Microenxerto e recultivo do calo basal na micropropagación de material adulto de carballo e castiñeiro

Índice I ÍNDICE ABREVIATURAS VII I - INTRODUCIÓN 1 1 - Descrición xeral e usos do carballo e do castiñeiro 1 1.1 - Caracterización botánica e autoecoloxía 1 1.2 - Importancia e utilización na actualidade 2 2 - A multiplicación vexetativa 4 2.1 - Técnicas convencionais de multiplicación vexetativa 5 2.1.1 - Estacaxe 5 2.1.2 - Enxerto 6 2.1.3 - Porbaixa 7 2.2 - Técnicas modernas de multiplicación vexetativa: a propagación por cultivo in vitro 8 2.2.1 - Concepto e vías de micropropagación 8 2.2.2 - Tipos de explantos na multiplicación a partir de meristemas preexistentes 9 2.2.2.1 - Nós, ápices e calo basal 9 2.2.2.2 - O calo basal 11 2.2.2.2.1 - Xeralidades. Calo basal vs calo organoxénico 11 2.2.2.2.2 - O uso do recultivo do calo basal e outros sistemas semellantes en micropropagación 12 2.2.3 - Fases da micropropagación de nós e ápices 14 2.2.4 - Factores que afectan ó éxito da micropropagación 16 2.2.5- Cultivo in vitro no xénero Quercus 17 2.2.6 - Cultivo in vitro no xénero Castanea 24 2.2.7 - A maduración e a súa influencia na micropropagación 30 2.2.7.1 - Maduración e propagación vexetativa nas árbores 30 2.2.7.2 - Fundamentos do cambio de fase 31 2.2.7.3 - Control do cambio de fase 32 2.2.7.4 - Partes “xuvenís” en plantas adultas 34 Índice II 2.2.7.5 - Obtención de material xuvenil a partir de plantas adultas: concepto de rexuvenecemento. Técnicas de rexuvenecemento. 36 3 - O microenxerto 38 3.1 - Descrición xeral 38 3.2 - Factores que afectan ó prendemento dos microenxertos 39 3.3 - O microenxerto como método de rexuvenecemento 41 3.3.1 - Introdución 41 3.3.2 - Microenxertos in vitro vs Microenxertos in vivo 41 3.3.3 - Uso do microenxerto in vitro na micropropagación 42 3.3.4 - Uso de enxertos e microenxertos in vivo con fins de micropropagación 47 3.3.5 - (Micro)enxerto de carballo e castiñeiro 50 3.3.6 - Fundamentos do microenxerto como método de rexuvenecemento 51 II - OBXECTIVOS 55 III - MATERIAL E MÉTODOS 57 1 - Material vexetal 57 1.1 - Material vexetal de Quercus robur L. 57 1.1.1 - Ensaios de recultivo do calo basal 57 1.1.2 - Ensaios de microenxerto 58 1.2 - Material vexetal de Castanea sativa Mill. 59 1.2.1 - Ensaios de recultivo do calo basal 59 1.2.2 - Ensaios de microenxerto 59 2 - Métodos 60 2.1 - Condicións xerais de cultivo 60 2.2 - Introdución in vitro de material vexetal 62 2.2.1 - Material vexetal introducido in vitro 62 2.2.2 - Obtención de brotes 62 2.2.3 - Proceso de desinfección 65 Índice III 2.2.4 - Medio de cultivo utilizado 66 2.2.5 - Ensaios realizados 66 2.3 - Ensaios de recultivo do calo basal 67 2.3.1 - Tipos de explanto con calo 67 2.3.2 - Descrición do recultivo do calo basal 68 2.3.3 - Variables estudadas 70 2.3.4 - Ensaios realizados 71 2.4 - Ensaios de microenxerto 73 2.4.1 - Obtención de plántulas in vitro 73 2.4.1.1 - Obtención de plántulas de carballo in vitro 73 2.4.1.2 - Obtención de plántulas de castiñeiro in vitro 75 2.4.2 - Obtención de plántulas in vivo 76 2.4.3 - Obtención de púas de material adulto para o microenxerto in vitro 76 2.4.4 - Obtención de púas de material adulto para o microenxerto in vivo 77 2.4.5 - Realización de microenxertos in vitro 78 2.4.6 - Realización de microenxertos in vivo 83 2.4.7 - Multiplicación in vitro dos explantos procedentes dos microenxertos 87 2.4.7.1 - Desenvolvemento dos microenxertos e reaillamento de explantos 87 2.4.7.2 - Ensaios realizados in vitro sobre explantos reaillados 87 2.4.8 - Avaliación do enraizamento in vitro 89 2.5 - Tratamento estatístico 91 IV - RESULTADOS 93 1 - Introdución in vitro de material vexetal 93 1.1 - Clons introducidos in vitro 93 1.2 - Introdución in vitro dos clons MIÑO, SISTO e EPS 93 1.3 - Introdución do clon QRFa 94 1.4 - Ensaio de medio base no clon QRFa 95 Índice IV 2 - Ensaios de recultivo do ‘calo basal’ 96 2.1 - Recultivo do calo en Quercus robur L. 96 2.1.1 - Taxa de multiplicación 96 2.1.2 - Número de brotes maiores de 1 cm 102 2.1.3 - Lonxitude do brote máis longo 104 2.1.4 - Porcentaxe de calos que se obteñen de cada tipo 106 2.1.5 - Porcentaxe de calos que se deixan de recultivar 107 2.2 - Recultivo do calo en Castanea sativa Mill. 108 2.2.1 - Taxa de multiplicación 108 2.2.2 - Porcentaxe de calos que se deixan de recultivar 110 2.3 - Natureza (axilar ou adventicia) dos brotes que emerxen a través do calo 113 2.4 - Cálculo de produción estimada 114 2.4.1 - Taxa de multiplicación utilizando o recultivo do calo basal 114 2.4.2 - Produción anual estimada 118 2.4.3 - Estudo de rendibilidade 123 3 - Ensaios de microenxerto 127 3.1 - Desinfección de landras (patróns) e xerminación 127 3.2 - Prendemento dos microenxertos 129 3.2.1 - Clons de Quercus robur (TROBO, MUÍÑOS, QRFa e MIÑO) 129 3.2.2 - Clons de Castanea sativa (EPS, SISTO, LOURA e PAREDE) 134 3.3 - Efecto do microenxerto sobre a multiplicación in vitro 141 3.3.1 - Introdución in vitro dos explantos procedentes dos microenxertos in vivo 141 3.3.2 - Taxa de multiplicación in vitro do material procedente de microenxerto 144 3.3.2.1 - Clons de Quercus robur 144 3.3.2.2 - Clons de Castanea sativa 147 3.3.2.2.1 - Microenxertos in vivo 147 3.3.2.2.2 - Microenxertos in vitro 149 Índice V 3.3.2.2.2.1 - Microenxerto in vitro de EPScopa sobre EPSbase 149 3.3.2.2.2.2 - Microenxerto in vitro de EPScopa sobre XUV9 151 3.3.2.2.2.3 - Microenxerto in vitro de SISTO sobre EPSbase 153 3.4 - Enraizamento in vitro do material procedente de microenxerto 154 3.4.1 - Clons de Quercus robur 154 3.4.2 - Clons de Castanea sativa 160 3.5 - Utilidade teórica do microenxerto en serie in vivo en ciclos curtos 168 V- DISCUSIÓN 171 1 - Consideracións sobre a introdución in vitro do material vexetal utilizado neste traballo 171 2 - O recultivo do calo basal e as súas implicacións na multiplicación in vitro 172 2.1 - Modificación dos parámetros produtivos mediante o recultivo do calo basal 172 2.2 - Sobre a natureza (axilar ou adventicia) dos brotes que emerxen a través do calo 175 2.3 - Implicacións produtivas e económicas do uso dos explantos con calo basal 176 3 - Microenxerto in vitro e in vivo de carballo e castiñeiro 177 3.1 - Contaminación de patróns procedentes de landras obtidos in vitro 177 3.2 - Prendemento dos microenxertos 177 3.2.1 - Consideracións xerais 177 3.2.2 - Prendemento dos microenxertos in vitro. Importancia da natureza do patrón e da púa 179 3.2.2.1 - Sobre os patróns 179 3.2.2.2 - Sobre as púas 180 3.2.3 - Prendemento dos microenxertos in vivo. A orixe das púas, o estado fisiolóxico, a lignificación e os ciclos de enxerto 182 3.3 - ¿Resulta efectivo o microenxerto como técnica de rexuvenecemento no material ensaiado? 186 Índice VI 3.3.1 - O efecto do microenxerto sobre a taxa de multiplicación in vitro 186 3.3.1.1 - Nos clons de Quercus robur 186 3.3.1.2 - Nos clons de Castanea sativa 187 3.3.2 - O efecto do microenxerto sobre o enraizamento in vitro 189 3.3.2.1 - Nos clons de Quercus robur 189 3.3.2.2 - Nos clons de Castanea sativa 190 3.4 - Posibilidades prácticas do uso do microenxerto in vivo en ciclos curtos 192 VI - CONCLUSIÓNS 195 VII - BIBLIOGRAFÍA 197 Índice VII ABREVIATURAS A adulto AD adolescente Ax adulto con características xuvenís ADN ácido desoxirribonucleico AIA ácido indolacético AIB ácido 3-indolbutírico ANA ácido naftalén-acético ARN ácido ribonucleico ARNm ARN mensaxeiro ARNi ARN de interferencia BA 6-benciladenina D días dende aplicación de tratamento D.F.R. densidade de fluxo radiante E enraizamento EPScopa material procedente da copa do clon EPS EPSbase material procedente de rebentos basais do clon EPS GA3 ácido xiberélico GD medio de cultivo de Gresshof e Doy (1972) GD 1/3 medio GD con un terzo da concentración de macronutrientes IB inmersión basal en disolución concentrada de auxina L lonxitude da raíz máis longa LSD test da mínima diferenza significativa MC hormona engadida ó medio de cultivo MS medio de cultivo de Murashige e Skoog (1962) N número de raíces por brote enraizado P nivel de significación Púa SC púa procedente do subcultivo convencional Púa RC púa procedente do recultivo do calo basal REC número de recultivo s.d. sen datos TDZ Tidiazurón TMV virus do mosaico do tabaco Índice VIII WPM Woody Plant Medium (Lloyd e McCown, 1981) X xuvenil ® marca rexistrada µenx microenxerto 1ºrp primeiro microenxerto con púas procedentes de repouso 1ºfz primeiro microenxerto con púas procedentes de forzado Introdución 7 de enraizamento da estacaxe de material adulto, ademais de manter as características desexadas, como pode ser un determinado hábito de crecemento ou a presenza de follas variegadas (Borzan, 1993). Os tipos de enxerto que proporcionan os mellores resultados en carballo son o inglés, o de fendedura ou o de cortiza, mentres que o de xema non resulta moi efectivo. Patróns e púas deben pertencer á mesma especie (Hartmann et al., 1990). No caso do castiñeiro, toda a planta producida con destino á plantación de soutos é enxertada coas variedades produtoras de castaña máis demandadas no mercado nese momento, xa que os castiñeiros silvestres raramente producen castañas de calidade comercial. Así mesmo, esta técnica resulta útil para substituír, mediante reenxerto, unhas variedades por outras. Actualmente, debido ós problemas existentes en relación coa doenza da “tinta”, as variedades de froito adoitan enxertarse sobre patróns híbridos resistentes a esta enfermidade (Pereira-Lorenzo e Fernández-López, 1997a; Pereira- Lorenzo et al., 2000). No castiñeiro fixéronse diversos estudos acerca da compatibilidade variedade-patrón e das diferentes técnicas de enxerto (Craddock e Bassi, 1999; Serdar e Soylu, 2005; Bueno et al., 2009; Celik et al., 2009; Serdar, 2009). 2.1.3 - Porbaixa Outro dos métodos que se inclúen na propagación vexetativa convencional é a porbaixa. Esta técnica non deu resultados satisfactorios na propagación do carballo (Hartmann et al., 1990). No entanto, no caso do castiñeiro, é unha técnica moi usada, sobre todo para a multiplicación do castiñeiro híbrido (Fernández et al., 1995), no que a multiplicación por sementes supón case sempre a perda de resistencia á ‘tinta’. O sistema de propagación vexetativa que mellores resultados ten achegado é a porbaixa por corte e recalce, mediante o recepado de plantas nai. Tras o recepado, a cepa emite brotes longos e vigorosos, que son anelados e tratados con hormonas na súa parte basal, aporcando terra finalmente para tapar a zona tratada. Estes brotes emitirán raíces e poderán ser separados da planta nai para continuar o seu crecemento coma plantas independentes. Estas novas plantas, coñecidas como “barbados”, adoitan ter entre 1 e 1,5 m de altura e un diámetro basal de uns 2 cm. Este sistema presenta, porén, algúns inconvenientes, como a baixa produción por unidade de superficie, a necesidade dun longo período para a entrada en produción, a necesidade dun elevado número de xornais en curtos períodos Introdución 8 de tempo, os custos de produción elevados e a obtención de plantas de calidade deficiente, descompensadas e con un sistema radical asimétrico e pouco desenvolvido. 2.2 - Técnicas modernas de multiplicación vexetativa: a propagación por cultivo in vitro 2.2.1 - Concepto e vías de micropropagación O cultivo in vitro consiste en cultivar pequenos fragmentos de material vexetal dentro de recipientes de vidro, en condicións asépticas, sobre medios de cultivo específicos e en condicións ambientais controladas. Baséase en dúas propiedades das células vexetais: a dediferenciación, que permite a unha célula especializada reverter ó estado meristemático, e a totipotencia, segundo a cal calquera tipo de célula vexetal, nas condicións axeitadas, pode dar lugar a unha planta enteira. Unha das aplicacións máis importantes da técnica do cultivo in vitro é a multiplicación in vitro ou micropropagación, que se caracteriza por permitir a obtención dunha gran cantidade de plantas nun espazo e tempo reducidos, sendo empregada cada vez máis na produción comercial de planta, en numerosas especies de valor ornamental, forestal e alimentario, e na produción de material vexetal libre de microorganismos. O principio da multiplicación vexetativa in vitro consiste en tomar da planta órganos, tecidos ou células (explantos) e cultivalos en condicións asépticas, procedendo a realizar subcultivos periódicos para obter cada vez un número maior de plantas. Os explantos máis comúns na micropropagación son embrións, cotiledóns, xemas, brotes e follas xuvenís (Bonga e Von Aderkas, 1992). As vantaxes do cultivo in vitro son, entre outras, a posibilidade de obter unha multiplicación máis rápida que en condicións in vivo, conseguir plantas libres de enfermidades, precisar dunha cantidade relativamente pequena para iniciar o cultivo, achegar unha produción homoxénea ó longo do ano, e ser especialmente útil para o establecemento de bancos de xenes. A micropropagación pode levarse a cabo, de forma xeral, por dúas vías, en función da preexistencia ou non sobre o explanto de puntos meristemáticos caulinares: Introdución 9 • A partir de estruturas organoxénicas, que inicialmente non portan meristemas caulinares, procedentes de células diferenciadas que requiren unha certa dediferenciación, como o cultivo de calo ou a embrioxénese somática. Estas técnicas poden presentar un certo risco de que se produza mutación somaclonal. • A partir de tecido meristemático xa existente no explanto, como xemas (na multiplicación de nós e ápices) ou a partir de embrións. Este tipo de propagación garante practicamente a fidelidade clonal (Joshi e Dhawan, 2007; Alizadeh e Singh, 2009; Nadha et al., 2011). 2.2.2 - Tipos de explantos na multiplicación a partir de meristemas preexistentes 2.2.2.1 - Nós, ápices e calo basal Con respecto á multiplicación in vitro de explantos que portan meristemas preexistentes, os máis comúns son os nós e ápices. Estes explantos proveñen da división dun brote, xa alongado, en partes máis pequenas, que levan polo menos unha xema axilar (nó) ou apical (ápice) e que se introducirán de novo en medio de cultivo (Figura 2). Respecto da lonxitude dos explantos, esta pode variar dende uns poucos milímetros ata varios centímetros. En xeral, canto máis pequena é a parte dunha planta que se establece in vitro máis problemas ofrece, xa que cada fracción illada ten a súa propia proporción de reservas e hormonas, e é obvio que canto maior sexa o fragmento vexetal, máis fácil é inducir o crecemento e rexeneración (Pierik, 1990a). Un problema dos explantos pequenos é que a proporción da superficie cortada en relación co volume do explanto é elevada. Deste xeito, a reacción á ferida é severa e, ás veces tan acusada, que os tecidos non se dan recuperado (Bonga e Von Aderkas, 1992). Unha vez que o brote se divide, é frecuente que unha pequena parte basal do mesmo, que está unida ó calo basal que se forma durante o período de crecemento do brote, non teña a lonxitude suficiente para ser subcultivada. Neste caso, esa parte pode subcultivarse xunto co calo basal (Meier-Dinkel et al., 1993), o cal lle confire o tamaño suficiente para formar un novo explanto (Figura 3). Un mesmo calo pode ser subcultivado (recultivado) varias veces consecutivas, xa que pode permanecer sen deteriorarse varios subcultivos. Introdución 10 Figura 2. Tipos de explantos obtidos tras o subcultivo dun microbrote de castiñeiro. Calo basal Figura 3. Explanto composto polo calo basal e pola parte remanente do microbrote despois de subcultivar. Nós Ápice Calo basal (+ nós) Parte do microbrote demasiado pequena para ser subcultivada como explanto independente Introdución 11 2.2.2.2 - O calo basal 2.2.2.2.1 - Xeralidades. Calo basal vs calo organoxénico Un calo é, basicamente, un tecido tumoral, que se divide de forma activa, máis ou menos organizado, que xeralmente xorde sobre feridas de órganos e tecidos diferenciados (Pierik, 1990a). No cultivo in vitro prodúcese como resposta á separación do explanto e á acción estimuladora de substancias tróficas (sales minerais, azucres, etc.) e dos reguladores do crecemento do medio de cultivo. O calo pode localizarse a nivel das feridas ou pode estenderse a rexións indemnes, e o seu crecemento pode prolongarse ó longo de diferentes transplantes a medio fresco. A estrutura do calo pode ser homoxénea ou heteroxénea. A súa heteroxeneidade pode ser inicial, debida á heteroxeneidade dos tecidos do explanto a partir dos que xorde, ou secundaria. O calo pode ter un crecemento máis ou menos activo, máis ou menos disociado ou compacto; pode ser incoloro ou, máis raramente, clorofílico ou antociánico (Margara, 1988). Poderíase dicir que, en función de que teñan ou non capacidade de rexenerar órganos ou embrións, hai dous tipos de calos: organoxénicos e non organoxénicos. A formación de calos organoxénicos estimúlase co obxectivo de conseguir rexeneración, mentres que os calos non organoxénicos prodúcense xeralmente como resposta directa a unha ferida. Con respecto ós calos organoxénicos, hai multitude de órganos (raíz, caule, folla, flor, ...) ou tecidos que poden ser empregados como material inicial para a súa indución (Rani e Grover, 1999). Unha vez estimulada a súa formación, o calo organoxénico pode dar lugar á formación de órganos adventicios (Pillai e Hildebrandt, 1969; Pierik, 1976; Han et al., 1997; Ntui et al., 2010) e/ou á formación de embrións (Rout et al., 2000; Shibli et al., 2001; Jain et al., 2002; Gopi e Ponmurugan, 2006) que reciben o nome de embrións somáticos (embrioxénese somática indirecta), o cal se consegue xeralmente utilizando medios con elevadas concentracións de auxina. A maior desvantaxe de usar o potencial organoxénico dos calos consiste no risco de que teñan lugar mutacións e variacións citoxenéticas, o que se coñece como variación somaclonal. Según Vestri et al. (1991), o estatus xenético de plantas rexeneradas vía calo pode ser diferente que o do tipo parental, existindo o risco de Introdución 12 perder a fidelidade clonal, sendo este un problema moi grave nun programa de multiplicación vexetativa. Por outra banda, os calos non organoxénicos son aqueles que se forman, xeralmente, como reacción a unha ferida ou corte. Na micropropagación de nós e ápices adoita formarse calo na base do explanto (o que en adiante denominaremos calo basal) que se introduce no medio de cultivo, como resposta á ferida producida polo corte no momento de subcultivar. O calo basal vai incrementando o seu tamaño de xeito progresivo dende que o explanto se introduce no novo medio de cultivo ata o momento no que é necesario subcultivar de novo. Cando se realiza o subcultivo de nós e ápices, é habitual desfacerse do calo basal e non aproveitalo de ningún xeito. Agora ben, o recultivo do calo basal permitiría aproveitar partes do brote que non teñen o tamaño suficiente para ser illadas individualmente, e que permanecen unidas ó calo, obténdose así un maior número de explantos. No caso do uso do calo basal como fonte de explantos, a probabilidade de variación somaclonal é moito menor que a que presentan os calos organoxénicos, xa que a estabilidade xenética normalmente permanece intacta se a propagación in vitro se leva a cabo utilizando o método de explantos nodais ou de xemas axilares (Pierik, 1990a). Soamente podería dubidarse da orixe axilar dun brote se este se ve xurdir do interior do calo, xa que non se podería asegurar se o brote procede dunha xema axilar (que quedou rodeada polo calo) ou se trata dun brote adventicio. 