Estudio de homodímeros del receptor 5-HT2A de serotonina y sus mecanismos de aplicación en la farmacología de la esquizofrenia
Abstract
Los receptores 5-HT2A de serotonina son receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) asociados a patologías del sistema nervioso central como la esquizofrenia, los cuales forman homodímeros. Para conocer los mecanismos de activación de estos receptores, se desarrolló una metodología miniaturizada de medición simultánea de la activación de las vías de señalización fosfolipasa A2 y fosfolipasa C a través del receptor 5-HT2A de serotonina. Se demostró que es necesario activar los dos protómeros del dímero para inducir la formación de segundos mensajeros. Se comprobó que el puente disulfuro entre la Cys148 y la Cys227 es determinante en la unión de ligandos y activación del receptor 5-HT2A de serotonina pero no para su naturaleza homodimérica.
Full text
7(6('('28725$0(172 '567&+1&'*1/1&ı/'415&'.4'%'2614*6#&'5'41610+0#; 575/'%#0+5/15&'#%6+8#%+ĵ0'0.#(#4/#%1.1)ı#&'.# '537+<1(4'0+# #NDC+INGUKCU(GTPhPFG\ '5%1.#&'&17614#/'061+06'40#%+10#. 241)4#/#&'&17614#/'061'0+08'56+)#%+ĵ0' &'5'081.8'/'061&'/'&+%#/'0615 6$17,$*2'(&203267(/$
&'%.#4#%+ĵ0 &1#7614'5' 'UVWFKQFGJQOQFsOGTQUFGNTGEGRVQT*6 # FGUGTQVQPKPC[UWU OGECPKUOQUFGCEVKXCEKxPGPNCHCTOCEQNQIsCFGNCGUSWK\QHTGPKC ''QD $/%$,*/(6,$6)(51ī1'(= Presento miña tese, seguindo o procedemento adecuado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) No seu caso, na tese se fai referencia as colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide ca versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio de outros autores nin de traballos presentados por min para a obtención de outros títulos. (Q6DQWLDJRGH&RPSRVWHODGH1RYHPEURGH $VGR $OED,JOHVLDV )HUQiQGH]
#7614+<#%+ĵ0 &1 &+4'%614 6+614'5' 'UVWFKQFGNJQOQFsOGTQFGNTGEGRVQT*6 # FGUGTQVQPKPC[UWU OGECPKUOQUFGCEVKXCEKxPGPNCHCTOCEQNQIsCFGNCGUSWK\QHTGPKC 'QD 0DUtD,VDEHO/R]D*DUFtD ' -RVp0DQXHO%UHD)ORULDQL ,1)250$1 4XHDSUHVHQWHWHVHFRUUHVSyQGHVHFRWUDEDOORUHDOL]DGRSRU''QD$OED,JOHVLDV)HUQiQGH]EDL[RD PLxDGLUHFFLyQHD XWRUL]R DV~D SUHVHQWDFLyQ FRQVLGHUDQGR TXHUH~QH RV U HTXLVLWRV HVL[LGRVQR 5 HJXODPHQWR GH (VWXGRVGH 'RXWRUDPHQWRGD86& H TXH FRPRGLUHFWRUGHVWD QRQLQFRUUH QDV FDXVDV GH DEVWHQFLyQHVWDEOHFLGDV QD /HL (Q6DQWLDJRGH&RPSRVWHODGH1RYHPEURGH $VGR 0DUtD,VDEHO/R]D *DUFtD $VGR-RVp0DQXHO%UHD )ORULDQL
La presente memoria ha sido realizada gracias a la financiación otorgada por el Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2009-13609-C04-01), el Ministerio de Economía y Competitividad (SAF2014-57138-C2-2R), el proyecto Innopharma (PI12/00742; Ministerio de Economía y Competitividad) y la beca del Programa de Formación de Personal Investigador (FPI) concedida por el Ministerio de Ciencia e Innovación.
Índice Resumen ................................................................................................................................. 21 Introducción ......................................................................................................................... 29 1. Esquizofrenia ........................................................................................................................ 31 1.1 Aspectos generales ...................................................................................................... 31 1.2 Etiopatología de la esquizofrenia ......................................................................... 33 1.2.1 Hipótesis glutamatérgica ............................................................................ 33 1.2.2 Hipotésis neurodegenerativa .................................................................... 33 1.2.3 Hipótesis del neurodesarrollo ................................................................... 34 1.2.4 La hipótesis clásica: la hipótesis dopaminérgica ............................... 34 1.2.5 Hipótesis serotonina-dopamina ............................................................... 36 1.2.6 Genes y proteínas asociadas a esquizofrenia ..................................... 36 1.3 Tratamiento farmacológico de la esquizofrenia ............................................. 37 1.3.1 Antipsicóticos típicos o de primera generación ................................. 37 1.3.2 Antipsicóticos atípicos o de segunda generación .............................. 38 2. Receptores acoplados a proteínas G ............................................................................ 41 2.1 Características generales .......................................................................................... 41 2.2 Modelos de interacción ligando-receptor ........................................................... 46 2.3 Dimerización de GPCRs.............................................................................................. 51 2.3.1 Dominios de interacción en dímeros ...................................................... 52 2.3.2 Técnicas de detección de dímeros ........................................................... 54 2.3.2.1 Técnicas bioquímicas: complementación funcional y coinmunoprecipitación ................................................................. 54 2.3.2.1.1 Complementación funcional ................................................. 54 2.3.2.1.2 Coinmunoprecipitación .......................................................... 55 2.3.2.2 Técnicas biofísicas: transferencia de energía de resonancia y complementación de fluorescencia bimolecular ........................................................................................ 55 2.3.2.2.1 FRET............................................................................................... 56 2.3.2.2.2 BRET .............................................................................................. 56 2.3.2.2.3 Técnicas de complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC) ................................................................... 57 2.3.2.3 Aproximaciones farmacológicas ................................................ 58
Índice 2.3.2.3.1 Inactivación-reactivación ...................................................... 58 2.3.2.3.2 Ligandos bivalentes ................................................................. 60 3. Receptores de serotonina ................................................................................................. 61 3.1 Receptor 5-HT2A de serotonina ............................................................................... 62 Justificación, hipótesis y objetivos ................................................................................ 71 Resultados .............................................................................................................................. 77 Publicación 1: ..................................................................................................................................... 79 Development of a Multiplex Assay for Studying Functional Selectivity of Human Serotonin 5-HT2A Receptors and Identification of Active Compounds by High Throughput Screening Publicación 2: ..................................................................................................................................... 91 Serotonin-2A homodimers are needed for signalling via both phospholipase A2 and phospholipase C in transfected CHO cells Publicación 3: ................................................................................................................................... 101 Serotonin 2A receptor disulfide bridge integrity is crucial for ligand binding to different signalling states but not for its homodimerization Discusión .............................................................................................................................. 113 Conclusiones ....................................................................................................................... 133 Bibliografía .......................................................................................................................... 137
Relación de abreviaturas ABREVIATURAS (±)DOB: (±)-1-(4-bromo-2,5-dimethoxyphenil)-2-aminopropane (±)DOI: (±)-1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane 5-HT: serotonin (serotonina) 7TMR: 7 transmembrane receptors (receptores con 7 dominios transmembrana) AA: arachidonic acid (ácido araquidónico) AKT1: serine-threonine protein kinase 1 (serina-treonina proteína kinasa 1) AMPc: 3’,5’-cyclic adenosine monophosphate (adenosin monofosfato 3’,5’-cíclico) BI: balance index (índice del balance) Bmax: maximum number of binding sites (número máximo de sitios de unión) BRET: bioluminiscence resonance energy transfer (transferencia de energía de resonancia bioluminiscente) BRET50: half maximal BRET signal (mitad de la señal de BRET máxima) BRETmax: maximal BRET signal (señal máxima de BRET) BSA: bovin serum albumin (albúmina sérica bovina) CFP: cyan fluorescence protein (proteína fluorescente cian) CHO: Chinese Hamster Ovary (ovario de hámster chino) COMT: catechol-o-methyltransferase (catechol-o-metiltransferasa) Cys: cysteine (cisteína) DAG: diacylglycerol (diacilglicerol) DISC1: disrupted in schizophrenia 1 DTNBP1: dystrobrevin binding protein 1 (proteína 1 de unión a distrobrevina) DTT: DL-1,4-dithiothreitol (DL-1,4-ditiotreitol) ECL: extracelular loop (bucle extracelular)
Relación de abreviaturas Emax: maximal response (respuesta máxima) ET-18-OCH3: 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine FEZ1: fasciculation and elongation protein Zeta 1 FRET: fluorescence resonance energy transfer (transferencia de energía de resonancia fluorescente) GDP: guanosine 5’-diphosphate (guanosina 5’-difosfato) GEF: guanine nucleotide exchange factor (factor intercambiador de nucleótidos de guanina) GFP: green fluorescence protein (proteína fluorescente verde) GPCRs: G protein coupled receptors (receptores acoplados a proteinas G) GR55562: 3-[3-(Dimethylamino) propyl]-4-hydroxy-N-[4-(4-pyridinyl) phenyl]benzamide dihydrochloride GTP: guanosine 5 ’-triphosphate (guanosina 5’-trifosfato) HA: hemaglutinin (hemaglutinina) HTS: High throughput screening (cribado de alto rendimiento) IC50: half maximal inhibitory concentration (mitad de la concentración inhibitoria máxima) ICL: intracelular loop (bucle intracelular) IP3: inositol 1,4,5-triphosphate (inositol 1,4,5-trifosfato) IUPHAR: International Union of Pharmacology (Unión Internacional de Farmacología) Kd: equilibrium dissociation constant (constante de disociación en equilibrio) Ki: inhibition constant (constante de inhibición) Koff: dissociation rate constant (constante ratio de disociación) Kon: association rate constant (constante ratio de asociación) LIS1: lissencephaly protein 1(proteína lisencefalina 1) LSD: Lysergic acid diethylamide (dietilamida del ácido lisérgico)
Relación de abreviaturas MDL 100,907: (±)-α-(2,3-Dimethoxyphenyl)-1-[2-(4-fluorophenyl)ethyl]-4- piperidinemethanol NDEL1: nuclear distribution protein nudE-like 1 NMDA: N-methyl-D-aspartate (N-metil-D-aspartato) NRG1: neuregulin 1(neuregulina 1) PACAP-1: pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide type-1 receptor (receptor tipo 1 del polipéptido activador de adenilato ciclasa de la pituitaria) PCP: phencyclidine (fenciclidina) PDE4B: phosphodiesterase 4B (fosfodiesterasa 4B) PIP2: phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (fosfatidilinositol 4,5 bifosfato) PKC: protein kinase C (proteína kinasa C) PLA2: phospholipase A2 (fosfolipasa A2) PLC: phospholipase C (fosfolipasa C) PSD95: postsynaptic density protein 95 (proteína de densidad postsináptica 95) RELN: reelin (reelina) RET: resonance energy transfer (transferencia de energía de resonancia) RGS4: regulator of G protein signaling 4 (proteína 4 reguladora de la señalización de la proteína G) RHC-80267: 1,6-Bis(cyclohexyloximinocarbonyl)hexane Rluc: Renilla luciferase (Renilla luciferasa) RNA: ribonucleic acid (ácido ribonucleico) RNAi: ribonucleic acid interference (ácido ribonucleico interferente) SNC: sistema nervioso central TM: transmembrane (transmembrana)
Relación de abreviaturas U73122: 1-[6-[[(17β)-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl]amino]hexyl]-1H-pyrrole-2,5- dione VC: venus protein C-terminus fragment (fragmento C-terminal de la proteína venus) VN: venus protein N-terminus fragment (fragmento N-terminal de la proteína venus) YFP: yellow fluorescence protein (proteína fluorescente amarilla) β-ME: β-mercaptoethanol (β-mercaptoetanol)
RESUMEN La esquizofrenia es una enfermedad mental crónica que afecta al 1% de la población mundial. Su etiología es desconocida aunque actualmente se asume que la esquizofrenia surge por la interacción de factores genéticos y ambientales. Su tratamiento farmacológico se basa en el empleo de antipsicóticos típicos o atípicos, con afinidad por diferentes receptores acoplados a proteínas G (GPCRs); destacando los antipsicóticos atípicos por su mayor afinidad por los receptores 5- HT2A de serotonina que por los D2 de dopamina. El receptor 5-HT2A de serotonina fue de los primeros en los que se describió el fenómeno de selectividad funcional donde distintos ligandos presentan diferentes eficacias y/o potencias en función de la vía de señalización estudiada. Aunque tradicionalmente los GPCRs se han considerado entidades monoméricas, actualmente se sabe que pueden formar dímeros u oligómeros de orden superior. Así, para el receptor 5-HT2A de serotonina se ha descrito la formación tanto de heterodímeros como de homodímeros, desconociéndose hasta el momento si la dimerización es esencial para su activación. Por ello, nuestra hipótesis se basa en que la homodimerización del receptor 5-HT2A de serotonina condiciona su activación y su selectividad funcional por antipsicóticos. El mecanismo de dicha activación implicaría, al menos parcialmente, la existencia de puentes disulfuro en los dominios extracelulares del receptor. En este trabajo se desarrolló y validó una metodología miniaturizada multiplex de medición simultánea de la activación de las vías de señalización fosfolipasa A2 (PLA2) y fosfolipasa C (PLC) a través del receptor 5-HT2A de serotonina, detectándose fenómenos de selectividad funcional y cooperatividad negativa. Para estudiar la unidad funcional mínima (monomérica u homodimérica) requerida para la activación de las vías de señalización PLA2 y PLC a través del receptor 5-HT2A de serotonina se siguió una aproximación farmacológica de inactivación-reactivación, comprobándose que era necesario activar los dos protómeros del dímero para su señalización presentando, además, comunicación alostérica entre ellos. Además, se caracterizó el efecto que produce la reducción de puentes disulfuro del receptor 5-HT2A de serotonina sobre la unión de ligandos, su función y naturaleza homodimérica del mismo. De este modo, se comprobó que el puente disulfuro 23
