Uso de Nanopartículas Magnéticas y Biología Molecular para la Mejora del Diagnóstico Microbiológico

TESIS DOCTORAL USO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS Y BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA MEJORA DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO José Javier Rodríguez Calviño Departamento de Microbiología y Parasitología SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 TESIS DOCTORAL USO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS Y BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA MEJORA DEL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Fdo.: JOSÉ JAVIER RODRÍGUEZ CALVIÑO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2015 BENITO JOSÉ REGUEIRO GARCÍA, CATEDRÁTICO DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA CERTIFICA: Que la presente Tesis titulada: “Uso de Nanopartículas Magnéticas y Biología Molecular para la Mejora del Diagnóstico Microbiológico” ha sido realizada, bajo mi dirección, por D. José Javier Rodríguez Calviño en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela y, estimado que se encuentra finalizada, solicita sea admitida a trámite para su lectura y defensa pública. Santiago de Compostela, 2015 Fdo.: Prof. Dr. Benito José Regueiro García Este trabajo fue financiado en parte por el Ministerio de Ciencia e Innovación mediante una beca FPI (BES-2009-018631) asociada al proyecto MAT2008-06503, y por el Fondo de Investigaciones Sanitarias mediante el proyecto PI14/00620. AGRADECIMIENTOS Al Dr. Benito Regueiro Garcia por darme la oportunidad de realizar este trabajo y por guiarme y ayudarme durante su realización. Al Dr. Antonio Aguilera Guirao por ayudarme en mis primeros pasos dentro de un laboratorio. Al Dr. Eduardo Varela Ledo por habernos enseñado y aportado tanto a todos. A todos los compañeros del Hospital de Conxo, Ramonita, Elvira, Pilar, Cruz, Lorena, por apoyarme y animarme siempre. A todos los residentes con los que coincidí en su paso por el Servicio de Microbiología, Ángeles, Patricia, Sandra, Carlos, Luz, Lucía, Gema, Miguel, Dani, Paloma, Gilberto, Javi, Isidro, Xana, Jose, Rocío, Tamara y Aldara, por apoyarme, animarme y todos los buenos ratos que pasamos juntos. A mis compañeros Pablo, Olaia y Carmen, por las horas de trabajo conjunto aprendiendo unos de otros. A todos los técnicos y facultativos del Servicio de Microbiología, Marisa, Fernanda, Manoli, Mercedes, Mª Teresa, Carlos, Pepe, Mónica, Luz, Lupe, Tiago, Maica, Teresa, por haberme animado y apoyado todos estos años. A mis amigos de la facultad, Javier, Antonio, Gonzalo, Bruno, Raquel, Raquelita, Marian, Raul, por todas las horas juntos que nos llevaron a donde estamos hoy. A mis amigos, Alberto, Tania, Silvia, Javier, Luis, Marta, Luis Q, Martín, Javier E, por tanos años de risas y apoyo que siempre llevaré conmigo. A mis padres, Manuel y Alicia, por cuidarme y apoyarme, y porque sin ellos nada de esto habría sido posible. A mis hermanos, Lolo y Tere, por estar siempre ahí, y a mi cuñado Jesús. A Tania y a Sara, que aún siendo las últimas en llegar a mi vida, me ayudaron más de lo que imaginan en los últimos pasos de este trabajo. Muchas gracias a todos por estar a mi lado, por apoyarme, por cuidarme, por animarme, y por todas las cosas importantes que aprendí con vosotros y que no podría encontrar en ningún libro. 1.6.1 Viabilidad: relevancia clínica ..................................................................... 40 1.6.2 Colorantes vitales: Monoazida de Etidio (EMA) y Monoazida de Propidio (PMA) 42 1.6.3 PCR de viabilidad (v-PCR) ........................................................................ 44 2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 51 3. MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................... 57 3.1 Nanopartículas y extracción de ácidos nucleicos (adsorción inespecífica) ....... 59 3.1.1 Valoración inicial del rendimiento con el sistema comercial HAMILTON kPCR (SIEMENS) .................................................................................................... 59 3.1.2 Nanopartículas para la mejora en la extracción de ácidos nucleicos .......... 59 3.1.3 Medios de cultivo para el crecimiento de bacterias transformadas ............ 62 3.1.4 Enzimas de restricción ................................................................................ 63 3.1.5 Obtención de poblaciones estándar de ácidos nucleicos ............................ 63 3.1.6 Medida de las concentraciones de ADN para calcular el rendimiento de las extracciones .............................................................................................................. 65 3.1.7 Ensayos de extracción de ácidos nucleicos usando nuevas nanopartículas 66 3.2 Diagnóstico microbiológico del Sthaphylococcus aureus resistente a meticilina 66 3.2.1 Sistema Microscan Walkaway® Plus (Siemens)........................................ 68 3.2.2 Difusión con disco de cefoxitina ................................................................ 68 3.2.3 BDMax™ MRSA Assay (Becton Dickinson) ............................................ 69 3.2.4 LightCycler® MRSA Advanced Test (Roche) ........................................... 69 3.2.5 Sistema Vitek®2 (bioMérieux) .................................................................. 69 3.2.6 Prueba de la coagulasa ................................................................................ 69 3.2.7 BDMax™ Staph SR (Bekton Dickinson) ................................................... 69 3.2.8 GenoType® MRSA (Hain Lifescience) ..................................................... 70 3.2.9 FluoroType® MRSA (Hain Lifescience) ................................................... 70 3.2.10 Análisis de distancias genómicas (Diversilab™ Staphylococcus kit (bioMerieux)) ............................................................................................................ 70 3.2.11 Análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI Biotyper (BRUKER)) .............................................................................................................. 71 3.2.12 Tipado en base a la región SCCmec ........................................................... 71 3.3 Detección de microorganismos mediante adsorción específica con nanopartículas ............................................................................................................... 71 3.3.1 Sistemas de detección ................................................................................. 72 3.3.2 Cepas de referencia y medios de cultivo .................................................... 72 3.3.3 Tipos de nanopartículas .............................................................................. 73 3.3.4 Pruebas de captura de microorganismos ..................................................... 73 3.4 Mejora de la detección molecular (PCR de viabilidad) ..................................... 76 3.4.1 Esquema general del protocolo de tratamiento con cisplatino en el test de viabilidad .................................................................................................................. 76 3.4.2 Cepa de referencia y preparación de la muestra ......................................... 77 3.4.3 Extracción de ácidos nucleicos y detección mediante PCR a tiempo real . 77 3.4.4 Búsqueda de sustancias ............................................................................... 78 3.4.5 Pruebas con Monoazida de Etidio (EMA) .................................................. 79 3.4.6 Prueba de control con ADN libre tratado con cisplatino ............................ 80 3.4.7 Condiciones iniciales de trabajo con cisplatino .......................................... 81 3.4.8 Pruebas de tratamiento con oxaliplatino ..................................................... 81 3.4.9 Protocolo de tratamiento con cisplatino usando centrifugación ................. 81 3.4.10 Mezcla de bacterias vías y muertas (VM) .................................................. 83 3.4.11 Protocolo de tratamiento con cisplatino en sangre usando centrifugaciones 83 3.5 Nanopartículas y viabilidad (Test de viabilidad) ............................................... 84 3.5.1 Captura de bacterias muertas ...................................................................... 84 3.5.2 Sistema automático usado en los ensayos con partículas ........................... 84 3.5.3 Protocolo viabilidad en solución con las nanopartículas de NANO MR ... 85 3.5.4 Protocolo de viabilidad en solución con las nanopartículas ApoH ............ 86 3.5.5 Protocolo de viabilidad en sangre usando nanopartículas .......................... 87 3.6 Ensayo sobre bacterias muertas por tratamiento antibiótico .............................. 88 4. RESULTADOS ........................................................................................................ 91 4.1 Nanopartículas y extracción de ácidos nucleicos (adsorción inespecífica) ....... 93 4.1.1 Valoración inicial del rendimiento con el sistema comercial HAMILTON kPCR (SIEMENS) .................................................................................................... 93 4.1.2 Valoración de nuevas nanopartículas en el sistema HAMILTON kPCR (SIEMENS) ............................................................................................................... 93 4.1.3 Comparativa con la medida de referencia en el HAMILTON kPCR ......... 95 4.1.4 Funcionalización de las partículas .............................................................. 96 4.2 Diagnóstico microbiológico del Sthaphylococcus aureus resistente a meticilina 96 4.3 Detección de microorganismos mediante adsorción específica con nanopartículas ............................................................................................................. 101 4.3.1 Pruebas de captura de microorganismos: partículas NANO MR ............. 101 4.3.2 Pruebas de Captura de microorganismos: partículas ApoH ..................... 104 4.3.3 Recuentos en placa de las soluciones de trabajo ...................................... 106 4.4 Mejora de la detección molecular (PCR de viabilidad) ................................... 107 4.4.1 Pruebas con Monoazida de Etidio (EMA) ................................................ 107 4.4.2 Prueba de control de cisplatino con ADN libre ........................................ 109 4.4.3 Condiciones iniciales de trabajo con cisplatino ........................................ 109 4.4.4 Prueba de viabilidad usando centrifugaciones .......................................... 112 4.4.5 Prueba de viabilidad en sangre usando centrifugaciones ......................... 114 4.4.6 Prueba de viabilidad con oxaliplatino ....................................................... 115 4.4.7 Pruebas con otras sustancias con efecto citostático .................................. 116 4.5 Nanopartículas y viabilidad (test de viabilidad) .............................................. 118 4.5.1 Prueba de captura de bacterias muertas usando nanopartículas ............... 118 4.5.2 Prueba de viabilidad en sangre usando nanopartículas ............................. 118 4.6 Ensayo sobre bacterias muertas por tratamiento antibiótico ............................ 121 5. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 125 5.1 Diseño de nanopartículas para la mejora de la extracción de ácidos nucleicos127 5.2 Diagnóstico microbiológico del Staphylococcus aureus resistente a meticilina 130 5.3 Uso de nanopartículas magnéticas para la captura de microorganismos y posterior detección ...................................................................................................... 132 5.4 Diseño de un protocolo de viabilidad para la detección diferencial de microorganismos vivos y muertos .............................................................................. 137 5.5 Aplicación del protocolo de viabilidad en sangre ............................................ 141 5.6 Aplicación del protocolo de viabilidad a partir de sangre con bacterias usando nanopartículas magnéticas .......................................................................................... 142 5.7 Protocolo de viabilidad sobre bacterias muertas por tratamiento antibiótico .. 143 6. CONCLUSIONES .................................................................................................. 147 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................... 153 1 1. INTRODUCCIÓN 2 3 1.1 LA NANOTECNOLOGÍA EN EL ÁMBITO CLÍNICO Desde hace tiempo, la investigación y desarrollo en el campo de los nanomateriales ha cobrado importancia, en diferentes campos de aplicación; a medida que se iban descubriendo nuevas propiedades de distintos materiales a escala nanométrica. Este campo de la nanotecnología ya es considerado por muchos como la nueva “gran revolución”, ya que este salto tecnológico, para controlar materiales a escala nanométrica, ha conducido en los últimos 10-15 años al desarrollo de sistemas nanométricos, como las nanopartículas. Además, se han encontrado aplicaciones para estas en campos que abarcan desde la electrónica y la comunicación, pasando por la óptica, química, energía y, por supuesto, la biología (1). Esto la ha hecho pasar de una especialidad propia de físicos y químicos, a una iniciativa científica y empresarial en todo el mundo (2). Cuando hablamos de nanociencia, nos estamos refiriendo al estudio de las propiedades de los objetos a un tamaño nanométrico, y al ordenamiento de todo ese conocimiento. En cambio, cuando hablamos de nanotecnología, nos estamos refiriendo a la aplicación del conocimiento ofrecido por la nanociencia para que, aplicando estas nuevas propiedades conocidas, poder obtener mejoras en productos y materiales existentes, o bien, proponer otros totalmente nuevos. Y si este estudio y aplicaciones de nuevos materiales lo enmarcamos en el campo medico, estaríamos hablando de nanomedicina (3). La nanotecnología abarca los materiales, aparatos y sistemas cuya función y estructura son relevantes a pequeñas escalas de tamaño, en el rango de 1-100 nm. En este rango de tamaños encontramos, por ejemplo, estructuras biológicas básicas como el ADN (diámetro de 2 nm) o las membranas celulares (grosor de ~10 nm). Aquí, cabe destacar la capacidad de construir naoestructuras artificiales de dimensiones comparables, como pueden ser nanoporos de ~2 nm, nanocables inorgánicos de ~10 nm o nanopartíclas esféricas de 10 a 100 nm de diámetro (4). Lo interesante de estos materiales, es que van a presentar propiedades que no aparecerían fuera de este tamaño nanométrico. Se sabe que, los electrones de la superficie de los materiales, tienen un comportamiento diferente al de los que se encuentran en su interior. Y a medida que un objeto disminuye más y más su tamaño, la proporción de átomos que conforman su superficie van aumentando. Esto, lo que hace es que vayan tomando una mayor relevancia las propiedades y comportamiento de esos átomos, respecto a los situados en el interior. Esto se manifiesta en la aparición de estas nuevas propiedades de los materiales debido a que, muchas propiedades eléctricas, magnéticas u ópticas, se van a ver modificadas a medida que varía el tamaño del objeto/ material (3). Por eso, si se es capaz de controlar el tamaño y la forma de un nanoobjeto, se van a poder controlar sus propiedades con una finalidad o intención determinada. Teniendo esto en 3 4 cuenta, se puede decir que el objetivo de la nanotecnología es controlar la forma, el tamaño y el orden interno de los nanoobjetos y las nanoestructuras, para modificar a voluntad sus propiedades, con el objetivo de crear sistemas con una funcionalidad o utilidad concreta. Las nanopartículas pueden hacerse de una amplia variedad de materiales, como metales (oro, plata), óxidos metálicos (dióxido de titanio (TiO2), dióxido de sílice (SiO2)), materiales inorgánicos (nanotubos de carbono, “quantum dots”), materiales poliméricos y lípidos (2, 5), generando así una gran variedad de nanopartículas con propiedades diversas. Esto, lo que nos proporciona, son distintas aplicaciones funcionales que permiten que se esté desarrollando una gran cantidad de tecnología, con variedad de aplicaciones en diversos campos, donde destaca su aplicación médica con fines diagnósticos y terapéuticos (2, 6). En la Tabla 1 se muestran ejemplos de los principales tipos de nanopartículas que nos podemos encontrar en base a su naturaleza. La aplicación de esta nueva tecnología en el ámbito de la asistencia sanitaria, la nanomedicina, sigue experimentando un gran desarrollo. Este le brinda un potencial prometedor para revolucionar los tratamientos médicos y las terapias, en áreas como imagen, diagnóstico rápido y regeneración tisular. Pero también ofrece muchas posibilidades en importantes líneas de investigación, como las centradas en el uso de nanopartículas para el tratamiento de enfermedades como el cáncer, HIV y diabetes, o como transportadores en la administración de fármacos (1, 2). De este modo, nos encontramos con materiales y aparatos de dimensiones nanométricas (1-100 nm) que ya están aprobados para su uso clínico, así como numerosos productos que están siendo evaluados en ensayos clínicos (7). Esta relevancia ganada por la nanotecnología en el campo médico, es debida a la capacidad de producir materiales de tamaño reducido y con efectos dirigidos de forma específica. Esto se debe a que, con tamaños que van de 100-10.000 veces más pequeños que la célula humana, y con su mayor área superficial relativa respecto a su volumen, estos materiales pueden interactuar fácilmente con biomoléculas (como enzimas y receptores), tanto en la superficie como en el interior celular (6). Sin embargo, también hay aspectos toxicológicos y cuestiones éticas que acompañan a la nanomedicina, y que podrían ensombrecer el prometedor futuro de este campo emergente y frenar su avance (1). 4 5 Tabla 1: Principales tipos de nanopartículas y sus aplicaciones. Tabla extraída de et a Llina MC et al (8). 1.1.1 Nanopartículas aplicadas al diagnóstico microbiológico En el ámbito del diagnóstico microbiológico, y más concretamente en el uso de técnicas de biología molecular, un punto de gran importancia es la obtención de ácidos nucleicos a partir de una gran diversidad de muestras clínicas. Estas pueden ser de Nanopartículas orgánicas Nanopartículas poliméricas Utilizadas en aplicaciones médicas. No obstante, presentan una biodistribución no específica y una baja capacidad de carga. Dendrímeros Macromoléculas definidas, que presentan una estructura altamente ramificada formada por un núcleo y múltiples ramas. Su estructura molecular les permite cargar diferentes agentes activos. Liposomas Nanosistemas esféricos formados por una bicapa lipídica que permiten la encapsulación de fármacos hidrofílicos e hidrofóbicos. A pesar de estar ampliamente estudiados, una de sus principales desventajas es su rápida eliminación. Micelas Agregados coloidales de moléculas amfifílicas. Las micelas están formadas por una parte interna hidrofóbica y una externa hidrofilia que permite la internalización de fármacos de carácter apolar para su vehiculización. Nanopartículas inorgánicas Nanopartículas de sílice Las nanopartículas de sílice son inertes, biodegradables y pr esentan una buena biodistribución. Son fácilmente sintetizables y se pueden obtener de distinta forma y tamaño. Nanopartículas de oro Nanopartículas metálicas que presentan unas propiedades ópt icas y electrónicas que dependen totalmente de su forma y tamaño. No presentan toxicidad intrínseca. Además son fácilmente funcionalizables mediante la formación de puentes Au-SR. Nanopartículas de óxido de hierro Nanopartículas de oxido de hierro, típicamente de magnetita (Fe3O4), biocompatibles y fácilmente biodegradables. Tienen gran potencial en biomedicina dada su capacidad intrínseca de ser monitorizadas in vivo por técnicas de resonancia magnética nuclear. Quantum dots (QD) Nanopartículas activas que se utilizan generalmente como sondas para imagen, ya que presentan elevados rendimientos cuánticos de fluorescencia, elevada fotoestabilidad y una emisión fluorescente que puede ser variable mediante el tamaño. Sin embargo, los QD no son biodeg radables ni biocompatibles con el organismo, lo que restringe bastante su uso en aplicaciones médicas. Nanotubos de carbono Monocapas de grafeno enrolladas en forma de cilindros. Presentan una elevada superficie específica que permite anclar una amplia variedad de moléculas terapéuticas. 5 12 1.1.2.3 Separación magnética (purificación por afinidad) Cuando hablamos de un elemento utilizando el término magnético, nos estamos refiriendo a que este obtiene un momento magnético cuando se sitúa bajo la influencia de un campo magnético. Lo que esto significa es que, partículas que tengan esta caracterítica, van a poder ser recuperadas de un medio si se aplica un campo magnético, como por ejemplo un imán. Se trata de un método rápido, simple y eficiente de recuperar las partículas después de la unión del ácido nucleico o tras el paso de elución. En este caso, la purificación se basa en la unión por afinidad de los ácidos nucleicos a la superficie de nanopartículas magnéticas (unión selectiva a las partículas magnéticas), normalmente recubiertas en su superficie con sílice. Mediante el uso de un imán, se pueden retener estas partículas con los ácidos nucleicos unidos durante los distintos pasos de lavado, para finalmente liberarlos en condiciones de baja salinidad y que puedan ser recuperados. Podríamos decir que se trata de una técnica en fase sólida que simplifica la purificación ya que, con un simple paso de separación magnética, se pueden remplazar los múltiples pasos de centrifugación, extracciones con solventes orgánicos y los pasos de separación de fases de los métodos convencionales. Además, ofrece la ventaja de la fácil automatización del proceso, minimizando los riesgos de contaminación y degradación habituales en los métodos manuales. 