Utilización de muestras alternativas en la detección precoz del consumo de drogas de abuso durante la gestación

       UTILIZACIÓNDEMUESTRASALTERNATIVASENLA DETECCIÓNPRECOZDELCONSUMODEDROGASDE ABUSODURANTELAGESTACIÓN       Memoriapresentadapor: PatriciaLópezEijo Paraoptaralgradode DoctorporlaUniversidad deSantiagodeCompostela   SantiagodeCompostela,marzo2010 FACULTADEDEMEDICINAE ODONTOLOXÍA DepartamentodeAnatomíaPatolóxica eCienciasForenses     Dña. Ana María Bermejo Barrera, Catedrática de Toxicología, Dña. María Jesús Tabernero Duque, Investigadora del Instituto de Medicina Legal, y Dña. Purificación Fernández Gómez, Catedrática de Toxicología de la Universidad de Santiago de Compostela Certifican: Que la presente memoria, titulada “UTILIZACIÓN DE MUESTRAS ALTERNATIVAS EN LA DETECCIÓN PRECOZ DEL CONSUMO DE DROGAS DE ABUSO DURANTE LA GESTACIÓN” que presenta la Licenciada Patricia López Eijo para optar al grado de Doctor ha sido realizada bajo su dirección en este Departamento y, a su juicio, reúne todos los requisitos exigidos por la normativa vigente para la elaboración y presentación de Tesis Doctorales. Y para que así conste, firman el presente informe en Santiago de Compostela, a 31 de Marzo de 2010. Ana María Bermejo Barrera María Jesús Tabernero Duque Purificación Fernández Gómez FACULTADEDEMEDICINAE ODONTOLOXÍA DepartamentodeAnatomíaPatolóxica eCienciasForenses    Ameuspais   Agradecimientos Quero agradecer en primeiro lugar á Profa. Ana María Bermejo Barrera, catedrática de Toxicoloxía da USC, por dirixir esta Tese e por todo o apoio e axuda prestada na elaboración da mesma. A María Jesús Tabernero Duque, investigadora do Instituto de Medicina Legal, polas súas valiosas suxerencias e acertados aportes durante o desenvolvemento deste traballo. Á Profa. Purificación Fernández Gómez, catedrática de Toxicoloxía da USC, por estar sempre dispoñible a todo canto precisase. Ó Prof. Antonio Moreda, polo seu aporte estatístico a esta Tese. Ós meus compañeiros de laboratorio, tanto ós que xa se foron (Puri, Marta Lago, Cathy, Santi e Oscar) como ós que aínda están (Pamela, Martha, Iván, Dani, Marta, Ana, Marisol, Elena e Salva) por facer máis agradable a vida diaria do laboratorio. En especial a Pamela, coa que compartín tantos momentos no laboratorio e fora del; e a Dani, pola súa permanente disposición e desinteresada axuda. Agradecerlle tamén a José Manuel, a súa valiosa axuda co sempre interminable “papeleo”. Ai miei collegui di l'Università Cattolica (Eleonora, Simona, Marialinda, Fede e Remo) per avermi accolto con tanto calore e per farmi sentire a casa pur essendo lontano da questa. In particolare, al Proff. Chiarotti, i cui consigli sono resultati utilissimi e per il tempo dedicato a rispondere alle mie domande. A Sabina por su ayuda en la búsqueda de alojamiento en Roma, y por estar pendiente de mí durante mi estancia en la ciudad. Ós meus compañeiros de carreira: Cris, Ana, Rosa e Migui, cos que compartín tantos e tan bos momentos en Santiago e cos que espero seguir compartindo moitos máis. Chegou o momento de emprender un novo camiño (espero que prometedor para todos!), seguramente nunca volverei a ter o privilexio de tervos tan cerquiña, pero a vosa compañía ó longo destes anos será un recordo que nunca se borrará do meu corazón. Deséxovos todo o mellor! Ás miñas amigas de Burela (Xoli, Tere, Su, Eva, María, Mónica e Zaki) e a Mery, Juan e Martín, por ser a miña vía de escape sempre que precisei desconectar do mundo da investigación, e por compartir comigo moito máis que esta Tese. Ós meus avós, meu irmán, miña cuñada e a toda a miña familia polo voso constante apoio. Tamén a Álvaro, e en especial á miña pequeniña por facerme rir cada día e por contaxiarme a súa alegría de vivir. A Diego, por escoitarme, entenderme e apoiarme incondicionalmente; e sobre todo por aguantarme nestes días de estres final, que sei que non foi fácil!. Sen ti este camiño sería aínda moito máis duro, grazas por estar ó meu lado e ser parte da miña vida, es o mellor que me pasou nunca. Quérote. E por último, un agradecemento moi especial a meus pais, que constantemente me brindaron todo o apoio necesario para alcanzar as miñas metas e os meus sonos e estiveron sempre ó meu lado cada día da miña vida, compartindo os bos e os malos momentos. Grazas por confiar en min, sen vós nunca chegaría ata aquí. Quérovos.  Índice General CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN: COCAÍNA ................................................................ 1 CAPÍTULO 2. INTRODUCCIÓN: OPIOIDES ............................................................. 21 CAPÍTULO 3. INTRODUCCIÓN: DROGAS Y EMBARAZO .......................................... 41 CAPÍTULO 4. INTRODUCCIÓN: DETECCIÓN DE DROGAS EN EL EMBARAZO ........... 71 CAPÍTULO 5. METODOLOGÍA GC-MS .................................................................. 143 CAPÍTULO 6. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ........................................................ 161 CAPÍTULO 7. EXPERIMENTAL: DETERMINACIÓN DE COCAÍNA Y OPIOIDES EN PELO POR GC-MS .......................................................................................................... 167 CAPÍTULO 8. EXPERIMENTAL: APLICACIÓN A MUESTRAS DE VELLO PÚBICO MATERNO Y CABELLO DEL RECIÉN NACIDO ........................................................... 197 CAPÍTULO 9. EXPERIMENTAL: DETERMINACIÓN DE COCAÍNA Y OPIOIDES EN MECONIO POR GC-MS ........................................................................................... 227 CAPÍTULO 10. EXPERIMENTAL: APLICACIÓN A MUESTRAS DE VELLO PÚBICO MATERNO Y MECONIO .......................................................................................... 263 CAPÍTULO 11. DISCUSIÓN .................................................................................. 287 CAPÍTULO 12. CONCLUSIONES ........................................................................... 323    Capítulo 1. Introducción: Cocaína 1.1 ESTRUCTURA QUÍMICA Y PROPIEDADES .................................................... 5 1.2 FORMAS DE ABUSO .................................................................................... 7 1.3 PREVALENCIA DE CONSUMO ...................................................................... 8 1.4 FARMACOCINÉTICA ................................................................................... 9 1.4.1 ABSORCIÓN Y CONCENTRACIONES PLASMÁTICAS .................................. 9 1.4.2 DISTRIBUCIÓN .................................................................................... 10 1.4.3 METABOLISMO .................................................................................... 11 1.4.4 EXCRECIÓN ......................................................................................... 15 1.5 MECANISMO DE ACCIÓN .......................................................................... 16 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 19 Cocaína  5   1.1 ESTRUCTURAQUÍMICAYPROPIEDADES La cocaína (C17H21NO4, COC) es el alcaloide principal de las hojas de algunas plantas del género Erythroxylon (Erythroxylon Coca, Erythroxylon Novogranatense y Erythroxylon Truxillense), en las cuales fue hallada por Friedrich Gaedcke en 1855, quien le dio el nombre de eritroxilina. Posteriormente fue aislada por Albert Niemann de las hojas de Erythroxylon Coca (Figura 1.1) en 1859. Figura 1.1. Erythroxylon Coca. Pertenece al grupo de los alcaloides tropánicos, su núcleo fundamental es el tropano, el cual es producto de la condensación de un anillo de cinco miembros o-pirrolidínico y otro de seis miembros o-piperidínico con tres átomos comunes, dos de carbono y uno de nitrógeno. El nitrógeno, que cumple la función de puente, contiene un grupo metilo. Del tropano deriva la ecgonina (C9H15NO3, ECG) que presenta un radical hidroxilo (OH) en el carbono 3 y un grupo carboxílico (COOH) en posición 2; siendo, por tanto, el 3-hidroxi-2- carboxi-tropano. La ECG puede formar ésteres con los alcoholes mediante su radical carboxílico (derivado del ácido metanólico) y con los ácidos por medio del grupo OH presente en la molécula. El éster doble, producto de la reacción con alcohol metílico y ácido benzoico, es la COC (Figura 1.2). La unión éster es bastante lábil en presencia de tejidos vegetales o animales, lo que hace que el contenido de COC en las hojas de coca se vaya perdiendo con el tiempo. La desecación hace más lento el proceso, pero no lo suprime. Introducción Cocaína 6  Figura 1.2. Estructura química de la COC. La estructura cíclica de la ECG permite a la COC generar los isómeros geométricos cis y trans. Además, la presencia de cuatro átomos de carbono asimétricos o quirales en la molécula, generan estereoisómeros ópticos (enantiómeros). Éstos presentan las mismas propiedades físicas y químicas pero se diferencian en que desvían el plano de la luz polarizada en diferente dirección: uno hacia la derecha y se representa con la letra (D) o el signo (+) (isómero dextrógiro o forma dextro) y otro a la izquierda y se representa con la letra (L) o el signo (-) (isómero levógiro o forma levo). Una mezcla de ambos isómeros en proporciones iguales genera la llamada COC racémica que no tiene actividad óptica. Los carbonos quirales que contienen las moléculas de COC compiten entre sí contrarrestando la actividad óptica de ésta. Por tanto, la actividad óptica de la COC, así como la de todos los alcaloides, se debe más al nitrógeno que a los carbonos quirales, pero tampoco se debe ignorar que estos producen algún efecto en la desviación de la luz polarizada. La L-cocaína es el alcaloide más importante de las hojas de coca. Es un prisma monoclínico, incoloro, con un punto de fusión de 98ºC, cristaliza a partir de etanol, es muy soluble en cloroformo, soluble en etanol, éter dietílico, sulfuro de carbono, benceno, aceite de oliva, trementina, acetona, ácido acético y petróleo; es muy poco soluble en agua fría, insoluble en glicerina y sus soluciones son alcalinas al papel de tornasol. Cocaína  7   La COC es una base débil (pKa de 8,6), con peso molecular de 303,35 g/mol, un alto porcentaje de unión a proteínas (aproximadamente 90%1) y un elevado volumen de distribución (1,96 a 2,7 L/Kg1). 1.2 FORMASDEABUSO El conocimiento de las formas de abuso de la COC es de gran interés ya que condiciona la farmacocinética, la actividad farmacológica, la toxicidad y el grado de adicción de la droga. Fundamentalmente se distinguen las siguientes formas de abuso: Hojas de coca. Su administración se realiza por vía oral. Pasta de coca. También se denomina sulfato de COC, pasta base o simplemente pasta. Es el producto bruto, o no refinado, que resulta del primer proceso de extracción de la COC a partir de las hojas de coca. Se obtiene de la maceración de las hojas con ácido sulfúrico u otros productos químicos (alcalinos, solventes orgánicos, amoniaco, etc.). Contiene de un 40 a un 85% de sulfato de COC. Sirve de base para la posterior elaboración del clorhidrato de COC. Se administra por vía intrapulmonar (fumada) . Clorhidrato de cocaína. Es la sal de la COC, formada con ácido clorhídrico. Se presenta en forma de cristales escamosos blancos, más o menos adulterada. Se administra por vía intranasal (esnifada) o se inyecta por vía intravenosa. No se puede fumar pues se destruye por el calor. A veces se combina con heroína (HER) (speedball) para evitar los desagradables efectos rebote producidos por la COC. Figura 1.3. Clorhidrato de COC. Cocaína base. Se obtiene mezclando el clorhidrato de COC con una solución básica (amoníaco, hidróxido sódico o bicarbonato sódico), luego se filtra el precipitado o se disuelve con éter y se deja que éste se evapore. Existen dos formas de consumo: la primera consiste en inhalar los vapores de base libre (free base), extraída del clorhidrato con solventes volátiles (éter) a muy alta temperatura (800ºC) utilizando mecheros de Introducción Cocaína 8  propano. La complejidad del proceso (necesidad de pipa de agua, éter, mechero de propano) hace que su uso esté menos extendido. El crack es la segunda forma de consumo. Es una forma de COC base que se obtiene añadiendo amoníaco a una solución acuosa de clorhidrato de COC en presencia de bicarbonato sódico para alcalinizarla. La base precipita cuando se calienta la mezcla a 98ºC. Una vez seca adquiere un aspecto de porcelana, se tritura en escamas, y se presenta habitualmente como gránulos de 125 a 300 mg (1 ó 2 dosis). El crack se inhala (vía intrapulmonar) en recipientes calentados o se fuma (vía intrapulmonar) pulverizado y mezclado con tabaco, marihuana, fenciclidina (PCP), etc., en forma de cigarrillos. 1.3 PREVALENCIADECONSUMO Según datos del Observatorio Europeo sobre Drogas y Toxicomanías2, en comparación con el resto de países de la Unión Europea, España mostró el mayor porcentaje de consumo de COC en la población general en el grupo de edad de 15 a 64 años. En el grupo de edad de 15 a 35 años, España es también, junto con Reino Unido, el país con mayor prevalencia; y en el grupo de edad de 15 a 24 años, España ocupa un segundo puesto por detrás, nuevamente, de Reino Unido. Actualmente la COC ocupa el segundo lugar entre las drogas ilegales que se consumen en España, después del cannabis, según el informe publicado por el Plan Nacional sobre Drogas en el 20093. Todos los indicadores manejados por el Observatorio Español sobre Drogas (OED) son consistentes a la hora de mostrar el aumento del consumo hasta 2004-2005. Por ejemplo, la prevalencia anual de consumo entre la población de 15 a 64 años pasó de 1,8% en 1995 a 2,7% en 2003 y 3,0% en 2005, la prevalencia anual entre los estudiantes de Enseñanzas Secundarias de 14 a 18 años de 1,8% en 1994, a 2,7% en 1996, 6,2% en 2002 y 7,2% en 2004, y el número de tratados por primera vez en la vida por COC de 932 en 1992 a 1892 en 1996, 5977 en 2001, 11851 en 2003 y 15258 en 2005. Por su parte, la proporción de urgencias hospitalarias, directamente relacionadas con drogas ilegales, en que se menciona consumo de COC, pasó de 26,1% en 1996 a 44,4% en 2001, 49,0% en 2002, 58,5% en 2004 y 63,4% en 2005, y la proporción de muertes por reacción aguda a drogas ilegales en que se detecta COC y no los opioides Cocaína  9   pasó de 0-2% en la década de los ochenta a 3,9% en 1996, 6,1% en 2000, 16,4% en 2003 y 20,6% en 2005. Además, la oferta de COC durante el mismo período se mantuvo estabilizada o aumentó. De hecho, el indicador precio-pureza de los pequeños decomisos de esta droga se mantuvo bastante estable; sin embargo, su disponibilidad mostró un aumento sostenido tanto entre la población de 15 a 64 años, como entre los estudiantes de 14 a 18 años4. Aunque es probable que en España esté aumentando el uso de COC fumada, las prevalencias de consumo que muestran las encuestas domiciliarias o escolares no son aún elevadas, por lo que es probable que su consumo permanezca en buena medida confinado en los círculos de los consumidores de HER. Además, aunque los problemas relacionados con el consumo de COC base han aumentado en los últimos años (de hecho, el número de primeros tratamientos por COC consumida preferentemente por vía pulmonar pasó de 139 en 1991 a 1284 en 2001, 1837 en 2004 y 1755 en 2005), lo han hecho a un ritmo mucho menor que la COC esnifada, y en 2005 la proporción que suponían los tratamientos por COC fumada sobre el total de tratamientos por COC era sólo de un 11,5%, y la proporción de urgencias relacionadas con COC fumada sobre el total de urgencias relacionadas con COC de un 22,7%, frente a un 80,6% y 55,4%, respectivamente, de los tratamientos y las urgencias relacionados con COC esnifada4. 1.4 FARMACOCINÉTICA La farmacocinética estudia los procesos de absorción de la droga, su distribución en los tejidos del organismo, su metabolismo y su excreción. La farmacocinética nos sirve para conocer la duración de la acción de una droga y la velocidad de su inactivación y eliminación5. 