Introducción 1. ESQUIZOFRENIA 1.1 Aspectos generales La esquizofrenia es una enfermedad mental crónica, multifactorial y de etiología desconocida que afecta al 1% de la población (Tandon y cols., 2008). Se trata de una patología con un alto índice de mortalidad, donde el 25-50% de los pacientes esquizofrénicos intentan suicidarse y un 10% lo consiguen, así, la tasa de mortalidad es ocho veces mayor que la de la población en general. La esperanza de vida puede ser 20-30 años menor, no sólo debido al suicidio, sino a una enfermedad cardiovascular prematura, la cual además de un componente genético puede verse agravada por un estilo de vida inadecuado (fumar, dieta inadecuada, carencia de ejercicio…) y por el tratamiento con algunos antipsicóticos (Blasco- Fontecilla y cols., 2010; Ray y cols., 2009; Saha y cols., 2007). Los síntomas de la enfermedad se clasifican en cinco dimensiones: síntomas positivos, negativos, cognitivos, agresivos y depresivos /ansiosos (Figura 1) (Stahl, 2000). Figura 1. Representación de las cinco dimensiones de la esquizofrenia (Stahl, 2000). Los síntomas positivos son considerados un exceso de las funciones normales; comprenden delirios (de persecución, grandeza, religiosos), alucinaciones (auditivas, visuales, táctiles), agitación, conducta catatónica, distorsión o exageración en el lenguaje y la comunicación. En los negativos nos encontramos con al menos cinco tipos de síntomas: apatía afectiva, alogia (restricciones en la fluidez y productividad del pensamiento y el INTRODUCCIÓN 31
Introducción habla), anhedonia (falta de placer), falta de atención y limitaciones en el comportamiento dirigido hacia un objetivo. Se considera que son una reducción de las funciones normales, pudiendo tener su origen en la propia enfermedad (síntomas negativos primarios), o ser secundarios a los síntomas positivos de la psicosis, a los efectos extrapiramidales producidos por los antipsicóticos o como consecuencia de los síntomas depresivos (síntomas negativos secundarios). Dentro de los síntomas cognitivos podemos destacar la dificultad para solucionar problemas o la falta de coherencia en el lenguaje. Por otro lado, aunque los síntomas agresivos pueden coincidir con los positivos, estos enfatizan problemas en el control de impulsos; incluyen agresión verbal o física, suicidio, autolesiones y falta de contención sexual. Por último, en cuanto a los síntomas depresivos y ansiosos, estos también se asocian frecuentemente con esquizofrenia (Tandon y cols., 2009; Stahl, 2008) La esquizofrenia, por definición, es un trastorno de al menos seis meses de duración, incluyendo al menos un mes de alucinaciones, delirio, habla desorganizada, conducta catatónica o síntomas negativos. La mayoría de los autores está de acuerdo en que el desarrollo de la esquizofrenia se divide en cuatro fases: premórbida (periodo anterior a la aparición de los primeros síntomas), prodrómica (manifestación sutil de algunos signos y síntomas de la enfermedad), una fase psicótica y fase crónica (Figura 2) (Tandon y cols., 2009). Figura 2. Fases de la esquizofrenia (Tandon y cols., 2009). 32
Introducción 1.2 Etiopatología de la esquizofrenia La esquizofrenia es una enfermedad de origen multifactorial donde factores genéticos y ambientales contribuyen al desarrollo de la misma. Existen múltiples hipótesis que tratan de explicarla, a continuación se comentan algunas de ellas. 1.2.1 Hipótesis glutamatérgica El primer indicio acerca de la participación del glutamato en la etiopatogenia de la esquizofrenia surgió al observar los síntomas psicóticos que sustancias como fenciclidina (PCP) o ketamina (antagonistas de los receptores N-metil-D-aspartato, NMDA) producían en individuos sanos (Javitt y Coyle, 2004; Javitt y Zukin, 1991; Javitt, 1987). La administración sostenida de antagonistas NMDA daba lugar a la aparición de síntomas psicóticos, a alteraciones del pensamiento, aislamiento social y síntomas cognitivos. Entre las diferentes vías glutamatérgicas cabe destacar una que proyecta desde las neuronas corticales piramidales (principalmente en la lámina 5) a los núcleos serotoninérgicos del rafe, al área tegmental ventral, a los centros dopaminérgicos de la sustancia negra y al locus cerúleo. Esta vía es la proyección glutamatérgica cortical-troncoencefálica. Se ha descrito que la actividad de las vías glutamatérgicas influye en la actividad de las vías dopaminérgicas, existiendo una interconexión entre estos dos sistemas y por tanto otorgándole al glutamato un papel modulador sobre la neurotransmisión dopaminérgica. Por ello, esta teoría sugiere que la fisiopatología de la esquizofrenia está asociada a una hipofunción glutamatérgica específicamente en ese área que, por tanto, no ejercería su papel inhibitorio sobre las neuronas dopaminérgicas de la vía mesolímbica produciendose la hiperactividad de la misma (Stahl, 2008; Chinchilla, 2007; Konradi y Heckens, 2003; Tamminga, 1998). 1.2.2 Hipótesis neurodegenerativa La presencia de anomalías tanto funcionales como estructurales demostradas en estudios de neuroimagen de pacientes esquizofrénicos sugieren un proceso neurodegenerativo con pérdida progresiva de la función neuronal. De este modo y como se ha descrito anteriormente, la esquizofrenia es una enfermedad que progresa desde una fase asintomática larga a una fase crónica de la que nunca se 33
Introducción vuelve al estado inicial. Entre las diferentes causas de esa condición degenerativa nos encontramos desde una apoptosis anormal, infecciones o anoxia a una excitación excesiva ejercida por el glutamato. Dicha sobreexcitación da lugar a lo que se conoce como “hipótesis excitotóxica de la esquizofrenia” donde las neuronas acaban muriendo debido a los radicales libres que se forman en el interior como consecuencia de la excesiva entrada de calcio (Watkins y Andrews, 2016; Stahl, 2008). 1.2.3 Hipótesis del neurodesarrollo Según esta hipótesis la enfermedad tendría su origen en anormalidades en el desarrollo cerebral fetal durante los estados tempranos de selección y migración neuronal. Así, complicaciones obstétricas desde infecciones maternas durante el embarazo (gripe, citomegalovirus, Herpes simplex o Toxoplasma gondii) que activan el sistema inmunitario a otro tipo de problemas como nacimiento prematuro, hipoxia o preeclampsia, pueden contribuir al desarrollo de esquizofrenia. Estos factores de riesgo tienen un final común, la reducción de factores de crecimiento nervioso, producción de citoquinas proinflamatorias y especies reactivas de oxígeno, hipoxia o estrés que producirían un daño estructural dando como resultado la selección de neuronas dañadas, una migración incorrecta o conexiones erróneas (Watkins y Andrews, 2016; Khandaker y Dantzer, 2015; Stahl, 2008). 1.2.4 La hipótesis clásica: la hipótesis dopaminérgica A pesar de que la base biológica de la esquizofrenia sigue siendo desconocida, se sabe que el neurotransmisor dopamina tiene un papel clave en los síntomas de la enfermedad, y por ello, se considera la hipótesis dopaminérgica como la hipótesis clásica. En el sistema dopaminérgico cerebral existen cinco vías: mesolímbica, mesocortical, nigroestriatal, tuberoinfundibular y talámica (Figura 3). 34
Introducción Figura 3. Vías dopaminérgicas cerebrales. (a) vía nigroestriatal (b) vía mesolímbica (c) vía mesocortical (d) vía tuberoinfundibular (e) vía talámica (Stahl, 2008). La vía mesolímbica se proyecta desde los cuerpos celulares dopaminérgicos en el área tegmental ventral a los terminales axónicos que inervan las áreas límbicas del cerebro como son el núcleo accumbens, hipocampo y amígdala. Esta vía tiene un papel importante en los síntomas positivos, especialmente en las conductas emocionales, las alucinaciones auditivas y los delirios. Se propone que la hiperactividad de esta vía es una de las causas de los síntomas positivos de la esquizofrenia pudiendo también desempeñar un papel en los síntomas agresivos. En la vía mesocortical los cuerpos celulares surgen del área tegmental ventral y proyectan hacia áreas de la corteza prefrontal. Una hipofunción de esta vía sería la responsable de los síntomas negativos y de algunos síntomas cognitivos. La vía dopaminérgica nigroestriatal se proyecta desde los cuerpos celulares dopaminérgicos de la sustancia negra hacia los ganglios basales y estriado. Esta vía forma parte del sistema nervioso extrapiramidal por lo que controla los movimientos. Así, un déficit de dopamina en esta zona causa trastornos motores como la enfermedad de Parkinson, la cual se caracteriza por rigidez, bradicinesia y temblores; mientras que por otro lado, una hiperactividad de la vía nigroestriatal sería la responsable de trastornos 35
Introducción motores como la corea de Huntington, discinesias y tics. El bloqueo crónico de los receptores D2 de dopamina en esta vía puede dar como resultado un trastorno motor hipercinético conocido como discinesia tardía inducida por neurolépticos. Las neuronas dopaminérgicas que se proyectan desde el hipotálamo a la adenohipófisis forman la vía tuberoinfundibular. Normalmente estas neuronas están activas e inhiben la liberación de prolactina. La vía talámica, descrita posteriormente, inerva el tálamo en primates y aunque todavía está siendo estudiada, parece tener un papel en los mecanismos del sueño. Por el momento no existen evidencias de una función alterada de esta vía en los pacientes esquizofrénicos. 1.2.5 Hipótesis serotonina-dopamina La hipótesis de que la serotonina (5-HT) juega un papel en la etiología de la esquizofrenia comenzó basándose en las actividades psicomiméticas producidas por la mescalina, psilobicina y la dietilamida del ácido lisérgico (LSD), todos ellos agonistas alucinógenos del receptor 5-HT2A de serotonina (Bartolomeis y cols., 2013; González-Maeso y cols., 2007). Posteriormente, el desarrollo de los antipsicóticos atípicos, cuya principal diana son los receptores 5-HT2A de serotonina y la mayor eficacia clínica observada frente a los clásicos (atribuída al bloqueo de dicho receptor) hizo que la teoría de la implicación de la serotonina en la esquizofrenia cobrara importancia (Meltzer y cols., 1989). Actualmente sabemos que la serotonina ejerce un papel modulador sobre las vías dopaminérgicas inhibiendo la liberación de dopamina en los terminales axónicos. Este efecto modulador variará en función del nivel de expresión de los receptores 5-HT2A de serotonina y D2 de dopamina. 1.2.6 Genes y proteínas asociadas a esquizofrenia Hoy en día se acepta que la esquizofrenia es una enfermedad poligénica, donde un único gen no es suficiente para producirla pero la combinación de la alteración varios genes junto con factores ambientales incrementan el riesgo de desarrollarla. El gen Disrupted in schizophrenia 1 (DISC1), descubierto en una familia escocesa, es uno de los genes asociados con esquizofrenia, se trata de una translocación 36
Introducción balanceada entre el cromosoma 1 y el 11 (1:11) (q42.1;q14.3). El producto de dicho gen, la proteína DISC1, es una proteína scaffold con una distribución celular diversa que tiene un papel importante en diferentes funciones (debido a su interacción con múltiples proteínas) como la arborización y migración neuronal, proliferación celular, crecimiento de neuritas, modulación de la función del citoesqueleto, transmisión sináptica y plasticidad. Entre las proteínas que interactúan con DISC1 se incluyen la fosfodiesterasa 4B (PDE4B), nuclear distribution protein nudE-like 1 (NDEL1), lissencephaly protein 1 (LIS1), fasciculation and elongation protein Zeta 1 (FEZ1), neuregulin 1 (NRG1), dystrobrevin binding protein 1 (DTNBP1), postsynaptic density protein 95 (PSD95), las cuales participan en los procesos mencionados anteriormente y cuyos genes han sido asociados con esquizofrenia. Otros genes relacionados con la enfermedad son los que codifican las siguientes proteínas catecol-o-metiltransferasa (COMT), regulator of G protein signaling 4 (RGS4), reelina (RELN) y serine-threonine protein kinase 1 (AKT1) (Varela y cols., 2015; Balu y Coyle, 2011; Mackie y cols., 2007; Porteous y Millar, 2006; Ross y cols., 2006; Lidow, 2003; Sawa y Snyder, 2003). 1.3 Tratamiento farmacológico de la esquizofrenia El tratamiento de la esquizofrenia tiene tres componentes: el tratamiento farmacológico con antipsicóticos, educación e intervención psicosocial y rehabilitación. El tratamiento farmacológico de la esquizofrenia es sintomático mediante la administración de fármacos antipsicóticos. Estos se clasifican en antipsicóticos típicos o de primera generación y antipsicóticos atípicos o de segunda generación. 1.3.1 Antipsicóticos típicos o de primera generación Los primeros fármacos antipsicóticos fueron descubiertos accidentalmente en la década de 1950, cuando se observó por casualidad que la clorpromazina (un compuesto con actividad antihistamínica) presentaba efectos antipsicóticos cuando se administraba a pacientes esquizofrénicos. A principios de la década de 1970 se comprobó experimentalmente mediante técnicas de unión de radioligandos que su propiedad farmacológica clave era el antagonismo de los receptores D2 de dopamina (Burt y cols., 1975; Creese y cols., 1976; Seeman y cols., 37
