Secuenciación de exomas en trastornos del neurodesarrollo de especial dificultad diagnóstica

Traballo de fin de grao Secuenciación de exomas en trastornos do neurodesenvolvemento de especial dificultade diagnóstica Secuenciación de exomas en trastornos del neurodesarrollo de especial dificultad diagnóstica Exome sequencing in neurodevelopmental disorders of special diagnostic difficulty Autora: Ana López Penedo Titor: Ángel María Carracedo Álvarez Cotitor: Julio Rodríguez López Departamento: Medicina Xenómica. Pediatría Curso académico: 2020-2021 Convocatoria Xuño 2021 Traballo de Fin de Grao presentado na Facultade de Medicina e Odontoloxía da Universidade de Santiago de Compostela para a obtención do Grao en Medicina ANA LÓPEZ PENEDO Índice Resumen…………………………………………………………………………………1 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 6 1.1 Trastornos del neurodesarrollo. ........................................................................ 6 1.1.1 Discapacidad intelectual. .............................................................................. 6 1.1.2 Trastorno de la comunicación....................................................................... 7 1.1.3 Trastorno del espectro del autismo (TEA). .................................................. 9 1.1.4 Trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH). ................. 10 1.1.5 Trastorno específico del aprendizaje. ......................................................... 11 1.1.6 Trastorno motor. ......................................................................................... 12 1.2 Comorbilidad de los trastornos del neurodesarrollo. ...................................... 13 1.2.1 Epilepsia como comorbilidad. .................................................................... 15 1.2.2 Modelo del doble impacto (two-hit) y expresividad variable..................... 15 1.3 Etiología de los trastornos del neurodesarrollo. ............................................. 16 1.3.1 Factores ambientales................................................................................... 16 1.3.2 El papel de la genética en los trastornos del neurodesarrollo. .................... 16 1.4 Utilidad del diagnóstico genético en los trastornos del neurodesarrollo: ...... 17 1.4.1 Variantes genéticas. .................................................................................... 18 1.4.2 Técnicas de investigación genética............................................................. 18 2. ANTECEDENTES ................................................................................................. 17 2.1 Probando afecto 1 ........................................................................................... 17 2.2 Probando afecto 2 ........................................................................................... 17 2.3 Probando afecto 3 ........................................................................................... 17 3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 19 4. MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................... 20 4.1 Columnas de anotación de variantes: ............................................................. 21 4.1.1 Definición de la variante: ........................................................................... 21 4.1.2 Anotaciones de posición genómica con respecto al gen y cambios en la secuencia de aminoácidos:...................................................................................... 22 4.1.3 Anotaciones de frecuencia poblacional: ..................................................... 24 4.1.4 Anotaciones internas: ................................................................................. 25 4.1.5 Anotaciones clínicas: .................................................................................. 25 4.1.6 Anotaciones de la predicción de patogenicidad: ........................................ 26 4.2 Criterios para el filtrado inicial de variantes: ................................................. 27 4.3 Priorización de variantes: ............................................................................... 28 4.4 Clasificación de las variantes: ........................................................................ 28 ANA LÓPEZ PENEDO 4.5 Aspectos éticos del estudio ............................................................................. 31 5. RESULTADOS ...................................................................................................... 32 5.1 Probando afecto 1 ........................................................................................... 32 5.2 Probando afecto 2 ........................................................................................... 33 5.3 Probando afecto 3 ........................................................................................... 34 6. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 35 6.1 Probando afecto 1 ........................................................................................... 35 6.2 Probando afecto 2 ........................................................................................... 36 6.3 Probando afecto 3 ........................................................................................... 37 7. CONCLUSIONES .................................................................................................. 38 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 40 ANA LÓPEZ PENEDO Abstract 3 Resumen Antecedentes: los trastornos del neurodesarrollo (TND), son un conjunto heterogéneo de cuadros clínicos que tienen en común la presencia de alteraciones cognitivas y del comportamiento de comienzo en el período del desarrollo y que producen limitaciones funcionales en varios ámbitos de la vida de quien lo padece. Si bien su etiología es compleja y múltiple, tienen una base genética predominante. En ellos puede existir una variación común que contribuye a la enfermedad pero también variantes raras, la mayoría de las cuales son mutaciones puntuales que requieren de paneles de genes o análisis de exomas o genomas completos. Objetivo: El objetivo principal de este trabajo consiste llevar a cabo un análisis del exoma completo de tres pacientes con TND complejos, los cuales muestran un fenotipo grave, claramente sindrómico, lo que puede indicar una posible causa genética subyacente, y cuyo diagnóstico no ha sido esclarecido con otros test genéticos de rutina previos. Métodos: Partiendo de la clínica de cada sujeto, se utilizaron un conjunto de herramientas in silico para aplicar una serie de criterios de filtrado de variantes, teniendo en cuenta criterios de calidad, la posición genómica, los cambios de aminoácidos, las frecuencias poblacionales y la clínica asociada de cada una. Posteriormente, se consultaron diferentes bases de datos (OMIM, ClinVar, Varsome) para el análisis y priorización de las variantes candidatas tras el filtrado inicial y se clasificaron las variantes según su patogenicidad atendiendo a los criterios propuestos por la American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Finalmente, se llevó a cabo una caracterización bibliográfica de los genes en relación con la historia clínica de los individuos. Resultados: Hallamos variantes que explican el fenotipo de los tres probandos afectos aportándonos el diagnóstico genético de cada uno de ellos. Palabras clave: trastorno del neurodesarrollo, trastorno del espectro autista, trastorno por déficit de atención/hiperactividad, discapacidad intelectual, comorbilidad, fenotipo sindrómico, genética del neurodesarrollo, medicina genómica, medicina de precisión, Next Generation sequencing, secuenciación de exomas, variantes puntuales, genética clínica, priorización de variantes, análisis genómico, biomedicina. ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 4 Resumo Antecedentes: Os trastornos do neurodesenvolvemento (TND) son un conxunto heteroxéneo de cadros clínicos que teñen en común a presenza de alteracións cognitivas e do comportamento que comezan no período do desenvolvemento e que producen limitacións funcionais en varias áreas da vida da persoa. Aínda que a súa etioloxía é complexa e múltiple, teñen unha base xenética predominante. Neles, hai unha variación común que contribúe á enfermidade pero tamén variacións raras, a maioría das cales son mutacións puntuais que requiren paneis xénicos ou análise de exomas ou xenomas completos. Obxectivos: o principal obxectivo deste traballo é realizar unha análise do exoma completo de tres pacientes con TND complexo, que amosan un fenotipo grave claramente sindrómico, que pode indicar unha posible causa xenética subxacente e cuxo diagnóstico non foi aclarado con outras probas xenéticas de rutina anteriores. Métodos: partindo da clínica de cada suxeito, utilizáronse un conxunto de ferramentas in silico para aplicar unha serie de criterios de filtrado de variantes, tendo en conta criterios de calidade, posición xenómica, cambios de aminoácidos, frecuencias poboacionais e a clínica asociada de cada un. Posteriormente, consultáronse diferentes bases de datos para a análise e priorización das variantes candidatas despois do filtrado inicial e clasificáronse as variantes segundo a súa patoxenicidade de acordo cos criterios propostos pola American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Finalmente, levouse a cabo unha caracterización bibliográfica dos xenes en relación coa historia clínica dos individuos. Resultados: atopamos variantes que explican o fenotipo dos tres probandos afectados, proporcionándonos o diagnóstico xenético de cada un deles. Palabras clave: trastorno do neurodesenvolvemento, trastorno do espectro autista, déficit de atención/hiperactividade, discapacidade intelectual, comorbilidade, fenotipo sindrómico, xenética do neurodesenvolvemento, medicina xenómica, medicina de precisión, Next Generation Sequencing, secuenciación de exomas, variantes puntuais, xenética clínica, priorización de variantes, análise xenómico, biomedicina. ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 5 Abstract Background: Neurodevelopmental disorders (NDDs) are an heterogeneous set of clinical features that have in common the presence of cognitive and behavioral impairments that begin early onset in the developmental period and produce functional limitations in several situations of the person’s daily life. Although their etiology is complex and multiple, they have a predominant genetic basis. Some of them have common variations that contribute to the disease, but there are also rare ones, most of which are point mutations that require gene panels or analysis of exomes or even complete genomes in order to achieve the diagnosis. Objective: The main objective of this project is to carry out an analysis of the complete exome of three patients with complex NDDs. They show a severe phenotype, which may indicate a possible underlying genetic cause, and their diagnosis has not been clarified with other previous routine genetic tests. Methods: Starting from the phenotype of each subject, a set of in silico tools were used to apply some variant filtering criteria, taking into account quality criteria, genomic position, amino acid changes, population frequencies and associated clinic of each one. Subsequently, different databases were consulted for the analysis and prioritization of the candidate variants that remained after the initial filtering, and they were classified according to their pathogenicity using the criteria proposed by the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Finally, a bibliographic characterization of the genes was carried out considering the clinical history of the individuals. Results: We found variants that may explain the phenotype of the three affected children, providing us with the genetic diagnosis for each one of them. Keywords: neurodevelopmental disorder, autism spectrum disorder, attention-deficit hyperactivity disorder, intelectual disability, comorbidity, syndromic phenotype, neurodevelopmental genetics, genomic medicine, precisión medicine, Next Generation sequencing, point variants, clinical genetics, variant priorization, genomic analysis, biomedicine. ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 6 1. INTRODUCCIÓN 1.1 TRASTORNOS DEL NEURODESARROLLO. Bajo el nombre de trastornos del neurodesarrollo (TND), se engloban un conjunto heterogéneo de cuadros clínicos que tienen en común la presencia de alteraciones cognitivas y del comportamiento de comienzo en el período del desarrollo (en la mayoría de los casos antes del inicio de la etapa escolar). Estos déficits dificultan la adquisición y ejecución de funciones intelectuales, motoras y sociales específicas, que se valoran como inferiores a las esperadas para la edad cronológica del paciente y terminan afectando al terreno personal, al de las relaciones sociales, al ámbito académico y posteriormente, al ocupacional del paciente. Su etiopatogenia, en muchos casos desconocida, es muy compleja y se basa esencialmente en la variación en el crecimiento y desarrollo del cerebro, asociando una alteración funcional del mismo (1, 2, 3). El diagnóstico clínico pueda ser dificultoso e insuficiente, jugando un papel importante la valoración neuropsicológica y multidisciplinar debido a la ausencia de biomarcadores específicos, la presencia aislada de manifestaciones clínicas de los respectivos en individuos “normales” no considerándose por ello patológico y teniendo que atender a su gravedad o presentación en una edad que no le corresponde para determinar su inclusión en un TND; así como la ausencia de límites claros entre unos y otros trastornos debido a la concurrencia de síntomas entre ellos y la frecuente comorbilidad asociada (4, 5). El Manual Diagnóstico y Estadístico de los Trastornos Mentales (DSM-5, en inglés Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) establece una clasificación que organiza a estos trastornos en seis entidades diferentes y con frecuencia coexistentes en un mismo individuo: discapacidad intelectual (DI), trastornos de la comunicación, trastorno del espectro del autismo (TEA), trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH), trastorno específico del aprendizaje y trastornos motores (1). 1.1.1 Discapacidad intelectual. La discapacidad intelectual (DI) se define como un trastorno con inicio en el período del desarrollo definido por déficits de las funciones intelectuales y adaptativas que provocan una limitación funcional en una o más actividades de la vida diaria. Las limitaciones en el comportamiento adaptativo se basan en la afectación de al menos una de las siguientes tres esferas: conceptual (incluye competencias en lenguaje, lectura o escritura), práctico (cuidado personal, organización de las tareas de trabajo) y social (empatía, habilidades de comunicación interpersonal). Tras el estudio de estos tres dominios, se establece un diagnóstico de gravedad en cuatro grados: leve, moderado, grave y profundo. Si bien la DI no suele ser progresiva, tiende a mantenerse a lo largo de toda la vida del paciente, con niveles de severidad que pueden fluctuar en el tiempo (1). ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 7 Su estudio debe basarse en una evaluación clínica individualizada y en el uso de test neuropsicológicos y de inteligencia estandarizados. Las personas con DI manifiestan una puntuación de aproximadamente dos o más desviaciones estándar por debajo de la media para individuos de la misma edad, sexo y contexto sociocultural del paciente y un coeficiente intelectual (CI) menor de 70 (1). Muchos artículos hablan a favor de un abordaje multidisciplinar y psicológico más amplio que el tradicional uso exclusivo de la puntuación del CI para definir a una persona como discapacitada intelectualmente (1, 6, 7). De acuerdo con los resultados aportados en 2014 por el “Centers for Disease Control and Prevention” (CDC), su prevalencia es de en torno el 1,10% siendo más frecuente en varones (1,5:1) (8). Mención a parte merece el denominado retraso del desarrollo global, reservado de acuerdo con la DSM para “individuos menores de cinco años cuando el nivel de severidad clínico no puede ser valorado de forma fiable durante la infancia temprana”, requiriendo una reevaluación posterior (1). 1.1.2 Trastorno de la comunicación. La comunicación se define como cualquier comportamiento verbal o no verbal que influya en la conducta, ideas o actitudes hacia otro individuo de manera intencionada o involuntaria. Los trastornos de la comunicación se dividen a su vez en: trastornos del lenguaje, trastornos fonológicos, trastornos de fluidez de inicio en la infancia, o tartamudeo, y trastornos de la comunicación. Es de especial importancia tener en cuenta el contexto sociocultural del individuo. 