Puesta a punto y validación de una técnica económica, rápida y sencilla para la estimación de la edad en odontocetos

María Piñeiro Varela Facultad de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2024 Modalidad del Trabajo: Experimental Trabajo de Fin de Grado Puesta a punto y validación de una técnica económica, rápida y sencilla para la estimación de la edad en odontocetos 2 Licencia Esta obra pertenece a María Piñeiro Varela y está sujeta a una licencia Reconocimiento- Compartir Igual 4.0 Internacional de Creative Commons. Para ver una copia de esta licencia, visite: https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/ 3 Resumen La estimación de la edad en animales salvajes es una herramienta esencial para el estudio de la estructura de las poblaciones, la interpretación de determinados datos biológicos y la gestión de los programas de conservación de especies amenazadas. Existen varias formas de estimar la edad de los animales, siendo la técnica más común el contaje de grupos de capas de crecimiento (GLG) en la dentina, un recuento que se puede llevar a cabo empleando diferentes métodos. En este trabajo se ha optado por estimar la edad en odontocetos mediante el contaje de GLG en secciones de dientes lijadas y pulidas, utilizando un estereomicroscopio y un microscopio óptico. Para validar el procedimiento, se compararon los resultados con los obtenidos en secciones descalcificadas de los mismos dientes empleando microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microtomografía computarizada. La Coordinadora para o Estudo dos Mamíferos Mariños (CEMMA) proporcionó dientes de 34 animales pertenecientes a las cuatro especies de odontocetos con mayor número de varamientos en la costa gallega: delfín común de hocico corto (Delphinus delphis), marsopa común (Phocoena phocoena), delfín listado (Stenella coeruleoalba) y delfín mular (Tursiops truncatus). Los mejores resultados, tanto para la identificación de las estructuras dentales como para el contaje de GLG, se obtuvieron con el microscopio electrónico de barrido en los dientes de delfín común, delfín listado y delfín mular. Sin embargo, la microscopía óptica en secciones no tratadas también demostró ser una técnica eficaz para la determinación de la edad en todas las especies, mientras que el proceso de descalcificación solamente mejoró la definición de los GLG en las secciones de dientes de delfín mular, por ser las de mayor tamaño. La microtomografía computarizada permitió identificar algunos GLG, pero no se consiguió completar el contaje en los dientes de delfín mular con la cavidad pulpar más cerrada. En definitiva, esta metodología ha permitido poner a punto en la Facultad de Veterinaria de la USC una técnica económica, rápida y sencilla para la estimación de la edad en odontocetos mediante el contaje de GLG en secciones de dientes lijadas y pulidas, técnica que se ha validado comparando los resultados con los obtenidos en secciones descalcificadas de los mismos dientes empleando microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microtomografía computarizada. Palabras clave: estimación de la edad, grupos de capas de crecimiento, GLG, cetáceos, odontocetos, dientes, microscopía óptica, estereomicroscopía, microscopía electrónica de barrido, microtomografía computarizada. 4 Resumo A estimación da idade en animais salvaxes é unha ferramenta esencial para o estudo da estrutura das poboacións, a interpretación de determinados datos biolóxicos e a xestión dos programas de conservación de especies ameazadas. Existen varias formas de estimar a idade dos animais, sendo a técnica máis común a conta de grupos de capas de crecemento (GLG) na dentina, un reconto que se pode levar a cabo empregando diferentes métodos. Neste traballo optouse por estimar a idade en odontocetos mediante a conta de GLG en seccións de dentes lixadas e pulidas, utilizando un estereomicroscopio e un microscopio óptico. Para validar o procedemento, comparáronse os resultados cos obtidos en seccións descalcificadas dos mesmos dentes empregando microscopia óptica, microscopia electrónica de varrido e microtomografía computarizada. Para isto, a Coordinadora para o Estudo dos Mamíferos Mariños (CEMMA) proporcionou dentes de 34 animais pertencentes ás catro especies de odontocetos con maior número de varamentos na costa galega: golfiño común (Delphinus delphis), toniña (Phocoena phocoena), golfiño riscado (Stenella coeruleoalba) e arroaz (Tursiops truncatus). Os mellores resultados, tanto para a identificación das estruturas dentais como para a conta de GLG, obtivéronse co microscopio electrónico de varrido para os dentes de golfiño común, golfiño riscado e arroaz. Porén, a microscopia óptica en seccións non tratadas tamén amosou ser unha técnica eficaz para a determinación da idade en todas as especies, mentres que o proceso de descalcificación soamente mellorou a definición dos GLG nas seccións de dentes de arroaz, por ser as de maior tamaño. A microtomografía computarizada permitiu identificar algúns GLG, pero non se conseguiu completar a conta nos dentes de arroaz coa cavidade polpar máis pechada. En definitiva, esta metodoloxía permitiu poñer a punto na Facultade de Veterinaria da USC unha técnica económica, rápida e sinxela para a estimación da idade en odontocetos mediante a conta de GLG en seccións de dentes lixadas e pulidas, técnica que se validou comparando os resultados cos obtidos en seccións descalcificadas dos mesmos dentes empregando microscopia óptica, microscopia electrónica de varrido e microtomografía computarizada. Palabras chave: estimación da idade, grupos de capas de crecemento, GLG, cetáceos, odontocetos, dentes, microscopia óptica, estereomicroscopia, microscopia electrónica de varrido, microtomografía computarizada. 5 Abstract Age estimation in wild animals is an essential tool for the study of populations structure, the interpretation of certain biological data and the management of conservation programmes for endangered species. There are several ways to estimate the age of animals, being the most common technique the counting of growth layer groups (GLGs) in dentine, which can be carried out using different methods. In this work, the age of odontocetes has been estimated by counting GLGs in ground and polished teeth sections, using a stereomicroscope and a light microscope. Besides, the procedure has been validated by comparing the results with those obtained on decalcified sections from the same teeth using light microscopy, scanning electron microscopy and microcomputed tomography. For this purpose, the Coordinadora para o Estudo dos Mamíferos Mariños (CEMMA) provided teeth from 34 animals belonging to the four species of odontocetes with the highest number of strandings on the Galician coast: short-beaked common dolphin (Delphinus delphis), harbour porpoise (Phocoena phocoena), striped dolphin (Stenella coeruleoalba) and bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). The best results, both for the identification of dental structures and for GLGs count, were obtained with scanning electron microscopy in common dolphin, striped dolphin and bottlenose dolphin teeth. However, light microscopy on untreated sections was also proved to be an effective technique for age determination in all species, while the decalcification process only improved the definition of GLGs in the bottlenose dolphin teeth sections, as they were the largest. Microcomputed tomography allowed the identification of some GLGs, but it was not possible to complete the count in bottlenose dolphin teeth with a more closed pulp cavity. In short, this methodology has made it possible to develop an economical, fast and simple technique at the Faculty of Veterinary Medicine of the USC for the estimation of age in odontocetes by counting GLGs in sanded and polished teeth sections, a technique that has been validated by comparing the results with those obtained in decalcified sections of the same teeth using light microscopy, scanning electron microscopy and microcomputed tomography. Keywords: age estimation, growth layer groups, GLG, cetaceans, odontocetes, teeth, light microscopy, stereomicroscopy, scanning electron microscopy, microcomputed tomography. 