1.4.1 ABSORCIÓNYCONCENTRACIONESPLASMÁTICAS La absorción, los picos plasmáticos, la duración del efecto y la biodisponibilidad de la COC tras el consumo dependen de la vía utilizada (Tabla 1.1). El término absorción denota la rapidez con que la COC pasa desde su punto de administración hasta la circulación sanguínea. Así, la absorción a través de la mucosa nasal después de esnifar y la absorción a través del tracto digestivo después de su administración oral es similar y Introducción Cocaína 10  mucho más lenta que después de fumar o después de la administración intravenosa. La vía de acción más rápida es la inhalada o fumada (vía intrapulmonar) ya que la COC se difunde muy rápidamente de pulmones a cerebro, sus efectos son inmediatos (3-5 segundos) y muy intensos (se dice que 10 veces superiores a la COC intravenosa o intranasal), sin embargo son muy fugaces (5-15 minutos), su “bajada” resulta tan insufrible que entraña un uso compulsivo y muy frecuente. La biodisponibilidad de la COC, es decir, la cantidad de droga que llega en forma activa a la circulación, es de un 30% por vía oral; por vía intranasal varía de un 25 a un 94% (dependiendo de la dosis) y por vía intrapulmonar varía de un 60% a un 70% (dependiendo de si se fuma en pipa de maíz o en pipa de vidrio, respectivamente)1. Tabla 1.1. Absorción, picos plasmáticos, duración del efecto y biodisponibilidad alcanzadas tras el consumo de COC1. VÍA* TIEMPO DE ACCIÓN PICO DE EFECTO MÁXIMO DURACIÓN DEL EFECTO BIODISP (%) O 5' - - 30 IN - 15-20' 60-90' 25-94 IV 10-60'' 3-5' 20-60' - IP 3-5'' 1-3' 5-15' 60-70 * O: oral, IN: intranasal, IV: intravenosa, IP: intrapulmonar . Las concentraciones plasmáticas máximas alcanzadas después de las diferentes administraciones varían enormemente. No sólo dependen de las dosis y de las vías de administración, sino también de la frecuencia de uso. Las dosis de COC normalmente varían en un rango entre 1 y 25 g de polvo y entre 4 y 10 mL de solución (40 mg/mL y 100 mg/mL)1, sin embargo las concentraciones plasmáticas máximas varían en un rango entre 100 ng/mL y 2500 ng/ml (en los casos de muerte por COC)1. 1.4.2 DISTRIBUCIÓN La distribución de la COC puede definirse, entre otras formas, como el transporte por la sangre hasta el lugar donde ejerce su acción. Algunos factores que afectan a la distribución de la COC en los tejidos son, el porcentaje de unión a proteínas y el volumen de distribución. Tal como se ha indicado en el apartado de Estructura Química y Cocaína  11   Propiedades, la COC presenta un alto porcentaje de unión a proteínas (aproximadamente 90%1), pero también un elevado volumen de distribución (1,96 a 2,7 L/Kg1). El volumen de distribución (VD) se define como el hipotético volumen en el que se distribuye una droga en el organismo, y se calcula conociendo la cantidad total de droga absorbida y la concentración plasmática a tiempo cero. Se expresa en litro por kilogramo de peso corporal (L/Kg). Las drogas que no se distribuyen por los tejidos o por el espacio extracelular tienen un VD de entre 0,05 L/Kg y 0,2 L/Kg. El contenido total de agua en el organismo es de 0,5 L/Kg, por lo que valores de VD > 0,5 L/Kg son elevados e implican altos valores relacionados con una alta afinidad de la droga por acumularse en los tejidos, como ocurre en el caso de la COC. 1.4.3 METABOLISMO Las vías del metabolismo de la COC se muestran a grandes rasgos en la Figura 1.4. La principal vía de transformación de la COC es la hidrolítica. En humanos, un 90% de la COC se metaboliza por hidrólisis y se excreta por la orina en forma de benzoilecgonina (BE) y ecgonina metil éster (EME). Las esterasas plasmáticas y hepáticas son las responsables de la formación del éster metílico de la ecgonina. Las pequeñas cantidades de ECG encontradas en la orina humana parecen derivar de la hidrólisis de la BE y quizás de la hidrólisis no enzimática de la EME6,7. Ninguno de los metabolitos derivados de la hidrólisis de la COC (BE, EME y ECG) son hepatotóxicos cuando se administraron a ratones en dosis elevadas. Se ha observado que la inhibición de esta vía hidrolítica con diazinon, produce una marcada elevación de la hepatotoxicidad de la COC en el ratón8, lo que confirma que el metabolismo hidrolítico de la COC es una vía de destoxificación. Introducción Cocaína 18  El exceso de noradrenalina que se produce por acción de la COC es el responsable de la mayoría de los efectos farmacológicos y de las complicaciones agudas derivadas del consumo de COC (aumento de presión arterial, dilatación pupilar, sudoración, temblor etc.)20. La COC también bloquea la recaptación de serotonina, y el consumo crónico de esta sustancia produce cambios en estos neurotransmisores, con una disminución de la biodisponibilidad, que se refleja en la disminución de los metabolitos 3-metoxi-4- hidroxifenetilenglicol y ácido 5-hidroxiindolacético. Estos efectos sobre la neurotransmisión catecolaminérgica y serotoninérgica constituyen, así mismo, la base de su mecanismo de acción como droga creadora de dependencia20. Por otra parte, es conocido que la COC fue el primer anestésico local utilizado en clínica. Desde entonces, se han sintetizado un número importante de estos agentes, el primero de los cuales fue la procaína (novocaína) en 1905. La COC comparte con todos estos compuestos el mecanismo de acción anestésica local: disminución de la permeabilidad de la membrana a los iones sodio, lo que produce un bloqueo de la conducción nerviosa20.  Cocaína  19   REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Leikin J, Paloucek F. Poisoning and Toxicology Handbook. Nueva York, CRC Press, 2008, 213. 2. Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías. El problema de la drogodependencia en Europa. Informe anual 2009. Luxemburgo, 2009. 3. Gobierno de España, Ministerio de Sanidad y Política Social. Estrategia Nacional sobre drogas 2009-2016. Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas, 2009. 4. Observatorio Español sobre Drogas (OED). Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (DGPNSD). Informe 2007. Situación y tendencias de los problemas de drogas en España. 5. Drummer OH, Odell M. The forensic pharmacology of drugs of abuse. Londres, Arnold, 2001. 6. Steward DJ, Inaba T, Lucassen M, Kalow W. Cocaine metabolism: cocaine and norcocaine hydrolysis by liver and serum esterases. Clin Pharmacol Ther 25(4) (1979) 464-468. 7. Roberts SM, Roth L, Harbison RD, James RC. Cocaethylene hepatotoxicity in mice. Biochem Pharmacol 43(9) (1992) 1898-1995. 8. Evans MA. Role of protein binding in cocaine-induced hepatic necrosis. J Pharm Exp Ther 224(1) (1983) 73-79. 9. Kloss MW, Rosen GM, Rauckman EJ. Cocaine-mediated hepatotoxicity. A critical review. Biochem Pharmacol 33(2) (1984) 169-173. 10. Inaba T, Stewart DJ, Kalow W. Metabolism of cocaine in man. Clin Pharmacol Ther 23(5) (1978) 547-552. 11. Freeman RW, Harbison RD. Hepatic periportal necrosis induced by chronic administration of cocaine. Biochem Pharmacol 30(7) (1981) 777-783. 12. Shuster L, Casey E, Welankiwar SS. Metabolism of cocaine and norcocaine to N- hydroxynorcocaine. Biochem Pharmacol 32(20) (1983) 3045-3051. 13. Charkoudian JC, Shuster L. Electrochemistry of norcocaine nitroxide and related compounds: implications for cocaine hepatotoxicity. Biochem Biophys Res Commun 130(3) (1985) 1044-1051. Introducción Cocaína 20  14. Boyer CS, Petersen DR. Hepatic biochemical changes as a result of acute cocaine administration in the mouse. Hepatology 14(6) (1991) 1209-1216. 15. Hearn WL, Rose S, Wagner J, Ciarleglio A, Mash DC. Cocaethylene is more potent than cocaine in mediating lethality. Pharmacol Biochem Behav 39(2) (1991) 531-533. 16. Katz JL, Terry P, Witkin JM. Comparative behavioral pharmacology and toxicology of cocaine and its ethanol-derived metabolite, cocaine ethyl-ester (cocaethylene). Life Sci 50(18) (1992) 1351-1361. 17. Dean RA, Christian CD, Sample RH, Bosron WF. 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Introducción: Opioides 2.1 OPIOIDES EN ESTUDIO ............................................................................ 25 2.2 ESTRUCTURA QUÍMICA Y PROPIEDADES .................................................. 25 2.3 FORMAS DE USO...................................................................................... 28 2.3.1 USO CLÍNICO ...................................................................................... 28 2.3.2 USOS ILÍCITOS .................................................................................... 28 2.3.2.1 MORFINA .................................................................................... 28 2.3.2.2 HEROÍNA .................................................................................... 29 2.4 PREVALENCIA DE CONSUMO .................................................................... 30 2.5 FARMACOCINÉTICA ................................................................................. 31 2.5.1 ABSORCIÓN ......................................................................................... 31 2.5.2 DISTRIBUCIÓN .................................................................................... 32 2.5.3 METABOLISMO .................................................................................... 33 2.5.3.1 MORFINA .................................................................................... 33 2.5.3.2 CODEÍNA ..................................................................................... 34 2.5.3.3 HEROÍNA .................................................................................... 35 2.5.4 EXCRECIÓN ......................................................................................... 36 2.6 MECANISMO DE ACCIÓN .......................................................................... 37 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 39     Opioides  25   2.1 OPIOIDESENESTUDIO La morfina (MOR) y la codeína (COD) son opioides naturales que se encuentran en el zumo de las semillas de la adormidera o Papaver somniferum (Figura 2.1). El zumo seco y fermentado se denomina opio, y contiene una mezcla de alcaloides-opiáceos (MOR, COD, tebaína, papaverina, noscapina, etc.). El opio puro contiene entre un 10 y un 17% de MOR y entre un 1 y un 4% de COD 1 . Figura 2.1. Papaver somniferum . La HER es un opioide semisintético que se sintetiza a partir de la MOR. Fue sintetizada por primera vez en 1874 por Heinrich Dreser tratando de buscar un fármaco con la potencia analgésica de la MOR pero sin su capacidad adictiva, aunque pronto se comprobó que sus riesgos y efectos negativos eran superiores a los de la MOR. 2.2 ESTRUCTURAQUÍMICAYPROPIEDADES La estructura pentacíclica de la MOR (el opioide arquetípico) está constituida por un anillo bencénico (A), dos anillos ciclohexánicos parcialmente saturados (B y C), un anillo de piperidina (D) y uno de dihidrofurano (E) (Figura 2.2). Los anillos A, B y C forman un sistema fenantreno muy común en la naturaleza. Por otro lado, la estructura presenta dos grupos hidroxilo, uno fenólico en posición 3 y otro alílico en posición 6 y un enlace de tipo éter en las posiciones 4 y 5. Otra característica estructural importante viene determinada por la presencia de un grupo amino terciario en la posición 17. Debido a la poca flexibilidad conformacional del anillo de fenantreno, así como por los 5 centros quirales presentes (en posiciones 5, 6, 9, 13 y 14), la molécula de MOR posee un alto grado de estereoselectividad en su acción analgésica, de modo que exclusivamente el isómero natural (-)-5(R),6(S),9(R),13(S),14(R)-morfina posee actividad analgésica 2 . Introducción Opioides  26  Figura 2.2. Estructura química de los isómeros de la MOR. Como hemos visto, la molécula de MOR contiene un grupo fenol relativamente ácido (pKa= 8,2) y un grupo amino terciario básico. Sin embargo, debido a que el grupo amino es más básico de lo que el grupo fenol es ácido, se puede considerar una molécula básica desde el punto de vista farmacéutico y fisiológico. Así, la MOR existe en forma de catión a valores de pH fisiológicos y forma fácilmente sales solubles con ácidos (de ahí que en la mayoría de los preparados se encuentre en forma de sulfato o clorhidrato)2. Los derivados de la MOR se pueden clasificar en tres grandes grupos, atendiendo a la naturaleza de su interacción frente a determinados receptores de narcóticos (Ver apartado Mecanismo de Acción). Así, existen derivados agonistas, que pueden ser naturales (alcaloides derivados del opio, MOR, COD, etc.), semisintéticos (hidromorfona, oximorfona, oxicodona, etc.) o sintéticos (meperidina, levarfanol, metadona, sufentanil, alfentanil, fentanil, etc.). También hay derivados con una acción mixta agonistaantagonista (nalbufina, pentazocina, etc.) que se caracterizan por tener una actividad agonista en ciertos receptores y antagonistas en otros, y derivados antagonistas simplemente. Estos últimos se caracterizan porque no tienen una actividad agonista en los receptores opiáceos y normalmente los bloquean, inhibiendo los efectos de los agonistas y por ello se utilizan en el tratamiento de trastornos de dependencia2. Se han llevado a cabo numerosas modificaciones sobre las distintas partes de la estructura de la MOR, principalmente mediante la funcionalización del grupo 3-hidroxilo, el cual posee una importancia clave en lo referente a su actividad analgésica2. Así, la Opioides  27   eterificación de dicho grupo reduce su capacidad analgésica, tanto más cuanto mayor es la longitud del grupo éter introducido. La introducción de un grupo metilo da lugar a la COD (Figura 2.3). Este derivado resulta ser un antitusivo muy útil, pese a su limitada actividad analgésica 2 . Figura 2.3. Estructura química de la COD. Cuando se acetilan los dos grupos hidroxilo de la posiciones 3 y 6 se obtiene la HER (Figura 2.4), cuya elevada lipofilia incrementa su entrada en el sistema nervioso central (SNC) 2 . Figura 2.4. Estructura química de la HER. De forma general podemos concluir que los opioides en estudio son sólidos blancos de sabor amargo y cristalizables, de carácter básico (pka próximos a 8), lipófilos, con pesos moleculares alrededor de 300 g/mol (286 g/mol para la MOR, 300 g/mol para la COD y 369 g/mol para la HER), con porcentajes de unión a proteínas bajos (35% para la MOR, 7% para la COD y 40% para la HER) 3 y un elevado volumen de distribución (3-4 L/Kg para la MOR y 25 L/kg para la HER) 3 . Introducción Opioides  34  Se ha demostrado que la modificación de la posición 3-hidroxi de la MOR disminuye la actividad analgésica, mientras que las modificaciones en la posición 6-hidroxi pueden, por el contrario, aumentar la actividad analgésica9. Por lo tanto, la M3G no tiene afinidad por los receptores opioides y no participa en la actividad analgésica de la MOR. Por otro lado, la M6G tiene una fuerte afinidad por los receptores opioides y se ha demostrado que tiene un efecto analgésico tanto en los roedores como en el hombre. Se ha descrito la M6G como un analgésico más potente que la propia MOR tras una administración central10 y con la misma actividad por vía sistémica. Estudios de unión ligando-receptor realizados a los opiáceos in vitro han demostrado que la M6G se une a los receptores opioides y es de 1 a 5 veces menos afín por los receptores μ que la MOR10. Otros metabolitos de la MOR, en particular la NMOR, han mostrado una cierta actividad analgésica. No obstante, estos otros metabolitos están presentes a unas concentraciones bajas y no son susceptibles de contribuir de forma significativa al efecto global de la MOR. 2.5.3.2 CODEÍNA A diferencia de lo que ocurre con la MOR, en la COD la presencia del grupo éter en posición 3 imposibilita su metabolización como derivado 3-glucurónido, de ahí que las principales vías de metabolización sean a través de la hidrólisis del grupo éter dando MOR (10% de la dosis, la cual sigue su curso metabólico normal), N-desmetilación a norcodeína (NCOD) y por formación del derivado 6-O-β-D-glucurónido (C6G)2. Opioides  35   Figura 2.8. Metabolismo de la COD. 2.5.3.3 HEROÍNA La metabolización de la HER tiene lugar mediante hidrólisis del grupo acetilo en el carbono 3 para dar 6-MAM y posterior hidrólisis del otro grupo acetilo restante a MOR, cuya posterior metabolización tiene lugar siguiendo las