1.1.3 Nanopartículas superparamagnéticas Debido a sus fuertes propiedades magnéticas y baja toxicidad, la aplicación de las nanopartículas en biotecnología y en medicina ha ido ganando interés. Se sabe que, las partículas magnéticas por debajo de aproximadamente 30 nm, van a tener la propiedad del superparamagnetismo. En este punto, podríamos decir que estas partículas no son realmente magnéticas, si no superparamagnéticas. Lo que esto significa es que solamente van a presentar magnetismo cuando sean sometidas a un campo magnético, como el generado por un imán (21). Esta propiedad permite que las partículas puedan estar de forma dispersa en solución, sin la formación de agregados magnéticos (22-24). De este modo, se previene la formación de aglomerados y se consigue la fácil dispersión de las partículas. Por otro lado, esto nos va a permitir una respuesta muy rápida de las partículas magnéticas frente a un campo magnético, pudiendo ser adsorbidas de una suspensión en cuestión de segundos (<10 seg), y dejando un sobrenadante claro que puede ser fácilmente retirado. Un ejemplo de esta separación aplicada a la extracción y purificación de ADN se muestra en la Figura 1. Pero el uso de partículas magnéticas nos presenta más ventajas a la hora de aplicarlas en bioseparación, ya que pueden ser utilizadas con muestras de un amplio rango de volúmenes (25-29). Esto nos permite solventar ciertos problemas, como el tener muestras con un volumen limitado, o el ser capaces de concentrar los analitos presentes en baja cantidad a partir de grandes volúmenes de muestra. Al mismo tiempo, nos permite eliminar los contaminantes e inhibidores que 12 13 puedan estar presentes. Además, estos procesos basados en el magnetismo también tienen la ventaja de ser aptos para la automatización, lo que va a permitir minimizar la manipulación y el tiempo empleado en todo el proceso, proporcionándonos así una mayor reproducibilidad de los resultados y su uso análisis a gran escala. Una de las principales biomoléculas que es susceptible de ser analizada es el ADN (y ácidos nucleicos en general). Ya sea en el estudio o el diagnóstico de microorganismo, o bien en la genética, una de las principales necesidades es la obtención de los ácidos nucleicos con la mayor cantidad y la mejor calidad posible. Esto debe lograrse a partir de múltiples y complejas muestras, muchas de ellas compuestas por gran cantidad de elementos, los cuales deben ser eliminados para poder realizar los procesos posteriores. El ADN es una molécula polianiónica debido a la presencia de grupos fosfato, por lo que puede ser capturada por superficies con grupos cargados positivamente (30, 31). El uso de nuevas estrategias para la recuperación de los ácidos nucleicos surge para sustituir a los largos y complicados métodos tradicionales, basados en el uso e fenol/cloroformo, pasando al uso de técnicas basadas en al adsorción para llevar a cabo la purificación del ADN/ARN. Entre los soportes más usados para conseguir esta adsorción nos encontramos partículas basadas en sílice (32, 33), fibras de vidrio (34), soportes de intercambio iónico (35-37) y partículas magnéticas modificadas (38-41). Para realizar esta separación se necesitan materiales que tengan una elevada área superficial, ya que de este modo se consiguen partículas con una elevada capacidad de unión. Así, nos vamos a encontrar principalmente con partículas esféricas (15). Las más comunes son las partículas de magnetita /óxido de hierro (Fe3O4), pero aunque estas partículas desnudas tienen la capacidad de unirse al ADN, su área total disponible para la adsorción se va a ver reducida debido a la formación de agregados debido a las fuerzas de atracción entre las partículas (15). Por eso, la estrategia que se lleva a cabo se basa en la modificación de la superficie con polímeros de distinta naturaleza o con grupos reactivos, con el fin de minimizar las interacciones entre partículas y favorecer la unión al ADN. Por ejemplo, el cubrir estas partículas con una capa de sílice las hace biocompatibles, reduciendo su toxicidad y evitando su degradación. Además, esta cubierta va a permitir la adsorción de los ácidos nucleicos de forma directa o por el anclaje en su superficie de grupos reactivos específicos. Otras estrategias incluyen la modificación de la partícula usando distintas sustancias portadoras de grupos reactivos como pueden ser el polietilen glicol (PEG) (42), compuestos amino silano (43), alkoxisilanos (44, 45) o polietilenamina (46, 47). 13 14 Figura 1: Esquema de la extracción de ácidos nucleicos usando partículas magnéticas para su recuperación usando un imán (15). 1.1.4 Automatización de los sistemas de extracción de ácidos nucleicos Hay muchas desventajas en el uso de los métodos manuales de extracción, entre los que están la gran cantidad de trabajo manual, la necesidad de personal especialmente entrenado para realizar la extracción, rendimiento limitado, y variabilidad interpersonal en la eficacia de la extracción. En este sentido, la aparición de sistemas automáticos para la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras clínicas supone una mejora en los test moleculares, ya que van a solventar los problemas que presenta la extracción manual (9). El uso de estas plataformas automáticas de extracción supone una mejora en la capacidad de trabajo en el laboratorio, mostrando resultados al menos igual de buenos que con los métodos manuales, cuando se usan test moleculares para la detección de patógenos a partir de muestras clínicas (48-58). El uso de estas plataformas automáticas supone el cambio de los métodos tradicionales, como la extracción con fenol-cloroformo o los métodos basados en filtros de fibra de vidrio, de difícil automatización y uso con gran número de muestras, por el uso de nanopartículas magnéticas acopladas a un sistema automatizado. El uso de nanopartículas magnéticas nos permite obtener ácidos nucleicos de mayor pureza con una recuperación más constante que con el uso de filtros de fibra de vidrio, ya que el movimiento de las partículas en los reactivos de extracción de ácidos nucleicos permite una mayor eficiencia en la unión, lavados y elución. Además, no están sujetas a la posible obstrucción de los filtros, y no requieren procesos de filtración a vacío ni centrifugación, haciendo muy fácil la puesta en marcha de la automatización. Pero además de estas facilidades, el uso de las partículas magnéticas permite la recuperación de los ácidos nucleicos en un pequeño volumen de elución con una concentración relativamente alta, lo que es ideal para posteriores aplicaciones (59). La implementación de estos sistemas implica el uso de nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro con una composición superficial apropiada, de forma que puedan ser usadas en numerosas aplicaciones como mejora en el contraste de imágenes de resonancia magnética, reparación tisular, inmunoensayos, detoxificación de fluidos biológicos, hipertermia, transporte de fármacos y separación celular (60-69). Y para que puedan ser efectivas en todas estas aplicaciones biomédicas, es necesario que estas nanopartículas tengan altos valores de magnetización, tamaño inferior a 100 nm y una estrecha distribución de tamaños. Pero también es importante la necesidad de 14 15 cubiertas de superficie especiales, que tienen que ser no tóxicas y biocompatibles, además de permitir una distribución dirigida de partículas en un área específica. De este modo, las partículas magnéticas se pueden unir a fármacos, proteínas, enzimas, anticuerpos o nucleótidos, y pueden ser dirigidas a un órgano, tejido o un tumor usando un campo magnético externo (70). O también pueden ser recuperadas de un medio complejo unidas a una biomolécula de interés, como por ejemplo los ácidos nucleicos. Para ello es crucial la estabilización de las partículas de óxido de hierro, pudiendo así obtener ferrofluidos coloidales magnéticos que sean estables frente la agregación, tanto en medios biológicos como bajo la acción de un campo magnético. El poder usar estas partículas para la separación magnética de ácidos nucleicos presenta múltiples ventajas en comparación con el uso de otras técnicas (15): 1. Los ácidos nucleicos pueden ser aislados directamente a partir de la muestra directa sin procesar como pueden ser sangre, tejidos, medios de cultivo, agua, etc. 2. Las partículas son usadas en procesos en bloque, donde no hay grandes restricciones respecto a los volúmenes de muestra. 3. Las partículas magnéticas pueden ser retiradas de un modo relativamente fácil y selectivo, incluso a partir de suspensiones viscosas. 4. La eficiencia de la separación magnética esta especialmente adaptada para la extracción a gran escala. 5. Esta separación sirve como base para diversos procesos automáticos de bajo y elevado flujo de trabajo, lo que permite el ahorro de tiempo y dinero. 6. Se evita el riesgo de contaminación cruzada de los métodos tradicionales. 1.2 SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS El control del tamaño monodisperso es muy importante, ya que las propiedades de las nanoestructuras (nanocristales) van a depender fuertemente de la dimensión de las nanopartículas. La síntesis de nanopartículas magnéticas puede ser llevada a cabo por múltiples procesos, como se indicará a continuación. Pero la síntesis de nanopartículas superparamagnéticas es un proceso complejo debido a su naturaleza coloidal (71). Por eso hay varios retos a conseguir en esa síntesis. Por un lado, conseguir definir unas condiciones experimentales que lleven a conseguir una población monodispersa de partículas con un tamaño adecuado; y por otro lado, conseguir un proceso reproducible que pueda ser industrializado, sin la necesidad de ningún proceso complejo de purificación como pueden ser la ultracentrifugación (72), la cromatografía de exclusión por tamaños (73) o la filtración magnética (67). 15 16 1.2.1 Coprecipitación La coprecipitación química de sales de hierro es la técnica más comúnmente utilizada para la síntesis de nanopartículas de magnetita (74-78). Los óxidos de hierro, tanto Fe3O4 como γFe2O3, normalmente son preparados por el envejecimiento de una mezcla estequiométrica de sales ferrosas y férricas en medio acuoso. La completa precipitación de Fe3O4 sucede a un pH entre 8 y 14, con una relación 2:1 (Fe3+/ Fe2+), y en un ambiente de no oxidación por oxígeno (79). Esta reacción de formación de magnetita se muestra en la Fórmula 1. Fórmula 1: Reacción de formación de magnetita por precipitación de sales de hierro (71). Pero la magnetita Fe3O4 no es muy estable y es sensible a la oxidación, transformándose en maghemita (γFe2O3) en presencia de oxígeno. Aunque también están implicadas en esta transformación varias transferencias de electrones o iones dependiendo del pH de la suspensión. Esta transformación está representada en la Fórmula 2. Fórmula 2: Reacción de formación de maghemita por oxidación de la magnetita (71). La principal ventaja que tiene el método de la coprecipitación es que permite la síntesis de gran cantidad de nanopartículas. Pero la contrapartida es que el control de la distribución de tamaño de partículas es limitado, ya que los únicos factores que controlan el crecimiento de los cristales son factores cinéticos. La coprecipitación implica dos pasos (80-84). Por un lado, se lleva a cabo una pequeña explosión de nucleación cuando las concentraciones de las especies alcanzan una supersaturación crítica. Y es entonces cuando se da un crecimiento lento de los núcleos por difusión de los solutos a la superficie del cristal. Para que se produzcan nanopartículas de óxido de hierro monodispersas, estas dos fases deben estar perfectamente separadas (85). Para ello, el control del tamaño de partículas monodispersas se debe llevar a cabo, normalmente, durante la etapa más temprana de la nucleación. Esto es así porque el número final de partículas viene determinado por el final de la nucleación, y no va a cambiar durante la fase de crecimiento. Además, una gran variedad de factores se pueden ajustar en la síntesis de nanopartículas de óxido de hierro para controlar el tamaño, características magnéticas o propiedades de superficie (86-89).El tamaño y la forma de las nanopartículas puede ser controlado con cierto éxito ajustando el pH, la fuerza iónica, la temperatura, la naturaleza de las sales (percloratos, sulfatos, nitraos) o la relación de concentración Fe2/ Fe3. Fe2+ + 2Fe3+ + 8OH- → Fe3O4 + 4H20 Fe3O4+ 2H+ → γFe3O3 + Fe2+ + H20 16 17 1.2.2 Reacciones en medios restringidos La idea de este método es el de usar nanoreactores sintéticos y biológicos para poder crear nanopartículas de óxido de hierro de tamaño bien definido. Esos medios restringidos incluyen surfactantes anfotéricos para crear estructuras micelares reversas, que formarán vesículas con nanopartículas de óxido de hierro, sirviendo así de soporte sólido para su formación (90, 91). Estas moléculas surfactantes pueden generar de forma espontánea nanogotas de diferentes tamaños, micelas (1-10 nm) o emulsiones agua-aceite (10-100 nm) (92). En estas nanogotas, las soluciones acuosas de sales de hierro son encapsuladas por una cubierta de surfactante, lo que las separa de la solución orgánica circundante. Lo que implica esto es que, con este sistema, se pueden imponer restricciones cinéticas y termodinámicas en el proceso de formación de las partícuas. Estos nanoreactores estabilizados por los surfactantes proporcionan un confinamiento que limita la nucleación y el crecimiento de la partícula. Por eso, la principal ventaja de este método es la variedad de nanopartículas que se pueden obtener, conseguidas variando la naturaleza y cantidad de surfactante y cosurfactante, la fase oleosa o las condiciones de reacción. 1.2.3 Reacciones hidrotermales y de alta temperatura Para la síntesis hidrotermal de nanopartículas de óxido de hierro, las reacciones se llevan a cabo en medios acuosos en reactores o autoclaves, donde la presión puede ser superior a 2000 psi y la temperatura puede estar por encima de 200 ºC. Existen dos vías para la formación de ferritas por medio de condiciones hidrotermales: hidrólisis y oxidación o neutralización de mezcla de hidróxidos metálicos (93). Se ve que, en estos procesos, el tamaño de partícula de magnetita se incrementa con tiempos prolongados de reacción, y que un mayor contenido en agua resulta en la precipitación de partículas de magnetita más grandes. En el proceso hidrotermal, el tamaño de partícula en cristalización se controla, principalmente, mediante la proporción entre los procesos de nucleación y crecimiento, ya que ambos compiten por las especies (94). La descomposición por alta temperatura se lleva a cabo a partir de precursores orgánicos de hierro (Fe(Cup)3, Fe(CO)5 ó Fe(acac)3) usando solventes orgánicos y surfactantes (95). Este método permite obtener nanopartículas con un alto nivel de monodispersión y de control de tamaño. El tamaño y la morfología de las nanopartículas pueden ser regulados mediante el control de los tiempos de reacción y la temperatura, pero también por la concentración y proporciones de los reactivos, naturaleza del solvente, precursores o fuerzas de los complejos. 17 18 1.2.4 Reacciones sol-gel Este proceso se basa en la hidroxilación y condensación de precursores moleculares en solución, originando un “sol” de partículas nanométricas. La posterior condensación y polimerización inorgánica llevan a la formación de una red tridimensional del óxido de metal denominada “gel húmedo” (96-98). Debido a que estas reacciones se realizan a temperatura ambiente, se hace necesario un tratamiento térmico final para alcanzar un estado cristalino. Los principales parámetros que influencian la cinética, las reacciones de crecimiento, la hidrólisis, las reacciones de condensación, y por tanto, la estructura y propiedades del gel, son: el solvente, la temperatura, la concentración de los precursores salinos utilizados, el pH y la agitación (99-101). La principal ventaja que ofrece este método es que se puede controlar adecuadamente tanto la estructura de las nanopartículas como sus tamaños. El procedimiento sintético puede optimizarse fácilmente mediante la incorporación de surfactantes a la fase de la disolución. De esta forma se pueden controlar las etapas de nucleación y crecimiento cristalino, además de evitar la agregación de las partículas insolubles, dando como resultado una dispersión de nanopartículas estabilizada. Sin embargo, el uso de surfactantes puede modificar la morfología y la carga superficial de dichas nanopartículas, a pesar de que la estructura cristalina no se vea afectada (102). 1.2.5 Métodos poliol Los procesos poliol (103) son una aproximación química para la síntesis de nano y micropartículas con formas bien definidas y tamaños controlados (104-106). Los solventes como los polioles (ej, polietilenglicol) actúan como solventes capaces de disolver compuestos inorgánicos, además de ofrecer un amplio rango operativo de temperatura (desde 25 ºC hasta el punto de ebullición) a la hora de preparar compuestos inorgánicos (107). Además, son muy útiles como agentes reductores, así como estabilizadores para controlar el crecimiento de las partículas y prevenir la agregación. En este método, un compuesto precursor se suspende en un líquido poliol. La suspensión es movida y calentada a una cierta temperatura, que puede alcanzar el punto de ebullición del poliol. Durante esta reacción, el metal precusor se solubiliza en el diol, forma un intermedio, y entonces es reducido para formar núcleos metálicos que resultarán en partículas metálicas. 1.2.6 Síntesis por inyección en flujo Esta técnica consiste en la mezcla continua o segmentada de reactivos bajo un régimen de flujo laminar en un reactor capilar. Algunas ventajas que presenta son su alta reproducibilidad, una gran homogeneidad de mezcla y la posibilidad de un control externo preciso del proceso (108). 18 19 1.2.7 Métodos electroquímicos La metodología consiste en la producción de iones en disolución, mediante la oxidación a corriente o potencial controlado, de una lámina del mismo metal del que se quieren generar los iones metálicos. Este método se puede considerar como un método de coprecipitación controlado, debido a que la cantidad de iones que se producen en la disolución se generan durante el tiempo de aplicación de la corriente. El producto final es obtenido por reducción de los hidróxidos formados. Con este método, se consigue un control sobre el tamaño de las partículas mediante variaciones en la densidad de corriente (109, 110). 1.2.8 Métodos aerosol/ vapor Las tecnologías en aerosol, como son la pirolisis en espray y en laser, son interesantes porque son procesos químicos continuos, lo que permite una alta tasa de producción. En la pirolisis por espray, una solución de sales férricas y un agente reductor conjuntamente en un solvente orgánico se pulveriza en una serie de reactores donde el soluto del aerosol se condensa y el solvente se evapora (111). El residuo seco resultante consiste en partículas cuyo tamaño depende del tamaño inicial de las gotas originales. La pirolisis por laser se puede usar para reducir el volumen de reacción. El láser calienta una mezcla gaseosa de precursor de hierro y una mezcla de gas, produciendo pequeñas nanopartículas de estrecho tamaño y no agregadas. 1.2.9 Sonolisis El óxido de hierro se puede preparar mediante la descomposición (por termolisis o sonolisis) de precursores organometálicos, y utilizando polímeros o agentes orgánicos de terminación para limitar el crecimiento de las nanopartículas (112-114). Las correspondientes nanopartículas se obtienen irradiando la disolución con ultrasonidos de alta intensidad, bajo una atmósfera de argón y temperatura ambiente durante al menos 3 h. La temperatura tan elevada, generada por el rápido colapso de las cavidades formadas por sonicación, permite la conversión de sales ferrosas en nanopartículas magnéticas. El control sobre el tamaño de las partículas se puede conseguir cambiando el precursor utilizado o variando la temperatura. 1.3 ESTABILIZACIÓN DE PARTÍCULAS MAGNÉTICAS La estabilización de partículas de óxido de hierro es crucial para obtener ferrofluidos magnéticos coloidales que sean estables contra la agregación, tanto en medios biológicos como bajo la actuación de un campo magnético. Además, va a impedir la aparición de cambios en su estructura original, que llevarían a la alteración de sus propiedades magnéticas, y evitando también su rápida biodegradación con la exposición a medios 19 20 biológicos. La estabilidad de una suspensión magnética coloidal viene dada como resultado del equilibrio entre fuerzas de atracción y de repulsión. En teoría, cuatro tipos de fuerzas pueden contribuir al potencial interpartícula en el sistema. Por un lado, nos encontramos con las fuerzas de van der Waals, que inducen atracciones isotrópicas fuertes de corta distancia. Aparecen también las fuerzas electroestáticas de repulsión. La descripción teórica entre estas dos fuerzas se conoce como la teoría Derjaguin- Landau- Verwey- Overbeek (DLVO) (115, 116). Cuando tratamos con suspensiones magnéticas, se añaden las fuerzas magnéticas dipolares entre dos partículas. Estas fuerzas inducen interacciones anisotrópicas que parecen ser globalmente atractivas. Y finalmente, tenemos las fuerzas estéricas de repulsión, que se deben tener en cuenta para partículas no desnudas (117). Teniendo esto en cuenta, la estabilización de partículas magnéticas se puede conseguir jugando con una o ambas fuerzas de repulsión: electroestática y estérica (118). En la Figura 2 se muestra un ejemplo gráfico de estas dos fuerzas repulsivas. Figura 2: (a) Partículas estabilizadas por la capa electroestática. (b) Partículas estabilizadas por repulsión estérica. (71). De forma habitual, las nanopartículas de óxido de hierro son cubiertas con macromoléculas como el ácido poliacrílico (PAA) (119), dextrano (120) y polietilenamina (PEI) (121), o bien con cubiertas inorgánicas como sílice (122), carbono (123) o metales preciosos (como oro o plata) (124). Así, vemos que se pueden adoptar distintas estrategias para lograr esta estabilización, basándonos en la naturaleza de las distintas sustancias que se pueden utilizar en la preparación de estas nanopartículas (125). 