2.2.2.2.2 - Recultivo do calo basal e outros sistemas semellantes en micropropagación O uso do calo basal como explanto para a micropropagación foi documentado en varios traballos, coas especies Pithecellobium scalare (Castillo de Meier e Bovo, 1989), Ulmus procera (Fenning et al., 1993), Robinia pseudoacacia (Woo et al., 1995) e Acer palmatum (Pérez et al., 2003). Sánchez (1991), utilizando o recultivo do calo basal en castiñeiro e carballo, conseguiu acurtar o período de subcultivo de microbrotes de castiñeiro de 4-5 semanas a 3 semanas, así como mellorar significativamente a taxa de multiplicación do clon de carballo durante 2 recultivos. Introdución 13 Meier-Dinkel et al. (1993) utilizaron o recultivo do calo basal para obter brotes para facer probas de enraizamento en Quercus robur. Observaron unha maior porcentaxe de enraizamento nas microestacas procedentes dos calos basais que nas procedentes de nós e ápices, achacándolle o efecto a un mellor estado fisiolóxico daqueles debido ó seu maior tamaño. No entanto, Sánchez (1991) comparando o enraizamento adventicio do mesmo tipo de explantos non observou un aumento significativo da porcentaxe de enraizamento. Nesta mesma especie, Llamazares (2003) comprobou que, en xeral, o primeiro recultivo do calo basal achega un maior número de explantos que un brote convencional (nó ou ápice). Os estudos realizados con calos basais, en todo caso, non son moi numerosos, adoptándose nalgúns casos sistemas parecidos, pero con claras diferenzas. Así, San José et al. (1988), nun estudo feito en carballo, estudaron a influencia do recultivo do mesmo explanto (inicialmente un segmento nodal), situado horizontalmente no medio de multiplicación, sobre as taxas de multiplicación e as porcentaxes de enraizamento dos brotes obtidos a partir del. Neste sistema, os explantos orixinais desenvolven un calo en cada un dos seus extremos, polo que se pode considerar, ata certo punto, semellante ó recultivo do calo basal. Unha vez que se cortan novos microbrotes, o explanto orixinal é recultivado a medio fresco (segundo ciclo de cultivo). Nos sucesivos recultivos, os novos microbrotes desenvólvense a partir de xemas do explanto orixinal que non agromaron, ou de xemas axilares remanentes de novos microbrotes de recultivos precedentes, sendo neste aspecto semellante ó recultivo do calo basal. O sistema permitiulles obter maiores taxas de multiplicación que realizando o subcultivo convencional de nós e ápices. No quinto recultivo, a maior parte dos explantos reducía a súa produtividade, sendo a taxa de multiplicación menor de 1. Esta mesma técnica foi utilizada por Ballester et al. (1990) en dous clons de carballo e un de camelia. Nos clons de carballo, a porcentaxe de enraizamento dos explantos procedentes dos 2-4 primeiros recultivos era maior ca dos explantos subcultivados de forma convencional, e no de camelia, a porcentaxe de enraizamento aumentaba nos explantos obtidos no 2º e 3º recultivo. Por outra banda, Sánchez et al. (1997) utilizaron un proceso idéntico na micropropagación de castiñeiro. A taxa de multiplicación dos explantos situados Introdución 14 horizontalmente foi significativamente maior que a dos nós e ápices colocados de forma vertical no medio. O número de novos microbrotes por explanto orixinal foi aumentando na maioría dos seguintes recultivos. Recultivar os explantos colocados de forma horizontal tivo un efecto positivo nas porcentaxes de enraizamento dos brotes producidos. Nun dos clons, a mellora nas taxas de multiplicación estendeuse ata o 8º recultivo e o ciclo de multiplicación, debido á maior velocidade de crecemento dos microbrotes, reduciuse a dúas semanas. A colocación en horizontal de explantos foi utilizada, así mesmo, noutras especies, como Rhododendron sp. (Anderson, 1984), Malus sp. (Yae et al., 1987), Quercus rubra (Viéitez et al., 1993) e Codiaeum variegatum (Orlikowska et al., 2000), o que habitualmente permite obter maior número de microbrotes por explanto que o cultivo en vertical (McClelland e Smith, 1990). A principal diferenza deste sistema co recultivo do calo basal é que no recultivo horizontal as xemas axilares do explanto están en contacto co medio de cultivo, mentres que no recultivo do calo a parte do caule que permanece sobre o mesmo non toca o medio. O recultivo do calo basal achega, en certos casos, resultados positivos na micropropagación, proporcionando un aproveitamento máis efectivo do material vexetal (Sánchez, 1991); non hai, porén, estudos que determinen a implicación sobre as taxas de multiplicación usando esta técnica, é dicir, como afecta incluír o recultivo do calo basal ó rendemento do sistema se o comparamos con aquel que non aproveita este explanto. Por outra parte, tampouco se define a influencia que pode ter aproveitar o calo basal no risco de variación somaclonal que normalmente se asocia a estes tecidos. 2.2.3 - Fases da micropropagación de nós e ápices A micropropagación abarca unha serie de fases, que van dende o momento en que o material vexetal que se pretende propagar se introduce in vitro, ata o momento no que se obteñen plantas en condicións de establecérense no campo. De forma xeral, a micropropagación de nós e ápices engloba catro fases: 1 - Introdución ou establecemento in vitro: corresponde á fase na que un fragmento do material vexetal procedente do exterior se introduce en condicións de cultivo in vitro. Debido a que a micropropagación ten lugar en condicións asépticas, Introdución 15 previamente á introdución in vitro é necesario levar a cabo un proceso de desinfección, para evitar a contaminación dos cultivos provocada polos microorganismos que poida portar o material vexetal procedente das condicións ex vitro. Unha vez desinfectado superficialmente, o explanto introdúcese nun medio de cultivo que contén reguladores do crecemento (normalmente citoquininas), para forzar o agromo das xemas que porta o explanto, obtendo así novos microbrotes que permitirán iniciar a fase de multiplicación. 2 - Fase de multiplicación: unha vez que se consegue o desenvolvemento dos primeiros microbrotes, e estes acadan unha lonxitude suficiente (≥ 2 cm), divídense en partes máis pequenas (1-2 cm) e introdúcense en medio de multiplicación (normalmente cunha concentración de citoquininas inferior á utilizada para a fase de introdución in vitro). Transcorrido un certo tempo, e unha vez que os novos explantos producen novos microbrotes, repítese o proceso de división e introdución en medio de multiplicación (subcultivo) (Figura 4). Os sucesivos subcultivos teñen lugar a intervalos periódicos, obténdose cada vez un número maior de explantos. Esta fase finaliza cando se consegue acadar o número de microbrotes necesarios para o fin desexado. Figura 4. Esquema da fase de multiplicación. Introdución 16 3 - Fase de enraizamento: esta fase ten lugar cando finaliza a fase de multiplicación, e consiste en inducir a formación de raíces nos microbrotes obtidos naquela, comportándose neste momento como microestacas. O enraizamento pode levarse a cabo in vitro ou in vivo. No primeiro caso conséguese, de forma habitual, utilizando medios de cultivo cunha concentración de macronutrientes máis baixa que para a multiplicación (Viéitez e Viéitez, 1983; Volkaert et al., 1990), e utilizando auxinas como indutores do enraizamento. No segundo caso, as microestacas introdúcense directamente nun substrato utilizado en propagación (turba, perlita, area, mesturas), mantendo unha alta humidade relativa e utilizando tamén auxinas. É bastante frecuente que haxa unha porcentaxe de microestacas que non produzan raíces, fenómeno que é máis acusado en certas especies recalcitrantes, coma o carballo e o castiñeiro. Este é un problema fundamental da micropropagación destas especies, xa que esta fase é crucial para poder chegar a dispor de plantas completas. 4 - Fase de aclimatación: as microestacas que desenvolven raíces (vitroplantas) pasan á fase de aclimatación, que consiste no acondicionamento gradual das vitroplantas ás condicións exteriores. Isto faise, normalmente, introducindo as vitroplantas en bandexas de cultivo cun substrato semiestéril (turba, perlita, vermiculita, cortiza de piñeiro ou mesturas) e colocándoas en condicións ambientais controladas, iniciando o proceso con altos niveis de humidade ambiental, os cales se van reducindo progresivamente ata chegar ás condicións propias do ambiente natural. Unha vez remata esta fase, obtéñense plantas completas e independentes, xenotipicamente idénticas a aquelas das que se recolleu o material de partida. 2.2.4 - Factores que afectan ó éxito da micropropagación A micropropagación vese influída por múltiples factores (Mantell, 1985; Debergh, 1988; Benson, 2000), entre os que destacan o estado fisiolóxico da planta nai, o medio e as condicións físicas de cultivo, o estrés fisiolóxico da planta in vitro, a idade da planta e, por suposto, o xenotipo. Non tódalas especies arbóreas teñen a mesma facilidade para adaptarse á micropropagación; entre as consideradas doadas de propagar encóntrase por exemplo os xéneros Betula e Populus, mentres que os xéneros Quercus e Castanea se consideran de difícil multiplicación (McCown e McCown, 1987). Introdución 23 Táboa 2. Condicións de enraizamento utilizadas en diversos estudos de micropropagación de Quercus robur (MC: hormona engadida ó medio de cultivo; IB: inmersión basal en disolución concentrada). Referencia Tipo de hormona Exposición á hormona Concentración e tempo de exposición Medio de expresión Chalupa 1981, 1984 AIB ANA MC 0,3 mg·L - 1 0,1 mg·L-1 Volkaert et al., 1990 AIB e ANA MC 0,04 - 4 mg·L-1 1/2 WPM Otero, 1999 AIB MC 3 mg·L - 1 Puddephat et al., 1999 AIB MC 1 mg·L-1 - 7 días Sánchez et al., 1996 AIB MC MC IB 3 mg·L - 1 - 7 días 25 mg·L-1 - 1 día 1 g·L-1 - 30 s 1/3 GD San-José et al., 1988 AIB IB 1 g·L-1 - 120 s 1/2 GD San José et al., 1983 AIB IB 0,5 g·L - 1 - 10 mim 1 g·L-1 - 2 min Pevalek- Kozlina, 1991 AIB g 1/2 GD Llamazares, 2003 AIB IB 1 g·L-1 - 30 s Fase de aclimatación Con respecto á fase de aclimatación, os factores que máis inflúen son as condicións ambientais ás que se someten as microestacas ou microbrotes e o substrato no que se introducen. Volkaert et al. (1990) aclimataron microbrotes de carballo en vermiculita, humedecida cunha disolución mineral e manténdoos nun invernadoiro con temperaturas entre 20 e 30 ºC, cun fotoperíodo natural, unha humidade relativa do 80 % e regando unha vez á semana con auga desionizada. Así, conseguiron unha supervivencia dun 90 %, acadando as plantas ós 2 meses unha lonxitude de 10-15 cm. Altos niveles de supervivencia tamén foron conseguidos por Chalupa (1988) ó transplantar os Introdución 24 microbrotes enraizados ó solo. Noutros casos, como na especie Quercus rubra, a supervivencia na aclimatación non superou o 30 % (Vengadesan e Pijut, 2009). Por outra banda, Sha Valli Khan et al. (1999), para aclimatar brotes de carballo enraizados in vitro, transplantáronos a bandexas de plástico con vermiculita estéril e saturada cunha disolución de ½ MS. Tres semanas despois foron transplantadas de novo a envases con substrato fertilizado e mantidas en invernadoiro. Analizando as características dos estomas e a perda de auga, concluíron que as plantas aclimatadas tiñan estomas en forma de elipse, mentres que nas follas dos brotes na fase de multiplicación in vitro a densidade de estomas era maior, con forma esférica e con aberturas máis grandes. A forma esférica dos estomas está relacionada cunha menor funcionalidade, mentres que a elipsoide denota un funcionamento normal (Zacchani et al., 1997). En canto á perda de auga, as follas de cultivo in vitro perdían un 88 % do seu contido en 30 min ó situalas en aire seco, mentres que as follas aclimatadas soamente perdían un 14 % no mesmo intervalo de tempo. Resultados moi parecidos, en canto á perda de auga, foron encontrados na especie Quercus suber (Romano e Martins-Loução, 2003). 2.2.6 - Cultivo in vitro no xénero Castanea Existen multitude de estudos de multiplicación in vitro de castiñeiro a partir de xemas adventicias e/ou por embrioxénese somática. Por exemplo, San José e Viéitez (1984), conseguiron a formación de xemas adventicias en seccións de epicotilo de plántulas de castiñeiro, mediante a adición de BA ó medio, obtendo os mellores resultados co medio de Heller (1953) e os tratamentos con 2 mg·L-1 de BA soa ou en combinación con 0,01 mg·L-1 de ANA ou AIB. Co obxectivo de obter un protocolo de rexeneración de plantas de castiñeiro para usar en enxeñería xenética, Mulin et al. (1999) utilizaron seccións lonxitudinais de entrenós e segmentos de entrenós de brotes cultivados in vitro. Para estimular a formación de brotes adventicios empregaron medio MS modificado, con BA e AIA, obtendo brotes que enraizaron in vitro e foron funcionais unha vez transferidos ó solo. Giovannelli et al. (2004) obtiveron brotes e raíces adventicios a partir de fragmentos de cotiledóns de Castanea sativa. A presenza ou ausencia de reguladores do Introdución 25 crecemento non influíu significativamente na rexeneración de raíces, mentres que as citoquininas estimularon a formación de brotes. En canto ós estudos de embrioxénese somática no xénero Castanea, estes fixéronse inicialmente a partir de embrións cigóticos inmaturos (Merkle et al., 1991; Viéitez, 1995; Xing et al., 1999). Sauer e Wilhelm (2005) investigaron a iniciación da embrioxénese somática a partir de diferentes explantos xuvenís de castiñeiro: ovarios, óvulos e embrións cigóticos inmaturos, obtendo os mellores resultados nos embrións cigóticos recollidos 5-10 semanas despois da antese. Ballester et al. (2001) estudaron a indución de embrioxénese en Castanea sativa a partir de tecidos procedentes de castañas, 1-10 semanas despois da antese, e a partir de seccións de folla e de entrenós. No primeiro caso, comparando os resultados a partir de diferentes explantos, a porcentaxe de embrións somáticos conseguidos foi de 5,1 % para os ovarios, 3 % para os óvulos e 27 % para os embrións cigóticos. As follas e entrenós, procedentes de brotes dun clon xuvenil cultivado in vitro, cultiváronse en medio MS con diferentes concentracións de BA en combinación con AIA ou ANA. Despois de 6 semanas, transferíronse ó mesmo medio con 0,1 mg·L-1 BA e 0,1 mg·L-1 de ANA durante 4 semanas. Os resultados mostraron unha baixa ocorrencia de embrioxénese (0,5 %), que se consegue con 1 mg·L-1 de BA e 1 mg·L-1 de ANA no medio inicial. Unha vez formados os embrións, estes son subcultivados en medio MS, coa metade da concentración de macronutrientes, e con 0,1 mg·L-1 de BA e 0,1 mg·L-1 de ANA, obténdose novos embrións por embrioxénese secundaria. Por outra banda, Corredoira (2002) demostrou que a indución de embrións somáticos é posible a través de material clonal cultivado in vitro. Estableceu liñas embrioxénicas a partir de explantos procedentes de follas de brotes cultivados in vitro, usando medio MS con 1 mg·L-1 de BA e 1 mg·L-1 de ANA. Posteriormente (Corredoira et al., 2003), estudouse a embrioxénese secundaria a partir dos embrións somáticos iniciais, con respecto á fase de maduración e xerminación. Neste estudo optimizouse o medio de maduración engadindo un 3 % de maltosa, e determinouse que a conversión a plántulas soamente ten lugar nos embrións sometidos a un tratamento en frío. Con respecto á multiplicación in vitro de nós e ápices a partir de xemas