rutas antes mencionadas 2 . Figura 2.9. Metabolismo de la HER. Introducción Opioides  36  2.5.4 EXCRECIÓN La MOR se excreta principalmente por vía renal con un aclaramiento de 2 L/h/kg3. Se excreta muy poca MOR inalterada, primordialmente se elimina como M3G por filtración glomerular. El 90% de la excreción total ocurre durante el primer día. Hay circulación enterohepática de la MOR y de sus glucurónidos, lo que explica la presencia de cantidades pequeñas del fármaco en las heces (7-10%) y en la orina durante varios días después de administrada la última dosis6. La M6G tiene una semivida de eliminación más prolongada que la MOR (4 horas frente a 2 horas)6, en neonatos el tiempo de vida media de la MOR se prolonga entre un 6 y un 10%3 debido a que éstos tienen una mayor dificultad en transformar la MOR en sus glucurónidos. A diferencia de la MOR, la COD es aproximadamente un 60% más eficaz por la vía oral que por la parenteral, como analgésico y como depresor respiratorio. Muy pocos opioides tienen una razón de potencia oral/parental tan alta. La mayor eficacia oral de estos fármacos se debe al menor metabolismo de primer paso en el hígado. Una vez absorbida, la COD se metaboliza en el hígado y se excreta principalmente por la orina, en su mayor parte en formas inactivas6. Cantidades mínimas de COD y sus metabolitos son encontrados en las heces. Tras una dosis de COD, la mayor parte es excretada en un tiempo de 24 horas tras la administración, de 5 a 15% como COD inalterada y el resto como producto de conjugación glucurónido de COD y sus metabolitos. La vida media de COD en el plasma es de 2,5 a 3,5 horas3. El aclaramiento de la HER es de 31 mL/kg/min 3, superando con creces el flujo sanguíneo hepático y renal (que oscilan entre 80 L/h y 60 L/h, respectivamente, en un humano estándar de 70 kg), indicando que la HER es metabolizada principalmente en el tejido periférico y en la circulación. El alto aclaramiento de la HER del plasma se debe principalmente a la rápida eliminación por las esterasas, la hidrólisis espontánea de la HER en el ambiente de fluidos corporales y el elevado volumen de distribución8. Las semividas de eliminación de la HER y de la 6-MAM son de 3-5 min y 3-12 min, respectivamente7. Las vidas medias de la MOR, M3G y M6G como metabolitos de la HER son comparables con los datos obtenidos de los estudios farmacocinéticos después de administración de MOR8. Opioides  37   Tras la administración de HER, aproximadamente el 70% de la dosis total de HER se recupera en la orina, fundamentalmente como conjugados de MOR (55%), y en menor cantidad como 6-MAM (1,3%) y MOR (10%)8. 2.6 MECANISMODEACCIÓN Los opioides producen sus acciones farmacológicas gracias a la fijación de una manera reversible y selectiva a unos receptores de membrana que se encuentran localizados predominantemente en el sistema nervioso (Figura 2.10). Actualmente se reconoce la existencia de tres tipos mayores de receptores opioides que corresponden a los receptores mu, delta y kappa, y cuyas características moleculares, bioquímicas y farmacológicas se encuentran bien definidas. Debe destacarse que se han definido al menos dos subclases de receptores mu y delta, y tres subclases de receptores kappa. Figura 2.10. Mecanismo de acción de los opioides. Neurotransmisores Opioide Receptor opioide Neurona postsináptica A TP A MPc A C K + - Ca+2 G - + - Neurona presináptica Introducción Opioides  38  Como ya se ha explicado anteriormente, los opioides pueden actuar como agonistas (MOR, COD, HER, peptidina, metadona, fentanilo y sus derivados), agonistas parciales (buprenorfina) o antagonistas (naloxona y naltrexona) en uno o varios de los receptores opioides. Los opioides exógenos presentan el llamado dualismo farmacológico. Este fenómeno consiste en que dos fármacos opioides actuando sobre receptores distintos (mu, kappa) ejercen el mismo efecto farmacológico, por ejemplo, analgesia. Pero estos mismos fármacos pueden actuar como agonista en un receptor y agonista parcial o antagonista sobre otro, siendo el resultado de su interacción distinto (pentazocina, butorfanol o nalorfina)7. La activación de los diferentes receptores opioides ya sea por agonistas exógenos o endógenos produce, por lo general, efectos de tipo inhibitorio sobre la transmisión sináptica. Aunque la localización de dichos receptores es variable, se encuentran principalmente ubicados en terminales de fibras presinápticas y su activación resulta en una disminución en la liberación de neurotransmisores. Los tres subtipos de receptores opioides poseen siete hélices transmembranarias y se encuentran acoplados a proteínas G que van a controlar el grado de fosforilación de nucleótidos de guanina. A través de la modificación en la estructura de estas proteínas G se producirá una inhibición en la actividad del enzima adenilciclasa (AC) y ello da lugar a una disminución en los niveles intracelulares de adenosín monofosfato cíclico (AMPc). Dicha disminución de AMPc precipita una cascada de acontecimientos intracelulares, incluida la disminución de la actividad de un segundo enzima, la proteinquinasa, lo que resulta en una disminución de la fosforilación de proteínas. Se produce además una facilitación del cierre de los canales de calcio (Ca+2) en las neuronas presinápticas, por lo que se reduce la liberación de neurotransmisor, así como la apertura de canales de potasio (K+) de las neuronas postsinápticas, lo que provoca una hiperpolarización de la membrana y como consecuencia una reducción de su activación. Por tanto, son receptores que median acciones inhibitorias7. La administración continuada de opioides produce cambios moleculares y de la expresión génica que son los responsables de los fenómenos de tolerancia, dependencia y abstinencia7.  Opioides  39   REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Seidenberg A, Honegger U. Metadona, heroína y otros opioides: manual para un tratamiento ambulatorio de mantenimiento con opioides. Madrid, Díaz de Santos, 2000, 30-31. 2. Gómez R. Aislamiento de la morfina: 200 años de un descubrimiento fundamental para la química moderna. An Quím 102(2) (2006) 45-53. 3. Leikin J, Paloucek F. Poisoning and Toxicology Handbook. Nueva York, CRC Press, 2008, 213. 4. Observatorio Europeo de las Drogas y las Toxicomanías. El problema de la drogodependencia en Europa. Informe anual 2009. Luxemburgo, 2009. 5. Observatorio Español sobre Drogas (OED). Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (DGPNSD). Informe 2007. Situación y tendencias de los problemas de drogas en España. 6. Goodman LS. 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Introducción: Drogas y embarazo 3.1 PREVALENCIA DEL CONSUMO DE DROGAS DURANTE EL EMBARAZO .......... 45 3.2 PRINCIPIOS FARMACOCINÉTICOS EN EL EMBARAZO ................................. 47 3.2.1 LA MADRE ........................................................................................... 49 3.2.2 LA PLACENTA ...................................................................................... 49 3.2.3 EL FETO .............................................................................................. 51 3.3 MODELOS FARMACOCINÉTICOS PARA LA UNIDAD MATERNO-FETAL .......... 53 3.4 EFECTOS DEL CONSUMO DE DROGAS DURANTE EL EMBARAZO ................. 55 3.4.1 COCAÍNA ............................................................................................. 56 3.4.1.1 EFECTOS FETALES ...................................................................... 56 3.4.1.2 EFECTOS NEONATALES ................................................................ 57 3.4.1.3 ALTERACIONES NEUROCONDUCTUALES ....................................... 57 3.4.1.4 ALTERACIONES ESTRUCTURALES ................................................. 58 3.4.1.5 ALTERACIONES DEL DESARROLLO Y LA CONDUCTA ...................... 58 3.4.1.6 ALTERACIONES DEL METABOLISMO ENERGÉTICO CEREBRAL ........ 59 3.4.2 OPIOIDES ............................................................................................ 60 3.4.2.1 EFECTOS FETALES ....................................................................... 60 3.4.2.2 EFECTOS NEONATALES ................................................................ 61 3.4.2.3 ALTERACIONES DEL DESARROLLO Y LA CONDUCTA ...................... 62 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................ 63 Drogas y embarazo 50 La cinética de transferencia de drogas al feto ha sido revisada56, y se ha sugerido que las drogas llegan al feto por diferentes vías: 1. Difusión pasiva de pequeñas moléculas liposolubles a través de la barrera placentaria, que pueden ser metabolizadas por el feto en función de la edad gestacional. Esta transferencia no requiere energía y depende de la concentración de la droga a través de la placenta, el área a través de la que ocurre la transferencia y el grosor de la membrana, tal como describe la ecuación de Fick: d CΔDA difusióndeVelocidad = Ecuación 3.1. Ecuación de Fick. En donde D es la constante de difusión de la droga, A es el área a través de la que ocurre la transferencia, ΔC es la concentración de la droga a través de la placenta (concentración plasmática materna-concentración plasmática fetal) y d es el grosor de la membrana. La constante de difusión D está determinada por las características de las drogas tales como su peso molecular, pKa, solubilidad lipídica, estado de ionización y unión a proteínas. En general compuestos con peso molecular superior o igual a 1000 Da no cruzan rápidamente la placenta, mientras que aquellos con peso molecular igual o inferior a 600 Da sí lo hacen. La mayoría de los fármacos y drogas de abuso están entre los 250 y 400 Da, y por tanto, cruzan fácilmente la placenta. El pH de la sangre fetal es relativamente ácido en comparación con el de la sangre materna, por eso las drogas básicas tienden a alcanzar mayores concentraciones en sangre fetal. Diversos estudios han puesto de manifiesto que drogas como la COC, marihuana y HER, entre otras, pueden atravesar la barrera placentaria. Las sustancias químicas pueden incluso actuar como teratógenos afectando directamente a la función de la placenta, e impidiendo el aporte de oxígeno y nutrientes al feto55. Drogas y embarazo 51 El transporte placentario de sustancias se establece alrededor de la quinta semana de vida embrionaria, pero antes de formarse la placenta cualquier sustancia puede actuar directamente sobre las células embrionarias o sobre los órganos maternos, alterando de forma indirecta el desarrollo fetal57,58. A medida que la placenta madura, el espesor del epitelio trofoblástico disminuye y aumenta la superficie de contacto, lo cual conlleva a que se eleve la velocidad de difusión de las sustancias cuando la placenta tiene mayor edad59. Por otra parte, la eliminación de sustancias psicoactivas en el compartimiento fetal se realiza por difusión hacia el compartimento materno, pero muchos metabolitos quedan en la porción fetal hasta que el riñón adquiere capacidad para eliminar las drogas circulantes al líquido amniótico57,59. Esta capacidad de eliminación reducida y la circulación fetal a través de la vena umbilical, que alcanza directamente su corazón y cerebro sin paso previo por el hígado, implica una disminución en el metabolismo de las drogas haciendo que el efecto de sustancias psicoactivas en el feto sea mayor59. 2. Unión de las drogas y/o sus metabolitos a las proteínas en el líquido amniótico, que posteriormente es ingerido por el feto. La ingestión continuada del líquido amniótico puede prolongar la exposición fetal a las drogas. 3.2.3 EL FETO Desde la perspectiva de la distribución fetal de la droga es conveniente resaltar que, dado que las drogas que atraviesan la placenta llegan al feto por la sangre venosa umbilical, y de ésta, el 50% entra en la circulación hepática y el resto atraviesa el ducto venoso; entonces, la mitad de la droga transportada es susceptible de metabolismo hepático y la otra mitad ingresa a la circulación fetal directamente48. La distribución de una droga en el feto constituye un factor determinante en el grado de exposición fetal y es en gran parte regulado por variaciones en el pH y en la unión a proteínas48. Al inicio del embarazo, el pH intracelular en el feto es mayor que en la madre, lo cual resulta en el secuestro de ácidos débiles y en la acumulación potencial de drogas ácidas Introducción Drogas y embarazo 52 en los tejidos fetales. Conforme avanza la edad gestacional, el pH intracelular fetal se hace más ácido, con el potencial atrapamiento de bases débiles. Durante el embarazo también pueden ocurrir variaciones en la unión a proteínas fetales60. La concentración de la glucoproteína ácida-α1, la cual une drogas lipofílicas ácidas, disminuye en el feto en relación con la madre a lo largo del embarazo, siendo insignificante a las 16 semanas de gestación y correspondiendo a un tercio de la concentración materna al momento del parto. La albúmina, la cual se une a drogas ácidas lipofílicas, está presente desde las semanas 12-15 de gestación, no obstante las concentraciones maternas superan en 3-4 veces las fetales. Sin embargo, conforme transcurre el embarazo, las concentraciones fetales de albúmina se incrementan en comparación con las maternas y a término son aproximadamente 20% mayores que las concentraciones maternas61. Los sistemas enzimáticos fetales destinados a la biotransformación se forman desde las semanas 5-8 de gestación y su actividad se incrementa hasta las semanas 12-14, cuando alcanza alrededor del 30% de la actividad del adulto. No es sino hasta el primer año de vida posnatal, que el sistema enzimático hepático se puede comparar con el del adulto62. El primer sistema que se expresa es el citocromo P450 es más activo en la glándula adrenal fetal que en el hígado y también está presente en el riñón e intestino. Las monooxigenasas están compuestas de un conjunto de formas inducibles y puede dividirse en dos grupos principales de acuerdo a las sustancias que inducen su actividad: fenobarbital o hidrocarburos aromáticos policíclicos63. La alcohol deshidrogenasa aparece durante las primeras seis semanas de gestación64. Los fetos humanos generalmente tienen bien desarrollada la actividad enzimática de conjugación, excepto por la glucuronidación, la cual continúa baja hasta poco después del nacimiento a término65. El metabolismo fetal puede generar intermediarios tóxicos indicando la participación del feto y de su estructura genética como factores en la susceptibilidad al desarrollo de toxicidad. La presencia de drogas en los líquidos fetales y amniótico procede de su paso a través de la orina, la cual se excreta dentro del líquido amniótico o sacos alantoicos, por transferencia a través de la piel fetal o por transporte directo desde la madre a las membranas corioalantoicas66. Drogas y embarazo 53 3.3 MODELOS FARMACOCINÉTICOS PARA LA UNIDAD MATERNO-FETAL48 Los modelos farmacocinéticos representan simplificaciones del modelo biológico real, facilitan la comprensión del fenómeno y permiten realizar predicciones exactas sobre la disposición del fármaco/droga en el organismo. Desde la perspectiva de la unidad materno-fetal, su diseño es particularmente importante debido a que los efectos de un fármaco en los tejidos fetales están, en gran parte, determinados por el tiempo de exposición, y éste, a su vez, por los procesos de distribución y excreción de los compartimentos materno y fetal. Los fármacos, una vez dentro del organismo, tienden a desplazarse entre los distintos compartimentos corporales. El análisis del fenómeno comienza con el estudio de los cambios en la concentración del fármaco en un compartimento en función del tiempo, de acuerdo a la siguiente fórmula: n KC dt dC −= Ecuación 3.2. Cambio en la concentración del fármaco en un compartimento en función del tiempo. En donde dC/dt representa el cambio en la concentración en relación al tiempo, y -KCn se refiere a que la disminución en la concentración de un fármaco es una función de tipo exponencial. Cuando n es igual a cero, el proceso es de orden cero y la velocidad de cambio es independiente de la concentración del fármaco: K dt dC −= Ecuación 3.3. Cinética de orden cero. Es lo que ocurre en los fenómenos saturables. Introducción Drogas y embarazo 54 Cuando n es 1, el proceso es de primer orden y la velocidad de cambio es proporcional a la concentración del fármaco: KC dt dC −= Ecuación 3.4. Cinética de primer orden. Cuando el fármaco después de ingresar en el organismo se distribuye en un compartimento homogéneo y después se elimina siguiendo un proceso de primer orden, se considera un modelo abierto de un compartimento. Cuando el sistema biológico está formado por un compartimento central en el que el fármaco se absorbe y se elimina, y un compartimento periférico comunicado con el anterior en donde la distribución del fármaco es un proceso reversible entre dos compartimentos, entonces se trata de un modelo abierto de dos compartimentos. En la unidad materno-fetal, un fármaco administrado a la madre se transfiere de la placenta al feto vía la vena umbilical y regresa del feto a la placenta vía las arterias umbilicales. El modelo más simple para este fenómeno es el de dos compartimentos representados por la madre y el feto con distribución bidireccional entre ellos (Figura 3.1)67. Existen dos modelos de este tipo: 1. El fármaco es eliminado sólo por la madre. 