Nuevas estrategias para el transporte de iones y la encapsulación selectiva de ligandos basadas en α,γ-ciclopéptidos

TESIS DOCTORAL NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL TRANSPORTE DE IONES Y LA ENCAPSULACIÓN SELECTIVA DE LIGANDOS BASADAS EN α,γ-CICLOPÉPTIDOS Alberto Fuertes García ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA SANTIAGO DE COMPOSTELA AÑO 2019 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL TRANSPORTE DE IONES Y LA ENCAPSULACIÓN SELECTIVA DE LIGANDOS BASADAS EN α,γ- CICLOPÉPTIDOS D. Alberto Fuertes García Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hará referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, ... de ..... de 2019 Fdo. AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS NUEVAS ESTRATEGIAS PARA EL TRANSPORTE DE IONES Y LA ENCAPSULACIÓN SELECTIVA DE LIGANDOS BASADAS EN α,γ- CICLOPÉPTIDOS D. Juan Ramón Granja Guillán D. Manuel Amorín López INFORMAN: Que la presente tesis se corresponde con el trabajo realizado por D. Alberto Fuertes García, bajo nuestra dirección, y autorizamos su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directores de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, ... de ..... de 2019 Fdo. Juan R. Granja Fdo. Manuel Amorín Agradecimientos En primer lugar, me gustaría expresar mi agradecimiento a los directores de esta tesis doctoral, Juan R. Granja y Manuel Amorín, puesto que sin ellos nada de lo que viene a continuación habría ni tan siquiera existido. Gracias por brindarme la oportunidad de trabajar con ellos y por poner a mi disposición todos los medios necesarios para que pudiera llegar a ser el investigador en el que me he convertido en la actualidad. Por fomentar mi pensamiento crítico, evitar que diese nada por sentado e inculcarme el rigor científico necesario para llevar a cabo un trabajo como este. A las diferentes instituciones que me han financiación a nivel personal durante los años que he estado trabajando en esta tesis: la Fundación Segundo Gil Dávila, la Xunta de Galicia y el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte del Gobierno de España por haberme concedido becas para desempeñar mi trabajo en estos casi 5 años. Además de estas, también me gustaría dar las gracias a estas y otras instituciones por haber financiado la labor investigadora del grupo con diversos proyectos de investigación en los que he participado. Al Prof. Neal K. Devaraj por haberme brindado la posibilidad de realizar una estancia en su grupo de investigación en la Universidad de California, San Diego y a Roberto J. Brea por haberme ayudado enormemente, tanto a nivel científico como personal, durante el tiempo que estuve en San Diego. Gracias por haberme permitido vivir una de las experiencias más alucinantes de mi vida, incluida la anécdota de “cuando me paró la policía”. A todos mis compañeros de laboratorio, desde los más veteranos que acogieron a aquel chaval nervioso de TFG que no había pisado un laboratorio de investigación en su vida, hasta los más jóvenes (y no tan jóvenes) con los que he coincidido en esta última etapa. Gracias por haberme enseñado tantas cosas y haberme hecho pasar tan buenos momentos dentro y fuera del laboratorio. Creo que hemos sido una gran familia que ejemplifica el trabajo en equipo y el apoyo mutuo en las situaciones complicadas, sin duda un ejemplo en el que cualquier otro grupo de investigación querría verse reflejado. A todos vosotros os deseo lo mejor en el futuro, os lo merecéis. Al resto de miembros del grupo de investigación como Javier Montenegro, Rebeca García-Fandiño, Martín Calvelo y Luis Castedo. Por las interesantes discusiones científicas y sugerencias que han aportado durante el transcurso de este trabajo. Además, me gustaría agradecer en especial a Martín su total disponibilidad a la hora de realizar estudios computacionales que han contribuido al desarrollo de esta tesis, a pesar de que en este manuscrito solo se recogen una pequeña parte de ellos. A la RIAIDT de la Universidad de Santiago de Compostela por poner a mi disposición sus medios técnicos para el correcto desarrollo de mis proyectos. En especial me gustaría destacar al técnico de RMN del CIQUS, Ramón Gesto, que ha sido el encargado de llevar a cabo la mayoría de los experimentos a campos magnéticos elevados. Además, me gustaría agradecer a todo el personal técnico del CIQUS, en especial a Arcadio Guerra (aunque a él también se le aplica todo lo dicho dos párrafos más arriba), porque además de ser un técnico de 10, se puede decir que fue como un padre durante mis primeros pasos en el laboratorio. A Eugenio Vázquez por haber diseñado la mayoría de las figuras tridimensionales esquemáticas de los CPs y otras estructuras que están incluidas en esta memoria. A colaboradores de otras instituciones, como por ejemplo Ignacio Alfonso (IQAC) por sus tutoriales sobre DOSY, a Pedro Nieto (CSIC) por habernos ayudado con experimentos de RMN heteronucleares o a Manuel Marcos (CACTI-UVigo) por haber realizado análisis de espectrometría de masas de nuestras complejas muestras. A todas las demás personas que hayan contribuido en mayor o menor medida al desarrollo de esta etapa de mi vida y no estén citados en los puntos anteriores. Entrando en el terreno más personal, me gustaría acordarme de todo mi grupo de amigos, que han servido como válvula de escape siempre que los he necesitado y siempre han estado dispuestos a escucharme cuando lo necesitaba. A Marisa, por además de ser compañera de laboratorio, ser compañera de infinitas vivencias fuera de él. Sin lugar a duda has sido uno de los mayores apoyos durante estos años de tesis (y todos los anteriores). La química hizo que se cruzasen nuestros caminos y, tras todo lo que hemos experimentado juntos, debo reconocer que le estaré eternamente agradecido por haberme dado la oportunidad de conocerte. Por último, me gustaría dedicarle unas líneas a mi familia, por apoyarme en todo momento y, muy especialmente a mis padres. Por hacer posible que haya recibido en todo momento la mejor formación posible, un largo proceso que se materializa en este trabajo. Creo que una buena educación (en su más amplio sentido) es el mejor regalo que le pueden hacer a uno, y en ese aspecto he sido un auténtico privilegiado (aunque a veces me haya costado darme cuenta). Por enseñarme que el esfuerzo tiene recompensa y mostrarme el valor del trabajo bien hecho. En definitiva, por convertirme en la persona que soy hoy en día. Gracias, gracias y gracias. Índice Abreviaturas...................................................................................................................... 11 Resumen ........................................................................................................................... 17 Summary ........................................................................................................................... 21 Introducción ...................................................................................................................... 27 1. Química supramolecular ........................................................................................ 27 1.1. Autoensamblaje y reconocimiento molecular ..................................................... 29 1.2. Sistemas host-guest ............................................................................................. 32 1.2.1. Receptores moleculares covalentes ................................................................ 32 1.2.2. Cápsulas autoensambladas ............................................................................. 42 1.3. Nanotubos basados en el autoensamblaje de subcomponentes .............................. 57 1.3.1. Nanotubos y dímeros constituidos por α-CPs ................................................ 62 1.3.2. Nanotubos y dímeros constituidos por α,γ-CPs .............................................. 65 1.3.3. Sistemas constituidos por otros CPs ............................................................... 71 1.3.4. Aplicaciones de los sistemas supramoleculares basados en CPs ................... 74 2. Transporte transmembranal de iones...................................................................... 80 2.1. Sistemas naturales ............................................................................................... 80 2.2. Membrane spanners ............................................................................................ 83 2.3. Ionóforos/carriers ............................................................................................... 89 Objetivos ......................................................................................................................... 101 Capítulo I: Nanotubos autoensamblados tipo Venturi .................................................... 109 1. Diseño................................................................................................................... 111 2. Metodología sintética ........................................................................................... 114 3. Estudios de dimerización y formación de nanotubos ........................................... 124 Capítulo II: Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos ......... 139 1. Transportadores de tipo membrane spanner ........................................................ 143 2. Transportadores tipo ionóforo/carrier ................................................................. 155 Capítulo III: Encapsulación de ligandos ditópicos mediante dímeros α,γ-ciclopeptídicos 175 1. Encapsulación de ligandos homoditópicos con ciclohexapéptidos ...................... 175 1.1. Encapsulación de dinitrilos tras la complejación de iones metálicos ................ 176 1.2. Alquil-diamonios ............................................................................................... 188 2. Encapsulación de ligandos heteroditópicos mediante ciclooctapéptidos ............. 208 2.1. Antecedentes ..................................................................................................... 208 2.2. Diseño de la cápsula heteroditópica .................................................................. 210 2.3. Síntesis .............................................................................................................. 213 Resumen 17 Resumen Desde el desarrollo de la química moderna, existe la necesidad creciente de obtener estructuras cada vez más complejas desde el punto de vista de su tamaño, función o biocompatibilidad. Por ello, en un primer momento, la química sintética ha jugado un papel relevante a la hora de desarrollar nuevas metodologías para la obtención de enlaces químicos covalentes o nuevas estrategias para la modificación selectiva de grupos funcionales. A pesar del gran avance que ha experimentado la síntesis orgánica en las últimas décadas, siguen existiendo limitaciones a la hora de obtener ciertas estructuras complejas de gran tamaño y que presenten grupos funcionales orientados en una zona precisa del espacio tridimensional, ya que su preparación, mediante únicamente estrategias basadas en la formación de enlaces covalentes, es hoy en día inabordable desde el punto de vista del tiempo y el esfuerzo humano que requieren. Es por ello por lo que ha emergido una nueva área, conocida como química supramolecular, la cual estudia y utiliza las interacciones débiles que van más allá de las moléculas singulares. Esta disciplina, la química supramolecular, se centra en el estudio de las interacciones entre diferentes entidades químicas mediante las conocidas como fuerzas no covalentes, que incluyen el enlace de hidrógeno, las interacciones tipo π o las fuerzas de Van der Waals, etc. Esta estrategia permite que precursores sintéticamente sencillos se asocien para dar lugar a morfologías tridimensionales complejas. Este fenómeno se logra combinando varias de estas interacciones las cuales, a pesar de tener individualmente una contribución entálpicamente pequeña, a nivel global son capaces de superar la barrera entrópica que supone ordenar tantas subunidades en una estructura supramolecular compleja. Dentro de la gran diversidad de topologías a las cuales ha sido posible tener acceso siguiendo esta estrategia supramolecular, caben destacar las estructuras tubulares y otras arquitecturas con cavidades que presenten grupos funcionales a la carta, las cuales se suelen englobar en una categoría conocida como “cápsulas supramoleculares”. La relevancia de estos últimos complejos reside en su capacidad para confinar pequeñas moléculas en su interior de forma selectiva. Estos procesos de reconocimiento molecular tienen implicaciones muy significativas en campos como la catálisis, el desarrollo de sensores o en la emulación de procesos biológicos básicos. De esta forma, el desarrollo de reacciones específicas en espacios confinados o el desplazamiento de sustancias a través de membranas lipídicas pueden ser imitados empleando macrociclos sintéticos más sencillos, los cuales nos permiten incrementar el conocimiento que tenemos sobre el funcionamiento de la complicada maquinaria biológica a nivel molecular. En el campo de la química supramolecular, nuestro grupo de investigación ha desarrollado en las últimas dos décadas una robusta metodología para la síntesis de péptidos cíclicos (CPs) compuestos por varios tipos de aminoácidos (Aas) diferentes. En particular, es pionero en el uso de γ-aminoácidos cíclicos (γ-Aca) en combinación con α-aminoácidos naturales de quiralidad opuesta. Esta especial combinación de lugar a péptidos que tienden a adquirir una conformación plana que facilitan la interacción con otros péptidos similares. Todo ello permite la posterior formación de largas estructuras tubulares huecas por el apilamiento de los CPs. Alternativamente, se pueden preparar unidades más cortas mediante el bloqueo del ensamblaje al sustituir los protones amídicos de una de las caras del CP por grupos alquílicos que impiden la formación de los enlaces de hidrógeno entre CPs. La principal característica que presentan estos α,γ-CPs es la asimetría que presentan sus dos caras, dado que en cada una de ellas se proyectan únicamente los grupos NH y carbonílicos de una única familia de Aas (α o Alberto Fuertes García 18 γ). Esta característica, junto con la capacidad de modificar el diámetro interno del anillo variando el número total de Aas que lo componen, permite modular la fortaleza de las interacciones que dirigen el ensamblaje supramolecular. Por tanto, la estructura resultante puede poseer una cierta respuesta química frente a determinados estímulos externos. Además, los γ-Acas proyectan hacia el interior de la cavidad un grupo metileno (posición β del cicloalcano), que abre la puerta a la obtención de cavidades funcionalizadas al utilizar un γ-Aca que contenga esta posición modificada. Con la idea de profundizar en el estudio de estas estructuras supramoleculares y aprovechar la capacidad para preparar cavidades funcionales con topologías definidas, el contenido de esta tesis doctoral se centrará en el diseño y la síntesis de nuevos α,γ-CPs modificados en su eje vertical, que incorporen sobre el átomo de nitrógeno del γ-Aca grupos funcionales. Esta incorporación abre la puerta a la obtención de cápsulas supramoleculares, así como nuevas topologías tubulares en la escala nanométrica. En el primer capítulo de esta memoria, se aborda la síntesis de una nueva clase de estructuras nanotubulares que, de forma pionera, presentan un diámetro alternante. Para dicho fin, se utilizaron dos tipos de CPs bloqueados en su cara γ que presentan diferentes tamaños (diferente número de Aas en su secuencia), los cuales presentan variaciones significativas en su constante de dimerización. Para poder llevar a cabo la unión covalente de los dos tipos de anillos, se optó por una cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen entre una azida y un alquino, comúnmente conocida como reacción de click, dada la ortogonalidad que ambos grupos reactivos presentan con respecto a las estrategias de la síntesis peptídica. Para ello se propuso la utilización de un α,γ-ciclooctapéptido equipado con dos grupos propargilo y un α,γciclotetrapéptido con cadenas de propilazida. El bis-ciclopéptido covalente resultante de esta transformación química presenta, como era de esperar, dos posibles modos de interacción con otros péptidos (formación de láminas β) con propiedades muy diferentes entre sí. Por un lado, la cara α del octapéptido presenta una constante de asociación elevada en disolventes apolares como el cloroformo (Ka>106). Alternativamente, el tetrapéptido posee una constante de asociación, según los cálculos empíricos basados en modelos termodinámicos, varios órdenes de magnitud más baja. Esta gran diferencia de Ka le confiere al sistema unas características que permiten modular el grado de agregación de los nanotubos resultantes. Así, fue posible determinar por RMN la influencia que tenían ciertos parámetros, como la concentración de la muestra o la temperatura del medio en el equilibrio entre monómeros discretos y nanotubos. También fue posible bloquear el crecimiento de los nanotubos mediante la adición de pequeñas cantidades de disolventes próticos que compiten por las interacciones entre los tetrapéptidos. Alternativamente, la incorporación al sistema de un ciclopéptido complementario al octapéptido promueve la formación preferente de heterodímeros, imposibilitando la sucesiva agregación del sistema y restringiendo el proceso de autoensamblaje a la formación de pequeños tubos formados por tres (medios próticos) o seis anillos peptídicos. Para estimar los tamaños de las especies en disolución y sacar así información relativa al grado de agregación del sistema se recurrió a la técnica de DOSY, la cual arrojó correlaciones claras entre concentración y el tamaño de las estructuras supramoleculares obtenidas. En el segundo capítulo, decidimos mantener una estrategia similar a la hora de preparar los péptidos cíclicos funcionalizados para tener acceso a unas estructuras que pudiesen comportarse como transportadores de membrana imitando a las moléculas anfipáticas que existen en la naturaleza conocidas como ionóforos. Los ionóforos son capaces de transportar con una gran eficiencia cationes y aniones inorgánicos difundiendo entre ambos lados de la Resumen 19 bicapa lipídica. En primer lugar, se llevó a cabo un estudio de estructura-actividad con una familia de CPs que diferían en el tamaño del anillo (hexámeros y octámeros) y con un número variable de apéndices ionóforos que se incorporaban en el plano vertical. Este número se gobernaba por la cuantía de Aas N-propargilados que se incorporaban en su estructura. Esta estrategia permitió acoplar diferentes cadenas de oligoetilenglicol de longitudes variables mediante una reacción tipo click. Dicha conjugación debe dar lugar a unas moléculas que poseen una parte central rígida y con un orificio de la que se irradian un número variable de tentáculos a ambos lados del dímero macrocíclico. La finalidad de estas moléculas era la de provocar un incremento de permeabilidad en las membranas que facilitase el transporte de protones. A pesar de que estos péptidos mostraban la capacidad de transportar diversos iones, los resultados fueron bastante modestos, por lo que decidimos variar el modelo de transporte. Para dicho fin, nuestra estrategia se basó en la incorporación de anillos de piridinas al final de la cadena propargílica. Las propiedades coordinantes de las piridinas son claramente superiores a las de las cadenas utilizadas en el primer diseño a la hora de llevar a cabo la migración de iones inorgánicos. De esta forma, tras la síntesis peptídica fue posible incorporar grupos directores tipo piridina, usando la reacción de Sonogashira con diferentes isómeros de yodo-piridina. Los ionóforos resultantes presentaron una actividad magnífica a la hora de transportar iones inorgánicos a través de membranas lipídicas modelo. Los experimentos realizados sirvieron para demostrar que estas moléculas, en su forma dimérica, actuaban como symporters, ya que eran capaces de facilitar el tránsito transmembranal simultáneo de un catión y un anión. Curiosamente, cuando se estudiaron las propiedades transportadoras de un heterodímero formado por un CP dotado de tres piridinas con otro no funcionalizado, se observaba una pérdida prácticamente total de su actividad. Este resultado pone de manifiesto que ambas tapas de tris-piridina son necesarias para desempeñar un transporte efectivo. Por último, los experimentos mecanísticos llevados a cabo excluyen que el transporte de iones tenga lugar mediante la formación decanales de membrana con largos tiempos de apertura o mediante un mecanismo tipo “ion hopping”, sugiriendo, por el contrario, un modo de acción tipo carrier. En el tercer capítulo de esta memoria, nos centramos en el estudio de la capacidad que presentan los dímeros estudiados en el capítulo previo para actuar como cápsulas supramoleculares versátiles. También se amplió el estudio con otras cápsulas de cavidad más grande (α,γ-ciclooctapeptídicas) pero dotadas de metaloporfirinas en vez de los anillos de piridina. Estas tapas moleculares deberían actuar, en este caso, como grupos directores en la encapsulación de ligandos amino-carboxílicos. Los estudios realizados con α,γ-ciclohexapéptidos equipados con diferentes isómeros de piridinas se dirigieron a evaluar la capacidad de las tapas piridínicas para dirigir la inclusión de ligandos tipo diamonios lineales. Al analizar los ligandos alquílicos de diferentes longitudes, se pudo observar por RMN la variación de las señales en el dímero de los hexapéptidos, lo que evidencia la interacción con las especies dicatiónicas. Además, se observó por DOSY que existe una relación directa entre la longitud del ligando bajo estudio y el tamaño de las especies supramoleculares que se forman. Este comportamiento se atribuye a que, si la longitud de la molécula huésped no es la apropiada para formar el aducto de inclusión, el sistema tiende a formar entramados moleculares de mayor tamaño derivados de interacciones intermoleculares en donde los diamonios interaccionan con diferentes dímeros ciclopeptídicos por su parte externa. Alberto Fuertes García 20 La presencia de las tres unidades de piridina también permite explorar la encapsulación de otros ligandos a través de la coordinación inicial de un metal de geometría apropiada que dirija la incorporación de un cuarto ligando (molécula huésped) en la cavidad definida por el dímero. A este respecto, hemos explorado el uso de sales de Cu(I), que forman complejos de geometría tetraédrica, los cuales satisfacen las necesidades de nuestro sistema. Para desarrollar este concepto, nos basamos en una primera etapa en la que tenga lugar la complejación de una unidad de CuI en cada una de las tapas tris-piridínicas. Los complejos derivados de esta interacción demostraron ser estables durante varios días y se pudieron caracterizar mediante diversas técnicas. La siguiente etapa consistió en generar un lugar de coordinación en el centro metálico mediante la substracción del ion yoduro, para lo cual este complejo se trató con una sal de plata para su precipitación. Desafortunadamente, tras llevar a cabo esta precipitación en presencia de una variedad de ligandos tipo dinitrilo de diferente longitud, siempre se observaba la degradación de la muestra. Posiblemente, la causa de esta resida en la oxidación de Cu(I) a Cu(II) tras perder el ion yoduro que le acompaña, lo que imposibilita la detección de los complejos de encapsulación de dinitrilos en la cápsula. En cuanto a las cápsulas derivadas de ciclooctapéptidos, se siguió una estrategia sintética que permite posicionar en el plano vertical al macrociclo peptídico dos grupos hidrazida. De esta manera, se puede diseñar una porfirina complementaria dotada de dos unidades de benzaldehído en posiciones meso no adyacentes para llevar a cabo la condensación al CP. De esta forma se obtuvo una cápsula que se mantiene unida por el proceso de dimerización del CP y, además, por los enlaces hidrazona entre este y las tapas de porfirina. En este punto, fue posible equipar a este precursor con diferentes centros metálicos, tal como Zn(II) o Sn(IV). Con esta combinación de metales se decidió llevar a cabo el reconocimiento de moléculas con ligandos que tuviesen dos grupos funcionales diferentes, cada uno de ellos complementario con uno de los centros metálicos. En nuestro caso particular, estos grupos resultaron ser un anillo de piridina, que forma complejos estables con las metaloporfirinas de Zn, y un anillo de ácido benzoico complementario con la porfirina de Sn. De esta manera, esperábamos poder observar un proceso de auto-selección (self-sorting) inducido por la adición de un ligando apropiado, que desplazaría el equilibrio hacia la formación del complejo de inclusión heterodimérico exclusivamente, frente a todas las posibilidades que estadísticamente se podrían dar en presencia de los dos precursores de las cápsulas (dos homodímeros y un heterodímero). En esta línea, se sintetizaron una serie de ligandos heterofuncionales lineales y relativamente rígidos para estudiar su encapsulación por parte de la mezcla equimolar de ambos CPs. En primer lugar, se realizaron valoraciones mediante espectroscopía UV-vis, que revelaron un comportamiento complejo y en ocasiones algo errático sobre el proceso de interacción cápsula-ligando. Se pudo observar que analizando parámetros como la Abs o la λmax de la banda Soret o, mejor dicho, de la mezcla de bandas Soret, de las porfirinas de Zn y Sn en presencia de diferentes cantidades de ligandos, no se podía obtener información concluyente sobre las diferencias de afinidad entre ligandos. Finalmente, comprobamos mediante RMN que al incubar uno de los ligandos con un tamaño similar al de la cápsula, aparecían nuevas señales que se correspondían con los protones del ligando, pero en regiones diferentes a las habituales para este tipo de anillos aromáticos. Este comportamiento se debe a la disposición del ligando en el cono de anisotropía de las tapas de porfirina que causan el apantallamiento de las señales del ligando. Este comportamiento, confirma claramente la encapsulación del ligando y la confirmación de que se han preparado capsulas capaces de reconocer ligandos hetero-difuncionales de forma selectiva. Summary 21 Summary Since the development of modern chemistry, there has been a constant need to obtain more and more complex molecular structures in terms of their size, function and biocompatibility. That is the reason why, since the early days of this field, synthetic organic chemistry has played a relevant role in the development of new methodologies for the discovery of new covalent bond-forming reactions as well as the selective transformation of specific functional groups. Despite all the groundbreaking advances experienced in organic synthesis during the last decades, there are still limitations when trying to obtain large and complex molecules that present a specific tridimensional topological disposition of functional groups, whose synthesis still demands plenty of manpower and time. To overcome this limitation, a new discipline has emerged, known as supramolecular chemistry, which is devoted to the study of weak interactions, such as hydrogen bonding, π-stacking or dispersion forces. between different molecules. This strategy allows synthetically simple precursors to be arranged providing complex tridimensional architectures. This goal is achieved upon the combination of several of these weak interactions which, despite delivering a small enthalpic contribution individually, add up to overcome the entropic barrier associated with bringing together a variety of individual molecules to generate a supramolecular complex. Among the vast diversity of different topologies that have been developed since the emergence of supramolecular chemistry, tubular structures as well as molecules that present functional groups directed towards a cavity, generally known as molecular capsules, have been of great interest. Molecular capsules are of particular importance due to their ability to confine small molecules in their lumen selectively. These processes can have important implications in fields such as catalysis, the development of molecular sensors or when trying to emulate specific biological transformations. In this regard, highly selective chemical transformations in confined spaces as well as the translocation of ions across biological membranes, can be reproduced using simple synthetic molecules to gain some insights about how complex biological machinery operates in living systems. During the last two decades, our research group has developed a robust methodology for the synthesis of cyclic peptides (CPs) made of a variety of amino acids (Aas). Notably, it has pioneered the incorporation of cyclic γ-Aas intercalated between natural α-Aas of opposing chirality. This particular mix provides peptides which are prone to achieve a planar conformation that facilitates the interaction between different peptide subunits. This allows the further association of different subunits to generate long hollow tubes composed of piled-up CPs. Alternatively, shorter tubes (dimers) can be assembled by the substitution of the amide protons of the peptidic backbone on one of the peptide’s faces by alkyl groups. The main characteristic that this α,γ-CPs present is, precisely, the asymmetry of their two faces, given that each of them presents the NH and carbonyl group of a single Aa family (either α or γ). This property, in addition to the simple modification on the internal diameter of the ring (achieved by the modification on the number of Aas that are included in its sequences), provides a fine tunability on the strength of the interactions that govern the self-assembly. Hence, the resulting supramolecular structure can present a certain capacity to respond to certain external stimuli. Moreover, γ-Aas present a methylene group (β position on the cycloalkane moiety) projected towards the lumen, which provides a unique opportunity to achieve modified cavities by incorporating γ-Aas with chemical modifications on this particular position. Alberto Fuertes García 22 Considering all these properties, this Ph.D. dissertation will cover the study of these supramolecular platforms, with a special focus on the design and synthesis of new dimeric α,γ- CPs which are functionalized on the vertical plane of the ring. We envision that these molecules can act as precursors of new supramolecular capsules as well as building blocks in novel nanotube architectures. The first chapter of these manuscript covers the synthesis of a family of tubular assemblies with nanoscale lengths which, for the first time, present an alternating diameter. Towards this end, we have covalently-attached two CPs whose supramolecular stacking is blocked on the γ-face and that display different sizes (different number of Aas in their sequences), which gives rise to significant differences in their association constants to give dimers. The covalent linkage of the two rings was achieved by means of a CuAAC reaction, commonly referred to as click reaction, given the total orthogonality that both reactive groups present along with the peptide synthesis strategy. We propose the incorporation of a propargyl group onto the skeleton of a α,γ-cyclic octapeptide and a propyl-azide chain onto a ,γ-cyclic tetrapeptide, whose combination gives rise to a covalent bis-cyclic peptide adduct with remarkably different modes of interaction (β-sheet type interactions) with other peptides. On the one hand, the α-face of the larger peptide is known to provide large association constants (Ka>106) in nonpolar solvents (i.e., chloroform), whereas the cyclic tetrapeptide presents a several orders of magnitude lower association constant, according to our experimental measurements based on thermodynamic models. These remarkable differences in their association constant allow the system to be externally modulated in terms of its aggregation behavior. In this regard, it was possible to determine by NMR measurements how parameters such as the concentration of the sample or the temperature of the external media affect the equilibria of the system between singular monomers and nanotubes. Also, it was possible to prevent the assembly into nanotubes upon the addition of small amounts of protic solvents, which compete for the interaction between the cyclic tetrapeptides. It is also possible to inhibit the linear growth of the complexes by adding a CP complementary to the the cyclic octapeptide, with which the former preferentially forms heterodimers, thus preventing the stacking of further bis-cyclic peptide subunits in a way that produces only small tubes made of three (protic media) of six (non-polar solvents) peptide rings. To assess the molecular sizes of the species mentioned above in solution and obtain some insights about the degree of aggregation in the system we have used DOSY measurements, which exhibited clear correlations between complex size and sample concentration. In the second chapter, we developed a similar strategy in which we used functionalized cyclic peptides to gain access to a family of structures that could act as membrane transporter agents, emulating the natural amphipathic molecules known as ionophores. These ionophores can translocate inorganic cations and anions across lipid bilayers with excellent efficiency. To this end, we first performed a structure-activity study on a group of α,γ-CPs that presented differences in their ring size (hexamers and octamers) and in the number of ionophoric pendants that were incorporated on the vertical axis of the macrocycle. This number was governed by the amount of N-propargylated γ-Aas that were incorporated in the sequence, which allowed the attachment of a variety of oligoethyleneglycol chains by means of a click chemistry procedure. This particular design gives rise to molecules that are made of a hollow central rigid core to which different tentacles that span the membrane are connected. The primary function of these molecules was to facilitate proton transport across lipid bilayers. Even though they showed the desired behavior, their results were pretty modest in terms of activity, which forced us to switch to a different transport model. Summary 23 Towards this end, we decided to incorporate pyridine rings at the end of the alkyne chains, knowing that coordinating properties of pyridine moieties could present some benefits for ion transport as compared to the long linear chains used in the first approach. After peptide synthesis, it was possible to incorporate the desired pyridine moieties utilizing a Sonogashira reaction in the presence of several iodo-pyridine isomers. The resulting ionophores presented a remarkable activity for the transport of inorganic ions across model lipid bilayers. Several transport experiments demonstrated that these molecules act as symporter agents, in which both a cation and an anion are translocated simultaneously. Interestingly, when the corresponding heterodimeric model with a non-functionalized CP was tested, we observed a total loss of ion transport in the system, which shows that both tripiridine caps are required to carry out an efficient transport process. Finally, mechanistic studies revealed that the mode of action was consistent with a carrier-like model, excluding both the generation of a permanent ion channel or an ion-hopping mechanism. In the third chapter of this dissertation, we have utilized the possibilities that the pyridinepeptide dimers described in the second chapter present as versatile molecular capsules. We have also extended this approach to other capsules with a larger cavity (i.e., α,γ-cyclic octapeptides) that are equipped with metalloporphyrin caps instead of pyridine rings. These closed caps can act as directing groups towards the formation of inclusion complexes with amino-carboxyl ligands. Studies on pyridine-peptide hybrids focused on exploiting the ability of the coordinating moiety to direct the incorporation of cationic diammonium guests into the cavity of the dimer. To that end, we analyzed alkyl-diammonium molecules of different lengths by NMR, that revealed significant changes in the signals of the cyclic hexapeptide skeleton, which evidences an interaction with the cationic species. Also, DOSY NMR experiments showed a clear relationship between the length of the ligand under study and the final size of the supramolecular complexes that are formed upon these interactions. This behavior can be correlated with an unmatched size between the cavity and the guests, which gives rise to the formation of large supramolecular aggregates derived from host-guest interactions on the external dimeric region if the guest is unfit for the cavity. Pyridine rings acting as capsule lids also allows the encapsulation of other ligands after the initial coordination of a metal center with an appropriate geometry. In this regard, the metal ion can direct the incorporation of a fourth ligand (guest molecule) into the void described by the peptide dimer. For this purpose, we have studied different tetrahedral Cu(I) salts that would match the requisites of the desired system. We have focused our efforts on a strategy in which, firstly, CuI is complexed to both tri-pyridine moieties. The resulting di-copper complexes were stable for several days and could be characterized by different techniques. The following step was devoted to subtracting the iodide ion attached to the copper to unveil the desired fourth coordination site on the metal, for which we treated the complex with a silver salt to favor the precipitation of AgI. Unfortunately, after carrying out this process in the presence of a variety of dinitrile ligands of different lengths, we were unable to detect the formation of the complex due to the fast degradation of the sample. This observation is probably caused by a Cu(I) to Cu(II) oxidation, which takes place immediately after the iodide ligand is removed from the medium. Regarding the molecular capsules based on cyclic octapeptides, we followed a synthetic strategy based on the incorporation of two hydrazide groups connected to different ends of the Alberto Fuertes García 24 peptide skeleton. With this approach, a complementary porphyrin that incorporates two aldehyde groups can be synthesized to carry out the condensation (hydrazone formation) with the cyclic peptide. Hence, a capsule can be assembled through the hydrazone bonds and the dimerization process between the CP subunits. At this point, it was possible to equip this intermediate with a metal center such as Zn(II) or Sn(IV), which gives rise to two different halfcapsule units. With this bimetallic approach, we envision the molecular recognition of ligands that present two different functional groups, each of them complementary with one of the metal centers. These functional groups were selected to be pyridines, which are recognized by Zn metalloporphyrins, and benzoic acid rings, complementary to the Sn center. We aimed to induce a self-sorting process upon the addition of an appropriate ligand, in which, from all possible statistical dimers (homo- and hetero-) that could be generated, only the heterodimeric bimetallic capsule should be observed in the presence of a heterodifunctional guest. Thus, we synthesized different linear and rigid difunctional guests to study their encapsulation with an equimolar mixture of both peptide-metalloporphyrin hybrids. First, we analyzed the interaction by UV-vis titrations which revealed a complex and somehow erratic behavior during the complexation step. Analysis of parameters such as Abs and λmax of the Soret band of the two porphyrins was insufficient to obtain evidence about the affinities of the ligand for the capsule. Finally, we employed NMR analysis to show that after the incubation of a ligand that fits the capsule with an equimolar mixture of both half-capsules a new set of signals emerge for the guest in a region of the spectrum unusual for this type of molecules. This anomaly can be explained by the disposition of the guest protons directly under the anisotropy cone of the porphyrin caps, which causes the observed shielding. This evidence confirms the incorporation of the guest to the cavity and confirms the ability of these novel heteromeric capsules to recognize heterodifunctional ligands. Introducción Alberto Fuertes García 32 mayor tamaño puede ser a su vez una supramolécula autoensamblada), por lo que no se hará una distinción explícita entre ambos a la hora de discutir los diversos ejemplos que se presentarán a continuación. Puesto que la cantidad de bibliografía en esta área excede con creces el alcance de esta memoria, organizaremos esta introducción atendiendo en primer lugar a diferentes ejemplos de sistemas supramoleculares basados en cápsulas moleculares y sus respectivos complejos de inclusión mientras que, posteriormente, nos centraremos en los procesos de autoensamblaje que dan lugar a estructuras monodimensionales de tamaño nanométrico (nanotubos), por ser las dos áreas temáticas más relevantes a la hora de contextualizar los resultados obtenidos en los diferentes capítulos de esta memoria. 