Novel procedures of viral quantification: development, optimization and validation of ex vivo and in vivo techniques

TESE DE DOUTORAMENTO NOVEL PROCEDURES OF VIRAL QUANTIFICATION: DEVELOPMENT, OPTIMIZATION AND VALIDATION OF EX VIVO AND IN VIVO TECHNIQUES Diego Vázquez Rodríguez ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN CIENCIAS CIENCIAS MARIÑAS, TECNOLOXÍA E XESTIÓN SANTIAGO DE COMPOSTELA ANO 2019 DECLARACIÓN DO AUTOR DA TESE NOVEL PROCEDURES OF VIRAL QUANTIFICATION: DEVELOPMENT, OPTIMIZATION AND VALIDATION OF EX VIVO AND IN VIVO TECHNIQUES D. Diego Vázquez Rodríguez Presento a miña tese, seguindo o procedemento axeitado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) De selo caso, na tese faise referencia ás colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide coa versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio doutros autores nin de traballos presentados por min para a obtención doutros títulos. En Santiago de Compostela, 23 de Setembro de 2019 Asdo AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE NOVEL PROCEDURES OF VIRAL QUANTIFICATION OF EX VIVO AND IN VIVO TECHNIQUES D. Carlos Pereira do Pazo INFORMA: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D. Diego Vázquez Rodríguez, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación, considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. De acordo co artigo 41 do Regulamento de Estudos de Doutoramento, declara tamén que a presente tese de doutoramento é idónea para ser defendida en base á modalidade de COMPENDIO DE PUBLICACIÓNS , nos que a participación do/a doutorando/a foi decisiva para a súa elaboración. A utilización destes artigos nesta memoria, está en coñecemento dos coautores, tanto doutores como non doutores. Ademais, estes últimos teñen coñecemento de que ningún dos traballos aquí reunidos poderá ser presentado en ningunha outra tese de doutoramento. En Santiago de Compostela, 23 de Setembro de 2019 Asdo COMPETING INTERESTS The PhD student declare that he has no competing interests in relation with the thesis presented. Agradecimientos En este apartado quiero agradecer a todos los que en mayor o en menor medida me han ayudado en este viaje. Durante todo este tiempo, mi familia ha jugado un papel crucial, ya que, aunque no son coautores de ningún artículo, sin ellos no habría llegado hasta el final, por eso quiero agradecer a mis padres y hermano su apoyo incondicional y por creer en mí siempre. A mis dos amores, Mónica y Leo, por ser la fuente de energía que me levanta cada día, llenar de felicidad cada minuto de mi tiempo y por apoyarme en este largo camino. Sin vosotros no lo hubiese logrado. A mis padrinos Consuelo, Alfonso y Begoña, por su constante ayuda, cariño y amenizarme los viajes a Santiago ;) A mi director Carlos P. Dopazo que, gracias a la oportunidad ofrecida hace ya unos cuantos años, pude iniciar esta tesis doctoral. Por ello, y por haber apoyado esta tesis hasta el final, quiero aprovechar estas líneas para agradecerle el tiempo dedicado a este proyecto. A Juan M. Cutrín por haber sido un gran apoyo en mis inicios, ofreciéndome siempre con una sonrisa, su ayuda y buen consejo. A Jose G. Olveira y Carmen López-Vazquez por compartir conmigo horas de trabajo y ayudarme con mis “frustraciones” en el laboratorio. A Maria, Sandra, Noelia y Alián, por haber ofrecido su tiempo y esfuerzo de manera desinteresada, y por tantos y buenos ratos entre “PCR” y “PCR”. ! ! ! ! Chapter 1 ! ! Introduction and Objectives of this Thesis ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Diego Vázquez Rodríguez 20! 1 INTRODUCTION The worldwide development of aquaculture in the last decades is unquestionable. In 2016, the world aquaculture production reached 80 million tons, with an estimated first-sale value of US$232 billion, consisting of 54.1 million tons of finfish (US$138.5 billion), 17.1 million tons of molluscs (US$29.2 billion), 7.9 million tones of crustaceans (US$57.1 billion), and 938500 tones of other aquatic animals such as turtles, sea cucumbers, sea urchins, frogs and edible jellyfish (US$6.8 billion) (FAO, 2018). This situation has been promoted by the intensification of the culture processes. However, the intensive fish and shellfish production is threatened by epidemic outbreaks affecting not only the “domestic” populations but also the wild stocks (Tompkins et al., 2015). Among the different pathologies affecting fish aquaculture, viral diseases have one of the highest economic impacts due to their virulence, rapid dispersion and absence of treatment and effective vaccines, what makes their complete eradication difficult. Therefore, research is focused not only to the development of prophylactic protocols and the design of new and more efficient vaccines, but also to the improvement of diagnostic procedures for the rapid control of outbreaks. Additionally, an increasing effort is being applied on health surveillances of cultured and wild fish populations, which has led to the discovery of several viruses which were not known to scientists; some of them are endemic among native populations and opportunistically spill-over to infect fish in aquaculture facilities (Walker and Winton, 2010). In addition, they have also provided important information on the distribution and virulence of other previously known viruses. For the present study, focused on the development, optimization and validation of viral quantification procedures, any of those viruses could have been chosen to be used as a model. Why was the infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) chosen among all? The same gap regarding the general aim of this study affects to all fish viruses in the literature, but for IPNV lower biosafety restrictions, together with the high availability and diversity of strains, make this pathogen a great candidate for these types of studies. Chapter 1 Introduction and Objectives ! ! 21! 2 OBJECTIVES OF THE PRESENT STUDY The purpose of the present study was the evaluation, design and validation of different techniques of virus quantification, using the infectious necrosis pancreatic virus (IPNV) as a general model. The final goal of the study was, in later stage, the transference of the technology validated to the standard operator procedures of the Aquaculture institute from the Universidad de Santiago de Compostela. From this general objective the sub-goals were: • The analysis of current methodologies available and revision of the literature to identify opportunities for improvement in the current processes of the laboratory. • The design, optimization and validation of qPCR for detection and quantification of the Infectious Pancreatic Necrosis Virus • To develop and validate a protocol for quantification of viral proteins expressed in salmon cell lines using fluorescence activated cell sorting. • The design, optimization and validation of virus titration using micro flow cytometry. Diego Vázquez Rodríguez 22! 3 REFERENCES FAO, 2018. The State of World Fisheries and Aquaculture 2018 - Meeting the sustainable development goals, fao.org. Rome. Tompkins, D.M., Carver, S., Jones, M.E., Krkošek, M., Skerratt, L.F., 2015. Emerging infectious diseases of wildlife: a critical perspective. Trends Parasitol. 31, 149–159. https://doi.org/10.1016/j.pt.2015.01.007 Walker, P.J., Winton, J.R., 2010. Emerging viral diseases of fish and shrimp. Vet. Res. 41, 51. https://doi.org/10.1051/vetres/2010022 ! Chapter 2 ! ! Virus Quantification: A General Review ! ! ! ! Diego Vázquez Rodríguez 24! 