Introducción 1976). Esta acción ha resultado ser la responsable no sólo de la eficacia de los antipsicóticos de primera generación sino también de la mayoría de sus efectos secundarios. Un bloqueo de los receptores de dopamina en la vía dopaminérgica mesolímbica da lugar a una reducción de la hiperactividad que presentan los pacientes esquizofrénicos en esta vía, la cual es responsable de los síntomas positivos. Los antipsicóticos típicos no permiten lograr un bloqueo específico de los receptores D2 a nivel mesolímbico sino que también producen un bloqueo en la vía dopaminérgica mesocortical que se encuentra hipoactiva en esquizofrenia y que es la responsable de los síntomas negativos y cognitivos, causando un empeoramiento de dichos síntomas. A nivel nigroestriatal, el bloqueo de los receptores D2 conlleva alteraciones en el movimiento (movimientos involuntarios hipercinéticos) ya que esta vía forma parte del sistema extrapiramidal, así, los efectos secundarios se conocen como síntomas extrapiramidales. En cuanto a los receptores D2 de la vía tuberoinfundibular también serán bloqueados y como consecuencia se produce hiperprolactinemia. Además de la clorpromazina, dentro de este grupo de antipsicóticos típicos se encuentran el haloperidol, tioridazina y loxapina entre otros. 1.3.2 Antipsicóticos atípicos o de segunda generación Los antipsicóticos atípicos representan la segunda generación de antipsicóticos. El primer fármaco de este grupo fue la clozapina, la cual no produce síntomas extrapiramidales ni hiperprolactinemia, presentando baja afinidad por los receptores D2 de dopamina y alta afinidad por los receptores 5-HT2A de serotonina (Gross y Langner, 1966). Durante un tiempo fue retirada del mercado debido a uno de sus efectos adversos, la agranulocitosis, que se produce entre el 0.5-2% de los pacientes (Alvir y cols., 1993; Gaszner y cols., 2002). Posteriormente, su demostrada superioridad clínica en esquizofrenia resistente y los pocos síntomas extrapiramidales que produce, hizo que se reintrodujera en el mercado aunque no sea la primera línea de tratamiento, considerándola el “estándar de oro” (gold standard) de la medicación antipsicótica (Kane y cols., 1988). El hecho de que los antipsicóticos atípicos como la clozapina presenten una mayor afinidad por los receptores 5-HT2A que por los receptores D2 condujo a lo que se conoce como índice de Meltzer: una relación pKi 5-HT2A/ pKi D2 que ha sido 38
Introducción clozapina utilizado como un criterio de clasificación de antipsicóticos, de esta manera si el resultado de la relación es menor de 1.09 el fármaco se comporta como un antipsicótico típico, mientras que si es mayor a 1.12 se comporta como antipsicótico atípico (Meltzer y cols., 1989). Sin embargo, la clozapina es considerado un fármaco “sucio” debido a su perfil multirreceptorial ya que presenta afinidad por más de una docena de receptores acoplados a proteínas G (GPCRs) como son todos los receptores de dopamina (D1- D5), los receptores 5-HT1A, 5-HT2A, 5-HT2C, 5-HT6 y 5-HT7 de serotonina, receptores de histamina H1, receptores muscarínicos y receptores adrenérgicos. Por ello, resulta complicado diseñar un fármaco clozapine-like con menos efectos adversos (Figuras 4 y Figura 5) (Roth y cols., 2004). Figura 4. Perfil multirreceptorial de la clozapina donde se representan los diferentes receptores para los que tiene afinidad (Stahl, 2008). 39
Introducción ARa A+Ri ARi Ka αL 2.2 Modelos de interacción ligando-receptor Desde que se conoce la existencia de los receptores, numerosas teorías y modelos matemáticos han tratado de explicar las interacciones ligando-receptor y a medida que aumentaba el conocimiento, estos modelos fueron aumentando en complejidad. El modelo clásico de interacción ligando receptor describe que un agonista (A) se une a un receptor en estado inactivo (Ri) para formar un complejo ARi que tras un cambio conformacional se transformará en el estado activo ARa. Posteriormente, De Lean y colaboradores (De Lean y cols., 1980) diseñaron otro modelo en el cual se incluía la interacción del receptor con la proteína G, conocido como modelo del complejo ternario. En 1989 Costa y Herz demostraron por primera vez que un receptor podía señalizar en ausencia de ligando, es lo que se conoce como actividad constitutiva (Costa y Herz, 1989). Por este motivo, fue necesario proponer un nuevo modelo que tuviera en cuenta esa característica, así, se propuso el modelo del complejo ternario extendido (Samama y cols., 1993) (Figura 11A). Este modelo a pesar de ser el que mejor explicaba la interacción ligando-receptor, era incompleto termodinámicamente desde el punto de vista de la interacción receptor-proteína G. Por lo tanto, se propuso el modelo del complejo ternario cúbico que incluía la posibilidad de que el receptor en estado inactivo (con ligando unido o no) interactuara con la proteína G (Weiss y cols., 1996a, 1996b, 1996c) (Figura 11B). ARaG ARa+G A+Ri ARi Ka αL γβKg 46
Introducción Figura 11. Modelos de interacción ligando-receptor. A) Modelo del complejo ternario extendido. B) Modelo del complejo ternario cúbico (Kenakin, 2002). Actualmente existen modelos aún más complejos que incluyen otras propiedades de los receptores como son el alosterismo, cooperatividad, señalización cruzada (crosstalk) y la formación de dímeros u oligomeros (Giraldo, 2013; Durroux, 2005). Para simplificar los modelos de sistemas proteicos se representa una única conformación, sin embargo, existen evidencias experimentales de que los receptores no existen como una única conformación activa o inactiva, sino que existen como colecciones de conformaciones, algunas de las cuales son capaces de producir un efecto (Park, 2012; Kenakin y Miller, 2010; Vaidehi y Kenakin, 2010; Kenakin, 2002, 1995). Asimismo, también existen evidencias de la existencia temporal de microconformaciones (Figura 12). Por ello, en la teoría del conjunto de conformaciones se asume que un receptor (en ausencia de ligando) posee un estado de distribución particular en el espacio conformacional y que los ligandos y/o proteínas G cambian esa distribución del estado basal después de interactuar. Cuando el ligando que se une es un agonista tendrá afinidad por la colección de conformaciones activas, lo que produce una redistribución de las mismas desplazando el equilibrio. En el caso de que el ligando sea un agonista inverso, presentará una mayor afinidad por la colección de conformaciones inactivas y el equilibrio será desplazado en el sentido opuesto (Figura 13) (Kenakin, 2004, 2003, 2002). B A 47
Introducción Figura 12. Representación del conjunto de microconformaciones. A) En ausencia de ligando, el receptor posee un conjunto de distribuciones en el espacio conformacional. B) Tras la interacción con el ligando esas distribuciones conformacionales cambian (Kenakin, 2004). A B 48
Introducción A C D E F B Figura 13. Diferentes conjuntos de conformaciones expresadas como distribuciones Gaussianas. A) Conformaciones basal (Ref) y activa (G) de un receptor. B) Redistribución de las conformaciones tras la unión de un agonista. Las zonas de intersección representan la respuesta. C, D) Redistribución de las conformaciones provocada por la interacción con un antagonista. E) Representación de un receptor con actividad constitutiva. F) Redistribución de las conformaciones tras la unión de un agonista inverso (Kenakin, 2002). La observación de que diferentes ligandos actuando sobre un mismo GPCR puedan seleccionar diferentes estados conformacionales y por consiguiente activar diferentes vías de señalización acopladas al mismo receptor de un modo diferencial, es lo que se conoce como agonist-directed trafficking of receptor stimulus (Kenakin, 1995) y se explica a través de la teoría de conjuntos 49
Introducción conformacionales. También se conoce como selectividad funcional (Urban y cols., 2007), biased agonism (Jarpe y cols., 1998) o collateral efficacy (Kenakin, 2007). Esta propiedad se observó en los receptores de serotonina, dopamina, adenosina y opioides entre otros (Figura 14) (Liu y cols., 2015; Kenakin y Miller, 2010). Figura 14. Esquema representativo del fenómeno de selectividad funcional. Cuando el agonista A1 interactúa con el receptor R, produce preferencialmente la activación de la vía de señalización E1 que de E2. El agonista A2 unido al mismo receptor promueve una activación similar para ambas vías mientras que el agonista A3 favorece la vía de señalización E2 (Berg y cols., 1998a). Una de las primeras observaciones del fenómeno de selectividad funcional fue en el receptor tipo 1 del polipéptido activador de adenilato ciclasa de la pituitaria (PACAP-1) acoplado a las proteínas Gs (produciendo AMPc a través de la adenilato ciclasa) y Gq/11 (generando IP3 a través de la PLC). En dicho receptor, los agonistas PACAP-27 y PACAP-38 invierten sus potencias relativas en función de la vía efectora caracterizada (Spengler y cols., 1993). Posteriormente, en 1998, Berg y colaboradores demostraron dicho fenómeno en los receptores 5-HT2C y 5-HT2A de serotonina. Estos receptores se encuentran acoplados a la PLC (a través de Gq/11 generando IP3 y DAG) y a la PLA2 produciendo AA (Hoyer y cols., 1994; Felder y cols., 1990). En los receptores 5-HT2C de serotonina, se observó que el agonista quipazina produce una respuesta máxima superior a la del (±)1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane (±DOI) en la vía de la PLC mientras que este último presenta una mayor respuesta a través de la vía de PLA2 (Figura 15A y 15B). Otros agonistas mostraron resultados similares en ese receptor (Berg y cols., 1998 a, b, c). 50
Introducción En el caso del receptor 5-HT2A de serotonina, agonistas como LSD o lisurida producen claramente una mayor activación de la PLA2 que de PLC (Figura 15C). Figura 15. Ejemplos de algunos agonistas que presentan selectividad funcional. A) El agonista (±)DOI presenta una mayor respuesta a través de PLA2 que PLC en el receptor 5- HT2C de serotonina expresado de forma estable en células CHO-1C19. B) El agonista quipazina presenta un efecto contrario, una mayor respuesta a través de la PLC que de PLA2 en el receptor 5-HT2C de serotonina expresado de forma estable en células CHO- 1C19. C) Estudio de la señalización de diferentes agonistas en células CHO-FA4 que expresan de forma estable el receptor 5-HT2A de serotonina (Berg y cols., 1998a). 2.3 Dimerización de GPCRs Los GPCRs fueron considerados tradicionalmente como entidades monoméricas donde un receptor se acopla a una proteína G con una estequiometría 1:1. Sin embargo, la aparición tanto de curvas de competición bifásicas con cooperatividad positiva o negativa (que no podían ser explicadas mediante el modelo tradicional) como de western blots con múltiples bandas, indicaban que los GPCR pueden formar oligómeros (Herrick-Davis y cols., 2013; Hiller y cols., 2013; Milligan, 2013; Kroeger y cols., 2003; Angers y cols., 2002). Las consecuencias de esta oligomerización son variadas y a diferentes niveles, siendo un requisito para el tráfico a la membrana plasmática desde el lugar de síntesis, modificando las propiedades de internalización u otorgándole al dímero/oligómero nuevas propiedades farmacológicas y vías de señalización (Smith y Milligan, 2010; Pin y cols., 2007). B A C 51
Introducción En el caso de dímeros la asociación puede ser entre proteínas idénticas, lo que se conoce como homodímeros, o entre proteínas distintas, formando en este caso heterodímeros. La IUPHAR estableció unos criterios para que un dímero sea aceptado por la comunidad científica: 1) debe existir una interacción física (o proximidad) de ambos receptores en tejido nativo o en células primarias, 2) debe tener propiedades farmacológicas específicas 3) evidencias en animales knockout o mediante la tecnología del ácido ribonucleico interferente (RNAi) in vivo. Así, deben cumplirse al menos dos de los tres criterios establecidos (Pin y cols., 2007). La primera evidencia aceptada del significado funcional de un dímero viene de la mano de un GPCR de clase C, el receptor GABAB, el cual forma un heterodímero obligado que consta de dos subunidades, GABAB1 (une agonistas) y GABAB2 (activa a la proteína G). En ausencia de GABAB2 la subunidad GABAB1 es retenida en el retículo endoplasmático, por el contrario, GABAB2 sí es transportada a la membrana cuando se expresa sola pero no une GABA ni promueve la señalización. Únicamente cuando ambas subunidades se coexpresan se produce un tráfico correcto a la membrana celular y la formación de un receptor funcional (Marshall y cols., 1999; White y cols., 1998). 2.3.1 Dominios de interacción en dímeros Numerosos estudios cristalográficos y de mutagénesis dirigida han tratado de explicar cuáles son los dominios de interacción entre los protómeros de un dímero. El modelo de intercambio de dominios (domain swapping model) considera que la unidad funcional monomérica consistiría en los cinco primeros dominios transmembrana (TM) de un monómero y los dos últimos del otro. De este modo, si ambos protómeros se coexpresan se produce un reordenamiento y se recupera el receptor funcional. Por otro lado, en el modelo de empaquetamiento lateral, el dímero se formaría por contacto a través de los dominios transmembrana (Figura 16) (Szidonya y cols., 2008). 52
Introducción Figura 16. Modelos de interacción entre monómeros. A) Modelo de empaquetamiento lateral. B) Modelo de intercambio de dominios domain swapping model (Szidonya y cols., 2008). Se ha demostrado que los dominios transmembrana IV y V forman la interfaz dimérica en los receptores D2 de dopamina, rhodopsina, 5-HT1A y 5-HT2A de serotonina y mGlu2 de glutamato (Xue y cols., 2015; Gorinski y cols., 2012; Moreno y cols., 2012; Bruno y cols., 2009; González-Maeso y cols., 2008; Fotiadis y cols., 2004; Guo y cols., 2003). Aunque los dominios transmembrana y las interacciones hidrofóbicas son consideradas las más efectivas y probables en el proceso de dimerización, las uniones covalentes entre cisteínas localizadas en las regiones extracelulares como por ejemplo en el N-terminal del receptor sensible a calcio, los receptores metabotrópicos de glutamato y el receptor de angiotensina II tipo 2 son importantes en la dimerización (Miura y cols., 2005; Zhang y cols., 2001; Ray y cols., 2000; Romano y cols., 1996). Por otro lado, se han descrito otras interacciones como la coiled-coil de los receptores GABAB (Figura 17) (Burmakina y cols., 2014; White y cols., 1998). A B 53