1.3.1 Estabilizadores monoméricos Las nanopartículas de óxido de hierro pueden ser cubiertas con distintos materiales como son la sílice (126, 127) o el oro (128, 129). El uso de estas cubiertas no solo proporcionan estabilidad a las nanopartículas en solución, sino que también ayudan a la unión de diversos ligando biológicos a la superficie de la nanopartícula. Estas nanopartículas tienen un núcleo de óxido de hierro con una cubierta metálica externa de materiales inorgánicos. 20 21 1.3.1.1 Sílice La sílice es un material que se ha usado ampliamente como cubierta de nanopartículas magnéticas (130-132). En general, una cubierta inerte de sílice en la superficie de nanopartículas magnéticas previene su agregación en medio líquido, mejora su estabilidad química y proporciona una mejor protección frente a la toxicidad (133). Esta estabilización de las partículas se lleva a cabo de dos formas (134). Por un lado, escudando la interacción del dipolo magnético con la capa de sílice. Por otra parte, las nanopartículas de sílice están cargadas negativamente. De este modo, la cubierta de sílice aumenta la repulsión de coulomb de las nanopartículas magnéticas. Hay tres métodos que se usan para generar nanoesferas magnéticas de sílice. El primero de los métodos se basa en el método de Stöber (135). Con este método, la sílice se forma in situ mediante la hidrólisis y condensación de un precursor sol-gel, como el tetraetoxiortosilicato (TEOS) (136, 137). El segundo método se basa en la deposición de sílice a partir de una solución ácida silicídica (138,139). Algunos estudios defienden que este método parece más eficiente, cubriendo una mayor proporción de la superficie de magnetita que el método TEOS (140). El tercer método es un método basado en la formación de emulsiones, en el que se utilizan micelas o micelas inversas para confinar y limitar la cubierta de sílice. Este método requiere un gran esfuerzo a la hora de separar la partícula cubierta de la gran cantidad de surfactantes asociados al sistema de emulsión (141,142). Una de las ventajas que ofrece tener una superficie enriquecida en sílice es la presencia de grupos silanol en superficie, que pueden reaccionar fácilmente con varios agentes de unión para enlazar covalentemente ligandos específicos a esas nanopartículas magnéticas (143, 144). Un ejemplo es la introducción de grupos amino en la superficie de nanopartículas magnéticas cubiertas de sílice mediante la hidrólisis y condensación de un organosilano como el aminopropiltrietoxisilano (APTS ó APS). Este método se conoce como silanización (145-147). 1.3.1.2 Oro El oro es una cubierta inorgánica muy útil para implementar la funcionalidad, así como para mejorar la estabilidad de las nanopartículas magnéticas en dispersiones acuosas (148). Esto se consigue gracias a dos propiedades principales del oro, que son su estabilidad química y su biocompatibilidad (149). Cuando el oro se usa como cubierta de las nanopartículas magnéticas, esta actúa como una barrera que previene la oxidación del núcleo y la degradación enzimática (150). Además, ésta cubierta exterior va a proporcionar una región de unión para una posterior funcionalización (151). 21 28 1.5.4 Variantes de la PCR convencional Una clasificación rápida que se puede hacer de la PCR es en base al tipo de ácido nucleico que se usa como molde para la amplificación. Tradicionalmente, la PCR convencional era una técnica que permitía la amplificación del ADN mediante el uso de una ADN polimerasa ADN dependiente. Pero a medida que se fue conociendo más sobre los mecanismos de síntesis y replicación de ácidos nucleicos, y con el descubrimiento de las ADN polimerasas dependientes de ARN, se pudo llevar a cabo la amplificación del material genético de muchos otros microorganismos. Como ejemplo, destacar una gran cantidad de virus con importancia clínica (Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), Virus de la Hepatitis C (VHC), gripe, sarampión, Virus de la Hepatitis A (VHA). Además, permitió también el análisis de los ARN implicados en las distintas rutas metabólicas, por ejemplo, en células eucariotas. Esta variante de PCR se conoce como PCR reversa o PCR de retrotranscripción (RT-PCR), ya que implica un primer paso de retrotranscripción para poder generar el ADN complementario (ADNc) de la molécula de ARN de partida. En base a esto, nos encontramos con más variantes de la PCR en función de los primers que se usan, en base al uso de sondas para monitorizar la amplificación o, por ejemplo, en base a la estrategia de temperaturas usadas para conseguir la correcta amplificación de la diana deseada. Algunos de los tipos más usados son (189): x multiplex PCR: se basa en el uso, en la misma mezcla de reacción, de múltiples pares de primers para la amplificación de varias regiones diana distintas al mismo tiempo. El número de pares de primers que se van a poder incluir depende de las condiciones de reacción, pero sobre todo, de la ausencia de interacciones entre los primers individuales en la mezcla de reacción. Los cebadores usados son ligeramente mayores (23-28 nucleótidos) que los usados en la PCR estándar con una sola diana, y son seleccionados en base a una Tm similar y a un contenido similar de guanosina/ citosina (de al menos el 40%). x PCR reversa (PCR de retrotranscripción): se basa en la formación de ADNc a partir de ARN para poder llevar a cabo su amplificación y análisis. Se usa, por ejemplo, en la detección y análisis de muchos virus (VIH, VHC). x PCR con primers degenerados: los primers degenerados son una mezcla de oligonucleótidos donde el núcleo de la secuencia es idéntica en todos. Pero una o más de las secuencias de los primers contiene cambios en uno o más nucleótidos, en comparación con el resto de primers presentes en la mezcla. Estas mezclas se diseñan para amplificar la misma secuencia diana de ADN, pero en la que se esperan pequeños cambios nucleotídicos entre diferentes aislados o individuos. 28 29 x PCR a tiempo real (cuantitativa o no): se basa en el uso se moléculas fluorescentes que se van a unir al ADN, permitiendo detectar la amplificación en cada ciclo a lo largo de toda la reacción. x Hot start PCR: se basa en el uso de nuevas DNA polimerasas termoestables, las cuales requieren un mayor periodo de tratamiento a altas temperaturas (por ejemplo 95 ºC ± 8 minutos) para ser activadas. Esto permite preparar la mezcla de reacción al completo sin el riesgo de la hibridación inespecífica de los primers, ya que la polimerasa no estará activa hasta que la temperatura esté por encima de la temperatura de hibridación. Esto permite generar mayor cantidad de amplicones específicos, así como ser menos sensible a la acción de inhibidores de la PCR. x touchdown PCR y touch-up PCR: se trata de reacciones en las que la temperatura de hibridación, en una primera parte de la PCR, va aumentando o disminuyendo (respectivamente) hasta llegar a la Tm óptima de los primers. El objetivo de estas estrategias es la de aumentar al especificidad de la reacción. 1.5.5 Análisis de los productos de amplificación de la PCR El análisis de los productos de amplificación de la PCR (amplímeros o amplicones) es un paso esencial a la hora de poder determinar tanto la calidad (por ejemplo, la presencia o ausencia de amplicones no específicos), como la cantidad (en valores relativos o exactos) del ácido nucleico diana que ha sido amplificado. Esta detección y análisis se va a poder llevar a cabo tras el proceso de amplificación, fuera de los tubos donde se llevó a cabo la PCR (análisis en geles de electroforesis), o bien se puede llevar a cabo en el mismo tubo de reacción durante el propio proceso de reacción (PCR a tiempo real). Esta detección a tiempo real se comentará en el punto siguiente. 1.5.5.1 Análisis mediante electroforesis en gel El método más usado comúnmente para establecer la calidad y cantidad de los productos de PCR, tras finalizar la reacción, es la electroforesis en gel de agarosa junto con el uso de agentes intercalantes del ADN para llevar a cabo la visualización (190). Los geles de electroforesis consisten en una matriz porosa semisólida sobre la que se va a realizar una separación en base al tamaño. En función de la concentración usada, más densa será la matriz del gel. Para conseguir que nuestras moléculas de ADN se desplacen a lo largo del gel se van a usar dos electrodos, uno a cada extremo del gel, generando una diferencia de cargas entre ambos polos. De este modo, como la carga neta global del ADN es negativa, será atraído hacia el polo donde se generan las cargas positivas (ánodo), al mismo tiempo que las cargas generadas en el polo negativo (cátodo) lo repelen. Así se consigue que las moléculas de ADN atraviesen el gel con una movilidad que va a depender de su tamaño. Aquellas de mayor tamaño tendrán mayor dificultad para atravesar la matriz porosa del gel, y por tanto, se desplazarán más lentamente que aquellas moléculas de menor tamaño, que se moverán más rápidamente a través de la 29 30 matriz del gel. De este modo, se produce una migración diferencial de las moléculas de ADN en función a su tamaño, que nos va a permitir separarlas y diferenciarlas. Pero para poder visualizar el ADN en la electroforesis se necesita el uso de agentes intercalantes de unión al ADN, siendo el bromuro de etidio el más usado. Lo que hace es intercalarse entre los pares de bases del ADN a lo largo de toda la molécula. En este estado de unión, cuando es expuesto a luz ultravioleta, emite fluorescencia. Así nos permite la visualización del ADN amplificado en nuestra PCR. Este agente intercalante puede ser añadido directamente al preparar el gel, o bien puede someterse al gel tras la electroforesis a un baño en una solución con bromuro de etidio. De ambos modos, lo que se consigue es “teñir” el ADN para permitir su visualización. Además, en la electroforesis se usan marcadores de peso molecular, formados por fragmentos de ADN de tamaño conocido. De este modo, se puede calcular el tamaño aproximado de los fragmentos de ADN que queremos estudiar. Para llevar a cabo la electroforesis se usan un tampón de electroforesis con el que se cubre el gel y ambos polos, y que es el mismo que se usa para disolver la agarosa a la hora de preparar el gel. El tipo de tampón usado puede afectar a la resolución de la separación del ADN. El tampón TAE (Tris-Acetato- EDTA) suele usarse para obtener una mejor resolución con fragmentos mayores a 4 kilobases (kb). En cambio, el TBE (Tris-Borato-EDTA) se suele usar para obtener una mejor resolución con fragmentos que oscilan entre 0.1-3 kb. También influye en la migración la concentración de agarosa, debido a la densidad de la matriz que se forma al usar mayor o menor cantidad en su preparación. La mayoría de los geles de agarosa utilizados en biología molecular tienen una concentración de agarosa que oscila entre 0.8 y 4 %, siendo los más ampliamente usados los geles con una concentración de 1% y 2%. Estas matrices del 1-2 % permiten la separación de amplicones de PCR con tamaños que van desde los 100 pares de bases hasta las 10 kb. Sin embargo, la naturaleza de las matrices de agarosa no va a permitir la separación de moléculas con un tamaño de, aproximadamente, menos de 15 nucleótidos. Además, como estos geles se vuelven más densos a mayor concentración de agarosa, fragmentos de unos 100 pares de bases tendrán dificultad para atravesar la matriz de geles con concentraciones del 4% o mayores. Una alternativa al uso de los geles de agarosa, pero usando exactamente la misma base de separación, son los geles de poliacrilamida. Estos se caracterizan por tener un mayor grado de resolución a la hora de separar amplicones de tamaños similares. Usando elevadas concentraciones de acrilamida, se pueden separar pequeños fragmentos de ADN y ARN que se diferencien en tamaño solamente en un nucleótido. 1.5.6 PCR a Tiempo Real La PCR en Tiempo Real es, básicamente, una PCR convencional (o PCR a punto final) en la que se va a poder monitorizar de forma continua, en cada ciclo, la amplificación. De este modo, nos va a permitir la detección a tiempo real. Así, se puede 30 31 eliminar el paso de detección mediante electroforesis, que es necesario para ver la formación de los amplicones en la reacción. Para poder llevar a cabo esta detección a tiempo real se necesita del uso unas moléculas, los fluoróforos, que emitirán fluorescencia durante la reacción. Además, es necesario el uso de termocicladores que llevan incorporados lectores de fluorescencia, con lo que van a poder medir los niveles de esta en cualquier momento de la reacción de amplificación. Esto nos va a permitir medir la cantidad de ADN sintetizado en cada ciclo, ya que la emisión de fluorescencia es proporcional al ADN formado durante la reacción. Así, el sistema puede detectar y registrar en todo momento la cinética de la reacción (191). Una de las principales ventajas que presenta la PCR a tiempo real es su mayor sensibilidad. Además, la cuantificación de la reacción no se hace en función del producto final (PCR convencional), ya que las variaciones que se pueden encontrar, debido a la propia naturaleza enzimática de la reacción, pueden ser muy significativas. Por eso, en la PCR a tiempo real esta cuantificación se realiza en función del denominado ciclo umbral (Threshold Cycle o Ct). Este se define como el ciclo a partir del cual la fluorescencia es estadísticamente significativa superior al ruido de fondo (background). Por tanto, como este Ct se sitúa al inicio de la reacción, no se va a ver afectado por las variaciones propias de la misma. En la Figura 5 vemos un ejemplo que explica esto, donde vemos muestras con cantidad igual de ADN de partida con el mismo valor de Ct, pero con variaciones en la cantidad total de amplificado al final de la reacción (punto final de la curva) (192). Figura 5: Ejemplo de la amplificación de tres réplicas de la misma muestra donde se ve el mismo valor de Ct, indicando el inicio de la amplificación, pero con un resultado final de la curva de amplificación diferente. Las principales propiedades de este parámetro son: x Como ya se indicó, nos va a determinar el ciclo inicial de amplificación, 31 32 x Nos permite separar los datos del ruido de fondo, xEs inversamente proporcional al número de copias inicial del la secuencia de ácido nucleico diana. Es decir, a mayor cantidad inicial de ácido nucleico, más bajo será el valor de Ct y viceversa (Figura 6). x Se suele establecer como 10 veces el ruido de fondo. Figura 6: Ejemplo de la amplificación de muestras con cantidad de copias decrecientes conocidas que nos muestra la relación inversamente proporcional entre el valor del Ct y la cantidad de partida de copias en una muestra. 1.5.6.1 Métodos de detección y cuantificación Como ya comentamos, la detección de la amplificación en la PCR a tiempo real se basa en la emisión y detección de fluorescencia durante la reacción. Así, nos encontramos que los sistemas de detección por fluorescencia empleados pueden ser de dos tipos: mediante el uso de agentes intercalantes y mediante el uso sondas específicas. Los agentes intercalantes son moléculas con afinidad para unirse al ADN de doble cadena e intercalarse entre sus bases. Estos fluorocromos, además, van a ver aumentada notablemente su emisión de fluorescencia en este estado de unión. Esto nos va a permitir la detección de la amplificación, ya que a medida que aumenten el número de copias, aumentará también la cantidad de fluoróforo unido al ADN, y por tanto, la cantidad de fluorescencia en cada ciclo (193, 194). El más utilizado es el SYBR Green I, que se excita a 497nm y emite a 520nm. La desventaja de usar estos agentes intercalantes es que se trata de un método de detección con una baja especificidad. Esto se debe a que se van unir de forma indiscriminada a cualquier ADN de doble cadena presente en el tubo de reacción, ya sea resultado de una amplificación inespecífica o dímeros de primers, algo muy frecuente en la PCR. Para ayudar a mejorar la especificidad es necesario el uso de unas condiciones de reacción óptimas, así como una selección cuidadosa de los primers para disminuir el riesgo de formación de dímeros. Una estrategia útil es la de iniciar la 32 33 reacción a temperaturas elevadas (hot-start PCR), para disminuir así de forma notable el riesgo de que se den amplificaciones inespecíficas. Además, lo que se hace para determinar si las curvas de amplificación corresponden a productos específicos de amplificación es determinar la temperatura de fusión de los fragmentos amplificados. Esto se lleva a cabo mediante el análisis de una curva de desnaturalización (“melting curve”) al final de la reacción. Este análisis consiste en calentar la mezcla de reacción lentamente desde 50°C hasta 95°C, monitorizando continuamente la fluorescencia. De este modo, la temperatura a la cual el DNA se desnaturaliza se observa como una caída drástica de la fluorescencia debido a la disociación del SYBR Green I. Cada fragmento amplificado tiene una Tm característica, que va a depender sobre todo de su longitud y de la composición de sus bases. Gracias a esto, se observarán diferentes picos al representar la derivada de la fluorescencia respecto a la temperatura. Podemos ver un ejemplo de este análisis en la Figura 7. En estas condiciones, el SYBR Green I se puede utilizar para cuantificar e incluso para la detección de mutaciones puntuales (SNPs). Esto se debe a que, hasta los amplicones que difieren en un solo nucleótido, pueden desnaturalizarse a diferentes temperaturas. Esto nos va a permitir detectar sus picos de desnaturalización, pudiendo así, por ejemplo, distinguir muestras homocigotas (un solo pico) de muestras heterocigotas (dos picos) (195). Figura 7: Ejemplo de un análisis de picos de melting de muestras con amplificación positiva para citomegalovirus usando SYBR Green I. A la izquierda, pico de dímeros de primers. A la derecha, picos específicos para la amplificación de citomegalovirus. 33 34 Las sondas son oligonucleótidos específicos que se van a unir una zona de la diana de amplificación. Estas van marcadas con dos tipos de fluoróforos, un donador (reporter) y un aceptor (quencher). El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas (196). Este mecanismo de detección se puede dividir en dos clases en función de las sondas, teniendo las sondas de hidrólisis y las sondas de hibridación. Las sondas de hidrólisis son oligonucleótidos marcados con dos fluoróforos, donador (extremo 5`) y aceptor (extremo 3`), que se encuentran próximos mientras la sonda se mantiene íntegra (197). En este estado, la fluorescencia liberada por el donador es absorbida por el aceptor, impidiendo así la detección. Cuando esta hibrida con el ADN molde durante la amplificación, la ADN polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena de ADN sintetizando la nueva cadena. Al llegar a la zona donde está la sonda, y gracias a su actividad exonucleasa, la polimerasa hidroliza la misma liberando al fluoróforo donador. De este modo, donador y aceptor ya no están próximos, por lo que la fluorescencia ya no puede ser absorbida por el aceptor, pero sí que es detectada por el fluorímetro del termociclador. Son conocidas como sondas TaqMan. El mecanismo de acción se puede ver en la Figura 8 (198). Figura 8: Esquema del funcionamiento de las sondas de hidrólisis usadas en la PCR a tiempo real. Se puede ver la unión de la sonda a la región diana específica (A), la hidrólisis de la misma por la acción de la polimerasa (B), y la emisión de fluorescencia por el fluoróforo una vez separado de la sonda. Las sondas de hibridación también son oligonucleótidos marcados con fluoróforos en sus extremos (199, 200). Al contrario que en las de hidrólisis, en las sondas de hibridación la emisión y captación de la fluorescencia se lleva a cabo con la unión de la sonda a la secuencia diana. Esto puede pasar de dos formas. Puede suceder por la separación de los fluoróforos, que estaban próximos entre sí con la sonda libre, tras la 34 35 unión (sondas molecular beacons, Figura 9 Izquierda) (198). También puede darse debido a la unión de dos sondas independientes, cada una marcada con uno de los fluoróforos, de tal forma que al unirse a la secuencia diana ambos fluoróforos quedaran próximos. En este momento, la fluorescencia emitida por el donador será captada por el receptor, que se excitará y emitirá fluorescencia en otra longitud de onda, que será captada por el termociclador (sondas FRET, Figura 9 Derecha) (199). Figura 9: Mecanismo de acción de las sondas de hibridación. Las sondas molecular beacons (izquierda), que tras la unión a la región específica de la diana dejará a los fluoróforos con los que está marcada lo suficientemente separados como para que la fluorescencia emitida por el donador no pueda ser absorbida por el receptor, siendo así detectada por el sistema de PCR. Las sondas FRET (derecha) son dos sondas individuales marcadas, una con un fluoróforo donador y otra con un receptor. Cuando se unen a la región diana, ambos fluoróforos quedarán próximos, de tal forma que el donador de energía excitará al receptor, haciendo que emita fluorescencia en otra longitud de onda que será detectada por el sistema de PCR. Con el uso de sondas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de las mismas, lo que conlleva un aumento en igual proporción de la fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza, además, la especificidad de la detección, ya que mientras no haya unión de la sonda, no habrá amplificación y tampoco fluorescencia. Del mismo modo que con los agentes intercalantes, se pueden hacer análisis de curvas de melting sobre los amplificados para identificar la correcta amplificación de la diana. Además, gracias a la elevada especificidad que ofrece el uso de las sondas, se puede llevar a cabo amplificaciones de distintas dianas de forma simultánea (PCR múltiple o multiplex PCR) en el mismo tubo de PCR, identificando posteriormente a cada amplificado de forma correcta con el análisis de estas curvas. Las sondas de hidrólisis no permiten realizar este tipo de análisis. 