Complejos proteicos de membrana externa de Neisseria meningitidis: análisis estructural y capacidad antigénica

Universidad de Santiago de Compostela Departamento de Microbiología y Parasitología COMPLEJOS PROTEICOS DE MEMBRANA EXTERNA DE Neisseria meningitidis: ANÁLISIS ESTRUCTURAL Y CAPACIDAD ANTIGÉNICA Memoria presentada por Juan Marzoa Fandiño para optar al Grado de Doctor en Biología Santiago de Compostela, marzo de 2010 D. Carlos Ferreirós Domínguez, Profesor Titular de Microbiología de la Universidad de Santiago de Compostela, y D.ª Sandra Sánchez Poza, Profesora de Microbiología de la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMAN: Que la presente Tesis Doctoral, titulada “Complejos proteicos de membrana externa de Neisseria meningitidis: análisis estructural y capacidad antigénica”, que presenta D. Juan Marzoa Fandiño para optar al Grado de Doctor en Biología, ha sido realizada en esta Universidad y, hallándose concluida, autorizamos su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Santiago de Compostela, marzo de 2010 Prof. Carlos Ferreirós Domínguez Prof.ª Sandra Sánchez Poza -III- La realización de esta Tesis Doctoral fue posible gracias a: • Las subvenciones obtenidas del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FISS) (cód. P1050178). • Las subvenciones obtenidas de la Secretaría Xeral de Investigación e Desenvolvemento. Xunta de Galicia (cód. PGIT 05PX11320302PR) • La concesión de una beca de investigación de la Diputación de A Coruña. -IV- Quiero expresar mi agradecimiento a todas aquellas personas que hicieron posible la realización de esta Tesis Doctoral, y especialmente: A los Profs. M.ª Teresa Criado Álvarez y Carlos Ferreirós Domínguez, por brindarme la oportunidad de formar parte de su grupo de investigación y por su gran profesionalidad y calidad humana, de la que he aprendido y disfrutado estos años. A la Prof.ª Sandra Sánchez Poza, codirectora de Tesis y amiga, por todos sus consejos y por tantas horas de laboratorio compartidas. A los Dres. I. M. Feavers, E. Rosenqvist y D. R. Martin, por proporcionarnos las cepas bacterianas utilizadas para la realización de esta Tesis Doctoral, y a los Dres. A. C. Gorrige y C. Charlotte, del Health Protection Agency por su colaboración en la realización de los ensayos de citometría de flujo. A Esteban Guitián (Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad de Santiago de Compostela) y a Félix Elortza (Servicio de Proteómica y Metabolómica de CIC bioGUNE, Bizkaia), por la identificación de proteínas y el asesoramiento técnico. A mis compañeros de laboratorio Ana, Laura, Liliana, Paula, Luis, Ernesto, Rita, Miguel y Javier por su amistad y por darle ese toque de alegría al día a día. A Cati por darme el amor y el aliento que tanto me ayudaron en los momentos de desánimo. A mis padres y hermano, por su apoyo incondicional y por el cariño que siempre he recibido, sin el cual no habría podido llegar hasta aquí. -V- Relación de artículos publicados y en proceso de publicación como resultado del desarrollo de esta Tesis Doctoral: Marzoa J, Sánchez S, Abel A, Criado MT, Ferreirós CM. Estudio comparativo de técnicas electroforéticas no desnaturalizantes para el análisis de complejos proteicos de membrana externa de Neisseria meningitidis. Proteómica. 2008; 1: 91-92. Marzoa J, Abel A, Sánchez S, Chan H, Feavers I, Criado MT, Ferreirós CM. Analysis of outer membrane porin complexes of Neisseria meningitidis in wild-type and specific knockout mutant strains. Proteomics. 2009; 9: 648-656. Marzoa J, Sánchez S, Brookes C, Taylor S, Gorringe A, Criado MT. Chaperonin (MSP63) complexes induce bacteriacidal and opsonophagocytic cross-reactive antibodies. Vacci Monitor. 2009; 18: 87-89. Marzoa J, Sánchez S, Ferreirós CM, Criado MT. Identification of Neisseria meningitidis outer membrane vesicle complexes using 2-D high resolution clear native/SDS-PAGE. J Proteome Res. 2010; 9: 611-619. Marzoa J, Sánchez S, Costoya L, Brokes C, Taylor S, Gorringe AR, Criado MT, Ferreirós CM. Induction of immune responses by major outer membrane native complexes from Neisseria meningitidis. Vaccine (En preparación). Relación de artículos publicados en los que se incluyen datos obtenidos a raíz de la optimización de las técnicas empleadas en esta Tesis Doctoral: Arenas J, Abel A, Sánchez S, Marzoa J, Berrón S, van der Ley P, Criado MT, Ferreirós CM. A cross-reactive neisserial antigen encoded by the NMB0035 locus shows high sequence conservation but variable surface accessibility. J Med Microbiol. 2008; 57: 80-87. Abel AM, Sánchez S, Marzoa J, Criado MT, Ferreirós C. Estudio de la interacción de las porinas PorA y PorB de Neisseria por incorporación en liposomas y “Blue Native Electrophoresis”. Proteómica. 2008; 1: 76-77. Índice - 4 - 1.1.3. Otras proteínas....................................................................................................................75 1.2. El estudio de los complejos proteicos de membrana................................................................76 1.3. Técnicas para el análisis de complejos proteicos......................................................................79 1.3.1. Métodos electroforéticos no desnaturalizantes.................................................................79 1.3.2. Otros métodos utilizados en el estudio de interacciones proteína-proteína....................86 2. MATERIAL Y MÉTODOS................................................................................................................91 2.1. Cepas bacterianas utilizadas y características..........................................................................91 2.2. Conservación de las cepas ..........................................................................................................92 2.3. Condiciones de cultivo ................................................................................................................93 2.4. Obtención de las vesículas de membrana externa (OMVs).....................................................93 2.4.1. Extracción de OMVs con Prensa de French .....................................................................93 2.4.2. Extracción con deoxicolato sódico .....................................................................................94 2.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) ...........................................................94 2.6. Electroforesis unidimensional high resolution Clear Native Electrophoresis (1-DhrCNE)....95 2.7. Electroforesis bidimensional nativa/desnaturalizante (2-D hrCNE/SDS-PAGE)..................97 2.8. Electroforesis bidimensional nativa/nativa (2-D hrCNE/hrCNE) ..........................................98 2.9. Análisis informático de las imágenes de geles...........................................................................98 2.10. Identificación de proteínas.......................................................................................................98 3. RESULTADOS..................................................................................................................................101 3.1. Análisis electroforético 1-D hrCNE .........................................................................................101 3.2. Análisis electroforético 2-D hrCNE/hrCNE............................................................................101 3.3. Identificación de proteínas por LC-MS/MS ...........................................................................105 3.4. Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE y MALDI-TOF..........................................107 3.5. Caracterización de complejos proteicos de las cepas mutantes PorA-, PorB-, RmpM- y FetA-.................................................................................................................................... 117 3.6. Caracterización de complejos proteicos en cepas heterólogas .............................................. 119 4. DISCUSIÓN......................................................................................................................................125 CAPÍTULO II: Análisis de la respuesta inmune frente a vesículas de membrana externa y complejos proteicos de membrana externa purificados.........................................................................137 1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................................139 Índice - 5 - 1.1. Indicadores de protección contra la enfermedad meningocócica..........................................139 1.1.1. Actividad bactericida del suero ........................................................................................139 1.2. Otros mecanismos relacionados con la protección frente al meningococo B .......................142 1.2.1. Unión de anticuerpos a superficie (SLA).........................................................................143 1.2.2. Deposición de Complemento (CDA) ................................................................................143 1.2.3. Opsonofagocitosis ..............................................................................................................144 1.2.4. Actividad bactericida de la sangre total...........................................................................146 1.2.5. ELISA de anticuerpos salivares........................................................................................146 2. MATERIAL Y MÉTODOS ..............................................................................................................149 2.1. Cepas bacterianas, características y condiciones de cultivo ..................................................149 2.2. Obtención de antígenos para la inmunización de animales de experimentación.................149 2.2.1. Purificación de los complejos proteicos de membrana externa.....................................149 2.3. Obtención de sueros inmunes...................................................................................................151 2.3.1. Sueros anti-OMVs .............................................................................................................151 2.3.2. Sueros anti-complejos........................................................................................................152 2.4. Caracterización de los sueros por Western-blotting...............................................................152 2.4.1. SDS-PAGE..........................................................................................................................152 2.4.2. hrCNE.................................................................................................................................152 2.4.3. Western-blotting ................................................................................................................153 2.5. Ensayo de actividad bactericida...............................................................................................154 2.6. Ensayos de citometría de flujo..................................................................................................155 2.6.1. Ensayo de unión de anticuerpos a superficie...................................................................156 2.6.2. Ensayo de deposición de C3b............................................................................................157 2.6.3. Ensayo de deposición de MAC .........................................................................................158 2.6.4. Ensayo de Opsonofagocitosis............................................................................................159 2.7. Análisis de los datos...................................................................................................................160 3. RESULTADOS .............................................................................................................................161 3.1. Purificación de los complejos proteicos ..............................................................................161 3.2. Obtención de sueros inmunes y caracterización por Western-blotting............................164 3.3. Ensayo de actividad bactericida..........................................................................................167 3.4. Unión de anticuerpos a superficie .......................................................................................170 3.5. Deposición de complemento.................................................................................................173 3.6. Deposición de MAC..............................................................................................................177 3.7. Opsonofagocitosis .................................................................................................................180 Índice - 6 - DISCUSIÓN .....................................................................................................................................183 CONCLUSIONES.....................................................................................................................................199 BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................................................203 Índice de figuras - 7 - ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1 Distribución global de los principales serogrupos de N. meningitidis causantes de enfermedad….………………………………………………………………. 20 Figura 2 Prevalencia dependiente de edad de la enfermedad meningocócica en relación a la inmunidad poblacional calculada por la actividad bactericida del suero….…………................................................................................................ 27 Figura 3 Representación esquemática de las tres vías de activación del sistema del complemento…………………………………………………………………… 28 Figura 4 Línea temporal del desarrollo de vacunas meningocócicas…………………..... 40 Figura 5 Modelos tridimensionales de la porina PorA y de un homotrímero de PorA….. 69 Figura 6 Esquema explicativo de la separación y análisis electroforético de complejos proteicos por electroforesis bidimensional nativa/desnaturalizante y nativa/nativa………………………………………………................................. 85 Figura 7 Perfil electroforético de la 1-D hrCNE de OMVs de la cepa H44/76 ................. 102 Figura 8 Complejos proteicos de OMVs meningocócicas detectados por electroforesis 2-D hrCNE/hrCNE ………….……………..…………………………………... 103 Figura 9. Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE de OMVs meningocócicas..... 108 Figura 10 Complejos proteicos de OMVs meningocócicas detectados por electroforesis 2-D hrCNE/SDS-PAGE con tampón de cátodo DDM ………………………… 115 Figura 11 Complejos proteicos de OMVs meningocócicas detectados por electroforesis 2-D hrCNE/SDS-PAGE con tampón de cátodo TX100………………………... 116 Figura 12 Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE de OMVs de cepas mutantes knock-out………………………………………………………………………. 118 Figura 13 Análisis electroforético 1-D hrCNE de OMVs de la cepa H44/76 y cinco cepas heterólogas................................................................................................. 120 Figura 14 Análisis de los complexomas de cepas heterólogas mediante primera dimesión nativa, la segunda dimensión nativa y la segunda dimensión desnaturalizante ................................................................................................... 122 Figura 15 Comprobación de los complejos proteicos presentes en los eluidos mediante hrCNE. Comprobación de la composición proteica de los eluidos por SDSPAGE ................................................................................................................... 162 Figura 16 Caracterización por Western-blotting de los sueros de ratón…………………... 166 Figura 17 Unión total de anticuerpos de los sueros anti-OMVs y anti-complejos a la superficie bacteriana de la cepa homóloga H44/76……………………………. 171 Índice de figuras - 8 - Figura 18 Unión total de anticuerpos de los sueros anti-OMVs y anti-complejos a la superficie bacteriana de la cepa homóloga H44/76 y el panel de cepas heterólogas…………………………………………………………………… 172 Figura 19 Deposición de complemento inducida por los sueros anti-OMVs y anticomplejos en la superficie bacteriana de la cepa homóloga H44/76 ……..…… 174 Figura 20 Deposición de complemento inducida por los sueros anti-OMVs y anticomplejos en la superficie bacteriana de la cepa homóloga H44/76 y el panel de cepas heterólogas............................................................................................. 176 Figura 21 Deposición del complejo de ataque a membrana inducida por los sueros anti- OMVs y anti-complejo en la superficie bacteriana de la cepa homóloga H44/76………………………………………………………………………... 178 Figura 22 Deposición del complejo de ataque a membrana inducida por los sueros anti- OMVs y anti-complejos en la superficie bacteriana de la cepa homóloga H44/76 y el panel de cepas heterólogas............................................................... 179 Figura 23 Opsonofagocitosis de la cepa homóloga H44/76 inducida por los sueros anti- OMVs y anti-complejos. ..................................................................................... 180 Figura 24 Opsonofagocitosis de la cepa homóloga H44/76 y el panel de cepas heterólogas inducida por los sueros anti-OMVs y anti-complejos. .................... 182 Índice de tablas - 9 - ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 1 Vacunas antimeningocócicas disponibles en la actualidad frente a los serogrupos A, C, Y, y W135 de N. meningitidis………..………………………...................... 44 Tabla 2 Antígenos de membrana externe que están o han estado bajo estudio como candidatos vacunales frente al serogrupo B…………………..………………... 46 Tabla 3 Eficacia de las vacunas basadas en vesículas de membrana externa de serogrupo B de N. meningitidis………………………………………………... 49 Tabla 4 Vacunas disponibles o en desarrollo contra el serogrupo B…………..………... 52 Tabla 5 Relación de cepas utilizadas en este trabajo. ..................................................... 92 Tabla 6 Identificación por LC/MS-MS de los componentes de los principales complejos proteicos detectados por electroforesis diagonal hrCNE/hrCNE….. 106 Tabla 7 Identificación por MALDI-TOF de los principales puntos detectados mediante electroforesis bidimensional hrCNE/SDS-PAGE................................................ 111 Tabla 8 Identificación por MALDI-TOF de los puntos detectados utilizando electroforesis bidimensional hrCNE/SDS-PAGE que no están descritos como proteínas asociadas a la membrana externa......................................................... 113 Tabla 9 Listado de sueros inmunes obtenidos por inmunización de ratones y antígenos utilizados para dicha inmunización. .................................................................... 164 Tabla 10 Titulación de la actividad bactericida de los sueros de ratón anti-OMVs…….. 