2. El fármaco es eliminado por la madre y el feto. Todos los procesos de distribución y eliminación siguen cinéticas de primer orden. La eliminación materna es el resultado tanto de la excreción del fármaco como de la distribución al feto y depende de la concentración del fármaco en el compartimento materno. En el caso de la eliminación fetal, ésta se deriva del proceso de biotransformación y de la transferencia feto-madre. La concentración fetal del fármaco será menor que la de la madre sólo si: Drogas y embarazo 55 1. La velocidad de eliminación materna es mayor que la velocidad de transferencia materno-fetal. 2. La velocidad de transferencia feto-madre es mayor que la madre-feto. 3. El feto o la placenta biotransforman el fármaco. Figura 3.1. Modelo materno-fetal (k= constantes de proporcionalidad correspondientes a las velocidades de absorción, distribución y eliminación). 3.4 EFECTOS DEL CONSUMO DE DROGAS DURANTE EL EMBARAZO La utilización de drogas ilícitas por parte de la mujer embarazada conlleva una situación de alto riesgo para la madre, el feto y el recién nacido68. Es difícil estimar el alcance total de las consecuencias del uso de la droga en las mujeres embarazadas y, por varias razones, es muy problemático determinar el peligro específico de una droga en particular sobre el feto. Hay muchos factores, como la cantidad y el número total de drogas de las que la madre abusó, los cuidados prenatales recibidos, la posible negligencia o abuso del niño, la exposición a la violencia, las condiciones socioeconómicas, el estado de nutrición materna, la posibilidad de que la Madre Ke Km - f Líquido amniótico K a Km - f Cordón umbilical Feto P L A C E N T A Km - f Introducción Drogas y embarazo 56 madre haya estado expuesta a enfermedades de transmisión sexual, y otros problemas de salud, que pueden contribuir a la dificultad para determinar el impacto directo, tanto maternal como infantil, del uso de drogas durante el período de gestación. 3.4.1 COCAÍNA Desde la introducción de la COC en el mercado, sus posibles efectos en el embarazo han generado una gran curiosidad entre la comunidad científica, que se ha reflejado en la abundante bibliografía al respecto. Así, a mediados de los 80, cuando empezaron a nacer los primeros hijos de madres adictas a la COC, se acuñó el término bebé crack para denominar a estos niños que previsiblemente tendrían un elevado riesgo de padecer daños irreversibles a nivel emocional e intelectual, que los haría irrecuperables para la sociedad. Los numerosos y exhaustivos estudios longitudinales iniciados a partir de entonces han constatado, sin embargo, que ese temor era infundado y que la mayoría de los efectos inicialmente atribuidos a la COC se correlacionan con otros factores concomitantes a su uso (alcohol, marihuana, tabaco, desnutrición materna, etc.). En este momento se cree que la figura del bebé crack es un mito. No obstante, la mayoría de estos estudios se basan en los efectos del crack en mujeres afroamericanas, por lo que puede ser peligroso hacer una simple extrapolación de los datos a otras poblaciones y a otras modalidades de consumo55. 3.4.1.1 EFECTOS FETALES El uso de COC se asocia a un amplio rango de efectos adversos para el embarazo, y el mecanismo por el cual se producen la mayoría de estos efectos adversos se cree debido a los efectos vasoconstrictores sobre la vasculatura materna y fetal. Estudios en animales han confirmado que la COC reduce el flujo arterial en el útero y la placenta, provocando una disminución en el aporte de oxígeno y nutrientes al feto. La alteración en la vascularización uterina y fetal puede ocasionar también las distintas anomalías congénitas que se han asociado al uso de COC. Parece que la vasoconstricción intermitente y la vasodilatación de rebote pudieran ser los responsables de las distintas malformaciones. Los defectos observados en estudios en roedores comparten muchas similitudes con los humanos, siendo la etiología sugestiva de un fenómeno de disrupción vascular. El descenso en el flujo sanguíneo uterino placentario y fetal puede provocar Drogas y embarazo 57 hemorragia y edemas, seguidos de necrosis y reabsorción de los tejidos afectados, causando la destrucción de las estructuras formadas55. Entre las complicaciones más habituales durante el embarazo se incluyen el aborto, la muerte fetal intraútero y el desprendimiento prematuro de la placenta. El riesgo de esta última se estima entre 5 y 20 veces superior al de la población general, y es posible que se deba a que la vasoconstricción causada por la COC pueda disminuir la adherencia de la placenta a la pared uterina55. 3.4.1.2 EFECTOS NEONATALES Entre los efectos neonatales cabe mencionar valores bajos de Apgar, peso, talla y perímetro craneal69-71. El bajo peso puede deberse a la falta de crecimiento del feto, al nacimiento prematuro o a una combinación de ambos factores. El riesgo de que un bebé de bajo peso muera durante su primer mes de vida es 20 veces mayor que el de un bebé de peso normal. El síndrome de muerte súbita neonatal es muy elevado (15%)72. Algunos estudios69 concluyen que los efectos neonatales adversos asociados con la exposición fetal a la COC siguen una relación dosis-respuesta. En cambio, otros73-75 afirman que las mujeres que consumen COC durante el embarazo presentan numerosas alteraciones en su vida que pueden afectar en el curso de su gestación, entre las cuales el consumo de COC sólo es un marcador más, que no parece influir en la prevalencia de bajo peso al nacer o de parto pretérmino. Entre otros efectos se ha descrito un aumento notable de los casos de enterocolitis necrosante y de muerte súbita75. 3.4.1.3 ALTERACIONES NEUROCONDUCTUALES Entre las posibles alteraciones neuroconductuales se incluyen: cuadro transitorio de irritabilidad del SNC (temblores, irritabilidad, hiperreflexia, etc.), de instauración precoz y de escasa intensidad (pero que dificulta la instauración del vínculo entre madre e hijo), que podría estar en relación con la presencia de la droga en el SNC del recién nacido. El síndrome de abstinencia propiamente dicho, es menos claro que para los opiáceos, y en caso de presentarse sería en el segundo o tercer día55. Introducción Drogas y embarazo 58 Se ha podido establecer una diferencia entre los efectos sobre la conducta del recién nacido producidos por la COC (neonatos letárgicos) y sus metabolitos, como la BE y NCO (signos de neuroexcitación)76. Como se ha demostrado en estudios de mujeres embarazadas consumidoras de COC, estas alteraciones neuroconductuales pueden aparecer, incluso, si sólo se ha consumido COC durante el primer trimestre de la gestación, a diferencia de la HER, que no causa síndrome de abstinencia neonatal (NAS, Neonatal Abstinence Syndrome) si no se ha consumido durante el último mes del embarazo. 3.4.1.4 ALTERACIONES ESTRUCTURALES Existe una gran controversia sobre la capacidad de la COC de provocar defectos estructurales, y la mayoría de los defectos asociados a esta droga podrían ser debidos a hipoxia, isquemia o hemorragia. Entre los defectos físicos asociados al uso de COC están las anomalías del tracto genitourinario, la reducción de extremidades, atresia intestinal y la microsomía hemifacial. De todos ellos, solo se ha demostrado una relación estadísticamente significativa para las malformaciones del tracto genitourinario55. 3.4.1.5 ALTERACIONES DEL DESARROLLO Y LA CONDUCTA También existe una gran controversia en torno a los efectos a largo plazo de la exposición prenatal a la COC sobre la estructura y la función del SNC del recién nacido. Así, un estudio75 concluye que en niños menores de 6 años no existe evidencia convincente de que la exposición prenatal a la COC se asocie de manera independiente a efectos tóxicos del desarrollo tanto físico (crecimiento) como conductual. Otros investigadores en el 200477 y en el 200778 también informaron que no existen efectos de la exposición prenatal a COC en el crecimiento durante la infancia. Sin embargo, otro estudio publicado en el 200779 en el que se siguió la evolución de 224 niños desde su nacimiento hasta los 10 años, ha demostrado que la exposición prenatal a la COC tiene un efecto duradero sobre el crecimiento infantil. Estos niños, en promedio, eran más bajos, pesaban menos y tenían una circunferencia de cabeza más pequeña que el resto de los niños a los 10 años. Drogas y embarazo 59 En referencia al desarrollo cognitivo, numerosos estudios han demostrado que no existen efectos perjudiciales de la exposición prenatal a COC en el desarrollo cognitivo durante la infancia, medido por el índice de desarrollo mental de la escala de Bayley del desarrollo infantil (BSID, Bayley Scales of Infant Development) 80,81. Solamente algunos estudios han afirmado la existencia de efectos perjudiciales. Alessandri y cols.82 encontraron un bajo desarrollo mental asociado a la exposición prenatal a COC a los 18 meses del nacimiento, pero no a los 8 meses, Singer y cols.83 a los 12, 17 y 24 y Behnke y cols.84 a los 6. En el desarrollo motor, medido por el índice de desarrollo psicomotor de la BSID o de la escala de Peabody del desarrollo motor (PDMS, Peabody Developmental Motor Scales) , muchos investigadores tampoco encontraron efectos perjudiciales de la exposición prenatal a COC. Sin embargo, de nuevo Singer y cols.83 encontraron asociación de la exposición prenatal a COC con bajos desarrollos motores a los 17 meses aproximadamente, Fetters y col.85 a los 7 y Miller-Loncar y cols.86 en la infancia temprana, sin embargo estos investigadores mostraron que a los 18 meses ya no existían diferencias significativas. Una preocupación todavía vigente hace referencia a la predisposición a un mayor riesgo de desarrollo de conductas adictivas en la adolescencia, y los estudios en animales así lo indican. La exposición prenatal a la COC podría incrementar el número de receptores cerebrales para la dopamina, predisponiendo al individuo a una reacción exagerada a las drogas de abuso55. 3.4.1.6 ALTERACIONES DEL METABOLISMO ENERGÉTICO CEREBRAL Se ha sugerido la aparición de anomalías del metabolismo energético en el cerebro de los recién nacidos expuestos a la COC durante la vida intrauterina87. Este estudio ha examinado los efectos neurotóxicos de la exposición prenatal a la COC mediante espectroscopía con resonancia magnética de protones, encontrando, al igual que en los adultos consumidores, un aumento de creatinina junto con un valor de noradrenalina (N- acetil aspartato, marcador de integridad neuronal) relativamente normal en el lóbulo frontal de niños expuestos con problemas de atención y conducta, según los padres. Así pues, destaca, en ausencia de anomalías estructurales, una alteración del metabolismo Introducción Drogas y embarazo 66 36. Dahlem P, Bucher HU, Cuendet D, Mieth D, Gautschi K. Prevalence of drugs in meconium. Monatsschr Kinderheilkd 141(3) (1993) 237-240. 37. Farkas AG, Colbert DL, Erskine KJ. Anonymous testing for drug abuse in an antenatal population. Br J Obstet Gyneacol 102(7) (1995) 563-565. 38. Sherwood RA, Keating J, Kavvadia V, Greenough A, Peters TJ. Substance misuse in early pregnancy and relationship to fetal outcome. Eur J Pediatr 158(6) (1999) 488-492. 39. Sanaullah F, Gillian M, Lavin T. Screening of substance misuse during early pregnancy in Blyth: an anonymous unlinked study. J Obstet Gyneacol 26(3) (2006) 187-190. 40. Williamson S, Jackson L, Skeoch C, Azzim G, Anderson R. Determination of the prevalence of drug misuse by meconium analysis. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 91(4) (2006) F291-F292. 41. Chiarotti M, Strano-Rossi S, Offidani C, Fiori A. Evaluation of cocaine use during pregnancy through toxicological analysis of hair. J Anal Toxicol 20(7) (1996) 555-558. 42. Fundarò C, Genovese O, Rendeli C, Valeri S, De Turris PL, Girlando P, Parenti D, Auriti C, Rossodivita A, Reynaud G, Segni G. Detection of occult fetal exposure to illicit drugs by meconium analysis. Rivista Italiana di Pediatria 24(3) (1998) 421-426. 43. Gerola O, Montagna M, Vignali C, Cerri C, Pistorio A, Di Mario M, Spinillo A, Rondini G. Evaluation of gestional exposure to opiates and cocaine by meconium analysis. Rivista Italina di Pediatria 25(6) (1999) 1073-1077. 44. Observatorio Español sobre Drogas (OED). Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (DGPNSD). Informe 2007. Situación y tendencias de los problemas de drogas en España. 45. Martinez Crespo JM, Antolín E, Comas C, Coll O, Marqués JM, Gual A, Fortuny A. The prevalence of cocaine abuse during pregnancy in Barcelona. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 56(3) (1994) 165- 167. 46. Pichini S, Puig C, Zuccaro P, Marchei E, Pellegrini M, Murillo J, Vall O, Pacifici R, García-Algar O. Assessment of exposure to opiates and cocaine during pregnancy in a Mediterranean city: preliminary results of the “Meconium Project”. Forensic Sci Int 153(1) (2005) 59-65. Drogas y embarazo 67 47. García Algar O, Vall Combelles O, Puig Sola C, Mur Sierra A, Scaravelli G, Pacifici R, Monleón Getino T, Pichini S. Exposición prenatal a drogas de abuso a través del análisis de meconio en una población de bajo nivel socioeconómico en Barcelona. An Pediatr 70(2) (2009) 151-158. 48. Villanueva LA. El embarazo desde una perspectiva farmacológica. Rev Hosp Gral Dr M Gea González 4(1-2) (2001) 32-38. 49. Szeto HH. Maternal-fetal pharmacokinetics: Summary and future directions. NIDA Res Monogr 154 (1995) 203-217. 50. Fabro S, Scialli AR. Drug and chemical action in pregnancy: pharmacological and toxicologic principles. Nueva York, Marcel Dekker, 1986, 103-113. 51. Fabro S, Scialli AR. Drug and chemical action in pregnancy: pharmacological and toxicologic principles. Nueva York, Marcel Dekker, 1986, 153-163. 52. Miller RK, Kellogg CK. The pharmacodynamics of prenatal chemical exposure. NIDA Res Monogr 60 (1985) 39-57. 53. Brody TM, Larner J, Minneman KP. Human pharmacology: molecular to clinical. San Luis, Mosby, 1993, 843-854. 54. Gleicher N. Medicina clínica en obstetricia. Buenos Aires, Editorial Médica Panamericana, 1989, 110-125. 55. Cruz Landeira A, Bouzas Montero CA, Concheiro Guisán M, De Castro Ríos A, Quintela Jorge O, Bermejo Barrera AM, Pereiro Gómez C. Drogas y teratogenia. Adicciones 18(1) (2006) 245-258. 56. Szeto HH. Kinetics of drug transfer to the fetus. Clin Obstet Gynecol 36(2) (1993) 246-254. 57. Schuetze P, Eiden R, Coles C. Prenatal cocaine and other substance exposure: Effects on infant autonomic regulation at 7 months of age. Dev Psychobiol 49 (2007) 276-289. 58. Tapia J, Ventura P. Manual de neonatología. Santiago de Chile, Mediterráneo, 2000. 