6 ABREVIACIONES CEMMA: Coordinadora para o Estudo dos Mamíferos Mariños DDE: Delphinus delphis (Delfín común de hocico corto) EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético GLG: Grupos de capas de crecimiento (del inglés, growth layer groups) LT: Longitud total (en cm), medida desde el extremo más rostral de la cara hasta a hendidura entre los lóbulos de la aleta caudal MEB: Microscopía electrónica de barrido; microscopio electrónico de barrido Micro-TC: Micrografía computarizada ONG: Organización no gubernamental PPH: Phocoena phocoena (Marsopa común) RDO: Rapid Decalcification Solution r.p.m.: Revoluciones por minuto SCO: Stenella coeruleoalba (Delfín listado) TTR: Tursiops truncatus (Delfín mular) 7 ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 8 1.1. Métodos para la estimación de la edad absoluta ........................................................... 9 1.1.1. Morfología de los dientes .......................................................................................... 10 1.1.2. Métodos para la determinación de los grupos de capas de crecimiento (GLG) ........ 12 1.1.3. Otros métodos para la estimación de la edad absoluta en cetáceos ........................... 14 1.2. Métodos para la estimación de la edad relativa ....................................................... 15 1.3. Descripción de los odontocetos estudiados ............................................................... 16 1.3.1. Delfín común de hocico corto (Delphinus delphis) ................................................... 16 1.3.2. Delfín mular (Tursiops truncatus) ............................................................................. 17 1.3.4. Delfín listado (Stenella coeruleoalba) ...................................................................... 18 1.3.5. Marsopa común (Phocoena phocoena) ..................................................................... 18 2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 20 3. MATERIAL Y MÉTODOS .............................................................................................. 21 3.1. Toma de muestras ....................................................................................................... 21 3.2. Lijado y pulido ............................................................................................................ 23 3.3. Descalcificación ........................................................................................................... 24 3.4. Microscopía electrónica de barrido (MEB) .............................................................. 24 3.5. Microtomografía computarizada (micro-TC) .......................................................... 24 4. RESULTADOS .................................................................................................................. 26 4.1. Almacenamiento de los dientes .................................................................................. 26 4.2. Obtención de las secciones ......................................................................................... 26 4.3. Descalcificación ........................................................................................................... 26 4.4. Estructura dental ........................................................................................................ 26 4.5. Contaje de GLG .......................................................................................................... 28 4.6. Contaje de GLG en secciones lijadas y pulidas ........................................................ 29 4.7. Contaje de GLG en secciones descalcificadas .......................................................... 31 4.8. Contaje de GLG en el microscopio electrónico de barrido ..................................... 32 4.9. Contaje de GLG con microtomografía computarizada .......................................... 34 5. DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 36 6. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 41 7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 42 8 1. INTRODUCCIÓN La estimación de la edad en animales salvajes aporta información fundamental para el estudio de la biología de las especies, tanto a nivel individual como para comprender los modelos dinámicos poblacionales. Estos modelos describen y predicen las variaciones en el tamaño y la estructura de las poblaciones a lo largo del tiempo (Hohn, 2018; Olson et al., 2022; Read et al., 2018). El conocimiento de la edad de los individuos permite definir la longevidad y las tasas de natalidad y mortalidad de una especie, lo que posibilita proyectar la trayectoria de las poblaciones en el tiempo (Campana y Stewart, 2014; Mbizah et al., 2016; Murphy et al., 2014; Rouby et al., 2020). Por otro lado, estimar el momento de maduración sexual proporciona información acerca del ciclo reproductivo de una especie, del potencial reproductivo de una población y, por tanto, de su capacidad de recuperación (Kesselring et al., 2017; Schwacke et al., 2022). Además del uso tradicional para estudiar la estructura de las poblaciones, la estimación de la edad también puede emplearse para interpretar los efectos de la bioacumulación de toxinas y sustancias contaminantes en la salud de los animales (Hohn, 2018; Read et al., 2018). Adicionalmente, algunas de las muestras empleadas para la determinación de la edad, como los dientes, también aportan información acerca de la salud, la madurez, el sexo, la historia reproductiva y la influencia de factores ambientales en el estado general de los individuos (Lockyer, 1995). Los mamíferos marinos, y más específicamente los cetáceos, son motivo de preocupación desde hace décadas debido a su baja tasa reproductiva y a su vulnerabilidad ante las agresiones antrópicas derivadas fundamentalmente de la actividad pesquera, uno de los principales factores que influyen en la incidencia de varamientos (Aguilar et al., 2009; Saavedra et al., 2017). Por tanto, además de lo mencionado anteriormente, estimar la edad en estas especies es esencial para conocer la repercusión que dichas actividades humanas generan sobre ellas con el objetivo de mejorar las estrategias de mitigación (Henriksen et al., 2024). Las aguas que bañan los aproximadamente 1500 km de costa gallega son muy ricas en nutrientes debido al fenómeno del afloramiento: ascenso estacional de agua profunda rica en nutrientes cerca de la costa (López, 2018). Esta riqueza nutritiva explica la elevada biodiversidad que sustenta, contabilizándose hasta 24 especies de cetáceos, pero también la intensa actividad pesquera que se desarrolla en esta área; fruto de esta coexistencia, las costas gallegas son el escenario de numerosos varamientos de cetáceos muertos, enfermos o aparentemente sanos (López et al., 2015; Saavedra et al., 2017). En 2023 se alcanzó la cifra récord de 592 cetáceos varados en un solo año en Galicia (delfín común de hocico corto, 9 Delphinus delphis: 433 individuos; delfín mular, Tursiops truncatus: 42 individuos; delfín listado, Stenella coeruleoalba: 20 individuos; marsopa común, Phocoena phocoena: 14 individuos; y varias especies de ballenas: 12 individuos). De los cetáceos varados en buen estado como para ser valorados, el 42,3% mostraban indicios claros de haber muerto consecuencia de interacciones con artes de pesca (Rede de Varamentos de Galicia [REVARGAL], 2023). En los varamientos de animales vivos la información sobre su edad permite tomar decisiones acerca de su liberación, rehabilitación o eutanasia. Por otro lado, la determinación de los grupos demográficos afectados en varamientos masivos o eventos de mortalidad inusuales puede ayudar a comprender los factores subyacentes y las posibles consecuencias para las poblaciones (Calzada et al., 1994; Moore et al., 2007). Sin embargo, la estimación de la edad en mamíferos marinos puede suponer un verdadero desafío debido a sus hábitats difícilmente accesibles y a su naturaleza esquiva, por lo que las oportunidades de adquirir información suficiente o de llevar a cabo la toma de muestras son limitadas (Herrman et al., 2020). Además, en el caso de los cetáceos, la ausencia de rasgos fenotípicos externos asociados a la edad una vez alcanzado el tamaño adulto, las grandes dimensiones de las poblaciones y los comportamientos migratorios dificultan todavía más la tarea (Barrett et al., 2024). Es por ello que en la mayoría de los casos se trabaja con estimaciones de edad relativa o categórica clasificando a los animales en grupos de edades (como neonato, juvenil y adulto), una clasificación que, aunque simple, aporta información valiosa en múltiples campos de investigación y determinados aspectos de su medicina. Sin embargo, existen varias técnicas para estimar la edad cronológica o absoluta de los especímenes que proporcionan unidades medibles (normalmente en años) (Herrman et al., 2020; Hohn, 2018; Laws, 1952). 