Receptores de angiotensina en neuroinflamación e inflamación periférica. Implicaciones en la degeneración dopaminérgica

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC María A Pedrosa Sánchez Tesis doctoral Receptores de angiotensina en neuroinflamación e inflamación periférica. Implicaciones en la degeneración dopaminérgica. Santiago de Compostela, 2022 Programa de doctorado en Neurociencia y Psicología Clínica TESIS DE DOCTORADO RECEPTORES DE ANGIOTENSINA EN NEUROINFLAMACIÓN E INFLAMACIÓN PERIFÉRICA. IMPLICACIONES EN LA DEGENERACIÓN DOPAMINÉRGICA. María A Pedrosa Sánchez ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN NEUROCIENCIA Y PSICOLOGÍA CLÍNICA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 D./Dña. María Ángeles Pedrosa Sánchez Título de la tesis: Receptores de angiotensina en neuroinflamación e inflamación periférica. Implicaciones en la degeneración dopaminérgica. Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela , 15 de noviembre de 2022. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS RECEPTORES DE ANGIOTENSINA EN NEUROINFLAMACIÓN E INFLAMACIÓN PERIFÉRICA. IMPLICACIONES EN LA DEGENERACIÓN DOPAMINÉRGICA D./Dª. José Luis Labandeira García INFORMA/N: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dª. María Ángeles Pedrosa Sánchez, bajo mi dirección/tutorización, y autorizo su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela., 15 de Noviembre de 2022 Firma electrónica: José Luis Labandeira García AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS RECEPTORES DE ANGIOTENSINA EN NEUROINFLAMACIÓN E INFLAMACIÓN PERIFÉRICA. IMPLICACIONES EN LA DEGENERACIÓN DOPAMINÉRGICA D./Dª. Ana Isabel Rodríguez Pérez INFORMA/N: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D/Dª. María Ángeles Pedrosa Sánchez, bajo mi dirección, y autorizo su presentación, considerando que reúne l os requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela., 15 de Noviembre de 2022 Firma electrónica: Ana Isabel Rodríguez Pérez I AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer a todas las personas que han colaborado enormemente a la elaboración de esta tesis doctoral, especialmente: Al Profesor José Luis Labandeira García, por su enorme dedicación, esfuerzo y pasión que ofrece cada día a la investigación. Gracias por haberme permitido formar parte de este gran grupo, por enseñarme y por iniciarme en el mundo de la investigación. A la profesora María José Guerra Seijas, por todo su trabajo y por su amabilidad y generosidad que nos transmite siempre. A Ana Isabel, gracias por tu lucha incansable, por tu inmensa dedicación, por lo mucho que me has enseñado, por apoyarme, por escucharme, por guiarme y por inspirarme. Para mí ha sido una grandísima suerte haber trabajado juntas en esta tesis. A Pablo Garrido, con quien he podido trabajar mano a mano, gracias por tu inmensa amabilidad, capacidad de enseñanza, paciencia y buen humor. A Rita, con la que he afrontado innumerables retos, contigo he aprendido cosas valiosísimas y lo que significa un trabajo con calidad científica. Al profesor Juan Suárez Quintanilla, con quien he tenido el placer de trabajar y compartir tantas conversaciones interesantes, útiles y divertidas. Siempre me has ayudado, gracias. A Jannette Rodríguez, gracias por haberme enseñado y ayudado en las prácticas y servirme de ejemplo para la docencia y la investigación. A Ana Muñoz, gracias por transmitir paz y tranquilidad, por ser buena profesora y por tu rigurosidad en el trabajo. A Juan Parga, gracias por tus innumerables gestiones, por tu enorme paciencia, por tu tranquilidad y buen estar. II A Cris, cuyo ánimo, energía, buen humor, pasión y entrega nos ayudan a todos cada día. Gracias por estar siempre ahí, por tu sabiduría y apoyo personal. A Pili, gracias por ser como eres, luchadora, cercana, con carácter explosivo, con energía y con empeño. A Iria, gracias por ser profesional, rigurosa y organizada. Además, tus sugerencias me han animado a hacer escapadas y conocer muchos rincones de Galicia. A Carmen Díaz, gracias por ser tan atenta, por cuestionártelo todo y aportar un punto de vista diferente. A Begoña Villar, gracias por la fuerza que siempre transmites, por tus consejos y por tu buen humor. A Antonio Domínguez, gracias por abarcar y enseñarnos tantísimos conocimientos, siempre es un placer hablar contigo. A Alicia, gracias por tu buen humor tan contagioso y por tu compañerismo. A Andrea, tu inmensa bondad y tu gran capacidad de trabajo te hacen una persona única y admirable. Gracias por ayudarme en todo y por estar siempre ahí. A María García gracias por tu rigurosidad en el trabajo, por ser una atenta y buena compañera. A Aloia, me ha gustado mucho enfrentarme contigo a nuevos retos, agradezco tu ayuda, tu compañía y tu buen humor. A Lucía, muchas gracias por el apoyo que me has dado siempre a mí y por la alegría que transmites. A Carmen Labandeira, gracias por todo tu trabajo, que nos ha permitido embarcarnos en desafíos extraordinarios. A Ana Muñoz Manchado, gracias por esa inolvidable y provechosa estancia, por abrirme las puertas de Karolinska, por haber sido tan cercana y atenta, y por ser un gran ejemplo a seguir. III A Fernando, una persona con un corazón que no le cabe en el pecho, un amigo con el que poder contar siempre. Me has apoyado en todos los malos momentos y hemos celebrado todo los buenos. Simplemente, gracias. A mi gran amigo Ismael, me alegro mucho de haber compartido contigo esta intensa aventura gallega. Has sido un grandísimo apoyo. Eres una excelente persona y te mereces lo mejor. A Albica, qué te voy a decir a ti. Gracias inmensas por todo, por tu positivismo extremo, por tus consejos, por tu empatía, por todas las aventuras que hemos vivido, por hacerme tan feliz, por ser tú, única. A Mari, la persona responsable de ser quien soy. Con la que he crecido, con la que he aprendido, con la que he viajado. Gracias por compartir conmigo las carcajadas, los miedos y los triunfos. A mi Tita Mari, mi segunda madre. Me has enseñado importantes lecciones de vida. Gracias por todo el cariño, por cuidarme y por apoyarme siempre. Gracias por la tradición “sábados de arroz”, que nos permiten reunirnos como familia. Gracias a todos por vuestra alegría, consejos y cariño. A mi hermana Pina. Me has apoyado y has confiado en mí siempre. Gracias por cuidarme, por ser hermana y amiga, por todo lo que he aprendido de ti y por todo lo que seguiré aprendiendo. A mi padre Antonio, gracias por todo lo que me has enseñado, por ayudarme, por inspirarme, por permitirme cumplir mis sueños y por hacerme reír. A mi madre Pina, luchadora, alegre, buena, entregada a los demás. No dejes de ser quien porque todos te necesitamos. Gracias por confiar en mí y apoyarme en cada paso. Todo lo que he conseguido ha sido gracias a ti, te quiero. Y, por supuesto, a Antonio. Tú has apostado y luchado por esta tesis tanto como yo. Gracias por ser mi apoyo incondicional, por tu cariño, por tu confianza y por tu buen corazón. Contigo cada día es una alegría y una aventura. Gracias por hacerme feliz y por recorrer el mundo conmigo. IV RESUMEN La desregulación en la expresión de receptores de angiotensina puede mediar procesos de neuroinflamación, promoviendo así, neurodegeneración dopaminérgica. Esta desregulación puede verse afectada por eventos patológicos de inflamación periférica crónica (como el envejecimiento o síndrome metabólico) y aguda (como la infección por SARS-CoV-2). El uso de tratamientos moduladores de los componentes y receptores del Sistema Renina-Angiotensina (SRA) pueden mediar, por tanto, mecanismos neuroprotectores y antiinflamatorios. El objetivo principal de la presente tesis doctoral se centra en el estudio de los receptores de angiotensina en la neuroinflamación e inflamación periférica, así como su implicación en la neurodegeneración dopaminérgica. Los resultados obtenidos muestran la implicación del receptor AT1 cerebral en la neuroinflamación y muerte neuronal dopaminérgica en un modelo animal de enfermedad de Parkinson (EP) inducido por la sobreexpresión de la proteína α-sinucleína. Además, se observó un efecto neuroprotector de los antagonistas del receptor AT1 mediante la inhibición de la respuesta inflamatoria microglial en el modelo animal de EP. Las respuestas inflamatorias de las células microgliales están mediadas por la expresión de receptores de angiotensina. En condiciones basales, los receptores AT2 regulan a la baja la expresión de los receptores del eje pro-inflamatorio del SRA (receptores AT1) en células microgliales. Sin embargo, en condiciones de inflamación periférica crónica (envejecimiento) y aguda (LPS), se reduce la expresión de receptores AT2, lo que conduce a un incremento en la expresión de los receptores AT1, promoviendo así fenómenos de neuroinflamación, que pueden ser revertidos mediante el empleo de antagonistas del receptor AT1. Además, la microglía de ratones hembra presenta mayor expresión del receptor AT2 que la microglía de machos, independientemente de las hormonas femeninas circulantes. La inflamación periférica crónica con la que cursa el síndrome metabólico, o la administración crónica de autoanticuerpos agonistas del receptor AT1 (AT1-AA), provocan un aumento en la expresión de V los receptores del eje pro-inflamatorio del SRA cerebral y una disminución en los receptores del eje anti-inflamatorio, así como un incremento de la muerte neuronal dopaminérgica y de la respuesta inflamatoria microglial en modelos animales de EP, que son revertidos por el tratamiento con el antagonista del receptor AT1, candesartán. Finalmente, en la inflamación periférica aguda desencadenada por COVID-19, también está implicado el SRA. El enzima ECA2 se identificó como el receptor funcional de entrada para el virus SARS- CoV-2. Dada la importancia del SRA en la inflamación periférica, se generó entonces un debate sobre el uso, perjudicial o beneficioso, de tratamientos que modulan el SRA y sus receptores, sobretodo en pacientes de mayor vulnerabilidad a la gravedad por COVID-19 (envejecimiento y síndrome metabólico). Nuestros resultados sugieren que el tratamiento con bloqueantes del receptor AT1 (candesartán), con inhibidores del enzima ECA (captopril) o con moduladores indirectos de los receptores del SRA (ibuprofeno) aumenta la expresión de los receptores del eje anti-inflamatorio del SRA (AT2 y Mas) y del enzima ECA2 a nivel pulmonar, efecto particularmente pronunciado en los modelos que cursan con inflamación periférica crónica (envejecimiento y síndrome metabólico). Este incremento en la expresión de ECA2 se confirmó a nivel celular en cultivos de neumocitos humanos de tipo II. Se comprobó, además, que la posible regulación positiva de la entrada viral a través del aumento de expresión de ECA2 transmembrana inducido por tratamientos moduladores del SRA es contrarrestada por mecanismos adicionales de los tratamientos mencionados, particularmente por la inhibición de la actividad de proteasas implicadas en la entrada celular de SARS-CoV-2 (ADAM17 y TMPRSS2). VI ABSTRACT Dysregulation of angiotensin receptor expression can mediate neuroinflammation processes, thus promoting dopaminergic neurodegeneration. This dysregulation can be affected by pathological events such as chronic peripheral inflammation (aging or Metabolic Syndrome) and acute inflammation (SARS-CoV-2 infection). Therefore, the use of modulating treatments of the Renin-Angiotensin System (RAS) receptors can mediate neuroprotective and antiinflammatory mechanisms. The role of angiotensin receptors in neuroinflammation and peripheral inflammation, as well as their involvement in dopaminergic neurodegeneration, has been studied in this doctoral thesis. The results obtained demonstrate the role of brain AT1 receptor in neuroinflammation and dopaminergic neuronal death in an animal model of Parkinson's disease (PD) induced by overexpression of αsynuclein protein. In addition, neuroprotective effect of AT1 receptor antagonists by inhibition of microglial inflammatory response was observed in PD animal model. Inflammatory responses of microglial cells are mediated by angiotensin receptor expression. In basal conditions, AT2 receptors downregulate the expression of RAS proinflammatory receptors in microglial cells. However, in chronic (aging) and acute (LPS) peripheral inflammation, the expression of AT2 receptors is reduced, which leads to an increase in the expression of AT1 receptors, thus promoting neuroinflammation processes that can be reversed by AT1 receptor antagonists. In addition, microglia from female mice exhibits higher expression of the AT2 receptor than microglia from males, independent of circulating female hormones. Chronic peripheral inflammation associated with the metabolic syndrome, or chronic administration of AT1 receptor agonistic autoantibodies (AT1-AA), cause an increase in pro-inflammatory receptor expression and a decrease in anti-inflammatory receptor expression of brain RAS. Additionally, both chronic peripheral inflammation models increase dopaminergic neuronal death and microglial inflammatory response in animal models of PD, which are VII reversed by the treatment with the AT1 receptor antagonist, candesartan. Finally, RAS is also implicated in the acute peripheral inflammation triggered by COVID-19. The ACE2 enzyme was identified as the functional entry receptor for the SARS-CoV-2 virus. Therefore, a major question was generated about whether the use of modulating treatments of RAS receptors was harmful or beneficial, especially in patients vulnerable to severe COVID-19 (aging and metabolic syndrome). The results suggest that treatment with AT1 receptor antagonists (candesartan), with ACE enzyme inhibitors (captopril) or with indirect modulators of the RAS receptors (ibuprofen) increases the expression of RAS anti-inflammatory receptors (AT2 and Mas) and ACE2 enzyme at the pulmonary level. This effect was particularly pronounced in chronic peripheral inflammation models (aging and metabolic syndrome). The increase in ACE2 expression was confirmed at the cellular level in type II human pneumocyte cultures. Furthermore, possible up-regulation of viral entry by the increase in expression of transmembrane ACE2 induced by RAS modulating treatments is counteracted by additional mechanisms, particularly by treatmentsinduced inhibition of activity of proteases involved in the viral entry of SARS-CoV-2 (ADAM17 and TMPRSS2). VIII ARTÍCULOS DERIVADOS DE LA TESIS Pedrosa MA, Labandeira CM, Valenzuela R, Quijano A, Sanchez- Andrade M, Suarez-Quintanilla JA, Lanciego JL, Labandeira- Garcia JL, Rodriguez-Perez AI. AT1 receptor autoantibodies mediate effects of Metabolic syndrome on dopaminergic vulnerability. 2022. Brain, Behaviour, and Immunity, en primera revisión. IF(2021): 19,227; Q1. Garrido-Gil P*, Pedrosa MA*, Garcia-Garrote M, Pequeño-Valtierra A, Rodriguez-Castro J, Garcia-Souto D, Rodriguez-Perez AI, Labandeira-Garcia JL. Microglial angiotensin type 2 receptors mediate sex-specific expression of inflammatory cytokines independently of circulating estrogen. 2022 *Garrido-Gil P y Pedrosa MA contribuyeron igualmente a este trabajo. Glia: 1-33. DOI: 10.1002/glia.24255. IF(2021): 8,073; Q1. Valenzuela R*, Pedrosa MA*, Garrido-Gil P, Labandeira CM, Navarro G, Franco R, Rodriguez-Perez AI, Labandeira-Garcia JL. Interactions between ibuprofen, ACE2, renin-angiotensin system, and spike protein in the lung. Implications for COVID- 19. 2021 *Valenzuela R y Pedrosa MA contribuyeron igualmente a este trabajo. Clinical and Translational Medicine: 4-11, pp. e371. DOI: 10.1002/CTM2.371. IF(2021): 8,554; Q1. Pedrosa MA, Valenzuela R, Garrido-Gil P, Labandeira CM, Navarro G, Franco R, Labandeira-Garcia JL, Rodriguez-Perez AI. Experimental data using candesartan and captopril indicate no double-edged sword effect in COVID-19. 2021. Clinical Science: 135-3, pp. 465-481. DOI: 10.1042/CS20201511. IF(2021): 6,876; Q1. XIII inglés reverse transcriptase polymerase chain reaction SARS-CoV-2: coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo 2 SEM: error estándar de la media, del inglés standard Error of the Mean SIRT1: sirtuina tipo 1 SIRT3: sirtuina tipo 3 SNC: sistema nervioso central SNpc / SN: sustancia negra pars compacta SNpr: sustancia negra pars reticulada SO: superóxido SRA: Sistema Renina-Angiotensina ST: núcleo estriado TELM: telmisartán TG2: transglutaminasa 2 TGF-β: factor de crecimiento transformador de tipo β TH: tiroxina hidroxilasa TH-ir: inmunorreactiva para TH TLR4: receptor toll like tipo 4 TMPRSS2: proteasa transmembrana serina 2, del inglés transmembrane protease serine 2 TNF-α: factor de necrosis tumoral TNFSF14/LIGHT: miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral VEGF: factor de crecimiento vascular endotelial WB: Western Blot WT: forma salvaje, del inglés wild type UFR: unidad de fluorescencia relativa ZD: ZD-7155 INTRODUCCIÓN 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1.SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA. RECEPTORES. El Sistema Renina-Angiotensina (SRA) se conoce clásicamente como un sistema hormonal circulante encargado de regular la presión arterial y la homeostasis del sodio y el agua. El precursor inicial de este sistema es el Angiotensinógeno (ANG), el cual se transforma en Angiotensina I (Ang I), un péptido inactivo, por acción del enzima Renina. La Ang I puede transformarse, a través de la acción del enzima conversora de angiotensina (ECA), en Angiotensina II (Ang II), la cual se considera el péptido efector más importante del SRA (Sparks et al., 2014). La Ang II actúa a través de dos receptores principales: el receptor de angiotensina tipo 1 (AT1) y el receptor de angiotensina tipo 2 (AT2) (Unger et al., 1996). Además, se han observado nuevos componentes y receptores del SRA como el enzima conversora de angiotensina II (ECA2) y nuevos péptidos como Angiotensina (1-7) (Ang(1-7)), Angiotensina III (Ang III) y Angiotensina IV (Ang IV) en diferentes células y tejidos. También se ha identificado un receptor específico para el enzima renina y su precursor pro-renina, el receptor PRR, que desencadena su propia vía de señalización (Figura 1) (Nguyen, 2010). La síntesis y función de los diferentes componentes del SRA se describen a continuación: -Renina: es una proteasa que cataliza la escisión del extremo N- terminal del ANG para formar Ang I. La principal fuente de renina en la circulación es el riñón, donde su expresión y secreción se encuentran reguladas por cambios en la presión arterial y el equilibrio de sal (Lorenz et al., 1993; Bell et al., 2003). La cantidad de renina presente MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 2 en el torrente sanguíneo es la que limita los niveles de Ang II y, por lo tanto, la actividad del SRA (Sparks et al., 2014). -ECA: es una peptidasa que cataliza la escisión del extremo C-terminal del precursor inactivo Ang I para formar Ang II. Su expresión es testicular y somática, siendo ésta última abundante en la superficie de células endoteliales de todo el cuerpo, principalmente pulmón, intestino, plexo coroideo, placenta y riñón. Además, existe una forma soluble en plasma formada por la escisión de su dominio transmembrana (Beldent et al., 1993). -Ang II: es un péptido vasoactivo que, clásicamente, regula la presión arterial. Las acciones biológicas de Ang II están mediadas por receptores de la superficie celular que pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a proteína G de siete hélices transmembrana (Sparks et al., 2014). Los dos receptores principales de Ang II son: -Receptores AT1: los estudios sugieren que la mayoría de las funciones clásicamente reconocidas del SRA están mediadas por los receptores AT1. En ratón (Sasamura et al., 1992) y rata (Iwai e Inagami, 1992), se han identificado dos subtipos de este receptor, denominados AT1a y AT1b; ambos comparten el 95% de la secuencia aminoacídica, sin embargo, difieren en su distribución, localización cromosómica y regulación transcripcional. No se ha confirmado la existencia de AT1b en humanos, siendo el AT1a murino el homólogo más cercano (Sparks et al., 2014). La Ang II se une al receptor AT1, activando la vía de señalización mediada por fosfolipasa C que provoca la hidrólisis del fosfatidilinositol bifosfato formando inositol trifosfato (IP3), el cual provoca la liberación de Ca++ de los depósitos intracelulares, y diacilglicerol (DAG), el cual activa la proteína quinasa C (PKC). Además, la acción de este receptor se ha relacionado con otras vías de señalización como la quinasa Janus (JAK), la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK), así como con vías dependientes de β-arrestina INTRODUCCIÓN 3 (Herichova y Szantoova, 2013; Forrester et al., 2018). Estas rutas moleculares tienen un efecto directo en la promoción del crecimiento en miocitos cardíacos, fibroblastos y células de músculo liso vascular, que causa remodelación cardiovascular. Además, otro mecanismo importante mediado por el eje Ang II/AT1 es la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, del inglés Reactive Oxygen Species) mediante el aumento de expresión y de activación del enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa (NOX / NADPH-oxidasa), cuyo efecto da lugar a diversos procesos fisiopatológicos, que incluyen vasoconstricción, fibrosis, aumento de la absorción renal de sodio, liberación de aldosterona y arginina vasopresina e inflamación (Herichova y Szantoova, 2013; de Morais et al., 2018). Sin embargo, la función de los receptores AT1 es más compleja. Los receptores pueden formar homodímeros y heterodímeros provocando cambios importantes en sus efectos fisiológicos. Así, se ha demostrado la formación de dímeros con el receptor AT2, con el receptor de endotelina B, con el receptor Mas, con adrenoceptores tipo B1 y B2 y con bradiquina B2 entre otros (Forrester et al., 2018). -Receptores AT2: estos receptores se expresan en gran cantidad durante el desarrollo fetal (Sparks et al., 2014) y sus niveles de expresión pueden ser modulados por Ang II y ciertos factores de crecimiento (Ichiki et al., 1995). Asimismo, se ha sugerido que su expresión puede incrementarse