Alimentos funcionales de origen animal con perfil lipídico modificado: estrategia, herramientas y diseño

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN E BROMATOLOXÍA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA ALIMENTOS FUNCIONALES DE ORIGEN ANIMAL CON PERFIL LIPÍDICO MODIFICADO: ESTRATEGIA, HERRAMIENTAS Y DISEÑO Memoria que para optar al grado de doctor presenta: Beatriz Martínez Ruiz. Lugo, 2011 ISBN 978-84-9887-796-0 (Edición digital PDF) DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN E BROMATOLOXÍA D. Alberto Cepeda Sáez, Catedrático de universidad, D. José Manuel Miranda López, investigador, pertenecientes al Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela y D. José Luis Rodríguez Rodríguez, Profesor titular del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Santiago de Compostela. AUTORIZAN a Dª. Beatriz Martínez Ruiz a la presentación del Trabajo titulado: “Alimentos funcionales de origen animal con perfil lipídico modificado: estrategia, herramientas y diseño”, realizado bajo su dirección en la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste, firman la presente en Lugo, en Abril de 2011. Fdo. D. Alberto Cepeda Sáez Fdo. D. José Manuel Miranda López Fdo. D. José Luis Rodríguez Rodríguez DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN E BROMATOLOXÍA D. Antonio Moreda Piñeiro, Director del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMA que Dª. Beatriz Martínez Ruiz ha realizado en este Departamento y bajo la dirección de D. Alberto Cepeda Sáez, D. José Manuel Miranda López y D. José Luis Rodríguez Rodríguez el trabajo titulado: “Alimentos funcionales de origen animal con perfil lipídico modificado: estrategia, herramientas y diseño”, que presenta para optar al grado de doctor. Y para que así conste donde proceda, firma la presente en Santiago de Compostela, el 19 de Abril de 2011. Fdo. Antonio Moreda Piñeiro AGRADECIMIENTOS El camino ha sido largo, y gracias a la realización de esta tesis doctoral conocí en ese camino a muchas personas, muchos siguieron conmigo hasta el final, a otros sólo me los crucé un momento en el camino y unos cuantos se unieron a mí a la mitad. Guardo de todos un cariñoso recuerdo y sólo espero que ellos también me recuerden a mí con cariño. A todos Gracias! Deseo agradecer de manera especial y sincera a mis directores de tesis. Al Dr. Alberto Cepeda Sáez por aceptarme para realizar esta tesis doctoral en el laboratorio que dirige y sobre todo bajo su propia supervisión. Su apoyo y confianza en mi trabajo y su capacidad para guiar mis ideas han sido un aporte incalculable. Al Dr. José Luís Rodríguez Rodríguez, por iluminarme, por enseñarme todo lo que sé sobre la cromatografía de gases y los ácidos grasos, conocimientos que han sido la clave de este trabajo. Al Dr. José Manuel Miranda López, sin ninguna duda, sin él no habría sido posible, por su trabajo incansable, por su amistad y sus consejos y por los empujones que me daba cuando me faltaban las fuerzas o las ganas. Gracias al Dr. Manuel Vázquez Vázquez, por sus ideas, su colaboración incondicional y su trabajo; por contagiarme su entusiasmo por la investigación desde los Cursos de Doctorado hasta el final de este trabajo. Igualmente quiero agradecer a todo el personal que formó parte del Laboratorio de Higiene, Inspección y Control de alimentos durante la realización de esta tesis, que con su apoyo y cariño, han hecho más llevaderas las jornadas de trabajo. A Carmen, a Rocío y a Rodrigo por su grano de arena, que más bien es una playa entera. Y especialmente a las niñas (Mónica, Carmiña y Minia), porque su apoyo moral (y a veces también físico) fue decisivo en los momentos bajos, y los buenos ratos que pasamos, tan divertidos, espero que se repitan durante muchos años. Deseo hacer constar también mi agradecimiento a la Asociación Gallega de la Carne que junto con la Consellería de Innovación, financiaron alguno de los proyectos que forman parte de esta tesis. Además, el agradecimiento a la Consellería de Innovación de la Xunta de Galicia es por partida doble, por financiar mi trabajo con un contrato Lucas Labrada. A la Universidad de Santiago, a la que llegué con 17 años solo con ilusión, y me voy ahora, después de 15 (casi la mitad de mi vida) con dos licenciaturas y un doctorado. La voy a echar de menos. Gracias a mi familia y a mis amigos, por apoyarme siempre aunque les suponga perderme un poco. A mi abuela que no llegó a verme licenciada, y a las mujeres que la antecedieron por ser siempre un ejemplo para mí. Muy especialmente, gracias a mi madre y a Juan porque la ilusión que pusieron en verme doctorada es lo que hizo que no pensase nunca en desistir. Índice i ÍNDICE AREVIATURAS iii RESUMEN ix I. INTRODUCCIÓN 1 1.1. La alimentación española en los últimos años 3 1.2. Los alimentos funcionales 6 1.2.1. Contextualización y definición 6 1.2.2. Legislación relativa a los alimentos funcionales 9 1.2.3. Estrategias para el diseño de alimentos funcionales 15 1.3. Clasificación y estructura de los lípidos 16 1.3.1. Los triglicéridos 18 1.3.2.Los ácidos grasos 19 1.3.3. Otros lípidos 21 1.4. Los lípidos desde el punto de vista nutricional 23 1.4.1. Fuentes de los ácidos grasos más importantes desde el punto de vista nutricional 24 1.4.2. Recomendaciones dietéticas para el consumo de lípidos 25 1.4.3. Ácidos grasos esenciales 29 1.4.4. Propiedades funcionales de los ácidos grasos omega-3 33 1.4.5 Relación entre la digestión de los lípidos y la composición de los productos animales 36 1.5. La carne 37 1.5.1. Composición nutricional de la carne de vacuno 38 1.5.2. La composición de los preparados de carne para hamburguesa 39 1.5.3. Productos cárnicos con propiedades funcionales 41 1.6. El pescado 43 1.6.1. Composición del pescado 45 1.6.2. El pescado como alimento funcional. 46 1.6.3. Comparación entre pescados salvajes y procedentes de la acuicultura 47 1.7. La leche 48 1.7.1. La grasa de la leche 49 Resumen ix En los últimos años se ha incrementado el interés por parte de las industrias alimentarias y los consumidores por el concepto de “alimento funcional”. Debido a que, el creciente interés del consumidor por alimentos más saludables ha hecho que la industria alimentaria comprendiese la potencialidad del mercado de los alimentos funcionales. A raíz de ello, se ha iniciado a nivel mundial una intensa actividad investigadora en el área de estos nuevos alimentos. Por otro lado, debe destacarse que las grasas alimentarias son los nutrientes que mayor atención han recibido en los últimos años, debido a las connotaciones negativas que tiene para la salud humana de una ingesta elevada de estos nutrientes. Sin embargo, dado que las grasas son esenciales por participar en diversos procesos fisiológicos y patológicos, se han convertido en el centro de muchas investigaciones encaminadas a identificar sus propiedades positivas y negativas. En el trabajo que aquí se presenta se abordará el tema de los alimentos funcionales desde el punto de vista de la salud, pero también desde la perspectiva de la problemática que plantea su obtención para las industrias alimentarias, para las cuales desarrollar este tipo de alimentos significa una importante fuente de diversificación de sus productos. Además, con el desarrollo de nuevos productos funcionales aparece la necesidad de desarrollar métodos rutinarios, rápidos, simples y fiables para la cuantificación de los nutrientes modificados en dichos alimentos. En muchos casos no existen métodos de determinación adecuados para la matriz de cada alimento, puesto que hablamos de nutrientes añadidos, que no son naturales del alimento. En otros casos, se trata de nutrientes que aun siendo naturales en un alimento, anteriormente no eran determinados por no encontrarse en cantidades importantes. Debido a que la problemática a abordar es muy extensa este trabajo se ha centrado en el estudio del perfil de ácidos grasos de alimentos funcionales de origen animal. Es un hecho demostrado que la ingesta de ácidos grasos insaturados puede reducir el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares y posiblemente la incidencia de algunos cánceres, el asma y la diabetes, entre otras enfermedades. Por otra parte, los productos animales han sido criticados por su alto contenido en ácidos grasos saturados, considerándolos perjudiciales para la salud. Por todo ello, en esta línea, se han llevado a Resumen x cabo cuatro trabajos de investigación relacionados con el estudio del perfil lipídico de los alimentos. En el primer estudio se ha desarrollado un preparado cárnico funcional con una formulación lipídica más saludable. Posteriormente se ha realizado un estudio completo del producto desarrollado, que incluye propiedades nutricionales, características físicoquímicas y organolépticas y además se ha determinado su vida útil. Paralelamente se ha realizado un estudio comparativo entre los valores de estos parámetros del producto desarrollado y los de los productos del mismo tipo que se encuentran en el mercado. Habitualmente, el diseño de alimentos funcionales presenta una serie de dificultades asociadas a la adición de los componentes funcionales al alimento, dado que se pretende obtener alimentos funcionales lo más similares posible a los tradicionales y los ingredientes que aportan funcionalidad habitualmente son elementos exógenos. Por este motivo se llevó a cabo un segundo estudio en el cual se ha utilizado el diseño de experimentos y la metodología de superficies de respuesta para conseguir una textura del preparado cárnico similar a la que presentan los productos que hay en el mercado, utilizando transglutaminasa. Puesto que un alimento funcional puede ser un alimento que per se presente efectos beneficiosos para la salud, se ha considerado como tal el pescado, por ser un alimento rico en omega-3. De este modo, se ha dedicado el tercer trabajo de esta tesis a la realización de un estudio comparativo entre las propiedades nutricionales y el perfil lipídico del rodaballo salvaje y el rodaballo de piscifactoría, ya que es un hecho conocido que la alimentación de los animales puede influir en el perfil lipídico de su carne y en sus valores nutricionales. Paralelamente, se ha estudiado también la resistencia a diferentes antimicrobianos de cultivos de Aeromonas spp. y Pseudomonas spp., aislados de músculo de rodaballos salvajes y de cultivo. Este tipo de estudios comparativos se hacen cada vez más necesarios, teniendo en cuenta que el aprovechamiento de la pesca extractiva ha tocado techo y que el incremento en la producción acuícola es y será necesaria en el futuro para satisfacer la demanda mundial de pescado. Como se ha mencionado anteriormente, hay que destacar que a menudo existe un déficit de métodos de rutina rápidos, simples y fiables para la determinación de los Resumen xi nutrientes de interés en los alimentos modificados. Esto nos ha llevado al desarrollo de un método rápido para la determinación de ácidos grasos en leche cruda de vaca. Este método permite el control del perfil lipídico de leche cruda en situaciones en las que es necesario obtener rápidamente resultados de un gran número de muestras, como por ejemplo durante estudios de modificación de la alimentación del ganado encaminados a modificar el perfil lipídico de su producción láctea. I. INTRODUCCIÓN Introducción 3 1.1. La alimentación española en los últimos años Hace décadas, la calidad de la dieta se juzgaba por su capacidad de proporcionar nutrientes para evitar la inanición. En la actualidad, en los países industrializados existe una abundancia y variedad de alimentos casi ilimitada a lo largo de todo el año. Por lo tanto las deficiencias nutritivas en estos países son poco frecuentes. Por el contrario, las enfermedades crónico-degenerativas como obesidad, diabetes mellitus, enfermedades cardiovasculares, hipertensión arterial, osteoporosis, algunos tipos de cáncer, etc., son las enfermedades asociadas a la mala nutrición más preocupantes en este momento en los países industrializados. Este hecho se ve favorecido por los cambios en el estilo de vida con tendencia al sedentarismo, unidos al mayor tiempo que se pasa fuera de casa que conlleva una menor elaboración de los alimentos y un aumento en el consumo de comida rápida. Los cambios que se han producido en la dieta son tanto de tipo cualitativo como cuantitativo. Así, se ha observado un aumento de dietas de alta energía con un significativo rol de grasa y azúcares añadidos en los alimentos, reducción de las ingestas globales de hidratos de carbono complejos, fibra, vegetales y frutas. La grasa de la dieta también ha tenido modificaciones importantes en los últimos años, ya que ha habido grandes variaciones en cuanto a las grasas añadidas, los aceites de consumo, las formas de cocinar, etc. Globalmente se puede decir que la nutrición humana en las sociedades industrializadas se caracteriza por: a) Un aumento en el consumo energético. b) Aumento en el consumo de grasas saturadas, ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) omega-6 (n-6) y ácidos grasos trans (AGt), y una disminución en el consumo de ácidos grasos omega-3 (n-3). c) Disminución en el consumo de carbohidratos complejos y fibra. Introducción 4 d) Disminución en el consumo de frutas y verduras, y aumento en el de cereales. e) Aumento en el consumo de proteínas y disminución en el de antioxidantes (Mata y col., 2002). Estos desequilibrios son en parte responsables de la alta incidencia de obesidad (que ha alcanzado en estos países unos niveles alarmantes) así como de la aparición de enfermedades crónicas y degenerativas (Lo y col., 2008). La cultura alimentaria de la población española de las zonas atlánticas se caracteriza por una alimentación más rica en proteínas, especialmente las procedentes de carnes rojas, de ganado bovino, mientras que en las zonas mediterráneas se consume una mayor cantidad de carnes magras como el pollo y el conejo. En el arco atlántico se consumen también más pescado, que es su alimento básico, huevos, productos lácteos y legumbres. Curiosamente, también se consume una mayor cantidad de aceite de oliva, a pesar de no ser zonas tan típicamente productoras de este producto como el resto de España (Barroso y Grande, 2003). En el marco de la dieta mediterránea los alimentos más representativos son, verduras, hortalizas, frutas, aceite de oliva y vino tinto, el consumo de leguminosas y pescados es también importante pero menor que en el marco atlántico, mientras que el consumo de carne y lácteos es moderado. Dada la especial composición de este tipo de dietas, en la que predominan productos que tiene naturaleza funcional per se, como el pescado y el aceite de oliva, podemos clasificarlas como dietas funcionales. Sin embargo, en los últimos años se ha observado una rápida e importante modificación de los hábitos alimenticios de la población española, que afecta especialmente a la población más joven. Como resultado de estas modificaciones, el consumo de proteínas en España (93,5 g/persona/día) según la Federación Española de la