspecific polymerase chain reaction (PCR) techniques (MSP). KEYWORDS Methylation, head and neck cancer, radiotherapy, epigenetics, saliva ABREVIATURAS 17 Abreviaturas RTP: radioterapia QTP: quimioterapia ORN: osteorradionecrosis COCE: carcinoma oral de células escamosas ICD: clasificación internacional de enfermedades OMS: organización mundial de la salud VPH: virus del papiloma humano NNN: nitroso-nor-nicotina NNK: 4-(metilnitrosamina)-1-(3-piridil)-1-butanona ADN: ácido dexosirribobucleico Rb: retinoblastoma UE: unión europea TNM: clasificación de tumores malignos:T=tamaño;N= nódulos linfáticos;M= metástasis Gy: grey Iridio 192: Ir192 Yodo125: I125 ATM: articulación temporomandibular EGFR: receptor de factor de crecimiento epidérmico C-Met: factor de crecimiento hepático STAT: proteínas transductoras de señales y activadoras de la transcripción NF-KB: factor nuclear kappa AP-1: proteína activadora 1 VEGF: factor de crecimiento vascular endothelial IL-8: interleuquina 8 PAULA BOÑAR ALVAREZ 18 MMP: metaloproteinasas de la matriz KDC: proteínas quinasas dependientes de ciclinas EFG: factor de crecimiento epidérmico MAPK: proteína quinasas activadas por mitógenos MEK: quinasa de reconocimiento de treonina y tirosina pRb: proteína supresora de tumores del gen del retinoblastoma kb: kilobase kDa: kilodalton GST: genes supresores de tumores CH3: grupo metilo MBD: proteínas de unión a metil-CpG ND: sin datos APC: adenomatous polyposis coli CDH1: e-cadherin MGMT: ADN-06-metilguanina metil transferasa MLH1: mutL homolog 1 DAPK1: death-associated protein kinase 1 RARB2: regulador transcrpcional nuclear ECM: peptidasas involucradas en la degradación de la matriz extracelular TIMP-3: inhibidor tisular de metlaloproteinasas CCND2: ciclina D2 TSG-I: tasa de saliva global en reposo TSG-II: tasa de saliva global estimulada ADA: american dental association µl: microlitro µg: microgramo ARN: ácido ribonucleico ABREVIATURAS 19 PCR: reacción en cadena de la polimerasa MSP: técnica de metilación específica de PCR pre-RTP: antes de la radioterapia post-RTP: después de la radioterapia DS: desviación estándar M: primer metilado U: primer no metilado g: gramos ml: mililitro mg: miligramos ÍNDICE 21 Índice 1 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ............................................................. 33 2 INTRODUCCIÓN .......................................................................................... 37 2.1 Carcinoma oral de Células Escamosas (COCE) ............................................. 39 2.1.1 Concepto .................................................................................................. 39 2.1.2 Etiología ................................................................................................... 40 2.1.3 Epidemiología .......................................................................................... 42 2.1.4 Clasificación ............................................................................................ 45 2.1.5 Clínica y localización ............................................................................... 45 2.1.6 Tratamiento .............................................................................................. 47 Complicaciones agudas de la RTP .................................................... 50 2.1.6.1 2.1.6.1.1 Mucositis ....................................................................................50 2.1.6.1.2 Riesgo de infecciones ................................................................51 2.1.6.1.3 Radiodermitis .............................................................................52 2.1.6.1.4 Alteraciones de las glándulas salivales ......................................53 2.1.6.1.5 Alteraciones del gusto ................................................................54 Complicaciones tardías de la RTP .................................................... 55 2.1.6.2 2.1.6.2.1 Necrosis de los tejidos blandos ..................................................55 2.1.6.2.2 Trismus ......................................................................................55 2.1.6.2.3 Osteorradionecrosis (ORN) .......................................................55 2.1.6.2.4 Caries post-irradiación ...............................................................57 2.1.7 Pronóstico ................................................................................................ 59 2.2 Bases Genéticas del cáncer ................................................................................ 60 2.2.1 Ciclo celular ............................................................................................. 60 2.2.2 Oncogénes ................................................................................................ 64 2.2.3 Principales genes supresores de tumores ................................................. 65 2.2.4 Carcinogénesis ......................................................................................... 69 2.3 Panel de metilación en el cáncer de cabeza y cuello ....................................... 71 2.3.1 Detección de la metilación ....................................................................... 80 2.3.2 Correlación de la metilación con la progresión y la malignización ......... 81 P AULA B OÑAR Á LVAREZ 22 3 MATERIAL Y MÉTODOS .......................................................................... 85 3.1 Tipo de estudio ................................................................................................... 87 3.2 Obtención de las muestras del estudio casos-controles .................................. 88 3.3 Selección de los genes a estudiar en el estudio casos-controles ...................... 89 3.4 Variables Clínicas .............................................................................................. 89 3.5 Protocolo ANTES, DURANTE y DESPUÉS DE LA RTP ............................. 91 3.5.1 Antes de la RTP ....................................................................................... 91 3.5.2 Durante la RTP ........................................................................................ 95 3.5.3 Después de la RTP ................................................................................... 96 3.6 Protocolo de análisis de las muestras ............................................................... 98 3.6.1 Extracción del ADN de las muestras ....................................................... 98 3.6.2 Técnica de Transformación con bisulfito ................................................ 99 3.6.3 Técnica de MSP ..................................................................................... 100 3.6.4 Análisis estadístico................................................................................. 103 4 RESULTADOS ............................................................................................. 105 4.1 Descriptivo ........................................................................................................ 107 4.1.1 Edad y sexo ............................................................................................ 107 4.1.2 Sesiones de RTP .................................................................................... 107 4.1.3 Estadíos TNM ........................................................................................ 107 Distribución de estadíos según sexo ............................................... 107 4.1.3.1 Distribución de estadíos según localización ................................... 108 4.1.3.2 Distribución de estadíos según hábito tabáquico ............................ 108 4.1.3.3 Distribución de estadíos según el tratamiento con QTP ................. 109 4.1.3.4 Distribución de estadíos según la recurrencia de la enfermedad .... 109 4.1.3.5 4.1.4 Localización del tumor .......................................................................... 109 4.1.5 Consumo de alcohol ............................................................................... 110 4.1.6 Consumo de tabaco ................................................................................ 110 4.1.7 Situación oral del paciente pre-RTP ...................................................... 110 Tratamiento bucodental .................................................................. 110 4.1.7.1 Infección por cándida ...................................................................... 111 4.1.7.2 Higiene oral ..................................................................................... 111 4.1.7.3 4.1.7.3.1 Asociación exodoncias pre-RTP e higiene oral previa ............111 4.1.7.3.2 Asociación exodoncias pre-RTP y habitos tóxicos .................112 ÍNDICE 23 Cantidad de saliva en reposo y estimulada ..................................... 112 4.1.7.4 4.1.8 Situación oral del paciente durante la RTP ............................................ 112 Mucositis ......................................................................................... 113 4.1.8.1 Radiodermitis .................................................................................. 114 4.1.8.2 Infección por cándida ...................................................................... 114 4.1.8.3 4.1.8.3.1 Asociación cultivo pre-RTP-cultivo y final del tratamiento ....114 4.1.8.3.2 Asociación cultivo mitad de la RTP y cultivo final del tratamiento ...............................................................................115 4.1.8.3.3 Asociación cultivo pre-RTP y cultivo mitad del tratamiento ..115 Cantidad de saliva en reposo y estimulada ..................................... 115 4.1.8.4 4.1.8.4.1 Asociación de la media de saliva de TSG-I pre-RTP y la media de TSG-I durante la RTP ..............................................116 4.1.8.4.2 Asociación tasas salivales y cultivo final ................................116 4.1.8.4.3 Asociación entre tasas salivales y cultivo post-tratamiento a los 3, 6 y 12 meses ...................................................................117 4.1.9 Situación oral del paciente post-RTP ..................................................... 120 Mucositis ......................................................................................... 120 4.1.9.1 Radiodermitis .................................................................................. 121 4.1.9.2 Infección por cándida a los 3,6 y 12 meses post-RTP .................... 121 4.1.9.3 Cantidad de saliva en reposo y estimula post-RTP ......................... 122 4.1.9.4 4.1.9.4.1 Asociación de la media de TSG-I pre-RTP y la media de TSG-I post-RTP .......................................................................123 4.1.9.4.2 Asociación de la media de saliva post-RTP I y II al mes, a los 6 meses y a las 12 meses ..........................................................123 4.1.9.4.3 Asociación de la media de saliva TSG-I post-RTP al mes, a los 6 meses y a los 12 meses ....................................................124 4.1.9.4.4 Asociación de la media de saliva TSG-II post-RTP al mes, a los 6 meses y a los 12 meses ....................................................125 4.1.9.4.5 Asociación del nivel salival con la RTP ..................................125 4.1.9.4.6 Asociación tasas salival y cultivo post-RTP a los 3 meses......128 4.1.9.4.7 Asociación tasas salival y cultivo post-RTP a los 12 meses....129 Extracciones post-RTP ................................................................... 131 4.1.9.5 ORN ................................................................................................ 131 4.1.9.6 4.1.9.6.1 Distribución de la ORN según QTP ........................................132 4.1.9.6.2 Distribución de la ORN según Estadío ....................................132 4.1.9.6.3 Distribución de la ORN según Hábitos Tóxicos ......................132 4.1.9.6.4 Distribución de la ORN según las extracciones pre y post- RTP ..........................................................................................133 4.1.9.6.5 Distribución de la ORN según la cirugía pre-RTP ..................133 P AULA B OÑAR Á LVAREZ 24 4.1.9.6.6 Distribución de la ORN según el cultivo en la mitad de tratamiento ...............................................................................133 4.1.9.6.7 Distribución de la ORN en el control a los 2 años ..................134 4.1.9.6.8 Distribución de la ORN según el estado bucodental a los 2 años y a los 3 años de seguimiento ..........................................134 4.1.9.6.9 Distribución de la ORN según sus causas de aparición y su momento de aparición y localización. .....................................134 4.1.9.6.10 Asociación de la ORN y TSG-II post-RTP a los 3 meses .......135 4.1.10 Asistencia a visitas de seguimiento........................................................ 136 4.1.11 Recurrencia, Seguimiento y Supervivencia a los 3 años ....................... 136 Análisis del tiempo de supervivencia ............................................. 136 4.1.11.1 4.1.11.1.1 Estadío .....................................................................................137 4.1.11.1.2 Fumadores (número de cigarrillos) ..........................................139 4.1.11.1.3 Recurrencia de la enfermedad .................................................139 4.1.11.1.4 Localización .............................................................................140 4.2 Calidad y cantidad de ADN ............................................................................ 141 4.3 Metilación ......................................................................................................... 142 4.3.1 Metilación caso-control pre-RTP ........................................................... 143 MGMT pre-RTP ............................................................................. 143 4.3.1.1 p16 pre-RTP .................................................................................... 143 4.3.1.2 DAPK1 pre-RTP ............................................................................. 143 4.3.1.3 CCND2 pre-RTP ............................................................................. 144 4.3.1.4 TIMP-3 pre-RTP ............................................................................. 144 4.3.1.5 4.3.2 Asociaciones metilación ........................................................................ 145 Asociación pre/post-RTP metilación en los casos .......................... 145 4.3.2.1 Cambios metilación pre/post-RTP estudiados en el mismo caso ... 145 4.3.2.2 Asociación de Cambios metilación pre/post estudiados en el 4.3.2.3 mismo caso (enjuague pre-RTP y post-RTP) y los Gy recibidos ... 146 4.3.3 Supervivencia y metilación .................................................................... 147 Metilación MGMT pre y post-RTP ................................................ 147 4.3.3.1 Metilación DAPK1 pre y post-RTP ................................................ 148 4.3.3.2 Metilación p16 pre y post-RTP ....................................................... 150 4.3.3.3 Metilación CCND2 pre y post-RTP ................................................ 151 4.3.3.4 Metilación TIMP-3 pre y post-RTP ................................................ 153 4.3.3.5 4.4 Modelos de Regresión ...................................................................................... 154 ÍNDICE 25 5 DISCUSIÓN .................................................................................................. 157 5.1 Consideraciones generales .............................................................................. 159 5.2 Datos Clínicos. .................................................................................................. 162 5.3 Situación oral del paciente antes de empezar el tratamiento....................... 165 5.4 Situación oral del paciente durante el tratamiento ...................................... 168 5.5 Situación oral del paciente después del tratamiento .................................... 173 5.6 Detección de la metilación en el cáncer de cabeza y cuello .......................... 180 6 CONCLUSIONES ........................................................................................ 191 7 BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 195 8 ANEXOS ....................................................................................................... 243 8.1 Anexo I Aprobación del comité de ética ........................................................ 245 8.2 Anexo II Protocolo pre , durante y post RTP ............................................... 247 8.3 Anexo III Consentimiento informado de la parte retrospectiva en castellano .......................................................................................................... 255 8.4 Anexo IV Consentimiento informado de la parte retrospectiva en galego . 262 8.5 Anexo V Consentimiento informado de los casos en castellano .................. 269 8.6 Anexo VI Consentimiento informado de los casos en galego ....................... 277 8.7 Anexo VII Consentimiento informado de los controles en castellano ........ 285 8.8 Anexo VIII Consentimiento informado de los controles en galego ............. 293 8.9 Anexo IX Capitulo: Radiotherapy and Chemotherapy Treatments in Head and Neck cancer patients-Protocol for Management Before, during and after RTP ................................................................................................... 301 8.10 Anexo X Articulo I: Dental management prior to radiation therapy in patients with head and neck cancer ............................................................... 337 8.11 Anexo XI Articulo II: State of Methylation and epigenome studies in some types of head and neck cancer .............................................................. 343 8.12 Anexo XII. Permisos para reproducir imágenes .......................................... 355 8.13 Anexo XIII. Material suplementario .............................................................. 358 PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 32 Gráfico 14 Análisis de la supervivencia de los pacientes en función de su estadío tumoral codificado .................................................................................... 138 Gráfico 15 Curva de supervivencia de los pacientes en relación con la variable fumador .................................................................................................... 139 Gráfico 16 Análisis de la supervivencia de los pacientes en base a la recurrencia de la enfermedad ...................................................................................... 140 Gráfico 17 Curva de supervivencia de la población estudiada en función de la localización tumoral ................................................................................. 141 Gráfico 18 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen MGMT pre-RTP ........................................................ 147 Gráfico 19 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen MGMT post-RTP....................................................... 148 Gráfico 20 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen DAPK1 pre-RTP ........................................................ 149 Gráfico 21 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen DAPK1 post-RTP ...................................................... 149 Gráfico 22 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen p16 pre-RTP ............................................................... 150 Gráfico 23 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen p16 post-RTP ............................................................. 151 Gráfico 24 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen CCND2 pre-RTP ....................................................... 152 Gráfico 25 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen CCND2 post-RTP ...................................................... 