1.2. Sistemas host-guest 1.2.1. Receptores moleculares covalentes Como se ha comentado previamente, se considera que el nacimiento de la química supramolecular moderna se produce a finales de la década de los 60s con los trabajos de Pedersen, Cram y Lehn sobre el descubrimiento de moléculas macrocíclicas que eran capaces de encapsular iones metálicos de los grupos I y II. El pionero de este trío fue Charles Pedersen, quien, en el año 1967, descubrió por serendipia el compuesto dibenzo-18-corona-6 y, posteriormente, otros poliéteres cíclicos cuya unidad repetitiva era el óxido de etileno (- CH2CH2O-), a los que bautizó como éteres corona. Este nombre proviene de la conformación en la que se disponían rodeando a los iones metálicos a los cuales complejaban con una afinidad asombrosa, debido a la interacción de estos con los pares electrónicos libres de los diferentes átomos de oxígeno. Estos macrociclos mostraban además una dependencia directa entre el tamaño de su cavidad interna y el tipo de ion alcalino o alcalinotérreo con el que interaccionaban.31 Este revolucionario trabajo sentó las bases del campo y puso de manifiesto que no solo existían productos naturales capaces de complejar este tipo de sustancias,32 sino que era posible preparar compuestos puramente sintéticos que llevasen a cabo este tipo de reconocimiento supramolecular. Continuando la línea iniciada por Pedersen, el químico francés Jean-Marie Lehn profundizó en el estudio de este tipo de estructuras dotándolas de tridimensionalidad, lo que permitió una complejación en la que el guest estaba más protegido del entorno. Este avance fue posible mediante la introducción de átomos con geometría trigonal como el nitrógeno, frente al uso de exclusivamente átomos de oxígeno.33 Esta nueva familia de cápsulas tridimensionales se bautizaron como criptandos (criptatos en su forma de complejo metálico), debido al mayor confinamiento de los iones metálicos en su interior que recordaba a una jaula. El atrapado tridimensional supone una mayor afinidad por los sustratos, además de una mayor lipofilia del complejo resultante tras la interacción. Esta estrategia permitió expandir el uso de estas moléculas más allá de los iones metálicos alcalinos y alcalinotérreos, ya que ligeras variaciones 31 C. J. Pedersen, J. Am. Chem. Soc. 1987, 89, 7017-7036. 32 N. Rodríguez-Vázquez, A. Fuertes, M. Amorín, J. R. Granja, “Bioinspired Artificial Sodium and Potassium Ion Channels” En The Alkali Metals Ions: Their Role for Life, Vol. 16; Springer International, Cham, 2016. 33 B. Dietrich, J.-M. Lehn, J. P. Sauvage, Tetrahedron Lett. 1969, 10, 2885-2888. B. Dietrich, J.-M. Lehn, J. P. Sauvage, Tetrahedron Lett. 1969, 10, 2889-2892. Introducción 33 en los receptores permitieron encapsular otras especies de geometría esférica o tetraédrica como iones amonio, pequeños cationes orgánicos o incluso aniones.34 Inspirado nuevamente por los trabajos pioneros de Pedersen, Donald Cram acuñó un nuevo término en la, hasta ese momento, breve historia de los receptores supramoleculares; concretamente describió una nueva familia de moléculas que nombró esferandos. Estas también exhiben una disposición tridimensional en torno a la molécula huésped, pero su diferencia fundamental es que no derivan del óxido de etileno y, sobre todo, que no tienen que sufrir ningún tipo de modificación conformacional a la hora de interaccionar con su ion complementario, ya que desde el momento de su síntesis presentan la geometría adecuada para la formación del complejo. Este hecho se traduce en mejoras sustanciales en las afinidades por los ligandos, ya que no se debe pagar el peaje energético de llevar a la molécula anfitrión a una geometría diferente a la de su estado normal.35 Estos tres autores fueron galardonados con el Premio Nobel de Química del año 1987, por sus trabajos pioneros en esta área de la química supramolecular.36 Figura 3. Estructuras de éter corona (15-corona-5), [2.2.2]criptando, esferando y p-ciclofano (de izquierda a derecha) y sus respectivos complejos con diferentes huéspedes. Con posterioridad a estos trabajos seminales se desarrollaron nuevas moléculas cíclicas que eran capaces de complejar moléculas apolares en su interior hidrofóbico y que se conocen como ciclofanos. Su estructura se basa en la presencia de unidades aromáticas que están puenteadas por cadenas alifáticas. El primer artículo en este campo se publicó en 1980 por parte del grupo de Koga, en donde se formaban complejos con guests aromáticos.37 Con posterioridad 34 J. Kim, A. S. Ichimura, R. H. Huang, M. Redko, R. C. Philips, J. E. Jackson, J. L. Dye, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 10666-10667. V. Amendola, G. Bergamaschi, A. Miljkovic, Supramolecular Chemistry 2018, 30, 236-242. 35 K. N. Trueblood, C. B. Knobler, E. Maverick, R. C. Helgeson, S. B. Brown, D. J. Cram, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 5594-5596. D. J. Cram, T. Kaneda, T. R. C. Helgeson, G. M. Lein, J. Am. Chem. Soc. 1979, 101, 6752- 6754. 36 Nobel lectures, Angew. Chem. Int. Ed. 1988, 27, 1909-1927. 37 K. Odashima, A. Itai, Y. Iitaka, K. Koga, J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 2504-2505. Alberto Fuertes García 34 se han descrito nuevos ciclofanos diseñados a la carta, los cuales permiten la interacción con huéspedes de diferente naturaleza y en una variedad de disolventes, mediante la modificación de propiedades como el tamaño, la riqueza electrónica o la forma del anillo ciclofánico.38 Avances fundamentales en el campo de las interacciones débiles como el estudio del efecto hidrofóbico39 o la interacción catión-π,40 tienen su origen en este tipo de estructuras. Dentro de esta clase de receptores covalentes, merecen una mención particular los macrociclos conocidos como pillar[n]arenos, que son para-ciclofanos compuestos por un número variable de anillos de benceno (n = 5-10) sustituidos por dos grupos alcóxido o hidróxido y unidos entre sí por unidades de metileno (Figura 4).41 La presencia de grupos fuertemente dadores en su estructura aromática hace que presenten cavidades muy ricas en electrones, lo que los convierte en anfitriones óptimos para la encapsulación de sustancias catiónicas, aunque su uso no se restringe a estos guests únicamente. Puesto que pueden presentar un diámetro y sustituyentes42 variables en el anillo, es posible modular el comportamiento de la pared aromática, así como su flexibilidad conformacional, lo que los convierte en receptores muy versátiles, pudiendo dar lugar a complejos con más de una molécula huésped en su cavidad.43 A pesar de su relativamente corta existencia (se describieron por primera vez en 2008),41 este tipo de macrociclos se han utilizado para un sinfín de aplicaciones, por lo que, por cuestiones de espacio, se remite al lector interesado en este tema a visitar revisiones bibliográficas recientes en este campo.44 Otra mención aparte merece la familia de los cucurbit[n]urilos (CB[n]), los cuales, a pesar de no poder ser estrictamente considerados como ciclofanos (no derivan de anillos aromáticos), presentan características supramoleculares estrechamente relacionadas con las de los pillar[n]arenos. Estos macrociclos de tamaño variable (n = 5-10) están compuestos por unidades de glicolurilo conectadas mediante dos puentes de metileno (Figura 4, derecha). A pesar de que CB[6] se conoce desde principios del siglo pasado,45 no fue hasta la década de los 80 cuando, a raíz de la resolución de su estructura cristalina,46 se disparó la utilización de estas estructuras en química supramolecular. Su cavidad hidrofóbica se complementa en este caso con bordes decorados con grupos carbonilo, lo que permite que se establezcan fuertes interacciones iondipolo con moléculas catiónicas y/o hidrofóbicas. La diferencia entre las propiedades de la cavidad y los portales carbonílicos hace posible la orientación precisa de los sustratos que presenten regiones catiónicas e hidrofóbicas, además de propiciar la complejación con una elevada afinidad de sustratos con dos cargas positivas separadas por un grupo apolar.47 Este tipo de sustratos es especialmente relevante en química supramolecular acuosa, ya que la formación de complejos de inclusión propicia la liberación de moléculas de agua muy 38 F. Diederich, Cyclophanes, Monographs in supramolecular chemistry (series editor J. F. Stoddart), Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1991. R. Gleiter, H. Hopf (Eds.), Modern Cyclophane Chemistry, Wiley-VCH, Weinheim, 2004. 39 W. Blokzikl, J. B. F. N. Engberts, Angew. Chem. Int. Ed. 1993, 32, 1545-1579. 40 D. A. Dougherty, Science 1996, 271, 163-168. 41 T. Ogoshi, S. Kanai, S. Fujinami, T. Yamagishi, Y. Nakamoto, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 5022-5023. 42 N. L. Strutt, H. Zhang, S. T. Schneebeli, J. F. Stoddart, Acc. Chem. Res. 2014, 47, 2631-2642. 43 T. Ogoshi, T. Yamagishi, Y. Nakamoto, Chem. Rev. 2016, 116, 7937-8002. 44 T. Ogoshi, T. Kakuta, T. Yamagishi, Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 2197-2206. 45 R. Behrend, E. Meyer, F. I.; Rusche, Ueber Condensationsproducte aus Glycoluril und Formaldehyd. (Tesis Doctoral), Heidelberg University, Heidelberg, (1905). 46 W. A. Freeman, W. L Mock, N. Y. Shih, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 7367-7368. 47 C. Marquez, R. R. Hudgins, W. M. Nau, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 5806-5816. F. Biedermann, O. A. Scherman, J. Phys. Chem. B 2012, 116, 2842-2849. Introducción 35 energéticas inicialmente alojadas en la cavidad del CB,48 lo que comúnmente se conoce como efecto hidrofóbico.49 Nuevamente, la cantidad y variedad de guests que estas moléculas pueden albergar en su cavidad, tanto para dar complejos 1:1 como 1:2, 2:1 o 1:1:1, es inmensa y excede el alcance de esta introducción, por lo que no se profundizará más en este tema.50 Figura 4. Ejemplos de estructura de pilarareno (izquierda, n=5; R=Me) y cucurbiturilo (derecha, n=6). A medida que se iba dominando el campo de los receptores covalentes, las ventajas que suponía el confinamiento del sustrato en el interior de la estructura del receptor, protegiéndolo completamente del medio externo, parecía quedar patente frente a las estructuras más abiertas. En esta línea, Cram impulsó un nuevo concepto en el campo de la química supramolecular con el desarrollo de moléculas con forma cóncava que determinaban una cavidad protegida, abierta, únicamente, por un lado, en la que se unían las moléculas de interés. Para sintetizar este tipo de moléculas cóncavas (denominadas cavitandos) se usó inicialmente como unidad fundamental un anillo de resorcin[4]areno (preparado a partir de la condensación de resorcinol con un aldehído, Figura 5) que define la parte más profunda de la cavidad y que se puede modificar con paredes aromáticas de propiedades variables que protejan al guest.51 Estos resorcinarenos en realidad pertenecen a una familia de cavitandos más amplia que se conocen mediante el nombre de calix[n]arenos. Este nombre fue propuesto por su descubridor, David Gutsche, quien fue el primero en determinar su forma de cáliz.52 Aparte de resorcinol, pueden tener como unidad repetitiva el fenol o el pirogalol, siempre unidos mediante grupos metileno. No obstante, los calixarenos derivados del fenol, a pesar de ser muy abundantes en bibliografía, no han sido tan explorados en la preparación de cavitandos, ya que sus grupos funcionales hidroxilo se dirigen hacia la punta del cono y no hacia la apertura de la cavidad (al contrario de lo que ocurre con las otras dos familias), por lo que la incorporación de elementos que confinen a los posibles guests es más dificultosa.53 Uno de los cavitandos a los que más atención se ha prestado durante el desarrollo de este campo es al derivado resorcin[4]areno equipado con paredes aromáticas de quinoxalina, que presenta un área lo suficientemente grande para dotar de cierta profundidad a esta molécula y 48 F. Biedermann, V. D. Uzunova, O. A. Scherman, W. M. Nau, A. De Simone, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 15318-15323. 49 J, Murray, K. Kim, T. Ogoshi, W. Yao, B. C. Gibb, Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 2479-2496. 50 S. J. Barrow, S. Kasera, M. J. Rowland, J. del Barrio, O. A. Scherman, Chem. Rev. 2015, 115, 12320-12406. 51 J. R. Moran, S. Karbach, D. J. Cram, J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 5826-5828. 52 C. D. Gutsche, R. Muthukrishnan, Journal of Organic Chemistry 1978, 43, 4905-4906. 53 X. Ma, Y. Zhao, Chem. Rev. 2015, 115, 7794-7839. Alberto Fuertes García 36 poder así albergar diferentes huéspedes en la cavidad aromática (Figura 5).54 Fue posible demostrar que si se retiraban dos de los cuatro paneles aromáticos de quinoxalina de las paredes del cáliz, el cavitando resultante era capaz de reconocer una familia de esteroides, en donde se producían importantes diferencias de selectividad en función de la estereoquímica de las diferentes estructuras.55 Esta observación es debida al efecto de los grupos hidroxilo libres en las dos unidades de resorcinol no sustituidas por paneles aromáticos, cuya interacción se maximiza con sustratos que exponen grupos polares hacia esas regiones. A pesar de este reseñable reconocimiento diastereoespecífico, los dos sistemas de quinoxalina con dos o cuatro paredes aromáticas presentaban en general afinidades bajas por los sustratos estudiados, así como tiempos de vida media bajos en la cavidad, lo que se achaca a su zona de entrada amplia y, sobre todo, a su libertad conformacional, que provoca que las paredes no permanezcan en el estado que forma la cavidad cónica. Con el objetivo de paliar este problema, se han modificado las aletas aromáticas tanto con grupos amida como con grupos voluminosos que puedan bloquear la salida del ligando. La primera aproximación utiliza el autoensamblaje intramolecular (enlace de hidrógeno entre los diversos grupos amida en la entrada del cavitando) para mantener la integridad estructural de la cavidad,56 mientras que el segundo se basa en la restricción en la difusión del guest hacia fuera de la cavidad una vez ha sido complejado.57 En ambos casos, el incremento de la afinidad es más bien moderado, pero a nivel cinético se produce un incremento notable en la barrera de activación durante el proceso de abandono de la cavidad. Figura 5. Diferentes cavitandos preparados a partir de una unidad de resorcin[4]areno.54-60 Más recientemente, se han empleado con éxito este tipo de cavitandos basados en resorcin[4]arenos para llevar a cabo reacciones de macrociclación en medios acuosos.58 La eficiencia de este proceso se basa en la capacidad de la cavidad para plegar o doblar largas cadenas alquílicas con dos grupos reactivos terminales por su zona media, facilitando el 54 P. Soncini, S. Bonsignore, E. Dalcanale, F. Ugozzoli, J. Org. Chem. 1992, 57, 4608-4612. E. Dalcanale, P. Soncini, G. Bacchilega, F. Ugozzoli, J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989, 500-502. 55 M. Cacciarini, V. A, Azov, P. Seiler, H. Kunzer, F. Diederich, Chem. Commun. 2005, 5269-5271. 56 D. Rudkevich, G. Hilmersson, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 9911-9912. D. Rudkevich, G. Hilmersson, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 12216-12225. 57 R. J. Hooley, H. J. Van Anda, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3894-3895. 58 Y. Yu, J. Rebek Jr., Acc. Chem. Res. 2018, 51, 3031-3040. Introducción 37 contacto entre ambos en la zona de entrada del cavitando59 (o entre los dos extremos del guest y una molécula bifuncional adicional).60 Este comportamiento ha propiciado que los autores se refieran a este tipo de receptores como chaperonas artificiales, ya que aceleran una determinada reacción favoreciendo el plegamiento adecuado del sustrato. Además, esta estrategia se ha explotado para la transformación de moléculas alquílicas bifuncionales en las que existe interés en llevar a cabo una reacción en solamente uno de los grupos reactivos.61 En este caso, el plegamiento de la molécula lleva a uno de estos grupos a quedar embebido en la cavidad, protegiéndolo así del medio de reacción externo. Además de estos ejemplos representativos que utilizan pilararenos como plataforma, otros calixarenos han sido extensamente modificados y estudiados en su complejación con moléculas más pequeñas. No obstante, a menudo se observa que el reconocimiento es llevado a cabo por especies que derivan del autoensamblaje de varios de estos receptores, por lo que se profundizará en su descripción como moléculas anfitrionas en química supramolecular a lo largo del siguiente apartado. Llevando un paso más allá el concepto de confinamiento de los huéspedes, en el grupo de Cram describieron por primera vez una molécula polimacrocíclica que rodeaba por completo a otra más pequeña. Esta aproximación se basaba en un proceso de condensación entre dos unidades de resorcin[4]areno en presencia del ligando a encapsular, el cual, tras la formación de los enlaces covalentes que unen ambas tapas, queda totalmente retenido en el interior de la cavidad.62 La única forma que este tiene de abandonar la cavidad es la rotura de, al menos, un enlace covalente. Esta característica les valió el nombre de carcerandos (carceplejos en su forma complejada), ya que se puede realizar la analogía entre este sistema supramolecular y un preso que únicamente puede escapar de su celda rompiendo los barrotes que la componen. En este tipo de moléculas se describió por primera vez la orientación específica de un guest asimétrico en la cavidad, lo que se bautizó como isomería orientacional.63 A pesar de que este avance supuso toda una revolución conceptual, el interés de estos sistemas es bastante limitado por razones obvias, por lo que se avanzó hacia sistemas en donde el confinamiento fuese modulable. Es así como nacen los hemicarcerandos, que son especies totalmente análogas a los carcerandos salvo por el hecho de que presentan una mayor flexibilidad en la zona de unión entre las bases (portales), lo que permite llevar a cabo el proceso de complejación/descomplejación del guest sin tener que romper enlaces covalentes, aunque a menudo se requiere un cierto aporte de energía por motivos cinéticos.64 Esta nueva familia de receptores sí ha demostrado una gran versatilidad a la hora de, como se comentaba con anterioridad, emular las condiciones en los centros activos de los enzimas naturales, ya que ha sido posible, por ejemplo, obtener y estudiar por primera vez una molécula de ciclobutadieno a temperatura ambiente en el interior de una de estos receptores polimacrocíclicos.65 Esta especie era desconocida en química convencional 59 N. W. Wu, I. D. Petsalakis, G. Theodorakopoulos, Y. Yu, J. Rebek Jr., Angew .Chem. Int .Ed. 2018, 57,15091- 15095. N. W. Wu, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 7512-7515. S. Mosca, Y. Yu, J. V. Gavette, K-D. Zhang, J. Rebek Jr. J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 14582-14585. 60 Q. Shi, D. Masseroni, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 10846-10848. 61 D. Masseroni, S. Mosca, M. P. Mower, D. G. Blackmond, J. Rebek Jr., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 8290- 8293. 62 D. Cram, S. Karbach, Y. H. Kim, L. Baczynskyj, K. Marti, R. M. Sampson, G. W. Kalleymeyn, J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2554-2560. D. Cram, S. Karbach, Y. H. Kim, L. Baczynskyj, G. W. Kalleymeyn, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 2575-2576. 63 P. Timmerman, W. Verboom, F. C. J. M. van Veggel, J. P. M. van Duynhoven, D. N. Reinhoudt, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33, 2345-2348. 64 J. R. Moran, S. Karbach, D. J. Cram, J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 5826-5828. 65 D. J. Cram, M. E. Tanner, R. Thomas, Angew. Chem. Int. Ed. 1991, 30, 1024-1027. Alberto Fuertes García 38 en disolución por su inestabilidad frente a la dimerización, sin embargo, en el interior de la cápsula, esta especie hiperreactiva está protegida de la degradación. De manera similar, ha sido posible estudiar propiedades de encapsulación66 o de isomerización67 de diferentes sustratos utilizando la protección del medio externo que ofrecen estos sistemas. Con el objetivo de llevar la modulabilidad de estos sistemas hacia nuevas cotas, ha sido posible desarrollar moléculas que respondan a estímulos externos para modificar su estructura pasando así de ser carcerandos a hemicarcerandos (y viceversa), fenómeno que se conoce como gating.68 Figura 6. Izquierda: estructuras representativas de un carcerando62 (arriba) y un hemicarcerando con su respectivo hemicarceplejo64 (abajo). Derecha: proceso de gating fotoinducido que permite modificar el comportamiento de un carcerando.68 Tras haber comentado las estructuras básicas más representativas a lo largo de la evolución de los receptores supramoleculares covalentes, cabe destacar que, a medida que el campo iba siendo más maduro, (los métodos sintéticos se fueron progresivamente optimizando y se conocieron los principios termodinámicos que están detrás de la formación de los complejos) ha sido posible llevar a cabo nuevos receptores con múltiples cavidades que combinan diferentes receptores.69 El resultado se traduce en complejas arquitecturas supramoleculares que son capaces de reconocer sustratos polifuncionales con una afinidad exquisita, hecho que ha tenido importantes consideraciones en el desarrollo de las conocidas como máquinas moleculares, cuyo descubrimiento ha sido reconocido con el Premio Nobel de Química en el año 2016.26 La combinación de cavitandos con otras unidades directoras de la encapsulación ha sido especialmente relevante a la hora de diseñar sistemas que imiten a los metaloenzimas existentes 66 R. C. Helgeson, C. B. Knobler, D. J. Cram, J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 3229-3244. 67 M.-Y- Ku, S.-J. Huang, S.-L. Huang, Y.-H. Liu, C.-C. Lai, S.-M. Peng, S.-H- Chiu, Chem. Commun. 2014, 50, 11709-11712. 68 F. Liu, R. C. Helgeson, K. N. Houk, Acc. Chem. Res. 2014, 47, 2168-2176. 69 W.-B. Hu, W.-J. Hu, Y. A. Liu, J.-S. Li, B. Jiang, K. Wen, Chem. Commun. 2016, 52, 12130-12142. Introducción 39 en la naturaleza. En este aspecto, cabe destacar que los sistemas naturales utilizan la precisa disposición tridimensional de aminoácidos coordinantes para fijar la primera esfera de coordinación alrededor de un centro metálico y que, además, utilizan las propiedades de confinamiento del sitio activo (segunda esfera de coordinación) del enzima para favorecer la selectividad de las transformaciones que llevan a cabo. De este modo, en las últimas décadas se han desarrollado aproximaciones eficientes que se basan en anclar varios ligandos monodentados (o un número menor de ligandos polidentados) sobre cavitandos que presentan posiciones funcionalizables en sus extremos, de tal manera que, tras coordinar un ion metálico, este quede colocado en el entorno de la cavidad, idealmente proyectando alguna posición de coordinación vacante hacia esta, lo que modula sus propiedades. Esta aproximación tiene importantes implicaciones en el reconocimiento molecular, así como en el campo de la catálisis, ya que se produce una sinergia entre el efecto del centro metálico y el de la cavidad.70 Es bastante habitual que se recurra a cavidades basadas en calixarenos o ciclodextrinas,71 siendo estas últimas las preferidas para utilizar en medios acuosos por su mayor solubilidad, mientras que, para la elección de los ligandos, normalmente se utilizan ligandos tripodales basados en dadores de nitrógeno (aunque también oxígeno y azufre) o incluso en porfirinas, por su gran parecido a los centros de hemo-enzimas.72 Figura 7. Sistema mimético de la anhidrasa carbónica (izquierda) basado en una tapa de trimetilimidazol anclada a una ciclodextrina73 y otro análogo de la succinato-deshidrogenasa (derecha), donde el grupo hemo se mimetiza con una tapa porfirínica.70 Uno de los grupos que más ha contribuido al desarrollo de esta área ha sido el de Olivia Reinaud, quien diseñó una serie de complejos basados en un derivado de calix[6]areno funcionalizado con tres ligandos nitrogenados de tipo piridina o metilimidazol anclados a los anillos 1, 3 y 5 de la cavidad, que dirigían la complejación de centros metálicos sobre la cavidad. Este tipo de sistemas demostró presentar comportamientos dispares en función del tipo de ion metálico que se emplease y de los ligandos que le acompañasen. En general, fue posible obtener los complejos de geometría tetraédrica deseados, en los que la cuarta posición de coordinación se completa con una molécula de disolvente hasta la incorporación de un ligando apropiado. Estos sistemas se han utilizado para complejar aminas, alcoholes, nitrilos o amidas lineales74 70 J.-N. Rebilly, B. Colasson, O. Bistri, D. Over, O. Reinaud, Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 467-489. 71 D. M. Homden, C. Redshaw, Chem. Rev. 2008, 108, 5086-5130. 72 T. L. Poulos, Chem. Rev. 2014, 114, 3919-3962. 73 I. Tabushi, Y. Kuroda, J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 4580-4584. 74 O. Sénèque, M. N. Rager, M. Giorgi, O. Reinaud, J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 6183-6189. S. Blanchard, L. Le Clainche, M. N. Rager, B. Chansou, J. P. Tuchagues, A. F. Duprat, Y. Le Mest, O. Reinaud, Angew. Chem. Int. Alberto Fuertes García 40 así como en procesos redox.75 No obstante, estos metaloenzimas artificiales presentan el inconveniente de que el cuarto ligando puede coordinarse con una orientación que no necesariamente tiene porqué estar orientada hacia la cavidad (conocida como posición endo), por lo que se desarrollaron otro tipo de ligandos tripodales que restringieran la orientación del ligando exógeno obligándolo a proyectarse hacia la cavidad. Como se ha comentado con anterioridad, es bastante habitual la utilización de ligandos polinitrogenados de naturaleza tripodal como el tren [tris(2-aminoetil)amina],76 TMPA [tris(2-piridilmetil)amina]77 o PN3 [tris(2-aminofenil)fosfina]78 (Figura 8, derecha). También ha sido posible modular la preferencia por la posición endo y exo utilizando macrociclos decorados con tapas porfirínicas, donde se han realizado estudios estructura-actividad mediante la modificación del número y la naturaleza de los conectores entre cavitando y porfirina, el metal coordinado y la naturaleza del ligando empleado.79 De este estudio se concluye que, dada la presencia de la cavidad cerca del centro metálico, es posible llevar a cabo una diferenciación entre las posiciones de coordinación endo y exo en centros metálicos hexacoordinados, debido a la estabilización adicional del complejo endo por la interacción con la cavidad (Figura 8, centro). Llevando el sistema un paso más allá, ha sido posible el reconocimiento de sustratos ditópicos mediante la funcionalización de ambos bordes de un cavitando gracias a la incorporación de dos sistemas metálicos diferentes (Figura 8, derecha).80 Figura 8. Algunos ejemplos de análogos de metaloenzimas desarrollados en el grupo de O. Reinaud donde se muestran las diferentes estrategias empleadas para le encapsulación selectiva de ligandos hacia la posición endo.74-80 Ed. 1998, 37, 2732-2735. D. Coquière, S. Le Gac, U. Darbost, O. Sénèque, I. Jabin, O. Reinaud, Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 2485-2500. 75 N. Le Poul, M. Campion, B. Douziech, Y. Rondelez, L. Le Clainche, O. Reinaud, Y. Le Mest, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 8801-8810. 76 I. Jabin, O. Reinaud, J. Org. Chem. 2003, 68, 3416-3419. 77 X. S. Zeng, D. Coquiere, A. Alenda, E. Garrier, T. Prange, Y. Li, O. Reinaud, I. Jabin, Chem.Eur. J. 2006, 12, 6393-6402. 78 X. S. Zeng, N. Hucher, O. Reinaud, I. Jabin, J. Org. Chem. 2004, 69, 6886-6889. 79 D. M. Rudkevich, W. Verboom, D. N. Reinhoudt, J. Org. Chem. 1995, 60, 6585-6587. H. Iwamoto, S. Nishi, T. Haino, Chem. Commun. 2011, 47, 12670-12672. O. Middel, W. Verboom, D. N. Reinhoudt, J. Org. Chem. 2001, 66, 3998-4005. 80 C. Monnereau, J.-N. Rebilly, O. Reinaud, Eur. J. Org. Chem. 2011, 166-175. Introducción 41 Los ejemplos en los que el centro metálico se dispone directamente en el interior de la cavidad y no en el borde de esta (como sucedía en el párrafo anterior) son mucho más escasos, dada la complejidad sintética que supone la obtención de estas cajas covalentes metálicas. No obstante, este tipo de sustratos tiene mucho interés desde el punto de vista de la catálisis, ya que un mayor confinamiento puede dar lugar a selectividades desconocidas fuera de dicha cavidad.81 No obstante, el diseño de modelos de este tipo no es trivial, ya que a pesar de que se consiga un sistema catalítico que transforme un sustrato encapsulado en otro, el centro activo puede quedar inhibido por la presencia del producto si este no es capaz de salir rápidamente de la cavidad.82 En esta línea se han preparado cápsulas derivadas de resorcinarenos en los que una de las aletas laterales se equipa con un punto de coordinación para el centro metálico, las cuales han servido para llevar a cabo reacciones de sustitución alílica mediante química de Pd83 o hidroformilaciones catalizadas por Pt84 de manera selectiva (Figura 9, izquierda). El mismo procedimiento se ha aplicado en el campo de la organocatálisis, donde la disposición de grupos carboxilato hacia la cavidad cataliza la ciclación de epoxialcoholes de manera 50 veces más eficiente que sin cápsula85 (Figura 9, centro) o la inclusión de superbases como los azafosfatranos en el seno de un hemicarcerando que se utilizó en reacciones de Diels-Alder catalizadas por medio básico (Figura 9, derecha).86 Figura 9. Ejemplos de receptores que incorporan catalizadores metálicos (izquierda) y organocatalizadoroes (derecha) apuntando directamente al seno de su cavidad.83-86 A pesar de que existen muchos más receptores covalentes que podrían tener cabida en esta introducción hemos decidido limitarnos a describir únicamente receptores sintéticos cuyo estudio se desarrolle en fase líquida, independientemente de si la disolución es acuosa u orgánica. Por este motivo no quedan recogidos importantes actores en química supramolecular como por ejemplo las ciclodextrinas87 (por tratarse de anfitriones naturales) o los entramados 81 J. Yang, B. Chatelet, D. Hérault, J.-P. Dutasta, A. Martinez, Eur. J. Org. Chem. 2018, 5618-5628. 82 R. J. Hooley, Nat. Chem. 2016, 8, 202-204. 83 C. Gibson, J. Rebek Jr., Org. Lett. 2002, 4, 1887-1890. 84 T. Chavagnan, D. Sémeril, D. Matt, L. Toupet, Eur. J. Org. Chem. 2017, 313-323. 85 S. R. Shenoy, F. R. P. Crisostomo, T. Iwasawa, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 5658-5659. 86 B. Chatelet, V. Dufaud, J.-P. Dutasta, A. Martinez, J. Org. Chem. 2014, 79, 8684-8688. 87 B. V. K. J. Schmidt, C. Barner-Kowollik, Angew. Chem., Int. Ed. 2017, 56, 8350-8369. Special issue, Chem. Rev. 1998, 98, 1741-2076. Alberto Fuertes García 48 Figura 13. Izquierda: diferencias en el comportamiento ácido-base de diferentes sustratos al encapsularse en la caja de coordinación tetraédrica.119 Derecha: ejemplo de transformación selectiva medada por la caja tetraédrica.124 Los tetraedros de coordinación de estequiometría M4L6 no se restringen a los catecolatos de Raymond, sino que otros ligandos bis-bidentados han sido utilizados como precursores de cajas supramoleculares. Concretamente, el grupo de Custelcean ha utilizados bis-2,2’- bipiridinas cuyo conector incluye un grupo urea, el cual posibilita la inclusión de huéspedes mediante la interacción por enlace de hidrógeno. De esta manera es posible modificar drásticamente la afinidad de la cavidad desde los huéspedes relativamente hidrofóbicos de baja carga a aniones policargados y muy hidrofílicos.129 Otro nombre propio en el campo de las cajas de coordinación tetraédricas es el de Jonathan Nitschke, quien ha llevado el concepto un paso más allá al introducir el componente de la química covalente dinámica en el diseño de nuevos ligandos multi-bidentados basados en enlaces imina. Concretamente, se combinan moléculas derivadas de la 2-formilpiridina con bisaminas aromáticas (que acabarán definiendo las aristas o las paredes de la caja) en presencia de sales de metales de geometría octaédrica (Fe, Co, Ni, Zn o Cd(II), que actúan como vértices). Con esta aproximación se obtienen cápsulas metálicas (Figura 14) derivadas de la formación simultánea de enlaces dinámicos de coordinación (N→metal) y covalentes (N=C).130 Al contrario de lo que sucedía con las cajas de Raymond, estas presentan carácter catiónico, ya que derivan de ligandos neutros, lo que propicia la encapsulación de guests aniónicos y/o apolares. Con esta estrategia basada en el autoensamblaje dinámico de varios subcomponentes, la versatilidad de las cajas de coordinación aumenta considerablemente, ya que se puede acceder de manera más fácil a una plétora de aplicaciones que serían inalcanzables con cajas basadas en ligandos puramente covalentes. Entre los ejemplos más relevantes de las cajas tetraédricas dinámicas destacan sus estudios sobre el papel del efecto solvofóbico131 en la encapsulación de ligandos neutros de manera selectiva al variar el disolvente de estudio.132 Otra de las conclusiones de este estudio es que, nuevamente, la elección de ligandos aromáticos de elevada superficie actuando como caras en vez de aristas del tetraedro suponen una mejora notable en la complejación, a la vez que se demuestra que pequeñas variaciones en la estructura de los 129 R. Custelcean, P. V. Bonnesen, N. C. Duncan, X. H. Zhang, L. A. Watson, G. van Berkel, W. B. Parson, B. P. Hay, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8525-8534. 130 T. K. Ronson, S. Zarra, S. P. Black, J. R. Nitschke, Chem. Commun. 2013, 49, 2476-2490. 131 M. X. Whitehead, S. Turega, A. Stephenson, C. A. Hunter, M. D. Ward, Chem. Sci. 2013, 4, 2744-2751. 132 J. L. Bolliger, T. K. Ronson, M. Ogawa, J. R. Nitschke, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14545-14553. Introducción 49 paneles aromáticos pueden suponer grandes cambios en las capacidades encapsuladoras de los hosts resultantes.133 Figura 14. Estrategia de ensamblaje de las cajas de coordinación desarrolladas por el grupo de Nitschke a partir de bis- o tris-anilinas y 2-formilpiridinas o fenantrolinas con metales octaédricos, en los que los ligandos pueden actuar como aristas o caras del poliedro que se forma.130 Otra área de interés desarrollada por el grupo de Nitschke es el reconocimiento de aniones en medio acuoso (a menudo una tarea complicada),134 en donde se demostró que las cápsulas tetraédricas son capaces de adaptarse a la presencia de diferentes aniones. Esto se logra reconfigurando su estructura (variando su relación diastereomérica) para maximizar las interacciones mediante enlaces de hidrógeno no-clásicos.135 De esta forma, ha sido posible diseñar cajas que actúen como transportadores transmembranales sintéticos de halogenuros,136 o incluso otras que sean capaces de extraer iones de interés desde una fase acuosa a otra orgánica.137 Por otro lado, estas cajas han sido utilizadas para la estabilización de especies altamente reactivas, como por ejemplo el fósforo blanco (Figura 15, derecha),138 y para llevar a cabo transformaciones en su interior, tales como la degradación de agentes neurotóxicos a otras moléculas inocuas (Figura 15, izquierda)139 o la transformación de sustratos muy sencillos hacia otras moléculas de alto valor sintético en una sola etapa de manera selectiva un sistema catalítico tipo “relé”.140 133 T. K. Ronson, A. B. League, L. Gagliardi, C. J. Cramer, J. R. Nitschke, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 15615- 15624. 134 N. Busschaert, C. Caltagirone, W. Van Rossom, P. A. Gale, Chem. Rev. 2015, 115, 8038-8155. 135 J. K. Clegg, J. Cremers, A. J. Hogben, B. Breiner, M. M. J. Smulders, J. D. Thoburn, J. R. Nitschke, Chem. Sci. 2013, 4,68-76. R. Custelcean, P. V. Bonnesen, N. C. Duncan, X. Zhang, L. A. Watson, G. Van Berkel, W. B. Parson, B. P. Hay, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 8525-8534. 136 A. B. Grommet, J. R. Nitschke, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 6294-6297. 137 D. Zhang, T. K. Ronson, J. Mosquera, A. Martinez, J. R. Nitschke, Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3717-3721. 