1.1.2.1 Trastorno del lenguaje. Por lenguaje se entiende el uso, forma y función de un conjunto convencional de símbolos en una manera ordenada por reglas para el acto comunicativo. Dentro de este subgrupo se engloban déficits en la compresión o producción del lenguaje debido a dificultades en su adquisición y empleo. Estas limitaciones afectan al léxico (como un vocabulario reducido) y a la gramática (estructuras de oraciones limitadas) y pueden alterar predominantemente a la habilidad expresiva (capacidad de emitir señales vocales, gestuales o verbales) o receptiva (recepción y comprensión de mensajes), en cuyo caso el pronóstico es más infausto y con mayor resistencia al tratamiento. Interfieren en las esferas académica, ocupacional o social y no pueden ser atribuibles a otras condiciones médicas (1, 9). Se inicia en el período del desarrollo, mas no es hasta pasados los cuatro años cuando las diferencias se hacen más evidentes y más fácilmente medibles. ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 8 El diagnóstico se basa en la historia y observación del niño en diferentes contextos, información que puede ser aportada por los padres o profesores y, por otro lado, la realización de test de habilidades del lenguaje estandarizados, que ayudan a establecer la severidad de la situación (1, 9). 1.1.2.1 Trastorno fonológico. Se caracterizan por dificultades para la articulación clara de fonemas alterando la inteligibilidad del habla. Se sustenta en mecanismos muy heterogéneos que incluyen un conocimiento de los sonidos y una capacidad de coordinación de los movimientos articulatorios. Ocasiona limitaciones en la comunicación eficaz de mensajes verbales que interfieren con los ámbitos académico-socio-ocupacionales del paciente. Como en todo TND, es de inicio temprano en el período del desarrollo y no es atribuible a otra causa médica subyacente (1). Un correcto diagnóstico y tratamiento eficaz permite en ocasiones mejorar las dificultades que pueden no estar presentes a lo largo de toda la vida del paciente. 1.1.2.2 Trastorno de la fluidez de inicio en la infancia (tartamudeo). Inadecuación para la edad del paciente de la fluidez y organización temporal normal del habla. Estas perturbaciones producen ansiedad en el paciente al hablar, sobre todo en determinados contextos como la presentación de un proyecto en público. Situaciones de estrés o ansiedad pueden exacerbar los síntomas que llegan a limitar la comunicación eficaz y con ello el rendimiento académico, laboral y las interrelaciones personales. Se inicia en el período del desarrollo, en la mayoría de los casos entre los 2 y 7 años. A medida que el niño crece y se hace consciente de su limitación, tiende a crear mecanismos de evitación de las situaciones incómodas y exacerbadoras de sus disfluencias, como no hablar en público o hacerlo con expresiones cortas (1). 1.1.2.4 Trastorno de la comunicación social (pragmático). Los trastornos de la comunicación social incluyen cuadros clínicos donde el paciente a pesar de haber desarrollado una expresión del lenguaje correcta manifiesta dificultades para un uso adecuado de él en la comunicación social tanto verbal como no verbal, con dificultades para adaptarse al contexto en el que se encuentra, incapacidad de seguir las normas de conversación, como respeto del turno de palabra y limitaciones para comprender significados no literales o ambiguos, entre otros. Todo esto condiciona las funciones del individuo en ciertos ámbitos. (1, 9) Debido a su dependencia en el desarrollo del lenguaje, es raro el diagnóstico antes de los cuatro años si bien el inicio debe tener lugar en la infancia temprana. En las formas más leves, el diagnóstico puede demorarse incluso hasta la adolescencia. ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 15 1.2.1 Epilepsia como comorbilidad. Si tuviésemos que destacar un proceso neurológico que tiene una elevada comorbilidad con los TND, este sería la epilepsia (3). Se define como una enfermedad cerebral crónica debida a descargas anómalas de neuronas de la corteza cerebral que ocasionan convulsiones recurrentes. Tiene una prevalencia en España de 62,7 casos por cada 100.000 habitantes/año (3, 25). Concurre en un tercio de los casos de TEA y de DI, sugiriendo una etiología común al menos en algunas formas (22, 26). Sin embargo, en ocasiones es difícil saber si es la epilepsia causa de una alteración del neurodesarrollo o si por el contrario ambas condiciones derivan de una lesión inicial del SNC (3). Por un lado, se han descrito genes responsables de alteraciones en el correcto desarrollo del SNC implicados en procesos como la neurogénesis cortical o alteraciones moleculares de canales iónicos, y por otra parte se ha constatado la implicación de las crisis epilépticas en cambios de la expresión génica o en la liberación de neurotransmisores, efectos que resultan en un impacto negativo sobre la cognición y la conducta (27). Un estudio llevado a cabo en el 2016 por Casanova EL et al. evaluó la comorbilidad de una lista de casos de DI con origen molecular conocido extraído de la base de datos de Mendelian Inheritance in Man (MIM). Sus resultados reflejaron que el 45% de los casos de DI tenían TEA asociado, el 44% manifestaban una elevada comorbilidad con epilepsia y que el 55% de las situaciones relacionadas con autismo tenían como característica común a la epilepsia (22). 1.2.2 Modelo del doble impacto (two-hit) y expresividad variable. En un intento de dar explicación a la elevada comorbilidad de los TND y al hallazgo de una misma variante en individuos sanos y en pacientes con un determinado fenotipo o entre personas con cuadros clínicos diferentes, se puede recurrir al modelo del doble impacto propuesto por Knudson AG et al en 1973. En él, se explica la heredabilidad de una mutación con capacidad oncogénica, pero para que el tumor se manifieste, deben tener lugar dos fenómenos: por un lado, la presencia del gen tumoral y por otro, una mutación en el alelo homólogo encargado de anular la capacidad oncogénica en condiciones normales y cuya inactivación supondría la pérdida de la capacidad supresora y la expresión del tumor (28). Esto, extrapolado a los TND, podría explicar que la aparición de diversos fenotipos ante una variante concreta haría alusión a la presencia de otras variantes asociadas (28). Sin embargo, este concepto con frecuencia se ve mezclado con el de expresividad variable, o grado de expresión individual de un fenotipo para un genotipo dado. Con este término, se alude al hecho de que un mismo genotipo produce manifestaciones clínicas diferentes en cuanto a tipo y grado de severidad dependiendo de la persona que lo porte (incluso dentro de una misma familia), con la teoría de que esto se pueda deber a la relación del gen con el resto del genoma y a la existencia de otras variantes no detectadas que serían las determinantes del fenotipo, pero también a una posible involucración de factores medioambientales y su interacción con el genoma. ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 16 La expresividad variable no debe ser confundida con el concepto de penetrancia, que se refiere a la proporción de individuos con una mutación patogénica que manifiestan alguna clínica asociada a ella, pudiendo ser esta completa, si en todo aquel que tenga la mutación, esta se expresa fenotípicamente; o bien incompleta, donde el porcentaje de expresión en la población varía. 1.3 ETIOLOGÍA DE LOS TRASTORNOS DEL NEURODESARROLLO. Gran parte de los TND no tienen un origen etiopatogénico único, sino que es la interacción entre genética, epigenética y ambiente, la responsable de su aparición, demostrándose un carácter etiológico multifactorial (4, 29). Por lo tanto, en la mayoría de los casos se postula una herencia poligénica donde diferentes condicionantes exógenos y/o endógenos juegan un importante papel modulador (17, 21, 30). 