152 Gráfico 26 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen TIMP-3 pre-RTP ........................................................ 153 Grafico 27 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen TIMP-3 post-RTP ...................................................... 154 1 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 1. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 35 Las pautas actuales de tratamiento en el cáncer de cabeza y cuello implican el uso de radioterapia (RTP) y quimioterapia (QTP). La utilización de la RTP tiene una doble vertiente, por un lado una intención curativa, pero al mismo tiempo desencadena una serie de complicaciones que genera un gran impacto en la calidad de vida del paciente. Se necesita avanzar en la investigación de paneles de genes que desarrollan el cáncer de cabeza y cuello, ya que en la actualidad son muchos los pacientes que padecen esta enfermedad. Por otro lado, es necesario el control de estos pacientes durante todo el tratamiento e incluso hasta un año después del mismo, ya que es necesario que conozcan las precauciones que deben de tener y las complicaciones que puedan presentarse. La complicación más grave es la osteorradionecrosis (ORN) de los maxilares, principalmente asociadas a las extracciones previas y posteriores a la RTP, por lo que unas condiciones bucodentales óptimas en pacientes con cáncer de cabeza y cuello antes de iniciar la RTP aminorará las secuelas derivadas de dicho tratamiento. Por ello, justificamos esta tesis doctoral en la cual se analizará la prevalencia de los efectos secundarios de la RTP. Además nos centraremos en el estudio de los factores de riesgo tumorales, así como las complicaciones derivadas de la terapia utilizada. Además de estas consideraciones clínicas, profundizaremos en el conocimiento epigenético del tumor, para ello abordaremos el estudio de varios genes implicados en el ciclo celular, estudiando su perfil de metilación y si este sufrirá modificaciones como consecuencia de la terapia aplicada. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 36 Objetivo principal Estudiar la prevalencia de los efectos secundarios de la RTP y el patrón de metilación de determinados genes en pacientes sometidos a RTP con cáncer de cabeza y cuello. Objetivos secundarios 1. Cuantificar las necesidades de tratamiento bucodental previas y posteriores, así como durante el tratamiento con RTP en pacientes con cáncer de cabeza y cuello. 2. Estudiar el estado de salud bucodental de estos pacientes a largo plazo. 3. Evaluar las complicaciones de la RTP en pacientes con cáncer de cabeza y cuello, concretamente mucostis, radiodermitis, hiposialia, candidiasis y ORN, en diferentes momentos del tratamiento. 4. Determinar la prevalencia de ORN y su relación con parámetros clínicos. 5. Estudiar el patrón de metilación de los genes (p16, MGMT, CCND2, DAPK1, TIMP-3) antes y después de ser sometidos a RTP, comparándolos con lo que ocurre en pacientes sanos, consid.erados como controles. 6. Establecer si existe relación entre parámetros clínico-patológicos y el estado de metilación. 2 INTRODUCCIÓN 2. INTRODUCCIÓN 39 2.1 Carcinoma oral de Células Escamosas (COCE) 2.1.1 Concepto Existen múltiples definiciones, en la bibliografía, de lo que se conoce como cáncer de cabeza y cuello. Independientemente de la definición que elijamos, todas ellas hacen referencia al grupo de tumores malignos localizados en los senos paranasales, nasofaringe, orofaringe (amígdala, paladar blando, base de lengua), hipofaringe, laringe, cavidad oral (refiriéndose a ella como mucosa oral, encía, paladar duro, lengua y suelo de boca) y glándulas salivales (1). El término de cáncer oral se emplea, habitualmente en la literatura y en la práctica clínica diaria, como sinónimo de COCE. Siguiendo la última edición de la Clasificación Internacional de Enfermedades (ICD) de la Organización Mundial de la Salud (OMS), sugieren que las lesiones asentadas en la porción móvil de la lengua, suelo de boca, mucosa yugal, mucosa del reborde alveolar superior e inferior y paladar deben ser agrupadas bajo la denominación de cáncer oral, y que el cáncer de labio, orofaringe y de glándulas salivales deben ser analizados separadamente (2). El COCE (Ilustración 1) es la neoplasia maligna más frecuente de la cavidad oral, que se origina a partir del epitelio escamoso que recubre la cavidad oral, constituyendo el 90% de todos los cánceres de cabeza y cuello y el 3-4% de las neoplasias malignas (3-6). En cuanto a su crecimiento, comienza como un tumor localizado, para invadir en profundidad (en algunos casos) llegando con el tiempo a producir metástasis en los ganglios linfáticos cervicales próximos y a distancia. P AULA B OÑAR Á LVAREZ 40 Ilustración 1 Paciente con COCE en el suelo de la boca 2.1.2 Etiología La etiología del cáncer es realmente desconocida, aunque se sabe que es una patología con origen multifactorial. Los factores de riesgo por excelencia son el tabaco y el alcohol que, aunque son factores de riesgo independientes, tienen un efecto sinérgico, (7-9). Otros factores etiológicos serían, el virus de Epstein Bar, el virus del papiloma humano (VPH), la radiación ultravioleta en el cáncer de labio, infecciones, dieta pobre en frutas y vegetales, inmunodepresiones, influencia de una mala higiene oral y la presencia de factores genéticos. Los estudios epidemiológicos muestran que el riesgo de desarrollar cáncer oral es de cinco a nueves veces mayor para los fumadores que para los no fumadores, y este riesgo puede aumentar hasta 17 veces para los fumadores de 80 o más cigarrillos/diarios (8-13). Un dato alentador para los pacientes fumadores, es que el cese de este hábito, tras un periodo de 10 años, disminuye el riesgo de desarrollar un tumor, llegando a niveles cercanos a los de los no fumadores (14). 2. INTRODUCCIÓN 41 En este sentido, el tabaquismo es el responsable del 90% de los cánceres de la cavidad oral en hombres y del 60% en mujeres (15), probablemente porque era un hábito más extendido en el sexo masculino. Existen más de 30 carcinógenos en el humo inspirado del tabaco, dentro de los cuales, los más importantes son el benzopireno y las nitrosaminas específicas del tabaco, nitroso-nor-nicotina (NNN), nitrosopirrolidina, nitrosodimetilamina y 4- (metilnitrosamina)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK). En cuanto al mecanismo de acción de los carcinógenos, estos interfieren en la replicación del ADN produciendo, por tanto, un daño en la replicación de las células, incluyendo aquellas que intervienen en la respuesta inmune (16). En cuanto a la aparición de segundos tumores primarios y la persistencia del tabaco, es del 30% si continúan fumando y del 18% si cesan el hábito tabáquico (17,18). En algunas áreas geográficas existe otras formas de consumir tabaco sin combustión, ya sea en forma de “snuff” (tabaco fino molido) o de tabaco de mascar (quid de betel), ambas se han asociado al cáncer oral (19). Concretamente el consumo “quid de betel” se asocia a un incremento de riesgo de cáncer oral en la encía y en el suelo de la boca (17,20). En lo que respecta al alcohol, es el segundo factor de riesgo por excelencia. El riesgo de cáncer en pacientes bebedores es seis veces mayor que en no bebedores, y el riesgo de muerte por cáncer de orofaringe es cuatro veces mayor en los bebedores (17,21). El alcohol actúa provocando una irritación en la mucosa oral, aumentando la permeabilidad de la misma, permitiendo, así, el paso de otros agentes carcinógenos como el tabaco. Es importante recalcar que el riesgo de desarrollar un tumor oral pasa de 1, en los consumidores de < 25 gramos (g) de alcohol/ día, a 125 en los que consumen > 100 g/día. Los “licores oscuros” como el whisky, el ron añejo PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 48 3 años, mientras que entre el 60% y el 70% tendrán una recidiva locorregional y/o desarrollarán metástasis a distancia, lo que es, en última instancia, la causa principal de muerte en estos pacientes (53). Pese a estos antecedentes tan poco alentadores, la QTP, junto con la RTP y la cirugía, se asocia con una mayor supervivencia general en los pacientes con cáncer bucal y orofaríngeo. La QTP consiste en la administración de fármacos citotóxicos capaces de destruir e inhibir el crecimiento y la reproducción celular (incluidas las células malignas) (54). De todos ellos, los más empleados en los cánceres de cabeza y cuello son la bleomicina, el cisplatino, el metotrexato, el 5- fluoruracilo, la vinblastina y la ciclofosamida (55). La administración de QTP puede ser simple o combinada. El uso de fármacos aislados se mostró ineficaz en la inducción de respuestas completas o parciales significativas. Por ello, la tendencia actual es la poliquimioterapia, cuyos objetivos son afectar poblaciones celulares en diferentes fases del ciclo celular, utilizando la acción sinérgica de los fármacos, disminuyendo el desarrollo de resistencias a los mismos y promoviendo una mayor respuesta por dosis administrada (55). Entre las combinaciones más usadas destacan: a) cisplatino y 5-fluoracilo; b) cisplatino, 5- fluoracilo y taxol o c) cisplatino, bleomicina y metotrexato (56). Los citostáticos ofrecen mejores resultados en los tumores con una importante fracción de crecimiento y/o diseminación a distancia temprana o frecuente como por ejemplo los linfomas (90% de fracción de crecimiento). Éste no es el caso del carcinoma de células escamosas, (25% de fracción de 2. INTRODUCCIÓN 49 crecimiento), por lo que la QTP suele emplearse siempre asociada a otra modalidad terapéutica (57). La RTP puede aplicarse de forma intersticial (braquiterapia) o externa (teleterapia). La RTP externa es la forma clásica de administración, con la fuente de radiación alejada del organismo. Las fuentes de irradiación externa son el bajo voltaje (rayos X), supervoltaje (cobalto 60), megavoltaje (acelerador lineal) y el haz de electrones (fuente eléctrica), de los cuales los más empleados para la terapia de cabeza y cuello son el cobalto 60 y el acelerador lineal de partículas (58). La RTP convencional consiste en un dosis de 10 Grey (Gy) semanales, 2 Gy diarios durante 5 días y 2 días de descanso, generalmente repartidos en un período de 5 a 7 semanas (50). La RTP fraccionada permite aplicar una dosis total de radiación elevada en el tumor, respetando el tejido normal adyacente y disminuyendo, por tanto, la toxicidad. También condiciona la respuesta en los tejidos sanos y tumorales mediante la reparación de las lesiones, ya que el tejido normal repara mejor el ADN dañado, sobre todo a dosis bajas, que el tejido tumoral. Además favorece la reoxigenación de las células tumorales, aumentando su radiosensibilidad y la repoblación del tejido entre las fracciones, especialmente durante los descansos semanales, cuando la zona no es irradiada, reduciendo de ese modo los efectos tempranos, como mucositis y radiodermitis entre otros (59). La dosis de radiación va a depender de la localización y el tipo de tumor y de si la RTP se emplea sola o asociada a otras terapias. Cuando la RTP es el tratamiento de elección se suelen dar dosis entre los 60-80Gy, mientras que cuando es postquirúrgica se administran dosis de 50-60Gy (3). P AULA B OÑAR Á LVAREZ 50 La braquiterapia, por otro lado, es un método que usa radiaciones ionizantes, situando el material radioactivo en las proximidades o en el interior del tumor. Existen diferentes modalidades de braquiterapia, de las cuales la más empleada para los tumores de cabeza y cuello es la RTP intersticial. El Iridio 192 (Ir192) y Yodo 125 (I125) son las fuentes radiactivas más comunes en esta modalidad (55). Muchas son las secuelas que, generalmente, produce la RTP y que afectan, en gran medida, la calidad de vida del paciente. Las complicaciones que provocan a nivel de la esfera orofacial las podemos clasificar en agudas y tardías (60). Complicaciones agudas de la RTP 2.1.6.1 2.1.6.1.1 Mucositis Consiste en la reacción inflamatoria de la mucosa orofaríngea que aparece como resultado de los efectos citotóxicos de la RTP. La mucositis es dosis-dependiente, por lo tanto, desaparece con el cese de la agresión (61). Su primer signo es el eritema que aparece cuando se acumula una dosis de 10 Gy (primera semana) y persiste hasta unos 15 días después de la finalización de la RTP. El punto de máxima sintomatología se produce cuando se acumulan dosis de 60-70 Gy (62,63). Clínicamente la mucosa está eritematosa, edematosa por lo que puede ulcerarse y sobreinfectarse por hongos (62,64). El dolor que acompaña a la mucositis puede ser tan intenso, que altere la calidad de vida del paciente 2. INTRODUCCIÓN 51 llegando a limitar funciones bucales básicas como hablar, deglutir saliva o alimentarse (64). Esta mucositis (Ilustración 2) por radiación se puede clasificar en 4 grados según la intensidad de la afectación de la mucosa (5,65,66): Grado 1: ninguno; Grado 2: eritema; Grado 3: eritema, úlceras, pero capaz de ingerir sólidos; Grado 4: úlceras pero requieren dieta líquida, y Grado 5: imposible la alimentación por vía oral. Ilustración 2 Mucositis en Grado 3 en paciente tratado con RTP de cabeza y cuello 2.1.6.1.2 Riesgo de infecciones La RTP facilita el desarrollo de infecciones oportunistas, fundamentalmente por Cándidas, como consecuencia de la disminución de saliva, uso de prótesis dentales, higiene oral deficiente y la persistencia de hábitos como el consumo de alcohol y tabaco (67). Este tipo de infecciones suele desaparecer con antimicóticos de uso tópico, pero el paciente irradiado, con frecuencia, ha de recurrir a fármacos de uso sistémico más efectivos (68). PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 52 2.1.6.1.3 Radiodermitis Con este término, nos referimos a la toxicidad que sufren la piel y tejido celular subcutáneo, y se clasifica, en función de su severidad, en tres niveles. El eritema transitorio se produce por la congestión de los capilares dérmicos en las primeras 24 horas; con una dosis de 3 Gy es suficiente para desencadenarlo. Una dosis de 25 Gy va a producir una aceleración del proceso descamativo de la piel que se manifiesta como una disminución importante de su espesor, tornándose oscura y atrófica y descamándose, lo que se denomina Radiodermitis Seca. La dosis de 50-70 Gy va a ocasionar un eritema tardío, seguido de una necrosis superficial y la formación de costras cutáneas. Si estas lesiones progresan, pueden aparecer vesículas (Ilustración 3) que sangran con facilidad, lo que se denomina Radiodermitis Húmeda. Estas lesiones curan al finalizar el tratamiento de RTP, dejando unas cicatrices en la piel que pueden ser blanquecinas, escleróticas, telangiectásicas, quedando destruidos los bulbos pilosos y, en ocasiones, aparecen pigmentaciones (5). 2. INTRODUCCIÓN 53 Ilustración 3 Paciente que presenta Radiodermitis tras el tratamiento con RTP de cabeza y cuello 2.1.6.1.4 Alteraciones de las glándulas salivales La mayoría de los pacientes con cánceres de cabeza y cuello sometidos a RTP sufren una xerostomía o hipofunción salival (Ilustración 4). Suele aparecer en las primeras semanas de la radiación. En dosis bajas (menos de 30 Gy) se cree que el daño puede ser reversible, aunque en dosis más altas (más de 60-70 Gy) se produce xerostomía irreversible y permanente, debido a una degeneración significativa de los acinos que se ve reflejada en la inflamación concomitante y la fibrosis del intersticio. La hipofunción salival (flujo salival en reposo de menos de 0,2 ml por minuto o estimulado con un flujo de menos de 0,7 ml por minuto) es causada por el daño de la radiación ionizante directa en las células de las glándulas salivales (69). Es la secuela más persistente en los pacientes que reciben RTP de cabeza y cuello. Se caracteriza por cambios en la cantidad y calidad de la saliva (más viscosa y escasa), produciendo malestar oral y dolor, un mayor riesgo de caries dental, infección oral, dificultad para hablar, y disfagia, teniendo un efecto perjudicial en la calidad de vida del P AULA B OÑAR Á LVAREZ 54 paciente (70-72). La reducción del flujo salival también puede aumentar la susceptibilidad a la caries dental y comprometer la integridad de la mucosa (73). Ilustración 4 Lengua con aspecto áspero y rugoso provocado por la hipofunción salival 2.1.6.1.5 Alteraciones del gusto La alteración de la sensación de sabor se produce como resultado de la radiación directa en las papilas gustativas y receptores gustativos, así como, a los cambios en la saliva (74-76). Contribuye a la pérdida del apetito por lo que lo pacientes presentan una pérdida de peso. Aparece a los 15 días de comenzar con el tratamiento a partir de los 4 Gy y llega a su máximo esplendor al finalizar la RTP; en la mayoría de los casos, el gusto retorna gradualmente a sus niveles normales, o casi normales, un año post-RTP (77), aunque algunos pacientes pueden conservar una reducción residual del sabor (hipogeusia), daño permanente en la sensación (disgeusia) e incluso pérdida del gusto (ageusia) (78,79). 2. INTRODUCCIÓN 55 Complicaciones tardías de la RTP 2.1.6.2 2.1.6.2.1 Necrosis de los tejidos blandos Se produce una necrosis de los tejidos blandos caracterizada por una úlcera localizada en el tejido irradiado sin presencia de malignidad residual. Normalmente es una condición dolorosa y los tejidos presentan una coloración pálida y ausencia de flexibilidad (80). 2.1.6.2.2 Trismus Se caracteriza por una disminución de la apertura, debido a la contracción e incluso fibrosis de los músculos masticatorios y de la articulación temporomandibular (ATM). Aparece entre tres y seis meses post radiación (67) y puede conducir a problemas en la alimentación, la comunicación, la realización de higiene oral, la prótesis que usa, y en la realización de tratamientos dentales. 