59. Simone C, Derewlany LO, Oskamp M, Knie B, Koren G. Transfer of cocaine and benzoylecgonine across the perfused human placental cotyledon. Am J Obstet Gynecol 170(5 Pt 1) (1994) 1404-1410. Introducción Drogas y embarazo 68 60. Green TP, O'Dea RF, Mirkin BL. Determinants of drug disposition and effect in the fetus. Annu Rev Pharmacol Toxicol 19 (1979) 285-322. 61. Krauer B, Dayer P, Anner R. Changes in serum albumin and alpha 1-acid glycoprotein concentrations during pregnancy: an analysis of fetal-maternal pairs. Br J Obstet Gyneacol 91(9) (1984) 875-881. 62. Pelkonen O. Biotransformation of xenobiotics in the fetus. Pharmacol Ther 10(2) (1980) 261- 281. 63. Dvorchik BH, Woodward G, Sitar DS, Tweed WA. Hidroxylation and glucuronidation of various xenobiotics by hepatic microsomes from the fetal lamb, pregnant ewe and human fetus. Dev Pharmacol Ther 9(4) (1986) 282-289. 64. Bibbo M, Gill WB, Azizi F, Blough R, Fang VS, Rosenfield RL, Schumacher GF, Sleeper K, Sonek MG, Wied GL. Follow-up study of male and female offspring of DES- exposed mothers. Obstet Gynecol 49(1) (1977) 1-8. 65. Burchell B, Coughtrie M, Jackson M, Harding D, Fournel- Gigleux S, Leakey J, Hume R. Development of human liver UDP-glucuronosyltransferases. Dev Pharmacol Ther 13(2-4) (1989) 70- 77. 66. Rudolph AM. Pharmacodynamics in the maternal-fetal-placental unit. NIDA Res Monogr 154 (1995) 163-174. 67. Briggs GG, Freeman RK, Yaffe SJ. Drugs in pregnancy and lactation. Baltimore, Lippincott Williams and Wilkins, 1994. 68. Echevarría J. Drogas en el embarazo y morbilidad neonatal. An Pediatr 5(6) (2003) 519-522. 69. Behnke M, Eyler FD, Garvan CW, Wobie K. The search for congenital malformations in newborns with fetal cocaine exposure. Pediatrics 107(5) (2001) E74. 70. Chiriboga CA, Brust JC, Bateman D, Hauser WA. Dose-response effect of fetal cocaine exposure on newborn neurologic function. Pediatrics 103(1) (1999) 79-85. 71. Bateman DA, Chiriboga CA. Dose-response effect of cocaine on newborn head circumference. Pediatrics 106(3) (2000) E33. Drogas y embarazo 69 72. Lizasoain I, Moro MA, Lorenzo P. Cocaína: aspectos farmacológicos. Adiciones 14(1) (2002) 57- 64. 73. Chavkin W. Cocaine and pregnancy - time to look at the evidence. JAMA 285(12) (2001) 1626- 1628. 74. Chiriboga CA. Neurological correlates of fetal cocaine exposure. Ann N Y Acad Sci 846 (1998) 109-125. 75. Frank DA, Augustyn M, Knight WG, Pell T, Zuckerman B. Growth, development, and behavior in early childhood following prenatal cocaine exposure: a systematic review. JAMA 285(12) (2001) 1613-1625. 76. Konkol RJ, Murphey LJ, Ferriero DM, Dempsey DA, Olsen GD. Cocaine metabolites in the neonate: potential for toxicity. J Child Neurol 9(3) (1994) 242-248. 77. Brown JV, Bakeman R, Coles CD, Platzman KA, Lynch ME. Prenatal cocaine exposure: a comparison of 2-years-old children in parental and nonparental care. Child Dev 75(4) (2004) 1282- 1295. 78. Chiriboga CA, Kuhn L, Wasserman GA. Prenatal cocaine exposures and dose-related cocaine effects on infant tone and behavior. Neurotoxicol Teratol 29(3) (2007) 323-330. 79. Richardson GA, Goldschmidt L, Larkby C. Effects of prenatal cocaine exposure on growth: a longitudinal analysis. Pediatrics 120(4) (2007) e1017-e1027. 80. BSID N. Bayley, Manual for the Bayley Scales of Infant Development, Psychological Corporation, New York, 1969. 81. BSID-II N. Bayley, Manual for the Bayley Scales of Infant Development, Psychological Corporation, New York, 1993. 82. Alessandri SM, Bendersky M, Lewis M. Cognitive functioning in 8- to 18- month-old drug-exposed infants. Dev Pyschol 34(3) (1998) 565-573. 83. Singer LT, Arendt R, Minnes S, Farkas K, Salvator A, Kirchner HL, Kliegman R. Cognitive and motor outcomes of cocaine-exposed infants. JAMA 287(15) (2002) 1952-1960. Introducción Drogas y embarazo 70 84. Behnke M, Eyler FD, Garvan CW, Wobie K, Hou W. Cocaine exposure an developmental outcome from birth to 6 months. Neurotoxicol Teratol 24(3) (2002) 283-295. 85. Fetters L, Tronick EZ. Neuromotor development of cocaine-exposed and control infants from birth through 15 months: poor and poorer performance. Pediatrics 98(5) (1996) 938-943. 86. Miller-Loncar C, Lester BM, Seifer R, Lagasse LL, Baurer CR, Shankaran S, Bada HS, Wright LL, Smeriglio VL, Bigsby R, Liu J. Predictors of motor development in children prenatally exposed to cocaine. Neurotoxicol Teratol 27(2) (2005) 213-220. 87. Smith LM, Chang L, Yonekura ML, Gilbride K, Kuo J, Poland RE, Walot I, Ernst T. Brain proton magnetic resonance spectroscopy and imaging in children exposed to cocaine in utero. Pediatrics 107(2) (2001) 227-231. 88. Briggs GG, Freeman RK, Yaffe SJ. Drugs in pregnancy and lactation. Filadelfia, Lippincott Williams and Wilkins, 2005 . Capítulo Introducción: Detección de drogas en el embarazo Capítulo 4. Introducción: Detección de drogas en el embarazo 4.1 ENTREVISTA MATERNA ............................................................................ 75 4.1.1 ENTREVISTA RUTINARIA ...................................................................... 75 4.1.2 ENTREVISTA ESTRUCTURADA .............................................................. 76 4.2 ANÁLISIS DE MUESTRAS BIOLÓGICAS ...................................................... 77 4.2.1 MUESTRAS BIOLÓGICAS ...................................................................... 77 4.2.1.1 SANGRE ...................................................................................... 77 4.2.1.2 ORINA ......................................................................................... 77 4.2.1.3 MECONIO .................................................................................... 78 4.2.1.4 PELO ........................................................................................... 79 4.2.1.4.1 COMPOSICIÓN ...................................................................... 79 4.2.1.4.2 INCORPORACIÓN DE DROGAS ............................................... 80 4.2.1.4.3 VENTAJAS Y DESVENTAJAS .................................................... 80 4.2.1.5 LECHE MATERNA ......................................................................... 81 4.2.1.6 FLUIDO ORAL .............................................................................. 82 4.2.1.7 SUDOR ........................................................................................ 83 4.2.1.8 LÍQUIDO AMNIÓTICO .................................................................. 83 4.2.2 MÉTODOS ANALÍTICOS ........................................................................ 84 4.2.2.1 TÉCNICAS DE CRIBADO ............................................................... 94 4.2.2.2 TÉCNICAS DE CONFIRMACIÓN ..................................................... 95 4.2.2.2.1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA .................................................... 96 4.2.2.2.2 CROMATOGRAFÍA DE GASES .................................................. 97 4.2.3 PREPARACIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS ......... 122 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 125 Detección de drogas en el embarazo 75 Dado el ambiente que rodea a la madre embarazada consumidora de drogas, con frecuencia es difícil obtener información fiable sobre el consumo de sustancias tóxicas para el feto, y si se pregunta de forma directa al respecto, puede recibirse una respuesta negativa. Por ello, a menudo la sospecha es clínica, tanto por los síntomas maternos como por los del recién nacido. Sin embargo, para confirmar esta sospecha, el análisis de las matrices biológicas es una fuente muy fiable. Los métodos usados para determinar el abuso de drogas en una mujer embarazada, o la exposición intrauterina a drogas en un recién nacido, deberían dirigirse no sólo al tipo de droga consumida, sino también a la cantidad, la frecuencia, y la duración de exposición de la droga. Aunque la adquisición de esta información no sea por lo general posible, dos métodos son los más usados: entrevista materna y análisis de muestras biológicas. 4.1 ENTREVISTA MATERNA La entrevista materna, realizada de forma adecuada, tiene un gran potencial para obtener información sobre el tipo, la cantidad, la frecuencia y la duración del empleo de droga en la madre. Sin embargo, su principal inconveniente es que es una prueba que requiere mucho tiempo y que tiene una sensibilidad muy baja, con un alto porcentaje de falsos negativos. Las dos formas de entrevista materna generalmente usadas son la rutinaria y la estructurada. 4.1.1 ENTREVISTA RUTINARIA La entrevista rutinaria forma parte de la historia obstétrica, que es obtenida prenatalmente o cuando una mujer embarazada es admitida en una instalación médica. La exactitud de los datos obtenidos por este método depende de la atención fiel a la entrevista. Entrevistas superficiales a menudo muestran baja incidencia en el empleo de droga, mientras que la incidencia aumenta, del triple al quíntuple, si se emplea un protocolo más organizado. De todos modos existen otros muchos elementos que afectan a su exactitud: miedo maternal a las consecuencias de su confirmación; la subestimación del empleo de droga, aún por los que admiten su empleo; y el disconfort físico experimentado por la mujer cuando está embarazada. Introducción Detección de drogas en el embarazo 82 del análisis cromatográfico. (4) El efecto de los agentes emulsificantes naturales de la leche materna pueden interferir con las reacciones antígeno-anticuerpo que tienen lugar en los screening mediante inmunoensayos. (4) La disposición de las drogas varía con la composición de la leche materna. (5) La composición de la leche materna varía diariamente, con el método de muestreo y con la alimentación17. 4.2.1.6 FLUIDO ORAL La saliva es el término que se usa para describir el líquido excretado por las más de 14 glándulas salivares. Cuando una mezcla de la saliva de las diversas glándulas es recolectada, por expectoración o mediante la colocación de colectores absorbentes en la boca, la muestra resultante se denomina fluido oral. Ésta puede contener sangre, linfa, líquido cervicular y las células de las encías y las mejillas, además de la saliva mixta. La saliva está compuesta de agua (99%), proteínas (0,7%, en gran parte amilasa) y mucinas (0,26%). Ventajas. (1) La recogida es fácil y no invasiva. (2) La probabilidad de adulteración es baja. Limitaciones. (1) Posibilidad de contaminación debido a la ingesta oral de la droga. (2) El método de recogida de la muestra puede afectar al pH de la saliva. Al aumentar el flujo de saliva, la concentración del ión bicarbonato aumenta, por lo que aumenta el pH, y como consecuencia, se puede modificar la concentración de la droga en la misma. (3) Tamaño de muestra limitado. (4) Bajas concentraciones de droga. (5) La detección de drogas en la saliva de la madre sólo es útil para detectar el consumo agudo que se produjo en las horas previas a la recogida de la muestra, proporcionando escasa información sobre la exposición intrauterina a drogas. Detección de drogas en el embarazo 83 4.2.1.7 SUDOR Es el producto de secreción de las glándulas sudoríparas de la piel. Es un líquido incoloro, límpido, ligeramente salado, que surge en forma de minúsculas gotas de la superficie cutánea, sobre todo de ciertas regiones (axilas, ingles, frente, manos, pies, etc.) cuando la temperatura interna del organismo se eleva por encima de lo normal, ya sea por fiebre, por intensa fatiga física, o a consecuencia de un ambiente demasiado caluroso. Está constituido principalmente por agua (98-99%) y el 1-2% restante está formado por diversas sustancias que provienen del metabolismo orgánico: cloruro sódico (que confiere al sudor un ligero gusto salado), urea, ácido úrico, creatinina, ácidos grasos, ácido láctico (producto de la fatiga muscular, y por lo tanto, más abundante en el sudor producido en la fatiga intensa), sulfatos, lactatos, etc. Ventajas. (1) La recogida es fácil y no invasiva. (2) Baja probabilidad de sustitución o adulteración. Limitaciones. (1) Bajas concentraciones de droga. Se requiere una alta cantidad de muestra para que las concentraciones de droga sean medibles. (2) El análisis del sudor materno solamente demuestra consumo reciente de droga, proporcionando escasa información sobre la exposición de drogas al feto. 4.2.1.8 LÍQUIDO AMNIÓTICO El líquido amniótico, producido por las células de la membrana más interna del saco amniótico, es el líquido que rodea y protege al embrión durante el embarazo. Este líquido amortigua al feto contra la presión de los órganos internos y de los movimientos de la madre. La producción del líquido comienza en la primera semana después de la concepción, y aumenta en forma constante hasta la décima semana, después de la cual el volumen de fluido aumenta rápidamente. El líquido amniótico alcanza alrededor de 1,5 L a los 9 meses, contiene células y grasa que pueden dar al líquido un aspecto ligeramente turbio. La concentración de proteínas y el pH del líquido varían con la edad gestacional. El líquido amniótico circula constantemente, siendo tragado por el feto, procesado, absorbido, y excretado por los riñones del feto a tasas altas (50 ml/h). Esta Introducción Detección de drogas en el embarazo 84 circulación de líquido expone continuamente al feto a compuestos que pueden ser absorbidos en el intestino o difundidos a través de la piel fetal en la fase inicial del desarrollo. La inmersión del feto en este líquido puede prolongar la exposición a las drogas nocivas y metabolitos17. Ventajas. (1) Prácticamente no requiere preparación de la muestra. (2) Útil para determinar la exposición intrauterina a drogas en la fase temprana del desarrollo. (3) Presenta relativamente pocas interferencias. (4) Es compatible con la mayoría de técnicas analíticas. Limitaciones. (1) La recogida es sumamente invasiva, requiere anestesia local, personal médico altamente cualificado, etc. (2) Riesgo de complicación asociado con el muestreo. (3) Tamaño de muestra limitado. 4.2.2 MÉTODOS ANALÍTICOS Existen dos tipos de métodos analíticos para determinar la exposición del feto a sustancias tóxicas durante el embarazo: las técnicas de cribado o screening y las técnicas de confirmación. Los distintos métodos analíticos que normalmente se usan en la detección de los analitos estudiados durante el embarazo, se resumen por orden cronológico en la Tabla 4.1. Se ha centrado la búsqueda bibliográfica en las matrices biológicas convencionales (sangre y orina) y en las utilizadas en esta Tesis (pelo y meconio). Detección de drogas en el embarazo 85 Tabla 4.1. Revisión bibliográfica de las técnicas analíticas usadas para la detección de COC, BE, COD, MOR y 6-MAM durante el embarazo en muestras de sangre, orina, pelo y meconio (COC: cocaína y/o BE, OPI: COD, MOR y/o 6-MAM, RN: Recién nacido, M: Madre y F: Feto). REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Ostrea19 OPI Meconio Inmunoensayo - Otras muestras analizadas: Tejidos biológicos F, fluido amniótico. Oro20 COC OPI Orina M TLC Inmunoensayo enzimático GLC Espectroscopía UV Orina RN EIA Otros compuestos analizados: Anfetaminas, otros opioides. Ostrea Jr21 OPI COC Meconio RIA - Otras matrices analizadas: Intestino RN. Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Parton22 COC Orina RN Inmunoensayo - Pelo RN - RIA Frank23 COC Orina M EMIT GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Halstead24 OPI COC Orina M/RN TLC EMIT GC-MS - Otros compuestos analizados: Benzodiacepinas, Cannabinoides, PCP. Ostrea Jr25 OPI COC Meconio RIA - Graham26 COC Pelo M RIA - Osterloh27 COC OPI Orina M/RN EMIT - Otros compuestos analizados: Benzodiacepinas, Salicilato, Fenotiazina, Antidepresivos, Antihistamínicos, Analgésicos narcóticos, Xantina, Anfetaminas, Sedantes, Alcohol. Ostrea Jr28 COC OPI Orina RN TDX (FPIA) RIA - Meconio RIA - Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Chasnoff29 OPI COC Orina M EMIT EMIT Otros compuestos analizados: Alcohol, Cannabinoides. Clark30 COC Meconio TDX (FPIA) EMIT GC-MS Gillogley31 COC OPI Orina M/RN EMIT - Otros compuestos analizados: Anfetaminas. Introducción Detección de drogas en el embarazo 86 REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Mastrogiannis 32 COC Orina RN FPIA TLC OPI - Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Otros opioides, Anfetaminas, Barbitúricos, Benzodiacepinas, PCP. Matera33 COC OPI Orina M EMIT - Otros compuestos analizados: Otros opioides, Anfetaminas, Barbitúricos, Benzodiacepinas, Etanol, PCP. Ostrea Jr34 COC OPI Meconio RIA - Pelo M Inmunoensayo - Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Welch35 COC Orina Pelo RIA - Maynard36 COC OPI Orina M/RN EIA TLC GC-MS - Meconio Abuscreen (RIA) Otros compuestos analizados: Cannabinoides. COC OPI Orina RN TDX (FPIA) RIA Ostrea Jr37 - Meconio RIA Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Polzin38 COC OPI Orina M FPIA GC-MS Otros compuestos analizados: Alcohol, Cannabinoides, Anfetaminas. Schutzman39 COC Meconio Coat-A-Count (RIA) - Bandstra40 COC Orina M/RN - GC-MS Meconio Abuscreen (RIA) EMIT TDX (FPIA) Coat-A-Count (RIA) - Browne41 COC Meconio - HPLC Callahan42 COC Orina RN EMIT - Meconio TDX (FPIA) GC-MS - Pelo M/RN RIA - Clark43 COC Orina RN EMIT - Meconio TDX (FPIA) GC-MS Dahlem44 OPI COC Meconio Orina RN RIA - Otros compuestos analizados: Otros opioides, Cannabinoides, Barbitúricos. Forman45 COC Pelo M/RN Coat-A-Count (RIA) - Detección de drogas en el embarazo 87 REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Howe46 COC OPI Orina M/RN EMIT - Meconio TDX (FPIA) GC-MS Otros compuestos analizados: Anfetaminas. Kintz47 OPI COC Pelo RN ADX (FPIA) GC-MS Otros compuestos analizados: Benzodiacepinas, Anfetaminas, Tabaco. Mirochnick48 COC OPI Orina M/RN EMIT - Meconio RIA Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Anfetaminas, Benzodiacepinas. Ostrea Jr49 COC OPI Orina RN TDX (FPIA) RIA - Meconio RIA Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Ostrea Jr50 OPI COC Meconio RIA - Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Ostrea Jr51 OPI COC Meconio RIA - Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Romero52 COC OPI Meconio RIA EMIT ADX (FPIA) - Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Sloan53 COC OPI Orina M COBAS (EIA) GC-MS Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Barbitúricos, Cannabinoides, PCP, Benzodiacepinas, Alcohol, Tabaco. Steele54 COC Orina M/RN Meconio Abuscreen (RIA) TDX (FPIA) EMIT ONLINE (KIMS) Coat-A-Count (RIA) - Varley55 COC Meconio TDX(FPIA) GC-MS Abusada56 COC Sangre Plasma Meconio - GC-MS Burke57 COC Orina M EMIT GC-MS DiGregorio58 COC Pelo M - GC-MS Henderson59 COC Manchas sangre RN Abuscreen (RIA) GC-MS Horn60 COC OPI Orina RN EMIT - Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Barbitúricos, Benzodiacepinas, PCP, Alcohol. Introducción Detección de drogas en el embarazo 88 REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Kintz61 OPI COC Pelo RN ADX (FPIA) GC-MS Otros compuestos analizados: Tabaco, Benzodiacepinas, Anfetaminas. Kintz62 OPI Pelo RN Orina RN - GC-MS Otros compuestos analizados: Tabaco. Lombardero63 COC Orina RN Meconio - GC-MS Otras matrices analizadas: Pañales. Marques64 COC Orina M EMIT GC-MS Pelo M/RN RIA - Montes65 COC OPI Meconio RIA EMIT ADX (FPIA) GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Moore66 COC Orina RN Inmunoensayo HPLC Otras matrices analizadas: Fluido amniótico, sangre cordón, cordón umbilical. Murphey67 COC Meconio - HPLC Needlman68 COC OPI Orina RN Meconio RIA - Otros compuestos analizados: Otros opioides, Anfetaminas, Cannabinoides, Benzodiacepinas. Ostrea Jr69 COC Meconio EMIT TDX (FPIA) GC-MS OPI - Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Anfetaminas. Ostrea Jr70 COC OPI Meconio Abuscreen (RIA) EMIT Abuscreen (RIA) ADx (FPIA) Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Romero71 COC OPI Meconio RIA EMIT ADX (FPIA) - Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Rosengren72 COC Meconio TDX (FPIA) GC-MS Steele73 COC Meconio Abuscreen (RIA) ONLINE (KIMS) EMIT TDX (FPIA) Coat-A-Count (RIA) TLC GC-MS Vaughn74 COC OPI Orina M TDX (FPIA) TDx (FPIA) Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Anfetaminas. Detección de drogas en el embarazo 89 REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Vega75 COC OPI Orina M EMIT GC Otros compuestos analizados: Alcohol, Anfetaminas, Barbitúricos, Benzodiacepinas, Cannabinoides, Otros opioides, PCP. Welch76 COC Orina RN Abuscreen OnTrak (AIA) EMIT GC-MS Browne77 COC Orina M/RN EMIT - Meconio HPLC GC-MS Casanova78 COC Orina M/RN Meconio - GC-MS Otras matrices analizadas: Fluido amniótico. DiGregorio79 COC Orina M EMIT GC-MS Pelo M/RM Meconio - Franssen80 OPI Orina RN TDXFLX (FPIA) - Meconio HPLC-DAD Otros compuestos analizados: Anfetaminas. Grant81 COC Pelo M RIA - Johnson82 COC Meconio RIA Jortani83 COC Orina M/RN EMIT TDX (FPIA) GC-MS Klein84 COC Pelo RN RIA - Otros compuestos analizados: Tabaco. Lewis85 COC OPI Meconio Pelo RN/M ADX (FPIA) GC-MS Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Cannabinoides, PCP. Lewis86 COC Meconio TDX (FPIA) GC-MS Martinez Crespo87 COC OPI Orina M EMIT - Otros compuestos analizados: Alcohol. Morales88 OPI Meconio RIA GC-MS Otros compuestos analizados: Otros opioides. Moriya89 COC Meconio Orina M/RN EMIT GC-MS OPI TLC Otros compuestos analizados: Anfetaminas, PCP. Ostrea Jr90 COC OPI Pelo M Meconio RIA GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Ostrea Jr91 COC OPI Meconio RIA - Pelo M GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides. Introducción Detección de drogas en el embarazo 90 REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Pegues92 COC OPI Orina M FPIA FPIA Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Barbitúricos, Anfetaminas. Potter93 COC Orina RN RIA - Meconio - GC-MS Pelo RN/M RIA TD-MS Otros compuestos analizados: Tabaco, Cannabinoides, Anfetaminas. Robinson94 COC Plasma M/F - GC-MS Otras matrices analizadas: Cerebro M. Ryan95 COC Orina M/RN Meconio TDX (FPIA) GC-MS OPI Orina M EMIT GC Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Marihuana, Benzodiacepinas. Wingert96 COC OPI Orina M/RN Meconio EMIT GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides, otros opioides. Farkas97 OPI COC Orina M GLC EMIT TLC GLC GLC FPIA GLC Otros compuestos analizados: Barbitúricos, PCP, Otros opioides, Antihistamínicos, Tabaco, Anfetaminas, Benzodiacepinas, Cannabinoides. Lewis98 COC Orina RN EMIT GC-MS Meconio ADX (FPIA) KIMS Lewis99 COC Meconio FPIA GC-MS Otros compuestos analizados: Marihuana, Anfetaminas. Mac100 COC OPI Meconio HPLC-UV GC-MS Otros compuestos analizados: Descongestivos, Benzodiacepinas, Anfetaminas, Antihistamínicos, Antidepresivos, Antitusivo, Otros opioides, Antipsicótico. Mirochnick101 COC OPI Meconio Orina M Abuscreen (RIA) - Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Benzodiacepinas, Cannabinoides. Moore102 OPI Meconio FPIA GC-MS Otros compuestos analizados: Otros opioides. Moore103 COC OPI Meconio EMIT - FPIA GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Anfetaminas. Detección de drogas en el embarazo 91 REF COMP MUESTRA SCREENING CONF Moriya104 COC OPI Meconio Heces EMIT GC-MS Otros compuestos analizados: Anfetaminas, PCP. Vorhees105 COC Plasma M - HPLC-UV Westdorp106 COC Orina M Abuscreen OnTrak (AIA) EMIT GC-NPD TLC Chiarotti107 COC Vello púbico M RIA GC-MS Newel108 COC OPI Pelo M RIA GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Anfetaminas, PCP. Oyler109 COC Orina M EMIT - Meconio FPIA GC-MS Sampèriz110 COC OPI Orina RN Pelo M Meconio EMIT GC-MS Otros compuestos analizados: Cannabinoides, Benzodiacepinas. Sosnoff111 COC Manchas sangre RN RIA LC-MS/MS Strano- Rossi112 COC Pelo RN Coat-A-Count (RIA) GC-MS Birnbach113 COC Orina M Abuscreen OnTrak (AIA) - Brown114 COC OPI Meconio FPIA GC-MS Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Cannabinoides, PCP. Henderson115 COC Manchas sangre RN RIA LC-MS/MS Lauria116 COC OPI Meconio GC - Mirochnick117 COC OPI Meconio Abuscreen (RIA) - Orina M EMIT Otros compuestos analizados: Anfetaminas, Benzodiacepinas, Cannabinoides. Monga118 COC Orina M Suero M - GC-MS Silvestre119 OPI Meconio RIA - Ursitti120 COC Pelo RN RIA - Vega121 COC OPI Orina M EMIT GC Otros compuestos analizados: Anfetaminas, PCP, Cannabinoides, Alcohol. Iwersen122 OPI Fluidos M/F Pelo M/F - GC-MS Otras matrices analizadas: Tejidos M/RN. Introducción Detección de drogas en el embarazo 98 Figura 4.3. Equipo de GC-MS. La combinación GC-MS constituye una de las herramientas más poderosas en manos de un químico analítico. Proporciona tanto información cualitativa, trabajando en modo de barrido de iones (full SCAN); como cuantitativa, trabajando en modo de monitorización de iones seleccionados (SIM, Selected Ion Monitoring), y una gran sensibilidad. El abaratamiento de los sistemas en las últimas décadas ha convertido el GC-MS en un instrumento usual de los laboratorios. Este abaratamiento ha permitido la utilización de sistemas tándem MS/MS de sobremesa como detectores de GC por el precio que hace dos décadas suponía acoplar un MS a un cromatógrafo, por lo que la modalidad en tándem empieza a ser ampliamente utilizada160-162. En las siguientes tablas (4.2 y 4.3) se describen las condiciones GC-MS y los parámetros de validación de los distintos métodos validados que han sido encontrados en la bibliografía, para la detección de COC, BE, COD, MOR y/o 6-MAM en muestras de pelo y de meconio, respectivamente. Los analitos diferentes a los analizados en esta Tesis no han sido incluidos en esta tabla. Detección de drogas en el embarazo 99 Tabla 4.2. Revisión bibliográfica de los métodos de determinación de COC, BE, COD, MOR y 6-MAM mediante GC-MS en muestras de pelo. REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Harkey163 COC Hidrólisis enzimática SPE Gas portador: He (5 psi, 55 cm/s) Programa temperaturas horno Columna DB-5 (15 m x 0,25 mm x 0,1 µm) Temperatura inyector: 260ºC (splitless) Temperatura línea transferencia: 260ºC Temperatura manifold: 240ºC Fuente ionización: CI (0,16 mA) Voltaje electromultiplicador: 1600V Gas reactivo: Isobutano Rango de masas: 80-440 Velocidad barrido: 1,0 s/scan r2>0,992 (0,1-10 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (0,1; 1 ng/g)<18,2% R (0,1; 0,5; 1 ng/mg)>90,4% BE r2>0,991 (0,1-10 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (0,1; 1 ng/g)<22,2% R (0,1; 0,5; 1 ng/mg)>93,3% Möller164 COC Hidrólisis enzimática SPE Gas portador: He (2 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP-Ultra 2 (12 m x 0,2 mm x 0,33 µm) Temperatura inyector: 260ºC Temperatura interfase: 280ºC Fuente ionización: EI (70eV) r2=0,9995 (0,5-50 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV (12,2 ng/g)=8% R (5 ng/mg)=90% BE r2=0,9998 (0,5-25 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV (2,8 ng/g)=14% R (5 ng/mg)=75% Introducción Detección de drogas en el embarazo 100 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Moeller165 BE Hidrólisis enzimática SPE Gas portador: He (2 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP-Ultra 2 (12 m x 0,2 mm x 0,33 µm) Temperatura inyector: 260ºC Temperatura interfase: 280ºC Fuente ionización: EI (70eV) r2=0,9999 (0,5-25 ng/mg) LOD=0,08 ng/mg LOQ=0,13 ng/mg CV (2,8 ng/g)=14% R (5 ng/mg)=90% COC r2=0,9998 (0,5-25 ng/mg) LOD=0,04 ng/mg LOQ=0,08 ng/mg CV (12,2 ng/mg)=8% R (5 ng/mg)=95% COD r2=0,9995 (0,5-25 ng/mg) LOD=0,04 ng/mg LOQ=0,06 ng/mg CV (1,7 ng/mg)=12% R (5 ng/mg)=80% 6-MAM r2=0,9998 (0,5-25 ng/mg) LOD=0,16 ng/mg LOQ=0,3 ng/mg R (5 ng/mg)=70% MOR r2=0,9999 (0,5-25 ng/mg) LOD=0,04 ng/mg LOQ=0,08 ng/mg CV (7,7 ng/mg)=4% R (5 ng/mg)=70% Edder166 COD SFE Gas portador: He (1,1 mL/min) Programa temperaturas horno Columna DB5 (15 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 270ºC (splitless) Temperatura detector: 250ºC r2=0,995 (0,5-2 ng/mg) LOD=0,03 ng/mg LOQ=0,1 ng/mg CV (1,99 ng/mg)=12% 6-MAM r2=0,997 (0,5-2 ng/mg) LOD=0,05 ng/mg LOQ=0,2 ng/mg CV (2,18 ng/mg)=10% MOR r2=0,996 (0,5-2 ng/mg) LOD=0,03 ng/mg LOQ=0,1 ng/mg CV (1,93 ng/mg)=3% Detección de drogas en el embarazo 101 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Wang167 COC Extracción con metanol SPE Gas portador: He (1 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP-1 (12 m x 0,2 mm x 0,33 µm) Temperatura inyector: 250ºC (splitless; 0,5 min) Temperatura línea transferencia: 280ºC Fuente ionización: EI (200 eV) r2>0,995 (0,1-100 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (1, 5, 25 ng/mg)<7,2% Exactitud interdía (1; 5; 25 ng/mg)>97% R>90% BE r2>0,995 (0,1-100 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (1, 5 ng/mg)<10,5% Exactitud interdía (1; 5; 25 ng/mg)=100% R>90% COD r2>0,995 (0,1-100 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (1, 5 ng/mg)<5,7% Exactitud interdía (1; 5; 25 ng/mg)>90% R>90% MOR r2>0,995 (0,1-100 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (1, 5 ng/mg)<7,0% Exactitud interdía (1; 5; 25 ng/mg)>90% R>90% 6-MAM r2>0,995 (0,1-100 ng/mg) LOD=0,1 ng/mg CV interdía (1, 5 ng/mg)<13,1% Exactitud interdía (1; 5; 25 ng/mg)>98% R>90% Introducción Detección de drogas en el embarazo 102 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Cirimele168 COD SFE Gas portador: He (1 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP5-MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 270ºC (splitless; 0,75 min) Fuente ionización: EI (70eV, 180ºC) Voltaje electromultiplicador: 400 eV LOD=0,3 ng/mg CV interdía (9,10-13,3 ng/mg)=13,2% R=61% MOR LOD=0,2 ng/mg CV interdía (0,45-0,70 ng/mg)=17,4% R=53% 6-MAM LOD=0,1 ng/mg CV interdía (9,80-14,9 ng/mg)=14,1% R=96% Kintz169 COC Hidrólisis ácida LLE Gas portador: He (1 mL/min) Programa temperaturas horno HP-5 (30 m x 0,25 mm) Temperatura inyector: 260ºC (splitless; 0,75 min) Fuente ionización: EI (70eV, 250ºC) Voltaje electromultiplicador: 400 eV r2=0,998 (0,2-50 ng/mg) LOD=0,05 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=8,4% R (2 ng/mg) =83,2% BE r2=0,998 (0,2-50 ng/mg) LOD=0,15 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=14,3% R (2 ng/mg) =72,1% Detección de drogas en el embarazo 103 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Kintz170 MOR Hidrólisis ácida LLE Gas portador: He (1,8 mL/min) Programa temperaturas horno EI (70 eV) Columna BP-5 (12 m x 0,22 mm) Temperatura inyector: 260ºC (splitless; 1 min) Temperatura fuente: 210-220ºC Voltaje electromultiplicador: 1650V r2=0,998 (0,2-10 ng/mg) LOD=0,10 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=12% R (2 ng/mg) =79,3% COD r2=0,998 (0,2-10 ng/mg) LOD=0,10 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=11,6% R (2 ng/mg) =85,7% 6-MAM r2=0,993 (0,2-10 ng/mg) LOD=0,25 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=15,7% R (2 ng/mg) =69,4% COC r2=0,998 (0,2-10 ng/mg) LOD=0,8 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=17,7% R (2 ng/mg) =68,6% BE r2=0,995 (0,2-10 ng/mg) LOD=0,20 ng/mg CV interdía (2 ng/mg)=14,3% R (2 ng/mg) =72,1% Introducción Detección de drogas en el embarazo 104 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Gaillard171 COC Hidrólisis ácida SPE Gas portador: He (1,3 mL/min) Programa temperaturas horno Tiempo análisis: 24 min Columna CP SIL 8 CB (25 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 280ºC (splitless) Temperatura detector: 300ºC LOD=0,19 ng/mg CV intradía (4 ng/mg)<6,7% CV interdía (4 ng/mg)=8,9% MRE (7,0 ng/mg)=7,14% R (4 ng/mg)=86,4% BE LOD=0,14 ng/mg CV intradía (4 ng/mg)<6,7% CV interdía (4 ng/mg)=2,8% MRE (4,0 ng/mg)=2,5% R (4 ng/mg)=91,6% COD LOD=0,15 ng/mg CV intradía (4 ng/mg)<6,7% CV interdía (4 ng/mg)=3,8% MRE (2,9 ng/mg)=0,34% R (4 ng/mg)=92,4% MOR LOD=0,12 ng/mg CV intradía (4 ng/mg)<6,7% CV interdía (4 ng/mg)=4,2% MRE (4,3 ng/mg)=0% R (4 ng/mg)=90,7% 6-MAM LOD=0,21 ng/mg CV intradía (4 ng/mg)<6,7% CV interdía (4 ng/mg)=7,8% R (4 ng/mg)=88,1% Detección de drogas en el embarazo 105 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Hold172 COC Hidrólisis enzimática SPE Gas portador: He (8 psi) Programa temperaturas horno Columna DB-1 (30 m x 0,32 mm x 1,0 µm) Temperatura inyector: 285ºC Temperatura interfase: 285ºC Temperatura línea transferencia: 275ºC Temperatura ionizador: 130ºC Fuente ionización: PCI (0,16 mA) Gas reactivo: metano-amonia (0,60 torr) Energía electrón: -70eV Dínodo de conversión: -3 