1.3.1 Factores ambientales. Se han estudiado eventos intrauterinos que afectan al temprano desarrollo fetal y otros insultos neonatales como posibles factores de riesgo para la aparición de TND (31). Así, la edad elevada parental, la exposición prenatal del feto a sustancias tóxicas como la nicotina, el ácido valproico o el alcohol o el crecimiento intrauterino retardado y el bajo peso al nacer, se han asociado a mayores tasas de TND (1, 22, 31, 32). Se estima que el 15% de los recién nacidos pretérmino presentarán un TND (1, 3, 31). Además, factores perinatales como accidentes obstétricos que lleguen a producir hipoxia fetal también han demostrado una asociación con este tipo de trastornos (1, 17). Mención necesaria merece el hecho de que estos factores por sí solos no son causa de TND, sino que es su actuación sobre el componente genético la que puede influir sobre su etiopatogenia. 1.3.2 El papel de la genética en los trastornos del neurodesarrollo. Las bases del desarrollo del SNC se sustentan en el material genético. Mutaciones que alteren su correcto funcionamiento pueden predisponer a la aparición de TND, en las llamadas formas sindrómicas. En ellas es frecuente la confluencia de diferentes manifestaciones sistémicas, rasgos dismórficos y otras alteraciones que apoyan, sobre todo en los casos más graves, la complementación de la evaluación clínica con un correcto estudio genético (4). En prácticamente todos ellos se ha identificado la región genética responsable y se ajustan a un patrón de herencia de tipo mendeliano (28). La coexistencia de diferentes TND en una misma persona ha llevado al planteamiento de la hipótesis de un posible origen común y heredabilidad compartida entre ellos. Estudios de hermanos gemelares corroboran la elevada correlación genética. Gracias a los nuevos avances, se ha visto que diferentes variantes se relacionan con diversos trastornos y que una misma alteración genética se asocia a más de un fenotipo distinto, quedando obsoleto el modelo de “un gen para una enfermedad” (3, 4, 5, 28). La mayor parte de los estudios realizados hasta la fecha señalan una heredabilidad de en torno al 0,77-0,88 y se centran en tres entidades en concreto: la DI, el TEA y el ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 17 TDAH, siendo escasas las referencias literarias de estudios científicos en lo que respecta al resto de TND (4). Estudios genéticos, de adopción y de hermanos gemelares han establecido una alta heredabilidad del TDAH, de en torno el 75% (16, 17). Por su parte, la del TEA se estima ser de entre el 37 al 90% (1, 12). Un análisis llevado a cabo en 2017 por Sandin et al., proporcionó un porcentaje de herencia más preciso, del 83% (33). En el 15% de ellos, se asociaban a una mutación genética conocida (12) y en un 50% de los casos, la herencia puede ser explicada por los SNPs (34). La mayoría de los genes relacionados con el autismo se localizan en el núcleo y funcionan como reguladores epigenéticos nucleares, formando parte integral del desarrollo neural (22). Sin embargo, también son frecuentes las mutaciones de novo o espontáneas, aquellas identificadas en el paciente sin haber sido heredadas de sus progenitores (18). 1.4 UTILIDAD DEL DIAGNÓSTICO GENÉTICO EN LOS TRASTORNOS DEL NEURODESARROLLO: La rentabilidad diagnóstica de los TEA y la DI ha pasado de ser del 3-5% al 30-40% con la aparición de nuevas técnicas de mayor resolución como los microarrays cromosómicos los cuales se postulan como una de las técnicas de referencia de estos trastornos. Mención especial merecen también las técnicas de secuenciación masiva de nueva generación como la secuenciación exómica, de ayuda en la resolución del origen genéticos de alta sospecha clínica donde los estudios previos reflejan conclusiones normales o no del todo aclaratorias (4). Así mismo, estos avances han aumentado nuestros conocimientos sobre el TDAH, el mayormente estudiado en las últimas décadas, permitiendo identificar genes que previamente se relacionaban con otros TND, epilepsia o esquizofrenia en estos sujetos y patrones de heredabilidad y variantes presentes en la población general pero cuya prevalencia es mayor en pacientes con TDAH (4). A parte de la tipificación etiológica de parte de los TND, su estudio genético permite descartar hipótesis diagnósticas alternativas, evitar la realización de pruebas innecesarias, o estudiar y prevenir afectaciones multisistémicas. Además, proporciona la posibilidad de ofrecer un consejo genético familiar y asesoramiento preconcepcional y prenatal para ayudar a comprender la naturaleza del proceso y a tomar decisiones en ocasiones muy difíciles como si tener o no más hijos o la realización de una intervención intrauterina. Esta decisión dependerá en parte de si ha sido identificada la causa genética del TND en su primer hijo. De ser así, y si la detectada es una mutación de novo, los hijos posteriores tendrán el mismo riesgo de TND que la población general. Permite también la anticipación terapéutica y la elección de nuevas líneas de tratamiento (4). Las evidencias hasta la fecha demuestran la importancia de un diagnóstico y una intervención temprana y continua, con mejoría en muchos casos de los comportamientos adaptativos del individuo a lo largo de su vida (1). ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 18 1.4.1 Variantes genéticas. Las diferencias individuales en relación con el material genético tienen que ver tan solo con el 1% de los genes, lo que quiere decir que el 99% restante será igual entre individuos (28). Esta variabilidad genética está relacionada con la presencia de variantes, que pueden estar presentes en la población en una frecuencia superior al 1%, en cuyo caso se denominarán polimorfismos o variantes comunes; o en menos del 1%, las cuales reciben el nombre de variantes raras (28). Los polimorfismos juegan un papel fundamental en el riesgo de TND, pero son las variantes raras las que confieren un riesgo individual más elevado por su mayor magnitud de efecto. Se establecen así dos modelos, el derivado de estas últimas, de gran tamaño e impacto superior, así como mayor tasa de mutaciones; y el derivado de variantes comunes, de pequeño tamaño, estables evolutivamente y cuya influencia génica se debe al sumatorio de varias variantes de baja magnitud de efecto (28, 35). A parte de las variantes heredadas, son frecuentes las mutaciones de novo (DNM). Una DNM tiene una mayor probabilidad de patogenicidad sobre un individuo que la porta que, por ejemplo, una variante en el número de copias (CNV: copy number variant) heredada (36). Debido a esto, crece el interés por su detección y estudio. Las variantes se dividen a su vez en variantes de secuencia, donde se afecta el orden en que los nucleótidos se ubican en la cadena de ADN, y las variantes estructurales (28). De las primeras, destacan las variantes de secuencia de un solo nucleótido (SNV: single nucleotide variant), denominándose polimorfismos de un solo nucleótido (SNP: single nucleotide polymorphism) cuando son vistas en más del 1% de la población. La mayor parte de las investigaciones genéticas hasta la fecha de TND se han centrado en las SNV, pues algunas de ellas se localizan en regiones del genoma que alteran la proteína codificada (28, 37). Sin embargo, también se ha visto una fuerte asociación de TND con las variantes estructurales más habituales: las CNVs (12, 22). Afectan a una región de la cadena de ADN superior a 1kb, donde se ha producido una deleción o inserción de un par de bases. Para su estudio se utilizan técnicas de microarrays (28). 