Introducción Figura 17. Dominios de interacción en receptores diméricos. A) Formación de dímeros mediante puentes disulfuro. B) Formación de dímeros a través del dominio C-terminal, interacción coiled-coil. C) Formación de dímeros por contacto entre los dominios transmembrana (Bouvier, 2001). 2.3.2. Técnicas de detección de dímeros Se han utilizado múltiples técnicas bioquímicas, biofísicas y farmacológicas para demostrar la existencia de dímeros. A continuación se mencionan algunas de ellas. 2.3.2.1 Técnicas bioquímicas : complementación funcional y coinmunoprecipitación 2.3.2.1.1 Complementación funcional Para estudiar las interacciones físicas entre GPCRs se han llevado a cabo estudios de complementación funcional donde receptores mutados o quimeras que no son funcionales cuando se expresan individualmente, reestablecen la señalización cuando son coexpresados. Un estudio realizado por Maggio y colaboradores (Maggio y cols., 1993a) utilizó dos receptores quimeras; uno contenía los cinco primeros dominios transmembrana del receptor α2-adrenérgico y los dos últimos del receptor muscarínico M3 y el otro viceversa. Cuando se expresaron individualmente estos receptores no fueron capaces de unir radioligandos ni de señalizar, por el contrario, cuando se coexpresaron se recuperó parcialmente la función sugiriendo una interacción física entre ambas quimeras creando receptores funcionales. Resultados similares se observaron en el receptor de A B C 54
Introducción angiotensina II tipo 1 y ambos apoyaban el modelo de dimerización domain swapping (Monnot y cols., 1996). Otra aproximación un tanto diferente en la que se utilizaron mutantes, en este caso del receptor D2 de dopamina, demostró la complementación funcional entre un receptor mutado en coexpresión con el receptor nativo (Han y cols., 2009). Por el contrario, en otros GPCRs la dimerización entre receptores mutados y nativos no reestablece la función, esto se conoce como efecto dominante negativo pero también demostraría la interacción entre ambos (Herrick-Davis y cols., 2005). 2.3.2.1.2 Coinmunoprecipitación Una de las técnicas bioquímicas más utilizada para estudiar la dimerización ha sido la coinmunoprecipitación de receptores marcados con epítopos diferentes. El primer receptor estudiado con esta aproximación fue el receptor β2-adrenérgico. Para ello se marcaron unos receptores con hemaglutinina (HA) y otros con c-MYC y se coexpresaron en células Sf9. Finalmente se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-myc y el dímero fue detectado con el anticuerpo anti-HA (Hebert y cols., 1996). Mediante estrategias similares se ha demostrado la homodimerización de otros receptores como los 5-HT2A, 5-HT2C y 5-HT4 de serotonina o el muscarínico M3 entre otros (Brea y cols., 2009; Berthouze y cols., 2005; Herrick-Davis y cols., 2004; Zeng y Wess, 1999). También se han demostrado numerosos heterodímeros como 5-HT2A-D2, D1-D2 o el GABAB1-GABAB2 (Albizu y cols., 2011; Lukasiewicz y cols., 2010; Lee y cols., 2004; White y cols., 1998). Aunque esta técnica es muy utilizada para estudiar interacciones proteínaproteína, la coinmunoprecipitación de receptores requiere la solubilización con detergentes que puede ser problemática cuando se trata de proteínas altamente hidrofóbicas como es el caso de GPCRs, pudiendo formar agregados y por lo tanto dímeros artefactuales. 2.3.2.2 Técnicas biofísicas: transferencia de energía de resonancia y complementación de fluorescencia bimolecular A pesar de que la coinmunoprecipitación es una técnica muy utilizada, no permite el estudio de dímeros en células vivas ni en tiempo real. Este inconveniente se solventó con la aparición de técnicas basadas en la transferencia de energía de 55
Introducción Dicho neurotransmisor ejerce su función a través de 7 tipos de receptores de 5-HT (5-HT1 a 5-HT7) clasificados en base a su secuencia genética, mecanismos de transducción de señales y afinidades por agonistas/antagonistas selectivos, de los cuales todos, salvo el 5-HT3 que es un canal iónico dependiente de ligando, son GPCRs de clase A o rodopsina α. A su vez, estos receptores fueron clasificados en 14 subtipos y 13 de ellos están acoplados a diferentes vías de señalización, principalmente a través de proteínas G como son Gi, Gq/11, Gs (McCorvy y Roth, 2015; Hoyer y cols., 1994). Para los receptores de serotonina tipo 5-HT1 (5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E y 5-HT1F) y 5-HT5 (5-HT5A y 5-HT5B) la vía más conocida implica a Gi, produciendo una inhibición de la adenilato ciclasa y por lo tanto una disminución del AMPc. Los receptores de serotonina tipo 5-HT2 (5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2C) están acoplados principalmente a Gq/11 y activan la PLC produciendo IP3, DAG y aumentando los niveles intracelulares de calcio. También existen evidencias del posible acoplamiento a Gi por parte de los receptores 5-HT2C y 5-HT2A de serotonina (Lucaites y cols., 1996; Garnovskaya y cols., 1995). En los receptores acoplados a Gs se incluyen 5-HT4, 5-HT6 y 5-HT7 de serotonina, que provocan la activación de la adenilato ciclasa incrementando los niveles de AMPc. Asimismo se ha observado que la activación del receptor 5-HT4 de serotonina puede resultar en un incremento en los niveles de calcio posiblemente a través de Gq/11 (Ponimaskin y cols., 2002). 3.1. Receptor 5-HT2A de serotonina El receptor 5-HT2A de serotonina es el objeto de estudio de este trabajo. En un principio se le denominó receptor 5-HT “D” por ser bloqueado por el antagonista irreversible dibenzylina, también conocido como fenoxibenzamina, y posteriormente fue renombrado como 5-HT2 (Peroutka y Snyder, 1979; Gaddum y Picarelli, 1957). En humanos es codificado por el gen HTR2A que se encuentra en el cromosoma 13q14-q21 y ejerce sus funciones tanto en la periferia como en el SNC. A nivel periférico participa en la agregación plaquetaria y en la contracción del músculo liso vascular, uterino, urinario, bronquial e intestinal. En el SNC participa en procesos fisiológicos como la regulación del sueño y la temperatura, control de la actividad sexual y control de la liberación de otros neurotransmisores 62
Introducción y hormonas como la oxitocina y prolactina (Hoyer y cols., 2002; Gerhardt y van Heerikhuizen, 1997). Su distribución en el SNC ha sido ampliamente estudiada por autorradiografía, hibridación in situ e inmunocitoquímica. El empleo de los radioligandos [3H]espiperona, [3H]ketanserina, [125I](±)DOI o [3H](±)-α-(2,3-Dimethoxyphenyl)-1- [2-(4-fluorophenyl)ethyl]-4-piperidinemethanol ([3H](±)MDL100,907) en técnicas de autorradiografía han permitido detectar dicho receptor en diferentes áreas del cerebro como el córtex, neocórtex, núcleo accumbens, núcleo olfatorio y en menor medida en ganglios basales e hipocampo (López-Giménez y cols., 1997; Pazos y cols., 1987, 1985). Se han encontrado altos niveles de expresión en la lámina V y también está presente en interneuronas GABAérgicas, neuronas dopaminérgicas, colinérgicas, neuronas piramidales glutamatérgicas y astrocitos (de Almeida y cols., 2007; Doherty y Pickel, 2000; Burnet y cols., 1995; Morilak y cols., 1994, 1993; Deecher y cols., 1993). Un gran número de desórdenes psiquiátricos y neurodegenerativos se asocian con variaciones en la estructura, función y expresión del receptor 5-HT2A de serotonina como por ejemplo la depresión, esquizofrenia, ansiedad, trastorno obsesivocompulsivo, síndrome de Tourette, desórdenes alimentarios, Parkinson y Alzheimer (Aznar y Hervig, 2016; Mestre y cols., 2013). Una de las evidencias más claras de su relación con la esquizofrenia viene de la mano del LSD y del (±)DOI, agonistas del receptor 5-HT2A de serotonina que producen alucinaciones similares a las observadas en dicha patología. Asimismo, el desarrollo de los antipsicóticos atípicos como la clozapina, la cual muestra menos efectos extrapiramidales y una mayor eficacia clínica en el tratamiento de los síntomas negativos debido al bloqueo de dicho receptor, pone de manifiesto la relación 5-HT2A-esquizofrenia. Como se mencionó anteriormente, el receptor 5-HT2A de serotonina se acopla, entre otras, a la proteína Gq/11 que activa a la PLC-β1 hidrolizando el fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2) situado en la membrana en dos segundos mensajeros, el DAG e IP3. El DAG permanece en la membrana plasmática y activa a la proteína kinasa C (PKC) mientras que el IP3 entra en el citoplasma (ya que es hidrosoluble) y se une al receptor de IP3 situado en el retículo endoplasmático activándolo y provocando la salida de calcio desde el retículo al citoplasma 63
Introducción (Figuras 22 y 23). Con el objetivo de regenerar el inositol, el IP3 entra en el ciclo de los inositoles fosfato donde el paso final es la conversión de inositol-1-fosfato a inositol por la enzima inositol monofosfatasa. Esta enzima es inhibida por el litio (elemento que ha sido utilizado como tratamiento en maníaco-depresivos) produciendo la acumulación de las especies de inositol fosfato (IPs) formadas previamente, pudiendo ser cuantificadas y utilizadas como una medida de activación del receptor (Figura 24) (Berridge, 2009; Hoyer y cols., 1994; Majerus, 1992; Berridge, 1984). Tanto la PKC como el calcio continuarán con la cascada de señalización. Otra de las múltiples vías de señalización de este receptor implica la activación de PLA2, posiblemente a través de la proteína Gα12/13 promoviendo la liberación de AA desde la posición 2 de algunos fosfolípidos de membrana (Figuras 22 y 23) (Kurrasch-Orbaugh y cols., 2003; Felder y cols., 1990). Figura 22. Esquema simplificado de las vías de señalización del receptor 5-HT2A de serotonina donde se muestra la activación de la PLA2 y la PLC tras la unión del agonista 5- HT (Masson y cols., 2012). 64
Introducción Figura 23. Estructura general de un fosfolípido y lugares de acción de las diferentes fosfolipasas (Capper y cols., 2001). Figura 24. Esquema simplificado del ciclo de inositoles fosfato. La activación del receptor 5-HT2A de serotonina por 5-HT produce la hidrolisis de PIP2 en IP3 y DAG. El IP3 produce la salida de calcio al citoplasma tras unirse a su receptor en el retículo endoplasmático. Además, posteriormente, el IP3 entra en el ciclo de inositoles fosfato para regenerar el inositol cerrando así el ciclo. La enzima inositol monofosfatasa que cataliza el último paso es inhibida por litio (Berridge, 2009). El receptor 5-HT2A de serotonina es uno de los primeros receptores en los que se observó el fenómeno de selectividad funcional donde diferentes ligandos presentan diferentes eficacias y/o potencias en función de la vía de señalización estudiada (PLA2 o PLC) (Figura 15C) (Berg y cols., 1998a). En 2003 Kurrasch- Orbaugh y colaboradores confirmaron dicho fenómeno en otra línea celular (fibroblastos NIH3T3) caracterizando distintos ligandos agonistas, así, aunque la triptamina no mostraba diferencias en cuanto a potencias en ambas vías de señalización, actuaba como agonista total en la vía de señalización de la PLC y como agonista parcial en la vía de la PLA2 (Figura 25A). Por el contrario, el LSD mostró una mayor eficacia en la señalización a través de la PLA2 (Figura 25B). IP5 IP4 IP6 65
Introducción Otro compuesto caracterizado, psilocin, no presento diferencias en eficacia pero sí en potencia, siendo esta significativamente mayor en PLA2 (86 3.9 nM en PLA2 y 2300 289 nM en PLC) (Figura 25C) (Kurrasch-Orbaugh y cols., 2003). Figura 25. Ejemplos de selectividad funcional de diferentes agonistas en el receptor 5- HT2A de serotonina expresado de forma estable en fibroblastos NIH3T3. Los círculos negros representan la vía de señalización mediada por la PLC y los cuadrados blancos la vía de señalización mediada por la PLA2 (Kurrasch-Orbaugh y cols., 2003). En cuanto a antagonistas, se ha demostrado la existencia de selectividad funcional para la clozapina, risperidona, ketanserina y MDL 100,907, presentando un perfil monofásico en la vía mediada por la PLC y un perfil bifásico en la liberación de AA tras la activación de la PLA2 (Figura 26A y 26B) (Brea y cols., 2009). Estas curvas bifásicas también fueron descritas en experimentos de competición frente a los radioligandos [3H](±)-1-(4-bromo-2,5-dimethoxyphenil)-2-aminopropane ([3H]()DOB) y [125I]()DOI siendo característico de receptores en forma dimérica que presentan cooperatividad, propiedad que ha sido descrita para varios GPCRs de clase A pudiendo ser positiva o negativa (Figura 26C) (Brea y cols., 2009; Albizu y cols., 2006; López-Giménez y cols., 2001). A B C 66
Introducción A B C Figura 26. Diferentes conformaciones del receptor 5-HT2A de serotonina reconocidas por los antagonistas clozapina, ketanserina, risperidona y MDL100,907. A) Curvas de inhibición de la estimulación producida por 5-HT 1μM en PLC (acumulación de IPs). B) Curvas de inhibición de la estimulación producida por 5-HT 1μM en PLA2 (liberación de AA). C) Competición de los antagonistas frente a [3H]DOB (Brea y cols., 2009). En el caso de los antagonistas antes mencionados, en los receptores 5-HT2A de serotonina se observó cooperatividad negativa, donde la unión de un ligando a uno de los protómeros del dímero dificulta la unión del segundo ligando al otro protómero (Brea y cols., 2009; López-Giménez y cols., 2001). Además de estas evidencias, se confirmó la homodimerización de dicho receptor mediante técnicas de coinmunoprecipitación y FRET (Brea y cols., 2009). Por otro lado, otros trabajos han descrito la formación de heterodímeros formados por el receptor 5-HT2A de serotonina y el receptor D2 de dopamina (Albizu y cols., 2011; Borroto-Escuela y cols., 2010; Lukasiewicz y cols., 2010) así como con el receptor de glutamato mGlu2 (Moreno y cols., 2016, 2012; Fribourg y cols., 2011; González-Maeso y cols., 2008) y con el receptor cannabinoide CB1 (Viñals y cols., 2015). Ambos heterodímeros se encuentran implicados en esquizofrenia y presentan crosstalk entre protómeros viéndose modificadas sus propiedades de unión y señalización. Albizu y colaboradores observaron que la coexpresión de 5- HT2A-D2 disminuye la afinidad del agonista (±)DOI por el receptor 5-HT2A de serotonina pero potencia su señalización al incrementar el acoplamiento a la proteína Gαq/11. Por el contrario, la coactivación de los receptores D2 de dopamina por el agonista quinpirol, produce el efecto opuesto incrementando la afinidad del (±)DOI y disminuyendo el acoplamiento de Gαq/11 a 5-HT2A (Albizu y cols., 2011). Como se comentó anteriormente se ha demostrado la existencia del heterodímero 5-HT2A-mGlu2 por varios métodos, presentando nuevas propiedades de 67