169 Tabla 11 Titulación de la actividad bactericida de los sueros de ratón anti-complejos… 169 - 11 - TABLA DE ABREVIATURAS 1-D Primera dimensión 2-D Segunda dimensión BCA Ácido bicinconínico (Bicinchoninic acid) BCECF biscarboxietilcarboxí-fluoresceina BCR Receptor de células B (B Cell Receptor) BNE Blue Native Electrophoresis BRET Bioluminiscencia por transferencia de energía resonante (Bioluminiscence Resonance Energy Transfer) BSA Seroalbúmina bovina C´ Fuente de complemento CBA Ensayo de Deposición de Complemento (Complement Deposition Assay) CBB Coomassie Brillant Blue cc Complejo clonal CFU Unidad formadora de colonia Chap Chaperonina de 60 kDa CNE Clear Native Electrophoresis Cx Complejo proteico DDM n-dodecil-β-D-maltósido DOC Ácido deoxicolato sódico ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ET Tipo electroforético (Electrophoresis Type) fH Factor H fHbp Proteína de unión al factor H (Factor H Binding Protein) FI Índice de fluorescencia FITC Fluoresceína-5-isotiocianato (Fluorescein isothiocyanate) FRET Fluorescencia por transferencia de energía resonante (Fluorescence resonance energy transfer) GBSS Solución gelatin-salina de equilibrado (Gelatin Balanced Salt Solution) Glu Glutamina sintetasa GNA Antígeno de Neisseria derivado de genoma (Genome-derived neisserial antigen) hrCNE high resolution Clear Native Electrophoresis ID Código de identificación - 12 - IEF Isoelectroenfoque IPP Interacción proteína-proteína Ket Cetol-ácido reductoisomerasa LOS Lipooligosacáridos LPS Lipopolisacárido MAC Complejo de ataque a membrana (Membrane Attack Complex) MBL Lectina de unión a manosa (Manose Binding Lectin) mbSUS Mating-Based Split-Ubiquitin System MCH Complejo mayor de histocompatibilidad (Mayor Complex Histocompatibily) MIP Potenciador de la infectividad a macrófagos (Macrophage Infectivity Potenciator) MLEE Multilocus Enzime Electrophoresis MLST Multilocus Sequence Tiping OPA Ensayo de opsonofagocitosis (Opsonophagocytosis Assay) NOMV Vesícula de membrana externa nativa (Native Outer Membrane Vesicle) OMV Vesícula de membrana externa (Outer Membrane Vesicle) ORF Marco abierto de lectura (Origyn Reading Frame) PA Poliacrilamida PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Tampón fosfato salino PS Polisacárido PVDF Polivinilidenofluoruro (Polyvinylidene fluoride) SBA Ensayo de actividad bactericida del suero (Serium Bactericidal Assay) SDS dodecilsulfato de sodio (Sodium Dodecyl Sulfate) SLA Ensayo de unión a superficie (Surface Labeling Assay) SPR Resonancia de plasmón superficial (Surface Plasmon Resonance) ST tipos de secuencia (Sequence Type) TAP-Tag Tamdem Afinity Purification-Tag TCA Ácido tricloroacético TEMED N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina TX100 Triton X-100 Y2H Sistema de doble híbrido (Yeast Two Hibrid) INTRODUCCIÓN AL MENINGOCOCO Y LA ENFERMEDAD MENINGOCÓCICA Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 20 - Figura 1. Distribución global de los principales serogrupos de N. meningitidis causantes de enfermedad (tomada de Stephens DS, 2007). El porcentaje de aislamientos del grupo C responsable de enfermedad meningocócica endémica varía en función del país. Hasta la introducción de la vacuna conjugada contra este serogrupo, fue uno de los máximos responsables de la enfermedad endémica en Europa y Norteamérica, alcanzando proporciones de hasta el 40% y registrándose múltiples epidemias21. La mayoría de estas infecciones son causadas por cepas altamente relacionadas pertenecientes al complejo clonal ST11/ET3714. Hasta hace poco tiempo, el serogrupo W135 era relativamente raro como causante de enfermedad invasiva y tampoco producía brotes epidémicos. Sin embargo, en 2001 produjo un brote epidémico en Arabia Saudí durante el 21 Granoff DM, Harrison LH, Borrow R. Meningococcal vaccines. En : Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA (Eds). Vaccines. Reino Unido: Elseiver Inc; 2008. p. 399-432. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 21 - peregrinaje de miles de personas del cinturón subsahariano a La Meca22. El clon causante pertenece al complejo clonal ST11/ET37, al que también pertenecen las cepas virulentas del serogrupo C comentadas en el párrafo anterior. Algunos autores sugieren que la coexistencia de dos serogrupos en el mismo complejo clonal es debido al llamado capsular switching, mecanismo por el que el meningococo cambia de serogrupo a través de la transformación y recombinación de los genes implicados en la síntesis de la cápsula, incrementando así su variabilidad23, 24. 3. Interacción con el huésped. Colonización, infección y respuesta inmune 3.1. Variabilidad antigénica como mecanismo de defensa Uno de los rasgos más relevantes de N. meningitidis es su gran variabilidad antigénica, tanto en los niveles de expresión de factores de virulencia, como de las propiedades antigénicas de los mismos. La diversidad antigénica favorece la evasión a la respuesta inmune por lo que supone un importante obstáculo en el desarrollo de vacunas25. Los mecanismos utilizados por el meningococo para generar la alta variabilidad antigénica que lo caracteriza son varios, como la variación de fase, el capsular switching o la transformación y recombinación homóloga. La variación de fase consiste en la expresión/no expresión de características fenotípicas, como proteínas, modificaciones secundarias, 22 Taha MK, Achtman M, Alonso JM, Greenwood B, Ramsay M et al. Serogroup W135 meningococcal desease in Hajj pilgrims. Lancet. 2000; 356: 2159. 23 Swatley JS, Marfin AA, Edupugantu S, Liu LJ, Cieslak P et al. Capsule switching of Neisseria meningitidis. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 271-276. 24 Alcalá B, Arreaza L, Salcedo C, Uría MJ, De La Fuente L et al. Capsule Switching among C:2b:P1.2,5 meningococcal epidemia strain alter mass immunization camping, Spain. Emerging Infectious Diseases. 2002: 8: 1512-1514. 25 Billker O, Gödert S, Meyer TF. Interactions of Neisseria meningitidis with the immune system. En: Ferreirós CM, Criado MT, Vázquez J. (Eds.) Emenging Strategies In The Fight Against Meningitis: Molecular and Cellular Aspects. 2002; Reino Unido: Horizon Scientific Press. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 22 - estructuras antigénicas, y que comúnmente se encuentra regulado por mutaciones en repeticiones en tándem de secuencias únicas de ADN localizadas en Open Reading Fragmes (ORFs) o en regiones promotoras de genes codificantes para factores de virulencia26. El capsular switching es un mecanismo de variabilidad antigénica por el que una determinada cepa sufre un cambio de serogrupo a través de la transformación y subsiguiente recombinación del gen que codifica para la polysialyltransferasa (siaD) o del operón de la biosíntesis de la cápsula. Este mecanismo de intercambio genético también es común en los loci de los genes que codifican para las proteínas de membrana externa PorA y PorB, en los que puede ocurrir la sustitución de cada alelo completo o el intercambio de una o varias regiones variables27. Otros mecanismos implicados son la recombinación homóloga intra-bacteria en grandes familias de genes, que generan variación en la secuencia de genes determinados, y los elementos genéticos transponibles que interrumpen la expresión de manera reversible. 3.2. Colonización e invasión del huésped Muchos patógenos han evolucionado para colonizar y completar su ciclo vital sin causar enfermedad, resultando la enfermedad infecciosa, como en el caso del meningococo, un suceso ocasional. Conocer los mecanismos que el patógeno utiliza en la colonización es de vital importancia para el desarrollo de estrategias en la prevención del estado de portador y la erradicación de la enfermedad. Sin embargo, estos mecanismos son de difícil estudio debido a la frecuente especificidad del patógeno por receptores y nutrientes del huésped28. 26 Srikhanta YN, Dowideit SJ, Edwards JL, Falsetta ML, Wu HJ et al. Phasevarions mediate random switching of gene expression in pathogenic Neisseria. PLoS Pathog. 2009; 5: e1000400. 27 Beddek AJ, Li MS, Kroll JS, Jordan TW, Martin DR. Evidence for capsule switching between carried and disease-causing Neisseria meningitidis strains. Infect Immun. 2009; 77: 2989-2994. 28 Exley RM, Sim R, Goodwin L, Winterbotham M, Schneider MC et al. Identification of meningococcal genes necessary for colonization of human upper airway tissue. Infect Immun. 2009; 77: 45-51. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 23 - El primer paso en la patogénesis de la mayoría de las enfermedades infecciosas es la colonización de individuos susceptibles por parte del microorganismo infeccioso. Dado que N. meningitidis interactúa con diferentes tipos celulares en el proceso de colonización, entrada en la circulación sistémica y producción de la enfermedad, presenta numerosas adhesinas que interaccionan con distintos receptores humanos, siendo los Pili tipo IV y las proteínas de membrana externa Opa y Opc, con diferencia, las expresadas más abundantemente29. En un primer contacto, el meningococo se une específicamente a las células epiteliales columnares no ciliadas de la nasofaringe e induce la producción de pseudopodios para su internalización en dichas células30. El contacto inicial de la bacteria con las células epiteliales es mediado por los Pili tipo IV31, proyecciones filamentosas de 4-6 nm de ancho y unos 6 µm de largo que se extienden desde la superficie de la bacteria atravesando la cápsula polisacarídica. El receptor propuesto para los Pili tipo IV de N. meningitidis es la proteína CD4632, perteneciente a una familia de proteínas expresadas en prácticamente todos los tipos celulares con excepción de los eritrocitos. Tras este contacto inicial, el microorganismo prolifera en la superficie de las células epiteliales no ciliadas formando microcolonias en el lugar del contacto inicial. La presencia de la cápsula impide la unión estrecha de otras adhesinas; sin embargo, el anclaje a las células epiteliales puede activar un sistema regulador 29 Virji M. Pathogenic neisseriae: surface modulation, pathogenesis and infection control. Nat Rev Microbiol. 2009;7: 274-286. 30 Stephens DS, Hofman LH, McGee ZA. Interaction of Neisseria meningitidis with human nasopharingea mucosa: attachment and entry into columnar ephitelial cells. J Infect Dis. 1983; 148: 369-376. 31 Taha MK, Morand PC, Pereira Y, Eugène E, Giorgini D et al. Pilus-mediated adhesion of Neisseria meningitidis: the essential role of cell contact-dependent transcriptional upregulation of the PilC1 protein. Mol Microbiol. 1998; 28: 1153-1163. 32 Källström H, Liszewski MK, Atkinson JP, Jonsson AB. Membrane cofactor protein (MCP or CD46) is a cellular pilus receptor for pathogenic Neisseria. Mol Microbiol. 1997; 25: 639-647. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 24 - que conduce a la pérdida o a una menor expresión de la cápsula33. Una vez desprovista de cápsula, se posibilita una adherencia íntima del meningococo a las células epiteliales, provocando la formación de placas corticales y conduciendo al reclutamiento de factores responsables de la formación y extensión de pseudopodios por parte de las células epiteliales que internalizarán al meningococo34. Esta adhesión íntima es mediada por las proteínas de membrana externa Opa y Opc35. Las proteínas Opa son una familia de proteínas transmembrana con estructura barril beta que presentan gran variabilidad antigénica y de expresión. A pesar de su alta heterogeneidad de expresión y variabilidad antigénica, distintas Opa pueden unirse al sitio común del receptor CD66 o CEACAM (carcinoembryonic antigen-related cell adhesión molecule) humano, uno de sus principales receptores diana, expresado en prácticamente todos los tipos celulares humanos salvo en los eritrocitos. Las proteínas Opc comparten propiedades fisicoquímicas y una cierta homología con las proteínas Opa, aunque difieren en estructura y control genético. Las Opc se unen a la superficie apical de células epiteliales polarizadas, requiriendo como intermediarios factores del suero (integrinas), facilitando de este modo la internalización en las células. Recientemente han sido descritas otras moléculas implicadas en la adhesión e invasión del epitelio respiratorio, como la NhhA (Neisseriahia/hsf homologue), la App (adhesion and penetration protein), la HrpA (haemagglutin/haemolysin-related protein A), NadA (Neisseria meningitidis Adhesin A) y MspA (meningococcal serine protease A)36. 33 Hammerschmidt S, Müller A, Sillmann H, Mühlenhoff M, Borrow R et al. Capsule phase variation in Neisseria meningitidis serogroup B by slipped-strand mispairing in the polysialyltransferase gene (siaD): correlation with bacterial invasion and the outbreak of meningococcal disease. Mol Microbiol. 1996; 20: 1211-1220 34 Doulet N, Donnadieu E, Laran-Chich MP, Niedergang F, Nassif X et al. Neisseria meningitidis infection of human endothelial cells interferes with leukocyte transmigration by preventing the formation of endothelial docking structures. J Cell Biol. 2006. 173: 627-637. 35 Corbett A, Exley R, Bourdoulous S, Tang CM. Interactions between Neisseria meningitidis and human cells that promote colonisation and disease. Expert Rev Mol Med. 2004; 6: 1-14. 36 Carbonnelle E, Hill DJ, Morand P, Griffiths NJ, Bourdoulous S et al. Meningococcal interactions with the host. Vaccine. 2009; 27: 78-89. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 25 - Los siguientes pasos de internalización, transcitosis, supervivencia intracelular y diseminación en el torrente sanguíneo están menos estudiados37. La bacteria atraviesa el espacio intracelular en el interior de vacuolas membranosas con la ayuda de factores de virulencia como la proteasa IgA1, la cual degrada proteínas de membrana asociadas al lisosoma (LAMPs) previniendo la maduración del mismo, y activando la expresión de la cápsula. Una vez atravesada la mucosa, accede al torrente sanguíneo pudiendo, en algunos casos, multiplicarse rápidamente produciendo infección sistémica o translocarse a través de la barrera hemato-meningea y proliferar en el sistema nervioso central causando meningitis. 3.3. Respuesta inmune frente al meningococo La respuesta del sistema inmune frente a la enfermedad causada por N. meningitidis involucra mecanismos, tanto innatos como adquiridos, que reconocen estructuras de la superficie bacteriana. Los escenarios donde tiene lugar son múltiples, comenzando en la mucosa nasofaríngea, y continuando en el sistema vascular y órganos infectados a medida que la infección avanza. La respuesta inmune varía en función de la edad del paciente así como del serogrupo del microorganismo, aunque los motivos moleculares todavía están por esclarecer. Los patrones mostrados por la enfermedad en individuos inmunodeficientes han arrojado claridad sobre la complejidad de la respuesta frente al meningococo y señalan a los anticuerpos y el sistema de complemento como los principales responsables de la respuesta, aunque la inmunidad celular está cobrando una mayor relevancia, especialmente en la respuesta contra el serogrupo B38. 37 Stephens DS, Greenwood B, Brandtzaeg P. Epidemic meningitis, meningococcemia and Neisseria meningitidis. Lancet. 2007; 369: 2196-2210. 38 Findlow J, Taylor S, Aase A, Horton R, Heyderman R et al. Comparison and correlation of Neisseria meningitidis serogroup B immunologic assay results and human antibody responses Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 26 - 3.3.1. Respuesta inmune humoral. Anticuerpos y sistema del complemento como principal mecanismo de defensa frente al meningococo El papel central de los anticuerpos en la protección frente al meningococo se ve reflejado en relación inversa entre los títulos de anticuerpos anti-meningococales (o la actividad bactericida del suero) y la incidencia de la enfermedad en función de la edad del paciente39 (figura 2). El 50% de los recién nacidos presentan actividad bactericida del suero como resultado de la transferencia de inmunoglobulinas protectivas maternas a través de la placenta. Esta inmunidad cae rápidamente tras el parto hasta los 12 meses de edad (cuando la susceptibilidad a la enfermedad es la más alta), período en el que sólo el 20% presentan actividad bactericida. Esta inmunidad se incrementa progresivamente durante la infancia hasta llegar a la edad adulta en la que el 65-85% de los individuos presentan suero bactericida contra al meningococo. El sistema efector de la actividad bactericida del suero es el sistema del complemento, el cual juega un importantísimo papel en la defensa contra el meningococo. El sistema del complemento se compone de un grupo de proteínas, muchas de ellas con actividad enzimática, que interaccionan secuencialmente entre sí con un orden predefinido. Desempeñan un importante efecto tanto en la inmunidad innata como en la adquirida, ya que la activación de la cascada enzimática depende tanto de la unión de un anticuerpo a la superficie de la bacteria como por mecanismos de inmunidad innata. following three doses of the Norwegian meningococcal outer membrane vesicle vaccine MenBvac. Infect Immun. 2006; 74: 4557-4565. 39 Pollard AJ, Frasch C. Development of natural immunity to Neisseria meningitides. Vaccine. 2001; 19: 1327-1346. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 27 - Figura 2. Prevalencia dependiente de edad de la enfermedad meningocócica en relación a la inmunidad poblacional calculada por la actividad bactericida del suero (tomada y modificada de Pollard AJ, 2001). Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 28 - Figura 3. Representación esquemática de las tres vías de activación del sistema del complemento. Las tres vías confluyen en la formación de la convertasa de C5, desencadenando la formación del complejo de ataque a membrana y la lisis celular. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 29 - Existen tres vías de activación del complemento (figura 3): (i) vía clásica, activada por la interacción antígeno-anticuerpo; (ii) vía alternativa, activada por la interacción de estructuras de la superficie microbiana con el componente C3b y los factores B y D; (iii) la vía de la lectina, activada cuando la lectina de unión a manosa se une a residuos manosa presentes en la superficie bacteriana. Los procesos iniciales de las tres vías consisten en una secuencia de reacciones proteolíticas en las que los productos generados contribuyen a la activación del siguiente componente. Entre los subproductos de la activación del complemento hay anafilotoxinas, quimioatrayentes que causan reacciones inflamatorias en el sitio de deposición del complemento y atracción y activación de fagocitos. Las tres rutas convergen en la formación del enzima C3 convertasa, que rompe la proteína C3 produciendo el componente activo C3b a partir del cual se activan los componentes tardíos de complemento, efectores de la lisis de la bacteria. La vía clásica es muy selectiva, y está acoplada a la inmunidad específica a través de los anticuerpos. Cuando un anticuerpo de isotipo IgM, IgA, IgG1, IgG2 o IgG3 (no IgG4, IgE, o IgD) se une al antígeno, se produce un cambio conformacional en su región Fc que permite la unión del primer componente de la vía clásica, C1q, y la activación de esta vía. Finalmente, la vía clásica resulta en la formación del complejo de ataque a la membrana (MAC), formado por la unión de los componentes finales del complemento (C5-9). El MAC es altamente lipofílico y se inserta en las membranas bacterianas formando un canal cilíndrico transmembrana provocando la lisis celular. Los fragmentos C3a y C5a, liberados durante la activación del complemento, constituyen un potentísimo promotor de las funciones de los fagocitos y la inflamación. La vía alternativa del complemento constituye un estado de activación permanente del componente C3 que genera C3b. En ausencia de antígenos Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 36 - la iniciación de la respuesta inmune contra el meningococo adquirido en los últimos veinte años, ha revelado la crucial importancia de la activación de las células del sistema inmune innato en el desarrollo de una inmunidad humoral protectiva65. La contribución de la fagocitosis a la inmunidad innata contra N. meningitidis ha sido escasamente analizada debido a las dificultades técnicas de su estudio, tanto in vivo como in vitro. Los principales tipos celulares implicados en esta respuesta son los granulocitos neutrófilos (o células polimorfonucleares), las células dendríticas y los macrófagos. La importancia de los neutrófilos en la eliminación del meningococo ha sido constatada por su predominancia en el líquido cerebroespinal de pacientes con meningitis meningocócica, y por su temprana activación durante el proceso de infección66,67. Han sido propuestos diferentes receptores en la superficie de los neutrófilos que interaccionan con N. meningitidis promoviendo la fagocitosis tanto por vía opsónica como no opsónica. Los neutrófilos humanos eliminan eficientemente los meningococos opsonizados a través de los receptores Fc-gamma. Entre éstos, FcyRII y FcyRIII, con distintas afinidades por distintos subtipos de IgG, tras detectar las modificaciones propias de la cadena constante de IgG que se producen tras la unión a los antígenos meningococales. La eliminación del meningococo por los neutrófilos ha sido constatada en sueros deficientes en los últimos componentes del sistema del complemento67. En estudios realizados tras vacunación de individuos con vacunas polisacarídicas de los serogrupos A, Y y W-135, se ha observado un incremento de la fagocitosis 65 Schmitt C, Villwock A, Kurzai O. Recognition of meningococcal molecular patterns by innate immune receptors. Int J Med Microbiol. 2009; 299: 9-20. 66 Peters MJ, Heyderman RS, Faust S, Dixon GL, Inwald DP et al. Severe meningococcal disease is characterized by early neutrophil but not platelet activation and increased formation and consumption of platelet-neutrophil complexes. J Leukoc Biol. 2003; 7: 722-730. 67 Platonov AE, Vershinina IV, Käyhty H, Fijen CA, Würzner R et al. Antibody-dependent killing of meningococci by human neutrophils in serum of late complement component-deficient patients. Int Arch Allergy Immunol. 2003; 130: 314-321. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 37 - dependiente de anticuerpos específicos y del complemento68 en los individuos vacunados. La captación opsónica de N. meningitidis también puede ser mediada por receptores de moléculas del sistema del complemento, como el receptor CR3, expresado en neutrófilos y monocitos. Paralelamente, los neutrófilos son capaces de captar y eliminar al meningococo de manera no opsónica mediante la unión de los receptores CEACAM a las proteínas Opa69. Las células dendríticas y los macrófagos son dos importantes tipos celulares especializados del sistema inmune innato. Estas células funcionan como nexo de unión entre la inmunidad innata y la adaptativa, y gobiernan el inicio y desarrollo de la respuesta inmune, debido a su doble papel como células fagocíticas y células presentadoras de antígenos56. Para los serogrupos A, B y C, la expresión de la cápsula reduce notablemente el acoplamiento a células dendríticas y la fagocitosis. La sialización de lipooligosacáridos representa un segundo mecanismo de N. meningitidis, para escapar de la fagocitosis de células dendríticas70. La infección de células dendríticas por N. meningitidis provoca un aumento de la expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad II (MCH) y una fuerte producción de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-8), directamente correlacionadas con la severidad de la enfermedad meningocócica, al provocar inflamación local y facilitar al patógeno la invasión. El papel que juegan los linfocitos B y T en la respuesta inmune muestra profundas diferencias, y la estimulación de unos u otros por los 68 Lowell GH, Smith LF, Griffiss JM, Brandt BL, MacDermott RP. Antibody-dependent mononuclear cell-mediated antimeningococcal activity. Comparison of the effects of convalescent and postimmunization immunoglobulins G, M, and A. J Clin Invest. 1980; 66: 260-267. 69 Sarantis H, Gray-Owen SD. The specific innate immune receptor CEACAM3 triggers neutrophil bactericidal activities via a Syk kinase-dependent pathway. Cell Microbiol. 2007; 9: 2167-2180. 70 Unkmeir A, Kämmerer U, Stade A, Hübner C, Haller S et al. Lipooligosaccharide and polysaccharide capsule: virulence factors of Neisseria meningitidis that determine meningococcal interaction with human dendritic cells. Infect Immun. 2002; 70: 2454-2462. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 38 - distintos antígenos tendrá consecuencias determinantes en la inmunidad frente al meningococo. El polisacárido capsular ha demostrado ser un antígeno T-independiente71. Salvo excepciones como el polisacárido A72, el polisacárido capsular estimula las células B por unión con el receptor de células B (BCR), induciendo su diferenciación a células plasmáticas productoras de anticuerpos, pero sin estimular las células T, por lo que no se producen células B de memoria nuevas y se agota el reservorio de las ya existentes, lo que resulta en una menor respuesta, en subsiguientes dosis vacunales, además de resultar no inmunogénico en niños73,74. Para que se genere y se mantenga memoria inmunológica se requiere la conjugación química de una proteína transportadora al polisacárido. De este modo se induce una respuesta T-dependiente, posibilitando la diferenciación de células T colaboradoras específicas, que a su vez ayudarán a la estimulación de células B productoras de anticuerpos y de memoria. La protección a largo plazo a nivel de individuo depende de dos mecanismos: la persistencia de anticuerpos funcionales y el mantenimiento de memoria inmunológica. Aunque teóricamente las células B de memoria podrían conferir inmunidad a largo plazo, la velocidad con la que el meningococo invade y produce enfermedad, en un plazo de incluso horas, hace que la defensa por parte de estas células pueda ser demasiado lenta ya que requiere 4 días o más para su puesta en marcha, salvo en aquellos casos en los que el período de incubación es largo. Por lo tanto, la persistencia de anticuerpos funcionales, especialmente en los períodos de mayor índice de 71 Coutinho A, Möller G. Mitogenic properties of the thymus-independent antigen pneumococcal polysaccharide S3. Eur J Immunol. 1973; 3: 608-613. 72 Muller E, Apicella MA. T-cell modulation of the murine antibody response to Neisseria meningitidis group A capsular polysaccharide. Infect Immun. 1988; 56: 259-266. 73 MacLennan J, Obaro S, Deeks J, Lake D, Elie C et al. Immunologic memory 5 years after meningococcal A/C conjugate vaccination in infancy. J Infect Dis. 2001; 183: 97-104. 74 Granoff DM, Pollard AJ. Reconsideration of the use of meningococcal polysaccharide vaccine. Pediatr Infect Dis J. 2007; 26: 716-722. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 39 - enfermedad, podría ser clave en la inmunidad individual y, al limitar el número de portadores, en la inmunidad poblacional75. 4. Estrategias en el diseño de vacunas meningocócicas. Situación actual A pesar de que se ha dispuesto de vacunas protectivas contra la enfermedad meningocócica desde hace treinta años (figura 4), todavía no existe una formulación que ofrezca protección contra todos los serogrupos causantes de enfermedad, debido especialmente a las serias dificultades que continúa ofreciendo el serogrupo B. Como se ha comentado anteriormente, el microorganismo ha desarrollado sofisticados mecanismos para evadir las defensas del huésped, como polisacáridos capsulares, lipooligosacáridos glicosilados con estructuras que imitan las de tejidos humanos, gran variabilidad antigénica, capacidad de reclutar reguladores negativos de la inmunidad humoral o transformación genética, dificultando así el diseño de formulaciones efectivas. Las estrategias seguidas en el diseño de vacunas contra los diferentes serogrupos han sido varias, alcanzando buenos resultados de eficacia en muchos de ellos incluso contra el serogrupo B, aunque en este último caso dicha eficacia se limita a la prevención de la enfermedad ante las cepas con las que han sido elaboradas. 75 Pollard AJ, Perrett KP, Beverley PC. Maintaining protection against invasive bacteria with protein-polysaccharide conjugate vaccines. Nat Rev Immunol. 2009; 9: 213-220. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 40 - Figura 4. Línea temporal del desarrollo de vacunas meningocócicas y estrategias seguidas (tomada y modificada de Stephens DS. 2007). 1970 1980 1990 2000 2005 2010 Vacunas contra los serogrupos A, C, Y, W-135 Ô1969-1971 – Vacunas polisacarídicas A y C (Mengivac A+C ® y Mencevax AC ® ) Ô 1978 - Vacuna polisacarídica polivalente A, C, Y, W-135 (ACWY Vax ® ) Ô 2000 – Vacunas conjugadas del serogrupo C (Menactra®) Ô 2005 – Nuevas vacunas conjugadas A, C, W-135 (Mencevax® y Menveo TM , (ensayos clínicos fase III) 2005 –Vacuna conjugada A (Meningitis Vaccine Proyect: MenAfriVac TM , ensayos clínicos fase III)) Ô 2009- Vacuna basada en OMVs A y W-135 (ensayos preclínicos) Vacunas contra el serogrupo B Ô 1980 al presente – Vacunas basadas en OMVs • 1987- VA-MENGOC-BC ® (Finlay Institute). Epidemias en Cuba y Brasil • 1987- WRAIR.Epidemia en Chile • 1988- MenBvac ® , (NIPH, Noruega)Epidemia en Noruega • 1991-OMVs multivalentes (MonoMen®, HexaMen®,NonaMen®, en ensayos clínicos fase II) • 2004- MeNZB TM (Novartis)Epidemia en Nueva Zelanda Ô 2000- Nuevas estratégias: • Vacunología reversa (rMenB Novartis), (ensayos clínicos fase III) • Proteínas recombinantes (NspA, fHbp) (ensayos clínicos fase II) • OMVs N. lactamica, (ensayos clínicos fase II) • OMVs mejoradas genéticamente (ensayos preclínicos) • OMVs nativas (ensayos preclínicos) Ô Vacunas basadas en LPS (ensayos preclínicos) 1970 1980 1990 2000 2005 2010 Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 41 - Los primeros pasos en el desarrollo de vacunas meningococales datan de principios del siglo XX. Los antígenos utilizados fueron células bacterianas muertas. Estos estudios fueron llevados a cabo con un control deficiente sin poder confirmar una inmunidad protectiva generada76. A finales de los años 60 el Walter Reed Army Institute (EEUU) trabajó con polisacáridos de los serogrupos A y C en respuesta a brotes epidémicos en reclutas norteamericanos, resultando seguros e inmunogénicos en humanos77,78. Posteriormente se desarrollaron vacunas polisacarídicas polivalentes, es decir, vacunas que incluyen en la misma formulación antígenos de diferentes serogrupos, inicialmente contra los grupos A y C, y posteriormente de cobertura ampliada a los grupos A, C, Y y W135. La principal limitación de las vacunas polisacarídicas es que no inducen inmunidad T-dependiente79,80. La ausencia de este tipo de inmunidad implica una pobre efectividad en niños, así como la incapacidad de generar memoria inmunológica a largo plazo81,82,83. 76 Underwood EA. Recent knowledge of the incidence and control of cerebroespinal fever. Br. Med. J. 1940; i: 757-763. 77 Gotschlich EC, Liu TY, Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus III. Preparation and immunochemical properties of the group A, group B, and group C meningococcal polysaccharides. J Exp Med. 1969; 129: 1349-1365. 78 Gotschlich EC, Goldschneider I, Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus. IV. Immunogenicity of group A and group C meningococcal polysaccharides in human volunteers. J Exp Med. 1969; 129: 1367-1384. 79 Kelly DF, Snape MD, Clutterbuck EA, Green S, Snowden C et al. CRM197-conjugated serogroup C meningococcal capsular polysaccharide, but not the native polysaccharide, induces persistent antigen-specific memory B cells. Blood. 2006; 108: 2642-2647. 80 Kelly DF, Pollard AJ, Moxon ER. Immunological memory: the role of B cells in long-term protection against invasive bacterial pathogens. JAMA. 2005; 294: 3019-3023. 81 Leach A, Twumasi PA, Kumah S, Banya WS, Jaffar S et al. Induction of immunologic memory in Gambian children by vaccination in infancy with a group A plus group C meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine. J Infect Dis. 1997; 175: 200-204. 82 MacDonald NE, Halperin SA, Law BJ, Forrest B, Danzig LE et al. Induction of immunologic memory by conjugated vs plain meningococcal C polysaccharide vaccine in toddlers: a randomized controlled trial. JAMA. 1998; 280: 1685-1689. 83 Goldblatt D. Immunisation and the maturation of infant immune responses. Dev Biol Stand. 1998; 95: 125-132. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 42 - Experiencias con las vacunas conjugadas contra Haemophylus influenza y Streptococus pneumoniae, han demostrado que la conjugación química de los polisacáridos a un transportador proteico permite que se induzca una respuesta T- dependiente84. Siguiendo este procedimiento han sido desarrolladas diferentes vacunas conjugadas en base a los polisacáridos A, C, Y, y W135 (tabla 1). Estas vacunas han sido ampliamente evaluadas, obteniendo sueros con títulos altos de anticuerpos bactericidas y respuesta inmune estable85. Sin embargo, el polisacárido capsular del serogrupo B (ácido α-2,8 N- acetilneuramínico) es poco inmunogénico y su similitud con residuos glucosílicos presentes en proteínas de células humanas, como la molécula de adhesión NCAM de células del sistema nervioso86, ha imposibilitado el desarrollo de una vacuna conjugada para el grupo B debido al riesgo de provocar una respuesta autoinmune. En un intento por superar este problema, Jenning y colaboradores desarrollaron un polisacárido modificado químicamente que contiene grupos N- propionil en vez de N-acetil en la posición C5 de los residuos de ácido siálico. Las vacunas desarrolladas mostraron resultados muy prometedores en ratones87 y primates no humanos88, pero en un ensayo de fase I realizado en adultos 84 Robbins JB, Schneerson R, Anderson P, Smith DH. The 1996 Albert Lasker Medical Research Awards. Prevention of systemic infections, especially meningitis, caused by Haemophilus influenzae type b. Impact on public health and implications for other polysaccharide-based vaccines. JAMA. 1996; 276: 1181-1185. 85 Reisinger KS, Baxter R, Block SL, Shah J, Bedell L, Dull PM. Quadrivalent meningococcal vaccination in adults: A Phase III comparison of an investigational conjugate vaccine, MenACWY- CRM, with the licensed vaccine, Menactra. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16: 1810-1815. 86 Finne J, Leinonnen M, Makela PH. Antigenic similarities between brain components and bacteria causing meningitidis: implications for vaccine development and pathogenesis. Lancet. 1982; 2: 355-357. 87 Jennings HJ, Roy R, Gamian A. Induction of meningococcal group B polisacharide-specific IgG antibodies in mice using N-propionolated B polisacharide-tetanus toxoid conjugate vaccine. J. Immunol. 1986; 137: 1708-1713. 88 Fusci PC, Michon F, Tai JY, Blake MS. Preclinical evaluation of a novel group B meningococcal conjugate vaccine that elicits bactericidal activity in both mice and non human primates. J. Infect. Dis. 1997; 175: 364-372. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 43 - voluntarios se comprobó que los anticuerpos inducidos carecen de actividad funcional89. En ausencia de vacunas polisacarídicas o conjugadas, el desarrollo de vacunas contra el grupo capsular B se ha basado en antígenos proteicos subcapsulares presentes en la superficie de la bacteria (tabla 2). Sin embargo, el diseño de vacunas de amplia protección basadas en componentes proteicos resulta complejo, especialmente cuando nos enfrentamos a un patógeno específico del ser humano que ha desarrollado múltiples mecanismos para evadir la respuesta inmune humana. Como resultado de la presión inmunoselectiva sufrida por la bacteria en el huésped, muchas proteínas de superficie muestran una gran diversidad en su secuencia aminoacídica, resultando en que los mejores antígenos diana, especialmente atractivos por su alta inmunogenicidad, sean también los más variables. Sin embargo el problema que supone la alta variabilidad antigénica podría ser abordado. Los análisis moleculares han mostrado que muchas variantes de estructuras antigénicas interesantes están relacionadas con linajes genéticos concretos, lo que simplifica en cierta medida el 89 Bruge J, Bouveret-Le Cam N, Danve B, Rougon G, Schulz D. Clinical evaluation of a group B meningococcal N-propionylated polysaccharide conjugate vaccine in adult, male volunteers. Vaccine. 2004; 22: 1087-96. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 44 - Tabla 1. Vacunas disponibles y en desarrollo contra los serogrupos A, C, Y y W135 de N. meningitidis. Vacunas Polisacarídicas Vacuna Antígenos Serogrupos Disponibilidad Mengivac A+C ® Sanofi-Pasteur Polisacárido (PS) A y C. A, C Disponible en España Mencevax AC® GlaxoSmithKline PS A y C. A, C Disponible en España Mencevax ACW135® GlaxoSmithKline PS A. C. y W-135 A, C y W-135 Utilizada desde 2003 en el cinturón de la meningitis africano. Menomune® Sanofi-Pasteur PS A, C, Y y W-135 A, C, Y y W-135 Autorizada en 1981 ACWY Vax® GlaxoSmithKline PS A, C, Y y W-135 A, C, Y y W-135 Disponible en España por medicación extranjera. Dirigida al mercado de los peregrinos a La Meca Vacunas Conjugadas Polisacárido-proteína Meningitec® Wyeth Ltd. PS C conjugado a toxoide diftérico CRM197 C Utilizada desde 1999 en UK Menjugate® Novartis PS C conjugado a toxoide diftérico CRM197 C NeisVac-C ® Baxter PS C conjugado a toxoide tetánico C Menitorix™ GlaxoSmithKline PS Hib y PS C conjugado a toxoide tetánico C Nuevas Vacunas A, C, Y , W-135 Menactra® Sanofi-Pasteur PS A, C, Y y W-135 conjugado a CRM197 A, C, Y y W-135 Aprobada en 2005 para USA y Canadá. Uso autorizado para mayores de 2 años. Mencevax® GlaxoSmithKline PS A, C, Y y W-135 conjugado a toxoide tetánico A, C, Y y W-135 Fase III comparándose con MenactraI MenveoTM Novartis Oligosacárido A, C, Y y W- 135 conjugado a CRM197 A, C, Y y W-135 Fase III, comparándose con MenactraII DTPvvHB/HibMenAC GlaxoSmithKline PS A y C conjugado a toxoide tetánico. A, C Fase IIIII MenAfriVacTM (Meningitis Vaccine Proyect)* Serum Institute of India Ltd. PS A conjugado a toxoide tetánico A Fase II/III completadaIV MenC vaccine Bio-Manguinhos/Fiocruz PS C conjugado a toxoide tetánico. C Fase I completadaV Vacuna OMVs bivalente OMVs serogrupo A y W- 135 A y W-135 Ensayos preclínicosVI,VII Las referencias indicas en esta tabla se muestran en la página 221. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 45 - diseño de formulaciones. La resolución del problema de la variación antigénica de las proteínas se está enfocando desde dos puntos de vista diferentes. Por un lado está el desarrollo de formulaciones multivalentes que contienen las variantes más representativas de antígenos inmunodominantes, normalmente abundantes y variables, y por otro lado se apuesta por el uso de antígenos conservados, a menudo minoritarios, no inmunodominantes y con expresión fuertemente regulada. Este segundo enfoque ha sido posible gracias al gran avance experimentado por las técnicas de genética molecular en las últimas décadas. Hasta la fecha las únicas formulaciones que han mostrado eficacia contra la enfermedad meningocócica del serogrupo B han sido aquellas basadas en vesículas de membrana externa (OMVs) monovalentes, desarrolladas en respuesta a brotes epidémicos causados por una cepa determinada. Las principales ventajas que presentan este tipo de vacunas es que las OMVs son un muestrario de antígenos proteicos representativo de la membrana externa del meningococo, y que la propia estructura de las vesículas posibilita que los antígenos de membrana expuestos en superficie conserven su estabilidad físicoquímica y puedan ser presentados en su conformación nativa. Además, durante su manufacturación, el contenido de LPS (endotoxina) se reduce considerablemente, mejorando sus características para uso parenteral. La eficacia de estas vacunas ha sido demostrada en Noruega (MenBvacTM)90, Nueva Zelanda (MeNZB®)91,92, Chile93, Cuba y Brasil (VA-Mengoc-BC®)94, áreas donde se han producido brotes epidémicos dominados por una cepa concreta. 90 Bjune G, Høiby EA, Grønnesby JK, Arnesen O, Fredriksen JH et al. Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway. Lancet. 1991; 338: 1093-1096. 91 Kelly C, Arnold R, Galloway Y, O'Hallahan J. A prospective study of the effectiveness of the New Zealand meningococcal B vaccine. Am J Epidemiol. 2007; 166: 817-823. 92 Wong SH, Lennon DR, Jackson CM, Stewart JM, Reid S et al. Immunogenicity and tolerability in infants of a New Zealand epidemic strain meningococcal B outer membrane vesicle vaccine. Pediatr Infect Dis J. 2009; 28: 385-390. 93 Boslego J, Garcia J, Cruz C, Zollinger W, Brandt B et al. Efficacy, safety, and immunogenicity of a meningococcal group B (15:P1.3) outer membrane protein vaccine in Iquique, Chile. Chilean National Committee for Meningococcal Disease. Vaccine. 1995; 13: 821-829. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 52 - Tabla 4. Vacunas disponibles o en desarrollo contra el serogrupo B de N. meningitidis. Vacunas basadas en OMVs Vacuna Formulación Etapa de desarrollo actual Eficacia e inmunogenicidad Ref.* VA-MENGOC-BC® Instituto Finlay, Cuba OMVs B:4:P1.19,15 Polisacárido grupo C En calendario vacunal de Cuba desde 1991 Descenso de la mortalidad (98%) Eficacia total 87% Poco efectiva en niños <2 años VIII MenBvac® NIPH, Holanda OMVs B:15:P1.7,16 Uso masivo contra brote epidémico en Noruega (1988-1991) Eficacia total 57% IX MeNZBTM Chiron Vaccines (Novartis) OMVs B:4:P1.7-2,4 Uso masivo contra brote epidémico en Nueva Zelanda desde 2004 Efectiva en todos los grupos de edad. Eficacia total 70% X Vacuna OMVs Bivalente Serogrupo B Instituto Finlay, Cuba GlaxoSmithKline, Bélgica OMVs B:4:P1.19,15 B:4:P1.7-2,4 Fase I completada Segura e inmunogénica. Induce Ac bactericidas. Cierto grado de reactividad cruzada con otras cepas. XI MenB-Bio Bio-Manguinhos/Fiocruz, Brasil OMVs B:4,7:P1.19,15 B:4,7:P1.7,1 LOS detoxificados Fase I completada Eventos adversos suaves o moderados. Títulos actividad bactericida: 55- 100% XII,XIII MonoMen® NVI, Holanda OMVs monovalentes Fase I completada HexaMen® NVI, Holanda OMVs de dos cepas recombinantes trivalentes Fase II completada Segura e inmunogénica. Diferente incremento de anticuerpos bactericidas contra PorAs incluidas. XIV,XV NonaMen® NVI, Holanda OMVs de tres cepas recombinantes trivalentes Fase I completada Bien tolerada e inmunogénica. XVII, XVII N. lactamica HPA, Reino Unido OMVs de N. lactamica Fase I completada Inmunogénica y segura. Escaso incremento de títulos de actividad bactericida. XVIII NOMVs WRAIR, USA OMVs nativas de cepa cápsula defectiva y con LOS no sializados Fase I Segura e inmunogénica. XIX Vacuna LOS detoxificados GlaxoSmithKline, Bélgica OMVs PorA- con sobreexpresión de los LOS L2, L3 y L7 detoxificados Ensayos preclínicos Genera respuesta bactericida. Alta reactividad cruzada. XX *Las referencias indicas en esta tabla se muestran en la página 221. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 53 - Vacunas basadas en proteínas recombinantes Vacuna Formulación Etapa de desarrollo actual Eficacia e inmunogenicidad Ref. rMenB Novartis GNA1030-GNA2132 GNA2091-fHbp NadA OMVs B:4:P1.7-2,4 Fase III Actividad bactericida en menores 1 año en el >93% de los casos contra las 3 cepas test. XXI, XXII rLP2086 Wyeth fHbp subfamilia A fHbp subfamilia B Fase I completada Respuesta dependiente de dosis. 87% respuesta bactericida contra 5 de 6 cepas ensayadas. Resultados en niños no disponibles. XIII, XIV rNspA NspA Fase I completada Poco inmunogénica en humanos. XXV Otros diseños se basan en OMVs de cepas mutantes defectivas en PorA y que sobreexpresan los lipooligosacáridos L3, L7 y L2 detoxificados por modificación genética104. En ambos casos se han obtenido buenos resultados de reactividad cruzada de los sueros obtenidos contra un panel de cepas heterólogas. Koeberling y colaboradores105 han mostrado que OMVs sobreexpresando las variantes V1 y V2 de la lipoproteína fHbp genera una mejor respuesta inmune que presentada como antígeno recombinante purificado. El desarrollo de inmunidad natural contra N. meningitidis está asociada a la adquisición de anticuerpos bactericidas durante el primer año de vida, período en el que la proporción de portadores de N. meningitidis es bajo. Sin embargo, en este rango de edad la proporción de portadores de la especie no patogénica N. 104 Weynants V, Denoël P, Devos N, Janssens D, Feron C et al. Genetically modified L3,7 and L2 lipooligosaccharides from Neisseria meningitidis serogroup B confer a broad cross-bactericidal response. Infect Immun. 2009; 77: 2084-2093. 105 Koeberling O, Giuntini S, Seubert A, Granoff DM. Meningococcal outer membrane vesicle vaccines derived from mutant strains engineered to express factor H binding proteins from antigenic variant groups 1 and 2. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16: 156-162. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 54 - lactamica es alto, indicando que la adquisición de inmunidad natural en niños pequeños podría ser resultado de la colonización de la nasofaringe por ésta y otras especies no patógenas de Neisseria, u otras especies bacterianas con antígenos de superficie cross-reactivos. Esta circunstancia, junto con la existencia constatada de numerosos antígenos de superficie que generan anticuerpos con reactividad cruzada entre N. meningitidis y N. lactamica106 y la no expresión de cápsula ni de la proteína inmunodominante e hipervariable PorA en N. lactamica, ha servido de fundamento para el desarrollo de una formulación basada en OMVs de N. lactamica por la Health Protection Agency (Reino Unido)107,108. Sin embargo, los sueros obtenidos en ensayos preclínicos no han mostrado actividad bactericida salvo con la cepa homologa, a pesar de existir reactividad cruzada. Los resultados mostraron que la protección observada en múridos frente a la bacteremia podría estar mediada por opsonofagocitosis109. Recientemente se han publicado resultados de los ensayos clínicos en fase I con adultos voluntarios, resultando ser una vacuna segura e inmunogénica, en la que la respuesta humoral presenta reactividad cruzada; sin embargo, los títulos de actividad bactericida obtenidos han sido poco alentadores110. El reciente avance de la genómica, la combinación entre el análisis in sílico de la secuencias nucleotídicas y el conocimiento de la genómica estructural y funcional, han posibilitado nuevas estrategias para una identificación y obtención 106 Troncoso G, Sánchez S, Moreda M, Criado MT, Ferreirós CM. Antigenic cross-reactivity between outer membrane proteins of Neisseria meningitidis and commensal Neisseria species. FEMS Immunol Med Microbiol. 2000; 27: 103-109. 107 Gorringe AR. Can Neisseria lactamica antigens provide an effective vaccine to prevent meningococcal disease? Expert Rev Vaccines. 2005; 4: 373-379. 108 Gorringe A, Halliwell D, Matheson M, Reddin K, Finney M et al. The development of a meningococcal disease vaccine based on Neisseria lactamica outer membrane vesicles. Vaccine. 2005; 23: 2210-2213. 109 Finney M, Vaughan T, Taylor S, Hudson MJ, Pratt C et al. Characterization of the key antigenic components and pre-clinical immune responses to a meningococcal disease vaccine based on Neisseria lactamica outer membrane vesicles. Hum Vaccine. 2008; 4: 23-30. 110 Gorringe AR, Taylor S, Brookes C, Matheson M, Finney M et al. Phase I safety and immunogenicity study of a candidate meningococcal disease vaccine based on Neisseria lactamica outer membrane vesicles. Clin Vaccine Immunol. 2009; 16: 1113-1120. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 55 - rápida de antígenos. La aproximación conocida como vacunología reversa111, 112 utiliza la secuencia del genoma completo del patógeno de interés para la identificación in sílico de nuevos antígenos, mediante la detección de genes codificantes para factores de patogenicidad y proteínas asociadas a membrana por algoritmos y herramientas computacionales específicos, cuya actividad es confirmada experimentalmente. Estos antígenos se denominan, en el caso de N. meningitidis, Genomic-derived Neisserial Antigen (GNA). Pizza M. y colaboradores, junto con el The Institute for Genomic Research han aplicado por primera vez esta estrategia con el objetivo de desarrollar una vacuna universal frente al serogrupo B. Tras secuenciar el genoma de la cepa MC58 (serogrupo B)9 y mediante el uso de herramientas computacionales se detectaron 600 posibles proteínas de membrana o secretables, de las cuales 355 fueron expresadas en sistemas heterólogos, purificadas y utilizadas para inmunizar ratones. De todos ellos se seleccionaron aquellos antígenos capaces de generar anticuerpos bactericidas, que presentasen una secuencia nucleotídica conservada en un panel de cepas representativo de diversidad genética global de la bacteria y que estuviesen presentes en los principales clones virulentos. Como resultado se obtuvo una mezcla de cinco antígenos (fHbp, NadA, GNA2132, GNA1030 y GNA2091) que son los componentes de la vacuna denominada 5CVMB. La proteína fHbp es un antígeno de características muy interesantes ya que induce anticuerpos bactericidas mediado por complemento y que inhiben la unión de factor H a la superficie bacteriana incrementando la susceptibilidad de la bacteria a la lisis por complemento humano41. Los anticuerpos contra la adhesina 111 Bambini S, Rappuoli R. The use of genomics in microbial vaccine development. Drug Discovery Today. 2009; 14: 252-60. 112 Serruto D, Serino L, Masignani V, Pizza M. Genome-based approaches to develop vaccines against bacterial pathogens. Vaccine. 2009; 27: 3245-3250. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 56 - expuesta en superficie NadA, involucrada en la interacción con las células epiteliales humanas, podría prevenir la colonización por el meningococo113. GNA2132 es una lipoproteína expuesta en superficie capaz de unir heparina, característica normalmente asociada al incremento de la adherencia a tejidos del huésped y resistencia al suero. Esta vacuna induce anticuerpos bactericidas en ratones contra el 78-90% de un panel del 85 cepas genéticamente diferentes114, es tolerable e inmunogénica en humanos. Los estudios en fase II demostraron que su reactividad cruzada es más limitada de lo esperada y por lo que se han incluido OMVs en su formulación. Actualmente se encuentra en ensayos clínicos Fase III115,116. Además de las mencionadas, otras proteínas de membrana, detectadas tanto por vacunología clásica como a partir del genoma, se encuentran en ensayos preclínicos o clínicos (tabla 2). Entre estas proteínas se incluyen numerosas adhesinas (Opc, Opa, NadA, App, Nhha o la proteína PiliQ), proteínas reguladas por hierro (TbpA y TbpB, LbpA y LbpB, FetA), y diversos antígenos derivados de genoma. 5. Epitopos conformacionales. Importancia de su estudio Los epitopos de macromoléculas como las proteínas, se clasifican normalmente en dos categorías, epitopos continuos o lineales y epitopos discontinuos o conformacionales. Los epitopos continuos están formados por un 113 Feavers IM, Pizza M. Meningococcal protein antigens and vaccines. Vaccine. 2009; 27: 42-50. 114 Giuliani MM, Adu-Bobie J, Comanducci M, Aricò B, Savino S et al. A universal vaccine for serogroup B meningococcus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103: 10834-10839. 115 Rappuoli R. The application of reverse vaccinology, Novartis MenB vaccine developed by design. 2008. En: 16th International Pathogenic Neisseria Conference, p:86 116 Serruto D, Giuliane M, Comanducci M, Aricó B, Savino S et al. A genome-based approach to identify novel Men B vaccine antigens. 2009. En: 2nd International workshop on Neisseria vaccines, p:12. Introducción al meningococo y la enfermedad meningocócica - 57 - solo segmento aminoacídico de la cadena polipeptídica capaz de unir anticuerpos específicos contra la proteína intacta. Los epitopos conformacionales, por el contrario, están constituidos por múltiples segmentos discontinuos que se reúnen físicamente en el antígeno plegado en su estructura nativa. La mayoría de los epitopos de proteínas nativas reconocidos por los linfocitos B son conformacionales (≈90%). Los linfocitos T, por el contrario, no reconocen antígenos proteicos nativos, sino epitopos correspondientes a péptidos lineales derivados del antígeno y presentados por el MCH117. Investigaciones recientes demuestran que epitopos inmunodominantes reconocidos por células B aparecen con las estructuras terciaria y cuaternaria de las proteínas, algunos de ellos solo detectables en los complejos multiméricos y no en sus subunidades individuales118. Los sueros inmunes obtenidos tras la inmunización con antígenos que han perdido su conformación nativa total o parcialmente, proporcionarán una información sesgada sobre su inmunogenicidad al no mantener todos los epitopos que estas moléculas presentan in vivo, y que pudieran ser determinantes en la adquisición de inmunidad natural frente a un determinado patógeno. Los complejos proteicos de membrana externa representan una fuente de epitopos conformacionales y ya ha sido demostrada, tanto en N. meningitidis119, 120 como en N. gonorrhoeae121, 122 la existencia de algunos antigénicos. 117 Arnon R, Van Regenmortel MH. Structural basis of antigenic specificity and design of new vaccines. FASEB J. 1992; 6: 3265-3274. 118 Ito HO, Nakashima T, So T, Hirata M, Inoue M. Immunodominance of conformation-dependent B-cell epitopes of protein antigens. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 308: 770-776. 119 Arakere G, Kessel M, Nguyen N, Frasch CE. Characterization of a stress protein from group B Neisseria meningitidis. J Bacteriol. 1993; 175: 3664-3668. 120 Sánchez S, Abel A, Arenas J, Criado MT, Ferreirós CM. Cross-linking analysis of antigenic outer membrane protein complexes of Neisseria meningitidis. Res Microbiol. 2006; 157: 136-142. 121 Newhall WJ, Wilde CE, Sawyer WD, Haak RA. High-Mr antigenic protein complex in the outer membrane of Neisseria gonorrhoeae, Infect. Immun. 1980; 27: 475–482. 122 Pannekoek Y, van Putten JPM, Dankert J. Identification and molecular analysis of a 63- kilodalton stress protein from Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. 1992; 174: 6928–6937. OBJETIVOS E INTERÉS DEL TRABAJO Objetivos e interés del trabajo - 61 - Hasta el momento, las únicas vacunas desarrolladas contra el serogrupo B que han demostrado ser eficaces han sido las vacunas de OMVs, resultando inmunogénicas y protectivas aunque presentan ciertos problemas como la restricción de cepa o la baja inmunogenicidad en niños pequeños. Gracias al importante desarrollo experimentado por la tecnología molecular y el creciente conocimiento de la biología y estructura del meningococo, ha sido posible abrir diversas estrategias en el diseño de nuevas vacunas más eficaces, aunque ninguna hasta el momento ha conseguido alcanzar los niveles de protección y cobertura deseados, por lo que la búsqueda de una formulación definitiva continúa. A pesar de la dificultad que ofrece este serogrupo para obtener antígenos válidos, un alto porcentaje de la población adulta presenta inmunidad natural, por lo que tienen que existir antígenos protectores responsables de esta inmunidad. Al contrario de lo que ocurre en los demás serogrupos contra los que ya existen vacunas eficaces, el polisacárido capsular B no es un buen candidato vacunal debido a su baja inmunogenicidad y al riesgo de generar reacciones autoinmunes tras su uso como tal a causa de su similitud estructural con moléculas humanas. Debido a estas circunstancias, los antígenos subcapsulares, principalmente proteínas de membrana externa y lipooligosacáridos, han acaparado toda la atención en los estudios de potencialidad vacunal de antígenos. Entre las distintas proteínas de membrana externa sometidas a estudio, se encuentran las porinas PorA y PorB, de gran importancia desde el punto de vista inmunogénico, especialmente la porina PorA, ya que es la principal responsable de la protección generada por las vacunas basadas en OMVs. Como han demostrado estudios anteriores en nuestro laboratorio, estas proteínas se encuentran en la membrana asociadas en complejos proteicos, formados por PorA, PorB y pudiendo estar acompañadas por otras proteínas como RmpM y FetA. Capítulo I. Introducción - 68 - condiciones ambientales y experimentales. A continuación revisaremos una serie de proteínas que, por su abundancia en la membrana, características inmunogénicas o su importancia en la biología y patogénesis del microorganismo, han sido estudiadas en profundidad. 1.1.1. Proteínas de clase Las proteínas de clase constituyen las proteínas más abundantes de la membrana externa de N. meningitidis, e incluyen proteínas de diversa función. Esta clasificación establece 5 clases estructurales127 de acuerdo con su peso molecular aparente, e incluyen las porinas PorA (clase 1) y PorB (clases 2 y 3), la proteína modificable por reducción o RmpM (clase 4) y las adhesinas Opa y Opc (clase 5). Porinas: las proteínas PorA y PorB pertenecen a la superfamilia de porinas de Gram-negativas128. Las porinas son canales acuosos que permiten el flujo pasivo de pequeñas moléculas, nutrientes y productos de desecho, generalmente de manera no específica y determinado por tamaño molecular. Las porinas se asocian típicamente en trímeros, en los que cada subunidad mantiene su estructura de canal coexistiendo, por lo tanto, tres canales por trímero (figura 5). Este tipo de estructura ha sido descrita en distintos organismos como Rhodobacter capsulatus129, Rhodopseudomonas blastica130, Escherichia coli131 o Neisseria meningitidis132. 