1.4.2 Técnicas de investigación genética. La citogenética ha sido una de las primeras técnicas desarrolladas en el ámbito de la genética. En ella, a través de métodos de tinción se permite ver con microscopía óptica la estructura de cada cromosoma, permitiendo conocer el cariotipo del paciente y la detección de variaciones estructurales de gran tamaño como deleciones, duplicaciones o traslocaciones. Permiten la identificación de TND en el contexto de síndromes como el ANA LÓPEZ PENEDO Introducción 19 de Down o el X frágil. Su mayor limitación es que solamente permite reconocer alteraciones relativamente grandes (28). Gracias a la aparición de la genética molecular, se puede realizar un estudio de la estructura y la función de los genes a través de secuencias de ADN o ARN con una resolución de hasta un nucleótido. Las dos técnicas más utilizadas son la hibridación in situ, basada en la capacidad de los ácidos nucleicos de unirse entre ellos, de modo que para identificar una secuencia de nucleótidos concreta se marca con fluoróforos y se observa si está presente en el material genético del paciente; y la reacción en cadena de polimerasa (PCR), cuyo objetivo es la obtención de un gran número de copias de un fragmento de ADN concreto para su estudio (28). Con el desarrollo de los microarrays, se ha conseguido el genotipado simultáneo de miles de variantes, de modo que se puede realizar un estudio de frecuencia de todos los marcadores genéticos en un grupo con una determinada enfermedad y otro que no la presentan y establecer hipótesis en caso de diferencias significativas. Son los llamados estudios de asociación global del genoma (GWA: genome-wide association study). Sin embargo, para su empleo se requiere el conocimiento a priori del genoma, lo que supone una limitación a la hora de estudiar variantes muy raras, de frecuencia poblacional inferior al 1%. Para dar respuesta a estas limitaciones de los métodos anteriores nacen las técnicas de secuenciación masiva paralela, también conocidas como de nueva generación (NGS: Next Generation Sequencing). Estos nuevos procedimientos computacionales permiten la secuenciación masiva de nucleótidos de exomas e incluso del genoma completo y la identificación de estas SNV raras (28, 38). ANA LÓPEZ PENEDO Antecedentes 18 2. ANTECEDENTES Como hemos visto, muchas variantes genéticas pueden resultar en una amplia gama de expresividad fenotípica variable, no existiendo una probabilidad del 100% de que se desarrolle la enfermedad, lo que se denomina, penetrancia incompleta. Por ello, es importante proporcionar datos clínicos comprensivos al laboratorio para ayudar a la interpretación de la variante (37). 2.1 PROBANDO AFECTO 1 Paciente varón de 16 aos que presenta Epilepsia, déficit cognitivo, trastorno del lenguaje expresivo y TDAH combinado. No se reportan antecedentes familiares. 2.2 PROBANDO AFECTO 2 Paciente varón de 11 aos y 1 mes que presenta retraso global del desarrollo, déficit cognitivo leve, rasgos TEA y TDAH, cardiopata congénita (CIV), fenotipo peculiar, facies sindrómica. No se reportan antecedentes familiares. 2.3 PROBANDO AFECTO 3 Paciente varón de 17 aos que presenta rasgos dismórficos, retraso de crecimiento prenatal y postnatal, discapacidad intelectual y TEA. Ha sido diagnosticado previamente con “Sndrome de Dubowitz”, un trastorno malformativo caracterizado por retraso del crecimiento intrauterino, estatura baja, microcefalia, retraso mental leve con problemas de comportamiento, eccema y facies sindrómicas (39). No se han indicado antecedentes familiares. ANA LÓPEZ PENEDO Objetivos 19 3. OBJETIVOS Este trabajo tiene como objetivo principal llevar a cabo un análisis del exoma completo de tres pacientes con TND complejos, los cuales muestran un fenotipo grave, lo que puede indicar una posible causa genética subyacente, y cuyo diagnóstico no ha sido esclarecido con otros test genéticos de rutina previos. Para ello, se partirá de la clínica de cada sujeto y, mediante la utilización de diferentes herramientas para la secuenciación del exoma y el empleo de criterios de filtrado, se buscarán variantes genéticas que permitan realizar un diagnóstico genético en cada uno de los probandos, todo ello apoyándose en la información recogida en diversas bases de datos. Finalmente, tras la filtración y priorización de las variantes halladas, se llevará a cabo una caracterización bibliográfica de los genes candidatos en relación con la historia clínica de los individuos. ANA LÓPEZ PENEDO Material y métodos 20 4. MATERIAL Y MÉTODOS Para el estudio de los probandos 1 y 2, el primer paso a realizar ha sido la búsqueda de mutaciones mediante la secuenciación NGS (Ion Proton) de toda la región codificante y de las regiones intrónicas flanqueantes de los genes incluidos en el exoma. Aquellas regiones de interés han sido capturadas en el probando 1, mediante SureSelectXT Clinical Research Exome (Agilent) el cual se basa en objetivos presentes en un conjunto de bases de datos (de las que hablaremos más adelante) tales como Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), the Human Genome Mutation Database (HGMD) y NCBI’s ClinVar, sumado a regiones objetivo seleccionadas por la Universidad Emory y el Children’s Hospital de Philadelphia; y en el probando 2 a través de SureSelectXT Focused Exome (Agilent). Gracias a estas herramientas se permite, partiendo del material genético extraído de una muestra en este caso de sangre, la informatización de la información obtenida del genoma de los probandos y su estudio in silico. Las lecturas de la NGS han sido en un primer momento filtradas para la eliminación de posibles errores o sesgos mediante su análisis con las herramientas informáticas TMAP 5.4.11, TVC 5.4-11, GATK v3.8-0, Picard 2.10.2-SNAPSHOT, BEDtools v2.26.0 y SAMtools 1.5 y ExomeDepth 1.1.10. En el caso del probando 3, el método de preparación de librerías ha sido el TruSeq DNA Library Prep Kit (Illumina). Una vez preparado el material, tuvo lugar su secuenciación mediante el equipo Illumina NextSeq y la captura de las regiones de interés a través de las sondas xGen Exome Research Panel (Integrated DNA Technologies). Para analizar los datos obtenidos, se emplearon las siguientes herramientas informáticas: fastp v0.19.7, bwa 0.7.17-r1188, GATK v3.8-0, GATK v4.1.0.0, Picard 2.18.25, BEDTools v2.27.1, SAMtools 1.9, ExomeDepth 1.1.10, ANNOVAR 2018Apr16 Para la visualización de todos los datos que nos aporta la secuenciación genómica, se utiliza la herramienta Integrative Genomics Viewer (IGV) en su versión 2.3.90 (40, 41). A continuación, las lecturas filtradas por la NGS deben ser alineadas con un genoma de referencia para realizar el análisis y la comparativa de la secuencia a estudio. En nuestro caso hemos utilizado el hg19 o GRCh37. Este genoma está compuesto por clones secuenciados primariamente como parte del Proyecto Genoma Humano (37, 42). Basándonos en las puntuaciones de calidad y en el contaje de los alelos de las lecturas alineadas en un determinado locus, se utiliza un algoritmo para predecir la probabilidad de variantes en cada locus. Uno de los puntos que se tienen en cuenta son el promedio de cobertura horizontal y la profundidad de lectura o cobertura vertical. La cobertura horizontal se define como la información genómica expresada como porcentaje de lectura ANA LÓPEZ PENEDO Material y métodos 21 mapeada contra su referencia, en este caso los exones y regiones intrónicas flanqueantes hasta 10pb (pares de bases). Cuanto mayor sea el porcentaje, más cubierto estará nuestro ADN a estudio. Por su parte, la profundidad de lectura media refleja cuántas veces fue secuenciado un locus concreto. Se expresan con la letra x precedido de un número que indica dicho número de lecturas. Cuanto mayor sea la profundidad, mayor será la confianza en la detección de variantes de baja frecuencia (43). PROBANDOS 1 2 3 NÚMERO GENES ANALIZADOS 18 873 5 555 19 113 COBERTURA DE ANÁLISIS 86,60% 92,80% 97,20% PROFUNDIDAD LECTURA MEDIA 93,8X 235,1X 144,4X NÚMERO DE VARIANTES ANALIZADAS 81 643 28 891 53 344 Tabla 2: Número de genes, variantes, cobertura y profundidad. Para la detección de aquellas variantes clínicamente significativas, partimos de 3 archivos de texto con extensión .tab, que contienen todas las variantes genéticas identificadas en cada individuo. Inicialmente, el probando 1 presentaba 81 643 variantes; el probando 2, 28 891; y el probando 3, 53 344 variantes. Para reducir el campo de búsqueda, se lleva a cabo un filtrado de variantes teniendo en cuenta la información proporcionada con anterioridad y la información de calidad asociada a cada una. Para ello, hemos utilizado el software RStudio (44). Con él, en primer lugar hemos seleccionado aquellas columnas de información más relevantes y que se exponen en el punto 4.1, pasando de 180 a 44, y posteriormente hemos realizado una priorización de variantes, mencionada en el punto 4.2. Todos los datos se pasarán a un archivo en formato Excel con extensión .xlsx, donde la información de cada variante se expone en diferentes columnas, cada una de las cuales correspondiente a un aspecto determinado de la variante. 