Introducción señalización diferentes de las que presentan los protómeros de manera individual. El receptor mGlu2 de glutamato se encuentra acoplado a Gαi mientras que el receptor 5-HT2A de serotonina se acopla principalmente a Gαq/11 existiendo para este último dos tipos de agonistas, los alucinógenos y los no alucinógenos, los cuales presentan un comportamiento diferente a nivel de señalización. Ambos pueden activar diferentes vías por seleccionar diferentes estados activos (conformaciones) del receptor, así, cuando ambos receptores forman heterodímeros, los agonistas alucinógenos del receptor de serotonina activan tanto Gαq/11 como Gαi induciendo la expresión de los genes c-fos y egr-2 respectivamente; mientras que los no alucinógenos solamente activan Gαq/11 produciendo únicamente la expresión de c-fos (Figura 27). Por lo tanto, egr-2 sería un marcador específico de la señalización mediada por un alucinógeno, siendo este hallazgo otro caso de selectividad funcional (González-Maeso y cols., 2008). Figura 27. A) Activación de proteínas G por el receptor 5-HT2A de serotonina e inducción de la expresión de genes por los compuestos alucinógenos (HCs) y no alucinógenos (NHCs). B) Activación de Gi/o por el receptor de glutamato mGlu2 tras la unión de un agonista (Guixà-González y cols., 2012). 68
Introducción La activación de Gαq/11 por el receptor 5-HT2A disminuye al ser coexpresado con el receptor mGlu2 mientras que se potencia la activación de Gαi por 5-HT2A. Estos efectos producidos por el receptor mGlu2 en la regulación de Gαq/11 y Gαi por el receptor de serotonina fueron invertidos en presencia del agonista glutamatérgico (LY379268) (Figura 28). La modulación por parte de mGlu2 del acoplamiento de 5-HT2A a Gαi indica que este complejo puede ser importante para la señalización de compuestos alucinógenos. La inducción de c-fos por agonistas 5-HT2A (alucinógenos y no alucinógenos) no se vio afectada por la presencia de LY379268 mientras que sí se vio bloqueada egr-2 (González-Maeso y cols., 2008). Figura 28. Crosstalk entre protómeros del heterodímero 5-HT2A-mGlu2. A) Estudio de la activación de Gαq/11 por el agonista serotoninérgico (±)DOI en ausencia o presencia del receptor mGlu2 y del agonista glutamatérgico LY379268. B) Estudio de la activación de Gαi por el agonista serotoninérgico (±)DOI en ausencia o presencia de receptor mGlu2 y del agonista glutamatérgico LY379268 (González-Maeso y cols., 2008). A B Gαq/11 Gαi 69
Introducción Fribourg y colaboradores proponen que la unión de ligandos a los receptores mGlu2 y 5-HT2A del heterodímero altera el equilibro Gαq/11-Gαi (Figura 29) (Fribourg y cols., 2011). Estos cambios en la regulación indican que 5-HT2A-mGlu2 pueden estar implicados en esquizofrenia y que este complejo es por lo tanto una prometedora diana terapéutica. Figura 29. Modulación del equilibrio fisiológico Balance index (BI) tras la unión de ligandos al heterodímero 5-HT2A-mGlu2, el cual integra las vías de señalización que presentan ambos monómeros por separado (Guixà-González y cols., 2012). 70
Resumen Los receptores acoplados a proteinas G (GPCRs) existen como colecciones de conformaciones en equilibrio, y la eficacia de los fármacos se ha propuesto que se asocia con sus afinidades absolutas y relativas por las diferentes conformaciones. El receptor 5-HT2A de serotonina regula múltiples funciones fisiológicas, está implicado en la patofisiología de la esquizofrenia y es una importante diana de los fármacos antipsicóticos atípicos. Este receptor fue uno de los primeros GPCRs para el cual se observó el fenómeno de selectividad funcional, donde varios ligandos ejercen efectos diferenciales en las vías de señalización de la fosfolipasa A2 (PLA2) y la fosfolipasa C (PLC). Nosotros nos propusimos desarrollar un ensayo funcional multiplex en placas de 96 pocillos para medir simultaneamente las vías PLA2 y PLC acopladas al receptor 5-HT2A; esta aproximación permite la detección de fenómenos de selectividad funcional o cooperatividad en estadíos tempranos de cribado de fármacos. La sostenibilidad del método para poner en marcha campañas de cribado fue puesta a prueba utilizando la librería química Prestwick®, y 22 hits fueron confirmados con actividades mayores al 90%; 11 de estos hits Resultados 77 79
presentan diferencias estadísticamente significativas entre las dos vías efectoras. Así, hemos desarrollado un ensayo multiplex miniaturizado en placas de 96 pocillos para medir selectividad funcional en los receptores 5-HT2A en estadíos tempranos del proceso de descubrimiento de fármacos. Palabras clave Receptor 5-HT2A, selectividad funcional, multiplex, fosfolipasa A2, fosfolipasa C Resultados 78 80
Resultados Publicación 1: Development of a Multiplex Assay for Studying Functional Selectivity of Human Serotonin 5-HT2A Receptors and Identification of Active Compounds by High Throughput Screening http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057116644162?url_ver=Z39. 88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%3dpubmed
Resultados 89 Resumen Diferentes ligandos activan diferencialmente las vías de señalización PLA2 y PLC acopladas al receptor de serotonina 2A (5-HT2A), un receptor acoplado a proteínas G (GPCRs) de clase A. El receptor de serotonina 5-HT2A ha sido demostrado que se expresa como homodímero presentando algunos ligandos cooperatividad negativa entre protómeros en la vía de señalización de PLA2. Nosotros desarrollamos la hipótesis de que el complejo homodimérico es la unidad funcional mínima requerida para la activación de las vías PLA2 y PLC por parte del receptor 5-HT2A de serotonina. Para investigar esta hipótesis, bloqueamos parcialmente los receptores 5-HT2A de serotonina con ritanserina y medimos la actividad de PLA2 y PLC simultáneamente. Posteriormente añadimos el antagonista competitivo espiperona para liberar al inactivador a través de un mecanismo de crosstalk permitiendo al dímero volver a un estado reactivo. La inactivación parcial del homodímero por la unión de ritanserina disminuye la actividad del receptor un 59±13% y un 70±4% en las vías de PLA2 y PLC respectivamente (P<0.001), sin observarse diferencias en la potencia de la serotonina (5-HT). La posterior unión de la espiperona libera a la ritanserina debido a un mecanismo de crosstalk entre protómeros y recupera la actividad del receptor hasta un 74±7% y un 72±4%. La 91
cooperatividad negativa entre los protómeros del dímero fue mantenida durante la liberación de ácido araquidónico (AA) después del bloqueo por ritanserina, como se indica por las curvas de inhibición bifásicas de la clozapina sobre la serotonina 1μM en estas condiciones. Estos hallazgos proporcionan la evidencia de que los receptores 5-HT2A de serotonina deben de expresarse como homodímeros para activar ambas vías de señalización PLA2 y PLC. Palabras clave Receptor de serotonina 2A, fosfolipasa A2, fosfolipasa C, homodímero, crosstalk, unidad funcional mínima Resultados 90 92
Resultados Publicación 2: Serotonin-2A homodimers are needed for signalling via both phospholipase A2 and phospholipase C in transfected CHO cells http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S001429991730095X?via%3D ihub
Resumen El receptor de serotonina 2A (5-HT2A) es un receptor acoplado a proteínas G (GPCRs) con un puente disulfuro conservado formado por la Cys148 (en la hélice transmembrana 3, TM3) y la Cys227 (en el loop extracelular 2, ECL-2). Nosotros desarrollamos la hipótesis de que los puentes disulfuro pueden determinar las funciones del receptor 5-HT2A de serotonina como la activación, selectividad funcional y el reconocimiento del ligando. Nosotros utilizamos el agente reductor dithiothreitol (DTT) para determinar como la reducción de los puentes disulfuro afectan a la unión del radioligando, movilización de segundos mensajeros y dimerización del receptor. El DTT induce una disminución en el número de sitios de unión (1190±63.55 fmol/mg de proteína para las células control en comparación con 921.2±60.84 fmol/mg de proteína para las células tratadas con DTT) así como en la eficacia de ambas vías de señalización caracterizadas, aunque la afinidad y la potencia permanecieron sin cambios. Ensayos de transferencia de Resultados 99 101
Discusión profundizar en el estudio de la selectividad funcional. Estos ensayos permiten cuantificar end-points como la liberación de calcio, la acumulación de especies de inositol fosfato o la producción de AMPc, entre otros (Lundstrom, 2016, 2013; Zhang y Xie, 2012). El empleo de ensayos funcionales en los que se caracteriza una única vía de señalización acoplada a un receptor, aporta información incompleta en el caso de ligandos que presenten selectividad funcional, por ello los ensayos múltiples, en los que se determina simultáneamente el efecto en diferentes vías efectoras en la misma población celular resuelven este problema permitiendo ver el sesgo que se produce en las diferentes señales. Previamente en nuestro laboratorio se desarrolló un ensayo múltiple en placas de 12 pocillos con el objetivo de medir simultáneamente la activación de la PLA2 y de la PLC a través del receptor 5-HT2A de serotonina, cuantificando los segundos mensajeros AA e IPs siguiendo el protocolo descrito por Berg y cols. (Brea y cols., 2009; Berg y cols., 1999, 1998a). Sin embargo, este ensayo tenía la limitación de que no era adecuado para un cribado con un número elevado de compuestos como requieren las amplias librerías químicas empleadas en la búsqueda de hits para programas de descubrimiento de fármacos; por lo tanto, el primer objetivo de la presente tesis doctoral fue poner a punto un ensayo múltiple en un formato miniaturizado para placas de 96 pocillos. Desarrollo de la nueva metodología multiplex y validación de la misma por cribado de una librería química (publicación 1) En primer lugar se estableció una concentración de 20.000 células por pocillo debido a la mejor relación señal específica/señal de fondo. Como consecuencia de la miniaturización, al pasar de placas de 12 a 96 pocillos, se produjo una reducción en la señal obtenida de [3H]AA liberado. De este modo, se decidió incrementar el porcentaje de albúmina sérica bovina (BSA) al 2% ya que forma complejos con los ácidos grasos, en nuestro caso con el AA, permitiendo incrementar la señal al facilitar su salida desde la membrana hacia el exterior celular. Sin embargo, a pesar de obtener mejores resultados en cuanto a señal, a la hora de simultanear la cuantificación de [3H]AA liberado y acumulación de [3H]IPs se observaron interferencias entre las dos señales marcadas con el mismo isótopo radiactivo. Por ello, la optimización del método continuó con un cambio en el radioisótopo y el 116
Discusión [3H]AA fue reemplazado por [14C]AA, obteniendo resultados análogos a los obtenidos con [3H]AA. Una vez optimizada la cuantificación de AA, se procedió a la optimización de la cuantificación de IPs. Tradicionalmente, el aislamiento de las especies de inositol fosfato se realizó a través de cromatografía de intercambio iónico tanto en el formato de 12 como el de 24 pocillos siguiendo el protocolo descrito por Berridge y colaboradores (Berridge y cols., 1982). Por ello, en un primer momento, el aislamiento de [3H]IPs en placas de 96 pocillos fue similar, utilizando una resina de intercambio aniónico AG 1-X8. La utilización de esta resina permitió llevar a cabo la medida simultanea de [3H]IPs y [14C]AA en placas de 96 pocillos. Los resultados obtenidos evidenciaron que la 5-HT estimula de manera concentración-dependiente con un perfil monofásico ambas vías de señalización y con una potencia similar a la obtenida en el formato no miniaturizado (Brea y cols., 2009). En cuanto a la clozapina, antipsicótico atípico considerado como el “estándar de oro”, presentó selectividad funcional con diferentes perfiles de inhibición de la estimulación producida por 5-HT en las dos vías de señalización caracterizadas y con resultados de potencia similares a las previamente descritas (Brea y cols., 2009). En la vía mediada por la PLC (cuantificación de la formación de IPs) se observó un perfil de inhibición monofásico, mientras que en la mediada por la PLA2 (cuantificación de la liberación de AA) el perfil fue bifásico. Este perfil bifásico fue previamente observado en ensayos funcionales y de unión (Brea y cols., 2009; López-Giménez y cols., 2001) y es característico de GPCRs en forma dimérica que presentan cooperatividad negativa entre los sitios de unión de ambos protómeros. La unión de un ligando al centro de unión ortostérico de uno de los protómeros del dímero puede ejercer efectos alostéricos en el centro ortostérico del otro protómero resultando en cooperatividad positiva o negativa (Figura 30) (Maurice y cols., 2011; Birdsall, 2010, Albizu y cols., 2006). En el caso de cooperatividad negativa, la unión de un ligando al centro ortostérico de un protómero dificulta la unión de un segundo ligando al otro protómero mostrando curvas bifásicas y ha sido observada en otros GPCRs (Maurice y cols., 2011; Smith y Milligan, 2010; Albizu y cols., 2006). 117
Discusión Figura 30. Esquema representativo de cooperatividad negativa o positiva en un receptor dimérico. La unión del ligando A al centro ortostérico del protómero R1 del dímero modifica de manera negativa o positiva las propiedades de unión del ligando B al protómero R2 del dímero (Maurice y cols., 2011). La selectividad funcional que presenta la clozapina en el receptor 5-HT2A de serotonina, capaz de seleccionar diversos estados conformacionales y por consiguiente activar las diferentes vías de señalización acopladas al receptor homodimérico de un modo diferencial, se explica a través de la teoría de estados conformacionales. El modelo matemático de tres estados para un receptor dimérico se basa en la existencia de un equilibrio entre el receptor en su forma dimérica inactiva (R2) y dos estados activos diferentes del receptor [(R2)* y (R2)**]. El perfil diferencial observado para la clozapina en los ensayos funcionales, es el resultado de diferentes conformaciones activas del receptor homodimérico para cada vía de señalización, por ejemplo (R2)* para la acumulación de IPs y (R2)** para la liberación de AA (Brea y cols., 2009). Diversos autores han propuesto que la activación de la PLA2 puede ocurrir como consecuencia de la activación de la PLC en algunos sistemas. En nuestro caso, para la línea celular utilizada CHO-FA4 que expresa de forma estable el receptor 5-HT2A de serotonina se ha descartado previamente esta propuesta utilizando diferentes inhibidores, comprobando que ambas vías son independientes. Así, tras el empleo de inhibidores de PLA2 como mepacrine o el ácido aristolóquico, la acumulación de IPs no se vio afectada. Del mismo modo, el empleo de inhibidores de PLC como el compuesto 1-[6-[[(17β)-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl]amino]hexyl]-1H- pyrrole-2,5-dione (U73122), el 1-O-Octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3- phosphocholine (ET-18-OCH3) o el compuesto 48/80 no afectaron a la liberación de AA. Por lo tanto, descartaron la existencia de un crosstalk entre ambas vías de señalización (Figura 31) (Brea y cols., 2009; Berg y cols., 1998). Los mismos 118
