Desarrollo de nuevas técnicas para el análisis genético en fibrosis quística : aplicación al cribado neonatal

Pablo Raña Díez TESIS DOCTORAL 2008 DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL Pablo Raña Díez Santiago de Compostela Instituto de Medicina Legal Facultad de Medicina y Odontología Universidad de Santiago de Compostela DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA “DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL” Memoria que presenta, para optar al grado de doctor, Pablo Raña Díez En Santiago de Compostela, junio de 2008. El Doctor D. Ángel Carracedo Álvarez, Catedrático de Medicina Legal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela y el Doctor D. Francisco Barros Angueira, CERTIFICAN: Que la presente memoria que lleva por título “DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL”, del licenciado en Farmacia por la Universidad de Santiago de Compostela Pablo Raña Díez, ha sido realizada bajo nuestra dirección, considerándolo en condiciones para optar al Grado de Doctor y autorizándolo para su presentación ante el Tribunal correspondiente. Y para que así conste, expedimos el presente certificado en Santiago de Compostela, a 13 de junio de 2008. Fdo.: Prof.Dr. Ángel Carracedo Álvarez Fdo: Dr. Francisco Barros Angueira Fdo: Pablo Raña Díez Exsilium hominis ignorantia, patria est sapientia. De hoc exsilio ad patriam via est scientia. (El exilio del hombre es la ignorancia, su patria es la sabiduría. De ese exilio a la patria el camino es la ciencia). HONORIO DE AUTUN (Siglo XII), De animae exsilio et patria (Sobre el exilio y la patria del alma). AGRADECIMIENTOS Ponerse a pensar en todas aquellas personas a las que uno debe estar agradecido durante todos estos años me ha resultado una tarea muy grata ya que me he dado cuenta de la infinidad de relaciones humanas que han surgido durante la realización de esta pequeña odisea que ha sido mi Tesis Doctoral. - En primer lugar comenzaré los agradecimientos, como no, por la Unidad de Medicina Molecular, mi otra casa durante todos estos años. Como no se me ocurre un orden lógico de agradecimientos, llevaré uno absurdo de manera que iré nombrando a la gente siguiendo el orden de entrada por el pasillo de la Unidad. Mis agradecimientos: A Ana Ézara, la organización personificada, por su ayuda y consejos para lidiar con la, por desgracia frecuente, burocracia que rodea al becario investigador y que tan importante resulta para poder seguir adelante. A Ana Vega y Clara Ruiz, por su trato amable y su disposición para resolverme cualquier duda o problema que me surgía. A Celsa Quinteiro, la Dra Quinn, por su sentido del humor y por ese toque de sarcasmo que aporta tan necesario para despertar de la, en ocasiones, soporífera rutina del laboratorio. A las técnico cum laude del laboratorio (Rocío, Marga y Lucía) a las que no había muestra que se les resistiera para obtener ADN. Espero que algún día me dejéis de tener miedo cuando entro por la puerta con nuevas manchas. A la nueva hornada de técnicos (Bego, María, Olga…), por hacerme siempre un hueco en los turnos de termociclador en esos días de muestras urgentes. A las nuevas incorporaciones de doctorandings (Carla, Marcos, Billy…), por ese aire fresco tan necesario que aportan al trabajo en el laboratorio. A la cuchipandi del Nesquik (Ana Blanco, Nuria Gómez, Ceres…), por aguantar mis filosofadas y mis chistes malos durante tantos y tantos días sin tirarme el café a la cara. A los compañeros con los que comencé la Tesis (Iván, Tono y Silvia) con los que he compartido mis inquedanzas en tantas ocasiones. Espero, para los que ya no estáis, que os vaya bien con vuestros nuevos rumbos. A Alejandro Gesteira, mi gran maestro de la informática (entre otras cosas) durante todos estos años. Gracias por estar siempre ahí para responderme a cualquier duda con ese sosiego y amabilidad de los que muchos deberían aprender. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL IV.3.3.- RESULTADOS GLOBALES DE CRIBADO EN PERÍODO 2003-2007 .............................................................................................. 130 IV.3.3.1.- DESCRIPCIÓN DE CASOS DIAGNOSTICADOS CON FIBROSIS QUÍSTICA MEDIANTE EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO .................................................................... 135 IV.4.- APÉNDICE .............................................................. 145 IV.4.1.- ESTUDIO MUTACIONAL DE PACIENTES GALLEGOS CON FIBROSIS QUÍSTICA .......................................................................... 145 IV.4.1.- PUBLICACIÓN .................................................................................... 151 CONCLUSIONES V.1.- CONCLUSIONES ....................................................... 159 ANEXOS ANEXO I.- PRIMERS DE AMPLIFICACIÓN Y EXTENSIÓN EN CHIP-CFTR VERSIÓN 2006. ........................................................ 163 ANEXO II.- PRIMERS DE AMPLIFICACIÓN Y EXTENSIÓN EN CHIP-CFTR VERSIÓN 2007. ........................................................ 165 ANEXO III.- EVOLUCIÓN EN LA COBERTURA DE LOS CHIPS.............. 169 BIBLIOGRAFÍA VII.1.- BIBLIOGRAFÍA ..................................................... 177 ABREVIATURAS ABREVIATURAS µL Microlitros µM Micromolar AAT α1-antitripsina ABC ATP-binding-cassette ACE Angiotensin 1 converting enzyme ACMG American College of Medical Genetics ACOG American College of Obstetricians and Gynecologists ADN Ácido desoxirribonucleico ADNc Ácido desoxirribonucleico copia Agua MQ Agua milli-Q AMPc Adenosín monofosfato-3',5' cíclico ATB0 Neutral amino acid transporter B0 ATP Adenosín trifosfato bp Base pairs (pares de bases) CBAVD Congenital bilateral absence of the vas deferens CDC Centre for disease control and prevention CeGen Centro Nacional de Genotipado CF Cystic Fibrosis CFGAC Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium CFTR Cystic Fibrosis Transmebrane Conductance Regulator CHUS Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela CLC-2 Chloride channel-2 cms Centímetros Dr Doctor dNTP Dinucleótidos trifosfato EDTA Etilendiaminotetraacetato ENaC Epithelial Sodium Channel FQ Fibrosis Quística GST M1 Gluthation- S-transferase M1 GST M3 Gluthation- S-transferase M3 GST P1 Gluthation- S-transferase P1 HFE Putative hereditary hemochromatosis gene HGMD Human Genome Mutation Database HLA-II Human leukocyte antigen gene II hME Homogenous Mass Extension IP Insuficiencia pancreática IRT Immunoreactive trypsinogen Kb Kilobase KDa Kilodalton M Molar MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry MBL Mannose-binding lectin MDR Multidrug resistance mEq/L Miliequivalentes/litro min Minutos DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL mM Milimolar mRNA Ácido ribonucleico mensajero NBD Nucleotide binding domain N.D. No disponible ng/mL Nanogramos/mililitro NHE3 Sodium-hydrogen exchanger isoform 3 NOS1 Nitric oxide synthase- 1 NOS3 Nitric oxide synthase- 3 ºC Grados centígrados OMIM Online Mendelian Inheritance in Man ORCC Outwardly rectifying chloride channel PAP Proteína asociada a pancreatitis PCR Polimerase Chain Reaction ROMK Renal outer-medullary potassium channel rpm Revoluciones por minuto rs Reference SNP identification SAP Shrimp Alkaline Phosphatase SDS Dodecilsulfato sódico seg Segundos SNP Single Nucleotide Polymorphism SP Suficiencia pancreática Taq Thermus acuaticus TGF β1 Transforming growth factor-β1 TIR Tripsinógeno inmunorreactivo TMD Transmembrane domain TNF-α Tumor necrosis factor-α TNF-α Tumor necrosis factor-α TRPV4 Transient receptor potential vanilloid 4 U Unidades de actividad enzimática UV Ultravioleta β2AR β2 adrenoreceptor INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 19 I.1.- INTRODUCCIÓN La fibrosis quística (FQ) es una de las enfermedades autosómicas recesivas graves más frecuentes en la población Caucásica. Su incidencia se sitúa en torno a 1 de cada 2500 nacidos. Son características comunes de esta enfermedad la patología respiratoria obstructiva, la insuficiencia pancreática, los problemas nutricionales y los problemas reproductivos. Su diagnóstico se basa principalmente en la detección de niveles altos de cloro en sudor y en la identificación de mutaciones en el gen CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). El gen causante de la fibrosis quística, gen CFTR, fue identificado mediante clonaje posicional en el año 1989 (Riordan JR et al), ubicándose en el brazo largo del cromosoma 7. El gen está formado por 27 exones con un tamaño de 250 kb que dan lugar a un mRNA de 6500 bp. El gen CFTR codifica para una proteína de 1480 aminoácidos, con un peso molecular de 168kDa. La función principal de esta proteína es la de actuar como canal de cloro estimulado por el AMPc (Cheng SH et al, 1991; Anderson MP et al, 1991A; Anderson MP, 1991B). Las células epiteliales de los pacientes con FQ tienen un transporte anormal de sodio y cloro. La mutación más importante en el gen CFTR (∆F508) se corresponde con una deleción de 3 pares de bases que da lugar a la pérdida de la fenilalanina en la posición 508 del gen (exón 10). Esta mutación se ha identificado en aproximadamente el 70% de los alelos de pacientes con FQ a nivel mundial (Cystic Fibrosis Analysis Consoritum, 1990). Actualmente se encuentran identificadas más de 1400 mutaciones que causan FQ (HGMD®- BIOBASE). Durante los últimos años se ha producido una importante mejora en la calidad y esperanza de vida de los pacientes con FQ (Kerem E et al, 1992). Las últimas estimaciones indican una esperanza de vida próxima a los 40 años para un niño con FQ nacido en los años 90 (Elborn JS et al, DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 20 1991). Los principales factores que han contribuido a ello han sido la mejora en los tratamientos antibióticos, la fisioterapia respiratoria, el trasplante pulmonar y una mejor organización asistencial en centros médicos. -EVOLUCIÓN DE LA ESPERANZA DE VIDA EN FIBROSIS QUÍSTICA. INTRODUCCIÓN 21 I.2.- ANTECEDENTES HISTÓRICOS Mucho antes de que la FQ fuera reconocida por la medicina científica de la época, se conocía ya en los medios populares de algunas regiones del Centro y Norte de Europa, en donde se relacionaba el sudor salado de los bebés con su muerte prematura. En relación a este sabor salado, se recoge en un manuscrito alemán del siglo XV, el Codex Latinus Monacensis 849 (actualmente en la biblioteca estatal de Baviera), la bendición Wider Elbe contra las enfermedades de los niños encantados. Dicha bendición recomendaba lamer la nariz del niño encantado para comprobar si ésta tenía un sabor salado. Es la primera documentación escrita que relacionaba el sabor salado con una posible enfermedad. Aproximadamente cien años más tarde (1606) aparece una descripción relacionada con el encantamiento de los niños y el sabor salado en la literatura médica de nuestro Siglo de Oro; el Dr Juan Alonso y de los Ruyzes de Fontecha, profesor de Medicina de la Universidad de Alcalá, en su libro Diez privilegios para mujeres preñadas dice: … conoce a la gente embrujada, si al rascarles en la frente, uno después nota un sabor salado en los dedos …. Probablemente la primera descripción histopatológica de la FQ se debe a Pieter Paaw (Holanda) que en 1595 realizó la autopsia a una niña de 11 años que se suponía estaba hechizada, concluyendo que la causa de la muerte había sido en realidad un problema pancreático. Una de las primeras historias clínicas de la enfermedad fue elaborada por Georg Seger (Polonia) que describió en 1673 a una niña de 3 años cuya autopsia reveló un páncreas endurecido y cirroso tras haber observado síntomas de fiebre, vómitos, diarrea, dificultades para ganar peso e inanición prolongada. En 1677 Gerardus Blasisus (Holanda) observa un páncreas cirroso en un niño fallecido a los nueve años. En el siglo XVIII el DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 22 pediatra sueco Nils Rosen von Rosenstein (Uppsala) describe en su libro sobre enfermedades infantiles una enfermedad a la que denominó fluxus coeliasus y que cursaba con diarrea, distrofia, debilidad y páncreas endurecido. Probablemente se trataba de enfermos con FQ. En 1838 el vienés Carl von Rokitansky (Austria), tras una autopsia realizada a un feto humano que había nacido en el séptimo mes de embarazo sin dar señales de vida, descubrió lo que debía ser un íleo meconial (obstrucción intestinal total o parcial de la luz del tracto gastrointestinal). Alois Bednar, también en Viena, describe en 1850 un caso similar de un recién nacido vivo que había muerto al sexto día de vida. Más o menos coincidentes en el tiempo se describen y publican cuadros semejantes