4.1 COLUMNAS DE ANOTACIÓN DE VARIANTES: 4.1.1 Definición de la variante: Chr: indica el cromosoma en el que se encuentra la variante. Start: se refiere a la posición de inicio del sitio de la variante en el cromosoma. End: marca la posición final de la variante en el cromosoma. ANA LÓPEZ PENEDO Material y métodos 22 Ref: señala la base genómica del nucleótido de referencia, monómero del ADN y ARN. Estos se dividen según su base nitrogenada en purinas y pirimidinas. Dentro de las purinas tenemos la adenina (A) y la guanina (G); las pirimidinas engloban a la timina (T), citosina (C) y uracilo (U) (45). Alt: indica el tipo de base variante por la cual se produjo el cambio. Si la variación se produce por una base del mismo tipo (purina por purina o pirimidina por pirimidina), entonces hablamos de una transición. En cambio, si el cambio es de una purina por una pirimidina o viceversa, entonces estaríamos ante una transversión. Las primeras son diez veces más frecuentes que las últimas. Technology: señala la tecnología que se utiliza. Zygosity: se refiere al grado en el que las dos copias (también conocidas como alelos) de un mismo gen tienen o no la misma secuencia genética. Hablamos de homocigoto cuando ambos alelos son idénticos y heterocigoto cuando son diferentes. Por último, el término hemicigoto hace referencia a la presencia de un único alelo para un determinado gen, lo que sucede con los cromosomas sexuales del varón XY (solo hay una copia de cada uno) o por la eliminación de un alelo, lo que produce una mutación (46). Filter: estado de filtrado de la variante (PASS, nada, o la razón por la que no PASS) Depth: indica la profundidad de lectura (43). RefCount: señala la profundidad de lectura del alelo de referencia (43). AltCount: en este caso, la profundidad de lectura se refiere a la del alelo variante (43). Qual: valor de calidad de la detección de la variante. 4.1.2 Anotaciones de posición genómica con respecto al gen y cambios en la secuencia de aminoácidos: Para este apartado, se ha utilizado la base de datos The Reference Sequence (RefSeq) la cual, basándose en un conjunto de genomas y, a partir de éstos, tráscritos y proteínas, se utiliza de referencia para la anotación genómica, la identificación y caracterización genética y el análisis de mutaciones y polimorfismos (47, 48). ANA LÓPEZ PENEDO Material y métodos 29 of Medical Genetics and Genomics (ACMG), la Association for Molecular Pathology (AMP) y el College of American Pathologists, se reúne con el fin de crear una guía de recomendaciones para el uso de una terminología estándar a la hora de clasificar a las variantes. Así, se crean las guías de la ACMG, aplicables a todos lo genes de herencia mendeliana (37). Las recomendaciones de la ACMG evalúan 28 tipos diferentes de evidencia asociados a características inherentes a cada variante, como la frecuencia alélica, los análisis funcionales, las predicciones in silico, análisis de segregación, relación genotipofenotipo… Con todos estos datos, se asigna un código alfanumérico que valora su contribución a la patogenicidad. Hay 1 código para Pathogenic very strong (PVS1), 4 para Pathogenic Strong (PS1-4), 6 para Pathogenic Moderate (PM1-6), 5 para Pathogenic Supporting (PP1-5), 1 para Benign Stand Alone (BA1), 4 para Benign Strong (BS1-4) y 7 para Benign Supporting (BP1-7) (37). Para valorar la evidencia existente para un número significativo de variantes, se debe seguir un esquema sistemático: 1. Primero se realiza una valoración de la frecuencia poblacional de cada variante en poblaciones de referencia. Para ello, se recurre a bases de datos como gnomAD o 1000g. Si la frecuencia del alelo es >5% o es superior a la esperada para la prevalencia de un trastorno o se observa para enfermedades AD en individuos sanos, se considera un fuerte indicador de benignidad. Por el contrario, la ausencia o frecuencia muy baja de la misma en estas bases de datos, será evidencia a favor de patogenicidad. 2. Por otro lado, se realiza un análisis de segregación de la variante dentro del grupo familiar, ya que la presencia de una variante concreta con el fenotipo en una misma familia evidencia la vinculación entre el locus y la enfermedad, pero no necesariamente implica que sea por sí misma patogénica. Se debe tener en cuenta si existe una concordancia con el modelo de herencia propuesto para la patología. 3. Resulta relevante el análisis de la maternidad y paternidad, para averiguar si estamos ante una mutación de novo, en cuyo caso, la evidencia estaría más a favor de un efecto deletéreo. 4. Las anotaciones y predicciones del efecto molecular conforman el cuarto grupo de evidencia. En ellas se contempla el tipo de variante (nonsense, missense, frameshift…), la posición de la misma en el gen y en la proteína, la existencia de estudios funcionales, las predicciones in silico y el mecanismo molecular a través del cual se desarrolla la enfermedad. 5. Se deben tener en cuenta así mismo otros datos y reportes previos, donde se haya analizado la misma variante en un contexto clínico y se hubiese obtenido una asignación de “patogénica” o “benigna”. ANA LÓPEZ PENEDO Material y métodos 30 La combinación de estos códigos, dan lugar a la clasificación final de cada variante en 5 categorías: P PATOGÉNICA (pathogenic) Clase 5 LP PROBABLEMENTE PATOGÉNICA (likely pathogenic) Clase 4 VUS VARIANTE DE SIGINIFICADO INCIERTO (variant of uncertain significance) Clase 3 LB PROBABLEMENTE BENIGNA (likely benign) Clase 2 B BENIGNA (benign) Clase 1 Tabla 4: Categorías de la ACMG (37) No obstante, se debe tener en cuenta que los criterios asignados a una variante pueden cambiar en relación con la valoración, el juicio profesional y la evidencia existente que está en continua evolución. Fig. 3. Diagrama de los 28 criterios de las últimas guías de la ACMG (37, 59) ANA LÓPEZ PENEDO Material y métodos 31 4.5 ASPECTOS ÉTICOS DEL ESTUDIO Este TFG se enmarca dentro de los trabajos llevados a cabo por el Grupo de Medicina Xenómica en la Linea de Trastornos del Neurodesarrollo dentro del estudio titulado “Enfoque integral y traslacional del diagnóstico y tratamiento de los trastornos del neurodesarrollo (TEA, TDAH, DI) y del TOC: una aproximación genética y funcional”; el cual pretende descifrar las bases genéticas, moleculares y neurocognitivas del Trastorno Obsesivo Compulsivo (TOC) y los Trastornos del Neurodesarrollo (TND), así como sus comorbilidades y manifestaciones fenotípicas asociadas, mediante estudios de asociación, metilación y de secuenciación del genoma completo. Ha sido aprobado por el Comité de Ética de la Investigación de Santiago-Lugo con código 2020/400 y tiene como objetivo evaluar la utilidad de las nuevas tecnologías de genotipado y secuenciación masiva en el diagnóstico genético del TOC y de los TND. El desarrollo del estudio se ha realizado respetando la Ley 14/2007, Declaración de Helsinki y Convenio de Oviedo. Las leyes vigentes en materia de Protección de datos: Ley Orgánica 3/2018 (LOPD y GDD), RD 1720/2007 y Reglamento (UE) 2016/679; las leyes que regulan el acceso a la Historia Clínica y Consentimiento Informado: Ley 3/2001, Ley 3/2005, Ley 41/2002, Decreto 29/2009 (Galicia), Decreto 164/2013 (Galicia) y la Instrucción 6/2007 (Galicia). También se atenderá a las normas de buena Práctica Clínica, la Orden SAS/3470/2009 así como la Ley 14/2007 y el RD 1716/2011. ANA LÓPEZ PENEDO Resultados 32 5. RESULTADOS Tras la realización del filtrado, priorización y clasificación inicial de las variantes, procedemos a analizar estudiar las variantes candidatas que nos quedan una a una. 5.1 PROBANDO AFECTO 1 En este paciente, se han detectado las siguientes variantes tras los pasos previos: Encontramos una variante en el gen CBS: NM_001178008.2 (CBS): c.833T>C (p.Ile278Thr) en heterocigosis. Se trata de un cambio de nucleótido el cromosoma 21q22 en el gen CBS, que provoca el cambio del aminoácido Isoleucina por Treonina. Estudios previos han asociado esta variante con homocistinuria debida a déficit de cistationina beta-sintasa (OMIM: 236200) (68). La homocistinuria es un trastorno con herencia autosómica recesiva caracterizado por la presencia de hiperhomocisteinemia en sangre, retraso mental, trastornos psiquiátricos, autismo, convulsiones, ectopia lentis, osteoporosis y neumotórax espontáneo. Así mismo, se relaciona con la aparición de eventos tromboembólicos como TVP, embolias pulmonares, ictus, infarto agudo de miocardio entre otros (69, 70). Así pues, las manifestaciones clínicas se asemejan relativamente al fenotipo del probando afecto 1 y ha sido clasificada como “patogénica” por ClinVar, según los criterios de la ACMG (71). Sin embargo, al estar asociada a un trastorno de herencia AR y no haber detectado una segunda mutación patogénica