Discusión resultados fueron obtenidos en la línea celular de fibroblastos NIH3T3, donde los autores han ido un poco más allá descartando que la liberación de AA pudiera ser el resultado de la rotura de cadenas de AA localizado en el DAG tras la acción de la DAG lipasa o por la activación de la PLA2 a través de la PKC. Para ello utilizaron 1,6- Bis(cyclohexyloximinocarbonyl)hexane (RHC-80267) como inhibidor de la DAG lipasa y estaurosporina como inhibidor de la PKC (Kurrasch-Orbaugh y cols., 2003). Además, la línea celular CHO-FA4 expresa de forma endógena el receptor 5-HT1B de serotonina acoplado a la proteína Gi/o. La posible contribución de dicho receptor a ambas vías de señalización fue descartada tras el tratamiento con el antagonista selectivo 3-[3-(Dimethylamino) propyl]-4-hydroxy-N-[4-(4-pyridinyl) phenyl]benzamide dihydrochloride (GR55562) (Figura 31) (Brea y cols., 2009; Berg y cols., 1994). 119
Discusión A C D B Figura 31. Las vías de señalización PLA2 y PLC son independientes en el receptor 5-HT2A de serotonina expresado de forma estable en CHO-FA4 así como del receptor 5-HT1B de serotonina. A) Efecto de la 5-HT (1μM) en presencia del inhibidor de la PLC (compuesto 48/80, 100μM), del inhibidor de PLA2 (ácido aristolóquico, 10μM) o del antagonista selectivo del receptor 5-HT1B de serotonina (GR55562, 10μM). B) Perfil de inhibición de la clozapina sobre el efecto producido por 5-HT en ambas vías de señalización en presencia del inhibidor de PLC. C) Perfil de inhibición de la clozapina sobre el efecto producido por 5-HT en ambas vías de señalización en presencia del inhibidor de la PLA2. D) Perfil de inhibición de la clozapina sobre el efecto producido por 5-HT en ambas vías de señalización en presencia del antagonista selectivo del receptor 5-HT1B de serotonina GR55562 (Brea y cols., 2009). Pese a que la utilización de la resina AG 1-X8 permitió la medida simultánea en placas de 96 pocillos, su empleo no permitía la automatización del método, ya que implicaba un proceso de lavados y filtrado, por ello fue sustituida por unas microesferas impregnadas con cerio y carga neta positiva (Yttrium Silicate 120
Discusión Scintillation Proximity Assay Beads) comercializadas para la cuantificación de ácido ribonucleico (RNA) (RNA binding YSi SPA beads). Estas microesferas con carga positiva se unirán a las cargas negativas de los grupos fosfato actuando como una matriz de intercambio iónico pudiendo ser cuantificados con un contador de radiactividad de centelleo líquido (Brandish y cols., 2003). Ambas aproximaciones, resina y microesferas, mostraron los mismos perfiles en términos de eficacia y potencia para la 5-HT y la clozapina. Para corroborar la utilidad de la nueva metodología se llevó a cabo una campaña de High Throughput Screening (HTS) con la librería química Prestwick® como prueba de concepto del método descrito previamente. Esta librería está compuesta por 1120 fármacos y/o compuestos que llegaron a fases clínicas. El punto de corte para la detección de hits se estableció en el valor de la media del porcentaje de inhibición + 3 veces la desviación estándar de todos los compuestos evaluados (Zhang y cols., 1999) obteniéndose 38 hits con una actividad superior al 90%. Muchos de los antagonistas identificados son antipsicóticos o antidepresivos con actividad conocida sobre el receptor 5-HT2A de serotonina, validando la sensibilidad de la metodología. Se confirmaron 22 de ellos mediante la construcción de curvas dosis-respuesta en ambas vías efectoras y 11 mostraron selectividad funcional. Los antipsicóticos tioridazina, loxapina y metotrimeprazina, los antidepresivos nortriptilina, ciclobenzaprina y trimipramina así como el antihistamínico trimeprazina mostraron una mayor potencia de inhibición en la vía de señalización de la PLA2 que en la mediada por la PLC. La clozapina mostró nuevamente los perfiles bifásico (PLA2) y monofásico (PLC) comentados anteriormente. Por el contrario, el pizotifeno, el antihistamínico pimetixeno, y el agente antiprolactina, metergolina, presentaron una mayor potencia de inhibición en la vía de la PLC que en la de la PLA2. Por tanto, la nueva metodología desarrollada en esta tesis permite identificar compuestos con selectividad funcional en el receptor 5-HT2A de serotonina por las vías efectoras de la PLA2 y PLC. 121
Discusión Estudio de la unidad funcional del receptor 5-HT2A de serotonina homodimérico (publicación 2) Una vez desarrollada la metodología y habiendo corroborado el estado dimérico del receptor 5-HT2A de serotonina a través de las curvas bifásicas con cooperatividad negativa, se utilizó este método para poder discernir si el homodímero 5-HT2A es la unidad funcional mínima de señalización o por el contrario la unión de un agonista a uno de los protómeros del dímero es suficiente para producir su activación. La aproximación farmacológica empleada fue la de inactivación-reactivación (ver introducción) descrita para los receptores 5-HT7 y 5-HT2A de serotonina en la vía de la PLC (Teitler y Herrick-Davis, 2014; Teitler y Klein, 2012; Smith y cols., 2011; Teitler y cols., 2010). Dicha aproximación es relativamente sencilla, ya que no requiere receptores mutados y puede ser llevada a cabo en células recombinantes o en cultivos celulares primarios que expresen un GPCR funcional. Se basa en la inactivación del homodímero mediante el empleo de ligandos antagonistas que se unen de un modo pseudo-irreversible a uno de los protómeros, es decir, una interacción no covalente de disociación lenta, energéticamente estable y resistente a lavados. La unión de un antagonista competitivo al protómero libre del homodímero permite disociar al ligando pseudo-irreversible del receptor a través de un mecanismo alostérico de crosstalk entre protómeros, en el cual, el cambio conformacional producido tras la unión del antagonista competitivo a un protómero es transmitido al protómero unido al antagonista pseudo-irreversible, haciendo que esa unión se vuelva reversible y por lo tanto sensible a lavados logrando así la reactivación del receptor. Así, la exposición a una concentración no saturante del inactivador ritanserina (antagonista selectivo 5-HT2A) formará diferentes poblaciones teóricas de homodímeros: un 25% de los homodímeros tendrán ambos protómeros ocupados por el antagonista inactivador y por lo tanto serán inactivos y no recuperables; un 50% tendrán un protómero ocupado y el otro protómero libre siendo inactivos pero recuperables y el otro 25% tendrán ambos protómeros libres (Figura 32A). Los homodímeros con un solo protómero ocupado son inactivos pero pueden ser recuperados tras la incubación con un 122
Discusión antagonista competitivo “reactivador”, en nuestro caso se ha utilizado la espiperona, que se une al protómero libre y a través de un mecanismo de crosstalk entre protómeros provoca la disociación del inactivador. El agente reactivador es eliminado posteriormente por un procedimiento de lavados permitiendo al 75% de los homodímeros restantes ser activados (Figura 32B y 32C) (Teitler y Klein, 2012). Figura 32. Esquema representativo de las diferentes poblaciones del homodímero 5-HT2A de serotonina en experimentos de inactivación-reactivación. A) Poblaciones del homodímero después de la exposición al inactivador ritanserina. B) La unión del antagonista competitivo espiperona al protómero libre produce un efecto alostérico sobre el protómero ocupado por ritanserina provocando su disociación. C) Poblaciones del homodimero 5-HT2A de serotonina tras la eliminación del reactivador (Teitler y Klein, 2012). A C B 123
Discusión Si todos los receptores fueran monómeros no podrían unir un segundo ligando al centro ortostérico, ya que la ritanserina tiene una disociación lenta y no podrían ser activados. La razón para utilizar una concentración no saturante de ritanserina cercana a su IC50 es debido a que ambos protómeros tienen la misma probabilidad de unión produciendo de este modo una inactivación parcial. Si la concentración de ritanserina fuera más alta se produciría la ocupación de todos los protómeros y por lo tanto una inactivación completa y no recuperable. La aproximación farmacológica de inactivación-reactivación utilizada por Teitler y Klein tiene cinco premisas sobre la función del homodímero 5-HT2A: (1) aunque los monómeros, homodímeros y receptores oligoméricos de alto orden coexisten en las células, solo los homodímeros son funcionales; (2) ambos protómeros de un homodímero vacío tienen la misma probabilidad de interacción con ritanserina; (3) la unión de ritanserina a un protómero no cambia la probabilidad de que el segundo protómero interaccione con ritanserina; (4) un homodímero con un protómero ocupado por ritanserina es inactivo y (5) la unión de un antagonista competitivo al homodímero con un protómero ocupado por el inactivador causa la disociación de este y la eliminación del antagonista competitivo vuelve al homodímero a un estado activable (reactivation) (Teitler y Klein., 2012). En primer lugar se evaluó la potencia inhibitoria de la ritanserina en ambas vías efectoras (liberación de AA y acumulación de IPs) obteniendo una potencia (IC50) de 0.05 μM, por ello se seleccionó como concentración no saturante de ritanserina para producir la inactivación de los receptores 5-HT2A de serotonina la concentración de 0.1μM. Tras la inactivación con ritanserina 0.1μM, los perfiles obtenidos para 5-HT y clozapina fueron los mismos que en las curvas control y los previamente descritos sin detectarse cambios en las respectivas potencias, sin embargo, se observaron disminuciones estadísticamente significativas en los valores de eficacia. Así, la 5-HT presentó una disminución del porcentaje de la respuesta máxima (%Emax) del 59±13% y del 71±4% en las vías de la PLA2 y PLC respectivamente. Del mismo modo, las curvas dosis respuesta para la clozapina presentaron disminuciones del porcentaje de la eficacia, obteniendose una Emax del 45±3% y del 23±1% (PLA2 y PLC respectivamente), sugiriendo que solo los receptores con ambos protómeros libres pueden señalizar. 124
Discusión Para verificar que esta señal obtenida pertenece al homodímero 5-HT2A de serotonina y que la funcionalidad de los homodímeros inactivados puede ser recuperada, estos fueron sometidos al proceso de reactivación con espiperona. Tras la completa eliminacion de la espiperona con 4 lavados y posterior incubación con 5-HT y/o clozapina, los perfiles farmacológicos obtenidos no presentaron cambios respecto al control y tampoco se observaron diferencias en las potencias; sin embargo, se reestablecen parcialmente los valores de eficacia. La Emax obtenida para la 5-HT fue del 74±7% y del 72±4% (PLA2 y PLC respectivamente) y para la clozapina del 77±10% y del 71±4% (PLA2 y PLC respectivamente). La falta de una recuperación total de la respuesta máxima se atribuye a la población de homodímeros con los dos protómeros ocupados por ritanserina y que por lo tanto no pueden unir espiperona y ser reactivados. Esto indica que en el homodímero 5-HT2A de serotonina es necesario activar ambos protómeros para señalizar a través de la PLA2 y de la PLC. Dichos resultados concuerdan con los observados previamente en nuestro laboratorio donde la coexpresión del receptor 5-HT2A de serotonina nativo con una variante mutada deficiente en unión a ligandos, 5-HT2A-S159R, reduce su señalización a través de la PLC tras la estimulación por 5-HT en un 72%, existiendo una señalización residual posiblemente debida a la formación de dímeros nativos (tesis doctoral Patricio Atanes Juiz, http://hdl.handle.net/10347/9234). Los mismos resultados fueron observados en el receptor 5-HT2C de serotonina donde la coexpresión del receptor nativo con otro mutado deficiente en unión a ligandos, 5-HT2C-S138R, elimina la actividad basal y disminuye drásticamente la producción de IPs tras la estimulación por 5-HT sin observarse cambios en la potencia (Herrick-Davis y cols., 2005). Ambos autores concluyen que la estequiometría ligando/dímero/proteína G tanto en el receptor 5-HT2A como en el 5-HT2C de serotonina sería 2:1:1 (tesis doctoral Patricio Atanes Juiz, http://hdl.handle.net/10347/9234; Herrick-Davis y cols., 2005). Teitler y Klein propusieron el término valor oligomérico para referirse al número de protómeros que interactuan en receptores oligoméricos. Dicho valor viene limitado por el grado de desplazamiento de las curvas concentración respuesta del antagonista inactivador antes y después de la reactivación y es indicativo del número de protómeros que interactúan. Este valor puede ser 1 para receptores 125
Discusión posteriormente como herramienta para confirmar que la unidad funcional mínima de estos receptores es la homodimérica, la cual presenta cooperatividad negativa, y cuya función está condicionada por la presencia del puente disulfuro conservado entre la Cys148 en el dominio TM3 y la Cys227 en el ECL-2. 132