preexistentes de Castanea sativa, existen igualmente na bibliografía multitude de Introdución 26 estudos, que se comentan tomando como referencia os resultados acadados nas diferentes fases da micropropagación. Introdución in vitro Respecto á época de colleita do material vexetal de castiñeiro do que se tomarán explantos para introducir in vitro, debe terse en conta que o material colleitado no inverno produce maior exudación de taninos que se é colleitado na primavera ou verán (Biondi et al, 1981), os cales poden afectar negativamente ó desenvolvemento dos explantos. Mert e Soylu (2009) utilizaron ápices de xemas en repouso como fonte de explantos para iniciar a fase de multiplicación en tres clons de castiñeiro, conseguindo así ampliar a época de dispoñibilidade de material fronte ó método convencional, onde se adoita utilizar brotes na época de crecemento vexetativo. En canto ó proceso de desinfección previo ó establecemento in vitro, o tratamento con lixivia é máis efectivo que con auga osixenada, e o grao de contaminación depende do estado vexetativo da planta nai e da localización e tipo de explanto inicial (Ferrador et al., 2005). Os microorganismos endóxenos máis habituais pertencen ós xéneros Bacillus e Pseudomonas. Viéitez et al. (2007) aconsellan utilizar brotes procedentes de forzado de segmentos de rama, en cámara de cultivo, para reducir a porcentaxe de contaminación no establecemento in vitro. Os medios de cultivo máis empregados para o establecemento in vitro foron MS (Viéitez e Viéitez, 1980; Mullins, 1987) e GD (Sánchez e Viéitez, 1991; Viéitez et al., 2007), principalmente. Con respecto ás hormonas, a BA é a que mellores resultados proporciona, en concentracións que varían entre 0,5 e 1 mg·L-1 (Viéitez e Viéitez, 1980; Sánchez e Viéitez, 1991; Viéitez et al., 2007). Fase de multiplicación Na fase de multiplicación, coma no caso do carballo, a hormona máis empregada en cultivo in vitro de nós e ápices é a BA; en combinación con outros reguladores, como ANA (Viéitez e Viéitez, 1983) ou AIB (Chevre et al., 1983), ou como único regulador do crecemento, resultou ser máis efectiva que outras citoquininas (Osterc et al., 2005). Os medios de cultivo máis empregados son GD e MS. Na Táboa 3 detállanse os medios de cultivo e a concentración de BA que achegaron os mellores resultados en diversos estudos de micropropagación de castiñeiro. Introdución 27 Táboa 3. Medios e concentracións de BA empregados en diversos estudos de multiplicación in vitro de nós e ápices de Castanea sativa. Referencia [BA] (mg·L - 1 ) Medio de cultivo Viéitez e Viéitez, 1980 0,1 MS Viéitez e Viéitez, 1983 0,1-0,5 MS, Heller, Lepoivre Chevre et al., 1983 1 MS Sánchez e Viéitez, 1991 0,2 GD Gonçalves et al., 1998 0,2 GD Miranda-Fontaíña e Fernández-López, 2001 0,2 GD Osterc et al., 2005 1 MS-1/2NO3 Viéitez et al., 2007 0,1-0,2 GD O medio GD foi un dos máis usados na multiplicación in vitro do castiñeiro, e é o medio de referencia nos protocolos actuais de micropropagación para Castanea sativa (Viéitez et al., 2007), onde se aconsella utilizar xunto coa adición de 0,1-0,2 mg·L-1 de BA. No noso laboratorio téñense obtido mellores resultados utilizando medio WPM que con GD, como sucede, por exemplo, en C. dentata (Xing et al., 1997; Guochen et al., 2009). No tocante á concentración de BA, a nosa experiencia di que, globalmente, 0,1 mg·mL-1 achega mellores resultados que 0,2 mg·mL-1. A BA a doses baixas tamén deu bos resultados en híbridos con Castanea crenata (Viéitez et al., 1983; Sánchez e Viéitez, 1991; Ballester et al., 2001), ou noutras especies do mesmo xénero, coma C. mollissima (Qi-Guang et al., 1986). No entanto, coma noutros aspectos da micropropagación, a resposta a un ou outro medio de cultivo ou concentración hormonal depende en gran medida do xenotipo (Chauvin e Salesses, 1988; Miranda- Fontaíña e Fernández-López, 2001). Outros aspectos, que tamén foron estudados na fase de multiplicación do castiñeiro, foron o tratamento con antioxidantes para reducir o exudado de taninos ó medio por parte dos brotes (Chevre et al., 1983), a concentración de nitróxeno no medio (Piagnani e Eccher, 1988), o tipo de fonte de carbono (Ballester et al., 2001) ou a orientación do explanto no medio de cultivo (Sánchez et al., 1997). Introdución 28 Fase de enraizamento Do mesmo xeito que o carballo, o castiñeiro considérase unha especie difícil de enraizar no estado adulto, o que condiciona moito o éxito da micropropagación. Foron moitos os estudos enfocados a solucionar o problema do enraizamento in vitro, cuxos resultados máis significativos se mencionan a continuación. No tocante ó medio de cultivo e ós reguladores do crecemento empregados na fase de enraizamento, na bibliografía atópanse numerosas referencias, que inclúen como factor determinante do éxito desta fase, do mesmo xeito que no carballo, a presenza dun estímulo auxínico, normalmente o AIB (Táboa 4). Noutras especies de Castanea, as condicións de enraizamento foron semellantes ás detalladas na Táboa 4. Por exemplo, Viéitez et al. (1983), para enraizar brotes cultivados in vitro de híbridos de Castanea sativa x C.crenata, mergullaron a base dos brotes en disolucións de AIB a unha concentración de 0,5 g·L-1 e 1 g·L-1 durante 15 min e 2 min respectivamente. Neste mesmo híbrido, Gonçalves et al. (1998) mergullaron a base dos brotes nunha disolución de 1 g·L-1 de AIB durante 1 min, ou mantiveron as microestacas 5 días nun medio con 3 mg·L-1 de AIB. O enraizamento de microestacas de Castanea mollissima conseguiuse mergullando a base das mesmas, durante 1 s, en disolucións de 2 e 3 g·L-1 de AIB, obtendo os mellores resultados coa concentración máis elevada (Qi-Guang et al., 1986). Na especie Castanea dentata (Marsh.) Borkh., o enraizamento levouse a cabo mergullando a base das microestacas en disolucións de AIB (2 ou 3 g·L-1) durante 1 min e transferíndoas a medio MS coa metade de concentración de macronutrientes (Xing et al., 1997). Outros factores estudados no enraizamento de microestacas de castiñeiro foron, por exemplo, a concentración de sacarosa no medio de cultivo e a temperatura da cámara de cultivo (San José e Viéitiez, 1984), a adición de carbón activo ó medio para evitar a necrose apical das microestacas (Viéitez et al., 1989) e a influencia das micorrizas na supervivencia de microestacas (Martins et al., 1996, 1997), entre outros. Introdución 29 Táboa 4. Condicións de enraizamento utilizadas en diversos estudos de micropropagación de Castanea sativa (MC: hormona engadida ó medio de cultivo; IB: inmersión basal en disolución concentrada). Referencia Tipo de hormona Exposición á hormona Concentración e tempo de exposición Medio de expresión Chevre et al., 1983 AIB MC IB 1 mg·L - 1 1 g·L-1 - 20 s MS Viéitez e Viéitez, 1983 AIB e ANA MC IB 3 mg·L - 1 - 12 días 1 g·L-1 - 2 min 1/2 MS (1/2 NO3) San José e Viéitez, 1984 AIB MC IB 2 mg·L - 1 - 6 días 1 g·L-1 - 2 min 1/2 MS (1/2 NO3) Sánchez e Viéitez, 1991 AIB IB 1 g·L - 1 - 0,5 - 3 min 1/3 GD Viéitez et al., 2007 AIB MC MC IB 3 mg·L - 1 - 5-7 días 25 mg·L-1 - 1 día 1 g·L-1 - 1-2 min Fase de aclimatación No que atinxe á fase de aclimatación, Viéitez et al. (2007) indican que a porcentaxe de supervivencia das microestacas de castiñeiro é maior se o enraizamento ten lugar directamente no substrato de aclimatación que se ten lugar in vitro. Isto foi comprobado previamente por Gonçalves et al. (1998) na aclimatación de microestacas de híbridos de Castanea sativa x C. crenata. Respecto ó protocolo aconsellado por Viéitez et al. (2007), unha vez que os brotes son mergullados en hormona, trasládanse a bandexas de poliestireno, colocando 100 brotes por bandexa, cunha mestura 1:2 de cortiza de piñeiro e perlita tratada con solución funxicida. As bandexas tápanse cun film de polietileno transparente e déixanse nunha cámara de cultivo durante 2 meses, onde se regan dúas veces á semana, unha con solución funxicida e outra con auga. Posteriormente, sácanselles as tapas e lévanse ó invernadoiro durante 1 mes, utilizando un sistema de nebulización para manter un 90 % de humidade relativa. Finalmente, as plantas enraizadas trasládanse a envases individuais cunha mestura 1:2:1 de cortiza de piñeiro, perlita e turba suplementada con Osmocote ®, e sométense a unha humidade relativa progresivamente máis baixa. Introdución 30 Outros factores estudados na aclimatación de híbridos de Castanea sativa x C. crenata foron a influencia da intensidade lumínica (Gonçalves et al., 2000; Carvalho e Amâncio, 2002) e da concentración de CO2 (Ballester et al., 2001; Carvalho e Amâncio, 2002), obtendo os mellores resultados coas intensidades de luz máis elevadas (300 vs 150 µmol·m-2·s-1) e concentracións de CO2 máis altas (700 vs 350 ppm). 2.2.7 - A maduración e a súa influencia na micropropagación 2.2.7.1 - Maduración e propagación vexetativa nas árbores Como xa se comentou anteriormente, un dos factores que máis inflúen sobre a capacidade de multiplicación dun material vexetal é o seu grao de xuvenilidade ou madurez, e estes relaciónanse directamente co proceso de maduración ou cambio de fase. No desenvolvemento de tódalas especies leñosas hai un período no que a floración non é posible de forma natural, coñecéndose dito período como fase xuvenil. A súa duración é variable, oscilando dende unhas semanas nas plantas herbáceas ata varios anos nas leñosas. Unha vez que se acada a capacidade de florecer e se mantén baixo condicións naturais, considérase que a planta entrou na fase adulta. O paso dunha a outra fase denomínase cambio de fase ou maduración (Hackett e Murray, 1996). A maduración pode definirse, globalmente, como un proceso de desenvolvemento que inclúe cambios en características morfolóxicas e fisiolóxicas que conducen ó estado reprodutivo. Unha vez que se acada o estado adulto, este é relativamente estable, xa que normalmente non ten lugar a reversión ó estado xuvenil. No entanto, dita reversión prodúcese de forma natural durante a reprodución sexual e apomíctica. Ademais, pode ser inducida por medio de certos tratamentos que conlevan a formación de brotes adventicios e de embrións somáticos. Mentres que a propagación vexetativa do material xuvenil se leva a cabo facilmente empregando métodos tradicionais (Hackett, 1976; Mantell, 1985), o envellecemento fisiolóxico que conduce ó estado adulto afecta negativamente a este tipo de propagación (Hackett, 1985; Bonga e Von Aderkas, 1992; Huang et al., 1995; Ewald, 1999). Non obstante, as plantas nai para propagación vexetativa son a miúdo árbores adultas, porque é nesta fase, normalmente, cando se poden seleccionar por Introdución 31 aquelas características que as fan interesantes para ser clonadas, e que demostraron no campo durante un tempo suficiente (Bonga e Von Aderkas, 1992). Numerosos autores demostran nos seus estudos o diferente comportamento in vitro do material xuvenil e adulto en Quercus robur L. (Chalupa, 1981, 1984; Viéitez et al., 1985; San-José et al., 1985, 1988; Favre e Juncker, 1987; Juncker e Favre, 1989; Evers et al., 1996a; Appelgren e Vintland, 1997; Appelgren, 1997; Pierik et al., 1997a; Pierik et al., 1997b) e Castanea sativa Mill. (Biondi et al.,1981; Chevre et al., 1983; Mullins, 1987; Sánchez e Viéitez, 1991; Ballester et al., 1999), sendo sempre o material adulto máis difícil de propagar que o xuvenil. Durante o cambio de fase, ademais da transición cara ó estado reprodutivo, teñen lugar cambios progresivos noutros atributos, como modificacións nas cutículas foliares, na cortiza, na forma e grosor das follas, na presenza ou non de espiñas, na orientación dos brotes, na pigmentación do caule, no tamaño dos ápices, na resistencia a enfermidades, na velocidade de crecemento ou na capacidade de formación de xemas e raíces adventicias (Hackett e Murray, 1993). En ocasións, algúns destes atributos, coma o ángulo de inserción dos brotes ou algunhas características biométricas do caule, poden servir de marcadores morfolóxicos da xuvenilidade, como amosan algúns estudos (McGowran et al., 1998) en Quercus robur e Quercus petraea. Os problemas que presenta a propagación vexetativa de material adulto acentúanse ó traballar con material seleccionado para o eido forestal, xa que a diminución no vigor de crecemento que acompaña á maduración é un factor negativo que incide directamente na produción de madeira (Bonga, 1982). 2.2.7.2 - Fundamentos do cambio de fase O meristema apical e a rexión meristemática subapical do ápice dun caule, así coma os puntos de inserción das follas, son os lugares onde se orixinan as diferentes vías de diferenciación celular, de tecidos e órganos. Este feito leva á conclusión de que estas partes da planta están relacionadas coas diferenzas en características fisiolóxicas, anatómicas e morfolóxicas que acompañan á maduración (Hackett e Murray, 1996). Pénsase que a xuvenilidade é un estado que existe nos meristemas (Thomas, 2002), e a través dunha serie de pasos avanza a un estado relativamente estable característico do meristema adulto (Pierik, 1990b). Introdución 32 Para explicar a estabilidade que acompaña á adquisición do estado adulto, propuxéronse as seguintes hipóteses (Wareing e Frydman, 1976): - Hipótese celular: as variacións entre o estado xuvenil e adulto débense a diferenzas intrínsecas entre as células meristemáticas dos ápices xuvenís e adultos. - Hipótese estrutural e de organización: as propiedades estables dos meristemas débense á estrutura e organización do ápice caulinar coma un todo. - Hipótese correlativa: a estrutura e propiedades do meristema apical están controladas por influencias de tecidos diferenciados preexistentes e localizados en zonas máis ou menos remotas da planta. Os datos experimentais non exclúen ningunha das tres, polo que é moi factible que o proceso de maduración se desenvolva nos tres niveis, e mesmo que o peso relativo de cada un deles sexa diferente segundo a especie considerada (Hackett, 1985). 2.2.7.3 - Control do cambio de fase En canto ós factores que desencadean o cambio de fase, Haffner et al. (1991) conclúen que son as hormonas vexetais as que controlan a maduración, e que os ratios entre elas son máis importantes que a súa concentración absoluta. O feito de que o GA3 esóxeno poida causar reversión a un estado xuvenil de plantas de Hedera helix adultas (Robbins, 1957) conduciu á hipótese de que esta hormona era importante no proceso de maduración. Outros experimentos concluían que as xiberelinas poderían ser as responsables do proceso de maduración (Pharis e King, 1985), xa que promovían a floración. No entanto, se o contido de xiberelinas inflúe na maduración, debería haber un mecanismo que regulase as concentracións endóxenas destas substancias, e probablemente doutras hormonas, ou a capacidade da planta para responder á súa presenza. Por outra banda, dende o punto de vista xenético, o paso ó estado adulto contémplase como unha acumulación de cambios epixenéticos, que supoñen a expresión diferencial dalgúns xenes, pero non necesariamente un cambio permanente na constitución do xenoma (Gil et al., 2003). O control da expresión diferencial de xenes Introdución 39 casos, nula no ápice. Estes coñecementos foron tomados como base para obter plantas libres de virus a través do microenxerto de meristemas in vitro, descrito por primeira vez por Murashige et al. (1972). Desta forma, foron saneados principalmente árbores frutais, como cítricos (Navarro et al., 1975; Starrantino e Caruso, 1988; Tusa et al., 1988; Vilela et al., 1993; Singh et al., 2008), especies do xénero Prunus (Deogratias et al., 1986; Deogratias et al., 1989; Barba et al., 1995), Passiflora edulis (Monteiro et al., 2008), ou plantas herbáceas, como Capsicum sp. (Katoh et al., 2004). No caso de material xenético de elevado valor, como as plantas transxénicas, o microenxerto pode ser usado para proporcionarlle un sistema radicular eficiente a aqueles brotes que non enraizaron in vitro (Luo e Gould, 1999), xa que, neste tipo de material, un enraizamento adventicio deficiente representa unha alta perda de eficiencia. Así mesmo, o microenxerto utilízase como método de indexado para detectar viroses en material vexetal (por exemplo en vide; Pathirana e McKenzie, 2005), ou para inocular bacterias co obxectivo de ensaiar material resistente (p. ex. en Malus sp.; Bisognin et al., 2007). Como se indicou, o microenxerto foi ensaiado en moitos casos como método de rexuvenecemento de material adulto, sendo este un dos aspectos tratados neste traballo. Dito uso descríbese polo miúdo no apartado 3.3. 