138 P. Mal, B. Breiner, K. Rissanen, J. R. Nitschke, Science 2009, 324, 1697-1699. 139 J. L. Bolliger, A. M. Belenguer, J. R. Nitschke, Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 7958-7962. 140 A. G.Salles Jr. S. Zarra, R. M. Turner, J. R. Nitschke, J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 19143-19146. Alberto Fuertes García 50 Figura 15. Aplicaciones de las cajas de coordinación dinámicas como aceleradores de la degradación de agentes tóxicos (izquierda)139 o estabilizadores de especies sensibles como el fósforo blanco (derecha).138 Las contribuciones del grupo de Nitschke no se reducen únicamente a las cajas de coordinación tetraédricas, ya que han explotado otro tipo de geometrías. Entre ellas destacan los sistemas heterometálicos que dan lugar a cubooctaedros en los cuales un tipo de metal determina los vértices del cubo mientras que el otro se sitúa en el centro de los lados.141 La presencia de estos nuevos centros metálicos ha sido explotada para dotar a las cajas de nuevas funciones, entre la que destaca la formación de cavidades de dimensiones muy grandes que pueden acomodar múltiples guest en su interior142 o dar cabida a aniones de gran tamaño,143 para los que no existen apenas receptores. Se demostró que cajas de dimensiones similares, pero con paredes más porosas, no son capaces de retener estos guest en su interior, por lo que la presencia del ion metálico central es clave a la hora de generar un nuevo punto de anclaje en el lado del cubo para ligandos aromáticos de elevada superficie. Otro ejemplo muy elegante en la utilización de esta estrategia se logró al utilizar como paredes de un cubo de coordinación una metaloporfirina de Zn, que presenta una nueva posición de coordinación para ligandos nitrogenados. Este nuevo centro metálico fue empleado con éxito para dirigir la encapsulación de un péptido que contiene un residuo de histidina y protegerlo así de la degradación por parte del enzima tripsina.144 El uso de metaloporfirinas para la formación de cajas de coordinación no ha sido exclusivo de este grupo, ya que su elevada superficie, así como la posibilidad de complejar diferentes metales en su posición central y su geometría C2/C4, que permite la modificación de sus extremos con dos o cuatro grupos coordinantes a otro centro metálico que actúe de vértice, las convierte en una unidad presente en muchos diseños de cajas.145 Algunos ejemplos en este área involucran la síntesis, purificación o identificación de diferentes alótropos de fullereno,146 la utilización de los metales centrales para inmovilizar un catalizador en una posición 141 D. Zhang, T. K. Ronson, J. R. Nitschke, Acc. Chem. Res. 2018, 51, 2423-2436. 142 F. J. Rizzuto, L. K. S. von Krbek, J. R. Nitschke, Nature Rev. Chem. 2019, 3, 204-222. 143 W. J. Ramsay, F. T. Szczypinski, H. Weissman, T. K. Ronson, M. M. Smulders, B. Rybtchinski, J. R. Nitschke, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 5636-5640. 144 J. Mosquera, B. Szyszko, S. K. Ho, J. R. Nitschke, Nat. Commun. 2017, 8, 14882-14887. 145 S. Durot, J. Taesch, V. Heitz, Chem. Rev. 2014, 114, 8542-8578. 146 W. Brenner, T. K. Ronson, J. R. Nitschke, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 75-78. Introducción 51 determinada de la cavidad,147 o incluso la internalización de otra unidad de metaloporfirina en la cavidad148 con implicaciones importantes en catálisis. Otros grupos como el de Anderson149 o Hupp150 han preparado cajas y anillos poliporfirínicos explotando la selectividad de coordinación que presentan los diferentes centros metálicos de las metaloporfirinas. Adicionalmente, ha sido posible combinar dos tipos de ligandos diferentes151 o incluso usar complejos organometálicos tipo sándwich como aristas durante el ensamblaje de la caja,152 en un espectacular ejercicio de diseño que demuestra un gran conocimiento sobre de las interacciones que mantienen unidas estas cajas de coordinación. Figura 16. Cajas de coordinación en los que los ligandos preparados se basan en una unidad de porfirina y que tienen importantes aplicaciones en el campo del reconocimiento de los diferentes alótropos de fullereno.142 Además de los nombres propios destacados previamente, existen muchos otros grupos que han desarrollado otros modelos de caja de coordinación y merecen ser citados brevemente como por ejemplo los metalocoronatos de Saalfrank,153 quien también ha diseñado criptandos154 basados en enlaces de coordinación junto con Dalcanale,155 el grupo de Chad Mirkin, que ha sido pionero en el campo de la utilización de ligandos lábiles para la generación de cápsulas metálicas con cavidades modulables (conocido como WLA de sus siglas Weak-Ligand 147 C. García-Simón, R. Gramage-Doria, S. Raoufmoghaddam, T. Parella, M. Costas, X. Ribas, J. N. H. Reek, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 2680-2687. 148 M. Otte, P. F. Kuijpers, O. Troeppner, I. Ivanovic-Burmazovic , J. N. H. Reek, B. de Bruin, Chem. Eur. J. 2013, 19, 10170-10178. 149 P. S. Bols, H. L. Anderson, Acc. Chem. Res. 2018, 51, 2083-2092. 150 S. J. Lee, K. L. Mulfort, X. Zuo, A. J. Goshe, P. J. Wesson, S. T. Nguyen, J. T. Hupp, D. M. Tiede, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 836-838. 151 M. Schmittel, B. He, P. Mal, Org. Lett. 2008, 10, 2513-2516. S. K. Samanta, M. Schmittel, Org. Biomol. Chem. 2013, 11, 3108-3115. Y. R. Zheng, Z. G. Zhao, M. Wang, K. Ghosh, J. B. Pollock, T. R. Cook, P. J. Stang, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 16873-16882. 152 Y. F. Han, Y. J. Lin, L. H. Weng, H. Berke, G. X. Jin, Chem. Commun. 2008, 350-352. N. P. E. Barry, P. Govindaswamy, J. Furrer, G. Sss-Fink, B. Therrien, Inorg. Chem. Commun. 2008, 11, 1300-1303. N. P. E. Barry, M. Austeri, J. R. M. Lacour, B. Therrien, Organometallics 2009, 28, 4894-4897. 153 R. W. Saalfrank, N. Löw, F. Hampel, H.-D. Stachel, Angew. Chem. Int. Ed. 1996, 35, 2209-2210. 154 R. W. Saalfrank, A. Dresel, V. Seitz, S. Trummer, F. Hampel, M. Teichert, D. Stalke, C. Stadler, J. Daub, V. Schunemann, A. X. Trautwein, Chem. Eur. J. 1997, 3, 2058-2062. 155 P. Jacopozzi, E. Dalcanale, Angew. Chem. Int. Ed. 1997, 36, 613-615. Alberto Fuertes García 52 Approach)156 o Ward y sus cápsulas polimórficas basadas en ligandos de bispirazolilpiridina.157 Como mencionábamos al inicio de esta sección, la utilización de complejos metálicos para el autosamblaje de cavidades funcionales no ha sido la única estrategia utilizada en la preparación de cápsulas, puesto que también se ha explorado la utilización del enlace de hidrógeno para llevar a cabo el autoensamblaje de varios subcomponentes que conformen una cápsula con propiedades definidas. Podemos considerar que esta rama de la química supramolecular comienza a principio de la década de 1990 con las contribuciones de Julius Rebek Jr. La primera observación de un complejo de inclusión en una cápsula autoensamblada sin mediación de centros metálicos se produjo en 1993, cuando se pudo observar la inclusión de pequeños hidrocarburos en la cavidad determinada por un dímero derivado de un bisglicolurilo ensamblado mediante enlaces de hidrógeno entre sus bordes complementarios.158 Las dos unidades de glicolurilo estaban unidas por espaciadores relativamente rígidos y provocaban el plegamiento de cada monómero para que ambas mitades se pudieran adaptar formando la cápsula, de una manera análoga a las dos mitades de una pelota de tenis.159 Las variaciones en las estructuras de las moléculas anfitrión, así como su estudio con una biblioteca de ligandos, puso de manifiesto que el grado de ocupación de la cavidad por parte del huésped es un factor que afecta en gran medida a la afinidad. Tras numerosos estudios se pudo concluir que la relación óptima entre el volumen de la cavidad de la cápsula autoensamblada y el volumen de la molécula encapsulada se sitúa en torno al 55%. Este descubrimiento significó un gran avance en el campo de los complejos host-guest y en el diseño racional de sistemas funcionales a partir de ese momento. De hecho, este descubrimiento se conoce como la “regla del 55% de Rebek”.160 Este grupo también ha analizado en detalle el proceso de encapsulación con cavitandos autoensamblados que generan anfitriones de cavidades cilíndricas. Para ello, utilizaron resorcin[4]arenos similares a los descritos en la Sección 1.2.1 de esta Introducción, aunque en este caso las paredes aromáticas estaban compuestas por unidades de diazaftalimida, de tal manera que en la apertura de la cavidad se exponen cuatro unidades de imida que propician la unión entre dos cavitandos mediante su autoensamblaje por enlaces de hidrógeno (Figura 17, izquierda). A lo largo de 20 años han ido profundizando en el estudio de estos cavitandos y han obtenido resultados realmente sorprendentes, como veremos a continuación. Estas cavidades diméricas se ensamblaban únicamente en presencia de huéspedes que se organizan de manera apropiada en su cavidad, exhibiendo una selectividad muy notable. Posteriormente se pudo estudiar el ensamblaje en presencia de alcanos lineales cuya longitud se asemejaba (C6-C10) a las dimensiones de la cápsula. Sin embargo, se observó también que alcanos cuyas dimensiones en la conformación puramente extendida (observable en disolución) excedían las de la cápsula (C11-C14), adquirían una conformación helicoidal que reducía la longitud neta de la molécula, demostrada por la presencia de efectos nOe entre las posiciones metilénicas i e i+4.161 Este enrollamiento sobre sí mismo, a pesar de presentar un coste 156 A. M. Lifschitz, M. S. Rosen, C. M. McGuirk, C. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 7252-7261. 157 M. D: Ward, C. A. Hunter, N. H. Williams, Acc. Chem. Res. 2018, 51, 2073-2082. 158 N. Branda, R. Wyler, J. Rebek Jr., Science 1994, 263, 1267-1268. 159 R. Wyler, J. de Mendoza, J. Rebek Jr., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993, 32, 1699-1701. 160 S. Mecozzi, J. Rebek Jr., Chem. Eur. J. 1998, 4, 1016-1022. 161 D. Ajami, J. Rebek Jr., Nat. Chem. 2009, 1, 87-90. 23 D. Ajami, L. Liu, J. Rebek Jr., Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 490-499. Introducción 53 energético derivado de las interacciones gauche, se compensaba con el resto de las interacciones favorables entre huésped y anfitrión. Estos resultados constituyen uno de los primeros ejemplos de lo que se conoce con el término soft templating.23 Este concepto involucra la existencia de complejos en los que ni el host ni el guest existen en disolución separadamente y su existencia solo tiene cabida como complejos supramoleculares. En este caso, el host no se puede aislar en forma dimérica sin un guest apropiado y el alcano helicoidal solo es estable dentro de la protección de la cápsula cilíndrica autoensamblada. Este fenómeno ha sido explotado para generar cápsulas cilíndricas extendidas, ya que para alcanos de más de 14 carbonos la cavidad derivada de la cápsula dimérica presentaba unas dimensiones insuficientes. Para ello, los autores incluyeron otro componente en el sistema, concretamente unidades de glicolurilo con una disposición de dadores-aceptores de enlace de hidrógeno complementaria a los extremos imídicos del cavitando. Con este nuevo componente, existe la posibilidad de que el cilindro se expanda en vertical mediante la inserción de varias unidades de glicolurilo entre las tapas de resorcin[4]areno, si la longitud del huésped así lo requiere.162 De esta forma se pudo aumentar la longitud de los alcanos hasta C21 con la adición de un cinturón de glicolurilos. Con posterioridad, se han llegado a describir cápsulas hiperextendidas que contienen hasta tres anillos de glicolurilos (para huéspedes de más de 24 átomos de carbono),163 que incluso pueden llegar a presentar formas angulares164 (Figura 17, derecha) si son ensambladas en presencia de guests apropiados en disolventes no competitivos. La adición de los cinturones de glicolurilo presenta un comportamiento modulable, ya que su protonación puede provocar su pérdida de capacidad para insertarse y, por tanto, el pH del medio externo puede usarse como un efector que provoque la compresión de ciertos ligandos desde su forma extendida (con cinturón) hacia su forma helicoidal comprimida (sin cinturón).165 También se ha llevado a cabo la N-metilación de los glicolurilos, que provoca el “cortocircuito” del autoensamblaje y fuerza el paso de cápsulas a cavitandos extendidos con un único cinturón de alargadores.166 Otras estructuras basadas en resorcinarenos han sido utilizadas para dar lugar a cápsulas autoensambladas, pero en lugar de basar su autoensamblaje en la interacción de paneles aromáticos laterales, se han introducido grupos que actúen como dadores o aceptores de enlace de hidrógeno en la posición 2 del resorcinol. En esta línea se han preparado fenoxiderivados167 y otros carboxiderivados, que se autoensamblan gracias a la presencia de anillos de protones o unidades de 2-aminopirimidina168/tetrahidro-2-pirimidona169, respectivamente (Figura 18, izquierda). 162 D. Ajami, J. Rebek Jr., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 5314-5315. 163 D. Ajami, J. Rebek Jr., Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 9283-9286. 164 K. Tiefenbacher, D. Ajami, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 12003-12007. 165 D. Ajami, J. Rebek, Jr., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 15038-15039. 166 Y. Yamauchi, D. Ajami, J.-Y. Lee, J. Rebek Jr., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 9150-9153. 167 R. G. Chapman, J. C. Sherman, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9081-9082. J. Trotter, J. C. Sherman, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 6252-6260. 168 K. Kobayashi, T. Shirasaka, K. Yamaguchi, S. Sakamoto, E. Horn, N. Furukawa, Chem. Commun. 2000, 41- 42. 169 M. Yamanaka, K. Ishii, Y. Yamada, K. Kobayashi, J. Org. Chem. 2006, 71, 8800-8806. Alberto Fuertes García 54 Figura 17. Cápsulas autoensambladas mediante enlace de hidrógeno desarrolladas por Rebek mediante la metodología soft template que permite alargar la cavidad mediante la inserción de cinturones de glicolurilos si la longitud de los guests así lo requiere.162-166 Estas cápsulas presentan cavidades más amplias y porosas que las desarrolladas por Rebek, lo que supone que se reducen considerablemente las interacciones CH-π durante el proceso de complejación. En consecuencia, juegan un papel relevante las interacciones del guest con los protones del puente metileno que une las diferentes unidades de resorcinol, los cuales presenta carga parcial positiva y favorecen las interacciones con iones halogenuro170 o con moléculas que contengan grupos carbonilo correctamente orientados,171 lo que ha sido explotado en su química host-guest. La posición 2 del anillo de resorcinol también ha servido como punto de anclaje para aminoácidos, que dirigen la dimerización mediante la interacción entre su grupo amonio y carboxilato. Esta cápsula autoensamblada presentaba afinidad por ligandos cargados e hidrofílicos, ya que la presencia de los aminoácidos en la zona ecuatorial no solo unía ambos hemisferios sino que también proyectaba grupos polares hacia el interior de la cavidad dirigiendo la encapsulación de huéspedes como el ácido málico, con el que presentaban una complementariedad en la formación de enlaces de hidrógeno.172 Los grupos de Reinhoudt y Kobayashi han ido un paso más allá y han preparado cápsulas heterodiméricas combinando los 2-carboxiresorcinarenos173 y 2-fenoxiresorcinarenos174 anteriores con otro cavitando basado en un resorcinareno que contiene anillos de piridina (Figura 18, derecha), de tal manera que se forme enlace de hidrógeno entre ambas unidades. Estas cápsulas heterodiméricas han sido capaces de encapsular bencenos 1,4-disustituídos asimétricos con una orientación definida en la cavidad, los cuales demostraron ser un ejemplo más de isomerismo orientacional.63,175 170 C. L. D. Gibb, E. D. Stevens, B. C. Gibb, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5849-5850. 171 N. Nishimura, K. Yoza, K. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 777-790. H. Kitagawa, Y. Kobori, M. Yamanaka, K. Yoza, K. Kobayashi, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 10444-10448. 172 A. Szumna, Chem. Commun. 2009, 4191-4193. A. Szumna, Chem. Eur. J. 2009, 15, 12381-12388. 173 I. Higler, L. Grave, E. Breuning, W. Verboom, F. de Jong, T. M. Fyles D. N. Reinhoudt, Eur. J. Org. Chem. 2000, 9, 1727-1734. 174 K. Kobayashi, R. Kitagawa, Y. Yamada, M. Yamanaka, T. Suematsu, Y. Sei, K. Yamaguchi, J. Org. Chem. 2007, 72, 3242-3246. 175 K. Kobayashi, K. Ishii, S. Sakamoto, T. Shirasaka, K. Yamaguchi, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 10615-10624. K. Kobayashi, K. Ishii, M. Yamanaka, Chem. Eur. J. 2005, 11, 4725-4734. Introducción 55 Figura 18. Cápsulas autoensambladas basadas en resorcin[4]arenos funcionalizados en la posición 2 del anillo. El trabajo pionero de Atwood demostró que un calix[4]areno derivado del resorcinol era capaz de autoensamblarse en presencia de agua para dar lugar a complejos hexaméricos de morfología pseudo-esférica mediante la formación de 60 enlaces de hidrógeno.176 Con posterioridad, modificaciones sutiles de esta estrategia permitieron la obtención de una cápsula que presentaba grupos hidroxilo apuntando a la cavidad y formando enlaces de hidrógeno con el disolvente encapsulado177 (Figura 19, izquierda). Este se considera el primer ejemplo de cápsula autoensamblada con funcionalización interna. Otros calix[4]arenos derivados del fenol también han sido equipados con grupos capaces de interaccionar mediante enlace de hidrógeno en la parte abierta del cono que determinan, concretamente en la posición 4 del anillo de fenol. Este tipo de moléculas, diseñadas para mantenerse en la forma cónica, han servido para autoensamblarse mediante grupos urea autocomplementarios178 (Figura 19, derecha) dando lugar a una cápsula dimérica que presenta propiedades muy diferentes de polaridad en su interior. Esto se debe a que el ecuador es polar (debido a la presencia de las ureas) mientras que el interior del cono es muy hidrofóbico, lo que de nuevo proporcionaba orientaciones muy definidas de los diferentes guest en la cavidad. Esta estrategia se ha utilizado en presencia de sulfonilureas 179 o fenilureas,180 las cuales dan lugar a cápsulas heterodiméricas. Los calix[4]pirroles presentan una alternativa interesante al uso de calix[4]arenos, ya que la presencia de anillos de pirrol en vez de fenol permite que actúen como donadores de enlace de hidrógeno de manera más eficiente. A pesar de que en condiciones normales el núcleo tetrapirrólico tienda a estar en la conformación 1,3-alternada,181 es conocido que en presencia de huéspedes apropiados se puede producir un cambio conformacional que disponga los cuatro grupos NH del pirrol hacia la cavidad para maximizar las interacciones con estas moléculas. Este tipo de receptores ha sido ampliamente utilizado como cavitando, en donde también se ha 63 P. Timmerman, W. Verboom, F. C. J. M. van Veggel, J. P. M. van Duynhoven, D. N. Reinhoudt, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994, 33, 2345-2348. 176 L. R. MacGillivray, J. L. Atwood, Nature 1997, 389, 469-472. 177 J. L. Atwood, L. J. Barbour, A. Jerga, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99, 4837-4841. 178 K. D. Shimizu, J. Rebek Jr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1995, 92, 12403-12407. 179 R. K. Castellano, B. H. Kim, J. Rebek, Jr., J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 12671-12672. 180 O. Mogck, V. Böhmer, W. Vogt, Tetrahedron 1996, 52, 8489-8496. 181 P. Ballester, Chem. Soc. Rev. 2013, 42, 3261-3277. Alberto Fuertes García 56 explorado la posibilidad de aumentar el confinamiento de la cavidad incorporando paredes aromáticas en la posición meso, que aumenten la profundidad de la cavidad.182 Figura 19. Complejo hexamérico basado en un monómero de resorcin[4]areno desarrollado por Atwood177 y cápsula dimérica de calixarenos derivados de fenilureido-fenol de Rebek.178 En particular, se han estudiado las interacciones de numerosos derivados calixpirrólicos con sustancias aniónicas183 o incluso con pares salinos, ya que la parte externa del cono puede estabilizar los cationes mediante interacciones cation-π184 o se puede incluso cerrar la parte externa del cavitando con derivados de éteres corona u otras estructuras ricas en heteroátomos que faciliten la complejación de cationes simultáneamente.185 Además de actuar como cavitandos, estos macrociclos han sido utilizados para la preparación de cápsulas supramoleculares, donde los trabajos del grupo de Pablo Ballester han sido pioneros. Inicialmente, se pudo demostrar que los calix[4]pirroles podían formar agregados hexaméricos similares a los descritos para calix[4]arenos por Atwood176,177 si se incluían anillos aromáticos en la posición meso que tuviesen posibilidad de formar redes de enlace de hidrógeno.186 Con posterioridad, fue posible limitar la agregación a cápsulas diméricas mediante el uso de grupos aromáticos de urea,187 los cuales dimerizaban nuevamente mediante el llamado “cinturón de ureas” y que demostraron ser buenos anfitriones para ligandos tipo bis-N-óxido de tamaño adecuado (Figura 20, derecha). Este reconocimiento se basaba en la interacción de ambos extremos aniónicos de manera simultánea con los conos de tetrapirrol, en los cuales se estabilizaba el anión por enlace de hidrógeno.188 Esto supuso una ventaja fundamental con respecto al uso de otros cavitandos como unidad monomérica, además de que el volumen interno era ligeramente mayor en este caso. Con posterioridad se demostró que la interacción con los N-óxidos no tenía por qué ser sinérgica, sino que era posible encapsular dos monómeros 182 A. Jana, S. Bähring, M. Ishida, S. Goeb, D. Canevet, M. Sallé, J. O. Jeppesen, J. L. Sessler, Chem. Soc. Rev. 2018, 47, 5614-5645. L. Escobar, G. Aragay, P. Ballester, Chem. Eur .J. 2016, 22, 13682-13689. 183 D. E. Gross, F. P. Schmidtchen, W. Antonius, P. A. Gale, V. M. Lynch, J. L. Sessler, Chem. Eur. J. 2008, 14, 7822-7827. 184 R. Custelcean, L. H. Delmau, B. A. Moyer, J. L. Sessler, W.-S. Cho, D. Gross, G. W. Bates, S. J. Brooks, M. E. Light, P. A. Gale, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2537-2542. 185 I.-W. Park, J. Yoo, B. Kim, S. Adhikari, S. K. Kim, Y. Yeon, C. J. E. Haynes, J. L. Sutton, C. C. Tong, V. M. Lynch, J. L. Sessler, P. A. Gale, C.-H. Lee, Chem. Eur. J. 2012, 18, 2514-2523. 186 G. Gil-Ramírez, J. Benet-Buchholz, E. C. Escudero-Adán, P. Ballester, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 3820- 3821. 187 P. Ballester, G. Gil-Ramírez, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009, 106, 10455-10459. 188 A. Galán, E. C. Escudero-Adán, P. Ballester, Chem. Sci. 2017, 8, 7746-7750. Introducción 57 con este grupo funcional a la vez189 o incluso co-encapsular dos guests diferentes simultáneamente.190 Figura 20. Estructuras de los dos isómeros de los calix[4]pirroles en donde la sustitución de los grupos R permite la incorporación de grupos que favorezcan la dimerización y la posterior encapsulación de guests bifuncionales, como los bis-N-óxidos (derecha).187 Cabe destacar que la utilización de enlaces metálicos y de hidrógeno para el ensamblaje de una cápsula supramolecular no son excluyentes entre sí, ya que existe algún ejemplo en bibliografía que explota de manera simultánea ambas aproximaciones. Por ejemplo, se han utilizado resorcin[4]arenos de simetría C2v que contienen dos grupos 4-piridilo y otros tantos 3-carbamoilfenilo191 o 3-octilureidofenilo192 que se autoensamblan en presencia de sales de Pd y Pt combinando ambas interacciones. 1.3. Nanotubos basados en el autoensamblaje de subcomponentes Como se ha comentado anteriormente, en el campo de la nanotecnología existe la necesidad creciente de desarrollar materiales con propiedades definidas de dimensiones nanométricas, para lo que generalmente se recurre a estrategias bottom up basadas en aproximaciones supramoleculares para la preparación de este tipo de estructuras. En esta línea, desde el nacimiento de esta disciplina se ha logrado obtener multitud de topologías tridimensionales, como las cajas anteriormente descritas, esferas,193 cubos,194 barriles195 o 189 G. Gil-Ramirez, M. Chas, P. Ballester, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 2520-2521. 190 A. Galán, V. Valderrey, P. Ballester, Chem. Sci. 2015, 6, 6325-6333. 191 M. Yamanaka, M. Kawaharada, Y. Nito, H. Takaya, K. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16650-16656. 192 M. Yamanaka, N. Toyoda, K. Kobayashi, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 9880-9881. 193 A. R. Stefankiewicz, J. K. M. Sanders, Science 2010, 328, 1115-1116. 194 A. Stephenson, M. D. Ward, Dalton Trans. 2011, 40, 10360-10369. 195 Y. Lim, M. J. Lee, Mater. Chem. 2011, 21, 11680-11685. Alberto Fuertes García 64 apilamiento heteromérico de ambos componentes de manera exclusiva, donde ambos enantiómeros se intercalan en el nanotubo.229 En muchos de estos ejemplos, los agregados supramoleculares obtenidos no presentaban un tamaño suficiente como para resolver la estructura de estas interesantes arquitecturas átomo a átomo. Este problema podría ser debido a la capacidad del nanotubo de crecer de manera (idealmente) infinita, lo que, además, limita en gran medida sus aplicaciones una vez se lleva a cabo el proceso de autoensamblaje. No ha sido hasta hace muy pocos años cuando se ha logrado resolver la estructura cristalina, tanto con una estructura de lámina β paralela como antiparalela, de este tipo de nanotubos peptídicos autoensamblados.230 Con el objetivo de determinar la estructura a nivel atómico de estos sistemas supramoleculares, así como de estudiar en detalle las propiedades termodinámicas del proceso de autoensamblaje, Ghadiri y colaboradores decidieron poner coto al crecimiento indefinido de los nanotubos peptídicos y se centraron en el desarrollo de sistemas en los que se pudiese estudiar las interacciones mínimas que provocan el apilamiento, a saber, sistemas diméricos. Para ello, los autores exploraron una característica intrínseca de los D,L-α-CPs por la cual todos los residuos homoquirales presentan sus grupos NH y C=O hacia la misma cara, por lo que, si se impide la formación de enlace de hidrógeno por una de esas caras se bloquea el crecimiento del nanotubo, puesto que solo puede producirse el apilamiento por la cara opuesta y desemboca en la formación del nanotubo más corto posible, un dímero. Este bloqueo se llevó a cabo mediante la sustitución de los protones amídicos de la alanina en la secuencia c-[(L-Phe-D-MeN- Ala)4] por grupos metilo (Figura 27).231 A pesar de que este no fue el primer estudio sobre D,L- α-CPs N-metilados (Lorenzi había estudiado previamente un ciclohexapéptido basado en el mismo dipéptido)232, se trata del primero en el cual se estudia de manera detallada el proceso de dimerización, atendiendo a sus parámetros termodinámicos. Los estudios por RMN demostraron la existencia de dos especies en disolución, que se atribuyeron a la forma monomérica en equilibrio con la dimérica, donde los cambios más significativos aparecían en el desplazamiento químico de los NHs, que se desapantallaban fuertemente en la forma dimérica, lo que corroboraba la formación de la especie ensamblada al justificarse este cambio en el desplazamiento por su implicación en la formación de enlaces de hidrógeno. Las constantes de asociación calculadas, así como los desplazamientos químicos, eran variables en función del disolvente en el que se llevasen a cabo los experimentos, aunque rondaban valores de 103-104. La difracción de rayos X permitió la resolución estructural detallada del dímero, en la que se corroboraban los datos obtenidos mediante microcristales previamente, con distancias N-O intermoleculares de 2.90 Å y con un diámetro (Van der Waals) interno de 7.5 Å. Profundizando en esta idea, se realizaron estudios de RMN con la mezcla de enantiómeros del ciclooctapéptido previamente caracterizado, que sirvieron para calcular la estabilidad relativa de los dímeros ensamblados mediante una lámina β paralela (heterodímero) o antiparalela (homodímeros). El RMN de protón en cloroformo de la mezcla racémica mostraba señales para cada una de las posibles especies diméricas presentes en disolución y, mediante el cálculo del área relativa, llegaron a la conclusión de que la lámina β antiparalela era más estable (0.8 kcal/mol) que la lámina β paralela.231 Estudios de dimerización posteriores con la mezcla 229 K. Rosenthal-Aizman, G. Scensson, A. Undén, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 3372-3373. 230 M. Silk, J. Newman, J. Ratcliffe, J. White, T. Caradoc-Davies, J. R. Price, S. Perrier, P. E. Thompson, D. K. Chalmers, Chem. Commun. 2017, 53, 6613-6616. 231 M. R. Ghadiri, K. Kobayashi, J. R. Granja, R. K. Chadha, D. E. McRee, Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 93- 95. 232 X. C. Sun, G. P. Lorenzi, Helv. Chim. Acta 1994, 77, 1520-1526. Introducción 65 racémica de otros CPs con composición aminoacídica diferente arrojaron resultados similares, por lo que se descartó que la diferencia de estabilidad de ambas especies estuviese provocada por interacciones entre las cadenas laterales de ambos ciclos.233 Finalmente, se realizó un estudio en profundidad de otros ciclos que presentaban diferentes tamaños y diferentes grupos alquilo bloqueando la formación de enlace de hidrógeno. Estas extensas investigaciones demostraron que no todos los sistemas eran capaces de dar lugar a dímeros estables y que la elección de las cadenas alquílicas no era trivial, puesto que podrían llegar a darse interacciones estéricas desfavorables al incorporar cadenas largas sobre el esqueleto peptídico.234 Figura 27. Proceso de dimerización de la mezcla racémica del D,L-α-CP c-[(L/D-Phe-D/L-MeN-Ala)4]. 1.3.2. Nanotubos y dímeros constituidos por α,γ-CPs A medida que se iban conociendo las propiedades de autoensamblaje de los D,L-α-CPs y se descubrían todas las posibilidades que ofrecían estas plataformas nanotecnológicas, quedaba patente que estas estructuras no eran buenas candidatas a la hora de intentar modular las condiciones internas del nanotubo que estas determinan, ya que ninguno de los protones de la posición α apunta directamente a la cavidad y por tanto su sustitución por otros grupos no es susceptible de producir modificaciones relevantes en ella. El mismo fenómeno se observaba con los nanotubos formados por β-CPs (ver Sección 1.3.3), donde la orientación de los protones metilénicos tampoco parecía propicia para poder modificar el interior. Para solucionar este problema, en nuestro grupo de investigación se desarrolló una nueva familia de péptidos cíclicos, denominados α,γ-CPs, que combinaba un número idéntico de residuos de α-Aas 233 K. Kobayashi, J. R. Granja, M. R. Ghadiri, Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 95-98. 234 T. D. Clark, J. M. Buriak, K .Kobayashi, M. P. Isler, M. R. Ghadiri, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8949-8962. Alberto Fuertes García 66 naturales con γ-Aas cíclicos artificiales (γ-Acas) con un patrón de sustitución cis.235 Estos nuevos γ-Acas guardaban cierta equivalencia con su parientes α, ya que es preciso escoger la combinación de quiralidades precisas entre ambos residuos para que se pueda producir la planarización y posterior apilamiento. Para su diseño se puede considerar la sustitución de todos los residuos homoquirales de un D,L-α-CPs por su γ-Aca de quiralidad equivalente. Esta equivalencia se detalla en la parte inferior de la Figura 28, donde se muestra la analogía existente entre los diferentes residuos y la convención utilizada a la hora de nombrarlos. Figura 28. Estructura de los α,γ-CPs, donde se muestran las diferentes interacciones entre residuos homoquirales que determinan la aparición de dos tipos de enlace de hidrógeno durante su proceso de apilamiento (arriba). Abajo: Equivalencia existente entre la quiralidad de los α-Aas y los ácidos 3- aminocicloalcanocarboxílicos (γ-Acas).235 Al contar con un número impar de átomos, los grupos carbonilo y NH de cada tipo de Aa quedan nuevamente orientados hacia la misma cara, lo que en esta ocasión supone que todas las amidas de los γ-Acas queden orientadas hacia la denominada cara γ, mientras que todos los α-Aas exponen sus aceptores y dadores de enlace de hidrógeno hacia la cara contraria (cara α). Además, la diferente separación entre los grupos aceptores/dadores de enlace de hidrógeno de los aminoácidos supone que, por motivos geométricos, solo se puede producir una interacción productiva de apilamiento entre residuos de la misma familia (α con α en azul y γ con γ en rojo, Figura 28) para dar lugar a una lámina β antiparalela, lo que supone un nuevo condicionante a 235 M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2844-2845. Introducción 67 la hora de diseñar estructuras funcionales, como veremos más adelante. Además, la presencia del anillo cicloalcánico en la secuencia ciclopeptídica dota a estos macrociclos de una rigidez adicional frente a sus análogos compuestos únicamente por α-Aas. Esto se traduce en una ventaja importante a la hora de construir macrociclos de mayor tamaño (mayor número de aminoácidos en su secuencia), ya que esta rigidez limita en cierta medida el plegamiento de la estructura, que impediría la planarización requerida para el ensamblaje supramolecular. Dada la clara diferenciación entre las dos caras de los α,γ-CPs, ha sido posible estudiar a nivel termodinámico el proceso de dimerización a través de ambas caras de manera independiente. Para esta tarea, en primer lugar, se estudiaron sistemas de ciclohexapéptidos que combinaban el γ-Aca que posee un anillo de 6 miembros (ácido (1R,3S)-aminociclohexáno carboxílico, L-γ-Ach, n=1 en la Figura 28) con el enantiómero opuesto de la Phe. La N- metilación selectiva de un tipo u otro de residuos condujo a la obtención de las Ka derivadas de los dos tipos de interacciones. De este modo, la interacción γ-γ, estudiada en CHCl3 mediante el uso de c-[(D-MeN-Ala-L-Ach)3], resultó ser mucho más débil (Ka en torno a 10² M-1) que su análoga α-α (c-[(D-Phe-L-MeN-Ach)3]), que presenta un valor de Ka del orden de 105 M-1. Además, la resolución de la estructura cristalográfica de este último CP permitió observar la presencia de una molécula de CHCl3 en la cavidad, evidenciando la mayor hidrofobicidad de este tipo de cavidades en comparación con los D,L-α-CPs. No obstante, trabajos posteriores han encontrado moléculas de agua desordenas en el interior del dímero, lo que demuestra un cierto comportamiento anfifílico.236 Figura 29. Estructura cristalográfica del c-[(D-Phe-L-MeN-Ach)3] en su forma dimérica que muestra una molécula de cloroformo en su cavidad (a) y la posición promediada de 4 moléculas de agua desordenadas en la cavidad (b).236 En cuanto a ciclos más pequeños como los ciclotetrapéptidos, no fue posible apreciar interacción γ-γ, mientras que la Ka α-α se situaba en torno a 10² M-1.237 La tendencia de que la 236 M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, J. Drug. Delivery Sci. Technol. 2005, 15, 87-92. 237 M. Amorín, R. J. Brea, L. Castedo, J. R. Granja, Org. Lett. 2005, 7, 4681-4684. M. Amorín, R. J. Brea, L. Castedo, J. R. Granja, Heterocycles 2006, 67, 575-583. Alberto Fuertes García 68 interacción α-α era más fuerte que la γγ se evidenció también para ciclos de mayor tamaño,238 lo que quizás se justifique en base al mayor impedimento estérico presente entre el grupo N-Me y el carbonilo en los residuos α, lo que puede llegar a desestabilizar la conformación plana penalizando el proceso de formación del dímero.239 Expandiendo esta metodología, se utilizó también el ácido 3-aminociclopentano carboxílico (γ-Acp, n=0 en la Figura 28), que presenta un ángulo mayor entre C=O y NH que su análogo Ach (140 frente a 120º), lo que permite la obtención de ciclos de mayor tamaño.240 En esta línea, este monómero se ha empleado para la preparación de una amplísima biblioteca ciclopeptídica que abarca desde tetrapéptidos hasta hexadecapéptidos.241El análisis del proceso de dimerización mostró que, salvo en el caso de los ciclotetrapéptidos (Ka ~ 10² M-1), las interacciones mediante la cara α mostraba valores de Ka>105, mientras que, si se invertía el patrón de N-metilación, la interacción mediante la cara γ únicamente daba lugar a estructuras plegadas en los que los enlaces de hidrógeno intramoleculares impedían la conformación plana, quizás inducido por la mayor flexibilidad del anillo de 5 miembros. En nuestro grupo de investigación también se ha propuesto la utilización de la versión insaturada del Acp, concretamente el ácido 4-aminociclopent-2-enocarboxílico (γ-Ace) como unidad constituyente de α,γ-CPs, ya que este presenta un ángulo todavía mayor en el plano determinado por C=O-Cα y NH-Cγ. No obstante, la presencia de la insaturación en el anillo del γ-Aa provocaba una tendencia a la epimerización del Cα muy superior a la de los demás análogos saturados, lo que hacía de la síntesis peptídica un proceso tedioso y poco eficiente. Además, los dímeros formados por este γ-Aa mostraron valores de Ka muy bajos, lo que propició el abandono de su uso.240 Posteriormente, se llevaron a cabo estudios de dimerización en presencia de mezclas de α,γ-CPs compuestos por un número idéntico de aminoácidos pero variando el tipo de γ-Aca en su esqueleto. De esta manera, la mezcla equimolar de un péptido cíclico compuesto por Acp y otro compuesto por Ach (ambos residuos de la misma quiralidad) dio lugar de manera preferente a la especie heterodimérica sobre las especies homodiméricas (Figura 30).241b Este proceso demostró ser independiente del tipo de α-Aas empleados, por lo que se concluye que se trata de una interacción guiada por el esqueleto peptídico y no por hipotéticas interacciones entre las cadenas laterales. Este sistema de diversificación estructural, que también es ampliamente utilizado por los sistemas naturales,242 ha permitido la obtención selectiva de sistemas funcionales muy interesantes, como veremos más adelante en la Sección 1.3.4 y en el desarrollo de la discusión de esta memoria. 238M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Eur. J. 2005, 11, 6543-6551. 239 R. García-Fandiño, L. Castedo, J. R. Granja, S. A. Vázquez, J. Phys. Chem. 2010, 114, 4973-4983. 240 C. Reiriz, L. Castedo, J. R Granja, J. Pept. Sci. 2008, 14, 241-249. 241 a) Ciclotetrapéptidos: Ref. 237. b) Ciclohexapéptidos: R. J. Brea, M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5710-5713. c) Ciclooctapéptidos: R. J. Brea, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Commun. 