Nutrición (FEN) se considera excesivo, excediendo en un 73 % las recomendaciones (FEN, 2007). Por otra parte, se recomienda que la dieta aporte unos 25-30 g/día de fibra, y la población española no alcanza estas recomendaciones, debido a la baja ingesta de productos de origen vegetal. En relación a la ingesta de macronutrientes, la mayor variación, entre el año 1964 y el 2006 (Figura 1), se ha producido en los hidratos de carbono, para los que se ha reducido la ingesta en casi 150 g/persona y día, Introducción 5 probablemente debido al descenso en el consumo de alimentos pertenecientes al grupo de cereales y derivados, además de patatas. De este modo, el perfil calórico medio se caracteriza por un elevado aporte de lípidos a expensas de los hidratos de carbono (FEN, 2007). El 30% de los lípidos consumidos durante el 2006 (126,1 g) fue proporcionado por aceites y grasas, mientras las carnes y derivados suministraron el 28%, es decir, el grupo de carnes y derivados aportó casi la misma cantidad de lípidos que el de aceites y grasas, este es un aspecto preocupante en nuestra dieta. Aunque todos los alimentos tienen ácidos grasos de distinto grado de saturación, el grupo de carnes y derivados contiene un mayor porcentaje de ácidos grasos saturados (AGS), por el contrario, el de aceites y grasas incluye mayoritariamente AGPI (girasol, maíz, soja,…) y ácidos grasos monoinsaturados (AGMI) (oliva). En la población española, el perfil lipídico medio muestra un porcentaje de AGS y AGPI superior a las recomendaciones. Viendo la evolución del perfil lipídico desde 1964 (Figura 2), se comprueba que el porcentaje de AGPI sobre la energía total casi se ha triplicado. Por otro lado, las relaciones (AGMI+AGPI)/AGS y AGPI/AGS mostraron valores satisfactorios. Se observa un consumo satisfactorio de ácidos grasos de la familia n-3 situado entre 0,2 y 2 g/día. Sin embargo, el consumo de ácido eicosapentaenoico (EPA) más ácido docosahexaenoico (DHA) se encuentra marcadamente por debajo de las recomendaciones (0,15-0,16 Figura 1. Evolución de la ingesta de macronutrientes (g/persona y día) Introducción 12 Bajo contenido en sodio/sal: podrá alegarse que un alimento tiene bajo contenido en sodio si el producto no contiene más de 0,12 g de sodio o el valor equivalente de sal, por 100 g o por 100 ml. Muy bajo contenido de sodio/sal: podrá declararse que un alimento posee un contenido muy bajo de sodio/sal, si el producto no contiene más de 0,04 g de sodio, o el valor equivalente de sal, por 100 g o por 100 ml. Sin sodio o Sin sal: podrá declararse que un alimento no contiene sodio o sal, si el producto no contiene más de 0,005 g de sodio, o el valor equivalente de sal, por 100 g. Fuente de fibra: esta alegación puede realizarse si el producto contiene como mínimo 3 g de fibra por 100 g o 1,5 g de fibra por 100 Kcal. Alto contenido de fibra: podrá declararse que un alimento posee un alto contenido de fibra, si el producto contiene como mínimo 6 g de fibra por 100 g o 3 g de fibra por 100 kcal. Fuente de proteínas: podrá declararse que un alimento es fuente de proteínas, si las proteínas aportan como mínimo el 12 % del valor energético del alimento. Alto contenido de proteínas: podrá declararse que un alimento posee un alto contenido de proteínas, si las proteínas aportan como mínimo el 20 % del valor energético del alimento. Fuente de vitaminas y/o minerales: podrá declararse que un alimento es una fuente de vitaminas y/o minerales, si el producto contiene como mínimo una cantidad significativa tal como se define en el Anexo de la Directiva 90/496/CEE o una cantidad establecida por las excepciones concedidas en virtud del artículo 6 del Reglamento (CE) 1925/2006 [sobre la adición de vitaminas, minerales y otras determinadas sustancias a los alimentos]. Alto contenido de vitaminas y/o minerales: podrá declararse que un alimento posee un alto contenido de vitaminas y/o minerales, si el producto contiene como Introducción 13 mínimo dos veces el valor de la «fuente de [NOMBRE DE LAS VITAMINAS] y/o [NOMBRE DE LOS MINERALES]». Contiene….: podrá declararse que un alimento contiene un nutriente u otra sustancia, para los que no se establezcan condiciones específicas en el Reglamento 1924/2006, si el producto cumple todas las disposiciones aplicables previstas en el Reglamento 1924/2006, y en particular en el artículo 5. Por lo que respecta a las vitaminas y minerales, se aplicarán las condiciones correspondientes a la declaración «fuente de». Mayor contenido de…: podrá declararse que se ha incrementado el contenido de uno o más nutrientes, distintos de vitaminas o minerales, así como efectuarse cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, si el producto cumple las condiciones previstas para la declaración «fuente de» y el incremento de su contenido es de, como mínimo, el 30 % en comparación con un producto similar. Contenido reducido de…: podrá declararse que se ha reducido el contenido de uno o más nutrientes, si la reducción del contenido es de, como mínimo, el 30 % en comparación con un producto similar, excepto para micronutrientes, en los que será admisible una diferencia del 10 % en los valores de referencia establecidos en la Directiva 90/496/CEE, así como para el sodio, o el valor equivalente para la sal, en que será admisible una diferencia del 25 %. Light/Lite/Ligero: las declaraciones en las que se afirme que un producto es «light» o «lite» (ligero), y cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, deberán cumplir las mismas condiciones que las establecidas para el término «contenido reducido»; asimismo, la declaración deberá estar acompañada por una indicación de la característica o características que hacen que el alimento sea «light» o «lite» (ligero). Naturalmente/Natural: cuando un alimento reúna de forma natural la condición o las condiciones establecidas en el presente Anexo para el uso de una declaración nutricional, podrá utilizarse el término «naturalmente/natural» antepuesto a la declaración. Introducción 14 Finalmente, el Reglamento (CE) nº 1925/2006, de 20 de diciembre de 2006 regula la adición de vitaminas, minerales y otras determinadas sustancias a los alimentos. En virtud de este reglamento se fijan en el anexo de la Directiva 90/496/CEE las cantidades mínimas significativas de vitaminas o minerales que deben estar presentes en un alimento para declararlo “fuente de...”. Fijándose este valor en una dosis equivalente al 15 % de la CDR (cantidad diaria recomendada) para cada una de las vitaminas y minerales. El Reglamento (CE) 1924/2006 se ha modificado recientemente en lo relativo a la lista de declaraciones nutricionales, por el Reglamento (CE) 116/2010 de la Comisión, de 9 de febrero de 2010. Esta modificación afecta al uso de las declaraciones nutricionales en relación con los ácidos grasos n-3, las grasas monoinsaturadas, las grasas poliinsaturadas y las grasas insaturadas. Según esta reciente modificación se establecen las siguientes condiciones para la utilización de declaraciones nutricionales que se refieran a esos elementos: Fuente de ácidos grasos omega-3: podrá declararse que un alimento es fuente de ácidos grasos omega-3 o efectuarse cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, si el producto contiene al menos 0,3 g de ácido α-linolénico (ALA) por 100 g y por 100 kcal, o al menos 40 mg de la suma de EPA y DHA por 100 g y por 100 kcal. Alto contenido de ácidos grasos omega-3: podrá declararse que un alimento tiene un alto contenido de ácidos grasos omega-3 o efectuarse cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, si el producto contiene al menos 0,6 g de ácido ALA por 100 g y por 100 kcal, o al menos 80 mg de la suma de EPA y DHA por 100 g y por 100 kcal. Alto contenido de grasas monoinsaturadas: podrá declararse que un alimento tiene un alto contenido de grasas monoinsaturadas o efectuarse cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, si al menos un 45 % de los ácidos grasos presentes en el producto proceden de grasas monoinsaturadas y las grasas monoinsaturadas aportan más del 20 % del valor energético del producto. Introducción 15 Alto contenido de grasas poliinsaturadas: podrá declararse que un alimento tiene un alto contenido de grasas poliinsaturadas o efectuarse cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, si al menos un 45 % de los ácidos grasos presentes en el producto proceden de grasas poliinsaturadas y las grasas poliinsaturadas aportan más del 20 % del valor energético del producto. Alto contenido de grasas insaturadas: podrá declararse que un alimento tiene un alto contenido de grasas insaturadas o efectuarse cualquier otra declaración que pueda tener el mismo significado para el consumidor, si al menos un 70 % de los ácidos grasos presentes en el producto proceden de grasas insaturadas y las grasas insaturadas aportan más del 20 % del valor energético del producto. 1.2.3. Estrategias para el diseño de alimentos funcionales En la actualidad se trabaja en tres frentes diferentes para obtener alimentos funcionales de origen animal. Actuación sobre el genoma; sobre la alimentación animal y/o sobre el proceso de elaboración del producto (Sánchez-Muñiz, 2005). Los principales pasos a seguir en el diseño de alimentos funcionales son los siguientes: 1. Selección de innovaciones prioritarias en forma de adición y/o supresión de ingredientes funcionales o componentes del alimento. 2. Formulación cualitativa/cuantitativa preliminar del alimento funcional, teniendo en cuenta las características deseadas. 3. Indagación sobre los efectos beneficiosos deseados, dosis recomendables, biodisponibilidad, sobredosis de seguridad y sistemas de aplicación apropiado al alimento y compatibilidad de los ingredientes con el alimento. 4. Evaluación organoléptica preliminar del alimento diseñado, para determinar el grado de aceptabilidad. En caso de ser necesario, hacer los ajustes pertinentes, utilizando colorantes, texturizantes o sustancias que enmascaran olores/sabores sin alterar la composición. 5. En caso de evaluación organoléptica positiva, realización del diseño a escala laboratorial del alimento funcional. 6. Estudio de la estabilidad de los componentes funcionales del alimento, en las condiciones normales de almacenamiento y consumo. Introducción 16 7. Estudio de la vida media útil del alimento funcional, para comprobar el tipo y nivel de degradación previsible o modificación de sus caracteres organolépticos en relación al producto base. 8. Planificación de un ensayo industrial confirmativo. 9. Análisis del contenido de ingredientes funcionales en el alimento y evaluación analítica periódica para comprobar la posible degradación de los mismos a lo largo de su vida útil. 10. Finalmente, la validación definitiva del diseño, comprobando la conformidad del alimento funcional a nivel organoléptico, físico-químico, microbiológico, de comportamiento (estabilidad y durabilidad) y de cumplimiento industrial (Gavilán, 2007). 1.3. Clasificación y estructura de los lípidos Los lípidos son un grupo de substancias diversas de naturaleza compleja, que se encuentran en los tejidos vegetales y animales y están formados básicamente por carbono, hidrógeno y, en menor proporción, oxígeno; aunque en ocasiones también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. Estas sustancias comparten dos características, ser insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos. Por ser un grupo de sustancias tan heterogéneo su clasificación (Tabla 1) es complicada, realizándose esta en base a criterios empíricos, basándose en si son saponificables; es decir, si forman jabones al reaccionar con sosa o potasa, o insaponificables; cuando no poseen dicha propiedad. (De Blas y col., 1987). Los lípidos saponificables contienen ácidos grasos en su estructura, mientras que los insaponificables no. Introducción 17 Tabla 1. Clasificación de los lípidos Saponificables Simples Ácidos grasos Solamente poseen carbono, hidrógeno y oxígeno. Glicéridos Ceras Complejos Fosfoglicéridos Estructura similar a las grasas, pero contienen fósforo y nitrógeno. Esfingolípidos Glicolípidos Insaponificables Esteroides Terpenos Prostaglandinas Los lípidos, cumplen las siguientes funciones en el organismo: 1.- Función de reserva energética, almacenándose en forma de triacilgliceroles. 2.- Función estructural, formando las bicapas lipídicas que componen las membranas biológicas, en forma de fosfolípidos. 3.- Función de señalización celular, participando en la transmisión de señales bajo la forma de mensajeros intracelulares hormonas esteroideas, fosfatidilinositol, eicosanoides y derivados de la esfingosina. 4.- Función transportadora desde donde son absorbidos (intestino) o producidos (hígado) hasta sus destinos, asociándose a apolipoproteínas en forma de lipoproteínas. La mayoría de los lípidos de reserva están en forma de triglicéridos, en más de un 95 %, que son los lípidos más abundantes. Además, los lípidos de reserva de energía son los predominantes en los animales, son los lípidos que se encuentran en forma de grasa que puede llegar a constituir el 97% del tejido adiposo en un animal obeso. Los lípidos estructurales (principalmente fosfoglicéridos) constituyen entre el 0,5 y 1% del tejido muscular y adiposo. Introducción 18 1.3.1. Los triglicéridos Las grasas o glicéridos son ésteres de ácidos grasos con el alcohol trihídrico 1,2,3-propanotriol (glicerol). Cuando los tres grupos alcohol se esterifican con ácidos grasos se habla de triglicéridos (triacilgliceroles). Aunque los triglicéridos son los más abundantes, los mono y diglicéridos también pueden aparecer de forma natural, pero en menores cantidades. Estos glicéridos se forman en una reacción de esterificación donde el grupo funcional carboxilo de cada ácido graso se une a un grupo funcional alcohol mediante un enlace covalente de tipo éster, desprendiéndose una molécula de agua (Figura 3). + + +H 2 C OH H 2 C OH H 2 C OH OH CR 1 COH R 3 C R 2 OH O O O Glicerol Ácidos grasos H 2 C O H 2 C O H 2 CO C R 1 C R 3 C R 2 O O O Triglicérido + 3 H 2 O + + +H 2 C OH H 2 C OH H 2 C OH H 2 C OH H 2 C OH H 2 C OHH 2 C OH H 2 C OHH 2 C OH OH CR 1 COH R 3 C R 2 OH O O O OH CR 1 OH CR 1 COH R 3 COH R 3 C R 2 OH C R 2 OH O O O Glicerol Ácidos grasos H 2 C O H 2 C O H 2 CO C R 1 C R 3 C R 2 O O O Triglicérido H 2 C O H 2 C O H 2 CO C R 1 C R 3 C R 2 O O O H 2 C O H 2 C O H 2 CO H 2 C O H 2 C O H 2 CO C R 1 C R 3 C R 2 O O O C R 1 C R 3 C R 2 O O O Triglicérido + 3 H 2 O Los triglicéridos constituyen la principal forma de almacenamiento de energía, en alimentos de origen animal y vegetal, así como en el organismo humano. En cantidades elevadas son perjudiciales, ya que pueden producir depósitos de grasa. Se clasifican en diferentes tipos según la naturaleza y la situación de los ácidos grasos que los forman. Si los tres ácidos grasos son los mismos se llaman triglicéridos simples, y si son diferentes se habla de triglicéridos mixtos. Las grasas y aceites naturales son mezclas de triglicéridos mixtos. Dependiendo del tipo de ácido graso mayoritario presente