3.2 - Factores que afectan ó prendemento dos microenxertos O éxito na realización do microenxerto depende primordialmente da especie e xenotipo utilizados, e da compatibilidade entre púa e patrón. Outros factores, mencionados na literatura son, entre outros, o tipo de enxerto, o tamaño da púa e o estado ontoxenético da mesma. Entre os tipos de enxerto, o de fendedura é o máis empregado e o que achega os mellores resultados en Garcinia mangostana (Te-chato et al., 1992), Larix sp. (Ewald, 1997), Malus domestica (Dobránszki et al., 2000), Pinus radiata (Fraga et al., 2002a), Pistachia vera (Onay et al., 2004), Ziziphus mauritiana var. Gola (Danthu et al., 2004), Persea americana (Raharjo e Litz, 2005), Garcinia indica (Chabukswar e Deodhar, 2006) e Protea cynaroides (Wu et al., 2007). Tamén tivo éxito o enxerto lateral en Pseudotsuga menziesii (Monteuuis, 1995a), Anacardium occidentale (Mneney e Introdución 40 Mantell, 2001), Persea americana (Raharjo e Litz, 2005) e Prunus dulcis (Yιldιrιm et al., 2010). Respecto da posición da púa (sobre o epicotilo ou sobre o hipocotilo), nun estudo realizado sobre anacardo (Mneney e Mantell, 2001), aínda que a porcentaxe de prendemento non varía, os enxertos realizados sobre o hipocotilo medraron con máis vigor que os realizados sobre o epicotilo. En xeral, canto maior é o tamaño da púa (dentro dun rango que varía normalmente de 0 a 15 mm) a porcentaxe de éxito aumenta (Pierik, 1990b). Nun estudo feito en plantas de algodón (Luo e Gould, 1999), pasouse dunha porcentaxe de prendemento dun 40 %, con púas de 1-2 mm, a un 95 %, con púas de 8-10 mm. Segundo Thimmappaiah et al. (2002), a porcentaxe de prendemento en Anacardium occidentale varía dende un 0,5 % con púas de 0-5 mm ata un 79,5 %, con púas de 6-15 mm. Onay et al. (2004), traballando con Pistachia vera determinan o tamaño óptimo entre 4-6 mm, diminuíndo notablemente a porcentaxe de éxito cando a púa é maior de 10 mm. Nun estudo feito en castiñeiro (Fernández-Lorenzo e Fernández-López, 2005) empregáronse púas de 15-20 mm constituídas por brotes apicais de dous clons adultos cultivados in vitro, obténdose unha porcentaxe de prendemento en torno ó 80 %. Amiri (2006) obtivo, na especie Prunus avium, os mellores resultados de prendemento con púas de 6-15 mm, fronte a outras de 3-6 mm. Con respecto ó grao de maduración do material, en certos casos, a porcentaxe de enxertos que prenden é maior canto máis xuvenil é o material que se enxerta, o que se comprobou en Prunus avium e Prunus persica (Deogratias et al., 1986). Probablemente por iso, cando se pretende levar a cabo un programa de enxerto en cascada, o éxito do enxerto adoita aumentar despois do primeiro paso (Siniscalco e Pavolettoni, 1988; Fraga et al., 2002a). No entanto, noutras casos isto non sucede, por exemplo en Larix laricina (Greenwood et al., 1989) ou en Faidherbia albida (Danthu et al., 2002). Outro dos factores que inflúe no prendemento é a rapidez durante a execución dos enxertos (Navarro, 1988). A maior rapidez, haberá menores problemas asociados coa oxidación de compostos fenólicos, sendo este factor máis efectivo que a utilización de antioxidantes. Introdución 41 3.3 - O microenxerto como método de rexuvenecemento 3.3.1 - Introdución Sen dúbida, un aspecto importante do microenxerto, vinculado á micropropagación in vitro, é a súa posible utilidade como método de rexuvenecemento de material adulto (Greenwood, 1987). A realización de un ou varios microenxertos de material adulto sobre plántulas procedentes de semente parece provocar a recuperación das capacidades morfoxenéticas perdidas no proceso de maduración (Champagnat, 1980; Bonga e Von Aderkas, 1992). Esta recuperación pode evidenciarse de forma sinxela no aumento da velocidade de crecemento dos explantos e, sobre todo, na mellora da capacidade de enraizamento dos brotes. Existen múltiples exemplos dos posibles efectos de rexuvenecemento do microenxerto en distintas especies. Nalgúns casos o efecto é nulo (Sánchez, 1991), noutros prodúcese unha revigorización transitoria (Tranvan et al., 1991; Ewald e Naujoks, 1997) e, nalgunha ocasión parece acadarse verdadeiro rexuvenecemento (Huang et al., 1992a, 1992b). Isto pon de manifesto, sobre todo, a importancia do factor especie no éxito da técnica. Nos casos nos que se produce rexuvenecemento, este adoita ser gradual, observándose un comportamento máis xuvenil a medida que aumenta o número de enxertos en serie realizados (Huang et al., 1992a; Huang et al., 1992b). 3.3.2 - Microenxertos in vitro vs Microenxertos in vivo Os microenxertos pódense realizar tanto in vitro como in vivo. A efectos comparativos, os microenxertos in vitro son máis difíciles de realizar que os realizados in vivo, entre outros motivos, pola necesidade de traballar en condicións asépticas e con púas de moi pequeno tamaño, que xeralmente esixen o uso dunha lupa binocular para a súa realización. A maior dificultade de realización vese compensada pola vantaxe de que o material xa está adaptado ás condicións in vitro. Os microenxertos in vivo son máis fáciles de realizar, xa que se usan púas de maior tamaño e non se precisa traballar en condicións de asepsia. No entanto, cando se precisa realizar microenxertos en serie, os ciclos de enxerto adoitan ser máis longos e, se a finalidade é a introdución in vitro, o material necesita dun proceso previo de desinfección e establecemento in vitro, no que se poden producir contaminacións, e require dun período máis ou menos prolongado de estabilización in vitro. Neste senso, os microenxertos in vitro son máis vantaxosos. Introdución 42 Respecto ó efecto como técnica de rexuvenecemento, en función do uso de un ou outro tipo de microenxerto, Franclet et al. (1987) afirman que o rexuvenecemento mediante microenxerto in vivo é máis lento que in vitro. 3.3.3 - Uso do microenxerto in vitro na micropropagación Os estudos que se citan a continuación evidencian a utilidade do microenxerto in vitro na mellora da micropropagación (Táboa 5). Misson e Giot-Wirgot (1985), despois de reenxertar tres veces púas de Thuja plicata Donn., procedentes de árbores de 10 anos de idade, sobre patróns xuvenís in vitro, obtiveron brotes con follaxe xuvenil e que medraban máis rapidamente que o material non enxertado. Noutro estudo, tratando de rexuvenecer material adulto de Persea americana Mill., Pliego-Alfaro e Murashige (1987) fixeron tres microenxertos in vitro de xemas de material adulto sobre sementes xerminadas in vitro. Unha vez que os microenxertos prenderon, os brotes producidos utilizáronse para ensaios de enraizamento. O enraizamento do material enxertado aumentou do 0 %, correspondente ó material adulto non enxertado, ó 30 %. Pola contra, o feito de realizar tres microenxertos en serie non mellorou os resultados con respecto a facer soamente un. Utilizando a mesma especie, Barceló-Muñoz (1995) foi capaz de obter un 90 % de enraizamento dos brotes adultos tras 16 microenxertos sucesivos en material xuvenil. Huang et al. (1992a) observaron un aumento das porcentaxes de enraizamento en microbrotes de Citrus reticulata e Citrus sinensis tras realizar 5 microenxertos sucesivos (sobre un total de 7) de ápices de 0,2 cm sobre plántulas in vitro de Poncirus trifoliata x C.sinensis. Así mesmo, en Hevea brasiliensis, o microenxerto de ápices sobre plántulas de 3 semanas de idade permitiu aumentar a porcentaxe de enraizamento de dous xenotipos adultos ó nivel do material xuvenil (Perrin et al., 1994). En Sequoia sempervirens, o microenxerto in vitro de ápices de brotes procedentes dunha árbore de 500 anos de idade sobre brotes enraizados in vitro procedentes dunha planta de 1 ano permitiu que o material procedente dos brotes microenxertados, unha vez enraizado e aclimatado, recuperase o crecemento ortotrópico, característico do material xuvenil. Este hábito perdurou durante varias semanas, pero finalmente o crecemento volveu a ser plaxiotrópico (Tranvan et al., Introdución 43 1991). Nesta mesma especie, Huang et al. (1992b) realizaron catro microenxertos consecutivos de ápices de material adulto de 1,5 cm sobre brotes procedentes de sementes establecidas in vitro, cun intervalo de 2 meses entre enxertos. Conseguiuse que o material adulto recobrase a capacidade de enraizamento, aumentando igualmente o número de raíces por brote enraizado, a elongación dos brotes, e a emisión de brotes laterais. Este incremento foi progresivo en función do número de microenxertos, superando nalgún dos parámetros, como a elongación dos brotes e a emisión de brotes laterais, ó material xuvenil. O material procedente dos microenxertos multiplicouse in vitro, e a mellora da porcentaxe de enraizamento mantívose ata 3 anos despois de realizar os microenxertos. Nun artigo máis recente (Chang et al., 2010), facendo referencia ó mesmo material, asegúrase que as características xuvenís do material rexuvenecido mediante microenxerto poden ser mantidas in vitro ata despois de 30 anos de multiplicación in vitro. No material rexuvenecido prodúcense unha serie de modificacións respecto do material adulto, como a variación do contido de certas enzimas (Huang et al., 1996), o aumento da fosforilación proteica (Huang et al., 2003c), unha maior liberación de etileno (Huang et al., 2000) ou un incremento dos niveis da respiración e da fotosíntese (Huang et al., 2003b). Ewald e Kretzschmar (1996) estudaron a influencia do microenxerto in vitro de brotes de Larix decidua de 140 anos de idade sobre patróns procedentes de semente. Comprobaron que unha vez reaillados os brotes procedentes dos microenxertos, estes multiplicábanse e enraizaban mellor que o mesmo material sen enxertar, que non enraizaba. Revilla et al. (1996) practicaron o microenxerto in vitro de árbores adultas de cultivares de Olea europaea L. sobre microbrotes xuvenís (sen raíces). Como resultado, obtiveron unha recuperación da capacidade de enraizamento do material adulto. O feito de facer dous microenxertos en serie non modificou os resultados respecto de facer soamente un. Noutro estudo, Mneney e Mantell (2001) realizaron microenxerto de material adulto de Anacardium occidentale sobre patróns xuvenís. Mentres que o material adulto non enraizaba e os brotes de material xuvenil enraizaban nun 67 %, os procedentes do microenxerto enraizaban entre un 13,3 e un 34 %, o que indicaba un certo grao de rexuvenecemento. Introdución 44 En Faidherbia albida conseguiuse rexuvenecer material adulto logo de 5 microenxertos consecutivos in vitro, realizados a intervalos de 5 semanas, en plántulas de 3 semanas de idade. Isto verificouse polo maior crecemento dos brotes e polo aumento da porcentaxe de enraizamento e do número de raíces, similar ó das plantas xuvenís, logo do terceiro microenxerto (Danthu et al., 2002). Traballando coa especie Ziziphus mauritiana, Danthu et al. (2004) fixeron 3 microenxertos en serie de microbrotes de material adulto sobre sementes xerminadas in vitro. As probas de enraizamento demostraron un incremento progresivo da porcentaxe de enraizamento dende o 1º ó 3º microenxerto, pero mantívose sempre por debaixo da do material xuvenil. Por outra parte, Chabukswar e Deodhar (2006) utilizaron o microenxerto en serie co obxectivo de aumentar as porcentaxes de enraizamento de material adulto de Garcinia indica. Como patróns, empregaron plántulas de 2 meses de idade e, como púas, microbrotes (0,5-1 cm de longo) cultivados in vitro, procedentes dunha árbore de 20 anos de idade. Unha vez que os enxertos produciron novos brotes (6-8 semanas despois da unión do enxerto), estes foron utilizados para facer probas de enraizamento e para reenxertar nunha nova plántula, repetíndose o proceso ata chegar a facer 5 microenxertos en serie. O material procedente dos 4 primeiros microenxertos non enraizou, mentres que o procedente do 5º microenxerto acadou un 75 % de enraizamento, preto dos valores obtidos para árbores de un mes e un ano de idade, que acadaron o 100 %, mentres que as microestacas procedentes de árbores de 5 e 20 anos non enraizaron. Padilla e Encina (2011) realizaron 3 microenxertos en serie en tres cultivares da especie Annona cherimola Mill. sobre sementes xerminadas in vitro. O material microenxertado amosou un incremento progresivo da porcentaxe de enraizamento in vitro tras os microenxertos en serie. Máis de tres microenxertos non aumentaron as porcentaxes de enraizamento e cando os microbrotes se multiplicaron in vitro perderon a capacidade de enraizamento, o que denota soamente unha recuperación temporal da capacidade morfoxenética do material microenxertado. Introdución 45 Táboa 5. Resumo dos estudos nos que o microenxerto in vitro tivo algunha influencia positiva sobre a micropropagación. Especie Tipo de púa Idade da púa Patrón Técnica enxerto Nº series x tempo entre elas Resultados Referencia Anacardium occidentale Brotes in vitro Adulta Plántulas in vitro Fendedura e lateral 1 Mellora enraizamento respecto ó material control Mneney e Mantell (2001) Annona cherimola Brotes nodais de estacas de material adulto Adulta Plántulas in vitro Fendedura 3 x 42 días Mellora enraizamento in vitro progresivamente Padilla e Encina (2011) Castanea sativa Brotes apicais in vitro 50-70 anos Brotes xuvenís enraizados in vitro Fendedura 3 x 45 días Mellora as taxas de multiplicación nun xenotipo e mantéñense 18 subcultivos Fdez-Lorenzo e Fdez-López (2005) Citrus reticulata; Citrus sinensis Brotes apicais de 0,2 cm, da árbore Adulta Plántulas de Poncirus trifoliata in vitro Lateral sobre epicotilo 7 x 2 meses Mellora enraizamento in vitro dende o 5º microenxerto Huang et al. (1992b) Faidherbia albida Brotes de estacas de raíz 40 anos Plántulas de 3 semanas Sobre hipocotilo 5 x 35 días Mellora enraizamento progresivamente ata o 3º microenxerto Danthu et al. (2002) Garcinia indica Microbrotes cultivados in vitro 20 anos Plántulas de 2 meses de idade 5 x Mellora enraizamento in vitro tras 5 microenxertos Chabukswar e Deodhar (2006) Larix decidua Brotes terminais 140 anos Plántulas in vitro Fendedura 1 Aumenta a taxa de multiplicación e enraizamento in vitro Ewald e Kretzsmar (1996) Hevea brasiliensis Brotes terminais Adulta Plántulas de 3 semanas 1 Mellora enraizamento Perrin et al. (1994) Olea europaea Brotes terminais de estacas de 12 anos procedentes de árbores adultas Adulta Brotes in vitro Fendedura 2 x 8 semanas Mellora enraizamento in vitro Revilla et al. (1996) Persea americana Xemas Adulta Plántulas in vitro De xema 3 x 6-8 semanas Mellora da porcentaxe de enraizamento tras un microenxerto Pliego-Alfaro e Murashige (1987) 16 x 6-8 semanas Mellora da porcentaxe de enraizamento Barceló-Muñoz (1995) Introdución 46 Pinus radiata Brotes terminais de árbores enxertados in vivo 1, 4, 30 e 32 anos Brotes in vitro de 1 ano Fendedura 1 x 45 días Mellora taxas de establecemento e multiplicación tras 6 meses in vitro Fraga et al. (2002) Sequoia sempervirens Brotes apicais in vitro Adulta Brotes xuvenís enraizados in vitro Fendedura 4 x 2 meses Rexuvenecemento gradual e permanente in vitro Huang et al. (1992a) Brotes terminais 500 anos Brotes enraizados in vitro procedentes dunha planta de 1 ano 1 Recuperación temporal do crecemento ortotrópico tras aclimatación Travan et al. (1991) Thuja plicata Adulta 3 Brotes con follaxe xuvenil e con maior velocidade de crecemento que o material control Misson e Giot- Wirgot (1985) Quercus robur Xemas terminais de un clon in vitro Adulta Plántulas in vitro de 4 semanas Fendedura 1 x 5-12 meses Mellora taxas de multiplicación nos primeiros subcultivos Ewald e Naujoks (1997) Ziziphus mauritiana Brotes in vitro de 5- 10 mm Adulta Plántulas in vitro de 4 semanas Fendedura 3 x 1 mes Mellora progresiva da porcentaxe de enraizamento in vitro Danthu et al. (2004) Táboa 5. (Continuación) Introdución 47 3.3.4 - Uso de enxertos e microenxertos in vivo con fins de micropropagación Respecto dos enxertos e microenxertos feitos en condicións in vivo con fins de micropropagación, na bibliografía atópanse diversos traballos (Táboa 6). Franclet (1981) menciona o rexuvenecemento de brotes de Pseudotsuga menziesii, orixinarios dunha árbore adulta, a través do reenxerto dos brotes en patróns xuvenís. Observou un rexuvenecemento gradual despois de cada reenxerto. O enxerto sucesivo sobre plántulas xuvenís (6-12 meses de idade) permitiu inducir condicións de xuvenilidade en estacas de árbores de eucalipto de 10 anos de idade; o fenómeno foi gradual, a través de 6 enxertos sucesivos realizados cada 6 meses (Siniscalco e Pavolettoni, 1988). Aínda así, as características do material adulto foron expresadas de novo nas estacas ó pouco tempo, polo que neste caso só se pode esperar un proceso de revigorización en curtos períodos de tempo. Moon e Yi (1993) estudaron a propagación de clons adultos de Quercus acutissima logo de enxertar brotes con 2 ou 3 xemas, 2 veces seguidas, sobre plantas de 2 anos de idade, con un intervalo entre enxertos de un ano. As porcentaxes de enraizamento das estacas obtidas do crecemento dos enxertos foron superiores logo do segundo enxerto. No entanto, nalgúns clons o enxerto non tivo efecto de revigorización, o que pon de manifesto a importancia das diferenzas clonais na eficacia do prendemento. Na especie Fagus sylvatica, o feito de enxertar material adulto sobre patróns xuvenís permitiu introducir in vitro dito material, multiplicalo e enraizalo, mentres que o material adulto, introducido directamente, nin sequera se conseguiu establecer in vitro (Meier e Reuther, 1994). Nun estudo realizado en Quercus suber (Freitas, 2002), obtívose unha mellora na porcentaxe de enraizamento de estacas logo de realizar un enxerto de xemas adultas sobre plántulas menores de 2 anos. Por outra banda, Husen e Pal (2003) conseguiron obter estacas parcialmente rexuvenecidas logo de enxertar xemas axilares de material adulto de Santalum album sobre plántulas de 2 anos de idade, facendo 2 enxertos en serie con intervalos de 1 ano. Introdución 48 Zaczek et al. (2006) conseguiron aumentar a porcentaxe de enraizamento de estacas de material adulto de Quercus rubra realizando microenxertos de xema sobre plántulas menores de 3 anos. O feito de realizar 3 enxertos consecutivos, con intervalos de 1 ano, non influíu na mellora do enraizamento respecto de utilizar soamente 1 ou 2. Rache-Cardenal et al. (2008) obtiveron unha revigorización de material