1 THE IMPORTANCE OF VIRUS QUANTIFICATION In most virology studies, one of the critical information is the concentration of total of infectious particles in a sample. Hence, it is crucial to know the replication cycle of a virus to study the level of virulence of new isolates, to assess the antiviral activity of chemotherapeutic agents, for monitoring the stage and efficiency of a virus purification in industrial processes or simply to evaluate virus pathogenicity (Hierholzer and Killington, 1996). In any experiment involving cells inoculation with virus, the multiplicity of infection (MOI; being the number of viral particles per cell) is crucial since irreproducible or unreliable MOIs, caused by inaccurate estimation of the viral titter of the inoculum, have a profound impact on the performance and batch consistency of the assay (Roldão et al., 2009). For this reason, accurate quantitative methods are mandatory. The clinical utility of the viral quantification has been deeply reviewed in human medicine. However, in the veterinary field, and more precisely in fish virology, most techniques and methodologies have been adapted from previous advances in human virology. In spite of its relevance, just a couple of reviews have been published in recent years ( Heider and Metzner, 2014; Pankaj, 2013) . Following the classification made by Heider and Metzner (2014), virus quantification methods can be broadly classified in four different categories depending on what are they based on: i) in the levels of infectivity, ii) in detection of viral proteins, iii) in detection of viral nucleic acid, or iv) in counting of viral particles 2 METHODS FOR VIRUS QUANTIFICATION 2.1 Virus infectivity The most basic and traditional procedures to know the viral concentration in a sample are based on the assessment of the viral infectivity. An infectivity assay measures the titer (the concentration) of an infective virus in a specimen or a preparation. These methods can be additionally classified in those based on the response of the inoculated subject to an infection –called quantal– and those relying on the detection and counting of foci of infection known as focal or quantitative assays. a) Quantal assay The end point dilution assays are definitely one of the most used methods for quantification of virus. Their objective is to find the viral dose yielding a response in 50 per cent of the inoculated subjects. Depending on the type of subject used for the inoculation, the final titer value could be named differently: tissue culture infectious dose 50 (TCID50), if cell cultures are used; lethal dose 50 Chapter 2 Virus quantification: A general review ! ! 25! (LD50), using experimental animals, or egg infective dose 50 (EID50), using embryonated chicken eggs. The general procedure always begins with serial dilution of the stock sample, and the subsequent infection or inoculation of the subjects. The estimation of the titer by TCID50 is, by far, one of the most used in the fish virology field. TCID50 is generally defined as the lowest viral dilution where the 50% of a given batch of cells are demonstrated to be infected, demonstration being attained by the visualization of cytopathic effect (CPE) in the cell monolayer. Then the estimation of the titer can be performed using different nonparametric methods like Spearman and Karber (SK), Reed and Muench (RM), Dragstedt and Behrens (DA), Litchfield and Wilcoxon (LW), and moving average (MA) (Finney, 1952; Hamilton, 1991), or by parametric procedures as the maximum likelihood (ML) based on the single hit Poisson response (Myers et al., 1994). To answer the immediate question of which method should be chosen, Finney (1952); afterwards supported by Hamilton, 1991) argued that neither RM, DA or LW are as powerful as the SK procedure, and their continued use in some areas is “motivated only by tradition”; in fact, the Spearman-Karber method is recommended by FAO because “ is statistically markedly superior and involves relatively simple calculation” (Litamoi et al., 1996) However, when the concentration is low but measurable (i.e titers below approximately 0.8 log10 of units per ml, using standard plates), SK method produces increasingly biased estimates of titers. Moreover, the methodology has an absolute requirement: that the serial dilutions provide both 100% and 0% infectivity, but this criteria is difficult to meet with low levels of virus in the sample (Darling et al., 1998). Therefore, either ML or SK methods have been recommended to be used at most virus concentrations; but, at low virus concentrations ML is preferred (Brownie et al., 2011). However, although spreadsheet algorithms are available to carry out the ML calculations one sample at a time, it is somehow harder to automate batch processing of multiple samples because the iterative solution of an equation is required. Therefore, the use of the SK method is more extended because calculations can be easily implemented in a spreadsheet format. This facilitates the standardization of computations across laboratories, when large numbers of assays are conducted (Brownie et al., 2011). b) Quantitative assay Quantitative assays are those in which foci of infection are counted somehow (Plaques, fluorescent foci, etc.). Plaques are localized as discrete foci of infection, denoted by zones of cell lysis or CPE within a monolayer of otherwise healthy tissue culture cells (Hierholzer and Killington, 1996). The plaque assay was firstly developed for animal viruses (the Western equine encephalomyelitis virus) by Renato Dulbecco in 1952 (Dulbecco, 1952), as an adaptation of the method already used for calculating bacteriophage stocks titers. Diego Vázquez Rodríguez 26! Since then, the method has been adapted for multiple animal virus including those affecting fishes, like the viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV), IPNV, the infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV), the channel catfish virus (CCV), and the lymphocistis disease virus (LV) (Burke and Mulcahy, 1980; Espinoza and Kuznar, 2002; Wolf et al., 1973). Plaque assays are performed in two different ways: suspension assays (cells and virus are seeded at the same time after adsorption), or monolayer assay (where the virus suspension is added to a confluent tissue culture cell monolayer). Some viruses, such as herpes viruses and poxviruses, may be plaque-assayed under standard liquid culture medium, because direct cell-to-cell spread of these viruses ensures formation of localized plaques. However, many other viruses require a viscous overlay medium to prevent secondary infections. Whatever the method chosen, it should be adapted to the particular condition of the virus used, and some aspects in the optimization process should be taken into account since they could affect the final titer, as: (i) the ability of the virus to cause a detectable CPE in tissue culture, since some clinical isolates may fail to induce CPE or form plaques (Hammarlund et al., 2012); (ii) the time required for each specific virus to adsorb to the cells; (iii) the type of overlay used, because some can cause an inhibitory effect on the replication of the virus (Matrosovich et al., 2006); (iv) the incubation time needed for plaques formation; (v) the sensitivity to virus infection of the cell chosen (Lorenzen et al., 1999), and (vi) the cell concentration –or monolayer confluency– at the time of infection (Roldão et al., 2009). As a result of the infection of the cell by –theoretically, but not necessarily– a single virion, a plaque is finally formed, and the number of plaques formed in the cell monolayer with each dilution will be proportional to the concentration of infectious viral particles used for the infection. For statistical reasons, 20-100 plaques per monolayer are ideal for counting, although the actual number is often dependent on the size of the plaque and the size of the flask or plaque used for the assay (Hierholzer and Killington, 1996). The final titer is expressed as plaque forming units per milliliter (pfu/mL). Although this methodology, as the quantal assay described before, is relatively simple, due to the long incubations required to obtain results (normally between 3 and 10 days, depending of the virus and cells used) it is considered time consuming. A direct equivalence between TCID50 and pfu titers does not exist. In the publication headed by Bryan (1957), the author finds that the pfu/TCID50 ratio must be around ln(2) ≈0.69, and using Monte Carlo simulation, it was demonstrated that the relation is about 0.56 when using the SK calculation method (Wulff et al., 2012). A comparative evaluation of both techniques for the titration of filovirus, suggested a relation value of around 0.1(PFU/TCID50) (Smither et al., 2013). On the other hand, these authors also found a greater reproducibility with the plaque assay than with the end point dilution method, results which are in concordance with others in the literature reporting differences in terms of standard error between plaque assay (coefficient of Chapter 2 Virus quantification: A general review ! ! 