2007, 31, 3267-3269. R. J. Brea, M. J. Pérez-Alvite, M. Panciera, M. Mosquera, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Asian J. 2011, 6, 110-121. d) Ciclodecapéptidos y ciclododecapéptidos: R. J. Brea, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Commun. 2007, 31, 3267-3269. e) Ciclohexadecapéptidos: R. J. Brea, Diseño, síntesis y aplicaciones de sistemas supramoleculares homo- y heterodiméricos selectivos y eficientes basados en α,γ-ciclopéptidos (Tesis Doctoral). Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela (2013). 242 P. M. Bowers, S. J. Cokus, D. Eisenberg, T. O. Yeates, Science 2004, 306, 2246-2249. Introducción 69 Figura 30. Esquema de formación de dímeros de naturaleza heterodimérica frente a sus análogos homodiméricos.241b Como se ha dicho con anterioridad, una de las principales ventajas que ofrece la incorporación de γ-Acas en la estructura ciclopeptídica es la presencia de una posición metilénica (Cβ) orientada directamente hacia la cavidad, por lo que en los últimos años se han llevado a cabo importantes avances en el desarrollo de CPs modificados en esa posición de tal manera que posicionen grupos funcionales apropiados hacia la cavidad del anillo. El primer ejemplo de estas características se describió en el año 2009, donde se incluyó en la secuencia de un α,γ-ciclotetrapéptido un residuo de ácido 4-amino-3-hidroxitetrahidrofuran-2-carboxílico (γ-Ahf), preparado a partir de la D-xilosa (Figura 31) que presenta un grupo hidroxilo proyectado hacia la cavidad dimérica. Estudios de dimerización sobre c-[D-Ala-γ-Ahf-D- Tyr(Me)-Acp] demostraron que si el grupo hidroxilo estaba protegido (OBn), el péptido no dimerizaba, mientras que al desprotegerse, la constante de dimerización aumentaba más de dos órdenes de magnitud frente a otros ciclotetrapéptidos compuestos únicamente por Ach, lo que evidencia la implicación de este grupo hidroxilo en el proceso de autoensamblaje.243 Con la idea de explotar las propiedades que ofrece este grupo hidroxilo, recientemente se ha publicado la incorporación de este Aa β-hidroxilado en las secuencias octapeptídicas c-[(D- Leu-γ-Ahf-D-Tyr(Me)-L-MeN-Acp)2] y c-[(D-Leu-MeN-γ-Ahf-D-Leu-L-MeN-Acp)2]. La primera de estas estructuras no fue capaz de adquirir la conformación plana debido a un plegamiento intramolecular, que propició el descubrimiento de un agregado hexamérico de geometría esférica con capacidad para reconocer aniones y transportar iones carbonato y nitrato a través de membranas lipídicas (Figura 31, parte superior).244 Sin embargo, cuando el residuo de Ahf se N-metilaba (segunda secuencia), tampoco se lograba la planarización esperada con los hidroxilos orientados hacia el interior de la cavidad, imposibilitando la caracterización de especies diméricas. Sin embargo, la adición de pequeñas cantidades de MeOH o agua (5%) sí dio lugar a estructuras diméricas, lo que sugiere que la cavidad hidrofílica requiere la presencia 243 C. Reiriz, M. Amorín, R. García-Fandiño, L. Castedo, J. R. Granja, Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 4358-4361. 244 N. Rodríguez-Vázquez, M. Amorín, I. Alfonso, J. R. Granja, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 4504-4508. Alberto Fuertes García 70 de moléculas polares. Además de dejar el grupo hidroxilo “desnudo” en el interior, es posible modificar esta posición con otros grupos para modificar las propiedades de la cavidad, aunque reduciendo notablemente su diámetro. En esta línea, se ha hecho reaccionar este ciclo con dos unidades de ácido picolínico, lo que ha permitido la encapsulación de iones de plata o ácidos dicarboxílicos (como el ácido oxálico) en la cavidad (Figura 31, parte inferior).245 Estos ejemplos han propiciado el desarrollo de agentes citotóxicos basados en el ciclodecapéptido c- [L-MeN-Ahf(CH2COOH)-D-Ala-L-MeN-Acp-D-Ala-L-MeN-Acp-D-Ach-L-MeN-Acp-D-Prg-L- MeN-Acp-D-Ala], en el que la presencia de un grupo carboxilato apuntando hacia la cavidad permitió su complejación a complejos derivados de cis-platino que mostraron actividad contra varias líneas celulares cancerosas.246 Figura 31. Diferentes patrones de N-metilación determinan la estructura secundaria de CPs que contienen dos residuos del Aa sintético γ-Ahf (en azul).244,245 Utilizando una aproximación ligeramente diferente, aunque también empleando un azúcar como sustrato, se preparó un γ-Aa derivado del ácido glucurónico que se denominó γ- Aga (Figura 32, azul), el cual se incorporó en la secuencia de un ciclooctapéptido compuesto únicamente por γ-Aas. La particularidad de este Aa es que incorpora un átomo de oxígeno hemiaminálico en la posición β, el cual apunta al interior de la cavidad. A pesar de que las aplicaciones de este CP no se han estudiado más allá de su caracterización estructural, se observó que, dada la simetría C2 de este macrociclo, se formaba preferentemente el dímero alternado, en el que los residuos de γ-Aga no se situaban uno encima del otro, seguramente debido a la repulsión electrónica del par solitario del oxígeno β.247 Adicionalmente, en nuestro 245 N. Rodríguez Vázquez, R. García Fandiño, M. Amorín, J. R. Granja, Chem. Sci. 2016, 7, 183-187. 246 N. Rodríguez-Vázquez, R. García-Fandiño, M. J. Aldegunde, J. Brea, M. I. Loza, M. Amorín, J. R. Granja, Org. Lett. 2017, 19, 2560-2563. 247 A. Guerra, R. J. Brea, M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 8762-8766. Introducción 71 grupo de investigación se han preparado otros aminoácidos con anillos de 5 y 6 miembros funcionalizados en la posición β con grupos metilo, flúor o hidroxilo, pero no se han empleado en la preparación de CPs debido a la dificultad que presentan para su obtención en gran escala y en forma enantiomericamente pura (Figura 32, derecha).248 Otros grupos de investigación han aportado su contribución a esta línea de investigación utilizando otras alternativas sintéticamente más eficientes. Así, el grupo de Ting Xu sustituyó uno de los α-aminoácidos de un D,L-α-ciclooctapéptido por un residuo del ácido 3-amino-2-metilbenzoico. Con esta aproximación se observó que el metilo de la posición C2 aromática está orientado hacia el interior de la cavidad, lo que le aporta una mayor hidrofobicidad a costa de reducir notablemente el diámetro interno del ciclo (Van der Waals) que pasa de 7.6 a 4.7 Å. Además, la incorporación de este Aa aromático distorsiona notablemente la conformación plana, demostrando que esta aproximación dista mucho de ser óptima a pesar de su mayor simplicidad sintética.249 Figura 32. Izquierda: CP que incluye residuos del aminoácido sintético γ-Aga.247 Centro: CP descrito por Xu basado en un D,L-α-ciclooctapéptido que sustituye un residuo por una unidad del ácido 3-amino- 2-metilbenzoico, que proyecta un metilo hacia la cavidad.249 Derecha: Aminoácidos sintéticos desarrollados en nuestro grupo de investigación con diferentes grupos funcionales (rojo) anclados al carbono β.248 1.3.3. Sistemas constituidos por otros CPs Además de los sistemas descritos hasta este punto basados en D,L-α-CPs y α,γ-CPs, en las últimas dos décadas se han desarrollado muchos más ejemplos compuestos por otras familias de aminoácidos, ya sea usando un solo tipo de Aas o la mezcla de varias clases. Sin ir más lejos, en la sección anterior se ha introducido un ciclo basado en únicamente γ-Aas cuando se discutía sobre la funcionalización de la posición β. El grupo de Deng también ha publicado un ejemplo de CPs construidos exclusivamente a partir de γ, concretamente mediante residuos de Ach modificados en la posición 5 con cadenas polioxigenadas, lo que le confiere mayor hidrofilia en la parte externa al ciclo. Además, hay que destacar que para los α,γ-CPs, la 248 N. Rodríguez-Vázquez, S. Salzinger, L. F. Silva, M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Eur. J. Org. Chem. 2013, 3477-3493. 249 R. Hourami, C. Zhang, R. Van der Weeger, C. Ruiz, C. Li, S. Keten, B. A. Helms, T. Xu, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 15296-15299. Alberto Fuertes García 72 alternancia entre ambos tipos de monómeros no está restringida a la relación 1:1. De hecho, dada la equivalencia comentada previamente entre la quiralidad de ambos residuos, ha sido posible desarrollar ejemplos en los que solo uno de cada cuatro residuos sean de tipo γ, conocidos generalmente como 3α,γ-CPs. Estos diseños, al dimerizar, adquieren unas formas que se asemejan más a elipses que a circunferencias, dadas las diferencias en la apertura del ángulo entre α y γ Aas. Además, existen diferencias notables en el valor de Ka del proceso de dimerización en función del patrón de N-metilación del esqueleto peptídico e incluso se puede llegar a producir la formación de hélices supramoleculares.250 Figura 33. Estructuras de β-CPs sintetizados por Seebach251 (izquierda) y Kimura252 (centro y derecha). Cronológicamente, los primeros CPs en aparecer fueron los compuestos por únicamente β-Aas. En el grupo de Seebach utilizaron cuatro residuos de β3-HAla para obtener un CP capaz de dimerizar. No obstante, dado el número par de átomos que separan ambos grupos formadores de enlace de hidrógeno, estos CPs planarizaban presentando todos los grupos NH hacia la misma cara y todos los grupos carbonilo hacia la opuesta, formando dímeros mediante el establecimiento de láminas β paralelas. Este fenómeno implica que el nanotubo formado presente una anisotropía neta, no observada en otros sistemas ciclopeptídicos. Se pudo comprobar que si se utilizaban β-Aas monosustituidos en el carbono β, la quiralidad que estos presentasen no tenía un papel relevante a la hora de adquirir la conformación plana requerida para dimerizar.251 También se han utilizado β-Aas cíclicos con anillos de 5 y 6 miembros derivados de azúcares los cuales, además de aportar una mayor rigidez al sistema, modificaban notablemente las propiedades externas del nanotubo. Además, aparte de dotarlos de una mayor hidrofilia, permitían su interacción con lectinas (proteínas de membrana que reconocen azúcares).252 250 M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Chem. Eur. J. 2008, 14, 2100-2111. A. Guerra, R. J. Brea, M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 8762-8766. 251 D. Seebach, J. L. Matthews, A. Meden, T. Wessels, C. Baerlocher, L. B. MsCusker, Helv. Chim. Acta 1997, 80, 173-182. 252 F. Fujimura, T. Hirata, T. Morita, S. Kimura, Biomacromolecules 2006, 7, 2394-2400. F. Fujimura, Y. Horikawa, T. Morita, J. Sugiyama, S. Kimura, Biomacromolecules 2007, 8, 611-616. Introducción 73 Ha sido posible aumentar sensiblemente la distancia entre el grupo amino y el grupo ácido de los monómeros precursores de CPs a base de incrementar la rigidez de los Aas para minimizar la libertad conformacional y dirigir la planarización una vez realizada la ciclación. En esta línea, el grupo de Dory presentó un nuevo tipo de δ-CPs formados por tres δaminoácidos α,β-insaturados cuyo doble enlace presenta una disposición trans, la cual favorecía el proceso de autoensamblaje para dar nanotubos. Al igual que sucedía con los β-CPs, los grupos formadores de enlace de hidrógeno estaban segregados en las caras opuestas, dando lugar a interacciones de lámina paralela con la anisotropía previamente comentada. Figura 34. CP desarrollado por Dory basado en el ácido (E)-5-aminopent-3-enoico y α,δ-CP desarrollado en nuestro grupo de investigación para la encapsulación de fullereno C60. En nuestro grupo de investigación también se han empleado recientemente δ-Aas rígidos para la construcción de CPs, aunque en este caso sea en combinación con otros tipos de Aas. En estos diseños, la rigidez viene determinada por la utilización del ácido trans-4- aminociclohexanocarboxílico, cuya conformación está restringida, presenta los grupos amina y ácido en una disposición ecuatorial y relativamente plana, lo que lo hace un candidato ideal para la preparación de CPs. En esta dirección, se ha combinado este δ-Aa cíclico tanto con α como con γ-Aas,253 en los que se produce una alternancia de la quiralidad, puesto que podría considerarse que el único papel de los residuos δ es el de actuar de espaciador entre el resto de los componentes. De esta manera, dado su ángulo de 180º, es posible obtener no solo ciclos de gran tamaño (se han descrito hasta macrociclos de 16 eslabones) sino que las formas que presentan contienen ángulos más marcados, ya que toda la torsión del sistema recae en los otros residuos. Estos sistemas de gran tamaño interno han sido utilizados recientemente para preparar nanotubos con capacidad de encapsular, y por tanto solubilizar, C60.254 Por último, cabe destacar que se ha llegado a describir por parte de Horne et al. el autoensamblaje de un 2α,ε-CP mediante una estrategia sintética muy elegante en la cual la etapa de ciclación es a la vez el paso en el que se genera el esqueleto de los dos ε-Aa. En este caso, prepararon un dipéptido que incluía en sus extremos un grupo azida y un grupo alquino, los cuales se hicieron reaccionar mediante química click para lograr las dos transformaciones en una única etapa. El triazol generado se situaba con una orientación paralela al eje del tubo, por 253 A. Guerra, Diseño y síntesis de ciclopéptidos que contienen γ- y/o δ-aminoácidos cíclicos y estudio de sus propiedades de autoensamblaje: síntesis de nuevos nanotubos peptídicos (Tesis Doctoral). Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela (2017). 254 A. Lamas, A. Guerra, M. Amorín, J. R. Granja, Chem. Sci. 2018, 9, 8228-8233. Alberto Fuertes García 80 transportar glucosa285 o ácido glutámico286 con D,L-α-ciclodecapéptidos pero no con octapéptidos, lo que evidencia la capacidad de estos nanotubos para realizar un cribado en base al tamaño de su cavidad, impidiendo el paso de sustancias mayores a dicho poro. Estos ciclos de menor tamaño, al igual que otros α,γ-CPs, cuando se componen de residuos hidrofóbicos, han demostrado tener la capacidad para transportar iones de un lado a otro de las membranas lipídicas, aspecto en el que nos centraremos con más detenimiento en la siguiente sección de esta Introducción. 2. Transporte transmembranal de iones 2.1. Sistemas naturales Podría considerarse que la compartimentalización ha sido uno de los procesos fundamentales a lo largo de la evolución de los sistemas biológicos. Desde la sopa primordial hasta el homo sapiens pasando por las bacterias extremófilas, los procesos evolutivos han ido generando una compleja maquinaria biológica que, en muchos casos, se fundamenta en la posibilidad de desempeñar funciones específicas en entornos aislados, de donde emana la selectividad que presentan la mayoría de los procesos naturales. Sin lugar a dudas, uno de los actores fundamentales en el proceso de compartimentalización han sido las membranas biológicas, las cuales han propiciado la aparición de organismos pluricelulares o la propia especialización de los diferentes orgánulos dentro de una misma célula, haciendo que los organismos compartimentalizados contasen con una mayor eficiencia en sus procesos vitales. Estas membranas biológicas no solo son las responsables de establecer una separación entre diferentes compartimentos, sino que juegan un papel clave en multitud de procesos celulares como el mantenimiento de la homeostasis entre ambos lados de la membrana, el tránsito de nutrientes hacia dentro de las células o la secreción de los residuos hacia el exterior, así como la comunicación entre diferentes compartimentos celulares o entre células diferentes (transducción de señales y regulación de procesos).287 A pesar de que la composición de estas membranas es tremendamente variada y depende de una infinidad de factores, se puede considerar que el componente fundamental y mayoritario de esta compleja mezcla de moléculas son los fosfolípidos. Esta familia de compuestos se caracteriza por estar formada por dos colas de ácidos grasos hidrofóbicas que se unen a una cabeza que contiene un grupo fosfato (hidrofílico) a través de una unidad de glicerol.288 Los fosfolípidos tienen la capacidad de autoensamblarse espontáneamente en medio acuoso dando lugar a bicapas que exponen las cabezas polares hacia el agua mientras que recluyen en su región interna las colas hidrofóbicas hidrocarbonadas, evitando el contacto directo con el agua. Son estas bicapas las que, al cerrase sobre si mismas pueden originar compartimentos (vesículas, orgánulos, células, etc.) donde las propiedades intra- y extramembranales pueden ser diferentes. No obstante, dado el carácter fuertemente hidrofóbico del interior de las bicapas lipídicas, esta compartimentalización provoca que se restrinja casi totalmente el tránsito de analitos 285 J. R. Granja, M. R. Ghadiri, J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10785-10786. 286 J. Sanchez-Quesada, H. S. Kim, M. R. Ghadiri, Ang. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2503-2506. 287 D. L. Nelson, M. M. Cox, Lehninger Priciples of Biochemistry, 5th edition, W.H. Freeman, New York, 2009. 288 R. L. Yeagle, The Structure of Biological Membranes, 2nd edition, CRC Press, Boca Raton, 2005. Introducción 81 polares a través de ellas, por lo que los sistemas naturales han tenido que desarrollar mecanismos para solventar este inconveniente. Mientras que las biomoléculas cargadas de gran tamaño como proteínas, oligosacáridos o ácidos nucleicos pueden entrar y salir de las células mediante procesos de endo- y exocitosis, respectivamente, los analitos polares y/o cargados de menor tamaño no son capaces de desencadenar ese mecanismo de internalización.289 Por el contrario, la Naturaleza ha desarrollado un componente adicional de las membranas para que se encargue del tránsito de pequeñas moléculas polares y iones, como son las proteínas transportadoras de membrana. Estas estructuras son fundamentales para controlar el potencial de membrana, que se define como la diferencia de potencial eléctrico (derivado de un gradiente iónico) entre el interior y el exterior de la célula, y que es fundamental en multitud de funciones biológicas vitales. Además, ciertas células, denominadas células excitables (neuronas o células musculares), tienen la función explícita de generar o transmitir señales eléctricas, lo que también se lleva a cabo mediante este tipo de compuestos, generalmente iones. Figura 41. Diferentes tipos de proteínas transportadoras como las acuaporinas290 (izquierda), y los canales de Ca2+ (centro) o K+ (derecha).291,292 A pesar de que existen numerosos tipos de proteínas transportadoras, como veremos a continuación, sus características químicas suelen ser bastante similares independientemente de qué analito transloquen o cómo lleven a cabo el transporte. En esta línea, la mayoría de las proteínas de este tipo cuentan con una superficie externa rica en residuos hidrofóbicos, de tal manera que la inserción en la parte apolar de la membrana esta favorecida por su lipofilia. Por otro lado, el canal interno por el que circulan los analitos polares suele estar dotado con residuos hidrofílicos que actúan, dependiendo del tipo de proteína, favoreciendo la formación de un pequeño canal de agua de un lado a otro de la bicapa o sustituyendo la esfera de hidratación de los iones de interés a lo largo de su camino a través de la bicapa. En ocasiones, ambos comportamientos coexisten en una misma proteína de membrana, en la que se puede llegar a observar una constricción con una zona más estrecha a lo largo del canal, que se conoce como 289 M. Miaczynska, H. J. Stenmark, Cell Biol. 2008, 180, 7-11. 290 B. L. de Groot, H. Grubmüller, Science 2001, 294, 2353-2357. 291 L. Tang, T. M. Gamal El-Din, J. Payandeh, G. Q. Martínez, T. M. Heard, T. Scheuer, N. Zheng, W.A. Catterall, Nature 2014, 505, 56-61. 292 D. Doyle, J. Cabral, R. Pfuetzner, A. Kuo, J. Gulbis, S. Cohen, B. Chait, R. MacKinnon, Science 1998, 280, 69-77. Alberto Fuertes García 82 filtro de selectividad. Es en esta región en la que se selecciona, en base a este tipo de interacciones con aminoácidos cargados, qué ion puede migrar de un lado al otro. Las proteínas transportadoras de membrana se pueden clasificar atendiendo a varios factores, aunque lo más típico es separarlas en aquellas que desempeñan un transporte considerado activo (requieren la hidrólisis de ATP para trabajar) o pasivo (no consumen energía). Estas últimas funcionan a favor del gradiente osmótico, con velocidades de transporte de iones cercanas a la difusión de estos en medio acuoso, y normalmente fluctúan entre un estado cerrado (en el que pasan la mayor parte del tiempo) y un estado abierto, provocado por cambios conformacionales tras una señal específica. Por otro lado, los transportadores de tipo activo, también denominadas bombas, requieren de una fuente de energía externa para superar el coste termodinámico asociado al movimiento de iones en contra del gradiente de concentración o carga. Otra posible clasificación se deriva de la cantidad de analitos que transportan simultáneamente y el modo en que lo hacen (Figura 42). Así, los transportadores que solo mueven un analito en una dirección se denominan uniport, mientras que los que son capaces de movilizar más de una molécula a la vez se conocen como cotransportadores. Estos últimos se dividen en symporters, si el sentido de transporte es el mismo para todos los analitos, o antiporters, si el sentido de migración entre dos analitos es opuesto. Sean del tipo que sean, estas proteínas juegan un papel fundamental a nivel biológico, por lo que su mal funcionamiento o su ausencia por motivos congénitos desemboca en la aparición de dolencias severas que se conocen como canalopatías, de las que quizás el ejemplo más conocido es la fibrosis quística.293 Figura 42. Clasificación de los modelos de transporte atendiendo a la estequiometría y direccionalidad del transporte. De izquierda a derecha: uniport, cotransporte tipo symport y cotransporte tipo antiport.32 Además de los canales y las bombas de membrana, existen otro tipo de proteínas de membrana capaces de formar poros en las bicapas. Dentro de este grupo se encuentran las hemolisinas210 y las gramicidinas,203 las cuales carecen de estados abierto/cerrado y de selectividad. Simplemente actúan favoreciendo la permeabilidad de las membranas y afectando a su homeostasis, por lo que son consideradas como toxinas. Además de estructuras proteicas formadoras de canales, se han descrito moléculas de tamaño más reducido que también tienen capacidad para transportar iones a pesar de no generar un canal continuo de un lado a otro de la bicapa fosfolipídica (Figura 43). Estas moléculas se definen como ionóforos (o en ocasiones carriers) y se componen generalmente de macrociclos (ciclopéptidos, depsipéptidos, macrólidos, etc.) con una cavidad hidrofílica, donde complejan los iones, y un exterior 293 R. Planells-Cases, T. J. Jentsch, Biochim. Biophys. Acta 2009, 1792, 173-189. Introducción 83 hidrofóbico, que permite su migración a través del interior apolar de los lípidos. Estos transportadores se unen a los analitos en la interfase fosfolípido-agua de un lado de la membrana, formando un complejo que es capaz de migrar a través de esta gracias a su lipofilia externa, para finalmente liberar su carga del lado opuesto de la membrana. Muchas de estas sustancias se han descubierto estudiando las secreciones de microorganismos, ya que este tipo de ionóforos se utilizan como medio de defensa natural frente a otros organismos competidores. Es por ello por lo que algunos de estos sistemas se utilizan como antibióticos en la actualidad, puesto que su capacidad para ejercer transporte pasivo es tan efectiva que puede llegar a destruir los potenciales de membrana requeridos para la subsistencia de muchas bacterias u hongos.294 Figura 43. Transporte mediante el modelo de tipo ionóforo basado en la migración del complejo receptor-ligando a través de la bicapa, además de algunos ejemplos de ionóforos naturales que transportan iones.32 Debido a la relevancia biológica de las proteínas e ionóforos naturales, los químicos sintéticos han intentado emular sus propiedades de manera artificial mediante el desarrollo de nuevas moléculas que, mediante diversos mecanismos de acción, sean capaces de inducir un transporte de analitos a través de una membrana lipídica. A continuación, se hará una breve revisión de algunas de estas moléculas, centrándonos únicamente en aquellas capaces de transportar iones de relevancia biológica y en la que no se cubrirán las aproximaciones basadas en la formación de un canal transmembranal definido de elevado tiempo de vida por motivos de concreción (este tema se cubrirá brevemente en la parte inicial del Capítulo II). 2.2. Membrane spanners Además de los mecanismos naturales previamente citados, se ha descubierto que también existen moléculas que combinan partes flexibles y rígidas en su estructura y que no están diseñadas para, en principio, adquirir una determinada estructura secundaria tras su contacto con las membranas. Esta familia se conoce mediante el término inglés de membrane spanners, 32 N. Rodríguez-Vázquez, A. Fuertes, M. Amorín, J. R. Granja, “Bioinspired Artificial Sodium and Potassium Ion Channels” En The Alkali Metals Ions: Their Role for Life, Vol. 16; Springer International, Cham, 2016. 210 L. Song, M. R. Hobaugh, C. Shustak, S. Cheley, H. Bayley, J. E. Gouaux, Science 1996, 274, 1859-1866. 203 D. A. Kelkar, A. Chattopadhyay, Biochim. Biophys. Acta 2007, 1768, 2011-2025. 294 M. Antoszczak, D. Steverding, A. Huczyński, Eur. J. Med. Chem. 2019, 166, 32-47. Alberto Fuertes García 84 que podría traducirse como “moléculas que atraviesan una membrana”.295 Como su propio nombre indica, las cadenas móviles de su estructura generalmente son lo suficientemente largas como para que una misma molécula transportadora se extienda de un lado al otro de una bicapa abarcándola por completo. El mecanismo mediante el cual son capaces de transportar iones, aunque no está completamente claro,296 se basa en inducir una permeabilidad parcial en las membranas, ya sea mediante la formación de pequeños poros de tamaño subnanométrico que alojen moléculas de agua o mediante la inducción de estrés mecánico debido a los contactos entre las dos capas de la membrana y las cadenas del propio transportador, que en parte impide el movimiento independiente de ambas mitades de la bicapa favoreciendo zonas temporalmente permeables en su seno.297 En cualquier caso, parece claro que no forman ningún canal que quede definido de forma permanente en la membrana y que no se unen de manera específica a los iones que transportan. En muchas ocasiones presentan una actividad dependiente del potencial eléctrico entre ambos lados de la membrana y es habitual que la etapa limitante sea su inserción en las bicapas, la cual se asemeja al proceso de flip-flop, tras la que pueden dar lugar a agregados o a formas torsionadas y plegadas (Figura 44).298 Figura 44. Diferentes modelos de compuestos que se sirven del modo de la permeabilización parcial de la membrana para inducir el proceso de transporte. Los transportadores no tienen por qué ser entidades unimoleculares, sino que la especie activa puede formarse a partir de un proceso de agregación entre varios componentes.299 En muchas ocasiones los investigadores han recurrido al uso de unidades con cierta rigidez a las cuales se anclan cadenas relativamente flexibles. Existen ejemplos en los cuales estas partes rígidas se localizan en el medio de la membrana mientras que en otros modelos los autores proponen su localización en la entrada de la bicapa. También se han descrito en bibliografía ejemplos minimalistas en los que se consigue inducir un transporte mediante moléculas lineales tremendamente simples, las cuales pretenden imitar el modelo de acción de la anfotericina B.300 295 T. M. Fyles, Chem. Soc. Rev. 2007, 36, 335-347. 296 J. K. W. Chui, T. M. Fyles, Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 148-175. 297 J. K. W. Chui, T. M. Fyles, Chem. Commun. 2010, 46, 4169-4171. 298 J. T. Davis, O. Okunola, R. Quesada, Chem. Soc. Rev. 2010, 20, 3843-3862. 299 I. Tabushi, Y. Kuroda, K. Yokota, Tetrahedron Lett. 1982, 23 , 4601-4604. 378 L. Li, Z. Zhang, Molecules 2016, 21, 1393-1415. C. S. McKay, M. G. Finn, Chem. Biol. 2014, 21, 1075-1101. 300 C. M. McNamara, S. Box, J. M. Crawforth, B. S. Hickman, T. J. Norwood, B. J. Rawlings, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1998, 83-88. Introducción 85 En las próximas líneas se recogerán algunos de los ejemplos más relevantes basados en este mecanismo que han sido utilizados para inducir el transporte de iones en membranas lipídicas. Figura 45. Ejemplos de transportadores tipo membrane spanner basados en éteres corona y sus derivados nitrogenados.301-303 Los primeros ejemplos en este terreno fueron desarrollados por el grupo de J. M. Lehn en la década de los 80, en los que se servían de su experiencia con éteres corona para desarrollar transportadores que poseían esta unidad en su zona central. El diseño se basaba en la sustitución de dos grupos etilenglicol por unidades de ácido tartárico, las cuales permitían la incorporación de cadenas de PEG (un total de 8, dos por carboxilato) en direcciones opuestas del macrociclo. Estas cadenas de etilenglicol estaban terminadas por grupos cargados para favorecer su posicionamiento en la parte polar de la bicapa (Figura 45, derecha).301 Con posterioridad, el grupo de Fyles llevó este diseño un paso más allá aumentando el número de unidades de ácido tartárico en el macrociclo y sustituyendo las cadenas de PEG lineales por unidades cíclicas altamente oxigenadas, que estaban terminadas con diferentes unidades cargadas o neutras (como azúcares), lo que permitió establecer relaciones estructura-actividad para el transporte de cationes alcalinos.302 El grupo de Gokel diseñó sistemas basados en múltiples unidades de 301 J. P. Behr, J. M. Lehn, A. C. Dock, D. Moras, Nature 1982, 295, 526-627. J. P. Behr, J. M. Lehn, D. Moras, J. C. Thierry, J. Am. Chem. Soc. 1981, 103, 701-703. L. Jullien, J.-M. Lehn, Tetrahedron Lett. 1988, 29, 3803-3806. 302 T. M. Fyles, T. D. James, K. C. Kaye, J. Am. Chem. Soc. 1993, 115 , 12315-12321. T. M. Fyles, T. D. James, A. Pryhitka, M. Zojaji, J. Org. Chem. 1993, 58, 7456-7468. F. R. Fronczek, R. D. Gandour, T. M. Fyles, P. J. Hocking, S. J. McDermid, P. D. Wotton, Can. J. Chem. 1991, 69, 12-19. Alberto Fuertes García 86 éter corona en los que sustituían dos átomos de oxígeno por átomos de nitrógeno en uno de los macrociclos, de tal manera que se comportasen de manera mixta, con macrociclos tanto a la entrada como en el seno de la bicapa (Figura 45, izquierda).303 En este caso, la inserción en la bicapa demostró ser un proceso cinéticamente lento, pero una vez incorporado, este transportador presentaba una cierta selectividad en la permeabilización de Na+ frente a K+.304 De manera análoga a los derivados de éteres corona, las ciclodextrinas (CDs) también han servido como plataforma para la incorporación de cadenas flexibles en sentidos opuestos del anillo, de tal manera que estas pudieran abarcar toda la membrana.305 Ha sido posible incluso funcionalizar únicamente una de las caras, en cuyo caso se propone un modelo dimérico en el que las CDs ocupan la parte externa de la membrana.306 Dadas las propiedades únicas de las CDs se ha logrado demostrar el impacto que tiene la presencia de guests hidrofóbicos en el transporte, ya que estos se complejan con el interior hidrofóbico y bloquean parcialmente la cavidad de las CDs.307 Estudios similares con resorcin[4]arenos que poseen una cara fuertemente hidrofílica y otra rica en cadenas alquílicas largas también ha invocado la naturaleza dimérica de la especie transportadora.308 Curiosamente, experimentos de electrofisiología evidenciaron una cierta selectividad en el transporte de K+ frente al de Na+ o Cl-, similar al de algunos sistemas naturales como la gramicidina A. Otros macrociclos como los calix[4]arenos han servido como plataforma funcionalizables, en este caso con unidades de ácido cólico. Sorprendentemente, al contrario que pasaba en los modelos de las cápsulas supramoleculares descritas en la Sección 1.2.2, cuando estas moléculas actúan como transportadores la conformación 1,3-alternada es más activa que la forma cónica, lo que refleja una correlación directa entre la longitud del transportador (que debe ser similar a la de la membrana) y su capacidad de movilización de iones (Figura 46).309 Como comentábamos con anterioridad, las especies transportadoras no se limitan a modelos monoméricos o diméricos, sino que, en ocasiones, agregados de mayor orden han sido propuestos como especies activas. Este es el caso de los pirogalol[4]arenos descritos nuevamente por el grupo de Gokel, que mostraron un funcionamiento diferente en función de la longitud del aldehído utilizado en el proceso de macrociclación del cavitando. La especie más activa, derivada del dodecanal, se estudió en profundidad y su diámetro se pudo estimar en 11 Å mediante la ecuación de Hille,310 lo que implica una asociación de, al menos, 6 unidades en la forma activa,311 que también fueron observadas al utilizar aldehídos ramificados.312 303 A. Nakano, Q. Xie, J. V. Mallen, L. Echegoyen, G. W. Gokel, J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 1287-1289. 304 G. W. Gokel, Acc. Chem. Res. 2013, 46, 2824-2833. 305 M. J. Pregel, L. Jullien, J. Canceil, L. Lacombe, J.-M. Lehn, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 1995, 417-426. 306 I. Tabushi, Y. Kuroda, K. Yokota, Tetrahedron Lett. 1982, 23, 4601-4604. J. K. W. Chui, T. M. Fyles, Chem. Soc. Rev. 2011, 41, 148-175. 307 J. K. W. Chui, T. M. Fyles, Org. Biomol. Chem. 2014, 12, 3622-3634. 308 Y. Tanaka, Y. Kobuke, M. Sokabe, Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 693-694. W.-H. Chen, M. Nishikawa, S.- D. Tan, M. Yamamura, A. Satake, Y. Kobuke, Chem. Commun.2004, 872-873. 309 N. Maulucci, F. De Riccardis, C. B. Botta, A. Casapullo, E. Cressina, M. Fregonese, P. Tecilla, I. Izzo, Chem. Commun. 2005, 1354-1356. 310 B. Hille, Ion Channels of Excitable Membranes , 3rd edition., Sinauer Associates Inc., Sunderland, 2001. 311 R. Li, O. V. Kulikov, G. W. Gokel, Chem. Commun. 2009, 6092-6094. 312 O. V. Kulikov, M. M. Daschbach, C. R. Yamnitz, N. Rath, G. W. Gokel, Chem. Commun. 2009, 7497-7499. Introducción 87 Figura 46. Izquierda: derivados de calixarenos funcionalizados con unidades de ácido cólico en la que la especie alternada (de mayor longitud) presenta mejores propiedades de transporte que el correspondiente isómero cónico.309 Derecha: diferentes aproximaciones basadas en el uso de un cavitando (resorcinarenos, calixarenos, ciclodextrinas, etc.) en combinación con cadenas hidrofóbicas para la preparación de moléculas que abarquen toda la bicapa. Se han descrito otras estructuras cíclicas basadas en unidades de β-fenil-D-glucopiranosa unidas mediante enlaces de tipo diéster, que generalmente se conocen como CyPLOS, en los que la sustitución de los hidroxilos de las posiciones C2 y C3 con cadenas hidrofóbicas o de oligoetilenglicol permite la formación de spanners. En este caso, el macrociclo aniónico se localiza en la interfase lípido-agua y proyecta los “tentáculos” hacia el interior de la membrana.313 La evolución de estos sistemas ha llevado a intentar reducir la complejidad supramolecular de los mismos, así como su obtención sintética. Es por ello por lo que se han desarrollado moléculas puramente lineales diseñadas para funcionar con un mecanismo similar a los anteriores ejemplos. En esta línea, abundan los sistemas que incorporan una parte central hidrofílica flanqueada por largas cadenas hidrofóbicas, en ocasiones terminadas nuevamente por grupos cargados, los cuales generalmente se conocen como bolanfifilos.314 En esta línea, se diseñaron sistemas en los que la zona polar estaba compuesta por heptapéptidos ricos en glicina, los cuales están a menudo presentes en dominios transmembranales de proteínas transportadoras de cloruro. Al equipar estos sistemas con diferentes cadenas alquílicas de gran longitud y diferentes características, se pudo llevar a cabo un interesante estudio de estructuraactividad con estos sistemas anfifílicos transportadores de Cl-.315 Aparte de péptidos 313 D. Montesarchio, C. Coppola, M. Boccalon, P. Tecilla, Carbohy. Res. 2012, 356, 62-74. C. Coppola, A. Paciello, G. Mangiapia, S. Licen, M. Boccalon, L. De Napoli, L. Paduano, P. Tecilla, D. Montesarchio, Chem. Eur. J. 2010, 16, 13757-13772. G. Di Fabio, A. Randazzo, J. D’Onofrio, C. Ausìn, A. Grandas, E. Pedroso, L. De Napoli, D. Montesarchio, J. Org. Chem. 2006, 71, 3395-3408. 314 N. Nuraje, H. Bai, K. Su, Prog. Polym. Sci. 2013, 38, 302-343. 315 P. H. Schlesinger, R. Ferdani, J. Liu, J. Pajewska, R. Pajewski, M. Saito, H. Shabany, G. W. Gokel, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1848-1849. N. Djedovic, R. Ferdani, E. Harder, J. Pajewska, R. Pajewski, M. E. Weber, P. H. Schlesinger, G. W. Gokel, New J. Chem. 2005, 29, 291-305. P. H. Schlesinger, N. K. Djedovic, R. Ferdani, J. Pajewska, R. Pajewski, G. W. Gokel, Chem. Commun. 2003, 308-309. Alberto Fuertes García 88 bioinspirados como base del diseño, se ha recurrido a la utilización del ácido cólico, un esteroide natural que presenta dos caras con diferencias notables de polaridad. En esta dirección, se han preparado dímeros de ácido cólico separados por diversos espaciadores, en los que la cara rica en hidroxilos lo convierte en un buen candidato para el transporte de cationes.316 Utilizando esta estrategia, Kobuke y colaboradores demostraron la importancia que juega el grupo polar terminal en los bolanfifilos basados en dímeros de ácido cólico (R en la Figura 47), ya que en ausencia de grupos cargados se perdía la selectividad catión/anión y K+/Na+.317 Finalmente se demostró, mediante un concepto bastante revolucionario, que la unión entre ambas unidades de ácido cólico no tenía por qué ser de naturaleza covalente, sino que se podía recurrir a la formación de enlaces de coordinación basados en complejos de Pd y piridina, los cuales demostraron tener una mejor eficiencia de transporte de K+ y Na+ que algunos ejemplos descritos previamente por Kobuke.318 Figura 47. Dímeros de ácido cólico con diferentes espaciadores317 y sistemas basados en heptapéptidos de poliglicina desarrollados por Gokel para el transporte de cloruro.315 Modelos anfipáticos todavía más sencillos han sido explotados como membrane spanners por varios de los grupos de investigación que se han nombrado hasta ahora. De esta forma, Kobuke demostró la posibilidad de utilizar parejas de anfifilos con carga opuesta (amonios cuaternarios con dos colas y carboxilatos con una cola), de tal manera que su dimerización, favorecida por la formación de puentes salinos, generaba la especie transportadora capaz de migrar iones potasio de manera preferente sobre los cloruros.319 Este diseño permitió ir un paso más allá en la funcionalidad de estos transportadores y se demostró que si se incorporaba una unidad azobencénica en una de las colas de la mitad amónica se podría modular la capacidad transportadora con la luz. 316 F. De Riccardis, I. Izzo, D. Montesarchio, P. Tecilla, Acc. Chem. Res. 2013, 46, 2781-2790. 