adulto de oliveira logo de enxertar púas, con tres pares de xemas axilares, sobre plantas de 2 anos de idade en condicións de invernadoiro. Os novos brotes procedentes dos enxertos foron utilizados como fonte de novas púas para realizar microenxerto in vitro. Os microenxertos in vitro feitos con púas procedentes dos enxertos feitos en invernadoiro prenderon e desenvolveron novos brotes, mentres que aqueles feitos con púas procedentes da copa da árbore non foron viables. Obxectivos 55 II - OBXECTIVOS O obxectivo xeral deste traballo é desenvolver estratexias de mellora do establecemento in vitro e da micropropagación de material adulto de Quercus robur L. e Castanea sativa Mill. a partir de xemas axilares. Os obxectivos específicos son os seguintes: • Estudar as repercusións do uso do calo basal na multiplicación in vitro de Quercus robur L. e Castanea sativa Mill., avaliando a súa incidencia sobre os coeficientes de multiplicación. • Estudar o efecto do microenxerto in vitro de material adulto de carballo e castiñeiro sobre patróns xuvenís (ou de comportamento xuvenil). • Estudar o efecto do microenxerto en serie in vivo, en ciclos curtos, de material adulto de Quercus robur L. e Castanea sativa Mill. sobre patróns xuvenís. Obxectivos 56 Material e métodos 57 III - MATERIAL E MÉTODOS 1 - Material vexetal 1.1 - Material vexetal de Quercus robur L. 1.1.1 - Ensaios de recultivo do calo basal Nos ensaios de recultivo de calo basal en Quercus robur utilizáronse dous clons adultos e un clon ‘adolescente’ (4 anos). Os clons adultos son TROBO e MUÍÑOS (Figura 6), establecidos a partir de árbores cunha boa aptitude forestal, baseándose na rectitude do fuste e na escasa ramificación do tronco dende a base. O material foi establecido in vitro en 1998 e subcultivado ata a actualidade. As condicións de establecemento e multiplicación in vitro cítanse no traballo de Fernández et al. (2001). O material ‘adolescente’ procede da semente dunha árbore adulta de hábito fastixiado. Esta semente xerminou en cámara de crecemento e estableceuse no campo co fin de avaliar o seu posible hábito fastixiado. Ós 4 anos verificouse o hábito fastixiado, e procedeuse a realizar unha introdución in vitro do material. O clon establecido denominouse QRF73. Pódese considerar que o clon presenta un elevado grao de xuvenilidade, polo que se fará referencia a el como xuvenil, para diferencialo dos clons adultos. Figura 6. Plantas nai do clon “TROBO” (esquerda) e “MUÍÑOS” (dereita). Material e métodos 58 1.1.2 - Ensaios de microenxerto Nos ensaios de microenxerto utilizouse igualmente material adulto e xuvenil. O material adulto obtívose: 1) dunha árbore de hábito fastixiado de máis de 100 anos (Figura 7), situada en Arzúa (A Coruña) e seleccionada pola súa aptitude ornamental, á que denominamos clon QRFa. 2) Os clons TROBO e MUÍÑOS, descritos no apartado precedente, 3) un clon adulto non seleccionado, ó que denominamos clon MIÑO, procedente dunha árbore situada en Castro de Rei (Lugo). Como material xuvenil (que foi usado de patrón no microenxerto), utilizáronse plántulas de carballo obtidas de sementes recollidas nos meses de outubro e novembro, estratificadas en frío previamente á sementeira e postas a xerminar en cámara de cultivo. Na Táboa 7 resúmense as características dos clons de carballo utilizados en cada ensaio e indícase o seu estado ontoxenético. Figura 7 . Planta nai do clon de Q. robur ‘fastigiata’ (QRFa), ubicada no Pazo de Santa Cruz (Arzúa - A Coruña). Material e métodos 59 Táboa 7. Clons de Quercus robur utilizados neste traballo. Indícase a súa condición ontoxenética (A: adulto; X: xuvenil; AD: adolescente) e o tipo de ensaios ó que foron sometidos. Clon Condición Ensaios calo basal Ensaios microenxerto TROBO A + + MUÍÑOS A + + QRF73 AD + - QRFa A - + MIÑO A - + SEMENTES XERMINADAS X - + 1.2 - Material vexetal de Castanea sativa Mill. 1.2.1 - Ensaios de recultivo do calo basal O material vexetal de castiñeiro procede de dous clons denominados EPS e SISTO, pertencente a árbores adultas. O material do clon EPS foi recollido en Lugo, nas inmediacións da Escola Politécnica Superior, e o do clon SISTO en Castro de Rei (Lugo). Estableceuse in vitro material da copa dos dous xenotipos, así como material de rebentos basais do clon EPS (no ano 2008). 1.2.2 - Ensaios de microenxerto O material adulto de castiñeiro utilizado nos ensaios de microenxerto procede da copa dos clons EPS (en adiante EPScopa) e SISTO, así coma doutros dous clons adultos seleccionados por ser variedades tradicionais de produción de castaña en Galicia, coñecidos como LOURA e PAREDE, e establecidos in vitro en traballos previos no noso laboratorio no ano 1994. Como patróns xuvenís para os microenxertos in vivo utilizáronse plántulas procedentes de sementes, colleitadas en Castro de Rei (Lugo), e postas a xerminar en cámara de crecemento. Material e métodos 60 Para os microenxertos in vitro utilizouse material establecido in vitro a partir de rebentos basais do clon EPS (en adiante EPSbase) e dun clon xuvenil establecido no ano 1995 a partir dunha semente (clon XUV9). Na Táboa 8 resúmense as características dos clons de castiñeiro utilizados en cada ensaio, e indícase o seu estado ontoxenético. Táboa 8. Clons de Castanea sativa utilizados neste traballo. Indícase a súa condición ontoxenética (A: adulto; X: xuvenil; Ax: adulto con características xuvenís) e o tipo de ensaios ó que foron sometidos. Clon Condición Ensaios calo basal Ensaios microenxerto EPScopa A + + EPSbase Ax + + SISTO A + + LOURA A - + PAREDE A - + XUV 9 X - + SEMENTES XERMINADAS X - + 2 - Métodos 2.1 - Condicións xerais de cultivo Os medios de cultivo utilizados, cos que se levaron a cabo os ensaios in vitro, foron o medio GD (Gresshof e Doy, 1972) , constituído polos sales e vitaminas de GD, 3 % de sacarosa e 0,7 % de Difco-Bacto agar como axente xelificante; e o medio WPM, constituído polos sales e vitaminas de WPM (Lloyd e McCown, 1981), e a mesma concentración de sacarosa e agar. O medio WPM utilizouse na multiplicación dos clons QRFa, MIÑO, LOURA, PAREDE, EPS e SISTO, mentres que o medio GD se utilizou nos clons TROBO e MUIÑOS. Material e métodos 61 O pH do medio de cultivo axustouse a 5,5-5,6 con HCl ou NaOH 1 N, segundo o caso, antes da esterilización en autoclave, que se realizou a 121 ºC e 1 atm durante 20 minutos. Todos os ensaios foron establecidos en cámara de crecemento (Figura 8) coas seguintes condicións ambientais: D.F.R. (densidade de fluxo radiante) 30 µmol·m-2·s-1, con tubos fluorescentes OSRAM L. 40 W de luz branca fría, un fotoperíodo de 16 horas de luz a 25 ºC e 8 horas de escuridade a 20 ºC e unha humidade relativa superior ó 70%. Como recipientes utilizáronse tubos (160 mm de altura x 25 mm de diámetro) e botes (90 mm de altura x 100 mm de diámetro) de vidro, contendo cada tubo un explanto e cada bote oito explantos. O intervalo entre subcultivos foi de 30-35 días. Figura 8. Ubicación dos ensaios na cámara de crecemento. Material e métodos 62 2.2 - Introdución in vitro do material vexetal 2.2.1 - Material vexetal introducido in vitro Para levar a cabo os distintos ensaios propostos neste traballo foi necesario introducir in vitro por primeira vez material vexetal dos clons de carballo QRFa e MIÑO, e dos clons de castiñeiro EPS (material da copa e de rebentos basais) e SISTO. O material vexetal do resto de clons utilizados fora establecido in vitro en traballos precedentes, dos cales se dispuña dun stock no laboratorio de micropropagación. O material vexetal procedente dos ensaios de microenxerto in vivo tamén foi introducido in vitro. Deste aspecto falarase máis adiante. 2.2.2 - Obtención de brotes O material vexetal para introducir in vitro foi obtido por dúas vías: - Directa: a partir da recollida de brotes da árbore no período de crecemento vexetativo (clon EPS). - Por forzado: a partir de segmentos de rama (seguindo a metodoloxía de Viéitez et al., 1994), obtidos no período de repouso vexetativo, que foron forzados a brotar en cámara de crecemento (clons QRFa, MIÑO e SISTO). Para obter brotes de forzado de segmentos de rama séguese o proceso mostrado na Figura 9 (ver asemade Figuras 10 e 11). No caso do clon QRFa diferenciáronse tres tipos de varas para o forzado (Figura 12): • Procedentes de ramas de máis de un ano (0,5-1 cm grosor). • Procedentes de ramas de máis de un ano con partes de ramas do último ano de crecemento (0,5-1 cm grosor). • Procedentes de madeira do último ano de crecemento (<0,5 cm grosor). Material e métodos 63 Figura 9. Pasos de forzado de segmentos de rama para a obtención de explantos. Figura 10. Segmentos de rama de castiñeiro en fase de ‘forzado’ da brotación. Material e métodos 64 Figura 11. Brotes de forzado en (a) carballo e (b) castiñeiro. Figura 12. Tipos de varas utilizadas no forzado do clon QRFa. (a) Procedentes de ramas de máis de un ano (0,5-1 cm grosor); (b) Procedentes de ramas de máis de un ano con partes de ramas do último ano de crecemento (0,5-1 cm grosor); (c) Procedentes de madeira do último ano de crecemento (<0,5 cm grosor). a b c a b Material e métodos 71 2.3.4 - Ensaios realizados 1. En tódolos clons utilizados nos ensaios de recultivo de calos, recultiváronse os calos sucesivas veces, ata que deixaron de producir novos microbrotes. Nos clons de carballo avaliáronse, nos sucesivos recultivos do calo, as taxas de multiplicación, o número de brotes maiores de 1 cm, a lonxitude do brote máis longo, a porcentaxe de calos que se obteñen de cada tipo e a porcentaxe de calos que se desbotan en cada recultivo. Nos clons de castiñeiro, tomáronse datos das taxas de multiplicación e da porcentaxe de calos que se desbotan en cada recultivo. Nos clons TROBO, MUIÑOS e SISTO fixéronse varias repeticións de cada recultivo, mentres que no material da base (EPSbase) e da copa (EPScopa), do clon EPS, partiuse de tres repeticións de 8 calos que se foron recultivando progresivamente. 2. Hai certos casos nos que os microbrotes procedentes do recultivo de calos parecen xurdir do interior do calo, sobre todo nos calos tipo 1, o cal fai dubidar se proceden de xemas axilares que quedaron envoltas polo calo, ou se pode tratarse de brotes adventicios, o que representaría un risco de variación somaclonal. Para resolver a dúbida, no material procedente dos clons QRFa e EPS(base) recultiváronse 3 grupos de 8 calos procedentes de explantos que non tiñan xemas ó longo de 1 cm dende a parte basal, e a súa evolución comparouse con outros 3 grupos de 8 calos que procedían de microbrotes que si posuían xemas na parte basal (Figura 16). Desta forma preténdese determinar se os microbrotes que emerxen a través do tecido do calo ó final do ciclo de multiplicación proceden, ou non, de xemas preexistentes. A toma de datos realizouse ós 30-35 días dende o momento de subcultivar. Material e métodos 72 Figura 16. Esquema do ensaio realizado para determinar a procedencia axilar ou adventicia dos microbrotes que emerxen a través do tecido do calo basal. Material e métodos 73 2.4 - Ensaios de microenxerto 2.4.1 - Obtención de plántulas in vitro 2.4.1.1 - Obtención de plántulas de carballo in vitro Para a obtención de plántulas de carballo in vitro faise unha introdución in vitro de landras e, unha vez que estas xerminan, son utilizadas como patróns. O proceso detállase a continuación:  Desinfección das sementes Unha vez colleitadas as sementes foi necesario un proceso de desinfección superficial das mesmas previamente á introdución in vitro. Para levar a cabo a desinfección, inicialmente eliminouse a cuberta externa da semente (exocarpo) e, posteriormente, baixo a cámara de fluxo laminar, realizouse a desinfección (ensaiáronse dous tratamentos) seguindo os mesmos pasos que na posta en cultivo do material vexetal dos diferentes clons (ver apartado 2.2.3).  Introdución in vitro das sementes, xerminación e preparación das plántulas para o uso como patróns Despois da desinfección procédese á eliminación parcial dos cotiledóns (Figura 17) (deixando unha parte dos mesmos sen cortar, xunto co eixo embrionario) para que a semente teña o tamaño axeitado para introducila nun tubo de vidro de 25 × 150 mm, contendo 15 mL de medio de cultivo. Unha vez feita a introdución in vitro, os ensaios dispóñense na cámara de crecemento. Cando a semente xermina (na primeira semana da súa introdución in vitro), produce unha raíz pivotante moi vigorosa, que cando acada o fondo do tubo “empurra” a plántula cara arriba, alonxándoa do medio de cultivo (Figura 17a). Para evitar isto, procedeuse á poda da raíz principal (Figura 17b). A poda, ou “repicado” favorece a emisión de raíces secundarias (Figura 18a), obténdose un sistema radical máis ramificado. As novas raíces, ó chegar ó fondo do tubo, tenden a enrolarse (Figura 18b), non acadando o vigor suficiente para sacar de novo a plántula do medio. Material e métodos 74 • Ensaios realizados: na obtención de plántulas in vitro de carballo, leváronse a cabo dous tratamentos de desinfección, en función do tempo de permanencia nas solucións desinfectantes: - 1º tratamento: 30 segundos en 70 % etanol e 15 minutos en lixivia (0,8 % Cl activo). - 2º tratamento: 120 segundos en 70 % etanol e 20 minutos en lixivia (1 % Cl activo). Ós 30 días da introdución in vitro, tomáronse datos da porcentaxe de landras contaminadas e non contaminadas. Sobre as non contaminadas tomáronse datos da porcentaxe de xerminación. Realizáronse 10 repeticións de 24 landras por cada tratamento. Figura 17. Introdución in vitro de landras. (a) Apréciase o corte dos cotiledóns e a tendencia da plántula a saírse do medio a medida que medra a raíz principal. (b) Aspecto das plántulas tras a poda da raíz principal. a b Material e métodos 75 Figura 18. (a) Emisión de raíces secundarias despois do repicado e (b) posterior enrolamento no fondo do tubo. 2.4.1.2 - Obtención de plántulas de castiñeiro in vitro Nos microenxertos in vitro de castiñeiro utilizáronse dous tipos de patróns con comportamento xuvenil, que proceden do establecemento in vitro de rebentos basais do clon EPS (EPSbase) e do clon XUV 9 (ambos con taxas de enraizamento in vitro por encima do 90 %): • Plántulas obtidas por enraizamento in vitro de microbrotes de material xuvenil. • Explantos con calo basal, sen raíces: neste caso o patrón está conformado por un segmento de caule do mesmo material xuvenil, que, en lugar de raíces, ten un calo basal. Outros autores tamén teñen usado patróns sen raíces no microenxerto in vitro, por exemplo Rache-Cardenal et al. (2008) nun estudo en oliveira, coa diferenza de que estes autores eliminan o calo e realizan o microenxerto directamente sobre o microbrote. Para enraizar os microbrotes que serviron como patróns, mergullouse a súa base nunha disolución acuosa de 1 mg·mL-1de AIB durante 2 minutos, sendo transferidos de inmediato a medio GD 1/3 (cun terzo da concentración de macronutrientes). a b Material e métodos 76 Os microbrotes enraizados utilizáronse para enxertar ós 30-35 días da indución ó enraizamento. Os patróns sen raíces (con calo basal) utilizáronse 30-35 días despois do subcultivo en medio de multiplicación dos microbrotes dos que proceden. 2.4.2 - Obtención de plántulas in vivo Para a obtención de plántulas in vivo fixéronse sementeiras en bandexas con alveolos troncocónicos de plástico termoconformado de 300 cm3 de capacidade, recheos cun substrato constituído por unha mestura turba:perlita (3:1). Empregáronse sementes estratificadas previamente en area e conservadas en frío, moitas das cales xa tiñan prexerminado (emitindo a radícula) no momento da sementeira, o cal permitiu unha xerminación rápida e uniforme. A xerminación tivo lugar nunha cámara de crecemento coas condicións citadas previamente (ver apartado 2.1). Considerouse o momento óptimo para utilizar os patróns aquel no que as plántulas rematan o primeiro crecemento, antes de que o grao de lignificación dificulte a introdución da púa. Isto sucede ás 2-3 semanas dende a xerminación, no caso do carballo, e ás 3-4 semanas, no caso do castiñeiro. 