1.1. Métodos para la estimación de la edad absoluta El método más extendido para la estimación de la edad absoluta de los individuos es el contaje de grupos de capas de crecimiento (growth layer groups, GLG) que, según Perrin y Myrick (1980), son “"patrones repetitivos o semirrepetitivos de grupos adyacentes de capas de crecimiento incremental dentro de la dentina, cemento o hueso que se definen como una unidad contable. Dicha unidad debe involucrar como mínimo un cambio: de transparente a opaco, de oscuro a claro, de cresta a surco o de más a menos teñido". Numerosos estudios han concluido que la tasa de depósito de estos GLG en los dientes de odontocetos es anual (Hohn et al., 1989; Myrick et al., 1984; Perrin y Myrick, 1980). Los factores que gobiernan la formación de GLG son desconocidos, pero es probable que la tasa de depósito se vea influenciada por cambios estacionales, nutritivos, la tasa de crecimiento y el 16 edad (Caron y Smith, 1990), determinación de patrones de proporciones de isótopos de carbono estables (Lubetkin et al., 2008), radiometría de la bulla timpánica para determinar el desequilibrio entre el 210Pb y el 226Ra (Kastelle et al., 2003), medición del peso del cristalino (Bauer et al., 1964) y análisis morfométricos (Blundell y Pendleton, 2008). En este trabajo se ha llevado a cabo la estimación de la edad cronológica en varias especies de odontocetos mediante el contaje de GLG en dentina comparando los resultados obtenidos con diferentes técnicas: estereomicroscopía, microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microtomografía computarizada. Para ello se ha contado con dientes procedentes de individuos de delfín común de hocico corto (Delphinus delphis), delfín mular (Tursiops truncatus), delfín listado (Stenella coeruleoalba) y marsopa común (Phocoena phocoena), las cuatro especies que más varan en las costas de Galicia (REVARGAL, 2023). Estos cuatro odontocetos pertenecen al Orden Artiodactyla, Infraorden Cetacea, Parvorden Odontoceti. Las tres especies de delfines pertenecen a la Familia Delphinidae, mientras que la marsopa común se incluye en la Familia Phocoenidae (Rosel et al., 2023). Dado que las especies objeto de este trabajo no se encuentran entre las estudiadas habitualmente en el Grado en Veterinaria, conviene realizar una breve descripción morfológica de cada una de ellas. 1.3. Descripción de los odontocetos estudiados 1.3.1. Delfín común de hocico corto (Delphinus delphis) El delfín común de hocico corto o golfiño común es la especie que vara más frecuentemente en toda la costa de Galicia. Su hábitat se localiza principalmente entre los 100 y 200 m de profundidad, normalmente fuera de las Rías (López, 2003 y 2018). Presenta el dorso de color negro formando un triángulo invertido a nivel de la aleta dorsal, el costado es amarillento en la parte anterior y gris en la mitad posterior, mientras que la zona ventral es de color blanco. Muestra un pico pronunciado, aletas pectorales largas y afiladas y una aleta dorsal alta y en forma de medialuna (Figura 2). En cuanto a la dentadura, presenta de 40 a 60 dientes cónicos de 2,5-3 mm de diámetro en cada hemiarcada (López 2003, 2018; López et al., 2015). El tamaño de los individuos neonatos en Galicia es de aproximadamente 100 cm. En torno a los 8-9 años los machos alcanzan la edad de madurez sexual con una longitud superior a los 205- 208 cm, mientras que las hembras maduran sexualmente a los 5-7 años presentando un tamaño superior a los 188 cm (López, 2003 y 2018). Su esperanza de vida es de 25-30 años (López et al., 2015). Está considerada como una especie de preocupación menor por la Lista Roja de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) (Genov, 2023) y pertenece al 17 Listado de Especies Silvestres en Régimen de Protección Especial (LESRPE) del Catálogo Nacional de Especies Amenazadas (Ministerio para la Transición Ecológica y el Reto Demográfico [MITECO], 2023). 1.3.2. Delfín mular (Tursiops truncatus) Es una especia ampliamente distribuida por aguas templadas y tropicales, tanto costeras como profundas (Uriarte et al., 2021). En Galicia es más frecuente en la costa occidental en zonas de menos de 20 m de profundidad, siendo también habitual en las Rías (López, 2003 y 2018). Muestran una coloración grisácea, más oscura en el área del lomo y más clara en el vientre (López et al., 2015). Son animales robustos, con el pico corto, las aletas pectorales largas y afiladas y la aleta dorsal con forma de medialuna (López, 2003 y 2018) (Figura 3). Presentan de 21 a 26 dientes cónicos y puntiagudos de 5-7,5 mm de diámetro en cada hemiarcada (López et al., 2015). La longitud de los neonatos se encuentra entre los 100-120 cm. Los machos alcanzan la maduración sexual sobre los 9-14 años con una longitud aproximada de 300 cm, llegando a alcanzar un tamaño máximo de 338 cm; en las hembras la madurez sexual se alcanza entre los Figura 2. Morfología externa del delfín común de hocico corto (Delphinus delphis). Se muestra un ejemplar adulto. Fuente: cedida por Alfredo López (Tokio Ilustración). Figura 3. Morfología externa del delfín mular (Tursiops truncatus). Se muestra un ejemplar adulto. Fuente: cedida por Alfredo López (Tokio Ilustración). 18 5-13 años con 277 cm de longitud, pudiendo llegar a medir 331 cm. Tienen una esperanza de vida de 30-40 años (López, 2003; López et al., 2015; Uriarte et al., 2021). Se considera una especie en preocupación menor por la Lista Roja de la UICN (Wells et al., 2019) y vulnerable en el Catálogo Nacional de Especies Amenazadas (MITECO, 2023). 1.3.4. Delfín listado (Stenella coeruleoalba) El delfín listado o golfiño riscado es una especie ampliamente distribuida por las aguas templadas de los océanos Pacífico y Atlántico, pero poco frecuente en la costa gallega (López, 2003; López et al., 2015). Son animales esbeltos, con el pico largo, la aleta dorsal triangular y las pectorales cortas. El dorso es de color azulado y está atravesado por una franja más clara en forma de hoz. La parte ventral es de color blanquecino y muestra varias líneas blancas y negras por todo el cuerpo (Figura 4). Presentan de 40 a 50 dientes en cada hemiarcada, con morfología cónica y de 2,5 mm de diámetro (López et al., 2015). Las crías nacen con 90 cm de longitud (López et al., 2015). Los machos maduran sexualmente en torno a los 9 años con un tamaño comprendido entre los 195 y 220 cm (Perrin y Reilly, 1984, como se citó en López, 2003). La maduración sexual en las hembras ocurre entre los 3 y los 10 años, al alcanzar una longitud total media de 200 cm. La longevidad estimada de esta especie es de 30 años (López, 2003; López et al., 2015). Pertenece al Listado de Especies Silvestres en Régimen de Protección Especial (LESRPE) del Catálogo Nacional de Especies Amenazada (MITECO, 2023) y es considerada como una especie de preocupación menor por la Lista Roja de la UICN (Braulik, 2019). 1.3.5. Marsopa común (Phocoena phocoena) La marsopa común se distribuye por todo el hemisferio norte. En la costa gallega se denomina toniña y es poco frecuente, siendo más abundante en el área suroccidental (López, 2003; López et al., 2015). Figura 4. Morfología externa del delfín listado (Stenella coeruleoalba). Se muestra un ejemplar adulto. Fuente: cedida por Alfredo López (Tokio Ilustración). 