en las grasas éstas se pueden clasificar como: saturadas (con presencia mayoritaria de AGS), monoinsaturadas (si la mayor parte de los ácidos grasos son monoinsaturados) y poliinsaturadas (si la mayor parte de los ácidos grasos que las forman son poliinsaturados). La composición de ácidos grasos de los triglicéridos determina sus características físicas. Figura 3. Formación y estructura básica de los triglicéridos. Los radicales (R 1 , R 2 y R 3 ) consisten en una cadena hidrocarbonada de longitud y saturación variable. Introducción 19 1.3.2. Los ácidos grasos Los ácidos grasos son las moléculas lipídicas con mayor interés nutricional. Forman parte de los triglicéridos y de los lípidos complejos, y también pueden esterificar al colesterol. Están constituidos por una cadena hidrocarbonada de mayor o menor longitud, con un grupo carboxilo en un extremo (HOOC-) y un grupo metilo (H 3 C-) en el otro, cuya fórmula es la siguiente: CH 3 -(CH 2 ) n COOH Donde n representa el número de átomos de carbono de que está compuesto el ácido graso. Este número será al menos dos, para formar el ácido butírico, que es el ácido graso de cadena más corta. Los ácidos grasos de interés biológico poseen un número par de átomos de carbono (fundamentalmente entre 4 y 26) y se clasifican en cuatro grupos atendiendo a la longitud de su cadena hidrocarbonada. Así los ácidos grasos de cadena corta tienen entre 4 y 6 átomos de carbono; los ácidos grasos de cadena media presentan entre 8 y 12; los ácidos grasos de cadena larga poseen entre 14 y 18; y finalmente, los ácidos grasos de cadena muy larga son aquellos que presentan 20 o más átomos de carbono en su cadena hidrocarbonada (Mataix, 2002). Los ácidos grasos se clasifican también según la saturación de su cadena hidrocarbonada (Figura 4). Según esto, existen básicamente dos tipos de ácidos grasos, los saturados y los insaturados, estos últimos se clasifican atendiendo al número de insaturaciones que presenten. Los AGS por su parte, presentan estructuras lineales con un número par de átomos de carbono unidos todos ellos por enlaces simples. Los AGMI contienen un doble enlace, como el ácido oleico (cis18:1n-9). Finalmente, los AGPI, son aquellos que contienen más de un doble enlace y se clasifican en función de la posición del último doble enlace respecto al grupo metilo terminal. En función de esta clasificación destacan dos familias de AGPI los n-6 y los n-3. Introducción 20 Ácido graso monoinsaturado Ácido oleico Ácido graso poliinsaturado Ácido linoleico Ácidos grasos saturados Ácido palmítico Ácido esteárico Figura 4. Estructura de los ácidos grasos según el número de insaturaciones En los ácidos grasos que poseen dobles enlaces, la conformación de los mismos suele ser de tipo cis. Aunque también existen de forma natural, minoritariamente, hay ácidos grasos con dobles enlaces con conformación trans, presentes de forma natural en la grasa de la leche y de la carne de los rumiantes, pueden originarse también debido a transformaciones químicas de los ácidos grasos naturales durante diversos procesos tecnológicos como la hidrogenación. Los ácidos grasos con dobles enlaces trans son rectos, como los saturados, a diferencia de los que poseen dobles enlaces cis dan como resultado moléculas angulares. Por lo cual, los AGt no pueden sustituir nutricionalmente a los cis, porque aunque proporcionan la misma cantidad de energía, no tienen las mismas propiedades biológicas que sus homólogos cis. Además de su configuración, hay que destacar, que los dobles enlaces de los ácidos grasos poliinsaturados más abundantes suelen situarse de forma que siempre aparezca un grupo metileno entre dos dobles enlaces, es decir, los siguientes se sitúan a una distancia de tres carbonos en dirección al extremo carboxilo. Gracias a este hecho, los AGPI más comunes pueden ser descritos indicando simplemente, el número de dobles enlaces y la posición del doble enlace más cercano al grupo terminal metilo, mientras que el resto de las posiciones de los dobles enlaces pueden ser deducidos (Wallis y col., 2002). Introducción 21 Sin embargo, existen casos de ácidos grasos naturales con dobles enlaces conjugados, como es el caso de los del ácido linoleico conjugado (CLA). Este CLA (Figura 5) representa a una mezcla de 28 isómeros posicionales y geométricos del ácido linoleico caracterizados por tener dobles enlaces conjugados, en lugar de estar separados por un grupo metileno (Steinhart y col., 2003). Estos dobles enlaces, pueden presentarse en forma de distintos isómeros posicionales, situándose en las posiciones 8 y 10, 9 y 11, 10 y 12, 11 y 13; y presentando también distintas configuraciones (isómeros geométricos cis, cis; cis, trans; trans, cis; y trans, trans) y suelen estar situados en las (Wahle y col., 2004). Figura 5. Estructura de diversos isómeros de ácido linoleico conjugado En la nomenclatura abreviada para los ácidos grasos, un primer número indica el número de átomos de carbono, un segundo número, tras dos puntos, indica el número de dobles enlaces, finalmente la letra n seguida de un número, y separada de este por un guión, indica la posición del primer doble enlace contando a partir del grupo metilo del ácido graso, al que se denomina extremo omega. 1.3.3. Otros lípidos Los llamados lípidos complejos, glicerofosfolípidos (fosfolípidos) y esfingolípidos, contienen en su estructura otros átomos además de carbono, hidrógeno y Introducción 28 colesterol sanguíneo. Mientras que los ácidos grasos monoinsaturados no modifican los niveles de colesterol sanguíneo, pero sí elevan la proporción de lipoproteínas HDL, que son las lipoproteínas encargadas de reenviar el exceso de colesterol acumulado en tejidos extrahepáticos al hígado para su transformación en sales biliares (transporte reverso del colesterol). Para conseguir estos objetivos, y basándose en los hábitos alimentarios de la población española en general, la SENC realizó una serie de recomendaciones alimentarias que hacen posible un aporte de ácidos grasos acorde a lo expuesto anteriormente (Mataix y col., 2001): − Limitar el consumo de grasa láctea, consumiendo productos desnatados o semidesnatados, y reduciendo el consumo de mantequilla. − Limitar o evitar el consumo de alimentos que contengan ácidos grasos de tipo trans. − Limitar el consumo de margarinas, seleccionando aquellas que contengan menores cantidades de AGPI. − El aceite será preferentemente de oliva, quedando como segunda opción los aceites de semillas como girasol, maíz o soja. Dentro de los distintos aceites de oliva, se recomiendan especialmente los de tipo virgen, por su mayor capacidad antioxidante. − Limitar el consumo de grasas procedentes de animales terrestres, seleccionando preferentemente piezas magras. − Es más recomendable cualitativamente la grasa de aves y cerdo que la de rumiantes. No obstante, eligiendo piezas magras, dichas diferencias no son significativas. − Limitar los embutidos a excepción del jamón, y evitar la porción grasa del mismo. − Limitar el consumo de productos de pastelería, bollería y heladería que contengan grasa saturada. − Finalmente, mantener o incrementar el consumo de grasa procedente de pescados. Introducción 29 1.4.3. Ácidos grasos esenciales Los AGPI se agrupan fundamentalmente en tres familias o series: los pertenecientes a serie n-3, de los cuales su precursor es el ácido ALA, la serie n-6, de los cuales el precursor es el ácido linoleico, y la serie n-9, de los cuales el precursor es el ácido oleico. Aunque existen otras series de AGPI, como es la serie omega-7 (n-7) o la serie omega-11 (n-11), éstas son minoritarias dentro de la grasa de los alimentos y no alcanzan la importancia nutricional de las tres series citadas anteriormente. La mayoría de los ácidos grasos pueden ser sintetizados por los mamíferos a partir de los hidratos de carbono de la dieta. Pero en nuestro organismo no existen mecanismos capaces de desaturar la cadena hidrocarbonada de los ácidos grasos en las posiciones 3 y 6, por este motivo los ácidos grasos linoleico (n-6) y ALA (n-3) (Figura 9) son ácidos grasos esenciales para el hombre y deben de ser ingeridos con los alimentos (Morimoto y otros, 2005). El ácido oleico no se considera esencial para los mamíferos, ya que puede ser sintetizado a partir del ácido esteárico (Mataix y col., 2001). Figura 9. Imagen de la estructura de los ácidos grasos esenciales . Los AGPI de cadena larga se sintetizan en el organismo a partir de estos ácidos grasos esenciales, mediante ciclos de desaturación de la cadena (con enzimas desaturasas) y elongación la misma (por las enzimas elongasas). De este modo los AGPI n-6 derivan del linoleico, mientras que los n-3 derivan del ALA (Figura 10). Así, el ALA (18:2n-6) se metaboliza a ácido araquidónico (ARA, 20:4n-6), por la acción de la ∆ 6 -desaturasa, de una elongasa y de una ∆ 5 -desaturasa. Mientras que el ALA se transforma del modo similar en EPA y posteriormente en DHA. Sin embargo, el Introducción 30 mecanismo final por el que se llega a la síntesis de DHA aún no está del todo claro, aunque todo apunta a que la síntesis tiene lugar mediante elongación y ∆6-desaturación, seguidas por una retroconversión a través de una β-oxidación peroxisomal (Qiu, 2003). Todas estas transformaciones emplean rutas metabólicas similares, compitiendo por las mismas enzimas. Las reacciones enzimáticas tienen lugar en el retículo endoplasmático de las células de unos pocos órganos y tejidos, como el intestino, el hígado, el cerebro y la retina. A priori, cabría pensar que un aporte adecuado de los dos ácidos grasos esenciales, al ser precursores de sus correspondientes series, proporcionarían un aporte adecuado de la serie de ácidos grasos completa. No obstante, en la práctica esto no es así, ya que dentro del organismo existen interacciones entre los distintos nutrientes que provocan tanto aumentos como descensos en los requerimientos de cada uno de los ácidos grasos (Gil, 2010). Tampoco es infrecuente, especialmente en niños y en adultos de edad avanzada, que debido a un déficit en alguna de las enzimas que catalizan las correspondientes vías enzimáticas, no se asegura con el aporte de estos dos ácidos grasos ya mencionados la síntesis adecuada de los distintos miembros de las familias de ácidos grasos correspondientes (Koletzko y col., 2010). Introducción 31 Ácido Linoleico (18:2) Serie Omega-6 Ácido Araquidónico (20:4) Ácido γ-Linolénico (18:3) Ácido Dihomo-γ-Linolénico (20:3) 22:4 24:4 Serie Omega-9 Ácido Oleico (18:1) 18:2 20:2 20:3 22:3 ∆6 Desaturasa 18-20 Elongasa ∆5 Desaturasa 20-22 Elongasa 22-24 Elongasa ∆6 Desaturasa 18-20 Elongasa ∆5 Desaturasa 20-22 Elongasa Serie Omega-3 Ácido α-Linolénico (18:3) Ácido Estearidónico (18:4) Ácido Eicosatetraenoico (20:4) Ácido Eicosapentaenoico (EPA) (20:5) Ácido Docosapentaenoico (22:5) 24:5 ∆6 Desaturasa β-oxidación peroxisomal 24:5 24:6 22:5 Ácido Docosahexaenoico (DHA) (22:6) Ácido Linoleico (18:2) Serie Omega-6 Ácido Araquidónico (20:4) Ácido γ-Linolénico (18:3) Ácido Dihomo-γ-Linolénico (20:3) 22:4 24:4 Serie Omega-9 Ácido Oleico (18:1) 18:2 20:2 20:3 22:3 ∆6 Desaturasa 18-20 Elongasa ∆5 Desaturasa 20-22 Elongasa 22-24 Elongasa ∆6 Desaturasa 18-20 Elongasa ∆5 Desaturasa 20-22 Elongasa Serie Omega-3 Ácido α-Linolénico (18:3) Ácido Estearidónico (18:4) Ácido Eicosatetraenoico (20:4) Ácido Eicosapentaenoico (EPA) (20:5) Ácido Docosapentaenoico (22:5) 24:5 ∆6 Desaturasa β-oxidación peroxisomal 24:5 24:6 22:5 Ácido Docosahexaenoico (DHA) (22:6) Figura 10. Esquema de la biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Las enzimas más relevantes desde el punto de vista metabólico en estos procesos son la ∆ 5 -desaturasa y la ∆ 6 -desaturasa, y en particular esta última. La afinidad de la ∆ 6 - desaturasa por los diferentes ácidos grasos es muy distinta, siendo mayor por el ALA que por el ácido linoleico, y por este motivo, si el aporte nutricional de ALA es muy elevado, no habrá suficiente enzima y por lo tanto, disminuirá la producción de los ácidos grasos de mayor numero de poliinsaturaciones pertenecientes a la serie n-6. No obstante, si tal y como suele suceder en los países occidentales, el aporte a través de la dieta de ácido linoleico es mucho mayor que el de ALA, la transformación de éste último en sus derivados n-3 será insuficiente (Gil, 2010), al haber mayor disponibilidad del sustrato de la serie n-6 (ácido linoleico) para dicha enzima. Por otra parte, la afinidad de la ∆ 6 -desaturasa por el ácido oleico es muy inferior a la apetencia por los ácidos ALA y linoleico. Por este motivo, sólo en casos de deficiencia grave de ácidos grasos esenciales se forman AGPI a partir del oleico. Por Introducción 32 tanto, si la transformación del ALA y del ácido linoleico en sus respetivos ácidos grasos de cadena larga es inhibida totalmente, se formará a partir del ácido oleico una alta proporción de un ácido graso de cadena larga de la serie n-9, el ácido 5,8,11- eicosatrienoico (20:3n-9), como un efecto compensatorio a la carencia de ácidos grasos de cadena larga pertenecientes a la serie n-3 y n-6. La acumulación de este ácido graso puede tomarse, por lo tanto, como una clara señal de insuficiente aporte de ALA y linoleico en nuestra dieta (Valenzuela y Morgano, 1999). Como se ha visto, el ácido ALA es precursor del DHA, pero a la vez compite con él por la ∆ 6 -desaturasa. Debido a esto se ha observado que la ingesta de ácido ALA tiene una relación directa con los niveles de EPA en hígado, eritrocitos y cerebro, pero no con los niveles de DHA. De hecho, la concentración de DHA en estos tejidos se incrementa cuando la ingesta de ácido ALA empieza a disminuir a partir de un cierto nivel (Blank y col., 2002; Cleland y col.,2005) Aproximadamente, el 95% del ácido linoleico que se aporta por la dieta es oxidado en las mitocondrias, con la finalidad de obtener energía, y sólo un pequeño porcentaje (5%) es transformado en ARA, el principal producto metabólico de la serie n-6. Esta transformación ocurre sobre todo en el hígado, desde donde es transportado hacia los tejidos periféricos, principalmente hacia el cerebro, órganos visuales y en caso de los hombres hacia los testículos (Gil, 2010). El ALA aportado por la dieta es también oxidado en su mayor parte (alrededor de un 85%), y el resto se transforma fundamentalmente en DHA, su principal producto metabólico. Esta transformación también ocurre principalmente en el hígado, y desde este órgano sería transportado por la misma vía y hacia los mismos órganos que el ARA. Durante el embarazo, además de en el hígado, éste ácido graso también se acumula en el tejido adiposo (Gil-Campos y Dalmau-Serra, 2010). Además, las células del endotelio cerebrovascular son susceptibles de convertir más del 50% del ALA que reciben en EPA y a continuación, los astrocitos (células de la sustancia gris del sistema nervioso) transforman el EPA en DHA (Guesnet y col., 1993) Los ácidos grasos de las familias n-6 y n-3 además de ser una fuente de energía, resultan indispensables por formar parte de los fosfolípidos de las membranas celulares. Algunos de estos ácidos grasos, todos ellos de 20 átomos de carbono (el di-homo- Introducción 33 gamma-linolénico o 20:3n-6, el ARA o 20:4n-6 y el EPA o 20:5n-3), son precursores de los eicosanoides (prostaglandinas, prostaciclinas, tromboxanos y leucotrienos), sustancias similares a las hormonas, que participan en los procesos inflamatorios, pero al contrario de éstas y debido a su potente actividad, deben ser generados en las células donde vayan a actuar. Cuando hay deficiencia de estos ácidos grasos se modifica la estructura y la función de las membranas, de forma que se altera el mecanismo de señalización celular. Las carencias de ácidos grasos esenciales en el hombre son raras y las causas excepcionales serían la alimentación parenteral prolongada, sin grasa y la alimentación prolongada exclusiva del recién nacido con leche de vaca. La leche materna es una fuente segura de ácidos grasos n-3. Se discute, si los recién nacidos con bajo peso y muy inmaduros pueden beneficiarse de fuentes dietéticas de ácidos grasos DHA y ARA, pues la misma inmadurez hace que no dispongan de las enzimas que desaturan y alargan las cadenas de ácidos grasos (Innis, 1993). Las carencias de ácidos grasos esenciales ocasionarían ciertas encefalopatías infantiles, retardo de la cicatrización y trastornos de los lípidos plasmáticos. Las deficiencias de ácidos grasos poliinsaturados en general, producen cambios estructurales en las criptas, vellosidades y microvellosidades intestinales que influyen las funciones intestinales (Debry y Pelletier, 1991). 