33! differentiate active versus persistent infection (Mackay et al., 2002). Many real time-qPCR protocols for the detection of microbial targets have been published, and commercial assays are available for a number of clinically important human viruses (Ratcliff et al., 2007). In veterinary diagnostics, and more specifically in fish virology, this technique has been successfully implemented for detecting and quantifying many viral pathogens, including VHSV (Garver et al., 2011; Jonstrup et al., 2013), IHNV (Overturf et al., 2001; Purcell et al., 2013), ISAV (Snow et al., 2006; Workenhe et al., 2008), or IPNV (Bowers et al., 2008; Calleja et al., 2012). However, there is still a lack of properly validated standards to be implemented in fish virus quantification. Commercial kits are usually validated using a large cohort of clinical samples. Development of in-house assays may be achieved if an appropriate structured validation procedure is implemented (Ratcliff et al., 2007). b) Digital PCR The first reference of digital PCR (dPCR)was in the 1990s (Sidransky et al., 1992; Vogelstein and Kinzler, 1999). The struggle with the design, validation and preservation of the standards needed for the previous technique has been overcome with the advent of the dPCR. One of the greatest benefits of this technology is the direct measurement of viral nucleic acid concentration, providing the absolute number of copies/ml without the need for a standard curve. The chemistry used in digital PCR is the same as qPCR, but the amplification is detected by a different method. The fluorescent quantification is made by diluting the sample and partitioning it into individual reactions (droplets), in a manner that each reaction ideally contains one (never more than 2) or no copies of the DNA of interest (Sedlak and Jerome, 2014). The absolute number of target nucleic acid molecules in the sample is calculated directly from the ratio of positive to total partitions using binomial Poisson statistics (Pinheiro et al., 2012). In a recent study, the comparative evaluation between RT-dPCR and RT-qPCR detecting the main viruses responsible for foodborne outbreaks human Noroviruses (NoV) and Hepatitis A virus (HAV), revealed that the RT- dPCR is 1 log10 more sensitive. Moreover, RT-dPCR may provide more accurate measurements than RT-qPCR as it is not dependent on amplification efficiency (Coudray-Meunier et al., 2015). In other study, the authors quantified GB Virus Type-C (GBV-C), an occult RNA virus associated with HIV-1 infection. They observed that, even after removing the potential error of a mass-based standard curve using a digital PCR calibrated standard curve, RT-qPCR had, on average, a lower repeatability; more precisely, dPCR had an average coefficient of variation of 11.7±2.2% for the viral load tested, while standard qPCR had an average CV of 25.8±4.9% (White et al., 2012). Another key advantage of this technology is that the efficiency of the reverse transcription and the kinetics of Diego Vázquez Rodríguez 34! the amplification, relevant principles in qPCR, have no impact on the final digital PCR quantification. In a work published by Veach et al. (2015), the authors observed that the extracted RNA does not need to be purified from the reagents used to lyse the virus; they found a high correlation of the dPCR method with other quantification procedures of influenza virus like ELISA, HA and Virus Counter. RT-dPCR demonstrates higher precision and repeatability for quantifying waterborne viruses, at their characteristic low concentrations: 54.4±2.6 and 6±1 rotavirus copies/10 µL reaction (Rački et al., 2014). Digital PCR is unlikely to supplant qPCR in the short term, but instead will be a complementary approach in certain applications (Rutsaert et al., 2018; Sedlak and Jerome, 2014). Recently, its reliability in quantification of important pathogens for the aquaculture industry like VHSV and IHNV (Jia et al., 2017; Pavšič et al., 2016) has been proven. 2.4 Virus particles Although the technical advances in Virology has provided a diverse variety of methodologies for viral quantification, the truth is that counting of viral particles was traditionally performed by the use of the transmission electron microscope (TEM). In a recent review by Heider and Metzner (2014), the authors include description of the atomic force microscopy (AFM), laser light scattering applications such as multiple-angle laser light scattering (MALLS) (or nanoparticle tracking analysis; NTA), tunable resistive pulse sensing (TRPS)– a method based on the Coulter principle–, and flow cytometry (FC) variants like the Virus Counter (VC). In addition, liquid chromatography has been evaluated for the quantification of virus particles (Transfiguracion et al., 2015). a) Electron microscopy Although it has been gradually replaced by more sensitive methods such as PCR and immunofluorescent assays (IFA), transmission electron microscopy (TEM) has certainly represented a major contribution to virology, because it facilitates the diagnosis of viral infections, supports the investigation on virus– host cell interactions, and has led to the discovery of new viruses (Roingeard, 2008). The basic viral quantification procedure using TEM is built upon negative staining (mainly with uranyl acetate, phosphotungstic acid or ammonium molybdate) of the viral particles and its counting along with standard latex particles of known concentrations (Reid et al., 2003; Watson et al., 1963; Zheng et al., 1996). TEM quantitation is far quicker than infectious titration and it also allows a qualitative observation of the viral morphology. However, the detection limit do not allows it to be used with samples with a concentration lower than 105 particles/mL (Malenovska, 2013; Reid et al., 2003). Chapter 2 Virus quantification: A general review ! ! 