19 Presenta una coloración negra en el dorso y blanca ventralmente, con la aleta dorsal triangular y las aletas pectorales negras y con el extremo redondeado. Su cuerpo es robusto y carece de pico (Figura 5). Tiene de 40 a 60 dientes por hemiarcada, de 3 mm de diámetro y morfología espatulada (López et al., 2015). Al nacimiento, las crías presentan un tamaño de 80 cm. Los machos alcanzan la maduración sexual alrededor de los 5 años con 155 cm de longitud, mientras que en las hembras sucede a los 3 años con 166 cm, superando el tamaño de los machos pudiendo llegar a medir 202 cm. Se estima que pueden vivir más de 25 años (López, 2003; López et al., 2015). Como especie global, la Lista Roja de la UICN la cataloga en el grupo de especies consideradas de preocupación menor (Braulik et al., 2020). Sin embargo, la población que asienta en aguas de Galicia ya fue declarada en 2007 como “vulnerable” (Decreto 88/2007), calificación que alcanzó en 2011 en el resto del estado español (Real Decreto 139/2011), pasando a ser recalificada como “en peligro de extinción” en 2020 (Orden TED/1126/2020, de 20 de noviembre). Figura 5. Morfología externa de la marsopa común (Phocoena phocoena). Se muestra un ejemplar adulto y una cría. Fuente: cedida por Alfredo López (Tokio Ilustración). 20 2. OBJETIVOS Con la realización de este trabajo se pretenden alcanzar dos objetivos: 1. Poner a punto en la Facultad de Veterinaria de la USC una técnica económica, rápida y sencilla para la estimación de la edad en odontocetos mediante el contaje de grupos de capas de crecimiento (GLG) en secciones de dientes lijadas y pulidas utilizando un microscopio óptico y un estereomicroscopio. 2. Comprobar la validez de la técnica comparando los resultados con los que se obtengan en las mismas muestras descalcificadas empleando microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microtomografía computarizada. 21 3. MATERIAL Y MÉTODOS Para llevar a cabo la estimación de la edad cronológica en odontocetos mediante el contaje de GLG en dentina, se han utilizado dientes procedentes de cuatro especies de cetáceos: delfín común de hocico corto (Delphinus delphis), marsopa común (Phocoena phocoena), delfín listado (Stenella coeruleoalba) y delfín mular (Tursiops truncatus). A partir de estos dientes se obtuvieron secciones longitudinales que se analizaron empleando estereomicroscopía, microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (MEB) y microtomografía computarizada (micro-TC). 3.1. Toma de muestras Las muestras utilizadas en la elaboración de este trabajo fueron facilitadas por la Coordinadora para o Estudo dos Mamíferos Mariños (CEMMA), ONG que desde 1999 es la responsable de la Red de Varamientos de Galicia con la colaboración económica de la Xunta de Galicia (Consellería de Medio Ambiente, Territorio e Vivenda). En total se emplearon dientes procedentes de 34 animales varados entre los años 2009-2024 en distintos puntos de la costa gallega: 7 ejemplares de delfín común de hocico corto (DDE), 7 ejemplares de marsopa común (PPH), 9 ejemplares de delfín listado (SCO) y 11 ejemplares de delfín mular (TTR). La Figura 6 muestra la morfología externa de los dientes de los odontocetos estudiados. Los dientes de los delfínidos son afilados, cónicos, cóncavos en la cara lingual y convexos en la vestibular; los dientes de marsopa común presentan una corona espatulada, con borde afilado, aplanada en el plano vestíbulo-lingual y están más curvados en la raíz, siendo cóncava la cara lingual y convexa la vestibular. La Tabla 1 recoge los datos acerca de especie, sexo, longitud total (LT) en cm, fecha y lugar de varamiento de todos los individuos cuyos dientes fueron analizados. La mayoría de los dientes estaban almacenados en alcohol de 70º o en formol tamponado al 10%, solamente los procedentes del ejemplar de DDE “sin datos1”, de la hembra de PPH de 187 cm y de la hembra de TTR de 159 cm se obtuvieron ya secos a partir de preparaciones museísticas. La extracción de los dientes de la hembra de delfín mular de 256 cm se realizó en la Sala de Disección del Pabellón III de la Facultad de Veterinaria de la USC a partir de su cabeza, conservada en congelación desde la fecha de varamiento y descongelada durante dos días en refrigeración. Se emplearon pinzas, bisturí y cuchillos de hoja corta para retirar cinco piezas dentales de la porción media de la hemiarcada mandibular izquierda. Este ejemplar presentaba una malformación a nivel de la columna vertebral (cifoescoliosis), por lo que su LT está subestimada. 22 Tabla 1. Datos de especie, sexo, longitud, fecha y lugar de varamiento y medio de conservación de los dientes utilizados en este trabajo. ESPECIE SEXO LT (cm) FECHA LUGAR MEDIO DE CONSERVACIÓN DDE Hembra 97,5 Sin datos Sin datos Alcohol DDE Macho 151* 23/11/2017 Sanxenxo Formol DDE Macho 156 01/02/2017 Sanxenxo Alcohol DDE Macho 187 23/11/2017 Porto do Son Formol DDE Macho 214 20/01/2017 Carballo Alcohol DDE Sin datos 1 Sin datos 1 Sin datos 1 Sin datos 1 En seco DDE Sin datos 2 Sin datos 2 Sin datos 2 Sin datos 2 Alcohol PPH Macho 95 15/12/2022 Vigo Alcohol PPH Macho 118,5 24/07/2017 Carnota Alcohol PPH Macho 139 28/02/2014 Ferrol Alcohol PPH Macho 143,5 17/04/2021 Barreiros Alcohol PPH Macho 167 11/09/2017 O Grove Alcohol PPH Macho 172 27/08/2021 San Ciprián Alcohol PPH Hembra 187 03/03/2024 Arteixo En seco SCO Hembra 110 21/08/2023 Foz Alcohol SCO Macho 112 19/07/2014 Sin datos Alcohol SCO Hembra 152 29/03/2024 Foz Alcohol SCO Hembra 158 29/04/2024 Foz Alcohol Figura 6. Dientes de los odontocetos estudiados. A, Dientes de DDE, morfológicamente indiferenciables de los de SCO; B , Dientes de un individuo neonato de PPH; C, Dientes de TTR; D , Cabeza del ejemplar de TTR hembra de 256 cm donde se aprecia la disposición y morfología de los dientes en la cavidad oral. La unidad de medida es 1 cm. 23 SCO Hembra 160 29/06/2017 Ferrol Alcohol SCO Hembra 169 Sin datos Sin datos Alcohol SCO Macho 202 20/06/2020 San Ciprián Alcohol SCO Macho 215 02/06/2021 O Vicedo Alcohol SCO Macho 216 05/08/2017 Foz Alcohol TTR Hembra 159 2021 Pontedeume En seco TTR Macho 162 06/07/2017 Cangas Alcohol TTR Hembra 236 23/01/2024 Muros Alcohol TTR** Hembra 256 16/02/2022 Porto do Son Alcohol TTR Hembra 270 06/11/2016 Arteixo Alcohol TTR Macho 271 23/11/2016 Ribeira Alcohol TTR Macho 274 15/12/2017 Muros Alcohol TTR Hembra 280 01/05/2009 Arteixo Alcohol TTR Macho 284 15/06/2023 Ribeira Alcohol TTR Hembra 304 10/12/2016 Carnota Alcohol TTR Hembra 318 31/08/2023 Porto do Son Alcohol DDE, delfín común; LT, longitud total; PPH, marsopa común; SCO, delfín listado; TTR, delfín mular. * Individuo con el pedúnculo caudal cortado. ** Individuo con una malformación a nivel de la columna vertebral. Antes del procesamiento de los dientes, se retiraron con un bisturí los restos de encía y de ligamento periodontal adheridos a la raíz y se dejaron secar al aire. 3.2. Lijado y pulido Se preparó como mínimo una sección de un diente de cada animal para realizar el contaje de GLG con un estereomicroscopio binocular Olympus SZX16 acoplado a una cámara digital Olympus EP50 y un fotomicroscopio óptico Olympus DP74. En los individuos de los que se disponía de más de una pieza dental, se prepararon hasta 3 secciones. Todos los dientes se lijaron con una amoladora (MD 125/150 CG) a 2950 r.p.m. en el plano vestíbulo-lingual, hasta que la cavidad pulpar quedó expuesta por ambos lados de la muestra, obteniendo una sección de entre 1-2,5 mm de grosor. Un diente del individuo de PPH hembra de 187 cm también se lijó en el plano mesio-distal hasta la línea media y un diente del ejemplar de DDE “sin datos1” en el plano transversal. Las secciones se continuaron lijando con los discos de una multiherramienta Dexter Power DM- 130b-1 o Parkside PFBS 12 B2 o con papel de lija de grano 120 o 180, hasta que se apreciaron los GLG en el microscopio óptico. Todas las muestras se pulieron con los discos de pulido de