317 Y. Kobuke, T. Nagatani, J. Org. Chem. 2001, 66, 5094-5101. M. Yoshii, M. Yamamura, A. Satake, Y. Kobuke, Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 2619-2623. 318 C. P. Wilson, S. J. Webb, Chem. Commun. 2008, 4007-4009. 319 Y. Kobuke, A. Ohgoshi, Colloids Surf. A 2000, 169, 187-197. Introducción 89 El grupo de Fyles desarrolló sistemas macrocíclicos derivados de ésteres del ácido málico, los cuales se unen entre sí a través de puentes disulfuro con una unidad central aromática.320 Este ejemplo demostró presentar características similares a los transportadores basados en varias unidades de éteres corona descritos previamente. El proceso de simplificación continuó tras este trabajo, y se pudo demostrar que compuestos lineales tan sencillos como oligoésteres que alternan secciones hidrofóbicas e hidrofílicas a lo largo de su extensa estructura también pueden ser utilizados para inducir permeabilidad membranal.321 La aparición de múltiples estados conductores en su caracterización electrofisiológica sugiere nuevamente que estos oligoésteres se asocian para generar diversos tipos de agregados supramoleculares, los cuales son, en realidad, las especies que presentan capacidad transportadora propiamente dicha.322 Más recientemente se han utilizado grandes macrociclos (hasta 72 átomos) basados en la química click, que cuentan con un modelo de bolanfifilo inverso en los cuales la parte interna es hidrofóbica y contiene dos fosfatos en extremos opuestos.323 Por último, destacar que ciertos fosfolípidos también pueden inducir permeabilidad en las membranas sin destruirlas completamente. Este proceso se basa en el uso de fosfolípidos compuestos por ácidos grasos de cadena más corta que los que contienen mayoritariamente las membranas a través de la cual se quieren transportar iones. El proceso que se induce en este caso es la formación de pequeños poros de tiempos de vida cortos (Figura 44, derecha) que derivan de las fluctuaciones en la fluidez de la membrana, ya que la temperatura de transición de fase de las membranas es dependiente de su composición lipídica.324 2.3. Ionóforos/carriers A la hora de diseñar transportadores sintéticos que actuasen con un modo de acción tipo ionóforo, los químicos se han podido inspirar en las muchas moléculas aisladas de organismos vivos que presentaban actividad antimicrobiana. Estos antibióticos, cuya actividad deriva de su capacidad para desequilibrar el balance iónico de ciertos microorganismos, poseen notables selectividades a la hora de discernir entre un analito u otro.325 Repasando las estructuras de los ionóforos naturales, estos presentan a menudo un macrociclo rico en motivos hidrofóbicos en su periferia y dotado con grupos directores polares orientados hacia su cavidad.326 Existen muchos ejemplos de ionóforos no macrocíclicos, no obstante, estos pueden adquirir conformaciones que, en mayor o menor medida, secuestran a su ion correspondiente en una especie de bolsillo polar que esté protegido tridimensionalmente del interior hidrofóbico de la 320 T. M. Fyles, D. Loock, W. F. Van Straaten-Nijenhuis, X. Zhou, J. Org. Chem. 1996, 61,8866-8874. 321 T. M. Fyles, K. C. Kaye, T. D., James, D. W. M. Smiley, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 1233-1236. T. M. Fyles, D. Loock, W. F. Van Straaten-Nijenhuis, X. Zhou, J. Org. Chem. 1996, 61, 8866-8874. T, Fyles, Acc. Chem. Res. 2013, 46, 2847-2855. 322 T. M. Fyles, C. Hu, R. Knoy, Org. Lett. 2001, 3, 1335-1337. H. Luong, T. M. Fyles, Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 725-732. 323 G. M. Mitchell, A. Hesketh, C. Lombardi, C. Ho, T. M. Fyles, Can. J. Chem. 2017, 95, 253 -262. 324 T. Heimberg, Biophys. Chem. 2010, 150, 2-22. 325 K. Neupertlaves, M. Dobler, Helv. Chim. Acta 1975, 58, 432-442. 326 J. Rotkowski, B. Brzezinski, J. Biomed Res Int. 2013, 162513. Alberto Fuertes García 96 dos caras con propiedades muy diferentes y que han demostrado actividad en el transporte de aniones no muy habituales, como el ion perclorato.359 El policiclo derivado de la benzoxacina también ha sido estudiado para la preparación de un ionóforo con paredes aromáticas extendidas, en donde se demostró que la incorporación de ureas es más efectiva para transportar cloruros que la presencia de amidas (Figura 52, derecha).360 Figura 52. Aproximaciones tripodales para la síntesis de transportadores de Cl-, en los que se explota la preorganización topológica de un esqueleto central tri-sustituido.357-360 Volviendo al uso de los cavitandos para diseñar ionóforos selectivos, los calixpirroles han sido ampliamente explotados en el campo del transporte de aniones. Su atractivo se basa en la presencia de varios grupos NH de pirrol dirigidos hacia la misma región espacial de la cavidad, lo que sumado a la posibilidad de modificar fácilmente su esqueleto los convierte en candidatos versátiles para el diseño de transportadores a la carta.361 Los primeros estudios en este campo descubrieron que el meso-octametilcalix[4]pirrol funciona como un symporter de CsCl excelente,362 donde la complejación se basa en la interacción del anión con los grupos NH mientras que el catión cesio se localiza en el cono aromático formando un par iónico similar a otras especies que habían sido descritas previamente con cationes grandes y con cargas deslocalizadas.363 Sin embargo, se demostró que la sustitución de los protones β de las unidades pirrólicas por átomos de flúor modificaban este comportamiento, de tal manera que este cavitando se pasaba a comportar como un antiport Cl-/NO3- o Cl-/HCO3-, evidenciando la versatilidad de estas plataformas. Además, ha sido posible modificar las propiedades transportadoras mediante la incorporación de varios tipos de cadenas que actúen como “tapas” 359 Z. Li, X.-H. Yu, D.-Q. Yuan, W.-H. Chen, J. Org. Chem. 2017, 82, 13368-13375. 360 A. Roy, D. Saha, A. Mukherjee, P. Talukdar, Org. Lett. 2016, 18, 5864-5867. 361 D. S. Kim, J. L. Sessler, Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 532-546. 362 C. C. Tong, R. Quesada, J. L. Sessler, P. A. Gale, Chem. Commun. 2008, 6321-6323. 363 R. Custelcean, L. H. Delmau, B. A. Moyer, J. L. Sessler, W.-S. Cho, D. E. Gross, G. W. Bates, S. J. Brooks, M. E. Light, P. A. Gale, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 2537-2542. Introducción 97 del cavitando, al igual que vimos con los calixarenos transportadores de cationes. De este modo, la incorporación de una o dos unidades de triazol en esta tapa supuso una mejora notable en la capacidad de transporte del Cl-,364 mientras que la incorporación de cadenas de oligoetilenglicol se ha utilizado para demostrar que, en función del catión metálico presente, se pueden formar complejos estables con el cono aromático de los pirroles (por ejemplo, con Cs+) o pares iónicos estables en los que cationes más pequeños ocupan las cadenas polioxigenadas (en el caso de Na+ o Li+). Finalmente, el grupo de Ballester ha llevado a cabo un detallado estudio con calixpirroles que presentan paredes aromáticas pobres en electrones en posiciones meso alternadas, en los que se demuestra la complejación y el transporte selectivo de iones nitrato frente a otros aniones relevantes.365 Figura 53. Utilización de cavitandos calixpirrólicos como anionóforos versátiles, donde permiten la modificación de sus posiciones tanto meso como β.361-365 Tras este breve repaso bibliográfico, podemos concluir que el diseño de nuevos transportadores transmembranales es un campo relativamente joven, en el cual todavía se está llevando a cabo una importante labor de refinamiento de las estructuras. Además, a pesar de que el salto al campo biológico para intentar paliar los problemas derivados de las anteriormente citadas canalopatías está dando sus primeros frutos,366 todavía se encuentra en una fase de 364 C.-H. Lee, H.-K. Na, D.-W. Yoon, D.-H. Won, W.-S. Cho, V. M. Lynch, S. V. Shevchuk, J. L. Sessler, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 7301-7306. 365 L. Adriaenssens, C. Estarellas, A. V. Jentzsch, M. M. Belmonte, S. Matile, P. Ballester, J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 8324-8330. 366 K. A. Muraglia, R. S. Chorghade, B. R. Kim, X. X. Tang, V. S. Shah, A. S. Grillo, P. N. Daniels, A. G. Cioffi, P. H. Karp, L. Zhu, M. J. Welsh, M. D. Burke, Nature 2019, 567, 405-408. Alberto Fuertes García 98 desarrollo muy temprana.349 Es por ello que existe un gran interés en el desarrollo de nuevas moléculas transportadoras que desempeñen su función de manera eficiente. 349 P. A. Gale, J. T. Davis, R. Quesada, Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 2497-2519. Objetivos Objetivos 101 Objetivos El objetivo general de esta tesis doctoral consiste en el diseño, síntesis y estudio de nuevos sistemas supramoleculares funcionales basados en dímeros de α,γ-ciclopéptidos. En vista de todos los antecedentes descritos previamente en la introducción de esta memoria, pensamos que estos macrociclos poseen una serie de características estructurales que los convierte en plataformas muy versátiles para la preparación de supramoléculas con aplicaciones en diversas áreas de relevancia, gracias a que se apilan mediante la formación de múltiples enlaces de hidrógeno formando sistemas diméricos estables. Concretamente, nos proponemos explorar la estrategia desarrollada recientemente en el grupo de investigación que consiste en el bloqueo de una de las caras del dímero mediante la incorporación de cadenas alquílicas funcionales en lugar de los tradicionales grupos metílicos. Para ello, durante la síntesis peptídica se llevará a cabo la incorporación de diferentes cadenas sobre el átomo de nitrógeno del ácido 3-aminociclopentanocarboxílico (γ-Acp). Esta alquilación se puede realizar en condiciones suaves si se emplea un grupo protector temporal fuertemente atractor de electrones sobre el grupo amina, tal como el 2-nitrobencenosulfonilo (Figura 54). Este grupo disminuye el pKa del protón amínico y facilita que se pueda llevar a cabo la incorporación de virtualmente cualquier cadena alquílica en condiciones básicas suaves. Esta estrategia resuelve una de las grandes limitaciones en las alquilaciones realizadas con grupos menos electroatractores; la epimerización observada en el Cα del Acp. Figura 54. Estrategia de Fukuyama para la mono-alquilación de aminas, que en nuestro caso se aprovechará para dotar a los γ-Aa de grupos funcionales (esfera roja). Con estas premisas, el primer objetivo concreto consistirá en la preparación de una nueva clase de nanotubos que permitan ejercer un control sobre los parámetros que guían su ensamblaje, pudiéndose modificar propiedades del agregado final como la longitud. Para llevar a cabo este proceso, recurriremos a las diferencias existentes entre las constantes de dimerización (Ka) de péptidos cíclicos de diferentes tamaños. Como se ha visto en la Introducción, este parámetro depende del tipo de Aas que interaccionan y, sobre todo, del número de enlaces de hidrógeno que se forman, lo cual viene determinado por el número de Aas que conforman el péptido. Para alcanzar este objetivo, nos proponemos unir covalentemente un octapéptido y un tetrapéptido a través de las cadenas incorporadas en los grupos amino de dos Acps de ambos ciclos, de tal forma que estos grupos queden orientados paralelamente (verticalmente) al eje de simetría de los péptidos. Para dicha unión optamos por la química click, basada en la cicloadición 2+3 catalizada por cobre entre una azida y un alquino. De esta forma, se obtendría un sistema bis-ciclopeptídico con forma cónico-truncada en el que las propiedades de autoensamblaje (Ka de dimerización) de cada cara fuesen diferentes. Los modelos diméricos estudiados con anterioridad varían entre los 10² M-1 para los tetrapéptidos Alberto Fuertes García 102 cíclicos y mayores de 105 M-1 para los octámeros. En base a estas diferencias de asociación, esperábamos que el empleo de diferentes disolventes se pudiese emplear para modular el proceso de autoensamblaje y, por ende, la longitud de los nanotubos. Por ejemplo, el empleo de disolventes orgánicos poco polares como el CH2Cl2 o el CHCl3, daría lugar a un crecimiento poco controlado del nanotubo y por tanto a la formación de agregados supramoleculares de gran longitud, puesto que en estas condiciones la dimerización tendría lugar por ambos extremos del sistema bis-ciclopéptido. No obstante, es de esperar que, dada la baja Ka del tetrapéptido cíclico, el equilibrio podría restringirse a la formación de agregados de menor tamaño al aumentar la temperatura o disminuir la concentración de la muestra. Adicionalmente, se podría bloquear el crecimiento de este nanotubo con diámetro alternante mediante la adición de un disolvente que compita por los enlaces de hidrógeno, lo que ocurrirá preferentemente por el extremo estrecho dada su menor constante de asociación. De esta forma se podría restringir el proceso a la formación de nanotubos formados únicamente por cuatro discos peptídicos apilados. Adicionalmente, se podría introducir en el sistema un segundo péptido basado en el γ-Aa Ach, capaz de formar heterodímeros más estables que los correspondientes homodímeros, para que impida el crecimiento del nanotubo. Gracias a la formación de estos heterodímeros, se podría formar nanotubos constituidos por seis unidades peptídicas apiladas. Figura 55. Diferentes especies nanotubulares (derecha) que se pretenden obtener mediante el uso del sistema bis-ciclopeptídico (izquierda). En el siguiente objetivo de ese trabajo de tesis pretendíamos extender la aplicación del sistema de funcionalización de la boca de entrada en los dímeros de α,γ-CPs hacia la preparación de transportadores transmembranales. Puesto que existen diversos factores que se Objetivos 103 pueden adaptar en las estructuras de estos anillos, planteamos la síntesis de diferentes CPs con sus esqueletos peptídicos N-funcionalizados que presenten propiedades externas hidrofóbicas para favorecer su incorporación en el entorno apolar de las membranas. Estos sustituyentes del esqueleto se seleccionarían con la idea de que permitan realizar modificaciones post-sintéticas para incorporar otros grupos funcionales en las entradas a la cavidad interior del dímero, de tal forma que puedan complejar analitos de relevancia. En este aspecto nuestro objetivo residirá en la evaluación de la capacidad de estas moléculas artificiales para favorecer la migración a través de las bicapas lipídicas de iones de relevancia biológica. Concretamente, se pretende construir péptidos cíclicos transportadores basados en el modelo de membrane spanner (ver Sección 2.2 de la Introducción). Para ello se propone la incorporación de cadenas ricas en grupos etilenglicol que presenten grupos catiónicos en su extremo utilizando la estrategia tipo click descrita previamente (Figura 56, derecha). Este modelo permite evaluar el efecto que la longitud y la polaridad de las cadenas incorporadas tiene sobre el transporte (eficiencia, selectividad, etc.), lo que proporcionará una mejor comprensión sobre los factores que influyen en el proceso. Además de hacer reaccionar los grupos reactivos colocados en la boca del dímero con cadenas lineales de diferentes longitudes, también pretendemos estudiar otros grupos directores con mejores propiedades para coordinarse con iones metálicos, como los anillos de piridina. Con esta modificación, la incorporación de grupos coordinantes en el transportador presentaría una morfología más parecida a una cápsula si dichos grupos se cerrasen con la incorporación de un metal, que se podría comportar como un ionóforo en el que las tapas de piridina actuasen como grupos directores de la interacción con los iones (Figura 56, izquierda). Figura 56. Síntesis de diferentes tipos de transportadores de membrana basados en dímeros ciclopeptídicos de propiedades modulables. Como continuación a la segunda aproximación del proyecto de transporte, consideramos que el siguiente objetivo natural es la evaluación de estas cápsulas dotadas con piridinas para funcionar como contenedores moleculares de moléculas bifuncionales. Tal como se comentó anteriormente, la presencia de tres grupos piridina estratégicamente colocadas en cada una de las bocas de la cavidad del dímero y a una distancia adecuada para interaccionar mediante enlaces de coordinación con un metal o mediante interacciones débiles con otro tipo de sustratos podrían cerrar la cavidad atrapando en su interior moléculas con forma y grupos funcionales complementarios a los de la capsula. En primer lugar, se propone la utilización de las piridinas para intentar la coordinación con metales de transición sobre la cavidad ciclopeptídica. De esta Alberto Fuertes García 104 manera, si se escogen metales de geometría apropiada (tetraédrica en este caso), se podría dirigir la encapsulación de moléculas que actúen como ligandos bidentados, conectando ambos metales a través de las posiciones de coordinación vacantes situados en las bocas de entradas del dímero. El objetivo en este aspecto sería demostrar la capacidad de este sistema para coordinar iones de cobre tetraédricos y explotar la cuarta posición de coordinación para alojar ligandos tipo bisnitrilo en la cavidad del dímero ciclopeptídico (Figura 57, derecha). Adicionalmente, este híbrido de péptido y piridinas podría actuar por sí mismo (sin necesidad de añadir un centro metálico) como contenedor de ligandos que poseyesen en sus extremos grupos ricos en dadores de enlace de hidrógeno como los grupos amonio, que son conocidos por formar pares iónicos con las piridinas mediante interacciones ácido-base (Figura 57, izquierda). Concretamente, llevaremos a cabo un estudio con varios ligandos diamónicos lineales de diferentes longitudes para estudiar el efecto que tiene este parámetro en la eficiencia de encapsulación. Esperamos que, si la longitud del guest es coincidente con la distancia entre las tapas piridínicas del dímero, el efecto quelato favorezca la interacción. Sin embargo, si las longitudes que separan a los dos grupos amonio difieren de la distancia adecuada para que se establezcan las interacciones con los dos grupos tripiridínicos simultáneamente, se formarían complejos con una menor estabilidad. Esta falta de complementariedad entre grupos de reconocimiento y longitudes podría dar lugar a la formación de entramados supramoleculares más complejos derivados de interacciones fuera de la cavidad. Figura 57. Estrategia versátil para la preparación de cápsulas para moléculas bifuncionales basadas en dímeros ciclopeptídicos funcionalizados con piridinas en sus extremos. Por último, también nos propusimos extender esta metodología de preparación de cápsulas a sistemas con una mayor cavidad interna tal como los derivados de octapéptidos N- funcionalizados. Además, para restringir la movilidad de los grupos que actúan como tapa del dímero, se planteó la utilización de un sistema más rígido y cerrado, que propicie un menor número de grados de libertad en la formación de las especies encapsuladas. Para ello se emplearán macrociclos como las metaloporfirinas, con las que, además, se podría explotar la presencia de un metal en la parte central de la tapa para dirigir la encapsulación de aquellos ligandos que tengan afinidad por el centro metálico. Estas propiedades de encapsulación ya se habían demostrado anteriormente en el grupo de investigación. Para este proyecto nos planteamos que las propiedades modulares empleadas en la construcción de las cápsulas podrían ser empleadas para el reconocimiento de ligandos con dos grupos funcionales diferentes. Para ello, a partir de un único esqueleto peptídico se pueden preparar diferentes Objetivos 105 hemicápsulas que contengan centros metálicos diferentes. Así, al combinar estas hemicápsulas se producirían mezclas complejas derivadas de la dimerización aleatoria de todas ellas. Sin embargo, nuestro objetivo es demostrar que, si se sintetizan ligandos que presenten dos grupos funcionales diferentes en sus extremos, puede ser posible desplazar el equilibrio hacia la formación de los complejos de inclusión formados por dos hemicápsulas diferentes en las que cada tapa interaccione con el grupo funcional con el que tiene afinidad su metal, exclusivamente. De esta forma se produciría una auto-selección o self-sorting inducida por la encapsulación del ligando. En esta línea, se amplificaría la presencia de los heterodímeros frente a los homodímeros con el empleo ligandos heterodifuncionales (Figura 58), mientras que empleando ligandos homobifuncionales se favorecería la formación de los homodímeros. Para llevar a cabo esta evaluación sintetizaremos una biblioteca de ligandos con diferentes grupos funcionales y longitudes para, posteriormente, evaluar su inclusión en los sistemas diméricos mediante diferentes técnicas espectroscópicas. Figura 58. Propuesta de encapsulación dinámica de ligandos heterodifuncionales mediante cápsulas construidas a partir de diferentes dímeros ciclopeptídicos equipados con tapas metaloporfirínicas. Alberto Fuertes García 112 molécula precursora de nanotubos modulables que consistiese en dos α,γ-CPs de diferente tamaño, unidos covalentemente por su cara γ, y que presentasen intacta su capacidad para dimerizar por sus respectivas caras α, sobre las que se ejercería el control en el proceso de crecimiento del nanotubo. Concretamente, proponemos la síntesis de dos péptidos: un ciclooctapéptido y un ciclotetrapéptido con sus caras γ bloqueadas mediante la N-alquilación de los residuos de Acp. Los grupos alquílicos dispondrían de grupos funcionales complementarios que permitan establecer la unión entre ellos, formando un dímero covalente con capacidad para autoensamblarse por ambas caras, en las que existen diferencias notables de dimerización (Figura 61). La elección de CPs de 4 y 8 Aa, independientemente de los motivos ya esgrimidos referentes a los valores de sus respectivas Ka, también se basó en términos de su simetría, ya que a la hora de realizar la unión covalente entre ambos es deseable que exista una cierta predisposición entre ambas unidades para reaccionar de manera precisa. De esta manera, se puede realizar un diseño en el que ambos ciclos presenten una simetría C2 apropiada para que los grupos reactivos de ambos CPs se ubiquen uno sobre el otro en el aducto covalente final. Como se ha comentado previamente, tras la planarización del anillo de los CPs, estos exponen los protones amídicos y los grupos carbonilos en una disposición perpendicular al plano del anillo lo que, precisamente, facilita su apilado supramolecular.235 Por ello, nos planteamos llevar el proceso de N-alquilación de los γ-Aas a un nuevo nivel, en el que, además de bloquear el crecimiento de los nanotubos por la cara γ, se pudiese dotar a esa cara con una reactividad adicional más allá del propio bloqueo. De esta manera, si se incluye en cada uno de los ciclopéptidos un número apropiado de cadenas alquílicas con grupos funcionales susceptibles de reaccionar con otros complementarios, sería posible la formación del aducto covalente en una última etapa, posterior a toda la síntesis peptídica. No obstante, la elección de estos grupos funcionales no es trivial, ya que la reacción que los una debe presentar una serie de características que permita la realización de este proceso de polimacrociclación de manera robusta. La reacción entre ambos grupos debe ser eficiente y transcurrir gran quimio- y regioselectividad, siendo compatible con otros posibles grupos funcionales. En base a esta condición, y teniendo en cuenta las consideraciones de simetría descritas previamente, planteamos la incorporación de dos cadenas que presenten un grupo azida en uno de los ciclopéptidos, mientras que el otro CP estaría funcionalizado con dos grupos alquino terminales (Figura 61). De esta forma, se puede llevar a cabo una reacción de cicloadición 1-3 dipolar catalizada por Cu(I) entre ambos grupos, normalmente conocida como reacción de click, cicloadición de Huisgen o CuAAC (de sus siglas en inglés Copper-catalized Azide-Alkyne Cycloaddition).373 Esta reacción ha cobrado mucha importancia en los últimos años por su eficiencia y versatilidad, lo que la convierte en un candidato aventajado a la hora de llevar a cabo transformaciones complejas sobre intermedios de alto valor sintético y/o en pasos finales de procesos multietapa, como en nuestro caso. Además, la incorporación sobre el átomo de nitrógeno de ambos grupos funcionales en etapas tempranas de la síntesis (ver a continuación) no supone ningún impedimento en el proceso de la síntesis peptídica, ya que ambos grupos son robustos frente a condiciones ácidas o básicas fuertes y además son inertes frente a electrófilos o nucleófilos. Uno de los desafíos que presenta este diseño es la diferencia de tamaño de los dos macrociclos, por lo que la longitud de las cadenas alquílicas que conectan el esqueleto 235 M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 2844-2845. 373 L. Liang, D. Astruc, Coord. Chem. Rev. 2011, 255, 2933-2945. J. E. Hein, V. Fokin, Chem. Soc. Rev. 2010, 39, 1302-1315. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 113 peptídico y los grupos reactivos deben ser adecuadas para que se pueda producir la doble reacción. Figura 61. Estrategia propuesta para preparar los sistemas covalentes bis-ciclopeptídicos con propiedades de apilamiento diferente en cada uno de sus extremos. Al inicio de esta tesis doctoral, en nuestro grupo de investigación se estaba desarrollando una metodología que permitiese llevar a cabo la incorporación de cadenas alquílicas a la carta sobre el átomo de nitrógeno del γ-Acp, ya que las metodologías de alquilación directas que se empleaban para la N-metilación fracasaban al emplear electrófilos de mayor tamaño. Esta estrategia se basaba en el procedimiento descrito por Fukuyama para la monoalquilación de aminas primarias, que pasaba por la utilización de un grupo protector temporal que aumentase la acidez del protón sobre la amina.374 Este grupo temporal consiste en una sulfonamida aromática pobre en electrones, que incorpora un grupo nitro en su posición orto o para el cual aumenta notablemente la acidez del protón del grupo sulfonamida por efecto inductivo. Este grupo es conocido como nosilo, por acotación de su nombre completo, 2- o 4- nitrobencenosulfonilo. Con la incorporación del nosilo se consigue que el valor de pKa de dicho protón se sitúe por debajo de 15 unidades, notablemente menor que para las aminas, amidas o carbamatos. Esto facilita su sustracción mediante condiciones básicas suaves, respetuosas con otros grupos funcionales sensibles a condiciones fuertemente básicas. En nuestro caso, este punto es de vital importancia, ya que el carbono α presenta un protón relativamente ácido (pKa~25) por estar cerca de un grupo éster, lo que imposibilita el uso de condiciones básicas más agresivas. Tras llevar a cabo la desprotonación en medio básico suave de la sulfonamida, se puede capturar el anión generado con cualquier electrófilo poco impedido estéricamente, lo que genera la especie N-funcionalizada. Otra ventaja del grupo nosilo son las condiciones que habitualmente se utilizan para su eliminación, un proceso que se lleva a cabo normalmente mediante el tratamiento con tioles en medio básico, los cuales son capaces de realizar una sustitución aromática nucleófila sobre el anillo pobre en electrones la cual, a través de un intermedio de Meisenheimer, acaba generando un tioéter, liberando SO2 y la amina libre en el 374 T. Kan, T. Fukuyama, Chem. Commun. 2004, 353-359. Alberto Fuertes García 114 proceso (Figura 62).374 Estas condiciones parecen compatibles y ortogonales con otros grupos protectores empleados en la síntesis peptídica. Figura 62. Estrategia de monoalquilación del γ-Aa Acp mediante el método de Fukuyama. 2. Metodología sintética Tras sentar las bases del diseño requeridas para el funcionamiento apropiado de nuestra estrategia de apilamiento supramolecular, procedimos con la síntesis del sistema covalente compuesto por dos ciclopéptidos de tamaño diferente. Este proceso empezó por la obtención de la forma enantiopura del γ-Aa en el que se basarán todos los diseños presentados en esta memoria, el Acp (concretamente su enantiómero L). Esta sustancia de partida se prepara a partir de un precursor comercial, la lactama de Vince, en tres etapas (Figura 63).241bLa primera de ellas consiste en la hidrólisis ácida de la lactama mediante el tratamiento con HCl acuoso, seguida de la introducción del grupo carbamato de tert-butilo (Boc) sobre la amina mediante el tratamiento con el anhídrido de Boc en medio básico. De esta manera se obtiene la mezcla racémica del aminoácido Ace protegido en su extremo amino-terminal. Figura 63. Primeras etapas en la síntesis del γ-Aa empleado a lo largo de esta memoria a partir de la lactama de Vince (izquierda). Puesto que para la síntesis peptídica es preciso trabajar con la forma enantiomericamente pura de cada Aa, se procedió a su resolución mediante las técnicas de cristalización clásica. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 115 Este método consiste en la formación de una pareja de diastereoisómeros a partir de un par de enantiómeros mediante el tratamiento con un reactivo quiral. De esta manera se generan dos especies diastereoméricas las que, al contrario que sucede con los enantiómeros, poseen propiedades diferentes. Este hecho hace que su separación sea factible si se utiliza una técnica apropiada. En este caso particular, la resolución se llevó a cabo utilizando la 1-feniletanamina en su forma enantiopura. De esta forma, las sales formadas por la interacción entre el ácido del γ-Aa y la amina presentan una relación de diasteroisomería, lo que permite explotar sus diferencias de solubilidad de las sales generadas en determinados disolventes. Concretamente, gracias a los estudios previos realizados en nuestro grupo de investigación,241b es conocido que si se utilizan mezclas de CHCl3 y hexano, una de estas sales precipita mientras que la otra se mantiene soluble en disolución, por lo que un simple proceso de filtración permite el enriquecimiento de las muestras en uno de los enantiómeros (Figura 64). Otro factor importante en la elección de esta amina quiral auxiliar viene determinado por el bajo coste de ambos enantiómeros, factor que debe ser tenido en cuenta en este tipo de procesos en los que ambos enantiómeros son de interés y se trabaja en escalas relativamente grandes. Figura 64. Proceso de resolución enantiomérica del γ-Ace mediante su cristalización con una amina quiral. En rojo se muestra la ruta seguida en particular durante este trabajo, que proporciona el isómero L de dicho aminoácido. Concretamente, la primera cristalización se realizó usando una mezcla CHCl3/Hexano (4:1) como disolvente y empleando solo 0.6 equiv del enantiómero dextrorrotatorio de la amina Alberto Fuertes García 116 quiral [(R)-1-feniletanamina]. Como se muestra en la Figura 64, este enantiómero propicia la cristalización del enantiómero 1S,4R del aminoácido, al que hemos denominado como el isómero L por su analogía con el -Aa que sustituye en el diseño de los nanotubos (Introducción, Figura 28).250A pesar de que los primeros núcleos de cristalización aparecieron al cabo de 24 horas, el proceso se prolongó durante una semana para obtener una cantidad razonable del aminoácido resuelto. Transcurrido ese tiempo, la mezcla se filtró y el sólido obtenido se suspendió en CH2Cl2 para luego lavarlo con HCl diluido, de forma que el ácido carboxílico se protona y se libera la sal. De esta manera, esta fracción de CH2Cl2 queda enriquecida en el enantiómero de interés, mientras que las aguas madres lo hacen en la sal del enantiómero opuesto. En este punto, se midió la rotación óptica de la fracción enriquecida para comprobar el exceso enantiomérico obtenido tras la primera cristalización. El valor obtenido de [α]D298 = -15° resultó estar todavía alejado a los valores descritos en la bibliografía ([α]D298 ≈ -50°),241b por lo que procedimos a repetir este proceso. Para la segunda cristalización, se aumentó la cantidad de la amina quiral hasta 1 equiv y se redujo la proporción de hexano utilizado en la mezcla de disolventes, ya que una cristalización demasiado rápida podría ser perjudicial en la resolución. Tras este segundo proceso ([α]D298 ≈ -36°), fue necesaria realizar una tercera cristalización para alcanzar un valor cercano al deseado, concretamente [α]D298 = - 49.1°. En este punto, decidimos utilizar un método más robusto para la determinación precisa del exceso enantiomérico de nuestra muestra enriquecida, dada la gran relevancia que tiene comenzar la síntesis con el máximo de enantiopureza en cada uno de los monómeros. En este caso, nos decantamos por la utilización de HPLC con una fase estacionaria quiral para determinar el exceso enantiomérico en las muestras que presentaban valores de rotación óptica cercanos al valor objetivo. Como se puede observar en la Parte experimental (Figure 1), la comparación entre la integral de los picos correspondientes a cada enantiómero permitió determinar que el exceso enantiomérico de la muestra 1 estaba en torno al 99%. Aunque no es de relevancia para este trabajo, hay que destacar que esta metodología permite también el tratamiento posterior de las fracciones de aguas madres obtenidas tras cada una de las cristalizaciones previamente descritas. En este caso, su cristalización con el enantiómero levorrotatorio de la amina, de nuevo repitiendo el proceso hasta tres veces, permite obtener el enantiómero 1R,4S del Ace con un exceso enantiomérico similar. Tras la obtención de la forma enantiopura del Ace (1), se procedió a su hidrogenación catalítica heterogénea sobre Pd/C en EtOH, lo que permitió la obtención de Boc-L-Acp-OH (2) de forma cuantitativa. Como hemos comentado previamente (Introducción, Sección 1.3.2), la síntesis de CPs con el derivado insaturado Ace presenta bastantes problemas, por lo que en este trabajo únicamente hemos trabajado con su variante insaturada Acp, exclusivamente como isómero L (1S,3R). En este punto, se procedió a la incorporación de los grupos alquílicos sobre la amina del Aa, para lo cual se siguieron dos estrategias diferentes. Por motivos de diseño, decidimos que el α,γ-ciclooctapéptido incluyese dos cadenas con alquinos terminales (concretamente grupos propargilo) y además, dos grupos metilo de manera intercalada, para restringir completamente cualquier posibilidad de interacción γ-γ entre CPs. Por otro lado, incorporaremos dos cadenas de propilazida sobre los residuos de Acp que componen el tetrapéptido, para que exista el suficiente espacio para que los ciclos se aproximen y reaccionen en la última etapa de la síntesis. La primera etapa en este aspecto consistió en la N-metilación del Acp, que se llevó a cabo de una manera directa sobre el compuesto 2 mediante el tratamiento con una base fuerte (NaH) y Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 117 MeI en THF seco. Este proceso genera un dianión (carboxilato y carga negativa sobre el nitrógeno) en el cual únicamente reacciona el grupo amina en estas condiciones, lo que evita la epimerización del carbono α y da lugar al compuesto 6 que, por conveniencia, se utiliza en la siguiente etapa sin purificación adicional (ver más abajo). Figura 65. Protocolo de N-metilación del Acp a partir del derivado de Ace 1. Por otro lado, se esterificó 2 con MeOH en presencia de EDC·HCl, HOBt y DMAP, lo que dio lugar al éster 3 en buen rendimiento. Con posterioridad comprobamos que el rendimiento de esta etapa se puede mejorar utilizando MeI en medio básico suave, lo que proporciona 3 cuantitativamente. Para la N-alquilación de Fukuyama con las otras cadenas funcionales se sustituyó en primer lugar el grupo protector Boc por el grupo nosilo. Este proceso se realizó mediante tratamiento de 3 con una mezcla de TFA y CH2Cl2, seguido del acoplamiento con el cloruro de 2-nitrobencenosulfonilo en presencia de DIEA, lo que permitió aislar la sulfonamida 4 en excelentes rendimientos.375 Este intermedio se pudo alquilar mediante tratamiento con K2CO3 anhidro en presencia de un exceso de diferentes electrófilos. Concretamente, el uso del tosilato del 3-azidopropan-1-ol (9), obtenido a partir del 3- bromopropan-1-ol en dos etapas (ver Parte experimental), o el 3-bromoprop-1-ino permitieron aislar los compuestos alquilados 5 y 7 en excelentes rendimientos. Esta transformación puede realizarse en disolventes polares como el ACN o la DMF, en los que la base presenta una solubilidad parcial. En ninguno de los dos casos se observaron cantidades apreciables (<5%) del epímero en el Cα a la vista del espectro de 1H RMN (desdoblamiento hacia campo bajo de la señal del Hα en torno a 2.9 ppm). Una vez llevada a cabo la incorporación de las cadenas reactivas, se procedió a la retirada del grupo nosilo, la cual se realizó mediante el tratamiento con tiofenol en medio básico suave, dando lugar en pocas horas a ambos aminoácidos N- funcionalizados (Aa1 y Aa3) en rendimientos en torno al 75%. Estas especies presentan una amina secundaria desprotegida, por lo que ya están disponibles para emplearse en la primera etapa de la síntesis peptídica. Por otro lado, el Aa N-metilado 6 se esterificó usando condiciones análogas a las descritas previamente para 2 de doble activación con carbodiimida y HOBt, lo que permitió obtener el compuesto Aa2 diprotegido como carbamato de tert-butilo y éster metílico. Esta etapa es necesaria ya que los α-Aas empleados en las rutas sintéticas se utilizaron en forma de ácido libre. 