2.1.6.2.3 Osteorradionecrosis (ORN) La ORN (Ilustración 5) puede llegar a ser la complicación más grave del RTP (81). Se define como una zona de exposición ósea en un campo previamente irradiado, de al menos 6 semanas de evolución y en ausencia de recidiva tumoral (82). La ORN se origina como consecuencia de una reducción de la vascularidad del periodonto, periostio y hueso que ocasiona un tejido hipovascular, hipocelular e hipóxico, donde la capacidad de reparación y regeneración ósea está severamente comprometida (83-85). Puede ser asintomática o cursar con dolor, disestesia o anestesia en función de su relación con el nervio dentario. Los pacientes refieren halitosis, trismus, disgeusia, impactación de alimentos en la lesión y dificultad en la masticación, deglución y fonación (80). En la mayoría de PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 56 los casos la condición es crónica, progresa gradualmente y se vuelve más extensa y dolorosa (83,86). Existen unos factores de riesgo que pueden desencadenar la ORN, los cuales están relacionados con el tumor, con el paciente o con el tratamiento con la RTP. En cuanto a los factores que depende del paciente nos centramos fundamentalmente en la realización de extracciones después de la RTP (post-RTP), de hecho, la ORN sin cirugía previa ha demostrado ser extremadamente rara, con una incidencia del 2,7% después de 5 años. Otros factores determinantes son la mala higiene oral, la irradiación previa del campo (87) y la presencia de periodontitis, además de malos hábitos como el tabaco y el alcohol. Los factores de riesgo dependiente del tratamiento con RTP se refiere a la dosis administrada, a su fraccionamiento, el tipo de RTP y la zona irradiada. Por último, los factores dependientes del tumor abarcan la localización anatómica, la proximidad o el grado de implicación de las estructuras óseas vecinas, y la etapa y el tamaño del tumor. Todos estos factores se deben de tener en cuenta porque aumentan el riesgo de ORN para así intentar prevenirla (88,89). La mayoría de los casos de ORN se producen en la mandíbula, donde la vascularización es deficiente y la densidad ósea alta. Las manifestaciones clínicas de ORN pueden incluir dolor, fístulas orofaciales, hueso necrótico expuesto, fractura patológica y supuración (90-92). Un tercio de los casos de ORN se producen espontáneamente, aunque la mayoría de los casos suceden por exodoncias de dientes durante la RTP o por un tiempo insuficiente de curación después de extracciones antes de la RTP (pre-RTP). Según Starcke et al., Murray et al., y Makkonen et al, cuando se realizan correctamente las exodoncias pre-RTP y se espera el 2. INTRODUCCIÓN 57 tiempo necesario, no se ve un aumento significativo del riesgo de ORN (93-95). La incidencia de ORN es dos veces mayor en pacientes dentados, aunque la mala higiene bucal y el uso continuado de alcohol y tabaco también pueden conducir a su rápida aparición (96), en la literatura hemos encontrado una indicencia y prevalencia entorno al 5-10% (97,98). Una mayor incidencia de ORN se observa después de recibir dosis superior a los 65 Gy, dependiendo del fraccionamiento de radiación, tratamiento con QTP o cirugía en el campo irradiado (99). Ilustración 5 Paciente que presenta ORN en cuarto cuadrante tras realizarle extracciones dentales después del tratamiento con RTP 2.1.6.2.4 Caries post-irradiación Son muy frecuentes las caries post-irradiación (Ilustración 6), que se inician a los tres meses de finalizar la RTP. Se produce un desmoronamiento y desprendimiento de los prismas del esmalte que afectan, fundamentalmente, a los bordes incisales, cúspides y región cervical de los dientes (5). Éste es el resultado de una alteración cuantitativa y cualitativa de la saliva, con una disminución de su capacidad tampón que favorece el desarrollo de una flora bacteriana acidógena y PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 64 en cada ciclo de división celular. La mayoría de estas proteínas que transmiten la señal de crecimiento a partir de la membrana hacia el núcleo, son codificadas por oncogenes. Las mutaciones en estos oncogenes pueden estimular la proliferación excesiva de los queratinocitos en el cáncer oral (127). 2.2.2 Oncogénes Las células cancerosas derivan de una sola célula que ha acumulado mutaciones a lo largo del tiempo (128). Las células de los organismos multicelulares están en reposo en ausencia de estímulos y las mutaciones ocurren en genes que controlan la proliferación y/o el ciclo celular, por lo que ha llevado a que los investigadores busquen las causas del cáncer dentro de la célula y en especial, mutaciones en los llamados oncogénes y genes supresores de tumores (129). Los protooncogénes son secuencias génicas que codifican las proteínas que controlan el crecimiento y la diferenciación celular (106). La mutación o la expresión anormal de estos protooncogénes conducen a la transformación maligna, por lo que se denominan oncogénes (130). Según la función de sus productos proteicos, los oncogénes se pueden dividir en: factores de crecimiento, receptores de membrana, mensajeros citoplasmáticos y factores de transcripción (131). Sidransky, en 1995, clasificó a los oncogénes en 5 grupos (132): I. Factores de crecimiento y receptores de los mismos: Hst-1, int-2, EGFR/erbB, C-ERBb-2/Her-2, sis. II. Transductores de señales intracelulares: Ras, Raf, STAT-3. 2. INTRODUCCIÓN 65 III. Factores de transcripción: Myc, Fos, Jun, C-myc. IV. Reguladores del ciclo celular: Ciclina D1. V. Inhibidores de la apoptosis: Bcl-2, Bax. Varios oncogenes han sido implicados en la carcinogénesis oral. La expresión aberrante del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR / c-erb 1) y CCND1/ciclina D1 y miembros de la familia ras, cmyc, int-2, hst-1, PRAD-q, y BCL-1 contribuye al desarrollo del cáncer oral (133). 2.2.3 Principales genes supresores de tumores Los oncogénes no son suficientes para causar cáncer oral. El evento crucial en la transformación de una célula premaligna a una célula maligna es la inactivación de reguladores negativos celulares-genes supresores tumorales, (GST), que provoca la incapacidad de respuesta a los mecanismos de control que regulan la división celular (134); se considera este proceso un evento importante que conduce al desarrollo de la malignidad. Los genes supresores de tumores a menudo son inactivados por mutaciones puntuales, delecciones y reordenamientos en ambas copias de genes (135-137). Gen Rb El gen del Rb o proteína Rb es abundante en el núcleo de las células de los mamíferos y se considera el primer gen supresor de tumores conocido (138). Reside en 200 kilobase (kb) de ADN, en el cromosoma 13 y concretamente en la banda 14 y está formado de 27 exones, su proteína está localizada en el núcleo celular y pesa de 10 a 110 kilodalton (kDa). Esta proteína se encuentra en las células en reposo, en fase G0 o G1, PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 66 formando un complejo con el factor de trascripción llamado E2F, (que actúa inactivándolo); éste regula la activación transcripcional de varios genes virales y celulares, el cual a su vez regula enzimas que sintetizan nucleótidos y polimerizan el DNA (139). En G1 o G0, la proteína Rb es fosforilada por las kinasas kdc4 y 6- ciclina; permite la liberación de E2F, es así, que se libera la represión mantenida por el complejo E2F-Rb y los genes requeridos para la fase S y M se activan (Ilustración 8). La pRb fosforilada se asocia principalmente con las kdc 4,6, ciclina D1,2,3, aunque dentro del ciclo existen complejos Rb-kdc2 y ciclinas E (120,140-143). La ciclina D1 es una proteína inestable fundamental para la progresión de G1 mediante la activación del complejo CDK 4/6 que lleva a la fosforilación de la proteína pRb. La fosforilación de la proteína pRb es esencial para la continuación del ciclo celular. Si pRb no está fosforilada se bloquea el ciclo celular. Se ha encontrado sobreexpresión de Ciclina D en carcinomas orales (26,144-145), asimismo, Koontongkaew et al. ha encontrado sobreexpresión de la proteína pRb en un 58,49% de los carcinomas estudiados (146). Es importante tener en cuenta que la producción excesiva de D1 dispara la entrada temprana de la célula a la fase S, por lo tanto, en determinado momento D1 puede inactivar la función control de la proteína Rb y permitir a la célula el paso a S. La actividad de la ciclina D1 es inhibida por diversos genes supresores de tumores, entre ellos P16, P21, y P27 (127). 2. INTRODUCCIÓN 67 Ilustración 8 Regulación del ciclo celular mediado por Rb y E2F. La fosforilación de la Rb por el complejo kcd4/ciclina D conlleva a la separación de Rb- E2F. Permitido por la revista MedUNAB (110) P53 El gen p53 en humanos reside en 20 kb de DNA del 7p13.1, está compuesto de 11 exones que producen ARNm de 2.2-2,5 kb y se expresan en casi todos los tipos celulares. La proteína del gen p53 está formada por 393 residuos de aminoácidos y es una fosfoproteína nuclear (130). La proteína p53 es llamada el “guardián del genoma”, se localiza en el núcleo y es una proteína lábil e inestable; parece estar asociada con múltiples funciones biológicas, entre ellas el crecimiento de la célula, la progresión o detención del ciclo celular, senescencia y apoptosis (147-149). Las mutaciones en p53, generan una síntesis anormal de proteínas. Una proteína p53 mutada tiende a estabilizarse y acumularse en el núcleo, perdiendo toda capacidad supresora de crecimiento celular, por lo que, la consecuencia del incremento de p53 es la detención del ciclo celular en G1, actuando mientras los mecanismo de reparación del ADN (138). PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 68 Si la reparación del ADN es satisfactoria, p53, activará a un gene denominado MDM2, cuyo producto se une e inhibe a la propia p53, levantando así el bloqueo celular (150); por el contrario, si los daños en el ADN son muy extensos y no puede ser reparado, p53 puede inducir el inicio de muerte celular fisiológica (apoptosis), activando los genes promotores de apoptosis, de ahí el nombre de guardián del genoma, dado que previene la inestabilidad genómica (106). El bloqueo celular se consigue mediante la inducción de la proteína p21, inhibidora de las KdC. La p21 bloquea la transición G1-S y bloquea también la replicación del ADN en la fase S del ciclo celular (26,144). P53 se une al ADN en sitios específicos como factor de transcripción. Así, incrementa la transcripción de CKI p21, el cual inhibe a los complejos ciclina A y D con sus repectivos KdCs, bloquea la actividad de KdCs evitando la hiperfosforilación de pRb y por tanto, la activación de genes de fase S (151,152). Por otro lado, el gen p53 también bloquea la angiogénesis, favorecedora del desarrollo y diseminación tumoral (138). La pérdida de la función de p53 está bien documentada en cánceres orales, y se han informado mutaciones de p53 en más del 60% de los COCE (153). La acumulación del p53 mutado en el epitelio oral maligno ha sido demostrada por varios estudios inmunohistoquímicos (154,155). El p53 elevado en cánceres orales se correlaciona con el tabaquismo intenso pero no con la edad del paciente (156-158). Sin embargo, los pacientes más jóvenes muestran acumulación de p53 durante la progresión maligna (159). Por último, p53 se ha utilizado como un marcador de pronóstico para la terapia actual contra el cáncer de cabeza y cuello (160-163). 2. INTRODUCCIÓN 69 Gen p73 El gen p73 en condiciones adecuadas, de igual manera que el gen p53, puede detener el ciclo celular y provocar la apoptosis (150). 2.2.4 Carcinogénesis Ya indicamos previamente que la carcinogénesis es el mecanismo a través del cual se desarrolla una neoplasia maligna y que desconocemos muchos de los factores implicados en la misma (164,165); sin embargo, sabemos que el silenciamiento de genes supresores de tumores es fundamental para el desarrollo del cáncer. Este silenciamiento se produce, entre otros, por mecanismos epigenéticos, concretamente las modificaciones post-translacionales de las histonas, principalmente los cambios mediante fosforilación, cambios en la deacetilación y en estatus de ubiquitinización (166-170). El grupo metilo (CH 3 ) se añade a los nucleótidos de citosina por medio de la enzima ADN-metiltransferasa, inhibiendo con ello la expresión del gen. Algunos de los genes que con frecuencia son metilados son encargados del crecimiento celular y la reparación del ADN (171). (Ilustración 9). Ilustración 9 Inactivación epigenética de un promotor del gen de reparación del ADN .Permitido por la revista Journal of Molecullar Cell Biology (172) PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 70 Según Larsen et al., existen aproximadamente 45.000 islas CpG, de unos 500 pares de bases, y no están distribuidas casualmente por todo el genoma, apareciendo con mayor frecuencia en la parte promotora de las regiones de genes específicos (173,174). La mayoría de las islas CpG están metiladas para prevenir la inestabilidad cromosómica; además un porcentaje muy alto de estas islas CpG permanecen sin modificaciones durante el desarrollo y en tejidos diferenciados (175). El código de metilación del ADN debe leerse por celda; la información almacenada por metilación de las islas CpG es en parte interpretada por proteínas de unión a metil-CpG (MBD). Las MBD son importantes "traductores" entre la metilación del ADN y los genes modificadores de histonas que establecen un ambiente de cromatina transcripcionalmente inactivo. Esta familia de proteínas consta de cinco miembros bien caracterizados (MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 y MBD4) (176). Las proteínas MBD se asocian con promotores isla CpG hipermetilados de genes supresores tumorales y su silenciamiento transcripcional (177,178). El descubrimiento de que MeCP2 reprime la transcripción de ADN metilado mediante el reclutamiento de un complejo que contiene histona deacetilada estableció por primera vez una conexión mecánica entre la metilación del ADN y la represión transcripcional mediante la modificación de la cromatina (179). La metilación de ADN puede ser utilizado como posible biomarcador para el diagnóstico precoz, así como para la clasificación, el pronóstico y el tratamiento del cáncer. El perfil de metilación de promotores de genes es diferente para cada tipo de tumor, permitiendo la identificación de patrones de metilación específica de tumores (180). Los genes más frecuentemente 2. INTRODUCCIÓN 71 metilados y silenciados en las células del cáncer residen en regiones cromosómicas que muestran pérdida de heterocigosidad (181). Existen varios factores que podrían desencadenar la metilación del ADN como la radiación, el tabaco, stress, dieta, hormonas (como el estradiol), cadmio, arsénico, níquel, por lo que es importante minimizarlos, ya que juegan un papel importante en la desarrollo del cáncer (182-184). 2.3 Panel de metilación en el cáncer de cabeza y cuello Los genes que se encuentran metilados en el carcinoma de cabeza y cuello cubren una amplia gama de procesos celulares, incluido el control del ciclo celular (p16, p15), apoptosis (p14, DAPK1, p73 y RASSF1A), Wnt señalización (APC, WIF1, RUNX3), adhesión célula-célula (E- cadherina) y reparación del ADN (MGMT y hMLH1) (185-188). La búsqueda de biomarcadores para evaluar y medir el estado de los procesos normales y patológicos en biología celular y su respuesta al tratamiento son de suma importancia, por tanto, el tratar de establecer un patrón de metilación para la identificación de individuos en las etapas iniciales del cáncer, así como para estratificar a los pacientes, de acuerdo con el pronóstico del tumor y la respuesta a los perfiles de la terapia, es de suma importancia (189). p16 /CDKN2A/ INK4A p16 se localiza en el cromosoma 9p21, inhibe la detención del ciclo celular quinasa dependiente de ciclina 4 y 6, y es vital para el mantenimiento de la proteína del Rb en su estado no fosforilado activo. Las PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 72 alteraciones genéticas de p16 conducen a la pérdida de control del punto de restricción en la fase G1 del ciclo celular y favorecen la transformación celular (190). La incidencia de metilación oscila entre el 23% al 76% tal y como podemos observar en la tabla 4 (191-197). La metilación de p16 se asocia con un aumento del tamaño tumoral, estadíos más avanzados (estadíos III y IV), metástasis ganglionares, mayor riesgo de recurrencia de la enfermedad y un mal pronóstico (198-200). Gen Año Referencias Nº de casos % Metilación p16 1995 Merlo et al.(201) ND ND 1997 Naggar et al.(202) ND ND 2000 Sánchez-Céspedes et al.(203) 95 27% 2001 Nakahara et al.(194) Hibi et al.(204) Esteller et al.(180) Rosas et al.(205) 32 31 ND 30 50% 23% ND 47% 2002 Huang et al.(193) Ogi et al.(195) Hasegawa et al.(206) 48 96 80 42% 29% 32% 2003 López et al.(207) Viswanathan et al.(191) Ai L et al.(208) ND 99 100 44% 23% 27% 2004 Kulkarni et al(192) Maruya et al.(196) 60 32 67% 33% 2005 Ishida et al.(199) Tran et al.(209) Puri et al.(210) 49 27 62 35% 63% 36% 2007 Righini et al.(211) Calmon et al.(212) Sengupta et al.(213) 90 43 99 29% 63% 23% 2008 Shaw et al(214) 79 28% 2009 Ohta et al.(215) De Shutter et al.(216) Taioli et al.(217) Supic et al.(187) 44 46 80 77 64% 5% 11,5% 58% 2014 Pierini et al.(218) 97 47,4% Tabla 4 Resumen de los trabajos publicados donde se muestran las alteraciones epigenéticas en p16 2. INTRODUCCIÓN 73 P15/ CDKN1A/ INK4B El inhibidor de quinasa dependiente de ciclina se localiza en una región en el cromosoma 9p21 (219). Actúa inhibiendo el crecimiento celular mediante la prevención de la progresión del ciclo celular durante la fase G1; codifica un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina, y forma un complejo con Cdk4 / Cdk6 (220). Su porcentaje de metilación varía entre 9% al 23% (191,195,211,213). Takeshima et al. encontró que los tejidos sanos y tumorales adyacentes no presentan típicamente señales de metilación para p15 (221), sin embargo, Yeh et al. en su estudio encontró que entre el 9 y 28% de los tejidos examinados con COCE presentaban metilación del gen p15 (222). P53 El gen P53, se localizado en el cromosoma 17p13. Como se indicó previamente, al alterar la función de P53, se altera la capacidad de las células de responder al estrés o daño, lo que produce una inestabilidad en el genoma. Este gen desempeña un papel en la reparación del ADN, progresión del ciclo celular, la diferenciación celular, y la apoptosis, siendo su función principal ser guardián del genoma. Este gen es el que con más frecuencia se encuentra metilado, el rango de metilación va del 25% a 69% (223-226). Los cambios en p53 surgen, entre otros, de la combinación de exposición al tabaco y alcohol (227). Señalización de Wnt La vía de señalización Wnt es una compleja red de proteínas con un papel relevante tanto en la embriogénesis como en el desarrollo tumoral. Implicados en esta vía encontramos distintos tipos de genes como, E- PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 80 desarrollo de un segundo tumor primario o de metástasis a distancia. Sun et al. (255) mostró la detección de metilación TIMP-3 en muestras de enjuagues salivales recogidas en diagnósticos asociados con la supervivencia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello sin recidivas locales. La detección de la metilación de TIMP-3 en el enjuague salival recolectado, no sólo en el momento del diagnóstico, sino también seis meses después del último tratamiento curativo es un factor pronóstico independiente para los pacientes con cáncer de cabeza y cuello (256). 2.3.1 Detección de la metilación Varios trabajos han estudiado la presencia de metilación en los fluidos corporales. La capacidad de determinar estados de metilación en tumores primarios mediante saliva y suero podría ofrecer la posibilidad de crear paneles de genes de metilación para detectar el cáncer (203,205,257), utilizando métodos poco agresivos, incluso incruentos (caso de la saliva) para el paciente. Clásicamente la fuente de la que partimos era tisular, sin embargo cada día está más en auge, nuevas fuentes como la obtención desde Suero /Plasma o biopsia líquida, que se caracteriza por ser un método prometedor, ya que es menos invasiva que la biopsia clásica y que parece ser eficaz para el seguimiento de los pacientes (258). Si bien hay estudios de metilación génica, utilizando fluídos como la orina para otros tipos tumorales, no hemos encontrado datos en pacientes con tumores de cabeza y cuello. En el caso de los tumores de cabeza y cuello, la citología exofoliativa, como fuente de obtención celular, sigue siendo un método eficaz y sencillo, ya que es una técnica mínimamente invasiva, el uso del cepillo permite 2. INTRODUCCIÓN 81 recoger todas las células del epitelio (259). Longo et al. mostró, que recogiendo muestras de mucosa oral tras un cepillado de la mucosa intraoral, era capaz de detectar la metilación de genes, en concreto en un estudio de 96 pacientes con COCE encontraron los siguientes porcentajes de metilación CCNA1 (60,4%), DCC (54,2%), y TIMP-3 (35,4%) (259). Múltiples estudios ha valorado y detectado la presencia de la metilación de los promotores génicos tras enjuagues salivales (205,211,256,260). Es una técnica prometedora para el seguimiento y la detección precoz de recidivas (211). El grupo de Rosas et al., demostró por primera vez la posibilidad de detectar metilación de genes utilizando la saliva del paciente. Este estudio evaluó la presencia de metilación en la región promotora de los genes implicados en la supresión tumoral, la metástasis tumoral y la reparación del ADN, como CDKN2A / p16, MGMT y DAPK1. Se evaluaron muestras pareadas de tumor y saliva de pacientes con cáncer de cabeza y cuello para verificar si los cambios encontrados en los tumores también podrían detectarse en la saliva, ya que este fluído corporal contiene células de la mucosa oral y la faringe (205), por otro lado, López et al. valoró la eficacia del estudio de la metilación de los genes en enjuagues orales, observando metilación de p16, p14 y MGMT en el 44%, 12% y 56% de las muestras orales, respectivamente (207). 