1.4.4. Propiedades funcionales de los ácidos grasos omega-3 Los tres ácidos grasos de la serie n-3 más importantes, fisiológicamente hablando, son el ALA, el EPA y el DHA. Sólo pequeñas cantidades de ALA y de EPA están presentes en los tejidos, y el contenido en DHA es habitualmente entre 5-30 veces superior al del EPA en la mayoría de los órganos. Además, el DHA es unas 100 veces más abundante que el EPA en el cerebro y la retina. Aunque los tres ácidos grasos están relacionados metabólicamente, diversos estudios han demostrado que la administración de ALA no genera las cantidades fisiológicas necesarias de DHA y de EPA, ya que en humanos, la capacidad endógena de convertir ALA en DHA o EPA es muy baja. Por eso, en cuanto a la administración de DHA o EPA, las últimas recomendaciones sugieren que la vía más eficiente para el incremento de las concentraciones de un ácido graso n-3 es la administración de dicho Introducción 34 ácido graso específicamente. De todas maneras en un planteamiento más general la administración de DHA garantiza una concentración básica de EPA, mientras que la administración exclusiva de este último disminuye la concentración de DHA debido a la retroconversión de DHA en EPA (Figura 11). De este modo, el consumo de DHA en la dieta puede ser crítico para mantener la concentración adecuada del mismo. α-Linolénico (18:3n-3) Estearidonónico (18:4n-3) (20:4n-3) EPA (20:5n-3) DPA (22:5n-3) DHA (22:6n-3) Figura 11. Retroconversión de ácido docosahexaenoico (DHA) en ácido eicosapentaenoico (EPA) Importantes estudios epidemiológicos han asociado la tasa de mortalidad coronaria y la tasa de eventos cardiovasculares, en especial la muerte súbita con los niveles plasmáticos y plaquetarios de EPA y DHA. (Albert y col., 2002; Siscovick y col., 1995). En especial, el EPA minimiza el riesgo de contraer enfermedades coronarias, reduce la presión arterial, inhiben la coagulación de la sangre y posee efectos antiinflamatorios (Mataix y Gil, 2004, Mata y Ortega, 2003). El DHA es esencial para una función celular normal y para el crecimiento y desarrollo normal del tejido neuronal en niños. Es el ácido graso n-3 más abundante en las membranas celulares y está presente en todos los órganos. Es particularmente el más Introducción 35 abundante en el sistema nervioso central, en el esperma y en la retina, además del más variable entre los órganos. Los n-3 son nutrientes importantes del cerebro. Ya que cerca del 60% del peso del cerebro humano es grasa y presenta un alto contenido de DHA, que es el ácido graso natural más insaturado. El DHA protege a las neuronas contra la apoptosis, por lo que se ha aventurado la hipótesis de que elevadas concentraciones de DHA en el cerebro pueden mejorar la supervivencia neuronal. Un déficit en DHA en el organismo va a causar modificaciones en las propiedades físicas de las membranas, alteraciones en la conducción nerviosa y alteraciones en la secreción de neurotransmisores y su recaptación, así como en los procesos de la transmisión postsináptica. De este modo, los tipos y las proporciones de grasas que forman las membranas de las células del cerebro determinarán la eficacia en su comunicación. La gestación es el período de mayor necesidad de ácidos grasos esenciales y AGPI. En las primeras etapas de desarrollo, la ingesta de cantidades adecuadas de ácidos grasos esenciales, así como de DHA, permite la correcta formación del sistema nervioso, concretamente del cerebro y también de la retina (Gil y col., 2003). Durante el último trimestre de embarazo y los primeros meses postnatales es muy importante el crecimiento del cerebro humano, con un gran aumento en el contenido cerebral de ácido ARA (C20:4n-6) y DHA. El feto y el niño recién nacido dependen del suministro maternal de estos ácidos grasos. Durante el embarazo y la lactancia, una ingesta de altas cantidades de estos ácidos grasos beneficiaría al niño por lo que es importante que las madres ingieran cantidades adecuadas de pescado durante la gestación y la lactancia. La suplementación de la dieta maternal durante el embarazo con AGPI n-3 podría prevenir el desarrollo de alergias (Dunstan y col., 2003). Es también conocido que el déficit de DHA durante la infancia está asociado con la aparición de enfermedades como la hiperactividad, déficit de atención, fenilcetonuria y fibrosis quística durante la infancia, y posteriormente, cuando la persona llega a la edad adulta, a un envejecimiento más rápido y a una mayor probabilidad de aparición de la enfermedad de Alzheimer (Riediger y col., 2009). Por todos estos motivos, en los últimos años un comité de expertos ha concluido que, basados en las evidencias científicas, en la fórmula infantil se deben añadir al menos el 0,2% de los ácidos grasos como DHA, aunque éstos no deben exceder el 0,5% del total de ácidos grasos, ya que Introducción 36 todavía no han sido suficientemente evaluados los efectos de una ingesta mayor. También es conocido que la cantidad de EPA no debe superar la de DHA (Lien y Clandinin, 2009; Gil-Campos y Dalmau-Serra, 2010). Los ácidos grasos n-3 pueden tener un efecto beneficioso en el humor irritable. Los bajos niveles de ácidos grasos n-3 encontrados en las membranas de los glóbulos rojos de pacientes deprimidos parecen indicar que los ácidos grasos n-3 pueden ser útiles en tratar desórdenes de humor (Peet y col., 1998). Otros estudios revelaron también que el éster etílico del EPA puede resultar efectivo en la estabilización de pacientes deprimidos (Nemets y col., 2002), y que el DHA puede ayudar a controlar las tendencias agresivas en situaciones de estrés (Hamazaki y col., 1996). Otro de los efectos beneficiosos de los AGPI, y especialmente de los pertenecientes a la serie n-3, es su efecto en la prevención del cáncer, especialmente en el caso del cáncer de mama, colon y en el melanoma maligno cutáneo. Puesto que ralentizan el crecimiento de las células cancerígenas. Existen trabajos que relaciona una ingesta adecuada de ácidos grasos n-3 con una reducción de la dosis, tiempo y ciclos de quimioterapia, mejorando así la vida de los pacientes con cáncer (Gil, 2010). 1.4.5. Relación entre la digestión de los lípidos y la composición de los productos animales La digestión de los lípidos en los animales, según sean rumiantes o no, tiene un efecto primordial en la transferencia de ácidos grasos de la dieta a los productos animales. La digestión de los lípidos en los animales no-rumiantes se produce principalmente en el intestino delgado y son absorbidos en los tejidos sin sufrir ninguna modificación. Por lo tanto, la fuente de la que proceden los lípidos de la dieta influye directamente en la composición de ácidos grasos de los productos de animales como el cerdo y las aves de corral. Con lo cual, la proporción de ácidos grasos insaturados (AGI) en los tejidos de estos animales puede incrementarse sencillamente aumentando la proporción de estos ácidos grasos en la dieta (Woods y col., 2009). Por el contrario, en el caso de los rumiantes, los microorganismos que se encuentran en el rumen producen grandes modificaciones en la composición de ácidos grasos que salen el rumen para ser absorbidos en el intestino delgado (Jenkins, 1993). Introducción 37 La absorción de AGI en el intestino de los rumiantes y no-rumiantes es similar, pero varía en el caso de los AGS. Estos últimos se adsorben más en el caso de los rumiantes. Esta mayor eficiencia en la absorción de AGS por los rumiantes se atribuye a la mayor capacidad de la bilis y del sistema micelar de lisofosfolípidos para solubilizar ácidos grasos, así como a la acidez del medio en el duodeno y el yeyuno (pH 3,0–6,0). Este pH tan bajo disminuye la conversión de AGS en sales insolubles de calcio, que no pueden ser absorbidas (Bauchart, 1993). Una diferencia importante entre no-rumiantes y rumiantes es que los AGPI de cadena larga, C20 y C22, no se integran en los triacilgliceroles en cantidades importantes sino que se integran en los fosfolípidos de membrana en cantidades significativas y pasan a formar parte del tejido intramuscular (Enser y col., 1996). Además, se producirá una transferencia muy baja de AGPI de cadena larga a la grasa de la leche, ya que los fosfolípidos del plasma que transportan estos ácidos grasos son un sustrato pobre para la lipoproteinlipasa de la glándula mamaria (Offer y col., 1999). 1.5. La carne La industria cárnica es un sector de primer orden dentro del tejido empresarial español. Para mantener este potencial de producción y transformación cárnica son necesarios una serie de aspectos claves, entre los que destaca la innovación y el desarrollo tecnológico, que ofrezca nuevos productos y alternativas de consumo a los productos tradicionales. En este sentido el desarrollo de productos cárnicos funcionales representa una oportunidad de ocupar nuevos nichos de mercado. El consumo de carne es muy alto en las sociedades desarrolladas, representando aproximadamente el 20 % de la ingesta calórica. (González Svatetz y Serra Majen, 2006). En España, desde 1964, se ha producido un importante aumento en el consumo de carne, mucho mayor que el de cualquier otro grupo de alimentos. Este consumo de carne era de 77 g/persona y día en 1964 y alcanzó un máximo con 190 g en 1992. En los años siguientes se produjo un ligero descenso y en 2002 el consumo de carne volvió a alcanzar los 186 g/persona y día (MAPA, 1992-2003; Carbajal Azcona, 2005). Introducción 44 desarrolla el cultivo de rodaballo que se realiza en instalaciones en tierra con aporte de agua de mar oceánica. Mientras que en regiones de aguas más templadas, Mediterráneo y Atlántico sur, se ha desarrollado el cultivo de dorada y lubina (MARM, 2007). Distribución de la producción de peces de acuicultura por especies (Toneladas, año 2007) 195 228 261 28.416 19.855 10.040 3.102 6.035 Trucha Dorada Rodaballo Lubina Túnidos Otros Corvina Besugo En acuicultura, el alimento que se proporciona mayoritariamente a los ejemplares consiste en harina y aceite de pescado. Estos productos se obtienen de la pesca, por lo que se trata de un sector que transforma proteína de pescado de escaso valor comercial, en proteína de pescado de mayor calidad y valor. Al depender de la pesca para la obtención de piensos, la acuicultura se enfrenta al mismo problema de escasez de recursos, por lo que es importante cualquier investigación o innovación que consiga sustituir las fuentes de alimentación del pescado (MARM, 2007). Sin embargo, estos estudios deberán realizarse cuidadosamente, ya que la alimentación es un factor decisivo para conservar las propiedades lo mejor posible nutritivas originales del pescado procedente de la pesca. Fuente: MARM 2009 Figura 12: Principales especies de peces de acuicultura producidas en España. Introducción 45 1.6.1. Composición del pescado Desde el punto de vista nutricional, el pescado presenta fácil digestibilidad, excelente valor proteico y grasa de gran valor nutricional, además de aportar minerales y vitaminas y poseer solo trazas de hidratos de carbono. Todo esto lo convierten en un alimento de primera categoría. Se compone básicamente de agua, proteínas y una pequeña proporción de grasa poliinsaturada. La proteína es de alto valor biológico, aunque su proporción es más baja que en la carne ya que el pescado presenta mayor proporción de agua. Además, el pescado contiene menos colágeno, lo cual contribuye a su digestibilidad y blandura. Los datos de composición química que existen para el pescado son muy variables, dependen de varios factores; factores extrínsecos como la variabilidad estacional, el método de captura, la alimentación, la temperatura de las aguas, el hábitat geográfico y factores intrínsecos, como son los genéticos, morfológicos, etc. Además, es bien conocido que la composición en ácidos grasos de los alimentos de origen animal no rumiantes, como el cerdo, las aves de corral y también el pescado puede ser alterada por la dieta, para aumentar su proporción de ácidos grasos insaturados (Decker y Park, 2010). En general, las especies demersales suministran fundamentalmente proteína, su contenido en lípidos es bajo, salvo en el caso del hígado, como el del Bacalao, que se usa para la obtención de aceites de pescado. Las especies pelágicas como los escómbridos y escomberomóridos presentan concentraciones en el músculo más elevadas, lo cual aumenta mucho su valor calórico, a pesar de esto, son muy apreciadas nutricionalmente dada la calidad de su grasa poliinsaturada. Los organismos marinos son considerados también una buena fuente de minerales esenciales, ya que absorben minerales de la dieta y del agua. Además, la concentración de minerales en el pescado está influida tanto por la especie de pescado como por factores estacionales, aspectos biológicos y por la alimentación del pescado (Aubourg y col., 2007). La característica especial que diferencia a los lípidos de las especies marinas de los lípidos de animales terrestres es que son fuente de AGPI de cadena larga, n-3 Introducción 46 (excepto la anguila), en particular, EPA, DHA y, en menor cantidad DPA. El consumo de pescado azul es importante también por su aporte de oleico y linoleico. La proporción de ácidos grasos n-3 depende de varios factores que afectan al pescado como son la edad, el tamaño y principalmente la época del año. Otro factor es el origen, ya que los el grado de instauración y la longitud de los ácidos grasos aumenta conforme aumenta la salinidad y la frialdad del agua, de este modo, pescados de agua dulce contienen menor proporción de n-3 y también presentan valores más altos de n-3 los de aguas frías como la caballa o el salmón. La alimentación del pez también influye, los que se alimentan de plancton, muy rico en n-3, como las anchoas, el bonito o el atún, tienen mayor cantidad de estos ácidos grasos. 