35! b) Virus Counter Based on a prototype reported some years ago by Stoffel et al.,(2005), ViroCyt (2013; http://www.virocyt.com) has developed a specialized “flow virometer” suitable for rapid virus particle quantification in liquid samples. The method of detection is based on a dual labelling system, one label specific for proteins and another for the viral genome. Intact virus particles are quantified by detecting fluorescence from particles containing colocalized proteins and nucleic acids (Stoffel and Rowlen, 2005). Both, a certain size of virus (>25 nm) and a certain length of viral genome (49000 nt/bp) are necessary to guarantee a sufficient level of staining to be detected (Heider and Metzner, 2014). The substitution of a multistep antibody staining procedure by a non-specific staining increases the simplicity of the procedure for the operator, and reduces the assay costs (Arakelyan et al., 2013; Ferris et al., 2011). The reliable range of measurement reported by Heider and Metzner,( 2014) was between 5 Í 105 to 1 Í 109 virus particles/ml. In a recent evaluation of the method for filovirus quantitation, the authors observed that the CV ranged from 9.4% to 31.5% for those samples that fell within the linear range of the instrument (2.8 Í 106 to 1.0 Í 109 VP/mL)(Rossi et al., 2015). These limits are similar to those obtained for H1N1 influenza virus (9.8 Í 104 VP/mL) (Stepp et al., 2011). High correlation of the method with TEM, qPCR or TCID50 was observed, but a big gap between infectious and total virus counts was detected (Heider and Metzner, 2014). In quantification of particles directly from samples with the high levels of contaminant proteins typical of clinical samples (whole blood, serum, plasma) or stock preparations with fetal bovine serum concentrations higher than 10%, the level of background negatively affects the counting; therefore, previous dilution or purification of the sample is mandatory (Rossi et al., 2015). Other technologies like AFM, MALLS or NTA have been recently reviewed in detail by Heider and Metzner (2014). Although promising in their results, only a few research groups have reported their evaluation. The viruses tested are reduced to influenza virus, adenovirus and lentivirus. All of them have their pros and cons, but it is too early to determine if their use will be generalized for research with other viruses including those affecting aquaculture. Diego Vázquez Rodríguez 36! 3 REFERENCES Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J.C., 2013. Nanoparticlebased flow virometry for the analysis of individual virions. J. Clin. Invest. 123, 3716–3727. https://doi.org/10.1172/JCI67042 Bae, H.-G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S.S., Niedrig, M., 2003. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. J. Virol. 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The results of this study were published in: A novel procedure of quantitation of virus based on microflow cytometry analysis . Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 100, Issue 5, pp 2347–2354. March 2016, doi: 10.1007/s00253-015-7228-3 ! Chapter 6 Final Discussion and Conclusions Chapter 6 Final discussion and conclusions 120 1 FINAL DISCUSSION Whether it is for routine evaluation of a biopharmaceutical product, for vaccine production, or for validation of antiviral substances, virus quantification is a critical step in any of these processes. Therefore, the main objective of the whole study constituting the present doctoral thesis was to provide the Fish Virus Unit at the Institute of Aquaculture, USC, with a set of standardized and validated techniques for reliable quantification of fish viruses. In addition, because in the last years EU researchers have aimed their efforts to the development of diagnostic and quantification procedures for the viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) and the viral nervous necrosis virus (VNNV), leaving apart another important virus: the infectious pancreatic necrosis virus (IPNV); it was the goal of the present study to provide additional tools to fight this disease. After the extensive review of the current methods used for quantification of viruses performed in Chapter 1, it was concluded that, for most of them the gold standard is, still the cell based methods like plaque assay or 50% tissue culture infectious dose estimation by TCID50. In the particular case of viruses affecting the fish aquaculture industry, cell culture is also the gold standard method chosen by the World Organization for Animal Health (OIE). However, that technique is time consuming and exhibits low sensitivity which, in some cases, makes virus quantification difficult (Dopazo and Bandín, 2011). Therefore, although this one was used as reference, other techniques were selected to be evaluated for viral quantification after previous optimization: the quantification of i) genomic units, by means of quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) (Chapter 2), ii) and viral proteins (Chapters 3 and 4). Based on the large experience of the Institute team with the PCR based technologies, both for diagnosis and quantification of viruses (Cutrín et al., 2009; Dopazo and Bandín, 2011; Lopez-Vazquez et al., 2015; Olveira 2006), qPCR was the first technique selected to be optimized and validated for diagnosis and quantification of IPNV. The qPCR is a well-recognized technology for nucleic acid quantification and has been –and nowadays is– widely employed for viral quantification, as well as to quantify gene expression. Unfortunately, in some cases those studies reporting its use did not include the validation of the procedure, which compromise, to our understanding, the reliability of the results. The in vitro validation of the qPCR procedure developed was performed using, as reference standards, crude virus (titrated by the plaque assay and the end-point dilution TCID50 methods) and several in vitro transcribed RNA standards obtained from representative reference strains. The standards tested were found in all cases highly reliable based on the correlation values obtained (R2 always ³ 0.95) (Broeders et al., 2014). In addition, its high repeatability and reproducibility confirms the reliability of the procedure for viral quantification. Chapter 6 Final discussion and conclusions 122 terms of quantification of IPNV protein synthesis. Although qFC is not a new technique (Schwartz et al., 2002; Serke et al., 1998; Wang et al., 2002) its application to quantitatively study virus replication has been limited (Gates et al., 2009; Schulze-Horsel et al., 2008) . To this regard, in the present study we have demonstrated that, thanks to the MARIS method (Hrvatin et al., 2014), the developed procedure can also be applied to study the viral replication, since it can assess the capsid VP2 protein production significantly related to the RNA synthesis. As already reported by other authors (Mizrahi et al., 2018), qFC requires careful standardization in order to get meaningful and reproducible results. Such standardization must include every item in the whole process: Sample handling – even type of sample: virus and cells – calibration beads, the cytometer itself, or even data analysis. This was the complete process followed in chapter 3 to set up our procedure. However, it has been evaluated for IPNV on BF-2 cells with anti- VP2 protein antibody. Therefore, the procedure should be validated for each particular virus to stablish individual protocols suitable for each different case. On the other hand, in spite of the fact that flow cytometry has been revealed as a valuable tool for virus quantification, it requires highly experience operators, and very expensive equipment and reagents to obtain reliable data. Therefore, to evaluate other alternatives, an easy to use approach based on the “Lab on a Chip” technology – (microfluidic glass chips) was designed and evaluated for viral quantification. The optimization of the procedure described in chapter 4 has demonstrated microflow cytometry (µFCM) to be an affordable and reliable alternative to traditional qFC when simple analysis of virus infected cells is required. The designed procedure provided a repeatable and reproducible viral titration in a minimum incubation time of 16h, with a dynamic range of 5 logs, and a minimum detectable titer of 104 TCID50/ml. It reached an improved limit of 102 TCID50/ml when the incubation time was increased to 24h. In addition, with this method, 6 samples can be analyzed within the same glass chip, which reduces time and costs in reagents and materials. In the study performed for chapter 4, we have observed that, as for qFC, µFCM is highly influenced by several parameters, which must be optimized to standardize the procedure for each virus-cell-sera set. In our case, the first parameter which we realized that influenced the efficiency of the procedure was the virus-cell incubation time, as already indicated above. Moreover, the high specificity of the method, which relies on the affinity of the monoclonal antibodies for an specific epitope of the viral protein, makes the initial optimization of the test conditions critical. It is important to highlight that despite the high specificity of the mAb (against VP2 epitopes) employed for both FACS and µFCM, it was possible to detect different types of IPNV. Diego Vázquez Rodríguez 123 Table 1.