2.3.2 Correlación de la metilación con la progresión y la malignización El estudio del estado de metilación en el carcinoma de cabeza y cuello tiene un gran potencial para la detección precoz, seguimiento y tratamiento. Existe una correlación entre la metilación y la gravedad de la enfermedad y metástasis (216,261,262). PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 82 La metilación del promtor DAPK1 se correlaciona con estadíos avanzados y la presencia de metástasis (195,203). Sanchez-Cespedes et al., en su estudio, encontró que los genes MGMT y DAPK1 fueron los promotores que con más frecuencia se metilaban en los tumores de orofaringe, DAPK1 se relacionaba con estadíos avanzados y metástasis ganglionares, concretamente 15 pacientes (93%) con metilación del gen tenían afectación de los ganglios linfáticos en el momento del diagnóstico, representando un papel importante en la diseminación tumoral. Todavía no se ha podido identificar la relación entre la metilación de hMLH1 y estadíos clínicos. Sin embargo, Tzao et al. describió la relación entre la metilación y la supresión de la expresión de hMLH1 en estadíos clínicos tempranos en el cáncer de esófago, lo que sugiere que la pérdida de proteína hMLH1 por metilación ocurre en fases tempranas de la carcinogénesis (263). Así mismo Gonzalez Ramirez et al. en su estudio reafirma que la metilación del promotor de hMLH1 es un evento temprano que ocurre en el cáncer oral, y lo ratifica en un estudio de casos y controles, donde en 50 pacientes de población mexicana y 200 muestras de control de individuos sanos, encontraron que el promotor de hMLH1 estaba metilado en 38 (76%) pacientes con COCE; el estudio mostró una alta frecuencia de casos de metilación con expresión negativa para la proteína hMLH1 correspondiente a una clínica temprana de COCE (264). En cuanto al silenciamiento epigenético de p16 y p15 juega un papel importante en el desarrollo temprano del cáncer de cabeza y cuello y se correlaciona con un peor pronóstico (265,266). En cuanto a p16 se puede utilizar como un biomarcador de baja supervivencia y metástasis (186, 267). 2. INTRODUCCIÓN 83 p16 puede usarse como biomarcador para predecir la transformación maligna, ya que la metilación de este gen se asocia con metástasis y una supervivencia general deficiente en pacientes con COCE (267). Aunque los tejidos normales sanos no muestran signos de metilación de p16, los tejidos normales de pacientes fumadores que no presentan COCE a menudo demuestran la metilación de este gen (268), sugiriendo que la metilación de p16 puede ser un evento muy temprano en el desarrollo de COCE (268). Por otro lado, en pacientes con leucoplasia, condición precancerosa, tras realizar el enjuague oral, se observó metilación de p16 en el 44% de los pacientes y la metilación aumentó con el estadío de la enfermedad (207). La metilación del gen p16 se correlacionó con la progresión maligna (269). Además de predecir la transformación maligna, la metilación p16 se relacionó con la recurrencia local del COCE (186). Para identificar el riesgo individual de un paciente para la recurrencia de COCE, puede ser útil evaluar algo más que el estado de metilación p16 de su tejido tumoral. Un estudio evaluó la efectividad de las pruebas para la metilación del promotor p16 en los tejidos tumorales y en los márgenes quirúrgicos. Se observó metilación del promotor de p16 en el 87% de los tejidos del COCE de la lengua. Pero, lo que es más importante, los pacientes con márgenes quirúrgicos, histológicamente, libres de tumor y p16 metilado tenían un riesgo seis veces mayor de recidiva local, en comparación con los pacientes con márgenes negativos y libres de tumor histológico (270). El silenciamiento del gen RASSF1A está asociado a tumores agresivos y una supervivencia baja (241). La metilación de MGMT es muy elevada en casos de displasia de la mucosa, con lo que se presenta en las fases tempranas de la carcinogénesis PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 84 (238). Kordi-Tamandani et al., Taioli et al., y Shaw et al., demostraron que la metilación MGMT podría considerarse un marcador de baja supervivencia del cáncer de cabeza y cuello (214,217,236). Sánchez-céspedes et al. y Ha pK et al. demostraron que las proteínas que controlan la apoptosis tales como DAPK1 y E-cadherina pueden aumentar la probabilidad de metástasis y tienen un papel importante en el pronóstico del cáncer (174,203). La metilación de E-cadherina tiene su principal acción en el pronóstico del cáncer (187,206,233). Curiosamente, para el cáncer de cabeza y cuello, se ha informado una correlación entre la metilación de DAPK1 y la presencia de ganglios linfáticos metastásicos (203). El silenciamiento epigenético de los genes MGMT, p16 y DAPK1 implican alteraciones en el proceso de reparación del ADN, el ciclo celular y los procesos relacionados con la metástasis, respectivamente (174). Por otro lado un factor pronóstico favorable es la detección de la metilación de TIMP-3 en el enjuague salival recolectado, no sólo en el momento del diagnóstico, sino también seis meses después del último tratamiento curativo (256). 3 MATERIAL Y MÉTODOS 3. MATERIAL Y MÉTODOS 87 3.1 Tipo de estudio Nuestro trabajo está compuesto de dos partes, la primera parte se trata de un estudio retrospectivo y la segunda parte de un estudio de casos y controles captados prospectivamente. La primera parte se trata de un estudio retrospectivo en 83 pacientes con diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello, donde se valorará su manejo antes, durante y post-RTP. Posteriormente, en la segunda fase de nuestro trabajo se procedió a realizar un estudio de casos y controles en 78 pacientes diagnosticados de cáncer de cabeza y cuello, que iban a recibir tratamiento de RTP y donde se estudiará el patrón de metilación. En la parte retrospectiva, se estudiaron 83 pacientes, concretamente se revisaron las historias clínicas de los pacientes diagnósticados con cáncer de cabeza y cuello que acudían al Máster de Medicina oral, Cirugía Oral e Implantología de la Universidad de Santiago de Compostela, entre Octubre de 2013 y Octubre de 2016; cuyos criterios de inclusión eran que estuviesen diagnosticados de cáncer de cabeza y cuello y tratados con RTP, siendo mayores de 18 años y excluyendo a los pacientes que habían recibido previamente RTP de cabeza y cuello y los pacientes sometidos a irradiación corporal total. En el estudio de casos y controles, todas las muestras, tanto casos como controles, fueron obtenidas de pacientes que acudían al Máster de Medicina oral, Cirugía Oral e Implantología de la Universidad de Santiago de Compostela, concretamente desde Octubre de 2013 hasta Septiembre de 2015. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 88 El número de casos fue de 78 pacientes y los criterios de inclusión fueron pacientes diagnosticados de cáncer de cabeza y cuello; cuyo tratamiento fue RTP de cabeza y cuello, siendo mayores de 18 años, quedando excluidos aquellos que habían recibido previamente RTP de cabeza y cuello y los sometidos a irradiación corporal total. El grupo control estaba formado por 23 pacientes que acudieron para su atención clínica al máster antes referido. En este caso los criterios de inclusión fueron pacientes sanos, mayores de edad y apareados por edad, descartándose aquellos que presenten enfermedad sistémica o patología de la cavidad oral. Todos los pacientes, tanto en la fase retrospectiva como en el grupo de casos y controles atendidos en el Máster de Medicina oral, Cirugía Oral e Implantología firmaron el correspondiente consentimiento informado para participar en el estudio. Los consentimientos estaban disponibles en gallego y castellano. Este estudio ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Ref. 2014/304 (Anexo I) y sigue el código ético de Helsinki. 3.2 Obtención de las muestras del estudio casos-controles De todos los pacientes, tanto casos como controles, se hizo la recogida de células de la mucosa oral con la finalidad de obtener material genético. Para ello, se realizó un enjuague con solución de clorhexidina al 0.12 % sin alcohol (10 ml), una hora después del último cepillado, durante un periodo de 5 minutos. El material obtenido fue depositado inmediatamente en un tubo estéril de 15 ml, conservándose a -80ºC hasta el momento de ser analizado. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 89 3.3 Selección de los genes a estudiar en el estudio casoscontroles Para estudiar el patrón de metilación, tanto en casos como en controles, se elaboró un panel de genes. Los genes seleccionados fueron DAPK1, MGMT, TIMP-3, p16, y CCND2. Para la selección de genes que constituyen dicho panel, nos hemos basado, tomando como referencia fuentes bibliográficas, en aquellos que están implicados en diferentes fases del ciclo celular, con el propósito de no centrarnos sólo en un punto sino de abarcar diferentes momentos por los que pasa la célula y cómo estos se pueden ver afectados por la RTP. 3.4 Variables Clínicas Para la obtención de las variables se hizo, previo consentimiento informado, la revisión de las historias clínicas que figuran en el archivo del Máster de Medicina oral, Cirugía Oral e Implantología de la Universidad de Santiago de Compostela. De cada una de las historias clínicas se recogieron las siguientes variables que se muestran a continuación. Hemos dividido las variables en función del momento de la RTP, es decir antes, durante y después. a) Variables antes de someterse a RTP Sexo (Hombre/Mujer), edad, tratamiento con QTP (si/no), estadío (T1/T2/T3/T4), T (T1/T2/T3/T4,Tx), N (N0/N1/N2/Nx), M (M0/M1/Mx), sesiones de RTP, tipo de tumor (COCE/otros), localización (lengua/ supraglotis/paladar duro/epiglotis/laringe/labio/faringe/cavum/seno piriforme/ PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 96 radiación. Por lo que en cada visita solemos hacer las siguientes mediciones (Anexo II): 1. Grado de mucositis. 2. Grado de radiodermitis. 3. Grado de higiene oral. 4. Presencia de ORN. 5. Eliminar posibles roces si tiene alguna prótesis removible o completa. 6. Estado bucodental e insistir en instrucciones en higiene oral. 7. Cantidad de saliva mediante el TSG-I y el TSG-II. 8. Cultivo a la mitad del tratamiento y al finalizar. Durante el tratamiento con RTP y hasta 18 meses después no se podrá realizar ninguna técnica quirúrgica en estos pacientes, y si se tiene que realizar tratamiento endodónticos, no sobrepasar el ápice dental (73). Se aconsejan movimientos mandibulares y ejercicios orales para la prevención del trismus y así mantener la máxima apertura. Debemos seguir insistiendo en las instrucciones de higiene oral, que comentábamos en el apartado de manejo pre-RTP, para prevenir la aparición de caries rampantes; como estos pacientes siente bastante dolor en la cavidad oral podemos aconsejar un cepillo blando para que no le irrite demasiado a la hora de la técnica del cepillado, además de una dieta blanda que no irrite las mucosas y anticariogénica. 3.5.3 Después de la RTP La revisión de los pacientes tras el tratamiento con RTP, se hizo en 5 tiempos: 1,3,6,9,12 meses. A partir de entonces, se revisan anualmente. 3. MATERIAL Y MÉTODOS 97 En cada una de las revisiones se valora el estado oral del paciente para establecer las necesidades de tratamiento realizando nuevamente las siguientes exploraciones: 1. Odontograma con la situación actual despues de recibir RTP, se valora el estado dental y periodontal. 2. Valoración de higiene oral: Indice de Silnessloe (271). Reforzarla y seguir efectuando las fluorizaciones. 3. Se valora el estado de la función salival cuantitativamente mediante TSG, tanto TSG-I, como TSG-II, siguiendo la técnica descrita por López- Jornet (Test de Schrimer oral) (272). 4. Se realiza un cultivo dorso lingual para el aislamiento y la identificación de especies de cándida. Se valora la forma clínica de candidiasis (subclínica, eritematosa, pseudomembranosa). 5. Se valora la mucositis y la radiodermitis residual. 6. Se solicita una nueva OPG 12 meses después de haber finalizado la RTP. 7. Evitar prótesis completa o removible hasta 6 meses post-RTP, y es imprescindible un control semanal para evitar el roce de las mismas y añadir siempre un rebase blando. 8. Realizar ejercicios orales para mejorar el grado de apertura bucal 9. Para realizar las extracciones post-RTP, se siguieron los criterios de Sulaiman y Jansma et al. (274,275). Es necesario demorar toda cirugía 18 meses post-RTP para disminuir el riesgo y seguir las siguientes recomendaciones: • Enjuague con colutorio antiséptico: digluconato de clorhexidina al 0,12%, 1 minuto. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 98 • Técnica anestésica: Anestesia sin vasoconstrictor: Mepivacaína al 2% (Scandinibsa®, Inibsa®) y Bloqueo troncular, anestesia infiltrativa, nunca anestesia intraligamentosa. • Mínimo trauma. • Alveolectomía, regularización del proceso alveolar con instrumental no rotatorio. • Cierre primario, con realización de colgajos mucoperiósticos. • Sutura no reabsorbible con seda 3.0 • Siempre profilaxis antibiótica (Amoxicilina 750mg 1/8horas/10 días, en caso de alergia a la penicilina se recetó la asociación de espiramicina y metronidazol (Rhodogil®), 2 cada 8 horas durante 10días). • Tratamiento postoperatorio: analgésico-antiinflamatorio (Ibuprofeno 600mg) y colutorio antiséptico de digluconato de clorhexidina al 0’12%, además del antibiótico. • Espaciar las exodoncias en el tiempo. 10. Inspeccion minuciosa de la cavidad oral para diagnosticar precozmente las recidivas. 11. Valoración de la ORN. 3.6 Protocolo de análisis de las muestras 3.6.1 Extracción del ADN de las muestras El material obtenido de la toma de muestras se sometió a centrifugación a 4º, 1200 rpm en la propia clorhexidina, para luego hacer un lavado con H20 libre de nucleasas y así conseguir un pellet celular. Para la obtención del material nucleico se utilizó el kit Puregene Core A (Quiagen ®) según 3. MATERIAL Y MÉTODOS 99 el protocolo del fabricante. Brevemente, añadimos a la muestra una solución de lisis así como proteinasa K (20mg/ml) y se incubará a 56ºC durante toda la noche, añadiendo, nuevamente, proteinasa K (50%) incubándolo una hora más. Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente y se añade solución de precipitación de proteínas al contenido de la lisis celular. Seguidamente, se centrifuga a 16.000 g durante 5 minutos para que las proteínas formen un pellet, se recoge el sobrenadante y se coloca en un tubo limpio de 1.5 ml que contenga Isopropanol al 100%, donde se precipitará el material nucleico a -80ºC y tras lavados con alcohol de 70 % se procede a la hidratación del ADN y se almacena a -20ºC o - 80ºC hasta su utilización. La cantidad de material nucleico obtenido fue medida a través del Nanodrop (Thermo Scientific®). 3.6.2 Técnica de Transformación con bisulfito Se realiza la conversión de ADN por bisulfito (Epitect® Bisulfite Kit®) para convertir las citosinas no metiladas en uracilos (y timinas tras la reacción de PCR) sin modificar las citosinas metiladas (278,279). Para ello, en tubos 200 microlitros (µl) , se añade 1 microgramo (µg) ADN con agua libre de ADN y ARN (20µl), mix de bisulfito (85 µl) y tampón de protección de ADN (35µl). Para llevar a cabo la conversión de ADN bisulfito se utiliza un termociclador, utilizándose las temperaturas y los tiempos que describimos a continuación: 5 minutos a 95°C para realizar la primera desnaturalización, seguidamente se incuba durante 25 minutos a 60°C, seguidamente se desnaturaliza 5 minutos a 95°C, y se realiza una nueva incubación durante 85 minutos a 60°C, otra desnaturalización PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 100 durante 5 minutos a 95°C, y una última incubación durante 175 min a 60°C. Se centrifugan los tubos que contienen la reacción de bisulfito y, posteriormente, se transfieren a tubos de 1,5 ml. Se añaden 310µl de Buffer BL y 3,1µl de Carrier ARN, se mezcla en vórtex y se centrifuga durante 1 minuto a velocidad máxima. Se adicionan 250µl de etanol a 96%. Se mezcla en vórtex y se centrifuga durante 1 minuto a velocidad máxima. Se transfiere la totalidad de la mezcla desde cada tubo a las columnas de spin EpiTect con tubo colector, se centrifugan las columnas a velocidad máxima durante 1 minuto y se elimina el filtrado. Se añaden 500µl de buffer BW, y se centrifugan a velocidad máxima durante 1 minuto. Se descarta el filtrado. Se adicionan 500µl de buffer BD en cada columna, y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente y se centrifuga a velocidad máxima durante 1 minuto. Se descarta el filtrado. Se adicionan 500µl de buffer BW en cada columna, se centrifuga a velocidad máxima durante 1 minuto. Se descarta el filtrado. Se repite este paso. Se colocan las columnas en nuevos tubos colectores de 2 ml y se centrifuga a velocidad máxima durante 1 minuto. Se descarta el filtrado. Se incuban las columnas, con las tapas abiertas, en microtubos nuevos de 1,5ml, durante 5 min a 56°C. Se adicionan 20µl de Buffer EB en el centro de cada membrana, sin tocarla, y se centrifuga durante 1 minuto. El producto final de conversión fue almacenado durante un tiempo indefinido a - 20°C. 3.6.3 Técnica de MSP Posteriormente y para ver el estado de metilación de los genes estudiados, utilizamos la técnica de metilación específica de reacción en 3. MATERIAL Y MÉTODOS 101 cadena de la polimerasa (PCR) (MSP), para lo cual se utilizaron los termocicladores (AB Applies Biosystems 2750 Thermanl cycler® y PTC 200 Peltier Thermal Cycler®). Las secuencias de primers han sido obtenidas de las referenicas bibliografías: p16, CCND2, MGMT y DAPK1, sin embargo para el estudio de TIMP-3 hemos diseñados primers específicos de metilación utilizando el programa Primer 3 Plus online. A continuación describimos la secuencia de MSP: 1. El primer paso consiste en hacer la MIX U (no metilada) y la MIX M (metilada): -Agua destilada (12,5 µl ) -Buffer (6 µl ) -DNTPs (2 µl) -Primers (MF, MR,UR,UF)(1 µl de cada) -TAQ Polymerasa (0.5µl ) 2. Una vez listas las mix, echaremos 23 µl de cada una en cada tubo nuevo rotulado. 3. Cargamos 2 µl de cada muestra tratada con bisulfito en cada tubo que contiene los 23 µl de mix. 4. Metemos las muestras en el termociclador con las condiciones adecuadas. 5. Los productos de amplificación serán separados en geles de agarosa al 2% p/v, a los que se añadió, en vez de Bromuro de Etidio, Realsafe nucleicacid staining solution (20.000x) 5mg/ml, visualizados bajo luz ultravioleta y fotografiados con cámara digital. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 102 La secuencia de primers metilados (M)/primer no metilados (U) y las condiciones de MSP para cada uno de ellos están recogidos en la siguiente tabla 10. GEN FORWARD PRIMER REVERSE PRIMER TEMPERATURA METILADO TEMPERATURA NO METILADO CCND2 M :GGCGGATTTTATCGTAGTCG U :AGAGTATGTGTTAGGGTTGATT M :CTCCACGCTCGATCCTTCG U: ACATCCTCACCAACCCTCCA 94º-5` 94º-30`` 57º-45`` 72º-1` 72º-7` 4º& 94º-5` 94º-30`` 55º-45`` 72º-1` 72º-7` 4º& TIMP-3 M :CGTTTCGTTATTTTTTGTTTTCGGTTTC U :TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT M: CCGAAAACCCCGCCTCG U :CCCCCAAAAACCCCACCTCA 94º-5` 94º30`` 59º-1` 72º-1` 72º-10` 4º& 94º-5` 94º-30`` 59º-1` 72º-1` 72º-10` 4º& P16 M :TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC U :TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT M : GACCCCGAACCGCGACCGTAA U :CAACCCCAAACCACAACCATAA 94º-5` 94º-30`` 57º-45`` 72º-1` 72º-7` 4º& 94º-5` 94º-30`` 55º-45`` 72º-1` 72º-7` 4º& MGMT M :GGTCGTTTGTACGTTCGC U :GTAGGTTGTTTGTATGTTTGT M :GACCGATACAAACCGAACG U :AACCAATACAAACCAAACA 94º-15` 94º-50`` 59º-50`` 72º-50`` 72º-10` 4º& 94º-15` 94º-50`` 59º-50`` 72º-50`` 72º-10` 4º& DAPK1 M :GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC U :GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT M :CCCTCCCAAACGCCGA U :CAAATCCCTCCCAAACACCAA 94º-5` 94º-1` 58º-1` 72º-1` 94º-30`` 55º-30`` 72º-1´ 94º-1` 58º-1` 72º-1` 72º-7` 4º-& 94º-4` 94º-30`` 63º-30`` 72º-32`` 94º-30`` 68º-30`` 72º-30`` 72º-10` 4º-& Tabla 10 Condiciones MSP 35 ciclos 35 ciclos 35 ciclos 35 ciclos 35 ciclos 35 ciclos 35 ciclos 5 ciclos 35 ciclos 15 ciclos 15 ciclos 35 ciclos 5 ciclos 3. MATERIAL Y MÉTODOS 103 3.6.4 Análisis estadístico Se realizará la recogida de las variables de estudio en una base diseñada al efecto, con comprobación repetida de la calidad de los datos. Para el análisis se emplea el paquete de software SPSS v.20 para Windows (SPSS Inc.,Chicago, ILL, EEUU). Para la descripción de las variables cuantitativas se emplea media o mediana y desviación estándar (DS) o rango intercuartílico. Para variables categóricas, frecuencia y porcentaje. Se estudió la normalidad de las muestras mediante el test de Kolmogorov- Smirnov. Análisis univariante: para comparación de medias, T de Student o prueba U de Mann Whitney según condiciones de aplicación; para comparación de proporciones, prueba Ji cuadrado o prueba exacta de Fisher. Se realizó estudio de correlación entre variables cuantitativas con Test estadístico de Fisher o Spearman, según condiciones de aplicación. Para el análisis de supervivencia se realiazaron curvas de Kaplan-Meier. Para el estudio multifactorial de metilación se realizó regresión logística, comparando las diferencias mediante el estadístico Hazard-Ratio. Se consideran valores estadísticamente significativos aquellos cuya p ≤0,05 y p≤0,01 para el estudio de correlación. 4 RESULTADOS P AULA B OÑAR Á LVAREZ 112 4.1.7.3.2 Asociación exodoncias pre-RTP y habitos tóxicos De los 60 pacientes que necesitaron realizar extracciones pre-RTP, el 83,3% (50) de ellos tenían hábitos tóxicos, ya sea tabaco, alcohol o ambos frente a un 16,7% (10) que no tenían hábitos tóxicos y si demandaron extracciones previas. En este caso no hemos encontrado, en nuestra serie, una asociación entre las variables estadísticamente significativas (p=0,591). Cantidad de saliva en reposo y estimulada 4.1.7.4 La media de producción de saliva en reposo fue de 37,24±17,36 mm con un rango de 10-99 y en estimulada de 60,70±30,98mm con un rango de 25- 160 de saliva. 4.1.8 Situación oral del paciente durante la RTP Durante las 6-7 semanas que duró el tratamiento de la RTP, analizamos la prevalencia de complicaciones de dicho tratamiento, centrándonos fundamentalmente en mucositis, radiodermitis, cantidad de saliva en reposo y estimulada, y la posible infección bacteriana. Es importante reseñar que a medida que aumentan las sesiones de RTP, el nivel de implicación del paciente en la asistencia a controles disminuye, por lo que nos encontramos siempre con algún valor perdido en las variables, si menos cabe, de que el porcentaje mostrado, es siempre el válido. 4. RESULTADOS 113 Mucositis 4.1.8.1 En la primera semana no hubo mucha prevalencia de complicaciones, tan sólo 1 paciente (2,2%) presentó Grado 2 de Mucositis frente a 10 pacientes (21,7%) que sólo tuvieron eritema (Grado 1) y 35 pacientes que no presentaron ninguna sintomatología (Grado 0). A medida que aumentan las semanas, el nivel de úlceras aumentan, por lo que las dificultades de deglución se incrementan, llegando a tener que recurrir a dieta sólo con líquidos y, a veces, soporte parenteral, ya que se acumulan las dosis de radiación. Nos encontramos que a mitad de tratamiento (tercera semana) disminuyen los pacientes con Grado 0 a 17 (37,8%) y aparecen más prevalencia de Grado 1, concretamente, 11 casos (24,4%) y con Grado 3, 7 casos (15,6%). Estos porcentajes de mucositis se reducen en la última semana de RTP, tan sólo en 1 paciente (4%) presenta Grado 4, 2 pacientes (8%) presentan Grado 3, 7 pacientes (28%) presentan Grado 2, 9 (36%) pacientes presentan Grado 1 y 6 pacientes (24%) Grado 0. (Tabla 15). Semanas Grado 0 Grado 1 Grado 2 Grado 3 Grado 4 1ª 76,1% 21,7% 2,2% 2ª 45,7% 28,3% 17,4% 8,7% 3ª 37,8% 24,2% 22,2% 15,6% 4ª 25% 25% 34,1% 15,9% 5ª 18,2% 18,2% 45,5% 18,2% 6ª 23,1% 20,5% 43,6% 10,3% 2,6% 7ª 24% 36% 28% 8% 4% Tabla 15 Prevalencia de pacientes que presentan mucositis durante las 7 semanas de tratamiento con RTP P AULA B OÑAR Á LVAREZ 114 Radiodermitis 4.1.8.2 Durante el tratamiento de RTP vemos que, desde la primera semana hasta la última, aumenta la radiodermitis; al principio del tratamiento tan sólo existe un eritema, como podemos ver en la tabla 16, pero a medida que aumentan las semanas ya aparece con más prevalencia la descamación seca y la descamación húmeda, resultante del acúmulo de dosis. Semanas Grado 0 Grado 1 Grado 2 Grado 3 1ª 74,5% 25,5% 2ª 56,5% 32,6% 8,7% 1,2% 3ª 48,9% 28,9% 22,2% 4ª 38,6% 31,8% 25% 4,5% 5ª 27,9% 30,2% 32,6% 9,3% 6ª 23,1% 41% 35,9% 7ª 32% 40% 28% Tabla 16 Prevalencia de pacientes que presentan radiodermitis durante las 7 semanas de tratamiento con RTP Infección por cándida 4.1.8.3 El estudio de la posible infección por cándida durante la RTP en dorso lingual, nos indica que 24 pacientes (55,8%) son positivos frente a 19 pacientes (44,2%) que resultan negativos y al final del tratamiento disminuye la positividad para cándida con sólo 19 pacientes afectados (45,2%) frente a 23 (54,8%) que son negativos, por lo que, comparando con los datos iniciales, vemos que solamente hay presencia de cándida durante el tratamiento con RTP. 4.1.8.3.1 Asociación cultivo pre-RTP-cultivo y final del tratamiento De los 42 pacientes estudiados vemos que tan sólo son negativos a la candidiasis al principio del tratamiento y positivos al final del tratamiento 8 4. RESULTADOS 115 de ellos (38,1%), frente a 13 que son negativos al principio y al final (61,9%). Por otro lado, presentan positividad para cándida al principio del tratamiento para después volverse negativo 10 (47,6%) de ellos y no fue efectivo el tratamiento, ya que seguían siendo positivos en 11 (52,4%) de los casos. Estas diferencias no son estadísticamente significativas (p=0,352). 4.1.8.3.2 Asociación cultivo mitad de la RTP y cultivo final del tratamiento De los 42 pacientes estudiados vemos que el 88,9% (16) se mantienen negativos en la mitad, y al final del tratamiento, frente a un 11,1% (2) que se hacen positivos al final del tratamiento. Por otro lado son positivos a la mitad y al final del tratamiento 70,8% (17) frente a 29,2% (7) que son positivos a la mitad pero negativos al final, siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p<0,0001). 4.1.8.3.3 Asociación cultivo pre-RTP y cultivo mitad del tratamiento De los 43 pacientes estudiados el 50% (11) son negativos para cándida al principio y a la mitad del tratamiento frente a 50% (11) que son negativos y después se positivan. Por otro lado de los 21 pacientes positivos, conseguimos que a la mitad del tratamiento el 38,1% (8) fuesen negativos. Siendo estas relaciones no estadísticamente significativas (p=0,432). Cantidad de saliva en reposo y estimulada 4.1.8.4 El estudio de la cantidad de saliva refleja que, a medida que aumentan las sesiones de RTP, disminuye la tasa de salivación en reposo y estimulada PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 116 debido a la acción directa de las radiaciones ionizantes en las glándulas salivales. Así, en nuestro estudio, tenemos una media de TSG-I de 37,24±2,025mm (rango10-99) y TSG-II de 60,70±30,984mm (rango 25- 160) previas a la RTP, mientras que, tras 7 semanas de tratamiento, la cantidad de saliva disminuye a 21,20±10,12mm (rango 5,71-40,14) y la media de TSG-II a 38,12±15,34mm (rango 24,71-70,57). (Tabla 17). 1ª S 2ªS 3ªS 4ªS 5ªS 6ªS 7ªS TSG-I 28,96 26,54 23,36 20,32 17,80 16,69 17,64 TSG-II 47,47 45,83 39,17 34,19 28,95 33,80 28,81 Tabla 17 Medias de tasas salivales en reposo y estimulada durante las 7 semanas de tratamiento de RTP 4.1.8.4.1 Asociación de la media de saliva de TSG-I pre-RTP y la media de TSG-I durante la RTP Antes del tratamiento con RTP, tenemos una media de TSG-I de 37,24±2,025mm (rango10-99) y, al terminar las 7 semanas, tenemos una disminución de la saliva media en reposo a 21,20±10,12mm (rango 5,71- 40,14) siendo estas diferencias estadísticamente significativas (CC=0,543; P=0,007). 4.1.8.4.2 Asociación tasas salivales y cultivo final Durante el tratamiento con RTP, sólo hemos encontrado una relación estadísticamente significativa entre la disminución de saliva y la aparición de candidiasis a partir de la sexta semana de tratamiento, es decir, en la sexta semana, la media de TSG-I para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 12,94 mm ± 7,094 (rango 9,16-16,72) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 20mm ±8,587 (rango 4. RESULTADOS 117 16,09-23,91), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,012). (Gráfico 1). Gráfico 1 Gráfico de medias. Niveles medios de TSG-I a las seis semanas de tratamiento con RTP en función de la positividad para el cultivo final 4.1.8.4.3 Asociación entre tasas salivales y cultivo post-tratamiento a los 3, 6 y 12 meses Siguiendo la misma línea indicada anteriormente, sólo hemos encontrado una asociación estadísticamente significativa entre la disminución de saliva y la aparición de candidiasis post-tratamiento a los 3 meses. Así, la media de TSG-II en el primer mes post-RTP, para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 38,67 mm ± 13,895 (rango 31,76-45,58), frente a los pacientes que son negativos que tienen tasas de saliva estimulada de 54,35mm ±27,485 (rango 42,46-66,23), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,033). (Gráfico 2) P AULA B OÑAR Á LVAREZ 118 Gráfico 2 Gráfico de medias. Niveles medios de TSG-II al mes de terminar la RTP en función de la positividad para el cultivo a los tres meses post-tratamiento La media de TSG-I en la segunda semana del tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 6 meses post-tratamiento ha sido 17,08mm ± 7,708 (rango 12,42-21,73) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 30,08mm±22,576 (rango 21,48-40,12) siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,041). (Gráfico 3). Gráfico 3 Gráfico de medias. Niveles medios de TSG-I a las dos semanas de tratamiento con RTP en función de la positividad para el cultivo a los seis meses post-tratamiento 4. RESULTADOS 119 La media de TSG-I en la séptima semana del tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 6 meses post-tratamiento ha sido 12,43mm ± 5,094 (rango 7,72-17,14) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 21,20mm ±10,122 (rango 15,59-26,81), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,044). La media de TSG-II en la séptima semana del tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 6 meses post-tratamiento ha sido 20,25mm ± 6,702 (rango 9,59-30,91 frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-II de 34,50mm±10,607 (rango 26,91-42,09), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,030). La media de TSG-I en el periodo de las 7 semanas durante el tratamiento, para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 6 meses post-tratamiento ha sido de 13,85mm±5,78 (rango 7,78-19,92) mientras que para los pacientes que son negativos tienen TSG-I de 25,26mm±10,14 (rango 19,40-31,12), siendo estas diferencias son estadísticamente significativas (p=0,020). La media TSG-II en la séptima semana del tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 12 meses post-tratamiento ha sido 18,00mm ± 6,083 (rango 2,89-33,11) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-II de 33,82mm ±10,313 (rango 26,89-40,75), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,028). La media de TSG-I en el periodo de las 7 semanas durante el tratamiento, para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 12 meses post-tratamiento ha sido de 12,60mm±6,20 (rango 2,73-22,47) mientras que para los pacientes que son negativos tienen TSG-I de P AULA B OÑAR Á LVAREZ 120 24,15mm±10,03 (rango 18,80-29,49), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,043). En la gráfica 4 podemos ver que la tasa salival media durante el tratamiento disminuye y se relaciona con la aparición de candisiasis. Gráfica 4 Diagrama de cajas donde se aprecian los valores de TSG-I medios durante la RTP en relación a la positividad para cándida 4.1.9 Situación oral del paciente post-RTP Mucositis 4.1.9.1 Según los resultados que muestra la tabla 18, vemos como a medida que aumentan los meses post-RTP, disminuyen las complicaciones, tan sólo el 1,2% de los pacientes presentan eritema a los 2 años de tratamiento; bien es cierto que tenemos que recalcar que durante el seguimiento de estos pacientes hemos tenido bastantes bajas, bien por fallecimiento, bien por abandono de los controles y a los 3 años de tratamiento, tan sólo podemos seguir el control de 22 pacientes de 83 . 4. RESULTADOS 121 Meses Grado 0 Grado 1 Grado 2 Grado 3 Grado 4 1ª 63,6% 29,5% 4,5% 2,3% 3er 88,1% 9,5% 2,4% 6º 94,7% 2,6% 2,6% 9º 97,4% 2,6% 12 97,4% 2,6% 24 96,9% 3,1% 36 100% Tabla 18 Prevalencia de pacientes que presentan mucositis post-tratamiento desde el 1 er mes hasta los 36 meses post-tratamiento Se encontró una relación estadísticamente significativa entre la ausencia de mucositis a los 9 y 12 meses post-tratamiento y el cultivo negativo (p=0,033). Radiodermitis 4.1.9.2 Tras un año de tratamiento con RTP, vemos que no existe ningún paciente con radiodermitis y este punto de corte se produce a los 6 meses post-RTP, como se refleja en la tabla 19. Meses Grado 0 Grado 1 Grado 2 Grado 3 1ª 77,3% 20,5% 2,3% 3er 97,6% 2,4% 6º 100% 9º 100% 12 100% 24 100% 36 100% Tabla 19 Prevalencia de pacientes que presentan mucositis post-tratamiento desde el 1 er mes hasta los 36 meses post-tratamiento Infección por cándida a los 3,6 y 12 meses post-RTP 4.1.9.3 El estudio de la posible infección por cándida, post-RTP en dorso lingual, nos indica que al año de recibir el tratamiento con RTP, tan sólo P AULA B OÑAR Á LVAREZ 128 4.1.9.4.6 Asociación tasas salival y cultivo post-RTP a los 3 meses Después del tratamiento con RTP, existen una relación estadísticamente significativa entre la disminución de saliva y la aparición de candidiasis post-tratamiento a los 3 meses. La media de TSG-II en la primer mes posttratamiento, para los pacientes que han dado positivo en el cultivo, ha sido 24,73mm±10,285 (rango 19,04-30,43) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-II de 41,26mm ±20,148 (rango 32,55-49,97) siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,006). (Gráfico 9). Gráfico 9 Gráfico de medias. Niveles medios de TSG-II al mes de terminar el tratamiento con RTP en función de la positividad para el cultivo a los 3 meses post-tratamiento La media de TSG-I en el tercer mes post-tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 16,83mm±8,053 (rango 12,83- 20,84) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 24,50mm±10,380 (rango20,12-28,88), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,013). (Gráfico 10). 4. RESULTADOS 129 Gráfico 10 Gráfico de medias. Niveles medios de TSG-I a los tres meses de terminar el tratamiento con RTP en función de la positividad para el cultivo a los tres meses posttratamiento La media de TSG-I, en el periodo de 36 meses post-tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 3 meses post-tramiento ha sido de 19,43mm±10,63 (rango 13,77-25,10) mientras que para los pacientes que son negativos tienen TSG-I de 24,48mm±9,45 (rango 20,29- 28,67), siendo estas diferencias no estadísticamente significativas (p=0,132). 4.1.9.4.7 Asociación tasas salival y cultivo post-RTP a los 12 meses Después del tratamiento con RTP, existen una relación estadísticamente significativa entre la disminución de saliva y la aparición de candidiasis post-tratamiento a los 12 meses. La media de TSG-II en el primer mes post-tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 21,50mm±11,167 (rango 9,78- 33,22) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-II de PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 130 38,71mm ±19,505 (rango 31,15-46,28), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,046). La media de TSG-I en el sexto mes post-tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 13,43mm±3,952 (rango 9,77- 17,08) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 23,71mm±11,702 (rango 19,42-28,00), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,029). La media de TSG-I en el noveno mes post-tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 14,29mm±7,274 (rango 7,56- 21,01) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 25,90mm±13,260 (rango 21,04-30,77), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,032). La media de TSG-I en el doceavo mes post-tratamiento para los pacientes que han dado positivo en el cultivo ha sido 16,00mm ± 6,633 (rango 9,78-22,13) frente a los pacientes que son negativos que tienen TSG-I de 28,74mm ±13,510 (rango 23,79-33,70) siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,021). La media de TSG-I en el periodo de las 36 meses después del tratamiento, para los pacientes que han dado positivo en el cultivo a los 12 meses post-RTP ha sido de 14,25mm±3,35 (rango 11,14-17,36) mientras que para los pacientes que son negativos tienen TSGI de 24,18mm±10,39 (rango 16,97-26,70), siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,017). 4. RESULTADOS 131 Extracciones post-RTP 4.1.9.5 Estos pacientes presentan un deterioro completo de la corona del diente, derivado de las caries post-irradiación (Ilustración 10 y 11), que se inician a los tres meses de finalizar la RTP, fundamentalmente por la alteración cuantitativa y cualitativa de la saliva. Se debe esperar al menos 18 meses para poder hacer extracciones en la cavidad oral; en nuestra muestra, de los 83 pacientes, hemos perdido a 48 tras 3 años post-tratamiento, por tanto de los 35 restantes, 17 (48,6%) no han necesitado ninguna extracción y 18 (51,4%) han necesitado al menos una extracción después de recibir el tratamiento. Ilustración 10 Radiografía panorámica donde se puede ver la situación oral del paciente antes de someterse a tratamiento con RTP Ilustración 11 Radiografía panorámica donde se puede ver la situación oral, concretamente los restos radiculares, que presenta el paciente post-RTP ORN 4.1.9.6 De 83 pacientes del estudio, tan solo hemos podido hacer el seguimiento a largo plazo en 37 pacientes, de los cuales, 15 (40,5%) han desarrollado una ORN frente a 22 (59,5%) que no tuvieron dicha complicación. En cuanto las causas, 6 (40%) han sido de manera espontánea, 4 (26,7%) por exodoncias post-RTP y 5 (33,3%) relacionadas con exodoncias pre-RTP. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 132 En cuanto al momento de aparición, 12 (80%) aparecieron tras terminar el tratamiento y 3 (20%) durante la RTP. En cuanto a la localización, 12 (80%) fueron localizadas en la mandibula y 3 (20%) en maxilar superior. De esos 15 pacientes que presentaron ORN, en 6 (33,3%) conseguimos cerrar la necrosis óseas, 3 (20%) están estable (no aumentan de tamaño pero tampoco se cierra la necrosis) y 7 (46,7%) han fallecido con la necrosis. 4.1.9.6.1 Distribución de la ORN según QTP De los 15 pacientes que desarrollaron ORN, 14 (93,3%) de ellos estuvieron a tratamiento concomitante con QTP, frente a 1(6,7%) que desarrolló ORN pero no estuvo a tratamiento con QTP. No siendo una relación estadísticamente significativa (p=0,314). 4.1.9.6.2 Distribución de la ORN según Estadío De los 15 casos de ORN, 12 (80%) presentaban un estadío IV, 2 (13,3%) se encontraba en estadío III, y 1 (6,7%) en estadío I. Sin que exista una relación estadísticamente significativa entre ambas variables (p=0,212). 4.1.9.6.3 Distribución de la ORN según Hábitos Tóxicos En relación a la aparición de ORN, sólo fue desarrollada por 15 pacientes, de los cuales 13 (86,7%) presentaban hábitos tóxicos, consumo de alcohol y/o tabaco, mientras que sólo 2 (13,3%) no poseían hábitos tóxicos. Sin embargo no hemos encontrado estadísticamente significativa (p=0,474). 