35 36 Una de las ventajas de la PCR a tiempo real, junto a su rapidez, es que nos va a permitir cuantificar la concentración inicial de ácido nucleico en nuestra muestra, así como identificar polimorfismos o mutaciones puntuales (201). 1.5.7 Utilidad de la PCR en el diagnóstico microbiológico Una de las grandes necesidades en el avance del diagnóstico era la necesidad, cada vez mayor, de detectar muy pequeñas cantidades de ciertas moléculas con relevancia clínica, lo que exigía una metodología con una elevada sensibilidad. El poder detectar infecciones virales con baja titulación, mutaciones puntuales en genes o aberraciones genéticas en tumores empezaron a ser posibles con el descubrimiento de la PCR en 1983 por Kary Mullis (202), y por el gran desarrollo posterior que se hizo de la técnica, consiguiendo perfeccionarla y desarrollando distintas variantes. La característica que hace destacar a la PCR reside en el hecho de que, a partir de cantidades extremadamente pequeñas de ADN, se van a poder ser amplificar de forma específica a grandes cantidades de ADN sintético in vitro. Esto se consigue mediante la replicación continua, exponencial y semiconservativa que se lleva a cabo de una región diana, bien definida, presente en el ADN molde (189). Si trasladamos esta capacidad y su uso al campo del diagnóstico microbiológico, nos encontramos con una herramienta increíblemente útil a la hora de mejorar la sensibilidad del diagnóstico (detección de microorganismos que no crecen o no se dan cultivado). También es de gran utilidad al mejorar la capacidad de respuesta para la identificación (unas pocas horas entre extracción de ácidos nucleicos y PCR) respecto al cultivo y pruebas bioquímicas (de 16-24 horas a días de crecimiento en medios de cultivo en función del microorganismo) (203). El gran desarrollo de esta técnica ha llevado a que, en la actualidad, nos encontremos con múltiples variantes de la misma que van a poder ser usadas en distintos ámbitos del laboratorio, no sólo clínico, en función de las necesidades. Desde la PCR convencional con posterior visualización por electroforesis en geles de agarosa, pasando por la PCR reversa, la PCR múltiple, la PCR de secuenciación o por la PCR a tiempo real, todas nos van a permitir en el laboratorio detectar y analizar los ácidos nucleicos con múltiples fines. Sin restar importancia a las diversas variantes de la PCR, una de las más implantadas en el diagnóstico microbiológico es la PCR a tiempo real. Esta, con sus distintas posibilidades metodológicas, nos permite mejorar el diagnóstico y, en muchos casos, ayudar en el seguimiento de las infecciones así como en la caracterización de los distintos microorganismos en distintos ámbitos (10,203): x Diagnóstico viral (VIH, gripe, CMV, VHB) x Diagnóstico bacteriano (tuberculosis, SARM, pneumococo, meningococo) x Carga viral (seguimeinto VIH, VHC) x Microorganismo con mutaciones de resistencia (SARM, carbapenemasas) 36 37 x Parasitología x Diagnóstico de hongos x Microorganismos no cultivables o de cultivo de bajo rendimiento x Caracterización genética (genotipado, estudio de mutaciones de resistencia) Por todo esto se convierte en una herramienta altamente útil en el ámbito clínico, permitiendo obtener información valiosa que ayudará en situaciones clínicas diversas. Y más concretamente, en el ámbito de la microbiología, podríamos destacar algunos puntos en los que se convierte en una herramienta tremendamente útil (10, 202, 203): x Diagnóstico Su principal ventaja aquí es su gran sensibilidad y especificidad diagnóstica si se comparan con técnicas convencionales como la serología y el cultivo. Además, también ofrece una gran rapidez en la obtención de los resultados, ya que nos permite conseguirlos en cuestión de pocas horas. Aunque también tiene su parte negativa, ya que no siempre es fácil la interpretación de resultados. Por ejemplo, su elevada capacidad de amplificación será capaz de amplificar también cualquier genoma que pueda aparecer en la muestra debido a una contaminación. Además, no siempre es posible distinguir un caso clínicamente significativo de aquel que no lo es, ni va a ser capaz de discriminar aquellos casos de infección activa de uno latente. x Seguimiento y pronóstico En algunos tipos de infecciones, como las infecciones virales por el VIH, por el HCV, el CMV, la determinación cualitativa y/o cuantitativa de la viremia puede ser de importancia. El obtener estos datos va a tener una idea del pronóstico de la infección, así como ser uno de los marcadores de seguimiento en la progresión de la misma. Así mismo, en las infecciones bacterianas, como por ejemplo la sepsis, la detección o no del microorganismo puede ser un marcador de seguimiento tras la aplicación de un tratamiento antibiótico. x Epidemiología En el escenario de un brote infeccioso, el uso de las técnicas de PCR nos va a permitir identificar un linaje bacteriano o vírico concreto para asociarlo como el agente causal. Además, nos va a permitir detectar el origen de dicho brote (204, 205). En algunos casos nos llevará incluso a la identificación de patógenos desconocidos hasta ese momento. x Resistencias farmacológicas 37 44 publicaciones donde indican el funcionamiento no completo de este tratamiento o la mejor aplicabilidad del mismo usando PMA (227). La primera vez que se describió el análisis selectivo de ADN, a partir de patógenos bacterianos vivos de alimentos usando colorantes vitales, fue en la detección de E. coli O157:H7, L. monocitogenes y Salmonella usando EMA (228). Tras tratamientos químicos y de calor, la combinación de EMA-PCR fue capaz de discriminar entre células vivas y muertas, convirtiendo el uso del EMA en un prometedor método para la detección de la viabilidad. A partir de ese momento, se usó ampliamente para la detección de bacterias viables en cultivos puros y en matrices complejas de alimentos. Aunque algunos estudios posteriores mostraban que el EMA penetraba en las células viables cuando se aplicaba en la detección de E. coli O157:H7 (229), y también con otras especies bacterianas (230), resultando en la pérdida parcial de ADN y causando una infraestimación del recuento de microorganismos vivos (231, 232). Entre toda esta controversia, aparecen publicaciones mostrando la utilidad del uso del PMA en la detección de la viabilidad. Lo que se empezó a defender fue que el PMA era más selectivo debido a la mayor carga de la molécula (230), lo que le permitiría penetrar más específicamente a través de la membrana dañada de las células muertas. Por otro lado, hay quien defiende que la diferencia entre género bacteriano puede tener un gran impacto en el efecto de los colorante vitales, especialmente las diferencias estructurales en la envuelta celular entre bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (233, 234). En bacterias Gram-negativas, la compleja estructura de la membrana externa representa la principal barrera de permeabilidad, mientras que la correspondiente barrera en Grampositivos es la capa de peptidoglicano (228). Esta diferencia facilitaría que el PMA penetrase a través de la membrana dañada de bacterias Gram-negativas muertas, y podría explicar la mejor actuación del PMA en la diferenciación entre bacterias vivas y bacterias muertas, con la membrana dañada, dentro de este grupo bacteriano. Aún con todos estos datos contrapuestos sobre el uso y eficacia de estos colorantes vitales, el uso de estas, la búsqueda de otras moléculas nuevas y su aplicación en el ámbito del diagnóstico microbiológico mediante la v-PCR, podría ser una herramienta complementaria muy útil para el diagnóstico y el seguimiento de las infecciones. 1.6.3 PCR de viabilidad (v-PCR) La PCR de viabilidad (v-PCR) es, posiblemente, el método que más se ha probado e investigado para intentar discriminar, en una muestra, los microorganismos vivos de los muertos (235-237). Entre la literatura destaca el gran interés y aplicación de este método en muestras alimentarias (227), aunque de forma indirecta van a tener su implicación clínica/ sanitaria, sobre todo viendo muchos de los microorganismos probados. En la Tabla 2 y la Tabla 3 se muestran unos ejemplos de los microorganismos detectados con los colorantes vitales usados para el tratamiento en esta técnica. 44 45 En general, los protocolos de v-PCR consisten en la separación de la muestra en dos alícuotas, para tratar a una de ellas con una sustancia con afinidad a los ácidos nucleicos. La molécula utilizada inicialmente en la mayoría de los experimentos es la monoazida de etidio (EMA), aunque se ha ido reemplazando más recientemente por otra sustancia similar, que es la monoazida de propidio (PMA) (230). Las concentraciones usadas en el tratamiento y las condiciones globales del protocolo pueden tener ligeras variaciones entre algunos trabajos pero en general el protocolo es siempre el mismo. Tras un tiempo de incubación en oscuridad, la muestra tratada es fotoactivada por la exposición a una lámpara de luz visible que activa a la sustancia usada, favoreciendo su unión al ADN. Ambas alícuotas son sometidas entonces a un proceso de extracción de ácidos nucleicos y posterior amplificación mediante PCR a tiempo real. Si ambas alícuotas presentan señales similares de amplificación, los microorganismos en la muestra se considera que son mayoritariamente viables (membranas intactas). Por la contra, si la muestra tratada presenta una señal medible más débil, los microorganismos de la muestra se consideran mayoritariamente inactivados. Esa diferencia de señal se refiere a diferencias medibles en el Ct cuando se comparan ambas alícuotas. La viabilidad en este contexto se basa en el concepto de integridad de membrana, de tal modo que aquellas bacterias que estén muertas tendrán la membrana dañada, y por tanto dejarán de ser impermeables a los colorantes vitales usados en la v-PCR. Pero a pesar de ver que en casos se mostró la capacidad de estos colorantes para discriminar entre bacterias vivas y muertas, también es cierto que hay algunos puntos a tener en cuenta que explicarían, en algunos casos, el fracaso de este procedimiento. Los puntos que algunos autores tienen en cuenta serían los siguientes: x Que la viabilidad basada en la integridad de la membrana no sería un concepto totalmente completo, ya que no da una medida directa de bacterias vivas y muertas (238), porque, aunque las células con membranas permeables a estos colorantes pueden ser asociadas a no viables, no todas las células no viables tendrían dañada su membrana (239, 240). A pesar de que la integridad de la membrana es un criterio incompleto para definir la viabilidad de la célula, el abordaje mediante la v-PCR ha conseguido resultados positivos en varias publicaciones (241, 242). En esta línea estarían algunos autores, que defienden que se debería considerar más de un único criterio de viabilidad, como por ejemplo ser o no cultivable, la actividad metabólica y la integridad de membrana (226, 243). x La importancia de la gran variedad de matrices de las que están formados los distintos tipos de muestras en alimentación y muestras ambientales (244). Estas podrían tener un efecto negativo sobre la eficacia de la v-PCR, debido a la presencia de inhibidores que podrían interferir en distintos puntos del proceso de detección (245, 246). x La concentración del microorganismo o microorganismos en la muestra junto con el límite de detección de la PCR. En muchos tipos de muestras, la cantidad de 45 46 patógenos bacterianos se encuentran en niveles muy bajos (entre 10 2 y 10 4 células/gr) (247), mientras que en los mejores casos, el límite de detección más aceptado para la PCR estaría en 103 células/gr (248). Por otro lado, se ve que cuando nos encontramos con elevadas concentraciones bacterianas en la muestra, la detección se va a ver limitada. Esto es debido a que, en el momento de la activación del colorante con la fuente de luz, esta elevada masa bacteriana interferiría en el paso de unión al ADN, bien por ensombrecer la luz o bien compitiendo por el colorante (249, 250). x Ya que cuando estos colorantes entran en la célula se van a intercalar en el ADN, parece mostrada la importancia del tamaño de la secuencia diana de detección. Parece que cuanto más grande es esa secuencia diana, mayor es la probabilidad de que el colorante se intercale en ella (251-254). 46 47 Tabla 2: Ejemplos del uso de colorantes vitales para la detección diferentes bacterias y levaduras a partir de distintos productos alimentarias (adaptado de Elizaquível P et al 2014 (227)). Tipo de alimento Microorganismo(s) Colorante vital Referencia Carne Pechuga y patas de pollo Campylobacter jejuni EMA Rudi et al (2005) Carcasas de pollo Campylobacter PMA Josefsen et al. (2010 Pollo y huevos Salmonella EMA Wang and Mustapha (2010) Pollo, ternera y jamón Salmonella entérica serovars PMA Yang et al (2012) Jamón cocido Salmonella PMA Martin et al (2013) Vegetales y zumos Espinacas y ensalada mixta E. coli O157:H7 , Salmonella, L. monocytogenes PMA Elizaquível et al ( 2012) Lechuga Salmonella PMA Liang et al (2011) Lechuga y tomate S. typhimurium, E. coli O157:H7 , L. monocitogenes PMA Yang et al (2013) Lechuga y espinacas E. coli O157:H7 PMA Dinu and Bach (2013) Tomate S. enteric serovars PMA Yang et al (2012) Zumos de manzana, naranja o uvas Zygosaccharomyces bailii EMA Rawsthorne et al (2009) Productos lácteos Yogur Bifidobacterium EMA Men et al (2010) Leche pasteurizada Coliformes totales EMA Soejima et al (2012) Leche pasteurizada Enterobacteriaceae PMA Soejima et al (2012) Queso Gouda L. monocytogenes EMA Rudi et al (2005) Leche en polvo Cronobacter sakazakii EMA Minami et al (2012) Pescado Salmón Photobacterium phosphoreum PMA Macé et al (2013) Camarón y salmón Brochotrix thermosphacta PMA Mamlouk et al (2012) Otros Mosto y vino Oenococcus oeni PMA Vendrame et al (2013) Superficies de procesado de alimentos E. coli, S. aureus, L. monocytogenes PMA Martinon et al (2012) 47 48 Tabla 3: Ejemplo de trabajos en los que se usaron colorantes vitales (EMA/PMA) para la detección de virus. (Adaptado de Elizaquível P et al 2014 (227)). Un punto importante para poder llevar a cabo esta detección diferencial radica en que las sustancias que se intenten usar sean capaces de ser totalmente selectivas a nivel de permeablidad, y que por tanto solamente sean capaces de atravesar aquellas membranas que estén dañadas. En la Figura 14 podemos ver un ejemplo gráfico de lo que nos podemos encontrar en el caso de usar una molécula cuya permeabilidad no sea la adecuada, comparando al uso de la PCR convencional y la v-PCR. Lo que nos muestra es que nos podemos encontrar con moléculas que acaben entrando en una porción de células viables (fracción a) y por tanto infravalorar el microorganismo presente. Pero también puede pasar que esa sustancia no sea capaz de penetrar en todas las células muertas con la membrana dañada, y por tanto estar detectando (fracción b) e sobrevalorando la presencia de organismos viables. Figura 14: ejemplo de la detección con la v-PCR con el uso de sustancias incapaces de mantener una permeabilidad totalmente selectiva entre membranas dañadas e íntegras, implicando la no detección de algunos de los microorganismos vivos (a) y la detección de algunos microorganismos muertos. Basado en el artículo Fittipaldi M et al 2011 (220)). Tipo de virus Proceso de inactivación Colorante vital Correcta monitorización Referencia Virus entéricos Coxsakievirus, Echovirus Tratamiento con calor PMA Si Parshionikar et al (2010) VHA Tratamiento con calor Procesado a alta presión PMA Si Parcial Sanchez et al (2012) Norovirus Tratamiento con calor PMA Si por RT -PCR No por RT-qPCR Parshionikar et al (2010) Poliovirus Tratamiento con calor PMA/EMA Si Parshionikar et al (2010) y Kim et al (2011) Otros virus Gripe aviar Estabilidad en agua PMA No Graiver et al (2010) Fago MS2 Tratamiento con calor PMA Si Kim y Ko (2012) Norovirus murino Tratamiento con calor PMA EMA No Si Kim y Ko (2012) Kim et al (2011) Fagos T4 Tratamiento con calor PMA No Fittipaldi et al (2010) 48 49 El poder desarrollar un protocolo de viabilidad, con una sustancia de unión al ADN sólo de aquellas bacterias que estén muertas, e inhibiendo su amplificación, sería una herramienta muy útil para mejorar la detección de aquellos microorganismos que realmente puedan estar causando o puedan llegar a causar una infección. 49 50 50 51 2. OBJETIVOS 51 52 52 53 En todo proceso de detección de un analito, a partir de una determinada muestra, son necesarios múltiples paso en el procesamiento de la misma hasta poder llegar al punto final en la detección. Desde la toma de muestra y el posterior procesamiento, hasta la realización de las técnicas específicas de la detección, todos son pasos de gran importancia para llegar a un resultado fiable. Por un lado, es importante poseer las técnicas apropiadas para el procesado de la muestra original, aislando si es necesario un analito concreto. Por el otro, también es de gran importancia el disponer de técnicas de detección con la suficiente sensibilidad y especificidad. En conjunto, ambos tipos de técnicas van a ser de gran ayuda en el proceso diagnóstico. En el ámbito del diagnóstico microbiológico se ha evolucionado mucho, incorporando en la rutina, junto a las técnicas convencionales, como el cultivo y pruebas bioquímicas, una gran variedad de técnicas moleculares basadas en la PCR (sobre todo en la PCR a tiempo real). Además de que la propia PCR sea lo suficientemente sensible y específica para detectar aquel o aquellos microorganismos de interés, uno de los paso de mayor importancia para poderla llevar a cabo es la extracción y purificación previa. Este paso nos va a permitir obtener los ácidos nucleicos presentes en nuestra muestra lo más puros posible, y en una cantidad suficiente para que puedan ser detectados. Los métodos más modernos se basan en el uso de nanopartículas magnéticas para la captación, recuperación y concentración de los ácidos nucleicos a partir de cualquier tipo de muestra, eliminando cualquier resto de contaminantes, inhibidores y elementos celulares que puedan interferir en procesos posteriores. La PCR nos permite llevar a cabo la amplificación y detección a partir cantidades muy bajas de material genético, permitiéndonos una elevada capacidad de detección, aunque como toda técnica tiene un límite de detección a partir del cual no será capaz. Pero esta gran capacidad para poder amplificar cualquier ácido nucleico de nuestra muestra no nos va a permitir discriminar si pertenece a un microorganismo viable o muerto, o incluso si se está amplificando ADN libre en la muestra perteneciente a microorganismos muertos. En este sentido, hay dos puntos que ayudarían a mejorar el diagnóstico microbiológico. En primer lugar, conseguir mejoras en los sistemas de extracción que permitan una mayor recuperación de ácidos nucleicos de calidad, para que puedan ser usados en técnicas posteriores. En segundo lugar, el poder desarrollar protocolos que permitan distinguir mediante PCR la amplificación únicamente de microorganismo viables y que por tanto serán los causantes del cuadro clínico del paciente Por este motivo, los objetivos que nos planteamos fueron los siguientes: 1. Diseñar y probar nanopartículas magnéticas para su uso en sistemas automáticos, para intentar mejorar el paso de purificación de ácidos nucleicos, y ayudar así a la mejora en la detección en las pruebas diagnósticas posteriores. 53 60 FeO-2204 Descripción Dispersión acuosa de nanopartículas de magnetita revestidas con ácido poliacrílico PAA Distribución de tamaño 10,5 ± 4 nm (85% part) Forma del producto Disperso en agua , pH=10 Concentración 20.2 mg/ml Densidad 1,00 g/ml Densidad de partículas 5,25·1018 part/l FeO-2206 Descripción Dispersión acuosa de nanopartículas de magnetita revestidas con sílice Distribución de tamaño 26 ± 3 nm 10 ± 2 nm (core) Forma del producto Disperso en agua , pH = 8,66 Concentración 5,25 mg/ml Densidad 0.99 g/ml Densidad de partículas ≈2.04·1017 partic/l FeO-2207 Descripción Dispersión acuosa de nanopartículas de magnetita revestidas con sílice Distribución de tamaño 45 ± 3 nm 10,5 ± 3 nm (core) Forma del producto Disperso en agua pH=9.9 Concentración 10 mg/ml (25- 30 % óxido de hierro, 70 - 75% sílice Densidad 1,0 g/ml Densidad de partículas ≈ 2.2·1015 partic/ml FeO-2206-APS Descripción Dispersión acuosa de nanopartículas de magnetita revestidas de sílice funcionalizadas con aminopropilsilano (APS) Distribución de tamaño 24,2 ± 3,4 nm 10 ± 2 nm (core) Forma del producto Disperso en agua , pH = 8,22 Concentración 4,99 mg/ml Densidad 1.00 g/ml Densidad de partículas − 60 61 FeO-2207-APS Descripción Dispersión acuosa de nanopartículas de magnetita revestidas de sílice funcionalizadas con aminopropilsilano (APS) Distribución de tamaño 47 ± 4 nm 10,5 ± 3 nm (core) Forma del producto Disperso en agua pH=9.4 Concentración 24,86 mg/ml Densidad 1,0 g/ml Densidad de partículas ≈ 1.71·1017 partic/ml Figura 15: Imágenes obtenidas para la caracterización de cada una de las partículas probadas. 