en Inglaterra. En 1936 Guido Fanconi (Suiza) establece una relación entre la afectación pancreática y las bronquiectasias como elementos característicos de la FQ (Fanconi G et al, 1936) aunque el término fibrosis quística (del páncreas) no aparece hasta 1938 cuando la patóloga estadounidense Dorothy H. Anderson en autopsias de lactantes y niños da una descripción comprensible de los síntomas de la FQ y de daños en órganos que siempre incluían la destrucción del páncreas y frecuentemente infección y daño en el parénquima pulmonar (Anderson DH et al, 1938). En el año 1943, Farber fue quien, al parecer, acuña el término de mucoviscidosis para referirse a la patología que nos ocupa, en la que los sistemas ductales de los órganos afectados acababan generalmente siendo ocluídos por secreciones inusualmente espesas (Farber D et al, 1944). Hacia 1946 los estudios de los pacientes comenzaron a revelar información sobre las bases genéticas de la FQ. Después de examinar el patrón de herencia en las familias Anderson y Hodges dedujeron que se trataba de una condición recesiva, probablemente causada por una mutación en un único gen (monogénica) (Anderson DH y Hodges RG, 1946). En 1953, tras una ola de calor en Nueva York, Paul A. Di Sant’Agnese observa la excesiva pérdida de sal en el sudor en los pacientes con FQ (Di INTRODUCCIÓN 23 Sant’Agnese PA et al, 1953). Esta observación serviría para desarrollar un test clásico en el diagnóstico de la FQ, la medición del contenido de cloruro en el sudor por estimulación mediante iontoforesis de pilocarpina (Gibson LE y Cooke RE, 1959). El patrón de herencia autosómico recesivo de la FQ fue definitivamente indicado por Allen en 1956 (Allen F Jr. et al, 1956) y confirmado por Conneally en 1973 (Conneally PM et al, 1973). La primera referencia a la FQ recogida en Anales Españoles de Pediatría la encontramos en una conferencia celebrada el 15 de febrero de 1969 en el Colegio de Médicos de Palma de Mallorca con el tema Mucoviscidosis. En los años 80 los científicos descubren que el mal funcionamiento de los tejidos epiteliales (impermeabilidad al ion cloruro) era un defecto común a todos los órganos afectados por la FQ (Knowles M et al, 1981; Quinton PM et al, 1983). En 1985 se localiza el gen en el cromosoma 7 y a finales de esta misma década se identifica definitivamente el gen CFTR mediante clonaje posicional por parte de Lap-Chee Tsui y John Riordan junto con Francis S. Collins y colaboradores (Riordan JR et al, 1989; Rommens JM et al, 1989; Kerem B et al, 1989). FUENTE: www.fibrosis.org/comunica/congreso/articles/M_histo.htm. Fecha de acceso mayo 2008 (Pérez Frías J et al). DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 30 americana Vertex Pharmaceuticals que ha mostrado buenos resultados para los pacientes con la mutación G551D. Por otro lado grupos de investigación como el de Alan Verkman llevan años desarrollando numerosas moléculas sin que todavía hayan llegado al uso en clínica (Verkman A, 2008). Otras opciones como la terapia intracelular y la terapia génica están también en fase de investigación. La FQ es un primer candidato a la terapia génica por su relativa accesibilidad a los órganos diana cruciales, es decir, los pulmones. Estudios de transferencia génica llevados a cabo utilizando adenovirus y complejos ADNc-FQ liposomales han logrado la restauración de cloruro en los ratones FQ transgénicos. Varios ensayos clínicos han sido realizados en pequeños grupos voluntarios de pacientes con FQ. Aunque existe evidencia experimental de la expresión de CFTR en los pacientes con FQ tratados, ha sido generalmente transitoria y existen varias descripciones de reacciones inflamatorias, especialmente cuando se utilizan adenovirus como vectores. A pesar de los problemas encontrados inicialmente, existe un notable optimismo de que se desarrollará una terapia génica efectiva para la FQ en los próximos años (Parsons DW et al, 2005). I.5.- DIAGNÓSTICO I.5.1.- DIAGNÓSTICO CLÍNICO Hasta hace poco tiempo, el diagnóstico de la fibrosis quística se había basado en criterios clínicos definidos detalladamente y el análisis de los niveles de cloruro en sudor (Davis PB et al, 1996). La disponibilidad desde los años 90 del análisis mutacional del locus del gen responsable de la enfermedad (Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium-CFGAC, 1994) y la valoración de las propiedades bioeléctricas del epitelio respiratorio mediante la medida de la diferencia de potencial nasal transepitelial (Knowles MR et al, 1995) han aumentado el espectro clínico de la FQ al incluir a individuos con presentaciones atípicas y menos severas de la enfermedad. INTRODUCCIÓN 31 Para orientar en el diagnóstico de este trastorno genético, un grupo de expertos clínicos y genetistas en el año 1997 se reunió a través de la Cystic Fibrosis Foundation para consensuar criterios para el diagnóstico de la enfermedad (Rosenstein BJ y Cutting GR, 1998). Así, concluyeron que el criterio diagnóstico para la FQ debería incluir la presencia de una o más características fenotípicas, una historia de FQ en un hermano o un resultado positivo en un test de cribado neonatal (además de evidencia en laboratorio de una anormalidad en CFTR documentada por una elevada concentración de cloruro en sudor, la identificación de mutaciones en los alelos del gen CFTR o anormalidades en el trasporte de iones en el epitelio nasal). CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DE LA FIBROSIS QUÍSTICA - Uno o más rasgos fenotípicos característicos. - Historia de fibrosis quística en hermano o primo hermano. - Cribado neonatal positivo. Evidencia de disfunción en CFTR demostrada por: - Concentración de cloruro en sudor elevada en dos o más ocasiones. - Identificación de dos mutaciones causantes de la enfermedad. - Diferencia de potencial nasal anormal. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 32 CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE FQ - Enfermedad crónica sinopulmonar manifestada por: a) Colonización o infección persistente con patógenos típicos de FQ, incluyendo Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa y Burkholderia cepacia. b) Tos crónica y producción de esputo. c) Anormalidades persistentes en radiografía torácica (bronquiectasias, atelectasias…). d) Obstrucción de las vías aéreas manifestada en dificultad respiratoria o sibilancias. e) Poliposis nasal; anormalidades radiográficas o de tomografía computerizada de los senos paranasales. f) Dedos en palillo de tambor. - Problemas gastrointestinales y nutricionales incluyendo: a) Intestinales: íleo meconial, síndrome de obstrucción intestinal distal, prolapso rectal. b) Pancreáticos: insuficiencia pancreática, pancreatitis recurrente. c) Hepáticos: enfermedad hepática crónica manifestada por evidencia clínica o histológica de cirrosis biliar focal o cirrosis multilobular. d) Nutricionales: problemas de crecimiento (malnutrición proteico-calórica), hipoproteinemia y edema, complicaciones secundarias a la deficiencia de vitaminas liposolubles. - Síndromes de falta de sal: pérdida aguda de sal, alcalosis metabólica crónica. - Anormalidades urogenitales masculinas resultantes en azoospermia obstructiva (CBAVD). INTRODUCCIÓN 33 TEST DEL SUDOR El test del sudor (Stern RC, 1997) sigue siendo el test de laboratorio más utilizado para confirmar la FQ. El test se basa en la recogida de sudor mediante iontoforesis por pilocarpina con la determinación química de la concentración de los cloruros. Por lo general, un nivel de cloruros en el sudor de más de 70 mEq/L en dos medidas diferentes se considera diagnóstico. -DISPOSITIVO PARA LA REALIZACIÓN DEL TEST DEL SUDOR. MEDIDA DE LA DIFERENCIA DE POTENCIAL NASAL El epitelio respiratorio, como los tejidos epiteliales en otros órganos, regula el contenido de iones y agua de los fluidos superficiales mediante mecanismos de transporte activo. Estos movimientos iónicos crean una diferencia de potencial transeptielial. La ausencia de CFTR en la superficie apical, el flujo disminuído de cloruros resultante y la hiperabsorción de sodio dan lugar a unas medidas anormales de la diferencia de potencial a través del epitelio de los individuos con FQ. Debido a la accesibilidad del tejido epitelial nasal, el distinto patrón de diferencias de potencial nasal tomado en pacientes con FQ se encuentra bien establecido (Knowles MR et al, DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 34 1995). La diferencia de potencial nasal ha sido aceptada como un test diagnóstico alternativo, que puede complementar el uso del test del sudor y el análisis mutacional. Este test es más útil en pacientes con presentaciones atípicas con niveles de test del sudor borderline (40-70 mEq/L) y en los que no se han identificado dos mutaciones asociadas a la FQ (Wilson DC et al, 1998). -MEDIDA DE LA DIFERENCIA DE POTENCIAL NASAL. I.5.2.- DIAGNÓSTICO MOLECULAR El test genético para la FQ generalmente se realiza para respaldar una evaluación clínica o para estudiar a un individuo que tiene un riesgo incrementado de portar un alelo de FQ. La identificación de portadores se lleva a cabo generalmente para valorar el riesgo de la transmisión de mutaciones a la descendecia. Individuos con una historia familiar de FQ tienen un mayor riesgo de ser portadores de mutaciones en el gen CFTR que el resto de la población, por lo cual pueden desear un test mutacional para definir con mayor exactitud su riesgo. El diagnóstico prenatal se lleva a cabo generalmente en parejas cuyos miembros son portadores y que por lo tanto tienen un riesgo del 25% de tener hijos con FQ. El análisis mutacional de ambos padres y el feto puede INTRODUCCIÓN 35 determinar si el feto ha heredado un genotipo de riesgo. El consejo genético puede resultar complicado para genotipos asociados a formas atípicas de FQ. Por otro lado, el actual desarrollo de tratamientos específicos para pacientes con fibrosis quística con determinadas mutaciones (codones de parada, G551D) repercutirá en la necesidad del análisis genético de los mismos para la selección de su terapia. I.5.3.- CRIBADO NEONATAL PARA LA FIBROSIS QUÍSTICA I.5.3.1.- FUNDAMENTO Aunque la FQ generalmente causa signos y síntomas característicos durante la infancia (Lai HC et al, 2002; Abman SH et al, 1991), los retrasos en el diagnóstico son comunes (Lai HC et al, 1998) y muy perjudiciales. Cuando se diagnostica por los métodos tradicionales, basándose en la sospecha por síntomas clínicos y un test del sudor, casi la mitad de los pacientes tiene ya malnutrición severa y muchos tienen infección crónica respiratoria (Cystic Fibrosis Foundation, 2001; Farrell PM, 2003). Numerosos estudios han demostrado en los últimos años los múltiples beneficios de un diagnóstico temprano de la enfermedad, tanto en la evolución clínica como en la reducción de la morbilidad. La evidencia sugiere que un diagnóstico presintomático temprano de la FQ a través de los programas de cribado neonatal está asociado a beneficios clínicos y para la salud del paciente (Farrell PM et al, 1997; Waters DL et al, 1999; Farrell PM et al, 2001; Mastella G et al, 2001; Siret D et al, 2003; Sims EJ et al, 2005; Farrell PM et al, 2003). Las expectativas para los niños nacidos con FQ han cambiado mucho en las últimas dos décadas. Un informe reciente sugiere unas mejores DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 36 funciones cognitivas en estos niños, con mejores niveles de vitamina E al diagnóstico (Koscik RL et al, 2005). Además, el cribado neonatal reduce la exposición de las familias a lo que frecuentemente constituye un período largo y estresante de diagnóstico y les proporciona a las parejas la oportunidad de tomar decisiones informadas sobre su reproducción (Merelle ME et al, 2003; Kharrazi M et al, 2005). El consenso general es que existe suficiente evidencia para apoyar el cribado neonatal en FQ y, según revisiones sistemáticas: …los beneficios en la salud en los niños con FQ compensan el riesgo de daño y justifican el screening de FQ… (Farell PM et al, 2005). El seguimiento de los niños identificados mediante programas de cribado ha suministrado importante información sobre la historia natural de la enfermedad así como un mejor entendimiento de su fisiopatología temprana. La mayoría de los niños tienen síntomas gastrointestinales en el momento del diagnóstico (Giglio L et al, 1997). El crecimiento reducido puede apreciarse a los dos meses de edad. Aproximadamente un 60% de los niños tiene una significativa malabsorción de grasas a esa edad y el grado de malabsorción se correlaciona con la falta de crecimiento (Bronstein MN et al, 1992). No sorprende por tanto que los niños con FQ diagnosticada convencionalmente tengan severas deficiencias vitamínicas o malnutrición proteica, conllevando deshidratación e hipoproteinemia (Wilfond BS et al, 1994). Adicionalmente a los problemas nutricionales, los niños con FQ identificada a través de programas de cribado tienen evidencias de infección en las vías aéreas e inflamación, sugiriendo que la enfermedad pulmonar en estos niños es similar a la de adultos y niños de mayor edad (Armstrong DS et al, 1995). Todos estos problemas tempranos sugieren de una manera importante la necesidad de un tratamiento precoz. En la tabla siguiente se pueden observar resumidas las ventajas que fundamentan el diagnóstico temprano mediante el cribado neonatal (Farrell PM, 2008): INTRODUCCIÓN 37 FUNDAMENTOS NUTRICIONALES Y GASTROINTESTINALES - Los pacientes con FQ son generalmente bien alimentados desde el momento del nacimiento. - En el 90% de los pacientes se producirá insuficiencia pancreática cerca del primer año de vida. - En el 50 % de los pacientes no tratados se desarrollará malnutrición severa. - La IP puede ser anticipada y la malnutrición prevenida. - Los beneficios a largo plazo de una nutrición adecuada son significativos. FUNDAMENTOS PULMONARES - Los pulmones de los afectados con FQ son generalmente sanos al nacer, aunque por poco tiempo. - La enfermedad pulmonar frecuentemente se produce a los 2 meses de vida. - La colonización por Pseudomonas aeruginosa ocurrirá aproximadamente en un tercio de los pacientes no diagnosticados. - La conversión de P. aeruginosa al tipo mucoide supone un alto riesgo a largo plazo para los niños con FQ. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 38 OTROS FUNDAMENTOS - El daño psicológico asociado a la odisea en el diagnóstico puede prevenirse. - Los padres pueden tomar decisiones informadas para futuros embarazos. - Beneficios económicos tanto para el diagnóstico como para el tratamiento. - Se favorece la investigación clínica, especialmente el estudio de estrategias preventivas. En esencia, excepto los pacientes con íleo meconial, los niños con FQ están generalmente sanos en el momento del nacimiento. Su estado nutricional es normal y el 90 % de los casos con mutaciones de las clases I, II y III (que serán descritas posteriormente) desarrollarán IP que puede ser anticipada utilizando terapias que prevengan la malnutrición. De este modo es bastante probable que crezcan de una manera normal (Farrel PM et al, 2001; Roussey M et al, 2003). Los fundamentos pulmonares para el cribado son claros. Afortunadamente, los pulmones de pacientes con FQ al nacimiento son normales (Bedrossian CWM et al, 1976), aunque esta situación suele no continuar después de los 2 meses de edad (Abman SH et al, 1991; Farrell PM et al, 2003b). Existen muy pocos pacientes diagnosticados a través de cribado neonatal que mostraran Pseudomonas aeruginosa en su tracto respiratorio, mientras que aproximadamente un tercio de los pacientes diagnosticados tras los signos o síntomas ya están colonizados con P. aeruginosa y muchos con el tipo mucoide (FitzSimmons SC, 1993). INTRODUCCIÓN 39 Adicionalmente a los fundamentos clínicos, existen otras consideraciones a tener en cuenta. Además de los riesgos a corto plazo debidos al diagnóstico retardado, sabemos que existen otras complicaciones a largo plazo entre las que se incluyen fallo en el desarrollo de la función cognitiva (Koscik RL et al, 2004) y un riesgo aumentado de enfermedad pulmonar temprana (Rosenfeld M, 2005). Por otro lado, también existe evidencia de las implicaciones económicas y coste-efectividad de los programas de cribado neonatal en FQ. En un estudio pionero reciente (Sims EJ et al, 2007) se concluye que, además de los evidentes beneficios clínicos y sociales de los programas de cribado neonatal, existe un beneficio económico traducido en un ahorro importante para los sistemas de salud. I.5.3.2.- APROXIMACIONES ACTUALES Casi todos los programas de cribado neonatal para la FQ comienzan con la determinación de tripsinógeno inmunoreactivo (TIR) (Crossley JR et al, 1981), un marcador de disfunción pancreática, de una mancha de sangre recogida a los pocos días del nacimiento (Wilcken B et al, 1993). Sin embargo, un nivel elevado de TIR tras el nacimiento no es específico de la FQ, ya que muchos niños sanos pueden mostrar elevaciones temporales transitorias por diversos motivos. Tras la introducción de este marcador en los programas de cribado se hizo evidente que los niños con FQ tenían elevaciones persistentes en los niveles de TIR, razón por la cual la mayoría de los programas de cribado introdujeron una segunda medida de TIR a las pocas semanas de edad aumentando así la especificidad del método. Un gran número de programas de cribado en el mundo han demostrado que mediante la medida de dos niveles de TIR, acompañado con un test de sudor, se puede conseguir una sensibilidad en la población a estudio próxima al 95%. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 46 I.6.1.1.- TEORÍAS SOBRE LA INCIDENCIA ELEVADA Se han propuesto diversas teorías para tratar de explicar la alta incidencia de la FQ. De entre ellas, la más conocida es la de la ventaja selectiva de los individuos heterocigotos con FQ frente a distintos tipos de diarrea provocados por bacterias como Vibrio cholerae (Gabriel SE et al, 1994) E.coli (Chao AC et al, 1994) o Salmonella Typhi (Pier GB et al, 1998). Ninguna de las teorías propuestas ha sido demostrada, por lo que todavía se desconoce la causa exacta de la alta incidencia de la FQ. De hecho, la teoría sobre el cólera ha sido rebatida (Cuthbert AW et al, 1995) ya que el cólera y la diarrea secretora se producen en todas las poblaciones humanas y por lo tanto no está claro como este mecanismo podría incrementar la frecuencia de los alelos FQ en sólo una raza y no en otras. I.6.1.2.- CLASIFICACIÓN MUTACIONAL POR FRECUENCIA Las mutaciones del gen CFTR que causan fibrosis quística pueden dividirse en tres categorías según su frecuencia: la mutación más común (ΔF508), mutaciones menos frecuentes y mutaciones raras: 1) La mutación ΔF508 fue la primera mutación identificada y se encuentra aproximadamente en el 70% de los alelos FQ en las poblaciones caucásicas (Cystic Fibrosis Analysis Consortium, 1990; CFGAC, 1994). -MUTACIÓN ΔF508. INTRODUCCIÓN 47 Esta mutación está aparentemente ausente en nativos africanos y asiáticos, aunque tiene una frecuencia considerable en grupos con mestizaje caucásico como los Afroamericanos (Cutting Gr et al, 1992). La frecuencia de la mutación ΔF508 varía entre las poblaciones europeas, con un aparente gradiente de frecuencia creciente desde el sureste hasta el noroeste de Europa (30% en Turquía e Israel, 88% en Dinamarca y partes de las islas Británicas). -FRECUENCIAS DE LA MUTACIÓN ΔF508 EN EUROPA. La alta frecuencia de la mutación da lugar a que alrededor de la mitad de todos los pacientes caucásicos con FQ sean homocigotos para la misma. De hecho, en ausencia de esta mutación, la FQ sería una enfermedad hereditaria relativamente rara en Caucásicos y ocurriría aproximadamente en la misma frecuencia en todas las razas (menos de 1 cada 10000). 2) Existe otro grupo de aproximadamente 20 mutaciones poco frecuentes que ocurren mundialmente en una frecuencia de 0,1% ó superior. La frecuencia relativa de cada mutación depende de la población, con algunas mutaciones que llegan al 5% de los alelos FQ en algunos grupos (CFGAC, 1994). DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 48 3) El resto de las mutaciones (94%) son denominadas como mutaciones raras. Sin embargo, cerca de 30 mutaciones tienen una frecuencia apreciable (mayor al 0,1%) en poblaciones específicas como resultado seguramente de un efecto fundador. Un ejemplo sería la mutación Y122X que representa el 48% de los alelos FQ en las Islas Reunión (Francia) pero es extraña en otros lugares (Chevalier-Porst F, 1992). Al menos se han descrito dos casos de FQ debidos a la herencia de dos copias del cromosoma siete de uno de los padres (disomía uniparental) (Spence JE et al, 1988; Voss R et al, 1989). Esta forma de herencia es extremadamente rara y no debe usarse para corregir las estimaciones del riesgo para portadores sanos de alelos FQ (Warburton D et al, 1988). I.6.2.- AISLAMIENTO Y ESTRUCTURA DEL GEN CFTR El gen causante de la FQ fue identificado mediante combinación de mapeado físico, aislamiento de regiones exónicas y análisis genético (Kerem B et al 1989, Riordan JR et al 1989, Rommens JM et al 1989). Los fragmentos de ADN aislados de la región entre los marcadores que flanqueaban el locus FQ fueron analizados para secuencias derivadas de los genes. Siguiendo la identificación y posterior eliminación de muchas secuencias candidatas, se aisló un fragmento de ADN de 4300 bp que demostró contener el primer exón del gen responsable de la FQ. A este gen se le denominó el regulador transmembrana de la conductancia de la FQ (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR) y se encuentra ubicado en el brazo largo del cromosoma 7 (7q31.2). El mapeado físico indica que el gen CFTR está compuesto por 27 exones (numerados del 1 al 24) con un tamaño de 250 kb de ADN (Zielinski J et al 1991; Ellsworth RE et al, 2000). El gen se transcribe a un mRNA maduro de aproximadamente 6500 bp (Riordan JR et al, 1989). Se ha descrito el procesamiento alternativo (splicing) de muchos exones, pero INTRODUCCIÓN 49 ninguno de los tránscritos resultantes codifica para una isoforma funcional de CFTR (Cutting GR et al, 1994). -ESTRUCTURA DEL GEN CFTR Y PROCESO DE TRADUCCIÓN. Muchos estudios han confimado que el CFTR es el gen responsable de la FQ (Kerem B et al, 1989). En primer lugar la deleción de tres nucleótidos ∆F508 se encontró únicamente en cromosomas de pacientes con FQ. En segundo lugar, no había recombinaciones entre ∆F508 y el fenotipo de la FQ. Además, la mutación ∆F508 se asoció casi exclusivamente con un haplotipo en fuerte desequilibrio de ligamiento con el locus FQ. Finalmente, cromosomas normales con el haplotipo común a los cromosomas FQ no tienen la ∆F508, indicando que esta deleción no era un polimorfismo ligado al haplotipo FQ. El mRNA de CFTR se expresa en tejidos epiteliales de los pulmones, el páncreas, la glándula sudorípara, el hígado, el intestino delgado y los testículos (Trezise AEO et al, 1991; Crawford I et al, 1991). Aunque la DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 50 expresión del CFTR tiene una regulación temporal y espacial muy precisa, las secuencias de control de la transcripción de CFTR todavía se conocen de manera escasa. I.6.3.- LA PROTEÍNA CFTR I.6.3.1.-ESTRUCTURA DE CFTR El gen CFTR codifica para una proteína de 1480 aminoácidos que tiene dos estructuras repetidas cada una de las cuales contiene un dominio transmembrana (TMD) compuesto por 6 fragmentos hidrofóbicos unidos a un dominio de unión de nucleótidos (NBD). Estas estructuras están separadas por una región de 241 aminoácidos con muchos residuos cargados y múltiples lugares potenciales para la fosforilación por proteinkinasas A y C (Riordan JR et al, 1989). La última región se postuló que estaba involucrada en el control de la función de la proteína y se le denominó dominio R. -ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA CFTR. La estructura global del CFTR es muy similar a miembros de la familia MDR (Multidrug Resistance). Estas proteínas pertenecen a la superfamilia de INTRODUCCIÓN 51 las proteínas ABC (ATP-binding cassette), que importan y exportan pequeñas moléculas (fármacos, proteínas, hidratos de carbono e iones) a través de las membranas celulares (Higgins C, 1989; Klein I et al, 1999). Los miembros de este grupo de proteínas son muy similares en la región hidrofílica, conteniendo un sitio de unión para el ATP (Hyde SC et al, 1990; Riordan JR et al, 1989). Mediante comparación con esta familia de proteínas, se propuso que CFTR podría actuar como un transportador dependiente de ATP, posiblemente exportando moléculas a través de las membranas celulares. -COMPONENTES DEL TRANSPORTADOR ABC. I.6.3.2.- FUNCIONES DE CFTR Aunque la estructura global de CFTR es semejante a los transportadores ABC, la evidencia experimental demuestra que su función principal es la de actuar como canal de cloro. De diversos estudios se obtiene que la expresión de CFTR da lugar a la aparición de nuevas secreciones de cloro estimuladas por el AMPc en una variedad de células derivadas de tejidos no epiteliales que no tenían canales de cloro AMPc dependientes (Kartner N et al, 1991; Anderson MP et al, 1991A). Además, la magnitud de esta secreción se correlacionó de un modo lineal con la cantidad de proteína CFTR presente. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 52 También se ha demostrado que CFTR es capaz de regular el funcionamiento de otros canales como ROMK, ENaC, ORCC, NHE3 y TRPV4 (Bush A et al, 2006). Se han propuesto otras muchas funciones para CFTR además de las anteriormente citadas. Se ha sugerido, por ejemplo, que CFTR modula la secreción de bicarbonato mediante la regulación del intercambiador de bicarbonato y cloro (Poulsen JH et al, 1994; Mastracola T et al, 1998; Lee MG et al, 1999). CFTR puede también jugar un papel en la regulación de canales aniónicos regulados por volumen y canales de uniones gap. Otras funciones propuestas incluyen la de sensor de los niveles intracelulares de ATP, conducción de una gran variedad de pequeños solutos y agua a través de las membranas celulares y la de facilitar la acidificación de las organelas intracelulares. La pérdida de estas propiedades podría explicar un gran número de desajustes metabólicos en las células. Sin embargo, la evidencia es insuficiente para corroborar estas funciones de CFTR. I.6.3.3.- CFTR EN PACIENTES CON FIBROSIS QUÍSTICA El transporte anormal de sodio y cloro en las células epiteliales de las vías aéreas que recubren los pulmones y las glándulas sudoríparas es el defecto bioquímico en los pacientes con FQ (Knowles MR et al, 1983; Quinton PM, 1983). Un gran número de estudios ha demostrado que la transfección de células epiteliales derivadas de pacientes con FQ con el ADNc salvaje da lugar a una reversión al fenotipo normal. Asimismo su expresión produce una corrección del defecto en el transporte de iones (Rich DP et al, 1990). Además, la reducción en los niveles endógenos de CFTR se asocia a una pérdida del transporte de cloro activado por AMPc en las células epiteliales. Varios estudios han confirmado que CFTR juega un papel central en el transporte de cloro y sodio que es defectuoso en pacientes con FQ (Sorscher EJ et al, 1991; Trapnell BC et al 1991; Wagner JA et al, 1991). INTRODUCCIÓN 53 -PULMONES EN INDIVIDUO SANO (IZQUIERDA) Y EN INDIVIDUO CON FQ (DERECHA). -GLÁNDULA SUDORÍPARA EN INDIVIDUO SANO (IZQUIERDA) Y EN INDIVIDUO CON FQ (DERECHA). Aunque se tienen bastantes conocimientos a nivel molecular y celular, el mecanismo por el cual la disfunción de CFTR lleva a una manifestación de la enfermedad a nivel orgánico no se comprende todavía con exactitud. Esto es particularmente cierto en el caso de la enfermedad pulmonar, la primera causa de morbilidad y mortalidad en FQ. De hecho, un debate importante en la investigación se centra en si la fisiopatología subyacente en FQ se debe a una pérdida de la absorción o secreción de electrolitos y fluidos o a una combinación de ambas (Wine JJ et al, 1999). I.6.4.- MUTACIONES EN EL GEN CFTR Para coordinar la recogida y distribución de información relativa a las mutaciones en FQ se creó en 1989 un consorcio mundial con 90 laboratorios, el Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium, con una página web en la que se puede contrastar información actualizada sobre las diversas mutaciones en individuos con FQ (www.genet.sickkids.on.ca/cftr/). DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 54 El objetivo de esta base de datos es el de proporcionar a los investigadores en FQ y otros profesionales relacionados información actualizada sobre las mutaciones individuales en el gen CFTR. De esta manera se intenta incrementar y facilitar la comunicación entre investigadores de FQ que estén trabajando en la identificación de mutaciones en el gen CFTR evitando esfuerzos innecesarios e intentando mejorar la comprensión de la función de los productos génicos en los pacientes con FQ así como la correlación de los síntomas clínicos y las mutaciones. Actualmente existen 130 grupos que trabajan en este consorcio en alrededor de 30 países. Además de en esta base de datos, se puede encontrar información extensa y actualizada sobre las mutaciones del gen CFTR en bases de datos como la Human Genome Mutation Database (www.biobaseinternational.com/hgmd/pro/gene.php?gene=CFTR). Actualmente se encuentran clasificadas más de 1400 mutaciones en el gen CFTR, la mayoría de las cuales corresponden a sustituciones nucleotídicas que dan lugar a un cambio de aminoácido o codón de parada. En segundo lugar están las pequeñas deleciones y posteriormente las sustituciones nucleotídicas que afectan al procesamiento del mRNA. En la tabla siguiente se pueden observar las distintas mutaciones descritas actualmente clasificadas según su naturaleza: INTRODUCCIÓN 55 -CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES EN EL GEN CFTR (HGMD-FEBRERO 2008). -DISTRIBUCIÓN POR EXÓN DE LAS MUTACIONES EN EL GEN CFTR. La mayoría de las mutaciones en el gen CFTR se corresponden con cambios que afectan a uno o pocos nucleótidos aunque en los últimos años se han detectado grandes deleciones que dan lugar a la pérdida de fragmentos grandes del gen (Hantash FM et al, 2006; Schneider M et al, 2007). Las distintas mutaciones se denominan siguiendo un criterio de recomendaciones establecido en el año 1998 (Antonarakis SE, 1998), clasificándose en los siguientes tipos: • cambio de aminoácido (missense): el cambio de nucleótido da lugar a la sustitución de un aminoácido. La mayoría de las mutaciones pertenecen a este tipo. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 62 I.6.7.- GENES MODIFICADORES La variedad de manifestaciones pulmonares en los pacientes con FQ y el desarrollo de complicaciones relacionadas con la FQ no se correlacionan en ocasiones con el genotipo de CFTR ni con los factores ambientales. Estudios recientes sugieren que las variaciones fenotípicas en la FQ pueden ser atribuídas a variaciones genéticas en otros genes diferentes al CFTR denominados genes modificadores. En los últimos años muchos genes modificadores candidatos se han investigado en relación con la FQ, especialmente genes implicados en el control de la infección, la inmunidad y la inflamación. Algunos de estos genes se han identificado de alguna manera como modificadores del fenotipo en la FQ, mientras que otras asociaciones no se han confirmado todavía (Slieker MG et al, 2005). RELACIONADOS CON ENFERMEDAD PULMONAR GEN REFERENCIAS MBL (Mannose-binding lectin) Garred P et al 1999, Davies JC et al 2004, Gabolde M et al 1999, Yarden J et al 2004. NOS1 (Nitric oxide synthase- 1) Grasemann H et al 2000, Grasemann H et al 2002, Texerau J et al 2004. NOS3 (Nitric oxide synthase- 3) Grasemann H et al 2003. AAT (α1-antitrypsin) Doring G et al 1994, Meyer P et al 2002, Mahadeva R et al 1998, Mahadeva R et al 1998b, Frangolias DD et al 2003, Henry MT et al 2001. HLA-II (Human leukocyte antigen gene II) Aron Y et al 1999. TNF-α (Tumor necrosis factor-α) Hull J y Thomson AH 1998. INTRODUCCIÓN 63 GST M1 (Gluthation- S-transferase M1) Hull J y Thomson AH 1998. GST M3 (Gluthation- S-transferase M3) Flamant C et al 2004. TGF β1 (Transforming growth factor-β1) Arkwright PD et al 2000. ACE (Angiotensin 1 converting enzyme) Arkwright PD et al 2003. β2AR (β2 adrenoreceptor) Buscher R et al 2002. CLC-2 (Chloride channel-2) Blaisdell CJ et al 2004. RELACIONADOS CON ENFERMEDAD GASTROINTESTINAL MBL (Mannose-binding lectin) Gabolde M et al 2001. AAT (α1-antitrypsin) Mahadeva R et al 1998. HLA-II (Human leukocyte antigen gene II) Carrington M et al 1994, Lanng S et al 1993, Duthie A et al 1995. TNF-α (Tumor necrosis factor-α) Hull J y Thompson AH 1998. GST M1 (Gluthation- S-transferase M1) Hull J y Thompson AH 1998. GST M3 (Gluthation- S-transferase M3) Flamant C el al 2004. GST P1 (Gluthation- S-transferase P1) Henrion-Caude A et al 2002. ACE (Angiotensin 1 converting enzyme) Arkwright PD et al 2003. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 64 HFE (Putative hereditary hemochromatosis gene) Rohlfs EM et al 1998, Devaney J et al 2003. ATB0 (Neutral amino acid transporter B0) Larriba S et al 2001. -POSIBLES GENES MODIFICADORES INVESTIGADOS EN FIBROSIS QUÍSTICA. Los genes modificadores pueden influir en la severidad de los fenotipos de FQ mediante un gran número de mecanismos. Pueden modular el fenotipo actuando en el nivel molecular básico, como permitiendo una conductividad alternativa de cloruros, o regulando el procesado y la expresión del gen CFTR. Pueden también actuar modulando la susceptibilidad a la infección y a la respuesta inflamatoria. Además, el fenotipo pulmonar en la FQ puede ser modificado por genes asociados al aclaramiento mucociliar o a la reparación del tejido epitelial dañado. Finalmente, los problemas gastrointestinales (hígado, páncreas, intestino) en la FQ pueden estar influenciados por genes que modulan la proteólisis y la fibrosis. INTRODUCCIÓN 65 I.6.8.-INFORMACIÓN Y ASOCIACIONES Es destacable la existencia de numerosas páginas web en las que se ofrece información acerca de la FQ, tanto para clínicos como para familiares de personas afectadas con dicha patología. Estos son algunos de los sitios web de mayor utilidad con información sobre FQ: ASOCIACIONES ¾ Federación Española contra la FQ: www.fibrosis.org ¾ Sociedad Europea de FQ: www.ecfsoc.org ¾ Fundación Sira Carrasco para ayuda a la FQ: www.fundacionfibrosisquistica.org ¾ Federación latinoamericana de FQ: www.fibrosis.org/paises/hispano/flafq.htm ¾ Asociación estadounidense de FQ: www.cfroundtable.com ¾ www.cysticfibrosis.com ¾ www.cff.org/home ¾ www.mycysticfibrosis.com ¾ www.cfawareness.org ¾ www.cfww.org DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 66 BASES DE DATOS ¾ Human Genome Mutation Database (HGMD): www.biobase-international.com/hgmd/pro/gene.php?gene=CFTR ¾ Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=602421 ¾ Cystic Fibrosis Mutation Database: www.genet.sickkids.on.ca/cftr ¾ SNPper: http://snpper.chip.org VARIAS ¾ Tutorial sobre FQ en español: www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/tutorials/cysticfibrosisspanish.html ¾ Investigación en FQ: www.cfri.org/home.htm ¾ Libro Blanco de atención a la fibrosis quistica: www.famma.org/asociaciones/Libro%20Blanco%20FibrosQuistica.pdf Fecha de acceso a direcciones web: mayo 2008. OBJETIVOS OBJETIVOS 69 II.1.- OBJETIVOS 1.- Desarrollo de nuevas técnicas de diagnóstico molecular para el análisis genético en fibrosis quística. 2.- Adecuación de las tecnologías desarrolladas para su aplicación en programas de cribado neonatal y aprovechamiento de las mismas para optimizar, simplificar y abaratar dichos programas. 3.- Estudio de la incidencia de la enfermedad en nuestra comunidad y creación de un mapa poblacional con las mutaciones más frecuentes en individuos afectados con fibrosis quística en Galicia. MATERIAL Y MÉTODOS DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 78 17B 17bi5 TTCAAAGAATGGCACCAGTGT 461 bp 17bi3 ATAACCTATAGAATGCAGCA 18 18i5 GTAGATGCTGTGATGAACTG 399 bp 18i3 AGTGGCTATCTATGAGAAGG 19 19i5 GCCCGACAAATAACCAAGTGA 555 bp 19i3 GCTAACACATTGCTTCAGGCT 20 20i5 GGTCAGGATTGAAAGTGTGCA 472 bp 20i3 CTATGAGAAAACTGCACTGGA 21 21i5 AATGTTCACAAGGACTCCA 475 bp 21i3 CAAAGTACCTGTTGCTCCA 22 22F GGTATCTGAACTATCTTCTCTA 251 bp 22i3 TGTCACCATGAAGCAGGCAT 23 23F CCCATGGTTGAAAAGCTGAT 414 bp 23i3 TAAAGCTGGATGGCTGTATG 24 24i5 GGACACAGCAGTTAAATGTG 548 bp 24i3 ACTATTGCCAGGAAGCCATT Las secuencias de los primers necesarios para la amplificaciónsecuenciación se obtuvieron de la Clinical Molecular Genetics Society, que en su página web (www.cmgs.org/BPG/Guidelines/1st_ed/cf.htm. Fecha de acceso: septiembre 2003) ofrecía un apéndice en el que se proponían los primers necesarios para amplificar mediante PCR los distintos fragmentos del gen CFTR. Los primers fueron suministrados por la casa Sigma-Genosys. Sin embargo, tras pruebas iniciales, se comprobó que no todos los fragmentos del gen se amplificaban o secuenciaban de forma adecuada por lo cual en algunos casos los primers propuestos se tuvieron que cambiar (así sucedió con los primers 8i5, 8i3, 11F, 14BS, 14BAS, 17AF, 22F y 23F). Para el diseño de éstos se utilizó el programa Primer3, de acceso gratuito online en la siguiente dirección: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi MATERIAL Y MÉTODOS 79 Las cantidades de reactivos utilizadas para llevar a cabo la PCR fueron: ¾ Agua MILLI-Q: 5 μL ¾ Eppendorf mastermix: 5 μL ¾ ADN: 1 μL ¾ Primer forward: 0,75 μL ¾ Primer reverse: 0,75 μL Las concentraciones de trabajo de los primers fueron 10 μM (dilución 1/10 del stock 100μM). Para la amplificación se utilizaron 15 picomoles y para la reacción de secuencia, como se verá más adelante, 10 picomoles. El agua MILLI-Q se obtuvo del dispositivo GRADIENT A10 de Millipore. Además, antes de introducir la placa en el termociclador se añadieron unas gotas de aceite mineral a cada pocillo (Mineral oil for molecular biology Sigma®) con la finalidad de tratar de evitar cualquier tipo de evaporación de los reactivos. Los termocicladores que se utilizaron tanto en la amplificación como en el resto de pasos hasta la consecución de la secuencia de ADN fueron de dos tipos, ambos válidos para placas de 96 pocillos: GeneAmp® PCR System 2700 (Applied Biosystems) y DNA Engine Dyad® (MJ) que se utilizaron indistintamente según su disponibilidad en el laboratorio. -TERMOCICLADORES UTILIZADOS EN LA SECUENCIACIÓN DEL GEN CFTR. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 80 Las condiciones seleccionadas para llevar a cabo la amplificación simultánea de todos los fragmentos del gen CFTR se pueden ver en el siguiente esquema: -CONDICIONES PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN CFTR. Como se puede observar, la PCR parte de una desnaturalización inicial a 95ºC de 2 minutos, para proseguir con 35 ciclos de desnaturalización/hibridación/extensión (94ºC, 1 min / 55ºC, 1 min / 72ºC 1 min) y finalizar con un ciclo de extensión final a 72ºC durante 7 minutos. La duración aproximada de la misma es de 2 horas y media. III.1.1.4.- COMPROBACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO Para comprobar el producto amplificado se utilizaron geles de agarosa del dispositivo READY-TO-RUN de AmershamBiosiences. En algunas ocasiones, en caso de necesitar una mayor precisión, se utilizaron también geles de poliacrilamida del dispositivo PHASTSYSTEM de Pharmacia. MATERIAL Y MÉTODOS 81 -DISPOSITIVO PHASTSYSTEM. -DISPOSITIVO READY-TO-RUN. III.1.1.5.- PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO Una vez hecha la comprobación, los ADNs amplificados se sometieron a una reacción en la que se eliminaron las posibles impurezas. Para ello se utilizó el reactivo EXOSAP-IT® de USB. El EXOSAP-IT consigue preparar el ADN amplificado para una mejor secuenciación. Está compuesto por dos enzimas hidrolíticas, exonucleasa I recombinante y fosfatasa alcalina de camarón (Pandauls borealis), formuladas en un tampón especial. La exonucleasa degrada los residuos monocatenarios de los primers o de cualquier otro ADN producido en la PCR mientras que la fosfatasa se encarga de hidrolizar los dNTPs sobrantes de la mezcla de PCR. Las cantidades utilizadas para esta reacción fueron 0,5 μL de producto amplificado y 0,25 μL de exosap-it. En ensayos iniciales se utilizaron 0,85 μL de exosap-it y 2,15 μL de producto amplificado (el fabricante recomienda 5 μL de ADN y 2 μL de exosap-it) pero posteriormente se consiguieron reducir las cantidades hasta las citadas DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 82 anteriormente con las consecuentes ventajas económicas sin por ello perder calidad en las secuencias. Para llevar a cabo esta reacción, el termociclador mantiene la placa a 37ºC durante 15 minutos (fase de tratamiento) y posteriormente a 80ºC otros 15 minutos (fase de inactivación). -ESQUEMA DE ACTUACIÓN EN LA REACCIÓN DE EXOSAP-IT. III.1.1.6.- REACCIÓN DE SECUENCIA Finalmente se lleva a cabo la reacción de secuencia previa a la secuenciación automática, para la cual se utiliza el BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). Las cantidades de reactivos utilizadas fueron las siguientes: MATERIAL Y MÉTODOS 83 ¾ ADN purificado: 0,5 μL ¾ Primer: 1 μL ¾ BigDye Terminator v3.1 Sequencing Buffer (5x): 1,75 μL ¾ Agua MQ: 6,25 μL ¾ BigDye Terminator v3.1: 0,5 μL La reacción de secuencia se fundamenta en el método enzimático de Sanger. En dicho método se utilizan análogos dideoxirribonucleótidos (que carecen de grupo 3’OH) que se incorporan a la cadena creciente de ADN compitiendo con los nucleótidos normales y actuando como terminadores dando lugar a un bloqueo en la síntesis de la cadena. Al incorporarse de manera aleatoria se van a crear un conjunto de fragmentos de ADN de diferentes longitudes complementario al molde de ADN que está siendo secuenciado. -FRAGMENTOS FORMADOS DURANTE LA REACCIÓN DE SECUENCIA. En nuestro caso, al procesar en un secuenciador automático los productos de esta reacción, en vez de usar isótopos radiactivos para marcar los fragmentos de ADN se utilizan terminadores marcados con fluoróforos diferentes (incluídos en los reactivos del kit). Esta técnica es más sencilla pues permite llevar a cabo la reacción en un solo pocillo en el que se añaden los cuatro terminadores marcados. Las condiciones para la reacción de secuencia fueron: desnaturalización inicial de 96ºC (3 minutos) y 25 ciclos de 96ºC (30 segundos) / 50ºC (15 segundos) / 60ºC (4 minutos). DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 84 III.1.1.7.- PURIFICACIÓN PREVIA A LA SECUENCIACIÓN Antes de introducir la placa en el secuenciador se somete a una última purificación del producto resultante de la reacción de secuencia. Para ello se utiliza el KIT MONTAGE SEQ96 ® de Millipore. Se realizan dos lavados de la placa mediante vacío, uno con 25 μL de solución de inyección y el segundo con 40 μL. Finalmente se añaden 25 μL de solución y se introduce la placa en un agitador durante 15 minutos. Tras la agitación se transfiere ya el producto a la placa que va al secuenciador. III.1.1.8.- SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA Finalmente ya tenemos las muestras preparadas para que se introduzca la placa en el secuenciador automático. El equipo funciona de manera totalmente automática inyectando las muestras en un capilar previamente cargado con un polímero que funciona como si fuera un gel de secuencia, permitiendo separar fragmentos de ADN de cadena sencilla que se diferencian en una única base. A una altura determinada el láser del dispositivo detecta la fluorescencia emitida por cada cadena sencilla de ADN fluorescente y traduce dicha emisión en la secuencia correspondiente. -LECTURA DE LOS FRAGMENTOS PROCEDENTES DE LA REACCIÓN DE SECUENCIA. MATERIAL Y MÉTODOS 85 En nuestro laboratorio utilizamos el secuenciador ABI 3730xl de Applied Biosystems que posee 96 capilares. -SECUENCIDOR ABI 3730XL. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 86 III.2.- ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA EL ANÁLISIS DEL GEN CFTR III.2.1.- CHIPS DE ADN Un chip de ADN (también llamado micromatriz, biochip o microarray) consiste en un gran número de moléculas de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido de manera que forman una matriz de secuencias en dos dimensiones. Estos fragmentos de material genético suelen ser secuencias cortas llamadas oligonucleótidos o de mayor tamaño como cDNA (ADN complementario, sintetizado a partir de mRNA), o bien productos de PCR. A estos fragmentos de ADN de una sola hebra inmovilizados en el soporte, se les denomina a menudo sondas. Los ácidos nucleicos de las muestras a analizar se marcan por diversos métodos (enzimáticos, fluorescentes, etc.) y se incuban sobre el panel de sondas, permitiendo la hibridación (reconocimiento y unión entre moléculas complementarias) de secuencias homólogas. Durante la hibridación, las muestras de material genético marcadas, se unirán a sus complementarias inmovilizadas en el soporte del chip, permitiendo la identificación y cuantificación del ADN presente en la muestra (mutaciones, patógenos, etc.). Con posterioridad, el escáner u otras herramientas informáticas permiten la interpretación y análisis de los datos obtenidos. Aunque la tecnología que hemos desarrollado, y que será descrita a continuación, no se ajusta de un modo estricto a la definición de chip de ADN (especialmente hasta el momento de la hibridación) hemos decidido denominarla así (Chip-CFTR) por sus semejanzas con la misma. MATERIAL Y MÉTODOS 87 -CHIPS UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE FIBROSIS QUÍSTICA (SpectroCHIP®). La existencia de un nodo del Centro Nacional de Genotipado (CeGen) en Santiago de Compostela supuso una ventaja por su accesibilidad desde nuestro laboratorio lo cual nos facilitó la introducción de esta tecnología en el programa piloto de cribado neonatal para la FQ. Concretamente la tecnología seleccionada para llevar a cabo nuestro proyecto fue la del sistema SEQUENOM MassARRAY®. -SISTEMA SEQUENOM MASSARRAY®. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 94 µL de tampón DLB (constituído con 100 µL de TRIS/HCL 1M pH 7,4, 20 µL de NaCl 5M, 200 µL de EDTA 0,5 M pH 8,0 y 9,7 ml de agua destilada). - Posteriormente se añaden 50 µL de SDS al 10% y 5 µL de proteinasa K (20mg/ml) y se deja incubando a 56ºC toda la noche. - Al día siguiente se añaden 20 µL de NaCl 5M, 250 µL de fenol-cloroformo y 250 µL de alcohol isoamílico 24:1 y se mezcla por inversión. - Se centrifuga 3 minutos a 12000 rpm y se pasa la fase acuosa (superior) a otro tubo, cortando la punta de la pipeta para evitar la fragmentación del ADN. - Posteriormente se añaden de nuevo 250 µL de fenol y 250 µL de alcohol isoamílico y se centrifuga 3 minutos a 12000 rpm. - Se recoge la fase acuosa nuevamente pasándola a otro tubo y se añade 1 mL de etanol absoluto frío. Se agita por inversión y se deja 30 minutos a 80ºC bajo cero. - Finalmente se centrifuga a 12000 rpm 15 minutos, se decanta el sobrenadante con la pipeta y se deja secar 10 minutos. Se añaden 30 µL de solución de rehidratación (Promega) y se incuba en un baño con agitación a 65ºC durante 1 hora. III.2.5.2.- CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y NORMALIZACIÓN El ADN se cuantifica mediante el espectrofotómetro NANODROP ND- 1000 y posteriormente se normalizan las muestras a 10 ng/µL utilizando una macro de Excel. La tabla de normalización nos permite saber el volumen de muestra necesario para la realización simultánea de los diferentes ensayos a la concentración adecuada para el análisis. En nuestro caso, teniendo en cuenta los ensayos del chip, el volumen mínimo necesario para cada muestra era de 70 µL (versión 2007). MATERIAL Y MÉTODOS 95 - EJEMPLO DE TABLA DE NORMALIZACIÓN PARA LAS MUESTRAS DE UN CHIP. Teniendo en cuenta estos datos se prepara una placa con las muestras a la concentración adecuada (añadiendo el ADN y el agua necesarios en cada caso, indicado en la tabla). Posteriormente el CeGen inicia con esta placa el proceso de genotipado. III.2.5.3.- AMPLIFICACIÓN DEL ADN El ADN se amplifica en una reacción PCR multiplex que tendrá distinto número de primers según las mutaciones que se analicen en cada ensayo. Las cantidades utilizadas para la reacción de amplificación de cada muestra fueron las siguientes : - Agua MQ: 53 µL. - PCR Buffer (10x): 27,6 µL. - MgCl2 (25 nM): 14,4 µL. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 96 - dNTP mix (25mM): 11,0 µL. - Hot Star Taq polimerasa (5 U/µL): 4,4 µL. - Primer mix (1 µM); 22,1 µL. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95ºC 15 min, 45 ciclos de 94ºC 20 seg / 56ºC 30 seg / 72ºC 1 min y por último 72ºC 3 minutos. III.2.5.4.- TRATAMIENTO CON SAP Tras la amplificación se lleva a cabo una reacción de purificación utilizando el reactivo SAP (Shrimp alkaline phosphatase) que cataliza la defosforilación 5’ fosfato de los extremos del ADN amplificado. Las cantidades utilizadas para cada placa fueron: - Agua MQ: 765 µL. - Buffer: 85 µL. - SAP: 150 µL. Las condiciones del termociclador para la reacción fueron 37ºC durante 40 minutos y 85ºC durante 5 minutos. III.2.5.5.- REACCIÓN DE EXTENSIÓN Una vez que tenemos el producto amplificado purificado, se procede a realizar la reacción de extensión iPLEX, para la que se utilizan diferentes cantidades de reactivos según en el ensayo se lleven a cabo 18 genotipos o más: -De 1 a 18 genotipos : -Agua MQ: 32,6 µL -Stop Buffer: 8,8 µL -iPlex mix: 4,4 µL -Extend Primers: 41,5 µL -Enzima iPlex-Gold: 0,9 µL MATERIAL Y MÉTODOS 97 -De 19 a 36 genotipos : -Agua MQ: 27,3 µL -Stop Buffer: 8,8 µL -iPlex mix: 8,8 µL -Extend Primers: 41,5 µL -Enzima iPlex-Gold: 1,8 µL Las condiciones del termociclador para la reacción de extensión fueron las siguientes: - Desnaturalización inicial: 94ºC 30 segundos. - 40 ciclos de desnaturalización-hibridación-extensión : 94ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg - Extensión final: 72ºC 3 minutos. III.2.5.6.- HIBRIDACIÓN EN CHIP Y LECTURA Tras la extensión, el producto resultante en cada pocillo se diluye en 15 µL de agua MQ y se le añade 6 mg de resinas de purificación (Clean Resin Sequenom®) con la finalidad de eliminar las sales de los productos resultantes de la reacción. Despúes se agita 15 minutos y se centrifuga para introducir la placa en el robot dispensador (Nanodispenser) que se encarga de coger el volumen necesario para hibridarlo en el chip (SpectroCHIP®) así como de añadir el calibrante necesario para el espectrómetro. Finalmente el chip se introduce en el espectrómetro (Autoflex Bruker Daltonics) donde se realiza la lectura del mismo. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 98 -ESPECTRÓMETRO E INTRODUCCIÓN DE CHIP PARA LECTURA. El fundamento del análisis de ácidos nucleicos mediante un espectrómetro MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization- Mass Spectrometry) puede verse esquematizado a continuación (Sauer S, 2006): -ESQUEMA DE FUNCIONAMIENTO DE UN ESPECTRÓMETRO MALDI-TOF. La irradiación de co-cristales formados por pequeñas moléculas acídicas orgánicas (la matriz) y biomoléculas con una láser pulsante (generalemente láser UV) induce una transferencia de energía y un proceso de deserción, evaporando la matriz y los iones del analito en una fase MATERIAL Y MÉTODOS 99 gaseosa. Tras la ionización, las moléculas de la matriz y el analito son aceleradas mediante un campo eléctrico. Generalmente la espectrometría de masas MALDI-MS se lleva a cabo con una separación time-of-flight (tiempo de vuelo). En ella, las moléculas son guiadas mediante óptica iónica por un tubo en vuelo libre de campo, donde se separan según sus relaciones masa/carga antes de que, finalmente, lleguen al detector. La interpretación de los espectros y la identificación de las mutaciones se lleva a cabo mediante algoritmos como los descritos por Bocker (Bocker S, 2003). III.2.5.7.- ANÁLISIS DE DATOS Por último, los datos procedentes del espectrómetro se analizan mediante el programa TyperAnalyzer (Sequenom®). Con dicho programa podemos visualizar cada uno de los espectros de las muestras a la vez que revisamos la asignación automática de genotipos que efectúa. -VISUALIZACIÓN DE ESPECTROS MEDIANTE EL PROGRAMA TYPERANALYZER. RESULTADOS Y DISCUSIÓN RESULTADOS Y DISCUSIÓN 103 IV.1.- DESARROLLO DE UNA TECNOLOGÍA DE ALTO RENDIMIENTO PARA EL GENOTIPADO DE CFTR IV.1.1.- DISEÑOS DE CHIPS-CFTR En el año 2006 se concluye el desarrollo de la primera versión del Chip-CFTR, que comienza a utilizarse de manera rutinaria en el programa piloto de cribado neonatal para FQ que se había iniciado tres años antes en la Unidad de Metabolopatías del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago (CHUS). La utilización de esta tecnología de alto rendimiento trató de solucionar los inconvenientes de la secuenciación, que se venía utilizando como método analítico en nuestro laboratorio desde el año 2003, y sus características específicas mostraron a esta tecnología durante los años siguientes como muy adecuada para el diagnóstico genético de la enfermedad y más concretamente para su aplicación en programas de cribado. Tras diversos ajustes en las condiciones de los ensayos con el fin de intentar analizar el mayor número de mutaciones en un mismo chip, desarrollamos una primera versión del Chip-CFTR (Chip-CFTRv2006) en la que se analizaban las siguientes variantes (mutaciones y polimorfismos) del gen CFTR, mediante los ensayos que se muestran a continuación (SNPs en negrita): DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 110 MUTACIÓN Nº DE ALELOS ΔF508 23 Y1014C 4 R1162X 3 711+1G-T 2 G576A 2 L206W 2 S1235R 2 R117H 2 2183AA-G 1 V562I 1 D1152H 1 E217G 1 E588V 1 F1052V 1 F1074L 1 G542X 1 I148T 1 R1066C 1 R334W 1 V232D 1 V754M 1 Y1092X 1 -MUTACIONES IDENTIFICADAS MEDIANTE CHIPS EN EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2006-2007). Asimismo, siguiendo el protocolo de actuación en el cribado, se secuenciaron las muestras en las que el chip sólo había identificado una mutación. En total se secuenciaron en este período otras 59 muestras confirmándose las mutaciones previamente identificadas y hallando otras como la G1069R. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 111 IV.1.3.2.- CASOS DIAGNOSTICADOS CON FIBROSIS QUÍSTICA MEDIANTE CHIPS EN CRIBADO Nuestro objetivo más importante dentro del programa piloto de cribado para la fibrosis quística era el de buscar recién nacidos con dos alelos mutados, lo cual identificaría de manera temprana a un individuo afectado con la enfermedad. Durante este período se diagnosticaron de esta manera un total de 11 neonatos, cuyos genotipos se pueden ver a continuación: AÑO ALELO 1 ALELO 2 2006 R1162X E588V 2006 ΔF508 L206W 2006 ΔF508 ΔF508 2006 ΔF508 ΔF508 2007 ΔF508 R117H 2007 ΔF508 L206W 2007 ΔF508 ΔF508 2007 ΔF508 ΔF508 2007 G576A G1069R 2007 ΔF508 ΔF508 2007 ΔF508 ΔF508 -GENOTIPOS DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS CON FQ MEDIANTE EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2006-2007). DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 112 IV.2.- CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE LOS CHIPS-CFTR Tras la experiencia acumulada utilizando las versiones iniciales de los chips se han podido comprobar las características diferenciales de los mismos, que hacen de esta tecnología una de las más adecuadas para su utilización en programas de cribado neonatal con unas ventajas importantes respecto a la mayoría de los métodos existentes en la actualidad para el análisis genético de CFTR. IV.2.1.- FLEXIBILIDAD Una de las características diferenciales más importantes de esta tecnología es su flexibilidad. Las mutaciones incluidas en las plexes de los chips pueden modificarse a voluntad y de esta manera se pueden ir añadiendo nuevas mutaciones para el análisis genético de CFTR en caso de ser necesario en las sucesivas versiones. Este sistema abierto se contrapone totalmente a la mayoría de los métodos de análisis genético comerciales, que presentan el gran inconveniente de ser sistemas cerrados en los que se estudian un número muy limitado de mutaciones (generalmente sobre 30-40) y que de ningún modo pueden adaptarse a las necesidades analíticas de poblaciones en las que, como veremos ocurre en la nuestra, pueda existir una frecuencia elevada de mutaciones diferentes a las que aparecen en los kits comerciales. La posibilidad de actualización de nuestro sistema se presenta, por tanto, como una de sus características más destacables. En nuestro caso, la primera versión del chip analizaba 119 variantes. La versión siguiente, que apareció en el año 2007, aumentó su cobertura a 175 variantes. La última versión, del año 2008 (en pruebas), contiene inicialmente 184 variantes. En el anexo adjunto (Anexo III) puede verse de manera esquemática la evolución en la cobertura de análisis de los chips. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 113 IV.2.2.- SENSIBILIDAD La alta sensibilidad de los chips es otra característica importante de los mismos. En principio, la cantidad mínima teórica necesaria para el genotipado es de 10-20 nanogramos de ADN. Esta pequeña cantidad (bastan 2µL a una concentración 10 ng/µL) hace que muestras mínimas sean suficientes para obtener el ADN necesario para realizar un genotipado satisfactorio. En los programas de cribado neonatal esta característica es fundamental ya que las muestras disponibles para realizarlos suelen ser escasas, generalmente manchas de sangre impregnadas en papel. Las cantidades mínimas necesarias para el genotipado con tecnologías de genotipado semejantes suelen ser mucho mayores. Por ejemplo, el CF-Microarray de Asper Biotech, requiere 1,75 µg de ADN genómico para el análisis (aproximadamente 100 veces más). IV.2.3.- COBERTURA La amplia cobertura de nuestro sistema es un aspecto fundamental de los Chip-CFTR. La última versión analiza ya conjuntamente más de 180 mutaciones. Este panel de genotipado incluye, como se ha citado anteriormente, a las mutaciones más frecuentes en población europea para las que existe información en la literatura científica durante los últimos años. La mayoría de los kits comerciales existentes en la actualidad para el análisis genético de FQ adolecen de una cobertura reducida de mutaciones a estudio (Johnson MA et al, 2007). Esto se debe principalmente a que, tomando como referencia las recomendaciones de la ACMG/ACOG (American College of Medical Genetics/American College of Obstetricians and Gynecologists), la mayoría de ellos incluyen un panel a estudio de aproximadamente 30 mutaciones. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 114 La ACMG/ACOG publicó en el año 2002 (Richards CS et al, 2002) unas recomendaciones para el análisis mutacional de CFTR. En dichas recomendaciones se sugería un panel de 25 mutaciones que se suponía contenía las mutaciones con una frecuencia de al menos 0,1% existentes en los diversos grupos étnicos norteamericanos. Además, recomendaba la realización de unos tests (reflex tests) para evitar la confusión con otros polimorfismos en el caso de que aparecieran la mutaciones ∆F508 ó ∆I507 en homocigosis (tests para I506V, I507V y F508C) o en caso de ser positivo para la mutación R117H (test para la politimina del intrón 8). Posteriormente, una revisión de este panel (Watson MS et al, 2004) reduciría las recomendaciones de análisis a únicamente 23 mutaciones (manteniendo los reflex test). Este panel se consideró desde el momento de su aparición como referencia para el análisis genético de CFTR en Norteamérica y para el desarrollo de kits comerciales utilizados en otros muchos países, incluyendo países europeos. ∆F508 R347P G542X 711+1G-T W1282X R334W G551D R560T 621+1G-T R1162X N1303K 3659delC R553X A455E ∆I507 G85E 3849+10kbC-T 2184delA 3120+1G-A 1898+1G-A R117H I148T 1717-1G-T 1078delT 2789+5G-A REFLEX TEST: I506V, I507V, F508C, IVS8-poliT -PANEL DE MUTACIONES RECOMENDADO POR LA ACMG/ACOG (EN NEGRITA MUTACIONES ELIMINADAS EN REVISIÓN DE 2004). Hay que tener en cuenta que, aunque este panel pretendió inicialmente ser un panel útil para cualquier grupo étnico, se basó principalmente en frecuencias de mutaciones en Caucásicos no hispánicos y en Judíos Ashkenazi, debido a la alta frecuencia de la enfermedad y a la RESULTADOS Y DISCUSIÓN 115 disponibilidad de los datos mutacionales. De hecho este panel se consideraba que identificaba aproximadamente el 97% de las mutaciones en Judíos Ashkenazi, 90% en Caucásicos, 69% en Afroamericanos y un 57% en Americanos Hispanos. En la población española, sin embargo, nos encontramos con una situación muy específica. Las publicaciones existentes sobre el espectro mutacional en poblaciones españolas indican una gran variedad de mutaciones. De hecho, inicialmente se describió a la población española como la de mayor heterogeneidad mutacional en CFTR de las estudiadas hasta el momento (Casals T et al, 1997), indicando la necesidad del estudio de al menos 75 mutaciones para caracterizar el 90% de los alelos mutados. Estudios más recientes en los que se analizaron casi 2000 alelos de pacientes españoles con FQ indican la necesidad de analizar al menos 121 mutaciones para caracterizar el 96% de los alelos mutados (Alonso MJ et al, 2007). Un dato interesante al respecto se puede comprobar observando los resultados en las mutaciones que hemos identificado con nuestra metodología y los que hubiésemos obtenido utilizando únicamente el panel estándar estadounidense. A continuación se pueden observar indicadas en rojo los genotipos hallados en los casos identificados mediante cribado que hubiesen pasado inadvertidos siguiendo el panel: ΔF508 S1235R I148T Y1014C V562I R1066C R1162X D1152H R334W 2183AA-G E217G V232D 711+1G-T E588V V754M G576A F1052V Y1092X L206W F1074L G1069R R117H G542X DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 116 Como se puede ver, de las 23 mutaciones diferentes identificadas en los distintos casos durante el programa piloto de cribado, únicamente 7 (30%) formaban parte del panel estadounidense recomendado. Otro dato a destacar sería el de los casos identificados con FQ mediante nuestro sistema de análisis que hubiesen pasado inadevertidos siguiendo las recomendaciones norteamericanas. En la siguiente tabla se pueden ver los genotipos de los casos identificados con FQ utilizando Chips- CFTR, señalando en negrita los genotipos no incluídos en el panel: ALELO 1 ALELO 2 R1162X E588V ΔF508 L206W ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 R117H ΔF508 L206W ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 G576A G1069R ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 Como se puede ver, de los 11 casos identificados durante el programa piloto de cribado (en los que se encontraron 2 alelos mutados) 3 de ellos habrían pasado como portadores y, lo que resulta más alarmante, RESULTADOS Y DISCUSIÓN 117 en uno de ellos ni siquiera se hubiera encontrado ninguna mutación siguiendo el panel norteamericano. Teniendo estos datos en cuenta resulta evidente que este panel no parece adecuado para el análisis genético de la FQ en nuestra población, para la cual es necesaria la utilización de un panel de estudio con una mayor cobertura mutacional como sucede en el caso de los chips. IV.2.4.