en el otro alelo del gen, por sí sola no explica el fenotipo del paciente, motivo por el cual se descarta. Se observa una variante patogénica en el gen HNF1A: Se descarta por haberse asociado en estudios previos a diferentes tipos de diabetes mellitus como la diabetes MODY tipo III (OMIM: #600496) (72), la no insulinodependiente tipo II (OMIM: #125853) (73) o la diabetes mellitus tipo 1 20 (OMIM: #612520) (74). Ninguno de estos cuadros clínicos no sería concordante con el fenotipo del probando afecto 1, por lo que se rechaza como causa. ANA LÓPEZ PENEDO Resultados 33 Se ha detectado la siguiente variante patogénica en el gen SCN3A: NM_006922.4 (SCN3A): c.4114A>G (p.Met1372Val) en heterocigosis. Se trata de una transición situada en el cromosoma 2q24, en el gen SCN3, que provoca el cambio de un aminoácido Metionina por Valina. Variantes de este tipo se han descrito como patogénicas en estudios previos asociadas a “Epilepsia focal familiar con focos variables 4” (FFEVF4) (OMIM: #617938) (75) El FFEVF4, es un síndrome de herencia autosómica dominante asociada a retraso del desarrollo psicomotor y presencia de un trastorno convulsivo caracterizado por la aparición de convulsiones focales en los primeros años de vida, en general bien controlables. Asocia además defecto cognitivo leve, incluyendo retraso del habla, déficit de atención-hiperactividad, discapacidad intelectual, dificultades de aprendizaje y características autísticas. También se presentan casos con hipotonía, microcefalia, disfunción autonómica y crecimiento general deficiente (76, 77). La variante es considerada por ClinVar como patogénica (78). Por todo esto, se considera que la variante en el gen SCN3A c.4114A>G (p.Met1372Val) en heterocigosis y herencia autosómico dominante, probablemente sea la variante causal del fenotipo observado en el paciente, que encaja con el descrito por la “Epilepsia focal familiar con focos variables 4”. 5.2 PROBANDO AFECTO 2 Se ha detectado la siguiente variante patogénica: NM_017780.4 (CHD7): c.5405-17G>A en heterocigosis. Se trata de una variante del cromosoma 8q12, en la región intrónica 25 del gen CHD7, situada en la posición -17 del sitio de splicing más próximo. La variante crea un nuevo sitio aceptor de corte y empalme que afecta al procesamiento del ARN del gen CHD7, adicionando cinco aminoácidos a la proteína traducida, pudiendo afectar a su función. Se manifiesta con herencia autosómica dominante. No está presente en las bases de datos de frecuencias poblacionales y estudios previos han asociado esta variante con el “Síndrome de CHARGE” (OMIM: #214800) (79). El Síndrome de CHARGE se caracteriza por un patrón de anomalías congénitas que incluye: Coloboma ocular (C), malformaciones cardíacas (H) tales como CIV, CIA, defectos del septo atrial, tetralogía de Fallot, atresia de coanas (A); retraso psicomotor y/o en el crecimiento (R) así como retraso mental; hipoplasia de genitales (solo en ANA LÓPEZ PENEDO Resultados 34 hombres) (G): hipogonadismo hipogonadotropo, microfalosomía y malformaciones auriculares y/o sordera (E). También se presenta con discapacidad intelectual, problemas de comportamiento como comportamientos repetitivos, obsesivo-compulsivos, agresivos y autolesivos, rasgos autistas o TDAH (79). Suelen manifestar fenotipo característico con facies sindrómicas consistente en orejas displásicas y de implantación baja, cara cuadrada, aplanamiento malar, retrogenia, fosas nasales pinzadas con narinas antevertidas, inclinación antimongoloide de las fisuras palpebrales, paladar hendido o labio leporino (79). ClinVar ha catalogado a esta variante como patogénica (80). Por todo lo detallado, la variante intrónica detectada en el gen CHD7: c.5405-17 G>A en heterocigosis y de herencia autosómica dominante, probablemente sea la variante causal del fenotipo observado en el paciente, que encaja con el descrito por el “Síndrome de CHARGE”. 5.3 PROBANDO AFECTO 3 Se ha detectado la siguiente variante descrita como patogénica: NM_005710.2 (PQBP1): c.461_462del (p.Glu154Alafs*12) en hemicigosis. Se trata de una deleción de dos nucleótidos a partir de la posición 461 del gen. Este cambio conlleva un desplazamiento en la pauta de lectura en el gen PBQP1. Esto implica que la lectura de los codones en la secuencia posterior a la variante codifique para aminoácidos diferentes, provocando en este caso el cambio del aminoácido Glutamato por Alanina en el codón 154 y originando un codón de parada prematuro en la posición 12 del nuevo marco de lectura. La proteína resultante puede perder su funcionalidad o esta verse notablemente afectada. La variante ha sido asociada en estudios previos al “Síndrome de Renpenning 1” (RENS1) (OMIM: #309500) (81). Se trata de un síndrome de retraso mental ligado al X de herencia recesiva, caracterizado por deficiencia de crecimiento postnatal, retraso del desarrollo global, retraso mental; hiperactividad y anomalías de comportamiento (82). También se han visto características fenotípicas reconocibles como talla baja, dismorfismos faciales, paladar hendido, microcefalia, cara larga y estrecha, configuración nasal anormal, orejuelas ahuecadas y fíltreme corto; defectos cardíacos congénitos, hipoplasia renal, testes pequeños… Tanto ClinVar como Varsome clasifican la variante como patogénica (83). Por todo esto, la variante detectada del gen (PQBP1): c.461_462del (p.Glu154Alafs*2) en hemicigosis probablemente sea la causa del fenotipo del paciente a estudio, compatible con el “Síndrome de Renpenning 1” ANA LÓPEZ PENEDO Discusión 35 6. DISCUSIÓN 6.1 PROBANDO AFECTO 1 En el caso del primer probando, habiendo descartado las variantes asociadas a los genes CBS y HNF1A, en el primer caso por estar asociada a un trastorno de herencia AR y no haberse detectado una segunda mutación patogénica en el otro alelo del gen, y en el segundo por relacionarse con un fenotipo incongruente con el del paciente, nos quedamos con la tercera variante, la del gen SCN3, como diagnóstica del cuadro clínico. En 2014, Vanoye et al. realiza un estudio del gen en cuestión, donde observa que el susodicho codifica para la subunidad alfa de un canal de sodio voltaje-dependiente Na(v)1.3. La mutación en este gen había sido detectada en 179 pacientes pediátricos con epilepsia focal y estudios in vitro han demostrado defectos en la función de los canales consistentes en un aumento de las corrientes de entrada durante una rampa de voltaje de despolarización lenta, promoviendo redes de hiperexcitabilidad. Las imágenes cerebrales eran anodinas (77). Por otra parte, los estudios de Lamar et al. han mostrado que los canales mutados no tenían corrientes de sodio detectables y se manifestaban en menor número en la superficie celular, con el consecuente detrimento de la magnitud de la corriente de entrada todo ello resultando en un efecto de pérdida de función (84). La variante en heterocigosis de este gen SCN3A se ha asociado a “Epilepsia focal familiar con focos variables 4” (FFEVF4), un trastorno convulsivo AD caracterizado por crisis focales de comienzo en los primeros años de vida, en algunos casos con generalización secundaria y déficits del desarrollo tales como discapacidad cognitiva, que incluye retraso del lenguaje, TDAH y dificultades del aprendizaje (77). Lamar et al. lo relacionó también con retraso global del desarrollo, hipotonía y microcefalia (84) sumado a retraso severo del lenguaje y características autísticas, según indican estudios como el de Celle et al. (85). Este cuadro clínico concuerda con el de nuestro probando afecto 1, un varón de 16 años con epilepsia, déficit cognitivo, trastorno del lenguaje expresivo y TDAH combinado. Mutaciones heterocigóticas en este mismo gen también se han asociado a “Encefalopata Epiléptica y del desarrollo-62” (DEE62), un trastorno epiléptico de mayor gravedad, con crisis multifocales de inicio antes del año de vida y alteraciones en pruebas de imagen y electroencefalograma (EEG) (76). ANA LÓPEZ PENEDO Discusión 36 6.2 PROBANDO AFECTO 2 En el segundo probando, se detecta una variante patogénica en el gen CHD7, pro un lado un regulador transcripcional que se une para potenciar elementos del nucleoplasma, y por otro un regulador positivo en la biogénesis del ARN ribosomal (ARNr) del nucléolo (86). Se localiza en el cromosoma 8q12.2 y se manifiesta en heterocigosis con una herencia que es AD. Los