375 Aunque no se incluye en esta memoria, se pudo comprobar que la sulfonamida derivada del 4- nitrobencenosulfonilo presenta un comportamiento prácticamente análogo en las etapas de protección, alquilación y desprotección. De hecho, a la hora de N-funcionalizar con cadenas impedidas estéricamente, este isómero puede ser más conveniente que el anillo con un grupo nitro en posición orto. Alberto Fuertes García 118 Figura 66. Ruta sintética empleada para la obtención de los Aas N-alquilados Aa1 y Aa3 a partir del precursor 2. Una vez preparados los tres γ-Aa sintéticos, comenzamos con la etapa del crecimiento de los péptidos lineales. Este proceso se llevó a cabo en disolución utilizando una estrategia convergente basada en la interconexión de las unidades repetitivas en cada ciclo. Esto es, la repetición de dos unidades del dipéptido Boc-D-Leu-C3N3N-L-Acp-OMe (dip1, Figura 67) en la síntesis de CP1 y la repetición del tetrapéptido Boc-D-Leu-MeN-L-Acp-D-Leu-propN-L-Acp- OMe (tet2,3, Figura 70) para la preparación CP2. Este tetrapéptido se obtiene mediante el acoplamiento de los dipéptidos Boc-Leu-MeN-L-Acp-OMe (dip2) y Boc-Leu-propN-L-Acp-OMe (dip3, Figura 70). Para la formación de dichos dipéptidos se optó por combinar el γ-Aa correspondiente con la Boc-D-Leu-OH, ya que confiamos en que las propiedades hidrofóbicas de la cadena lateral de este Aa le otorguen a los CP finales una buena solubilidad en los disolventes apolares en los que llevaremos a cabo los estudios posteriores (CHCl3, por ejemplo). La decisión de optar por una estrategia en disolución frente a la alternativa habitual de la síntesis peptídica en fase sólida se debe a varios factores. El primero y más importante deriva de la necesidad de utilizar grandes excesos de los distintos Aas durante los protocolos de acoplamiento en fase sólida, lo que, en nuestro caso, al emplear residuos sintéticos de elevado valor añadido, limita en gran medida esta opción. Además, la mitad de nuestros acoplamientos se deben llevar a cabo sobre las aminas secundarias, menos activas que los típicos Aas naturales, lo que complica el proceso especialmente en los acoplamientos con péptidos relativamente largos. En nuestra aproximación, estos acoplamientos de aminas secundarias se llevan a cabo en la primera etapa del crecimiento del péptido exclusivamente, por lo que este problema se minimiza enormemente. Por último, al utilizar Leu como único α-Aa, no quedaría otro remedio que realizar la etapa de ciclación en disolución, ya que se tendría que anclar el péptido a la resina a través del grupo carboxilo terminal, puesto que la cadena lateral no presenta esa posibilidad.376 376 P. Cherkupally, G. A. Acosta, S, Ramesh, B. G. de la Torre, T. Govender, H. G. Kruger, F. Albericio, Amino Acids 2014, 46, 1827-1838. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 119 Como ha quedado patente con la descripción de la síntesis de los precursores, nuestra estrategia de grupos protectores se basará en la utilización del carbamato de tert-butilo (Boc, sensible al medio ácido) para proteger los extremos N-terminales y del éster metílico (sensible a hidróxidos alcalinos) en el grupo ácido. Ambos métodos de incorporación y desprotección son ortogonales entre sí y no presentan incompatibilidad ni con el grupo alquino ni con la azida. Figura 67. Ruta sintética empleada para la obtención del α,γ-ciclotetrapéptido CP1, que incorpora dos cadenas 3-azidopropílicas en su estructura. Para la obtención de CP1, comenzamos por la preparación de dip1 mediante el acoplamiento peptídico entre Aa1 y la Boc-D-Leu-OH comercial. Este proceso se llevó a cabo empleando N-HATU como agente de acoplamiento junto con la base no-nucleófila DIEA en CH2Cl2 (Figura 67). Bajo estas condiciones se pudo aislar el dipéptido de interés en muy buen rendimiento (92%). Este dipéptido, unidad fundamental del CP objetivo, se separó en dos porciones. Una de ellas se trató con una mezcla de TFA y CH2Cl2 para eliminar el Boc del grupo amina de la Leu. La segunda fracción se trató con LiOH en una mezcla de MeOH/H2O para dar lugar al ácido dip1a. Ambas etapas tienen un rendimiento prácticamente cuantitativo. Estos fragmentos se acoplaron entre sí utilizando una metodología análoga a la empleada para la formación de los dipéptidos, pero en esta ocasión se optó por N-HBTU como agente de acoplamiento. La elección de uno u otro reactivo de acoplamiento (Figura 68) viene determinada por la dificultad para llevar a cabo dicha reacción, de tal manera que N-HATU, más reactivo, se utiliza en acoplamientos de aminas secundarias mientras que N-HBTU, con una actividad más modesta pero un menor coste y una mayor estabilidad en disolución, se utiliza en los acoplamientos con aminas primarias.377 377 A. El-Faham, F. Albericio, Chem. Rev. 2011, 111, 6557-6602. Alberto Fuertes García 120 Figura 68. Mecanismo de formación de enlaces peptídicos mediante la utilización de agentes de acoplamiento basados en sales de uronio/guanidinio y fosfonio. Tras la obtención de tet1, se llevó a cabo su desprotección secuencial en ambos extremos (empezando por el grupo ácido) y por último se llevó a cabo la ciclación en condiciones de muy alta dilución en CH2Cl2 (0.25 mM), utilizando medio básico y PyAOP como reactivo de acoplamiento. Estas condiciones de dilución son necesarias para evitar un acoplamiento intermolecular previo al proceso de ciclación que conduzca a precursores de mayor tamaño (octameros, dodecámeros, etc). Esto es debido a que la ciclación de los ciclotetrapéptidos no está demasiado favorecida por motivos de tensión en el esqueleto peptídico.241b A pesar de estas precauciones, tras llevar a cabo una purificación rápida en columna del crudo de la ciclación, pudimos observar mediante RMN la aparición de señales características de un subproducto que identificamos como el ciclooctapéptido (Figura 69, azul) cuya presencia, aunque minoritaria con respecto al producto deseado (rojo), hizo necesaria una etapa de purificación adicional mediante HPLC. Este paso adicional permitió aislar en exclusiva el producto deseado CP1 con un rendimiento cercano al 50%. A continuación, procedimos con la síntesis de CP2 (Figura 70), que se compone de dos unidades de Aa2, dos unidades de Aa3 y 4 residuos de D-Leu. Como en el caso anterior la primera etapa consistió en la preparación de los dipéptidos. Para ello, se acopló el derivado N- metilado Aa2 y la Boc-D-Leu-OH, para lo que, en primer lugar, se trató el primero con un medio ácido fuerte para desproteger su grupo amina y permitir la formación del enlace peptídico. Este proceso se llevó a cabo empleando nuevamente la mezcla de N-HATU y DIEA en CH2Cl2, y proporcionó el producto deseado (dip2) en buen rendimiento (80%). Por otro lado, el monómero propargilado Aa3, carente de grupo protector sobre el extremo N-terminal se acopló de manera directa en idénticas condiciones con Boc-D-Leu-OH proporcionando dip3 con un excelente rendimiento (96%). Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 121 Figura 69. Espectro de 1H RMN (CDCl3) del crudo de la etapa de ciclación para obtener CP1 (en rojo), que muestra un juego de señales adicionales que se corresponden con el subproducto (en azul) derivado de un acoplamiento intermolecular previo a la ciclación intramolecular. Una vez preparados los dipéptidos correspondientes, procedimos con la síntesis del tetrapéptido protegido tet2,3. Con este fin, desprotegimos el extremo amino de dip3 mediante el tratamiento con una mezcla de TFA y CH2Cl2 y el extremo ácido de dip2 mediante la hidrólisis del éster metílico con LiOH en MeOH/H2O (3:1), transcurriendo ambas etapas en rendimientos cuantitativos. El acoplamiento de ambos sustratos utilizando las condiciones de acoplamiento típicas con N-HBTU, dio lugar al correspondiente tetrapéptido (tet2,3) con un rendimiento superior al 90%. Como en la anterior síntesis, se dividió la cantidad obtenida en dos porciones, se desprotegieron los extremos C- o N-terminales de cada fracción y posteriormente se acoplaron para dar lugar al oct2,3. Siguiendo los protocolos típicos descritos con anterioridad, se preparó el octapéptido lineal en un 72% para las tres etapas. Finalmente se llevó a cabo la formación del ciclo, tras las desprotecciones sucesivas de los extremos del péptido, mediante el tratamiento de una disolución 2 mM del precursor peptídico en CH2Cl2 con N-TBTU en presencia de DIEA. La elección de este agente activante se debió a su mayor tiempo de vida en el medio de reacción, especialmente adecuado para estos procesos intramoleculares en los que la transformación procede en tiempos de reacción de varias horas en condiciones anhidras. Bajo estas condiciones se aisló CP2 en un rendimiento del 60%, bastante satisfactorio considerando los rendimientos típicos de las etapas de ciclación. La última etapa sintética de la ruta consistió en la unión covalente entre las cadenas reactivas de ambos ciclopéptidos (CP1 y CP2) mediante la reacción de click. Esta cicloadición ha cobrado una gran importancia en los últimos tiempos debido principalmente a su bioortogonalidad y gran eficacia, además de su relativa versatilidad al ser empleada en una gran variedad de sustratos, desde proteínas hasta polímeros o macrociclos.378 378 L. Li, Z. Zhang, Molecules 2016, 21, 1393-1415. C. S. McKay, M. G. Finn, Chem. Biol. 2014, 21, 1075-1101. Alberto Fuertes García 128 𝐿𝑜𝑔(𝐾𝑎)=−( ∆𝐻 2,3𝑅)·(1 𝑇)+( ∆𝑆 2,3𝑅) (𝟐) De esta manera, el proceso de autoensamblaje a 25ºC en CDCl3 tiene una constante de asociación de Ka = 329 M-1 con unos parámetros termodinámicos de ΔH = -22.1 kJ/mol y ΔS = -26.0 J/mol·K. Estos datos ponen de manifiesto que el proceso de autoensamblaje está dirigido entálpicamente, gracias a la formación de enlaces de hidrógeno, mientras que está desfavorecido entrópicamente, debido al aumento en el orden del sistema al pasar de una especie monomérica a una dimérica. Además, hay que destacar que el valor de Ka es en torno a 7 veces mayor que para otros α,γ-ciclotetrapéptidos N-metilados previamente descritos.241a A continuación, procedimos con el análisis análogo del proceso de dimerización menos favorable presente en CP3, en donde rápidamente nos percatamos de que se nos presentarían varias dificultades. Por un lado, como ya se ha comentado anteriormente, la solubilidad de esta especie está restringida a valores por debajo de 4 mM aproximadamente (estimado en base a la integración relativa entre un patrón interno, TMSS, y algunas señales de referencia en CP3). Por otro lado, la pobre definición de las dos señales de los NHs, cuyo desplazamiento químico exacto debe ser conocido para llevar a cabo el análisis, restringía este procedimiento, ya que el ancheamiento excesivo de estas señales imposibilitó la determinación de sus desplazamientos por debajo de 0ºC, al diluirse en la propia línea base del espectro. Tras ponderar estos dos problemas decidimos desistir en el proceso de llevar a cabo un análisis cuantitativo análogo al realizado previamente para CP1, aunque sí se pudo hacer una comparación de tipo cualitativo entre ambas estructuras (Figura 77). Como se aprecia en este análisis, los desplazamientos químicos de las dos especies diméricas presentes en CP3 (líneas continuas en la Figura 77) flanquean de manera prácticamente paralela a los desplazamientos observados para CP1 (líneas discontinuas), por lo que consideramos de manera aproximada, un valor de Ka del tetrapéptido de CP3 próximo al del CP1. Podemos afirmar pues que no se observa un efecto negativo para la dimerización al anclar otro ciclopéptido de manera covalente sobre el α,γ-ciclotetrapéptido. 1 /T /K -1 lo g (K a ) 0.0030 0.0035 0.0040 0.0045 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Slope 1156 ± 100.3 X-intercept when Y=0.0 0.001177 Figura 76. Recta de Van’t Hoff para el proceso de dimerización de CP1 obtenida a partir de los valores representados en la Figura 75. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 129 Figura 77. Evaluación de las variaciones de los desplazamientos químicos de los protones amídicos de los residuos de Leu del ciclotetrapéptido (eje Y) frente a la concentración de las muestras en CP1 y CP3. A continuación, decidimos continuar explorando la versatilidad de este sistema mediante la introducción en escena de un ciclopéptido adicional que permitiera la formación de heterodímeros. En base a los antecedentes existentes en este campo, descritos a lo largo de las secciones 1.3.2 y 1.3.4 de la Introducción, decidimos emplear el α,γ-ciclooctapéptido CP4, compuesto por 4 unidades de MeN-L-Ach y otras 4 unidades de D-Phe, el cual puede dar lugar a complejos heteroméricos con CP3.241b La decisión de formar heterodímeros con el octapéptido de CP3 se debe a que el comportamiento de la cara opuesta, como hemos visto previamente, es fácilmente modulable, por lo que entendemos que, actuando sobre el ciclooctapéptido, que en otras condiciones forma dímeros que no responden a ningún estímulo, se puede introducir un grado de complejidad adicional al sistema. Figura 78. Arriba: estructura de las formas monomérica y dimérica de CP4 basado en el aminoácido Ach. Debajo: propuesta de empleo de CP4 para el incremento de la diversidad estructural de los nanotubos basados en el bis-ciclopéptido CP3. 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 5.5 6.0 6.5 7.0 [C ] / M N H L e u 1 (p p m ) C P 1 2 0 ºC C P 3 m in o rita rio 2 0 ºC C P 1 4 0 ºC C P 3 m a y o rita rio 4 0 ºC C P 3 m a y o rita rio 2 0 ºC C P 3 m in o rita rio 4 0 ºC Alberto Fuertes García 130 A nivel estructural (Figura 78), la incorporación de este CP supondría el bloqueo efectivo del crecimiento supramolecular de CP3 hacia NT3. La formación de manera preferente del heterodímero D3-4 frente a D3 (Figura 74) bloquea el crecimiento por dicha cara (CP4 está N- metilado en su cara γ) quedando restringido a una dimerización por la cara opuesta, lo que daría lugar a un nanotubo formado por seis péptidos apilados que por su forma hemos denominado como nanotubo Venturi386 (NTV3-4). Además, la nueva especie D3-4 presentaría unas características de dimerización débiles idénticas a las de CP3 por su cara estrecha, por lo que el equilibrio entre dicha especie y NTV3-4 puede ser controlado usando la misma estrategia de concentración, temperatura y pequeños porcentajes de disolventes competidores que hemos descrito con anterioridad. Para corroborar estas propuestas estructurales, procedimos a la formación de los derivados heterodiméricos en CDCl3, siguiendo la evolución del sistema por RMN de protón a temperatura ambiente. La adición de cantidades crecientes de CP4 sobre una disolución sobresaturada de CP3 (>5 mM) proporcionó cambios notables en las señales, inicialmente anchas. Además, se observaba la desaparición del precipitado blanco presente en el seno de la disolución al inicio de la valoración, lo que implica que los agregados supramoleculares de NT3 con elevado peso molecular ya no están presentes en la muestra. Figura 79. Adición de cantidades crecientes de CP4 sobre una muestra sobresaturada de CP3 en CDCl3. 241b R. J. Brea, M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5710-5713. 386 Los tubos de Venturi son instrumentos que se emplean en ingeniería y presentan una zona interna constreñida que acelera el flujo del fluido que transcurre a través de ellos. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 131 Como se puede observar en la Figura 79, a medida que se van añadiendo cantidades crecientes del péptido de Ach sobre el aducto covalente de Acp, se aprecia la disminución progresiva en la intensidad de las dos parejas de señales de CP3 (en rojo), así como la aparición progresiva de otras señales asociadas a la formación del heterodímero D3-4. Si analizamos en detalle el caso de los NHs de los ciclooctapéptidos, se aprecia como las dos parejas originales de CP3, con intensidades relativas de 3:1, situadas entre 8.1 y 8.5 ppms dan lugar a una única pareja de dobletes de igual intensidad que aparecen a campo más bajo (8.7 ppm, NH Leu2 en la Figura 79). Esta simplificación también se observa en el caso de los NHs del ciclotetrapéptido (NH Leu1 en la Figura 79), que pasan de aparecer como dos señales anchas a dar lugar a una única señal tras la adición de 1 equiv de CP4. Esta aparente simplificación se debe a que en la especie heterodimérica no existe la posibilidad de formación de distintos rotoisómeros, ya que todos los residuos de MeN-Ach son indistinguibles dentro de CP4 (eje de simetría C4). Sin embargo, en el caso del NH de los residuos de Phe de CP4, en el momento en el que pasan a formar parte del complejo heterodimérico D3-4, su equivalencia original (un único doblete en la traza verde de D4) se desvanece al estar ahora formando enlace de hidrógeno con un ciclopéptido en el que no todos los grupos carbonilo son equivalentes, ya que el carbonilo de la Leu que está unida a un residuo de MeN-Acp no es idéntico al que está unido a un propN- Acp. Esto implica que la señal de NH de CP4 que en su forma dimérica se encuentra a en torno a 8.6 ppm, en la especie D3-4 genere dos dobletes a campo ligeramente más alto (8.5 y 8.4 ppm). Se puede observar que, a pesar de que la especie heterodimérica deseada es de largo la especie mayoritaria, aparece un doblete claro en el desplazamiento químico original del NH de D4, por lo que es probable que, debido a alguna imprecisión experimental, en realidad se haya añadido una cantidad de este CP ligeramente superior a la equivalencia. No obstante, también se observa que quizás queden algunas tenues señales residuales de la especie D3 o NTV3, por lo cabe la posibilidad de que la Ka del proceso de heterodimerización no sea lo suficientemente grande en comparación con las Ka de homodimerización como para desplazar el equilibrio completamente hacia la forma heterodimérica. En cualquier caso, esta especie es minoritaria, lo que, sumado a la presencia de trazas de impurezas provenientes de la muestra de CP4, hace que el análisis de la estabilidad relativa de ambas especies se complique. Para finalizar este capítulo, planteamos la utilización de una técnica adicional como los experimentos de difusión en RMN para la estimación del tamaño de las especies supramoleculares que se han ido comentando a lo largo de este capítulo. En los últimos años, los experimentos de difusión387 se han generalizado para convertirse en una interesante herramienta que permite conocer el tamaño de las moléculas en disolución. La variable física que se obtiene de dichos experimentos se conoce como coeficiente de autodifusión (Dt), que representa el resultado de los movimientos aleatorios de origen térmico que cada molécula exhibe de manera natural en un disolvente. Este dato se correlaciona directamente con el radio hidrodinámico (rh)388 de una molécula a través de la ecuación de Einstein-Stokes (Ec. 3), la cual, dependiendo de diversos factores, puede ser ajustada (como veremos más adelante) para realizar correcciones en función de la naturaleza de las partículas estudiadas.389 Más concretamente, los experimentos de DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY)390 son 387 W. S. Price, Concepts Magn. Reson. 1997, 9, 299-336. 388 El valor de rh calculado mediante medidas de difusión suele encontrarse entre los valores experimentales obtenidos mediante difracción de rayos-X y teóricos mediante cálculos de van der Waals. 389 J. T. Edward, J. Chem. Educ. 1970, 47, 261. 390 C. S. Johnson Jr., Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1999, 34, 203-256. Alberto Fuertes García 132 probablemente los más utilizados en este ámbito dada su presencia en la mayoría de los paquetes comerciales de espectrofotómetros y su versatilidad, ya que han sido empleados con éxito en la determinación del tamaño de multitud de sustancias discretas o supramoleculares, como cajas de coordinación, complejos organometálicos o polímeros.391 𝐷𝑡=𝑘𝑇 𝜋𝜂𝑟ℎ (𝟑) Figura 80. Representación esquemática de un experimento de DOSY sobre una muestra que contiene tres sustancias (A, B y C) de diferente peso molecular. A la izquierda se muestra la diferencia en la intensidad del decaimiento de la señal de cada especie a lo largo del gradiente de pulsos en función de su tamaño, lo que se traduce en los diferentes valores de difusión obtenidos (derecha) para las señales de cada especie. A nivel experimental, esta técnica consiste en someter a la muestra a un gradiente pulsado de campos magnéticos, de tal manera que se vaya produciendo un decaimiento de la intensidad de las señales a lo largo del experimento, cuya magnitud depende directamente del tamaño de cada especie en disolución. Las especies de bajo peso molecular, con radios hidrodinámicos pequeños, difunden muy rápido en disolución, por lo que su decaimiento será más abrupto que en el caso de moléculas de mayor tamaño y migración más lenta. Este hecho se ejemplifica en la Figura 80, en la que se puede observar un decaimiento muy acusado en las señales de la molécula de H2O en comparación con las de la cafeína. De esta manera, esta técnica es muy útil a la hora de trabajar con mezclas de compuestos, ya que si estos no interaccionan entre sí en disolución (migran independientemente), todas las señales de una misma molécula presentarán el mismo coeficiente de autodifusión (Dt) a la vez que cada molécula difundirá en una línea diferente en el espectro de DOSY (Figura 80, derecha). Por el contrario, si existe una interacción entre dos moléculas diferentes en disolución (por ejemplo, la formación de un complejo supramolecular), ambas moléculas estarán “pegadas” y por tanto difundirán de manera conjunta en el seno de una disolución, por lo que las señales de los protones de ambas especies se 391 L. Avram, Y. Cohen, Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 586-602. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 133 localizarán en la misma línea de difusión. Además, hay que destacar que para especies que están en equilibrio rápido en la escala de tiempo de esta técnica de RMN, donde se observa una única señal que representan una media ponderada entre las diferentes especies en equilibrio, el valor de difusión observado será la media ponderada de las difusiones de todas las especies presentes en el equilibrio.391 Una vez atendidas estas consideraciones previas, procedimos a la realización de los experimentos de DOSY con las muestras que se han discutido a lo largo de este capítulo. Mediante esta técnica deseábamos corroborar las tendencias de agregación propuestas en base a los experimentos 1H RMN, así como cuantificar el tamaño de las diferentes especies supramoleculares en equilibrio. Con el objetivo de lograr una robustez adicional en nuestros experimentos, que permitiese la comprobación directa de los tamaños entre muestras analizadas en condiciones diferentes,392 decidimos emplear una molécula adicional, que fuese inerte con respecto a los procesos de agregación presentes en nuestros CPs y, por tanto, actuase como patrón interno. Decidimos que esta molécula fuese el tetrakis-(trimetilsilil)silano (TMSS) cuyos valores de difusión son constantes y conocidos en bibliografía,393 de tal manera que el conocimiento de sus datos de difusión facilitase el cálculo de los radios hidrodinámicos de nuestras “muestras problema” de una manera más rápida y precisa.394 Además, debido a la relación entre el tamaño del disolvente (o mezclas de disolventes) empleado y el de las moléculas estudiadas, así como de la desviación morfológica de alguna de las especies con respecto del modelo esférico, decidimos emplear la ecuación de Einstein-Stokes corregida Ec. 4, la cual incluye parámetros como c395 y fs,396 que corrigen las desviaciones en los dos aspectos previamente comentados, respectivamente (ver Parte Experimental, Sección 1.5). 𝐷𝑡=𝑘𝑇 𝑐(𝑟𝑠𝑜𝑙,𝑟𝐻)𝑓𝑠(𝑎,𝑏)𝜋𝜂𝑟ℎ (𝟒) → 𝐷𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐷𝑇𝑀𝑆𝑆 =𝑐(𝑇𝑀𝑆𝑆)𝑓𝑠(𝑇𝑀𝑆𝑆)𝑟𝑇𝑀𝑆𝑆 𝑐(𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)𝑓𝑠(𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)𝑟𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝟓) De esta forma, es posible relacionar la difusión de la muestra y del patrón interno como se muestra en la Ec. 5, lo que permite eliminar parámetros de la ecuación como la viscosidad del disolvente empleado (η). Como se ha comentado con anterioridad, todos los datos del numerador son conocidos,393 mientras que los valores de c y fs pueden obtenerse mediante la estimación de las dimensiones de las moléculas bajo estudio. Por todo esto, si experimentalmente (Figura 81) se puede determinar el cociente entre la difusión de la muestra y la del patrón interno TMSS, sería posible calcular directamente el radio hidrodinámico de la especie en equilibrio. 392 Las medidas de difusión pasan por ser bastante sensibles y variar notablemente con factores tales como pequeñas variaciones en los disolventes (viscosidad) u otros factores ambientales (pequeñas impurezas de elevado peso molecular, temperatura, etc.) 393 D. Zuccaccia, A. Macchioni, Organometallics 2005, 24, 3476-3486. 394 A. Macchioni, G. Ciancaleoni, C. Zuccaccia, D. Zuccaccia, Chem. Soc. Rev. 2008, 37, 479-489. 395 H.-C. Chen, S.-H. Chen, J. Phys. Chem. 1984, 88, 5118-5121. 396 G. Li, J. X. Tang, Phys. Rev. E: Stat. Phys., Plasmas, Fluids, Relat. Interdiscip. Top. 2004, 69, 61921. F. Perrin, J. Phys. Radium. 1936, 7, 1-11. Alberto Fuertes García 134 Figura 81. Ejemplo de experimento DOSY llevado a cabo con CP3 en una mezcla 1% MeOH d3/CDCl3 en presencia del patrón interno TMSS. En la parte superior se muestra el decaimiento monoexponencial en la intensidad de los picos de la muestra, que garantiza la fiabilidad del experimento. Los resultados obtenidos por DOSY corroboran por completo nuestras observaciones iniciales. En el caso del equilibrio entre CP3 y NT3 (círculos rojos conectados en la Figura 82) se puede apreciar un aumento en el tamaño promedio de las especies en disolución a medida que aumenta la concentración (de 9.4 a 10.6 Å) derivado del desplazamiento del equilibrio hacia la especie agregada NT3. El hecho de que el incremento no sea muy notable (en torno al 10- 15% en el valor de rh) al aumentar la concentración tiene sentido, ya que la dimerización a través del ciclotetrapéptido presenta un valor de Ka bajo que se traduce en un número de agregación397 pequeño en este rango de concentraciones. En el momento en el que a este sistema se le añade una pequeña porción de MeOH, el valor de rh disminuye en más de una unidad, evidenciando el menor tamaño de D3 (cuadrado rojo en la Figura 82), la especie presente en estas condiciones, frente a los agregados nanotubulares. Por otro lado, para los sistemas heterodiméricos se llevaron a cabo medidas sobre muestras inéditas hasta este momento, como las que presentan una relación subestequiométrica de CP4 frente a CP3. Al variar esta relación, es posible que se produzca (al menos en términos estadísticos) la inserción en el nanotubo final de más de dos unidades de CP3 (como en el caso de NTV3-4) antes del bloqueo del crecimiento por parte de CP4. Estas muestras darían lugar pues a nanotubos de Venturi con más de una zona estrecha en su estructura, que se refleja en los experimentos de DOSY con un incremento 397 S. S. Pochapsky, H. Mo, T. Pochapsky, J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1995, 2513-2514. Nanotubos autoensamblados tipo Venturi 135 notable del valor de rh (1.7 Å) cuando se pasa de una relación 1:1 a una relación 1:2 o 1:3 entre CP4 y CP3 (línea punteada en Figura 82). El hecho de que no exista mucha diferencia entre ambos experimentos subestequiométricos se razona nuevamente considerando el valor de Ka del ciclotetrapéptido, que desemboca en un moderado número de agregación y, por tanto, el sistema se aleja del resultado estadísticamente esperado (inserción de hasta 6 unidades de CP3 antes del bloqueo, derivadas de la formación de 3 dímeros con baja afinidad en el experimento 1:3). Figura 82. Resultados obtenidos para los diferentes experimentos de DOSY llevados a cabo en CDCl3 con las muestras indicadas. a) Se utilizó un 1% de MeOH d3 como co-disolvente. En base a todos estos resultados, queda demostrada la versatilidad de este sistema supramolecular, con el que hemos exhibido la posibilidad de realizar apilamientos columnares compuestos por un número variable de CPs de diferente diámetro interno, tanto covalente como supramolecularmente unidos. De esta manera, se han preparado: nanotubos de elevado peso molecular, nanotubos de Venturi compuestos por 6 (NTV3-4) o más (ratios subestequiométricos entre CP3 y CP4) anillos ciclopeptídicos apilados, agregados supramoleculares con forma de embudo (D3-4) e incluso dímeros con forma de cápsula que presentan una zona ancha en la parte media y extremos estrechos (D3).398 Creemos que este tipo de sistemas, si se amplía ligeramente el diámetro interno de la parte estrecha, podrían tener aplicaciones interesantes en campos como el transporte transmembranal, ya que dichas constricciones podrían actuar como los filtros de selectividad presentes en algunas proteínas transportadoras naturales. No obstante, a nivel sintético esto supone un reto importante, ya que habría que encontrar un sistema que, aunque fuese más ancho, siguiese presentando una cierta capacidad para modular su comportamiento, lo que evitaría su precipitación instantánea tras ser sintetizado (Figura 78). 398 A. Fuertes, H. L. Ozores, M. Amorín, J. R. Granja, Nanoscale 2017, 9, 748-753. 02468 5 10 15 C o n c e n tra c ió n (m M ) R a d io h id ro d in á m ico / Å Capítulo II Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos Alberto Fuertes García 144 de partida. Por otro lado, si estos transportadores poseen unas buenas propiedades, se podrían evaluar sus posibles actividades farmacológicas (citotoxicidad), como ya se ha hecho con otros transportadores catiónicos.¡Error! Marcador no definido. En cuanto al modo de anclaje entre las cadenas que se utilizarán para abarcar la membrana y el esqueleto peptídico, utilizaremos nuevamente la cicloadición azida-alquino catalizada por Cu(I) (Figura 86), comúnmente conocida como click,378 ya que es preciso utilizar una reacción robusta en la última etapa sintética, y la optimización llevada a cabo durante el Capítulo I supone una ventaja clara en nuestro caso. Además, dada la gran relevancia que tienen las cadenas de PEG en campos como la bioconjugación,407 es bastante habitual encontrarse en los catálogos comerciales una abundante oferta de azido-conjugados de PEG y oligoetilenglicol de longitudes muy diversas, algo esencial para este trabajo. Figura 86. Representación esquemática de la estrategia llevada a cabo para la preparación de transportadores de membrana sintéticos tipo spanner. En cuanto a la síntesis de la parte central de los transportadores, planteamos la preparación de varios α,γ-CP que presenten variaciones en su diámetro y en el número de puntos de anclaje de cadenas de oligoetilenglicol. Estas dos características son fácilmente modificables mediante la incorporación de un número mayor o menor de Aas en la secuencia y de grupos reactivos que permite la N-funcionalización (grupo propargilo), respectivamente. En esta línea nos planteamos el uso de hexapéptidos y de octapéptidos para esta tarea, que contienen, respectivamente, tres y cuatro γ-Aas en su secuencia que están N-alquilados. Con el objetivo de simplificar las síntesis de ambas familias de ciclos, nos propusimos utilizar como unidades constituyentes (building blocks) únicamente dos dipéptidos (Figura 87): el dip2, que contiene en su estructura un residuo de L-Acp N-metilado y dip3, que está N-propargilado. En ambos casos decidimos emplear la D-Leu como único α-Aa dado su carácter apolar que debe favorecer la localización del péptido en la región hidrofóbica de las membranas. Esta aproximación, aun siendo óptima en términos de esfuerzo sintético, limita el estudio de la influencia de las propiedades externas (hidrofobicidad fundamentalmente) de los CPs en su capacidad transportadora, ya que no permite la variación de las α-Aas en la primera ronda de optimización 378 L. Li, Z. Zhang, Molecules 2016, 21, 1393-1415. C. S. McKay, M. G. Finn, Chem. Biol. 2014, 21, 1075-1101. 407 J. Kalia, R. T. Raines, Curr. Org. Chem. 2010, 14, 138-147. Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos 145 de las estructuras. Por tanto, en este trabajo nos centraremos en abordar únicamente la influencia que tienen los factores del tamaño del dímero y grado de sustitución con cadenas largas cargadas en el transporte. Para la obtención de los CPs, estos dos dipéptidos se desprotegieron de forma ortogonal en sus extremos N- o C- terminales secuencialmente y los productos resultantes se acoplaron convenientemente para dar los diferentes tetra-, hexa- y octapéptidos lineales. El tratamiento de estas especies con hidróxido de litio en una mezcla de metanol y agua dio lugar a los correspondientes péptidos lineales en su forma de ácido libre tras la acidificación del medio de reacción. Estos fueron posteriormente tratados con TFA en diclorometano, lo que permitió liberar el extremo N-terminal dando lugar a las correspondientes sales de trifluoroacetato. Los macrociclos derivados de los péptidos lineales desprotegidos se obtuvieron mediante los protocolos (N-TBTU, DIEA, CH2Cl2) descritos en el Capítulo I de esta memoria (Figura 70). De esta forma se obtuvieron los α,γ-ciclohexapéptidos CP5, CP6 y CP7, que contienen 3, 1 y 2 grupos propargilo, respectivamente, y los α,γ-ciclooctapéptidos CP2, que posee 2 grupos propargilos en extremos opuestos del anillo, y CP11, que posee los 4 γ-Acp N-propargilados. Renunciamos a la utilización de ciclotetrapéptidos por su escaso diámetro interno y baja constante de asociación,408,237237 y a ciclos más grandes ya que su mayor complejidad sintética no parecía compensar, a priori, las propiedades que esperábamos obtener del incremento del tamaño del anillo. Considerábamos que, en caso de que el transporte se diese a través de la cavidad interna de un dímero, los anillos de ocho miembros tendrían un diámetro interno suficiente para acomodar los iones típicamente estudiados y no pensamos que fuesen a existir diferencias sustanciales entre la incorporación de cuatro o cinco cadenas de oligoetilenglicol. Figura 87. Ruta sintética hacia los diferentes CPs utilizados como precursores de transportadores de membrana. 408 La constante de asociación (Ka) calculada en disolventes apolares (CDCl3) supone una buena referencia para compararla con la que hipotéticamente presentarían en el interior de la bicapa lipídica. 237 M. Amorín, R. J. Brea, L. Castedo, J. R. Granja, Org. Lett. 2005, 7, 4681-4684. M. Amorín, R. J. Brea, L. Castedo, J. R. Granja, Heterocycles 2006, 67, 575-583. Alberto Fuertes García 146 También nos planteamos estudiar el efecto de la longitud de las cadenas de oligoetilenglicol y de la presencia de otros grupos funcionales en el interior de la cadena que modifiquen su hidrofilia. En todos los casos se propone incorporar una sal de amonio cuaternario en el extremo terminal más alejado del péptido, como ya se ha comentado previamente. El primer ligando seleccionado (L), que cuenta con 35 átomos entre los grupos amonio y azida (44 Å en su forma extendida) se preparó mediante la protección del compuesto comercial H2N-(CH2CH2O)11-CH2CH2N3 con cloruro de tritilo en medio básico. Esta protección fue necesaria para poder llevar a cabo el posterior acoplamiento con el CP, ya que las diferentes condiciones estudiadas para la reacción de acoplamiento no permitieron conversiones satisfactorias usando el sustrato comercial con el grupo amino libre. Además, preparamos otros dos colgantes de longitud menor, S e I, que presentan 21 y 24 átomos de longitud (25-28 Å aprox.). Estos alargadores contienen en su estructura grupos amida además de las unidades de etilenglicol y los extremos de amina primaria y azida terminal. La fuente comercial de estos alargadores es el ácido 8-(tert-butilcarbonilamino)-3,6-dioxaoctanoico (Boc-O2Oc-OH) y la síntesis de ambos es análoga, con una ligera modificación en el extremo que contiene el grupo azida y que esperamos modifique ligeramente la hidrofobicidad en el interior de las bicapas. Para aislar estas cadenas más cortas, se protegió el extremo C-terminal de este aminoácido lineal mediante la formación de sendos ésteres con 3-azidopropan-1-ol (para el ligando S) y el 6-azidohexan-1-ol (para I), usando la estrategia de la doble activación de ácidos carboxílicos mediante una carbodiimida (EDC) y el hidroxibenzotriazol en medio básico. A continuación, se desprotegió el extremo N-terminal de este éster mediante tratamiento con TFA y se acopló a otra unidad de Boc-O2Oc-OH utilizando N-HBTU en medio básico (Figura 88). Figura 88. Arriba: preparación de los alargadores de diferente longitud, L (izquierda) y S e I (derecha), que contienen un grupo azida y amina protegida en cada extremo. Abajo: procedimiento de conjugación de los alargadores a los diferentes CPs mediante la reacción de click seguido de la desprotección de las aminas primarias mediante tratamiento con ácido fuerte. Tras la preparación de ambos componentes, la unión entre la azida de las cadenas largas y los grupos alquino de los CPs se llevó a cabo utilizando la metodología desarrollada en el Capítulo I para la reacción de click. De esta forma, el complejo [Cu(MeCN)4PF6] se empleó Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos 147 como fuente de Cu (I), lo que permitió llevar a cabo la reacción en disolventes orgánicos (CH2Cl2) en presencia de DIEA y TBTA (Figura 88). Tras mezclar todos estos componentes en estrictas condiciones anhidras y en atmósfera inerte se pudieron aislar los diferentes transportadores en su forma protegida en muy buenos rendimientos (ver cuadro de la Fig. 7). El último paso en la ruta sintética consistió en la desprotección del grupo amina primaria mediante tratamiento con TFA en CH2Cl2, que proporciona la forma activa de los transportadores (sales de amonio cuaternario) en rendimientos cuantitativos tras breves tiempos de mezcla. El exceso de ácido utilizado para desenmascarar la amina se elimina mediante sucesivas evaporaciones y lavados con CH2Cl2, seguidos de periodos de tiempo prolongados bajo atmósfera de alto vacío (0.1 mm Hg). De esta manera, disponemos de la pequeña biblioteca de trece moléculas transportadoras con pequeñas diferencias en su estructura (Figura 89). Esperamos que el estudio sistemático de sus aptitudes para transportar iones monovalentes arroje información útil sobre le relación entre estructura y actividad, de tal manera que se puedan observar tendencias que propicien el desarrollo de nuevas generaciones de membrane spanners con propiedades mejoradas. A pesar de que las membranas biológicas pueden llegar a ser morfológicamente muy diversas, si se tuviese que hacer una generalización con respecto a su estructura, se podría afirmar que el fosfolípido POPC supone una representación bastante apropiada de dichas bicapas.409 Este fosfolípido, compuesto por una cadena grasa derivada del ácido oleico (18:1) y otra del ácido palmítico (16:0), tiene una longitud aproximada (en su conformación puramente extendida) en torno a 19 Å entre el extremo de colina y el metilo terminal de sus colas hidrofóbicas (donde se produce el contacto entre las dos capas de la membrana lipídica) que se corresponde por tanto con un tamaño total en torno a 35-40 Å. Los transportadores seleccionados para este estudio poseen una longitud (considerando la distancia entre el amonio terminal y el átomo de nitrógeno del Acp), en torno a 28 Å para los derivados del alargador L, 20 Å para los de I y 18 Å para los de S, aproximadamente. Hay que tener en cuenta que estos transportadores contienen un CP que está diseñado para dimerizar en condiciones hidrofóbicas como el interior de la membrana, por lo que la estimación de la longitud total de la especie dimérica se obtiene considerando el doble de estas longitudes y la distancia intercíclica, que en los dímeros de α,γ-CPs ronda los 4.5 Å. De esta forma, claramente, los transportadores basados en L son más largos que la longitud de una bicapa lipídica estándar, mientras que S e I se encuentran más próximos a sus dimensiones. En este último caso sería necesario que los alargadores mantuviesen una conformación extendida casi en su totalidad para lograr posicionar sus grupos amonio en el entorno de los grupos fosfato de la región externa de la membrana (Figura 85, izquierda). 