la multiherramienta Parkside PFBS 12 B2. Finalmente se obtuvieron secciones de entre 0,2-1 mm de grosor de los dientes de DDE, PPH y SCO y secciones de 0,4-2,3 mm de los dientes de TTR. El contaje de los GLG en dentina de cada una de las secciones fue llevado a cabo por dos lectoras empleando el estereomicroscopio y el fotomicroscopio óptico con los objetivos 4x y 10x. 24 3.3. Descalcificación Tras ser observadas al estereomicroscopio y al fotomicroscopio óptico, todas las secciones previamente lijadas y pulidas se descalcificaron introduciéndolas en ácido fórmico al 5% durante 2 horas para las muestras de DDE, PPH y SCO y durante 3 horas en el caso de los dientes de TTR. Pasado este tiempo se extrajeron, se lavaron con agua destilada dos veces durante 5 minutos y se dejaron secar al aire. Las mismas dos lectoras realizaron de nuevo el contaje de GLG en dentina empleando el fotomicroscopio óptico Olympus DP74 con el objetivo 4x. 3.4. Microscopía electrónica de barrido (MEB) Todas las secciones de dientes previamente lijadas y descalcificadas con ácido fórmico al 5% se prepararon para el MEB, exceptuando los dientes de los ejemplares de DDE hembra de 97,5 cm, PPH macho de 95 cm, TTR hembra de 159 cm y TTR macho de 162 cm, que no fueron analizados con esta técnica. Cada una de las secciones se colocó en un portamuestras debidamente identificado adhiriéndola con una cinta de carbono de doble cara. Las muestras se introdujeron en un metalizador (BALTEC SCD 005 Cool Sputter Coater) para cubrirlas con una capa de oro y se observaron con el microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM-6360LV). Las micrografías fueron tomadas con una distancia de trabajo de 44-49 mm a 20 kV, con una magnificación desde 8x (para secciones más grandes) hasta 75x (para los detalles) y fueron interpretadas por una observadora. 3.5. Microtomografía computarizada (micro-TC) Los dientes de tres ejemplares de delfín mular (TTR hembra de 236 cm, TTR hembra de 280 cm y TTR hembra de 318 cm) fueron escaneados con un micro-TC SkyScan 1172 (Bruker, Bélgica). Se obtuvo una sección de 1,5 mm de cada uno de los dientes con una sierra de diamante (Exakt 300). El corte se realizó longitudinalmente a nivel de la línea media en el plano vestíbulolingual, fijando previamente el diente a un portaobjetos con una resina a base de metacrilato (Technovit 4000). Una vez obtenidas las secciones, se descalcificaron sumergiéndolas en ácido fórmico al 5% durante 2 horas. A continuación se extrajeron, se introdujeron en acetona durante 30 minutos y finalmente se lavaron con agua destilada. Cada sección se colocó directamente sobre el portamuestras y se realizó la captura con un voltaje de 55 kV, una potencia de 10 W y una intensidad de 181 µA. Se colocó un filtro de 25 aluminio de 0,5 mm de espesor en la trayectoria del haz. La muestra fue escaneada en 180º con 0,2º de paso de rotación y la resolución se estableció en un tamaño de píxel de 2,5 µm. Con estos parámetros cada escaneo tuvo una duración promedio de 5 horas y 40 minutos. La reconstrucción de las microtomografías se realizó utilizando el software N Recon (Bruker) basándose en el algoritmo de Feldkamp et al. (1984). Para el análisis de las imágenes se emplearon los programas DataViewer, que permitió la observación de la sección en dos dimensiones y en una escala de grises; y CTvox, que ofreció una imagen tridimensional del diente con diferentes patrones de colores. 32 accesorias, conduciendo a recuentos más elevados, como en el caso de la hembra TTR de 280 cm; o bien a una subestimación de la edad en secciones demasiado delgadas (de menos de 0,3 mm de grosor) que sufrieron una descalcificación excesiva, lo que provocó deformaciones de las muestras y la pérdida de definición de los GLG, impidiendo el contaje en el caso del ejemplar DDE macho de -151 cm y en un diente del individuo DDE macho de 214 cm. Solamente en la sección transversal del diente del individuo DDE “sin datos1” la descalcificación facilitó la visualización de los primeros GLG. En los dientes de TTR el proceso de descalcificación sí mejoró la definición de los GLG, especialmente en los ejemplares TTR macho de 284 cm, permitiendo en este caso realizar la estimación de la edad, y TTR hembra de 304 cm, en el que aun así no se pudo completar el recuento. 4.8. Contaje de GLG en el microscopio electrónico de barrido En el MEB la línea neonatal se identificó como una cresta a continuación de la dentina prenatal y en cada GLG se diferenciaron una cresta y un surco adyacente (Figura 14). Figura 14. Contaje de GLG con el MEB. A, Diente de DDE “sin datos 1 ” (20x), se cuentan 7 GLG; B , Diente de TTR hembra de 280 cm (8x), se cuentan 7 GLG; C, Diente de SCO macho de 152 cm (19x), se cuentan 8 GLG; C, cemento; CP, cavidad pulpar; D 1 , dentina prenatal; E, esmalte; LNN, línea neonatal; PD, pulpa dental. 33 El contaje de los GLG en secciones de dientes de DDE, SCO y TTR fue más sencillo con esta técnica que con los métodos anteriores, ya que facilitó su identificación y permitió diferenciarlos de las capas accesorias. Sin embargo, en los dientes de PPH el MEB empeoró la definición de los GLG, por lo que no se obtuvieron buenos resultados, especialmente en los individuos de mayor longitud total. En los dientes pertenecientes a los ejemplares de mayor tamaño y con la cavidad pulpar cerrada se observó una pérdida de definición de los últimos GLG depositados, por lo que no se pudo completar el contaje y solamente se estimó una edad mínima. La Tabla 2 recoge el contaje de GLG y, por tanto, la edad en años estimada para cada individuo empleando las tres técnicas anteriores. Tabla 2. Contaje de GLG/ edad en años estimada para cada uno de los individuos empleando secciones de dientes sin descalcificar observadas con el estereomicroscopio y el microscopio óptico, y secciones descalcificadas vistas con el microscopio óptico y el microscopio electrónico de barrido. ESPECIE SEXO LT (cm) NÚMERO DE GLG/ EDAD ESTIMADA EN AÑOS Secciones sin descalcificar Secciones descalcificadas Microscopio óptico Estereomicroscopio Microscopio óptico MEB DDE Hembra 97,5 0 0 0 - DDE** Macho - 151 1 1 No valorable 0 DDE Macho 156 3 3 3 3 DDE* Macho 187 +7 No valorable +7 +10 DDE* Macho 214 7 6 6 7 DDE SD 1 SD 1 7 7 7 7 DDE SD 2 SD 2 2 2 No valorable 2 PPH Macho 95 0 0 0 - PPH Macho 118,5 2 2 1 1 PPH Macho 139 +8 +7 +7 2 PPH* Macho 143,5 +10 +10 +10 +9 PPH* Macho 167 No valorable No valorable No valorable No valorable PPH Macho 172 6 6 6 4 PPH* Hembra 187 +15 No valorable +12 +7 SCO Hembra 110 0 0 0 - SCO Macho 112 0 0 0 - SCO Hembra 152 2 2 2 2 SCO Hembra 158 2 2 2 2 SCO Hembra 160 3 2 2 3 SCO Hembra 169 2 2 2 1 SCO Macho 202 8 8 8 No valorable SCO* Macho 215 +10 +10 +10 +10 SCO* Macho 216 +20 +11 +20 +20 TTR Hembra 159 0 0 0 - TTR Macho 162 0 0 0 - TTR Hembra 236 2 2 2 1 TTR* ** Hembra 256 +16 No valorable +15 +15 TTR Hembra 270 6 6 8 7 TTR Macho 271 4 3 +6 5 TTR Macho 274 8 7 8 +7 TTR Hembra 280 7 7 10 7 TTR Macho 284 No valorable No valorable 7 6 34 Las diferencias en el contaje de GLG entre las distintas técnicas fueron más significativas en los animales de mayor tamaño con la cavidad pulpar cerrada, mientras que en los ejemplares de menor longitud las estimaciones de la edad se aproximaron más entre sí. Para un mismo individuo, los resultados obtenidos en el recuento de GLG fueron similares en los cuatro métodos. El MEB fue la técnica que ofreció unos resultados más variables con respecto al resto. 