1.6.2. El pescado como alimento funcional. El pescado puede ser considerado un alimento funcional en sí mismo, no es necesario que esté enriquecido. Ya que está demostrado que aportan componentes que afectan beneficiosamente al organismo humano proporcionando un mejor estado de salud y bienestar. De hecho, se ha demostrado que el aumento en el consumo de pescado es la única manera práctica de aumentar las cantidades dietéticas de AGPI n-3 de cadena larga como el EPA y el DHA y para conseguir una proporción más equilibrada de n-6/n-3 en la dieta. En la actualidad se recomienda el consumo de pescado azul, en especial para las personas con riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares o una trombosis. Este interés por los n-3 procedentes del pescado comenzó a raíz de los trabajos publicados en los años 70 por Bang, en los que se sugería que la abundancia de ácidos grasos n-3, en la dieta de los esquimales de Groenlandia, era la responsable de la baja mortalidad por cardiopatía isquémica en comparación con los esquimales que habían emigrado a Dinamarca (Bang y col., 1972 y 1976), son muchos los estudios que han apoyado esta teoría protectora frente a determinadas enfermedades cardiovasculares. De este modo, la mayoría de los estudios de observación establecen una relación inversa entre la frecuencia en el consumo de pescado y la muerte por enfermedad coronaria (Kromhout y col., 1985; Daviglus y col., 1997; Hu y col., 2002), estableciendo que a medida que aumenta el consumo semanal de pescado, disminuye el riesgo de muerte por enfermedad coronaria. En pacientes con una historia de infarto de miocardio se ha Introducción 47 observado, que aproximadamente cada aumento de 20 g/día en la ingesta de pescado supone descenso de un 7% en el riesgo de muerte por enfermedad coronaria (He y col., 2004). Finalmente, se ha establecido que el consumo de 40-60 g diarios de pescado disminuye la probabilidad de aparición de enfermedades cardiovasculares en pacientes de riesgo en un 30% (Mataix y col., 2001). Un consumo regular de pescado en niños de menos de un año, podría asociarse con una reducción del riesgo de padecer alergias y de sensibilización a alergenos de alimentos y por inhalación durante los primeros 4 años de vida (Calvani y col., 2006; Kull y col., 2006). No obstante, también debemos tener en cuenta que en algunos pescados azules, especialmente en los de escala trófica superior (túnidos, salmónidos, pez espada, etc), hay frecuentemente concentraciones elevadas de contaminantes como el metil-mercurio, que pueden afectar fundamentalmente al desarrollo cerebral y al crecimiento en la infancia, por lo que hay que limitar su consumo, especialmente en mujeres gestantes y niños (Gil-Campos y Dalmau-Serra, 2010). Por este motivo, a pesar de la enorme importancia que el consumo de estos ácidos grasos, y especialmente del DHA, en estas etapas de la vida, deben adoptarse precauciones a la hora de recomendar un elevado consumo de pescado azul, al menos de las especies de mayor talla. Por este motivo, una interesante alternativa para el consumo de estos alimentos sería el consumo de alimentos enriquecidos en ácidos grasos n-3, a través de los cuales podamos cubrir nuestras necesidades diarias sin necesidad de modificar nuestros hábitos alimenticios. Otros beneficios derivados del consumo del pescado y aceite de pescado hacen referencia a la mejora de la sintomatología de ciertos desórdenes psiquiátricos como trastornos bipolares y esquizofrénicos. Que se relacionan en especial con el consumo de EPA (Stoll y col., 1999). 1.6.3. Comparación entre pescados salvajes y procedentes de la acuicultura En los últimos años, debido al creciente auge de la acuicultura, se han realizado diversos estudios comparativos entre ejemplares de especies de peces procedentes de cultivo y procedentes de la pesca extractiva, en cuanto a valor nutricional y contaminantes. En el besugo de cultivo se encontraron valores superiores de lípidos que Introducción 48 en el salvaje, los valores para los ácidos grasos saturados fueron similares en ambos casos, mientras que los de monoinsaturados fueron superiores para el besugo cultivado y los poliinsaturados superiores en los ejemplares salvajes (Alvarez y col., 2009). En el caso de la corvina se encontró que los ejemplares salvajes presentaban menor contenido en materia grasa. En el perfil de ácidos grasos de dicha grasa, los ejemplares de cultivo presentaron mayor cantidad de monoinsaturados y menor proporción de poliinsaturados (AGPI). Dentro de este último grupo los ácidos grasos n- 3, fueron predominantes en la corvina salvaje, mientras los n-6 fueron más abundantes en la de cultivo (Fuentes y col., 2010). Resultados similares se han encontrado para la trucha (Kaya y Erdem, 2009). Así, por regla general el pescado de cultivo se caracteriza por valores más altos de grasa y ácidos grasos omega-6 que sus congéneres salvajes, debido a la presencia abundante de ácidos grasos omega-6 en los aceites vegetales que se utilizan para sustituir parcialmente al aceite de pescado en las formulaciones del alimento para pescado (Grigorakis, 2007; Busetto y col., 2008). Por lo tanto, las diferencias en el perfil lipídico del pescado procedente de la pesca y el procedente del cultivo intensivo dependen de las fuentes de alimentación de los ejemplares y utilizando fuentes de ácidos grasos específicas en las fórmulas utilizadas para la alimentación del pescado podrían eliminarse estas diferencias (Gessner y col., 2008). 1.7. La leche La demanda de leche y productos lácteos es importante en los hogares españoles y su consumo se extiende a la práctica totalidad de los consumidores. En el consumo global de estos productos se ha producido un importante descenso en su compra entre los años 2000 (416 g/persona y día) y 2006 (379 g/persona y día), sin embargo, el consumo de lácteos ha aumentado entre 1964 (228 g/persona y día) y 2006 en aproximadamente 150 g/persona y día (FEN, 2007). Por otro lado, se está produciendo un trasvase del consumo de leche hacia otros productos lácteos. En 1987 se consumían, 124 l de leche por persona, 8 Kg de yogur, 6 Kg de queso y 1,9 Kg de otros productos Introducción 49 lácteos. En 2007, el consumo de leche fue de 94 l por persona, 10 Kg de yogur, 7 Kg de queso y 15,7 Kg de otros productos lácteos (Martín Cerdeño, 2008). 1.7.1. La grasa de la leche La leche de vaca contiene entre un 3 y un 5 % de lípidos, aunque en la actualidad la media está en 3,34 % (Tabla 4). Estos lípidos se encuentran formando glóbulos que contienen triglicéridos, ésteres de colesterol y ésteres de retinol. En los lípidos de la leche hay mayoritariamente triglicéridos, que suponen un 97-98% de los lípidos. El resto de los componentes están en muy pequeña proporción siendo los más destacados los fosfolípidos (0,2-1 %), los diglicéridos (0,28-0,59 %), y colesterol (0,419 %) (Jensen, 2002). En la grasa de la leche se han identificado más de 400 ácidos grasos, de los cuales sólo 15 aparecen en concentraciones superiores al 1%, todos ellos presentan un número par de átomos de carbono y no son ramificados. Tabla 4. Composición lipídica de la leche COMPONENTE CANTIDAD Lípidos totales 3-5 g/100g de leche Triglicéridos 97-98 g/100g de grasa Diglicéridos 0,28-0,59 g/100g de grasa Monoglicéridos 0,16-0,38 g/100g de grasa Fosfolípidos 0,2-1 g/100g de grasa Glucoesfingolípidos 0,01-0,07 g/100g de grasa Colesterol libre 0,419 g/100g de grasa Ácidos grasos libres 0,10-0,44 g/100g de grasa Fuente: (Jensen, 2002) La grasa láctea no ha sido muy apreciada desde el punto de vista funcional debido a que contiene importantes cantidades de ácidos grasos saturados y colesterol. Sin embargo, en la actualidad se conoce que el 60 % de los ácidos grasos presentes en la leche no producen un aumento un aumento de los niveles de colesterol sérico, ya que los ácidos grasos C12:0, C14:0 y C16:0 son los que más influencia tienen en su aumento (Schaafsma, 1997). Además en la grasa láctea se han identificado componentes que contribuyen a la salud. Algunos de estos componentes son el CLA y los AGPI n-3. Introducción 50 1.7.2. El ácido linoleico conjugado Estos isómeros del ácido linoleico aparecen como microcomponentes en la carne y productos lácteos procedentes de ganado bovino y ovino. Ya que se forman (Figura 13) por acción de una bacteria Gran-negativa, Butirivibrio fibrisolvens, presente en el rumen de estos animales que isomeriza el ácido linoleico produciendo mayoritariamente el isómero cis-9, trans-11, llamado ruménico, que supone más de 90% del total del CLA en el tejido graso de los rumiantes. Este isómero puede incorporarse a los tejidos o bien ser biohidrogenado a trans-11-octadecanoico (ácido vaccénico). Tras su absorción el vaccénico puede almacenarse como tal o ser convertido en cis-9, trans-11 por incorporación de un doble enlace cis en posición 9, gracias a la acción del enzima delta- 9 desaturasa presente, en el intestino, en la glándula mamaria y en el tejido adiposo (Moon y col., 2008). En el rumen también puede formarse trans-10 octadienoico, pero éste no puede ser transformado en los tejidos en trans-10, cis-12 CLA porque los mamíferos no disponen del enzima delta-12 desaturasa; por ello, las cantidades de este isómero vendrán determinadas por su síntesis en el rumen (Griinari y col., 2000). Figura 13. Esquema del metabolismo del ácido linoleico conjugado en el rumen La grasa láctea contiene entre 5 y 7 mg de CLA/g. También está presente en menor concentración en carne y marisco, mientras que su concentración en aceite vegetal es inferior a 1 mg/g. Es bien sabido que el contenido de CLA en los alimentos Introducción 51 derivados de rumiantes depende más de la dieta del animal y del sistema de producción que de factores relacionados con la fabricación del alimento en sí (Brown y col., 2001). Son varios los factores que influyen en el contenido de CLA de estos alimentos, la dieta del animal, la edad y la raza de los animales, y por factores estacionales (Mir y col, 2004). A pesar de ser un conjunto de ácidos grasos que presentan disposición trans, al contrario que lo normal en los ácidos grasos que presentan esta disposición, no presenta efectos perjudiciales para la salud, sino todo lo contrario. Uno de los primeros efectos que se le han atribuido al CLA es la inhibición de tumores epiteliales en animales de experimentación (Ha y col., 1987). Además, existen distintos estudios que sugieren acciones positivas de los ácidos grasos conjugados sobre la respuesta inmune, el riesgo cardiovascular y la composición corporal, con acciones específicas sobre la reducción del contenido en grasa corporal (Fernández-Quintela y col., 2004). El más importante de los efectos beneficiosos que se atribuyen a los CLA es el efecto cardioprotector, ya que disminuyen el riesgo de arritmias. Los CLA también inhiben el aumento de la presión vascular en condiciones de hipertensión, especialmente la presión sistólica, e inhibe la agregación plaquetaria, por lo que también se considera que tiene efecto antitrombótico. Al CLA también se le atribuyen otros efectos beneficiosos sobre la salud, como su efecto anticarcinogénico (Park y col., 1999), antiinflamatorio, y regulador de la respuesta inmune (Pariza, 2004). No obstante, en los últimos años ha sido fruto de una gran atención por parte de la comunidad científica su empleo para la reducción de la grasa corporal. Esta acción, de la cual el isómero trans-10, cis-12 CLA parece ser el mayor responsable (Park y col., 1999) se produce por la inhibición de las enzimas lipoproteín-lipasas de los adipocitos, por lo que se inhibe el paso de grasa hacia el interior de los adipocitos, mientras que por otra parte aumenta la lipolisis al aumentar el transporte de las grasa hacia las mitocondrias, donde son oxidadas. Por otra parte, los CLA también aumentan la actividad de las enzimas musculares carnitina palmitolin transferasa, las cuales median en el transporte de ácidos grasos de cadena larga a través de las membranas de los miocitos. Introducción 52 Estos efectos parecen ser mediados por dos isómeros de CLA, y los dos isómeros biológicamente activos son el cis-9, trans-11 y trans-10, cis-12 (Pariza y col. 2000 y 2001). La mayor parte de los estudios se han llevado a cabo utilizando mezclas de isómeros de CLA y solamente existen algunos datos sobre la actividad biológica de isómeros individuales. Debido a estas propiedades, estos isómeros han sido potenciados en aquellos alimentos donde de manera natural están en mayor cantidad (carne y leches), e incorporados como fortificantes a otro tipo de alimentos con el fin de lograr propiedades funcionales en los mismos. Estos ácidos grasos son especialmente interesantes como complementos en tratamientos tanto preventivos como terapéuticos de la obesidad, ya que presentan la doble ventaja de que por una parte disminuyen el depósito de grasa en los tejidos adiposos mientras aumentan el tono muscular, además de tener también acción hipolipemiante y cardioprotectora. 1.7.3. Métodos de determinación de la composición en ácidos grasos en leche. La determinación de ácidos grasos en alimentos se lleva a cabo habitualmente por cromatografía de gases (CG). Los métodos tradicionales empleados para este fin implican la extracción de los lípidos de los alimentos, seguida de un procedimiento de derivatización para obtener los ésteres metílicos de los ácidos grasos (FAMES), para finalizar con su determinación mediante CG. La metodología de extracción de los lípidos, propuesta por primera vez por Folch, Lees y Stanley en 1957, utiliza una mezcla de cloroformo-metanol para la extracción de los lípidos totales de los tejidos animales. De la misma forma, los lípidos generalmente son extraídos de la leche, con mezclas de solventes (Jensen y col., 1997). Sin embargo, los ácidos grasos son compuestos polares y de baja volatilidad que tienden a adherirse a las paredes de las columnas de CG u otras superficies, y por lo tanto, la separación de ácidos grasos no modificados por CG es bastante problemática. Debido a esto es necesario un proceso de derivatización para convertir los ácidos grasos en sus correspondientes ésteres metílicos, que son menos polares, relativamente volátiles y térmicamente estables (Juárez y col., 2008; Rosenfeld, 2002). Introducción 53 En los últimos años, los métodos ISO-IDF 14156 (ISO-IDF, 2001) e ISO-IDF 15884 (ISO-IDF, 2002) han sido adoptados como métodos oficiales para la extracción de lípidos y la obtención de FAMES en muestras de leche. Sin embargo, es sabido que los métodos convencionales utilizados para el análisis de perfiles lipídicos en muchas muestras son poco prácticos, ya que son largos y laboriosos, requieren muestras grandes, y consumen grandes cantidades de solventes (Araujo y col., 2008). Además, la excesiva manipulación de las muestras debida a los múltiples pasos causa pérdidas de la fase lipídica extraída y contaminaciones (Kang y Wang, 2005). Dificultando la posibilidad de expresar los resultados de concentración de los ácidos grasos sobre muestra. Por estas razones, son necesarios métodos rápidos, sencillos, exactos y menos costosos para determinar las concentraciones de ácidos grasos en leche. El H 2 SO 4 ha sido utilizado como catalizador para preparar isopropil ésteres de ácidos grasos en grasa de leche (Wolff y col., 1995; Chardigny y col., 1996), pero algunos investigadores le achacan a este método una excesiva isomerización de los dienos conjugados y la producción de artefactos, lo mismo pasa con el HCl/metanol (Kramer y col., 1997). Sin embargo, aunque todavía no ha sido investigado completamente, el H 2 SO 4 /metanol ha dado resultados alentadores en otros estudios (Yamasaki y col., 1999; Luna y col., 2008). De este modo, algunos investigadores han encontrado que la cantidad total de CLA determinada después de una metilación ácida o básica no mostraba diferencias significativas (Lee y Tweed, 2008). Por otro lado, la metilación básica es el procedimiento comúnmente utilizado para desnaturalizar la grasa de leche. Pero este procedimiento requiere condiciones anhidras estrictas (Carvalho y Malcata, 2005). Por esta razón es difícil de aplicar este procedimiento a muestras de leche cruda directamente. Bibliografía 60 Gil, A., Ramírez, M., Gil, M. 2003. Role of polyunsaturated fatty acids in infant nutrition. European Journal of Clinical Nutrition. 