409 D. L. Nelson, M. M. Cox, Lehninger Priciples of Biochemistry, 5th edition, W.H. Freeman, New York, 2009. Alberto Fuertes García 148 Figura 89. Qumioteca de transportadores tipo membrane spanners preparados. Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos 149 A la hora de evaluar su capacidad transportadora, planteamos, en primer lugar, llevar a cabo experimentos en bicapas lipídicas modelo como las de los liposomas. Esta robusta metodología permite la preparación de una gran variedad de tipos de vesículas con diferentes tamaños, composición lipídica y que encapsulen diferentes disoluciones acuosas en su interior.410 De esta manera, es posible introducir en el interior de estas entidades sondas fluorescentes que respondan a un estímulo en particular, como el pH,411 su propia concentración,412 la presencia de otras moléculas413 (quenchers)414 o determinados iones,415 etc. Todo esto abre numerosas posibilidades para estudiar de manera sencilla y rápida, mediante métodos basados en la fluorescencia, el comportamiento de diferentes moléculas que se inserten en las membranas de los liposomas. De todas las opciones que ofrece la técnica de la fluorescencia, pensamos que lo más sencillo para iniciar el estudio sería evaluar la capacidad de nuestras moléculas para insertarse en una membrana y promover una rectificación en el pH de la disolución intravesicular, si existe un gradiente entre esta y la disolución extravesicular. Figura 90. Representación esquemática del experimento de disipación de gradiente de pH mediante los transportadores tipo spanner usando CF como sonda fluorescente. 410 S. Matile, N. Sakai, “The Characterization of Synthetic Ion Channels and Pores.” En Analytical Methods in Supramolecular Chemistry; Ed. Schalley, C. A.; C. A. Wiley, Weinheim, 2007, 391-418. 411 J. A. Thomas, R. N. Buchsbaum, A. Zimniak, E. Racker, Biochemistry 1979, 18, 2210-2218. 412 J. N. Weinstein, S. Yoshikami, P. Henkart, R. Blumenthal, W. A. Hagins, Science 1977, 195, 489-492. 413 Y. Li, H. Zhu, O. Kuppusamy, V. Roubaud, J. L. Zweier, M. A. Trush, J. Biol. Chem. 1998, 273, 2015-2023. 414 T. Takeuchi, S. Matile, Faraday Discuss. 2009, 143, 187-203. 415 M. Lisbjerg, H. Valkenier, B. M. Jessen, H. Al-Kerdi, A. P. Davis, M. Pittelkow, J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 4948-4951. Alberto Fuertes García 150 En esta línea, decidimos utilizar vesículas unilamelares grandes (con un diámetro aproximado de 100-200 nm), que contuviesen en su interior un fluoróforo cuya intensidad de fluorescencia dependiese del pH del medio. La 5(6)-carboxifluoresceína (CF) presenta una fuerte emisión a pH neutro (con una relación prácticamente lineal entre pH 6 y 8), pero emite débilmente a pH ácido (Figura 90). 416 Para simplificar su nomenclatura, estas vesículas se abreviarán como CF⊃LUVs (por sus siglas en inglés: Large Unilamellar Vesicles). El fundamento del experimento en el que se utilizan estos liposomas se basa en el cambio que se produce en la intensidad de emisión de la fluoresceína en función del pH del medio (ver curva en Figura 90). A pH ligeramente ácido (pH intravesicular inicial de 5.8) la emisión será baja. No obstante, si se suspenden estas vesículas en una disolución extravesicular con un pH mayor (7.4 en este caso) y a continuación se añade un transportador capaz de propiciar la disipación del gradiente de pH, basificando el medio interno (ver mecanismos en verde, Figura 90), se observará un incremento en la fluorescencia de la CF con el tiempo. Para la preparación417 de las CF⊃LUVs, se utilizó la metodología de hidratación de films de lípidos. Para ello, una disolución de fosfolípido en disolvente orgánico (CHCl3 o EtOH) se evaporó lentamente a presión reducida (rotavapor) mientras estaba sujeta a una rotación continua, de tal manera que se formó una película fina en la superficie interna del matraz de fondo redondo en el que se lleva a cabo el proceso. En este caso, utilizamos el fosfolípido natural fosfatidilcolina, que se obtiene de la yema de huevo (abreviado como EYPC, del acrónimo de sus siglas en inglés: Egg Yolk Phospatidyl Choline) y cuyo componente mayoritario (>65%) es POPC. Tras eliminar las posibles trazas de disolvente orgánico mediante la aplicación de alto vacío durante varias horas, la película se rehidrató con la disolución intravesicular, que contenía CF (30 µM) y un tampón fosfato sódico (10 mM) a pH 5.8. Este proceso se llevó a cabo mediante la técnica conocida como tumbling, es decir, bajo rotación continua de la muestra. Tras este proceso, se aplicaron varios ciclos de congelacióndescongelación (freeze-thaw), sumergiendo secuencialmente la suspensión acuosa de lípido y fluoróforo en nitrógeno líquido y un baño a 40ºC. La finalidad de estos ciclos es la de transformar la mezcla de vesículas que se forman espontáneamente en vesículas unilamelares, que son las más adecuadas para este experimento. A continuación, se hizo pasar la dispersión de vesículas unilamelares a través de una membrana porosa con un orificio específico (extrusión), concretamente 100 nm en este caso, que permite homogeneizar el tamaño de la población de vesículas a ese diámetro concreto. Finalmente, la muestra se purificó mediante una cromatografía de exclusión por tamaños, cuya finalidad principal es retirar del medio todo el exceso de fluoróforo que no haya quedado atrapado en el seno de los liposomas. Por último, se recogió la fracción de CF⊃LUVs, tras su elución mediante buffer intravesicular sin fluoróforo, en un volumen conocido, de tal manera que se obtiene una dispersión de liposomas con una concentración aproximada de 6.6 mM de lípido. El protocolo del experimento en el fluorímetro consiste en dispersar una alícuota de la suspensión de CF⊃LUVs en la disolución tampón extravesicular (10 mM Na2HPO4, pH 7.4) en una cubeta de fluorescencia termostatizada a 24ºC y con agitación magnética. A continuación, se mide la emisión a 510 nm de la CF (λexc= 493 nm) en función del tiempo. A los 50 s desde el inicio del experimento se añaden alícuotas de las disoluciones de los diferentes transportadores en DMSO (concentraciones desde 10 mM hasta 10 µM). En todos los casos, el volumen de la disolución de DMSO añadida supuso el 1% del volumen total utilizado en el 416 S. Massou, Biochemical Education 2000, 28, 171-173 417 V. P. Torchilin, V.Weissig, Liposomes, Oxford University Press, 2003. Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos 151 experimento, por lo que la concentración del transportador en la cubeta (la que se indica en las figuras posteriores) es 100 veces menor a la de la disolución stock. Con esta pequeña porción, el efecto del disolvente orgánico añadido se limita a un incremento residual de en torno al 5% en la fluorescencia. Tras monitorizar el aumento de la fluorescencia con el tiempo, a los 400 s se añadió un detergente (TritonX-100) que rompe las membranas lipídicas liberando el contenido de las vesículas y basifica súbitamente el entorno de la CF, de tal manera que se puede tomar el valor de fluorescencia máximo tras este punto y utilizarlo para normalizar los datos. Además de las medidas con los transportadores, llevamos a cabo una serie de controles para comprobar si únicamente los alargadores desprotegidos (con la azida terminal) tenían alguna capacidad transportadora por sí solos, al igual que los CPs con alquinos, antes de realizar ninguna click sobre ellos (Figura 87). Figura 91. Resultados obtenidos para el transporte de H+/OH- (basificación de CF encapsulada en LUVs) mediante los transportadores tipo spanner (a la derecha se muestra una ampliación de la región 250-400 s). Las trazas acompañadas de un asterisco (*) indican la aparición de turbidez en la cubeta de 100 200 300 400 0.0 0.5 1.0 Alargador I Tiempo / s Fluorescencia normalizada CP2I 75 µM CP2I 50 µM CP2I 20 µM CP7I 100 µM CP7I 75 µM CP7I 50 µM CP10I 100 µM CP7I 20 µM CP10I 50 µM CP6I 100 µM CP6I 75 µM CP6I 20 µM CP6I 50 µM 100 200 300 400 0.0 0.5 1.0 Alargador S Tiempo / s Fluorescencia normalizada CP6S 100 µM CP6S 75 µM CP6S 50 µM CP6S 20 µM CP7S 100 µM CP7S 75 µM CP7S 50 µM CP7S 20 µM CP5S 100 µM CP5S 75 µM CP5S 50 µM CP5S 20 µM CP2S 100 µM* CP2S 75 µM* CP2S 50 µM CP2S 20 µM CP10S 100 µM CP10S 75 µM CP10S 50 µM CP10S 20 µM 100 200 300 400 0.0 0.5 1.0 Alargador L Tiempo / s Fluorescencia normalizada CP6L 100 µM CP6L 75 µM CP6L 50 µM CP6L 20 µM CP7L 100 µM* CP7L 75 µM* CP7L 50 µM CP7L 20 µM CP5L 100 µM* CP5L 75 µM* CP5L 50 µM CP5L 20 µM CP2L 100 µM* CP2L 75 µM* CP2L 50 µM CP2L 20 µM 250 300 350 400 0.0 0.2 0.4 0.6 Alargador L Tiempo / s Fluorescencia normalizada 300 350 400 0.0 0.2 0.4 0.6 Alargador S Tiempo / s Fluorescencia normalizada 250 300 350 400 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Alargador I Tiempo / s Fluorescencia normalizada Alberto Fuertes García 152 fluorescencia al término del experimento, causada por la baja solubilidad del transportador en el medio experimental. Figura 92. Controles del experimento de basificación de CF (añadidos como disolución en DMSO). En la parte derecha se muestra la ampliación de la región 250-400 s. Como se puede observar en la Figura 91, la capacidad de transporte de protones de estos compuestos es bastante limitada, ya que, si excluimos los compuestos que presentaron problemas de solubilidad a concentraciones altas (por ejemplo, para el caso de CP2S, donde se puede observar este fenómeno por la forma de las trazas y el ruido que presentan), en ningún caso se superó un 40% de actividad en el rango de µM medio-bajo, que supone una concentración relativamente elevada para este tipo de compuestos transportadores, si atendemos a ejemplos previos descritos en bibliografía.418,349 Además, en el experimento control con la cadena más larga (Figura 92) se pudo observar que esta presenta una ligera actividad, por lo que, en contexto, los resultados de la primera serie serían aún más modestos. En cuanto a las tendencias generales, se observa que un gran nivel de sustitución (3 o 4 cadenas de etilenglicol en los derivados de CP5 y CP11 respectivamente) no es favorable para el transporte, como indican la baja actividad de las trazas en tonos verdes y naranjas de las gráficas de la Figura 91. Para las series de S e I, los compuestos más activos (excluyendo CP2S por su solubilidad limitada que puede dar lugar a artefactos en las medidas) son los derivados de CP7, que tienen dos cadenas unidas. Para el caso de L, la mejor actividad la presenta CP6L, con únicamente una cadena. El hecho de que un grado de funcionalización menor del anillo ciclopeptídico funcione mejor con el PEG grande, mientras que con alargadores más cortos se requiera el doble de cadenas ancladas podría indicar que la cantidad neta de unidades de etilenglicol tiene un papel más relevante que el número de cadenas en sí. No obstante, como ya se ha comentado con anterioridad, el exceso de grupos etilenglicol parece restringir la capacidad transportadora si hay muchas cadenas, muy probablemente debido a su baja solubilidad en el medio lipófilo de la membrana. Desafortunadamente a pesar de que las cadenas de PEG se supone que incrementan la solubilidad de este tipo de moléculas con núcleos muy apolares en medios acuosos, en nuestro caso no ha sido así con alguno de los transportadores, y por ello 418 R. Li, O. V. Kulikov, G. W. Gokel, Chem. Commun. 2009, 6092-6094. P. K. Eggers, T. M. Fyles, K. D. D. Mitchel, T. Sutherland, J. Org. Chem. 2003, 68, 1050-1058. J. K. W. Chui, T. M. Fyles, Org. Biomol. Chem. 2014, 12 , 3622-3634. 349 P. Gale, J. Davies, R. Quesada, Chem. Soc. Rev. 2017, 46, 2497-2519. 100 200 300 400100 200 300 400 0.0 0.5 1.0 Controles Tiempo / s Fluorescencia normalizada L 100 µM CP5 100 µM CP2 100 µM CP10 100 µM DMSO CP7 100 µM S 100 µM 300 350 400 0.0 0.1 0.2 0.3 Controles Tiempo / s Fluorescencia normalizada Nuevos transportadores de membrana basados en α,γ-ciclopéptidos 153 sacar conclusiones claras para todas las series no ha sido posible. En cuanto a la influencia del tamaño del anillo, parece que los ciclohexapéptidos se comportan mejor que los ciclooctapéptidos, posiblemente debido a la solubilidad de CP2S y CP2L. Estos muestran actividades similares a concentraciones altas a los transportadores CP6L y CP7S, pero el hecho de que al acabar el experimento se observe una considerable turbidez en la cubeta de fluorescencia nos hace tomarnos estos resultados con un cierto escepticismo. Para caracterizar en detalle las aptitudes transportadoras este tipo de sistemas, generalmente se recurre a la representación de curvas de dosis-respuesta410 que se pueden ajustar a la ecuación de Hill (Ec. 6).419 Esta permite obtener parámetros como el coeficiente de Hill (n), que ofrece información sobre la estequiometría (o cooperatividad) de la especie transportadora, o la EC50, que se corresponde con la concentración a la cual el transportador desempeña el 50% de su actividad máxima (Ymax).420 Dados los modestos resultados obtenidos para estos sistemas, únicamente llevamos a cabo este análisis en profundidad para la molécula CP7S, con un estudio detallado en un rango de concentraciones mayor para ajustar de manera realista a la ecuación de Hill, mientras que para el resto de los transportadores se realizó una estimación usando el valor del control de DMSO (6%) como transporte mínimo (Y0). Los datos aproximados se presentan en la Figura 93, en donde se representa el % de transporte a 395 s (Y395) frente a la concentración de la muestra. 𝑌 =𝑌0+(𝑌𝑚𝑎𝑥 −𝑌0) [1+(𝐸𝐶50 𝑐)𝑛] (6) Figura 93. Curvas de dosis respuesta que permiten estimar los parámetros de la Ec de Hill (Ec. 6) para cada transportador (a la derecha se muestra la ampliación del gráfico de la izquierda). 419 A. V. Hill, Biochem. J. 1913, 7, 471-480. 410 S. Matile, N. Sakai, “The Characterization of Synthetic Ion Channels and Pores.” En Analytical Methods in Supramolecular Chemistry; Ed. Schalley, C. A.; C. A. Wiley, Weinheim, 2007, 391-418. 420 S. Matile, A. V. Jentzsch, J. Montenegro, A. Fin, Chem. Soc. Rev. 2011, 40, 2453-2474. 0.000001 0.00001 0.0001 0.001 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 Curvas Dosis-Respuesta Concentración (M) Fluorescencia normalizada CP7S CP6L CP6S CP6I CP7L* CP7I CP5L* CP5S CP2L* CP2S* CP2I CP10S CP10I 0.00001 0.0001 0.2 0.4 0.6 Curvas Dosis-Respuesta Concentración (M) Fluorescencia normalizada Alberto Fuertes García 256 c-[(D-Leu-MeN-L-γ-Acp-D-Leu-propN-L-γ-Acp-)2] (CP2). A solution of linear octapeptide oct2,3 (0.186 g, 0.16 mmol) in a mixture MeOH/H2O (3:1, 3.2 mL) was treated with LiOH (0.020 g, 0.82 mmol). After stirring for 1 h at r.t., the MeOH was removed on the rotary evaporator and the resulting solution was acidified with an aqueous solution of HCl (5%) to pH 2. This solution was extracted with CH2Cl2 (4x10 mL) y and the combined organic extracts were dried, filtered and concentrated in vacuo. The resulting foam was dissolved in a mixture of CH2Cl2 (1.5 mL) and TFA (1.5 mL) and stirred for 15 min. The solution was concentrated, and the residue was dissolved in CH2Cl2 and concentrated (3 times). It was further dried under high vacuum for 3 h. This residue was suspended in dry CH2Cl2 (50 mL) and DIEA (0.16 mL, 0.30 mmol) and N-TBTU (0.096 g, 0.30 mmol) were added. This mixture was left to stir during 15 h and additional DIEA (0.16 mL, 0.30 mmol) and N-TBTU (0.036 g, 0.12 mmol) were added. After 6 h, the solution was washed with aqueous solutions of HCl (5%, 2x10 mL) and NaHCO3 (2x10 mL). The organic phase was dried over anh. Mg2SO4, filtered and concentrated. The residue was purified by flash chromatography (0-4% MeOH/CH2Cl2) to give the CP2 as a white solid [0.099 g; 60%; Rf = 0.47 (5% MeOH/CH2Cl2)]. 1H RMN (CDCl3, 500 MHz, δ): 8.35 (d, J = 9.5 Hz, 1.2 H), 8.26 (d, J = 9.5 Hz, 0.8 H), 8.20 (d, J = 9.5 Hz, 0.9 H), 8.14 (d, J = 9.5 Hz, 1.1 H), 5.10 (m, 4H), 4.80 - 4.55 (m, 6H), 3.82 (td, J = 13.7 and J = 2.2 Hz), 3.08 (m and 2s, 10H), 2.21 (t, J = 2.4 Hz, 2H), 2.12 – 1.38 (m, 36H) 0.95 - 0.78 (m, 24H). 13C RMN (CDCl3, 125 MHz, δ): 175.4 (C), 174.7(C), 174.1(C), 173.3 (C), 80.2 (C), 72.5 (C), 55.4 (CH), 54.6 (CH), 47.0 (CH), 46.9 (CH), 43.3 (CH), 42.2 (CH), 41.5 (CH2), 34.3 (CH2), 32.6 (CH2), 31.4 (CH2), 29.4 (CH2), 28.3 (CH2), 28.2 (CH3), 28.0 (CH2), 27.7(CH2), 26.9 (CH2), 26.7 (CH), 24.8 (CH), 23.5 (CH3), 22.1 (CH3). FT-IR (293 K, CHCl3) 3308 (amide A), 1673, 1632 (amide I), 1540 (amide II) cm-1. HRMS (ESI) Calculated for C56H89N8O8: 1001.6798, found: 1001.6794. CP3. Both cyclic peptides CP2 (6.0 mg, 0.006 mmol) and CP1 (4.3 mg, 0.007 mmol) were dissolved in freshly distilled and degassed (Ar flow, 20 min) CH2Cl2 (6 mL) and then solutions of DIEA (65 μL, 0.285 M), TBTA (64 μL, 0.005 M) and [Cu(MeCN)4PF6] (64 μL, 0.012 M) in freshly distilled and degassed CH2Cl2 were added. The resulting mixture was stirred overnight under Ar atmosphere. The resulting turbid solution was concentrated under reduced pressure and re-suspended in a 10% MeOH/CHCl3 mixture. This solution was filtered, and the filtrate was purified by semi-preparative normal-phase HPLC (5-8% MeOH/CH2Cl2 over 30 min) to give the adduct product as a white solid [4.8 mg, 48%, tR = 15 min]. 1H RMN (CDCl3, 500 MHz, δ): 8.38 (d, J = 9.0 Hz, 1.45 H), 8.32 (d, J = 9.3 Hz, 0.45), 8.21 (d, J = 8.7 Hz, 0.55H), 8.17 (d, J = 8.8 Hz, 1.55H), 8.02 - 7.89 (2s, 2H), 6.60 (brm, 0.55H), 6.37 (brs, 1.55H) 5.35 - 5.21 (m, 2H), 5.19 - 5.06 (m, 2H), 4.87 - 4.53 (m, 14H), 4.45 - 4.22 (m, 2H), 3.62 - 3.49 (m, 2H), 3.32 -2.64 (m, 22H), 2.31 - 1.08 (m, 58H), 1.03 - 0.83 (m, 36H). FT-IR (293 K, CHCl3) 3304 (amide A), 1679, 1620 (amide I), 1531 (amide II) cm-1. HRMS (ESI) Calculated for C86H139N18O12: 1616.0811, found: 1616.0814. Experimental section 257 c-[(D-Phe-L-MeN-Ach-)4] (CP4). This CP was prepared following a protocol previously described in our group.491 1H RMN (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.57 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.24 - 7.12 (m, 20H), 5.36 - 5.29 (m, 4H), 4.50 - 4.42 (m, 4H), 3.04 (m, 4H), 2.96 - 2.89 (m, 4H), 2.85 - 2.77 (m, 4H), 2.66 (s, 12H), 1.90 - 0.79 (m, 24H). Heterodimer of c-[(D-Phe-L-MeN-Ach)4] (CP4) with CP3 (D3- 4). To an NMR tube containing a solution of CP4 (4.5 mg, 2.78·10³ mmol) in CDCl3 (400 μL) portions of a stock solution of CP4491 (7.3 mg, 6.38·10³ mmol) in CDCl3 (230 μL) were successive added. Hence, samples containing a ratio of 0.25, 0.5, 0.75 and 1.0 equivalents of CP4 to CP3 were prepared in the same experimental run. In case of any excess CP4 being added, it was possible to purify the mixture to separate the heterodimer to the excess of any cyclic octapeptide by normal-phase HPLC ( 3-7.5% MeOH/CH2Cl2 over 30 min, tR = 24 min for the D3-4 and tR = 20 min for CP3). 1H RMN (5% MeOH d3/CDCl3, 500 MHz, δ): 8.64 - 8.57 (m, 4H), 8.47 - 8.42 (m, 4H), 7.85 (s, 2H), 7.18 - 7.00 (m, 20H), 6.58 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.34 - 4.96 (m, 8H), 4.92 - 4.69 (m, 4H), 4.69 - 4.44 (m, 8H), 4.37 - 4.19 (m, 8H), 0.89 - 0.77 (m, 36H). FT-IR (293 K, CHCl3): 3298 (amide A) 1669, 1618 (amide I), 1530 (amide II) cm-1. HRMS (ESI) Calculated for C182H223N16O8: 2760.7529, found 2760.7535. 491 M. Amorín, L. Castedo, J. R. Granja Chem.–Eur. J. 2005, 11, 6543-6551. Alberto Fuertes García 258 1.2. Determination of the enantiopurity of compound 1 by chiral HPLC After the enantiomeric resolution of 1 with (R)-1-phenylethanamine (3 to 4 crystallizations), a solution of i.e., 5 mg in a mixture of hexane:iPrOH (1 mL, 9:1) was analyzed by quiral HPLC using an isocratic method of 3% iPrOH/hexane at 1 mL/min for 30 minutes. The e.e. was determined comparing the areas of the peaks at 15.7 minutes (L enantiomer) and 13 minutes (R enantiomer) by the following formula: 𝑒.𝑒.= 𝐴𝑟𝑒𝑎𝐿−𝐴𝑟𝑒𝑎𝐷 𝐴𝑟𝑒𝑎𝐿+𝐴𝑟𝑒𝑎𝐷 (10) Figure 1. Chromatograms resulting from quiral HPLC analysis of enantioenriched fractions of 1. From top to bottom: reference sample containing a mixture of both enantiomers, slightly enriched in L; enantiopure L sample used for further peptide synthesis showing 99% e.e.; enantiopure D fraction. Experimental section 259 1.3. NMR dimerization analysis Different samples containing solutions of CP1 in CDCl3 were prepared at concentrations ranging from 1 to 40 mM. For each sample, 1H NMR spectra were recorded at various temperatures; from -40 to +40 ⁰C (ΔT = 20 ⁰C). For each set of temperatures, the chemical shift of the NH protons (6.2 to 7.3 ppm) was accurately determined using the chemical shift of CHCl3 (7.26 ppm) as reference and plotted versus the concentration of the sample (see Figura 75). Figure 2. Variable concentration NMR analysis of CP1 in CDCl3 at 293 K. From top to bottom: 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM. Alberto Fuertes García 260 1.4. ΔT 1H NMR experiments on CP3/NT3 Figure 3. Variations on the 1H NMR spectra upon the modification of the temperature at which they are recorded. 1.5. DOSY experiments The samples were prepared by dissolving previously purified (HPLC) CPs in either pure CDCl3 or a 1% MeOH d3 solution in CDCl3, a solvent system which allowed the disruption of high molecular weight aggregates in certain samples without having a remarkable influence on the viscosity of the medium, which is a critical factor in this technique. Also, due to our interest in quantifying apparent diffusion radii, the samples included tetrakis(trimethylsilyl)silane (TMSS) as internal standard. The concentration of TMSS was different for each sample, but a constant ratio of [TMSS] = 1.2 [Sample] was maintained throughout the whole study. We found this ratio to be optimal in terms of TMSS signal’s decay in the experiments as long as, due to its small size, its decay is much more accused along the gradient as compared to the larger peptide adducts that are object of this study. Also, we considered that the peptides and the internal standard have independent diffusion rates, as no interactions were observed in NOESY experiments. DOSY NMR. Each sample was measured twice or three times in order to check the reproducibility of the measurement and to obtain an average of the diffusion data used to determine hydrodynamic radii. Experimental section 261 For each sample, a certain peak in the 1H NMR spectra was used in order to obtain the ratio between the observed diffusion of TMSS and the target supramolecular assemblies. The selection of the signal was not arbitrary but chosen to ensure the highest signal-to-noise ratio, in order to avoid incorrect weightings. For each system the selected signals were as follows: a) TMSS (constant throughout all experiments): Singlet at 0.22 ppm. b) D3 (both in CDCl3 and 1% MeOH d3/CDCl3): Singlet at 3.13 ppm (N-Me of CP3). c) Heterodimers D3-4 (all stoichiometries): Singlet at 3.06 ppm (N-Me of CP3). In these systems the rate of equilibration is higher than the time scale of the diffusion experiments, thus, a single horizontal row (Diffusion scale) is observed for the supramolecular systems, which is a weighted average of the individual contributions of monomer, dimers, trimers, etc. that are present in solution (Figura 81). In order to analyze the diffusion data, we decided to consider the protocol established by Maccioni et al..394 In this direction, we first considered an approximation to the Einstein-Stokes equation 3, in which two correction factors are included to the original expression; cs which responds to the fact that these aggregates do not present an apparent rh larger than 20 Å and also the fs factor, which accounts for the asymmetry in the shape of some of the tubular aggregates. Hence, in our case: • cs= 5.85, estimating an average size of 10-15 Å and following Chen plots.395 • fs= 1.00 for D4, D3 (1.4 mM to 2.6 mM) and D3-4 1:1 and 1:2; 1.05 for D3 (3.5 mM) and D3-4 1:3, considering a prolate (cylinder-like) aggregate is being formed.396 Both these factors are known for TMSS, thus it is possible to establish a relationship (Eq. 5) between the apparent diffusion of TMSS and that of the sample as follows, that allows the obtention the parameter of interest rsample: 𝐷𝑡=𝑘𝑇 𝑐(𝑟𝑠𝑜𝑙,𝑟ℎ)𝑓𝑠(𝑎,𝑏)𝜋𝜂𝑟ℎ (𝟒) → 𝐷𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 𝐷𝑇𝑀𝑆𝑆 =𝑐(𝑇𝑀𝑆𝑆)𝑓𝑠(𝑇𝑀𝑆𝑆)𝑟𝑇𝑀𝑆𝑆 𝑐(𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒)𝑓𝑠(𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒)𝑟𝑠𝑎𝑚𝑝𝑙𝑒 (𝟓) Alberto Fuertes García 262 Chapter II 2.1. Synthesis and characterization Boc-(D-Leu-propN-L-Acp)2-OMe (tet3). A solution of dip3 (1.11 g, 2.83 mmol) in MeOH/H2O (Vt = 20 mL, 4:1) was treated with LiOH (340 mg, 14.1 mmol) and stirred for 1 h. After this time, MeOH was concentrated under reduced pressure and the resulting solution was acidified until pH 2 (HCl 5% aq.) and extracted with CH2Cl2 (4x15 mL). The combined organic layers were dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure to give Boc-D-Leu-propN-L- Acp-OH as a white foam. Parallelly, a different fraction of dip3 (550 mg, 1.40 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (10 mL) and treated with TFA (4 mL). After stirring for 15 min, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting oil was redissolved in CH2Cl2 and further evaporated, repeating this process up to three times. The free-acid fraction (533 mg, 1.40 mmol) was dissolved in dry CH2Cl2 (5 mL) and subsequently DIEA (0.49 mL, 2.80 mmol) and N- HBTU (634 mg, 1.75 mmol) were added. The TFA salt was dissolved in dry CH2Cl2 (5 mL) and DIEA was added (0.98 mL, 5.60 mmol). Finally, both fractions were mixed and reacted under Ar for 2 h. This solution was washed with HCl 5% (2x15 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x15 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure. The crude mixture was purified by flash column chromatography (25-50% AcOEt/hexane). To give the title compound as a foam. [897 mg, 97%, Rf = 0.30 (50% AcOEt/hexane)]. MS (ESI) [m/z (%)]: 657 (100), 476 (75), 679 (35). HRMS (ESI) Calculated for C36H57N4O7: 657.4222; found: 657.4222. Boc-(D-Leu-propN-L-Acp)3-OMe (hex3). Tet3 (692 mg, 1.05 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (5 mL) and treated with TFA (5 mL). After stirring for 15 min, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting oil was redissolved in CH2Cl2 and further evaporated, repeating this process thrice. Free-acid Boc-D-Leu-propN-L-Acp-OH obtained in the previous step was dissolved in dry CH2Cl2 (5 mL) and then DIEA (0.37 mL, 2.10 mmol) and N-HBTU (478 mg, 1.26 mmol) were added. The TFA salt was dissolved in dry CH2Cl2 (10 mL) and DIEA was added (0.73 mL, 4.20 mmol). Finally, both fractions were mixed and reacted under Ar for 2 h. This solution was washed with HCl 5% (2x15 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x15 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated in vacuo. The crude mixture was purified by flash column chromatography (0-4 % MeOH/CH2Cl2), to give the linear hexapeptide as a foam. [874 mg, 91%, Rf = 0.42 (5% MeOH/CH2Cl2)]. HRMS (ESI) Calculated for C51H79N6O9: 919.5903; found: 919.5904. Boc-(D-Leu-MeN-L-Acp)2-D-Leu-propN-L-Acp-OMe (hex2,2,3). Tet2,3 (90 mg, 0.13 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (1.3 mL) and treated with TFA (1.3 mL). After stirring for 15 min, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting oil was redissolved in CH2Cl2 and further evaporated, repeating this process up to Experimental section 263 three times. Free-acid Boc-D-Leu-MeN-L-Acp-OH (49 mg, 0.13 mmol) obtained previously was dissolved in dry CH2Cl2 (3 mL) and subsequently DIEA (45 µL, 0.26 mmol) and N-HBTU (61 mg, 0.16 mmol) were added. The TFA salt was dissolved in dry CH2Cl2 (3 mL) and DIEA was added (90 µL, 0.52 mmol). Finally, both fractions were mixed and reacted under Ar for 2 h. This solution was washed with HCl 5% (2x5 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x5 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated. The crude mixture was purified by flash column chromatography (0-4 % MeOH/CH2Cl2), to give the linear hexapeptide as a foam. [95 mg, 81%, Rf = 0.42 (5% MeOH/CH2Cl2)]. MS (ESI) [m/z (%)]: 894 ([100), 871 (85), 420 (65) .HRMS (ESI) Calculated for C47H78N6NaO9: 893.5722; found: 893.5730. Boc-D-Leu-propN-L-Acp-D-Leu-MeN-L-Acp-D-Leu-propN-L-Acp- OMe (hex3,2,3). Tet2 (92 mg, 015 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (1.3 mL) and treated with TFA (1.3 mL). After stirring for 15 min, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting oil was redissolved in CH2Cl2 and further evaporated, repeating this process up to three times. Free-acid Boc-D-Leu-propN-L-Acp-OH (55 mg, 0.15 mmol) obtained previously was dissolved in dry CH2Cl2 (3.5 mL) and subsequently DIEA (50 µL, 0.28 mmol) and N-HBTU (65 mg, 0.17 mmol) were added. The TFA salt was dissolved in dry CH2Cl2 (3 mL) and treated with DIEA (150 µL, 0.52 mmol). Finally, both fractions were stirred together under Ar for 2 h. The resulting solution was washed with HCl 5% (2x5 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x5 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under vacuum. The crude mixture was purified by flash column chromatography (0-4 % MeOH/CH2Cl2), to give the linear hexapeptide as a foam. [105 mg, 80%, Rf = 0.37 (5% MeOH/CH2Cl2)]. MS (ESI) [m/z (%)]: 918 (100), 896 (55), 420 (40). HRMS (ESI) Calculated for C49H78N6NaO9: 917.5722; found: 917.5717. c-[(D-Leu-propN-L-Acp)3] (CP5). To a solution of hex3 (804 mg, 0.876 mmol) in MeOH/H2O (Vt = 8.7 mL, 3:1), LiOH (63.0 mg, 2.63 mmol) was added and the resulting mixture was stirred for 2 h. Then, the organic solvent was concentrated under reduced pressure and the remaining aqueous solution was acidified until pH 2 (HCl 5% aq.), extracted with CH2Cl2 (4x10 mL), dried with anh. Mg2SO4 and filtered. After solvent evaporation, the free acid was obtained as a white foam. This foam was further dissolved in CH2Cl2 (4 mL) and treated with TFA (4 mL). After stirring for 15 min, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting oil was redissolved in CH2Cl2 and successively evaporated (3x). This residue was dissolved in dry CH2Cl2 (876 mL; 2 mM) and then DIEA (0.92 mL, 5.26 mmol) and N-TBTU (338 mg, 1.05 mmol) were added. After 16 h of stirring under Ar, this solution was concentrated to i.e., one tenth of its initial volume and washed with HCl 5% (2x10 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x10 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated by rotary-evaporation. The crude mixture was purified by flash column chromatography (0-4 % MeOH/CH2Cl2). To give the desired cyclic peptide as a white solid. [341 mg, 49%, Rf = 0.35 (5% MeOH/CH2Cl2)].1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.11 (d, J = 9.5 Hz, 3 H), 5.10 (m, 3H), 4.80 (AB, J = 20.1 Hz, 3H), 4.66 Alberto Fuertes García 264 (m, 3H), 3.82 (AB, J = 20.1 Hz, 3H), 2.86 (m, 3H), 2.27 (s, 3H), 2.21 - 1.28 (m, 27H), 0.94- 0.84 ppm (overlapped 2d, 18H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, δ): 175.7 (C), 173.6 (C), 80.2 (C), 72.4 (CH), 54.9 (CH), 47.2 (CH), 41.4 (CH), 41.4 (CH2), 35.9 (CH2), 32.7 (CH2), 27.7 (CH2), 27.5 (CH2), 24.6 (CH), 23.3 (CH3), 22.0 ppm (CH3). FTIR (CaF2): ν = 3301 (amide A), 1665, 1620 (amide I), 1533 cm-1 (amide II). MS (ESI) [m/z (%)]: 809 (100), 787 (70). HRMS (ESI) Calculated for C45H67N6O6: 787.5117; found: 787.5116. c-[(D-Leu-MeN-L-Acp)2-D-Leu-propN-L-Acp] (CP6). Hex2,2,3 (100 mg, 0.12 mmol) was dissolved in a MeOH/H2O mixture (3:1, Vt = 2.3 mL) and then LiOH (13 mg, 0.57 mmol) was added. The mixture was stirred for 1h and, later, MeOH was evaporated under vacuum. The resulting aqueous layer was acidified until reaching pH 2, causing the precipitation of a white viscous product, which was extracted with CH2Cl2 (4x5 mL). The combined organic extracts were dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure. The resulting free-acid white film was dissolved in a mixture of CH2Cl2/TFA (1:1, Vt = 1.5 mL) and stirred for 15 minutes, to be then rotary-evaporated in order to remove all traces of TFA. After deprotecting the N-terminus of the linear peptide, the residue was dissolved in dry CH2Cl2 (108 mL) and treated with DIEA (110 µL, 0.65 mmol) and N-TBTU (52 mg, 0.16 mmol). The mixture was stirred overnight under Ar and after that time, the volume was reduced until 10 mL and washed with 5% HCl (2x10 mL) and saturated aqueous NaHCO3 (2x10 mL). After drying with Mg2SO4, filtering and concentrating, the crude was purified by SiO2 flash column chromatography (1-10% MeOH/CH2Cl2) to give the title compound as white solid. [35 mg, 42%, Rf = 0.25 (5% MeOH/CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.37 - 7.97 (m, 3H), 5.37 - 4.97 (m, 3H), 4.97 - 4.56 (m, 4H), 4.12 - 3.65 (m, 1H), 3.08 (s, 6H), 3.04 - 2.75 (m, 3H), 2.44 - 2.17 (s and m, 4H), 2.17 - 1.29 (m, 24H), 1.12 - 0.75 (m, 18H). FTIR (neat): ν = 3301 (amide A), 1670, 1620 (amide I), 1531 cm-1 (amide II). HRMS (ESI) Calculated for C41H67N6O6: 739.5117; found: 739.5112. c-[(D-Leu-propN-L-Acp)2-D-Leu-MeN-L-Acp] (CP7). To a solution of hex3,2,3 (105 mg, 0.12 mmol) in MeOH/H2O (3:1, Vt = 2.4 mL), LiOH (14.0 mg, 0.59 mmol) was added and the resulting mixture was stirred for 2 h. Then, the organic solvent was concentrated under reduced pressure and the resulting solution was acidified until pH 2 (HCl 5% aq.) and extracted with CH2Cl2 (4x10 mL), dried with anh. Mg2SO4 and filtered. After solvent evaporation, the free acid was obtained as a white foam. This foam was dissolved in CH2Cl2 (1 mL) and treated with TFA (1 mL). After stirring for 15 min, the solvent was removed under reduced pressure and the resulting oil was redissolved in CH2Cl2 and successively evaporated (three repetitions in total). The TFA salt was dissolved in dry CH2Cl2 (117 mL) and then DIEA (120 µL, 0.7 mmol) and N-TBTU (56 mg, 0.18 mmol) were added. After 13 h stirring under Ar, this solution was concentrated up to 20 mL and washed with HCl 5% (2x10 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x10 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated by rotary-evaporation. The crude mixture was purified by flash column chromatography (0-5% MeOH/CH2Cl2) to give the desired cyclic peptide as a white solid. [43 Experimental section 265 mg, 48%, Rf = 0.33 (5% MeOH/CH2Cl2)].1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.31 - 8.06 (m, 3H), 5.26 - 5.07 (m, 3H), 4.88 - 4.60 (m, 5H), 3.85 (2s, 2H), 3.07 (m, 3H), 2.89 (m, 3H), 2.27 (2s, 2H), 2.25 - 1.32 (m, 27H), 1.03 - 0.86 (m, 18H). FTIR (neat): ν = 3306 (amide A), 1663, 1626 (amide I), 1531 cm-1 (amide II). MS (ESI) [m/z (%)]: 763 (100), 785 (90). HRMS (ESI) Calculated for C43H67N6O6: 763.5117; found: 763.5103. c-(D-Leu-propN-L-Acp)4 (CP11). Tet3 (210 mg, 0.32 mmol) was dissolved in MeOH (2.4 mL) and water (0.8 mL) and then LiOH (38 mg, 1.6 mmol) was added. After stirring for 2h, the organic solvent was evaporated, and the remaining aqueous layer was acidified until pH 2 with HCl. The resulting white precipitate was extracted with CH2Cl2 (4x5 mL), dried, filtered and concentrated. Free acid was further deprotected by a solution of TFA/CH2Cl2 (1:1, Vt = 3.5 mL), in which the product was stirred for 15 min. After completion of the reaction, TFA was removed using the typical protocol (vide supra). For the cyclization step, the oil obtained in the previous step was dissolved in dry CH2Cl2 (85 mL) and treated with DIEA (170 µL, 1 mmol) and N-TBTU (164 mg, 0.51 mmol). The mixture was stirred under Ar for 18 h and then washed with 5% HCl (2x15 mL) and sat. aq. NaHCO3 (2x15 mL). The organic layer was dried with Mg2SO4, filtered and concentrated. The crude was purified by semipreparative HPLC (2-5% MeOH/CH2Cl2 in 30 min) to give the compound as white solid.492 (22 mg, 13%, tR=8 minutes). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.24 (d, J = 9.5 Hz, 4H), 5.24 - 5.10 (m, 4H), 4.78 - 4.58 (m, 8H), 3.89 (dd, J = 19.3, 2.0 Hz, 4H), 3.07 - 2.91 (m, 4H), 2.30 - 2.24 (m, 4H), 1.96 - 1.47 (m, 36H), 0.95 (d, J = 6.2 Hz, 24H). FTIR (CaF2): ν = 3307 (amide A), 1628 (amide I), 1536 cm-1 (amide II). HRMS (ESI) Calculated for C60H89N8O8: 1049.6798 763.5117; found: 1049.6810. c-[(D-Leu-py-oN-L-Acp)3] (CP5a). CP5 (30.0 mg, 0.0382 mmol), 2-iodopyridine (37 μL, 0.344 mmol) and CuI (2.2 mg, 1.15·10-3 mmol) were dissolved in a THF/Et3N mixture (Vt = 3.8 mL, 4:1) and degassed for 15 min with a steady Ar bubbling. After this time, Pd(PPh3)2Cl2 (4.0 mg, 5.73·10-3 mmol) was added and the mixture was stirred under Ar for 12 h. The solvent was evaporated, and the resulting mixture was dissolved in CH2Cl2 (5 mL) and washed with sat. aq. NH4Cl (2 x 5 ml). The organic layer was dried over anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure. Finally, the crude mixture was purified by flash column chromatography (0-10% MeOH/CH2Cl2), which afforded the title compound as a slightly yellowish solid. [17.0 mg, 44%, Rf = 0.27 (10% MeOH/CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.58 (d, J = 4.4 Hz, 3H), 8.26 (d, J = 9.4 Hz, 3H), 7.64 (t, J = 6.4 Hz, 3H), 7.38 (d, J = 7.7 Hz, 3H), 7.23 (t, J = 5.0 Hz, 3H), 5.28 (m, 3H), 5.13 (AB, J = 19.0 Hz, 3H), 4.79 (m, 3H), 4.12 (AB, J = 19.0 Hz, 3H), 2.95 (m, 3H), 2.36-1.32 (m, 27H), 1.02 - 0.78 ppm (m, 18H). 13C NMR (CDCl3, 75.4 MHz, δ): 175.7 (CO), 173.9 (CO), 150.1 (CH), 142.7 (C), 136.1 (CH), 127.0 (CH), 123.0 (CH), 85.8 (C), 83.6 (C), 55.0 (CH), 47.6 (CH), 42.0 492 The reaction also provided the compound c-[(D-Leu-propN-L-Acp)2] as main product (26%), which presented a Rf value similar to the octameric product, which made them very difficult to separate by regular flash column chromatography. Alberto Fuertes García 272 (amide A), 1748, 1702, 1664, 1626 (amide I), 1532 cm-1 (amide II). HRMS (ESI) calculated for C96H163N18O26: 1984.1980, found: 1984.1982. (Boc)-CP2I. CP2 (8.0 mg, 8 ·10-3 mmol) and 15 were reacted as usual to give the title compound as transparent oil. (14.3 mg, 86%).1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.56 - 8.29 (m, 4H), 7.66 (s, 2H), 7.46 (d, J = 7.6 Hz, 11H), 7.35 - 7.11 (m, 21H), 5.36 - 5.08 (m, 4H), 5.08 - 4.65 (m, 6H), 4.59 - 4.34 (m, 6H), 3.98 - 3.24 (m, 88H), 3.21 - 2.87 (m, 10H), 2.45 - 2.24 (m, 8H), 2.19 - 1.18 (m, 32H), 1.08 - 0.84 (m, 12H), 0.84 - 0.69 (m, 6H), 0.69 - 0.50 (m, 6H). FTIR (neat): ν = 3303 (amide A), 1744, 1702, 1668, 1628 (amide I), 1532 cm-1 (amide II). HRMS (ESI) calculated for C92H160N18O22: 934.5972, found: 934.5970 (half peak). (Boc)-CP11S. CP11 (10.0 mg, 10 ·10-3 mmol) and 12 were clicked by means of the protocol. (17.2 mg, 57%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.43 - 8.32 (m, 4H), 7.68 (s, 4H), 7.30 - 7.26 (m, 4H), 5.35 - 5.09 (m, 8H), 5.09 - 4.92 (m, 4H), 4.86 - 4.70 (m, 4H), 4.53 - 4.36 (m, 12H), 4.25 - 4.09 (m, 16H), 3.99 (s, 8H), 3.77 - 3.45 (m, 56H), 3.31 (m, 8H), 3.18 - 2.94 (m, 4H), 2.38 - 1.19 (m, 80H), 0.77 (d, J = 6.4 Hz, 12H), 0.67 - 0.54 (m, 12H). 