- Summary of parameters and characteristics of the 3 techniques developed Technique LOD (Inf/ml) DR Reliability of titration Time Operator Experience qPCR 31 TCID50 50 pfu 60 RNA copies 2-9 lg TCID50 q 1.5-6.5 lg TCID50 l 102.5-1010 copies Underestimation ½ day Medium qFC 10 TCID50 26 pfu 1-6 lg TCID50 1.4-6.4 pfu 2nd-degree polynomial relationship 24h High µFCM 200 TCID50 501 pfu 2-7 lg TCID50 2.7-7.7 lg pfu Overestimation under 105 TCID50 16h for >104 TCID50 24h for >102 TCID50 Medium LOD, limit of detection; DR, dynamic range; R&R, repeatability and reproducibility; Replic, the virus is detected associated to replication in cell culture; Stand., the technique has been standardized; q , 8 logs if a second-degree polynomial regression is applied; l , 5 logs if a lineal regression is applied Which of the procedures developed would be advisable for diagnosis and quantification? Following, we will compare the validated parameters and the characteristics of the three procedures and technologies, their advantages and disadvantages (Table 1). Regarding the detection capacity in terms of limit of detection (LOD), the best method was the qFC, which was able to detect as little as 10 TCID50/ml (or 26 pfu/ml) of virus. This value is 1 log lower than the data reported for other viruses like measles (Grigorov et al., 2011) or varicella (Gates et al., 2009). Among the three technologies, the worst sensitivity was exhibited by µFCM, with a LOD=2×102 TCID50/ml (50 pfu/ml). The LOD obtained with qPCR (around 30 TCID50/ml or 50pfu/ml) revealed a sensitivity close to the qFC; however, we must say that this value was obtained with just one replica, and the LOD data with 3 replicas (480 pfu/ml) was quite similar to that provided by µFCM. The dynamic range (DR) for quantification in terms of TCID50 or pfu was the same for the 3 techniques: 6 log, an optimum data, as reported in previous guidelines (Bustin et al., 2009). However, in the case of qPCR, the use of in vitro transcribed RNA (ivRNA) provided a 9 logs DR; also with this technology, the DR reached 9 logs of TCID50 when a second-degree regression was applied. A perfect equivalence between traditional titration and quantification by any of the three procedures was not observed. For instance, with µFCM an overestimation (from 1.5 to 3 logs) was observed at the lowest titers (from 102 to 105), and almost no differences at the highest ones. To this regard, It has been Chapter 6 Final discussion and conclusions 124 reported that the concentration values obtained by plaque assay or any other infectivity method are lower than methods based in nucleic acid or protein (Heider and Metzner, 2014). However, in the case of qPCR, the use of ivRNA as standard implied an underestimation of the real titer in the whole DR, from 1.5 log of difference at the lowest titers to 0.5 at the highest, what, as discussed in Chapter 2, could be due to the degeneration of several bases in the sequence of the primers. This effect has also been observed in IPNV by Jorquera et al., (2016), although they also stated that degenerated primers is the best solution to compensate polymorphic sites and overcome the high mutation rate of these viruses. Only with qFC a clear relationship between titration and protein quantification was observed, but just using a second-degree polynomial regression. Using these parameters as criteria and considering that the 3 methods showed high repeatability and reproducibility, the extremely high sensitivity of the qFC, and the high sensitivity and wide dynamic range of the qPCR, makes them the best candidates to be used for viral quantification. However, other criteria must be considered, for instance, the requirements of level operator’s experience is an important aspect to ensure the reliability of the results. To this regard, the qFC technology requires a highly qualified technician to operate the equipment and provide raw data for analysis; even, the analysis of the raw data must also be performed with a dedicated software, which requires previous training and experience. In terms of simplicity, the µFCM has been found to be suitable for operators with low experience (Chapter 4) because the equipment and method designed are, once standardized, of low complexity for preparation and performance. In addition, in spite of the fact that highly trained operators obtained better results, the µFCM have shown to be robust when performed by unexperienced technicians, as observed from the assessment of the reproducibility of the method, with coefficients of variation (CV) lower than 10%. Regarding the qPCR, the standardization of the procedure itself is complex, as it is for qFC and µFCM but, once standardized, it is expected to be reproducible between different laboratories and technicians of different levels of experience (Dopazo and Bandín, 2011). There are two additional parameters that must also be considered: time and viral activity. Taking the second one under consideration, qPCR should not be taken into account because only qFC and µFCM rely on the infection of cell monolayers by viruses. However, considering the first criteria –time–, qPCR exceeds the other two techniques in speed to perform detection, identification and quantification. 131 RESUMEN CAPÍTULO 1: Introducción El desarrollo mundial de la acuicultura en los últimos años es incuestionable. En 2016, la producción mundial de acuicultura alcanzó 80 millones de toneladas, con un valor de primera venta estimado de US $ 232 mil millones, que consiste en 54,1 millones de toneladas de peces (US $ 138,5 mil millones), 16.1 millones de toneladas de moluscos (US $ 29,2 mil millones) , 7,9 millones de toneladas de crustáceos (US $ 57,1 mil millones) y 9385000 toneladas de otros animales acuáticos (US $ 6,8 mil millones) (FAO, 2018). Esta situación ha sido promovida en gran parte, por la intensificación de los procesos de cultivo. Sin embargo, la producción intensiva de peces y mariscos está amenazada por brotes epidémicos que afectan no solo a las poblaciones "domésticas" sino también a las poblaciones silvestres (Tompkins et al., 2015). Entre las diferentes patologías que afectan a la acuicultura de peces, las enfermedades virales tienen uno de los mayores impactos económicos debido a su virulencia, rápida dispersión y ausencia de tratamiento y vacunas efectivas, lo que dificulta su erradicación completa. Por lo tanto, la investigación se centra no sólo en el desarrollo de protocolos profilácticos y el diseño de nuevas y más eficientes vacunas, sino también en la mejora de los procedimientos de diagnóstico para facilitar el control de los brotes. Además, se está aplicando un esfuerzo cada vez mayor en las inspecciones del estado de salud de poblaciones de peces cultivados y silvestres, lo que ha llevado al descubrimiento de virus de peces que la ciencia desconocía hasta el momento; siendo alguno de ellos endémicos entre las poblaciones nativas y propagándose de manera oportunista para infectar peces en instalaciones de acuicultura (Walker y Winton, 2010). Además, esa vigilancia, también ha