en estados patológicos, ya que se ha observado su implicación en la modulación de la proliferación y diferenciación celular (Rodriguez-Pallares et al., 2004) y procesos de regeneración y apoptosis (Labandeira- Garcia et al., 2011). Los mecanismos de señalización del receptor AT2 aún son especulativos en comparación con los descritos para el receptor AT1. Los receptores AT2 parecen emitir señales mediante el acoplamiento a las proteínas Gαi2 y Gαi3, y están relacionadas con la activación de fosfatasas para MAPK y ERK. Además, se MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 4 ha sugerido que la activación de estos receptores estimula la producción de bradicinina, óxido nítrico (NO, del inglés nitric oxide) y guanosín monofosfato cíclico (GMPc), promoviendo la natriuresis y la disminución de la presión arterial en el sistema cardiovascular. De esta manera, la estimulación del receptor AT2 contrarresta la constricción inducida por el receptor AT1 en la vasculatura (Sparks et al., 2014; Forrester et al., 2018). -Nuevos componentes del SRA: la Ang II se considera el efector más importante del SRA, pero actualmente se conoce que no es el único componente bioactivo. La Angiotensina (1-12) es un péptido presente en plasma, corazón, riñón y otros tejidos. Se forma a partir del ANG por una escisión independiente de renina, y actúa como precursor de la formación de Ang II (Ferrario et al., 2019); La Ang III es un péptido formado a partir de Ang II por la acción de la aminopeptidasa A (Yugandhar y Clark, 2013). La Angiotensina A es otro péptido derivado de Ang II y que solo se diferencia de ésta en el primer aminoácido de su secuencia (Coutinho et al., 2014). Estos tres tipos de angiotensinas tienen acciones muy similares a la Ang II, por lo que causan vasoconstricción y proliferación de células de músculo liso mediante la activación del receptor AT1 (Hussain y Awan, 2018). A nivel periférico, Ang III induce natriuresis y diuresis al actuar sobre el receptor AT2 (Kemp et al., 2019). Otros péptidos como Ang IV, Ang(1-7), Angiotensina (1-9) y alamandina ejercen efectos protectores, opuestos a los demostrados por la Ang II/AT1. La Ang(1-7) se puede formar a partir de varias vías. Una de ellas es a partir de la Ang II por acción del enzima ECA2 (Santos et al., 2018). Ang(1-7) actúa sobre el receptor Mas (MasR) en varios tejidos, participando en procesos fisiológicos y patológicos como el reclutamiento e inflamación de leucocitos, remodelación cardíaca, función renal y alteración vascular (Chappell, 2007; Simoes e Silva et al., 2013). Además, algunos estudios recientes sugieren que la Ang(1- 7) puede promover su señalización a través de otros receptores como el receptor acoplado a proteína G relacionado con Mas (MrgD), promoviendo la producción de ácido araquidónico (Karnik et al., 2017). MrgD también funciona como receptor de alamandina, estimulando la INTRODUCCIÓN 5 producción de NO participando en respuestas anti-hipertensivas (Lautner et al., 2013). De forma general, ECA2 es un enzima que regula negativamente la función sistémica del SRA. Además de la generación de Ang(1-7), ECA2 limita la producción de Ang II y puede actuar sobre otros péptidos vasoactivos con funciones importantes en la regulación de la presión arterial (Kuba et al., 2013). Recientemente, el ECA2 ha cobrado mucha atención, ya que este enzima es el receptor funcional del virus que provoca el síndrome respiratorio agudo severo del coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el agente etiológico de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19; Zhu et al., 2020); por lo que su regulación se ha relacionado con la función pulmonar, cerebral, cardiovascular y renal. Actualmente, y teniendo en cuenta todos los componentes y receptores, el SRA se define como un sistema constituido por dos brazos de acción opuesta (Figura 1). El brazo presor está compuesto por el eje Ang II/AT1, que media los efectos vasoconstrictor, proliferativo, hipertensivo, oxidativo, proinflamatorio y profibrótico del SRA (Labandeira et al., 2017, 2021). El brazo depresor está compuesto principalmente por el eje Ang(1-7)/MasR que actúa como mediador de los efectos depresores, vasodilatadores, antiproliferativos, antioxidantes, anti-inflamatorios y antifibróticos, y por el eje Ang II/AT2, que se opone a los efectos mediados por la activación del receptor AT1 (Labandeira et al., 2017, 2021; Santos et al., 2019). Ambos ejes funcionan de forma conjunta, de manera que el equilibrio en la expresión de los diferentes componentes y receptores garantiza el correcto funcionamiento del SRA. La alteración de la expresión de cualquiera de los componentes provoca un desequilibrio del SRA que se ha relacionado con gran diversidad de eventos patológicos (Labandeira-Garcia et al., 2011, 2013, 2017, 2021). Además del SRA humoral o sistémico, se ha demostrado la existencia de un SRA local o tisular que presenta una regulación independiente del sistémico (Sigmund et al., 2017). Los componentes del SRA tisular se han demostrado en diferentes tejidos y órganos, como corazón, riñón, pulmón, hígado, retina y cerebro (Marshall, 2003; Ola et al., 2013; Labandeira-Garcia et al., 2017; Sigmund et al., 2017). El SRA local MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 6 regula la supervivencia y diferenciación celular, así como los procesos inflamatorios a nivel celular y, por tanto, específicos de tejido. Así, los tratamientos moduladores del SRA, como los antagonistas del receptor AT1 (ARAII), empleados en la práctica clínica habitual como antihipertensivos, pueden desencadenar efectos específicos de tejidos, más allá de su efecto sistémico sobre la presión arterial y otros eventos cardiovasculares (Zaman et al., 2002). En los últimos años, se ha destacado la importancia de estudiar los posibles efectos protectores y anti-inflamatorios en tejidos específicos, como pueden ser a nivel cerebral (Labandeira-Garcia et al., 2021) o pulmonar (Tan et al., 2018). Figura 1. Esquema de los principales péptidos, enzimas y receptores identificados en la señalización del Sistema Renina-Angiotensina (SRA). La Pro-renina y la Renina se unen al receptor PRR mientras que la Angiotensina I (Ang I) es escindida por el enzima conversora de angiotensina (ECA) y da lugar a la Angiotensina II (Ang II), que puede estimular los receptores de angiotensina tipo 1 (AT1), formándose el eje presor del SRA. Por otro lado, en el eje depresor del SRA, la Ang II también puede estimular los receptores de angiotensina tipo 2 (AT2), Ang I puede ser escindido a Ang (1-9) y actuar sobre los receptores AT2. Además, Ang II puede convertirse en Ang(1-7) mediante la acción del enzima conversora de angiotensina II (ECA2) o en Ang III mediante la acción de una aminopeptidasa. Se ha demostrado que la Ang(1-7) se une a los receptores AT2, Mas y MrgD, además puede formar alamandina que es un ligando para el receptor MrgD. La Ang III se puede unir tanto a los receptores AT1 como a los AT2, y se puede escindir formando Ang IV que se une principalmente al receptor de angiotensina tipo 4 (AT4). Esquema de elaboración propia con www.biorender.com INTRODUCCIÓN 7 1.1.1. Tratamientos moduladores del SRA y sus receptores Los principales tratamientos que modulan el SRA y sus receptores se centran en bloquear los componentes del brazo presor del sistema, como son los inhibidores de ECA (IECAs) y los antagonistas o bloqueantes del receptor AT1 (ARAII). Estos fármacos presentan una gran importancia en el tratamiento de la hipertensión, así como en la insuficiencia y remodelación cardíaca posteriores al infarto de miocardio (Zaman et al., 2002). Los principales tratamientos que regulan la expresión y actividad del SRA y sus receptores son: -IECAs: se han desarrollado diferentes tipos para uso clínico, entre los que se encuentran el benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, entre los más utilizados. Todos ellos tienen el mismo efecto farmacológico, es decir, actúan uniéndose al sitio activo de ECA e interfieren en la capacidad del enzima para unirse y escindir sus sustratos, como la Ang I, disminuyendo, por tanto, la fuente de síntesis de Ang II. Los diferentes fármacos difieren en la duración de la inhibición de ECA, en la absorción, vida media y disponibilidad metabólica (Zaman et al., 2002). En su administración crónica, se ha observado que los IECAs no inhiben completamente la generación de Ang II, fenómeno conocido como escape de Ang II, a pesar de que se mantiene su efecto antihipertensivo. Los mecanismos que subyacen a este evento aún no han sido descritos, pero se ha sugerido un aumento de la transcripción de ECA, así como un aumento de su actividad catalítica en células endoteliales tras el tratamiento crónico de un IECA (King y Oparil, 1992). Así mismo, el efecto protector de los IECAs puede verse aumentado por la bradiquinina. ECA cataliza la hidrólisis de bradiquinina en productos biológicamente activos, por lo que sus inhibidores conducen a la acumulación de bradiquinina la cual estimula la liberación de prostaglandinas vasodilatadoras y de NO, con efectos antioxidantes y anti-hipertensivos (Zaman et al., 2002). MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 8 -ARAII: son los tratamientos anti-hipertensivos más utilizados en hipertensión y trastornos cardiovasculares. Son altamente efectivos y bien tolerados por los pacientes. Se han desarrollado diferentes tipos entre los que se encuentran el losartán, valsartán, irbesartan, candesartán, telmisartán, entre los más utilizados. Todos ellos son compuestos no peptídicos que bloquean específicamente la unión de Ang II al receptor AT1 ocupando el espacio entre las siete hélices transmembrana del receptor, y sin actuar sobre los receptores AT2 (Zaman et al., 2002). Además, muchos estudios han demostrado que los ARAII presentan dobles mecanismos con efectos importantes. Específicamente el telmisartán también funciona como agonista de los receptores activados por proliferadores peroxisomales tipo γ (PPAR-γ, del inglés peroxisome proliferator-activated receptors γ), los cuales se caracterizan por tener efectos anti-inflamatorios (Garrido-Gil et al., 2012). Por diversas razones, entre las que se encuentran la falta de biodisponibilidad oral, la variabilidad en la eficacia anti-hipertensiva y la eficacia terapéutica de los IECAs y ARAII, el desarrollo tratamientos clínicos sobre otras dianas del SRA se ha visto reducido (Zaman et al., 2002; Seva Pessoa et al., 2013). Por ejemplo, los agonistas del receptor AT2, como el Compuesto 21 (C21) y el CGP-42112 (CG), han sido ampliamente estudiados. Sin embargo, el efecto protector de C21, disminuyendo mediadores pro-inflamatorios y activando la cascada NO/GMPc, se ha demostrado sólo en células renales (Verdonk et al., 2012) mientras que, el compuesto CG sólo ha mediado efectos hipotensores al combinarse con tratamientos bloqueantes del receptor AT1 (Tanaka et al., 1999). Los inhibidores de receptores Mas, como el A779, han demostrado el importante papel protector que presentan estos receptores (Zimpelmann y Burns, 2009). 1.2.SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA CEREBRAL El Sistema Nervioso Central (SNC) se encuentra protegido por la barrera hematoencefálica (BHE) que evita el paso de la mayoría de los componentes circulantes del SRA sistémico. Sin embargo, se ha INTRODUCCIÓN 15 promueven la apoptosis de neuronas, oligodendrocitos y astrocitos, favoreciendo la degeneración celular (Lee et al., 2009; Sanchez- Guajardo et al., 2010). La polarización hacia el estado anti-inflamatorio de la microglía normalmente se inicia mediante la estimulación de IL-4 o interleucina 13 (IL-13), que son secretadas por las células Th2 (Ghosh et al., 2016). Con este fenotipo, la microglía produce citoquinas antiinflamatorias como la Arginasa-1 (ARG-1), la interleucina tipo 10 (IL- 10) y el factor de crecimiento transformador de tipo β (TGF-β), quimioquinas (TARC y MDC) y factores de crecimiento que suprimen las respuestas pro-inflamatorias y contribuyen a la reparación y remodelación neuronal (David y Kroner, 2011). Por lo tanto, el fenotipo microglial puede tener efectos contrapuestos en los procesos que desencadenan la neurodegeneración (Joers et al., 2017). En referencia a la EP, se ha demostrado que la SNpc es una región muy densa en células microgliales y se caracteriza por la presencia de neuronas dopaminérgicas altamente vulnerables a las respuestas pro-inflamatorias (Picca et al., 2021). Múltiples estudios han demostrado la existencia de una respuesta inflamatoria microglial en SN y ST de pacientes con EP (Sanchez-Guajardo et al., 2010; Joers et al., 2017). Sin embargo, la presencia de microglía reactiva por sí sola no define su función, beneficiosa o prejudicial, en la neurodegeneración de la EP. La evaluación de los factores solubles, como las citoquinas, tanto en el tejido cerebral como en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y plasma, puede proporcionar datos sobre el fenotipo microglial y, por tanto, el efecto de la respuesta inflamatoria microglial en el inicio y progresión de la enfermedad (Joers et al., 2017). Además de la respuesta inflamatoria microglial, la existencia de astrocitos reactivos en el parénquima cerebral también es una característica de la neuroinflamación (Ransohoff y Perry, 2009). La astrogliosis se caracteriza por el aumento de los niveles de expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP, del inglés anti-glial fibrillary acidic protein) y la hipertrofia del cuerpo celular y de las extensiones celulares en respuesta a estímulos inflamatorios, como el lipopolisacárido (LPS), IL-1β y TNF-α (Wang et al., 2015a). En MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 16 consecuencia, los astrocitos producen mediadores inflamatorios, aunque en estadios más tardíos que la microglía, amplificando la neuroinflamación. La respuesta inflamatoria astroglial se ha observado en regiones cerebrales afectadas en pacientes de EP, así como en modelos animales y celulares (Yamada et al., 1992; Fellner et al., 2013; Wang et al., 2015a). La implicación de la respuesta inflamatoria microglial y los fenómenos de neuroinflamación en el inicio y progresión de la EP ha sido descrita (Joers et al., 2017). Sin embargo, los mecanismos por los cuales contribuyen a la patología de dicha enfermedad no han sido completamente dilucidados y requieren de estudios más profundos.  Implicación de la microglía en modelos de EP Los modelos animales de EP actuales sólo reproducen parcialmente la enfermedad, debido a que aún no se conocen todas las causas que inician y mantienen la neurodegeneración dopaminérgica (Falkenburger et al., 2016). Sin embargo, la neuroinflamación y la respuesta inflamatoria microglial han sido detectadas en diversos modelos de la enfermedad. Los modelos animales basados en neurotoxinas son los más ampliamente utilizados en EP, ya que permiten obtener una muerte celular selectiva de las neuronas dopaminérgicas y son capaces de generar un estado de estrés oxidativo e inflamación en la SNpc y/o en el ST (Blesa et al., 2012; Bezard et al., 2013). Las principales neurotoxinas utilizadas son: -6-Hidroxidopamina (6-OHDA): se trata de una molécula que se diferencia de la DA por la presencia de un grupo hidroxilo, lo que la convierte en una molécula tóxica para las neuronas dopaminérgicas. Debido a que la 6-OHDA es un producto propio del metabolismo endógeno de la DA, y produce lesiones específicas en la ruta nigroestriatal, se considera un buen candidato para el desarrollo de modelos animales de EP (Rodriguez-Pallares et al., 2007, 2008; Blesa et al., 2012; Jackson-Lewis et al., 2012). INTRODUCCIÓN 17 -1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP): esta molécula es transformada, por la acción del enzima monoamino oxidasa B cerebral, en su metabolito activo (MPP+), el cual es captado por el transportador de DA. El MPP+ intracelular se concentra en las mitocondrias, donde inhibe el complejo I de la cadena de transporte de electrones (Tipton y Singer, 1993) produciendo una reducción en la generación de adenosín trifosfato (ATP) y un aumento en la producción de radicales libres (Chan et al., 1991), lo que conduce a la muerte de neuronas dopaminérgicas. Los modelos inducidos por las mencionadas neurotoxinas cursan con una elevada respuesta inflamatoria microglial horas después de su administración, y antes de que se produzca una muerte neuronal dopaminérgica significativa (Blandini et al., 2008; Boyd et al., 2022). El aumento de expresión de citoquinas pro-inflamatorias también se ha encontrado en estos modelos, aunque existe variabilidad en cuanto al tipo de citoquinas. Probablemente estas diferencias se encuentren asociadas a diferentes dosis y tiempos utilizados en el modelo desarrollado, así como el lugar de la inyección (Depino et al., 2003). Además, otros estudios han demostrado que la administración a dosis no neurotóxica de la toxina inflamatoria LPS aumenta la degeneración neuronal inducida por 6-OHDA (Koprich et al., 2008), lo que sugiere una relación entre la inflamación periférica con la muerte neuronal dopaminérgica. Por lo tanto, la inhibición de la reacción glial y los procesos inflamatorios puede representar un enfoque terapéutico importante para retrasar la progresión de la EP (Lee et al., 2009). Sin embargo, aún se encuentran resultados contradictorios sobre los efectos neuroprotectores de los tratamientos con efectos anti-inflamatorios. Esto puede deberse a que los modelos animales basados en neurotoxinas no reproducen fielmente la patofisiología de la EP, especialmente en lo que a sinucleinopatía se refiere (Sarkar et al., 2016; Visanji et al., 2016; Koprich et al., 2017). Es importante destacar, que en los últimos años se ha descrito una importante relación entre la neuroinflamación y respuesta inflamatoria microglial con la toxicidad generada por la proteína α-syn (Zhang et al., 2017). En consecuencia, MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 18 se está avanzando rápidamente hacia la implementación de modelos animales basados en sinucleinopatía (Fajardo-Serrano et al., 2021). Así, se han desarrollado varios modelos de animales transgénicos que sobreexpresan el tipo salvaje (WT, del inglés Wild type) o formas mutadas de α-syn humana (A30P, E36K, A53T) con el objetivo de estudiar los efectos de la acumulación y agregación de αsyn en la muerte de neuronas dopaminérgicas (Magen y Chesselet, 2010). Los ratones transgénicos que sobreexpresan α-syn desarrollan neurodegeneración, pérdida de DA estriatal, disfunción locomotora e inclusiones citoplasmáticas, aunque éstas no conforman una estructura fibrilar que se asemeje a los cuerpos de Lewy con exactitud (Chia et al., 2020). Sin embargo, la pérdida neuronal suele ser débil o en regiones no relacionas con EP, por lo que la principal limitación de estos modelos es que no imita la expresión espaciotemporal de α-syn que se muestra en pacientes de EP (Visanji et al., 2016; Volpicelli-Daley, 2017). Para corregir estas limitaciones, actualmente se están desarrollando modelos que inducen la sobreexpresión de α-syn utilizando vectores virales, en particular vectores virales adenoasociados (AAV) (Bey et al., 2020), los cuales, gracias a la incorporación de promotores específicos, permiten una transducción y sobreexpresión de α-syn en regiones y/o tipos celulares relacionados con la fisiopatología de la EP humana. De forma general, se han encontrado 12 serotipos de AAV diferentes, siendo el serotipo 9 (AAV9) uno de los únicos capaz de atravesar la BHE y el que ha demostrado mayor eficacia de transducción en el SNC (Bey et al., 2020). Diversos estudios han demostrado que la sobreexpresión de αsyn humana mediada por vectores AAV reproduce distintas etapas de progresión de la enfermedad que coinciden con las etapas presintomáticas, sintomáticas tempranas y avanzadas observadas en pacientes con EP (Decressac et al., 2012; Volpicelli-Daley, 2017). En modelos con sobreexpresión de α-syn se ha demostrado una intensa respuesta neuroinflamatoria (Sanchez-Guajardo et al., 2010; Barkholt et al., 2012). Diversos estudios han observado que la microgliosis generada en estos modelos se produce en etapas iniciales INTRODUCCIÓN 19 en las que la muerte neuronal dopaminérgica todavía no es significativa. Por tanto, se ha sugerido que los agregados proteicos de α-syn liberan señales que inducen microgliosis e inflamación, provocando que un número creciente de células microgliales reaccionen y migren al sitio de la lesión para defender la progresiva muerte neuronal (Chavarria et al., 2022). Este evento dirige a la activación de la microglía con fenotipo pro-inflamatorio, encargado de la fagocitosis de α-syn y, posteriormente, a la activación de diferentes eventos pro-inflamatorios junto con una liberación elevada de citoquinas, lo que potencia la pérdida de neuronas dopaminérgicas y un estado de inflamación cerebral crónica en EP (Su et al., 2008; Lee et al., 2010). Sin embargo, los diferentes modelos de α-syn siguen mostrando resultados contradictorios. Las diferentes formas de α-syn exhiben diferentes efectos sobre la fagocitosis microglial y la respuesta inflamatoria. Por ejemplo, la proteína mutada α-syn-A53T desencadena una respuesta microglial pro-inflamatoria exacerbada y altera la fagocitosis (Hoenen et al., 2016). Hay que tener en cuenta que los modelos animales no son los únicos disponibles para estudiar procesos de neuroinflamación que transcurren durante la progresión de la neurodegeneración. Los modelos celulares son una forma rápida, menos costosa que los modelos animales, y que ofrecen la posibilidad de estudiar efectos y respuestas de diferentes tipos de células de forma individual (Falkenburger et al., 2016). Los resultados in vitro han demostrado el efecto neuroinmunomodulador de la microglía a través de la liberación de sustancias citotóxicas (ROS, NO, ácido araquidónico, citoquinas) (Harry y Kraft, 2008). Generalmente, la estimulación del fenotipo neurotóxico se induce por el tratamiento con LPS o el interferón tipo γ (IFN-γ) (Melchior et al., 2006). Los experimentos in vitro más utilizados son aquellos que utilizan líneas celulares inmortalizadas derivadas de poblaciones celulares de un organismo celular (Lopes et al., 2017), siendo las más utilizadas para microglía: N9, BV2 (ambas de linaje de ratón), HAPI, MLS-9 (ambas de linaje de rata), CHME-5 y HMO6 (ambas de linaje humano) (Timmerman et al., 2018). Los cultivos primarios, también MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 20 muy utilizados en modelos celulares, están constituidos por uno o más tipos celulares que han sido aislados de un tejido, generalmente embrionario (Lopes et al., 2017). En el caso de la microglía, los cultivos primarios generalmente derivan del tejido cerebral de animales neonatos (Timmerman et al., 2018). Hay que tener en cuenta que diversos estudios han revelado diferencias importantes entre las líneas microgliales de roedores y la microglía primaria (Horvath et al., 2008), por lo que los resultados obtenidos deben extrapolarse con precaución. Además, también existen diferencias entre la microglía in vitro e in vivo, atribuidas principalmente a la dificultad de cultivar microglía en un estado de reposo inactivo (Harry y Kraft, 2008). Las células microgliales pueden co-cultivarse con otros tipos celulares, como las neuronas, o realizar cultivos primarios mesencefálicos en los que se encuentran diversos tipos celulares. En estos cultivos multicelulares pueden realizarse estudios de la neuroinflamación de la EP mediante el uso de neurotoxinas (6-OHDA, MPTP) o α-syn (Lopes et al., 2017). 