127 Tsai CM, Frasch CE, Mocca LF. Five structural classes of major outer membrane proteins in Neisseria meningitidis. J Bacteriol. 1981; 146: 69-78. 128 Jeanteur D, Lakey JH, Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction. Mol. Microbiol. 1991; 5: 2153–2164. 129 Weiss MS, Schulz GE. Structure of porin refined at 1.8 A resolution. J Mol Biol. 1992; 227: 493- 509. Capítulo I. Introducción - 69 - Figura 5. Modelos tridimensionales de la porina PorA y de un homotrímero de PorAs. (a) Estructura de β-barril propuesto para la proteína de membrana externa PorA. Los bucles externos, indicados con números romanos (I a VIII), unen 16 láminas beta transmembrana giradas 36º respecto a los planos creados por las membranas. (b) Modelo propuesto para un trímero de PorAs. El bucle III (en el interior de cada canal, representado en líneas segmentadas) sería el responsable de las propiedades de canal. El bucle II ha sido propuesto como responsable de la estabilidad del trímero (imágenes tomadas de Derrick JP, 1999). 130 Kreusch A, Schulz GE. Refined structure of the porin from Rhodopseudomonas blastica. Comparison with the porin from Rhodobacter capsulatus. J Mol Biol. 1994; 243: 891-905. 131 Cowan SW, Schirmer T, Rummel G, Steiert M, Ghosh R et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 1992; 358: 727-733. 132 Tommassen J, Vermeij P, Struyvé M, Benz R, Poolman JT. Isolation of Neisseria meningitidis mutants deficient in class 1 (porA) and class 3 (porB) outer membrane proteins. Infect Immun. 1990; 58: 1355-1359. cara interna cara externa a b Capítulo I. Introducción - 70 - Las porinas de N. meningitidis poseen una serie de propiedades muy particulares como la apertura de canal a potenciales de membrana bajos, la capacidad de transferirse a otras membranas cuando la distancia es suficientemente pequeña y funcionalidad en membranas tanto en eucariotas como en procariotas. La proteína PorA o de clase I es exclusiva del meningococo dentro del género Neisseria. Sólo el gonococo comparte el gen porA aunque no lo expresa debido a mutaciones en su promotor133. Su nivel de expresión presenta una considerable variabilidad y está sometida a variación de fase, aunque se ha encontrado en todos los aislados meningococales. Presenta un peso molecular de entre 44 y 47 kDa en función de la cepa y su diversidad antigénica es la base del sistema de serotipado. Su estructura secundaria contiene una alta proporción de láminas-β (~36%) lo que le confiere un motivo estructural predicho en forma de β-barril134,135 (figura 5). Un total de ocho bucles externos (I a VIII) unen las regiones transmembrana, siendo los más largos y expuestos los bucles I, IV, V y VI, y en menor medida VII y VIII. Los bucles I y IV contienen las secuencias hipervariables VR1 y VR2136 respectivamente, donde se sitúan los epitopos de serotipado. Los lazos II y III, por el contrario, son conservados y se considera que juegan un papel estructural en el modelo tridimensional y en la funcionalidad del poro134. 133 Feavers IM, Maiden MC. A gonococcal porA pseudogene: implications for understanding the evolution and pathogenicity of Neisseria gonorrhoeae. Mol Microbiol. 1998; 30: 647-656. 134 Derrick JP, Urwin R, Suker J, Feavers IM, Maiden MC. Structural and evolutionary inference from molecular variation in Neisseria porins. Infect Immun. 1999; 67: 2406-2413. 135 Minetti CA, Tai JY, Blake MS, Pullen JK, Liang SM et al. Structural and functional characterization of a recombinant PorB class 2 protein from Neisseria meningitidis. Conformational stability and porin activity. J Biol Chem. 1997; 272: 10710-10720. 136 McGuinness BT, Lambden PR, Heckels JE. Class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis: epitope analysis of the antigenic diversity between strains, implications for subtype definition and molecular epidemiology. Mol Microbiol. 1993; 7: 505-514. Capítulo I. Introducción - 71 - La proteína PorB o de clase 2 y 3, de entre 37 y 42 kDa, son los productos de dos alelos del locus porB, siendo ambos mutuamente excluyentes en las distintas cepas de N. meningitidis. Las secuencias aminoacídicas de las dos versiones proteicas muestran una similitud del 60- 70%137. Al igual que PorA, contiene una alta proporción de láminas-β (~36%) y una conformación de β-barril. La estructura cuaternaria propuesta también es trimérica. Topológicamente, también presenta ocho lazos aunque en este caso con un menor grado de variabilidad. Los lazos II y IV son los más conservados y parecen estar comprometidos en la estabilidad del trímero138. El lazo II, también conservado se ha asociado a las propiedades de canal139. La proteína PorB posee características que indican un importante papel en la interacción patógeno-huésped, con diversos efectos en las células eucariotas como la formación de poros y la prevención de apoptosis de las células infectadas, modulando el potencial de membrana mitocondrial140. La RmpM (reduction modifiable protein M) o proteína de clase 4 ha sido descrita como proteína de membrana externa, aunque todavía no está claro cómo se asocia a ella. Su peso molecular es de 24 kDa aunque la rotura de sus dos puntes disulfuro en condiciones reductoras proporciona una movilidad electroforética en SDS-PAGE correspondiente a 32 kDa. La RmpM se encuentra altamente conservada en todos los serogrupos, manteniendo un 99% de identidad de secuencia. Su extremo C-terminal guarda una gran similitud con el dominio C-terminal de la proteína OmpA de 137 Minetti CA, Tai JY, Blake MS, Pullen JK, Liang SM et al. Structural and functional characterization of a recombinant PorB class 2 protein from Neisseria meningitidis. Conformational stability and porin activity. J Biol Chem. 1997; 272: 10710-10720. 138 Fourel D, Bernadac A, Pagès JM. Involvement of exposed polypeptide loops in trimeric stability and membrane insertion of Escherichia coli OmpF porin. Eur J Biochem. 1994; 222: 625-30. 139 Minetti CA, Blake MS, Remeta DP. Characterization of the structure, function, and conformational stability of PorB class 3 protein from Neisseria meningitidis. A porin with unusual physicochemical properties. J Biol Chem. 1998; 273: 25329-25338. 140 Massari P, Ram S, Macleod H, Wetzler LM. The role of porins in neisserial pathogenesis and immunity. Trends Microbiol. 2003; 11: 87-93. Capítulo I. Introducción - 72 - E. coli. Este dominio, encontrado en muchas proteínas de bacterias Gramnegativas, se ha sugerido que se asocia de manera no covalente con el peptidoglicano. La presencia de este dominio C-terminal de unión a peptidoglicano y la interacción descrita con proteínas integrales de membrana como la PorA y la PorB141, transportadores dependientes de TomB, TbpA y LbpA142, y la proteína Omp85 implicada en la biogénesis de OMPs, ha llevado a considerar una función intermediaria de anclaje de determinados complejos proteicos a la pared celular y estabilización de los mismos143. Las Opa y Opc, o proteínas de clase 5, desempeñan como principal función la adherencia e invasión de células epiteliales y endoteliales25. La estructura predicha para las proteínas Opa es de β-barril, con ocho láminas β transmembrana conectadas por lazos cortos en la cara intracelular, y lazos largos en la extracelular, ambos con carácter hidrofílico144. Los lazos expuestos en superficie presentan una región semivariable (SV) y dos regiones hipervariables (HV1 y HV2), presentando un considerable grado de variabilidad antigénica. Existe también gran variabilidad de expresión de estas proteínas debido a la presencia de 3-4 copias de los genes opa, situados en locus diferentes, sujetos a variación de fase y pudiéndose expresar ninguno, uno o varios de ellos145. La Opc es estructuralmente diferente a las proteínas Opa, pues contiene diez regiones transmembrana y cinco lazos 141 Jansen C, Wiese A, Reubsaet L, Dekker N, de Cock H et al. Biochemical and biophysical characterization of in vitro folded outer membrane porin PorA of Neisseria meningitidis. Biochim Biophys Acta. 2000; 1464: 284-298. 142 Prinz T, Tommassen J. Association of iron-regulated outer membrane proteins of Neisseria meningitidis with the RmpM (class 4) protein. FEMS Microbiol Lett. 2000; 183: 49-53. 143 Grizot S, Buchanan SK. Structure of the OmpA-like domain of RmpM from Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 2004; 51: 1027-1037. 144 Malorny B, Morelli G, Kusecek B, Kolberg J, Achtman M. Sequence diversity, predicted twodimensional protein structure, and epitope mapping of neisserial Opa proteins. J Bacteriol. 1998; 180: 1323-1330. 145 Taha MK, Deghmane AE. Informative talk between Neisseria meningitidis and host cells. En: Ferreirós CM, Criado MT, Vázquez J. (Eds.). Emenging Strategies In The Fight Against Meningitis: Molecular and Cellular Aspects. 2002; Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. Capítulo I. Introducción - 73 - expuestos en superficie146. Los niveles de expresión son también muy variables. 1.1.2. Proteínas de captación de hierro La adquisición de hierro es un factor determinante en la patogénesis de meningococo por ser un nutriente de vital importancia. La mayor parte del hierro del huésped se encuentra unido a proteínas de unión a hierro, tanto en ambiente intracelular como en fluidos corporales, por lo que N. meningitidis ha desarrollado sistemas de captación de hierro147, localizados en la membrana externa, capaces de utilizar el hierro transportado por la transferrina (complejo TbpAB), la lactoferrina (complejo LbpAB), la hemoglobina (sistema HmbR) y la haptoglobina-hemoglobina (complejo HpuAB), todos ellos transportadores TomB-ExbBD dependientes cuya expresión está regulada por fur teniendo al hierro como correpresor148,149,150,151. Además, esta especie presenta un receptor para sideróforo exógeno enterobactina (FetA)152. 146 Merker P, Tommassen J, Kusecek B, Virji M, Sesardic D et al. Two-dimensional structure of the Opc invasin from Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 1997; 23: 281-293. 147 Perkins-Balding D, Ratliff-Griffin M, Stojiljkovic I. Iron transport systems in Neisseria meningitidis. Microbiol Mol Biol Rev. 2004; 68: 154-171. 148 Legrain M, Mazarin V, Irwin SW, Bouchon B, Quentin-Millet MJ, Jacobs E et al. Cloning and characterization of Neisseria meningitidis genes encoding the transferrin-binding proteins Tbp1 and Tbp2. Gene. 1993; 130: 73-80. 149 Pettersson A, Prinz T, Umar A, van der Biezen J, Tommassen J. Molecular characterization of LbpB, the second lactoferrin-binding protein of Neisseria meningitidis. Mol. Microbiol. 1998; 27: 599-610. 150 Stojiljkovic I, Hwa V, de Saint Martin L, O'Gaora P, Nassif X, Heffron F, So M. The Neisseria meningitidis haemoglobin receptor: its role in iron utilization and virulence. Mol. Microbiol. 1995; 15: 531-541. 151 Lewis LA, Gray E, Wang YP, Roe BA, Dyer DW. Molecular characterization of hpuAB, the haemoglobin-haptoglobin-utilization operon of Neisseria meningitidis. Mol Microbiol. 1997; 23: 737-749. 152 Gorringe AR, Oakhill J. Neisseria meningitidis: Multiple Mechanisms To Acquire Iron. En: Ferreirós C., Criado M.T., Vázquez J. (Eds). Emerging Strategies In The Fight Against Meningitis: Molecular And Cellular Aspects. 2002. Horizon Scientifific Press, Wymondham, UK. Capítulo I. Introducción - 74 - Las proteínas TbpA y TbpB son un receptor de transferrina en la superficie del meningococo cuya expresión es inducida por condiciones de restricción de hierro. Este sistema capta el hierro transportado por la transferrina, y lo incluye en el periplasma, para ser posteriormente internalizado al citoplasma por el sistema FbpABC153. La estructura de TbpA (93-98 kDa) es de β-barril, conteniendo 22 láminas β transmembrana y 11 lazos extracelulares de distinta longitud154,155. La proteína TbpB se ha propuesto como una lipoproteína anclada a la membrana externa y que funcionaría junto con TbpA para formar el complejo receptor156 TbpAB. De manera similar, las proteínas LbpA y LbpB constituyen el receptor de lactoferrina LbpAB. Las proteínas LbpA y LbpB comparten similitudes con TbpA y TbpB, como una identidad aminoacídica del 25% y 33% respectivamente157,158,159, y una estructura de β-barril. Se ha sugerido que estas similitudes podrían deberse a un receptor ancestro común157. La proteína HmbR y el complejo HpuAB son dos sistemas independientes que reconocen y transportan al periplasma grupos hemo a partir de hemoglobina y hemoglobina-haptoglobina respectivamente. La proteína FetA es un receptor exógeno de sideróforos similar a la FepA, 153 Khun HH, Kirby SD, BC Lee. A Neisseria meningitidis fbpABC mutant is incapable of using nonheme iron for growth. Infect. Immun. 1998; 66: 2330-2336. 154 Buchanan SK. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Opin Struct Biol. 1999; 9: 455-461. 155 Koebnik R, Locher KP, Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 2000; 37: 239-253. 156 Gómez JA, Criado MT, Ferreirós CM. Cooperation between the components of the meningococcal transferrin receptor, TbpA and TbpB, in the uptake of transferrin iron by the 37- kDa ferric-binding protein (FbpA). Res Microbiol. 1998; 149: 381-387. 157 Gray-Owen SD, Schryvers AB. Bacterial transferrin and lactoferrin receptors. Trends Microbiol. 1996; 4: 185-191. 158 Pettersson A, Klarenbeek V, van Deurzen J, Poolman JT, Tommassen J. Molecular characterization of the structural gene for the lactoferrin receptor of the meningococcal strain H44/76. Microb Pathog. 1994; 17: 395-408. 159 Schryvers AB, Bonnah R, Yu RH, Wong H, Retzer M. Bacterial lactoferrin receptors. Adv Exp Med Biol. 1998; 443: 123-133. Capítulo I. Introducción - 75 - receptor exógeno de la enterobactina de E. coli. Al igual que el resto de transportadores de N. meningitidis presenta homología con las proteínas dependientes de TomB. 1.1.3. Otras proteínas Los pili tipo IV son proyecciones filamentosas retráctiles de la superficie celular del meningococo, involucradas en diversas funciones biológicas del meningococo como la adhesión a las células epiteliales de la nasofaringe humana, la captura de ADN extracelular o el movimiento espasmódico (twitching motility). Los pili son un polímero helicoidal de la proteína denominada PilE, que esconde sus residuos conservados hacia el interior mientras que las regiones hipervariables son expuestas a la superficie. Su síntesis requiere la participación de una compleja maquinaria para su ensamblaje en la membrana interna y translocación a la membrana externa. La Omp85 es una proteína de unos 88 kDa, evolutivamente conservada, que juega un papel fundamental en el ensamblaje de proteínas160,161 en la membrana externa y, posiblemente, también de lípidos162,163. Tal es su importancia que su gen codificante se haya presente en el genoma de todos los Gram-negativos secuenciados hasta el momento164 y en las mitocondrias de las células eucariotas. 160 Bos MP, Tommassen J. Biogenesis of the Gram-negative bacterial outer membrane. Curr Opin Microbiol. 2004; 7: 610-616. 161 Wu T, Malinverni J, Ruiz N, Kim S, Silhavy TJ et al. Identification of a multicomponent complex required for outer membrane biogenesis in Escherichia coli. Cell. 2005; 121: 235-245. 162 Genevrois S, Steeghs L, Roholl P, Letesson JJ, van der Ley P. The Omp85 protein of Neisseria meningitidis is required for lipid export to the outer membrane. EMBO J. 2003; 22: 1780-1789. 163 Doerrler WT, Raetz CR. Loss of outer membrane proteins without inhibition of lipid export in an Escherichia coli YaeT mutant. J Biol Chem. 2005; 280: 27679–27687. 164 Bredemeier R, Schlegel T, Ertel F, Vojta A, Borissenko L. et al. Functional and phylogenetic properties of the pore-forming beta-barrel transporters of the Omp85 family. J Biol Chem. 2007; 282: 1882-1890. Capítulo I. Introducción - 76 - 1.2. El estudio de los complejos proteicos de membrana El sistema de membrana es una de las estructuras más importantes en los sistemas biológicos conteniendo proteínas que juegan papeles cruciales en la actividad biológica. En base a los resultados de diversos trabajos genómicos se estima que las proteínas de membrana representan entre el 25 y el 30% de todas las proteínas codificadas. Es tal su importancia que más del 70% de los fármacos disponibles actúan a nivel de las proteínas de membrana165. Sin embargo, la investigación sobre proteínas de membrana permanece parcialmente explorada debido a diversas dificultades técnicas. La mayoría de las proteínas, tanto citoplasmáticas como de membrana, desempeñan su función mediante la interacción con otras proteínas a través de las denominadas interacciones proteína-proteína (IPPs). Existe una gran diversidad de IPPs, pudiéndose clasificar en función de su composición (homómeros si se da entre polipéptidos idénticos y heterómeros si son diferentes), del tiempo de vida del complejo (complejos transitorios o permanentes) o si son obligadas o no obligadas166. Las dificultades en la investigación de complejos proteicos de membrana radican en la propia naturaleza de las proteínas de membrana y la debilidad de las fuerzas que a menudo sostienen estas estructuras. En el estudio de este tipo de complejos, las condiciones fisicoquímicas experimentales son determinantes para permitir la interacción entre proteínas, ya sea para interacciones transitorias o para interacciones permanentes. Esta condición supone un obstáculo en el estudio del complexoma de un organismo o compartimento celular, ya que en función de las condiciones experimentales utilizadas se pueden producir falsos positivos y 165 Byrne B, Iwata S. Membrane protein complexes. Curr Opin Struct Biol. 2002 ; 12: 239-243. 