61 62 La síntesis de las partículas se realizó usando como referencia la metodología expuesta en la publicación de Kang K et al 2009 (255). Esta se llevo a cabo mediante el método de reacción sol-gel a partir de una mezcla de sales de hierro. La posterior cubierta de sílice se añadió usando el método de Stöber (135) y tomando como referencia la anterior publicación. Como precursor para la hidrólisis y condensación en el proceso de formación de la cubierta de sílice se utilizó el tetraetoxiortosilicato (TEOS), usando cambios en su concentración para conseguir controlar el grosor de la cubierta. Un esquema gráfico de la formación de las nanopartículas se muestra en la Figura 16. Como se indica en las tablas anteriores con las características de cada nanopartícula, algunas de ellas fueron funcionalizadas con grupos reactivos en su superficie buscando una mejora en la adsorción de ácidos nucleicos. Las sustancia usada para funcionalizar la cubierta de las partículas fue el aminopropiltrietoxisilano (APS/APTS). Figura 16: Esquema de los distintos pasos e l obtención de nanopartículas de magnetita recubiertas de sílice y funcionalizadas con grupos con grupos amino reactivos en su superficie para la adsorción de ácidos nucleicos. Figura obtenida de Kang K et al 2009 (255). Con este método de síntesis, y como se ve en las características de las nanopartículas, se consiguió sintetizar y probar nanopartículas de magnetita desnudas, nanopartículas de magnetita recubiertas con sílice y nanopartículas de magnetita recubiertas con sílice con grupos funcionales en su superficie. También se probó a usar una nanopartícula en la que se utilizó como revestimiento el ácido poliacrílico (PAA) en vez de sílice. 3.1.3 Medios de cultivo para el crecimiento de bacterias transformadas Para la obtención de las bacterias, se utilizó medio de cultivo sólido (DifcoTM LB agar, Lennox) para el crecimiento inicial en placa. Para el posterior crecimiento a mayor escala, se usó medio líquido (DifcoTM LB Broth, Lennox). Todos los medios fueron preparados añadiéndole ampicilina (Sigma Aldrich) preparada a una concentración de 100 mg/ml. Para preparar el medio líquido (LB Broth), se añadieron 10 g de medio en 500 ml de agua y se sometió a esterilización en autoclave. Una vez atemperado el medio, se añadieron 500 μl de una solución de ampicilina a 100 mg/ml. 62 63 Las placas con medio sólido (LB agar) se prepararon del mismo modo que el medio líquido, pero añadiendo 17,5 g de LB agar. Tras añadir la ampicilina, el medio se repartió en placas petri estériles, y se dejaron solidificar a temperatura ambiente. Una vez listas, se conservaron en nevera hasta su uso. La ampicilina se preparó disolviendo 0,6 g de la misma en 6 ml de agua estéril para inyección (Meinsol), para obtener una concentración de 100 mg/ml. Posteriormente se guardaron alícuotas a -20 ºC para conservarlas hasta su uso. 3.1.4 Enzimas de restricción Para realizar los cortes de los plásmidos en la etapa correspondiente de identificación, se usaron los enzimas de restrcción Apa I, Xma I, Cla I y Hind III de la casa comercial New England BioLabs. Los cortes se hicieron en baño a 37 ºC siguiendo las instrucciones del fabricante. 3.1.5 Obtención de poblaciones estándar de ácidos nucleicos Para conseguir una cantidad cuantificable de muestra y en cantidad suficiente para realizar los experimentos, se usaron stocks congelados de E. coli DH5α transformada con cinco pseudotipos basados en el plásmido NL4.3 (256, 257). Este plásmido contiene la estructura genética básica del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), lo que nos permite de detectarlo con gran variedad de técnicas moleculares. Estos plásmidos (Tabla 4) se diferencian entre sí por tener sitios de restricción únicos, que nos permiten distinguirlos mediante técnicas como la pirosecuenciación, o con el uso de enzimas de restricción seguido de separación y visualización mediante electroforesis en gel de agarosa. Además portan insertada en una región del plásmido el gen de resistencia a ampicilina. Enzimas de restricción Plásmido Fragmento resultante Hind III pNL4.3 1480 pb Apa I - Cla I p4254 2248 pb Apa I - Xma I p4411 2405 pb Apa I – Xma I p4634 2628 pb Apa I – Cla I p4696 2690 pb Tabla 4: Listado de los plásmidos utilizados y de los enzimas de restricción con los que se realiza el corte en cada uno. Se indica también el tamaño de fragmento resultante que se visualizará mediante electroforesis en gel de agarosa. 63 64 A partir de los stocks de glicerol, con la bacteria transformada de forma independiente con cada uno de los plásmidos, se hizo una siembra con asa de 10 μL en una placa de agar con ampicilina y se incubaron toda la noche en estufa a 37 ºC. Esto nos permitió el crecimiento solamente de nuestra bacteria con plásmido. Desde estas placas se seleccionaron cuatro colonias, que se pusieron a crecer en 4 ml de medio líquido con ampicilina y se dejaron crecer toda la noche a 37 ºC y en agitación continua. De estos tubos con crecimiento se usaron 2 ml para recuperar las bacterias por centrifugación y hacer la extracción del ADN plasmídico usando el kit NucleoSpin® Plasmid (Machery- Nagel, Ref: 740588.50). Una vez extraídos los plásmidos, se utilizó un volumen para hacer el corte con el enzima de restricción correspondiente, y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% para identificar las bandas correspondientes a cada uno y confirmar su identidad. En la Figura 17 se muestra el perfil electroforético para cada uno de los plásmidos. Figura 17: Imagen de un gel de electroforesis con las bandas correspondientes los distintos plásmidos tras el corte con los enzimas de restricción. Una vez identificado de forma correcta cada plásmido, y a partir del volumen de los tubos con bacteria crecida, se hizo un nuevo cultivo en medio líquido pero a mayor escala. Para eso, transferimos 500 μL de bacteria crecida en un matraz con 500 ml de medio de cultivo con ampicilina y se dejó crecer toda la noche a 37 ºC en agitación continua. A continuación, se centrifugó todo el medio de cultivo con bacterias en varios 64 65 ciclos de centrifugación (15.000 x g durante 10 minutos) usando tubos estériles de 50 ml para precipitar y recuperar las bacterias, eliminando los restos de medio de cultivo y sustancias que quedan en él. En este punto, si no se iban a procesar a corto plazo, los precipitados se congelaron a -40 ºC. Bien de forma inmediata a la precipitación de las bacterias, o bien tras la congelación, estos precipitados se usaron para extraer de forma específica el ADN plasmídico que portan. Para eso se usaron los reactivos y protocolo del “Plasmid Maxi kit” (Quiagen, ref: 12162). Posteriormente, se realizó el mismo tratamiento con enzimas de restricción y separación por electroforesis para comprobar cada uno de los plásmidos. La recuperación de los plásmidos y la preparación de todas sus diluciones se realizaron siempre con tampón T.E. (pH 8). 3.1.6 Medida de las concentraciones de ADN para calcular el rendimiento de las extracciones Para conseguir valorar la utilidad de estas nanopartículas en la extracción de ácidos nucleicos y el rendimiento obtenido con las mismas se realizaron mediciones de la cantidad de ADN presente en los plásmidos obtenidos en la extracción a partir de las bacterias, a partir de las diluciones que se prepararon de estos para usar como muestra en las extracciones con las nanopartículas, y también a partir del eluído final recuperado tras los procesos de extracción de ácidos nucleicos en la plataforma automatizada usando nuestras nanopartículas. Estas medidas se realizaron mediante un método fluorimétrico comercial con el sistema Qubit® 2.0 (Invitrogen) y usando los reactivos correspondientes para la detección de bajas cantidades de ADN (Quant-iT dsDNA HS Assay Kit, Ref: Q32851, Invitrogen) y para cantidades altas de ADN (Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, Ref: Q32850, Invitrogen), según la necesidad. De este modo, pudimos saber la cantidad de ADN en μg/ml en nuestras muestras de partida, y compararlo después con lo que se obtuvo al final de las extracciones con nuestras partículas. Con ambos valores calculamos el rendimiento de la recuperación en porcentaje. En la Figura 18 se muestra el sistema de medición donde, al introducir un tubo con el reactivo correspondiente y un volumen conocido de nuestra muestra, nos calculará la concentración de ADN en μg/ml de partida. Al mismo tiempo, usa dos calibradores internos, en base a los cuales se realizan los cálculos. Con este dato y con el volumen total de muestra que se usó para la extracción, así como con el volumen en que se recuperó el ADN, pudimos calcular la cantidad total de ADN introducida, la cantidad total recuperada, y calcular así rendimiento de dicha extracción. 65 66 Figura 18: Imagen del sistema de medición por fluorimetría usado para calcular la cantidad de ADN presente en las muestras preparadas. 3.1.7 Ensayos de extracción de ácidos nucleicos usando nuevas nanopartículas Para llevar a cabo las extracciones de ácidos nucleicos se utilizó el sistema abierto de extracción HAMILTON kPCR (Siemens), basado también en el uso de nanopartículas magnéticas para la captura de los ácidos nucleicos en muestras biológicas. Como primer punto a tener en cuenta, al ser un sistema abierto de reactivos, lo que se hizo fue sustituir las partículas propias del aparato por las nuestras que tratábamos de probar. Para llevar a cabo las extracciones se prepararon diluciones seriadas, en tampón T.E., de la mezcla de los ADN plasmídicos obtenidos de las bacterias. Cada punto de concentración se introdujo por triplicado, y se realizó la medición de la concentración de ADN antes de la extracción y al eluído obtenido tras la misma. El volumen de partida de cada muestra fue de 600 μl, y el del eluído final de la extracción fue de 50 μl. Los valores medios ajustados de cada punto inicial de ADN de las diluciones seriadas fueron de 120, 65, 38, 22, 13, 7, 4 y 2 μg totales presentes en los 600 μl usados por el sistema para la extracción. 3.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DEL STHAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A METICILINA Un total de 100 aislados clínicos fueron seleccionados aleatoriamente de la colección de cepas de nuestro laboratorio. Además, se incluyó una cepa de referencia para SARM, la ATCC 43300. En esta selección aleatoria establecimos dos criterios para aceptar las 66 67 muestras en el grupo de estudio. Primero, los aislados debían haber sido identificados en el sistema “Microscan Walkaway® Plus instrument” (Siemens) usando el “Pos Combo Panel type 31”. Posteriormente, la resistencia a meticilina debía haber sido confirmada mediante el test de susceptibilidad por difusión con disco de cefoxitina (30 microg; Oxoid). En base a esto, los 101 aislados fueron revisados para comprobar que cumplían ambos criterios, y a partir de ahí se realizó la detección mediante PCR a tiempo real de forma paralela con dos sistemas de detección: el “BDMax™ MRSA Assay” (Becton Dickinson) y el “LightCycler® MRSA Advanced Test” (Roche). Como se muestra en el esquema de flujo de trabajo de la Figura 19, se llevaron a cabo técnicas fenotípicas y moleculares alternativas a aquellas muestras que presentaron un resultado negativo en al menos una de las técnicas de PCR a tiempo real, con el objetivo de asegurar la fiabilidad del resultado. Las técnicas y sistemas usados fueron el (a) Vitek®2 (tarjeta GP; bioMérieux), (b) “BBL™ Coagulase Plasma Rabbit with EDTA” (Becton Dickinson), (c) BDMax™ Staph SR (Beckton Dickinson), (d) GenoType® MRSA kit (Hain Lifescience) y (e) FluoroType® MRSA kit (Hain Lifescience). Para el análisis eventual de distancias genómicas completas se usó la técnica rep-PCR (Diversilab™ Staphylococcus kit (bioMerieux)). Además, se les realizó un análisis por espectrometría de masas por MALDI-TOF usando el sistema MALDI Biotyper (BRUKER) con dos objetivos: por un lado, identificar como S. aureus a los aislados con resultado negativo; y por otro lado, para obtener un dendrograma donde los aislado fueran analizados y agrupados para intentar descubrir una posible formación de grupos entre los distintos aislados negativos para cada sistema de PCR a tiempo real. Finalmente, se realizó un tipado de estos aislados basado en PCR para asignarlos a uno de los grupos de clasificación basados en la región SCCmec, para tratar de explicar la posible agrupación de aislados en el dendrograma obtenido. La PCR se realizo usando el protocolo indicado en la publicación de Milheiriço C et al 2007 (258). 67 68 Figura 19: Flujo de trabajo para las distintas pruebas realizadas para la caracterización de los aislados de MRSA. 3.2.1 Sistema Microscan Walkaway® Plus (Siemens) El sistema Microscan Walkaway® Plus es un sistema totalmente automatizado en el que se lleva a cabo la identificación bacteriana y la determinación de la susceptibilidad antibiótica usando el panel “Pos Combo Panel Type 31”. Todas las muestras fueron procesadas siguiendo las recomendaciones del fabricante. 3.2.2 Difusión con disco de cefoxitina El test de susceptibilidad por difusión en disco de cefoxitina 30 Pg (Oxoid) se hizo a las muestras para confirmar la resistencia a meticilina. Se preparó una solución 0,5 McFarland de cada aislado y se hizo una siembra en césped en placas de agar sangre. Las placas se incubaron a 37 ºC durante 18 horas y se midieron los diámetros de las zonas de inhibición. Siguiendo la guía del CLSI (Clinical and Laboratory Standars institute), una zona de inhibición con un diámetro ≤ 21 mm fue considerada como resistente a meticilina, y con un valor ≥ 22 mm fue considerada como sensible (259). 68 69 3.2.3 BDMax™ MRSA Assay (Becton Dickinson) El test “BDMax™ MRSA Assay” es un ensayo diagnóstico cualitativo automatizado in vitro para la detección directa de ADN de S. aureus resistente a meticilina (SARM) a partir de hisopos nasales en pacientes con riesgo de colonización. El ensayo utiliza la PCR a tiempo real para la amplificación del ADN perteneciente a SARM y sondas de hibridación específicas marcadas con fluoróforos para la detección del amplificado. El ensayo detecta de forma simultánea la región SCCmec y una secuencia específica de S. aureus localizada en el gen orfX. Todas las muestras fueron procesadas siguiendo las recomendaciones del fabricante. 3.2.4 LightCycler® MRSA Advanced Test (Roche) El test “LightCycler® MRSA Advanced Test” (ROCHE) es un test diagnostico cualitativo in vitro para la detección directa de colonización nasal con SARM para ayudar en la prevención y control de las infecciones por MRSA en el ámbito hospitalario. La prueba está diseñada para detectar una secuencia propia indicativa de la integración de la región SCCmec en el cromosoma de S. aureus (unión del gen SCCmec/orfX), indicando la presencia del ADN perteneciente a MRSA. Todas las muestras fueron procesadas siguiendo las recomendaciones del fabricante y la PCR a tiempo real se llevó a cabo en el sistema LightCycler®. 3.2.5 Sistema Vitek®2 (bioMérieux) El Vitek®2 es un sistema totalmente automático que realiza la identificación bacteriana y el test de susceptibilidad antibiótica. Todas la muestras se analizaron usando a tarjeta “GP ID card” para la identificación de bacterias gram-positivas. Todas los aislados se procesaron siguiendo las indicaciones del fabricante. 3.2.6 Prueba de la coagulasa El criterio usado de forma más amplia y globalmente aceptado para la identificación de estafilococos asociados a una infección aguda está basado en la presencia del enzima coagulasa (260). El test “BBL™ Coagulase Plasma Rabbit with EDTA” (Beckton Dickinson) se usa para determinar cualitativamente la patogenicidad de los estafilococos usando el método directo e tubo. Las pruebas se llevaron a cabo siguiendo las recomendaciones el fabricante. 3.2.7 BDMax™ Staph SR (Bekton Dickinson) El test “BDMax™ Staph SR Assay” es un ensayo diagnóstico cualitativo in vitro automatizado para la detección directa de ADN de MRSA a partir de hisopos nasales de pacientes en riesgo de colonización. El test utiliza la PCR a tiempo real para la detección 69 76 3.4 MEJORA DE LA DETECCIÓN MOLECULAR (PCR DE VIABILIDAD) 3.4.1 Esquema general del protocolo de tratamiento con cisplatino en el test de viabilidad Como se indica a lo largo de los siguientes apartados, el test de viabilidad consiste en el tratamiento de una muestra en la que hay presente una cantidad de microorganismo vivo, muerto o ambos, para posteriormente ser capaz de, mediante PCR a tiempo real, llegar a una detección diferencial, de tal modo que sólo se lleve a cabo la amplificación del ADN de aquel microorganismo que esté vivo. En la Figura 22 se muestra de forma esquematizada el desarrollo general de los distintos ensayos del test de viabilidad. En los ensayos se parte siempre de dos grupos de muestras en duplicado: uno formado por bacterias vivas y otro por bacterias muertas, en las cuales uno de los duplicados se le aplica el tratamiento y el otro sirve como control para comparar los resultados. En los ensayos se añade un tercer grupo de muestras en las que las bacterias vivas y muertas se mezclan en iguales cantidades y se procesan igualmente en duplicado. El grupo de muestras no tratadas sufre las mismas incubaciones y procesos de lavado, lo único que cambia es que se les añade el mismo volumen de agua que volumen de sustancia de tratamiento es añadida a las tratadas. Una vez pasado el tratamiento y el lavado/ procesado para limpiar de sustancia sobrante que pueda interferir, se realiza la extracción de ácidos nucleicos en un sistema automático y se lleva a cabo la PCR a tiempo real para poder ver el efecto o no de inhibición del tratamiento y poder compararlo con los controles. Figura 22: Esquema general de los pasos de protocolo de viabilidad. 76 77 3.4.2 Cepa de referencia y preparación de la muestra Para llevar a cabo los diferentes ensayos se utilizó una cepa de colección para S. aureus resistente a meticilina con referencia ATCC 43300. Para su crecimiento la bacteria se sembró en placas de agar sangre y se dejó crecer a 37 ºC toda la noche. Las soluciones bacterianas se prepararon en agua a partir de la bacteria crecida en placa. Para ello se preparó una solución 0.5 McFarland, que luego se diluyó para conseguir una solución bacteriana con una concentración de 1E4 cfu/ml. Una vez conseguida la concentración de trabajo se realizaba una siembra en placa para comprobar el crecimiento y poder comparar con los resultados. Como para los diferentes ensayos es necesario contar con dos poblaciones distintas de bacterias, vivas y muertas, a partir de la solución obtenida se retiró una parte y se sometió a un shock térmico en un baño a 80 ºC durante tres minutos para así matar las bacterias, y se pasó inmediatamente a hielo para atemperar la solución. Para establecer estas condiciones de incubación se realizaron varios experimentos con tiempos de incubación entre 1 y 10 minutos, con incrementos de 1 minuto, y con la posterior siembra en placa de 100 μl de la solución de bacterias e incubación durante al menos 24 horas para comprobar la presencia o ausencia de crecimiento. Para las pruebas realizadas a partir de sangre, las bacterias se obtuvieron del mismo modo mencionado arriba, y a continuación se añadieron a la sangre para obtener la misma concentración teórica de 1E4 cfu/ml. 3.4.3 Extracción de ácidos nucleicos y detección mediante PCR a tiempo real Para llevar a cabo la extracción de ADN y su posterior detección, se utilizaron dos de los sistemas automáticos de extracción y su sistema de PCR a tiempo real correspondiente disponibles en nuestro laboratorio para su uso en la rutina diagnóstica. Por un lado se usó el sistema de extracción MagNA Pure (Roche) y su sistema independiente para detección LightCycler (Roche) usando el kit de detección múltiple de microorganismos SeptiFast (Roche). El sistema MagNA Pure es un sistema de extracción automático que utiliza la lisis enzimática de la muestra y nanopartículas magnéticas para la captura de los ácidos nucleicos. El sistema LightCycler es un termociclador para realizar PCR a tiempo real que utiliza capilares que se calientan por corriente de aire. El kit de PCR SeptiFast consiste en una multiplex RT-PCR para la detección simultánea de 24 microorganismos con implicación en cuadros de sepsis. Para ello consta de tres mezclas distintas de reacción correspondientes a los microorganismos agrupados en gram positivos, gram negativos y hongos. En la extracción se parte de 400 μl de muestra y se recuperan 200 μl de eluído, de los que se usarán para la PCR 50 μl para cada para cada grupo de 77 78 microorganismos con 50 μl de la mezcla correspondiente de PCR. Los mismos volúmenes se usan para los controles positivos y negativo en la misma PCR. El otro sistema que se usó es el BD MAX (Beckton Dikinson) es un sistema automático con extracción y PCR integrados en el mismo sistema. El método de extracción está basado en la lisis enzimática y el uso nanopartículas magnéticas para la captura de los ácidos nucleicos. El sistema tiene incorporados dos termocicladores para realizar PCR a tiempo real con pequeños volúmenes de reacción (PCR microfluídica). Para realizar los experimentos en esta plataforma se usó el kit MRSA XT (Beckton Dikinson) para la detección de S. aureus resistente a meticilina. El volumen necesario para realizar la prueba es de 200 μl. 3.4.4 Búsqueda de sustancias Se usaron distintas sustancias que fueran impermeables frente a una membrana íntegra, pero con un tamaño suficiente para ser permeables a membranas dañadas. Además, debían ser susceptibles de tener cierta afinidad o actividad sobre los ácidos nucleicos, ya fuese por unión estable a los mismos o por un efecto de degradación, pudiendo así afectar a la capacidad de ser amplificado y detectado mediante PCR. Distintas sustancias fueron probadas sobre soluciones de bacterias muertas comparadas con bacterias vivas para comprobar el posible efecto sobre la amplificación mediante PCR, así como la posible toxicidad o algún efecto detectable en las bacterias vivas. Las sustancias fueron el EMA (Ethidium monoazide bromide) como agente colorante para tinciones por su afinidad al ADN y distintos citostáticos (cisplatino, oxaliplatino, mitromicina, chromomicina, 5-fluoracilo, camptotecina, amsacrina, mitoxantrona, elipticina, etoposido) con actividad sobre el ADN en quimioterapia. 3.4.4.1 Monoazida de Etidio (EMA) Se trata de una sustancia colorante intercalante del ADN que sólo puede atravesar las membranas dañadas de bacterias muertas, ya que es prácticamente impermeable al paso a través de estas, y que se une covalentemente al ADN celular tras su activación con luz. Para realizar las pruebas se usó EMA suministrado por Sigma-Aldrich (Ethidium Monoazide Bromide, Ref: 22028). 