1.2.2. Receptores de angiotensina en la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson La expresión de diferentes componentes y receptores del SRA se ha demostrado en las estructuras cerebrales relacionadas con la EP. En la SNpc se han observado receptores AT1 y AT2 en neuronas dopaminérgicas, astrocitos y microglía de ratas (Rodriguez-Pallares et al., 2008), ratones (Joglar et al., 2009), primates no humanos (Valenzuela et al., 2010; Garrido-Gil et al., 2013, 2017) y cerebros humanos (Garrido-Gil et al., 2013). Además, estos receptores también se observaron en neuronas dopaminérgicas y células gliales de cultivos de células primarias de la región mesencefálica y varias líneas celulares neuronales y gliales (Rodriguez-Pallares et al., 2004, 2008; Joglar et al., 2009; Rodriguez-Perez et al., 2015). La relación entre el SRA y la EP fue definida por primera vez por Allen et al. (1992). A día de hoy, son numerosos los estudios en los que se ha demostrado el papel determinante del SRA en diversos procesos patológicos implicados en la progresión de la EP (Grammatopoulos et INTRODUCCIÓN 21 al., 2007; Zawada et al., 2011; Labandeira-Garcia et al., 2017), como son el envejecimiento, el estrés oxidativo y la neuroinflamación. Otros mecanismos importantes que subyacen en la EP, como son los cambios en el sistema dopaminérgico nigroestriatal y la implicación de hormonas sexuales, como los estrógenos, también se encuentran estrechamente relacionados con el SRA cerebral (Villar-Cheda et al., 2010, 2014; Rodriguez-Perez et al., 2012).  Estrés oxidativo y neuroinflamación El SRA cerebral se ha relacionado, tanto con procesos de estrés oxidativo y generación de ROS, como con la neuroinflamación en el SNC. La generación de ROS es esencial para el funcionamiento celular pero, una excesiva producción puede conducir a un estado de estrés oxidativo (Li et al., 2013), que constituye un factor principal de la muerte neuronal dopaminérgica que cursa en la EP (Wright et al., 2012). En las neuronas, la activación de los ejes Ang II/AT1 y (Pro)renina/PRR media propiedades pro-oxidativas y proinflamatorias, mientras que la activación de los ejes Ang II/AT2 y ECA2/Ang(1-7)/MasR media efectos anti-inflamatorios (Costa-Besada et al., 2018). Las evidencias acumuladas sugieren que la activación del eje Ang II/AT1 incremente la producción de ROS, a través del complejo enzimático NOX. Se ha demostrado que NOX produce superóxido (SO), el cual activa las vías del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-kB) y RhoA/Rho quinasa (ROCK) (Joglar et al., 2009; Borrajo et al., 2014b; Rodriguez- Perez et al., 2015; Lopez-Lopez et al., 2021). Es importante destacar que la activación de los receptores AT1 nucleares regula la expresión génica y desencadena varios mecanismos que protegen a las células contra el estrés oxidativo. En neuronas, el SRA nuclear aumenta la expresión del receptor AT2 y del ANG, y activa los ejes Ang II/AT2 y ECA2/Ang(1-7)/MasR para contrarrestar los efectos pro-oxidativos de la estimulación de los receptores AT1 (Villar-Cheda et al., 2017; Costa- Besada et al., 2018). En células microgliales esta relación está menos estudiada. MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 22 Diversos estudios han demostrado que la actividad y expresión de los componentes y receptores del SRA desempeñan un papel inmunorregulador, debido a que afecta a la función y fenotipo microglial mediante la activación de los receptores AT1, AT2 y MasR en mitocondrias, núcleos y membranas celulares (Garrido-Gil et al., 2013; Regenhardt et al., 2013; Costa-Besada et al., 2018). La respuesta pro-inflamatoria mediada por la estimulación del receptor AT1 es un mecanismo que exacerba la muerte neuronal e inflamación; mientras que la respuesta anti-inflamatoria, mediada por la estimulación del receptor AT2, conduce a la producción de citoquinas anti-inflamatorias y a la regulación positiva de los receptores fagocíticos que ayudan al aclaramiento sináptico (Rodriguez-Pallares et al., 2008; Regenhardt et al., 2013; Fouda et al., 2017). La regulación de la expresión de los receptores de Ang II, en células microgliales es compleja, y puede alterarse en eventos patológicos e inflamatorios, por lo que se necesitan más estudios para esclarecer los mecanismos que intervienen en esta compleja regulación.  Envejecimiento Muchos estudios han demostrado que los niveles de los diferentes componentes y receptores del SRA cambian a lo largo de la edad acelerando la senescencia celular y disfunción de tejidos y órganos mediante mecanismos de estrés oxidativo, inflamación, apoptosis y cambios vasculares (Cosarderelioglu et al., 2020). En el SRA cerebral, los niveles de expresión del receptor AT1 están regulados al alza en el envejecimiento (Abadir, 2011). También se observó que la expresión del eje Ang(1–7)/MasR disminuyó en ratas envejecidas (Costa-Besada et al., 2018). De manera similar, diversos estudios demostraron que la sobreactivación del eje Ang II/AT1/NOX cerebral conduce a una mayor vulnerabilidad celular al estrés oxidativo, debido a una disminución de los niveles de sirtuina tipo 3 (SIRT3), y que, además, los ejes de sirtuina tipo 1 (SIRT1), y Ang II/AT1 se encuentran alterados en animales envejecidos (Diaz-Ruiz et al., 2015; 2020). INTRODUCCIÓN 23  Sistema dopaminérgico nigro-estriatal Las interacciones entre la DA y Ang II, tanto en el ST como en la SN de roedores, se han demostrado en diversos estudios (Villar-Cheda et al., 2010, 2014). Particularmente, se ha observado que existe una regulación inversa entre los receptores de Ang II y de DA. Una disminución de los niveles de DA conduce a un aumento en la expresión de receptores AT1 en la SN y ST, lo que potencia la respuesta inflamatoria microglial y contribuye a la muerte de neuronas dopaminérgicas. Además, la DA también tiene función inmunomoduladora, ya que se encuentra presente en células inmunitarias, tanto en el SNC como en tejidos periféricos (Arreola et al., 2016). Estudios previos demuestran que la DA desempeña un papel anti-inflamatorio a través de la inhibición del SRA cerebral, y que la disminución de los niveles de DA en las primeras etapas de la EP y en el envejecimiento pueden promover la neuroinflamación y la progresión de la degeneración neuronal a través de la hiperactivación del eje pro-inflamatorio del SRA mediante los receptores AT1 (Dominguez-Meijide et al., 2017).  Dimorfismo sexual y efecto de las hormonas sexuales. Diversos estudios han mostrado la existencia de un dimorfismo sexual en el SRA cerebral, lo que puede repercutir en las respuestas inflamatorias microgliales y en progresión de la EP. En los últimos años se ha demostrado que la pérdida de estrógenos puede conducir a la activación del eje pro-oxidativo del SRA y al aumento de la vulnerabilidad de la muerte de neuronas dopaminérgicas en la SN de roedores (Rodriguez-Perez et al., 2010; 2011, 2012; Labandeira-Garcia et al., 2016). Se sabe que los efectos anti-inflamatorios de los estrógenos constituyen un mecanismo importante de neuroprotección (Vegeto et al., 2008). En consonancia con esto, diversos estudios han demostrado que el sistema nigroestriatal de las ratas macho muestra una mayor actividad del eje pro-oxidativo del SRA en comparación con las ratas hembra (Rodriguez-Perez et al., 2011). Curiosamente, el tratamiento con un bloqueante del receptor AT1 (ARAII), específicamente con candesartán, reduce significativamente la pérdida de neuronas dopaminérgicas en ratas menopáusicas ovariectomizadas MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 24 (Rodriguez-Perez et al., 2012), destacándose la importancia del receptor AT1 en las diferencias de sexo. La implicación de otros componentes del SRA está menos estudiado. 1.2.2.1.Tratamientos moduladores de los receptores del SRA: Efecto en neuroinflamación y degeneración dopaminérgica Actualmente, las terapias farmacológicas disponibles para la EP se centran en compensar la ausencia de señalización de DA en los núcleos basales y rescatar los síntomas motores cardinales (Valdes y Schneider, 2016; Kim et al., 2021), ya sea por la administración de un fármaco, como el precursor de la DA, L-3,4-dihidroxifenilalanina (L- DOPA) (Carlsson et al., 1957; Birkmayer y Hornykiewicz, 1998), o por la intervención quirúrgica de la estimulación cerebral profunda (Larson, 2014). Estas terapias son exclusivamente sintomáticas, incapaces de frenar la pérdida progresiva de neuronas dopaminérgicas y, aunque proporcionan beneficios de mejora en los síntomas motores de EP a corto plazo, la terapia crónica puede dar lugar a fluctuaciones motoras y discinesias (Kim et al., 2021). Se hace evidente, por tanto, la necesidad de desarrollar nuevas terapias neuroprotectoras (Dong et al., 2016). En los últimos años, la tasa de descubrimiento de fármacos para las enfermedades neurodegenerativas ha sido inferior a la tasa media obtenida para otras indicaciones terapéuticas (Wong et al., 2019). Una de las razones de esta falta de éxito puede atribuirse a la complejidad etiológica y a las numerosas vías biológicas implicadas en la neurodegeneración (Kim et al., 2021). Así, la búsqueda de biomarcadores tempranos de la enfermedad y, de una diana terapéutica común de la mayoría de los eventos patológicos que ocurren en la EP, podría ser una buena estrategia para el desarrollo de terapias neuroprotectoras. En apartados anteriores se ha definido que el envejecimiento, el estrés oxidativo y la neuroinflamación son factores determinantes en el desarrollo y progresión de la muerte neuronal dopaminérgica que cursa la EP, y se ha descrito como todos estos factores son regulados INTRODUCCIÓN 31 estudios han demostrado que los AT1-AA producen liberación de Ca++ en células endoteliales del músculo liso, lo que conduce a alteraciones vasculares (Sun et al., 2008). Además, el efecto de los AT1-AA es bloqueado por el uso de ARAII como el valsartán (Wang et al., 2017) e irbesartán (Wenzel et al., 2011). La causa que origina la producción de AT1-AA no ha sido del todo dilucidada. Sin embargo, la inflamación periférica parece ser un mecanismo implicado en la liberación de antígenos para la producción de los autoanticuerpos (LaMarca et al., 2009; Parrish et al., 2010; Mistry y Kaplan, 2017). Diferentes estudios han demostrado que la infusión de citoquinas circulantes, como el miembro 14 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF14 / LIGHT) (Luo et al., 2016) e IL-17 (Dhillion et al., 2012) son estimuladores de la producción de AT1-AA en modelos animales. Curiosamente en MetS se ha demostrado un aumento en mediadores pro-inflamatorios séricos (Whitton, 2007; Harlid et al., 2017), mientras que otros estudios demuestran que una dieta rica en grasa promueve la producción de AA en animales de experimentación (Arai et al., 2013). Además, estudios recientes, muestran que el MetS conduce a inflamación e hiperactivación del SRA tanto del tejido adiposo como del circulante (Ramkumar y Kohan, 2019; Schutten et al., 2017). Otro estudio demostró que el desarrollo de obesidad en un modelo animal induce un aumento en los niveles de Ang II circulante y un aumento en los niveles séricos de LIGHT (Harlid et al., 2017), el cual es capaz de activar el enzima transglutaminasa 2 (TG2). Este enzima se ha visto implicada en mecanismos de glicosilación del receptor AT1, lo que podría promover la producción de neoantígenos para producir AT1-AA (Liu et al., 2017a). Sin embargo, los niveles de AA frente a receptores del SRA no se han estudiado de forma específica en modelos animales de MetS, y aún se desconoce hasta qué punto estas respuestas inmunitarias periféricas contribuyen a la alteración de los receptores del SRA cerebral, así como al inicio y progresión de la EP. MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 32 Además, la progresión y la gravedad de varios procesos relacionados con la inflamación periférica se han asociado con la presencia de autoanticuerpos frente a otros componentes del SRA, como los autoanticuerpos frente al enzima ECA2 (ACE2-AA). Su función se ha relacionado con la inhibición de la función catalítica del enzima ECA2, lo que provoca una disminución en la síntesis de Ang(1- 7) y, por tanto, una disminución del eje anti-inflamatorio del SRA (Takahashi et al., 2010). Sin embargo, la causa y mecanismos de su producción aún no está definida. 1.3.2. Inflamación periférica aguda y receptores de angiotensina: COVID-19 En el último año se ha destacado la relación entre el SRA y el SARS-CoV-2, debido a que el ECA2 de la membrana celular se ha identificado como el receptor funcional de entrada del virus (Wan et al., 2020; Xu et al., 2020). Uno de los eventos fisiopatológicos asociados a la infección de SARS-CoV-2 y que, aumenta la gravedad de la COVID-19, es la respuesta inflamatoria sistémica aguda conocida como tormenta de citoquinas (Portales et al., 2022). La entrada del SARS-CoV a la célula media la liberación, tisular y sérica, de diferentes tipos de citoquinas pro-inflamatorias, estableciendo un estado de inflamación periférica aguda en el organismo (Cheung et al., 2005; Jiang et al., 2005; Chen et al., 2010). En apartados anteriores, se define que la inflamación periférica crónica asociada al envejecimiento puede provocar cambios en la expresión del ECA2, y otros receptores del SRA, en células cerebrales (Labandeira-Garcia et al., 2011; Costa-Besada et al., 2018; Diaz et al., 2020). Por tanto, la inflamación periférica aguda asociada a la COVID-19 podría promover cambios en la expresión de diferentes receptores y componentes del SRA pulmonar, lo cual a su vez, podría promover una mayor severidad en la progresión de esta enfermedad. 1.4.SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA PULMONAR Y SARS-COV-2 En los últimos años, la infección de SARS-CoV-2 ha generado una pandemia responsable de más de 600 millones de casos de infección y INTRODUCCIÓN 33 más de 6 millones de muertes acumuladas según la Organización Mundial de la Salud. Los principales síntomas de COVID-19 son respiratorios, sin embargo, los altos niveles de citoquinas asociados a la infección viral provocan síndrome de dificultad respiratoria aguda, insuficiencia orgánica y coagulopatía diseminada, lesiones cardíacas y renales agudas, arritmias, anomalías de la función intestinal y hepática, así como complicaciones neurológicas (Gheblawi et al., 2020; Guo et al., 2020; Sulzer et al., 2020; Mascolo et al., 2021). El mecanismo de entrada del virus SARS-CoV-2 se realiza mediante una proteína de su superficie celular denominada proteína Spike, que es responsable de unirse al ECA2 de membrana. Específicamente, la proteína Spike forma un trímero y cada monómero alberga un dominio de unión al receptor (RBD, del inglés Receptor Binding Domain) que interactúa con el ECA2 presente en la superficie celular (Xu et al., 2020), formando un complejo de unión distinto del sitio catalítico de ECA2 (Gheblawi et al., 2020; Bian y Li, 2021). Además, el SARSCoV- 2 ha evolucionado para utilizar una amplia gama de proteasas del huésped celular que incluyen catepsina L, catepsina B, tripsina, factor X, elastasa, furina y TMPRSS2 (proteasa transmembrana serina 2 del inglés transmembrane protease serine 2) para preparar a la proteína Spike, así como a su receptor ECA2, y facilitar su entrada a la célula (Millet y Whittaker, 2015; Gheblawi et al., 2020). 1.4.1. Enzima conversora de Angiotensina II (ECA2) como receptor de SARS-CoV-2 La expresión del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de ECA2 se ha demostrado prácticamente en todos los órganos (Harmer et al., 2002). En el tracto respiratorio, la mayoría (aproximadamente el 83%) de las células que expresan ECA2 son células del epitelio alveolar tipo II (Zou et al., 2020). Sin embargo, ECA2 también se expresa en otros tejidos, incluidos el corazón, el riñón, el endotelio, el intestino delgado y cerebro (Crackower et al., 2002; Hamming et al., 2004; Danilczyk et al., 2006; Costa-Besada et al., 2018). El ECA2 desempeña un papel clave en el equilibrio de los componentes y receptores del SRA, una MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 34 disminución en sus niveles de expresión puede provocar un estado proinflamatorio y pro-oxidativo, que puede conducir al desarrollo de diversas enfermedades como la insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, hipertensión y enfermedad pulmonar (Gheblawi et al., 2020). La infección de SARS-CoV-2 produce una disminución en la expresión de ECA2 a través de dos vías: por la vía endocítica y por la vía proteolítica: -Endocitosis mediada por receptor: el virus se introduce en el citoplasma celular mediante la formación de un endosoma, que contiene también el receptor de membrana ECA2. La principal vía endocítica para SARS-CoV es la dependiente de clatrina (Inoue et al., 2007). Además, se encontró endocitosis dependiente de balsas lipídicas como una nueva vía de entrada especializada de SARS- CoV (Lu et al., 2008). -Fusión de membrana: la fusión directa de la membrana plasmática está mediada por TMPRSS2, y a diferencia de la endocitosis mediada por receptor, el ECA2 participa sólo en la detención y fijación del virus en la superficie, mientras que TMPRSS2 es la encargada de inducir la fusión de la membrana entre el virus y la célula huésped (Hoffmann et al., 2020). Sin embargo, todos los mecanismos de entrada de SARS-CoV-2 se están viendo sujetos a una alta variabilidad en los resultados de investigación. Resulta evidente la necesidad de más ensayos experimentales que ayuden a determinar los diferentes mecanismos y qué papel tienen las diferentes proteínas asociadas al mecanismos de entrada del virus en diferentes tipos celulares. Además de la forma transmembrana, ECA2 también se ha encontrado en forma soluble en plasma y orina (Shaltout et al., 2007). Esta forma se produce principalemente por la acción de dos proteasas (dominio 17 de desintegrina y metalopeptidasa (ADAM17) y TMPRSS2, que realizan una escisión proteolítica del dominio extracelular de ECA2, proceso conocido como desprendimiento (Lambert et al., 2005). Los efectos de la ECA2 soluble aún presentan controversia, pero se sugiere que el enzima pierde la actividad INTRODUCCIÓN 35 catalítica. Específicamente, la actividad de ADAM17 se regula al alza tras la unión del SARS-CoV-2 y ECA2, facilitando la entrada viral (Liu et al., 2020), así como la pérdida de expresión de ECA2 de membrana. Esta pérdida promueve la acumulación de Ang II, lo que se ha corroborado con estudios que demuestran un aumento significativo en los niveles de Ang II en muestras de plasma de pacientes infectados con SARS-CoV-2 (Liu et al., 2020), y éstos niveles se correlacionaron con la carga viral y la lesión pulmonar (Bian y Li, 2021). El aumento de Ang II, con la consecuente activación del receptor AT1, desencadena una cascada de señalización que activa MAPK y produce la fosforilación de ADAM17 por la formación de ROS inducidas por NOX (Scott et al., 2011). Esta fosforilación aumenta la actividad de la proteasa, estableciéndose una retroalimentación positiva en la que los receptores del SRA tienen un papel clave. La expresión y actividad del enzima ECA2 también puede verse alterada por otros mecanismos independientes de la infección de SARS- CoV-2, y, que de forma indirecta pueden afectar a su entrada celular. Algunos factores implicados en la inactivación catalítica de ECA2 son la presencia de citoquinas pro-inflamatorias (Chen et al., 2020) y la acción de la aldosterona a través de la vía NOX (Keidar et al., 2005). Recientemente, se ha demostrado la interacción del ECA2 de membrana con receptores acoplados a proteínas G del SRA en tejido pulmonar de ratón adulto (Franco et al., 2020). Se ha demostrado que la interacción de ECA2 con el receptor AT1 conduce a una disminución de la expresión de ECA2 de membrana, mientras que la interacción con AT2 conduce a un aumento de expresión de ECA2 (Franco et al., 2020). Por ello, la expresión de otros receptores del SRA también tienen un papel relevante en la infección de SARS-CoV-2. Se sugiere que los cambios en los niveles de expresión son compensatorios en lugar de causales, ya que el SRA puede cambiar su equilibrio para restaurar la homeostasis y evitar el daño tisular, estableciéndose una regulación dinámica (Smart et al., 2020). Así mismo, la expresión de los diferentes receptores del SRA se ve alterada con el uso de tratamientos moduladores del SRA y sus receptores, y que, además, son ampliamente utilizados, como los anti- MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 36 inflamatorios no esteroideos (ibuprofeno), los bloqueantes del receptor AT1 (ARAII) y los inhibidores de ECA (IECAs). Por ello, se ha generado una gran controversia sobre si el uso de IECAs o ARAII puede aumentar el riesgo de infección viral, y, si los pacientes hipertensos, deben sustituir estos tratamientos anti-hipertensivos (Bian y Li, 2021). 