166 Nooren IM, Thornton JM. Diversity of protein-protein interactions. EMBO J. 2003; 22: 3486- 3492. Capítulo I. Introducción - 77 - falsos negativos, resultando la elección de la técnica y la optimización de las condiciones en las que se desarrolla un punto crítico en el estudio de las IPPs. Las proteínas de membrana son altamente hidrofóbicas y tienen una o varias regiones transmembrana, estableciendo una estrecha relación con los lípidos de membrana para mantener la estabilidad del complejo. El aislamiento de los complejos proteicos normalmente requiere la disyunción de la membrana en la que se encuentran insertados. Las proteínas de membrana fuera de esta plataforma física tienden a la agregación, adsorción y precipitación en solventes acuosos, conllevando a una pérdida de muestra y dificultando su análisis con ciertas técnicas, como las electroforéticas. El ambiente lipídico que rodea a los complejos proteicos de membrana proporciona un ambiente hidrofóbico estable para las regiones intermembrana, favoreciendo la interacción entre ellas y estabilizando la estructura del complejo. Para el aislamiento y análisis de los complejos de membrana, se hace indispensable, por lo tanto, disponer de una serie de agentes que permitan la extracción y solubilización de estas hidrofóbicas estructuras del ambiente lipídico que los rodea minimizando en la medida de lo posible la alteración estructural de los mismos167. Los agentes caotrópicos y los detergentes son utilizados extensamente en biología molecular para la solubilización de proteínas. Los agentes caotrópicos son agentes desnaturalizantes que estabilizan estados desplegados de las proteínas mediante enlaces no covalentes (Ej. urea, thiourea). Los detergentes son moléculas anfipáticas que contienen dominios hidrofóbicos e hidrofílicos. Esta estructura permite su autoasociación (como la formación de micelas) uniéndose a superficies hidrofóbicas como las encontradas en los dominios transmembrana. Los detergentes, en un sentido amplio, imitan el comportamiento de los lípidos, y 167 Hooker BS, Bigelow DJ, Lin CT. Methods for mapping of interaction networks involving membrane proteins. Biochem Biophys Res Commun. 2007; 363: 457-461. Capítulo I. Introducción - 84 - Los complejos proteicos pueden, a su vez, asociarse para formar supercomplejos. Una 2-D en SDS-PAGE, como hemos visto, informa sobre las subunidades proteicas que forman un complejo proteico. Sin embargo, utilizando una 2-D con otro sistema nativo diferente, o el mismo variando las condiciones, es posible romper el supercomplejo en los distintos complejos que lo forman o , por otro lado, separar complejos solapados en la primera dimensión por tener el mismo tamaño molecular pero distinta composición. Como representa la figura 6c, hipotéticos complejos co-migrantes aislados en una 1-D hrCNE, podrían ser sometidos a una 2-D hrCNE/hrCNE en la que, utilizando una combinación o concentración diferente de detergentes, se generarían movilidades electroforéticas distintas. Capítulo I. Introducción - 85 - Figura 6. Esquema explicativo de la separación y análisis electroforético de complejos proteicos. a) La utilización de técnicas electroforéticas no desnaturalizantes (nativas), permite la separación en gel de proteínas y complejos proteicos por tamaño molecular (Cx1>Cx2>Cx3>Cx4). b) La primera dimensión nativa puede ser sometida a una segunda dimensión desnaturalizante, rompiendo los complejos en sus subunidades constituyentes. c) La aplicación de una segunda dimensión con un sistema nativo diferente al empleado en la primera, puede resolver la co-migración de complejos de tamaño molecular similar (Cx1 y Cx2). Segunda dimensión desnaturalizante Segunda dimensión no desnaturalizante 1-D no desnaturalizante Cx2 Cx3 Cx4 Cx1 a) b) c) Cx1 Cx2 Cx3 Cx4 Cx1 Cx2 Cx3 Cx4 SDS-PAGE Electroforesis nativa Electroforesis nativa Capítulo I. Introducción - 86 - 1.3.2. Otros métodos utilizados en el estudio de interacciones proteínaproteína Co-inmunoprecipitación: la co-inmunoprecipitación171,180 es una técnica diseñada para el análisis de las interacciones entre una proteína conocida y aquellas con las que pueda interaccionar, bien formando un complejo estable, bien interaccionando de manera transitoria con la suficiente afinidad. El método implica el uso de anticuerpos específicos contra una proteína específica que, al incubarse con una muestra proteica compleja, formarán inmunocomplejos anticuerpo-proteína específica. La proteína específica puede estar interaccionando con otras proteínas, por lo que participarán en el inmunocomplejo y podrán ser copurificadas. Las principales ventajas de la inmunoprecipitación son su especificidad, su relativa sencillez y la compatibilidad con la mayoría de métodos para análisis posteriores (SDS-PAGE, immunoblotting, espectrometría de masas, etc.). Sin embargo, la dificultad ocasional en la obtención de anticuerpos de alta especificidad y avidez reduce la capacidad de esta técnica. Cross-linking: las condiciones necesarias para aislar y purificar una determinada proteína son casi siempre diferentes a las que se dan in vivo. Tras la lisis de la célula o compartimiento celular, las proteínas son diluidas y expuestas a multitud de pequeñas moléculas que desestabilizan interacciones entre proteínas. El uso de agentes químicos de cross-linking180 es una vía para evitar la desestabilización de interacciones. Los agentes químicos cross-linker consisten en dos grupos reactivos unidos por un “brazo” molecular, solubles, pudiendo ser capaces de atravesar membranas lipídicas y fraccionables. El cross-linker se unirá covalentemente a dos péptidos a través de sus grupos reactivos, estabilizando las asociaciones presentes en el momento que se 180 Phizicky EM, Fields S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 1995; 59: 94-123. Capítulo I. Introducción - 87 - añade. Tras la estabilización de la interacción, las proteínas pueden ser separadas por SDS-PAGE, descomponiendo el complejo en sus partes constituyentes. El formaldehído es uno de los más utilizados debido a su escaso coste, su capacidad para inactivar proteasas y la escasa distancia entre los grupos reactivos (2 Å). Desafortunadamente, resultan estabilizadas tanto asociaciones específicas como inespecíficas, problema que se acentúa cuanto mayor sea la distancia entre los grupos reactivos del cross-linker. Fluorescencia por transferencia de energía resonante: los métodos basados en transferencia de energía resonante170, 181, denominados fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET) y bioluminiscencia por transferencia de energía resonante (BRET), permiten visualizar la interacción de proteínas en complejos proteicos en células vivas. Consisten en la transferencia de energía desde un cromóforo en estado activado, unido a una proteína conocida X, a una molécula aceptor, unida a una proteína conocida Y, resultando en el incremento de fluorescencia del aceptor si X e Y forman complejo. El rango efectivo de transferencia de energía se sitúa por debajo de los 10 nm, distancia similar al descrito para los complejos de proteínas multiméricos observados en los sistemas biológicos182. Aunque esta metodología no genera muchos falsos positivos, la tasa de falsos negativos es bastante alta ya que si las dos proteínas incógnita, compañeras de complejo, se encuentran separadas por más de 10 nm la transferencia de energía no será efectiva. Resonancia de plasmón superficial (SPR): SPR se basa en medición de los cambios registrados en el índice de refracción cuando se unen proteínas 181 Ciruela F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 2008; 19: 338-343. 182 Sheng M, Hoogenraad CC. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 2007; 76: 823-847. Capítulo I. Introducción - 88 - purificadas a una fase sólida.183 Esta aproximación está limitada a aquellas proteínas que pueden ser expresadas y purificadas y hay que tener en cuenta que la unión de una proteína a una fase sólida puede afectar a su capacidad para formar complejos. Etiquetas de afinidad: el uso de proteínas recombinantes etiquetadas permite el aislamiento y purificación de complejos proteicos in vivo por afinidad. Las proteínas son expresadas como proteínas quimera formadas por una proteína cebo y otra proteína (Ej.: GST, proteína de unión a manosa o péptido de unión a calmodulina) o una cadena corta de aminoácidos (Ej.: hexahistidina) a modo de etiqueta. Tras su expresión in vivo o su incubación con un lisado celular, la proteína cebo formará los correspondientes complejos proteicos y estos podrán ser recuperados por la unión de la etiqueta a un soporte sólido. Tras la elución de las proteínas, éstas pueden ser separadas por electroforesis en gel e identificadas por espectrometría de masas. Esta técnica resulta eficaz para proteínas que se expresan abundantemente en la célula184, o de cinética de disociación baja. Otra limitación de la técnica es la elevada tasa de falsos positivos debido a uniones inespecíficas a la proteína cebo o a la columna empleada para la purificación. El uso de proteínas artificiales genera por su parte una serie de problemas, la etiqueta puede interferir negativamente en la unión de algún componente del complejo, perdiendo información acerca del mismo. Si la etiqueta queda oculta en el interior del complejo, no podrá ser recuperado. La purificación por afinidad en tándem (TAP-Tag) reduce en gran medida las uniones no específicas en comparación con otras técnicas de afinidad. La etiqueta fusionada a la proteína específica consiste en dos 183 Cooper MA. Label-free screening of bio-molecular interactions. Anal Bioanal Chem. 2003; 377: 834–842. 184 von Mering C, Krause R, Snel B, Cornell M, Oliver SG, Fields S, Bork P. Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 2002; 417: 399-403. Capítulo I. Introducción - 89 - etiquetas de afinidad secuenciales separadas por un lugar de rotura de la proteasa de virus del mosaico del tabaco185, por lo que son necesarias dos columnas de afinidad para la purificación reduciendo el número de uniones inespecíficas. Las principales desventajas del método son la pérdida de proteínas de interacciones de baja afinidad durante los lavados y se requiere gran cantidad de material de partida para la purificación e identificación de subunidades poco representadas. Sistema de doble híbrido: el sistema de doble híbrido (Y2H) es un método ampliamente utilizado en el estudio de interacciones proteínaproteína. Y2H se basa en el hecho de que muchos activadores de expresión eucariotas tienen dos dominios funcionales distintos, uno de unión al promotor de la secuencia de ADN y otro activador de la transcripción. Utilizando levaduras como sistema de expresión heterólogo, se construyen dos plásmidos, uno codificando para la proteína cebo fusionada al dominio de unión a promotor y otro codificando para la proteína diana fusionada al dominio de activación de la transcripción. Tras la coexpresión de ambos plásmidos, la interacción de las proteínas cebo y diana induce la transcripción de un gen marcador en el núcleo. Esta metodología detecta interacciones in vivo y es sensible a interacciones transitorias, sin embargo se limita a interacciones binarias y presenta una tasa alta de falsos positivos186 (hasta el 50%) y falsos negativos187 (64%), requiriendo la comprobación de los resultados mediante otros métodos. Otra limitación de esta aproximación es la dificultad de 185 Rigaut G, Shevchenko A, Rutz B, Wilm M, Mann M, Séraphin B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 1999; 17: 1030-1032. 186 Sprinzak E, Sattath S, Margalit H. How reliable are experimental protein-protein interaction data? J Mol Biol. 2003; 11: 919-923. 187 Deng M, Mehta S, Sun F, Chen T. Inferring domain-domain interactions from protein-protein interactions. Genome Res. 2002; 12: 1540-1548. Capítulo I. Introducción - 90 - estudiar la interacción de proteínas con importantes dominios hidrofóbicos como las proteínas integrales de membrana, debido a la formación de agregados. Con el fin de solventar este problema se ha desarrollado la técnica mating-based split-ubiquitin system (mbSUS)188, en la que tras la interacción de las proteínas en la membrana se libera un factor de transcripción que inducirá a la transcripción de un gen marcador en el núcleo. En el presente capítulo estudiaremos el complexoma de membrana externa de la cepa H44/76 utilizando la electroforesis nativa hrCNE y las electroforesis bidimensionales hrCNE/hrCNE y hrCNE/SDS-PAGE seguidas de identificación de proteínas por espectrometría de masas. Los resultados se compararán con las cepas mutantes y heterólogas recogidas en la tabla 5. 188 Miller JP, Lo RS, Ben-Hur A et al. Large scale identification of yeast integral membrane protein interactions. 2005. Proc Nat Acad Sci USA; 102: 12123-12128. Capítulo I. Material y métodos - 91 - 2. MATERIAL Y MÉTODOS 2.1. Cepas bacterianas utilizadas y características Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo y sus características se describen en la tabla 5. Las cepas 3061, 3063, H44/76 y las cepas mutantes knock-out PorA-, PorB- y FetA- fueron cedidas por el Dr. I. M. Feavers (Division of Bacteriology, National Institute for Biological Standards and Control, South Mimm, Reino Unido). El mutante knock-out RmpM- fue cedido por el Dr. E. Rosenqvist (Division of Infectious Disease Control, Norwegian Institute of Public Health [NIPH], Noruega). La cepa salvaje H44/76 es la cepa vacunal utilizada por el Instituto Nacional Noruego de Salud Pública para desarrollar la vacuna de OMVs MenBvac90, y a partir de ésta se obtuvieron las cepas mutantes PorA-, PorB-, RmpM- y FetA-, defectivas en las proteínas de membrana externa PorA, PorB, RmpM y FetA respectivamente. La cepa NZ98/254, utilizada para el desarrollo de la vacuna de OMVs MeNZB189 fue cedida por la Dr.a D. R. Martin (Institute of Environmental Science and Research, Kenepuru Science Centre, Porirua, Nueva Zelanda). Las cepas Nm26 y NmP27 pertenecen de la colección del Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Farmacia (Universidad de Santiago de Compostela). La cepa N. meningitidis Nm26 fue aislada del líquido cefalorraquídeo de un paciente en el antiguo Hospital Xeral de Santiago. La cepa NmP27 procede de la orofaringe de un individuo sano de nuestra comunidad autónoma. 189 Oster P, Lennon D, O'Hallahan J, Mulholland K, Reid S et al. MeNZB: a safe and highly immunogenic tailor-made vaccine against the New Zealand Neisseria meningitidis serogroup B disease epidemic strain. Vaccine. 2005; 23: 2191-2196. Capítulo I. Material y métodos - 92 - La caracterización de las cepas de N. meningitidis de la colección del Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana de la USC (serogrupado, serotipado, subtipado y MLST) se realizó en el Laboratorio de Referencia de Meningococos del Centro Nacional de Microbiología, Virología e Inmunología Sanitarias, Instituto de Salud Carlos III (Madrid). Tabla 5. Relación de cepas utilizadas en este trabajo. Cepa Serogrupo Serotipo/ subtipo ST/ ET H44/76 B 15:P1.7,16 ST-32,ET-5 PorA- B 15: (-) ST-32,ET-5 PorB- B (-):P1.7,16 ST-32,ET-5 RmpM- B 15:P1.7,16 ST-32,ET-5 FetA- B 15:P1.7,16 ST-32,ET-5 NZ98/254 B 15:P1.7-2,4 ST-41 3061 B 4:P1.7-2,4 ST-41, Burst 5 3063 B 1:P1.22,14 ST-213, Burst 8 Nm26 B 4:P1.16 - NmP27 Aa 15:P1.7,16 - Aa: autoaglutinante 2.2. Conservación de las cepas Las bacterias fueron conservadas a -80 ºC, suspendidas en una solución estéril de leche descremada al 10% (p/v). A partir de los viales originales se realizó un aislamiento en estría en medio Choc-Iso. Tras incubar 24 horas a 37 ºC en atmósfera húmeda enriquecida en CO2 (5%), se realizó un césped a partir de una colonia aislada para ser incubado 8 horas en las condiciones anteriores. El césped fue recuperado y resuspendido en leche descremada y repartido en partes alícuotas de 300 µL. Capítulo I. Material y métodos - 93 - 2.3. Condiciones de cultivo A partir de dos céspedes bacterianos crecidos en medio Choc-Iso enriquecido con Biovitex al 1% (Biolife, Milán, Italia), se preparó una suspensión bacteriana en medio líquido Müeller-Hinton (Oxoid, Unipath Ltd. Basingstoke, Hamshire, Reino Unido) ajustada a unos valores de absorbancia a 540 nm de entre 1,6 y 1,8. A partir de esta suspensión se inocularon 8 mL en un matraz de 2 L con 400 mL de medio líquido Müeller-Hinton al que se le añadió Desferal (Deferoxamina mesilato [Sigma-Aldrich, Inc., Saint Louis, Missouri, EEUU]) como quelante de hierro a una concentración de 100 μM con el fin de obtener condiciones de restricción de hierro. La incubación se realizó a 37 ºC en baño termostático con agitación de vaivén (70 oscilaciones por minuto) durante 12 horas, momento en el que se alcanzó la fase exponencial tardía de la curva de crecimiento. 2.4. Obtención de las vesículas de membrana externa (OMVs) 2.4.1. Extracción de OMVs con Prensa de French Las OMVs se obtuvieron siguiendo una variación del protocolo descrito por Gómez y colaboradores156. Tras 12 horas de incubación, se procedió a la muerte de las células por calor, sumergiendo los matraces en un baño a 56 ºC durante una hora. Las células se recuperaron por centrifugación (10 minutos, 10 000 x g, 4 ºC). La pellet resultante se resuspendió en agua MilliQ a razón de 4 mL por cada gramo de pellet (peso húmedo), para finalmente ser sometidas a 3 pases por Prensa de French a una presión de 1,1x105 kPa. El material obtenido se centrifugó durante 10 minutos a 10 000 x g y 4 ºC para precipitar células enteras y restos celulares. El sobrenadante se ultracentrifugó (10 minutos, 200 000 x g, 4 ºC) y el precipitado se resuspendió en agua MilliQ con azida sódica al 0,02% (p/v). La concentración de proteína se Capítulo I. Material y métodos - 100 - solo lugar de rotura perdido, y una desviación de masa de 20 ppm y 0,1 Da por fragmento. Análisis por MALDI-TOF: el analizador utilizado fue un espectómetro Reflex IV MALDI-TOF-MS (Bruker). Los programas informáticos utilizados para el control del equipo y la evaluación de los espectros generados fueron FlexControl 2.4 y FlexAnalisis 2.4 (Bruker), respectivamente. Los puntos cortados del gel se digirieron con tripsina para posteriormente cargar 0,5 µL de muestra en una placa AnchorChip MTP384-600 (Bruker) y ser cubiertos con 0,5 µL de una matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico. En la adquisición de datos, la lista de picos se generó a partir de un mínimo de 200 disparos de láser. Para la búsqueda en las bases de datos se utilizó MASCOT v. 2.2.06 como motor de búsqueda. La tolerancia en la desviación de la masa de los péptidos fue 50-100 ppm. Las bases de datos utilizadas para la identificación de las proteínas fueron MSDB y Swiss-Prot. Capítulo I. Resultados - 101 - 3. RESULTADOS 3.1. Análisis electroforético 1-D hrCNE Con el fin de analizar el complexoma de membrana externa de Neisseria meningitidis, los complejos proteicos presentes en vesículas de membrana externa fueron separados por electroforesis nativa hrCNE, empleando como modelo la cepa H44/76. En la figura 7 se muestran los perfiles de bandas obtenidos con los tampones de cátodo descritos (tampón DDM, que incluye el detergente aniónico DOC y el detergente neutro DDM, y el tampón TX100, en el que se sustituye el DDM por TX100). Ambos perfiles mostraron diferencias significativas en cuanto al número y posición de las bandas, donde únicamente 3 (denominadas en la figura como bandas D1, D2 y D3 en el perfil obtenido con DDM, y como T1, T2 y T3 en el obtenido con TX100) mostraron el mismo peso molecular, independientemente de la combinación de detergentes presente en el tampón de cátodo. Estas 3 bandas mostraron un peso molecular de 740, 540 y 470 kDa respectivamente. Otras siete bandas relevantes (D4 a D10 y T4 a T10) mostraron una movilidad diferente en función del tampón de cátodo utilizado, alcanzando unos pesos moleculares de entre 220 y 140 kDa cuando se utilizó el tampón DDM, y de entre 470 y 230 kDa cuando se utilizó TX100. Además, en ambos casos, también se observó un número variable de bandas de menor peso molecular, algunas de ellas relevantes y bien definidas como las bandas D11, D12, T11, T12, T13, T14 y T15. 