3.4.4.2 Cisplatino y Oxaliplatino El cisplatino (Cis-Diammineplatinum(II) dichloride; ref: P4394, SIGMAALDRICH) y el oxaliplatino (Oxaliplatin; ref: O9512, SIGMA-ALDRICH) (Figura 23) son medicamentos usados en quimioterapia para el tratamiento de varios tipos de cáncer. Estos complejos basados en el platino son agentes alquilantes que reaccionan in vivo con el ADN celular mediante puentes cruzados entre las bases, impidiendo así la replicación y la transcripción y causando la apoptosis de la célula. Debido a esta afinidad por el 78 79 ADN, se presentaban como moléculas candidatas a ser probadas para desarrollar el protocolo de viabilidad. Ambos compuestos fueron resuspendidos usando solución salina al 0,9 %, que se usó también para preparar las correspondientes diluciones. Figura 23: Imagen mostrando la estructura molecular del cisplatino (parte superior) y del oxaliplatino (parte inferior). 3.4.4.3 Otras sustancias con efecto citostático El resto de sustancias probadas fueron suministrados por la casa comercial Sigma- Aldrich (chromomicina (Ref: C2659); 5-fluoracilo; camptotecina (Ref: C9911); amsacrina (Ref: A9809); mitoxantrona (Ref: M6545); elipticina (Ref: E3380); etoposido (Ref: E1383). Para resuspenderlos se utilizó solución salina al 0,9%. Todos ellos fueron probados a distintas concentraciones (200 y 350 μg/ ml) para valorar su actividad sobre bacterias vivas y muertas. Las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los lavados para recuperar las bacterias y eliminar los restos de sustancias se hicieron mediante centrifugación a 12.000 rcf durante 5 minutos. 3.4.5 Pruebas con Monoazida de Etidio (EMA) Para estas pruebas nos basamos en la metodología general disponible en un buen número de publicaciones (230, 263, 252), pero combinando algunas condiciones debido a la variación entre artículos en parámetros como la concentración de tratamiento o tiempos de incubación y exposición. La forma en la que se obtuvieron las bacterias vivas y muertas, así como la cepa de referencia de S. aureus utilizada, son las indicadas en puntos anteriores. Siguiendo lo viso en la literatura, el EMA fue resuspendido en DMSO al 20%. Las soluciones de trabajo se prepararon a diferentes concentraciones para realizar el tratamiento. Las concentraciones de tratamiento final probadas fueron de 1.5, 5, 10 μg/ml finales de 79 80 EMA. Se usaron 750 μl de bacterias vivas y muertas por duplicado. A uno de los duplicados de cada grupo de bacterias se le añadió 750 μl de EMA y se dejaron incubar durante 5 minutos en hielo y en oscuridad envuelto en papel de aluminio. A continuación se les quito el papel de aluminio, y sobre el hielo se expusieron a una fuente de luz situada a 20 cm durante 5 minutos. Para ello se usó una lámpara halógena de 500 W. A continuación se centrifugaron las muestras a 12.000 rcf durante 5 minutos y se recuperaron en el mismo volumen de partida de la muestra, para a continuación realizar la extracción de ácidos nucleicos y la posterior detección por PCR a tiempo real. Para el sistema de Extracción MagNA Pure se usaron 400 μL de muestra y el eluído se usó para la PCR en el sistema LightCycler. Para el sistema BD MAX se usaron 200 μL de muestra y el sistema realizó de forma automática y continuada la extracción y la PCR a tiempo real. 3.4.6 Prueba de control con ADN libre tratado con cisplatino Ante la falta de referencias de un uso parecido para esta sustancia, se hizo esta prueba de unión a ADN libre. Para probar la unión del cisplatino al ADN, y comprobar su posible efecto inhibitorio de la amplificación mediante PCR, se usó directamente una solución con ADN libre a la que se le añadió el cisplatino. Como solución de ADN se usó uno de los controles positivos de la PCR a tiempo real comercial SeptiFast (Roche) que detecta de forma simultánea hasta 24 microorganismos. En el ensayo de PCR se usó el cisplatino y los controles positivos por separado (haciendo de blanco y de control de amplificación respectivamente), así como una serie de muestras con distintas proporciones de solución de ADN y cisplatino, que se dejaron incubar a temperatura ambiente 10 minutos antes de usarlos para la amplificación. Las muestras del experimento se muestran en la Tabla 6. Tabla 6: Listado con las muestras usadas en la prueba de amplificación con cisplatino. 1 Cisplatino 1.400 μg/ml (50 μl) 2 RC G(-) (50 μl) 3 RC G(-) (50 μl) 4 50 μl RC G(-) + 10 μl Cisplatino 1.400 μg/ml 5 50 μl RC G(-) + 30 μl Cisplatino 1.400 μg/ml 6 50 μl RC G(-) + 50 μl Cisplatino 1.400 μg/ml 7 50 μl RC G(-) + 70 μl Cisplatino 1.400 μg/ml 8 50 μl RC G(-) + 90 μl Cisplatino 1.400 μg/ml 9 25 μl RC G(-) + 50 μl Cisplatino 1.400 μg/ml 80 81 3.4.7 Condiciones iniciales de trabajo con cisplatino Para establecer las condiciones finales de trabajo se probaron distintas condiciones de concentración de tratamiento con cisplatino, así como tiempos y temperaturas de incubación de dicho tratamiento. Inicialmente, se probaron en el sistema LightCycler unas condiciones de incubación a temperatura ambiente, durante 10 minutos, y con unas concentraciones de 200 y 250 μg/ml. El siguiente paso en este sistema fue cambiar las condiciones amentando la concentración del cisplatino a 350 μg/ml con unos tiempos de incubación de 35 y 45 minutos. En este punto se intentó comparar ciertas condiciones de forma paralela en el sistema BD MAX y en LightCycler. Las condiciones a comparar consistieron en un tiempo de incubación de 45 minutos, con una concentración de cisplatino de 350 μg/ml, y con una temperatura de incubación de 37 ºC. El uso de esta temperatura se basó en el hecho de que el cisplatino tiene un uso como agente quimioterápico en humanos inyectándose en sangre, y por tanto está actuando a temperatura corporal. Finalmente, se probó en el sistema BD MAX un aumento de la concentración a 700 μg/ml manteniendo el tiempo (45 minutos) y la temperatura de incubación (37ºC). Estas condiciones son las que finalmente se adoptaron para el protocolo. Los detalles de los distintos pasos del protocolo usando estas condiciones se explican en los siguientes apartados. Cuando hablamos de concentración de cisplatino, nos referimos siempre a concentración de tratamiento final. Es decir, la resultante tras añadir el volumen de cisplatino a la muestra con bacterias. 3.4.8 Pruebas de tratamiento con oxaliplatino Tras los ensayos realizados con el cisplatino se decidió probar otro compuesto derivado del mismo. En los ensayos con el oxaliplatino se usaron algunas de las condiciones de trabajo usadas con el cisplatino usando los mismos pasos. 3.4.9 Protocolo de tratamiento con cisplatino usando centrifugación Una vez establecidas las condiciones del ensayo, el proceso completo de detección selectiva de bacterias vivas sería el siguiente: A partir de la bacteria crecida en placa (SARM ATCC 43300), se preparó una solución 0,5 McFarland en agua, que luego se ajustó haciendo una dilución 1/100 a una concentración aproximada de 1E4 cfu/ml. Esta solución bacteriana fue dividida en dos, y una de esas partes se sometió a un shock térmico poniéndola en un baño a 80ºC durante 3 minutos para conseguir el grupo de bacterias muertas, pasándolas a continuación a hielo unos minutos para atemperar la solución y evitar un deterioro excesivo por acción del calor. La otra porción de la solución bacteriana serán las bacterias vivas. Hicimos una 81 82 siembra en placa de agar sangre tanto de bacterias vivas (10 μl) como de las muertas (100 μl) para comprobar si realmente había o no crecimiento, respectivamente. A continuación, y para cada una de las dos soluciones, se transfirió 1 ml de bacterias a dos tubos nuevos, obteniendo así dos muestras por cada una de las soluciones bacterianas: una de ellas a modo de control sólo con bacterias, y el otro con bacterias a las que se le añadirá cisplatino para ser tratadas. Una vez preparadas las muestras, necesitamos preparar una solución de cisplatino a una concentración adecuada para el tratamiento posterior. La muestra y el cisplatino se mezclarán en volúmenes iguales, por lo que el cisplatino se preparó al doble de concentración de la requerida para el tratamiento. Por eso se preparó el cisplatino a una concentración de 1.400 μg/ml. Tanto para resuspender como para preparar las diluciones de cisplatino se debe usar solución salina al 0,9% de cloruro sódico. Una vez listo el cisplatino, se añadió 1 ml sólo en los tubos de las muestras que iban a ser tratadas, dejando a su par correspondiente sin cisplatino para usarlo como control. Una vez añadido el cisplatino, mezclamos por inversión varias veces e incubamos en estufa a 37ºC durante 45 minutos en un agitador orbital. Aquellos tubos que no llevan cisplatino también se sometieron a esta incubación, y seguieron el mismo proceso que los otros en todo momento. Tras la incubación, para eliminar los restos de la solución de cisplatino y evitar su interferencia en la detección, se centrifugaron los tubos a 12.000 rcf durante 5 minutos, descartando después el sobrenadante y lavando en 1 ml de agua. A continuación, volvimos a centrifugar a 12.000 rcf durante 5 minutos, eliminando posteriormente el sobrenadante y recuperando en 1 ml de agua. Estas centrifugaciones se hicieron a todas las muestras, las tratadas y las no tratadas con cisplatino. Una vez recuperadas las muestras, ya se puede realizar la extracción de ácidos nucleicos para poder hacer la detección por PCR a tiempo real. Este proceso se llevó a cabo en dos sistemas distintos, bien de forma individual o de forma simultánea en ambos. Para continuar con el sistema automático BD MAX fue necesario transferir 200 μl de nuestra solución al tubo de muestra del kit de extracción, mezclar por vorteado, colocar los reactivos de extracción y de PCR del kit en la tira de reacción, e introducirlo todo en el sistema. En este, todo el proceso se llevó a cabo de forma automatizada sin necesidad de más manipulación hasta el momento de la visualización del resultado final. Cuando el proceso se continúa haciendo con el sistema automático de extracción MagNA Pure, se necesitó traspasar 400 μl de la muestra a un tubo de muestra vacío que se situará en el sistema junto con el resto de reactivos para la extracción. Una vez acabada la esta, se recuperó el eluído (200 μl), y se usaron 50 μl con 50 μl del reactivo del kit de PCR a tiempo real SeptiFast para realizar la amplificación en el termociclador LightCycler. 82 83 3.4.10 Mezcla de bacterias vías y muertas (VM) Para comprobar el funcionamiento del protocolo en una mezcla heterogénea, se realizó el mismo tratamiento pero a una muestra compuesta por la mezcla de bacterias vivas y muertes. Las soluciones bacterianas se prepararon en la misma concentración y del mismo modo que en el protocolo ya citado, y luego se mezclaron en volúmenes iguales para constituir la muestra de trabajo. El protocolo se llevó a cabo de la forma habitual, sometiendo al tratamiento con cisplatino sólo a uno de los duplicados de la muestra, dejando al otro como control. 3.4.11 Protocolo de tratamiento con cisplatino en sangre usando centrifugaciones Para probar el efecto del tratamiento en una muestra real, se usó sangre de pacientes sanos, a la que se le añadió bacterias para asemejarla a una muestra clínica de un paciente con sepsis. Como se menciona a continuación, las bacterias en sangre se intentaron recuperar por centrifugación previamente al tratamiento con cisplatino, ya que este muestra afinidad para unirse a proteínas, además de poder interactuar con la fracción celular de la sangre, lo que haría difícil controlar las condiciones del tratamiento para realizar el test. A partir de la bacteria crecida en placa se preparó una solución 0,5 McFarland. A partir de esta, se tomó parte de la solución y se sometío a un shock térmico en un baño a 80 ºC durante 3 minutos para conseguir las bacterias muertas necesarias para la prueba, y se pasaron inmediatamente a hielo para atemperar la solución. A partir de las dos soluciones que obtuvimos ahora (bacterias vivas y muertas), se hizo una dilución directamente en sangre para conseguir una concentración aproximada de 1E4 cfu/ml para cada una. La sangre con bacterias se dejó entre 5-10 minutos en agitación a temperatura ambiente para que se mezclasen las bacterias en la totalidad de la muestra. A continuación, cada muestra se dividió en dos para que, a la hora del tratamiento con cisplatino, añadírselo solamente a uno de los tubos de cada grupo (a un tubo con bacterias vivas y a un tubo con bacterias muertas). Así nos quedamos con un duplicado que servirá como control para cada grupo. Además, se usó también una porción de la sangre sin bacterias que se usó como blanco. Tanto para la sangre con bacterias como para el blanco, el volumen total fue de 1 ml. A continuación, las muestras fueron centrifugadas a 150 rcf durante 5 minutos y se recuperaron los sobrenadantes. Estos se centrifugaron a 20.000 rcf durante 2 minutos, se eliminó el sobrenadante, se resuspendieron en 1 ml de agua y se centrifugaron de nuevo (20.000 rcf, 2 minutos). A continuación se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en 1 ml de agua. Una vez recuperadas las muestras, añadimos 1 ml de cisplatino a 1.400 μg/ml a uno de los duplicados de bacterias vivas y de bacterias muertas, y al otro duplicado y al blanco se les añadió 1 ml de agua para completar el volumen. Todas las muestras se incubaron a 37 ºC durante 45 minutos en un agitador orbital. Al finalizar la incubación, las muestras se 83 84 centrifugaron a 12.000 rcf durante dos minutos, se eliminó el sobrenadante, y se resuspendieron en 1 ml de agua. Repetimos este paso y ya obtuvimos la muestra final lista para el proceso de extracción y detección. En este punto, podemos usar la muestra para extraer sólo en uno de los sistemas o por ambos a la vez. Para llevar a cabo la extracción y detección en el sistema BD MAX, se necesita poner 200 μl de muestra en el tubo de extracción con tampón, preparar los reactivos de extracción y de PCR a tiempo real del kit, y lanzar el experimento. Para el sistema MagNA Pure se usan 400 μL de la muestra, y posteriormente 50 μL del ADN extraído para la PRC en el sistema LightCycler. 3.5 NANOPARTÍCULAS Y VIABILIDAD (TEST DE VIABILIDAD) 3.5.1 Captura de bacterias muertas Para asegurar la utilidad de las nanopartículas para la captura no sólo de bacterias vivas, se realizaron pruebas de captura en el mismo modo que previamente se probara para determinar la captura con distintos microorganismo vivos. De esto modo garantizaríamos la utilidad para la detección en el protocolo de viabilidad. El procedimiento consistió en preparar una solución bacteriana en agua a una concentración teórica de 1E4 cfu/ml con la cepa de referencia ya usada (S. aureus ATCC 43300). Parte de esta solución se introdujo en un baño a 80 ºC durante 3 minutos y se pasó a hielo para atemperar. Tanto la bacteria viva como la muerta se sembraron en placa de agar sangre para estimar la cantidad aproximada de colonias usadas, así como para comprobar la ausencia de crecimiento, respectivamente. En el caso de las vivas se sembraron 10 μl, y 100 μl en el caso de las muertas, y se incubaron a 37 ºC. Con ambas partículas (NANO MR y ApoH) se siguió el mismo procedimiento de separación indicado en los apartados anteriores y usando el sistema automático BD MAX con el kit de detección MRSA XT para la detección por PCR a tiempo real. 3.5.2 Sistema automático usado en los ensayos con partículas Para llevar a cabo los ensayos del test de viabilidad usando nanopartículas magnéticas, y a pesar de que en ambos sistemas la extracción de ácidos nucleicos y su detección se mostró compatible con el uso de ambas, finalmente se optó por llevarlos a cabo únicamente en el sistema BD MAX con el kit de detección MRSA XT. Esta decisión fue basada en los resultados de los experimentos previos y en la facilidad de manejo de este sistema, por integrar de forma automática en un mismo aparato la fase de extracción y de amplificación. 84 85 3.5.3 Protocolo viabilidad en solución con las nanopartículas de NANO MR Para llevar a cabo las pruebas se siguió el mismo protocolo ya descrito, pero cambiando las centrifugaciones de recuperación de bacterias y de lavado del cisplatino por el uso de nanopartículas magnéticas de unión específica a microorganismos. A partir de la bacteria crecida en placa (S. aureus ATCC 43300), se preparó una solución 0,5 McFarland en agua que luego se ajustó a una concentración aproximada de 1E4 cfu/ml. Esta solución bacteriana fue dividida en dos, y una de esas partes la sometimos a un shock térmico poniéndola en un baño a 80ºC durante 3 minutos para conseguir el grupo de bacterias muertas, pasándolas a continuación a hielo unos minutos para atemperar la solución y evitar un deterioro excesivo por acción del calor. La otra porción de la solución bacteriana serán las bacterias vivas. Hicimos una siembra en placa de agar sangre tanto de bacterias vivas (10 μl) como de las muertas (100 μl) para comprobar si realmente había o no crecimiento respectivamente. A continuación, y para cada una de las dos soluciones, se pasó 1 ml o 500 μl (partículas NANO MR y ApoH, respectivamente) de bacterias a dos tubos nuevos, obteniendo así dos muestras por cada una de las soluciones bacterianas: una de ellas a modo de control sólo con bacterias, y el otro con bacterias a las que se le añadirá cisplatino para ser tratadas en pasos posteriores. En este punto es donde preparamos cada una de las nanopartículas para poder añadirlas a las soluciones bacterianas para recuperar las bacterias. Las partículas de NANO MR se proporcionan en forma de esfera sólida, por lo que es necesario resuspenderlas con 10 ml de un tampón de unión propio del kit. Una vez en modo líquido, se añadió 1 ml de partículas en cada tubo con 1 ml de bacterias. A continuación se incubaron a 37 ºC durante 35 minutos en un agitador orbital para garantizar que las partículas se mezclasen continuamente a través de toda la muestra. Al finalizar la incubación, los tubos se pusieron en un imán durante 10 minutos a temperatura ambiente, y luego se retiró el líquido. Se añadieron 2 ml de tampón de lavado, se resuspendieron de nuevo las partículas, y se situaron otra vez los tubos 5 minutos en el imán. Este paso se repitió una vez más, y finalmente eliminamos el líquido, recuperando las partículas en 1 ml de agua. Una vez recuperadas las partículas con las bacterias unidas, se sembraron 10 μl de cada tubo para comprobar que seguía habiendo crecimiento o no, según correspondiese. Cuando se recuperan las bacterias unidas a las partículas ya se le puede añadir el cisplatino preparado a 1.400 μg/ml sólo a uno de los duplicados de cada grupo de muestras (vivas y muertas). Añadimos 1 ml de cisplatino sobre 1 ml de muestra recuperada con las partículas. A los duplicados que no se les añadió cisplatino se les añadió igual volumen de agua. Se mezclaron bien y se incubaronn todas las muestras a 37 ºC durante 45 minutos con agitación continua en un agitador orbital. Tras la incubación, se pusieron todas las muestras en el imán durante 10 minutos a temperatura 85 92 92 93 4.1 NANOPARTÍCULAS Y EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (ADSORCIÓN INESPECÍFICA) 4.1.1 Valoración inicial del rendimiento con el sistema comercial HAMILTON kPCR (SIEMENS) Tras las extracciones realizadas con las mezclas de plásmidos, nos encontramos con que en las concentraciones elevadas de nuestras series es donde el sistema parece tener un menor rendimiento y posiblemente se sature la capacidad de unión de las partículas, tanto por su propio tamaño como por la concentración a la que se encuentran. Aún así, se ve una rápida subida en el rendimiento del ADN recuperado que en algunos de los puntos alcanzó valores entre el 18 y 20 %. De todos modos, en la Tabla 7 se muestran de forma resumida los valores medios de los resultados obtenidos en los ensayos. Tabla 7: Tabla con un resumen de los valores medios de las cantidades de ADN introducido y recuperado del sistema, así como del rendimiento de esa extracción. 4.1.2 Valoración de nuevas nanopartículas en el sistema HAMILTON kPCR (SIEMENS) Al realizar las extracciones de ADN plasmídico usando nuestras nanopartículas, y llevar a cabo las mediciones y estimar las concentraciones de ADN recuperado y el porcentaje recuperado para calcular el rendimiento, nos encontramos con unos porcentajes muy bajos de recuperación. De hecho, con muchas de las partículas estos se mueven por valores inferiores al 0,1 % incluso en los puntos de concentraciones más elevada, aunque con una tendencia a mejorar a medida que disminuía la cantidad inicial de ADN en la muestra. De todas las partículas mencionadas, solamente las FeO-2206 destacan con unos valores mayores, que se sitúan en torno al 6% (de valor medio en los μg totales de inicio μg totales de recuperados Rendimiento (%) 212 1,866 0,88 86,6 1,398 1,614 39,9 1,364 3,419 18,140 1,015 5,595 8,640 0,816 9,443 4,030 0,494 12,256 1,907 0,305 15,998 0,929 0,119 12,809 0,450 0,054 11,71 0,222 0,029 13,140 0,108 0,014 13,03 93 94 mejores casos), cuando nos fijamos en aquellas muestras con menos cantidad de ADN de partida. En las siguientes figuras se muestra la representación gráfica de los resultados de las partículas FeO-2206, FeO-2202 y FeO-2204. En la Figura 24 se puede ver una gráfica comparativa entre las tres partículas donde se ve una clara diferencia en la cantidad total de ADN recuperada, sobre todo en los puntos iniciales que corresponden a las muestras de partida con más cantidad inicial de ADN. Algo similar podemos ver fijándonos en la Figura 25, donde se representan los valores medios del rendimiento en la extracción (porcentaje extraído) de cada una de las partículas. Se puede ver nuevamente el mejor funcionamiento de las partículas 2206 respecto a las otras, y mostrando los mejores porcentajes de recuperación en condiciones de poca cantidad de ADN de partida. Figura 24: Comparativa de la cantidad total de ADN recuperado en μg totales entre las tres partículas. Los valores debajo de cada grupo de barras se corresponden con las cantidades totales iniciales (valores medios) de ADN en μg introducidas en el sistema en orden decreciente. 