1.4.1.1.Efecto del bloqueo de receptores de angiotensina o de ECA sobre ECA2 Aunque el ECA2 no es la diana celular directa de los ARAII, tanto su transcripción, traducción y actividad catalítica se ven modificadas por el uso de estos tratamientos debido a la interconectada naturaleza del SRA (Gheblawi et al., 2020; Labandeira-Garcia et al., 2022). El uso de IECA y ARAII, inhibe el eje ECA/Ang II/AT1 potenciando los efectos del ECA2 como contrarregulador endógeno del SRA (Gheblawi et al., 2020; Labandeira-Garcia et al., 2022). Actualmente, existe una alta controversia sobre cómo afectan estos tratamientos a la expresión de ECA2. Estudios recientes han demostrado que los ARAII aumentan de manera constante la expresión de ARNm, los niveles de proteína y la actividad catalítica de ECA2 en corazón, riñón y aorta torácica, pero los niveles en la expresión y en la actividad difieren entre los modelos experimentales (Gheblawi et al., 2020). Otros estudios demostraron que los IECAs, lisinopril y enalapril, pueden aumentar la expresión del ARNm de ECA2 en corazón de un modelo de hipertensión (Jessup et al., 2006) y de un modelo de infarto de miocardio (Ocaranza et al., 2006) en ratas. Además, otro estudio demostró que el IECA perindopril fue capaz de aumentar la expresión hepática de ECA2 en condiciones de fibrosis hepática en un modelo de rata (Huang et al., 2010). Sin embargo, otro estudio demostró que el IECA ramipril no aumentó la expresión de ECA2 después de un infarto de miocardio en un modelo de rata (Burchill et al., 2012). La controversia en los diferentes estudios puede deberse a varias razones. Una de ellas es la regulación específica a nivel tisular de ECA2, ya que se ha demostrado que los niveles de ARNm más altos se encuentran en el corazón mientras que su actividad catalítica es más alta en riñón (Gembardt et al., 2005). Otra razón puede deberse a las diferentes dosis INTRODUCCIÓN 37 y tiempos de tratamientos utilizados en los diferentes estudios, así como los diferentes modelos de inflamación utilizados. Resulta evidente que la regulación de la expresión y de la actividad de ECA2 por inhibidores del SRA requiere una caracterización adicional, sobretodo en tejidos principalmente afectados por la infección de SARS-CoV-2, como es el caso del pulmón, para poder concluir su efecto, adverso o beneficioso, en los pacientes infectados por SARS-CoV-2 (Labandeira-Garcia et al., 2022). 1.4.1.2.Efecto de moduladores indirectos de receptores de angiotensina sobre ECA2. Anti-inflamatorios no esteroideos Además de las posibles consecuencias de la administración de fármacos inhibidores/bloqueantes de receptores del SRA a pacientes con COVID-19, la seguridad de los anti-inflamatorios no esteroideos, en particular el ibuprofeno, también ha sido ampliamente cuestionada (Moore et al., 2020). Muchos estudios han discutido si el ibuprofeno aumenta o disminuye la expresión de ECA2 en pulmón y, por tanto, si afecta a la entrada del SARS-CoV-2 (Labandeira-Garcia et al., 2022). El principal mecanismo de acción del ibuprofeno es la inhibición del enzima COX-2. Estudios previos muestran interacciones entre COX-2 y receptores del SRA en varios tejidos (Wu et al., 2005). Por un lado, se ha demostrado que COX-2 aumenta la liberación de renina y la formación de Ang II, lo que provoca un aumento en la presión arterial por la activación del receptor AT1 (Quadri et al., 2016). Por otro lado, la activación del eje Ang II/AT1 conduce a la producción de mediadores inflamatorios entre los que se encuentra COX-2 (Suzuki et al., 2003). En este caso, el ibuprofeno puede mejorar la respuesta del eje protector ECA2/Ang(1-7)/MasR al inhibir la respuesta de los receptores del eje pro-inflamatorio del SRA (Smart et al., 2020). Los anti-inflamatorios no esteroideos también participan en la inhibición de la actividad de NF-kβ durante un estado de inflamación. El factor de transcripción NF-kβ controla la expresión de COX-2, entre una gran cantidad de otros mediadores inflamatorios, y tiene múltiples implicaciones en la patogénesis de la infección por SARS-CoV-2. En MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 38 primer lugar, se observa que la inhibición de NF-kβ evita la sobreexpresión renal del receptor AT1 en un modelo animal de ratas obesas (Luo et al., 2015). En segundo lugar, otro estudio, utilizando células endoteliales pulmonares, se ha observado que NF-kβ es utilizado por el virus SARS-CoV para regular al alza el micro-ARN- 200c-3p, responsable de regular a la baja la ECA2 (Liu et al., 2017b). Por tanto, la seguridad del uso de ibuprofeno en la infección por SARS- CoV-2 se ha cuestionado debido a su capacidad de regular al alza la expresión de ECA2 en diferentes modelos animales, como, por ejemplo, en fibrosis miocárdica de ratas diabéticas (Qiao et al., 2015). Sin embargo, el mecanismo directo por el que lleva a cabo este proceso aún es desconocido. Por tanto, diversos estudios postulan, que el aumento de ECA2 en el tejido pulmonar, ya sea por el tratamiento de anti-inflamatorios no esteroideos como el ibuprofeno, de bloqueantes del receptor AT1 (ARAII) o de inhibidores de ECA (IECAs), conduciría a una mayor susceptibilidad a la infección viral por SARS-CoV-2, aumentando la gravedad de la infección y conduciendo a un peor pronóstico. Sin embargo, muchos otros estudios han demostrado que un aumento en la actividad de ECA2 es esencial para equilibrar el SRA hacia la respuesta anti-inflamatoria y, por tanto, inhibir respuestas pro-inflamatorias. Así, varios estudios previos han demostrado efectos protectores de la activación del eje ECA2/Ang(1-7) en modelos experimentales de lesiones pulmonares (Rockx et al., 2009; Klein et al.,2013; Sarzani et al., 2020). Por tanto, se necesitan más estudios para establecer los mecanismos de regulación del ECA2, y otros receptores del SRA, por parte de dichos tratamientos, así como su influencia, beneficiosa o perjudicial, en la infección e inflamación ocasionada por SARS-CoV-2 (Figura 3). INTRODUCCIÓN 39 Figura 3: Representación esquemática de la doble función de ECA2 en la inflamación pulmonar inducida por la infección por SARS-CoV-2. El enzima ECA2 (enzima conversora de angiotensina II) es responsable de la conversión de Ang II (angiotensina II) en Angiotensina(1-7) y, por tanto, de regular el SRA (Sistema Renina-Angiotensina) hacia el eje anti-inflamatorio, disminuyendo la actividad del eje pro-inflamatorio mediado por Ang II/AT1 (receptores de angiotensina tipo1) (1). Por otro lado, el ECA2 es el receptor de entrada celular del virus SARS-CoV-2 (coronavirus de tipo 2 causante del síndrome respiratorio agudo severo 2), por lo que su expresión puede asociarse con una mayor susceptibilidad y un aumento en la gravedad de la infección que desemboca en un incremento de la inflamación pulmonar (2). MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 44 correspondiente de la Universidad de Santiago de Compostela. Los procedimientos fueron desarrollados en el centro usuario autorizado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo el registro REGA: ES150780263401 y en el Centro de Biomedicina Experimental de la Universidad de Santiago de Compostela (CEBEGA), enmarcados en el proyecto autorizado para experimentación animal con los códigos 15005/15/002 y 5012/2021/012. Los animales dispusieron de un período mínimo de aclimatación de 7 días antes del comienzo de los experimentos y ninguno fue sometido a estudios previos. Para el estudio se utilizaron un total de 220 ratas macho adultas que se dividieron aleatoriamente en tres grandes grupos (ANEXO I, Tabla I): -Grupo A: formado por ratas lesionadas mediante la inyección estereotáxica unilateral en el mesencéfalo derecho y sacrificadas a la semana de la lesión (Experimento I). Los animales del grupo A (n = 50) fueron distribuidos en tres subgrupos: -Grupo A1: formado por ratas lesionadas con AAV9-α-syn-WT (n = 5) y un grupo de ratas lesionadas tratadas simultáneamente con candesartán (n = 5) o telmisartán (n = 5), desde 1 semana antes de la lesión hasta el sacrificio. -Grupo A2: formado por ratas lesionadas con AAV9-α-syn- A53T (n = 5) y un grupo de ratas lesionadas tratadas simultáneamente con candesartán (n = 5) o telmisartán (n = 5), desde 1 semana antes de la lesión hasta el sacrificio. -Grupo A3: formado por ratas control (sin lesión estereotáxica; n = 5) y por ratas lesionadas en el mesencéfalo derecho mediante la inyección estereotáxica de solución salina (n = 5), o de vectores AAV9 neuroespecíficos vacíos (Ф) (AAV9-vacío; n = 5), o de AAV9 neuroespecíficos que expresan proteína verde fluorescente (GFP) humana (n = 5), desde 1 semana antes de la lesión hasta el sacrificio. MATERIAL Y MÉTODOS 45 -Grupo B: formado por ratas lesionadas mediante la inyección estereotáxica unilateral en el mesencéfalo derecho y sacrificadas a las cuatro semanas post-lesión (Experimento II). Los animales del grupo B (n = 170) fueron distribuidos en tres subgrupos: -Grupo B1: formado por (1) ratas lesionadas con AAV9-α-syn- WT (n = 21), (2) ratas lesionadas tratadas simultáneamente con candesartán (n = 18) o telmisartán (n = 18). - Grupo B2: formado por (1) ratas lesionadas con AAV9-α-syn- A53T (n = 21); (2) ratas lesionadas tratadas simultáneamente con candesartán (n=18) ó (3) telmisartán (n = 18). -Grupo B3: formado por (1) ratas control (sin lesión estereotáxica; n = 15); (2) ratas lesionadas en el mesencéfalo derecho mediante la inyección estereotáxica de solución salina (n = 15), ó (3) de vectores AAV9 neuroespecíficos vacíos (Ф) (AAV9-vacío; n = 14), ó (4) de AAV9 neuroespecíficos que expresan proteína verde fluorescente (GFP) humana (n = 12). Los tratamientos con los bloqueantes del receptor AT1, candesartán o telmisartán, de los grupos de animales A y B se administraron por vía oral, dispersos en la mínima cantidad necesaria de crema de avellanas (“Nocilla”; Nutrexpa, Barcelona, España). Los tratamientos se iniciaron una semana antes de la inyección estereotáxica y se mantuvieron hasta el sacrificio de los animales con una dosis de 1mg/Kg/día para ambos fármacos, seleccionadas en base a resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio (Garrido-Gil et al., 2012; Rodriguez-Perez et al., 2012). Los animales del grupo control A3 y B3 recibieron únicamente la crema de avellanas. Los tratamientos fueron administrados entre las 9:00-10:00h de cada día. Para el sacrificio, los animales fueron anestesiados con la combinación de ketamina (50mg/kg) / medetomidina (0,4mg/kg) inyectada intraperitonealmente. MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 46 Una parte de las ratas de los diferentes grupos se perfundió con el fin de realizar los estudios histológicos, en los que se analizó la sobreexpresión de α-syn o GFP o α-syn fosforilada en las neuronas dopaminérgicas, en las células microgliales y en astrocitos de la SNpc mediante doble inmunofluorescencia y microscopía confocal de barrido láser. También se realizó inmunohistoquímica para determinar la muerte de células dopaminérgicas (junto con una tinción Nissl) o la respuesta inflamatoria microglial. Otra parte de las ratas de los diferentes grupos fue utilizada para determinar los niveles de expresión de receptores del SRA y marcadores de actividad microglial, así como medidas de actividad enzimática. Para ello, los cerebros fueron extraídos, la región de la SNpc disecada y congelada inmediatamente en nitrógeno líquido y posteriormente, almacenada en -80ºC. Sobre este material se realizaron determinaciones de RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, del inglés reverse transcriptase polymerase chain reaction), WB (Western Blot) y ensayos enzimáticos para determinar la expresión del receptor AT1, actividad NOX, marcadores de actividad fagocítica (CD68, cluster de diferenciación 68), y marcadores de microglía con fenotipo pro-oxidante como iNOS (óxido nítrico sintasa inducible), TNF-α, IL- 1β e IL-6 y anti-oxidante(ARG-1). 3.1.2. Modelo de lesión con AAV9-α-syn-WT y AAV9-α-syn- A53T en ratas El modelo de EP basado en la sobreexpresión de la proteína α-syn humana se realizó mediante la inyección estereotáxica unilateral de los AAV9-α-syn-WT o AAV9-α-syn-A53T (Grupos A y B) y salino, AAV9-vacío o AAV9-GFP (Grupo C). Todos los vectores virales utilizados en el presente modelo fueron sintetizados y diseñados en el laboratorio de Neuroanatomía de los Ganglios Basales del Dr. José Luis Lanciego, en el Centro de Investigación Médica Aplicada de la Universidad de Navarra, España. Para realizar la cirugía, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina (50mg/kg) / medetomidina (0,4mg/kg) y fueron colocados en el aparato de MATERIAL Y MÉTODOS 47 estereotaxia (Kopf Instruments) con la barra dental a -2,3 mm. La inyección se realizó en el mesencéfalo dorsal derecho siguiendo las coordenadas: -5,4 mm anterior al bregma, -1,9 mm a la derecha de la línea media y -7,0 mm ventral a la duramadre (Paxinos y Watson, 1986). La solución se inyectó usando una jeringa Hamilton de 5μl acoplada a un inyector monitorizado (Stoeling), a una velocidad de 0,5μl/min (2µl para el grupo AAV9-α-syn-WT y 1µl AAV9-α-syn- A53T) y la aguja se mantuvo in situ en torno a 10 minutos una vez se realizó la inyección para evitar el reflujo del vector viral a través del tracto de la inyección. 3.1.3. Pruebas de comportamiento motor del modelo de lesión con α-syn Tras 4 semanas de lesión se realizaron pruebas de comportamiento animal para evaluar la eficacia de la lesión dopaminérgica inducida por la inyección de AAV9-α-syn-WT o AAV9-α-syn-A53T, así como el efecto neuroprotector de los ARAII, candesartán y telmisartán. Todas las pruebas motoras se realizaron durante el período de oscuridad, en el cual los animales se encuentran en su fase activa del ciclo. -Test del cilindro: se realizó para evaluar la acinesia de las extremidades anteriores (Schallert et al., 1997). Los animales se colocaron individualmente en un cilindro de vidrio de 20cm de diámetro con dos espejos, para permitir la visualización desde todas las direcciones. Los animales fueron grabados en video y se contó el número de contactos que realizan con cada una de sus extremidades anteriores en la pared del cilindro, hasta un total de 20 contactos. Los datos se expresaron como porcentaje de contactos con la extremidad impedida en relación con el total. -Test de actividad locomotora: la actividad locomotora global de los animales se monitorizó automáticamente con un analizador de movimiento Videomex-X (Columbus Instruments), el cual realiza un vídeo que monitoriza la imagen a tiempo real (20 fotogramas por segundo; Rozas et al., 1996). Con el programa de monitorización de movimiento múltiple se estimó la actividad total (tasa de movimiento) que representa la MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 48 cantidad de cambios en la imagen de un fotograma a otro. De este modo, el programa cuenta el número de cambios de píxeles causados por los movimientos de cada animal. El ensayo se llevó a cabo en una caja abierta de paredes y suelo negros, con las siguientes dimensiones: 70 x 75 x 40 cm. Cada animal se aclimató durante, al menos, 10 minutos, y se monitorizó la actividad locomotora durante 30 minutos. -Test del rotarod: permite una evaluación automatizada de los déficits motores generales ocasionados en modelos de EP y una identificación de los cambios inducidos por tratamientos neuroprotectores (Rozas et al., 1997). Se realizó con una unidad de rotarod automatizada de 4 carriles (CR-1 Rotamex System, Columbus Instruments, Columbus, OH) aplicando un protocolo de velocidad de rotación acelerada. Los animales fueron colocados en la barra giratoria, a una velocidad inicial de 4 revoluciones por minuto (rpm). A continuación, se incrementó la velocidad de la barra hasta 44 rpm durante 90 segundos, y se registró el tiempo total de carrera sobre la barra. Los animales fueron entrenados 2 días consecutivos para alcanzar un rendimiento estable en la prueba, y los datos se tomaron en los 3 días siguientes de forma consecutiva. Los resultados se obtuvieron como la media de los 3 días para cada animal. Finalmente, se presentaron los resultados de cada animal como el área bajo la curva (AUC del inglés Area Under Curve; Rozas et al., 1997; Lundblad et al., 2003). 3.1.4. Técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en el modelo de lesión con α-syn La técnica de inmunohistoquímica se realizó para confirmar la lesión dopaminérgica mediante el marcaje y contaje de células inmunorreactivas al marcador de tirosina hidroxilasa (TH-ir, junto con una tinción de Nissl) y para estudiar la respuesta inflamatoria microglial mediante el marcaje y contaje de células inmunorreactivas para MHC de clase II (OX-6-ir). MATERIAL Y MÉTODOS 49 Los animales fueron anestesiados y perfundidos con 0,9% de salino e inmediatamente después con paraformaldehído frío al 4% en 0,2M de tampón fosfato (0,162M de Na2HPO4 y 0,036M NaH2PO4), a pH 7,4. Tras la perfusión, los cerebros fueron extraídos, lavados y almacenados durante 48 horas en una solución crioprotectora (tampón fosfato con 20% de sacarosa) a 4ºC. A continuación, el tejido fue cortado en secciones de 40 μm usando un microtomo de congelación y se almacenaron en una solución crioprotectora a -20ºC hasta su procesamiento. En primer lugar, se seleccionaron secciones a nivel de la SN y del ST. Las secciones de tejido fueron incubadas 1 hora a temperatura ambiente en una solución con 10% de suero porcino normal, 0,25% de Triton X-100 en 20mM de PBS (buffer fosfato salino) potásico (KPBS) que contenían 1% de BSA (seroalbúmina bovina, del inglés bovine serum albumin) (KPBS-BSA). Posteriormente las secciones fueron incubadas a 4ºC durante toda la noche con los anticuerpos primarios correspondientes (Tabla 2). Tirosina hidroxilasa (TH): se trata del enzima limitante en la síntesis de DA, considerándose un marcador de neuronas dopaminérgicas. Se utilizó, por tanto, un anticuerpo primario anti-TH (1:10.000, T2928, Sigma; ver Tabla 2) MHC de clase II (OX-6): se trata de un complejo proteico que desempeña un papel importante tanto en la respuesta inmunitaria innata como en la adaptativa, y se ha demostrado su expresión en microglía por inducción de α-syn en experimentación in vivo e in vitro (Harms et al., 2013). Se considera un marcador de microglía con respuesta inflamatoria, por lo que se utilizó un anticuerpo anti-MHCII (1:50, MCA46G, BioRad, ver Tabla 2). Todos los anticuerpos primarios fueron diluidos en una solución con 2% de suero normal de caballo, 0,25% de Triton X-100 en 20mM de KPBS con un 1% de BSA. Al día siguiente, las secciones se incubaron durante 90 minutos en los correspondientes anticuerpos secundarios biotinilados (caballo anti-ratón, 1:200, ver Tabla 3) y, a MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 50 continuación, se trataron durante 90 minutos con un complejo avidinabiotina-peroxidasa (1:50, Vector, Burlingame, CA) a temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se revelaron con 0,04% de peróxido de hidrogeno y 0,005 % de 3,3´-diaminobezidina (DAB). Para intensificar la tinción microglial (OX-6) se añadió 0,1% de níquel a la solución del revelado. Para la tinción de control negativo, las secciones se incubaron en solución, sin anticuerpos primarios. Una vez reveladas, las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina para su visualización. Las microfotografías fueron realizadas empleando el microscopio Eclipse, NIKON (139263, Japón). Para confirmar la muerte de las células dopaminérgicas, y no sólo la disminución de la actividad enzimática de TH, se realizó una tinción de Nissl. Para ello se seleccionaron secciones a nivel de SN, se montaron en portaobjetos recubiertos con gelatina y se tiñeron durante 5 minutos con violeta de Cresilo al 1% (C0775, Sigma) disuelto en agua destilada. A continuación, las secciones teñidas se deshidrataron mediante etanol graduado (100%, 95%, 70% y 50%), se aclararon en xileno durante 5 minutos, se montaron con medio de montaje DPX (Panreac Applichem, Barcelona, España) y se cubrieron con un portaobjetos para su posterior visualización y contaje. La técnica de inmunofluorescencia se realizó para confirmar la sobreexpresión y colocalización de α-syn, GFP o α-syn fosforilada en las neuronas dopaminérgicas (TH-ir), las células microgliales (Iba-1-ir, molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1, del inglés Ionized calcium binding adaptor molecule 1), y astrocitos (GFAP-ir, proteína ácida fibrilar glial, del inglés anti-glial fibrillary acidic protein) en la SNpc utilizando microscopía confocal de barrido láser. Los cerebros fueron procesados como se ha descrito anteriormente y las secciones correspondientes al nivel de la SNpc fueron utilizadas para el estudio. Para el análisis de expresión de la proteína α-syn humana en los diferentes tipos celulares, se realizó una recuperación antigénica en las secciones. Para ello, las secciones fueron incubadas a 37ºC durante 30 minutos en tampón citrato de sodio (10 mM de citrato de sodio, 0,05% MATERIAL Y MÉTODOS 51 de Tween 20, pH 6,0). Posteriormente, las secciones se incubaron en solución salina tamponada con KPBS-BSA y 5% de suero porcino normal durante 60 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se incubaron a 4ºC durante toda la noche con los anticuerpos primarios (Tabla 2). Por un lado, se realizó un marcaje de doble inmunofluorescencia para identificar las células que expresan GFP, α-syn o α-syn- fosforilada. Por otro lado, los anticuerpos contra α-syn se combinaron con TH, GFAP o Iba-1 para estudiar su posible colocalización con los marcadores celulares para neuronas dopaminérgicas, astrocitos y microglía, respectivamente (Tabla 2). Tras la incubación de los anticuerpos primarios, la inmunorreacción se visualizó con los correspondientes anticuerpos secundarios fluorescentes (Tabla 3). Por último, las secciones se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con el colorante de unión al ácido desoxirribunuleico (ADN) Hoechst 33342 (10µg/ml; 3 x 10-5 M, sigma) en KPBS para la tinción nuclear. Las secciones se montaron en portaobjetos recubiertos de gelatina y se cubrieron con Shandon Immu Mount (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Antígeno Especie Tipo Dilución Casa Comercial /Referencia TH Ratón Monoclonal 1:10000 Sigma / T2928 OX-6 Ratón Monoclonal 1:50 BioRad / MCA46G α-syn-WT Ratón Monoclonal 1:500 Abcam / ab80627 α-syn-A53T Ratón Monoclonal 1:200 Invitrogen / 18-0215 α-syn- fosforilada Conejo Monoclonal 1:1000 Abcam / ab51253 TH Conejo Policlonal 1:1000 Merck Millipore / ab152 GFAP Ratón Monoclonal 1:500 Merck Millipore / MAB360 Iba-1 Conejo Policlonal 1:500 Wako / 019-19741 Tabla 2: Anticuerpos primarios utilizados en inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en el modelo de lesión con AAV9-α-syn. Abreviaturas: TH, Tiroxina Hidroxilasa; OX-6, MHC de clase II; α-syn, α-sinucleína; WT, forma salvaje; GFAP. proteína ácida fibrilar glial; Iba-1, molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1. Antígeno Especie Dilución Casa Comercial / Referencia IgG Ratón Caballo 1:200 Vector Laboratories / BA2001 IgG Conejo Mono 1:200 Molecular Probes / A-21202 (Alexa Fluor 568) IgG Ratón Burro 1:200 Molecular Probes / A-10042 (Alexa Fluor 488) MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 52 IgG Ratón Cabra 1:200 Molecular Probes / A-11004 (Alexa Fluor 568) Tabla 3: Anticuerpos secundarios utilizados en inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en el modelo de lesión con AAV9-α-syn. Abreviaturas: IgG, inmunoglobulina de tipo G 3.1.4.1.Cuantificación estereológica y densidad de terminales estriatales El número total de neuronas TH positivas (TH-ir), de células OX-6 positivas (OX6-ir) y el número total de neuronas de la SNpc se estimaron mediante el método de estereología imparcial (fraccionador óptico) utilizando un sistema Olympus CAST–Grid (Computer Assited Stereological Toolbox; Olympus, Ballerup, Dinamarca). La cuantificación se realizó en la SNpc de, al menos, seis secciones elegidas al azar para cada uno de los grupos experimentales mediante una rejilla estereológica (fraccionador), y se estimó el volumen de la SNpc según el método de Cavalieri (Gundersen et al., 1988; Rey et al., 2007). La densidad de los terminales dopaminérgicos estriatales se estimó con la ayuda del software de análisis de imágenes NIH-Image 1.55 (National Institutes of Health, Bethesda, MD) en un ordenador acoplado a una videocámara (CCD-72, DAGE-MTI, INC, Michigan City, IND) y a una mesa de luz de iluminación constante (Northern Light, St. Catharines, Canadá). Se midieron, al menos, cuatro secciones del ST central y, para cada sección, se corrigieron las densidades ópticas mediante la diferencia del fondo seleccionada en el cuerpo calloso. 