proporcionado información importante sobre la distribución y la virulencia de otros virus conocidos previamente. CAPÍTULO 2: Cuantificación viral: Una revisión general En la mayoría de los estudios de virología, uno de los principales datos a conocer es la concentración de partículas totales o infecciosas en una muestra. Por lo tanto, la cuantificación del virus es crucial para conocer entre otras cosas, el ciclo de replicación de un virus, para estudiar el nivel de virulencia de nuevos aislados, para evaluar la actividad antiviral de los agentes quimioterapéuticos, para monitorizar la etapa y la eficiencia de una purificación de virus en procesos industriales o simplemente para evaluar la virulencia de un determinado agente viral (Hierholzer y Killington, 1996). En cualquier experimento que involucre la infección de células con virus, la multiplicidad de la infección (MOI por sus siglas en Inglés, que es el número de partículas virales por célula) es el factor más crítico, ya que las MOI irreproducibles o imprecisas, causadas por una estimación Resumen 132 inexacta del título viral del inóculo, tienen un profundo impacto en el rendimiento y la consistencia del lote o del ensayo (Roldão et al., 2009). Por esta razón, es muy importante contar con métodos cuantitativos precisos. La utilidad clínica de la cuantificación viral ha sido profundamente revisada en medicina humana. Sin embargo, en el campo veterinario, y más concretamente en la virología de peces, la mayoría de las técnicas y metodologías se han adaptado de anteriores avances en virología humana. A pesar de su relevancia, solo un par de revisiones se han publicado en los últimos años (Heider y Metzner, 2014; Pankaj, 2013). En esta línea, y siguiendo la clasificación realizada por Heider y Metzner, los métodos de cuantificación de virus pueden clasificarse en cuatro categorías diferentes dependiendo de en qué se basen: i) en los niveles de infectividad, ii) en la detección de proteínas virales, iii) en la detección de ácido nucleico viral, y iv) en la enumeración de partículas virales. En este capítulo se han revisado en detalle las siguientes técnicas de cuantificación basándonos en la clasificación descrita anteriormente: • Infectividad: Ensayos quantales y cuantitativos. • Detección de Proteínas Virales: Ensayo de Foci Fluorescentes, ELISA, Ensayo de inmunodifusion Radial Simple (SRID), Cromatografía liquida de alta precisión (HPLC), Ensayos de Hemaglutinación, Citometría de Flujo. • Detección de ácido nucleico viral: PCR en tiempo real PCR digital • Enumeración de partículas virales: Microscopia electrónica, Contador de Virus Para el presente estudio, centrado en el desarrollo, la optimización y la validación de los procedimientos de cuantificación viral, cualquiera de los virus que afectan actualmente a la industria de la acuicultura podría haberse elegido como modelo. ¿Por qué se eligió entre todos el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV, por sus siglas en Inglés)? La misma brecha con respecto al objetivo general de este estudio afecta a todos los virus de peces en la literatura, pero las restricciones de bioseguridad del IPNV, junto con la alta disponibilidad y diversidad de cepas, hacen de este patógeno un gran candidato para este tipo de estudios. Por lo tanto, el propósito del presente estudio fue la evaluación, diseño y validación de diferentes técnicas de cuantificación de virus, utilizando el virus de necrosis infecciosa pancreática (IPNV) como modelo general. El objetivo final del estudio fue, en una etapa posterior, la transferencia de las tecnologías desarrolladas en esta tesis a los protocolos estándar del Instituto de Acuicultura de la Universidad de Santiago de Compostela. Diego Vázquez Rodríguez 133 CAPÍTULO 3: Diseño y validación de un procedimiento RT- qPCR para el diagnóstico y cuantificación de la mayoría de los tipos de virus pancreáticos infecciosos utilizando un solo par de cebadores degenerados Es incuestionable que una de las mayores revoluciones de la biología molecular en el siglo pasado fue la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y posteriormente se impulsó con la posibilidad de seguir la evolución de la amplificación en tiempo real, PCR en tiempo real o qPCR (por sus siglas en Inglés); y su capacidad para producir verdaderos datos cuantitativos (Higuchi et al., 1992, 1993; Wittwer et al., 1997). Aunque la mayoría de los protocolos de diagnóstico de PCR publicados inicialmente son cualitativos, en la actualidad, la tecnología de la PCR en tiempo real, basada en la detección y cuantificación de un amplicón o sonda fluorescente (Bustin, 2000), está reemplazando progresivamente al uso de la PCR tradicional. La literatura sobre este tema es muy abundante y se ha revisado en profundidad en anteriores publicaciones (Bustin et al., 2009; Hoffmann et al., 2009; Kubista et al., 2006; Mackay et al., 2002). El desarrollo de la PCR en tiempo real ha llevado la verdadera cuantificación de los ácidos nucleicos virales a los laboratorios de diagnóstico (Mackay et al., 2002). La cuantificación de la concentración de una muestra (ARN o ADN) se puede realizar siguiendo dos estrategias: qPCR absoluta o relativa. La cuantificación absoluta relaciona la señal de PCR con los números de copia de entrada utilizando una curva de calibración, mientras que la cuantificación relativa se basa en los niveles de expresión de un gen objetivo frente a un gen de referencia o control (Pfaffl, 2004). En general, la cuantificación relativa proporciona información suficiente y es más fácil de desarrollar. Sin embargo, cuando se realiza el seguimiento del progreso de una infección, la cuantificación absoluta es útil para expresar los resultados en unidades, que son comunes tanto para los científicos como para los clínicos en diferentes plataformas. La cuantificación absoluta también puede ser necesaria cuando faltan muestras con una etapa conocida de la infección para demostrar cambios en los niveles de virus, cuando no hay disponibles reactivos de referencia estandarizados adecuadamente, o cuando se usa la carga viral para diferenciar la infección activa frente a la persistente ( Mackay et al., 2002). Se han publicado muchos protocolos de qPCR en tiempo real para la detección de enfermedades microbianas, y se dispone de kits comerciales para varios virus humanos clínicamente importantes (Ratcliff et al., 2007). En diagnósticos veterinarios, y más específicamente en virología de peces, esta técnica se ha implementado con éxito para detectar y cuantificar varios patógenos virales, incluyendo (en sus siglas en Inglés): VHSV (Garver et al., 2011; Jonstrup et al., 2013), IHNV (Overturf et al., 2001; Purcell et al., 2013), ISAV (Snow et al., 2006; Workenhe et al., 2008), o IPNV (Bowers et al., 2008; Calleja et al., 2012). Sin embargo, todavía faltan estándares validados Resumen 134 adecuadamente para ser implementados en la cuantificación de virus de peces. Los kits comerciales generalmente se validan utilizando una gran cohorte de muestras clínicas. El desarrollo de ensayos internos se puede lograr si se implementa un procedimiento de validación estructurado apropiadamente (Ratcliff et al., 2007). Hoy en día, la PCR cuantitativa está reemplazando a otros métodos tradicionales porque proporciona información adicional sobre la carga viral, lo cual es importante para tener una mejor comprensión del nivel de replicación del virus y de la etapa de la infección y su nivel de riesgo. El principal problema radica en la gran diversidad del virus de necrosis pancreática infecciosa, que puede comprometer la fiabilidad del diagnóstico. Como parte de esta tesis doctoral, hemos diseñado un procedimiento RT-qPCR para el diagnóstico y la cuantificación de IPNV basado en un único par de cebadores dirigidos al segmento B