94 95 Figura 25: Comparativa del rendimiento global de la extracción (%) de ADN para las tres partículas. Las otras partículas, FeO-2206-APS, FeO-2207 y FeO-2207-APS, muestran valores aún más bajos (por debajo de 0,1% de recuperación), por lo que no se muestran en la gráfica ya que no aportan más información y las curvas sólo se superpondrían como ya lo hacen las mostradas en el gráfico. 4.1.3 Comparativa con la medida de referencia en el HAMILTON kPCR Como la única partícula con resultados susceptibles de ser válidos y comparables fue la FeO-2206, es esta la única que usaremos para comparar con las pruebas iniciales realizadas con el sistema HAMILTON kPCR tomado como referencia. En la Figura 26 podemos ver como a la hora de comparar el total de ADN extraído, las partículas 2206 parecen ser ligeramente inferiores en su capacidad de recuperación mientras que esa capacidad se iguala en algunos puntos, y en otros hasta parece mejorar cuando nos fijamos en los puntos finales correspondientes a menores cantidades de ADN de inicio. De todos modos, si nos fijamos en los valores numéricos en la parte baja del gráfico, nos encontramos con una relación bastante pareja entre el sistema original y el uso de las partículas 2206. 95 96 Figura 26: Comparación de los valores de ADN total extraído por el sistema HAMILTON kPCR usando sus propias partículas con el uso de las partículas 2206. Desde el punto uno al ocho se representa la cantidad inicial de ADN en orden decreciente. 4.1.4 Funcionalización de las partículas Las partículas funcionalizadas con APS con el objetivo de mejorar la unión del ADN y mejorar la recuperación se llevó a cabo con las dos partículas ya descritas y denominadas como FeO-2206-APS y FeO-2207-APS. La principal diferencia en el diseño de estas partículas radica en las dimensiones del núcleo de magnetita, ya que en la FeO-2207-APS tiene casi el doble de diámetro. Como ya se mencionó en el punto anterior, no se consiguió realizar extracciones con una cantidad de ADN destacable, volviendo a encontrar valores por debajo del 0,1 % en el caso de las FeO-2206-APS, e incluso llegando a puntos sin detección de ADN en el caso de las FeO-2207-APS. Por ese motivo no se muestra ninguna gráfica con referencia a ningún dato numérico. 4.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DEL STHAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A METICILINA Tras el primer análisis para los 101 aislados de MRSA con las dos técnicas moleculares (BDMax™ MRSA Assay y LightCycler® MRSA Advanced Test) nos encontramos con resultados distintos entre ambas técnicas. Se obtienen un total de 84 aislados positivos por ambas técnicas, un total de 10 aislados negativos en ambos 96 97 sistemas, y un total de 7 aislados fueron positivos en el sistema BD MAX y negativos en el sistema Lightcycler. Todos los aislados negativos se volvieron a repetir con ambas técnicas para confirma los resultados. Además, para intentar explicar estos resultados negativos, se llevaron a cabo dos nuevos tests a estos aislados. Estos dos ensayos fueron el sistema de identificación Vitek®2 y el test de la coagulasa. Los resultados obtenidos mostraron que tres de los aislados que se mantenían como negativos en el reanálisis fueron identificados por el Vitek®2 y el test de la coagulasa como S. epidermidis, y por tanto se retiraron del grupo de estudio. Por otro lado, en el reanálisis con las dos técnicas moleculares, otros tres aislados resultaron positivos por el sistema BD MAX, pero se mantuvieron como negativos en el sistema LightCycler. Además, estos tres aislados fueron confirmados como SARM con los resultados obtenidos en el Vitek®2 y con la prueba de la coagulasa. De este modo, tras el reanálisis de los aislados con resultado discrepante, obtendríamos los siguientes valores. Tendríamos un total de 84 aislados positivos con ambas técnicas moleculares, un total de 4 aislados negativos en ambos sistemas, y un total de 10 aislados positivos en BD MAX y negativos en LightCycler. Un resumen global de estos datos se muestra en la Figura 27. . Figura 27: Resultados globales para el análisis de la detección de MRSA usando las técnicas de de los sistemas BD Max y ROCHE. 97 98 Como ya se mencionó, se usaron otras técnicas con el objetivo de esclarecer estos resultados negativos obtenidos en ambos sistemas. Por un lado se usó el kit “BD MAX Staph SR” en todos los aislados, negativos y positivos. Lo que nos encontramos es un cambio en el resultado para dos de ellos: uno con resultado positivo con el test “BDMax™ MRSA Assay” resultaría ahora negativo, y uno negativo sería positivo con este nuevo test. Al mismo tiempo, se realizó el análisis de distancias genómicas usando el ensayo “Diversilab™ Staphylococcus kit” (bioMerieux). Con el uso de esta tecnología fuimos capaces de comparar los diferentes aislados y encontrar una cierta agrupación de los mismos. Como se ve en la Figura 28, los aislados negativos y los positivos usados como controles, están ordenados por proximidad genómica, por patrón electroforético y con valores de proximidad en porcentaje. Al contrario de lo esperado, los grupos de muestras negativas (POS BD MAX/ NEG ROCHE y NEG BD MAX/ NEG ROCHE) aparecen mezcladas dentro de los mismos grupos. De este modo, este análisis no nos permite discriminar diferencias genéticas claras que puedan explicar las discrepancias de resultados entre ambos sistemas, mostrándonos que el BD MAX puede detectar algunas muestras pero no otras con al menos un 95% de homología. Figura 28: Análisis de distancias genéticas usando rep-PCR obteniendo un dendrograma con los aislados ordenados por similitud genética, por patrón electroforético y con los valores de porcentaje de similitud entre ellas. En cuadros amarillos se muestran los aislados negativos para ambos sistemas. En cuadros rojos los aislados positivos para BD MAX y negativos para Lightcycler. Sin cuadro se muestran muestras positivas por ambos sistemas usadas como controles. 98 99 Para obtener más información de estos aislados, se usaron otras dos técnicas moleculares, “GenoType® MRSA test” y “FluoroType® MRSA test” (HAIN Lifescience). Con el ensayo GenoType® MRSA, todas las muestras fueron positivas para el gen meca, a pesar de su resultado negativo con al menos una de las técnicas iniciales. Además, tres de ellas fueron identificadas como SARM adquiridos en la comunidad por la detección del factor PVL. Con el ensayo FluoroType® MRSA solo tres muestras seguían siendo negativas para MRSA. El análisis realizado mediante la espectrometría de masas identificó a todos los aislados como S. aureus, confirmando lo que el resto de ensayos nos indicaban. Cuando se realizó el análisis de los espectros para cada aislado (al menos 20) para obtener un espectro único de referencia, se pudo realizar una comparación de la similitud entre aislados con un dendrograma que nos indicaría las distancias entre ellos. En la Figura 29 se muestra el dendrograma resultante para los aislados discrepantes, donde las diferencias entre ellos se representan por las distancias entre cada rama. Lo que podemos ver claramente es una agrupación de los aislados. Por un lado, los cuatro aislados inicialmente negativos para ambos sistemas se encuentran en la parte superior del dendrograma, claramente separados de los aislados con resultado positivo para BD MAX y negativo para LightCycler. Y ambos grupos separados por la cepa de referencia ATCC 43300 para MRSA. Esto parece indicarnos una cierta diferencia entre los aislados, lo que podría influir a la hora de la detección en cada uno de los ensayos moleculares. Figura 29: Dendrograma obtenido mediante el análisis de los espectros obtenidos mediante espectrometría de masas donde se ven los dos grupos de aislados con resultado negativo para MRSA claramente separados y agrupados. 99 100 Aunque esta información parecía indicar cierta diferencia entre estos aislados, la posibilidad de obtener una caracterización genética más completa que nos pudiese explicar los resultados nos llevó a realizar un tipado basado en un ensayo de PCR para definir el tipo de SCCmec al que pertenece cada uno. Tras el análisis electroforético de los amplificados, nos encontramos con cuatro tipos distinto de SCCmec entre nuestros aislados: 2 de ellos pertenecientes el Tipo V, 2 al Tipo II, 7 al tipo IV y 2 al Tipo III. Además, para dos de los aislados no fue posible asignarles a un tipo concreto tras repetir la PCR. Estos datos se relacionaron con el dendrograma obtenido por el análisis mediante espectrometría de masas para intentar identificar la posible formación de grupos (Figura 30). En la Tabla 8 se muestra un resumen de los resultados obtenidos para los aislados discrepantes con todas las técnicas usadas. Tabla 8: Resumen de los resultados obtenidos en el análisis de aquellos aislados discrepantes para su asignación como MRSA. En rojo se muestran los aislados que inicialmente fueron positivos para BD MAX y negativos para LightCycler. En amarillo se muestran aquellos que fueron negativos inicialmente con ambos sistemas. 100 101 Figura 30: Asiganción de los Tipos SCCmec obtenidos mediante PCR para cada aislado sobre el dendrogrma obtenido mediante espectrometría de masas. 4.3 DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE ADSORCIÓN ESPECÍFICA CON NANOPARTÍCULAS 4.3.1 Pruebas de captura de microorganismos: partículas NANO MR Cuando se realizaron las pruebas de captura de microorganismos con estas partículas se observó que, tras introducir la solución final de partículas en el sistema de extracción MagNA Pure y realizar la amplificación en el sistema LightCycler usando el kit de detección SeptiFast, todos los microorganismos usados fueron detectados por PCR a tiempo real en base al análisis de las temperaturas de melting de los amplificados. Lo único negativo a destacar es el hecho de que para E. faecium se obtienen picos de melting siempre muy próximos a la línea base indicando poca señal. Cuando este microorganismo se prueba de forma individual, los resultados se mantienen. Cuando la prueba fue realizada en el sistema automático BD MAX con el kit de detección MRSA XT, se vio también que la amplificación era positiva para las muestras usadas. Lo que también se vio con estos resultados fue la compatibilidad de estas partículas de adsorción específica a microorganismos para ser usadas en ambos sistemas automáticos de extracción, también basado en partículas magnéticas, pero de adsorción inespecífica a ácidos nucleicos. Una muestra de los resultados obtenidos se puede ver en 101 108 Figura 39: Resumen de resultados de amplificación obtenidos en el sistema LightCycler para distintas concentraciones de tratamiento con EMA. Al ver los resultados obtenidos en el sistema BD MAX (Figura 40), vemos como al mismo tiempo que se nota un cierto efecto de inhibición sobre las bacterias muertas, reflejado en un atraso claro en el inicio de la amplificación, se nota también el mismo efecto sobre el grupo de bacterias vivas. Y este efecto se acentúa en ambos grupos de bacterias al aumentar al aumentar la concentración de tratamiento con EMA. Figura 40: Resumen de resultados de amplificación obtenidos en el sistema BD MAX para distintas concentraciones de tratamiento con EMA. 108 109 4.4.2 Prueba de control de cisplatino con ADN libre Al realizar la prueba de amplificación de ADN libre mezclado con cisplatino, lo que nos encontramos es que ninguna de las muestras que llevan el citostático es amplificada, así como aquellas que llevan únicamente el citostático. Además, se ve que los controles de ADN a los que no se le añadió el cisplatino tienen una amplificación clara. El resultado se puede ver en laFigura 41. Figura 41: Curvas de amplificación y picos de melting para la prueba de ADN libre mezclado con cisplatino. 4.4.3 Condiciones iniciales de trabajo con cisplatino Con los primeros ensayos usando cisplatino y en la plataforma LigthCycler nos encontramos con un ligero efecto sobre las bacterias muertas. En la Figura 42 se muestra el resultado de uno de los ensayos, en los que se usó cisplatino con incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos a concentraciones de 200 y 250 μg/ml. En la imagen de la izquierda se muestra el grupo de bacterias vivas (tratadas y no tratadas), donde no se percibe efecto de atraso en las curvas de amplificación. En la imagen de la derecha se puede ver el grupo de bacterias muertas, y como aquellas que fueron tratadas muestran un ligero pero perceptible atraso en el punto de inicio de la amplificación, así como en la altura de las curvas. En la Tabla 10 se muestran los valores numéricos parra los Ct de cada muestra donde se ven los ligeros efectos de retardo en la amplificación de 3 y 4 ciclos en las bacterias muertas tratadas. Tabla 10: Valores de Ct para las muestras en la prueba con cisplatino a 200 y 250 μg/ml. Muestra Cp Cp Muestra V 26.10 27.67 M V200 26.43 30.69 M200 V250 28.10 31.90 M250 109 110 Figura 42: Resultado de las pruebas con cisplatino a 200 y 250 μg/ml durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se muestran en rojo las muestras que fueron tratada,s y con el número que indica la concentración de dicho tratamiento. A la izquierda se muestra el grupo de las bacterias vivas. A la derecha se muestra el grupo de las bacterias muertas. El otro grupo de ensayos buscando la inhibición de la amplificación en bacterias muertas se hizo aumentando la concentración de cisplatino en el tratamiento, así como aumentando el tiempo de incubación del mismo. En la Figura 43 se muestra el resultado del tratamiento con cisplatino a una concentración de 350 μg/ml durante 35 y 45 minutos, a temperatura ambiente. Lo que nos encontramos respecto a las primeras pruebas es que ya se nota un atraso muy evidente en el inicio de la amplificación a ambos tiempos de tratamiento, siendo más intenso para el tratamiento a 45 minutos. En este se ve, además del atraso, una caída muy elevada en la altura de la curva. En la Tabla 11 se muestran los valores de Ct para las muestras, donde nos encontramos con hasta diez ciclos de retardo cuando comparamos las bacterias muertas no tratadas con aquellas bacterias muertas tratadas durante 45 minutos. Lo que vimos también fue un efecto sobre las bacterias vivas tratadas que se manifiesta en torno a los 7 ciclos si comparamos aquellas no tratadas con las tratadas durante 45 minutos. Figura 43: Resultado de las pruebas con cisplatino a una concentración de 350 μg/ml. En rojo se muestran las muestras tratadas, indicando con un número el tiempo de tratamiento al que se sometieron. A la izquierda se muestra el grupo de las bacterias vivas. A la derecha se muestra el grupo de las bacterias muertas. 110 111 Muestra Cp Cp Muestra V 27.93 29.67 M V350 (35) 32.11 36.38 M350 (35) V350 (45) 34.94 39.87 M350 (45) Tabla 11: Valores de Ct para las muestras en la prueba con cisplatino a 350 μg/ml durante 35 y 45 minutos. El siguiente grupo de pruebas se llevó a cabo también en otro sistema de extracción y PCR integrada, el BD MAX. Las condiciones de tratamiento consistían en cisplatino a 350 μg/ml durante 45 minutos, pero pero con incubación en una estufa a una temperatura de 37 ºC. En la Figura 44 se muestran los resultados comparados en ambos sistemas. Si nos fijamos en los resultados obtenidos en el LightCycler, vemos como se mantiene sólo un ligero efecto del tratamiento sobre las bacterias muertas, y también como parece atenuarse el efecto inicial visto sobre las bacterias vivas. Si nos fijamos en los resultados obtenidos en el BD MAX, podemos ver como se mantiene el efecto claro sobre las bacterias muertas tratadas manteniendo unos 7 ciclos de retraso respecto al control no tratado, y sin mostrar un efecto significativo en las bacterias vivas. Aún así, no se consiguió la inhibición en estas condiciones. Las condiciones finales que nos aproximan a ese objetivo son las que se muestran usan en los puntos siguientes, donde la concentrción de tratamiento con cisplatino se establece en 750 μg/ml, a 37 ºC durante 45 minutos. 111 112 Figura 44: Resultados para el tratamiento con cisplatino a 350 μg/ml durante 45 minutos a 37 ºC. En la parte superior se muestran los resultados obtenidos en el sistema LightCycler. En la parte inferior se muestran los resultados para el sistema BD MAX. 4.4.4 Prueba de viabilidad usando centrifugaciones Una vez comprobado el efecto inhibitorio del cisplatino y las condiciones óptimas para el tratamiento de las muestras, se realizaron nuevas pruebas para garantizar los resultados del protocolo de tratamiento previo a la detección. Estas condiciones consisten el el tratamiento con cisplatino a 750 μg/ml, durante 45 minutos, a 37 ºC. Como se menciona anteriormente, las pruebas se realizan a partir de una solución bacteriana. Como se muestra en la Figura 45 y la Figura 46, vemos que con el tratamiento que realizamos con cisplatino conseguimos la inhibición completa en la amplificación de las bacterias muertas en la mayoría de los casos. Mientras, en el resto, se consigue una atraso claramente significativo en su Ct si se compara con el control no tratado, o bien una combinación de atraso en la amplificación con un descenso en la altura de la curva de amplificación. Vemos que sólo usando el sistema BD MAX somos capaces de lograr la inhibició completa en la amplificación de las bacterias muertas tratadas, o al menos un atraso muy significativo en el inicio de la amlificación. Con el sistema LightCycler no se consigue llegar al efecto inhibitorio, pero sí que se consigue en algunas réplicas un atraso claro del inicio de la amplificación acompañado de una caída de la señal de la curva. 112 113 Figura 45: Resultados para la amplificación del protocolo de viabilidad en el sistema BD MAX. Figura 46: Resultados para la amplificación del protocolo de viabilidad en el sistema LightCycler. Lo que también vemos en estas pruebas es que, cuando las bacterias vivas son sometidas a nuestro tratamiento, no se ve efecto significativo en la mayoría de los ensayos, lo que es de gran importancia para poder utilizar el tratamiento sin llegar a perder señal cuando se trate una muestra clínica. Por otro lado, se probó también a realizar la prueba preparando muestras en las que bacterias vivas y muertas se encontrasen mezcladas, como podría darse en una muestra real. Estas muestras se prepararon mezclando, en volúmenes iguales, las soluciones bacterianas que se usaban para preparar las bacterias vivas y muertas por separado. De este modo, aunque estamos metiendo la mitad de concentración de cada grupo de bacterias, nos sirve para ver el efecto claro sobre las bacterias muertas, ya que como se ve en la figura, los controles sin tratar amplifican más o menos en el mismo punto, ya que la cantidad total de bacterias es la misma, independientemente de que estén vivas o muertas. Pero si nos fijamos en la mezcla de bacterias a las que se les aplica el 113 114 tratamiento, vemos como claramente hay un atraso en la amplificación, ya que las muertas se verán inhibidas, y como hay la mitad de bacterias vivas respecto al grupo de vivas solas, se ve la amplificación más tarde también respecto a estas. Este efecto lo vemos de forma más clara en los ensayos llevados a cabo en el sistema BD MAX. De este modo vemos como podemos llegar a ser capaces de detectar en una muestra, de forma mayoritaria, solamente a aquellas bacterias que están vivas. 4.4.5 Prueba de viabilidad en sangre usando centrifugaciones Una vez comprobados los efectos del tratamiento con cisplatino sobre bacterias en solución, se avanzó al siguiente paso, donde las bacterias fueron introducidas en sangre para simular una muestra clínica a la que poder aplicar el tratamiento con el test de viabilidad para la detección especifica de bacterias vivas. Cuando se visualizan los resultados en ambos sistemas de detección, se observa que en ningún caso se consigue inhibición o atraso evidente en la amplificación para las bacterias muertas, consiguiendo en muchos casos curvas de amplificación similares, independientemente de que las muestras se hubiesen o no tratado. En la Figura 47 se muestra el resultado de dos experimentos llevados a cabo a partir de sangre con bacterias en el sistema LightCycler, donde se puede ver claramente que no hay diferencias entre las curvas ni de bacterias tratadas ni de las no tratadas, ya que están casi solapadas. Por ese motivo, en la figura no se señala a que muestra corresponde cada curva ya que resulta complicado señalarlas. Sólo en el BD MAX (Figura 48) parece haber un ligero efecto sobre las bacterias muertas tratadas, que las lleva a tener un Ct entorno a 2-3 ciclos más tardíos que aquellas no tratadas, y con una ligera caída en la curva que hace intuir el efecto inhibitorio del cisplatino. De todos modos, este es un efecto muy pequeño que no nos permite la aplicación del protocolo de viabilidad a partir de muestras de sangre. Figura 47: Curvas de amplificación de dos experimentos de viabilidad en el sistema LightCycler a partir de bacterias en sangre recuperadas mediante centrifugaciones. 114 115 Figura 48: Curvas de amplificación de dos experimentos de viabilidad en el sistema BD MAX a partir de bacterias en sangre recuperadas mediante centrifugaciones. 4.4.6 Prueba de viabilidad con oxaliplatino Con la esperanza de poder complementar la actividad del cisplatino en nuestro test de viabilidad, o incluso de mejorar la acción o simplificar las condiciones de trabajo, se llevaron a cabo pruebas con el oxaliplatino sobre grupos de bacterias vivas y muertas. Lo que se observa en nuestros resultados es que en la mayoría de las condiciones, incluso sin llegar a una inhibición completa en la detección de las bacterias muertas, es que esta sustancia presenta un mayor efecto toxico y con efecto inhibitorio sobre el grupo de bacterias vivas. De este modo, se convierte en una molécula que no nos permite su uso, ya que tiene efecto sobre toda la población bacteriana interfiriendo en la detección para el diagnóstico. Un ejemplo del efecto de esta nueva sustancia lo vemos en laFigura 49, que muestra los resultados de la amplificación de las muestras en el sistema LightCycler (ROCHE) en un ensayo en el que la concentración de tratamiento con oxaliplatino era de 350 μg/mL durante 45 minutos a temperatura ambiente. Y aunque la concentración de oxaliplatino es aproximadamente la mitad de la establecida para el cisplatino, se ven los claros efectos inhibitorios atrasando las curvas y disminuyendo la intensidad de señal en las curvas de amplificación, tanto en baterías vivas como en bacterias muertas. 