3.1.4.2.Microscopia confocal: análisis de colocalización Las secciones de inmunofluorescencia se visualizaron con un microscopio confocal de barrido láser (AOBS-SP5X; Leica Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Alemania). Para el análisis de colocalización de GFP, α-syn o α-syn fosforilada con los diferentes tipos celulares, se obtuvieron tres imágenes de la SNpc por animal en diferentes coordinadas de su eje antero-posterior (-5’20, - 5’60 y -6’04 mm desde el bregma). Las imágenes se obtuvieron con el objetivo 10x utilizando parámetros de microscopia constantes y una intensidad de láser similar. Se delimitó la SNpc en cada imagen y se MATERIAL Y MÉTODOS 59 pérdida de neuronas dopaminérgicas en la SNpc en ausencia del receptor AT2. -Grupo 1D: formado por ratones adultos AT2KO y WT (n=21) y ratas jóvenes (n=6) y envejecidas (n=6). Los animales fueron utilizados para confirmar los resultados obtenidos en experimentos in vitro (ver más adelante) en referencia a la regulación del receptor AT2 en la expresión del ARNm del receptor AT1. Para los estudios bioquímicos (grupos 1A y 1B), los ratones fueron sacrificados, los cerebros fueron extraídos, se disecó la región de la SNpc y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y, posteriormente, almacenada en -80ºC. Además, se utilizaron mitocondrias puras aisladas del cerebro de ratón para evaluar la actividad de la citocromo C oxidasa (COX). Los animales del grupo 1D se utilizaron para aislar la microglía y neuronas dopaminérgicas de los cerebros adultos, que se obtuvieron mediante la clasificación magnética de la microglía (utilizando microperlas anti CD11b) y la microdisección por captura láser, respectivamente. -Grupo 2: se realizaron experimentos in vitro para estudiar los mecanismos moleculares implicados en la regulación de los receptores AT2 en células microgliales en estado de inflamación y su implicación en la muerte neuronal dopaminérgica (Experimento IV). Para ello se emplearon dos subgrupos: -Grupo 2A: Un primer grupo de experimentos se realizó para estudiar el papel de la interacción de los receptores AT1/AT2 microgliales en condiciones de inflamación microglial. Para ello, se utilizaron cultivos de microglía primaria y la línea celular microglial N9, tratados con LPS (10 nM; Sigma) o con LPS y/o el agonista para el receptor AT2, CGP-42112 (CG, 200 nM; Sigma), o LPS y/o el antagonista del receptor AT1 (ARAII), ZD-7155 (1 μM; Sigma). Los agonistas y/o antagonistas se administraron 30 minutos antes de añadir el tratamiento con LPS (n = 6, por grupo). Después de 24 horas, se recogieron las células y/o el medio de cultivo para determinar la MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 60 expresión de ARNm y proteínas de los receptores AT1 y AT2, la actividad NOX, la liberación de TNF-α y la actividad de ROCK. Las dosis utilizadas se seleccionaron en función de estudios anteriores (Borrajo et al., 2014a, 2014b; Dominguez- Meijide et al., 2017). También se determinó el efecto de la supresión del receptor AT2 en la expresión del receptor AT1 utilizando microglía primaria de ratón AT2KO. -Grupo 2B: se utilizó para investigar los posibles mecanismos implicados en la regulación de la expresión del receptor AT1 mediados por AT2 durante la respuesta inflamatoria microglial inducida por LPS. Para ello se utilizaron cultivos de microglía primaria y línea celular microglial N9 tratadas con LPS (10nM) y/o con el inhibidor del enzima NOS, Nω-Nitro-L-arginina metil éster clorhidrato (L-NAME, 100 μM, Sigma), o el inhibidor específico para el enzima GMPc, 1H-[1,2,4]- oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one (ODQ, 10 μM; Sigma), o el inhibidor específico del factor de transcripción Sp1, Mitramicina A (MMA, 400nM; Sigma) o el antagonista del receptor Mas, A779 (1 μM; Bachem). Algunos cultivos fueron tratados con LPS o LPS más CG para estudiar posibles efectos de la activación de AT2 en la activación de los factores de transcripción Sp1 y Sp3. Los distintos inhibidores se administraron 30 minutos antes de la adición del tratamiento con LPS (n = 6, por grupo), y se determinó la expresión del ARNm y de la proteína del receptor AT1 o la actividad de los factores de transcripción Sp1 o Sp3 24 h después. Las dosis utilizadas en los experimentos se seleccionaron en la base a estudios anteriores con L- NAME y A779 (Costa-Besada et al., 2018), ODQ (Nimmervoll et al., 2009) y MMA (Wang et al., 2014a). Todos los datos procedentes de los experimentos de cultivos celulares se obtuvieron de, al menos, tres experimentos independientes con, al menos, n = 6, por grupo. -Grupo 3: se realizaron experimentos para estudiar el dimorfismo sexual en la expresión del receptor AT2 y su influencia en la MATERIAL Y MÉTODOS 61 neuroinflamación y generación de mediadores inflamatorios (Experimento V). Para ello se realizaron los siguientes subgrupos: -Grupo 3A: se aislaron células microgliales adultas de cerebros de ratones WT machos (n = 14), hembras (n = 14) y hembras ovariectomizadas (OVX) (n = 14) y se usaron para estudiar el efecto del sexo y de los niveles de estrógeno circulante sobre la expresión del ARNm del receptor AT2 y de citoquinas antiinflamatorias (IL-10) y pro-inflamatorias (IL-1β, IL-6). Se usaron dos cerebros de ratón para obtener una muestra de células microgliales. Un segundo grupo de ratones WT machos (n = 8) y hembras (n = 8) se perfundieron rápidamente con solución salina fría, se extrajeron los cerebros y se procesaron para el aislamiento microglial, como controles para excluir cualquier contaminación por células sanguíneas circulantes. Se incluyó un grupo adicional de ratones WT machos (n = 5) y hembras (n = 10) para observar la expresión de ARNm de los receptores AT2 en células microgliales en secciones de tejido cerebral que contenían la SNpc mediante hibridación in situ con RNAscope. -Grupo 3B: se aislaron células microgliales adultas de ratones macho AT2KO (n = 14), ratones hembra AT2KO (n = 14) y ratones hembra AT2KO ovariectomizados (n = 14) para evaluar el efecto de la ausencia del receptor AT2 en las diferencias relacionadas con el sexo y los niveles de estrógeno circulante en la expresión de citoquinas pro y anti-inflamatorias. -Grupo 3C: se aislaron células microgliales adultas de ratones hembra WT (n = 8) y ratones hembra AT2KO (n = 8) tratados con LPS (5 mg/kg por inyección intraperitoneal) o con salino (n = 8) y sacrificados 24 h más tarde para observar la respuesta inflamatoria periférica aguda en presencia y en ausencia del receptor AT2, y entre machos y hembras. -Grupo 3D: se investigaron otros posibles mecanismos implicados en las diferencias de sexo observadas en la expresión del receptor AT2 microglial. En un primer experimento, los ratones WT macho fueron orquiectomizados bilateralmente (n = MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 62 10) para analizar los posibles efectos de las hormonas gonadales masculinas. En un segundo experimento, las crías WT hembra (n = 12) se sometieron a masculinización cerebral mediante inyecciones subcutáneas de benzoato de estradiol. 3.2.2. Pruebas de comportamiento motor en un modelo de envejecimiento Para estudiar la implicación del receptor AT2 en el comportamiento motor influenciado por la inflamación periférica crónica que cursa el envejecimiento, se realizaron las pruebas de comportamiento motor: test de actividad locomotora y test de rotarod, descritas de forma detallada en el apartado anterior 3.1.3.Pruebas de comportamiento motor del modelo de lesión con α-syn 3.2.3. Inmunohistoquímica de TH y análisis estereológico El efecto de la ausencia del receptor AT2 sobre la supervivencia de neuronas dopaminérgicas fue estudiado mediante el análisis inmunohistoquímico del marcador TH en la región de la SNpc de ratones WT y AT2KO, descrito en el apartado 3.1.4.Técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en el modelo de lesión con α-syn. 3.2.4. Cromatografía de alto rendimiento del sistema dopaminérgico Con el fin de estudiar la influencia del receptor AT2 en el sistema dopaminérgico estriatal, se analizaron los niveles de DA y su metabolito DOPAC en el estriado de ratones WT y AT2KO mediante la técnica HPLC descrita en el apartado 3.1.5. Cromatografía de alto rendimiento para el modelo de lesión de α-syn. 3.2.5. Microdisección por captura láser La microdisección por captura láser de las neuronas de la SN de ratón fue realizada siguiendo el protocolo descrito previamente por Garrido-Gil et al., (2017), con ligeras modificaciones. Los cerebros fueron extraídos rápidamente, congelados con nitrógeno líquido y almacenados a -80ºC. Posteriormente, se cortaron secciones coronales MATERIAL Y MÉTODOS 63 con un criostato (Thermo Scientific) a un grosor de 20μm a nivel de la SN. Dichas secciones se montaron en un portaobjetos de vidrio y fueron teñidas con un protocolo acortado para rojo neutro al 1% en agua DEPC, durante 2 minutos en frío. Finalmente, las secciones de tejido fueron deshidratadas con concentraciones crecientes de etanol y se les realizó la microdisección por captura láser usando el sistema PALM MicroBeam (Zeiss) controlado por el software Robo PALM. Las neuronas dopaminérgicas de la SN se visualizaron bajo microscopía de campo brillante con un aumento de 40x con la ayuda de una cámara AxioCam Icc (Zeiss). Se seleccionaron grupos de células (1000 neuronas por animal) usando el software correspondiente, y luego se cortaron y catapultaron mediante pulsos de láser a una tapa de microtubo adhesivo (Zeiss). Los grupos de células se lisaron inmediatamente durante 30 minutos a temperatura ambiente en un tampón de lisis (RNesy Microkit, Qiagen) y se almacenaron a -80ºC hasta la posterior extracción de ARNm. 3.2.6. Aislamiento de mitocondrias cerebrales y análisis de la actividad del citocromo c oxidasa En homogenados cerebrales de ratones WT y AT2KO jóvenes (2 meses), adultos (12 meses) y envejecidos (18 meses) se midió la actividad del complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial (COX IV) como marcador de la función mitocondrial y la producción de ROS, ya que la disfunción mitocondrial (es decir, la disminución de la actividad del complejo IV) se ha asociado con el estrés oxidativo observado durante el envejecimiento (Payne y Chinnery, 2015). En primer lugar, se aislaron las mitocondrias cerebrales. Para ello el tejido cerebral se lavó en buffer de aislamiento frío (0,32 M de sacarosa, 1 mM y 10 mM de TRIS; pH 7,4), se diseccionó en trozos pequeños y se transfirió a un homogeneizador Dounce con solución Percoll al 12%. A continuación, se homogeneizó el tejido en un mortero de vidrio, se colocó sobre un gradiente de Percoll y se ultracentrifugó a 30.700g durante 5 minutos a 4 °C. La fracción mitocondrial enriquecida (entre las capas de 26% y 40% de Percoll), se retiró cuidadosamente, se lavó con buffer de aislamiento y se centrifugó a 16.700g durante 10 minutos a 4 °C. El pellet mitocondrial puro se resuspendió suavemente en buffer MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 64 de aislamiento y se concentró mediante centrifugación a 7300g durante 10 min a 4 °C. Finalmente, se determinó el contenido proteíco en las mitocondrias aisladas utilizando el kit Pierce BCA Protein Assay (Thermo Scientific). La actividad de COX se midió utilizando el ensayo de actividad de mitocondrias, según las especificaciones del fabricante (KC310100; Biochain). Para el ensayo se utilizaron 10 µg de proteína de mitocondria aislada con 0,1% de ditiotreitol. Se añadió ferrocitocromo c, un sustrato de la COX, a cada muestra y se leyó inmediatamente la absorbancia a 550 nm durante 55 segundos. La actividad de COX (unidad/ml) de cada muestra se estimó a partir de la disminución de la absorbancia debida a la oxidación enzimática del ferrocitocromo c a ferricintocromo c. 3.2.7. Análisis de proteínas mediante western blot Los cambios de expresión proteica de diferentes componentes y receptores del SRA fueron analizados por la técnica de WB. Las fracciones de tejido pertenecientes a la SN se homogenizaron con ayuda de un politrón en un tampón de radioinmunoprecipitación que contenía inhibidores de proteasas (P8340, Sigma), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (P7626, Sigma) e inhibidores de fosfatasa (P5726, Sigma). El homogenado resultante se centrifugó 20 minutos a 12.000 g y se recogió el sobrenadante. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo BCA (Pierce 23225). Las muestras se diluyeron en buffer de radioinmunoprecipitación y tampón de carga, se desnaturalizaron con un choque térmico, calentándolas durante 4 minutos a 95ºC y se procedió a la separación de las proteínas utilizando una electroforesis discontinua con geles de poliacrilamida Bis-Tris al 8%-12%. A continuación, se realizó la transferencia de las proteínas desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa. Finalmente, las membranas se incubaron con una solución de bloqueo (leche al 10%) durante una hora a temperatura ambiente y, a continuación, se incubaron durante toda la noche a 4ºC con el anticuerpo primario correspondiente. Los niveles proteicos de ANG y de los receptores AT1 y Mas fueron analizados en homogenados de cerebros de ratones WT y MATERIAL Y MÉTODOS 65 AT2KO utilizando los anticuerpos primarios correspondientes: ANG (1:200, sc-7419), receptor AT1 (1:200, sc-31181, SantaCruz), receptor Mas (1:1000, AAR-013, Alomone labs). La expresión proteica del receptor AT1 también fue analizada en los diferentes tratamientos de las células microgliales N9 utilizando el mismo anticuerpo AT1 (1:200, sc-31181, SantaCruz Biotechnology). Para el revelado se utilizaron los anticuerpos secundarios HRP anti-conejo IgG (1:5000, sc-2004, SantaCruz Biotechnology) y anti-cabra IgG (1:3000, sc-2020, SantaCruz Biotechnology). Finalmente, las membranas fueron incubadas con el control de carga GADPH (1:25.000, G9545, Sigma). El nivel de expresión de las proteínas se cuantificó por densitometría de cada una de las bandas usando el software Quantity One y se expresó en relación con el valor de la banda control de GAPDH. Los datos se normalizaron con respecto a los valores del grupo control de la misma membrana (es decir, se expresaron en relación con el valor obtenido para el grupo control, 100%) y se expresaron como medias ± SEM. 3.2.8. Extracción de ARN, RT-QPCR y Q-PCR La expresión del ARNm de los componentes y receptores del SRA (ANG, receptores AT1, AT2, Mas), del sistema dopaminérgico (receptores D1, D2) y de diferentes mediadores de inflamación (IL-1β, IL-6, NFkβ, p47 phox) fueron analizados mediante RT-PCR y Q-PCR previamente descrita 3.1.7. Extracción de ARN, RT-PCR y Q-PCR del modelo de lesión con α-syn utilizando la secuencia de cebadores correspondiente (Tabla 4). 3.2.9. Modelos in vitro 3.2.9.1.Cultivos primarios de microglía Los cultivos primarios de microglía se realizaron a partir de cerebros de neonatos P1-P3 de ratas Sprague-Dawley o de ratones WT o AT2KO. Para cada experimento se utilizaron un mínimo de 20 neonatos. Los cerebros se extrajeron en condiciones de esterilidad bajo la llama de un mechero bunsen e inmediatamente después se lavaron en una solución fría (4ºC) de glucosalino y penicilina/estreptomicina al 1%. Seguidamente, con la ayuda de un bisturí, se eliminaron las meninges, plexos coroides y los restos de médula espinal. A MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 66 continuación, en el interior de una campana de flujo laminar, se llevó a cabo la disociación mecánica con un bisturí y se realizó la filtración de los fragmentos mediante un filtro de nylon de tamaño de poro de 100 μm (Falcon). La suspensión celular obtenida se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 2.000 rpm y se eliminó el sobrenadante. El pellet celular se resuspendió en el volumen de medio requerido para cada experimento (10 ml de medio por cerebro aislado) y fue sembrado en frascos de 75 cm2 (BD Falcon, 2,5x107 células/frasco). La siembra se realizó con medio de cultivo DMEM completado con 10% suero fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma) y 1% de anfotericina B (Sigma). Las células en cultivo se mantuvieron en una incubador a 37ºC, 5% de CO2 y humedad al 95% hasta que llegaron a su máxima confluencia (aproximadamente 12-15 días). El primer cambio de medio se realizó cuatro días después de la siembra inicial y, posteriormente, se cambió cada cuatro días. Una vez llegaron a la máxima confluencia, los frascos se agitaron durante 4 horas a 180 rpm en una incubador a 37ºC, 5% de CO2 y humedad al 95%, con el objetivo de extraer la microglía. Tras la agitación, se recogió el medio de cultivo, se centrifugó a 2.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y el pellet obtenido se resuspendió en medio de cultivo al volumen de siembra requerido. La cuantificación de células viables se realizó en una cámara de Neubauher sobre una suspensión en azul de tripano. Las células microgliales fueron sembradas en placas de 35mm (Falcon) tratadas con poli-L-lisina (Sigma; 10mg/ml) a una concentración aproximada de 1x106 células/ml. Una hora después de la siembra se cambió el medio, para eliminar las células no adheridas y, finalmente, los cultivos fueron mantenidos en condiciones de cultivo 24 horas antes de realizar el ensayo, para evitar el estado activado de las células microgliales tras la agitación. Mediante esta técnica de aislamiento se consigue una pureza de células positivas para el marcador microglial OX-42 de más del 95% (Dominguez-Meijide et al., 2017). 3.2.9.2.Línea celular microglial (N9) La línea microglial murina N9 fue proporcionada por la Dra. Paola Ricciardi-Castagnoli (Red de Inmunología de Singapur, Agencia MATERIAL Y MÉTODOS 67 de Ciencia, Tecnología e Investigación, Singapur). Las células se mantuvieron en condiciones de cultivo en una incubador a 37ºC, 5% de CO2 y humedad al 95%, y se cultivaron en medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640; Invitrogen) completado con 10% de suero fetal bovino, 2mM de L-glutamina (Sigma) y un 1% de penicilina/estreptomicina. Para realizar los ensayos las células se cuantificaron y se sembraron a una densidad de 0,5x106 células/pocillo en placas de 12 pocillos (Falcon). 