del genoma del virus. El procedimiento ha sido validado, in vitro e in vivo, probando dos tipos diferentes de estándares frente a siete genotipos de referencia y 23 aislados de campo de diferentes genotipos. El protocolo presentado en el Capítulo 3 es apropiado para la detección de cualquier genotipo del virus IPNV, con un límite de detección de 31 TCID50/mL, 50 pfu/mL o 66 copias de RNA/mL, según el estándar con que se realice la cuantificación. Todas las curvas estándar mostraron una alta fiabilidad (R2> 0,95). Los resultados presentados en el capítulo 3 respaldan la alta fiabilidad de este nuevo protocolo para el diagnóstico y cuantificación de IPNV. CAPÍTULO 4: Citometría de flujo cuantitativa para medir la producción viral utilizando el virus de la necrosis pancreática infecciosa como modelo: un estudio preliminar. Los procedimientos clásicos para la cuantificación de virus, basados en la medición de la infectividad descritos en detalle en el Capítulo 1 de esta tesis (ensayo infectividad y cuantificación de placas), requieren que en el cultivo de células susceptibles se desarrolle un efecto citopático visible (CPE , en sus síglas en Inglés). Como consecuencia, esos procedimientos requieren entre 3 y 12 días, dependiendo del virus que se esté analizando y del nivel requerido de evaluación del CPE; Por lo tanto, se considera que, hasta obtener un resultado final mediante ambos tipos de cuantificación, es necesario invertir mucho tiempo. Además, algunas células no producen CPE visible, y algunas no admiten la formación de placa. Por ejemplo, algunos aislamientos clínicos de ciertos virus como la fiebre amarilla pueden ser más difíciles de cuantificar porque no provocan la formación de placa o no inducen un CPE medible. Se han observado problemas similares con otros flavivirus como el virus del dengue, ya que los aislamientos clínicos a menudo no inducen efecto citopático, ni forman placas (Hammarlund et al., 2012, Li et al., 2011). Para superar estas limitaciones, se han desarrollado algunas alternativas a los métodos tradicionales. Diego Vázquez Rodríguez 135 Algunas de las estrategias se basan en la evaluación de la producción viral mediante la detección relativa y la cuantificación de antígenos o proteínas virales específicas. Este valor podría correlacionarse con la carga viral, sin embargo, no proporciona la concentración actual de partículas virales infecciosas, ya que la presencia de algunos antígenos libres o proteínas disociadas podría afectar la medición. La citometría de flujo (FCM) se basa en la medición de las características físicas y / o químicas de las células mientras pasan a través de un aparato de medición en una sola fila en una corriente de fluido (Shapiro, 2003). Mcsharry revisó a fondo los usos de la citometría de flujo en virología en 1994 y 2000. La cuantificación del virus mediante citometría de flujo ha evolucionado enormemente debido a las mejoras en la tecnología. Los protocolos de cuantificación viral usando citometría de flujo publicados en los últimos años, pueden clasificarse en dos grupos principalmente: por un lado, la cuantificación directa de virus en solución usando tinciones fluorescentes y, por otro, las estrategias basadas en la detección y cuantificación de antígenos o proteínas virales en células o tejidos, utilizando técnicas de inmunofluorescencia. La estrategia descrita en el Capítulo 4 se conoce como citometría de flujo cuantitativo (qFCM en sus siglas en inglés). Se ha reconocido que la intensidad de la señal fluorescente es proporcional a la cantidad de anticuerpo unido por célula y, por lo tanto, está relacionada con la cantidad de antígeno expresados. Esta relación hace que la citometría de flujo, al menos teóricamente, sea capaz de cuantificar la expresión del antígeno en términos de moléculas por célula (Maher y Fletcher, 2005). Liu y colaboradores en 1997 demostraron la utilidad del análisis mediante citometría de flujo cuantitativa de CD38 como marcador pronóstico en la infección por VIH. Aunque se han desarrollado muchos métodos para estandarizar las mediciones de QFCM, los más fáciles son aquellos que utilizan estándares basados en microesferas fluorescentes (Maher y Fletcher, 2005). El uso del estándar de fluorescencia proporciona la clave para convertir unidades de intensidad relativa arbitrarias en unidades de fluorescencia cuantitativas estándar, informando moléculas cuantitativas de equivalencias de fluorocromo soluble (MESF, por sus siglas en Inglés) e incluso números de anticuerpos unidos a la célula (capacidad de unión del anticuerpo; ABC) (Schwartz et al. al., 1998). Como ejemplo, la detección cuantitativa de la infección por el virus de la influenza equina en las partículas calibradas de células MDCK mediante la transformación de intensidades de fluorescencia arbitrarias en las unidades estandarizadas MESF, permite comparaciones de las intensidades de señal no solo dentro de las muestras teñidas en un grupo sino también dentro de diferentes grupos de tinción. Hemos diseñado un estudio preliminar para evaluar la fiabilidad de qFCM para estudiar la replicación viral, utilizando IPNV como modelo. Además, hemos adaptado la metodología FACS descrita por Hrvatin y colaboradores en Resumen 136 2014 para la cuantificación de la replicación viral en las células clasificadas positivas. En el capítulo 4 antes de evaluar el uso de qFCM para la cuantificación de componentes virales, primero realizamos unas pruebas preliminares del protocolo para garantizar su fiabilidad y rendimiento para discriminar entre las concentraciones virales, y hemos confirmado la correlación entre las dosis virales (MOI) y fluorescencia (MFI), y entre estos y el número de copias de ARN en las células positivas. Para ello hemos usado microesferas con una emisión de fluorescencia conocida (que se usan como referencia para transformar las unidades de fluorescencia arbitrarias en MESF), y se demostró que son fiables basándonos en los valores de CV por debajo del 10%, en todos los casos, y en los valores de correlación significativos (R2> 0,99). El método fue probado en el capítulo 4 para estudiar la replicación viral. Para este propósito, se estudió la cinética de expresión de la proteína VP2 durante las primeras 24 h de la infección por IPNV analizando MFI a partir de eventos detectados FITC +. Para estudiar la producción de ARN viral, se aplicó el método MARIS descrito por Hrvatin et al. (2014) Los resultados revelaron evidencia de la internalización de las partículas de IPNV, ya que las células analizadas justo después de la adsorción mostraron un aumento de fluorescencia con respecto a las células infectadas simuladas. Luego, se observó un pico importante de producción de VP2 a las 12 h post infección (p.i). Curiosamente, este pico en la producción de VP2 coincide claramente con el de la producción de ARN, y debemos destacar que los cebadores de PCR fueron diseñados para la secuencia de VP2. Espinoza y colaboradores publicaron previamente resultados similares usando microscopía de fluorescencia y anticuerpos monoclonales contra VP2 en el año 2000, quienes observaron una alta acumulación de grandes grupos esféricos de proteínas VP2 en una ubicación perinuclear, aparecieron señales fuertes a las 8 h p.i. Sin embargo, el resultado más importante de este ensayo fue el hecho de que hemos demostrado que los datos de qPCR se correlacionaron significativamente (R2 = 0.9514) con la producción de ARN (secuencia VP2). El protocolo descrito en el capítulo 4 ha demostrado ser repetible y reproducible a un nivel aceptable, aunque para garantizar la reproducibilidad, el uso de un estándar en cada análisis es inevitable. Respecto a su uso para la cuantificación viral, se observó una relación directa (por una regresión polinómica de segundo grado) entre los títulos