4. RESULTADOS 133 4.1.9.6.4 Distribución de la ORN según las extracciones pre y post- RTP De los 15 pacientes, 10 (66,7%) se le realizaron extracciones pre-RTP frente a 5 que desarrollaron ORN, y no se le hicieron extracciones pre-RTP. Sin relación estadísticamente significativa (p=0,476), pero fundamentalmente se puede deber al poco tiempo de espera entre el que realizamos la extracciones y el comienzo de la RTP. De los 15 pacientes, 7 (46,75%) se le realizaron extracciones post-RTP tras esperar 18 meses y, aun así, desarrollaron ORN frente a 8 (53,3%) que desarrollaron ORN y no se le relacionan con extracciones post-RTP. Sin relación estadísticamente significativa (p=0,625). 4.1.9.6.5 Distribución de la ORN según la cirugía pre-RTP El número de pacientes que desarrollaron una ORN y que tuvieron que ser operados antes de recibir la RTP es de 12 (80%). Solo hay 3 (20%) casos que no hicieron ORN y si fueron operados. No existe relación estadísticamente significativa entre ambas variables (p=0,427). 4.1.9.6.6 Distribución de la ORN según el cultivo en la mitad de tratamiento De los casos con ORN tan sólo tenían sobreinfección por cándida en la mitad del tratamiento 4 (33,3%) de los pacientes, frente a 8 (66,7%) que presentaban ORN y no tenían candidiasis (p=0,043). Siendo está relación estadísticamente significativa. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 134 4.1.9.6.7 Distribución de la ORN en el control a los 2 años A los dos años de terminar con el tratamiento, es decir, a los 24 meses, 14 (93,3%) de los 15 pacientes ya habían desarrollado la ORN, frente a 1 (6,7%) caso que la desarrolló a posteriori. Sin relación estadísticamente significativa. (p=0,193). 4.1.9.6.8 Distribución de la ORN según el estado bucodental a los 2 años y a los 3 años de seguimiento En lo que respecta a la distribución de la ORN según el estado bucodental, en nuestra muestra, hemos encontrado que de los 15 pacientes que tuvieron una necrosis ósea, tan sólo tenemos seguimiento bucodental de 12 de ellos, y podemos decir que sólo 3 (25%) continúan con necrosis pero controladas, 1 (8,3%) con una boca muy inestable, 2 (16,7%) con necrosis curada y bocas estables y 6 (50%) edéntulos y sin necrosis. Siendo esta relación estadísticamente significativa (p=0,050). A los 3 años post-tratamiento, vemos que, de los 15 pacientes iniciales, tan sólo sobreviven 10, y sólo 1 (10%) de ellos permanece con necrosis estabilizada; de los 9 restantes es importante señalar que todos están sin necrosis y con bocas estables, concretamente 7 (70%) mantienen su dentadura estable sin necrosis, 1 (10%) se encuentra edéntulo y 1 (10%) está rehabilitado con prótesis completas. Siendo esta relación estadísticamente significativa (p=0,014). 4.1.9.6.9 Distribución de la ORN según sus causas de aparición y su momento de aparición y localización. Las causas fundamentales de la aparición de ORN en nuestros 15 pacientes fueron en 6 (40%) espontáneas (dosis-dependiente) frente a 5 4. RESULTADOS 135 (33,3%) que fueron relacionadas con exodoncias pre-RTP y 4 (26,7%) que fueron por extracciones post-RTP. En cuanto a qué momento es el más prevalente para desarrollar una ORN, vemos que de los 15 casos, 12 de ellos fueron post-RTP (80%) y tan sólo el 3 (20%) durante la RTP. Si nos fijamos en la localización, 12 (80%) se encuentran en la mandíbula frente a 3 (20%) que se sitúan en el maxilar. 4.1.9.6.10 Asociación de la ORN y TSG-II post-RTP a los 3 meses La media de TSG-II a los 3 meses de terminar el tratamiento para los pacientes que han desarrollado una ORN ha sido de 42,55mm ±16,60 (rango 31,39-53,70) frente a los pacientes que no han desarrollado una ORN que tienen TSG-II de 30,60mm±13,60 (rango 24,23-36,97) siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p=0,039). (Gráfico 11). Gráfica 11 Gráfico de medias. Niveles medios de TSG-II a los tres meses de terminar el tratamiento en función de la ORN P AULA B OÑAR Á LVAREZ 136 4.1.10 Asistencia a visitas de seguimiento Tras dos años de recibir el tratamiento con RTP tan sólo hemos podido valorar el seguimiento en 32 pacientes (38,6%) y los 51 restantes (61,4%) no acudieron a la consulta (bien por abandono o por fallecimiento). A los 3 años de tratamiento, 23(27,7%) pacientes acuden a controles y 60 (72,3%) no acuden a controles. 4.1.11 Recurrencia, Seguimiento y Supervivencia a los 3 años En cuanto a la recurrencia de enfermedad, hemos visto que de los 83 pacientes a 3 años, el 54,2% ha tenido una recidiva del tumor primario frente a un 43,3% que no ha tenido ninguna recidiva; en cuanto a la supervivencia a los 3 años, un 53% no sobreviven a la enfermedad tras recibir tratamiento de RTP frente a un 47% que si lo hacen. La media de seguimiento de nuestros pacientes fue de 41,48 meses con un rango de 20,30-53,73 meses. Análisis del tiempo de supervivencia 4.1.11.1 A los 83 pacientes se les realizó un seguimiento de la enfermedad desde el momento del diagnóstico. Dicho seguimiento terminaba en el momento del fallecimiento o al cierre del estudio, si permanecía vivo. Se registró el tiempo de supervivencia para cada paciente. De los 83 pacientes, el 47 % falleció.(Gráfico 12). 4. RESULTADOS 137 Gráfico 12 Porcentaje de supervivencia de los 83 pacientes tras el seguimiento durante 3 años Los factores en los que se analizó la influencia de la supervivencia de los pacientes fueron los siguientes: estadío, fumadores (número de cigarrillos), recurrencia de la enfermedad y localización. 4.1.11.1.1 Estadío Los pacientes presentaron un tiempo medio de supervivencia medio de 19,89 meses, con un intervalo de confianza al 95% [15,85-23,93]. El tiempo medio de supervivencia es más elevado en estadío iniciales (T1) siendo de 26,187 meses (13,61-38,75), seguidamente sobreviven más los pacientes en estadíos T4, siendo de 20,7 meses (15,77-25,63) y por último la menor supervivencia es para los estadíos T2-T3 con una media de 16,201 meses (1,62-30,78) y de 15,286 meses (4,59-25,98) respectivamente; a pesar de las diferencias encontradas, el test del Logaritmo del Rango confirma que las curvas de supervivencia no son estadísticamente significativas (p=0,687).(Gráfico 13). 53% 47% VIVO MUERTO P AULA B OÑAR Á LVAREZ 144 Ilustración 14 Gel de agarosa donde se observan metilados algunos casos de DAPK1 CCND2 pre-RTP 4.3.1.4 En nuestro estudio 4 pacientes, dentro del grupo casos, tienen metilado el gen CCD2 pre-RTP, frente a 0 controles, por lo que no existen diferencias estadísticamente significativas (p=0,131).( Ilustración 15). TIMP-3 pre-RTP 4.3.1.5 En nuestro estudio 4 pacientes, dentro del grupo casos, tienen metilado el gen TIMP-3 pre-RTP, frente a 0 controles por lo que no existen diferencias estadísticamente significativas (p=0,131). (Ilustración 16). Ilustración 15 Gel de agarosa donde se observan metilados algunos casos de CCND2 4. RESULTADOS 145 Ilustración 16 Gel de agarosa donde se observan metilados algunos casos de TIMP-3 4.3.2 Asociaciones metilación Asociación pre/post-RTP metilación en los casos 4.3.2.1 Analizamos la relación en la metilación de los diferentes genes, antes y post-RTP, y no hemos encontramos diferencias estadísticamente significativas en ningún gen. (Tabla 28). Metilación Gen Valor P MGMT 0,35 DAPK1 0,26 P16 0,25 CCND2 0,50 TIMP-3 0,75 Tabla 28 Asociación en el estado de metilación de los genes indicados antes y después de la RTP Cambios metilación pre/post-RTP estudiados en el mismo 4.3.2.2 caso De las 78 muestras estudiadas, tan sólo hemos podido hacer el seguimiento pre-post en 11 pacientes. De los 5 genes que hemos estudiado, Amigdala Agua Ladder IVD P AULA B OÑAR Á LVAREZ 146 no se encontraron cambios pre/postRTP, en cuanto a metilación, en MGMT ni en TIMP-3. Si que encontramos cambios en el gen p16 y CCND2, principalmente han pasado a una demetilación, es decir de metilado a no metilado. Para p16, de 11 pacientes, 3 (2,8%) han sufrido una demetilación y para CCND2, 1 (0,9%) ha sido demetilación. Por otro lado el gen que más variabilidad ha tenido pre/post fue el DAPK1, algunos pacientes han sufrido una demetilación (2 pacientes (1,9%) y otros una metilación {2 pacientes (1,9%)} y sin embargo otros 7 han mantenido el mismo estado inicial (6,6%). Asociación de Cambios metilación pre/post estudiados en 4.3.2.3 el mismo caso (enjuague pre-RTP y post-RTP) y los Gy recibidos No encontramos diferencias estadísticamente significativas entre la dosis de RTP en los diferentes subgrupos para los diferentes genes, comparando la variable Gy_total en los diferentes subgrupos de cada gen (Demetilado, metilado, no cambios). En la siguiente tabla 29 se muestran los resultados estadísticos. Cambmeti_p16 N Media DS valor p Gy_total Demetilado 3 64,6667 5,03322 0,279 No Cambios 8 69 4,78091 Cambmeti_CCND2 Gy_total Demetilado 1 64 0,545 No Cambios 10 68,2 5,11642 Cambmeti_DAPK1 Gray_total Demetilado 2 67 9,89949 0,155 No Cambios 7 68,2857 4,68025 0,667 Metilado 2 67 4,24264 0,657 Total 11 67,8182 5,01634 Tabla 29 Asociación en el estado de metilación de los genes indicados antes y después de la RTP y los Gy recibidos en el mismo paciente 4. RESULTADOS 147 4.3.3 Supervivencia y metilación Metilación MGMT pre y post-RTP 4.3.3.1 El tiempo medio de supervivencia es más elevado en los pacientes que presentan metilación previa del gen MGMT, 17 meses (17-17) frente a los pacientes que no presentan metilación, con una media de 11,46 meses (8,28-14,64), siendo estas diferencias no estadísticamente significativas (p=0,672; Long Rank Test) . (Gráfico 18). Gráfico 18 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen MGMT pre-RTP Los pacientes que no presentan metilación del gen MGMT después del tratamiento viven una media de 23,28 meses (18,29-28,18), no hemos podido comparar con casos que diesen positivo post-RTP, porque no hemos encontrado ninguno en nuestra serie de casos. (Gráfico 19). P AULA B OÑAR Á LVAREZ 148 Gráfico 19 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen MGMT post-RTP Metilación DAPK1 pre y post-RTP 4.3.3.2 El tiempo medio de supervivencia en pacientes con el gen DAPK1 metilado antes del tratamiento fue 17 meses (10,55-23,44) frente a los no metilados, que fue de 11,21 meses (7,95-14,47) siendo estas diferencias no estadísticamente significativas (p=0,646; Long Rank Test) (Gráfico 20) En cuanto al tiempo medio de supervivencia en pacientes con DAPK1 positivo después del tratamiento es menor que en los pacientes que no presentan metilación, 15,40(4,80-26) frente a 24,06(18,78-29,33), respectivamente; concretamente viven 9 meses menos si presentan metilación de dicho gen, siendo estas diferencias no estadísticamente significativas, (p=0,147; Long Rank Test) (Gráfico 21) 4. RESULTADOS 149 Gráfico 20 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen DAPK1 pre-RTP Gráfico 21 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen DAPK1 post-RTP P AULA B OÑAR Á LVAREZ 150 Metilación p16 pre y post-RTP 4.3.3.3 El tiempo medio de supervivencia en pacientes con metilación de p16 antes del tratamiento es de 10, 85 meses (6,09-15,61) frente a los que no tienen metilación, que sobreviven una media de 12,11 meses (8,07-16,16), por tanto resulta beneficioso antes del tratamiento no presentar metilación de dicho gen, pero estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p=0,456; Long Rank Test).(Gráfico 22). Gráfico 22 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen p16 pre-RTP Por otro lado, valoramos también la curva de supervivencia de Kaplan- Meier en función de la metilación de p16 post-tratamiento, viendo que el tiempo medio de supervivencia para los pacientes en que presentan metilación de p16 después del tratamiento fue de 33,87 meses (26,38- 41,37), y de 20,73 meses (15,50-25,96) para los pacientes que no presentan 4. RESULTADOS 151 metilación después del tratamiento. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p=0,91; Long Rank Test). (Gráfico 23). Gráfico 23 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen p16 post-RTP Metilación CCND2 pre y post-RTP 4.3.3.4 Los tiempos medios de supervivencia para los pacientes que no presentaban metilación pre de CCNAD2 fueron de 12,414 meses (9,13- 15,69) frente a los que si presentaban metilación previa que fueron de 6,675 meses (0-14,71). La media de supervivencia de los pacientes disminuyó a medida que aumenta la metilación de CCND2 antes del tratamiento, pero estas diferencias no son estadísticamente significativas (p=0,162; Long Rank Test) (Gráfico 24). P AULA B OÑAR Á LVAREZ 152 Gráfico 24 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen CCND2 pre-RTP Por otro lado, los tiempos de supervivencia para los pacientes que no presentaban metilación de CCND2 después del tratamiento fueron de 23,23 meses (18,29-28,18). No encontramos casos de metilación de CCND2 después de recibir la RTP (Gráfico 25). Gráfico 25 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen CCND2 post-RTP 4. RESULTADOS 153 Metilación TIMP-3 pre y post-RTP 4.3.3.5 Los pacientes con metilación previa de TIMP-3 en el momento del diagnóstico presentaron un tiempo de supervivencia de 15,89 meses (8,62- 14,77) frente a los que no presentaron metilación que fueron de 11,31 meses (8-14,62), siendo estas diferencias no significativas(p=0,704; Long Rank Test) (Gráfico 26). Si estudiamos la curva de supervivencia después del tratamiento vemos que sobreviven más meses los pacientes que presentaron metilación de dicho gen, concretamente 29,604 meses (18,29-28,18) frente a los 21,74 meses que sobreviven los pacientes que no presentan metilación de dicho gen después del tratamiento (16,51-26,96), pero estas diferencias no son estadísticamente significativas (p=0,704; Long Rank Test) (Gráfico 27). Gráfico 26 Curva de supervivencia poblacional en relación al estado de metilación del gen TIMP-3 pre-RTP PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 256 ¿Por qué me ofrecen participar a mí? Ud. es invitado a participar porque padece un carcinoma de cabeza y cuello. ¿En qué consiste mi participación? Se le realizará una historia clínica completa donde se recogerán los siguientes datos : edad, sexo, uso de la CTP, estadío TNM, sesiones RTP, cirugía previa, sesiones de quimioterapia, tipo histológico del tumor, localización, recurrencia de la enfermedad y supervivencia y se le harán las siguientes pruebas : prueba completa de la saliva inicial (TSG-I) y en reposo (TSG-II), presencia de cándida, nivel de higiene, hábitos tóxicos (tabaco y alcohol), exodoncias (ubicación, número y razón), necesidad de un tratamiento conservador, profiláctico o quirúrgico, cultivo a los 6 meses, TSG I y II semanales, mucositis semanal, radiodermitis semanal, ORN tras RTP, especie de cándida. Su participación tendrá una duración total estimada de 20 minutos cada vez que acuda a la Unidad Docente de Medicina Oral,Cirugía Oral e Implantología. Es una visita que forma parte del protocolo de manejo de los pacientes que van a recibir radioterapia. Será una vez a la semana durante el tiempo que dure el tratamiento con radioterapia. Una vez terminada la radioterapia el paciente acudirá al mes de terminar el tratamiento, a los tres meses, a los 6 meses, a los 9 meses y al año de terminar el tratamiento. ¿Qué molestias o inconvenientes tiene? Los efectos secundarios que pueden presentarse son derivados del tratamiento con radioterapia. ¿Obtendré algún beneficio por participar? No se espera que Ud. obtenga beneficio directo por participar en el estudio. 8. ANEXOS 257 ¿Recibiré la información que se obtenga del estudio? Si Ud. lo desea, se le facilitarás un resumen de los resultados del estudio. También podrá recibir los resultados de las pruebas que se realicen con sus muestras si así lo solicita dirigiéndose al investigador. Estos resultados pueden no tener aplicación clínica ni una interpretación clara, por lo que, si quiere disponer de ellos, deberían ser comentados con el médico del estudio. ¿Se publicarán los resultados de este estudio? Los resultados de este estudio serán remitidos a publicaciones científicas para su difusión, pero no se transmitirá ningún dato que pueda llevar a la identificación de los participantes. ¿Cómo se protegerá la confidencialidad de mis datos y muestras? El tratamiento, comunicación y cesión de sus datos se hará conforme a lo dispuesto por la Ley Orgánica 15/1999, de 13 de diciembre, de protección de datos de carácter personal. En todo momento, Ud. podrá acceder a sus datos, corregirlos o cancelarlos, solicitándolo ante el investigador Solo el equipo investigador, y las autoridades sanitarias, que tienen el deber de guardar la confidencialidad, tendrán acceso a todos los datos recogidos por el estudio. Se puede transmitir a terceros información que no pueda ser identificada. En el caso de que alguna información sea transmitida a otros países, se realizará con un nivel de protección de los datos equivalente, como mínimo, al exigido por la normativa de nuestro país. Sus datos y muestras biológicas serán recogidos y conservados hasta finalizar el estudio de modo: Codificados, que quiere decir que poseen un código con el que el equipo investigador podrá conocer a quien pertenecen. El responsable de la custodia de los datos y muestras es Mario Pérez- Sayáns García, y el lugar de realización de los análisis previstos en este estudio es Facultad de Odontología. Máster de Medicina Oral. Cirugía Oral e Implatología y Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Clínico de Santiago de Compostela. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 258 Al terminar el estudio, conforme al RD 1716/2011, sus muestras biológicas serán Anonimizadas, es decir, que se rompió todo vínculo que pueda identificar a la persona donante de la muestra, no pudiendo ser identificado ni siquiera por el equipo investigador. ¿Existen intereses económicos en este estudio? Esta investigación es promovida por el Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Impantologia de la Faculta de Odontologia de la USC con fondos aportados por Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Impantologia de la Faculta de Odontologia de la USC El investigador no recibirá retribución específica por la dedicación al estudio. Ud. no será retribuido por participar. ¿Cómo contactar con el equipo investigador de este estudio? Ud. puede contactar con Mario Pérez-Sayáns García en el teléfono. nº teléfono 981563100 Ext. 12357 o correo electrónico [email protected] Muchas gracias por su colaboración 8. ANEXOS 259 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados en cáncer de cabeza y cuello. Yo, _________________________________________________________ • Leí la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se me entregó, pude conversar con: ______________________________________ y hacer todas las preguntas sobre el estudio necesarias. • Comprendo que mi participación es voluntaria, y que puedo retirarme del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. • Accedo a que se utilicen mis datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. • Presto libremente mi conformidad para participar en este estudio. Respecto a la conservación DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio  No accedo a que sean conservadas una vez terminado el estudio.  