Conclusiones CONCLUSIONES 1. Se ha desarrollado un ensayo funcional multiplex en placas de 96 pocillos para la medición simultánea de la activación de las vías de señalización PLA2 y PLC a través del receptor 5-HT2A de serotonina, que nos permitió evaluar fenómenos de selectividad funcional y cooperatividad. 2. El antipsicótico típico clozapina presentó selectividad funcional para las vías efectoras estudiadas sobre el receptor 5-HT2A de serotonina, observándose un perfil monofásico en la vía mediada por la PLC y un perfil bifásico en la vía de la PLA2, siendo característico este último de receptores en forma dimérica que presentan cooperatividad negativa. 3. Se ha validado la metodología multiplex a través de una campaña de High Throughput Screening (HTS) con la librería química Prestwick® sobre el receptor 5-HT2A de serotonina, donde diez compuestos presentaron diferencias estadísticamente significativas entre las dos vías efectoras evaluadas, de los cuales siete presentaron una mayor potencia en la vía de la PLA2 y tres en la de la PLC. 4. La inactivación parcial del receptor 5-HT2A de serotonina con ritanserina 0.1μM redujo el efecto máximo de la 5-HT en torno a un 57% en la vía de la PLA2 y en torno a un 74% en la vía de la PLC. Esta reducción sugiere que únicamente los homodímeros que no unieron ritanserina fueron capaces de ser activados por 5-HT en ambas vías efectoras. La posterior unión de espiperona al protómero libre de los dímeros que unicamente unieron una molécula de ritanserina, permitió liberar a la ritanserina a través de un mecanismo de crosstalk, obteniendose un efecto máximo de la 5-HT en torno al 75% (PLA2) y en torno al 71% (PLC). La pérdida de señal se atribuye a la población de homodímeros con ambos protomeros ocupados por ritanserina y por tanto no recuperables. 5. El receptor 5-HT2A de serotonina homodimérico es la unidad funcional mínima de activación de las vías de señalización PLA2 y PLC, existiendo además comunicación alostérica entre los dos protómeros del dímero. 6. La rotura de puentes disulfuro tras el tratamiento con DTT 20mM indujo un descenso en la unión del LSD y modificó la señalización de los receptores 135
Conclusiones 5-HT2A de serotonina en las vías de señalización de la PLA2 y PLC. Mediante estudios de BRET se demostró que el tratamiento con DTT no modificó la naturaleza homodimérica del receptor. 7. Los estudios de modelización molecular y el hecho de que el DTT únicamente rompe puentes disulfuro accesibles al solvente, sugieren que la modificación de la unión y de la función en el receptor 5-HT2A de serotonina se debe a la rotura del puente disulfuro entre la Cys148 (en el dominio TM3) y la Cys227 (en el ECL-2). 8. La presente tesis doctoral demuestra la necesidad de un estado homodimérico del receptor 5-HT2A de serotonina para su señalización, al igual que la integridad del puente disulfuro conservado entre el dominio TM3 y el ECL-2. Estos resultados permitirán el diseño de fármacos, como ligandos bivalentes de los bolsillos de unión ortostéricos o moduladores alostéricos en el ECL-2 más selectivos y/o potentes sobre el receptor 5-HT2A de serotonina homodimérico. 136
Bibliografía BIBLIOGRAFÍA Ahn KH, Bertalovitz AC, Mierke DF, Kendall DA (2009). Dual Role of the second extracellular loop of the cannabinoid receptor 1: ligand binding and receptor localization. Mol. Pharmacol. 76: 833-842. Albizu L, Balestre MN, Breton C, Pin JP, Manning M, Mouillac B y cols. (2006). Probing the existence of G protein-coupled receptor dimers by positive and negative ligand-dependent cooperative binding. Mol. Pharmacol. 70: 1783-1791. Albizu L, Holloway T, González-Maeso J, Sealfon SC (2011). Functional crosstalk and heterodimerization of serotonin 5-HT2A and dopamine D2 receptors. Neuropharmacology. 61: 770-777. Alvir JM, Lieberman JA, Safferman AZ, Schwimmer JL, Schaaf JA (1993). Clozapine-induced agranulocytosis. Incidence and risk factors in the United States. N. Engl. J. Med. 329: 162- 167. Angers S, Salahpour A, Bouvier M (2002). Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 42: 409- 435. Angers S, Salahpour A, Joly E, Hilairet S, Chelsky D, Dennis M y cols. (2000). Detection of beta 2-adrenergic receptor dimerization in living cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 3684-3689. Avlani VA, Gregory KJ, Morton CJ, Parker MW, Sexton PM, Christopoulos A (2007). Critical role for the second extracellular loop in the binding of both orthosteric and allosteric G protein-coupled receptor ligands. J. Biol. Chem. 282: 25677-25686. Aznar S, Hervig Mel-S (2016). The 5-HT2A serotonin receptor in executive function: implications for neuropsychiatric and neurodegenerative diseases. Neurosci. Biobehav. Rev. 64: 63-82. Balu DT, Coyle JT (2011). Neuroplasticity signaling pathways linked to the pathophysiology of schizophrenia. Neurosci. Biovehav. Rev. 35: 848-870. Barington L, Rummel PC, Lückmann M, Pihl H, Larsen O, Daugvilaite V y cols. (2016). Role of conserved disulfide bridges and aromatic residues in extracellular loop 2 of chemokine 139
Bibliografía receptor CCR8 for chemokine and small molecule binding. J. Biol. Chem. 291: 16208- 16220. Barnes NM, Sharp T (1999). A review of central 5-HT receptors and their function. Neuropharmacology. 38: 1083-1152. Bartolomeis A, Buonaguro EF, Iasevoli F (2013). Serotonin-glutamate and serotonindopamine reciprocal interactions as putative molecular targets for novel antipsychotic treatments: from receptor heterodimers to postsynaptic scaffolding and effector proteins. 225: 1-19. Berg KA, Clarke WP, Sailstad C, Saltzman A, Maayani S (1994). Signal transduction differences between 5-hydroxytryptamine type 2A and type 2C receptor systems. Mol. Pharmacol. 46: 477-484. Berg KA, Maayani S, Clarke WP (1998c). Interactions between effectors linked to serotonin receptors. Ann. N. Y. Acad. Sci. 861:111-120. Berg KA, Maayani S, Goldfarb J y cols. (1998a). Effector pathway-dependent relative efficacy at serotonin type 2A and 2C receptors: evidence for agonist-directed trafficking of receptor stimulus. Mol. Pharmacol. 54: 94-104. Berg KA, Maayani S, Goldfarb J, Clarke WP (1998b). Pleiotropic behavior of 5-HT2A and 5- HT2C receptor agonists. Ann. N. Y. Acad. Sci. 861:104-110. Berg KA, Stout BD, Cropper JD et al (1999). Novel actions of inverse agonist on 5-HT2C receptor systems. Mol. Pharmacol. 55: 863-872. Berridge MJ (1984). Inositol trisphosphate and diacylglycerol as second messengers. Biochem. 220: 345-360. Berridge MJ (2009). Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanism. Biochim. Biophys. Acta. 1793: 933-940. Berridge MJ, Downes CP, Hanley MR (1982). Lithium amplifies agonist-dependent phosphatidylinositol responses in brain and salivary glands. Biochem. J. 206: 587-595. Berthouze M, Ayoub M, Russo O, Rivail L, Sicsic S, Fischmeister R (2005). Constitutive dimerization of human serotonin 5-HT4 receptors in living cells. FEBS. Lett. 579: 2973- 2980. 140
Bibliografía Birdsall NJ (2010). Class A GPCR heterodimers: evidence from binding studies. Trends. Pharmacol. Sci. 31: 499-508. Blasco-Fontecilla H, Baca-Garcia E, de Leon J (2010). Do atypical antipsychotic drugs reduce the risk of ischemic heart disease and mortality? Possible role of 5-HT2A receptor blockade. Schizophr. Res. 119: 160-163. Borroto-Escuela DO, Romero-Fernandez W, Tarakanov AO, Marcellino D, Ciruela F, Agnati L y cols. (2010). Dopamine D2 and 5-hydroxytryptamine 5-HT2A receptors assemble into functionally interacting heteromers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 401: 605-610. Bouvier M (2001). Oligomerization of G-protein-coupled transmitter receptors. Nat. Rev. Neurosci. 2: 274-286. Brandish PE, Hill LA, Zheng W y cols. (2003). Scintillation proximity assay of inositol phosphates in cell extracts: high-throughput measurement of G-protein-coupled receptor activation. Anal. Biochem. 313: 311-318. Brea J, Castro M, Giraldo J y cols. (2009). Evidence for distinct antagonist-revealed functional states of 5-hydroxytryptamine (2A) receptor homodimers. Mol. Pharmacol. 75: 1380-1391. Bruno A, Guadix AE, Costantino G (2009). Molecular dynamics simulation of the heterodimeric mGluR2/5HT(2A) complex. An atomistic resolution study of a potential new target in psychiatric condition. Burmakina S, Geng Y, Chen Y, Fan QR (2014). Heterodimeric coiled-coil interactions of human GABAB receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111: 6958-6963. Burnet PW, Eastwood SL, Lacey K, Harrison PK (1995). The distribution of 5HT1A and 5HT2A receptor mRNA in human brain. Brain. Res. 676: 157-168. Burt DR, Enna SJ, Creese I, Snyder SH (1975). Dopamine receptor binding in the corpus striatum of mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 72: 4655-4659. Capper EA, Marshall LA (2001). Mammalian phospholipases A(2): mediators of inflammation, proliferation and apoptosis. Proq. Lipid. Res. 40: 167-197. Carman-Krzan M (1984). The effect of group selective reagents N-ethylmaleimide and dithiothreitol on histamine H1-receptor binding sites in the vascular smooth muscle membranes. Agents Actions. 14: 561-565. 141
Bibliografía Liu G, Frølund B, Ozoe F, Ozoe Y (2015). Differential interactions of 5-(4-piperidyl)-3- isoxazolol analogues with insect γ-aminobutyric acid receptors leading to functional selectivity. Insect. Biochem. Mol. Biol. 66: 64-71. López-Gimenez JF, Canals M, Pediani JD, Milligan G (2007). The α1b-adrenoreceptor exists as a higher-order oligomer: effective oligomerization is required for receptor maduration, surface delivery, and function. Mol. Pharmacol. 71: 1015-1029. López-Giménez JF, Mengod G, Palacios JM, Vilaró MT (1997). Selective visualization of rat brain 5-HT2A receptors by autoradiography with [3H]MDL 100,907. Naunyn- Schmeideberg’s. Arch. Pharmacol. 356: 446-454. López-Giménez JF, Villazón M, Brea J, Loza MI, Palacios JM, Mengod G y cols. (2001). Multiple conformations of native and recombinant human 5-hydroxytryptamine (2a) receptors are labeled by agonist and discriminated by antagonists. Mol. Pharmacol. 60: 690-699. Lucaites VL, Nelson DL, Wainscott BD, Baez M (1996). Receptor subtype and density determine the coupling repertoire of the 5-HT2 receptor subfamily. Life. Sci. 59: 1081- 1095. Lukasiewicz S, Polit A, Kedracka-Krok S, Wedzony K, Máckowiak M, Dziedzicka- Wasylewska M (2010). Hetero-dimerization of serotonin 5-HT2A and dopamine D2 receptors. Biochim. Biophys. Acta. 1803: 1347-1358. Lundstrom K (2013). Present and future approaches to screening of G-protein-coupled receptors. 5: 523-538. Lundstrom K (2016). New winds in GPCR-based drug discovery. Future. Med. Chem. 8: 605-608. Mackie S, Millar JK, Porteous DJ (2007). Role of DISC1 in neural development and schizophrenia. Curr. Opin. Neurobiol. 17: 95-102. Maggio R, Vogel Z, Wess J (1993a). Coexpression studies with mutant muscarinic/adrenergic receptors provide evidence for intermolecular “cross-talk” between G-protein-linked receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 3103-3107. Majerus PW (1992). Inositol phosphate biochemistry. Annu. Rev. Biochem. 61: 225-250. 148
Bibliografía Mancia F, Assur Z, Herman AG, Siegel R, Hendrickson WA (2008). Ligand selectivity in dimeric associations of the serotonin 5HT2c receptor. EMBO. Rep. 9: 363-369. Marinissen MJ, Gutkind JS (2001). G-protein-coupled receptors and signaling networks: emerging paradigms. Trends. Pharmacol. 22: 368-376. Marshall FH, White J, Main M, Green A, Wise A (1999). GABA(B) receptors function as heterodimers. Biochem. Soc. Trans. 27: 530-535. Masson J, Emerit MB, Hamon M, Darmon M (2012). Serotonergic signaling: Multiple effectors and pleiotropic effects. Wiley. Interdiscip. Rev. Membr. Transp. Signal. 1: 685- 713. Maurice P, Kamal M, Jockers R (2011). Asymmetry of GPCR oligomers supports their functional relevance. Trends. Pharmacol. Sci. 32: 514-520. McCorvy JD, Roth BL (2015). Structure and function of serotonin G protein coupled receptors. Pharmacol. Ther. 150: 129-142. Meltzer HY, Matsubara S, Lee JC (1989). Classification of typical and atypical antipsychotic drugs on the basis of dopamine D-1, D-2 and serotonin2 pKi values. J. Pharmacol. Exp. Ther. 251: 238-246. Mestre TA, Zurowski M, Fox SH (2013). 5-Hydroxytryptamine 2A receptor antagonists as potential treatment for psychiatric disorders. Expert. Opin. Investig. Drugs. 22: 411-421. Milligan G (2013). The prevalence, maintenance and relevance of GPCR oligomerization. Mol. Pharmacol. 84: 158-169. Milligan G, Kostenis E (2006). Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br. J. Pharmacol. 147: S46-S55. Miura S, Karnik SS, Saku K (2005). Constitutively active homo-oligomeric angiotensin II type 2 receptor induces cell signaling independent of receptor conformation and ligand stimulation. J. Biol. Chem. 280: 18237-18244. Monnot C, Bihoreau C, Conchon S, Curnow KM, Corvol P, Clauser E (1996). Polar residues in the transmembrane domains of the type 1 angiotensin II receptor are required for binding and coupling. Reconstitution of the binding site by co-expression of two deficient mutants. J. Biol. Chem. 271: 1507-1513. 149
Bibliografía Moreno JL, Miranda-Azpiazu P, García-Bea A, Younkin J, Cui M y cols. (2016). Allosteric signaling through an mGlu2 and 5-HT2A heteromeric receptor complex and its potential contribution to schizophrenia. Sci. Signal. 9: ra5. doi: 10.1126/scisignal.aab0467. Moreno JL, Muguruza C, Umali A, Mortillo S, Holloway T, Pilar-Cuéllar F y cols. (2012). Identification of Three Residues Essential for 5-Hydroxytryptamine 2A-Metabotropic Glutamate 2 (5-HT2A·mGlu2) Receptor Heterodimerization and Its Psychoactive Behavioral Function. J Biol Chem. 287: 44301-44319. Morilak DA, Garlow SJ, Ciaranello RD (1993). Immunocytochemical localization and description of neurons expressing serotonin2 receptors in the rat brain. Neuroscience. 54: 701-717. Morilak DA, Somogyi P, Lujan-Miras R, Ciaranello RD (1994). Neurons expressing 5-HT2 receptors in the rat brain: neurochemical identification of cell types by immunocytochemistry. Neuropsychopharmacology. 11: 157-166. Nguyen AT, Baltos JA, Thomas T, Nguyen TD, Muñoz LL, Gregory KJ y cols. (2016a). Extracellular loop 2 of the adenosine A1 receptor has a key role in orthosteric ligand affinity and agonist efficacy. Mol. Pharmacol. 90: 703-714. Nguyen AT, Vecchio EA, Thomas T, Nguyen TD, Aurelio L, Scammells PJ y cols. (2016b). Role of the second extracellular loop of the adenosine A1 receptor on allosteric modulator binding, signaling, and cooperativity. Mol. Pharmacol. 90: 715-725. Noda K, Saad Y, Graham RM, Karnik SS (1994). The high affinity state of the beta 2- adrenergic receptor requires unique interaction between conserved and non-conserved extracellular loop cysteines. J. Biol. Chem. 269: 6743-6752. Noda K, Saad Y, Graham RM, Karnik SS (1994). The high affinity state of the beta 2- adrenergic receptor requires unique interaction between conserved and non-conserved extracellular loop cysteines. J. Biol. Chem. 269: 6743-6752. Palczewski K, Kumasaka T, Hori T, Behnke CA, Motoshima H, Fox BA y cols. (2000). Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science. 289: 739-745. Park PS (2012). Ensemble of G protein-coupled receptor active states. Curr. Med. Chem. 19: 1146-1154. Park PS, Filipek S, Wells JW, Palczewski K (2004). Oligomerization of G protein-coupled receptors: past, present, and future. Biochemistry. 43: 15643-15656. 150