4.9. Contaje de GLG con microtomografía computarizada Las imágenes bidimensionales obtenidas con el programa DataViewer mostraron la línea neonatal como una capa hipomineralizada y cada GLG como un conjunto de dos capas de diferente mineralización en una escala de grises (Figura 15). Las imágenes tridimensionales visualizadas con el programa CTvox permitieron identificar las estructuras dentales empleando diferentes patrones de colores (Figura 16). A pesar de que con esta técnica se pudo diferenciar el patrón de GLG en todas las secciones, solamente se completó el contaje en el individuo TTR hembra de 236 cm, obteniendo un resultado de 1 GLG (Figuras 15 y 16). En los ejemplares TTR hembra de 280 cm y de 318 cm no se consiguieron identificar todas las capas de crecimiento ya que, al tratarse de individuos de más edad y, por tanto, con la cavidad pulpar más cerrada, los parámetros seleccionados para escanear la muestra no permitieron obtener una imagen que incluyese un área suficiente de la corona y la cavidad pulpar para realizar el contaje completo de GLG. Además, al igual que en técnicas anteriores, a medida que avanzaba el cierre de la cavidad pulpar, los GLG se aproximaban y perdían definición. TTR* Hembra 304 No valorable No valorable No valorable No valorable TTR* Hembra 318 +8 No valorable +8 +20 DDE, delfín común; LT, longitud total; PPH, marsopa común; SCO, delfín listado; SD, sin datos; TTR, delfín mular. * Individuos con la cavidad pulpar muy cerrada dificultando el contaje; ** individuo con el pedúnculo caudal cortado; *** individuo con cifoescoliosis y con la cavidad pulpar muy cerrada. Figura 15. Contaje de GLG en secciones de dientes escaneadas con el micro-TC y visualizadas con el programa DataViewer. A, Corte en 2D de un diente del ejemplar TTR hembra de 236 cm, se cuenta 1 GLG; B, Corte en 2D de un diente del ejemplar TTR hembra de 318 cm, cada flecha señala un GLG, pero no se puede completar el contaje. CP, cavidad pulpar; D1, dentina prenatal; E, esmalte; LNN, línea neonatal. 35 Figura 16. Contaje de GLG en secciones de dientes escaneadas con el micro-TC y visualizadas con el programa CTvox. A, Corte en 2D de un diente del ejemplar TTR hembra de 236 cm, se cuenta 1 GLG; B, Corte en 2D de un diente del ejemplar TTR hembra de 318 cm, cada flecha señala un GLG, pero no se puede completar el contaje. CP, cavidad pulpar; D1, dentina prenatal; E, esmalte; LNN, línea neonatal. A B 36 5. DISCUSIÓN La elaboración de este TFG ha permitido implementar en la Facultad de Veterinaria de la USC la técnica de estimación de la edad en odontocetos mediante el contaje de grupos de capas de crecimiento (GLG) en secciones de dientes lijadas y pulidas, utilizando estereomicroscopía y microscopía óptica. Para ello se ha seguido el método descrito por Henriksen et al. (2024) para la marsopa común, un método que ofrece una alternativa económica, rápida y sencilla a otras técnicas como el recuento de GLG en secciones de dientes incluidos en parafina (Luque et al., 2009), puesta a punto en la Facultad de Veterinaria de la USC por Álvarez (2018). Además, se confirmó su validez comparando los resultados con los obtenidos en las mismas secciones descalcificadas empleando microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido (MEB) (siguiendo el modelo de Hohn, 1980b), y microtomografía computarizada (micro-TC) (según el método descrito por Baier-Stegmaier et al., 2023). Para llevar a cabo las técnicas anteriores se contó con dientes procedentes de 34 individuos de las cuatro especies de odontocetos que más varan en la costa gallega (REVARGAL, 2023): delfín común de hocico corto (Delphinus delphis) (DDE), marsopa común (Phocoena phocoena) (PPH), delfín listado (Stenella coeruleoalba) (SCO) y delfín mular (Tursiops truncatus) (TTR). El método que ofreció mejores resultados, tanto para la identificación de las estructuras dentales como para llevar a cabo el contaje de GLG en los dientes de DDE, SCO y TTR, fue la MEB. Esta técnica permitió distinguir con claridad las capas accesorias, que son el resultado de alteraciones en el patrón de depósito de los GLG debidas a factores extrínsecos, como cambios ambientales, o intrínsecos, como modificaciones en el organismo del animal que afectan al crecimiento de los dientes (Hohn, 1980b). La MEB no fue igual de eficaz en los dientes de PPH, posiblemente debido a que en esta especie los dientes presentan muchas anomalías morfológicas que dificultan la lectura de los GLG, probablemente derivadas de situaciones de estrés asociadas a variaciones ambientales, al cambio climático o a determinados eventos a lo largo de su historia vital (Read et al., 2010). Hohn (1980b) y Pribanic (2000) utilizaron la MEB para la estimación de la edad en dientes de TTR. A pesar de que otros autores han usado la MEB para el estudio de la estructura de los dientes en diferentes especies de cetáceos fósiles (Loch et al., 2015; Viglino et al., 2023), el nuestro es el primer trabajo en el que se emplea la MEB para estimar la edad en dientes de DDE, PPH o SCO. En cuanto a la metodología, Hohn (1980b) y Pribanic (2000) utilizaron secciones de 1-2,5 mm de grosor, cortadas con una sierra de diamante y descalcificadas; en nuestro trabajo se emplearon secciones más delgadas, obtenidas mediante el lijado de los dientes con una amoladora y una multiherramienta (los grosores fueron de 0,2-1 mm para los dientes de 37 DDE, PPH y SCO y de 0,8-2,3 mm para los dientes de TTR), consiguiendo igualmente buenos resultados. El método de contaje de GLG mediante microscopía óptica a partir de secciones no tratadas y secciones descalcificadas es menos laborioso que la MEB, aunque para algunos autores menos fiable para llevar a cabo el recuento de los GLG con precisión (Hohn, 1980b). Lockyer et al. (2010) y Myrick et al. (1980) recomiendan utilizar secciones descalcificadas, obtenidas con criostato y teñidas para llevar a cabo el contaje de GLG, pues afirman que el mayor coste y tiempo necesarios para la preparación de dichas secciones se compensan con una mejor resolución de los GLG y de otras estructuras dentales. Estos autores consideran que usar solo secciones descalcificadas, sin teñir, es un buen método en dientes de gran tamaño, como los de TTR, y como última preferencia estarían las secciones sin tratar, en cuyo caso recomiendan realizar el contaje con microscopios de alta calidad y luz polarizada. Para Henriksen et al. (2024), sin embargo, la técnica más sencilla para preparar los dientes es igualmente válida. Estos autores compararon los contajes de GLG obtenidos observando al microscopio óptico secciones lijadas y pulidas y secciones descalcificadas de dientes de PPH, concluyendo que la estimación de la edad en secciones de dientes no tratadas era una alternativa fiable a la descalcificación, además de ser más simple, más rápida y necesitar de menos material. En nuestro trabajo la microscopía óptica en secciones no tratadas permitió la estimación de la edad en todas las especies, resultando más sencilla la identificación de los GLG que con estereomicroscopía. El proceso de descalcificación tampoco supuso ninguna ventaja en cuanto a la resolución y facilidad de contaje de los GLG, obteniéndose resultados similares en las dos técnicas para los dientes de PPH, SCO y DDE. La descalcificación sí facilitó la resolución de los GLG en los dientes de TTR, probablemente debido a su mayor tamaño (Myrick et al., 1980). Para la descalcificación de los dientes se siguió el método descrito por Hohn (1980b), sumergiendo las secciones en ácido fórmico al 5% durante 3 h en el caso del TTR y durante 2 h para los dientes de DDE, PPH y SCO, lavándolos después con agua destilada. Como el tiempo necesario para la descalcificación depende del tamaño y la densidad de cada diente (Lockyer et al., 2010), se redujo la duración del proceso de descalcificación para los dientes de DDE, PPH y SCO, ya que su tamaño es menor que el de los dientes de TTR. Por otro lado, el escaneo de los dientes de TTR mediante micro-TC permitió diferenciar las distintas estructuras dentales e identificar algunos GLG como capas alternas de tejidos hipo- e hipermineralizados en la dentina postnatal (Hohn, 1980b). Sin embargo, como los parámetros seleccionados no permitieron escanear el diente completo, la estimación de la edad solamente pudo realizarse en el ejemplar TTR hembra de 236 cm, pues al tratarse del individuo más joven y, por tanto, con la cavidad pulpar más grande, se pudo completar el contaje de GLG. En los ejemplares TTR hembra de 280 y 318 cm, a pesar de que la técnica resaltó algunos GLG, no se 38 pudo determinar la edad ya que la imagen obtenida no permitió visualizar toda la dentina postnatal. Para realizar el