3.2. Análisis electroforético 2-D hrCNE/hrCNE Con el propósito de resolver posibles co-migraciones de complejos proteicos y determinar qué complejos proteicos forman las principales bandas detectadas Capítulo I. Resultados - 102 - en las primeras dimensiones obtenidas, las OMVs se sometieron a un análisis electroforético bidimensional nativo/nativo en el que se realizaron secuencialmente dos electroforesis hrCNE, utilizando alternativamente los tampones de cátodo DDM y TX100 tal y como se describe en el apartado de material y métodos 2.8. La figura 8 muestra los mapas bidimensionales obtenidos con las dos secuencias de tampones, DDM en la primera dimensión y TX100 en la segunda dimensión (figura 8, imagen i) y viceversa (figura 8, imagen ii). Figura 7. Perfil electroforético de la 1-D hrCNE de OMVs de la cepa H44/76 obtenidos con los detergentes DDM o TX100 incluidos en el tampón de cátodo. A la derecha de cada prefil se muestra el peso molecular de las principales bandas, detectadas según su densidad óptica con el programa informático QuantityOne. Capítulo I. Resultados - 103 - Figura 8. Análisis hrCNE/hrCNE de OMVs meningocócicas utilizando DDM en el tampón de cátodo para la separación nativa de complejos en la primera dimensión, y Triton X-100 en la segunda (imagen i) y viceversa (imagen ii). Los recuadros de la derecha (A y B) muestran la representación Gaussiana de los principales complejos de porinas, obtenidas por tratamiento de imágenes y coloreadas de verde y rojo respectivamente. La imagen B fue volteada horizontalmente y girada 90º en el sentido de las agujas del reloj para posteriormente superponer sobre la imagen A, coincidiendo en dirección y sentido la secuencia de detergentes utilizada en la separación de los complejos. Las regiones superpuestas aparecen en negro mientras que las no coincidentes mantienen su color original. Los números corresponden a los complejos Cx1 a Cx9 de la tabla 6. D1 a D10 y T1 a T10 designan las principales bandas detectadas en la 1-D hrCNE utilizando DDM o Triton X-100, respectivamente. Capítulo I. Resultados - 104 - En cada uno de los mapas bidimensionales representados, cada punto corresponde a un complejo proteico aislado. En las composiciones i e ii de la figura 8, se dispuso, a modo de ejes de coordenadas, la imagen de la correspondiente primera dimensión en la parte superior de los geles (eje X), y a la izquierda una imagen de la 1-D obtenida con el segundo tampón (eje Y), para así poder determinar en qué banda de cada una de las 1-D se sitúan los diferentes complejos analizados. Por ejemplo, en la figura 8i, se muestra el mapa bidimensional obtenido empleando DDM en la 1-D y TX100 en la 2-D. En la parte superior se colocó la imagen de una 1-D obtenida con DDM (homóloga a la utilizada para obtener dicha 2-D), y a la izquierda la imagen de una 1-D obtenida con TX100. Por lo explicado anteriormente, el punto denominado CxChap estaría presente en la banda D1 de la 1-D con DDM y en la banda T1 de la 1-D con TX100. En la tabla 6 se indican las bandas en las que se sitúan los complejos CxChap, CxGlu, CxKet, Cx1, Cx2, Cx3, Cx4, Cx5, Cx6, Cx7, Cx8 y Cx9 en ambas primeras dimensiones. En los dos mapas bidimensionales los puntos observados se agrupan en dos categorías, aquellos cuya movilidad electroforética no dependió del tipo de detergentes presentes en los tampones de cátodo utilizados, reconocibles en el gel por aparecer alineados dibujando una línea diagonal, y aquellos cuya movilidad electroforética sí varió en función del tampón de cátodo, situados por encima o por debajo de dicha diagonal como resultado de una menor o mayor movilidad otorgada por el segundo tampón. Los complejos denominados CxChap, CxGlu y CxKetol se detectaron en ambos geles bidimensionales en la diagonal, mientras que los complejos de porinas Cx1 a Cx9 se situaron bien por encima de la diagonal cuando la secuencia de tampones fue DDM→TX100 (figura 8i) bien por debajo de la diagonal cuando la secuencia fue TX100→ DDM (figura 8ii). Las imágenes digitales de las áreas recuadradas A y B (figura 8iii), que contienen los puntos 1, 2,...9 de ambos análisis bidimensionales fueron tratadas Capítulo I. Resultados - 105 - aplicando una representación gausiana de los puntos y un filtro de detección de bordes por diferencia de Gausianas con el fin de simplificar la imagen. Los complejos separados siguiendo la secuencia de tampones DDM en la 1-D y TX100 en la 2-D, aparecen coloreados en verde (recuadro A), y los complejos separados siguiendo la secuencia inversa se muestran en color rojo (recuadro B). El recuadro B se reorientó de manera que la secuencia de tampones empleados en A y B coincidan en dirección y sentido. Ambas figuras se superpusieron y combinaron de manera que las áreas superpuestas aparezcan ennegrecidas y las no coincidentes mantengan su color original, verde o rojo. Tras dicha superposición, los 9 complejos aparecieron en color negro, confirmando que la posición relativa entre los 9 complejos es la misma en ambas electroforesis bidimensionales. 3.3. Identificación de proteínas por LC-MS/MS Del total de puntos detectados, los denominados CxChap, CxGlu, CxKetol, Cx1, Cx2, Cx3, Cx4, Cx5, Cx6, Cx7, Cx8 y Cx9 fueron cortados del gel para su análisis por espectrometría de masas mediante nanoLC-MS/MS. Las proteínas identificadas en cada complejo se muestran en la tabla 6. Los complejos proteicos CxChap, CxGlu y CxKetol están formados por un único tipo de proteína, la proteína chaperonina de 60 kDa (Chap), la glutamina sintetasa (Glu) y la cetol-ácido reductoisomerasa (Ket) respectivamente. Los complejos proteicos Cx1 a Cx9 están formados por porinas en los que la proteína de clase 3 o porina PorB está presente en todos ellos, pudiendo estar acompañada por la porina PorA y la proteína de clase 4 o RmpM. De este modo los complejos Cx1 y Cx2 están formados únicamente por la proteína PorB, los complejos Cx3, Cx4, Cx5, Cx6 y Cx7 son heterómeros de PorA y PorB, y los complejos Cx8 y Cx9 formados por las proteínas PorA, PorB y RmpM. Capítulo I. Resultados - 106 - Tabla 6. Identificación por LC-MS/MS de los componentes de los principales complejos proteicos detectados por electroforesis diagonal hrCNE/hrCNE. Los nombres de los complejos se corresponden con los utilizados en la figura 8. Las coberturas de secuencia y los códigos de identificación en las bases de datos TIGR y GenBank son los correspondientes a los genes homólogos de la cepa MC58. En las columnas 2 y 3 se muestra la correspondencia de los com p le j os con las bandas en las q ue se encuentran en el análisis 1-D hrCNE. DDM Triton X-100 Código de identificación Complejo Banda Peso molecular (kDa) Banda Peso molecular (kDa) Identificación Péptidos Score (XC) ΔCN Cobertura de secuencia (%) TIGR GenBank CxChap D1 740,0 T1 740,0 60 kDa chaperonin 19 5,34 0,37 35 NMB_1972 AAF42301.1 CxGlu D2 540,0 T2 540,0 glutamine synthetase 4 3,41 0,35 9 NMB_0359 AAF40802.1 CxKet D3 470,0 T3 470,0 ketol-acid reductoisomerase 4 5,26 0,47 34 NMB_1574 AAF41927.1 Cx1 D10 145,0 T10 390,0 PorB 24 5,27 0,36 68 NMB_2039 AAF42360.1 Cx2 D9 154,0 T10 390,0 PorB 20 5,09 0,47 76 NMB_2039 AAF42360.1 PorA 3 4,70 0,55 12 NMB_1429 AAF41790.1Cx3 D8 170,0 T9 360,0 PorB 16 5,51 0,48 64 NMB_2039 AAF42360.1 PorA 5 4,94 0,49 18 NMB_1429 AAF41790.1Cx4 D9 154,0 T8 320,0 PorB 10 4,47 0,41 39 NMB_2039 AAF42360.1 PorA 12 5,46 0,48 41 NMB_1429 AAF41790.1Cx5 D8 170,0 T8 320,0 PorB 15 4,60 0,46 57 NMB_2039 AAF42360.1 PorA 6 4,62 0,46 22 NMB_1429 AAF41790.1Cx6 D7 180,0 T7 310,0 PorB 16 4,76 0,36 50 NMB_2039 AAF42360.1 PorA 11 4,36 0,45 39 NMB_1429 AAF41790.1Cx7 D6 200,0 T6 300,0 PorB 13 3,99 0,42 48 NMB_2039 AAF42360.1 PorA 3 4,02 0,42 11 NMB_1429 AAF41790.1 PorB 15 4,87 0,58 48 NMB_2039 AAF42360.1 Cx8 D6 200,0 T5 250,0 RmpM 3 3,65 0,23 17 NMB_0382 AAF40822.1 PorA 11 5,32 0,50 33 NMB_1429 AAF41790.1 PorB 15 5,61 0,48 46 NMB_2039 AAF42360.1 Cx9 D5 216,0 T4 390,0 RmpM 3 2,32 0,38 12 NMB_0382 AAF40822.1 Capítulo I. Resultados - 107 - 3.4. Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE y MALDI-TOF Las OMVs fueron sometidas a una análisis electroforético bidimensional desnaturalizante, en el que los complejos proteicos separados por hrCNE se sometieron a una electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE (2-D hrCNE/SDSPAGE). Los mapas proteicos generados a partir de las primeras dimensiones obtenidas mediante hrCNE con los tampones DDM y TX100 se muestran en la figura 9 (imágenes A y B respectivamente). Las flechas de la figura indican la dirección y sentido de migración de los complejos/proteínas en cada una de las dimensiones. Los principales puntos de cada gel fueron cortados y analizados por espectrometría de masas mediante huella peptídica MALDI-TOF para la identificación de proteínas. En base a los resultados obtenidos a partir de cinco geles (réplicas), se analizaron un total de 151 puntos, de los cuales 80 resultaron en una identificación fiable (45 presentes en los geles 2-D obtenidos a partir de la primera dimensión con detergente DDM y 35 presentes en los geles 2-D obtenidos a partir de la primera dimensión con detergente Triton X-100). Capítulo I. Resultados - 108 - Figura 9. Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE de OMVs meningocócicas utilizando DDM (A) o Triton X-100 (B) en el tampón de cátodo para la separación nativa en la primera dimensión. Todos los puntos identificados por MALDI-TOF y reconocidos como proteínas asociadas a membrana están indicados en la figura con números y su identificación está referida a la tabla 7. Las proteínas que aparecen como múltiples puntos en una horizontal se señalan dentro de un rectángulo. Capítulo I. Resultados - 109 - Debido a la coincidencia de muchos de los puntos entre los dos tipos geles y la presencia en múltiples puntos en una horizontal (trails) de algunas de las proteínas (como las porinas PorA y PorB), los 80 puntos pertenecen únicamente a 46 proteínas diferentes. De éstas, un total de 29 (marcadas en la figura 9 y recogidas en la tabla 7) son proteínas cuya localización predicha es la membrana externa o periplasma, están asociadas a membrana externa o han sido detectadas repetidamente en otros estudios proteómicos de OMVs124,125,194,195. A su vez, 17 de ellas se encontraron en ambos tipos de geles, 9 únicamente en geles obtenidos con DDM y 3 sólo en los geles obtenidos con Triton X-100. La tabla 8 recoge las proteínas identificadas cuya localización, según las bases de datos públicas (SwissProt), es citoplasmática. La electroforesis 2D hrCNE/SDS-PAGE, junto con la identificación de las proteínas, permitió la identificación de complejos proteicos y su posible composición siguiendo la regla aceptada para este tipo de geles según la cual los puntos alineados verticalmente en el gel y de similar forma son potencialmente subunidades del mismo complejo proteico. En las figuras 10 y 11 se muestran los complejos proteicos detectados siguiendo esta metodología a partir de geles obtenidos con DDM y Triton X-100 respectivamente. Comenzando por la figura 10, en el cuadro b se muestra la composición proteica de los complejos de porinas presentes en las bandas D4 a D10. Bajo las bandas D5, D6 se dispusieron alineadas verticalmente las proteínas PorA, PorB y RmpM, debajo de las bandas D7, D8 y D9 las proteínas PorA y PorB, y bajo la banda D10 únicamente PorB, coincidiendo con la composición de los complejos 194 Ferrari G, Garaguso I, Adu-Bobie J, Doro F, Taddei AR et al. Outer membrane vesicles from group B Neisseria meningitidis ∆gna33 mutant: Proteomic and immunologicalcomparison with detergent-derived outer membrane vesicles. Proteomics 2006; 6: 1856-1866. 195 Uli L, Castellanos-Serra L, Betancourt L, Domínguez F, Barberá R et al. Outer membrane vesicles of the VA-MENGOC-BC vaccine against serogroup B of Neisseria meningitidis: Analysis of protein components by two dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Proteomics 2006; 6: 3389-3399. Capítulo I. Resultados - 116 - Figura 11. Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE de OMVs utilizando TX100 en el tampón de cátodo para la separación nativa en la primera dimensión. Los recuadros a y b corresponden a zonas ampliadas del gel superior, que incluyen los componentes proteicos de los complejos separados en la 1-D donde las proteínas situadas en la vertical (líneas de puntos) desde la posición inicial del complejo, son potencialmente subunidades de dicho complejo. Capítulo I. Resultados - 117 - 3.5. Caracterización de complejos proteicos de las cepas mutantes PorA-, PorB-, RmpM- y FetA- La colaboración con otros grupos de investigación nos ha permitido disponer de cepas mutantes defectivas en las proteínas PorA, PorB, RmpM y FetA. Los estudios de los complejos proteicos de la membrana externa de estas cepas ofreció una valiosa información acerca de los complejos proteicos en los que participan las proteínas defectivas en cada mutante por comparación con la cepa homóloga salvaje H44/76. Con este fin, los complejos proteicos y proteínas presentes en OMVs de las cepas mutantes fueron sometidas a electroforesis 2-D hrCNE/SDS-PAGE, mostrando los resultados en la figura 12. Los complejos proteicos CxChap, CxGlu y CxKet no mostraron variación en su tamaño molecular en ninguna de las cuatro cepas mutantes, manteniendo su peso molecular observado de 740, 540 y 470 kDa respectivamente. Con la excepción de la cepa FetA-, cuyo mapa 2-D hrCNE/SDS-PAGE no mostró diferencias con el de la cepa salvaje, los mapas generados por las OMVs mutantes PorA-, PorB- y RmpM mostraron importantes diferencia entre sí y respecto al de la cepa salvaje. El mutante PorA- mostró un aumento en la intensidad de los puntos correspondientes a los complejos homoméricos de PorB. En el mapa 2-D hrCNE/SDS-PAGE a partir de DDM, el número de complejos proteicos con RmpM se reduce a uno, tanto en los geles tratados con DDM en la 1-D como en los tratados con TX100, que estaría formado por PorB y RmpM. Los complejos proteicos de porinas de alto peso molecular resultaron menos evidentes o inexistentes. Capítulo I. Resultados - 118 - Figura 12. Análisis electroforético 2-D hrCNE/SDS-PAGE de OMVs de la cepa salvaje H44/76 y las cepas mutantes knock-out defectivas en las proteínas PorA, PorB, RmpM o FetA. Los análisis del panel de la izquierda se realizaron empleando DDM en el tampón de cátodo para la separación nativa de los complejos en la primera dimensión. Los situados en el panel de la izquierda fueron realizados utilizando Triton X-100. Únicamente se muestran las regiones conteniendo los componentes de los complejos de porinas. Capítulo I. Resultados - 119 - El mutante PorB- resultó ser el mutante que más diferencias presentó respecto a la cepa salvaje. A pesar de que la PorA se encontró bajo la región correspondiente a los complejos de porinas de la cepa salvaje, la gran mayoría de PorA se situó formando dos complejos de alto peso molecular, entorno a los 700 kDa, tanto en las 2-D resultantes tras la 1-D con DDM como con TX100. El mutante RmpM- mostró un aumento de la intensidad de los puntos correspondientes a los complejos homoméricos de PorB y heteroméricos PorA/PorB, no detectándose ni PorA, ni PorB bajo la posición correspondiente a los heterómeros PorA/PorB/RmpM de la cepa salvaje. 3.6. Caracterización de complejos proteicos en cepas heterólogas Tras el análisis cualitativo de los complejos proteicos de membrana de la cepa H44/76, se sometieron a análisis electroforético las OMVs de las cepas heterólogas NZ98/254, 3061, 3063, Nm26 y NmP27, prestando una especial atención a los complejos de porinas. Para ello, los complejos proteicos presentes en las OMVs de dichas cepas se analizaron por electroforesis nativa 1-D hrCNE y por electroforesis 2D hrCNE/hrCNE y 2-D hrCNE/SDS-PAGE. En la figura 13 se comparan los perfiles electroforéticos obtenidos con las OMVs de las cepas mencionadas mediante hrCNE, utilizando el tampón de cátodo conteniendo DDM. Todos los perfiles mostrados proceden del mismo gel de poliacrilamida. Los complejos CxChap, CxGlu y CxKet se detectaron en la seis cepas heterólogas, sin existir ninguna diferencia significativa en su movilidad electroforética, tal y como indica la perfecta coincidencia en su peso molecular. Capítulo I. Resultados - 120 - Figura 13. Análisis electroforético 1-D hrCNE, con DDM en el tampón de cátodo, de OMVs de la cepa modelo H44/76 y 5 cepas heterólogas. Capítulo I. Resultados - 121 - Los complejos de porinas sí mostraron diferencias en cuanto al número y posición de bandas, si bien todas se detectaron dentro del rango de peso molecular de 130 a 250 kDa. A partir de las primeras dimensiones obtenidas se realizó una segunda dimensión nativa, en la que se empleó el tampón de cátodo con el detergente TX100, para resolver los posibles complejos co-migrantes, y una segunda dimensión desnaturalizante nativa mediante SDS-PAGE para estudiar la composición proteica de los complejos presentes en las bandas detectadas, tal y como se hizo con la cepa H44/76. En la figura 14 se muestra una composición de imágenes correspondientes a esta secuencia de electroforesis realizadas con cada una de las cepas heterólogas. Las imágenes de los geles están dispuestas de tal modo que en la línea vertical que desciende desde cada una de las bandas de la 1-D hrCNE se sitúan los complejos que forman dicha banda (2-D hrCNE/hrCNE), y las proteínas individuales que componen dichos complejos (2-D hrCNE/SDS-PAGE). Los mapas obtenidos con cada cepa fueron muy similares a los de la cepa modelo H44/76. Tras la electroforesis 2-D hrCNE/hrCNE en todas las cepas, los complejos CxChap, CxGlu y CxKet se situaron en la diagonal dibujada por las proteínas complejos con igual movilidad en ambos tampones, del mismo modo que en la cepa H44/76. Por su parte, los complejos de porinas se situaron por encima de la diagonal, como ocurre con la cepa modelo con esta secuencia de tampones. El número de complejos de porinas varió en cuanto a número aunque su composición proteica, como muestra la segunda dimensión desnaturalizante, fue similar presentando en todas ellas complejos formados por PorB, PorA/PorB, y PorA/PorB/RmpM (en la figura indicados como B, AB, y ABR, respectivamente). Además, también se encontraron asociaciones homoméricas de PorA y heterómeros PorB/RmpM (indicados como A y BR). Capítulo I. Resultados - 122 - Figura 14. Análisis de los principales complejos proteicos de membrana externa de la cepa H44/76 y las cinco cepas heterólogas mediante la primera dimesión nativa, la segunda dimensión nativa y la segunda dimensión desnaturalizante (en la figura indicadas como: 1-D hrCNE DDM, 2-D hrCNE/hrCNE, 2-D hrCNE/SDS, respectivamente). Capítulo I. Resultados - 123 - Las cepas NZ98/254, 3061, Nm26 y NmP27 fueron las que mostraron una mayor similitud a la cepa modelo. La composición proteica de los complejos de porinas se dedujo a partir de la bidimensional desnaturalizante, existiendo 5 tipos de asociaciones entre los componentes de los poros de porinas estudiados en la cepa H44/76. Estas combinaciones son, de menor a mayor peso molecular, homómeros de PorB y heterómeros de PorA/PorB, homómeros de PoaA, y heterómeros de PorB/RmpM y PorA/PorB/RmpM. Debido a baja cantidad de los homómeros de PorA y su similar tamaño con los complejos PorB/RmpM, los homómeros de PorA solo se detectaron claramente en las cepas NZ98/254 y 3061. La cepa 3063 presentó 6 complejos de porinas en los que su composición es muy similar a las anteriores, homómeros de PorB y heterómeros de PorA/PorB, de PorB/RmpM y PorA/PorB/RmpM. En las cinco cepas heterólogas se detectó un único punto bajo los complejos CxChap, CxGlu y CxKet correspondientes a las proteínas que componen dichos complejos: chaperonina, glutamina sintetasa y cetol-ácido reductoisomerasa. La proteína MIP fue detectada en las 5 cepas heterólogas (NZ98/254, 3061, 3063, Nm26 y NmP27), y su asociación a complejos de porinas de alto peso molecular no se pudo concluir debido a la similitud en tamaño de la RmpM. Capítulo I. Discusión - 125 - 4. DISCUSIÓN Los trabajos publicados con anterioridad sobre complejos proteicos de N. meningitidis se han centrado en complejos proteicos específicos, como los pili36, receptores de proteínas transportadoras de hierro156,159, síntesis de membrana196 o complejos de porinas135,139,197,198. Estos estudios se han realizado con técnicas electroforéticas desnaturalizantes adaptadas al estudio de complejos, como la SDS-PAGE con bajo contenido de SDS o con solubilización de las proteínas a baja temperatura, y mediante la utilización de cepas mutantes. En el caso de los complejos de porinas, la mayoría de los estudios sobre estructura y función se han llevado a cabo utilizando bien porinas recombinantes (rPorA o rPorB) insertadas en membranas lipídicas artificiales141,197 o bien porinas purificadas de cepas mutantes deficientes en una de las dos porinas198. En base a estos estudios, junto con la similitud a porinas de otras bacterias Gramnegativas, se ha asumido que existen en la membrana externa como homotrímeros, tanto de PorA como de PorB. Los consiguientes trabajos de funcionalidad han sido realizados en base a esta asunción. Sin embargo, existen otras evidencias que sugieren que las porinas meningocócicas también se asocian normalmente como heterotrímeros. En trabajos previos en nuestro laboratorio, se analizó el complexoma de las vesículas de membrana externa utilizando las técnicas electroforéticas SDS-PAGE diagonal199 y BNE200, que permitieron 196 Volokhina EB, Beckers F, Tommassen J, Bos MP. The beta-barrel outer membrane protein assembly complex of Neisseria meningitidis. J Bacteriol. 