3.2.10. Análisis de inflamación por actividad enzimática y ELISA en células microgliales Para estudiar la inflamación mediada por los receptores de angiotensina en las células microgliales (cultivos primarios de microglía y línea celular N9) se cuantificaron los niveles de actividad enzimática NOX y ROCK, así como los niveles de expresión de TNF- α mediante kit ELISA. -Actividad enzimática de NOX: se midió mediante quimioluminiscencia potenciada por lucigenina en un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). Las células o el tejido fueron homogenizados en un tampón de lisis (10-1 mol/L de K2HPO4, 10-3 mol/L fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 0.2% Triton X-100) y centrifugados a 12.000g durante 30 minutos a 4ºC. A continuación, se recogieron los sobrenadantes y se les analizó la concentración de proteína con un kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce (Thermo Scientific, Fremont, CA). La actividad de NOX se midió en los sobrenadantes en presencia de su sustrato NADPH (10-4 mol/L; Sigma) y lucigenina (5x10- 6 mol/L; Sigma). La reacción se realizó con 10-20µl de células o tejido homogenizado que contenía entre 20-50µg de proteína (Griendling et al., 2000; Hong et al., 2006). La quimioluminiscencia se expresó como unidades de luz relativas (ULR/mg de proteína x min). -Actividad enzimática de ROCK: la actividad de ROCK se midió con un kit de ensayo de actividad de ROCK (STA-416; Cell Biolabs, San Diego, CA) según las instrucciones del MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 68 fabricante. En funcionamiento de este kit se basa en un inmunoensayo enzimático desarrollado para la detección de la fosforilación específica de la subunidad 1 de la miosina fosfatasa en Thr696 mediada por el enzima ROCK. Las células primarias de microglía y N9 se homogeneizaron en un buffer de lisis (50 mM Tris-HCl pH7’5, 150 mM NaCl, 1 mM 2- glicerofosfato, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA y 1 mM Na3VO4) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasas (P8340; Sigma). A continuación, se midió la concentración de proteínas en los extractos con un kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce (Thermo Scientific, Fremont, CA). La reacción se realizó con una cantidad final de proteína de 5 μg/pocillo y la fosforilación se evaluó midiendo la absorbancia a 450 nm en un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). -Determinación de TNF-α: los niveles de TNF-α liberados al medio en los cultivos celulares de microglía (microglía primaria y línea celular microglial N9) fueron determinados mediante kit ELISA (TNF-α de rata de Diaclone 865.000.96, Gen-Probe Diaclone SAS, Besançon, Francia) siguiendo las instrucciones del fabricante y usando un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). El contenido de TNF-α se obtuvo en pg/mL de proteína y se expresó como porcentaje del contenido en las muestras del grupo de control. 3.2.11. Análisis de factores de transcripción en células microgliales La activación de los factores de transcripción Sp1 y Sp3, implicados en la regulación de la expresión del receptor AT1, en células de microglía primaria se realizó con un kit TransAM (Active Motif, Carlsland) basado en un ensayo inmunoenzimático de unión al ADN. Se incubaron 10µg/pocillo de extracto nuclear aislado de los cultivos celulares siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, se midió la absorbancia a 450 nm en un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). MATERIAL Y MÉTODOS 75 3.3.RECEPTORES DE ANGIOTENSINA EN INFLAMACIÓN PERIFÉRICA CRÓNICA DE SÍNDROME METABÓLICO. IMPLICACIÓN EN LA NEURODEGENERACIÓN DOPAMINÉRGICA 3.3.1. Diseño experimental En el presente apartado de la tesis se realizaron los siguientes experimentos in vivo con ratas macho de la cepa Sprague-Dawley (2-3 meses de edad) para estudiar el papel de los receptores del SRA cerebral en modelos de inflamación periférica crónica del MetS, y su posible implicación en la neurodegeneración dopaminérgica (Objetivo 3). Para ello se utilizaron los siguientes animales distribuidos de forma aleatoria en los grupos experimentales (ANEXO I, Tabla III): -Grupo A: para estudiar la implicación de la inflamación periférica crónica del MetS (obesidad, aumento de la presión arterial e hiperglucemia) en los componentes y receptores del SRA cerebral, inflamación y muerte neuronal dopaminérgica (Experimento VI). Se utilizaron los siguientes grupos experimentales: -Grupo A1: formado por ratas control (n = 6) y ratas con MetS (n =6). Este grupo fue utilizado para la caracterización del modelo de MetS inducido por una dieta alta en grasa durante 18 semanas, mediante cuantificación de peso, presión arterial y niveles séricos de triglicéridos, colesterol y glucosa. Transcurridas 18 semanas, el LCR y suero fueron extraídos para el análisis de AT1-AA, ACE2-AA, mediadores proinflamatorios y 27-hidroxicolesterol (27-OHC). -Grupo A2: formado por ratas control (n = 12), ratas con MetS (n = 12) y ratas con MetS tratadas con el bloqueante del receptor AT1, candesartán (n = 12). El candesartán se administró por vía oral (1 mg/kg/día durante al menos 2 semanas; entre las 9:00- 10:00h de cada día) mezclado con crema de avellanas “Nocilla” (Nutrexpa, Barcelona, España), tras 18 semanas de dieta alta en grasa. A los animales no tratados con candesartán, se les administró únicamente crema de avellanas “Nocilla”. La mitad de los animales de cada grupo fue utilizada para analizar los MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 76 componentes y receptores del SRA, mediadores proinflamatorios y marcadores de estrés oxidativo en cerebro, mientras que la otra mitad de los grupos fue utilizada para el análisis de permeabilidad de la BHE. El peso, el suero y la medición de la presión arterial (antes del tratamiento con candesartán) de los animales de este grupo, se utilizaron además, para aumentar el tamaño muestral para la caracterización del modelo de MetS (Grupo A1). -Grupo A3: se utilizó para estudiar la implicación del MetS en la progresión de la muerte neuronal dopaminérgica. Estaba compuesto por ratas control (n = 5), ratas lesionadas con 6- OHDA (n = 5), ratas con MetS y lesionadas con 6-OHDA (n = 5) y ratas con MetS, lesionadas con 6-OHDA y tratadas con el bloqueante del receptor AT1, candesartán (n = 5). Tras 18 semanas de dieta alta en grasa los animales fueron lesionados mediante inyección estereotáxica de la neurotoxina 6-OHDA. El candesartán fue administrado desde una semana antes de la lesión estereotáxica (1 mg/kg/día) hasta el sacrificio (4 semanas después de la lesión con la neurotoxina). Finalmente, los animales fueron sacrificados y el cerebro fue procesado para los estudios inmunohistoquímicos de muerte neuronal dopaminérgica. -Grupo B: destinado a estudiar la implicación de los AT1-AA en la expresión de los componentes y receptores del SRA cerebral, respuesta inflamatoria microglial y muerte neuronal dopaminérgica (Experimento VII). Para ello se utilizaron los siguientes grupos experimentales: -Grupo B1: formado por ratas control (n = 6), ratas con administración intraperitoneal de 0,25 µg/µl de AT1-AA humanos (n = 6), ratas con administración de 0,15 µg/µl de AT1-AA humanos (n = 12). Se destinó a caracterizar el efecto en la presión arterial y los niveles de IgG humanos en LCR y suero durante 1 y 2 semanas después de la administración de autoanticuerpos. MATERIAL Y MÉTODOS 77 -Grupo B2: formado por ratas control (n = 5), ratas con administración intraperitoneal de AT1-AA (0.15 µg/µl, n = 5) y ratas con administración de AT1-AA y tratadas con el bloqueante del receptor AT1 candesartán, (1 mg/Kg/día durante al menos 2 semanas; administrados entre las 9:00-10:00h de cada día). Quince días después de la administración de AT1- AA, los animales fueron sacrificados y utilizados para analizar los componentes y receptores del SRA, mediadores proinflamatorios y marcadores de estrés oxidativo a nivel de la SNpc. -Grupo B3: destinado a estudiar la implicación de los AT1-AA en la progresión de la muerte neuronal dopaminérgica se utilizaron ratas control (n = 6), ratas lesionadas con AAV9-α- syn-A53T (n = 6), ratas infundidas con AT1-AA y lesionadas con AAV9-α-syn-A53T (n = 6) y ratas lesionadas con AAV9- α-syn-A53T, infundidas con AT1-AA y tratadas con el bloqueante del receptor AT1, candesartán (n = 6). La administración de los AT1-AA se realizó mediante la implantación intraperitoneal de mini-bombas osmóticas (modelo x, Alzet) que contenían 200 µl de una disolución de AT1-AA con una concentración de 0,15 µg/µl, durante 6 semanas (1 semana antes de la inyección con AAV9-α-syn- A53T). El tratamiento con candesartán (1mg/kg/día) se inició 1 semana antes de la administración de AT1-AA y se continuó hasta el momento del sacrificio (4 semanas después de la lesión con AAV9-α-syn-A53T) tras el cual el cerebro fue procesado para los estudios inmunohistoquímicos de muerte neuronal dopaminérgica e inflamación microglial. 3.3.2. Desarrollo de un modelo de síndrome metabólico en rata El desarrollo de un modelo de MetS (obesidad, aumento de la presión arterial e hiperglucemia) se realizó en ratas macho de 150-200g que recibieron ad libitum una dieta alta en grasa (D18042603; Research Diets, U.S.A.) durante un periodo de 18 semanas. La incorporación de MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 78 esta dieta en edad temprana facilita y homogeniza el desarrollo del MetS entre los diferentes individuos (Sharma y Taliyan, 2018). Mensualmente, a los animales se les extrajo sangre por la vena lateral de la cola, que fue utilizada para la determinación de los niveles séricos de triglicéridos, colesterol y glucosa utilizando kits enzimáticos colorimétricos comerciales (1001093; 1001314; 1001191; Spinreact, España, respectivamente), siguiendo las instrucciones del fabricante. Además, a los animales se les hizo un seguimiento mensual del aumento de peso y medición de la presión arterial utilizando un sistema de presión no invasiva MRBP (IITC Life Science, California, EE.UU.). 3.3.3. Modelo de lesión con 6-OHDA en ratas con síndrome metabólico El estudio de la implicación de la inflamación periférica inducida por MetS en la progresión de la muerte neuronal dopaminérgica se realizó en un modelo animal de EP basado en la inyección estereotáxica de la neurotoxina 6-OHDA. En primer lugar, a los animales se les indujo MetS mediante la administración de una dieta alta en grasa durante 18 semanas. Una vez desarrollado el MetS, se les inyectó, unilateralmente por estereotaxia, la neurotoxina 6-OHDA en el estriado derecho. Para realizar la cirugía, los animales fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina (50mg/kg) / medetomidina (0,4mg/kg) y fueron colocados en el aparato de estereotaxia (Kopf Instruments) con la barra dental a -3,3mm. Con un bisturí se realizó una incisión en la línea media y se calcularon las coordenadas craneométricas en base al bregma correspondientes al ST derecho: 1,0mm anterior, 3mm lateral a la línea media y 5,5mm ventral a la duramadre (Paxinos y Watson, 1986). A continuación, se trepanó el cráneo para inyectar 7,5μg de 6- OHDA disueltos en 3μl de solución salina estéril con 0,2% de ácido ascórbico (Sigma, EE.UU.). La solución se inyectó usando una jeringa Hamilton de 10μl acoplada a un inyector monitorizado (Stoeling), a una velocidad de 0,5μl/min y la aguja se mantuvo in situ 5 minutos, una vez MATERIAL Y MÉTODOS 79 realizada la inyección, a fin de evitar el reflujo de la toxina. A los animales utilizados como control salino, se les realizó la misma cirugía inyectando únicamente solución salina. Transcurridas 4 semanas tras lesión, los animales fueron sacrificados. 3.3.4. Modelo de infusión sistémica de AT1-AA humanos en rata Los AT1-AA humanos se obtuvieron de muestras de suero de mujeres embarazadas que sufrieron preeclampsia. Estas mujeres eran pacientes del Servicio de Obstetricia del Complejo hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, todas fueron informadas del propósito y protocolo del estudio y firmaron un consentimiento informado. Este estudio obtuvo la aprobación del Comité Ético de Investigación en Medicamentos de Galicia (CEIm-G), protocolo 2017/618, y la investigación se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. El aislamiento de AT1-AA de suero humano se realizó mediante cromatografía de afinidad y se cuantificó utilizando ELISA (LaMarca et al., 2011). Un ml de suero fue pasado por una columna de purificación para IgG, y se obtuvo la fracción de IgG específica de AT1- AA mediante la unión del epítopo a la secuencia correspondiente del segundo bucle extracelular del receptor AT1 (SC1208; síntesis química de péptidos) unido covalentemente al gel activado por Sepharose 4B CNBr (GE17-0430- 01; Sigma-Aldrich). La fracción de IgG no unida se eliminó por lavado y la IgG unida (AT1-AA) se eluyó con tampón de glicina 200 mM. La fracción de IgG eluida se mantuvo en tampón de neutralización (3M TRIS-HCl y 3M KCl). Finalmente, la concentración final de AT1-AA se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop 252 (Thermo Fisher Scientific). Para la infusión de AT1-AA humanos en rata se utilizaron minibombas osmóticas (Alzet Model 2002, Durect Corp, Cupertino, CA), que se prepararon con 200ul de AT1-AA diluidos (concentraciones; 0,15µg/µl ó 0,25µg/µl) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, las minibombas se insertaron por vía intraperitoneal, en ratas anestesiadas como se describió anteriormente MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 80 (Cunningham et al., 2016). La administración intraperitoneal mediante el empleo de minibombas, permite la infusión continua y constante de AT1-AA durante dos semanas. La dosis de 0,15 µg/µl se calculó inicialmente como la dosis más baja que inducía un ligero, pero significativo aumento, de la presión arterial, lo que demostraba la funcionalidad de los AT1-AA purificados. 3.3.5. Modelo de lesión con AAV9-α-syn-A53T en ratas con infusión de AT1-AA humanos El estudio de la implicación de la infusión sistémica de AT1-AA en la progresión de la neurodegeneración dopaminérgica y neuroinflamación fue estudiada en un modelo de EP basado en la sobreexpresión de la proteína α-syn humana mutada AAV9-α-syn- A53T. En primer lugar, a ratas macho adultas se les realizó la infusión de AT1-AA humanos tal y como se describe en el apartado anterior 3.3.4. Modelo de infusión sistémica de AT1-AA humanos en rata. Una semana después de la implantación de las bombas miniosmóticas, a las ratas se les realizó una inyección estereotáxica unilateral de AAV9-α-syn-A53T, que se describe detalladamente en el apartado 3.1.3.Modelo de lesión con AAV9-α-syn-WT y AAV9-α-syn- A53T en ratas. 3.3.6. Extracción de líquido cefalorraquídeo y sangre en modelo de rata La extracción de LCR se realizó siguiendo el método descrito anteriormente (Pegg et al., 2010). Las ratas fueron anestesiadas con una inyección intraperitoneal de una combinación anestésica de ketamina (50mg/kg) / medetomidina (0,4mg/kg) y colocadas en el aparato de estereotaxia (Kopf Instruments) con la cabeza flexionada 45º hacia abajo. Seguidamente, con un bisturí se realizó una incisión en la parte ventral de la cabeza y las capas de músculos superficiales y subyacentes se separaron a lo largo de la línea media mediante disección roma y hasta la exposición de la duramadre de la cisterna magna. MATERIAL Y MÉTODOS 81 Inmediatamente después, el LCR fue extraído con una aguja de 30G acoplada a una jeringa de 1ml insertada en un ángulo de 30º con respecto a la superficie de la duramadre. El LCR se almacenó inmediatamente a -80ºC hasta su procesado. Para la obtención del suero, se procedió a la extracción de sangre por decantación tras la decapitación del animal, previamente anestesiado. La sangre recogida se centrifugó a 2000g durante 10min. Finalmente, se recogió el sobrenadante, que corresponde a la muestra de suero, y se almacenó a -80ºC hasta su procesamiento. 3.3.7. Determinación de autoanticuerpos en líquido cefalorraquídeo y suero de rata Los niveles de AT1-AA y ACE2-AA fueron medidos usando kit ELISA humano con ligeras modificaciones previamente descritas (Zhang et al., 2010). Se utilizó un anticuerpo secundario HRP- conjugado de cabra anti-IgG de rata (1:2500, ab97057, abcam), la inmunoreacción se detectó con un kit de quimioluminiscencia HRP (170-5044; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y la señal de luminiscencia ULR se midió con un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). 3.3.8. Análisis de permeabilidad de la barrera hematoencefálica en un modelo de síndrome metabólico Para estudiar la permeabilidad de la BHE en un modelo de MetS y la implicación del bloqueo del receptor AT1 se realizó la infusión de colorante Evans Blue (E2129, Sigma-Aldrich). El colorante se inyectó en una sola inyección (solución salina al 4 % a 2 ml/kg) a través de la vena femoral. Dos horas después de la inyección, los animales fueron perfundidos con solución salina al 0,9% para eliminar el exceso de colorante. Posteriormente, los animales fueron decapitados, el tejido cerebral aislado y se diseccionaron las regiones correspondientes a corteza, ST y SN. Los tejidos cerebrales recogidos se suspendieron en 1:1 peso (mg): volumen (ml) de ácido tricloroacético al 50 % (T6399; Sigma-Aldrich) y se homogeneizaron con politrón. Los homogeneizados se centrifugaron a 10. 000 g durante 20 min y los sobrenadantes se sometieron a detección espectrométrica a 620 nm en MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 82 un volumen 1:4 de etanol al 95 % utilizando un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). Para la cuantificación, se prepararon curvas de colorante Evans Blue estándar paralelas por duplicado (Wang y Lai, 2014). 3.3.9. Análisis inmunohistoquímico de TH y OX-6 Cuatro semanas después de la lesión estereotáxica con 6-OHDA en ratas con MetS o con AAV9-α-syn-A53T en ratas infundidas con AT1- AA humanos, los animales fueron perfundidos y procesados para el análisis inmunohistoquímico previamente descrito en el apartado 3.1.4.Técnicas de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia en el modelo de lesión con α-syn. 3.3.10. Análisis de expresión de los componentes y receptores del SRA cerebral El efecto de la inflamación periférica inducida por el MetS o la administración sistémica de AT1-AA sobre la expresión de los componentes y receptores del SRA cerebral (ECA2 y receptores PRR, AT1, AT2 y Mas) fue analizada en los homogenados de la región de la SN. Los niveles de expresión proteica se estudiaron mediante la técnica de WB descrita detalladamente en el apartado anterior 3.2.7.Análisis de proteínas mediante western blot. Las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios: ECA2 (ab108252; Abcam; 1:1000), AT1 (sc-31181; Santa Cruz; 1:200), AT2 (sc-9040; Santa Cruz; 1:200), Mas (AAR-013; Alomone labs; 1:1000) y (pro)-renina (ab40790; Abcam; 1:3000). La especificidad de todos los anticuerpos primarios utilizados se evaluó en nuestro laboratorio mediante la aplicación de diferentes técnicas (Valenzuela et al., 2010, 2016; Labandeira-Garcia et al., 2017). Se usaron los siguientes anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP, del inglés horseradish peroxidase): cabra anti-HRP de conejo y cabra anti-HRP de ratón (Santa Cruz Biotechnology; 1:2500). MATERIAL Y MÉTODOS 83 Los niveles de expresión de los transcritos de ARNm de los componentes y receptores del SRA cerebral se estudiaron mediante la técnica RT-QPCR y Q-PCR descrita detalladamente en el apartado anterior 3.2.8.Extracción de ARN, RT-QPCR y Q-PCR. La secuencia de los cebadores para ECA2 y receptores AT1, AT2, PRR y Mas de rata se especifican en la Tabla 4. 3.3.11. Análisis de inflamación y estrés oxidativo por actividad enzimática y ELISA En los homogenados de SN de rata con MetS se midieron los marcadores pro-inflamatorios, particularmente relacionados con la degeneración dopaminérgica como el TNF-α (ELISA, 865.000.96; Gen-Probe Diaclone), y marcadores de estrés oxidativo, como la NOX, mediante quimioluminiscencia potenciada por lucigenina. En suero de rata con MetS se midieron los niveles de interleucinas pro-inflamatorias: interleucina tipo 17 (IL-17), IL-6; LIGHT, TNF-α e IL-1β y del 27-OHC con kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas específicos para ratas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (MBS2503506 para IL-17; MBS701221 para IL-6; MBS2021982 para LIGHT; MBS284210 para IL-1β; MBS9712719 para 27-OHC; de MyBioSource y KRC3011 para TNF-α de Invitrogen). 3.4.RECEPTORES DE ANGIOTENSINA E INFLAMACIÓN PERIFÉRICA AGUDA. INFLAMACIÓN PULMONAR EN COVID-19. 