2.4.3 - Obtención de púas de material adulto para o microenxerto in vitro Como púas para os microenxertos in vitro empregáronse microbrotes cultivados in vitro de 1,5-2,5 cm de lonxitude. Estes brotes foron obtidos ó final dun ciclo de multiplicación (30-35 días dende o último subcultivo). No caso do carballo utilizáronse púas de microbrotes obtidos de explantos nodais e apicais e de calos basais recultivados dos clons TROBO e MUÍÑOS. No castiñeiro utilizáronse microbrotes procedentes da multiplicación in vitro de explantos nodais e apicais dos clons SISTO e EPS (copa). Material e métodos 77 2.4.4 - Obtención de púas de material adulto para o microenxerto in vivo Para os microenxertos in vivo, utilizáronse como púas brotes de 1,5-2,5 cm de longo, obtidos das seguintes fontes (Figura 19): • Microbrotes procedentes de cultivo in vitro. • Brotes procedentes de forzado de segmentos de rama en cámara de crecemento. • Brotes en repouso vexetativo procedentes de madeira dun ano, recollidos das ramas da árbore nai uns días antes de realizar os microenxertos. • Brotes procedentes de microenxertos precedentes que prenderon (cando se realizan microenxertos en serie, a partir do 2º microenxerto, este incluído). Figura 19. (a) Púas de microenxertos in vivo procedentes de microbrotes cultivados in vitro, (b) de forzado de segmentos de rama e (c) de brotes en repouso vexetativo, (1) en carballo e (2) castiñeiro. Pódese observar a utilización de parafilm para protexer e manter firme a zona do microenxerto. a1 b1 c1 a2 c2 b2 Material e métodos 78 2.4.5 - Realización de microenxertos in vitro Unha vez que a plántula que será utilizada como patrón se encontra no momento óptimo (3-4 semanas despois da introdución in vitro, no caso das landras; ó final dun ciclo de multiplicación, no caso dos microbrotes enraizados in vitro) e os microbrotes cultivados in vitro dos que se obterán as púas se encontran ó final dun ciclo de multiplicación, procédese á realización do microenxerto. Para levalo a cabo utilízanse (baixo cámara de fluxo laminar) unha lupa binocular e escalpelos moi afiados, que son desinfectados superficialmente con etanol 96º. O tipo de enxerto empregado é como un enxerto de fendedura a pequena escala. Consiste na preparación da base da púa en forma de cuña ou V, a cal se introduce nunha fendedura vertical realizada lonxitudinalmente no patrón (Figura 20). O patrón secciónase transversalmente a unha altura de 5-15 mm por encima do colo da raíz e posteriormente realízase a fendedura, a cal se debe facer no centro do patrón, afondando 3-5 mm na vertical dende a superficie seccionada. O microbrote cultivado in vitro extráese do recipiente de cultivo, prepárase a púa en forma de cuña, e a súa base introdúcese o máis rapidamente posible na fendedura do patrón, co fin de diminuír o risco de desecamento da mesma. No caso do carballo, para manter a unión do microenxerto emprégase un aro de silicona (Figura 21), mentres que nos microenxertos de castiñeiro non se utiliza ningún elemento de unión. Despois de realizar o microenxerto, a plántula microenxertada vólvese a introducir nun recipiente con medio de cultivo, asegurándose de que o sistema radicular quede ben introducido no medio. Os medios de cultivo utilizados para os microenxertos foron os mesmos que para a multiplicación (WPM + 0,1 mg·L-1 BA en castiñeiro e GD + 0,2 mg·L-1 BA en carballo). Nos clons de castiñeiro fixéronse 4 microenxertos en serie. O microenxerto en serie consiste en microenxertar consecutivamente, cada certo tempo, o mesmo material vexetal sobre un novo patrón. Unha vez que se desenvolve un novo crecemento a partir da púa microenxertada, obtéñense novas púas que se enxertan sobre outro patrón. Como xa se indicou, os microenxertos in vitro realizados en castiñeiro fanse sobre microbrotes enraizados ou sobre microbrotes con calo basal (Figura 22). Material e métodos 79 Ó longo do proceso de prendemento do microenxerto elimínanse os brotes que ás veces emerxen das xemas axilares do patrón, para evitar a competencia coa púa (Figura 21). A necesidade desta operación xa foi mencionada noutros estudos de microenxerto (Katoh et al., 2004). O número de microenxertos feitos por clon, tipo de púa e tipo de patrón resúmense na Táboa 9. Nas distintas probas de microenxerto in vitro avaliouse a porcentaxe de contaminación e a porcentaxe de prendemento ós 30 días da realización dos microenxertos. Material e métodos 80 Figura 20. Microenxerto de fendedura utilizado no estudo. Material e métodos 87 2.4.7 - Multiplicación in vitro dos explantos procedentes dos microenxertos 2.4.7.1 - Desenvolvemento dos microenxertos e reaillamento de explantos No caso dos microenxertos realizados in vitro, cando o enxerto prende, a púa desenvólvese e deixase medrar ata uns 3-4 cm de longo. Posteriormente divídese en explantos apicais e nodais de 1-2 cm, que se subcultivan de xeito convencional. Respecto ós microenxertos in vivo, unha vez que prenden e se desenvolven as púas, é preciso facer unha introdución in vitro dos explantos obtidos destas. Previamente á reintrodución in vitro, os brotes procedentes das púas divídense en fragmentos que son desinfectados superficialmente seguindo o mesmo esquema indicado no apartado 2.2.3. Unha vez acabado o proceso de desinfección, os fragmentos divídense en explantos con unha ou dúas xemas axilares, cunha lonxitude de 1-2,5 cm. No medio de introdución emprégase unha concentración de BA de 1 mg·L-1. Unha vez que as xemas dos explantos comezan a agromar (Figura 26a), o que ten lugar ós 20-30 días dende a introdución no medio de cultivo, faise unha transferencia a medio de multiplicación convencional (ver apartado 2.2.4), e ós 30-35 días realízase o primeiro subcultivo (Figura 26b). 2.4.7.2 - Ensaios realizados in vitro sobre explantos reaillados No caso do carballo, nos ensaios de introdución in vitro, tómanse datos da porcentaxe de contaminación e reactividade, unha vez que se realiza a transferencia ó medio de multiplicación. Unha vez que o material microenxertado se establece e multiplica in vitro, avalíanse as taxas de multiplicación do material microenxertado tanto in vitro como in vivo, así como as do material que non foi sometido a microenxerto. Cómpre destacar que os valores das taxas de multiplicación do material procedente dos microenxertos in vivo son comparados cos do material control dende a súa introdución in vitro (SC1- SCn) xa que ambos pasan de condicións ex vitro a in vitro. No entanto, no caso dos microenxertos in vitro, as púas obtidas do material control obtivéronse cando dito material xa acadou un certo grao de estabilización in vitro, polo que os valores comparáronse a partir do momento de realizar os microenxertos in vitro (SCx-Scy, Material e métodos 88 sendo SCx o subcultivo no que se encontra o material control no momento de realizar os microenxertos in vitro, e SCy o subcultivo ata o que se toman datos da taxa de multiplicación, sendo os subcultivos neste caso coetáneos). En cada subcultivo tómanse datos de 3 repeticións de 8 ou 12 microbrotes por cada tipo de material e por cada clon. Cando non houbo material dabondo (nos primeiros subcultivos) non se fixeron repeticións, tomándose datos absolutos. Figura 26. (a) Aspecto de explantos de carballo procedentes de púas enxertadas in vivo ós 20-30 días tras a posta en cultivo, en medio con 1 mg·L-1 de BA, e (b) ós 28-35 días da transferencia a medio con 0,2 mg·L-1 de BA, no momento previo ó primeiro subcultivo. a b Material e métodos 89 2.4.8 - Avaliación do enraizamento in vitro Para avaliar o enraizamento in vitro fanse ensaios comparativos entre o material procedente dos microenxertos e o material que non se microenxertou. Para facer os ensaios de enraizamento utilízanse microestacas procedentes de microbrotes obtidos ó final dun ciclo de multiplicación. As microestacas teñen unha lonxitude entre 5 e 30 mm e poden ter, ou non, unha xema apical. As variables analizadas nos ensaios de enraizamento son a porcentaxe de enraizamento, o número de raíces por micropúa enraizada e a lonxitude da raíz máis longa por micropúa enraizada. Estas variables mídense ós 7, 14, 21, 28 e 35 días da indución do enraizamento. A indución do enraizamento consistiu nunha inmersión basal (Figura 27) durante un período de tempo variable (45-120 s), nunha disolución acuosa de 1 mg·mL-1 de AIB e a posterior introdución en medio GD 1/3 (medio de expresión). Na Táboa 11 resúmense as probas de enraizamento realizadas. Figura 27. Inmersión basal dun microbrote de carballo nunha disolución 1 mg·mL-1de AIB, antes de ser establecido en medio de enraizamento. Material e métodos 90 Especie Clon púa Clon patrón Material empregado no ensaio Tempo inmersión (s) Microestaquilla Nº µenx Series µenx in vitro Series µenx in vivo Tipo explanto Lonxitude (mm) Quercus robur TROBO Varios - semente 1º 1º, 2º 120 A 15-30 3x8 MUÍÑOS 1º 1º 120 A 15-30 3x8 QRFa - 1º, 3º, 5º, 8º, 12º 120 A 15-30 3x12 45 N < 10 3x12 MIÑO - 1º, 2º 120 A 15-30 3x12 N 15-30 3x12 Castanea sativa EPScopa Varios - semente - 1º, 2º, 4º 120 N < 10 3x12 EPScopa EPS base raíz 1º, 3º, 4º - 60 A 15-30 3x10 EPS base calo 4º EPScopa XUV 9 raíz 1-2º, 3º, 4º - 60 A 15-30 3x8 XUV 9 calo 1º SISTO Varios - semente - 1º, 2º 45 e 120 N 15-30 3x12 SISTO EPS base raíz 1º - 120 N/A 15-30 3x12 EPS base calo 1º SISTO EPS base raíz 1º, 3º, 4º - 60 A 15-30 3x8 Táboa 11. Ensaios de enraizamento realizados no estudo (EPS base raíz: microbrotes enraizados de EPS base ; EPS base calo: explantos con calo basal de EPS base ; A: apical; N: nodal; µenx: microenxerto). Material e métodos 91 2.5 - Tratamento estatístico No caso dos tratamentos que se fixeron en tres repeticións, os datos establecéronse en bloques ó azar. Os datos foron tratados estatisticamente mediante análise de varianza e tests de comparación de medias (t de Student ou LSD), utilizando o paquete estatístico SPSS. Os valores en porcentaxes transformáronse para a súa análise mediante transformación angular ou arcoseno, do xeito que se relata a continuación: Chamemos y ó número de micropúas enraizadas, microenxertos prendidos, microbrotes contaminados, etc., p a expresión das porcentaxes en tanto por un e n o número de observacións realizadas por repetición. Entón: • Se y = 0 p = 1/4n • Se 1 ≤ y ≤ n-1 p = y/n • Se y = n p = (n –1/4)/0,98n A fórmula do arcoseno empregada na transformación será: Valor transformado = arcsen p En táboas e gráficas exprésanse os valores sen transformar. Material e métodos 92 Resultados 93 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 MIÑO (Q.robur) SISTO (C.sativa) EPS (C.sativa) % reactividade contaminacion IV - RESULTADOS 1 - Introdución in vitro do material vexetal 1.1 - Clons introducidos in vitro Para levar a cabo os distintos ensaios propostos neste traballo foi necesario establecer in vitro algúns clons de carballo (MIÑO e QRFa) e castiñeiro (SISTO e EPS). Os clons TROBO, MUÍÑOS e QRF73 (Quercus robur), e XUV 9, LOURA e PAREDE (Castanea sativa) xa foran introducidos en traballos previos e dispúñase de stocks in vitro en fase de multiplicación. 1.2 - Introdución in vitro dos clons MIÑO, SISTO e EPS Na Figura 28 móstranse os resultados da porcentaxe de contaminación e da reactividade in vitro do material procedente de forzado dos clons MIÑO e SISTO, e da introdución directa de brotes procedentes da árbore do clon EPS. Compróbase que a porcentaxe de contaminación é moito máis elevada cando introducimos material directamente do exterior que cando se realiza forzado de segmentos de rama. No primeiro caso contamináronse preto do 90 % dos explantos, mentres que no material procedente de forzado non se supera o 10 %. Por outra banda, o material procedente de forzado ten unha reactividade inicial elevada, encontrándose arredor do 86 % no clon MIÑO e do 97 % no clon SISTO. Figura 28. Contaminación e reactividade (en %) dos explantos procedentes de forzado dos clons MIÑO e SISTO, e contaminación dos explantos tomados da árbore do clon EPS. s.d.: sen datos. s.d. Resultados 94 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1ª Introdución 2ª Introdución 3ª Introdución % reactividade contaminación 1.3 - Introdución in vitro do clon QRFa No forzado do clon QRFa utilizáronse tres tipos de varas (Figura 12). As varas procedentes de madeira do último ano de crecemento non produciron brotes aproveitables, mentres que as que tiñan madeira de máis de un ano si. As varas produciron unha media de 3-4 brotes aproveitables como explantos para introducir in vitro. Os brotes foron agromando progresivamente, saíndo os primeiros ós 15 días de introducir as varas en auga, producíndose un máximo arredor dos 25 días e descendendo logo progresivamente, non saíndo máis brotes despois de 35- 40 días. Na Figura 29 pódense apreciar os resultados da porcentaxe de contaminación e da reactividade in vitro do material procedente do forzado do clon QRFa. Como se pode comprobar, a reactividade é maior cando se emprega o proceso de desinfección máis suave que cando se emprega o máis forte. Usando o tratamento máis suave, a porcentaxe de contaminación non aumenta, ou faino lixeiramente, polo que parece o tratamento máis axeitado para desinfectar os brotes procedentes de forzado antes da súa introdución in vitro. Figura 29. Contaminación e reactividade (en %) dos explantos procedentes de forzado do clon QRFa, para as tres introducións in vitro. Letras diferentes indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P < 0,01). Condicións desinfección 1ª introdución 30 s en etanol ó 70 % 15 min en lixivia 0,8 % Cl activo 2ª e 3ª introdución 10 s en etanol ó 50 % 10 min en lixivia 0,8 % Cl activo a ab b 0% 0% Resultados 95 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 SC1 SC2 SC3 SC4 SC5 SC6 SC7 SC8 SC9 SC10 SC11 TM WPM GD 1.4 - Ensaio de medio base no clon QRFa Na Figura 30 pódese apreciar a evolución das taxas de multiplicación no clon QRFa, ó longo dos 11 primeiros subcultivos, empregando os medios GD ou WPM. Obsérvase como sempre acada maiores valores de multiplicación o material cultivado en medio WPM; asemade, o material cultivado en medio GD perdeuse no noveno subcultivo, mentres que o material cultivado en WPM se mantivo ata a actualidade. Deste xeito, pódese concluír que, para este clon, o medio máis axeitado é o WPM, polo que foi o utilizado en posteriores ensaios. Os valores de multiplicación son, en todo caso, bastante baixos, xa que en moitos subcultivos toman valores por debaixo de 1, que se considera o mínimo valor para que exista unha multiplicación efectiva. Esta baixa taxa de multiplicación está relacionada, con toda seguridade, co alto grao de madurez deste clon, o que adoita ter unha relación negativa coa micropropagación en xeral, e coa facilidade de multiplicación en particular (Bonga e Von Aderkas, 1982). Figura 30. Evolución da taxa de multiplicación (TM), ó longo de 11 subcultivos (SC1-SC11), do material do clon QRFa procedente de forzado, empregando os medios WPM e GD. Letras diferentes indican diferenzas significativas segundo a proba t de Student mediante observación por pares (P < 0,01). Límite de multiplicación efectiva Resultados 96 2 - Recultivo do calo basal 2.1 - Recultivo do calo en Quercus robur L. 2.1.1 - Taxa de multiplicación Represéntanse a continuación, para os clons TROBO, MUÍÑOS e QRF73, os resultados da taxa de multiplicación dos distintos tipos de calos en cada recultivo, en comparación coas taxas de multiplicación dos explantos nodais e apicais. Cómpre recordar que denominamos ‘calo’ ó conxunto formado polo explanto nodal, cun tamaño demasiado pequeno para ser subcultivado independentemente, e polo calo que se forma na súa base. Así, distinguimos calos tipo 1: aqueles nos que non se aprecian visualmente xemas nin brotes; calos tipo 2: aqueles nos que se aprecian visualmente xemas axilares; calos tipo 3: aqueles nos que se aprecian visualmente brotes < 1 cm (e xemas axilares). Clon TROBO Táboa 12. Taxa de multiplicación dos tres tipos de calos (fronte ó nº de recultivo - Nº REC) e dos nós e ápices no clon TROBO. Letras diferentes (maiúsculas en cada fila e minúsculas en cada columna) indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P < 0,05). Nº REC TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3 NÓS E ÁPICES 1 1,18 ± 0,31D-a 2,24 ± 0,25B-a 2,79 ± 0,43A-a 1,79 ± 0,13C 2 0,69 ± 0,19C-b 0,88 ± 0,04BC-b 1,30 ± 0,46B-b 1,79 ± 0,13A 3 0,33 ± 0,22C-b 0,82 ± 0,06B-b 0,89 ± 0,27B-b 1,79 ± 0,13A 4 0,57 0,70 ± 0,17B-b 0,25 1,79 ± 0,13A Na Táboa 12 pódese observar como, no primeiro recultivo, os calos tipo 2 e 3 mostran unha taxa de multiplicación significativamente maior á taxa de multiplicación dos nós e ápices, mentres que a partir deste a media é menor. No caso dos calos tipo 1, a taxa de multiplicación é menor cá dos nós e ápices dende o primeiro recultivo. Tamén se poden observar diferenzas na taxa de multiplicación entre tipos de calos para un mesmo recultivo (o maior valor obsérvase nos tipo 3 e o menor nos tipo 1), máis marcado no primeiro recultivo que nos seguintes. Todos os tipos de calo perden a súa produtividade progresivamente con sucesivos recultivos. Resultados 103 Como se pode observar, o número de brotes maiores de 1 cm diminúe significativamente do primeiro ós seguintes recultivos, para os tres tipos de calo, nos tres clons estudados. A partir do segundo recultivo, os valores tamén baixan, pero de forma máis progresiva. Nos clons adultos os valores dos calos soamente chegan a superar ós dos explantos convencionais no primeiro recultivo, mentres que nos posteriores son menores ou non difiren significativamente con eles. Pola contra, non clon xuvenil, os valores dos calos acadan valores semellantes ós dos nós e ápices durante máis recultivos (ata o 5º nos calos tipo 2), o que indica a maior capacidade deste clon para desenvolver as xemas remanentes no calo. De feito, no clon xuvenil, a diferenza no número de brotes > 1 cm dos calos (Figura 37) con respecto ós nós e ápices foi moi marcada nos primeiros recultivos, polo que, neste caso, este parámetro é, polo menos en parte, responsable do elevado valor das taxas de multiplicación. Comparando os distintos tipos de calo, os valores non amosan grandes diferenzas entre eles, polo que se pode deducir que o número de brotes maiores de 1 cm non se ve influído de xeito determinante polo tipo de calo que se recultiva. Figura 37. Aprécianse, no clon xuvenil QRF73, cinco brotes maiores de 1 cm sobre un calo recultivado unha vez. 1 cm Resultados 104 2.1.3 - Lonxitude do brote máis longo Este dato corresponde ós valores da lonxitude do brote máis longo para cada tipo de explanto ó final dun ciclo de multiplicación. Os valores móstranse na Táboa 16, para os diferentes clons, en sucesivos recultivos. Tamén se mostra o valor medio de varios subcultivos de nós e ápices. Táboa 16. Lonxitude do brote máis longo (en cm) para os tres tipos de calos (TIPO 1, TIPO 2 e TIPO 3), en cada recultivo (Nº REC), e a media dos nós e ápices, para os clons de carballo TROBO, MUÍÑOS e QRF73. Letras diferentes (maiúsculas en cada fila e minúsculas en cada columna, dentro de cada clon) indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P < 0,05). CLON Nº REC TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3 NÓS E ÁPICES TROBO 1 2,06 ± 0,39B-a 2,57 ± 0,05B-a 3,65 ± 0,49A-a 2,63 ± 0,19B 2 1,64 ± 0,28B-ab 1,57 ± 0,20B-b 1,80 ± 0,55B-b 2,63 ± 0,19A 3 1,33 ± 0,35B-b 1,39 ± 0,19B-b 1,52 ± 0,59B-b 2,63 ± 0,19A 4 1,53 1,22 ± 0,47B-b 0,40 2,63 ± 0,19A MUÍÑOS 1 2,10 ± 0,37B-a 2,72 ± 0,17A-a 3,17 ± 0,28A-a 2,18 ± 0,28B 2 1,17 ± 0,36C-b 1,45 ± 0,26BC-b 1,78 ± 0,10AB-b 2,18 ± 0,28A 3 1,17 ± 0,25B-b 1,16 ± 0,08B-b 1,53 ± 0,59B-b 2,18 ± 0,28A 4 0,75 1,09 ± 0,32B-b 1,10 2,18 ± 0,28A QRF73 1 2,42 ± 0,53B 2,73 ± 0,29B-a 3,41 ± 0,31A-a 3,21 ± 0,18A 2 2,77 2,24 ± 0,15B-b 2,79 ± 0,34A-b 3,21 ± 0,18A 3 0,00 2,18 ± 0,13B-b 2,26 ± 0,20B-c 3,21 ± 0,18A 4 1,5 2,32 ± 0,25B-ab 2,25 3,21 ± 0,18A 5 -- 1,94 ± 0,14B-b 1,86 3,21 ± 0,18A 6 1,06 1,52 1,42 3,21 ± 0,18 Do mesmo xeito que o parámetro do epígrafe anterior, os valores da lonxitude do brote máis longo diminúen de forma brusca no segundo recultivo, producíndose posteriormente unha diminución menos acusada. No primeiro recultivo, os explantos que presentan os brotes máis longos son sempre os calos tipo 3. A diferenza de lonxitude entre os microbrotes procedentes dos calos tipo 3 e os que achegan nós e ápices, no clon TROBO, pódese apreciar na Figura 38. Resultados 105 Nos seguintes recultivos, as diferenzas entre tipos de calos tenden a desaparecer, presentando os nós e ápices os valores máis elevados. A diferenza neste parámetro seguramente se debe a que, no caso dos explantos convencionais, o desenvolvemento visible comeza ós 10-15 días dende o momento de realizar o subcultivo, mentres que no caso dos calos o crecemento comeza ó pouco tempo da introdución en medio fresco, producíndose unha diferenza moi notable no desenvolvemento dos explantos ós 15 días de subcultivar (Figura 39). Figura 38. Diferenza de lonxitude entre os microbrotes producidos por (b) explantos nodais e apicais e (a) os producidos polo primeiro recultivo de calos tipo 3, no clon TROBO, ós 30 días de subcultivar. Figura 39. Diferenza de crecemento entre os microbrotes producidos por (a) un calo recultivado unha vez e (b) un explanto apical, ós 15 días de realizar o subcultivo, no clon MUÍÑOS. 