Accedo a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la participante, Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: ___________ Nombre y apellidos: _____________ Fecha: Fecha: PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 260 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO ANTE TESTIGOS PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDIO DE INVESTIGACIÓN (para los casos en los que el participante no pueda leer/escribir) El testigo imparcial ha de identificarse y ser una persona ajena al equipo investigador TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados en cáncer de cabeza y cuello. Yo __________________________________________, como testigo imparcial, afirmo que en mi presencia: • Se le leyó __________________________________________ la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se le entregó, y pudo hacer todas las preguntas sobre al estudio. • Comprendo que su participación es voluntaria, y que puede retirarse del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. • Accede a que se utilicen sus datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. • Presta libremente su conformidad para participar en este estudio. Respecto a la conservación e utilización DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio  No accedió a que sean conservadas una vez terminado el estudio.  Accedió a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: O/a testigo Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: _____________ Nombre y apellidos: ____________ Fecha: Fecha: 8. ANEXOS 261 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO PARA REPRESENTANTE LEGAL PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados en cáncer de cabeza y cuello. Yo, ___________________________________ , representante legal de ________________________ : • Leí la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se me entregó, pude conversar con ____________________________________________ y hacer todas las preguntas sobre el estudio. • Comprendo que su participación es voluntaria, y que puede retirarse del estudio cando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. • Accedo a que se utilicen sus datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. • Presto libremente mi conformidad para que participe en este estudio. Respecto a la conservación e utilización DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio  No accedo a que sean conservadas una vez terminado el estudio  Accedo a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la representante legal, Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: _____________ Nombre y apellidos: _____________ Fecha: Fecha: PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 262 8.4 Anexo IV Consentimiento informado de la parte retrospectiva en galego FOLLA DE INFORMACIÓN AO PARTICIPANTE ADULTO/A TÍTULO DO ESTUDO: Patrón de metilación en pacientes irradiados con cancro de cabeza e colo. Fase restrospectiva INVESTIGADOR Mario Pérez-Sayáns García CENTRO: Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxía. Facultade de Odontoloxía da USC Este documento ten por obxecto facilitarlle información sobre un estudo de investigación no que se lle invita a participar. Este estudo foi aprobado polo Comité de Ética da Investigación de Santiago-Lugo. Se decide participar neste, debe recibir información personalizada do investigador, ler antes este documento e facer todas as preguntas que precise para comprender os detalles sobre este. Se así o desexa, pode levar o documento, consultalo con outras persoas, e tomar o tempo necesario para decidir se participar ou non. A participación neste estudo é completamente voluntaria. Vostede pode decidir non participar ou, se acepta facelo, cambiar de parecer retirando o consentimento en calquera momento sen ter que dar explicacións. Asegurámoslle que esta decisión non afectará á súa relación co médico nin á asistencia sanitaria á que vostede ten dereito. ¿Cal é o propósito do estudo? O propósito deste estudo é describir os efectos da radioterapia de cabeza e colo. Evaluar o paciente con cáncer de cabeza e colo antes, durante e despóis da radioterapia. 8. ANEXOS 263 ¿Por que me ofrecen participar a min? Vostede é convidado a participar porque padece un carcinoma de cabeza e colo. ¿En que consiste a miña participación? Realizaráselle unha historia clínica completa onde se recollerán os seguintes datos : idade, sexo, uso da CTP, estadiaxe TNM, sesions RTP, ciruxía previa, sesions de quimioterapia, tipo histolóxico do tumor, localización, recurrencia da enfermidade e supervivencia e se farán as seguintes probas : proba completa da saliva inicial (TSG-I) e en reposo (TSG-II), presencia de cándida, nivel da higiene, hábitos tóxicos (tabaco e alcohol), exodoncias (ubicación, número e razón), necesidade d un tratamento conservador, profiláctico o quirúrxico, cultivo aos 6 meses, TSG I y II semanales, mucositis semanal, radiodermitis semanal, ORN tras RTP, especie de cándida. A súa participación terá unha duración total estimada de 20 minutos cada vez que acuda á Unidade Docente de Medicina Oral, Ciruxía Oral e Implantoloxía. É unha visita que forma parte do protocolo de manexo dos pacientes que recibirán radioterapia. Será unha vez á seman durante ó tiempo que dure o tratamiento con radioterapia. Unha vez terminada a radioterapia o paciente acudirá ao mes de terminar o tratamiento, aos tres meses, aos 6 meses, aos 9 meses e ó año de terminar o tratamiento. ¿Que molestias ou inconvenientes ten? Os efectos secundarios que pode presentar son os derivados do tratamento con radioterapia. ¿Obterei algún beneficio por participar? Non se espera que vostede obteña beneficio directo por participar no estudo. ¿Recibirei a información que se obteña do estudo? Se vostede deséxao, facilitaráselle un resumo dos resultados do estudo. Tamén poderá recibir os resultados das probas que se realicen coas súas mostras se así o solicita dirixíndose ao investigador. Estes resultados poden PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 264 non ter aplicación clínica nin unha interpretación clara, polo que, se quere dispoñer deles, deberían ser comentados co médico do estudo. ¿Publicaranse os resultados deste estudo? Os resultados deste estudo serán remitidos a publicacións científicas para a súa difusión, pero non se transmitirá ningún dato que poida levar á identificación dos participantes. ¿Como se protexerá a confidencialidade dos meus datos e mostras? O tratamento, comunicación e cesión dos seus datos farase conforme ao disposto pola Lei Orgánica 15/1999, do 13 de decembro, de protección de datos de carácter persoal. En todo momento, vostede poderá acceder aos seus datos, corrixilos ou cancelalos, solicitándoo ante o investigador. Só o equipo investigador, e as autoridades sanitarias, que teñen deber de gardar a confidencialidade, terán acceso a todos os datos recollidos polo estudo. Pódese transmitir a terceiros información que non poida ser identificada. No caso de que algunha información sexa transmitida a outros países, realizarase cun nivel de protección dos datos equivalente, como mínimo, ao esixido pola normativa do noso país. Os seus datos e mostras biolóxicas serán recollidos e conservados ata finalizar o estudo de modo: Codificados, que quere dicir que posúen un código co que o equipo investigador poderá coñecer a quen pertencen. O responsable da custodia dos datos e mostras é Mario Pérez-Sayáns García, e o lugar de realización das análises previstas neste estudo é Facultade de Odontoloxía. Máster de Medicina Oral. Cirurxía Oral e Implatología e Departamento de Anatomía Patolóxica do Hospital Clínico de Santiago de Compostela. Ao rematar o estudo, conforme ao RD 1716/2011, as súas mostras biolóxicas serán Anonimizadas, é dicir, que rompeu todo vínculo que poida identificar a persoa doadora da mostra, non podendo ser identificado nin sequera polo equipo investigador. ¿Existen intereses económicos neste estudo? Esta investigación é promovida polo Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxia da Facultade de Odontoloxia da USC con fondos 8. ANEXOS 265 achegados polo Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxía da Facultade de Odontoloxia da USC O investigador non recibirá retribución específica pola dedicación ao estudo. Vostede non será retribuído por participar. ¿Como contactar co equipo investigador deste estudo? Vostede pode contactar con Mario Pérez-Sayáns García no teléfono 981563100 Extensión12357 ou correo electrónico [email protected] Moitas grazas pola súa colaboración PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 272 ¿Existen intereses económicos en este estudio? Esta investigación es promovida por el Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Impantologia de la Faculta de Odontologia de la USC con fondos aportados por Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Impantologia de la Faculta de Odontologia de la USC El investigador no recibirá retribución específica por la dedicación al estudio. Ud. no será retribuido por participar. ¿Cómo contactar con el equipo investigador de este estudio? Ud. puede contactar con Mario Pérez-Sayáns García en el teléfono. nº teléfono 981563100 Ext. 12357 o correo electrónico [email protected] Muchas gracias por su colaboración 8. ANEXOS 273 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados en cáncer de cabeza y cuello. Yo, Leí la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se me entregó, pude conversar con: y hacer todas las preguntas sobre el estudio necesarias. Comprendo que mi participación es voluntaria, y que puedo retirarme del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. Accedo a que se utilicen mis datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. Presto libremente mi conformidad para participar en este estudio. Respecto a la conservación DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio No accedo a que sean conservadas una vez terminado el estudio. Accedo a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la participante, Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: Nombre y apellidos: Fecha: Fecha: P AULA B OÑAR Á LVAREZ 274 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO ANTE TESTIGOS PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDIO DE INVESTIGACIÓN (para los casos en los que el participante no pueda leer/escribir) El testigo imparcial ha de identificarse y ser una persona ajena al equipo investigador TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados en cáncer de cabeza y cuello. Yo como testigo imparcial, afirmo que en mi presencia: Se le leyó la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se le entregó, y pudo hacer todas las preguntas sobre al estudio. Comprendo que su participación es voluntaria, y que puede retirarse del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. Accede a que se utilicen sus datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. Presta libremente su conformidad para participar en este estudio. Respecto a la conservación e utilización DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio No accedió a que sean conservadas una vez terminado el estudio. Accedió a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: O/a testigo Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: __________________ Fecha: Fecha: 8. ANEXOS 275 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO PARA REPRESENTANTE LEGAL PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados en cáncer de cabeza y cuello. Yo, , representante legal de : Leí la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se me entregó, pude conversar con y hacer todas las preguntas sobre el estudio. Comprendo que su participación es voluntaria, y que puede retirarse del estudio cando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. Accedo a que se utilicen sus datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. Presto libremente mi conformidad para que participe en este estudio. Respecto a la conservación e utilización DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio No accedo a que sean conservadas una vez terminado el estudio Accedo a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la representante legal, Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: _________________ Fecha: Fecha: 8. ANEXOS 277 8.6 Anexo VI Consentimiento informado de los casos en galego FOLLA DE INFORMACIÓN AO PARTICIPANTE ADULTO/A TÍTULO DO ESTUDO: Patrón de metilación en pacientes irradiados con cancro de cabeza e colo. INVESTIGADOR Mario Pérez-Sayáns García CENTRO: Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxía. Facultade de Odontoloxía da USC Este documento ten por obxecto facilitarlle información sobre un estudo de investigación no que se lle invita a participar. Este estudo foi aprobado polo Comité de Ética da Investigación de Santiago-Lugo. Se decide participar neste, debe recibir información personalizada do investigador, ler antes este documento e facer todas as preguntas que precise para comprender os detalles sobre este. Se así o desexa, pode levar o documento, consultalo con outras persoas, e tomar o tempo necesario para decidir se participar ou non. A participación neste estudo é completamente voluntaria. Vostede pode decidir non participar ou, se acepta facelo, cambiar de parecer retirando o consentimento en calquera momento sen ter que dar explicacións. Asegurámoslle que esta decisión non afectará á súa relación co médico nin á asistencia sanitaria á que vostede ten dereito. ¿Cal é o propósito do estudo? O propósito deste estudo é describir os efectos da radioterapia de cabeza e colo e estudar os diversos xenes que causan o cancro de cabeza e colo, PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 278 antes e despois da radioterapia. Pretendemos demostrar a alteración nos xenes para establecer tratamentos antitumorais. ¿Por que me ofrecen participar a min? Vostede é convidado a participar porque padece un carcinoma de cabeza e colo. ¿En que consiste a miña participación? Realizaráselle unha enxaugadura con solución de clorhexidina ao 0.12% sen alcohol (10 ml) para confirmar o patrón de metilación de determinados xenes diana. A enxaugadura realizarase unha hora despois do último cepillado, durante un período de 5 minutos antes de empezar co tratamento de radioterapia e un mes despois de finalizar o devandito tratamento repetiremos a enxaugadura. A súa participación terá unha duración total estimada de 10 minutos,é unha visita que forma parte do protocolo de manexo dos pacientes con cancro de cabeza e colo que recibir que van a recibir radioterapia. O investigador pode decidir finalizar o estudo antes do previsto ou interromper a súa participación. En todo caso informaráselle dos motivos da súa retirada ¿Que molestias ou inconvenientes ten? Os efectos secundarios que pode presentar son os derivados da enxaugadura. Pode presentar molestias durante a enxaugadura, picor e incapacidade de enxaugarse durante 5 minutos. ¿Obterei algún beneficio por participar? Non se espera que vostede obteña beneficio directo por participar no estudo. A investigación pretende descubrir aspectos descoñecidos ou pouco claros sobre a metilación no cancro de cabeza e colo. Esta información poderá ser de utilidade nun futuro para outras persoas. 8. ANEXOS 279 ¿Recibirei a información que se obteña do estudo? Se vostede deséxao, facilitaráselle un resumo dos resultados do estudo. Tamén poderá recibir os resultados das probas que se realicen coas súas mostras se así o solicita dirixíndose ao investigador. Estes resultados poden non ter aplicación clínica nin unha interpretación clara, polo que, se quere dispoñer deles, deberían ser comentados co médico do estudo. ¿Publicaranse os resultados deste estudo? Os resultados deste estudo serán remitidos a publicacións científicas para a súa difusión, pero non se transmitirá ningún dato que poida levar á identificación dos participantes. ¿Como se protexerá a confidencialidade dos meus datos e mostras? O tratamento, comunicación e cesión dos seus datos farase conforme ao disposto pola Lei Orgánica 15/1999, do 13 de decembro, de protección de datos de carácter persoal. En todo momento, vostede poderá acceder aos seus datos, corrixilos ou cancelalos, solicitándoo ante o investigador. Só o equipo investigador, e as autoridades sanitarias, que teñen deber de gardar a confidencialidade, terán acceso a todos os datos recollidos polo estudo. Pódese transmitir a terceiros información que non poida ser identificada. No caso de que algunha información sexa transmitida a outros países, realizarase cun nivel de protección dos datos equivalente, como mínimo, ao esixido pola normativa do noso país. Os seus datos e mostras biolóxicas serán recollidos e conservados ata finalizar o estudo de modo: Codificados, que quere dicir que posúen un código co que o equipo investigador poderá coñecer a quen pertencen. O responsable da custodia dos datos e mostras é Mario Pérez-Sayáns García, e o lugar de realización das análises previstas neste estudo é Facultade de Odontoloxía. Máster de Medicina Oral. Cirurxía Oral e Implatología e Departamento de Anatomía Patolóxica do Hospital Clínico de Santiago de Compostela. Ao rematar o estudo, conforme ao RD 1716/2011, as súas mostras biolóxicas serán Anonimizadas, é dicir, que rompeu todo vínculo que poida PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 280 identificar a persoa doadora da mostra, non podendo ser identificado nin sequera polo equipo investigador. ¿Existen intereses económicos neste estudo? Esta investigación é promovida polo Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxia da Facultade de Odontoloxia da USC con fondos achegados polo Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxía da Facultade de Odontoloxia da USC O investigador non recibirá retribución específica pola dedicación ao estudo. Vostede non será retribuído por participar. ¿Como contactar co equipo investigador deste estudo? Vostede pode contactar con Mario Pérez-Sayáns García no teléfono 981563100 Extensión12357 ou correo electrónico [email protected] Moitas grazas pola súa colaboración 8. ANEXOS 281 DOCUMENTO DE CONSENTIMENTO PARA A PARTICIPACIÓN NUN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados con cancro de cabeza e colo. Eu, _________________________________________________________ • Lin a folla de información ao participante do estudo arriba mencionado que se me entregou, puiden conversar con: ______________________________________ e facer todas as preguntas sobre o estudo necesarias. • Comprendo que a miña participación é voluntaria, e que podo retirarme do estudo cando queira, sen ter que dar explicacións e sen que isto repercuta nos meus coidados médicos. • Accedo a que se utilicen os meus datos e mostras nas condicións detalladas na folla de información ao participante. • Presto libremente a miña conformidade para participar neste estudo. Respecto á conservación DAS MOSTRAS recollidas neste estudio  Non accedo a que sexan conservadas unha vez rematado o estudo.  Accedo a que sexan conservadas anonimizadas. Fdo.: O/A participante, Fdo.: O/A investigador/a que solicita o consentimento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: _________________ Fecha: Fecha: PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 288 identificar a la persona donante de la muestra, no pudiendo ser identificado ni siquiera por el equipo investigador. ¿Existen intereses económicos en este estudio? Esta investigación es promovida por el Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Impantologia de la Faculta de Odontologia de la USC con fondos aportados por Máster de Medicina Oral, Cirugía Oral e Impantologia de la Faculta de Odontologia de la USC El investigador no recibirá retribución específica por la dedicación al estudio. Ud. no será retribuido por participar. ¿Cómo contactar con el equipo investigador de este estudio? Ud. puede contactar con Mario Pérez-Sayáns García en el teléfono. nº teléfono 981563100 Ext. 12357 o correo electrónico [email protected] Muchas gracias por su colaboración 8. ANEXOS 289 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiado en cáncer de cabeza y cuello. Yo, _________________________________________________________ • Leí la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se me entregó, pude conversar con: ______________________________________ y hacer todas las preguntas sobre el estudio necesarias. • Comprendo que mi participación es voluntaria, y que puedo retirarme del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en mis cuidados médicos. • Accedo a que se utilicen mis datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. • Presto libremente mi conformidad para participar en este estudio. Respecto a la conservación DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio  No accedo a que sean conservadas una vez terminado el estudio.  