- COSTE-EFECTIVIDAD Otro aspecto a tener en cuenta en nuestro método es lo costeefectivo que resulta ya que, pese a tener una gran cobertura de análisis, esto no implica un gasto excesivo respecto a otros métodos de análisis genéticos comerciales. Para ejemplificar este punto, podemos comparar nuestro chip con uno de los métodos comerciales de análisis genético para CFTR más utilizados en Europa (por poseer acreditación europea para fines diagnósticos) llamado INNO-LiPA CFTR® (Innogenetics) y que fue utilizado en nuestros laboratorios antes de poner a punto la metodología para la secuenciación del gen. -TIRAS DE NITROCELULOSA UTILIZADAS EN TEST INNO-LiPA. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 118 Este test, basado en el principio de hibridación reversa (reverse dotblot), utiliza unas tiras de nitrocelulosa con las que se logra analizar simultáneamente 36 mutaciones. El precio aproximado en febrero de 2008 (PVP) de los reactivos necesarios para la realización de 20 tests era de 2500 euros (125 euros/muestra). Habría que tener en cuenta que, además de los reactivos, es necesaria la compra/leasing de un dispositivo necesario para llevar a cabo las reacciones y del escáner para la lectura automática de las tiras. Por otro lado también habría que considerar el tiempo del personal que lo lleva a cabo técnicamente. Comparativamente, el gasto en un análisis con la última versión del chip que contiene más de 170 mutaciones (incluidas todas las del INNO- LiPA) se aproxima a los 105 euros. Por tanto, como se puede observar, nos encontramos con un método que no sólo aporta mayor cobertura en el análisis y se adapta mejor a nuestra población sino que su coste incluso es inferior al de otros métodos comerciales tradicionalmente utilizados. IV.2.5.- RAPIDEZ Una característica importante de las pruebas genéticas para diagnóstico clínico es el tiempo necesario para su realización. El genotipado mediante chips posee también la ventaja de la rapidez. Así, el tiempo aproximado total para realizar todos los pasos necesarios para el genotipado es de 8 horas, dividido en las siguientes etapas: 1) PCR: 2 horas 30 minutos. 2) SAP: 40 minutos. 3) Reacción de extensión: 3 horas 30 minutos. 4) Purificación con resinas: 20 minutos. 5) Punteado de muestra en chip y lectura: 1 hora. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 119 Este tiempo para el análisis resulta muy corto si se compara con otros métodos que aportan una cobertura semejante, como podría ser el caso de la secuenciación directa. La secuenciación de las 14 muestras que se pueden analizar simultáneamente en un mismo chip podría prolongarse durante semanas, sin tener en cuenta la complejidad de procesos para realizarla. Con nuestra metodología, de ser necesario, podrían obtenerse los resultados de los genotipos en un solo día. IV.2.6.- EXACTITUD La gran exactitud de la espectrometría de masas MALDI-TOF en el campo del genotipado es un hecho constatado (Sun X et al, 2006; Sauer S, 2006) y ha sido una de las causas del interés creciente de su aplicación en el campo de la genética con unos niveles de exactitud descritos superiores al 99.7%. En nuestro caso, la exactitud de nuestros chips viene avalada, además, de dos maneras: mediante la realización de programas de controles de calidad y mediante la secuenciación. IV.2.6.1.- CONTROLES DE CALIDAD En nuestro laboratorio, a la vez que desarrollamos los chips para el análisis genético de CFTR, llevamos a cabo controles de calidad externos que certifican su validez. En concreto, todos los años llevamos a cabo dos tipos de controles de calidad, el control de calidad europeo de la Cystic Fibrosis European Network (External European Quality Assessment) y el control de calidad norteamericano del Center for Disease Control and Prevention (Newborn Screening Quality Assurance Program). DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 126 -ESQUEMA DEL PROTOCOLO DE CRIBADO INICIAL PARA FQ. En este modelo de cribado se comenzaba con la medida de niveles de TIR de una muestra de mancha de sangre. En el caso de ser superior a 70 ng/mL se procedía pedir una segunda muestra, también en papel, con la que se volvía a realizar una nueva medida de TIR (generalmente se reclamaba la muestra si no llegaba antes de un mes desde la fecha de nacimiento). En caso de ser superior esta segunda medida a 40 ng/mL se procedía a citar a la familia para obtener una muestra de sangre líquida y poder realizar el análisis genético mediante secuenciación directa. Al mismo tiempo se realizaba la medida de cloruro en sudor, la anamnesis y el estudio familiar. Aún teniendo en cuenta las múltiples ventajas que ofrecía la secuenciación del gen CFTR frente a otros métodos de análisis genético comerciales probados en el laboratorio para la FQ (como el INNO-LiPA- CFTR), no dejaba de ser un método laborioso en el que había numerosas etapas (como puede comprobarse en el capítulo de metodología) y en el que podían transcurrir varias semanas antes de poder dar una información completa útil para los profesionales médicos debido al gran número de muestras que se acumulaban para secuenciar. La larga incertidumbre de los padres antes de recibir la posible confirmación de un diagnóstico de FQ se RESULTADOS Y DISCUSIÓN 127 presentaba como el problema crítico a resolver para la optimización del programa de cribado. Teniendo esto en cuenta y observando los avances que se sucedían año tras año en las distintas tecnologías de genotipado (Meng Z et al, 2004) decidimos crear el Chip-CFTR como un posible método óptimo para un programa de cribado. La introducción de esta nueva tecnología para el análisis genético de CFTR dio lugar cambios importantes en el protocolo de cribado, cuyo esquema actual se puede ver en la imagen inferior: -PROTOCOLO DE CRIBADO ACTUAL PARA FIBROSIS QUÍSTICA. El cambio de esquema en el protocolo trajo consigo dos repercusiones importantes que hicieron que esta tecnología diagnóstica se adecuara mucho mejor al proceso de cribado: En primer lugar se eliminó la segunda medida de TIR. Con esta nueva tecnología era suficiente con un pequeño fragmento de una mancha de sangre procedente del cartón para el estudio de metabolopatías de todos los recién nacidos gallegos (no se necesitaba pedir una nueva muestra a los DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 128 padres para secuenciar) con lo cual se evitaba el estrés de unos padres pendientes de saber si su hijo recién nacido padecería FQ. En segundo lugar, en el plazo máximo de un mes todos los individuos analizados tienen sus resultados. Este plazo se consensuó con la Unidad de Metabolopatías teniendo en cuenta plazos oficiales para realizar un programa de cribado y el número de muestras necesarias para que el análisis fuera coste-efectivo (utilizar un chip para analizar una sola muestra no sería viable). En este esquema se simplifica y se elimina la medida del cloruro en sudor, que sigue utilizándose en el seguimiento clínico a voluntad del facultativo en caso de encontrar dos alelos mutados. Cabe destacar que dentro de este protocolo no se informa a los individuos portadores. IV.3.2.- RESULTADOS DE CRIBADO PREVIOS AL USO DE CHIPS Durante el período inicial de cribado 2003-2005 se analizaron un total de 223 muestras. Las mutaciones encontradas en estos años mediante el método de secuenciación directa de la región exónica del gen CFTR fueron las siguientes: MUTACIÓN Nº DE ALELOS ∆F508 11 V232D 2 F1052V 2 2184insA 2 I148T 2 L206W 2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 129 R334W 2 G576A 2 P205S 1 2176insC 1 711+1G-T 1 D1270N 1 M952I 1 R1162X 1 R74W 1 S1235R 1 S42F 1 Y1014C 1 R117H 1 D1152H 1 -MUTACIONES ENCONTRADAS MEDIANTE SECUENCIACIÓN DIRECTA EN EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2003-2005). Además de estas mutaciones, desde un punto de vista poblacional cabe destacar el hallazgo de polimorfismos frecuentes en ciertos exones de las muestras analizadas. Concretamente, los exones en los que aparecieron de SNPs con frecuencia fueron: 1. Exón 10: rs213950, rs1800094, rs1800095. 2. Exón 14A: rs1042077. 3. Exón 24: rs1800136. Otros SNPs no sinónimos fueron R75Q, T351S, F508C o R668C. Los genotipos de los casos identificados con FQ durante este período de cribado pueden verse en la siguiente tabla: DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 130 AÑO ALELO 1 ALELO 2 2003 ΔF508 2184insA 2003 2184insA G576A 2004 ΔF508 R334W 2004 ΔF508 R1162X 2005 ΔF508 D1152H 2005 ΔF508 2176insC 2005 711+1G-T V232D -GENOTIPOS DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS CON FQ MEDIANTE EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2003-2005). IV.3.3.- RESULTADOS GLOBALES DE CRIBADO EN PERÍODO 2003-2007 Teniendo en cuenta los resultados del cribado obtenidos mediante secuenciación conjuntamente con los de la utilización de chips, durante el período 2003-2007 hemos encontrado las siguientes mutaciones en los neonatos con los niveles de TIR elevados: MUTACIÓN Nº DE ALELOS ΔF508 34 Y1014C 5 L206W 4 R1162X 4 G576A 4 711+1G-T 3 F1052V 3 I148T 3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 131 R334W 3 S1235R 3 V232D 3 R117H 3 2184insA 2 D1152H 2 2176insC 1 2183AA-G 1 D1270N 1 E217G 1 E588V 1 F1074L 1 G1069R 1 G542X 1 M952I 1 P205S 1 R1066C 1 R74W 1 S42F 1 V562I 1 V754M 1 Y1092X 1 -MUTACIONES ENCONTRADAS GLOBALMENTE DURANTE EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2003-2007). Como se puede ver, en total se identificaron 30 mutaciones diferentes siendo la más frecuente, como cabría esperar, la ΔF508. Respecto a la distribución poblacional de las mutaciones encontradas (véase gráfica siguiente) en A Coruña y Pontevedra encontramos un mayor número de mutaciones lo cual resulta lógico al ser las provincias gallegas en las que se registran más nacimientos. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 132 -DISTRIBUCIÓN DE MUTACIONES POR PROVINCIAS GALLEGAS. Los datos procedentes del programa piloto de cribado neonatal para la FQ durante estos años pueden verse resumidos en la siguiente tabla: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 133 2003 2004 2005 2006 2007 TOTAL FRECUENCIA NIÑOS ANALIZADOS 19.911 20.548 21.165 21.270 22.143 105.037 TIR ELEVADO 1ª MUESTRA 139 154 164 137 203 797 0.76% TIR ELEVADO 2ª MUESTRA - 28 57 - - 85 0.20% ESTUDIO GENÉTICO 138 28 57 137 203 563 0.54% PORTADORES 13 3 6 10 21 53 1:1981 FIBROSIS QUÍSTICA 2 2 3 4 7 18 1:5835 -DATOS DEL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO NEONATAL (2003-2007). El número elevado de pacientes para estudio genético en 2003 se debe a que en ese año todavía no se hacía una segunda medida de los niveles de TIR. En 2004 y 2005 para optimizar el proceso de secuenciación se inicia el protocolo con doble TIR, con el cual se siguió detectando el mismo número de pacientes. A partir del años 2006 se usan los chips con lo cual se vuelve a eliminar la segunda medida de TIR. Como se puede observar, la prevalencia al nacimiento en nuestra comunidad se aproxima a 1 de cada 6000 nacidos. Comparando este dato con el de otros programas de cribado existentes en España vemos que nuestra prevalencia es muy semejante aunque ligeramente inferior: Castilla y León 1/4083, Cataluña 1/5457 y Baleares 1/4433. Otra cuestión importante se desprende de los datos recogidos en la siguiente tabla: DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 134 FECHA INICIO OFICIAL TOTAL DESDE INICIO FRECUENCIA NORMALIZADA LEUCINOSIS 1978 18 1/30.700 FENILCETONURIA 1978 40 1/13.815 HIPERFENILALANINEMIA 1978 55 1/10.047 HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO 1980 226 1/2.414 DÉFICIT ACIL-COA- DESHIDROGENASA CADENA MEDIA (MCAD) 2000 7 1/21.801 FIBROSIS QUÍSTICA 18 1/5.835 -DATOS DE ENFERMEDADES INCLUÍDAS OFICIALMENTE EN EL PROGRAMA GALEGO PARA A DETECCIÓN PRECOZ DE ENFERMIDADES ENDÓCRINAS E METABÓLICAS EN PERÍODO NEONATAL. Comparando la prevalencia al nacimiento de la FQ con la de algunas aminoacidopatías que se analizan en el programa gallego de cribado (leucinosis, fenilcetonuria, hiperfenilalaninemia) se ve que es de 3 a 5 veces superior. Tan sólo el hipotiroidismo congénito, de las patologías consideradas graves, tiene una mayor prevalencia al nacimiento. Por otro lado, comparándola con patologías de implantación reciente como los defectos de la β-oxidación de los ácidos grasos, la FQ también muestra una prevalencia muy superior. Debido al éxito obtenido en este período piloto, actualmente el cribado para la FQ se encuentra pendiente de su instauración oficial en Galicia. A nivel estatal, se encuentra en debate entre las sociedades científicas implicadas en el cribado neonatal en España y el Ministerio de Sanidad la unificación de un mínimo de patologías para ser detectadas en todos los centros de cribado neonatal regionales (entre las que se baraja la posibilidad de incluír a la FQ). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 135 IV.3.3.1.- DESCRIPCIÓN DE CASOS DIAGNOSTICADOS CON FIBROSIS QUÍSTICA MEDIANTE EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO A continuación se muestra una tabla resumen con los genotipos de los casos identificados con FQ mediante el programa piloto de cribado desde su comienzo en el año 2003: CASO AÑO ALELO 1 ALELO 2 1 2003 ΔF508 2184insA 2 2003 2184insA G576A 3 2004 ΔF508 R334W 4 2004 ΔF508 R1162X 5 2005 ΔF508 D1152H 6 2005 ΔF508 2176insC 7 2005 711+1G-T V232D 8 2006 R1162X E588V 9 2006 ΔF508 L206W 10 2006 ΔF508 ΔF508 11 2006 ΔF508 ΔF508 12 2007 ΔF508 R117H 13 2007 ΔF508 L206W 14 2007 ΔF508 ΔF508 15 2007 ΔF508 ΔF508 16 2007 G576A G1069R 17 2007 ΔF508 ΔF508 18 2007 ΔF508 ΔF508 -GENOTIPOS DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS CON FQ MEDIANTE EL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2003-2007). Cabe destacar que el criterio seguido para seleccionar los casos con FQ ha sido el de encontrar en el recién nacido dos mutaciones asociadas previamente a fenotipos más o menos graves de la enfermedad. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 142 CASO 12: ΔF508 / R117H (IVS8 Tn 7/9) En este caso encontramos las mutaciones ΔF508 y R117H en heterocigosis. Además la politimina del intrón 8 tiene el genotipo 7/9. Este genotipo se ha asociado a una FQ con síntomas pulmonares leves y CBAVD. Respecto a los datos clínicos, existían antecedentes familiares de asma (aunque nunca con diagnóstico de FQ). El estatus al nacimiento fue normal, mostrando un nivel de cloruro en sudor de 33 mEq/L. Actualmente recibe un seguimiento con atención a los procesos catarrales y con profilaxis antibiótica. Su evolución pondoestatural ha sido normal aunque en el último control (año y medio) se evidenció un estancamiento ponderal. CASO 13: ΔF508 / L206W Al igual que el caso 9, nos encontramos con otro caso heterocigoto para las mutaciones ΔF508 y L206W. Respecto a los datos clínicos, hasta el momento también se ha mostrado como totalmente asintomático, con un crecimiento pondoestatural normal y suficiencia pancreática. El nivel de cloruro en sudor es de 70 mEq/L y pasa por los controles anuales rutinarios. CASO 14: ΔF508 / ΔF508 Este caso, homocigoto para la mutación ΔF508, presentaba a los 8 meses de edad un excelente estado general, siendo clínicamente asintomático, mostrando buen apetito y recibiendo suplementación enzimática y nutricional. Asimismo se tomaron medidas preventivas infecciosas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 143 CASO 15: ΔF508 / ΔF508 Este caso homocigoto para la deleción ΔF508 también presentó hasta los 8 meses de edad una evolución clínica excelente con muy buen apetito. La exploración física fue normal. Actualmente recibe suplementación vitamínica y enzimática. CASO 16: G576A / G1069R En este caso encontramos las mutaciones G576A y G1069R en heterocigosis. Esta última mutación es una mutación rara que se ha descrito en pacientes con un fenotipo severo a nivel pulmonar y pancreático, aunque asociado a la mutación ΔF508. Respecto a los datos clínicos, no tiene antecedentes personales conocidos para FQ. Sus padres y hermanos están sanos. El paciente se muetra totalmente asintomático con cloruro en sudor de 28 mEq/L. Dados estos niveles y la ausencia de sintomatología clínica se procede únicamente a revisiones periódicas. CASO 17: ΔF508 / ΔF508 Este caso homocigoto para la mutación ΔF508 presentó íleo meconial al nacimiento. Debido a su nacimiento reciente, aún no tienen datos clínicos relevantes, recibiendo suplementación nutricional y enzimática. CASO 18: ΔF508 / ΔF508 Este caso homocigoto para la mutación ΔF508 ingresó al mes y medio de edad por escasa ganancia ponderal. Actualmente recibe suplementación enzimática y vitamínica. DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 144 GENOTIPO CLÍNICA DESTACABLE CLORURO EN SUDOR (mEq/L) ΔF508 / 2184insA -Evolución asintomática. 105 2184insA / G576A -Evolución asintomática. N.D. ΔF508 / R334W -Evolución asintomática. 77 ΔF508 / R1162X -Estancamiento ponderal. -Neumonía neumocócica. N.D. ΔF508 / D1152H -Infecciones en vías aéreas superiores. 26 ΔF508 / 2176insC -Posible hipoproteinemia. 98 711+1G-T / V232D -Infección por S. aureus. -Consolidación de lóbulo pulmonar. 63 R1162X / E588V -Evolución asintomática. 72 ΔF508 / L206W -Desnutrición con afectación pondoestatural. 111 ΔF508 / ΔF508 -Insuficiencia pancreática. -Problemas pulmonares. N.D. ΔF508 / ΔF508 -Desnutrición. 101 ΔF508 / R117H -Estancamiento pondoestatural. 33 ΔF508 / L206W -Evolución asintomática. 70 ΔF508 / ΔF508 -Evolución asintomática (hasta 8 meses). N.D. ΔF508 / ΔF508 -Evolución asintomática (hasta 8 meses). N.D. G576A / G1069R -Evolución asintomática. 28 ΔF508 / ΔF508 -Íleo meconial. N.D. ΔF508 / ΔF508 -Escasa ganancia ponderal. N.D. -TABLA RESUMEN DE CASOS POSITIVOS DE FQ EN CRIBADO(N.D.:NO DISPONIBLE). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 145 IV.4.- APÉNDICE IV.4.1.- ESTUDIO MUTACIONAL DE PACIENTES GALLEGOS CON FIBROSIS QUÍSTICA Tras los dos años iniciales del programa piloto de cribado, dentro del grupo gallego de trabajo en FQ surgió la iniciativa de intentar recopilar toda la información posible acerca de los genotipos de todos los pacientes gallegos diagnosticados con FQ con anterioridad al inicio del programa para intentar obtener así una información más amplia sobre la frecuencia de mutaciones en individuos gallegos. Esta iniciativa surge debido a que los clínicos, hablando con sus pacientes, se dan cuenta de que sólo algunos habían confirmado genéticamente su enfermedad en Galicia (en la mayor parte de esos casos se habían sometido a pruebas genéticas sencillas en otras comunidades) por lo cual muchos tenían la genética sin hacer o incompleta. Esta labor, nunca antes llevada a cabo en nuestra comunidad, resultó imprescindible a la hora de diseñar un chip apropiado para el análisis genético de CFTR en población gallega ya que, hasta la fecha, no existían publicaciones sobre las mutaciones de individuos con FQ en Galicia. De esta manera, hasta el momento hemos conseguido recopilar información genética acerca de 128 pacientes gallegos con FQ (algunos de ellos ya fallecidos) cuyos genotipos se pueden observar en la siguiente tabla (los espacios vacíos se corresponden con alelos sin mutación identificada): DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 146 ALELO 1 ALELO 2 ΔF508 G542X ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 2184insA ΔF508 ΔF508 Y1092X G85V V562I V562I ΔF508 1811+1.6Kb A-G ΔF508 ΔF508 ΔF508 L206W ΔF508 R1162X ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 1811+1.6Kb A-G ΔF508 ΔF508 ΔF508 R1162X ΔF508 ΔF508 ΔF508 2184insA ΔF508 G542X 2183AA-G ΔF508 ΔF508 L206W G542X ΔF508 ΔF508 R1162X E588V ΔF508 ΔF508 G542X 1811+1.6Kb A-G ΔF508 ΔF508 N1303K 711+1G>T ΔF508 ΔF508 ΔF508 R1162X ΔF508 R1162X 711+1G>T ΔF508 ΔF508 ΔF508 G542X ΔF508 R334W ΔF508 R1066C 2184insA G576A ΔF508 ΔF508 ΔF508 V232D ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 S1045Y S1045Y 1609delCA ΔF508 G85E ΔF508 ΔF508 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 147 ΔF508 R347P ΔF508 G542X ΔF508 ΔF508 3860ins31 711+1G>T 3860ins31 711+1G>T 3860ins31 711+1G>T ΔF508 G542X ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 R1162X ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 D1152H ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 G542X V232D ΔF508 ΔF508 ΔF508 2176insC 875+1G>A 711+1G>T ΔF508 ΔF508 ΔF508 R1066C ΔF508 ΔF508 F1052V ΔF508 2176insC ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 G542X ΔF508 G85E ΔF508 G85E G576A G1069R ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 Q1100P ΔF508 ΔF508 621+1G>T 621+1G>T ΔF508 ΔF508 ΔF508 Y1381X Y1381X ΔF508 R334W DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 148 ΔF508 ΔF508 V754M ΔF508 D614G ΔF508 L206W ΔF508 L159S ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 A107V ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 2176insC ΔF508 R117H ΔF508 G542X ΔF508 ΔF508 ΔF508 G542X G576A ΔF508 M595I ΔF508 ΔF508 2184insA ΔF508 ΔF508 ΔF508 V754M D443Y-G576A-R668C ΔF508 ΔF508 711+1G-T V232D ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 ΔF508 2184insA ΔF508 G542X -GENOTIPOS DE PACIENTES GALLEGOS CON FQ (EN NEGRITA CASOS DETECTADOS EN CRIBADO). En muchos de estos pacientes sólo se había identificado un alelo mutado debido a las limitaciones técnicas del momento en que fueron diagnosticados con la enfermedad. Por ello en muchos casos se nos enviaron muestras, además de para realizar un primer estudio genético del paciente, para completar o contrastar estudios genéticos previos. Hasta el momento, de 129 pacientes identificados en Galicia con FQ, se ha logrado obtener información genética en 123 casos. A continuación muestro una tabla con la frecuencia para las mutaciones de estos pacientes: RESULTADOS Y DISCUSIÓN 149 MUTACIÓN ALELOS PORCENTAJE(%) ΔF508 146 59,34 Desconocido 14 5,69 G542X 12 4,87 711+1G>T 6 2,43 R1162X 6 2,46 2184insA 5 2,03 G576A 3 1,22 V232D 3 1,22 1811+1.6Kb A-G 3 1,22 3860ins31 3 1,22 L206W 3 1,22 G85E 3 1,22 2176insC 3 1,22 V562I 3 1,22 Y1381X 2 0,81 V754M 2 0,81 S1045Y 2 0,81 R334W 2 0,81 R1066C 2 0,81 621+1G>T 2 0,81 875+1G>A 1 0,41 G85V 1 0,41 L159S 1 0,41 M595I 1 0,41 N1303K 1 0,41 Q1100P 1 0,41 G1069R 1 0,41 R117H 1 0,41 F1052V 1 0,41 R347P 1 0,41 E588V 1 0,41 DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL 150 2183AA-G 1 0,41 1609delCA 1 0,41 D1152H 1 0,41 D614G 1 0,41 D443Y-G576A-R668C (ALELO COMPLEJO) 1 0,41 Y1092X 1 0,41 A107V 1 0,41 -FRECUENCIA DE ALELOS MUTADOS EN PACIENTES GALLEGOS CON FQ. La frecuencia de la mutación ΔF508 en pacientes diagnosticados con FQ en nuestra comunidad, próxima al 60%, se muestra superior a la encontrada en el cribado pero sigue siendo semejante a la estimada a nivel mundial del 66% (Estivill X et al, 1997). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 151 IV.4.1.- PUBLICACIÓN THREE NOVEL MUTATIONS IN THE CFTR GENE IDENTIFIED IN GALICIAN PATIENTS Rana-Díez P. a, Colón C. b, Alonso-Fernández, J. R. b, Solar A. c, Barros-Tizón J.C. d, Barros-Casas D. d, Sirvent J. e, Carracedo A. a, Barros F. a,* a Fundacion Publica Galega de Medicina Xenomica, Grupo de Medicina Xenómica, CIBERER, Santiago de Compostela, 15706 Spain. b Unidad de Metabolopatias, Pediatria, CHUS, Santiago de Compostela, 15706 Spain. c Unidad de Gastroenterologia Pediatrica, Hospital Juan Canalejo, A Coruña, 15006 Spain. d Servicio de Neumologia, CHUVI, Vigo, 36204 Spain. e Unidad de Neumologia Pediatrica, Hospital Juan Canalejo, A Coruña, 15006 Spain. Keywords: Galicia; Spain; CFTR; mutation; Cystic Fibrosis Abstract We report three novel CFTR missense mutations detected in Spanish patients from Galicia (North West of Spain). In the first case, a patient homozygous for a novel S1045Y mutation died due to pulmonary problems. In the other two cases, both heterozygous for novel mutations combined with the F508del mutation, clinical symptoms were different depending on the mutation, detected as M595I and A107V. 1. Introduction More than 1400 different mutations within the CFTR gene have been described to date [1]. It is known that there are mutations associated with severe cystic fibrosis (CF) phenotype and mutations associated with milder or atypical CF disease. The potential of a mutation to contribute to the phenotype depends on its type, localization in the gene and interactions with secondary modifying factors [2, 3]. It is assumed that nonsense, frameshift and splice site mutations result in the loss of functional CFTR. Missense mutations are more problematical in that they may only partially affect CFTR function. As the amount of functioning CFTR appears to be related to clinical status, some mutations with more modest effect may present congenital absence of the vas deferens with or without mild respiratory disease. From 2004, when we started sequencing the exonic regions of the CFTR gene in our laboratory, we have sequenced nearly 150 samples of patients from Galicia (North West of Spain) with possible or independently diagnosed cystic fibrosis. From these analyses we discovered three mutations in the CFTR gene not previously described in the literature: one homozygous S1045Y and two compound heterozygous, A107V and