1 cm a b 1 cm b a Resultados 106 2.1.4 - Porcentaxe de calos que se obteñen de cada tipo Este dato representa a porcentaxe media de calos de cada tipo (1, 2 ou 3) que hai nun determinado recultivo. Os valores obtidos móstranse na Táboa 17. Táboa 17. Porcentaxe dos tres tipos de calos (TIPO 1, TIPO 2 e TIPO 3), en cada recultivo (Nº REC), para os clons de carballo TROBO, MUÍÑOS e QRF73. Letras diferentes (maiúsculas en cada fila e minúsculas en cada columna, dentro de cada clon) indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P < 0,05). CLON Nº REC TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3 TROBO 1 9,38 ± 1,83C-a 49,86 ± 3,47A-b 40,74 ± 5,31B-a 2 16,00 ± 1,81B-a 66,54 ± 7,11A-a 16,91 ± 7,53B-b 3 13,64 ± 0,33B-a 67,91 ± 5,70A-a 18,43 ± 5,36B-b 4 20,89 73,13 5,98 MUÍÑOS 1 9,82 ± 3,90C-a 59,16 ± 5,90A-a 30,99 ± 1,99B-a 2 12,81 ± 5,54B-a 67,88 ± 7,71A-a 19,30 ± 2,17B-a 3 14,57 ± 9,01B-a 67,28 ± 9,65A-a 18,14 ± 0,64B-a 4 10,52 76,31 13,17 QRF73 1 13,33 ± 6,33C-a 34,62 ± 0,88B-d 52,04 ± 5,04A-a 2 8,32 ± 5,15C-ab 52,10 ± 11,16A-c 39,57 ± 1,75B-b 3 4,08 ± 3,34C-ab 64,22 ± 2,63A-b 31,69 ± 0,71B-bc 4 7,85 ± 5,87C-ab 55,78 ± 0,31A-bc 36,37 ± 6,18B-b 5 0,00 ± 0,00C-b 76,19 ± 6,73A-a 23,81 ± 6,73B-c 6 15,79 63,16 21,05 De forma xeral, obsérvase que os calos tipo 1 son sempre os que se obteñen en menor proporción, non existindo diferenzas entre recultivos nos clons adultos, e sendo estas pouco marcadas no clon xuvenil. Respecto ós calos tipo 2 e 3, os valores máis elevados correspóndenlles ós tipo 2 (salvo no primeiro recultivo do clon QRF73), os cales tenden a aumentar nos sucesivos recultivos, a costa de diminuír os calos tipo 3. Pódese considerar normal que a porcentaxe de calos tipo 3 diminúa despois do primeiro recultivo, xa que se o número de brotes maiores de 1 cm se reduce con cada recultivo, é lóxico pensar que o número de brotes menores de 1 cm tamén o faga, e con eles o número de calos tipo 3. Esta redución expresaría a perda da capacidade de multiplicación dos calos ó avanzar o número de recultivos. Resultados 107 2.1.5 - Porcentaxe de calos que se deixan de recultivar Cando un calo non produce explantos nodais ou apicais ó final dun ciclo de multiplicación, este non volve a recultivarse, considerándose que perde a capacidade de produción de novos explantos. Na Táboa 18 móstranse os resultados deste parámetro para os diferentes tipos de calo, nos sucesivos recultivos, nos tres clons estudados. Táboa 18. Porcentaxe de calos que se deixan de recultivar, en función do calo do que proceden (TIPO 1, TIPO 2 e TIPO 3), en cada recultivo (Nº REC), para os clons de carballo TROBO, MUÍÑOS e QRF73. Letras diferentes (maiúsculas en cada fila e minúsculas en cada columna, dentro de cada clon) indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P < 0,01). CLON Nº REC TIPO 1 TIPO 2 TIPO 3 TROBO 1 23,07 ± 15,38A-a 2,05 ± 3,55B-a 0,00 ± 0,00B-a 2 33,33 ± 0,00A-a 3,15 ± 2,76B-a 0,00 ± 0,00B-a 3 47,61 ± 8,25A-b 3,26 ± 5,64B-a 0,00 ± 0,00B-a 4 35,71 1,93 ± 0,35a 0,00 MUÍÑOS 1 44,73 ± 7,77A-a 2,65 ± 2,64B-a 0,00 ± 0,00B-a 2 24,60 ± 11,02A-b 1,71 ± 2,96B-a 0,00 ± 0,00B-a 3 36,57 ± 13,91A-a 2,78 ± 4,81B-a 0,00 ± 0,00B-a 4 75,00 7,32 ± 7,15a 0,00 QRF73 1 42,13 ± 11,81A 1,85 ± 3,21B-a 0,00 ± 0,00B-a 2 56,25 1,19 ± 2,06A-a 1,85 ± 3,21A-a 3 100 7,9 ± 0,37A-a 0,00 ± 0,00A-a 4 85,71 2,08 ± 3,61a 0,00 5 -- 3,03 ± 5,25a 0,00 6 0,00 0,00 0,00 A porcentaxe de calos que se deixan de recultivar no caso dos calos tipo 1 é sempre significativamente maior que no caso dos tipo 2 e 3. Entre os calos tipo 2 e 3 non se encontran diferenzas significativas. A porcentaxe de calos tipo 2 e 3 que non se reaproveitan é sempre moi baixa, non variando nos sucesivos recultivos. Estes valores son de esperar, xa que os calos tipo 2 e 3 se recultivan con xemas ou brotes menores de 1 cm, polo que sempre portan puntos meristemáticos que se poden desenvolver. Resultados 108 2.2 - Recultivo do calo en Castanea sativa Mill. 2.2.1 - Taxa de multiplicación Na Figura 40 pódense observar os valores da taxa de multiplicación dos calos, para os clons EPS (copa e base) e SISTO, nos sucesivos recultivos, comparados co valor medio da taxa de multiplicación dos nós e ápices. Os datos revelan diferentes comportamentos en función do material ensaiado. No material EPScopa, en tódolos recultivos a taxa de multiplicación dos calos é menor que a taxa de multiplicación media de nós e ápices, a excepción do primeiro recultivo, no que as diferenzas non son significativas. Os valores máximos nos diferentes recultivos encóntranse en torno a 0,5. Todos os calos tórnanse improdutivos no quinto recultivo. Pola contra, no caso do material EPSbase, os resultados son totalmente diferentes. As taxas de multiplicación nos sucesivos recultivos de calos mantéñense en valores próximos ós valores de multiplicación dos nós e ápices durante moitos recultivos, sendo significativamente superiores no primeiro recultivo. Os calos producen novos explantos nos 17 recultivos analizados. Unha contaminación microbiana dos cultivos no recultivo 18 impediu recultivos posteriores (nese momento quedaban 7 calos dos 24 iniciais). Esta diferenza tan notable co material EPScopa pon de manifesto que o estado ontoxenético inflúe decisivamente na capacidade produtiva dos explantos con calo, dun xeito semellante a como o fai na multiplicación dos nós e ápices. Respecto do clon SISTO, a taxa de multiplicación dos nós e ápices é, igual que no clon EPScopa, significativamente superior á taxa de multiplicación dos calos. No entanto, salvo no segundo e terceiro recultivos, os valores das taxas de produción encóntranse, case de forma constante, por encima de 1. O número de recultivos no que os calos son produtivos tamén é moito maior que no material de EPScopa, chegándose ata o recultivo número 24, en que, a causa da contaminación do material se detivo o ensaio. Nos clons de castiñeiro, unha diferenza moi importante a ter en conta respecto ós de carballo é que a calidade dos microbrotes non descende a medida que avanzan os recultivos de calo (Figura 41). Resultados 109 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11 R12 R13 R14 R15 R16 R17 R18 R19 R20 R21 R22 R23 R24 TM Tipo de explanto EPScopa(N/A) EPS base(N/A) SISTO(N/A) calos EPScopa calos EPSbase calos SISTO A a c c b BC CD BBBC BBC BC D N/A Figura 40. Taxa de multiplicación (TM) dos calos, para os diferentes tipos de material de castiñeiro (ESP copa , EPS base e SISTO), ó longo dos sucesivos recultivos (Rn). Represéntase a media da taxa de multiplicación (TM) dos nós e ápices (N/A) durante o período de recultivo de calos. As barras verticais representan a desviación típica das medias calculadas en sucesivas repeticións. Letras diferentes, minúsculas no clon EPS e maiúsculas no clon SISTO, indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P<0,05). Resultados 110 Figura 41. Microbrotes do recultivo (a) nº 15 no clon SISTO e (b) nº 12 no clon EPSbase. 2.2.2 - Porcentaxe de calos que se deixan de recultivar Na Táboa 19 inclúense os resultados da porcentaxe de calos que se desbotan, en cada recultivo, para cada un dos clons de castiñeiro estudados. Neste aspecto, tamén se observa como o estado ontoxenético inflúe decisivamente, xa que a diferenza entre o material procedente da copa e da base do clon EPS é patente. Partindo de 24 calos en cada caso, os que proceden da copa soamente producen brotes ata o 4º recultivo, non producindo nada no 5º recultivo, polo que son desbotados. No caso do material procedente da base, a porcentaxe de calos que se tiran é sempre menor, chegando a producir brotes ata o 17º recultivo. No caso do clon SISTO, a porcentaxe de calos que se desbotan oscila entre o 0 % e o 36 % ó longo dos diferentes recultivos. Esta porcentaxe é significativamente máis elevada nos primeiros recultivos, e a partir do 4º recultivo diminúe notablemente. Chegáronse a recultivar calos 24 veces consecutivas. a b b b Resultados 111 Táboa 19. Porcentaxe de calos que se desbotan (fronte ó nº de recultivo - Nº REC) nos clons de castiñeiro EPS (copa e base) e SISTO. Letras diferentes na mesma columna indican diferenzas significativas segundo o test LSD (P<0,05). Nº REC EPS copa EPS base SISTO 1 16,67 ± 14,43 4,17 ± 7,21 15,22 ± 12,25 ab 2 35,00 4,35 27,98 ± 8,94 bc 3 15,38 5,00 36,40 ± 7,88 c 4 45,45 0,00 13,92 ± 10,90 ab 5 100* 26,32 5,00 ± 10,00 a 6 7,14 10,66 ± 13,24 a 7 7,69 6,25 ± 12,50 a 8 0,00 4,17 ± 7,22 a 9 8,33 4,17 ± 7,22 a 10 9,09 13,04 11 0,00 5,26 12 0,00 0,00 13 0,00 4,76 14 0,00 10,00 15 10,00 0,00 16 11,11 11,11 17 12,50* 0 18 13,33 19 7,69 20 18,18 21 12,50 22 0 23 0 24 50* * Remate do ensaio Na Figura 42 pódese apreciar o grao de diminución do número de calos no material EPScopa e EPSbase, tendo en conta que se parte inicialmente de 24 calos por cada tipo de material, e como o faría (extrapolación teórica) no clon SISTO se se comezase a recultivar co mesmo número de calos. Resultados 112 0 5 10 15 20 25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Nº calos Nº recultivo EPScopa EPSbase SISTO Obsérvase como no material de características adultas se produce un importante descenso inicial do número de calos produtivos, mentres que no de características xuvenís (EPSbase) o descenso é máis suave. Pola contra, mentres que en EPScopa o material se perde rapidamente, no clon SISTO permanece moitos máis recultivos, poñendo de manifesto unha vez máis as diferenzas interclonais na micropropagación en xeral (San José et al., 1988; Juncker e Favre, 1989), e no recultivo de calos en particular. Figura 42. Número de calos que se recultivan para os diferentes tipos de material de castiñeiro (ESPcopa, EPSbase e SISTO), ó longo de sucesivos recultivos, partindo de 24 calos iniciais. Resultados 119 No clon SISTO, de castiñeiro, sucede algo parecido ós clons de carballo, o valor de TM´ é practicamente o mesmo con 5 que con 10 recultivos, e pásase de obter 34 microbrotes a finais de ano a cerca de 3500 empregando o calo basal. No material da base do clon EPS, a taxa de multiplicación co recultivo do calo estabilízase co 5º recultivo, incrementando a produción máis de 100 veces. No material de EPScopa é no que máis incidencia ten o uso do recultivo do calo de todos os clons ensaiados, xa que mentres que a taxa de multiplicación do subcultivo convencional é próxima a 1, co que practicamente non habería multiplicación efectiva, utilizando o recultivo do calo obtense un valor próximo a 1,58. Se se partise de 10 nós e ápices a primeiros de ano, utilizando o subcultivo convencional chegaríase a finais de ano con pouco máis de 14, mentres que utilizando o recultivo do calo obteríanse cerca de 1566 nós e ápices, o que dá unha idea clara do interese en recultivar os calos. Resultados 120 Táboa 20. Produción de nós e ápices ó final dun ano de multiplicación, nos clons TROBO, MUÍÑOS, QRF73, SISTO, EPS base e EPS copa , partindo dun único explanto, comparando o subcultivo sen recultivo e con recultivo do calo basal, recultivando os calos unha (rec1) ou máis veces (rec2-rec10). TM´: taxa de multiplicación utilizando o recultivo do calo; ∆: número de veces que se incrementa a produción, recultivando os calos, respecto ó subcultivo de nós e ápices. Represéntase o número de nós e ápices ó final dun ano de produción. Especie Clon Variable Subcultivo convencional Con recultivo do calo basal rec1 rec2 rec3 rec4 rec5 rec6 rec10 Quercus robur TROBO Nós e ápices 1082 100483 141473 153198 156163 TM´ 1,79 2,67 2,76 2,78 2,79 ∆ - 92,87 130,75 141,58 144,33 MUÍÑOS Nós e ápices 120 27367 40956 45294 46488 TM´ 1,49 2,41 2,5 2,53 2,53 ∆ - 228,55 342,04 378,27 388,24 QRF73 Nós e ápices 104620 4690836 6888320 7354067 7444549 7459128 7461214 TM´ 2,62 3,67 3,81 3,84 3,84 3,84 3,84 ∆ - 44,84 65,84 70,29 71,16 71,30 71,32 Castanea sativa SISTO Nós e ápices 34 1387 2554 3100 3339 3439 3475 3498 TM´ 1,34 1,87 1,98 2,02 2,03 2,04 2,04 2,05 ∆ - 41,38 76,21 92,52 99,65 102,64 103,7 104,39 EPSbase Nós e ápices 6189 316527 596429 682568 706692 711776 712848 713271 TM´ 2,07 2,94 3,12 3,16 3,17 3,18 3,18 3,18 ∆ - 51,14 96,36 110,28 114,18 115,00 115,17 115,24 EPScopa Nós e ápices 1,43 60 120,6 133,4 156,6 TM´ 1,03 1,44 1,53 1,55 1,58 ∆ - 41,96 84,34 93,29 109,51 Resultados 121 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 TM´ nº Subcultivo TROBO MUÍÑOS QRF73 SISTO EPSbase EPScopa Utilizando o recultivo do calo basal, a taxa de multiplicación (TM´) tarda en estabilizarse varios subcultivos. Isto débese a que se introducen progresivamente novos calos, con distintas capacidades produtivas segundo o número de veces que foron recultivados, mentres que no cultivo de nós e ápices a proporción relativa de ambos tipos de explanto se estabiliza rapidamente, e ademais presentan taxas de multiplicación máis homoxéneas ó longo dos subcultivos. Supoñendo que os calos fosen recultivados unha soa vez, a TM´ dos clons estudados evolucionaría segundo se representa na Figura 45. Os valores de TM´ no primeiro subcultivo coinciden coa taxa de multiplicación dos nós e ápices, xa que previamente non existen calos basais. Os valores de TM´ tenden a estabilizarse arredor do 5º subcultivo, cando se estabiliza a proporción relativa de cada tipo de explanto no sistema. Figura 45. Taxa de multiplicación ó longo de 12 subcultivos incluíndo o recultivo do calo basal (TM´), para os diferentes clons estudados, considerando que os calos basais se recultivan unha soa vez. Resultados 122 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TM´ Nº Recultivos TROBO MUÍÑOS QRF73 SISTO EPSbase EPScopa Como se observa na Táboa 18, canto máis se recultivan os calos, maior é o valor de TM´, tendendo este a aproximarse a un valor estable. A evolución do valor de TM´ recultivando os calos ata dez veces móstrase na Figura 46. Na maioría dos clons, cando os calos se recultivan 4-5 veces acádase un valor moi próximo ó de estabilización, xa que é arredor dese número de recultivo cando se acada unha proporción fixa de cada tipo de explanto (nós e ápices, e calos basais). Entón, de xeito intuitivo, en termos de máxima produción non merecería a pena recultivar os calos máis de 4-5 veces, pois o valor de TM´ non aumenta de forma significativa. Figura 46. Valor de estabilización da taxa de multiplicación incluíndo o recultivo do calo basal (TM´), para os diferentes clons estudados, recultivando os calos dende unha ata dez veces. Resultados 123 2.4.3 - Estudo de rendibilidade Se nun sistema de micropropagación pretendemos obter a máxima produción ó menor custo posible, cómpre determinar qué tipo de explantos se deben utilizar, pois a rendibilidade pode variar en función dos valores de multiplicación que aporte cada un. Como o calo basal non deixa de ser un explanto máis, a continuación faise unha pequena análise da súa influencia nos custos e produción, ben sexa recultivando diferentes tipos de calo ou recultivando varias veces un mesmo calo. Xa que os diferentes tipos