3.4.1. Diseño experimental En la última parte de esta tesis se estudiaron los efectos de los tratamientos con bloqueantes del receptor AT1 (candesartán), inhibidores de ECA (captopril) y moduladores indirectos de los receptores del SRA (AINEs; ibuprofeno) sobre la expresión pulmonar de ECA2 y demás receptores del SRA pulmonar en ratas adultas jóvenes y en modelos animales de individuos vulnerables a COVID-19 grave (MetS y envejecimiento). Usando un modelo in vitro, se MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 84 estudiaron los efectos de estos mismos tratamientos en (1) cambios inducidos por la proteína viral en los niveles de ECA2 transmembrana; (2) en los niveles de internalización de la proteína vírica y (3) en la respuesta inflamatoria aguda asociada al tratamiento de la proteína viral (IL-6, TNF-α y CCL-2 (ligando de quimiocina 2, del inglés chemokine (C-C motif) ligand 2)) (Objetivo 4). Para ello, se utilizaron un total de 98 animales y una línea celular del endotelio pulmonar distribuidos en dos grandes grupos (ANEXO I, Tabla IV): -Grupo 1: en el que se abordó el estudio del efecto de los tratamientos de ARAII (candesartán) e IECA (captopril) en la expresión de los principales receptores del SRA pulmonar (Experimento VIII). Para ello, se utilizaron un total de 68 animales distribuidos de forma aleatoria, y una línea celular divididos en dos subgrupos: -Grupo 1A: en este primer grupo de experimentos se utilizaron ratas macho adultas jóvenes de 10 semanas de edad (n = 30; n = 6 por grupo) para comprobar el efecto del tratamiento con candesartán (1 o 10 mg/Kg/día; AstraZeneca) o captopril (5 o 40 mg/Kg/día; C4042; Sigma) sobre la expresión del ECA2 y los principales receptores del SRA pulmonar. En un segundo grupo de experimentos, se utilizaron modelos animales de vulnerabilidad al COVID-19 grave por infección por SARS-CoV-2: ratas macho con MetS (n = 20; n = 6 por grupo) tratadas con las dosis altas de candesartán (10 mg/kg/día) y captopril (40 mg/Kg/día) durante tres semanas; ratas envejecidas de 18-20 meses de edad (n = 18; n = 5 por grupo) tratadas con candesartán (1 mg/Kg/día) durante tres semanas. Los tratamientos fueron administrados por vía oral, mezclados con crema de avellanas (“Nocilla”; Nutrexpa, Barcelona, España) durante de 3 semanas. Los animales del grupo control recibieron únicamente la crema de avellanas. Las dosis se establecieron en base a experimentos preliminares y estudios in vivo anteriores (Inada et al., 1999; Zhu et al., 2000; Arumugam et al., 2012; Abdel-Wahab et al., 2014). Los tratamientos fueron administrados entre las 9:00-10:00h de cada día. Tras el MATERIAL Y MÉTODOS 91 3.4.6. Cromatografía de alto rendimiento para niveles de angiotensina pulmonar Para estudiar el efecto del tratamiento con ibuprofeno en el metabolismo de la angiotensina pulmonar, se midieron los niveles de Ang II y Ang(1-7), sustrato y producto de la actividad de ECA2 respectivamente, mediante HPLC seguido de un inmunoensayo enzimático (Brosnihan y Chappell, 2017). Inicialmente, el tejido fue homogenizado, utilizando un politrón, en una solución de ácido (HCl)- etanol con EDTA y un cóctel de inhibidores de proteasas (P8340, Sigma). Seguidamente, las muestras se centrifugaron, se incubaron a - 20ºC y se acidificaron con una solución de ácido heptafluorobutírico. Posteriormente, los sobrenadantes se pasaron por unas columnas de extracción en fase sólida (Sep-Pak C18, Oasis HLB 1cc, WAT094225, Waters Chromatography Europe BV; Etten-Leur, Países Bajos) y los péptidos de angiotensina se eludieron con una solución de ácido heptafluorobutírico-metanol. El eluyente se deshidrató en Savant (ISS110, Thermo Scientific; Massachusetts, EE. UU.), sin aplicación de calor y, finalmente, el sedimento se resuspendió en una solución de acetonitrilo al 12% con ácido heptafluorobutírico al 0,015% y se inyectó en el sistema de HPLC. Los péptidos de angiotensina se separaron usando un gradiente de cuatro pasos con acetonitrilo acidificado (0.1% de ácido heptafluorobutírico; gradiente lineal al 12- 32%, condiciones isocráticas al 32%, gradiente lineal al 32-12% y condiciones isocráticas al 12%) en una columna de fase inversa (Symmetry300 C18, Waters Chromatography Europe BV; Etten-Leur, Países Bajos). La velocidad de inyección fue de 0’35 ml por minuto a una temperatura de 25ºC. Las fracciones de angiotensina se controlaron a 220 nm con un detector UV-VIS (SPD-20 AV, Shimadzu Corporation; Kyoto, Japón), se recogieron en un colector de fracciones (FRC-10A, Shimadzu Corporation; Kyoto, Japón) y se secaron en Savant. El sedimento se resuspendió y finalmente se determinaron los niveles de Ang II y Ang(1-7) mediante inmunoensayo enzimático (LS-F10589, LSBio; Washington, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos se expresaron como fmol por gramo de tejido húmedo. MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 92 3.4.7. Análisis de actividad enzimática para la dinámica celular de ECA2 El efecto de los tratamientos con candesartán, captopril e ibuprofeno en la actividad enzimática de ECA2 pulmonar, así como en la actividad enzimática de las proteasas encargadas del desprendimiento de ECA2 fueron medidas con kit específicos de actividad enzimática. -Actividad enzimática de ECA2: se midió utilizando un kit comercial de actividad de ECA2 (Anaspec, AS-72086) siguiendo las instrucciones del fabricante. El funcionamiento del kit se basa en el péptido de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) acetilo 7-Metoxicumarina- 4-il (Mca, del inglés 7-Methoxycoumarin-4-yl acetyl) / 2,4- dinitrofenilo (Dnp, del inglés 2,4-dinitrophenyl) (10 μM). Específicamente, el kit contiene un péptido FRET, cuya fluorescencia de Mca es inhibida por Dnp. Sin embargo, cuando se produce una escisión del sustrato, provocada por la acción del enzima ECA2, éste produce una separación en dos fragmentos, de modo que la fluorescencia de la Mca deja de estar inhibida y puede medirse en el rango de excitación/emisión a 330/390 nm utilizando un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). La actividad de ECA2 se midió en 20 μg de tejido pulmonar de rata o en 5 μg de lisado celular de A549, y se confirmó con el inhibidor específico de ECA2, DX600 (1 μM), incluido como control en el mismo kit (AnaSpec, AS-72086). La fluorescencia se expresó como ULR (unidades de luminiscencia relativas). -Actividad enzimática de ADAM17: se midió utilizando un kit comercial de actividad ADAM17 (AnaSpec, AS-72085) siguiendo las instrucciones del fabricante. El funcionamiento del kit se basa en el péptido de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) basado en 5-FAM/QXL® 520 (1 μM). Específicamente, el kit contiene un péptido FRET, cuya fluorescencia de la 5-FAM es inhibida por el QXL® 520. Sin embargo, cuando se produce la escisión del sustrato, provocada por la acción enzimática de ADAM17, éste produce MATERIAL Y MÉTODOS 93 una separación en dos fragmentos, así que la fluorescencia de 5- FAM se puede medir en rango de excitación/emisión a 490/520 nm utilizando un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN). La actividad de ADAM17 se midió en 20 μg de lisado de celular de A549, y se confirmó con el inhibidor de ADAM17, TAPI-0 (10 μM), incluido como control en el mismo kit. -Actividad enzimática de TMPRSS2: se midió utilizando un kit comercial de proteasas (AS-71124, AnaSpec; California, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El funcionamiento del kit se basa en la escisión proteolítica, mediante la acción de enzimas proteasas, de la caseína-HiLyte Flour 488 lo que da lugar a una fluorescencia que se puede medir en el rango de excitación/emisión a 488/520 nm en una placa multipocillo utilizando un equipo Infinite M200 (TECAN GmbH; Grödig, Austria). La actividad de TMPRSS2 se midió en 125 μg de lisado celular de A549 homogenizado en tampón fosfato de sodio 20 mM, pH 8. La actividad específica para TMPRSS2 se midió restando la actividad total de proteasas menos la actividad inhibida por un inhibidor específico para TMPRSS2 (mesilato de Camostat, 100 μM, SML0057, Merck KGaA; Darmstadt, Alemania; Deshotels et al., 2014). La fluorescencia se expresó como ULR/mg de proteína. 3.4.8. Análisis de mediadores inflamatorios en células A549 mediante ELISA El análisis de la liberación de marcadores pro-inflamatorios por la línea A549 se llevó a cabo en los sobrenadantes del cultivo celular, después de los correspondientes tratamientos. Los sobrenadantes fueron recogidos y centrifugados a 2.000 g durante 10 min para eliminar los restos celulares. Las concentraciones de los diferentes marcadores se cuantificaron utilizando kits ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante: TNF-α (BMS223HS, Invitrogen), CCL-2 (ab179886, Abcam), IL-6 (BMS213HS, Invitrogen). MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 94 Las densidades ópticas se midieron con un lector de placas multipocillo Infinite M200 (TECAN) y se cuantificaron las concentraciones de cada citoquina utilizando la curva estándar específica de cada kit comercial (ajuste de curva 4PL). 3.5.ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Y REPRESENTACIÓN GRÁFICA Todos los datos fueron obtenidos de al menos tres experimentos independientes y se expresaron como la media ± SEM. El número mínimo de animales por grupo fue estimado teniendo en cuenta el principio de las tres erres, remplazamiento, refinamiento y reducción (RRR), empleando la herramienta calculadora estadística en la página https://www.imim.cat/ofertadeserveis/softwarepublic/granmo/ del Instituto Hospital del Mar de investigaciones Médicas del Parque de Investigaciones Biomédicas de Barcelona. Los análisis estadísticos fueron realizados únicamente en estudios donde el tamaño muestral era igual o superior a cinco. La normalidad de todos los conjuntos de datos se comprobó con la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Si el conjunto de datos superaba la prueba de normalidad, se utilizaron pruebas paramétricas: la prueba t de Student para las comparaciones de dos grupos y el análisis de la varianza (ANOVA, del inglés analysis of variance) de una vía seguido de la prueba post-hoc de Student-Newman-Keuls para las comparaciones múltiples. Si el conjunto de datos no superaba la prueba de normalidad, se utilizaron pruebas no paramétricas: las comparaciones de dos grupos se realizaron mediante la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney y las comparaciones múltiples, mediante el análisis unidireccional de varianza de Kruskal-Wallis seguido de la prueba post hoc Student-Newman-Keuls o Dunn’s. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p˂0,05. Todos los análisis estadísticos fueron realizados con el programa SigmaPlot 3.0 ó 11.0 (Jandel Scientific, Systat Software, Inc., CA, EE.UU). Para la representación gráfica de los resultados se emplearon los softwares SigmaPlot y GraphPad Prism 8 (Graph Pad Inc., San Diego, CA, EE.UU). RESULTADOS 95 4. RESULTADOS 4.1.RECEPTORES AT1 CEREBRALES E INFLAMACIÓN: NEUROINFLAMACIÓN Y DEGENERACIÓN DOPAMINÉRGICA EN UN MODELO DE PARKINSON BASADO EN SINUCLEINOPATÍA. Para estudiar la implicación del receptor AT1 en la neuroinflamación y muerte neuronal dopaminérgica que cursan en la EP, se desarrolló un modelo basado en la sobreexpresión de la proteína α-syn humana con el objetivo de representar más fielmente la sinucleinopatía con la que cursan los pacientes de EP. 4.1.1. Sobreexpresión de la proteína α-syn mediante la inyección estereotáxica de AAV9 En primer lugar, para probar la eficacia de la lesión, se demostró la sobreexpresión de dos formas de la proteína α-syn, la forma WT y la forma mutada A53T, en las neuronas TH-ir de la SNpc, inducida tras la inyección estereotáxica de vectores AAV9-α-syn-WT y AAV9-α-syn- A53T, respectivamente, comparada con la inyección de AAV9-GFP utilizada como grupo control. Para ello se realizaron análisis de inmunofluorescencia en secciones mesencefálicas y se estudió la colocalización de los marcadores de diferentes tipos celulares y la proteína α-syn. Las imágenes de microscopía láser confocal con doble inmunofluorescencia revelaron que la inyección del vector AAV9 inducía una sobreexpresión de GFP o α-syn en neuronas dopaminérgicas, pero no en las células microgliales ni astrocitos de la SNpc de rata. Una semana después de la inyección del vector AAV9, se observó una expresión generalizada de GFP o α-syn que colocalizó con el marcador TH mostrando una eficiente transducción en las neuronas dopaminérgicas de la SNpc (Figura 4a, d, g, j). En MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 96 consonancia con estudios previos (Pignataro et al., 2018), no se encontró señal de colocalización significativa entre α-syn o GFP y el marcador de población microglial Iba-1 (Figura 4b, e, h, k) o el marcador de astrocitos GFAP (Figura 4c, f, i, l). Además, se observó colocalización en neuronas negativas para TH, es decir, no dopaminérgicas. Figura 4. Doble inmunofluorescencia del marcador neuronal dopaminérgico TH (a, d, g, j), o el marcador microglial Iba-1 (b, e, h, k), o el marcador astrocítico (c, f, i, l) (rojo) y diferentes transgenes (GFP: a-f; α-syn-A53T: g-l) en la región de la sustancia negra 1 semana después de la inyección del vector AAV9 que expresan GFP humano o α-syn-A53T humana, respectivamente (verde). Las imágenes de microscopia láser confocal muestran la RESULTADOS 97 colocalización (amarillo) de GFP o α-syn-A53T con el marcador neuronal dopaminérgico TH (a, d, g, j). Sin embargo, GFP o α-syn-A53T no se expresan en células microgliales ni astrocitos (b, c, e, f, h, i, k, l). Las áreas cuadradas en (a-c) y (g-i) se amplían en (d-f) y (j-l), respectivamente. Barras de escala = 75 μm (a-c, g-i), 25 μm (d) y 7,5 μm (e-f, j-l). Abreviaturas: TH, tiroxina hidroxilasa; GFAP, proteína ácida fibrilar glial; Iba-1, molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1; GFP, proteína verde fluorescende; α-syn, α-sinucleína. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018; y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Cuatro semanas después de la inyección, se observó una clara pérdida de células dopaminérgicas TH-ir en la SNpc de los grupos lesionados con ambos vectores de α-syn. A pesar de la intensa reacción microglial observada en la zona ventral del mesencéfalo ipsilateral a la lesión (véase más adelante), la expresión de α-syn se localizó exclusivamente en neuronas (Figura 5a-f). Sin embargo, se observaron algunas células microgliales fagocíticas envolviendo a neuronas que expresaban α-syn (Figura 5g-k). La tasa de colocalización de las neuronas dopaminérgicas fue similar en los vectores de α-syn-WT y α-syn-A53T. Además, se determinó un marcaje intenso de la proteína la α-syn fosforilada en las neuronas dopaminérgicas supervivientes en los grupos lesionados (Figura 6b-g; j-l). Los resultados obtenidos por WB demuestran la expresión de la proteína α-syn transcurrida una semana post-lesión. Sin embargo, 4 semanas tras la lesión se observa un aumento de expresión de α-syn fosforilada en serina p129, la cual no fue observada en la primera semana de lesión (Figura 6h-i). Para estudiar si los antagonistas del receptor AT1 están implicados en la fosforilación de la proteína α-syn, se analizó la tasa de fosforilación de α-syn/TH en ratas tratadas con candesartán o telmisartán. Los resultados muestran que la tasa de fosforilación no disminuyó en ratas tratadas con bloqueantes del receptor AT1, en comparación con ratas no tratadas, lo que sugiere que la disminución de la expresión y de la fosforilación de la proteína α-syn no es una mecanismo responsable de los efectos neuroprotectores de candesartán y telmisartán descritos en los siguientes apartados (Figura 6b, c). MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 98 Figura 5. Doble y triple inmunofluorescencia del marcador neuronal dopaminérgico TH (a, d), o el marcador astrocítico GFAP (c, f), o el marcador microglial Iba-1 (b, e, g-k) (rojo), o el marcador nuclear Hoechst 33342 (i-k; azul), y diferentes transgenes (α-syn-WT: a-f; α-syn- A53T: g-k) (verde) en la región de la sustancia negra 4 semanas después de la inyección de AAV9 que expresa α-syn-WT humana (a-f) o α-syn-A53T humana (g-k), respectivamente. Las imágenes de microscopia láser confocal muestran la colocalización (amarillo) de α-syn-WT con el marcador neuronal dopaminérgico TH (a, d). Sin embargo, α-syn-WT no se expresa en la microglía ni en los astrocitos. Las áreas cuadradas en (a-c) se amplían en (d-f). En (b, e) se observa una intensa respuesta inflamatoria microglial. En (g, k) se muestra una célula microglial envolviendo a una neurona que expresa α-syn-A53T (flecha). Barras de escala = 75 μm (a-c), 7,5 μm (d), 5 μm (e-f), y 10 μm (g-k). Abreviaturas: TH, tiroxina hidroxilasa; GFAP, proteína ácida fibrilar glial; Iba-1, molécula adaptadora de unión a calcio ionizado 1; α-syn, α-sinucleína. RESULTADOS 99 Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018 y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Figura 6. Expresión de α-syn (a, h) y α-syn fosforilada (pS129-α-syn) (b-g, i-l) a 1 semana (a, h) y a 4 semanas (b-g, i-l) después de la inyección de vectores AAV9. La tasa de expresión de α-syn en neuronas dopaminérgicas (TH-ir) de ratas inyectadas con AAV9-α-syn-WT o AAV9- α-syn-A53T se muestra en (a). La tasa de expresión de α-syn fosforilada en neuronas dopaminérgicas (TH-ir) de ratas inyectadas con AAV9-α-syn-WT o AAV9-α-syn-A53T y tratadas o no con candesartán (CAND) o telmisartán (TELM) se muestra en (b, c). La colocalización (amarillo) de α-syn fosforilada (roja) y neuronas dopaminérgicas (verde) en los MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 100 diferentes grupos experimentales se ilustra en (d, g) y se amplía en (j, l). La expresión de α-syn 1 semana después de la inyección (h) y α-syn fosforilada en la región nigral (es decir, células dopaminérgicas y no dopaminérgicas) 1 y 4 semanas después de la inyección (i) se confirmó mediante WB. Los datos se representan como la media ± SEM. *p< 0,05 en relación con el grupo inyectado con solución salina; #p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9- Ф. ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak. Barras de escala = 250 μm (d-g) y 25 μm (j-l). Abreviaturas: TH, tiroxina hidroxilasa; GFP, proteína verde fluorescende; α-syn, α-sinucleína; AAV9, vector viral adenoasociado tipo 9; CAND, candesartán; TELM, telmisartán; WT, forma salvaje. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018 y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 4.1.2. Pérdida de neuronas dopaminérgicas en un modelo de Parkinson basado en sinucleinopatía. Efecto neuroprotector de los bloqueantes del receptor AT1 Para comprobar la muerte neuronal dopaminérgica y la pérdida de densidad de los terminales estriatales que caracteriza a los modelos animales de EP se realizó un análisis inmunohistoquímico del marcador TH en la SNpc y en el ST, respectivamente. En relación con estudios anteriores en los que utilizan modelos animales similares (Decressac et al., 2012, Van der Perren et al., 2015), no se produjo una pérdida apreciable de la viabilidad de neuronas dopaminérgicas (Figura 7a) una semana después de la inyección. Además, no se observaron cambios significativos en las células TH-ir del estriado, lo que sugiere que no se produjo una pérdida significativa de terminales dopaminérgicos estriatales (Figura 8a). Cuatro semanas después de la inyección, mediante cuantificación estereológica, se demostró que el número de las neuronas TH-ir en la SNpc ipsilateral a la lesión de ratas inyectadas con solución salina no fue significativamente diferente del cuantificado en los animales con inyección de vectores vacíos. Sin embargo, la inyección de AAV9-α- syn-WT o AAV9-α-syn-A53T indujo una pérdida de neuronas TH-ir próxima al 57% con respecto a los grupos control (Figura 7b-f). La pérdida de neuronas en la SNpc se confirmó mediante el recuento celular de secciones con tinción de Nissl. Además, la pérdida de terminales estriatales dopaminérgicos se confirmó mediante análisis de densidad óptica de TH-ir estriatal, tanto en las ratas inyectadas con AAV9-α-syn-WT, como en las inyectadas con AAV9-α-syn-A53T, que RESULTADOS 107 para la actividad locomotora (c, f). Las mediciones muestran reducciones significativas del rendimiento motor en las ratas lesionadas en relación con los controles (solución salina y vectores vacíos), que mejoraron significativamente con el tratamiento con candesartán o telmisartán. Los datos se presentan como la media ± SEM. *p< 0,05 en relación con el grupo inyectado con solución salina; #p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9-Ф; &p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9-α-syn-WT humana (a-c) o AAV9-α-syn- A53T humana (d-f). ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak. Abreviaturas: WT, forma salvaje; α-syn, α-sinucleína; CAND, candesartán; TELM, telmisartán; AAV9, vector viral adenoasociado tipo 9; AUC, área bajo la curva. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018 y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). 4.1.3. Implicación del receptor AT1 en la neuroinflamación mediada por la sobreexpresión de α-syn Estudios previos han demostrado una importante relación entre la sinucleinopatía y la respuesta inflamatoria microglial. Otros estudios han observado una estrecha relación entre la hiperactivación del eje prooxidativo del SRA, Ang II/AT1/NOX, y la neuroinflamación. Por ello, se estudió si el uso de antagonistas del receptor AT1 podrían tener un efecto beneficioso en la inflamación mediada por la sobreexpresión de α-syn. Para ello, se llevaron a cabo análisis de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica de microglía reactiva. Además, se estudió la expresión del ARNm de las principales citoquinas de fenotipo microglial pro-inflamatorio/pro-oxidante (TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS) y fenotipo anti-inflamatorio/anti-oxidante (ARG-1). En las imágenes de fluorescencia, se observó que 1 semana después de la inyección de AAV9-α-syn se produjo un aumento en la densidad de células Iba-1-ir en la SNpc (Figura 4h, k). Sin embargo, los fenotipos fagocíticos, así como, la microglía fagocítica que envolvía las neuronas que sobreexpresaban α-syn eran poco abundantes. Cuatro semanas después de la inyección de los vectores virales, se observó un marcado aumento de la respuesta microglial, acompañada de un abundante fenotipo de microglía activada y un alto número de células microgliales envolviendo las neuronas positivas para α-syn (Figura 5b, e g-k). Por otro lado, el elevado número de fenotipos morfológicos de microglía clásicamente activada se confirmó con inmunohistoquímica y cuantificación esterológica de OX-6 en la SNpc. Las ratas inyectadas con AAV9-α-syn-WT o AAV9-α-syn-A53T mostraron un número MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 108 significativamente mayor de células OX6-ir que las inyectadas con salino o con vectores vacíos cuatro semanas después de la inyección. Sin embargo, los efectos de la α-syn en la respuesta microglial fueron significativamente menores en las ratas tratadas con los antagonistas del receptor AT1, candesartán o telmisartán (Figura 11). Figura 11. Células microgliales inmunorreactivas a OX6 en la sustancia negra a las 4 semanas después de la inyección de solución salina, o vectores AAV9 vacíos (AAV9-Ф), o AAV9-α- syn-WT, o AAV9-α-syn-A53T en ratas no tratadas o tratadas con el antagonista AT1 candesartán (CAND) o telmisartán (TELM). En (C-I) se muestran fotomicrografías representativas de la sustancia negra compacta de diferentes grupos de ratas. El número estimado de células positivas para OX6 en la sustancia negra de los diferentes grupos experimentales se muestra en (A, B). Las células microgliales se muestran como porcentajes de las observadas en los controles (es decir, ratas inyectadas con solución salina), y los datos son representados como la media ± SEM. *p < 0,05 en relación con el grupo tratado con solución salina, #p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9-Ф-, &p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9 expresando α-syn-WT humana (A) o expresando α-syn-A53T humana (B). ANOVA de una vía y prueba post hoc de Holm-Sidak. Barra de escala = 100 μm. RESULTADOS 109 Abreviaturas: WT, forma salvaje; α-syn, α-sinucleína; DA, dopamina; DOPAC, ácido 3,4- dihidroxifenilacético; HVA, ácido homovanílico; AAV9, vector viral adenoasociado tipo 9; OX6-ir, inmunorreactivas a OX-6; CAND, candesartán; TELM, telmisartán. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018 y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Tras los resultados obtenidos, se estudió si la sobreexpresión de αsyn podría provocar un aumento del eje pro-oxidativo del SRA, tal y como se ha demostrado en otros modelos de EP (Labandeira-Garcia et al., 2021). Para ello, se estudió la expresión del ARNm del receptor AT1 mediante RT-QPCR y la actividad de NOX en homogenado de SNpc de ratas inyectadas con AAV9-α-syn y AAV9-∅. Los resultados mostraron que los animales que sobreexpresaban α-syn tenían incrementada la expresión de los receptores AT1 y de la actividad NOX en la región nigral en comparación con las ratas control inyectadas con vectores vacíos (Figura 12a, b, d). Esta hiperactivación del eje prooxidativo del SRA podría inhibirse con el uso de antagonistas del receptor de AT1 (ARAII). Por ello, se trataron animales inyectados con AAV9-α-syn-WT ó AAV9-α-syn-A53T con antagonistas de AT1, candesartán y telmisartán. El uso de ambos tratamientos demostró una disminución de la hiperactivación del eje pro-oxidativo del SRA, disminuyendo así, la expresión del ARNm del AT1 y la actividad de NOX, con respecto a ratas inyectadas con AAV9-α-syn sin tratamiento (Figura 12a, b, d). En consonancia con estos resultados, las ratas inyectadas con AAV9-α-syn mostraron un aumento significativo de la expresión del marcador de actividad fagocítica CD68 (Figura 12c) y de los marcadores del fenotipo microglial pro-inflamatorio (iNOS, TNF-α, IL- 1β e IL-6) (Figura 13a-e) y una disminución significativa de la expresión del marcador del fenotipo microglial anti-inflamatorio ARG- 1 (Figura 13f). Estos cambios en los marcadores de respuesta inflamatorias microgliales fueron inhibidos por el tratamiento simultáneo con los antagonistas de AT1, candesartán o telmisartán (Figura 13a-f). MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 110 Figura 12. Efecto de los vectores AAV9 vacíos (AAV9-Ф) o AAV9-α-syn sobre la expresión del ARNm del receptor AT1, la actividad NOX y los marcadores de actividad fagocítica (CD68) en ratas no tratadas o tratadas con el antagonista AT1, candesartán (CAND) o telmisartán (TELM). AAV9-α-syn-WT indujo un aumento significativo de la expresión del ARNm del receptor AT1 (a), de la actividad NOX (b) y de CD68 (c). En (d) se muestra un aumento significativo de la actividad NOX inducido por AAV9-α-syn-A53T. Estos cambios fueron inhibidos por el tratamiento simultáneo con los antagonistas de AT1, candesartán o telmisartán (a-d). En (a, c), los resultados se normalizaron con respecto a los valores del grupo de control. Para la RT-QPCR, se utilizó el método de valores umbral de ciclo comparativo (2-ΔΔCt). La expresión de ARNm se midió en relación con la de los transcritos de mantenimiento (β-actina). La actividad de NOX se expresó como unidades de luminiscencia relativas (ULR/min/mg de proteína). Los datos son representados como la media ± SEM. *p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9-Ф; #p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9 que expresa α-syn humana. ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak. Abreviaturas: WT, forma salvaje; α-syn, α-sinucleína; AAV9, vector viral adenoasociado tipo 9; CAND, candesartán; TELM, telmisartán; AT1, receptor de angiotensina tipo 1; CD68, cluster de diferenciación 68. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018 y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). RESULTADOS 111 Figura 13. Efecto de los vectores AAV9 vacíos (AAV9-Ф) o AAV9-α-syn humana sobre la expresión de marcadores del fenotipo microglial en ratas no tratadas o tratadas con el antagonista AT1, candesartán (CAND) o telmisartán (TELM). El AAV9-α-syn-WT indujo un aumento significativo de la expresión de marcadores del fenotipo pro-oxidante (IL-1β, IL-6, iNOS y TNF-α) (a-d). El marcado aumento de la expresión de TNF-α inducido por AAV9-α- syn-A53T se muestra en (e). Sin embargo, se observó una disminución de la expresión del marcador del fenotipo de reparación/regeneración anti-inflamatorio ARG-1 (f). Estos cambios MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 112 fueron inhibidos por el tratamiento simultáneo con los antagonistas de AT1, candesartán (CAND) o telmisartán (TELM) (a-f). Los resultados se normalizaron con respecto a los valores del grupo de control. Para la RT-PCR, se utilizó el método de valores umbrales de ciclo comparativo (2-ΔΔCt). Se midió la expresión ARNm en relación con el de los transcritos de mantenimiento (β-actina). Los niveles de TNF-α se cuantificaron con kits de ensayo inmunoenzimático (ELISA) específicos para ratas en picogramos por mililitro por miligramo de proteína y se expresaron como porcentajes del contenido en las muestras del grupo de control. Los datos se representan como la media ± SEM. *p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9-Ф; #p < 0,05 en relación con el grupo inyectado con AAV9 que expresa α-syn humana. ANOVA de una vía seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak. Abreviaturas: Abreviaturas: WT, forma salvaje; α-syn, α-sinucleína; CAND, candesartán; TELM, telmisartán; AAV9, vector viral adenoasociado tipo 9; IL-1β, interleucina 1β; IL-6, interleucina 6; iNOS, óxido nítrico sintasa inducible; TNF-α, factor de necrosis tumoral. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2018 y se distribuye bajo los términos de Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). En resumen, los resultados obtenidos muestran un importante papel de los receptores AT1 en la neuroinflamación mediada por la sobreexpresión de la proteína α-syn humana en un modelo de rata. El tratamiento con bloqueantes del receptor AT1, candesartán y telmisartán, disminuyó la respuesta microglial inflamatoria promoviendo así, un efecto neuroprotector en la muerte neuronal dopaminérgica en la SNpc resultando en un mejor rendimiento del comportamiento motor. 4.2.RECEPTORES AT2 CEREBRALES E INFLAMACIÓN Los resultados anteriormente presentados muestran un importante papel del receptor AT1 en la neuroinflamación y respuesta microglial de un modelo de neurodegeneración dopaminérgica. Sin embargo, la implicación del receptor AT2 en dichos procesos ha sido menos estudiada. Es por ello que, el siguiente objetivo de la tesis se centró en estudiar el papel del receptor AT2, bajo situaciones de inflamación periférica crónica, y su posible implicación en la degeneración dopaminérgica con la que cursa la EP. 4.2.1. Receptores AT2 cerebrales en inflamación periférica crónica (envejecimiento) y aguda (LPS) El envejecimiento es un proceso fisiológico que desemboca en diversos mecanismos pro-oxidativos que promueven un estado de inflamación crónica en el organismo. Este estado de inflamación podría RESULTADOS 113 influir en la expresión del receptor AT2 cerebral. Para estudiar la expresión del receptor AT2 en el envejecimiento se compararon ratones WT jóvenes (2m), adultos (12m) y envejecidos (18m). Los análisis de RT-QPCR revelaron que, en el homogenizado de la SN, la expresión de ARNm del receptor AT2 mostraba una marcada disminución con el envejecimiento (Figura 14A). Seguidamente, se analizó cómo podría influir la disminución de la expresión del receptor AT2 observada en el envejecimiento sobre otros componentes y receptores del SRA cerebral. Para ello se utilizaron ratones AT2KO jóvenes y envejecidos, y ratones WT jóvenes y envejecidos, y se realizaron análisis de transcritos mediante RT-QPCR y análisis de expresión de proteínas mediante WB. Los resultados muestran que, en el homogenado de SN, la expresión de ARNm del receptor AT1 mostró un marcado aumento en ratones envejecidos (Figura 14B). Curiosamente, los niveles altos de expresión de ARNm del receptor AT1 ya era significativos en ratones AT2KO jóvenes con respecto a WT jóvenes (2m), y no cambiaron significativamente con el envejecimiento (12m y 18m) (Figura 14B). Los resultados obtenidos también muestran una disminución significativa en la expresión de ARNm del MasR en ausencia de AT2 en comparación con ratones WT jóvenes. En ratones WT, la expresión del receptor MasR disminuyó con el envejecimiento y no hubo diferencias significativas en la expresión del receptor Mas entre los ratones WT adultos y envejecidos y los ratones AT2 KO (Figura 14C). Además del aumento de la expresión de AT1, los ratones AT2KO de diferentes edades (2m, 12m, 18m) mostraron un aumento significativo en la expresión de ARNm y de proteína del ANG en relación con los controles WT correspondientes (Figura 14D). Por último, los cambios importantes observados en la expresión de ARNm en ratones AT2KO jóvenes se confirmaron a nivel de proteína mediante WB (Figura 14E- G). Todos estos resultados indican un marcado desequilibrio en la expresión de componentes y receptores del SRA cerebral hacia el eje pro-inflamatorio y pro-oxidativo en ratones AT2KO y WT envejecidos. MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 114 Este desequilibrio podría desembocar en un incremento de la respuesta inflamatoria cerebral. Por ello se estudió la expresión de ARNm de diferentes marcadores pro-inflamatorios. Los resultados mostraron un aumento en la expresión de marcadores pro-inflamatorios como IL-1β, NF-kB e IL-6 en animales envejecidos WT, que ya se encontraba incrementada en los ratones AT2KO (Figura 15A, B, C). También se observó un aumento de la expresión de ARNm de marcadores de estrés oxidativo como la subunidad p47 de NOX (p47 fagocito oxidasa) y una disminución de la actividad COX en la SNpc de ratones AT2KO con respecto a ratones WT (Figura 15D-E). Curiosamente, se observó un aumento similar en la expresión de los marcadores pro-oxidativos en ratones WT envejecidos (Figura 15D-E). RESULTADOS 115 Figura 14. Cambios en los componentes y receptores del SRA con el envejecimiento en la región de la SNpc en ratones WT y en ratones AT2KO. Los ratones WT mostraron una disminución progresiva de la expresión del ARNm del receptor AT2 (A) y del MasR (C) y un aumento del ARNm del receptor AT1 (B) y del ANG (D; estadísticamente no significativo) con el envejecimiento, que ya se observa en los ratones AT2KO jóvenes (B-D). Los principales cambios en la expresión del ARNm de los receptores AT1 y Mas y del ANG se confirmaron a nivel proteico mediante un análisis de WB (E-G). La expresión proteica se midió en relación MARÍA A PEDROSA SÁNCHEZ 116 con la banda de la proteína de mantenimiento GAPDH y la expresión de ARNm se midió en relación con la de los transcritos de mantenimiento (β-Actina). Los valores de las proteínas fueron normalizados a los valores de los controles (100%). Para el ARNm se utilizó el método de los valores umbrales del ciclo comparativo (2-ΔΔCt). Los datos son representados como la media ± SEM. *p < 0,05 en comparación con el control WT correspondiente, #p < 0,05 en comparación con el grupo joven (2m) WT o joven (2m) AT2KO, $p < 0,05 en comparación con el grupo adulto (12m) WT. ANOVA de una vía (A) o ANOVA de dos vías (B-D) seguido de la prueba post hoc de Student-Newman-Keuls, y prueba t de Student (E-G). Abreviaturas: WT, forma salvaje; AT2, receptor de angiotensina tipo 2; AT1, receptor de angiotensina tipo 1; ANG, angiotensinógeno; AT2KO, Knock-Out para el receptor AT2. Esta figura ha sido traducida de Rodriguez-Perez et al., 2019 (con autorización de Elsevier). Con el objetivo de estudiar la respuesta a estímulos proinflamatorios periféricos agudos en ausencia de los receptores AT2, a un grupo de ratones jóvenes AT2KO se les inyectó LPS para inducir una respuesta inflamatoria periférica aguda. Con este modelo se observó que la expresión de ARNm de marcadores pro-inflamatorios (IL-6, IL-1β) mostró un aumento adicional tras la inyección de LPS. Sin embargo, no se observó (al menos con la dosis 5mg/kg y al tiempo utilizado, 24 h) un aumento adicional en la expresión del ARNm del receptor AT1 (Figura 15F). Estos resultados están en consonancia con lo observado en ratones AT2KO (Figuras 14B y 15A–C), ya que el envejecimiento induce un aumento adicional de los marcadores proinflamatorios pero no un aumento adicional de la expresión del ARNm de AT1 en animales AT2KO. BIBLIOGRAFÍA 217 angiotensin receptor (AT1) in patients with hypertension. J Hypertens 18, 945-953, doi:10.1097/00004872-200018070-00017 Gandhi, C. K., Holmes, R., Gewolb, I. H. & Uhal, B. D. (2019) Degradation of Lung Protective Angiotensin Converting Enzyme-2 by Meconium in Human Alveolar Epithelial Cells: A Potential Pathogenic Mechanism in Meconium Aspiration Syndrome. 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La doctoranda, María A Pedrosa Sánchez, declara no tener ningún conflicto de interés en relación con la presente tesis doctoral. 250 FINANCIACIÓN  Ministerio de Sanidad (PI20/00345; PI17/00828, RD16/0011/0016, Centro de Investigación Biomédica en Red Enfermedades Neurodegenerativas, CIBERNED).  Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2015-70523; BFU2017-82407-R; RTI2018-098830-B-I00; RTI2018-094204- B-I00).  Gobierno de Galicia (Xunta de Galicia, Consejería de Educación; GRC2014/002; ED431C 2018/10; ED431G/05; IN845D 2020/20). Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas, CIMUS (2016-PG013; ED431G/05). Ayudas de apoyo a la etapa predoctoral (ED481A-2017).  Gobierno de Navarra (Departamento de Salud; 046-2017).  Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). Xefatura Territorial Sº de Gandaría Edificio administrativo Monelos, 4º andar Rúa Vicente Ferrer, Nº 2 15008 A Coruña Tfno.: 981 184 565 Correo electrónico: ser[email protected] RESOLUCIÓN DE AUTORIZACIÓN DE PROXECTO DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL Expediente núm.: 15012/2021/012 Data de inicio do expediente: 16.4.2021 Persoa solicitante: Anxo Vidal Figueroa Procedemento: resolución de autorización Forma de inicio: solicitude da persoa interesada ANTECEDENTES A persoa solicitante presentou con data 16.4.2021 unha solicitude para a realización do proxecto de experimentación animal (entrada no Rexistro electrónico da Xunta de Galicia 2021/880369), cuxos datos se detallan a continuación: Denominación do proxecto: Estudos de novas terapias en modelos de enfermidade de Parkinson e outras enfermidades neurodexenerativas Nome do centro usuario: Centro de Biomedicina Experimental (CEBEGA) da Universidade de Santiago de Compostela Persoa responsable do proxecto: José Luis Labandeira García Establecemento onde se realizarán os procedementos do proxecto (ou lugar xeográfico no caso de traballos de campo): Centro de Biomedicina Experimental (CEBEGA) Clasificación do proxecto : Tipo I Tipo II Tipo III CONSIDERACIÓNS LEGAIS E TÉCNICAS 1 O Real decreto 53/2013, de 1 de febreiro (BOE 34, do 8 de febreiro), polo que se establecen as normas básicas aplicables para a protección dos animais utilizados en experimentación e outros fins científicos, incluíndo a docencia, establece no seu artigo 33 as condicións de autorizacións dos proxectos con animais de experimentación. 2 O artigo 88 da Lei 39/2015, de 1 de outubro, do procedemento administrativo común das administracións públicas (BOE 236, do 2 de outubro de 2015) establece que a resolución que poña fin o procedemento decidirá todas as cuestións expostas polos interesados e aquelas outras derivadas deste. X CVE: 7O1XzUVA62 Verificación: https://sede.xunta.gal/cve Xefatura Territorial Sº de Gandaría Edificio administrativo Monelos, 4º andar Rúa Vicente Ferrer, Nº 2 15008 A Coruña Tfno.: 981 184 565 Correo electrónico: ser[email protected] 3 O Servizo de Gandaría da Coruña revisou a documentación achegada na solicitude e o resultado favorable da avaliación do proxecto realizada polo órgano habilitado, a Sección de Experimentación Animal do Comité de Bioética da Universidade de Santiago de Compostela. Esta xefatura territorial é competente para ditar unha resolución, de conformidade co Decreto 149/2018, do 5 de decembro, polo que se establece a estrutura orgánica da Consellería do Medio Rural e se modifica parcialmente o Decreto 177/2016, do 15 de decembro, polo que se fixa a estrutura orgánica da Vicepresidencia e das consellerías da Xunta de Galicia (DOG 235, do 11 de novembro). De acordo con todo o indicado, RESOLVO: 1 Autorizar o proxecto solicitado. 2 O proxecto non precisa someterse a unha avaliación retrospectiva. 3 A autorización deste proxecto terá unha duración de cinco anos e unha vez transcorrido este tempo, deberá ser renovada. A citada autorización é unicamente válida nas condicións que figuran no expediente. Ante calquera cambio significativo no proxecto que poida ter efectos negativos sobre o benestar dos animais, deberá solicitar a confirmación da autorización ao Servizo Provincial de Gandaría. Esta autorización poderá ser suspendida no caso de que o proxecto non se leve a cabo de acordo coas condicións de autorización e retirala, previo expediente tramitado ao que se lle dará audiencia. Contra a presente resolución, que non pon fin á vía administrativa, poderá interpoñer un recurso de alzada ante o conselleiro de Medio Rural. O prazo comezará a contar dende o día seguinte ao da recepción desta resolución. Todo isto, segundo o disposto nos artigos 121 e 122 da citada Lei 39/2015. Mediante este escrito notifícaselle a Anxo Vidal Figueroa esta resolución segundo o esixido no artigo 40.1 da antedita Lei 39/2015. CVE: 7O1XzUVA62 Verificación: https://sede.xunta.gal/cve Asinado por: SANTOS MANEIRO, JOSE MANUEL Cargo: Xefe Territorial Data e hora: 30/04/2021 14:32:23 Secr etaria Técnica Com ité Autonómico de Ética da Investigación de Galicia Secr etaria Xeral. Consellería de Sanidade Edificio Administrativo San Lázaro 15703 SANTIAGO DE COMPOSTELA Te l: 881546425. Correo-e: ce ic@ s erg as.es Secr etaria Técnica Com ité Autonómico de Ética da Investigación de Galicia Secr etaria Xeral. Consellería de Sanidade Edificio Administrativo San Lázaro 15703 SANTIAGO DE COMPOSTELA Te l: 881546425. Correo-e: ce ic@ s erg as.es DICTAMENDELCOMITÉDEÉTICADELAINVESTIGACIÓNDESANTIAGOLUGO  GuillermoJoséPradaRamallal,SecretariodelComitédeÉticadelaInvestigacióndeSantiagoLugo,  CERTIFICA: QueesteComitéevaluóensureunióndeldía18deenerode2018elestudio:  Título:Obtención,purificacióny concentracióndeAutoanticuerposfrentealreceptorde Angiotensinatipo1apartirdemuestrassanguíneasdepacientesconpreeclampsia Promotor:AnaIsabelRodríguezPérez Tipodeestudio:Outros Versión:versiónnº2de3deenerode2018 CódigodelPromotor:AIRPRVAAAT1201801 CódigodeRegistro:2017/618  Y,tomandoenconsideraciónlassiguientescuestiones: - Lapertinenciadelestudio,teniendoencuentaelconocimientodisponible,asícomolos requisitoslegalesaplicables,yenparticularlaLey14/2007,deinvestigaciónbiomédica,el RealDecreto1716/2011,de18denoviembre,porelqueseestablecenlosrequisitosbásicos deautorizaciónyfuncionamientodelosbiobancosconfinesdeinvestigaciónbiomédicaydel tratamientodelasmuestrasbiológicasdeorigenhumana,yseregulaelfuncionamientoy organizacióndelRegistroNacionaldeBiobancosparainvestigaciónbiomédica,laORDEN SAS/3470/2009,de16dediciembre,porlaquesepublicanlasDirectricessobreestudios PostautorizacióndeTipoObservacionalparamedicamentosdeusohumano,ylaCircularnº 07/2004,deinvestigacionesclínicasconproductossanitarios. - Laidoneidaddelprotocoloenrelaciónconlosobjetivosdelestudio,justificacióndelos riesgosymolestiasprevisiblesparaelsujeto,asícomolosbeneficiosesperados. - LosprincipioséticosdaDeclaracióndeHelsinkivigente. - LosProcedimientosNormalizadosdeTrabajodelComité.  EmiteundictamenFAVORABLEparalarealizacióndelestudioporel/lainvestigador/adel centro:  CentrosInvesti gad oresPrinci p ales CIMUS.UniversidadedeSantiagodeCompostela ( USC )  AnaIsabelRodríguezPérez     EnSantiagodeCompostela,a23deenero2018.  ElSecretariodelComitéTerritorialdeÉticadelaInvestigacióndeSantiagoLugo,    GuillermoJoséPradaRamallal  [email protected] 2018.01.24 11:11:26 +02'00' Secr etaria Técnica Com ité Autonómico de Ética da Investigación de Galicia Secr etaria Xeral. Consellería de Sanidade Edificio Administrativo San Lázaro 15703 SANTIAGO DE COMPOSTELA Te l: 881546425. Correo-e: ce ic@ s erg as.es Secr etaria Técnica Com ité Autonómico de Ética da Investigación de Galicia Secr etaria Xeral. Consellería de Sanidade Edificio Administrativo San Lázaro 15703 SANTIAGO DE COMPOSTELA Te l: 881546425. Correo-e: ce ic@ s erg as.es GuillermoJoséPradaRamallal,SecretariodelComitédeÉticadelaInvestigacióndeSantiagoLugo,  HACECONSTARQUE:  1. ElComitéTerritorialdeÉticadelaInvestigacióndeSantiagoLugocumpletantoensu composicióncomoensusPNTslosrequisitoslegalesvigentes(RD1090/2015deensayosclínicos,y laLey14/2007deInvestigaciónBiomédica). 2.LacomposiciónactualdelComitéTerritorialdeÉticadelaInvestigacióndeSantiagoLugoes:  JuanManuelVázquezLago(Presidente).MédicoespecialistaenMedicinaPreventivay SaludPública.ÁreadeGestiónIntegradadeSantiago.  PilarRodríguezLedo(Vicepresidenta).MédicoespecialistaenMedicinaFamiliary Comunitaria.ÁreadeGestiónIntegradadeLugo.  GuillermoJoséPradaRamallal(Secretario).MédicoespecialistaenFarmacologíaClínica. ÁreadeGestiónIntegradadeSantiago.FundaciónRamónDomínguez. LorenzoArmenteros delOlmo(Vicesecretario). Médicoespecialista enMedicinaFamiliar yComunitaria.ÁreadeGestiónIntegradadeLugo.  FranciscoCamposPérez.Biólogo.InstitutodeInvestigaciónSanitariadeSantiagode Compostela.  RosanaCasteloDomínguez.FarmacéuticadeAtenciónPrimaria.ÁreadeGestiónIntegrada deSantiago.  RicardoGarcíaMartínez.LicenciadoenDerecho.ÁreadeGestiónIntegradadeLugo.  JaimeGulínDávila.FarmacéuticoespecialistaenFarmaciaHospitalaria.ÁreadeGestión IntegradadeLugo.  VictorHerránCarreira.Paciente.ADILAsociacióndeDiabéticosLucense.  MaríaJesúsLamasDíaz.FarmacéuticaespecialistaenFarmaciaHospitalaria.Áreade GestiónIntegradadeSantiago.  CarlosRodríguezMoreno.MédicoespecialistaenFarmacologíaClínica.ÁreadeGestión IntegradadeSantiago.  RafaelCarlosVidalPérez.MédicoespecialistaenCardiología.ÁreadeGestiónIntegradade Lugo.  MaríaJesúsWandosellPicatoste.Enfermera.ÁreadeGestiónIntegradadeSantiago.  Paraqueconstedondeproceda,yapeticióndelpromotor/investigador,enSantiagodeCompostela, a23deenerode2018.  ElSecretariodelComitéTerritorialdeÉticadelaInvestigacióndeSantiagoLugo,    GuillermoJoséPradaRamallal  [email protected] 2018.01.24 11:11:28 +02'00'