escaneo se emplearon secciones de dientes de 1,5 mm obtenidas con una sierra de diamante y descalcificadas. La principal ventaja del micro-TC es que se trata de una técnica no invasiva para la determinación de la edad que no necesita de la preparación de las secciones, por lo que es muy útil en piezas de museo que necesitan ser preservadas (Alstrup et al., 2017; Baier-Stegmaier et al., 2023; Loch et al., 2013). Por tanto, en futuros trabajos podrían escanearse dientes enteros, reduciendo el tiempo del proceso al prescindir del corte y descalcificación de las secciones. Los primeros autores en emplear el micro-TC para la estimación de la edad en odontocetos (Alstrup et al., 2017; Loch et al., 2013) fracasaron en visualizar los GLG en la dentina, pero sí aportaron información acerca de la anatomía del diente. Baier-Stegmaier et al. (2023) publicaron el primer estudio exitoso para la determinación de la edad en carnívoros y odontocetos mediante el escaneo de los dientes con un micro-TC, obteniendo resultados comparables con los métodos tradicionales. Las diferencias con nuestro trabajo podrían deberse a que el micro-TC empleado en su estudio permitió utilizar una potencia de 15 W, mientras que el equipo que nosotros empleamos trabaja con una potencia máxima de 10 W. El contaje de GLG utilizando estereomicroscopía, microscopía óptica, MEB y micro-TC resultó más sencillo en individuos jóvenes con la cavidad pulpar de gran tamaño. A medida que la cavidad pulpar se cerraba, la pérdida de definición y aproximación de los últimos GLG depositados dificultó el proceso. Esto ocurrió en los ejemplares PPH macho de 139 y 143,5 cm, PPH hembra de 187 cm, SCO macho de 215 y 216 cm y TTR hembra de 318 cm, en los que no se pudo completar el contaje de GLG y solo se estimó una edad mínima. Otros trabajos coinciden en que la estimación de la edad mediante el contaje de GLG es más sencilla en individuos jóvenes. En animales viejos el cierre de la cavidad pulpar dificulta el proceso, ya que los GLG se vuelven más finos y difíciles de leer (Gallo-Reynoso et al., 2014; Henriksen et al., 2024). Además de la morfología de los dientes, la presencia de piedras pulpares también condiciona la identificación de GLG. Las piedras pulpares son centros secundarios de depósito de dentina que se forman en una región de la cavidad pulpar y en ocasiones pueden causar compresiones de los GLG que conducen a errores en el recuento (Hohn et al., 1989; Mead et al., 1980). En las secciones de los dientes de TTR hembra de 280 cm y TTR hembra de 318 cm visualizadas al microscopio óptico y al estereomicroscopio se encontraron piedras pulpares; este hallazgo dificultó el contaje en el caso del ejemplar TTR hembra de 318 cm, pero no en el individuo TTR hembra de 280 cm. 39 Un resultado llamativo de nuestro estudio fue encontrar variaciones en el contaje de GLG entre diferentes dientes de un mismo individuo y entre las dos caras de una misma sección, tanto empleando una misma técnica como entre técnicas distintas. Por ejemplo, para el ejemplar hembra de TTR de 236 cm se estimaron dos años con estereomicroscopía y microscopía óptica, mientras que con MEB y micro-TC solamente se contó un GLG. Estas variaciones individuales en la estimación de la edad podrían ser debidas a alteraciones en el depósito de los GLG, cuyas causas son todavía desconocidas, pero es probable que se vea influenciado por cambios estacionales, nutritivos, la tasa de crecimiento y el estado general de salud de cada animal (Barratclough et al., 2023; Hohn, 1989). Además de su posible relación con procesos fisiológicos, las fluctuaciones en el contaje para un mismo individuo también pueden ser el resultado de errores de los lectores por una identificación deficiente de los GLG. Estos errores son principalmente causados por una preparación inadecuada de las secciones, lo que resulta en una exposición incompleta de la cavidad pulpar, un exceso de lijado, una descalcificación insuficiente o excesiva y la rotura de los dientes durante su preparación (Henriksen et al., 2024; Hohn, 1989, 2018). En este trabajo, las secciones que fueron lijadas en exceso y alcanzaron un grosor inferior a los 0,4 mm ofrecieron peores resultados al ser visualizadas con el estereomicroscopio y el microscopio óptico; las que superaron los 2 mm de grosor, como en el caso de TTR macho de 284 cm y TTR hembra de 304 cm, tampoco mostraron una buena resolución de los GLG y no permitieron realizar el contaje. En cuanto a la descalcificación, como la duración del proceso fue independiente del grosor de la sección, aquellas secciones con un grosor inferior a 0,3 mm (como los dientes de los ejemplares de DDE macho de -151 cm y de 214 cm) sufrieron una descalcificación excesiva, perdiéndose la definición de los GLG al microscopio óptico. En el caso de la sección del diente de TTR hembra de 304 cm, el tiempo de descalcificación no fue suficiente ya que tras el proceso no mejoró la resolución de los GLG. Por tanto, es importante trabajar con secciones de igual grosor para poder estandarizar la duración de la descalcificación. Por otro lado, los dientes desgastados o con morfologías anormales, como en el caso del individuo PPH macho de 167 cm, impiden una correcta preparación de la sección ya que dificultan realizar el lijado hasta la línea media, por lo que la cavidad pulpar no queda completamente expuesta y no se puede llevar a cabo el contaje de GLG. Por todo lo descrito anteriormente, es fundamental disponer de 3-5 piezas dentales de un mismo ejemplar para poder preparar varias secciones por si en alguna de ellas los GLG no son valorables (Henriksen et al., 2024; Hohn, 1989). La longitud total de los animales también se puede utilizar para estimar la edad de los individuos. Los cetáceos crecen rápidamente tras el nacimiento y después sufren una disminución gradual de la tasa de crecimiento hasta alcanzar el tamaño asintótico adulto 40 (Herrman et al., 2020; Read et al., 1993). Por lo tanto, teniendo también en cuenta los tamaños al nacimiento y las longitudes máximas para cada especie (López et al., 2015), en un principio supusimos que los individuos de menor tamaño serían los más jóvenes y, por ende, aquellos con un menor número de GLG, mientras que los individuos con una longitud total mayor deberían ser los más viejos y presentar un contaje de GLG más elevado. Sin embargo, esta predicción solamente se cumplió en el caso de los animales de menor longitud total. A medida que los individuos se aproximaban a la longitud adulta, los resultados fueron más variables, encontrando dentro de una misma especie animales de gran tamaño con menos GLG que otros de menor longitud. Por ejemplo, en el individuo de PPH macho de 143,5 cm se estimó una edad mínima de 9 años, mientras que en el ejemplar macho de 172 cm de la misma especie solamente se identificaron 4 GLG con el MEB. Estas incoherencias se deben a que la tasa de crecimiento y, por tanto, la longitud de los individuos se ven influenciadas por diversos factores como la nutrición, el hábitat, el estado de salud general, el sexo o la estación, de forma que para una misma edad se observan amplios rangos de longitud, incluso en individuos jóvenes. Además, el tamaño es menos informativo cuando los delfines se aproximan a la longitud asintótica, es decir, cuando la tasa de crecimiento se aproxima a 0. Por tanto, la longitud no se considera un índice preciso para la estimación de la edad en odontocetos (McFee et al., 2012; Read et al., 1993; Schwarz, 2009, citado por Herrman et al., 2020). Para completar la validación de los resultados obtenidos en este trabajo, además de la comparación entre las distintas técnicas, sería interesante poder contar con individuos de historia o edad conocida como en otros estudios (Baier-Stegmaier et al., 2023; Henriksen et al., 2024), pero ese tipo de muestras son muy difíciles o imposibles de conseguir en individuos salvajes. Además, se ha utilizado una muestra pequeña y distribuida de manera desigual entre las diferentes categorías de edad y sexo, por lo que en el futuro deberían incluirse en el estudio