115 116 Figura 49: Resultado de amplificación en LightCycler para el ensayo de viabilidad usando oxaliplatino en el tratamiento de las muestras. 4.4.7 Pruebas con otras sustancias con efecto citostático Para ninguno de los otros citostáticos probados se obtiene resultado de inhibición completa sobre la amplificación de las bacterias muertas. Si que llegamos a conseguir un cierto efecto inhibitorio con algunos de ellos, pero al mismo tiempo también se ve efecto sobre las bacterias vivas (camptotecina, amsacrina, mitoxantrona, elipticina, etoposido). En el resto no conseguimos ningún efecto de inhibicón tras hacer los tratamientos (5- fluoracilo, cromomicina). Una muestra de los resultados se puede ver en la Figura 50 y la Figura 51. 116 117 Figura 50: Muestra de los resultados obtenidos con el tratamiento con distinto citostáticos. Figura 51: Muestra de los resultados obtenidos tras el tratamiento con el resto de citostáticos. 117 124 124 125 5. DISCUSIÓN 125 126 126 127 5.1 DISEÑO DE NANOPARTÍCULAS PARA LA MEJORA DE LA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Un aspecto crítico a la hora de realizar pruebas diagnósticas, es el procesamiento previo de la muestra. La manipulación apropiada de la misma, nos va a permitir realizar de forma segura y fiable los análisis necesarios. El procesamiento preanalitico de la muestra, diferencia el análisis con técnicas moleculares del resto de las tecnologías de trabajo en el laboratorio de Microbiología. En efecto, a la hora de realizar un diagnóstico usando técnicas de biología molecular y amplificación genética; (1) es siempre necesario realizar previamente una extracción de ácidos nucleicos que permita separar estos del resto de los elementos de la muestra que potencialmente puedan interferir las determinaciones que vamos ha realizar. (2) El proceso de extracción deberia servir además de sistema de concentración de los acidos nucleicos para mejorar su límite de detección (10,15). (3) Estas técnicas basadas en la PCR necesitan obtener la máxima pureza posible para poder llevar a cabo la mejor amplificación de la región diana del genoma del microorganismo a detectar. Para lograr la recuperación de los ácidos nucleicos de una muestra se utilizan actualmente casi de forma generalizada, métodos automatizados basados en el uso de nanopartículas magnéticas, de forma que la superficie de estos soportes sirva como sistema facilitador de los lavados sucesivos que incluye la química de los procesos de extracción. La unión de las superficies de estas particulas a los ácidos nucleicos se realiza mediante adsorción inespecífica, permitiendo la fácil recuperación y separación del resto de elementos de la muestra, en general, se ha buscado la capacidad superparamagnetica en las partículas, para facilitar la suspensión en liquidos al retirarse el campo magnetico de la zona proxima a las mismas. La rapidez de esta separación y su automatización, permiten su aplicación a gran escala, logrando el procesado de altos número de muestras diversas, minimizando las contaminaciones y el deterioro de los ácidos nucleicos inducido por las nucleasas (15, 59). En nuestro trabajo, con el objetivo de conseguir recuperar a partir de las muestras la mayor cantidad posible de ácidos nucleicos y así mejorar el diagnóstico, hemos desarrollado diversas nanopartículas magnéticas, probadas en un proceso de extracción automatizado, valorando su posible aplicación/ utilidad en el ámbito clínico. Estas nanopartículas, fueron diseñadas con pequeños cambios de tamaño entre ellas, con diferencias en su revestimiento y algunas se funcionalizaron en su superficie con 127 128 grupos reactivos para la unión a los ácidos nucleicos, esto último, como un paso en el intento de acercarnos a una posible adsorción específica, que pudiese mejorar el proceso de extracción. Como hemos visto en los resultados presentados, sólo una de nuestras partículas obtuvo valores significativos de captura de ADN. Se trata de unas nanopartículas de magnetita de pequeño tamaño (10 nm), recubiertas de una pequeña capa de sílice y sin ningún tipo de molécula funcionalizando su superficie. Estas partículas, mostraron mejores resultados (a) que aquellas que no tenían ninguna cubierta, (b) que aquellas que fueron recubiertas con PAA, y (c) que aquellas recubiertas con sílice pero con una capa mayor. Las partículas que se funcionalizaron con grupos reactivos en la superficie de la cubierta de sílice mostraron, sorprendentemente, unos malos resultados a la hora de capturar y recuperar ADN. Una posible justificación de este fallo, podría ser en que aquellas partículas con una mayor cubierta de sílice, podrían no ser retenidas tan eficazmente por el imán, por culpa del grosor de la cubierta que “enmascararía” el magnetismo del núcleo metálico de las partículas, provocando el arrastre de las mismas durante las fases de lavado y por tanto perdiendo el ADN que pudiesen tener unido. El disponer de imanes de mayor potencia quizás podría permitirnos ver alguna mejora en la tasa de recuperación de estas partículas. Como ya se comentó, una de las ventajas de la sílice, es que proporciona a las nanopartículas, una carga negativa, que les va a dar gran estabilidad en suspensión, impidiendo su agregación, y por tanto favoreciendo la unión a su superficie de moléculas de ADN (143, 144). De este modo podría explicarse el mal resultado de las partículas de magnetita desnuda en las que la posible inestabilidad y tendencia a agregarse, podría dificultar su unión al ADN. La funcionalización de la superficie de las nanopartículas con moléculas portadoras de grupos reactivos, es una estrategia habitual usada a la hora de especializar las funciones de estas, favoreciendo su unión a moléculas biológicas específicas, pudiendo así, por ejemplo, unirse a biomoléculas como proteínas para su separación a partir de una muestra biológica o incluso para su unión específica a tipos celulares concretos, para ayudar en su separación y detección, así como para servir de marcaje a la hora de aplicar técnicas de imagen en diagnóstico (resonancia magnética), etc. (71). Con esta idea, fue con la que diseñamos nanopartículas que, además de su cubierta de sílice, llevaban unidas en su superficie moléculas portadoras de grupos reactivos con afinidad por biomoléculas, en este caso ADN. La molécula que se usó para funcionalizar las nanopartículas para intentar pasar a una adsorción específica del ADN, fue el aminopropiltrietoxisilano (APTS ó APS), que mediante su hidrólisis y condensación en 128 129 la superficie de las nanopartículas nos proporciona grupos amino, que van a poder unirse al ADN. Cuando las dos nanopartículas que fueron funcionalizadas con APS, se probaron en la extracción de ADN, nos encontramos que sus rendimientos no eran lo esperado, ya que obtuvimos valores inferiores al 0,1 % o incluso con niveles de no detección del ADN o no recuperación del mismo (partículas FeO-2206-APS y FeO-2207-APS). Estas partículas, ni siquiera se aproximaron en su capacidad de absorción de acidos nucleicos a los valores obtenidos para las nanopartículas recubiertas de sílice (FeO-2206). Para las partículas FeO-2207-APS, podríamos justificar los malos resultados obtenidos, en función del mayor diámetro de las partículas, debido a la cubierta más gruesa de sílice, que podría impedir la adecuada atracción de las mismas cuando se aplica un campo magnético con el imán del sistema automático. Cuando vemos los resultados de las partículas FeO-2206-APS, esta explicación no nos parece suficiente ya que el rango de tamaño de las nanopartículas es prácticamente igual al de las FeO-2206 que mostraron mejores resultados y aunque el hecho de tener grupos amino en su superficie debería favorecer la unión a las moléculas de ADN, los resultados indican que en nuestras partículas esta funcionalización puede no ser del todo adecuada por generar una reducción de la cantidad de moléculas que se van a poder unir a las partículas, por una teórica reducción de superficie total disponible al añadir estos grupos sobre la superficie de sílice de las mismas. También, se podría suponer que las condiciones concretas del proceso de extracción, como podrían ser la composición de los distintos tampones usados para los lavados y la liberación final del ADN de las partículas para su recuperación, no favoreciesen de la misma manera la correcta captura y posterior liberación del ADN, produciéndose la pérdida de este durante los distintos pasos del proceso de extracción. La necesidad fundamental a la hora de aplicar las técnicas de biología molecular en el diagnóstico, es el poder conseguir una cantidad suficiente de los ácidos nucleicos diana, de la forma más pura posible, que pueda ser detectado posteriormente (46, 48). En estas extracciones de ADN lo que se es capaz de recuperar son los ácidos nucleicos totales y no solamente de los de la diana buscada, así es importante obtener el máximo rendimiento posible del ADN para tener la mayor proporción de nuestra diana o, alternativamente, ser capaces de hacer una separación específica del ADN de interés tras la funcionalización de las partículas con moléculas que presentan oligonucleótidos específicos para un ADN diana. Nuestro intento inicial de funcionalización de nanopartículas resultó ser poco efectivo. Al comparar los rendimientos obtenidos con las nanopartículas recubiertas de sílice, con los de un sistema automático de extracción de ácidos nucleicos pudimos valorar la utilidad de nuestras partículas. Lo que vimos; fue que las partículas FeO-2206 tenían unos resultados, que aunque no iguales, se aproximaban a los valores obtenidos por las 129 130 partículas del sistema automático, al valorar las cantidades totales de ADN extraído. Esto nos proporciona unas nanopartículas susceptibles de modificaciones o de ajustes en el proceso de extracción, que nos podrían proporcionar una herramienta útil a la hora del procesamiento previo de nuestras muestras biológicas para su posterior análisis molecular. 5.2 DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DEL STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTENTE A METICILINA La detección del S. aureus resistente a meticilina es importante en el cuidado de los pacientes y en la apropiada utilización de los métodos de control de la infección nosocomial (169, 173). En la actualidad, hay disponibles gran variedad de ensayos fenotípicos y moleculares para la detección de MRSA. Al contrario que los ensayos basados en el cultivo, las pruebas moleculares requieren menos tiempo hasta la obtención del resultado, convirtiéndose en una alternativa muy útil para el manejo del paciente. El uso de estas técnicas moleculares, a día de hoy, no implica el abandono de las técnicas fenotípicas clásicas en el laboratorio, ya que al añadirlas al catálogo de técnicas disponibles para el diagnóstico, podemos disponer de herramientas complementarias y obtener una mayor información, de una forma rápida, para usarla para el beneficio del paciente. En esta parte de nuestro estudio, podemos ver que incluso las técnicas moleculares no son infalibles, bien por tener un límite de detección alto o por la circulación de cepas que no son susceptibles de amplificación con las sondas seleccionadas, nos podemos encontrar con falsos negativos o discrepantes en algunas de las técnicas. Para evitar encontrarse en esta situación, es recomendable poder usar en el laboratorio técnicas, con fundamentos distintos, que puedan complementarse para poder discriminar entre aquellas muestras realmente negativas o positivas y en caso de duda poder apoyarse en datos firmes a la hora de comunicar un resultado, que en los casos de aplicación de tratamiento antibiótico pueda ser aplicado de forma efectiva, cuando sea necesario. Por eso el uso complementario de las técnicas fenotípicas clásicas (cultivo, antibiograma, pruebas bioquímicas), de la proteómica con el uso de herramientas como la espectrometría de masas (MALDI-TOF) y las técnicas moleculares (PCR, PCR a tiempo real, hibridación) nos van a permitir obtener más información y como vemos en nuestro trabajo, pueden complementarse, resolviendo algunos casos dudosos obtenidos de cualquiera de las técnicas usadas. Además, la combinación de la información obtenida con estas técnicas nos va permitir caracterizar en profundidad, todos aquellos microorganismos de interés, combinando datos fenotípicos y datos genotípicos, permitiendo tiparlos y compararlos entre si de una forma más eficaz. 130 131 Algo que también hay que tener en cuenta a la hora de la detección de estos resultados negativos falsos, es la necesidad de una vigilancia y actualización constante de las técnicas de Biología Molecular. Debido a la creciente variabilidad genética, que se ve afectada entre otros aspectos; por la presión de resistencias en muchos microorganismos y la aparición de nuevos tipos de mutantes dentro de una misma especie, con pequeños cambios que favorecen su expansión y adaptación, convirtiéndose muchas veces en un problema de salud. Algunas veces, estas variantes pueden no ser detectables con las sondas o los algoritmos inicialmente desarrollados para el diagnóstico. De ahí la necesidad de la vigilancia, en busca de nuevas variantes de mutantes, para que puedan ser identificados y caracterizados los cambios genéticos implicados y para que puedan ser incorporados posteriormente a las técnicas moleculares usadas en el diagnóstico. El hecho de encontrar técnicas moleculares basadas en la PCR con resultados distintos entre si (discrepantes), nos hace subrayar, la ya conocida importancia de la elección de las dianas de amplificación a la hora de diseñar una técnica de detección. El buen conocimiento del genoma del microorganismo en cuestión, así como de los elementos móviles implicados también en algunas resistencias y el poder caracterizar las regiones concretas implicadas en la aparición de las resistencias, es de gran importancia a la hora de la elección de las dianas de amplificación, ya que puede implicar dejar fuera de nuestra capacidad de detección a cepas con pequeñas variaciones en las regiones inicialmente seleccionadas. En nuestro estudio encontramos que la técnica “BD MAX MRSA Assay” nos da 4 resultados falsos positivos, frente a los 14 que nos encontramos con la técnica “LightCycler MRSA Advanced Test”. Este es un resultado claramente positivo a favor del ensayo diseñado para el sistema BD MAX, demostrándonos su utilidad a la hora de poder usarlo como herramienta de cribado en los pacientes con sospecha clínica. Lo que vemos también, es que a pesar de ser ensayos diseñados para la amplificación de los genes implicados en la resistencia a ampicilina, sólo uno de ellos consigue una buena cobertura a la hora de detectar los distintos tipos en los que se pueden agrupar estas variantes resistentes. El uso paralelo de las técnicas fenotípicas y otras técnicas moleculares, nos llevan a apoyar la correcta asignación de los distintos aislados como verdaderos MRSA, permitiéndonos valorar los resultados obtenidos y demostrando la utilidad del uso combinado de distintas técnicas en el laboratorio. Para intentar conocer algo más de estos aislados con resultado negativo por alguna de las técnicas se llevaron a cabo análisis de distancias; utilizando técnicas de biología molecular (rep-PCR y PCR convencional), así como de espectrometría de masas (MALDI-TOF) para el análisis proteómico. El estudio de las distancia genéticas obtenido por rep-PCR nos mostró similitudes entre los aislados negativos, pero no nos 131 132 permitió encontrar diferencias de agrupación entre aquellas negativas por una técnica o las muestras negativas por las dos técnicas. Cuando la caracterización se llevó a cabo mediante la espectrometría de masas, comparando los espectros proteicos generados mediante un dendrograma, nos encontramos con una separación clara entre los dos grupos de negativos, indicándonos algún tipo de posible diferencia que podría estar influyendo en la capacidad de detección por cada una de las técnicas. Cuando se intenta un tipado de los aislados basado en la caracterización por PCR de los distintos tipos de la región SCCmec, vemos una variedad de tipos entre los aislados, e incluso en dos de ellos no hemos sido capaces de llegar a esta caracterización. Esto no nos permite asignar un problema en la detección asociado a un tipo concreto, basándonos en la región SCCmec, si no, probablemente se trate de variantes con cambios en regiones más específicas que pueden estar implicados en cualquiera de los distintos tipos. 5.3 USO DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS PARA LA CAPTURA DE MICROORGANISMOS Y POSTERIOR DETECCIÓN En el diagnóstico microbiológico nos enfrentamos a diario con gran cantidad de muestras de diversa naturaleza y que va a ser sometidas a procesos convencionales de crecimiento en distintos medios de cultivo, con el fin de aislar e posteriormente identificar y caracterizar con otras técnicas el microorganismo o microorganismos presentes y que puedan ser la causa de la patología en un paciente. Lo malo de este tipo de procesos es que implican gran cantidad de tiempo, necesario para el crecimiento de aquellos microorganismos que se pueden cultivar fácilmente, pero también nos encontramos con microorganismos de difícil crecimiento o incluso que no se pueden cultivar y frente a los que tendremos que usar otras metodologías. Los procesos que implican pasos de cultivo utilizaran tiempos que pueden oscilar entre las 18-24 horas a varios días o incluso semanas, implicando un gran retraso en la asignación nominal concreta o no del microorganismo asociado al cuadro clínico del paciente. Lo ideal, en estos casos, sería poder aislar física y rápidamente, a partir de la muestra, el microorganismo o microorganismos presentes en ella, para poder realizar una detección, por ejemplo, mediante métodos moleculares. Además, esta posibilidad de aislar el microorganismo a partir de la muestra de origen podría ser de gran utilidad para eliminar restos de sustancias inhibitorias u otros elementos a partir de muestras complicadas favoreciendo el proceso de cultivo si es necesario, así como evitando la interferencia de esas sustancias en otras técnicas que se usarían posteriormente y concentrando, en este caso, los microorganismos presentes a partir de los volúmenes diversos de muestra, para ganar así tiempo y eficacia en el diagnóstico. Del mismo modo que en la extracción de ácidos nucleicos hablábamos de la posibilidad de conseguir una adsorción específica de los ácidos nucleicos en los procesos 132 133 de extracción, la modificación de las nanopartículas con moléculas en su superficie como pueden ser anticuerpos u otro tipo de moléculas (ligandos de receptores específicos de membrana) puede convertir a estas partículas en elementos con unión específica a un tipo celular concreto (14, 71). Nuestra intención en este estudio, fue la de probar dos tipos de nanopartículas diseñadas para la unión a microorganismos para bioseparación. Una de las partículas, las ApoH, es un producto comercial de la compañía ApoH technologies (Francia) que usan la unión de esta la proteína de fase aguda ApoH (apolipopreteina H) a la superficie de nanopartículas magnéticas para valerse de su capacidad de unión a proteínas de la superficie de múltiples patógenos (parásitos, virus, bacterias) (267). La Apolipoproteína H (ApoH), también conocida como E2-glicoproteína I (ß2-GPI), es una glicoproteína plasmática de 50 kDa. ApoH está presente en el plasma humano en una concentración de entre 150 y 300 mg/ml (272). En sangre, la ApoH circula en conformaciones libres o ligada a lipoproteínas: quilomicrones, lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). Además, la ApoH tiene una alta afinidad para las lipoproteínas ricas en triglicéridos. La cantidad de ApoH asociado con las lipoproteínas del plasma en individuos sanos varía según los autores del 4 al 13% hasta alrededor del 40% (273, 274). La ApoH es capaz de activar las lipoproteínlipasas (Lee et al., 1983). La ApoH fue aislada de la fracción de lipoproteínas plasmaticas y descritoapor primera vez en 1961 por HE Schultze (275). En menor medida, también se asocia a fracción de globulinas ß2 La ApoH se expresa en el hígado humano, en las células y tejidos intestinales. En ratas, se han identificado otros sitios de la síntesis en bajas concentraciones como el riñón, intestino delgado, cerebro, cardiomiocitos del corazón y en concentraciones inferiores en el bazo, estómago y próstata. La ApoH es una proteína de fase aguda y cuando se activa, ApoH enlaza, con una relativa alta afinidad, patógenos o sus proteínas, por eso ApoH también se considera como un elemento de la respuesta inmune innata del huésped, particularmente durante la fase aguda. Es difícil de clasificar como proteína de fase aguda positiva o negativa. Está propiedad se utiliza como un medio para mejorar drásticamente el diagnóstico de agentes patógenos de diferentes orígenes, incluyendo humanos, animales o del medio ambiente y la naturaleza, incluyendo virus envueltos o no envueltos, parásitos y bacterias gram positivas o gram negativas. De hecho, ApoH activada unida a soportes sólidos se ha utilizado para concentrar o para "limpiar" de patógenos inhibidores, algunos métodos de detección. También en este estudio probamos las nanopatículas de la compañía NANO MR (USA), que en base a la misma estrategia, utilizan la unión de anticuerpos en la superficie de las nanopartículas para unirse a moléculas de superficie de bacterias y hongos. Estas 133