KV Voltaje multiplicador: -1500 V r2>0,990 (0,5-50 ng/mg) LOQ=0,5 ng/mg CV intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)<5,7% Exactitud intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)>73% R (0,5; 5,0; 50 ng/mg)>71,0% BE r2>0,990 (0,5-25 ng/mg) LOQ=0,5 ng/mg CV intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)<33% Exactitud intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)>94% R (0,5; 5,0; 50 ng/mg)>66,4% COD r2>0,990 (0,5-50 ng/mg) LOQ=0,5 ng/mg CV intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)<27,9% Exactitud intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)>96,1% R (0,5; 5,0; 50 ng/mg)>64,4% MOR r2>0,990 (0,5-50 ng/mg) LOQ=0,5 ng/mg CV intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)<27% Exactitud intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)>92,6% R (0,5; 5,0; 50 ng/mg)>102,7% 6-MAM r2>0,990 (0,5-50 ng/mg) LOQ=0,5 ng/mg CV intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)<16,1% Exactitud intradía (0,2; 0,5; 5; 50 ng/mg)>106% R (0,5; 5,0; 50 ng/mg)>24,0% Introducción Detección de drogas en el embarazo 106 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Pichini173 COC Extracción con metanol Gas portador: He (1 mL/min) Programa temperaturas horno Tiempo análisis: 22 min Columna Restek Rtx-5 (30 m x 0,25 mm; 0,25 µm) Temperatura inyector: 250ºC (splitless) Temperatura línea transferencia: 280ºC Fuente ionización: EI (20 µA) Temperatura trampa iónica: 200ºC Rango masas: 80-500 uma r2=0,994 (0,02-100 ng/mg) LOQ=0,02 ng/mg MRE (7,3; 7,0 ng/mg)<11,4% BE r2=0,991 (0,01-50 ng/mg) LOQ=0,01 ng/mg MRE (1,6; 4,0 ng/mg)<18,7% COD r2=0,998 (0,01-50 ng/mg) LOQ=0,01 ng/mg MRE (6,7; 2,9 ng/mg)<24,1% MOR r2=0,996 (0,01-50 ng/mg) LOQ=0,01 ng/mg MRE (11,9; 4,3 ng/mg)<5,88% 6-MAM r2=0,998 (0,01-100 ng/mg) LOQ=0,01 ng/mg Detección de drogas en el embarazo 107 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Girod174 COD Hidrólisis ácida ASPE Gas portador: He Programa temperaturas horno Columna DB5MS (15 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 270ºC (splitless) Temperatura interfase: 280ºC Temperatura fuente: 200ºC r2=0,9987 (1-20 ng/mg) LOD=0,05 ng/mg CV (31,9; 4,2 ng/mg)<7,5% R=95% 6-MAM r2=0,9979 (1-20 ng/mg) LOD=0,05 ng/mg CV (26,6; 3,5 ng/mg)<7,9% R=80% MOR r2=0,9999 (1-20 ng/mg) LOD=0,05 ng/mg CV (32,9; 3,5 ng/mg)<6,4% R=103% COC r2=0,9984 (1-20 ng/mg) LOD=0,15 ng/mg CV (41,1; 5,5 ng/mg)<11,6% R=79% Jones175 COD Hidrólisis ácida SPE Gas portador: He (1 mL/min) Columna DB-5 (25 m x 0,20 mm x 0,33 mm) Tiempo de análisis: 14,65 min Temperatura inyector: 280ºC (splitless) Temperatura línea transferencia: 290ºC Fuente ionización: EI (230ºC) Temperatura cuadrupolo: 150ºC Dwell time: 50 ms LOD=0,03 ng/mg LLOQ=0,32 ng/mg ULOQ=10 ng/mg CV (1, 4 ng/mg)<9% MOR LOD=0,01 ng/mg LLOQ=0,15 ng/mg ULOQ=10 ng/mg CV (1, 4 ng/mg)<11% 6-MAM LOD=0,01 ng/mg LLOQ=1,10 ng/mg ULOQ=10 ng/mg CV (1, 4 ng/mg)<18% Introducción Detección de drogas en el embarazo 114 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Barroso184 COC Hidrólisis ácida SPE Gas portador: He (0,8 mL/min) Programa temperaturas horno Columna capilar HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 220ºC (split) Fuente ionización: EI (70 eV, 300 µA) Temperatura detector: 280ºC r2=0,9978 (0,05-20 ng/mg) LOD=0,02 ng/mg LOQ=0,05 ng/mg CV intradía (0,05; 0,5; 7,5; 17,5 ng/mg)<13,3% CV interdía (0,44; 3,72; 5,54 ng/mg)<11,7% MRE intradía (0,05; 0,5; 7,5; 17,5 ng/mg)<14,52% MRE interdía (0,44; 3,72; 5,54 ng/mg)<3,38% R (0,05; 0,5; 7,5; 17,5 ng/mg)>92,5% BE r2=0,9987 (0,05-20 ng/mg) LOD=0,015 ng/mg LOQ=0,05 ng/mg CV intradía (0,05; 0,5; 7,5; 17,5 ng/mg)<6,29% CV interdía (0,79; 1,47; 3,33 ng/mg)<10,5% MRE intradía (0,05; 0,5; 7,5; 17,5 ng/mg)<9,02% MRE interdía (0,79; 1,47; 3,33 ng/mg)<1,15% R (0,05; 0,5; 7,5; 17,5 ng/mg)>90,9% Detección de drogas en el embarazo 115 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Wu185 MOR Extracción ácida SPE Gas portador: He (1 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 230ºC (splitless) Temperatura línea transferencia: 280ºC Fuente ionización: EI (70eV, 230ºC) Temperatura cuadrupolo: 150ºC r2=0,999 (0,1-10 ng/mg) LOD= 0,05 ng/mg LOQ= 0,08 ng/mg CV intradía (0,1; 5; 10 ng/mg)<7,0% CV interdía (0,1; 5; 10 ng/mg)<6,7% MRE intradía (0,1; 5; 10 ng/mg)<10,6% MRE interdía (0,1; 5; 10 ng/mg)<13,8% R=92,9% COD r2=0,999 (0,1-10 ng/mg) LOD= 0,05 ng/mg LOQ= 0,08 ng/mg CV intradía (0,1; 5; 10 ng/mg)<4,8% CV interdía (0,1; 5; 10 ng/mg)<4,6% MRE intradía (0,1; 5; 10 ng/mg)<10,7% MRE interdía (0,1; 5; 10 ng/mg)<9,3% R=88,6% 6-MAM r2=0,999 (0,1-10 ng/mg) LOD= 0,08 ng/mg LOQ= 0,1 ng/mg CV intradía (0,1; 5; 10 ng/mg)<5,5% CV interdía (0,1; 5; 10 ng/mg)<5,9% MRE intradía (0,1; 5; 10 ng/mg)<10,6% MRE interdía (0,1; 5; 10 ng/mg)<12,2% R=89,6% Introducción Detección de drogas en el embarazo 116 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Wu186 MOR Extracción ácida SPE Gas portador: He (1 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP-5MS (40 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 230ºC Temperatura línea transferencia: 280ºC Fuente ionización: NCI (150ºC) Gas reactivo: Metano Temperatura cuadrupolo: 150ºC Dwell time: 20 ms r2=0,996 (0,05-5 ng/mg) LOD= 0,002 ng/mg LOQ= 0,005 ng/mg CV intradía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<5,3% CV interdía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<7,1% MRE intradía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<8,5% MRE interdía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<10,2% R (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)>80,5% COD r2=0,999 (0,05-5 ng/mg) LOD= 0,002 ng/mg LOQ= 0,005 ng/mg CV intradía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<5,3% CV interdía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<7,2% MRE intradía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<8,2% MRE interdía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<10,2% R (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)>86,5% 6-MAM r2=0,995 (0,05-5 ng/mg) LOD= 0,01 ng/mg LOQ= 0,04 ng/mg CV intradía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<9,1% CV interdía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<12,3% MRE intradía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<10,3% MRE interdía (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)<13,2% R (0,05; 0,5; 2,0 ng/mg)>85,8% Detección de drogas en el embarazo 117 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Moller185 COD Extracción con metanol HS-SPME Programa temperaturas horno Columna FactorFour (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 260ºC Temperatura interfase: 310ºC Temperatura fuente: 230ºC r2=0,9975 (0,005-5,0 ng/mg) LOD=0,002 ng/mg LOQ=0,004 ng/mg CV intradía (0,5; 5 ng/mg)<3,44% CV interdía (0,5; 5 ng/mg)<11,46% MOR r2=0,996 (0,1-5,0 ng/mg) LOD=0,005 ng/mg LOQ=0,01 ng/mg CV intradía (0,5; 5 ng/mg)<5,11% CV interdía (0,5; 5 ng/mg)<14,34% 6-MAM r2=0,996 (0,1-5,0 ng/mg) LOD=0,005 ng/mg LOQ=0,01 ng/mg CV intradía (0,5; 5 ng/mg)<5,14% CV interdía (0,5; 5 ng/mg)<14,77% Introducción Detección de drogas en el embarazo 118 REF COMP DIGESTIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Barroso188 COD Extracción con metanol SPE Gas portador: He (0,8 mL/min) Programa temperaturas horno Columna HP-5MS (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) Temperatura inyector: 220ºC (splitless) Fuente ionización: EI (70eV, 300 µA) Temperatura detector: 280ºC r2=0,9980 (0,05-50 ng/mg) LLOQ=0,05 ng/mg CV intradía (0,05-40 ng/mg)<18,24% CV interdía (0,75; 12,5; 35 ng/mg)<12,9% MRE intradía (0,05-40 ng/mg)<8,36% MRE interdía (0,75; 12,5; 35 ng/mg)<6,7% R (0,1; 10; 40 ng/mg)>96,84% MOR r2=0,9943 (0,05-50 ng/mg) LLOQ=0,05 ng/mg CV intradía (0,05-40 ng/mg)<15,77% CV interdía (0,75; 12,5; 35 ng/mg)<11,8% MRE intradía (0,05-40 ng/mg)<10,96% MRE interdía (0,75; 12,5; 35 ng/mg)<2,7% R (0,1; 10; 40 ng/mg)>95,20% 6-MAM r2=0,9966 (0,05-50 ng/mg) LLOQ=0,05 ng/mg CV intradía (0,05-40 ng/mg)<11,52% CV interdía (0,75; 12,5; 35 ng/mg)<11,4% MRE intradía (0,05-40 ng/mg)<5,95% MRE interdía (0,75; 12,5; 35 ng/mg)<2,7% R (0,1; 10; 40 ng/mg)>94,15% Detección de drogas en el embarazo 119 Tabla 4.3. Revisión bibliográfica de los métodos de determinación de COC, BE, COD, MOR y 6-MAM mediante GC-MS en muestras de meconio. REF COMP PREPARACIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Clark30 COC Extracción con metanol SPE Columna HP-5 LOD=300 ng/g ULOQ=10000 ng/g R=100% BE LOD=300 ng/g ULOQ=3500 ng/g R=30% Clark43 COC Extracción con metanol SPE Columna HP-5 Temperatura horno: 260ºC r2=0,99 LOD=250 ng/g ULOQ=10000 ng/g CV intradía (5000 ng/g): 8,1% R=99% BE r2=0,97 LOD=500 ng/g ULOQ=10000 ng/g CV intradía (5000 ng/g): 11,2% R=30% Varley55 BE Extracción con acetonitrilo SPE - ULOQ=5000 ng/g CV (60 ng/g): 9,6% Abusada56 BE Extracción con metanol SPE Gas portador: He (40 cm/min) Programa temperaturas horno Columna HP-Ultra 2 (12 x 0,2 mm x 0,33 µm) Temperatura inyector: 260ºC (split) Temperatura línea transferencia: 280ºC Voltaje electromultiplicador: 200V r=0,946 (0-1000 ng/g) LOD=6,52 ng/g LOQ= 13,66 ng/g R (100; 250; 500 ng/g)>67,6% COC r=0,850 (0-1000 ng/g) LOD=5,94 ng/g LOQ= 9,38 ng/g R (100; 250; 500 ng/g)>77,7% Introducción Detección de drogas en el embarazo 120 REF COMP PREPARACIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN Lombardero 63 COC Extracción con metanol SPE - 25-10000 ng/g LOD= 5 ng/g R=64% BE 25-10000 ng/g LOD= 5 ng/g CV interdía=8% R=21% Lewis98 COC Extracción con ácido acético/acetona SPE - LLOQ= 5 ng/g LOD= 2 ng/g CV intradía=0,67% CV interdía=12,1% BE LLOQ= 5 ng/g LOD= 2 ng/g CV intradía=2,99% CV interdía=19,4% Oyler109 COC BE Extracción con metanol SPE Columna HP-1 (12 m x 0,2 mm x 0,33 µm) Programa de temperaturas horno Temperatura inyector: 250ºC Temperatura línea transferencia: 295ºC Voltaje electromultiplicador: 200 mV Rango masas: 50-550 uma CV intradía (500 ng/g)<5% LOD<7,5 ng/g Detección de drogas en el embarazo 121 REF COMP PREPARACIÓN Y/O EXTRACCIÓN CONDICIONES GC-MS RESULTADOS DE VALIDACIÓN ElSohly124 BE Extracción con tampón fosfato potásico + cloroformo/ isopropanol LLE Columna DB-1 (10 m x 0,28 mm x 0,4 µm) Programa temperaturas horno Tiempo de análisis: 7 min r2=0,999 (50-500 ng/g) LOD= 50 ng/g LOQ= 50 ng/g CV intradía (100 ng/g)=1% CV interdía (350 ng/g)=1,7% R (100 ng/g)=33% MOR Extracción con tampón fosfato potásico + etil acetato LLE Columna DB-1 (10 m x 0,28 mm x 0,4 µm) Programa temperaturas horno Tiempo de análisis: 10 min r2=0,9998 (50-500 ng/g) LOD= 50 ng/g LOQ= 50 ng/g CV intradía (100 ng/g)=7% CV interdía (200 ng/g)=1,1% R (300 ng/g)=56% COD r2=0,9964 (50-500 ng/g) LOD= 50 ng/g LOQ= 50 ng/g CV intradía (100 ng/g)=8% CV interdía (200 ng/g)=4,1% R (300 ng/g)=64% 6-MAM r2=0,9964 (50-500 ng/g) LOD= 50 ng/g LOQ= 50 ng/g CV intradía (100 ng/g)=5% CV interdía (200 ng/g)=5,1% R (50 ng/g)=57% ElSohly125 COC Extracción con metanol SPE Gas portador: He (37,8 cm/s; 1,7 atm) Programa de temperaturas horno Columna DB-5 MS (25 m x 0,28 mm x 33 µm) Temperatura inyector: 250ºC (splitless) Temperatura interfase: 280ºC Voltaje electromultiplicador: 200-400V LOQ=25 ng/g R=65% BE LOQ=25 ng/g R=50% Introducción Detección de drogas en el embarazo 122 4.2.3 PREPARACIÓN Y TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS Antes de aplicar las técnicas cromatográficas anteriormente mencionadas se requiere un proceso de preparación y extracción de la muestra que va a ser analizada, esto es, una purificación de la misma para eliminar las posibles interferencias y para concentrar los analitos. Muestras como la orina no necesitan una preparación antes de la extracción, pero muestras más complejas como el pelo o el meconio sí la necesitan. En las tablas anteriores (4.2 y 4.3) se muestran los métodos de preparación y extracción más usualmente empleados en la detección de los compuestos de interés en muestras de pelo y meconio, respectivamente. Para el pelo, la mayoría de los laboratorios realizan una etapa previa de lavado, sin embargo, no hay consenso o uniformidad en los procedimientos. Los agentes más utilizados en el lavado son los detergentes como el champú, las soluciones de lavado quirúrgico, los surfactantes como dodecilsulfato de sodio 0,1%, el tampón fosfato, o los disolventes orgánicos como acetona, dietil éter, metanol, etanol, diclorometano, hexano o pentano de varios volúmenes para tiempos de contacto diferentes. En general se utiliza una sola etapa de lavado, aunque a veces se realiza un segundo lavado idéntico. Algunos autores sostienen que analizando la solución de lavado se demuestra que lavados sucesivos eliminan la contaminación externa17, sin embargo otros190 sostienen que no es posible eliminar totalmente dicha contaminación. Un método útil para distinguir entre ingestión activa de una droga y exposición pasiva es analizar los metabolitos en vez del compuesto original. La COC es una de las pocas drogas que es excretada primariamente a la vez que sus metabolitos. Muchas de las demás drogas de abuso son excretadas en forma de metabolitos, no encontrándose el compuesto original como producto de la excreción de la droga, por lo que habría que tomar en consideración la posibilidad de la exposición pasiva. Presumiblemente, si se encontrasen en el pelo los metabolitos de la COC, habría que asumir que el individuo había ingerido la droga. Pero esto es verdad sólo en parte ya que los tres metabolitos primarios de la COC (BE, EME y ECG) están presentes en sangre y son excretados en Detección de drogas en el embarazo 123 orina en cantidades variables que difieren según los individuos; sin embargo, estos metabolitos pueden también ser formados por hidrólisis básica in vitro189. Después de la descontaminación, la muestra de pelo puede ser pulverizada en un molino de bolas o cortada en segmentos antes del paso de hidrólisis, o disuelta en un medio alcalino (NaOH) para mejorar la solubilización de las drogas. Existen muchos procedimientos de hidrólisis utilizando diferentes sustancias (ácidos, bases, enzimas, etc.), sin embargo, es necesario elegir en cada caso el procedimiento adecuado. Una vez hidrolizado el pelo, las drogas son extraídas del líquido de hidrólisis utilizando diversas técnicas. La más empleada es la extracción en fase sólida (SPE, Solid Phase Extraction), aunque otras técnicas como la extracción líquido-líquido (LLE, Liquid-Liquid Extraction), la extracción con fluidos supercríticos (SFE, Subcritical Fluid Extraction) y la microextracción en fase sólida (SPME, Solid Phase MicroExtraction) también son utilizadas. En cuanto al meconio, en general éste es homogeneizado en un solvente orgánico, como el metanol o el acetonitrilo, en una mezcla de solventes, como acético/acetona y cloroformo/isopropanol o en un tampón, para ayudar a distribuir la droga en toda la matriz y pueda ser analizado mediante una técnica de screening estándar. Sin embargo, es difícil alcanzar los niveles de detección necesarios para un análisis válido sin alguna forma de extracción de las drogas de la matriz debido a la inferencia de la pigmentación y la turbidez del extracto, sobre todo cuando se utiliza detección enzimática o fluorescente. Por este motivo, algunos autores optan por utilizar la LLE o la SPE (más habitual) a continuación de la homogenización del meconio. La elección de un procedimiento de extracción adecuado es clave en el desarrollo de cualquier método analítico. En esta Tesis, tras probar distintos procedimientos, se ha elegido la SPE como procedimiento de extracción de las muestras de pelo y meconio (previamente preparadas). La SPE ha demostrado ser una herramienta eficaz en la eliminación de las interferencias de la matriz, permitiendo métodos de análisis sensibles, selectivos y robustos. Además permite el enriquecimiento de los analitos seleccionados sin concentrar las interferencias, lo cual es muy importante en el caso de las matrices de estudio, donde los compuestos de interés están presentes en niveles bajos. Introducción Detección de drogas en el embarazo 130 57. Burke MS, Roth D. Anonymous cocaine screening in a private obstetric population. Obstet Gynecol 81(3) (1993) 354-356. 