57(supl 1), S31:S34. Gil-Campos, M., Dalmau Serra, J. 2010. Importancia del ácido docosahexaenoico (DHA): funciones y recomendaciones para su ingesta en la infancia. Anales de Pediatría. 73, 142.e1-142.e2. González Svatetz, C.A., Serra Majen, L. 2006. Dieta, Nutrición y Cáncer. Nutrición y salud pública: métodos, bases científicas y aplicaciones. 2ª ed. Eds.Lluís Serra Majem y Javier Aranceta Bartrina. Elsevier España, Barcelona. Grigorakis, K. 2007. Compositional and organoleptic quality of farmed and wild gilhead sea bream (Sparus aurata) and sea bass (Dicentrarchus labrax) and factors affecting it: A review. Aquaculture. 27, 55-75. Griinari, J., Cori, B., Lacy, S., Chouinard, P., Nurmela, K., Bauman, D. 2000. Conjugated linoleic acid is synthesized endogenously in lactating dairy cows by delta-9 desaturase. Journal of Nutrition. 130, 2285-2291. Guesnet, P., Alessandri, J.M., Durand, G. 1993. Métabolisme, fonctions biologiques et importance nutritionnelle des acides gras polyinsaturés. Cahiers de Nutrition et de Dietetique. 1, 19-25. Innis, S.M. 1993. Essential fatty acid requirements in human nutrition. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 71, 699-706. International Life Siences Institute (ILSI). 1999. Safety assessmente and potential health benefits of food components based on selected scientific criteria. ILSI North America Technical Committee on Food Components for Health Promotion. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 39, 203-316. International Organization for Standardization-International Dairy Federation (ISO-IDF). 2001. Milk and milk products-Extraction methods for lipids and liposoluble compounds. International Standard ISO 14156-IDF 172. Brussels: IDF. International Organization for Standardization-International Dairy Federation (ISO-IDF). 2002. Milk fat-preparation of fatty acid methyl esters. International Standard ISO 15884-IDF 182. Brussels: IDF. Ha, Y. L., Grimm, N. K., Pariza, M. W. 1987. Anticarcinogens from fried ground beef: Heat-altered derivatives of linoleic acid. Carcinogenesis. 8, 1881-1887. Hamazaki, T., Sawazaki, S., Itomura, M., Asaoka, E., Nagao, Y., Nishimura, N., Yazawa, K., Kuwamori, T., Kobayashi, M. 1996. The effect of Bibliografía 61 docosahexaenoic acid on aggression in young adults. A placebo-controlled double-blind study. Journal of Clinical Investigation. 97(4), 1129-1133. He, K., Song, Y., Daviglus, M.L., Liu, K., Van Horn, L., Dyer, A.R., Greenland, P. 2004. Accumulated evidence on fish consumption and coronary heart disease mortality. A meta-analysis of cohort studies. Circulation.109, 2705-2711. Hu, F.B., Bronner, L., Willett, W.C., Stampfer, M.J., Rexrode, K.M., Albert, C.M., Hunter, D., Manson, J.E. 2002. Fish and omega-3 fatty acid intake and risk of coronary heart disease in women. Journal of American Medical Association. 287, 1815-1821. Jensen, R.G. 2002. Invited review: the composition of bobine milk lipids: January 1995 to December 2000. Journal of Dairy Science. 85, 295-350. Jensen, R.G., Lammi-Keefe,C.J., Koletzko, B. 1997. Representative sampling of human milk and the extraction of fat for analysis of environmental lipophilic contaminants. Toxicology and Environmental Chemistry. 62, 229-247. Jiménez Colmenero, F. 2007. Healthier lipid formulation approaches in eatbased functional foods. Technological options for replacement of meat fats by non-meat fats. Trends in Food Science and Technology. 18, 567-578. Jimenez-Colmenero, F., Carballo, J., Cofrades, S. 2001. Healthier meat and meat products: Their role as functional foods, Meat Science 59, 5–13. Juárez, M., Polvillo, O., Contò, M., Ficco, A., Ballico, S., Failla, S.J. 2008. Comparison of four extraction/methylation analytical methods to measure fatty acid composition by gas chromatography in meat. Journal of Chromatography A. 1190, 327- 332. Kang, J.X., Wang, J.A. 2005. A simplified method for analysis of polyunsaturated fatty acids. BMC Biochemistry. 6, 5. Kaya, Y., Erdem, M.E. 2009. Seasonal comparison of wild and farmed brown trout (Salmo trutta forma fario L., 1758): crude lipid, gonadosomatic index and fatty acids. International Journal of Food Science and Nutrition. 60 (5), 413-423. Koletzko, B., Uauy, R., Palou, A., Hornstra, G., Eilander, A., Moretti, D., Osendarp, S., Zock, P., Innis, S. 2010. Dietary intake of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) in children- a workshop report. British Journal of Nutrition. 103, 923-928. Kramer, J.K.G., Fellner, V., Dugan, M.E.R., Sauer, F.D., Mossoba, M.M., Yurawecz, M.P. 1997. Evaluating acid and base catalysts in the methylation of milk Bibliografía 62 and rumen fatty acids with special emphasis on conjugated dienes and total trans fatty acids. Lipids. 32, 1219–1228. Kris-Etherton, P,M,, Harris, W.S., Appel, L.J. 2002. Fish consumption, fish oil, omega-3 fatty acids, and cardiovascular disease. Circulation. 106, 2747-2757. Kromhout, D., Bosschieter, E.B., de Lezenne Coulander, C. 1985. The inverse relation between fish consumption and 20-year mortality from coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 312, 1205-1209. Kull, I., Bergstrom, A., Lilja, G., Pershagen, G., Wickman, M. 2006. Fish consumption during the first year of life and development of allergic diseases during childhood. Allergy. 61:1009-1015. Lamarche, B. 2008. Review of the effect of dairy products on non-lipid risk factors for cardiovascular disease. Journal of the American College of Nutrition. 27, 741S-746S. Lee, M.R.F., Tweed, J.K.S. 2008. Isomerisation of cis-9 trans-11 conjugated linoleic acid (CLA) to trans-9 trans-11 CLA during acidic methylation can be avoided by a rapid base catalysed methylation of milk fat. Journal of Dairy Research. 75, 354- 356. Lien, V.W., Clandinin, M.T. 2009. Dietary assessment of arachidonic acid and docosahexaenoic acid intake in 4-7 year-old children. Journal of the American College of Nutritionists. 28, 7-15. Lo, S.K., Tan. C.P., Long, K., Affandi Yusoff, M.S., Lai, O.M. 2008. Diacylglycerol oil-properties, processes and products: a review. Food and Bioprocess Technology. 1, 223-233. Luna, P., Juárez, M., de la Fuente, M.A. 2008. Gas chromatography and silver-ion high-performance liquid chromatography analysis of conjugated limoleic acid isomers in free fatty acid form using sulphuric acid in methanol as catalyst. Journal of Chromatography A. 1204, 110-113. Mann, N. J., O'Connell, S.L., Baldwin, K.M., Singh, I., Meyer, B.J. 2010. Effects of Seal Oil and Tuna-Fish Oil on Platelet Parameters and Plasma Lipid Levels in Healthy Subjects. Lipids. 45 (8), 669-681. Martín Cerdeño, V.J. 2008. Evolución de los hábitos de compra y consumo en España: 1987-2007, dos décadas del Panel de Consumo Alimentario. Distribución y Consumo. 100, 208-239. Bibliografía 63 Mata, P., Alonso, R., Mata, N. 2002. Los omega-3 y omega-9 en la enfermedad cardiovascular. Libro blanco de los omega-3. Instituto Omega3-Puleva Food. Madrid. 49-63. Mata, P., Ortega, R.M. 2003 Omega-3 fatty acids in the prevention and control of cardiovascular disease. European Journal of Clinical Nutrition. 57 (Suppl. 1), S22- S25. Mataix, A., Gil., A. 2004. Libro blanco de los omega-3. Ediciones Médica Panamericana, Madrid. Mataix, J. 2002. Lípidos alimentarios. Libro blanco de los omega-3. Instituto omega-3-Puleva Food. Madrid. 14:32. Mataix, J., Mataix, B., Serra, Ll. 2001. Aceite de oliva y alimentación mediterránea. En: Mataix y col. Aceite de oliva virgen: nuestro patrimonio alimentario. Universidad de Granada. Ediciones Puleva. Granada. Menrad, K. 2003. Market and marketing of functional food in Europe. Journal of Food Engineering. 56, 181–188. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación (MAPA). (1992/95/97/2001/02 y 2003). Dirección General de Alimentación. Panel de Consumo Alimentario. La alimentación en España. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM). (2007) Libro blanco de la pesca. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM). (2009). La pesca en España: indicadores. Mir, P.S., McAllister, T.A., Scott, S., Aalhus, J., Baron, V., McCartney, D., Charmley, E., Goonewardene, L., Basarab, J., Okine, E., Weselake, R.J., Mir, Z. 2004. Conjugated linoleic acid-enriched beef production. American Journal of Clinical Nutrition. 79, 1207S-1211S. Moon, H.S., Lee, H.G., Chung, C.S., Choi, Y.J., Cho, C.S. 2008. Physicochemical modifications of conjugated linoleic acid for ruminal protection and oxidative stability. Nutrition and Metabolism. 5, 16. Moreiras, O., Carbajal, A., Cabrera, L., Cuadrado, C. 2006. Tablas de composición de alimentos. 10ª Edición. Editorial Pirámides. Morimoto, K.C., Van Eenennaam, A.L., Depeters, E.J., Medrano, J.F. 2005. Hot Topic: Endogenous Production of n-3 and n-6 Fatty Acids in Mammalian Cells. Journal of Dairy Science. 88 (3), 1142-1146. Bibliografía 64 Nemets, B., Stahl, Z., Belmaker, R.H. 2002. Addition of omega-3 fatty acid to maintenance medication treatment for recurrent unipolar depressive disorder. American Journal of Psychiatry. 159(3), 477-479. Offer, N.W., Marsden, M., Dixon, J., Speake, B.K., Thacker, F.E. 1999. Effect of dietary fat supplements on levels of n−3 polyunsaturated fatty acids, trans acids and conjugated linoleic acid in bovine milk. Animal Sciences. 69, 613–625. Palanca, V., Rodríguez, E., Señoráns, J., Reglero, G. 2006. Bases científicas para el desarrollo de productos cárnicos funcionales con actividad biológica combinada. Nutrición Hospitalaria. 21(2), 199-202. Palou, A., Serra, F., Pico, C. 2003. General aspects on the assessment of functional foods in the European Union. European Journal of Clinical Nutrition. 57, S12-S17. Pariza, M.W., Park, Y., Cook, M.E. 2000. Mechanisms of action of conjugated linoleico acid: evidence and speculation. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 223, 8-13. Pariza, M.W., Park, Y, Cook, M.E. 2001. The biologically active isomers of conjugated linoleic acid. Prog Lipid Res. 40, 283-298. Pariza, M. W. 2004. Perspective on the safety and effectiveness of conjugated linoleic acid. American Journal Clinical of Nutrition. 79, 1132S-1136S. Park, Y., Storkson, J.M., Albright, K.J., Liu, W., Pariza, M.W. 1999. Evidence that the trans-10,cis-12 isomer of conjugated linoleic induces body composition changes in mince. Lipids. 34, 235-241. Pascal, G. 1996. Functional foods in the European Union. Nutritional Reviews. 25 (supl. 1), S29-S32. Paul, A.A. y Southgate, D.A.T. 1979. The composition of Foods. 4ª ed. McCance y Widdowson`s eds. Elsevier, Londres. Peet, M., Murphy, B., Shay, J., Horrobin, D. 1998. Depletion of omega-3 fatty acid levels in red blood cell membranes of depressive patients. Biological Psychiatry. 43(5), 315-319. Qiu, X. 2003. Biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA, 22:6- 4,7,10,13,16,19): two distinct pathways. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 68(2), 181-186. Bibliografía 65 Reglamento (CE) 1924/2006 de 20 de Diciembre de 2006, relativo a las declaraciones nutricionales y de propiedades saludables en los alimentos. Diario Oficial de la Unión Europea. 30 Diciembre 2006, Nº 404, 9-25. Reglamento (CE) 1925/2006 de 20 de Diciembre de 2006, sobre la adición de vitaminas, minerales y otras sustancias determinadas a los alimentos. Diario Oficial de la Unión Europea. 30 Diciembre 2006, Nº 404, 26-38. Reglamento (CE) 116/2010 de 9 de Febrero de 2010 por el que se modifica el Reglamento (CE) Nº 1924/2006 del Parlamento Europeo y del Consejo en lo relativo a la lista de declaraciones nutricionales. Diario Oficial de la Unión Europea. 10 Febrero 2010, Nº 37, 16-18. Riediger, N.D., Othman, R.A., Suh, M., Moghadasian, M.H. 2009. A systematic review of the roles of n-3 fatty acids in health and disease. Journal of the American Dietetic Association. 109, 668-679. Rosenfeld, J.M. 2002. Application of analytical derivatizations to the quantitative and qualitative determination of fatty acids. Analytical Chimica Acta. 465, 93-100. Sánchez-Muñiz, F. J. 2005. Nuevos alimentos. Realidad y perspectivas de la carne y sus derivados como alimentos funcionales. Derivados cárnicos funcionales: estrategias y perspectivas. Serie informes. Fundación Española De La Nutrición (FEN); 65-76. Schaafsma, G. 1997. The Western diet with a special focus on Dairy products. Brussels, Belgium: Institute Danone. Danone Chair Monographs. 4, 69-79. Simopoulos, A.P. 2008. The importance of the omega-6/omega-3 fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronic diseases. Experimental Biology and Medicine. 233(6), 674-688. Siscovick, D.S., Raghunathan, T.E., King, I., Weinmann, S., Wicklund, K.G., Albright, J., Bovbjerg, V., Arbogast, P., Smith, H., Kushi, L.H., et al. 1995. Dietary intake and cell membrane levels of long-chain n-3 polyunsaturated fatty acids and the risk of primary cardiac arrest. Journal of the American Medical Association. 274, 1363-1367. Steinhart, H., Rickert, R., Winkler, K. 2003. Identification and analysis of conjugated linoleic acid isomers (CLA). European Journal of Medical Research. 8: 370- 372. Bibliografía 66 Stoll, A., Severus, W., Freeman, M., Rueter, S., Zboyan, H.A., Diamond, E., Cress, K.K., Marangell, L.B. 1999. Omega 3 fatty acids in bipolar disorder: a preliminary double-blind, placebo-controlled trial. Archives of General Psychiatry. 56:407–412. Trautwein, E.A. 2001. n-3 fatty acids-physiological and technical aspects for their use in food. European Journal of Lipid Science and Technology. 