dientes de más individuos que cubriesen todos los grupos de edad. 41 6. CONCLUSIONES Con este TFG se ha puesto a punto en la Facultad de Veterinaria de la USC una técnica económica, rápida y sencilla para la estimación de la edad en odontocetos mediante el contaje de grupos de capas de crecimiento (GLG) en secciones de dientes lijadas y pulidas, utilizando estereomicroscopía y microscopía óptica. Además, se ha validado la técnica comparando los resultados con los obtenidos en secciones descalcificadas de los mismos dientes empleando microscopía óptica, microscopía electrónica de barrido y microtomografía computarizada. Aunque la microscopía óptica en secciones no tratadas ha demostrado ser una técnica valiosa para la estimación de la edad en todas las especies, los mejores resultados tanto para la identificación de las estructuras dentales como para el contaje de GLG en los dientes se obtuvieron con el microscopio electrónico de barrido. El contaje de GLG en todas las técnicas resultó más sencillo en animales jóvenes con la cavidad pulpar de mayor tamaño, pues a medida que se cierra la cavidad pulpar los GLG están más próximos y son más delgados, empeorando su definición y dificultando el recuento. Para obtener unos buenos resultados es fundamental contar con 3-5 dientes de cada ejemplar y realizar una buena preparación de las secciones, de un grosor adecuado, exponiendo completamente la cavidad pulpar y evitando el exceso o la falta de descalcificación. 48 Miyazaki, N., Perrin, W. F., Stewart, B. S. y Sergeant, D. E. (1980). Session reports: Dolphins. En W. F. Perrin y A. C. Myrick (Eds.), Age determination of toothed whales and sirenians (pp. 21-30). Reports of the International Whaling Commission (Special Issue 3), Cambridge. Myrick, A. C., Shallenherger, E. W., Kasg, I. y Mackay’, D. B. (1984). Calibration of dental layers in seven captive hawaiian spinner dolphins, Stenella longirostris, based on tetracycline labeling. Fishery Bulletin, 82(1), 207-225. Olsen, M. T., Robbins, J., Bérubé, M., Rew, M. B. y Palsbøll, P. J. (2014). Utility of telomere length measurements for age determination of humpback whales. NAMMCO Scientific Publications, 10. https://dx.doi.org/10.7557/3.3194 Olson, Å. y Stenlid, J. (2022). Population dynamics of forest tree pathogens. En F. O. Asiegbu y A. Kovalchuk (Eds.), Forest Microbiology (Vol. 2, pp. 131–143). Academic Press. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/B978-0-323-85042-1.00041-0 Orden TED/1126/2020 [Ministerio para la Transición Ecológica y el Reto Demográfico]. Por la que se modifica el Anexo del Real Decreto 139/2011, de 4 de febrero, para el desarrollo del Listado de Especies Silvestres en Régimen de Protección Especial y del Catálogo Español de Especies Amenazadas, y el Anexo del Real Decreto 630/2013, de 2 de agosto, por el que se regula el Catálogo Español de Especies Exóticas Invasoras. 20 de noviembre de 2020. Owen, R. (1845). Odontography; or, A treatise on the comparative anatomy of the teeth; their physiological relations, mode of development, and microscopic structure, in the vertebrate animals. (Vol. 1). Hippolyte Baillière. https://doi.org/10.5962/bhl.title.16281 Perrin, W. F. y Myrick, A. C. (Eds.). (1980). Age determination of toothed whales and sirenians. Reports of the International Whaling Commission (Special Issue, 3), Cambridge. Peters, K. J., Gerber, L., Scheu, L., Cicciarella, R., Zoller, J. A., Fei, Z., Horvath, S., Allen, S. J., King, S. L., Connor, R. C., Rollins, L. A. y Krützen, M. (2022). An epigenetic DNA methylation clock for age estimates in Indo-Pacific bottlenose dolphins (Tursiops aduncus). Evolutionary applications, 16(1), 126–133. https://doi.org/10.1111/eva.13516 Pribanic, S., Miokovic, D. y Kovacic, D. (2000). Preliminary growth rate and body lengths of the bottlenose dolphins Tursiops truncatus (Montagu,1821) from the Adriatic Sea. Natura Croatica, 9(3), 179-188. Read, A. J., Wells, R. S., Hohn, A. A. y Scott, M. D. (1993). Patterns of growth in wild bottlenose dolphins, Tursiops truncatus. Journal of Zoology, 231(1), 107-123. https://doi.org/10.1111/j.1469-7998.1993.tb05356.x 49 Read, F. L., Hohn, A. A. y Lockyer, C. H. (2018). A review of age estimation methods in marine mammals with special reference to monodontids. NAMMCO Scientific Publications, 10. https://doi.org/10.7557/3.4474 Read, F.L., Santos, M.B., González, A.F., López, A., Ferreira, M., Vingada, J. y Pierce, G.J. (2010). Understanding harbour porpoise (Phocoena phocoena) and fishery interactions in the north-west Iberian Peninsula. Document AC20/Doc.6.1b (S), 20th ASCOBANS Advisory Committee Meeting. Real Decreto 139/2011 [Ministerio de Medio Ambiente, y Medio Rural y Marino]. Para el desarrollo del Listado de Especies Silvestres en Régimen de Protección Especial y del Catálogo Español de Especies Amenazadas. 4 de febrero de 2011. Rede de Varamentos de Galicia, REVARGAL. (2023). Datos generales de la Red de Varamientos de Galicia en 2023. Boletín REVARGAL nº 2. http://www.cemma.org/inve/Revargal_boletin_2_esp.pdf Rosel, P., Archer, F., Baker, C. S., Boness, D. J., Brownell, R. L., Churchill, M., Costa, A. P., Domning, D. P., Jefferson, T. A., Kinze, C., McGowen, M., Oliveira, L. R., Wang, J. Y. y Yamada, T. K. (Junio de 2023). List of marine mammal species and subspecies. The Society for Marine Mammalogy. Recuperado el 26 de junio de 2024 de https://marinemammalscience.org/science-and-publications/list-marine-mammal- species-subspecies/ Rouby, E., Ridoux, V. y Authier, M. (2021). Flexible parametric modeling of survival from age at death data: A mixed linear regression framework. Population Ecology, 63(1), 108– 122. https://doi.org/10.1002/1438-390X.12069 Saavedra, C., Pierce, G. J., Gago, J., Jusufovski, D., Cabrero, Á., Cerviño, S., López, A., Martínez-Cedeira, J. A. y Santos, M. B. (2017). Factors driving patterns and trends in strandings of small cetaceans. Marine Biology, 164(8), 164-165. https://doi.org/10.1007/s00227-017-3200-3 Scheffer, V. B. (1950). Growth layers on the teeth of Pinnipedia as an indication of age. Science, 112(2907), 309–311. https://doi.org/10.1126/science.112.2907.309-a Schwacke, L. H., Marques, T. A., Thomas, L., Booth, C. G., Balmer, B. C., Barratclough, A., Colegrove, K., De Guise, S., Garrison, L. P., Gomez, F. M., Morey, J. S., Mullin, K. D., Quigley, B. M., Rosel, P. E., Rowles, T. K., Takeshita, R., Townsend, F. I., Speakman, T. R., Wells, R. S., … Smith, C. R. (2022). Modeling population effects of the Deepwater Horizon oil spill on a long-lived species. Conservation biology: the journal of the Society for Conservation Biology, 36(4), e13878. https://doi.org/10.1111/cobi.13878 50 Sergeant, D. E. (1959). Age determination in odontocete whales from dentinal growth layers. Norsk Hvalfangsttid, 48(6), 273-288. Sergeant, D.E. (1967). Age determination of land mammals from annuli. Zeitschrift für Saeugetierkunde, 32, 297-300. Stewart, R., Stewart, B., Stirling, I. y Street, E. (1996). Count of growth layer groups in cementum and dentine of ringed seals (Phoca hispida). Marine Mammal Science, 12(3), 383-401. Uriarte, A., García-Barón, I., Franco, J. y Louzao, M. (2021). Delfín mular Tursiops truncatus. Evaluación espacial de la Red Natura 2000 para la conservación de especies de interés comunitario en la Demarcación Noratlántica. AZTI. https://doi.org/10.13140/RG.2.2.25984.76807 Viglino, M., Ezcurra, M. D., Fordyce, R. E. y Loch, C. (2023). The better to eat you with: morphological disparity and enamel ultrastructure in odontocetes. Scientific reports, 13(1), 16969. https://doi.org/10.1038/s41598-023-44112-8 Wells, R.S., Natoli, A. y Braulik, G. (2019). Tursiops truncatus. The IUCN Red List of Threatened Species 2019: e.T22563A156932432. Recuperado el 26 de junio de 2024 de https://dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2019-1.RLTS.T22563A156932432.en Yalman, R. G., Bruegemann, William., Baker, P. T. y Garn, S. M. (1959). Volumetric Determination of Calcium in Presence of Phosphate. Analytical Chemistry, 31(7), 1230- 1233. https://doi.org/10.1021/ac60151a001