de calo soamente se distinguiron nos clons de carballo, analizarase nestes qué tipos de calo é máis rendible recultivar. Debido a que nos clons adultos só o primeiro recultivo achega elevadas taxas de multiplicación, con brotes de calidade, a análise farase para o primeiro recultivo. Nos clons de castiñeiro analizarase cantas veces se deben recultivar os calos. De forma estándar farase un estudio de produción dun ano de duración partindo dun só explanto inicial. A produción medirase en explantos enraizables (nós e ápices) a finais de ano. Se chamamos “y” ó custo de subcultivar e manter un explanto en cultivo, para obter o custo total na produción anual, haberá que sumar tódolos explantos (nós, ápices e calos) que durante o ano estiveron en cultivo e multiplicalo por ese valor “y”. Para saber o prezo ó que nos sae cada explanto enraizable, haberá que dividir a suma anterior entre o número de nós e ápices obtidos a finais de ano. A relación sería a seguinte: - Subcultivo convencional: 13 12 1 a yai× ∑ - Con recultivo do calo basal: [ ] 13 12 1 12 1a yba ii ×+ ∑∑ , sendo: ai: número de nós e ápices ó inicio do subcultivo i bi: número de calos ó inicio do subcultivo i a13: número de nós e ápices (explantos enraizables) ó final do subcultivo número 12. Resultados 124 Os cálculos coas expresións anteriores, para cada un dos clons de carballo (TROBO, MUÍÑOS e QRF73), pódense observar na Táboa 21. Compróbase que a mellor opción para acadar a maior produción a un menor custo unitario conséguese recultivando soamente os calos tipo 2 e 3. Isto sucede nos tres clons estudados. Táboa 21. Custo unitario de cada explanto a finais de ano recultivando distintas combinacións de calos tipo 1, 2 e 3, para os clons TROBO, MUÍÑOS e QRF73. TIPO DE CALO CUSTO UNITARIO TROBO MUÍÑOS QRF73 Sen recultivo do calo 1,265 y × 2,024 y × 0,617 y × Tipo 1 1,236 y × 1,914 y × 0,623 y × Tipo 2 0,952 y × 1,122 y × 0,547 y × Tipo 3 0,917 y × 1,329 y × 0,492 y × Tipo1,3 0,919 y × 1,320 y × 0,499 y × Tipo 1,2 0,952 y × 1,126 y × 0,554 y × Tipo 2,3 0,819 y × 1,001 y × 0,470 y × Tipo 1,2,3 0,823 y × 1,005 y × 0,476 y × Por outra banda, nos clons de castiñeiro analízase como varía o custo unitario recultivando os calos unha ou varias veces (Táboa 22). Segundo a análise da Táboa 22 o custo unitario tamén tende a acadar un valor estable a medida que aumenta o número de veces que se recultiva un mesmo calo. No entanto, non sempre é aconsellable recultivalos moitas veces, pois en EPScopa soamente sería recomendable, dende o punto de vista económico, recultivar os calos dúas veces. No resto do material, o custo unitario é practicamente o mesmo nos últimos recultivos (ata o décimo), polo que o máis aconsellable é recultivar todos os calos, pois obteremos a máxima produción. Resultados 125 A evolución do custo unitario, recultivando os calos unha ou varias veces, varía de forma inversamente proporcional á evolución da taxa de multiplicación do sistema, segundo se observa na Figura 47. Compróbase, polo tanto, que o custo unitario de cada explanto producido depende altamente da taxa de multiplicación do sistema, polo que o recultivo do calo basal será unha vía de obter máis produción a menor custo Táboa 22. Custo unitario de cada explanto a finais de ano recultivando os calos dende 1 ata 10 veces, para os clons EPS (copa e base) e SISTO. Número recultivos CUSTO UNITARIO EPScopa EPSbase SISTO Sen recultivo do calo 9,954 × y 0,934 × y 2,853 × y 1 3,834 × y 0,693 × y 1,763 × y 2 3,729 × y 0,671 × y 1,763 × y 3 3,859 × y 0,667 × y 1,751 × y 4 3,750 × y 0,666 × y 1,735 × y 5 0,666 × y 1,728 × y 6 0,666 × y 1,726 × y 7 0,666 × y 1,724 × y 8 0,666 × y 1,723 × y 9 0,666 × y 1,723 × y 10 0,666 × y 1,723 × y Resultados 126 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 s/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TM C.U. Nº recultivo SISTO C.U. TM 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 s/c 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TM C.U. Nº recultivo EPSbase C.U. TM 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 0 2 4 6 8 10 12 s/c 1 2 3 4 TM C.U. Nº recultivo EPScopa C.U. TM Figura 47. Taxa de multiplicación (TM) e custo unitario (C.U.), nos clons SISTO e EPS (copa e base), sen recultivar os calos basais (s/c) e recultivando os calos dende unha ata dez veces. Resultados 127 3 - Ensaios de microenxerto 3.1 - Desinfección de landras (patróns) e xerminación Como se apuntou en ‘Material e métodos’, para preparar os patróns necesarios para realizar os microenxertos in vitro dos clons TROBO e MUÍÑOS, foi preciso a introdución in vitro de landras cos cotiledóns parcialmente seccionados e desprovistas das cubertas externas. Resumidamente, os tratamentos para o proceso de desinfección foron: - Desinfección 1: 30 s en 70 % etanol e 15 min en lixivia (0,8 % Cl activo). - Desinfección 2: 120 s en 70 % etanol e 20 min en lixivia (1 % Cl activo). Táboa 23. Porcentaxe de contaminación, landras útiles e landras non xerminadas logo do proceso de desinfección mediante dous tratamentos diferentes (ver texto) e posterior introdución in vitro. Letras diferentes nas columnas indican diferenzas significativas segundo o test t de Student cunha significación P < 0,05. Móstrase o valor de P para cada análise. Parámetro Desinfección 1 Desinfección 2 P % Contaminación 36 a 41 a 0,3 % Landras útiles 53 a 37 b 0,002 % Landras non xerminadas 10 a 22 b 0,4 Os resultados pódense observar na Táboa 23, onde se pode comprobar que unhas condicións de desinfección máis estritas (2ª tratamento) non provocaron un descenso da porcentaxe de contaminación. A maior parte da contaminación microbiana foi patente ós poucos días de introducir as sementes in vitro (Figura 48). A xerminación das landras tivo lugar entre 7 e 15 días tras a introdución in vitro. Outro dato que resulta interesante é a porcentaxe de landras que non xermina. Este valor foi maior no segundo tratamento. Isto pode ser debido a que as condicións de desinfección, ó ser máis fortes, produzan danos no embrión. Segundo Benson (1999) hai certos tecidos, coma óvulos inmaturos ou embrións, que tenden a ser facilmente danados polos desinfectantes. Resultados 128 O uso de patróns de 3-4 semanas implica un risco de que apareza contaminación tras a realización dos microenxertos (Figura 49), mesmo se estes se fan en condicións de esterilidade, pois nun período tan curto de tempo non se pode asegurar que non haxa esporas presentes nos patróns xerminados, podendo estas permanecer latentes sobre o patrón (Leifert e Cassells, 2001). Figura 48. Contaminación de landras ós 7 días dende a introdución in vitro. Figura 49. Microenxerto in vitro no que o patrón está contaminado por fungos. Resultados 135 Unha vez realizados, os microenxertos in vitro prenderon rapidamente e as primeiras xemas xa se puideron ver agromando ós 7 días, chegándose a reaillar os primeiros explantos ós 30-35 días (Figura 58), aínda que nalgún caso houbo que cambiar os microenxertos a medio fresco e esperar outros 30-35 días. Nos microenxertos in vivo, os valores de prendemento do 1º microenxerto son os máis baixos, tanto utilizando como fonte de púas brotes de forzado ou brotes en repouso vexetativo. A duración dos ciclos de microenxerto en serie foi, nos casos de menor duración, duns 60 días. Debido á baixa porcentaxe de prendemento, nalgún caso non foi posible obter unha cantidade de material suficiente para reenxertar e introducir in vitro ó mesmo tempo, polo que os primeiros brotes illados foron utilizados para facer o seguinte microenxerto da serie, e esperouse ó rebrote do fragmento de púa remanente sobre o patrón no microenxerto para poder introducir material in vitro, co que a duración do ciclo se alongou aínda máis. Nestes dous clons o microenxerto in vivo foi menos exitoso que nos clons de carballo, principalmente polo reducido desenvolvemento da púa (Figura 59), que ralentiza o proceso de microenxerto en serie. Resultados 136 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1º 2º 3º 4º 1º 2º 3º 4º 1º 4º 2º 3º 4º % Prend Microenxertos in vitro Microenxertos utilizando o material EPScopa como púa sobre diferentes patróns Microenxertos in vivo Número de microenxertos en serie Tipo de patrón: Plántulas EPSbase raíz EPSbase calo XUV9 raíz n=24 n=12 n=19 n=19 n=18 n=13 n=19 n=6 n=2 n=11 n=22 n=24 n=24 Figura 56. Porcentaxe de prendemento (%Prend) dos microenxertos en serie realizados utilizando como púa material de EPS copa . As cores das barras diferencian o tipo de patrón (Plántulas: plántulas procedentes de semente de 3 semanas de idade; EPS base raíz: brotes enraizados de EPS base ; EPS base calo: calos basais de EPS base ; XUV9 raíz: brotes enraizados do clon XUV9). Na parte superior de cada barra móstrase o número de microenxertos realizados en cada un dos pasos da serie. Resultados 137 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1ºfz 1ºrp 2º 1º 2º 3º 4º 1º % Prend Microenxertos in vitro Microenxertos utilizando o clon SISTO como púa sobre diferentes patróns Microenxertos in vivo Número de microenxertos en serie Tipo de patrón: Plántulas EPSbase raíz EPSbase calo n=24 n=17 n=9 n=3 n=32 n=18 n=24 n=12 0 % Figura 57. Porcentaxe de prendemento (%Prend) dos microenxertos en serie realizados utilizando como púa material do clon SISTO. As cores das barras diferencian o tipo de patrón (Plántulas: plántulas procedentes de semente de 3 semanas de idade; EPS base raíz: brotes enraizados de EPS base ; EPS base calo: calos basais de EPS base ; XUV9 raíz: brotes enraizados do clon XUV9). Na parte superior de cada barra móstrase o número de microenxertos realizados en cada un dos pasos da serie. No 1º microenxerto in vivo do clon SISTO diferéncianse os que se fixeron con púas procedentes de brotes de forzado (1ºfz) e de brotes en repouso vexetativo (1ºrp). Resultados 138 Figura 58. Desenvolvemento de dous microenxertos in vitro ós 35 días da súa realización. Un microenxerto realizado sobre (a) un brote enraizado e outro (b) sobre un calo basal. Figura 59. Crecemento da púa 60 días despois da realización dos microenxertos in vivo (a) no clon EPScopa e (b) SISTO. a b a b Resultados 139 n=22 n=18 n=18 n=23 n=18 n=18 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1º µenx 2º µenx 3º µenx % prend Número de microenxerto en serie LOURA PAREDE Clons LOURA e PAREDE As porcentaxes de prendemento dos microenxertos in vivo dos clons de castiñeiro LOURA e PAREDE aparecen reflectidas na Figura 60. Figura 60. Porcentaxe de prendemento (% prend) dos sucesivos microenxertos en serie in vivo dos clons LOURA e PAREDE sobre patróns xuvenís. Indícase na parte superior das barras o número de microenxertos realizados. No primeiro microenxerto da serie utilizáronse como púas microbrotes cultivados in vitro. Respecto ó 1º microenxerto, antes de seren utilizados como material para obter púas, os microbrotes in vitro permaneceron no mesmo medio durante un período correspondente a dous ciclos de multiplicación (60 días fronte ós 30 convencionais). Isto permitiu que os microbrotes acadasen un maior grao de lignificación que no subcultivo convencional, o que facilitou a inserción das púas nos patróns in vivo. A porcentaxe de prendemento móvese en torno a un 60 %, que se pode considerar un valor alto comparado cos resultados obtidos nos clons EPS e SISTO, tamén de castiñeiro. O prendemento do 3º microenxerto no clon LOURA foi baixo se temos en conta o resto dos valores. Puido existir algún factor que influíse neste Resultados 140 1 2 3 4 5 parámetro, probablemente unha falta de homoxeneidade no estado de lignificación do patrón e da púa. Aínda que non foi avaliado directamente neste traballo, un factor que ten influencia no prendemento é a compatibilidade entre o grao de lignificación dos brotes que se utilizan como púas e o dos patróns. Neste sentido, unha vez que un microenxerto in vivo de castiñeiro prende, aínda que o primeiro fluxo de desenvolvemento da púa remata sobre os 20-35 días (Figura 61), son necesarios 2-3 meses para que se acade o momento óptimo para obter novas púas e facer o seguinte microenxerto da serie. Figura 61. Evolución do crecemento dun microenxerto in vivo do clon LOURA, dende o momento en que a púa inicia a brotación (1) ata que remata o primeiro crecemento en altura (5). (2): 5 días, (3): 10 días, (4): 15 días, (5): 20 días. Neste caso aplicouse GA3 na xema apical para estimular a elongación dos entrenós. O crecemento dos microenxertos unha vez que prenderon foi reducido, do mesmo xeito que nos clons EPS e SISTO. Así, aplicouse GA3 (ver Material e métodos) coa intención de que os brotes desenvolvidos acadasen unha lonxitude suficiente para realizar os microenxertos da serie en intervalos máis curtos. A aplicación de GA3 sobre a púa tivo un notable efecto sobre o crecemento (Figura 62). Na Táboa 24 exprésase o efecto do GA3 no crecemento dos microenxertos e no número de púas que se poden obter de cada un. Resultados 141 O feito de aplicar GA3 permite aumentar, tanto no clon LOURA como no PAREDE, a lonxitude media do crecemento das púas en máis de 10 cm. Isto débese principalmente ó alongamento dos entrenós, o que facilita a preparación das novas púas e o aproveitamento de todos os nós obtidos. Figura 62. Diferenza de crecemento entre dous microenxertos in vivo, no clon PAREDE, en función da (a) aplicación ou (b) non de GA3, ós 40 días da realización dos microenxertos. Táboa 24. Lonxitude das púas (L) e número de novas púas obtidas (N), aplicando ou non un tratamento con GA3, para os microenxertos in vivo realizados nos clons LOURA e PAREDE, ós 40 días da realización dos microenxertos. CLON GA3 L (cm) N LOURA + 17,06 ± 5,88 6,20 ± 1,40 - 5,67 ± 3,13 4,50 ± 1,29 PAREDE + 17,61 ± 5,82 5,91 ± 1,22 - 6,35 ± 3,07 3,67 ± 1,97 a b Resultados 142 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1ºrp 1ºfz 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º % cont Nº de microenxerto QRFa MIÑO 0% 0% 0% 0% s.d. 3.3 - Efecto do microenxerto sobre a multiplicación in vitro 3.3.1 - Introdución in vitro dos explantos procedentes de microenxertos in vivo Na Figura 63 e 64 represéntanse, respectivamente, os resultados da porcentaxe de contaminación e da reactividade dos explantos introducidos in vitro a partir dos microenxertos in vivo dos clons de carballo. Figura 63. Contaminación (% cont), ós 35 días da introdución in vitro, dos explantos obtidos das púas que se desenvolveron a partir dos microenxertos in vivo dos clons QRFa (1º-12º microenxertos) e MIÑO (1º e 2º microenxertos). Nos explantos do 1º microenxerto do clon QRFa diferéncianse os explantos procedentes de microenxertos feitos con púas obtidas de brotes de forzado (1ºfz) dos de microenxertos feitos con púas obtidas de brotes en repouso (1ºrp). s.d.: sen datos. A porcentaxe de contaminación foi, no peor dos casos, dun 25 %, e en varias ocasións foi nula, o que se pode considerar un resultado positivo, tendo en conta que se introducen explantos procedentes de brotes que se desenvolveron en cámara de crecemento, onde non existen condicións de esterilidade. As condicións de desinfección resultan igualmente axeitadas en canto a que non afectaron á viabilidade dos explantos. Resultados 143 s.d. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1ºrp 1ºfz 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º 9º 10º 11º 12º % react Nº de microenxerto QRFa MIÑO Figura 64. Reactividade (% react), ós 35 días da introdución in vitro, dos explantos obtidos de púas que se desenvolveron a partir dos microenxertos in vivo dos clons QRFa (1º-12º microenxertos) e MIÑO (1º e 2º microenxertos). Nos explantos do 1º microenxerto do clon QRFa diferéncianse os explantos procedentes de microenxertos feitos con púas obtidas de brotes de forzado (1ºfz) dos de microenxertos feitos con púas obtidas de brotes en repouso (1ºrp). s.d.: sen datos. A reactividade dos explantos in vitro foi elevada, superando sempre o 80 %. No caso do clon QRFa, os explantos procedentes dos microenxertos presentaron unha reactividade superior ós brotes procedentes de forzado de segmentos de rama, que se introduciron como material control (ver apartado 1). Ó contrario do que sucede cos brotes procedentes de forzado, que debe introducirse in vitro en estado herbáceo, ó material enxertado pódeselle deixar acadar un certo grao de lignificación antes de introducilo in vitro, o que permite que os explantos soporten mellor as condicións de desinfección. Resultados 144 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 control µenx in vitro 4º µenx in vivo TM TROBO MUIÑOS aa a a a a 3.3.2 - Taxa de multiplicación in vitro do material procedente de microenxerto 3.3.2.1 - Clons de Quercus robur Clons TROBO e MUÍÑOS Na Figura 65 pódese observar que os explantos procedentes do material dos clons TROBO e MUÍÑOS microenxertado in vitro unha vez sobre un patrón procedente de semente non melloran significativamente as taxas de multiplicación respecto ós explantos procedentes de material sen enxertar (control). O mesmo sucede cos explantos que proceden de material microenxertado 4 veces in vivo. Figura 65. Taxa de multiplicación media de 7 subcultivos, para os clons TROBO e MUÍÑOS, do material control (sen enxertar), do procedente de microenxerto in vitro (µenx in vitro) e do procedente do 4º microenxerto en serie in vivo (4º µenx in vivo). Letras iguais, dentro de cada clon, indican que non existen diferenzas significativas segundo o test LSD (P<0,05).