103, 45-55. Ulbricht, T.L.V. Southgate, D.A.T. 1991. Coronary heart disease: seven dietary factors. The Lancet. 228, 985-992. Urrialde, R. 2006. Alegaciones nutricionales y de salud diferenciación y autorización. Libro de Abstracts: Alimentos funcionales y salud ¿serán necesarios en el futuro?. Ediciones Diputación de Lugo.251-255. Valenzuela, A., Morgano, N. 1999. Trans fatty acid isomers in human health and in the food industry. Biological Research. 32, 273-287. Wahle, K.W.J., Sheys, S.D., Rotondo, D. 2004. Conjugated linoleic acids: are they beneficial or detrimental to health? Progress in Lipid Research. 43, 553-587. Wallis, J.G., Watts, J.L., Browse, J. 2002. Polyunsaturated fatty acid synthesis: what will they think of next? Trends in Biochemical Sciences. 27 (9), 467- 473. Whitney, E.N., Rolfes, S.R. 2002. Understanding nutrition (Ninth ed), Wadsworth, Belmont, CA. Wood, J.D., Enser, M., Fisher, A.V., Nute, G.R., Sheard, P.R., Richardson, R.I., Hughes S.I., Whittington, F.M. 2008. Fat deposition fatty acid composition and meat quality: A review. Meat Science, 78, 343-358. Woods, V.B., Fearon, A.M. 2009. Dietary sources of unsaturated fatty acids for animals and their transfer into meat, milk and eggs: A review. Livestock Science. 126, 1-20. Wolff, R.L., Bayard, C.C., Fabien, R.J. 1995. Evaluation of sequential methods for the determination of butterfat fatty acid composition with emphasis on trans-18/1 acids—application to the study of seasonal variations in French butters. Journal of American Oil Chemists ´Society. 72, 1471. Yamasaki, M., Kishihara, K., Ikeda, I., Sugano, M., Yamada, K. 1999. A recommended esterification method for gas chromatographic measurement of conjugated linoleic acid. Journal of American Oil Chemists´ Society. 76 (8), 933-938. III. OBJETIVOS Objetivos 69 3.1. Objetivo general Diseñar alimentos funcionales de origen animal a través de la modificación de su perfil lipídico, así como establecer herramientas para resolver las problemáticas que surgen durante el diseño de estos alimentos. 3.2. Objetivos específicos 1. Desarrollar una hamburguesa modificada con niveles más bajos de grasa y sodio que los productos convencionales y con un perfil lipídico más adecuado a las recomendaciones nutricionales. Además el producto desarrollado debe ser aceptable por el consumidor, estable durante un tiempo razonable de vida útil y debe mantener sus propiedades nutricionales durante el cocinado. 2. Evaluar el uso de transglutaminasa y caseinato para mejorar las propiedades de la textura en pasteles de carne de ternera con menos grasa y con fibra dietética añadida. 3. Determinar la composición proximal, el perfil de ácidos grasos y la composición en minerales traza del rodaballo de cultivo y del rodaballo salvaje, y evaluar sus posibles diferencias. 4. Desarrollar un método sencillo de extracción-derivatización antes del análisis por cromatografía de gases, para la determinación cuantitativa de la composición en ácidos grasos en leche. Resultados y discusión 76 cocinada, fue buena, obteniendo puntuaciones estadísticamente similares a los productos convencionales. La hamburguesa modificada desarrollada por métodos tecnológicos es viable y puede ser considerado un alimento útil para impedir desórdenes nutricionales o para ser incluída en regímenes nutricionales como sustituto de otros productos cárnicos. Resultados y discusión 77 Resultados y discusión 78 Resultados y discusión 79 Resultados y discusión 80 Resultados y discusión 81 Resultados y discusión 82 Resultados y discusión 83 Resultados y discusión 84 4.2. Evaluación de transglutaminasa y caseinato para una formulación original de pasteles de carne de ternera enriquecidos en lípidos más sanos y fibra dietética. Evaluation of transglutaminase and caseinate for a novel formulation of beef patties enriched in healthier lipid and dietary fiber Beatriz Martínez, José M. Miranda, Carlos M. Franco, Alberto Cepeda, Manuel Vázquez LWT - Food Science and Technology, 44 (2011): 949-956 Resultados y discusión 92 Resultados y discusión 93 Resultados y discusión 94 Resultados y discusión 95 Resultados y discusión 96 4.3. Diferenciación entre rodaballo cultivado y salvaje (Psetta maxima): contenido proximal y lipídico, composición en minerales traza y resistencia a antibióticos de las bacterias contaminantes. Differentiation of farmed and wild turbot (Psetta maxima): proximate and lipid content, trace mineral composition and antimicrobial resistance of contaminant bacteria. B. Martínez, J.M. Miranda, C. Nebot, J.L. Rodríguez, A. Cepeda and C.M. Franco Food Science and Technology International, 16 (5): 435–441 Resultados y discusión 99 Resumen El pescado es un alimento con reconocidas propiedades funcionales per se, y es además una parte fundamental de nuestra Dieta Atlántica. No obstante, debido a la sobreexplotación de los bancos de pesca tradicionales y al consecuente encarecimiento de estos alimentos, el consumo de pescado procedente de la acuicultura se ha incrementado notablemente en las últimas décadas. No obstante, el diferente hábitat y alimentación del pescado cultivado y el procedente de la pesca extractiva hacen que su composición nutricional pueda ser diferente, por lo que es importante disponer de datos científicos que demuestren si ambos productos pueden ser equiparados desde el punto de vista nutricional. En el presente trabajo fueron evaluadas la composición proximal, el contenido en colesterol, la composición en ácidos grasos y el contenido en minerales traza de la carne de rodaballo (Psetta maxima), tanto de cultivo como salvaje. Adicionalmente, fueron aisladas del músculo de los mismos rodaballos, un total de 144 cepas de Pseudomonas spp. y 127 de Aeromonas spp., y se estudió su susceptibilidad a 12 antibióticos, utilizando el método de difusión de disco. El rodaballo cultivado presentó valores significativamente mayores de grasa, colesterol y calorías, así como un contenido más bajo de humedad que su homólogo salvaje. El perfil de ácidos grasos de rodaballo cultivado incluyó niveles más altos de los ácidos, mirístico (14:0), pentadecaenoico (15:0), palmitoleico (16:1n-7), gadoleico (20:1n-9), cetoleico (22:1n-11), linoleico (18:2n-6), ALA (18:3n-3), estearidónico (18:4n-3), eicosadienoico (20:2n-6), y EPA (20:5n-3), y niveles más bajos de los ácidos, esteárico (18:0), ARA (20:4n-6), DPA (22:5n-3) y DHA (22:6n-3) que su homólogo salvaje. La proporción de AGPI y la relación n-3/n-6 fueron más altas en el rodaballo salvaje que en el rodaballo cultivado, aunque este último valor estuvo en ambos casos muy por encima de las recomendaciones (1/6). Por otra parte, el rodaballo procedente de la acuicultura presenta mayores valores de AGS y AGMI que el salvaje. Resultados y discusión 100 Con respeto a los minerales traza, en el caso de los oligoelementos esenciales determinados Co, Fe, Cu, Mn, Zn y Cr, para todos ellos excepto para el Cr los niveles más altos se encontraron en los especímenes procedentes de la acuicultura. Para los metales pesados determinados Cd y Pb, los niveles más altos aparecieron también en las muestras de rodaballo de cultivo, pero hay que destacar, que tanto para el caso de metales pesados como para el de oligoelementos esenciales, no se encontraron niveles tóxicos de ninguno de ellos en ambos tipos de rodaballo. La resistencia de las cepas aisladas de Pseudomonas spp. y de Aeromonas spp. fueron bastante similares, sólo la resistencia a trimetroprim-sulfametoxazol de las cepas de Aeromonas spp. Aisladas de rodaballo de cultivo presentaron resistencias mayores que las aisladas de rodaballo salvaje. En el caso de ampicilina, las cepas aisladas de Pseudomonas spp. del rodaballo salvaje mostraron niveles más altos de resistencia que aisladas de sus homólogos de cultivo. En conclusión, los parámetros nutricionales del rodaballo salvaje son más adecuados con respecto a las recomendaciones nutricionales, y aunque el rodaballo cultivado es también una excelente fuente de ácidos grasos n-3, su composición nutricional es mejorable. Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la seguridad alimentaria derivadas de las concentraciones de minerales traza ni de la resistencia a antibióticos de las cepas aisladas, ni para el rodaballo salvaje ni para el de cultivo. Resultados y discusión 101 108 4.4. Desarrollo de un método abreviado para la determinación cuantitativa de ácidos grasos en leche con especial énfasis en los ácidos grasos de cadena larga Development of a simple method for the quantitative determination of fatty acids in milk with special emphasis on long chain fatty acids B. Martínez, J.M. Miranda, C.M. Franco, A. Cepeda, J.L. Rodríguez CyTA – Journal of Food, Acepted. Resultados y discusión 113 Resumen La obtención de una leche natural enriquecida en ácidos grasos n-3 a partir de la ración suministrada al ganado vacuno conlleva la comprobación del éxito de la modificación mediante el análisis de la composición en ácidos grasos de la leche. Para realizar este tipo de investigaciones, es necesario procesar una gran cantidad de muestras de leche durante semanas de trabajo, para comprobar los cambios con la alimentación a lo largo del tiempo. Además, la comercialización de una leche de este tipo supone también, una vez que se ha obtenido los datos necesarios para la alimentación adecuada, un riguroso control de calidad del producto para asegurar que cumple las especificaciones requeridas en todo momento. A este hecho debemos añadir la dificultad de que el perfil lipídico de la leche experimenta cambios frecuentes por causas ajenas a la alimentación, como son cambios estacionales y cambios fisiológicos que se producen durante los ciclos de reproducción de las vacas. Por ello, es imprescindible que la metodología empleada en la determinación del perfil lipídico de la leche sea especialmente rápida, a fin de poder modificar de manera inmediata la ración aportada a los animales para corregir estas variaciones externas, o si esto no fuese posible, corregir el etiquetado del producto desarrollado incluyendo la nueva composición. Mediante este trabajo se ha desarrollado un nuevo método de análisis para la extracción y derivatización de ácidos grasos en muestras de leche. La extracción de los lípidos presentes en 10 µL de leche se llevó a cabo en H2SO4/metanol manteniendo la mezcla a en oscuridad durante toda la noche a -20 ºC. La metilación se ha realizado a 60 ºC durante 2 h en la misma solución y los ésteres metílicos de los ácidos grasos fueron recuperados para el análisis cromatográfico mediante la adición de hexano. El método desarrollado fue optimizado en función del volumen de muestra utilizado, el tiempo de extracción, la temperatura y el tiempo de metilación. Finalmente, el método simple fue comparado con el método de referencia oficial para la extracción y metilación de los ácidos grasos en muestras de leche. Los resultados obtenidos muestran que, para 21 de los 24 ácidos grasos analizados, las recuperaciones obtenidas por el método desarrollado fueron significativamente mayores que las Resultados y discusión 114 obtenidas por el método convencional, especialmente en el caso de los ácidos grasos de cadena más larga (entre los que se encuentran los ácidos grasos n-3). El método simple permite procesar un alto número de muestras al mismo tiempo, minimizando la manipulación de la muestra y consecuentemente, la pérdida de grasa y la contaminación. Además, el método abreviado utiliza materiales sencillos y es menos laborioso que el método tradicional. En conclusión, el método propuesto es simple, rápido, económico y logra buenos resultados, por lo que es especialmente adecuado para el control analítico de las leches enriquecidas en ácidos grasos n-3, tanto durante su desarrollo como en la monitorización rutinaria de su perfil lipídico. Resultados y discusión 115 Development of a simple method for the quantitative determination of fatty acids in milk with special emphasis on long chain fatty acids Desarrollo de un método abreviado para la determinación cuantitativa de ácidos grasos en leche con especial énfasis en los ácidos grasos de cadena larga B. Martineza, J.M. Mirandaa*, C.M. Francoa, A. Cepedaa, J.L. Rodriguezb aLaboratorio de Higiene Inspección y Control de Alimentos, Dpto. de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, Spain. bDpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria, Universidad de Santiago de Compostela, Lugo, Spain. *Corresponding author. Email: [email protected]; phone +34982252231 ext. 22407; fax + 34982254592 Resultados y discusión 116 Abstract A new and simple method was developed for the extraction and derivatization of fatty acid in milk. Lipid extraction of milk was carried out in H2SO4/methanol. Methylation was performed for 2 h at 60 ºC and fatty acid methyl esters were recovered for chromatographic analysis by the addition of hexane. The method parameters were optimized and the simple method was compared to the official reference procedure for the extraction and methylation of fatty acids in milk samples. For most of the 24 fatty acids determined, similar or significantly higher recoveries were obtained by the simple method than by conventional method. The simple method allows processing a high number of samples at the same time, minimizing the sample manipulation and consequently, the sample loss and contamination. In conclusion, the proposed method is simple, rapid, low-cost and achieves good results. Keywords: fatty acid; milk; bovine; gas chromatography. Resultados y discusión 117 Resumen Un nuevo método abreviado ha sido desarrollado para la extracción y derivatización de ácidos grasos en leche. La extracción de los lípidos de la leche se ha llevado a cabo en H2SO4/metanol. La metilación se ha realizado a 60 ºC durante 2 h y los ésteres metílicos de los ácidos grasos fueron recuperados para el análisis cromatográfico mediante la adición de hexano. Los parámetros del método fueron optimizados y el método abreviado fue comparado con el método de referencia para la determinación de ácidos grasos en leche. En la mayor parte de los 24 ácidos grasos analizados, el método abreviado mostró recuperaciones similares o mejores que el método convencional. El método simple permite procesar un alto número de muestras al mismo tiempo, minimizando la manipulación de la muestra y consecuentemente, la pérdida de la misma y su contaminación. En conclusión, el método propuesto es simple, rápido, económico y logra buenos resultados. Palabras clave: ácido graso; leche; bovino; cromatografía de gases Resultados y discusión 124 curves consisted of a plot of peak area versus concentration. Linear regression analysis of absolute areas versus injected quantities of the FAs was used. The limit of detection (LOD) was determined as the lowest concentration that gave a signal to noise ratio (S/N) ≥ 3, and the limit of quantification (LOQ) was determined as the lowest concentration that gave an S/N ≥10. Simple method optimization Before studying the simple method and comparing the results obtained by the simple method with those obtained by the conventional method, it was necessary to establish the optimal conditions in terms of sample volume, extraction time, and the time and temperature during methylation. Initially, FAs were extracted from a 50 µL milk sample by adding 2 mL of 25 mL L-1 H2SO4 in methanol. Samples were mixed and stored at - 20 °C for 2 h, and then derivatization was carried out in a water bath at 80 ºC for 1 h as described by Watts & Browse (2002). For the determination of the ideal amount of sample, the proposed method was assayed using 5, 10, 50 and 100 µL of milk. The FAMEs extracted by the hexane layer were diluted before GC analysis in order to inject the same final concentration of FAMEs in all cases. The effect of extraction time was studied at 1, 3, 8, 12, 16 and 24 h. Samples were kept in a water bath at 40, 60 and 80 ºC for a period of 1 h to determine the ideal temperature during methylation. After the optimal temperature was established, this procedure was assayed in terms of time for 30 min, 1, 2, 4, 8 and 12 hours in a water bath at 60 ºC. Resultados y discusión 125 Repeatability, intermediate precision, and recoveries The repeatability (intra-day Relative Standard Deviation (RSD) %)) of the simple method was calculated based on the RSD of nine (n=9) complete analyses of the same milk sample under the same experimental conditions by the same operator. The intermediate precision (inter-day RSD %) was established from three complete analyses of the same milk sample on three consecutive days (n=9). The recovery of the simple method was determined from the complete analysis of nine replicate analyses (n=9) of the same milk sample pre-fortified with the selected pure FA dilutions (Std3, Std4, Std5). Statistics Changes in the measured fatty acid content due to the extraction and methylation conditions were statistically analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA). Post hoc analysis was carried out using Tukey´s test. Student’s t-test was used to determine differences in the FA content of milk analyzed by conventional and simple methods. Differences were considered to be significant when P<0.05. Data analyses were conducted using the SPSS statistical package, version 13.