víricos y las Moléculas de Fluorocromo Soluble Equivalente (MESF). Los resultados apoyan el uso de esta tecnología, no solo para cuantificación de virus, sino también para estudiar la replicación viral desde un enfoque cuantitativo. Diego Vázquez Rodríguez 137 Sin embargo, como ya se indicó previamente en este trabajo, los protocolos descritos en esta tesis se han evaluado para un conjunto específico de células y virus. Por lo tanto, el primer punto que deberíamos asumir como crucial es que, si esta metodología desea aplicase en otro ámbito, la recualificación debería extenderse a otros virus y / o líneas celulares para cubrir la mayoría de las necesidades en investigación y diagnóstico de virus. CAPÍTULO 5: Un nuevo procedimiento de cuantificación de virus basado en análisis de citometría de microflujo Otro enfoque utilizado para la cuantificación de la carga viral en una muestra dada es, mediante la tinción de inmunofluorescencia de antígenos virales o proteínas expresadas en las células infectadas, establecer una correlación entre la concentración de antígeno o proteína viral medida, y la concentración real de virus. A este respecto, se ha demostrado una alta correlación entre el porcentaje de células infectadas y la carga viral de una muestra (Drayman et al., 2010; Grigorov et al., 2011; Lonsdale et al., 2003). Normalmente, las titulaciones se realizan sobre células de cultivo infectadas con una muestra viral diluida en serie. Luego, las células infectadas se incuban con anticuerpos policlonales o monoclonales contra algún antígeno viral, expresado extra o intracelularmente. Estos anticuerpos pueden marcarse con algún colorante fluorescente o pueden detectarse indirectamente por un anticuerpo secundario marcado fluorescente (McSharry, 2000). Finalmente, los títulos obtenidos se expresan generalmente como unidades infecciosas fluorescentes por mL de solución, unidades infecciosas / mL o células infectadas / mL. Los detalles matemáticos de los diferentes ensayos publicados hasta la fecha están fuera del alcance de esta revisión, pero en general: el título se calcula mediante la fórmula T = [% de células positivas] x [número de células infectadas] / [volumen de infección] muestra de virus]. La reproducibilidad del método, determinada a partir del CV (como porcentaje), se ha demostrado entre el 7% y el 31% (Hammarlund et al., 2012; Roldão et al., 2009). El ensayo FCM solo se puede utilizar con muestras con un título superior a 1x104 unidades infecciosas / ml (Grigorov et al., 2011; Lambeth et al., 2005) o 5x103 pfu / mL (Gates et al., 2009). Esta es una limitación del ensayo FCM en comparación con el ensayo de placa, que es más sensible (Lambeth et al., 2005). Aunque debido a la rapidez de análisis y fiabilidad, la titulación por citometría de flujo se puede convertir en una alternativa rápida y eficiente a los ensayos de infectividad como el análisis de placa o TCID50, el coste del equipo y los reactivos, sumado a la necesidad de personal altamente capacitado, dificultan la generalización de esta tecnología. Recientemente, los dispositivos integrados “Lab-on-a-chip” han llevado a cabo la miniaturización de este equipo, convirtiendo la citometría de flujo en una alternativa asequible y fácil de usar, en comparación Resumen 138 a los citómetros tradicionales. En el presente estudio, hemos diseñado un procedimiento de citometría de microflujo (µFC) para la cuantificación de virus, utilizando el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) como modelo. La optimización de las condiciones y la validación del método se informan en detalle en el Capítulo 5 de esta tesis. La fiabilidad del protocolo descrito en el capítulo 5 ha quedado demostrada por la alta repetibilidad y reproducibilidad, ya que los valores de coeficiente de variación observados siempre fueron inferiores al 10%. De hecho, aunque los resultados obtenidos por el operador más experimentado parecen proporcionar la mayor repetibilidad y reproducibilidad, los obtenidos por técnicos con poca experiencia fueron lo suficiente precisos como para ser considerados fiables. Además, la frecuencia de los falsos positivos (es decir, la sobreestimación del título viral debido a la detección de virus no infeccioso) se ha descartado claramente porque la muestra viral inactivada se cuantificó con títulos y porcentajes extremadamente bajos de células infectadas, como se esperaba. Finalmente, el procedimiento se evaluó con varias muestras de diferentes tipos y títulos de IPNV, y los resultados demostraron que los valores proporcionados por el procedimiento µFC están altamente correlacionados con los de los ensayos tradicionales de dilución y placa. CAPÍTULO 6: Discusión Final y Conclusiones Debido a la aplicabilidad y la fiabilidad de los métodos presentados en líneas anteriores, estudios de validación adicionales podrían derivarse de esta tesis. Se recomienda evaluar la robustez de los protocolos en un ensayo de colaboración con otros laboratorios y proporcionará información valiosa sobre el rendimiento de los métodos relacionados con la detección y cuantificación de otros virus. Además, sería valioso incluir un análisis y evaluaciones comparativas con el número de partículas obtenidas para un título definido. Como se indicó anteriormente (Heider y Metzner, 2014; Roldão et al., 2009), no es posible definir una técnica única para la cuantificación de la carga de virus que se adapte a todos los virus y que se espere obtener la misma eficiencia y precisión en todos de ellos. Por lo tanto, un enfoque general para la cuantificación de la carga de virus no es factible y se recomienda seguir un solo método, completar una validación cuidadosa de las condiciones para cada caso particular y evaluar los resultados frente a un panel de estándares calificado. Las conclusiones de esta tesis son las siguientes: 1- La importancia y singularidad del protocolo de RT-qPCR propuesto en este estudio para IPNV radica en que, por primera vez, se ha demostrado que un método basado en un solo par de cebadores es fiable no solo para el diagnóstico Diego Vázquez Rodríguez 139 de la mayoría de los genotipos de IPNV, sino también para la cuantificación simultánea de la carga viral, tanto ex vivo como in vivo. Este protocolo puede ayudar a simplificar y reducir drásticamente el costo, manteniendo la fiabilidad, de los programas de vigilancia y monitorización, y de cualquier estudio que requiera diagnóstico y cuantificación de virus de tipo IPNV sin la necesidad de un conocimiento previo del tipo esperado de IPNV presente en la población. 2- Los resultados del presente estudio respaldan el uso de la citometría de flujo en combinación con la tecnología qPCR, no solo para la cuantificación de la tasa óptima de infectividad del virus, sino también para estudiar la replicación viral desde un enfoque cuantitativo 3- Nuestros resultados respaldan firmemente la propuesta del método de microcitometría de flujo (µFC), como una alternativa fiable a los métodos tradicionales de titulación viral porque, incluso cuando se usan tiempos de incubación de 24 h, la reducción del tiempo necesario para cuantificar la concentración viral de una muestra es incuestionable. 4- Con respecto a la aplicabilidad de las metodologías, i) µFCM debería usarse para la titulación viral cuando la cuantificación rápida del virus activo es un requisito inevitable; ii) qPCR debería aplicarse para la cuantificación viral cuando se necesita el conocimiento del virus total pero el virus activo no es crucial; también es importante cuando se necesita alta sensibilidad (porque se esperan bajas cargas virales) y velocidad; iii) qFC y qPCR, combinados, se aconsejan en estudios de replicación viral, ya que ambos proporcionan datos complementarios (síntesis de proteínas y ARN) para comprender todo el ciclo viral.