estudios de Nagase et al. demostraron una mayor presencia del gen en el cerebro, riñón y músculo esquelético (87). Por su parte, Sanlaville et al. analizaron su expresión en las primeras etapas del desarrollo fetal, donde se mostraba una amplia expresión en el neuroepitelio indiferenciado y el mesénquima de la cresta neural (88). Más adelante, en el 2010, Bajpai et al. demostró que el CDH7 tenía un rol evolutivamente conservado en la promoción de la expresión de los genes de la cresta neural y su migración celular y cuya alteración podría explicar la patogénesis del trastorno asociado con este gen, el “Síndrome de CHARGE” (89). Cabe destacar también el estudio de Van Nostrand et al. donde analizaron el rol crítico en general en varios síndromes del desarrollo y en concreto en este en cuestión, de la proteína de supresión tumoral p53. CHD7 se une a p53 regulándola negativamente. Mutaciones en dicho gen dejan de suprimir a la proteína con su consecuente activación, con un resultado letal en la última etapa gestacional y asociada a características fenotípicas del “Síndrome de CHARGE” (90). La mayoría de las mutaciones del gen CDH7 asociadas a CHARGE son mutaciones de novo (DNM) (79). Pauli et al. identificó un polimorfismo cercano a la mutación en CHD7 en 13 familias. En un intento de analizar su conexión detectó que, en 12 de las 13 familias, la mutación afectaba al alelo paterno (92.3%) (91). Esta mayor afectación paterna no es un hecho aislado. Varios estudios demuestran que la mayoría de las DNMs se originan en el padre (debido al gran número de divisiones celulares que presentan las células germinales masculinas existiendo una cantidad de espermatozoides producidos a lo largo de la vida en comparación con el número de óvulos mucho mayor); y se estima que, por cada año adicional de edad paterna en el momento de la concepción, aparecen 2 DNMs extra en cada hijo (92). El fenotipo asociado a CHARGE (coloboma ocular, malformaciones cardíacas, atresia de coanas, retraso psicomotor y/o en el crecimiento y retraso mental, hipoplasia de genitales, hipogonadsmo hipogonadotropo y malformaciones auriculares y/o sordera asociado a TEA, TDAH, DI…) (79), es compatible con el de nuestro paciente: un varón de 11 años y 1 mes con retraso global del desarrollo, déficit cognitivo leve y rasgos de TDAH y TEA, cardiopatía congénita y facies sindrómicas. ANA LÓPEZ PENEDO Discusión 37 6.3 PROBANDO AFECTO 3 En el último sujeto, la variante patogénica se sitúa en el cromosoma Xp11.23, en el gen PQBP1. Dicho gen codifica para una proteína nuclear unidora de poliglutamina que contiene un dominio N-terminal WW idéntico en sus cuatro tránscritos (PQBP1a- PQBP1d), difiriendo en su extremo C-terminal. Se localiza fundamentalmente en el cerebro, sobre todo en el cerebelo, hipocampo y bulbo olfatorio (93, 94). Se trata de una variante de herencia ligada al cromosoma X, manifestada en hemicigosis. PQBP1 se une a tractos de poliglutamina para mediar funciones celulares. Su sobreexpresión suprime el crecimiento celular y aumenta su susceptibilidad al estrés (93). Se propone una posible involucración del gen en la patología de la “Ataxia Espinocerebellar 1” (SCA1) al demostrarse una interacción de PQBP1 con ataxina-1 (95). Para corroborar dicha asociación, Okuda et al. generó ratones trasngénicos que sobreexpresaban el PQBP1 humano, resultando en un genotipo gradualmente similar a una enfermedad de motoneurona, con pérdida de dichas neuronas en el asta espinal anterior y causando una disfunción neuronal por su excesiva acción, lo que concluye su posible implicación con la patología de SCA1. En cambio, la variante que nos atañe es una deleción de dos nucleótidos que provoca un codón de parada prematuro, descrita por primera vez por Kalscheuer et al. en 2003 (82). Un estudio llevado a cabo 6 años después por Ito et al. al generar ratones con expresión de PQBP1 bloqueada, demostraba la posible asociación de la disfunción en la regulación de la expresión genética con problemas de comportamiento y cognición que demostraban estos ratones y relacionaba la recuperación de la función con una mejoría de los sntomas en pacientes adultos que manifestaban “Sndrome de Renpenning” y retraso mental asociado a PQBP1 (96). Existe una considerable variabilidad fenotípica entre las familias con diferentes mutaciones del gen e incluso entre familias con la misma mutación. La microcefalia, el retraso mental y la talla baja parece que son características constantes entre individuos con mutaciones en PQBP1. Cabe destacar que la microcefalia es el rasgo físico más comúnmente encontrado entre varones con retraso mental de causa desconocida (97). No obstante, la patología asociada a la variante mencionada con anterioridad es el “Sndrome de Renpenning”, un tipo de retraso mental ligado a X asociado a deficiencia de crecimiento postnatal, retraso del desarrollo global, retraso mental; hiperactividad, anomalías de comportamiento y características fenotípicas reconocibles (82). Esta clínica concuerda con la de nuestro paciente, un adolescente varón de 17 años con rasgos dismórficos, retraso de crecimiento prenatal y postnatal, discapacidad intelectual y TEA diagnosticado en un principio como “Sndrome de Dubowitz”. ANA LÓPEZ PENEDO Conclusiones 38 7. CONCLUSIONES Mediante la realización de este trabajo, hemos conseguido realizar el análisis del exoma completo en 3 pacientes con TND de especial dificultad diagnóstica, en busca de variantes genéticas que pudieran proporcionar un diagnóstico genético de cada uno. Para ello, partiendo de diferentes herramientas in silico y utilizando criterios de filtrado y la información registrada en diferentes bases de datos, se ha llevado a cabo una priorización y clasificación de las variantes atendiendo a los criterios de la ACMG. Con esto, llegamos al diagnóstico genético de los tres casos clínicos. Resulta conveniente, sin embargo, tener en cuenta las limitaciones de los estudios y una serie de consideraciones a mayores: Por una parte, la técnica utilizada puede no detectar otras mutaciones tales como deleciones, inserciones o inversiones. Además, este análisis no excluye la presencia de mutaciones en regiones no examinadas como intrones, regiones reguladoras o no accesibles a la hibridación. Así mismo, se debe tener en cuenta que el análisis de variantes actualmente es imperfecto, y que la categoría asociada no implica un 100% de certeza. Por ello, se sugiere que la evaluación clínica se realice atendiendo a las características fenotípicas y bioquímicas asociadas a cada uno de los genes, contextualizando la interpretación del resultado al fenotipo del paciente y antecedentes familiares. Por ello, es también conveniente el estudio de portadores de los padres del probando, para poder proporcionar un mejor asesoramiento genético y establecer si la variante es de novo, si se cosegrega con la enfermedad dentro de la familia o si se manifiesta en trans con una variante patogénica en el mismo gen causante de una enfermedad recesivo. Son los llamados “test de tros” (madre, padre e hijo afecto) (37). La genética ha avanzado considerablemente en los últimos años, permitiendo un refinamiento de los métodos de detección de variantes genéticas y un incremento de los estudios y con ello del conocimiento acerca de este campo. Proyectos como la NGS, han abaratado los costes de secuenciación y el número de genomas humanos y exomas secuenciados cada año está en un aumento imparable. Todo ello ha permitido un creciente número de diagnósticos genéticos y un mejor asesoramiento a las familias, así como la aparición de terapias guiadas. Dado el gran volumen de diagnósticos que se están realizando resulta necesario la creación de un lenguaje común y universal guiado por unas mismas normas que permita la estandarización de los resultados e informes emitidos. ANA LÓPEZ PENEDO Referencias bibliográficas 45 53. Sudmant PH, Rausch T, Gardner EJ, et al. An integrated map of structural variation in 2.504 human genomes. Nature. 2015 Oct 1 [cited 2021 Mar 10]; 526 (7571): 75-81. Doi: https://doi.org/10.1038/nature15394 54. Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM®. McKusick-Nathans Institutw of Genetic Medicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD), 2021 Mar 11. World Wide Web URL: https://omim.org/ 55. 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