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Results and discussion Response linearity The response linearity for different pure FA standards (Table 1) show an adequate linearity for all analytes, with r values higher than 0.99. The slope and intercept of the injected FAs were used to calculate the linear FID response of the FAs. The high slope values are indicative of the high detector sensitivity for the different FAs. The LOD and Resultados y discusión 126 LOQ for the different pure FAs showed that standard solutions Std7 and Std8 were beyond the quantification limits for C4:0, C6:0, C8:0, cis9-trans11 CLA and C20:1n-9. For the other fatty acids, only standard Std8 was outside the quantification limits. The values for standard solutions outside the quantification limits were not used during further study of the method. Method optimization Upon examination of the importance of sample volume (Table 2), only C15:0 showed high concentrations when using 50 µL of sample. However, for most of the FAs, the highest concentrations were obtained using 5 and 10 µL of sample. For five FAs (C16:0, C17:0, C17:1n-7, C18:1n-9 and C20:1n-9), significantly higher concentrations were obtained using 10 µL than using 5 µL. For other FAs (C14:0, C14:1n-5, C18:3n-3 and C22:5n-3), the RSD using a sample volume of 5 µL was higher than 10%. Thus, a sample volume of 5 µL was considered to be inadequate, and 10 µL of milk was chosen as the optimum sample volume. Once the optimum sample volume was established, the optimum extraction time was investigated (Table 3). The amount of FAs increased with increasing extraction time up to 12-16 h, when the highest values were obtained for all FAs. Significantly higher amounts of FAs were only found at 16 h versus 12 h for C20:0. As a result, overnight extraction (12-16 h) was selected as the optimal extraction time for the method. The extraction procedure was performed in darkness at a temperature of -20 ºC in order to prevent FA degradation (Araujo et al., 2008). The derivatization process was optimized by determining the ideal temperature (Table 4) and reaction time (Table 5). The best results for most of the FAs in milk were obtained at 60 ºC and 80 ºC. Regarding individual FAs, higher amounts of C20:1n-9 Resultados y discusión 127 were obtained for transmethylation at 80 ºC than at 60 ºC, but the best results were obtained at 60 ºC for cis-9,trans-11 CLA and C20:0. Taking into account these results and the fact that the process at 60 ºC is less aggressive and more energy efficient than at 80 ºC, we selected 60 ºC as the optimal temperature. When optimizing derivatization time, the highest FAs quantities were generally obtained at 2 and 4 h. For the shortest FAs (C4:0 and C6:0), higher values were obtained at 1 and 2 h. For C16:0, the results were better at 4 h than at 2 h, but higher concentrations were measured for 8 FAs (C14:1n-5, C15:0, C18:0, C18:1n-7, C20:0 and C22:5n-3) when using a transmethylation time of 2 h. Thus, since a transmethylation time longer than 2 h did not improve the results and was less efficient in terms of time and energy consumption, we chose 2 h as the optimal transmethylation time. Recovery factor The recoveries (R) (Table 6) were determined in spiked samples at three different concentrations, corresponding to standards Std3, Std4 and Std5 (Table 1). The highest R values were obtained at the intermediate level, and the lowest R values were found following spiking similar to the concentration of the least-concentrated standard solution (Std5). For the three different levels, the lowest R values were obtained for short chain fatty acids. This is probably due to the loss of volatiles during concentration under the nitrogen stream. The R values obtained for this method were between 74.18 and 100.34. Repeatability and intermediate precision The simple method showed repeatability values lower than 7 % (Table 6), except for C4:0. The repeatability values for the method were between 7.00 and 1.04 %. The Resultados y discusión 128 intermediate precision for the method had values under 10% except for C18:0, C18:1n- 9, C18:1n-7 and C20:1n-9, which showed the greatest RSD. The inter-day RSD varied between 10.94 and 3.09 % for the same sample analyzed in triplicate on three different days. Comparison with conventional method Once the simple method was optimized and recovery, repeatability and intermediate precision were conducted, the developed method was compared to the conventional method by analyzing milk samples. Figure 1 shows the chromatogram of a milk sample obtained by the simple method. The obtained results (Table 7) showed that the FA content obtained by the simple method was significantly lower than those obtained by the conventional method for the cases C4:0 and C6:0 FAs. No significant differences were obtained when milk samples were analyzed by the two methods for the case of C8:0, C10:0, C14:1n-5 and C20:1n-9, whereas for the case of all the other FAs determined, appeared to be higher when using the simple method rather than the conventional method. The differences in the FA content of milk were more evident (2- fold in some cases) for longer-chain FAs than for shorter-chain FAs (except for C20:1n- 9). Moreover, the concentration of the longest FAs detected using the conventional method were below the quantification limits of the GC analysis. This finding is in agreement with the fact that the alkali-based transesterification using in the conventional method has two main shortcomings. Free FAs (Carvalho & Malcata, 2005; Golay, Dionisi, Hung, Giuffrida, & Destaillats, 2006) and sphingolipids may remain partially unreacted and esters undergo saponification reactions. In presence of methoxide, water yields free hydroxide ions. In presence of these ions, esters and the newly generated FAMEs can be hydrolyzed (Juárez et al., 2008). For this reason strict Resultados y discusión 129 anhydrous conditions are required (Carvalho & Malcata, 2005). These factors help to explain the poor results found for long-chain FAs in comparison to the simple method. The higher quantities of these FAs obtained through the simple method is a very important factor since modified milks classified as functional foods most frequently contain increased concentrations of n-3 polyunsaturated fatty acids and CLAs. These compounds are included in the longer-chain FAs from milk. Other modified methods, obtained statistically indistinguishable results for most FAs when compared to the conventional method, but they displayed significant advantages in terms of time, chemical usage, and labor (Araujo et al., 2008; Feng, Lock, & Gasnsworthy, 2004; Luna, Juárez, & de la Fuente, 2005). Additionally, other simple methods carried out for other matrices obtained better results than those obtained by traditional methods. This fact is due to the prevention of FA losses by the multiple step handling and high quantities of sample and solvents. (Abdulkadir & Tsuchiya, 2008; Carrapiso, Timón, Petrón, Tejeda, & García, 2000; Juárez et al., 2008; Meier, Mjøs, Joensen, & Grahl-Nielsen, 2006). PLEASE INSERT HERE FIGURE 1 In conclusion, the method developed in this research obtained better results than the conventional method for detection of the nutritionally important long-chain FAs. In addition, this method decreases the risk of FA loss and sample contamination through reduction in sample handling, and it is suitable for the analysis of large number of samples at the same time. Moreover, the proposed, simple method shows good recoveries and accuracy. Resultados y discusión 130 Acknowledgments The authors thank Consellería do Medio Rural (FEADER 2008/32 and FEADER 2008/33) and Dirección Xeral de Investigación Desenvolvemento e Innovación (Xunta de Galicia, Lucas Labrada program) for financial support. References Abdulkadir, S., & Tsuchiya, M. (2008). One-step method for quantitative and qualitative analysis of fatty acids in marine animal samples. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 354, 1-8. Alexander, J.W. (1998). Inmunonutrition: the role of x-3 fatty acids. Nutrition, 14, 627- 633. Araujo, P., Nguyen, T.T., Frøyland, L., Wang, J., & Kang, J.X. (2008). Evaluation of a rapid method for the quantitative analysis of fatty acids in various matrices. Journal of Chromatography A, 1212, 106-113. Belury, M. A. (2002). Dietary conjugated dienoic isomers of linoleic acid in health: physiological effects and mechanisms of action. Annual Review of Nutrition, 22, 505-531. Resultados y discusión 131 Carrapiso, A.I., Timón, M.L., Petrón, M.J., Tejeda, J.F., & García, C. (2000). In situ transesterefication of fatty acids from Iberian pig subcutaneous adipose tissue. Meat Science, 56, 159-164. Carvalho, A.P., & Malcata, F.X. (2005). Preparation of fatty acid methyl ester for gaschromatographic analysis of marine lipids: insight studies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 5049-5059. Castañeda-Gutiérrez, E., de Veth, M.J., Lock, A.L., Dwyer, D.A., Murphy, K.D., & Bauman, D.E. (2007). Effect of supplementation with calcium salts of fish oil on n- 3 fatty acids in milk fat. Dairy Science, 90, 4149-4156. British Standards Institution. (1955). Gerber method for the determination of fat in milk and milk products. BS 696. London: British Standards Institution. Feng, S., Lock, A.L., & Gasnsworthy, P.C. (2004). A rapid lipid separation method for determining fatty acid composition of milk. Journal of Dairy Science, 87, 3785- 3788. Folch, J., Lees, M., & Stanley, G.H.S. (1957). A singe method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry, 226, 497-506. Garg, M.L., Wood, L.G., Singh, H., & Moughan, P.J. (2006). Means of delivering recommended levels of long chain n-3 polyunsaturated fatty acids in human diets. Journal of Food Science, 71(6), R66-R71. Golay, P.-A., Dionisi, F., Hung, B., Giuffrida, F., & Destaillats, F. (2006). Direct quantification of fatty acids in dairy powders with special emphasis on trans fatty acid content. Food Chemistry, 101, 1115-1120. Resultados y discusión 132 International Organization for Standardization-International Dairy Federation (ISOIDF). (2001). Milk and milk products-Extraction methods for lipids and liposoluble compounds. International Standard ISO 14156-IDF 172. Brussels: IDF. International Organization for Standardization-International Dairy Federation (ISOIDF). (2002). Milk fat-preparation of fatty acid methyl esters. International Standard ISO 15884-IDF 182. Brussels: IDF. Jimenez, M., Garcia, H.S., & Beristain, C.I. (2008). Sensory evaluation of dairy products supplemented with microencapsulated conjugated linoleic acid (CLA). LWT - Food Science and Technology, 41, 1047-1052. Juárez, M., Polvillo, O., Contò, M., Ficco, A., Ballico, S., & Failla, S.J. (2008). Comparison of four extraction/methylation analytical methods to measure fatty acid composition by gas chromatography in meat. Journal of Chromatography A, 1190, 327-332. Kang, J.X., & Wang, J.A. (2005). A simplified method for analysis of polyunsaturated fatty acids. BMC Biochemistry, 6, 5. Luciano, F.B. (2009). The impacts of lean red meat consumption on human health: a review. CyTA-Journal of Food, 7, 143-151. Luna, P., Juárez, M., & de la Fuente, M.A. (2005). Validation of a rapid milk fat separation method to determine the fatty acid profile by gas chromatography. Journal of Dairy Science, 88, 3377-3381. Luna, P., Juárez, M., & de la Fuente, M.A. (2008). Gas chromatography and silver-ion high-performance liquid chromatography analysis of conjugated linoleic acid Resultados y discusión 133 isomers in free fatty acid form using sulphuric acid in methanol as catalyst. Journal of Chromatography A, 1204, 110-113. Meier, S., Mjøs, S.A., Joensen, H., & Grahl-Nielsen, O. (2006). Validation of a one-step extraction/methylation method for determination of fatty acids and cholesterol in marine tissues. Journal of Chromatography A, 1104, 291-298. Noriega-Rodriguez, J.A., Ortega-Garcia, J., Angulo-Guerrero, O., Garcia, H.S., Medina-Juarez, L.A., & Gamez-Meza, N. (2009). Oil production from sardine (Sardinops sagax caeruela). CyTA-Journal of Food, 7, 173-179. Rosenfeld, J.M. (2002). Application of analytical derivatizations to the quantitative and qualitative determination of fatty acids. Analytica Chimica Acta, 465, 93-100. Watts, J., & Browse, J. (2002). Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caeborhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99, 5854-5859. WHO. (2003). Diet, Nutrition and the Prevention of Chronic Diseases. WHO technical report (Vol. 916, pp. 1-149). Geneva: World Health Organization. Woods, V.B., & Fearon, A.M. (2009). Dietary sources of unsaturated fatty acids for animals and their transfer into meat, milk and eggs: A review. Livestock Science, 126, 1-20.