13C NMR (CDCl3, 75.4 MHz, δ):495 175.5 (C), 174.5 (C), 170.2 (C), 170.0 (C), 156.0 (C), 145.1 (C), 121.3 (CH), 79.2 (C), 70.9 (CH2), 70.9 (CH2), 70.5 (CH2), 70.4 (CH2), 70.2 (CH2), 70.0 (CH2), 68.3 (CH2), 61.2 (CH2), 55.7 (CH), 47.5 (CH), 47.0 (CH2), 42.0 (CH2), 41.3 (CH), 40.4 (CH2), 38.6 (CH2), 29.7 (CH2), 29.5 (CH2), 28.4 (CH3), 24.4 (CH), 23.4 (CH3), 21.3 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C140H236N28Na2O44: 1530.3437, found: 1530.3432. Experimental section 273 (Boc)-CP11I. CP11 (9.0 mg, 8.5 ·10-3 mmol) and 15 were clicked by means of the protocol. (14 mg, 52%). HRMS (ESI) calculated for C152H260N28Na2O44: 1613.9376, found: 1613.9377. General procedure for terminal amine deprotection (Boc and Trt protecting groups cleavage) of click derivatives PEG-CPs. A solution of the corresponding substrate in a mixture of TFA and CH2Cl2 (1:1, 0.05M) was stirred for 30 min at r.t., followed by solvent evaporation via the typical TFA removal protocol (vide supra). Protonated primary-amine products were dissolved in the appropriate amount of DMSO without further treatment and their transporting properties were tested by means of fluorescence transport assays described later in this manuscript (Section 2.2). Boc-(D-Leu-py-oN-L-Acp)-OMe (dip3a). dip3 (40.0 mg, 0.1 mmol), 2-iodopyridine (32 μL, 0.3 mmol) and CuI (3.0 mg, 0.015 mmol) were dissolved in a THF/Et3N mixture (Vt = 5 mL, 4:1) and degassed for 15 min with Ar flow. After this time, Pd(PPh3)2Cl2 (4.0 mg, 5.73·10-3 mmol) was added and the mixture was stirred under Ar for 12 h at 50 ºC. The solvent was evaporated, and the resulting mixture was dissolved in CH2Cl2 (5 mL) and washed with sat. aq. NH4Cl (2 x 5 ml). The organic layer was dried over anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure. Finally, the crude mixture was purified by flash column chromatography (25-100% AcOEt/hexane), which afforded the title compound as transparent oil. [41.4 mg, 87%, Rf = 0.27 (50% AcOEt/hexane)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.62 - 8.51 (m, 1H), 7.74 - 7.59 (m, 1H), 7.52 - 7.36 (m, 1H), 7.32 - 7.17 (m, 1H), 5.39 - 5.27 (m, 0.5H), 5.15 (d, J = 9.2 Hz, 0.5H), 5.00 - 4.63 (m, 2H), 4.48 - 4.14 (m, 2H), 3.78 - 3.63 (m, 3H), 2.94 - 2.77 (m, 1H), 2.39 - 1.53 (m, 9H), 1.53 - 1.37 (m, 9H), 1.10 - 0.84 (m, 6H). 13C NMR (CDCl3, 75.4 MHz, δ): 176.3 and 175.8 (CO), 174.0 and 172.59 (CO), 149.92 and 149.58 (CH), 136.19 (CH), 132.2 and 132.0 (C), 127.4 and 127.3 (CH), 123.1 and 122.9 (CH), 86.6 (C), 83.6 (C), 79.6 (C), 57.8 and 55.2 (CH), 52.0 and 51.91 (CH3), 49.6 and 48.9 (CH), 43.4 and 42.5 (CH2), 41.2 (CH3), 33.61 and 32.87 (CH2), 31.96 and 31.58 (CH2), 29.2 (CH2), 28.3 (CH3), 27.68 and 27.34 (CH2), 3.51 and 23.42 (CH), 22.02 and 21.61 (CH). HRMS (ESI) calculated for C26H37N3O5Na: 494.2625, found: 494.2621. Alberto Fuertes García 274 Boc-(D-Leu-py-mN-L-Acp)-OMe (dip3b). dip3 (40.0 mg, 0.1 mmol), 3-iodopyridine (61 mg, 0.3 mmol) and CuI (3.0 mg, 0.015 mmol) were dissolved in a THF/Et3N mixture (Vt = 5 mL, 4:1) and degassed for 15 min with an Ar flow. After this time, Pd(PPh3)2Cl2 (4.0 mg, 5.73·10-3 mmol) was added and the mixture was stirred under Ar for 12 h at 50 ºC. The solvent was evaporated, and the resulting mixture was dissolved in CH2Cl2 (5 mL) and washed with sat. aq. NH4Cl (2 x 5 ml). The organic layer was dried over anh. Mg2SO4, filtered and concentrated under reduced pressure. Finally, the crude mixture was purified by flash column chromatography (25-100% AcOEt/hexane), which afforded the title compound as an oil. [43.2 mg, 90%, Rf =0.51 (10% MeOH/CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.70 - 8.57 (m, 1H), 8.55 - 8.41 (m, 1H), 7.77 - 7.64 (m, 1H), 7.23 (m, 1H), 5.29 (d, J = 9.1 Hz, 0.5H), 5.15 (d, J = 9.2 Hz, 0.5H), 4.95 - 4.60 (m, 2H), 4.44 - 4.12 (m, 2H), 3.73 - 3.64 (m, 3H), 2.92 - 2.76 (m, 1H), 2.30 - 1.44 (m, 9H), 1.43 - 1.38 (m, 9H), 0.93 (m, 6H). 13C NMR (CDCl3, 75.4 MHz, δ): 176.5 and 175.9 (CO), 174.0 and 172.6 (CO), 155.6 (C), 152.1 (CH), 148.8 and 148.3 (CH), 138.9 (CH), 123.0 (CH), 89.7 and 89.0 (C), 81.0 (C), 79.6 (C), 57.8 and 55.0 (CH), 52.1 and 51.9 (CH), 49.5 and 48.9 (CH), 43.2 and 42.7 (CH2), 41.2 (CH3), 33.6 and 32.8 (CH2), 31.9 and 31.6 (CH2), 29.1 and 28.3 (CH2), 28.1 (CH3), 27.7 and 27.4 (CH2), 24.7 (CH), 23.5 and 23.4 (CH), 22.1 and 21.7 (CH). HRMS (ESI) calculated for C26H37N3O5Na: 494.2625, found: 494.2622. c-[(D-Phe-MeN-L-Ach)3] (CP8). This compound was prepared following a previously described protocol in our group.235 1H NMR (THF d8, 500 MHz) δ 8.59 (d, J = 9.4 Hz, 3H), 7.24 - 7.07 (m, 15H), 5.39 (m, 3H), 4.55 (m, 3H), 3.17 (m, 3H), 3.05 - 2.91 (m, 6H), 2.57 (s, 9H), 1.84 - 1.09 (m, 24H). Experimental section 275 2.2 . Fluorescence assays 2.2.1 CF assay for pH gradient dissipation Vesicles were prepared by slowly evaporating 1 mL of an EYPC (Avanti Polar Lipids) CHCl3 solution (25 mg/mL) in a 10 mL round bottom flask, to give a thin film that was dried at high vacuum overnight. The film was hydrated with 1 mL of an aqueous solution containing CF (30 μM) in a NaH2PO4 buffer (10 mM, pH 5.8). The resulting mixture was subjected to tumbling (rotation) for an hour and after that time 9 freeze-thaw cycles (N2(l) → 40 °C water bath) were carried out. The resulting suspension was extruded 15 times across a 100 nm polycarbonate membrane and finally purified by size exclusion chromatography (Sephadex G- 25) using as eluent NaH2PO4 buffer (10 mM, pH 5.8). The resulting vesicle suspension was taken up in a total volume of 5 mL (approximate lipid concentration 6.6 mM). Measurement protocol: 200 μL of the vesicle suspension were taken into a plastic cuvette containing 1800 μL of NaH2PO4 buffer (10 mM, pH 7.4). At t = 70 s, the compound under study (20 µL DMSO solution) was added and the change in CF fluorescence (basification) was measured (λexc = 493 nm and λem = 510 nm). At t = 400 s, Triton-X 100 (50 μL, 10% solution in water) was added to lyse all the vesicles and normalize the fluorescence trace. Experiment ended at t = 500 s. The data was normalized using the following equation: 𝐹𝑛= 𝐹𝑡−𝐹0 𝐹∞−𝐹0 (𝟏𝟏) Where Fn is the normalized fluorescence, Ft is the fluorescence value at a certain time, F0 is the fluorescence value before the addition of the compound under study (i.e., 50 s) and F∞ is the fluorescence intensity after the total lysis of the liposomes (i.e., 450 s). Alberto Fuertes García 276 Figure 4. Hill curves of CF⊃LUVs presented as transporter:lipid ratio. 2.2.1.1 DLS characterization of CF⊃LUVS Figure 5. Dynamic Light Scattering analysis of freshly prepared 100 nm vesicles loaded with CF. 10 100 1000 10000 100000 1000000 0.0 0.5 1.0 CP5a CF Dose-Response Ratio lipid/transporter Normalized fluorescence Bottom Top IC50 HillSlope 1.005 0.08945 2508 1.140 10 100 1000 10000 100000 1000000 0.0 0.5 1.0 CP5b CF Dose-Response Ratio lipid/transporter Normalized fluorescence Bottom Top IC50 HillSlope 0.6323 0.01230 3320 0.7355 R a w c o rre la tio n d a ta T im e / s C o rre la tio n c o e fficien t 10 -1 10 01 0 110 21 0 31 0 410 51 0 610 71 0 8 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Experimental section 277 2.2.2 HPTS assay for pH dissipation and M+/X- selectivity Vesicles were prepared by taking 1 mL of a EYPC (Avanti Polar Lipids) CHCl3 solution (25 mg/mL) into a 10 mL round bottom flask containing a mixture of CHCl3/EtOH (1:1, Vt = 2 mL) and then this mixture was slowly evaporated on a rotary evaporator providing a thin film that was dried at high vacuum overnight. Then, the film was hydrated with 1 mL of an aqueous solution containing: HPTS (1 mM), HEPES (10 mM), NaCl (100 mM), pH 7.0. The resulting mixture was subjected to tumbling (rotation) for an hour and after that 9 freeze-thaw cycles (N2(l) → 40 °C water bath). The resulting suspension was extruded 15 times across a 100 nm polycarbonate membrane and finally purified by size exclusion chromatography (Sephadex G- 25) using as eluent HEPES (10 mM), NaCl (100 mM), pH 7.0. The resulting vesicle suspension was taken up in a total volume of 5 mL (approximate lipid concentration 6.6 mM). Measurement protocol: 25 μL of the vesicle suspension were dispersed into a plastic cuvette containing 1980 μL of HEPES (10 mM), MX (100 mM), pH 7.0. At t = 20 s, NaOH is added (20 μL, 0.5 M) and at t = 100 s transporter aliquots (DMSO solutions) were added and the change in HPTS fluorescence (basification) was measured (λexc = 450 nm and λem = 510 nm). At t = 400 s, Triton-X 100 was added (50 μL, 10% solution in water) was added to lyse all the vesicles and normalize the fluorescence trace. Experiment ended at t=500 s. The data was normalized using the following equation: 𝐹𝑛= 𝐹𝑡−𝐹0 𝐹∞−𝐹0 (𝟏𝟏) Where Fn is the normalized fluorescence, Ft is the fluorescence value at a certain time, F0 is the fluorescence value before the addition of the compound under study (i.e., 95 s) and F∞ is the fluorescence intensity after the total lysis of the liposomes (i.e., 450 s). Alberto Fuertes García 278 Figure 6. Hill curve of HPTS⊃LUVs presented as transporter:lipid ratio for CP5a. 496 Y. Marcus, J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1997, 87, 2995-2999. 100101102103104105106107 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 CP5a HPTS Dose-Response Ratio lipid/transporter Normalized fluorescence Bottom Top IC50 HillSlope 0.5835 0.2427 271.6 0.6447 CP CP5a CP5b Anion r/Å496 1/r ΔGhyd (kJ/mol) Y Y F- 1.31 0.763359 -465 0.55 0.7085 Cl- 1.81 0.552486 -340 0.55 0.5485 Br- 1.96 0.510204 -315 0.71 0.545 I- 2.2 0.454545 -275 0.89 0.476 AcO- 1.62 0.617284 -365 0.42 0.7615 NO3- 1.79 0.558659 -300 0.91 0.5645 ClO4- 2.4 0.416667 -430 0.71 0.60 Table 1. Normalized percentage of transport in the presence of different extravesicular sodium salts (100 mM) using a constant concentration of the transporters (1 µM). Experimental section 279 2.2.3 Lucigenin assay for Cltransport 2.2.3.1 NaNO3 buffer 25 μL of an EYPC (Sigma Aldrich) EtOH solution (1 g/mL) dispersed in a 10 mL round bottom flask containing a mixture of CHCl3/EtOH (1:1, Vt = 2 mL) was slowly evaporated on a rotary evaporator to give a thin film that was dried at high vacuum overnight. Then, the film was hydrated with 1 mL of an aqueous solution containing: N,N′-Dimethyl-9,9′-bisacridinium dinitrate (lucigenin, 1 mM), NaNO3 (200 mM). The resulting mixture was subjected to tumbling (rotation) for an hour and after that 9 freeze-thaw cycles (N2(l) → 40 °C water bath). The resulting suspension was extruded 15 times across a 200 nm polycarbonate membrane and finally purified by size exclusion chromatography (Sephadex G-25) using NaNO3 (200 mM) as eluent. The resulting vesicle suspension was taken up in a total volume of 5 mL (approximate lipid concentration 6.6 mM). Measurement protocol: 50 μL of the vesicle suspension were taken into a plastic cuvette containing 1950 μL of a NaNO3 solution (200 mM) in milli-Q water. At t = 50 s, NaCl is added (25 μL, 2 M) and at t = 100 s the transporter under study (iPrOH solutions) was added and the change in lucigenin fluorescence (nitrate exchanged by chloride; halide collisions cause quenching of fluorophore) was measured (λexc = 450 nm and λem = 535 nm). At t = 400 s, Triton- X 100 was added (50 μL, 10% solution in water) was added to lyse all the vesicles and normalize the fluorescence trace. Experiment ended at t = 500 s. The data was normalized using the following equation: 𝐹𝑛= 𝐹𝑡−𝐹0 𝐹∞−𝐹0 (𝟏𝟏) Where Fn is the normalized fluorescence, Ft is the fluorescence value at a certain time, F0 is the fluorescence value before the addition of the compound under study (i.e., 95 s) and F∞ is the fluorescence intensity after the total lysis of the liposomes (i.e., 450 s). Alberto Fuertes García 280 Figure 7. Hill curve of HPTS⊃LUVs presented as transporter:lipid ratio. 2.2.3.1.1. Kinetic analysis of the Cl--induced quenching of LG Several selected examples of different samples at a range of concentrations were analyzed to obtain the decay rate on the fluorescence of LG upon the interaction with Clions. For this purpose, we modified the normalization manner of the samples, so the initial values of fluorescence were set to 100% (1 in the Normalized Fluorescence axis) and the fully quenched state was assigned to 0. Also, we set as t = 0 the moment of the addition of the transporter molecule (see Figure 8 and Figure 9). The decay curves of F/F0 were fitted to monoexponential (Eq. 13) and double exponential (Eq. 14) decay functions after applying the following correction (Eq. 12): (𝐹 𝐹0)𝑐=𝐹 𝐹0−𝑔·𝑡 (𝟏𝟐) Where g was obtained by the linear fit of the last 50 s of the transport curves. This subtraction accounts for the unassisted transport of chloride to the vesicle interior without transporter and helps flatten the plateau region at high values of time. 101102103104105106107 0.0 0.5 1.0 CP5a LG Dose-Response Ratio lipid/transporter Normalized fluorescence Bottom Top IC50 HillSlope 1.166 0.05121 3624 0.7549 100101102103104105106107 0.0 0.5 1.0 CP5b LG Dose-Response Ratio lipid/transporter Normalized fluorescence Bottom Top IC50 HillSlope 0.9351 0.03142 974.0 1.299 Experimental section 281 a. Monoexponential fit: 𝐹(𝑡)=𝑠𝑝𝑎𝑛·𝑒−𝐾·𝑡 + 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑒𝑎𝑢 → 𝑡1/2 =ln (2) 𝐾 (𝟏𝟑) Figure 8. Monoexponential fit for Clinduced quenching of LG in the vesicular media. b. Double exp. fit: 𝐹(𝑡)=𝑠𝑝𝑎𝑛1·𝑒−𝐾1·𝑡 +𝑠𝑝𝑎𝑛2·𝑒−𝐾2·𝑡 + 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑒𝑎𝑢 (𝟏𝟒) Figure 9. Double exponential fit for Clinduced quenching of LG in the vesicular media. T im e / s % C lin d u c e d q u e n c h in g (F /F 0) 100 200 300 0.0 0.5 1.0 C P 5 a 2 5 µ M C P 5 a 1 .5 µ M C P 5 a 3 3 0 n M C P 5 b 2 5 µ M C p 5 b 5 u M D ip 3 b 2 5 u M C p 5 b 5 0 0 n M Span K Plateau HalfLife CP5a 25 µM 1.036 0.1551 0.04527 4.468 CP5a 1.5 µM 0.9894 0.08927 0.01903 7.765 CP5a 330 nM 0.8044 0.05142 0.06526 13.48 CP5b 25 µM 0.8873 0.02922 0.1027 23.72 Cp5b 5 uM 0.8294 0.03299 0.08246 21.01 Cp5b 500 nM 0.7482 0.007642 0.2220 90.70 Dip3b 25 uM 0.8230 0.02405 0.1080 28.82 R square CP5a 25 µM 0.9872 CP5a 1.5 µM 0.9755 CP5a 330 nM 0.9486 CP5b 25 µM 0.9913 Cp5b 5 uM 0.9822 Cp5b 500 nM 0.9978 Dip3b 25 uM 0.9666 T im e / s % C lin d u c e d q u e n c h in g (F /F 0) 100 200 300 0.0 0.5 1.0 C P 5 a 2 5 µ M C P 5 a 1 .5 µ M C P 5 a 3 3 0 n M C P 5 b 2 5 µ M C p 5 b 5 u M C p 5 b 5 0 0 n M D ip 3 b 2 5 u M Span1 K1 Span2 K2 Plateau HalfLife_1 HalfLife_2 CP5a 25 µM ~ 0.6745 ~ 0.1551 ~ 0.3612 ~ 0.1553 0.04527 ~ 4.470 ~ 4.465 CP5a 1.5 µM 0.2057 0.02649 0.8720 0.1369 0.008632 26.16 5.065 CP5a 330 nM 0.2510 0.01245 0.7484 0.1127 0.02964 55.66 6.149 CP5b 25 µM 0.3047 0.01212 0.6752 0.04786 0.07526 57.21 14.48 Cp5b 5 uM 0.3352 0.01374 0.6296 0.06782 0.05540 50.44 10.22 Cp5b 500 nM 0.7262 0.005644 0.1308 0.03779 0.1542 122.8 18.34 Dip3b 25 uM 0.4990 0.01233 0.5310 0.08361 0.06889 56.23 8.290 R square CP5a 25 µM 0.9872 CP5a 1.5 µM 0.9918 CP5a 330 nM 0.9937 CP5b 25 µM 0.9983 Cp5b 5 uM 0.9973 Cp5b 500 nM 0.9993 Dip3b 25 uM 0.9901 Alberto Fuertes García 288 mixture. After stirring for 14 h, the solvent was removed, and the residue was dissolved in AcOEt (40 mL), which was further washed with H2O (25 mL), aqueous HCl (5%, 25 mL), saturated aqueous NaHCO3 (25 mL) and brine (25 mL). The organic layer was dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated. The slurry was recrystallized from a AcOEt/hexane mixture (1:3, 10 mL) and the resulting transparent needles were recovered by filtration. (700 mg, 34%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 4.82 (t, J = 12.1 Hz, 4H). 11.459 Ditriflate 10 (0.150 mg, 0.27 mmol) was dissolved in dry DMF (2 mL) and then NaN3 (42 mg, 0.64 mmol) was added under Ar. After stirring for 3 h at room temperature, H2O (5 mL) was added, and the resulting mixture was extracted with Et2O (3x5 mL). The combined organic phases were washed with H2O (3x5 mL) and dried with Mg2SO4. After removing the solvent at reduced pressure, the title compound was isolated as a transparent oil (62 mg, 54%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 3.76 (t, J = 14.5 Hz, 4H). 12.459 Diazide 11 (60 mg, 0.15 mmol) and quinoline (1 µL, 0.008 mmol) were dissolved in EtOH (1 mL). Lindlar catalyst (3 mg, 0.028 mmol) was added under Ar and then H2 (1 atm.) was introduced into the system. The reaction proceeded at room temperature for 6h. After this time, the suspension was filtered over a pad of celite. After removal of the solvent, aqueous HCl was added (10%, 2 mL) and this aqueous layer was washed with Et2O (2x3 mL). Then, it was basified with NaOH and extracted with Et2O (3x3 mL), dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated. The resulting solid was sublimated at room temperature under vacuum (i.e., 1 mbar), yielding the diamine compound as a stinky crystalline white solid. (8 mg, 21%) 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 3.24 (t, J = 16.0 Hz, 4H), 1.35 - 1.18 (b, 4H). G6. Diamine 12 (3.3 mg, 0.012 mmol) was dissolved in aqueous HCl (10%, 1 mL) and stirred for 4 h. Afterwards, it was freezedried to afford a white solid that was used in the next step without further purification. This salt was dissolved in MeOH (1 mL) and treated with tetrakis(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)borate (21 mg, 0.024 mmol) for 3h. Then, the solvent was removed at reduced pressure and the residue was resuspended in CH2Cl2. After centrifugation, the supernatant was evaporated to yield the desired compound as a crystalline solid. (19 mg, 80%).1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 7.80 - 7.68 (m, 16H), 7.61 (s, 8H), 4.20 (s, 6H), 3.76 (t, J = 15.1 Hz, 4H). 19F NMR (CD2Cl2, 282.2 MHz, δ): -61.33, -116.51 (m), -120.50 (m). G7. 2,2,3,3,4,4,4-heptafluorobutananamine (35 µL, 0.25 mmol) was dissolved in an aqueous solution of HCl (10%, Vt = 2.5 mL) and stirred at room temperature for 7 h. After that time, the solution was concentrated to dryness and 40 mg of the Experimental section 289 corresponding hydrochloride salt were recovered. 5 mg of the aforementioned salt were further dissolved in MeOH (1 mL) and tetrakis(3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl)borate (18 mg, 0.02 mmol) was added. After stirring the mixture overnight, the solvent was evaporated at reduced pressure. The resulting residue was resuspended in CH2Cl2 (2 mL), centrifugated, and the supernatant evaporated, yielding the title compound as a white powder. [20 mg, 94%]. 1H NMR (CD2Cl2, 300 MHz, δ): 7.73 (s, 8H), 7.57 (s, 4H), 5.14 (br, 3H), 3.87 (t, J = 14.8 Hz, 2H). 19F NMR (CD2Cl2, 282.2 MHz, δ): -61.39, -79.25 (t, J = 10.4 Hz), -116.98 (d, J = 14.1 Hz), -125.89 (d, J = 25.1 Hz). G8. To a solution of 1,5-hexadiyne (0,125 mL, 0.64 mmol) in EtOH (2.2 mL), freshly repurified CuCl497 (158 mg, 1.6 mml) was added. After 30 min, the initial intense blue color of the mixture turned green. At this point, H2O (5 mL) was added, and the precipitate was collected by vacuum filtration. Copper 1,5-hexadiyne bisacetylide G8 was recovered as yellow solid, which was dried overnight in a desiccator. Spectroscopic data was in agreement with values reported in the literature.498 (65 mg, 50%). Por1. This molecule was prepared following a previously described protocol in the literature.464 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz, δ): 10.32 (s, 2H), 8.76-8.69 (br s, 8H), 8.50 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.33 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.94 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.29 (s, 4H), 2.64 (s, 6H), 1.85 (s, 12H), -2.61 ppm (s, 2H). Por1A. Por1 (20 mg, 0.03 mmol) was dissolved in CHCl3 (5 mL) and then a solution of SnCl2·2H2O (59 mg, 0.26 mmol) in EtOH (5 mL) was added. After refluxing this mixture for 6 h, Et3N (250 µL, 60 equiv) was added and the stirring continued for additional 5 min. The solvent volume was reduced until i.e., 2 mL and the crude compound was purified by basic Al2O3 column chromatography (0- 2% MeOH/CH2Cl2) to yield the desired product as deep purple solid [8 mg, 36%, Rf = 0.35 (CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ):499 9.18 - 9.02 (m, 4H), 9.02 - 8.86 (m, 4H), 8.56 - 8.41 (m, 2H), 8.41 - 8.24 (m, 2H), 7.98 (dt, J = 7.8, 1.5 Hz, 2H), 7.93 - 7.72 (m, 2H), 7.34 (s, 4H), 5.84 (s, 2H), 3.92 - 3.80 (m, 4H), 3.80 - 3.69 (m, 4H), 2.66 (s, 6H), 2.00 - 1.77 (m, 12H), 1.45 - 1.17 (m, 12H), 2.04 - -2.16 (m, minor form), -2.29 - -2.54 (m, minor form), -7.42 (br, 2H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ146.6 (C), 146.3 (C), 141.0 (C), 139.5 (C), 138.4 (C), 138.0 (C), 137.4 (C), 135.0 (CH), 133.6 (CH), 133.3 (C) 133.1 (CH), 131.2 (CH), 127.9 (CH), 126.9 (CH), 126.4 (CH), 120.6 (C), 119.5 497 E. C. Davison, M. E. Fox, A. B. Holmes, S. D. Roughley, C. J. Smith, G. M. Williams, J. E. Davies, P. R. Raithby, J. P. Adams, I. T. Forbes, N. J. Press, M. J. Thompson, Chem. Soc., Perkin Trans. 2002, 12, 1494-1514. 498 Y. L. Chow, Gonzalo E. Buono-Core, Can. J. Chem. 1983, 61, 795-800. 464 H. L. Ozores, M. Amorín, J. R. Granja, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 776-784. 499 The dialdehyde product is in equilibrium with its bis-diethyl acetal form. Alberto Fuertes García 290 (C) 101.6 (CH), 61.4 (CH2), 21.7 (CH3), 21.5 (CH3), 15.4 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C60H61N4O5Sn: 1037.3658, found: 1037.3672 (dehydrated bis-diethoxyacetal form). Por2. Por1 (15 mg, 0.02 mmol) was mixed with tert-butyl carbazate (11 mg, 0.08 mmol) in CH2Cl2 (2 mL). and stirred overnight. The crude mixture was purified by flash column chromatography (0-1% MeOH/CH2Cl2), to yield the desired compound as a violet solid. [19 mg, 95%, Rf = 0.17 (CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.79 - 8.68 (2AB, 8H), 8.49 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 8.23 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 8.14 (m, 4H), 7.76 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.28 (s, 4H), 5.85 (br, 2H), 2.65 (s, 6H), 1.87 (s, 12H), 1.51 (s, 18H), -2.62 (br, 2H). HRMS (ESI) calculated for C62H63N8O4: 983.4967, found: 983.4964. Por2A. Por2 (12 mg, 0.012 mmol) was dissolved in CHCl3 (3 mL) and then a solution of SnCl2·2H2O (17 mg, 0.73 mmol) in EtOH (3 mL) was added. After refluxing this mixture for 6 h, Et3N (110 µL, 60 equiv) was added and stirred for additional 5 min. The solvent volume was reduced until a final volume of i.e., 1 mL and the crude compound was purified by basic Al2O3 column chromatography (0-2% MeOH/CH2Cl2) to give Por2A as purple solid. [45%, Rf = 0.30 (CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 9.05 (2AB, 8H), 8.52 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 8.42 - 8.34 (m, 2H), 8.31 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 8.09 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 8.06 - 7.96 (m, 2H), 7.85 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.34 (s, 4H), 2.67 (s, 6H), 1.89 (s, 3H), 1.54 (s, 9H), 1.27 (s, 9H). HRMS (MALDI-TOF) calculated for C62H63N8O6Sn: 1135.3902, found: 1135.3282. Por2B. This porphyrin was synthesized following the procedure described elsewhere.464 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.81 (br, 2H), 8.73 (AB, J = 3.5 Hz, 4H), 8.67 (AB, J = 3.5 Hz, 4H), 8.49 (br s, 2H), 8.24 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 8.09 - 7.96 (m, 4H), 7.70 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.26, 7.25 & 7.23 (3s, 4H), 2.60 (s, 6H), 1.88, 1.82 & 1.77 (3s, 12H), 1.45 ppm (s, 18H). Experimental section 291 c-[(D-Leu-MeN-L-γ-Acp-D-Leu-AcHydN-L-γ-Acp-)2] (CP10). This compound was prepared following a synthetic route described by us.464 1H-RMN (5% DMSO d6/CDCl3, 500 MHz, δ): 9.57 (m, 2H), 8.42 (m, 4H), 6.86 (m, 2H), 5.21-5.06 (m, 2H), 4.90-4.64 (m, 8H), 3.94 (d, J = 12.2 Hz, 0.8H), 3.91 (d, J = 11.6 Hz, 1.2H), 3.23 (q, J = 8.0 Hz, 1.2H), 3.13 (m, 0.8H), 3.02 (s, 2.4H), 3.01 (s, 3.6H), 2.93 (m, 2H), 2.13-1.48 (m, 32H), 1.44 (s, 18H), 1.42-1.30 (m, 4H), 0.99-0.77 ppm (m, 24H). CP10A. CP10 (20 mg, 0.016 mmol) was dissolved in CH2Cl2 (1 mL) and treated with TFA (1 mL). After stirring for 1h, the solution was concentrated, redissolved in additional CH2Cl2 and evaporated to dryness again, repeating this process three times. The oily residue was further dried at high vacuum for 6h. This oil was dissolved in 6 mL of dry CH2Cl2 and slowly added to a solution of Por2 (14 mg, 0.016 mmol) in dry CH2Cl2 (25 mL). The resulting mixture was stirred under Ar overnight. Then, the volume was reduced by evaporation and the mixture was purified by basic Al2O3 column chromatography (0-15% MeOH/ CH2Cl2) to give the desired compound as bright purple solid (40%). 1H NMR (10% DMSO d6/CDCl3, 500 MHz, δ): 11.28 - 10.88 (m, 2H), 9.12 - 8.67 (m, 10H), 8.35 - 7.60 (m, 12H), 7.32 - 7.04 (m, 4H), 5.14 - 3.93 (m, 12H), 2.62 - 2.16 (m, 22H), 2.03 - 0.53 (m, 66H), -7.31 - -7.51 (m, 1H), -7.51 - -8.03 (m, 1H). HRMS (MALDI-TOF) calculated for C106H119N16O11Sn: 1921.9048, found: 1921.9007 (dehydrated species). CP10B. This compound was prepared following a synthetic route described by us from CP10 and Por1B.464 1H NMR (10% DMSO d6/CDCl3, 500 MHz, δ): 11.36 (br, 1.6H), 11.29 (s, 2.4H), 8.93 - 8.60 (m, 16H), 8.88 and 8.80 (br, 4H), 8.43 (br, 4H), 8.30 and 8.25 (br and s, 4H), 8.23, 8.20 and 8.02 (d, J = 8.9 Hz, 8H), 8.19 and 8.15 (t, 4H),7.65 and 7.61 (d, J = 4.3 Hz,), 7.23 and 7.19 (s, 8H), 4.95 and 4.19 (br, 3.2H,), 4.90 and 4.45 (m, 4.8H), 4.88 and 4.60 (m, 3.2H), 4.85 and 4.08 (d, J = 20.1 Hz, 4.8H), 4.50 and 4.30 (m, 8H), 2.71 and 2.59 (m, 8H), 2.56 and 1.71 (s, 24H), 2.44 and 2.03 (s, 12H), 2.36 (m, 12H), 2.19-1.12 (m, 72H), 1.12-0.63 ppm (m, 48H). a. General procedure for Suzuki cross-coupling reaction: Aryl-halide (1 equiv), aryl-boronic acid (1.25 equiv) and anh. K3PO4 (3 equiv) were loaded on a Schlenk tube and dissolved in dry and degassed DMF (0.1 to 0.05 M). Then, Pd(PPh3)4 (0.05 equiv) was added and the mixture was stirred overnight at 100 ºC. After that time, the mixture was partitioned between water and AcOEt and the organic layer was washed with brine, dried Alberto Fuertes García 292 with anh. Mg2SO4, filtered and evaporated under vacuum. The purification was carried out by flash column chromatography. b. General procedure for Sonogashira cross-coupling reaction: Aryl-halide (1 equiv), aryl-alkyne (1.25 equiv), CuI (0.1 Equiv) and PdCl2(PPh3)2 (0.05 equiv) were loaded on a Schlenk tube and then a mixture of freshly distilled THF and Et3N (3:1, 0.1- 0.05 M) was added. The mixture was stirred under Ar at 50 ºC overnight. After removing the solvents, the crude mixture was purified by flash column chromatography over SiO2. c. General procedure for alkyne reduction: Alkyne-containing substrate (1 equiv) was dissolved in MeOH (0.1-0.05 M) and, under Ar, Pd/C (10 mol%) was added. After applying 1 atm of H2 (balloon), the mixture was stirred overnight. The resulting black suspension was filtered through a pad of Celite and concentrated in vacuo to yield the saturated product. d. General procedure for methyl benzoate hydrolysis: Methyl benzoate-derivative (1 equiv) was suspended in a mixture of THF/MeOH/H2O (2:2:1, 0.05-0.02 M) and treated with NaOH (10 equiv). After stirring for, at least, 12h at 50 ºC (completion of the reaction judged by TLC), the solution was acidified with 5% HCl until pH 1 and the resulting precipitated product was centrifuged and freeze dried to remove the remaining water. 14. This intermediate was prepared from methyl 4-iodobenzoate (167 mg, 0.64 mmol) and 4-bromophenylboronic acid following general procedure A.500 [87%, Rf = 0.45 (40% CH2Cl2/hexane)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.10 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.66 - 7.54 (m, 4H), 7.49 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H). 15. Intermediate 14 (50 mg, 0.17 mmol) and 4-pyridinylboronic acid were crosscoupled following procedure A to give 15 as white solid. [95%, Rf = 0.40 (5% MeOH/CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.67 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 8.12 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.72 (s, 4H), 7.68 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 6.2 Hz, 2H), 3.93 (s, 3H). 13C NMR (CDCl3, 75.4 MHz, δ): 166.8 (C), 150.3 (CH), 147.5 (C), 144.5 (C), 140.6 (C), 137.7 (C), 130.3, (CH), 129.3 (C), 127.9 (CH), 127.5 (CH), 126.9 (CH), 121.4 CH), 52.2 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C19H16NO2: 290.1176, found: 290.1174. 500 Y. Monguchi, J. Vagner, H. L. Handl, U. Jana, L. J. Begay, V. J. Hruby, R. J. Gillies, E. A. Mash, Tetrahedron Lett. 2015, 46, 7589-7592. Experimental section 293 L1. 15 (59 mg, 0.21 mmol) was hydrolyzed as described in procedure D (27%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.88 - 8.75 (m, 2H), 8.24 - 7.99 (m, 6H), 7.99 - 7.83 (m, 2H). HRMS (ESI) calculated for C18H13NO2: 275.0946, found: 275.0944. 16. Following general protocol B, 1-bromo-4-ethynylbenzene and methyl 4- iodobenzoate (145 mg, 0.55 mmol) were reacted to yield the title compound as a slightly yellow solid. [70%, Rf = 0.18 (25% CH2Cl2/hexane)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.04 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.44 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H) 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 166.5 (C), 133.1 (CH), 131.7 (CH), 131.5 (CH), 129.6 (CH), 127.6 (C), 123.1 (C), 121.7 (C), 91.2 (C), 89.7 (C), 52.3 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C16H11BrO2: 313.9942, found: 313.9948. 17. Compound 16 (50 mg, 0.16 mmol) and 4-pyridinylboronic acid were transformed into 17 (white solid) using protocol A. [70%, Rf=0.30 (5% MeOH/CH2Cl2)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.70 (br, 2H), 8.04 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.70 - 7.65 (m, 4H), 7.61 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.56 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 3.94 (s, 3H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz) δ 166.5 (C), 150.2 (CH), 147.4 (C), 138.1 (C), 132.4 (CH), 131.5 (CH), 129.7 (C), 129.5 (CH), 127.6 (C), 127.0 (CH), 123.6 (C), 121.5 (CH), 91.7 (C), 90.2 (C), 52.3 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C21H16NO2: 314.1180, found: 314.1176. L2. This ligand was obtained from 17 (33 mg, 0.11 mmol) utilizing procedure D. (42%).1H NMR (DMSO d6, 300 MHz, δ): 8.67 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 7.99 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 8.3 Hz, 2H). HRMS (ESI) calculated for C20H14NO2: 300.1017, found: 300.1019. Alberto Fuertes García 294 L3. Synthetized from L2 (13 mg, 0.04 mmol) by protocol C and isolated as a solid (97%). 1H NMR (DMSO d6, 300 MHz, δ): 8.68 - 8.56 (m, 2H), 7.93 - 7.79 (m, 2H), 7.79 - 7.65 (m, 2H), 7.65 - 7.49 (m, 2H), 7.44 - 7.25 (m, 2H), 3.09 - 2.86 (m, 4H). HRMS (ESI) calculated for C20H18NO2: 304.1332, found: 304.1333. 18. Asymmetric coupling of 1,4-diethynylbenzene (42 mg, 0.34 mmol) with 4- iodopyridine and methyl 4-iodobenzoate, provided title compound by means of protocol B. Purification by flash chromatography (40-80% AcOEt/hexane) afforded the desired product as a light orange solid. [19%, Rf = 0.16 (40% CH2Cl2/hexane)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.61 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.03 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.54 (s, 4H), 7.41 - 7.36 (m, 2H, J = 6.0 Hz), 3.93 (s, 3H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, δ): δ 166.5 (C), 149.7 (CH), 132.5 (C), 131.9 (CH), 131.8, 131.6 (CH), 131.2 (CH), 129.8 (C), 129.6 (CH), 127.5 (C), 125.5 (CH), 123.6 (C), 122.3 (C), 93.5 (C), 91.7 (C), 90.9 (C), 88.6 (C), 52.3 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C23H16NO2: 338.1175, found: 338.1176. 19. This molecule was obtained from 18 (10 mg, 0.03 mmol) using protocol C. [98%, Rf = 0.75 (AcOEt)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 7.96 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.30 - 7.20 (m, 4H), 7.07 (m, 6H), 3.93 (s, 3H), 3.00 - 2.88 (m, 8H). HRMS (ESI) calculated for C22H21NO2: 331.1572, found: 331.1573. Experimental section 295 L4. According to procedure D, 19 (10 mg, 0.03 mmol) was hydrolyzed to yield L4. (97%). 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ):501 8.58 - 8.39 (m, 2H), 8.09 - 7.89 (m, 2H), 7.19 - 6.96 (m, 6H), 3.44 - 3.26 (m, 8H), 2.69 - 2.36 (m, 8H). 1.75 - 1.53 (m, 8H), 1.53 - 1.37 (m, 8H), 1.00 (t, J = 7.3 Hz, 12H). HRMS (ESI) calculated for C22H22NO2: 332.1645, found: 332.1648. L5. This ligand was obtained from 18 (9 mg, 0.03 mmol) applying protocol D. (30%).1H NMR (DMSO d6, 300 MHz, δ): 8.43 - 8.32 (m, 2H), 7.78 - 7.64 (m, 2H), 7.50 - 7.35 (m, 6H), 7.31 (s, 2H). HRMS (ESI) calculated for C22H13NO2: 323.0946, found: 323.0940. 20. Asymmetric double Suzuki cross-coupling (procedure A) starting from commercially available 2,7-dibromopyrene (100 mg, 0.28 mmol), 4- pyridinylboronic acid and (4-(methoxycarbonyl)phenyl)boronic acid, provided the desired compound as yellow solid, after recrystallization from a 5% MeOH/CH2Cl2. [10%, Rf = 0.53 (10%MeOH/CH2Cl2)]. 1H NMR (5% MeOD d4/CDCl3, 300 MHz, δ): 8.77 - 8.71 (m, 2H), 8.43 (s, 4H), 8.22 - 8.11 (m, 6H), 7.98 - 7.89 (m, 4H), 3.95 (s, 3H). 13C NMR (5% MeOD d4/CDCl3, 75 MHz, δ): 167.2 (C), 149.7 (C), 149.4 (CH), 145.7 (C), 138.2 (C), 135.4 (C), 131.8 (C), 131.7 (C), 130.3 (CH), 129.0 (C), 128.4 (CH), 128.0 (CH), 127.9 (CH), 124.6 (C), 124.2 (CH), 123.9 (C), 123.5 (CH), 122.8 (CH), 52.2 (CH3). HRMS (ESI) calculated for C29H20NO2: 414.1484, found: 414.1489. 501 For solubility reasons, in the NMR analysis, 1 equiv of TBAOH was added to increase the solubility of the product in organic solvents. Alberto Fuertes García 296 L6. Basic hydrolysis of 20, as described in protocol D, afforded the pyrenederivative as light orange solid. (quant.). 1H NMR (DMSO d6, 300 MHz, δ): 8.78 (s, 4H), 8.69 (s, 2H), 8.39 - 8.28 (m, 4H), 8.11 - 8.01 (m, 4H), 7.92 (d, J = 7.9 Hz, 2H). HRMS (ESI) calculated for C28H18NO2: 400.1332, found: 400.1336. 21. Methyl 4-iodobenzoate (185 mg, 0.71 mmol) and ethynyltrimethylsilane were reacted following procedure B. After flash column chromatography (10% AcOEt/hexane), the title compound was isolated as a crystalline solid. Spectroscopic data is in agreement with values reported in the literature.502 [73%, Rf = 0.53 (10% AcOEt/hexane)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 7.95 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.50 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 0.25 (s, 9H). 22.503 21 (95 mg, 0.41 mmol) was dissolved in a mixture of MeOH/CH2Cl2 (1:1, Vt = 4 mL) and then an aqueous solution of KOH (1 M, 0.33 mL) was added dropwise. After stirring for 1 h, the mixture was diluted with H2O (3 mL) and the phases separated. The aqueous layer was acidified with 10% HCl and the resulting white precipitate was extracted with CH2Cl2 (3x10 mL). The combined extracts were dried with anh. Mg2SO4, filtered and concentrated, to give an orange solid that was used in the next step without further purification. Then, the previous product was dissolved in CH2Cl2 and treated with TMEDA (203 µL, 10 equiv) and CuCl504 (148 mg, 10 equiv). After 2 h stirring in open air, H2O (3 mL) was added and the organic layer was further washed with H2O (3x5 mL). After drying, filtering and concentrating the solvent, the crude was purified by SiO2 column chromatography (10% AcOEt/hexane). [40% over 2 steps, Rf = 0.54 (10% AcOEt/hexane)]. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, δ): 8.02 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.59 (d, J = 7.9 Hz, 4H), 3.93 (s, 6H). 502 S. R. Parsons, J. F. Hooper, M. C. Willis, Org. Lett. 2011, 13, 998-1000. 503 A. S. Batsanov, J. C. Collings, I. J. S. Fairlamb, J. P. Holland, J. A. K. Howard, Z. Lin, T. B. Marder, A. C. Parsons, R. M. Ward, J. Zhu, J. Org. Chem. 2005, 70, 703-706. 504 CuCl was purified prior to its use to remove CuCl2: it was dissolved in 37% HCl, precipitated by adding water, centrifuged (washed with further portions of water) and freeze dried. Stored under inert gas shielded from light. Experimental section 297 L7. Methyl ester 22 (10 mg, 0.03 mmol) was hydrolyzed following protocol D. (96%). 1H NMR (DMSO d6, 300 MHz, δ): 13.23 (br, 2H), 7.98 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.75 (d, J = 8.1 Hz, 4H). HRMS (ESI) calculated for C18H11O4: 291.0652, found: 291.0656. 3.2. Computational analysis of the interaction between D5a and alkyldiammonium guests. Table 2. Summary of BSSE, interaction and complexation energies of the different alkyldiammonium guests with the capsule D5a. Energy values were calculated using B3LYP/6-31G(d).456-458 3.3. NMR sample preparation protocol. a) General procedure for the preparation of heterodimers D5a-8 and D5a-9. A 5 mm NMR tube was loaded with a TMSS solution (10 µL, 31 mM) of the appropriate deuterated solvent, CP5a (2.5 mg, 1.2 10-6 mol of dimer) and 240 µL of CD2Cl2 or THF d8. At this point the NMR tube was equipped with a narrower 3 mm tube that was used empty for the purpose of increasing the height of the solution. On a separate vial, a solution of CP8/CP9 (30 mM) in the same deuterated solvent was prepared, so the addition of 10 µL of the later solution represented 0.25 equiv with respect to the amount of CP5a inside the NMR tube. With this approach, the final concentration of heterodimer in the sample is 8.4 mM. E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) EBSSE 0,017166134 10,77192075 0,021210286 13,30966657 0,024687479 15,49163995 0,027650491 17,35095961 E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) Einter 0,225327924 -141,3955256 0,213510754 -133,9801332 0,193275375 -121,2822306 0,203104755 -127,4502648 E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) E. (Hartree) E. (kcal/mol) Ecomplex 6281,440312 -86,14105184 6202,796962 -99,73676947 6163,457881 -86,09218889 6124,138705 -91,06892113 G2 G3 G5 G4 Alberto Fuertes García 304 Figure 17. Interaction of 1 Equiv G3 with D8 in CD2Cl2 (5mM). [Document text truncated for crawler view.]