Accedo a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la participante, Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: _________________ Fecha: Fecha: PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 290 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO ANTE TESTIGOS PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDIO DE INVESTIGACIÓN (para los casos en los que el participante no pueda leer/escribir) El testigo imparcial ha de identificarse y ser una persona ajena al equipo investigador TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiado en cáncer de cabeza y cuello. Yo __________________________________________, como testigo imparcial, afirmo que en mi presencia: • Se le leyó __________________________________________ la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se le entregó, y pudo hacer todas las preguntas sobre al estudio. • Comprendo que su participación es voluntaria, y que puede retirarse del estudio cuando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. • Accede a que se utilicen sus datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. • Presta libremente su conformidad para participar en este estudio. Respecto a la conservación e utilización DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio  No accedió a que sean conservadas una vez terminado el estudio.  Accedió a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la testigo Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: _________________ Fecha: Fecha: 8. ANEXOS 291 DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO PARA REPRESENTANTE LEGAL PARA LA PARTICIPACIÓN EN UN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiado en cáncer de cabeza y cuello. Yo, ___________________________________ , representante legal de ___________________________________ ): • Leí la hoja de información al participante del estudio arriba mencionado que se me entregó, pude conversar con ____________________________________________ y hacer todas las preguntas sobre el estudio. • Comprendo que su participación es voluntaria, y que puede retirarse del estudio cando quiera, sin tener que dar explicaciones y sin que esto repercuta en sus cuidados médicos. • Accedo a que se utilicen sus datos y muestras en las condiciones detalladas en la hoja de información al participante. • Presto libremente mi conformidad para que participe en este estudio. Respecto a la conservación e utilización DE LAS MUESTRAS recogidas en este estudio  No accedo a que sean conservadas una vez terminado el estudio  Accedo a que sean conservadas anonimizadas. Fdo.: El/la representante legal, Fdo.: El/la investigador/a que solicita el consentimiento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: _________________ Fecha: Fecha: 8. ANEXOS 293 8.8 Anexo VIII Consentimiento informado de los controles en galego FOLLA DE INFORMACIÓN AO PARTICIPANTE ADULTO/A TÍTULO DO ESTUDO: Patrón de metilación en pacientes irradiados con cancro de cabeza e colo. INVESTIGADOR Mario Pérez-Sayáns García CENTRO: Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxía. Facultade de Odontoloxía da USC Este documento ten por obxecto facilitarlle información sobre un estudo de investigación no que se lle invita a participar. Este estudo foi aprobado polo Comité de Ética da Investigación de Santiago-Lugo. Se decide participar neste, debe recibir información personalizada do investigador, ler antes este documento e facer todas as preguntas que precise para comprender os detalles sobre este. Se así o desexa, pode levar o documento, consultalo con outras persoas, e tomar o tempo necesario para decidir se participar ou non. A participación neste estudo é completamente voluntaria. Vostede pode decidir non participar ou, se acepta facelo, cambiar de parecer retirando o consentimento en calquera momento sen ter que dar explicacións. Asegurámoslle que esta decisión non afectará á súa relación co médico nin á asistencia sanitaria á que vostede ten dereito. ¿Cal é o propósito do estudo? O propósito deste estudo é describir os efectos da radioterapia de cabeza e colo e estudar os diversos xenes que causan o cancro de cabeza e colo, PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 294 antes e despois da radioterapia. Pretendemos demostrar a alteración nos xenes para establecer tratamentos antitumorais. ¿Por que me ofrecen participar a min? Vostede é convidado a participar porque é un grupo control xa que non padece un carcinoma de cabeza e colo. ¿En que consiste a miña participación? Realizaráselle unha enxaugadura con solución de clorhexidina ao 0.12% sen alcohol (10 ml) para confirmar o patrón de metilación de determinados xenes diana. A enxaugadura realizarase unha hora despois do último cepillado, durante un período de 5 minutos. A súa participación terá unha duración total estimada de 5 minutos. O investigador pode decidir finalizar o estudo antes do previsto ou interromper a súa participación. En todo caso informaráselle dos motivos da súa retirada ¿Que molestias ou inconvenientes ten? Os efectos secundarios que pode presentar son os derivados da enxaugadura. Pode presentar molestias durante a enxaugadura, picor e incapacidade de enxaugarse durante 5 minutos. ¿Obterei algún beneficio por participar? Non se espera que vostede obteña beneficio directo por participar no estudo. A investigación pretende descubrir aspectos descoñecidos ou pouco claros sobre a metilación no cancro de cabeza e colo. Esta información poderá ser de utilidade nun futuro para outras persoas. ¿Recibirei a información que se obteña do estudo? Se vostede deséxao, facilitaráselle un resumo dos resultados do estudo. 8. ANEXOS 295 Tamén poderá recibir os resultados das probas que se realicen coas súas mostras solicita dirixíndose ao investigador. Estes resultados poden non ter aplicación clínica nin unha interpretación clara, polo que, se quere dispoñer deles, deberían ser comentados co médico do estudo. ¿Publicaranse os resultados deste estudo? Os resultados deste estudo serán remitidos a publicacións científicas para a súa difusión, pero non se transmitirá ningún dato que poida levar á identificación dos participantes. ¿Como se protexerá a confidencialidade dos meus datos e mostras? O tratamento, comunicación e cesión dos seus datos farase conforme ao disposto pola Lei Orgánica 15/1999, do 13 de decembro, de protección de datos de carácter persoal. En todo momento, vostede poderá acceder aos seus datos, corrixilos ou cancelalos, solicitándoo ante o investigador. Só o equipo investigador, e as autoridades sanitarias, que teñen deber de gardar a confidencialidade, terán acceso a todos os datos recollidos polo estudo. Pódese transmitir a terceiros información que non poida ser identificada. No caso de que algunha información sexa transmitida a outros países, realizarase cun nivel de protección dos datos equivalente, como mínimo, ao esixido pola normativa do noso país. Os seus datos e mostras biolóxicas serán recollidos e conservados ata finalizar o estudo de modo: Codificados, que quere dicir que posúen un código co que o equipo investigador poderá coñecer a quen pertencen. O responsable da custodia dos datos e mostras é Mario Pérez-Sayáns García, e o lugar de realización das análises previstas neste estudo é Facultade de Odontoloxía. Máster de Medicina Oral. Cirurxía Oral e Implatología e Departamento de Anatomía Patolóxica do Hospital Clínico de Santiago de Compostela. Ao rematar o estudo, conforme ao RD 1716/2011, as súas mostras biolóxicas serán Anonimizadas, é dicir, que rompeu todo vínculo que poida identificar a persoa doadora da mostra, non podendo ser identificado nin sequera polo equipo investigador. PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 296 ¿Existen intereses económicos neste estudo? Esta investigación é promovida polo Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxia da Facultade de Odontoloxia da USC con fondos achegados polo Máster de Medicina Oral, Cirurxía Oral e Impantoloxía da Facultade de Odontoloxia da USC O investigador non recibirá retribución específica pola dedicación ao estudo. Vostede non será retribuído por participar. ¿Como contactar co equipo investigador deste estudo? Vostede pode contactar con Mario Pérez-Sayáns García no teléfono 981563100 Extensión12357 ou correo electrónico [email protected] Moitas grazas pola súa colaboración 8. ANEXOS 297 DOCUMENTO DE CONSENTIMENTO PARA A PARTICIPACIÓN NUN ESTUDO DE INVESTIGACIÓN TÍTULO: Patrón de metilación en pacientes irradiados con cancro de cabeza e colo. Eu, _________________________________________________________ • Lin a folla de información ao participante do estudo arriba mencionado que se me entregou, puiden conversar con: ______________________________________ e facer todas as preguntas sobre o estudo necesarias. • Comprendo que a miña participación é voluntaria, e que podo retirarme do estudo cando queira, sen ter que dar explicacións e sen que isto repercuta nos meus coidados médicos. • Accedo a que se utilicen os meus datos e mostras nas condicións detalladas na folla de información ao participante. • Presto libremente a miña conformidade para participar neste estudo. Respecto á conservación DAS MOSTRAS recollidas neste estudio  Non accedo a que sexan conservadas unha vez rematado o estudo.  Accedo a que sexan conservadas anonimizadas. Fdo.: O/A participante, Fdo.: O/A investigador/a que solicita o consentimento Nombre y apellidos: __________________ Nombre y apellidos: _________________ Fecha: Fecha: Articulo II: State of Methylation and epigenome studies in some types of head and neck cancer 8. ANEXOS 355 8.12 Anexo XII. Permisos para reproducir imágenes OXFORD UNIVERSITY PRESS LICENSE TERMS AND CONDITIONS Dec 10, 2018 This Agreement between calle perez cepeda 10 ("You") and Oxford University Press ("Oxford University Press") consists of your license details and the terms and conditions provided by Oxford University Press and Copyright Clearance Center. License Number 4485570544595 License date Dec 10, 2018 Licensed Content Publisher Oxford University Press Licensed Content Publication Journal of Molecular Cell Biology Licensed Content Title Epigenetic changes of DNA repair genes in cancer Licensed Content Author Lahtz, Christoph; Pfeifer, Gerd P. Licensed Content Date Feb 1, 2011 Type of Use Thesis/Dissertation Institution name Title of your work Evaluación clinica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello Publisher of your work master de medicina oral, cirugía e implantología Expected publication date Dec 2018 Permissions cost 0.00 EUR Value added tax 0.00 EUR Total 0.00 EUR Title Evaluación clinica y molecular de los efectos de la radioterapia en pacientes con cáncer de cabeza y cuello Institution name master de medicina oral, cirugía e implantología Expected presentation date Dec 2018 Order reference number Figure 1 Portions Figure 1 Specific Languages Spanish Requestor Location calle perez cepeda 10 calle perez cepeda 10 a coruña, a coruña 15004 Spain Attn: calle perez cepeda 10 Publisher Tax ID GB125506730 Billing Type Invoice Billing Address calle perez cepeda 10 calle perez cepeda 10 PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 356 a coruña, Spain 15004 Attn: calle perez cepeda 10 Total 0.00 EUR Terms and Conditions STANDARD TERMS AND CONDITIONS FOR REPRODUCTION OF MATERIAL FROM AN OXFORD UNIVERSITY PRESS JOURNAL 1. Use of the material is restricted to the type of use specified in your order details. 2. This permission covers the use of the material in the English language in the following territory: world. If you have requested additional permission to translate this material, the terms and conditions of this reuse will be set out in clause 12. 3. This permission is limited to the particular use authorized in (1) above and does not allow you to sanction its use elsewhere in any other format other than specified above, nor does it apply to quotations, images, artistic works etc that have been reproduced from other sources which may be part of the material to be used. 4. No alteration, omission or addition is made to the material without our written consent. Permission must be re-cleared with Oxford University Press if/when you decide to reprint. 5. The following credit line appears wherever the material is used: author, title, journal, year, volume, issue number, pagination, by permission of Oxford University Press or the sponsoring society if the journal is a society journal. Where a journal is being published on behalf of a learned society, the details of that society must be included in the credit line. 6. For the reproduction of a full article from an Oxford University Press journal for whatever purpose, the corresponding author of the material concerned should be informed of the proposed use. Contact details for the corresponding authors of all Oxford University Press journal contact can be found alongside either the abstract or full text of the article concerned, accessible from www.oxfordjournals.org Should there be a problem clearing these rights, please contact [email protected] 7. If the credit line or acknowledgement in our publication indicates that any of the figures, images or photos was reproduced, drawn or modified from an earlier source it will be necessary for you to clear this permission with the original publisher as well. If this permission has not been obtained, please note that this material cannot be included in your publication/photocopies. 8. While you may exercise the rights licensed immediately upon issuance of the license at the end of the licensing process for the transaction, provided that you have disclosed complete and accurate details of your proposed use, no license is finally effective unless and until full payment is received from you (either by Oxford University Press or by Copyright Clearance Center (CCC)) as provided in CCC's Billing and Payment terms and conditions. If full payment is not received on a timely basis, then any license preliminarily granted shall be deemed automatically revoked and shall be void as if never granted. Further, in the event that you breach any of these terms and conditions or any of CCC's Billing and Payment terms and conditions, the license is automatically revoked and shall be void as if never granted. Use of materials as described in a revoked license, as well as any use of the materials beyond the scope of an unrevoked license, may constitute copyright infringement and Oxford University Press reserves the right to take any and all action to protect its copyright in the materials. 9. This license is personal to you and may not be sublicensed, assigned or transferred by you to any other person without Oxford University Press’s written permission. 10. Oxford University Press reserves all rights not specifically granted in the combination of (i) the license details provided by you and accepted in the course of this licensing transaction, (ii) these terms and conditions and (iii) CCC’s Billing and Payment terms and conditions. 11. You hereby indemnify and agree to hold harmless Oxford University Press and CCC, and their respective officers, directors, employs and agents, from and against any and all claims arising out of your use of the licensed material other than as specifically authorized pursuant to this license. 12. Other Terms and Conditions: v1.4 Questions? [email protected] or +1-855-239-3415 (toll free in the US) or +1-978-646-2777. 8. ANEXOS 357 Estimada Paula Boñar Álvarez, Reciba usted un cordial saludo, Como revista MedUNAB, podemos otorgar el permiso para utilizar las ilustraciónes del artículo que fue publicado en nuestra revista en el año 2003 de la edición 6(16) para su tesis doctoral, teniendo como condición que usted pueda comprometerse por escrito que indicará de manera adecuada el origen de la ilustración a utilizar del artículo: Lomanto Díaz, L., Ortiz Cala, Óscar, Bretón Pinto, C., Gómez Lizcano, Álvaro, & Mesa Cornejo, V. (1). El ciclo celular. MedUNAB, 6(16), 21-29. https://doi.org/10.29375/01237047.266 En el trabajo escrito de su tesis, deberá hacer la aclaración que la imagen es autorizada para su uso por la Revista MedUNAB y poner la cita del artículo en el que se publicó. Puede utilizar la cita que le enviamos en el presente correo subrayada en amarillo. A continuación el link que la llevará al artículo y encontraá información de los autores y sobre como citar que puede serle de utilidad: https://revistas.unab.edu.co/index.php/medunab/article/view/266 Quedamos atentos a su respuesta. Muchas gracias, Comité Editorial Revista MedUNAB ********************************************** Universidad Autónoma de Bucaramanga UNAB Facultad de Ciencias de la Salud UNAB Revista MedUNAB (7) 6571800 Ext. 549 - 529 [email protected] MedUNAB https://revistas.unab.edu.co/index.php/medunab/index Calle 157 No. 19-55 Cañaveral Parque Campus El Bosque, Floridablanca-Santander Código postal: 680003 PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 358 8.13 Anexo XIII. Material suplementario En las siguientes tablas se especifica de cada muestra la concentración y la pureza con los valores de absorbancia 260/280 y 260/230 tanto para los casos como para los controles. Características de las muestras del grupo de casos Pre-RTP (NaN). Caso Ng/microL 260/280 260/230 1 148,72 1,86 0,91 2 946,76 1,28 1,39 4 474,24 1,88 6,72 5 214,11 2,06 2,37 6 83,46 2,00 1,50 7 96,97 1,72 1,50 8 287,25 1,97 1,29 12 349,87 1,84 1,83 13 756,6 1,86 0,98 18 931,42 2,02 1,61 19 878,24 2,00 1,53 34 351,72 1,79 1,07 41 825,27 2,72 1,11 42 413,42 2,29 1,00 43 719,46 1,82 1,60 44 713,19 1,73 0,79 45 920,24 1,84 0,82 46 699,88 2,05 0,98 49 107,62 2,08 0,31 51 334,39 1,84 0,76 52 345,94 1,92 0,69 54 108,53 1,81 0,44 55 303,22 1,91 0,51 59 545,36 1,78 1,16 62 241,72 2,10 0,97 63 925,58 1,91 1,22 64 924,32 1,92 1,24 70 617,22 1,59 1,64 71 760,68 2,92 1,10 72 995 2,80 1,19 73 897 1,81 0,95 74 974 1,72 0,54 75 887,96 1,88 1,08 76 244,98 1,67 0,47 78 153,24 1,54 0,30 79 844,67 1,74 0,55 80 169,33 1,89 0,39 81 957,16 2,26 1,07 83 800,17 2,13 0,83 84 714,94 1,91 0,89 85 879,28 2,09 0,99 87 942,78 1,89 0,90 8. ANEXOS 359 Características de las muestras del grupo de casos Post-RTP (NaN) Caso Ng/micoroL 260/280 260/230 10 147,81 1,79 0,98 15 135,67 1,74 0,82 16 498,95 2,15 1,30 17 929,9 2,00 1,50 20 451,76 1,45 1,21 21 273,23 1,58 0,94 22 299,86 1,70 0,90 23 539,24 1,53 1,12 24 750 1,89 1,49 25 167,95 2,23 1,05 26 280 1,83 1,73 28 920,2 1,72 1,54 29 420,97 1,47 1,06 30 519,19 1,69 1,21 31 236,57 1,82 1,35 33 434,56 1,76 1,16 35 323,9 1,79 1,02 37 416,05 1,73 1,27 39 336,37 2,60 1,35 40 818,36 2,35 1,10 47 860,53 1,95 2,00 48 566,2 1,79 1,27 50 453,8 1,91 0,87 53 454,07 2,17 0,82 56 956,45 2,15 1,02 57 975,77 1,68 0,84 58 159,61 1,46 1,49 60 438,97 2,22 1,01 61 920,72 2,10 1,19 65 960,2 1,34 1,35 67 135,24 1,59 0,44 68 935,17 1,65 0,90 77 278,6 1,74 0,57 82 437,1 2,21 1,29 86 766,28 2,53 1,53 PAULA BOÑAR ÁLVAREZ 360 Características de las muestras del grupo control (NaN) Control Ng/micoroL 260/280 260/230 1 195 1,80 0,76 3 163,78 1,84 0,78 4 269,82 1,77 1,09 5 647,61 1,93 1,07 6 106,72 1,67 0,56 7 925,6 1,75 1,93 9 792 1,78 1,00 11 381,27 1,64 1,31 13 287,72 1,70 0,82 14 349,66 1,97 0,88 15 94 1,51 0,74 17 91 1,82 1,53 18 533,92 1,92 1,69 20 546,48 1,71 1,10 21 287,23 1,49 1,28 22 884,89 1,80 1,11 25 460,85 1,83 1,79 26 486,65 2,00 1,52 27 976,02 1,96 1,51 28 302,66 1,94 1,52 29 347,55 1,88 1,10 34 170,25 1,81 0,98 35 100,86 1,77 0,53