2009; 191: 7074-7085 197 Jansen C, Wiese A, Reubsaet L, Dekker N, de Cock H et al. Biochemical and biophysical characterization of in vitro folded outer membrane porin PorA of Neisseria meningitidis. Biochim Biophys Acta. 2000; 1464: 284-298. 198 Massari P, King CA, MacLeod H, Wetzler LM. Improved purification of native meningococcal porin PorB and studies on its structure/function. Protein Expr Purif. 2005; 44: 136-146. 199 Sánchez S, Arenas J, Abel A, Criado MT, Ferreirós CM. Analysis of outer membrane protein complexes and heat-modifiable proteins in Neisseria strains using two-dimensional diagonal electrophoresis. J Proteome Res. 2005; 4: 91-95. Capítulo I. Discusión - 132 - supervivencia intracelular204. En Neisseria gonorrhoeae ha sido detectada una lipoproteína, Ng-MIP, que presenta alta homología con los MIPs, y que aumenta la supervivencia en el interior de macrófagos, célula que infecta durante el proceso infeccioso205. Es posible que en N. meningitidis ejerza un papel similar a N. gonorrhoeae aumentando su supervivencia en el interior celular para atravesar el epitelio de la nasofaringe o la barrera hematoencefálica. La porina PorB también juega un importante papel en la supervivencia del meningococo en el interior celular, inhibiendo la apoptosis de la célula infectada140 por modulación del potencial de membrana mitocondrial, por lo que no es descartable una acción conjunta. Todos los mutantes utilizados en el presente estudio se obtuvieron de la cepa H44/76 por inserción del gen de la resistencia a la kanamicina en el gen diana en los que la correcta identificación de las proteínas defectivas fue previamente realizada206 y concordante con nuestros datos obtenidos. Un trabajo reciente en el que se utilizó PorA recombinante demuestra que esta porina tiene un menor ratio de transporte que otras porinas bacterianas incluyendo la PorB del meningococo207. Esta anotación es coherente con la observación en experimentos realizados con estas cepas en los que la tasa de crecimiento de la cepa mutante PorB- fue menor que la de las cepas salvaje y demás mutantes200, pudiendo ser explicado por el menor ratio de transporte mediado por los poros PorA. El mutante PorB-, además de las características de crecimiento comentadas, mostró serias alteraciones en la formación de los poros. Los complejos Cx1-Cx9 no se 204 Wagner C, Khan AS, Kamphausen T, Schmausser B, Unal C et al. Collagen binding protein Mip enables Legionella pneumophila to transmigrate through a barrier of NCI-H292 lung epithelial cells and extracellular matrix. Cell Microbiol. 2007; 9: 450-462. 205 Leuzzi R, Serino L, Scarselli M, Savino S, Fontana MR et al. Ng-MIP, a surface-exposed lipoprotein of Neisseria gonorrhoeae, has a peptidyl-prolyl cis/trans isomerase (PPIase) activity and is involved in persistence in macrophages. Mol Microbiol. 2005; 58: 669-681. 206 Vipond C, Wheeler JX, Jones C, Feavers IM, Suker J. Characterization of the protein content of a meningococcal outer membrane vesicle vaccine by polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry. Hum Vaccin. 2005; 1: 80-84. 207 Cervera J, Komarov AG, Aguilella VM. Rectification properties and pH-dependent selectivity of meningococcal class 1 porin. Biophys J. 2008; 94: 1194-1202. Capítulo I. Discusión - 133 - formaron y prácticamente la totalidad de la porina PorA se encontró formando un complejo o agregado de alto peso molecular (≈800 kDa), mientras que en el mutante PorA- existieron complejos de porinas, formados por PorB o PorB/RmpM. Estas observaciones cuestionan la relevancia del papel fisiológico de la PorA en el metabolismo de la bacteria y confirman un papel clave de la porina PorB en la estructura de los complejos de porinas. Pudiera ser que la PorA tuviese menor importancia que PorB en el transporte de solutos; de hecho, otras especies del género únicamente expresan una porina, homóloga a la codificada por el gen porB134,208. Esto se ve apoyado por la alta variabilidad antigénica e inmunodominancia de PorA, por lo que serviría de señuelo desviando la unión de Igs a componentes de la membrana externa funcionalmente más importantes en etapas críticas de la infección bacteriana. El mutante PorA-, así como las imágenes 2-D hrCNE/SDS-PAGE obtenidas con las cepas heterólogas NZ98/254, NmP27, 3061, 3063 y Nm26 mostraron la presencia de complejos PorB/RmpM, a pesar de no ser detectados en las identificaciones por LC-MS/MS. El mutante RmpM- confirmó la participación de la RmpM en ciertos complejos de porinas ya observada por las resultados con la cepa salvaje, mostrando un incremento de la proporción de complejos PorB y PorA/PorB como consecuencia de la suma de los ya existentes más los que formaban complejo con RmpM. La participación de RmpM en los complejos de porinas había sido constatada ya por Tommassen y colaboradores197, mientras que en otros trabajos muestran la asociación a otras proteínas como proteínas de captación de hierro142 o a la proteína de síntesis de membrana Omp85196. Se ha propuesto que la función de la RmpM podría ser de estabilización de los complejos de porinas debido a las observaciones de una mayor susceptibilidad de 208 Arakere G, Kessel M, Nguyen N, Frasch CE. Characterization of a stress protein from group B Neisseria meningitidis. J Bacteriol. 1993; 175: 3664-3668. Capítulo I. Discusión - 134 - estos complejos a la desnaturalización por SDS a baja temperatura en ausencia de RmpM. Sin embargo, la presencia de complejos de PorB y PorA/PorB estables tanto con RmpM como sin ella y la unión a otras proteínas resta importancia a la función estabilizadora y apunta a la existencia de otro papel. La proteína RmpM presenta el dominio C-terminal similar al de la proteína OmpM de E. coli por el que se une al peptidoglicano143 pudiendo, de este modo, mediar el anclaje de los complejos de porinas a la capa peptidoglicano con fines funcionales. Los complejos proteicos CxChap, CxGlu y CxKet se detectaron consistentemente en todas las cepas estudiadas, siendo identificados como homómeros de chaperonina de 60 kDa, de glutamina sintetasa y de cetol-ácido reductoisomerasa. Sus homólogas en otras especies bacterianas se asocian en estructuras cuaternarias homoméricas. La conformación de los complejos de la proteína chaperonina de 60 kDa es la de dos anillos heptaméricos superpuestos, cuyo peso molecular coincide con el observado para CxChap209. Sin embargo, esta conformación puede variar según la especie, como ocurre con la chaperonin Skp de E. coli que forma trímeros210. La presencia de esta proteína en la membrana externa, a pesar de su localización predicha citoplasmática, es coherente con su detección en otras especies asociada a la membrana externa235, y la existencia de anticuerpos anti-chaperonina en sueros de individuos convalecientes de la enfermedad meningocócica211. También han sido detectados complejos análogos a CxGlu y CxKet en otras especies bacterianas. La glutamina sintetasa se asocia formando dos anillos 209 Pannekoek Y, Dankert J, van Putten JP. Construction of recombinant neisserial Hsp60 proteins and mapping of antigenic domains. Mol Microbiol. 1995; 15: 277-285. 210 Qu J, Mayer C, Behrens S, Holst O, Kleinschmidt JH. The trimeric periplasmic chaperone Skp of Escherichia coli forms 1:1 complexes with outer membrane proteins via hydrophobic and electrostatic interactions. J Mol Biol. 2007; 374: 91-105. 211 Pannekoek Y, Schuurman IG, Dankert J, van Putten JP. Immunogenicity of the meningococcal stress protein MSP63 during natural infection. Clin Exp Immunol. 1993; 93: 377-381. Capítulo I. Discusión - 135 - hexaméricos superpuestos212 y es co-transcrita y/o asociada a proteínas integrales de membrana implicadas en el transporte de componentes nitrogenados213, mientras que los complejos de la cetol-ácido reductoisomerasa están formados por seis dímeros. En ambos casos, los pesos moleculares esperados a partir del peso de cada subunidad coincide con los observados en las hrCNE, si bien esta no es una prueba fiable dada la escasa capacidad de la hrCNE para deducir pesos moleculares a partir de los estándares. A pesar de que la identificación por MALDI-TOF a partir de este tipo de mapas bidimensionales no permite un análisis exhaustivo de la composición proteica total de las OMVs, dado que quedan fuera del análisis las proteínas y complejos solubles con carga neta positiva a pH 7.0, y las proteínas y complejos con carga neta negativa a pH 7.0 con un tamaño molecular menor a 60 kDa, sí permitió un análisis orientativo de su composición y reflejó la escasa contaminación por proteínas citoplasmáticas durante la obtención de las preparaciones de OMVs. Los trabajos publicados sobre composición proteica de OMVs de N. meningitidis, muestran porcentajes de proteínas de membrana externa sobre el total de identificadas de 6,4%124, 27%214 o 59,4%125, todas ellas a partir de extracciones con DOC. Aunque la presencia de proteínas citoplasmáticas en OMVs, así como la de ADN y ARN, es un hecho documentado en distintas especies bacterianas215, con la metodología utilizada en este trabajo el porcentaje de proteínas de membrana fue del 63% sugiriendo que la extracción con Prensa de French es un método de extracción de OMVs que 212 Hill HS, Pfluegl GM, Eisenberg D. Multicopy crystallographic refinement of a relaxed glutamine synthetase from Mycobacterium tuberculosis highlights flexible loops in the enzymatic mechanism and its regulation. Biochemistry 2002; 41: 9863–9872. 213 Arcondéguy T, Jack R, Merrick M. P(II) signal transduction proteins, pivotal players in microbial nitrogen control. Microbiol Mol Biol Rev. 2001; 65: 80-105. 214 Gil J, Betancourt LZ, Sardiñas G, Yero D, Niebla O et al. Proteomic study via a non-gel based approach of meningococcal outer membrane vesicle vaccine obtained from strain CU385: a road map for discovering new antigens. Hum Vaccin. 2009; 5: 347-356. 215 Lee EY, Choi DS, Kim KP, Gho YS. Proteomics in gram-negative bacterial outer membrane vesicles. Mass Spectrom Rev. 2008; 27: 535-555. Capítulo I. Discusión - 136 - conlleva una menor contaminación por proteínas citoplasmáticas que la extracción con detergentes, como ya había sido documentado en trabajos anteriores en nuestro laboratorio200. CAPÍTULO II: Análisis de la respuesta inmune frente a vesículas de membrana externa y complejos proteicos de membrana externa purificados Capítulo II. Introducción - 139 - 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Indicadores de protección contra la enfermedad meningocócica 1.1.1. Actividad bactericida del suero Con la excepción de unas pocas áreas del planeta como el África subsahariana, la incidencia de la enfermedad meningocócica es demasiado baja como para diseñar estudios aleatorizados que determinan la eficacia de las vacunas. Por lo tanto, esta eficacia es inferida a través de ensayos en los que se evalúa una determinada función inmunológica, y a partir de los cuales se establecen unos resultados que sirven de indicador de protección contra la enfermedad. La actividad bactericida de los anticuerpos del suero ha mostrado tener una alta correlación con la inmunidad a la enfermedad meningocócica. Como hemos visto en la introducción a la enfermedad meningocócica (apartado 3.3.1), los anticuerpos bactericidas mantienen un papel central en la defensa contra el meningococo. Esta característica ha sido aceptada a partir de una serie de observaciones216: • La capacidad del antisuero meningococal terapéutico para reducir en gran medida la mortalidad por enfermedad meningocócica. • La rareza de segundos episodios de enfermedad meningocócica causada por el mismo serogrupo bajo condiciones epidémicas. • Relación inversa entre la incidencia de la enfermedad meningocócica y el dominio dependiente de edad de anticuerpos bactericidas. • La alta susceptibilidad a la enfermedad meningocócica invasiva en individuos con defectos en los componentes finales de la cascada del complemento constituyentes del complejo de ataque a membrana. 216 Frasch CE, Borrow R, Donnelly J. Bactericidal antibody is the immunologic surrogate of protection against meningococcal disease. Vaccine. 2009; 27: 112-116. Capítulo II. Introducción - 140 - • Las vacunas meningococales polisacarídicas y de vesículas de membrana externa inducen anticuerpos bactericidas y son eficaces. Es por ello que la actividad bactericida del suero es considerado el mejor indicador de inmunidad frente a la enfermedad meningocócica, especialmente frente a la producida por el serogrupo C y se determina a través del denominado ensayo de actividad bactericida. Para llevar a cabo el ensayo, se incuban diluciones seriadas del suero a testar con la cepa diana y una fuente de complemento exógena. Aquellos anticuerpos específicos se unirán a la superficie meningococal a través de antígenos capsulares o subcapsulares. La subunidad C1q del componente C1 del sistema del complemento se une a la región Fc de la inmunoglobulina unida a superficie, activando de este modo la vía clásica del complemento, que finalmente resultará en la muerte de la célula bacteriana. El título de actividad bactericida del suero se expresa como la máxima dilución del suero que reduce en un 50% o más el número de células viables respecto a las presentes antes de la incubación217. El indicador original de protección meningocócica fue establecido en los años 60 por Goldschneider y colaboradores218 contra el serogrupo C como un título de actividad bactericida del suero ≥4, determinado en estudios con reclutas militares durante 8 semanas en EEUU; se observó que sólo 3 de los 54 casos meningococales tenían títulos de actividad bactericida del suero ≥4 antes del seguimiento comparado con los 444 de 540 casos que no contrajeron la infección y que sí tenían títulos de actividad bactericida ≥4. Los trabajos de Goldschneider y colaboradores fueron realizados con suero humano agammaglobulémico como fuente de complemento exógena. Sin embargo, debido a las dificultades que ofrece el complemento humano a la 217 Borrow R, Balmer P, Miller E. Meningococcal surrogates of protection--serum bactericidal antibody activity. Vaccine. 2005; 23: 2222-2227. 218 Goldschneider I, Gotschlich EC, Artenstein MS. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. J Exp Med. 1969; 129: 1307-1326. Capítulo II. Introducción - 141 - hora de estandarizar y comparar resultados entre laboratorios, la Organización Mundial de la Salud recomienda desde 1976 el uso de complemento de cría de conejo comercial (Baby Rabbit Complement) en los ensayos de actividad bactericida estandarizados para la evaluación de vacunas meningococales polisacarídicas219. Es sabido que el meningococo es más susceptible a la lisis mediada por complemento en presencia de complemento de conejo que con el humano, por lo que el ensayo de actividad bactericida fue re-evaluado para su realización con complemento de conejo220. De acuerdo con lo observado por Goldschneider también se encontraron relación entre la edad y la incidencia de la enfermedad, aunque la relación inversa entre la prevalencia de los títulos de anticuerpos protectivos y la incidencia de la enfermedad resultó mejor explicada con un título de actividad bactericida con complemento de conejo ≥8. En los estudios de eficacia de vacunas conjugadas contra el serogrupo C, se encontró una fuerte correlación entre un título de actividad bactericida con complemento de conejo ≥8 y eficacia vacunal en adolescentes tras el primer mes desde la vacunación, mostrando ser un buen indicador de protección a corto plazo. Sin embargo, 7 meses después de la vacunación, todos los títulos subestimaron la eficacia vacunal observada en adolescentes sugiriendo que los individuos son menos dependientes de la memoria inmunológica o que presentan bajos niveles de anticuerpos funcionales no detectados en el ensayo de actividad bactericida. Actualmente, la correlación de protección a corto plazo para el serogrupo C se establece como un título de actividad bactericida con complemento de conejo ≥8, aunque la protección a largo plazo requiere un mayor conocimiento de las bases inmunológicas. 219 World Health Organization. Requeriments for meningococcal polysacharide vaccine. World Health Organization technical report series, no. 594. Geneva, Switzerland: World Health Organization; 1976. 220 Trotter C, Borrow R, Andrews N, Miller E. Seroprevalence of meningococcal serogroup C bactericidal antibody in England and Wales in the pre-vaccination era. Vaccine. 2003; 21: 1094- 1098.