Bibliografía Pazos A, Cortes R, Palacios JM (1985). Quantitative autoradiographic mapping of serotonin receptors in the rat brain. II. Serotonin-2 receptors. Brain. Res. 346: 231-249. Pazos A, Probst A, Palacios JM (1987). Serotonin receptors in the human brain-IV. Autoradiografic mapping of serotonin-2 receptors. Neuroscience. 21: 123-139. Pedersen SE, Ross EM (1985). Functional activation of beta-adrenergic receptors by thiols in the presence or absence of agonists. J. Biol. Chem. 260: 14150-14157. Peeters MC, van Westen GJ, Li Q, Ijzerman AP (2011). Importance of the extracellular loops in G protein-coupled receptors for ligand recognition and receptor activation. Trends. Pharmacol. Sci. 32: 35-42. Pellissier LP, Barthet G, Gaven F, Cassier E, Trinquet E, Pin JP y cols. (2011). G protein activation by serotonin type 4 receptor dimers: evidence that turning on two protomers is more efficient. J. Biol. Chem. 286: 9985-9997. Peroutka SJ, Snyder SH (1979). Multiple serotonin receptors: differential binding of [3H]5- hydroxytryptamine, [3H]lysergic acid diethylamide and [3H]spiroperidol. Mol. Pharmacol. 16: 687-699. Pin JP, Neubig R, Bouvier M, Devi L, Filizola M, Javitch JA y cols. (2007). International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXVII. Recommendations for the recognition and nomenclature of G protein-coupled receptor heteromultimers. Pharmacol. Rev. 59: 5-13. Ponimaskin EG, Profirovic J, Vaiskunaite R, Richter DW, Voyno-Yasenetskaya TA (2002). 5- Hydroxytrytamine 4(a) receptor is coupled to the galpha subunit of heterotrimeric G13 protein. J. Biol. Chem. 277: 20812-20819. Porteous DJ, Millar JK (2006). Disrupted in schizophrenia 1: building brains and memories. Trends. Mol. Med. 12: 255-261. Portoghese PS, Ronsisvalle G, Larson DL, Yim CB, Sayre LM, Takemori AE (1982). Opioid agonist and antagonist bivalent ligands as receptor probes. Life. Sci. 31: 1283-1286. Ragnarsson L, Andersson Å, Thomas WG, Lewis RJ (2015). Extracellular surface residues of the α1B-adrenoceptor critical for G protein-coupled receptor function. Mol. Pharmacol. 87:121-129. Rapport MM, Green AA, Page IH (1948a). Crystalline serotonin. Science. 108: 329-330. 151
Bibliografía Rapport MM. Green AA, Page IH (1948b). Partial purification of the vasoconstrictor in beef serum. J. Biol. Chem. 174: 735-741. Ray K, Hauschild BC (2000). Cys-140 is critical for metabotropic glutamate receptor-1 dimerization. J. Biol. Chem. 275: 34245-34251. Ray K, Hauschild BC, Steinbach PJ, Goldsmith PK, Hauache O, Spiegel AM (1999). Identification of the cysteine residues in the amino-terminal extracellular domain of the human Ca2+ receptor critical for dimerization. J. Biol. Chem. 274: 27642-27650. Ray WA, Chung CP, Murray KT, Hall K, Stein M (2009). Atypical antipsychotic drugs and the risk of sudden cardiac death. N. Engl. J. Med. 360: 225-235. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992). Specific [3H]raclopride binding to neostriatal dopamine D2 receptors: role of disulfide and sulfhydryls groups. Neurochem. Res. 17: 749-759. Reynolds IJ, Rush EA, Aizenman E (1990). Reduction of NMDA receptors with dithiothreitol increases [3H]-MK-801 binding and NMDA-induced Ca2+ fluxes. Br. J. Pharmacol. 101: 178-182. Rios CD, Jordan BA, Gomes I, Devi LA (2001). G-protein-coupled receptor dimerization: modulation of receptor function. Pharmacol. Ther. 92: 71-87. Romano C, Yang WL, O'Malley KL (1996). Metabotropic glutamate receptor 5 is a disulfidelinked dimer. J. Biol. Chem. 271: 28612-28616. Ross CA, Margolis RL, Reading SA, Pletnikov M, Coyle JT (2006). Neurobiology of schizophrenia. Neuron. 52: 139-153. Roth BL, Sheffler DJ, Kroeze WK (2004). Magic shotguns versus magic bullets: selectively non-selective drugs for mood disorders and schizophrenia. Nat. Rev. Drug. Discov. 3: 353- 359. Roth BL, Willins DL, Kristiansen K, Kroeze WK (1998). 5-Hydroxytryptamine2-Family receptors (5-hydroxytryptamine2A, 5-hydroxytryptamine2B, 5-Hydroxytryptamine2C): where structure meets function. Pharmacol. Ther. 79: 231-257. Saha S, Chant D, McGrath J (2007). A systematic review of mortality in schizophrenia. Is the differential mortality gap worsening over time?. Arch. Gen. Psychiatry. 64: 1123-1131. 152
Bibliografía Samama P, Cotecchia A, Costa T, Lefkowitz RJ (1993). A mutation-induced activated state of the β2-adrenergic receptor. Extending the ternary complex model. J. Biol. Chem. 368: 4625-4636. Santos R, Ursu O, Gaulton A, Bento AP, Donadi RS, Bologa CG y cols. (2017). A comprehensive map of molecular targets. Nat. Rev. Drug. Discov. 16: 19-34. Sawa A, Snyder SH (2003). Schizophrenia: diverse approaches to complex disease. Science. 296: 692-695. Scarselli M, Li B, Kim SK, Wess J (2007). Multiple residues in the second extracellular loop are critical for M3 muscarinic acetylcholine receptor activation. J. Biol. Chem. 282: 7385- 7396. Seeman P, Chau-Wong M, Tedesco J, Wong K (1976). Dopamine receptors in human and calf brains, using [3H]apomorphine and an antipsychotic drug. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 73: 4354-4358. Shi L, Javitch JA (2004). The second extracellular loop of the dopamine D2 receptor lines the binding-site crevice. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101:440-445. Shonberg J, Scammells PJ, Capuano B (2011). Design strategies for bivalent ligands targeting GPCRs. Chem. Med. Chem. 6: 963-974. Smith C, Rahman T, Toohey N, Mazurkiewicz J, Herrick-Davis K, Teitler M (2006). Risperidone irreversible binds to and inactivates the h5-HT7 serotonin receptor. Mol. Pharmacol. 70: 1264-1270. Smith C, Toohey N, Knight JA, Klein MT, Teitler M (2011). Risperidone-induced inactivation and clozapine-induced reactivation of rat cortical astrocyte 5- Hydroxytryptamine7 receptors: evidence for in situ G protein-coupled receptor homodimer protomer cross-talk. Mol. Pharmacol. 79: 318-325. Smith NJ, Milligan G (2010). Allostery at G protein-coupled receptor homo and heteromers: uncharted pharmacological landscapes. Pharmacol. Rev. 62: 701-725. Soto AG, Smith TH, Chen B, Bhattacharya S, Cordova IC, Kenakin T y cols. (2015). N-linked glycosylation of protease-activated receptor-1 at extracellular loop 2 regulates G-protein signaling bias. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112: E3600-E3608. 153
Bibliografía Spengler D, Waeber C, Pantaloni C, Holsboer F, Bockaert J, Seeburg PH y cols. (1993). Differential signal transduction by five splice variants of the PACAP receptor. Nature. 365: 170-175. Stahl SM. Essential psychopharmacology. Neuroscientific basis and practical applications. 2nd ed. Cambridge University Press 2000. ISBN: 84-344-0898-8. Stahl SM. Essential psychopharmacology. Neuroscientific basis and practical applications. 3rd ed. Cambridge University Press 2008. ISBN: 978-0-521-85702-4. Stitham J, Gleim SR, Douville K, Arehart E, Hwa J (2006). Versatility and differential roles of cysteine residues in human prostacyclin receptor structure and function. J. Biol. Chem. 281: 37227-37236. Storjohann L, Holst B, Schwartz TW (2008). A second disulfide bridge from the N-terminal domain to extracellular loop 2 dampens receptor activity in GPR39. Biochemistry. 47: 9198-9207. Szidonya L, Cserzó M, Hunyady L (2008). Dimerization and oligomerization of G-protein- coupled receptors: debated structures with established and emerging functions. J. Endocrinol. 196: 435-453. Talukder I, Kazi R, Wollmuth LP (2011). GluN1-specific redox effects on the kinetic mechanism of NMDA receptor activation. Biophys. J. 101: 2389-2398. Tamminga CA. Schizophrenia and glutamatergic transmission (1998). Crit. Rev. Neurobiol. 12: 21-36. Tandon R, Nasrallah HA, Keshavan MS (2009). Schizophrenia, “just the facts” 4. Clinical features and conceptualization. 110: 1-23. Tandon R, Keshavan MS, Nasrallah HA (2008). Schizophrenia, "just the facts" what we know in 2008. 2. Epidemiology and etiology. Schizophr. Res. 102:1-18. Teitler M, Herrick-Davis K (2014). Determining the oligomer number of native GPCR using florescence correlation spectroscopy and drug-induced inactivation-reactivation. Curr. Pharm. Biotechnol. 15: 927-937. Teitler M, Klein MT (2012). A new approach for studying GPCR dimers: drug-induced inactivation and reactivation to reveal GPCR dimer function in vitro, in primary culture, and in vivo. Pharmacol. Ther. 133: 205-217. 154
Bibliografía Teitler M, Toohey N, Knight JA, Klein MT, Smith C (2010). Clozapine and other competitive antagonists reactivate risperidone-inactivated h5-HT7 receptors: radioligand binding and functional evidence for GPCR homodimer protomer interactions. Psychopharmacology. 212: 687-697. Toohey N, Klein MT, Knight J, Smith C, Teitler M (2009). Human 5-HT7 receptor-induced inactivation of forskolin-stimulated adenylate cyclase by risperidone, 9-OH-risperidone and other “inactivating antagonists”. Mol. Pharmacol. 75: 552-559. Unal H, Jagannathan R, Bhat MB, Karnik SS (2010). Ligand-specific conformation of extracellular loop-2 in the angiotensin II type 1 receptor. J Biol Chem. 285: 16341-16350. Urban JD, Clarke WP, von Zastrow M, Nichols DE, Kobilka B, Weinstein H y cols. (2007). Functional selectivity and classical concepts of quantitative pharmacology. J. Pharmacol. Exp. Ther. 320: 1-13. Vaidehi N, Kenakin T (2010). The role of conformational ensembles of seven transmembrane receptors in functional selectivity. Curr. Opin. Pharmacol. 10: 775-781. Valant C, Lane JR, Sexton PM, Christopoulos A (2012). The best of both worlds? Bitopic orthosteric/allosteric ligands of G protein-coupled receptors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52: 153-178. Varela MJ, Lage S, Caruncho HJ, Cadavid MI, Loza MI, Brea J (2015). Reelin influences the expression and function of dopamine D2 and serotonin 5-HT2A receptors: a comparative study. Neuroscience. 290: 165-174. Vauquelin G, Bottari S, Kanarek L, Strosberg AD (1979). Evidence for essential disulfide bonds in beta1-adrenergic receptors of turkey erythrocyte membranes. Inactivation by dithiothreitol. J. Biol. Chem. 254: 4462-4469. Venkatakrishnan AJ, Deupi X, Lebon G, Tate CG, Schertler GF, Babu MM (2013). Molecular signatures of G-protein-coupled receptors. Nature. 494: 185-194. Vidi PA, Watts VJ (2009). Fluorescent and bioluminescent protein-fragment complementation assays in the study of G protein–coupled receptor oligomerization and signaling. Mol. Pharmacol. 75: 733-739. Vignes M, Guiramand J, Sassetti I, Recasens M (1992). Dithiotreitol specifically inhibits metabotropic responses of glutamate and depolarizing agents in rat brain synaptoneurosomes. Neurochem. Int. 21: 229-235. 155
Bibliografía Viñals X, Moreno E, Lanfumey L, Cordomí A, Pastor A, de La Torre R y cols. (2015). Cognitive impairment induced by Delta9-tetrahydrocannabinol occurs through heteromers between cannabinoid CB1 and serotonin 5-HT2A receptors. PloS. Biol. 13: e1002194. Wacker D, Wang S, McCorvy JD, Betz RM, Venkatakrishnan AJ, Levit A y cols. (2017). Crystal structure of an LSD-bound human serotonin receptor. Cell. 168: 377-389. Wacker D, Wang C, Katritch V, Han GW, Huang XP, Vardy E y cols. (2013). Structural features for functional selectivity at serotonin receptors. Science. 340: 615-619. Wang C, Jiang Y, Ma J, Wu H, Wacker D, Katritch V y cols. (2013). Structural basis for molecular recognition at serotonin receptors. Science. 340: 610-614. Watkins CC, Andrews SR (2016). Clinical studies of neuroinflammatory mechanisms in schizophrenia. Schizophr. Res. 176: 14-22. Weiss JM, Morgan PH, Lutz MW, Kenakin TP (1996b). The cubic ternary complex receptoroccupancy model II. Understanding apparent affinity. J. Theor. Biol. 178: 169-182. Weiss JM, Morgan PH, Lutz MW, Kenakin TP (1996c). The cubic ternary complex receptoroccupancy model III. Resurrecting efficacy. J. Theor. Biol. 181: 381-397. Wheatley M, Simms J, Hawtin SR, Wesley VJ, Wooten D, Conner M y cols. (2007). Extracellular loops and ligand binding to a subfamily of Family A G-protein-coupled receptors. Biochem. Soc. Trans. 35: 717-720. Wheatley M, Wootten D, Conner MT, Simms J, Kendrick R, Logan RT y cols. (2012). Lifting the lid on GPCRs: the role of extracellular loops. Br. J. Pharmacol. 165: 1688-1703. White JH, Wise A, Main MJ, Green A, Fraser NJ, Disney GH y cols. (1998). Heterodimerization is required for the formation of a functional GABA(B) receptor. Nature. 396: 679-682. Wootten D, Reynolds CA, Smith KJ, Mobarec JC, Koole C, Savage EE y cols. (2016). The extracellular surface of the GLP-1 receptor is a molecular trigger for biased agonism. Cell. 165: 1632-1643. Wright M, Drummond GI (1983). Inactivation of the beta-adrenergic receptor in skeletal muscle by dithiols. Biochem. Pharmacol. 32: 509-515. 156
Bibliografía Xie L, Rovira X, Scholler P, Zhao H, Liu J, Pin JP y cols. (2015). Major ligand-induced rearrangement of the heptahelical domain interface in a GPCR dimer. Nat. Chem. Biol. 11: 134-140. Xue L, Rovira X, Scholler P, Zhao H, Liu J, Pin JP y cols. (2015). Major ligand-induced rearrangement of the heptahelical domain interface in a GPCR dimer. Nat. Chem. Biol. 11: 134-140. Zhang D, Zhao Q, Wu B (2015). Structural studies of G protein-coupled receptors. Mol. Cells. 38: 836-842. Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR (1999). A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J. Biomol. Screen, 4: 67-73. Zhang R, Xie X (2012). Tools for GPCR drug discovery. Acta. Pharmacol. Sin. 33: 372-384. Zhang Z, Sun S, Quinn SJ, Brown EM, Bai M (2001). The extracellular calcium-sensing receptor dimerizes through multiple types of intermolecular interactions. J. Biol. Chem. 276: 5316-5322. Zheng FY, Wess J (1999). Identification and Molecular Characterization of m3 Muscarinic Receptor Dimers. J. Biol. Chem. 274: 19487-19497. 157