58. 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Introducción Aplicación a muestras de vello púbico materno y cabello del recién nacido 222 8.3.2 RELACIÓN ENTRE LOS RESULTADOS POSITIVOS Y NEGATIVOS EN LA MADRE Y EL RECIÉN NACIDO Se ha establecido también una relación entre las muestras de vello púbico materno y las de cabello del recién nacido en función de si los resultados de screening y/o confirmación han sido positivos o negativos para cada uno de los analitos estudiados. En este caso se han incluido en el estudio todas las muestras de Obstetricia y Neonatología analizadas y se ha establecido la relación que se observa en la Tabla 8.6. Tabla 8.6. Relación de positivos y negativos en la madre y en el recién nacido. M + / RN + M - / RN - M + / RN - M - / RN + COC 9/9 60/60 6/6 2/2 BE 9/9 62/62 6/6 0/0 COD 0/0 74/74 3/3 0/0 MOR 1/1 74/74 2/2 0/0 6-MAM 1/1 74/47 2/2 0/0 En la Figura 8.18 se puede observar la representación gráfica de la distribución porcentual de los cinco compuestos analizados en función de la relación de positivos y negativos en la madre y el recién nacido en la población total. Figura 8.18. Distribución porcentual de los cinco analitos estudiados en función de la relación de positivos y negativos en la madre y el recién nacido. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% M + / RN + M - / RN - M + / RN - M - / RN + COC 12% 78% 8% 3% BE 12% 80% 8% 0% COD 0% 96% 4% 0% MOR 1% 96% 3% 0% 6-MAM 1% 96% 3% 0% Aplicación a muestras de vello púbico materno y cabello del recién nacido 223 8.3.3 RELACIÓN ENTRE EL CONSUMO MATERNO Y LAS POSIBLES ALTERACIONES EN EL RECIÉN NACIDO En 7 recién nacidos de Neonatología se han observado alteraciones clínicas perinatales (N1-N7). La distribución porcentual de las patologías encontradas en estos 7 recién nacidos se representa en la Figura 8.19. El NAS ha sido la manifestación clínica más frecuentemente encontrada (6). Otras patologías como bajo peso al nacer (4), parto prematuro (2) y crecimiento intrauterino retardado (cir, 2) también han sido encontradas aunque en menor proporción. Figura 8.19. Representación gráfica de las patologías encontradas en los 7 recién nacidos de Neonatología. 0% 20% 40% 60% 80% 100% cir Prematuros Bajo peso NAS 29% 29% 57% 86% Experimental Aplicación a muestras de vello púbico materno y cabello del recién nacido 224 8.3.4 INCIDENCIA DEL CONSUMO DE COCAÍNA Y OPIOIDES EN EL EMBARAZO La incidencia del consumo de COC y opioides observada en este estudio para las dos poblaciones y las dos matrices analizadas se resume en la siguiente tabla. Tabla 8.7. Incidencia del consumo de COC y opioides en el embarazo. OBSTETRICIA NEONATOLOGÍA Vello púbico Cabello Vello púbico Cabello COC 8% 8% 41% 29% OPIOIDES 0% 0% 0% 0% COC+OPIOIDES 3% 2% 6% 0% Aplicación a muestras de vello púbico materno y cabello del recién nacido 225 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Tabernero MJ, Bermejo AM, Fernández P. Analysis of opiates and cocaine by RIA and GC-MS: distribution of their metabolites in urine and hair from drug addicts. Addict Biol 4(4) (1999) 421-428. 2. Bermejo-Barrera P, Moreda-Piñeiro A, Bermejo-Barrera A, Bermejo-Barrera AM. Application of multivariate methods to scalp hair metal data to distinguish between drug-free subjects and drug abusers. Anal Chim Acta 455(2) (2002) 253-265. Experimental Capítulo Experimental: Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS Capítulo 9. Experimental: Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 9.1 EXTRACCIÓN CON WATERS OASIS® HLB ................................................. 233 9.1.1 MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................... 233 9.1.1.1 INSTRUMENTACIÓN .................................................................... 233 9.1.1.1.1 INSTRUMENTACIÓN PARA LA PREPARACIÓN Y EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA........................................................................................... 233 9.1.1.1.2 INSTRUMENTACIÓN ANALÍTICA ............................................ 234 9.1.1.1.2.1 CROMATÓGRAFO DE GASES .......................................... 234 9.1.1.1.2.2 ESPECTRÓMETRO DE MASAS ......................................... 234 9.1.1.1.2.3 SOPORTE INFORMÁTICO ............................................... 234 9.1.1.2 MATERIAL DE LABORATORIO ...................................................... 234 9.1.1.3 REACTIVOS ................................................................................ 235 9.1.1.4 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES ............................................... 236 9.1.1.4.1 PREPARACIÓN DE TAMPONES Y SOLUCIONES ....................... 236 9.1.1.4.2 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES MADRE ............................. 236 9.1.1.4.3 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES DE TRABAJO .................... 236 9.1.1.5 CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES .......................... 237 9.1.1.6 CONDICIONES DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS ......................... 237 9.1.1.7 RECOGIDA Y RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS ............................... 238 9.1.1.8 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS .............................................. 238 9.1.1.8.1 PREPARACIÓN ...................................................................... 238 9.1.1.8.2 PROCESO DE EXTRACCIÓN ................................................... 238 9.1.1.8.3 DERIVATIZACIÓN ................................................................. 239 9.1.1.9 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ......................................................... 239 9.1.1.9.1 SELECTIVIDAD ..................................................................... 239 9.1.1.9.2 MODELO DE CALIBRACIÓN (LINEALIDAD) ............................. 239 9.1.1.9.3 LÍMITES ............................................................................... 240 9.1.1.9.4 PRECISIÓN .......................................................................... 240 9.1.1.9.5 EXACTITUD .......................................................................... 240 9.1.1.9.6 RENDIMIENTO ..................................................................... 240 9.1.1.10 APLICACIÓN A CASOS REALES ................................................ 241 9.1.2 RESULTADOS ..................................................................................... 241 9.1.2.1 CONDICIONES DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS ........................ 241 9.1.2.2 SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA ................................................ 242 9.1.2.3 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN ............................................... 243 9.1.2.3.1 SELECTIVIDAD .................................................................... 243 9.1.2.3.2 LINEALIDAD, LÍMITES, PRECISIÓN, EXACTITUD Y RENDIMIENTO... .................................................................................... 244 9.1.2.4 APLICACIÓN A CASOS REALES .................................................... 247 9.2 EXTRACCIÓN CON BOND ELUT CERTIFY® ............................................... 247 9.2.1 MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................... 247 9.2.1.1 INSTRUMENTACIÓN ................................................................... 247 9.2.1.1.1 INSTRUMENTACIÓN PARA LA PREPARACIÓN Y EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA .......................................................................................... 247 9.2.1.1.2 INSTRUMENTACIÓN ANALÍTICA ........................................... 248 9.2.1.1.2.1 CROMATÓGRAFO DE GASES .......................................... 248 9.2.1.1.2.2 ESPECTRÓMETRO DE MASAS ........................................ 248 9.2.1.1.2.3 SOPORTE INFORMÁTICO .............................................. 248 9.2.1.2 MATERIAL DE LABORATORIO ..................................................... 249 9.2.1.3 REACTIVOS ................................................................................ 249 9.2.1.4 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES .............................................. 250 9.2.1.4.1 PREPARACIÓN DE TAMPONES Y SOLUCIONES ....................... 250 9.2.1.4.2 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES MADRE ............................ 251 9.2.1.4.3 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES DE TRABAJO .................... 251 9.2.1.5 CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO DE GASES Y DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS ....................................................................... 251 9.2.1.6 RECOGIDA Y RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS .............................. 252 9.2.1.7 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS .............................................. 252 9.2.1.7.1 PREPARACIÓN ..................................................................... 252 9.2.1.7.2 PROCESO DE EXTRACCIÓN .................................................. 252 9.2.1.7.3 DERIVATIZACIÓN ................................................................ 253 9.2.1.8 VALIDACIÓN DEL MÉTODO ......................................................... 253 9.2.1.8.1 SELECTIVIDAD .................................................................... 253 9.2.1.8.2 MODELO DE CALIBRACIÓN (LINEALIDAD) ............................. 253 9.2.1.8.3 LÍMITES ............................................................................... 254 9.2.1.8.4 PRECISIÓN .......................................................................... 254 9.2.1.8.5 EXACTITUD .......................................................................... 254 9.2.1.8.6 RENDIMIENTO ..................................................................... 254 9.2.1.9 APLICACIÓN A CASOS REALES .................................................... 255 9.2.2 RESULTADOS ...................................................................................... 255 9.2.2.1 CONDICIONES DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS ......................... 255 9.2.2.2 SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA ................................................ 256 9.2.2.3 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN ................................................ 257 9.2.2.3.1 SELECTIVIDAD ..................................................................... 257 9.2.2.3.2 LINEALIDAD, LÍMITES, PRECISIÓN, EXACTITUD Y RENDIMIENTO. ....................................................................................... 258 9.2.2.4 APLICACIÓN A CASOS REALES .................................................... 260 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 262 Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 238 9.1.1.7 RECOGIDA Y RECEPCIÓN DE LAS MUESTRAS Muestras blanco de meconio, necesarias para la realización de la validación del método analítico, han sido obtenidas de 8 bebés nacidos en el Hospital Clínico de Santiago de Compostela de los que se tenía absoluta certeza de que no habían sido expuestos a drogas durante el embarazo. La aplicabilidad del método se ha realizado en 30 muestras de meconio, también procedentes del Hospital Clínico y remitidas al Servicio de Toxicología del IUML de Santiago tras observarse una sospecha clínica de consumo de drogas durante el embarazo. Todas estas muestras correspondían al primer meconio obtenido del pañal del recién nacido durante las primeras 24 horas de vida de éste. La recogida de las mismas ha sido realizada por personal del hospital. Para su traslado al laboratorio las muestras han sido depositadas en botes plásticos e éstos introducidos en neveras. Una vez en el laboratorio, las muestras han sido adecuadamente identificadas y almacenadas a una temperatura de -20ºC hasta su análisis. 9.1.1.8 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS 9.1.1.8.1 PREPARACIÓN Las muestras de meconio han requerido una etapa de preparación previa a la extracción. Ésta ha sido realizada a partir de 0,5 g de meconio al que se le han añadido el PI (50 μL 10 μg/mL) y 3 mL de metanol. A continuación la mezcla fue agitada durante 20 minutos y centrifugada a 2000 rpm durante 10 minutos más. Finalmente la fase orgánica ha sido transferida a un tubo cónico y el disolvente evaporado a seco a 40ºC bajo una corriente de nitrógeno. 9.1.1.8.2 PROCESO DE EXTRACCIÓN El residuo seco fue a continuación disuelto en 1 mL de tampón borato (pH 9) y sometido al mismo proceso de SPE que el empleando para las muestras de pelo (véase apartado 7.1.8.3). Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 239 9.1.1.8.3 DERIVATIZACIÓN Los extractos fueron evaporados a seco a 40ºC bajo una suave corriente de nitrógeno y el extracto seco fue derivatizado empleado el mismo procedimiento que en las muestras de pelo (40 µL BSTFA-TMCS (99:1, v/v), 100ºC, 20 min). Después de enfriar la muestra a temperatura ambiente, 1 µL de ésta ha sido inyectada manualmente en el sistema cromatográfico. 9.1.1.9 VALIDACIÓN DEL MÉTODO La validación de este método ha sido realizada en base a los criterios establecidos por la FDA, la ICH y algunas revisiones, tal como se ha explicado en la validación del método del Capítulo 7. Los parámetros de validación estudiados han sido los que a continuación se indican. 9.1.1.9.1 SELECTIVIDAD La evaluación de la selectividad se realizó analizando el meconio de ocho recién nacidos de los que se tenía absoluta certeza de que no habían sido expuestos a drogas de abuso durante el embarazo (muestras blanco). 9.1.1.9.2 MODELO DE CALIBRACIÓN (LINEALIDAD) El modelo de calibración elegido ha sido el de mínimos cuadrados, elección basada en un examen visual de la curva de calibrado y un estudio de las residuales obtenidas aplicando el modelo. El estudio de la linealidad ha sido realizado preparando controles de calibrado con muestras blanco de meconio con concentraciones de 40, 200, 400, 1000, 1500 y 2000 ng/g (Tabla 9.1), las cuales fueron sometidas al proceso de tratamiento de muestra previamente descrito. Para cada concentración, seis controles de calibrado han sido preparados en días diferentes. Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 240 Tabla 9.1. Preparación de los controles de calibrado. 40 ng/g 200 ng/g 400 ng/g 1000 ng/g 1500 ng/g 2000 ng/g SOL. 0,8 µg/ml 25 µl - - - - - SOL. 2 µg/ml - 50 µl 100 µl - - - SOL. 5 µg/ml - - - - 150 µl - SOL. 10 µg/ml - - - 50 µl - 100 µl PI 10 µg/ml - - - 50 µl - - 9.1.1.9.3 LÍMITES El cálculo del LOD, LLOQ y el ULOQ ha sido realizado empíricamente analizando 5 replicados de muestras blanco de meconio con concentraciones decrecientes de los analitos de interés. 9.1.1.9.4 PRECISIÓN En el cálculo de la precisión se analizaron 5 replicados de una concentración el mismo día de análisis (precisión intradía) o en días distintos (precisión interdía). Se ha estudiado la precisión a tres niveles de concentración diferentes (LLOQ, ULOQ y un punto intermedio de la recta de calibración). 9.1.1.9.5 EXACTITUD En el cálculo de la exactitud se analizaron 5 replicados de una concentración el mismo día de análisis (exactitud intradía) o en días distintos (exactitud interdía) para tres niveles de concentración (LLOQ, ULOQ y un punto intermedio de la recta de calibración). 9.1.1.9.6 RENDIMIENTO En el cálculo del rendimiento se utilizaron 4 replicados para dos niveles de concentración (punto bajo y alto de la recta de calibración). Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 241 9.1.1.10 APLICACIÓN A CASOS REALES El método desarrollado ha sido aplicado a 30 muestras de meconio procedentes del Servicio de Neonatología del Hospital Clínico de Santiago de Compostela y remitidas al Servicio de Toxicología del IUML de Santiago tras observase una sospecha clínica de consumo de drogas durante el embarazo. La cuantificación de estas muestras se realizó con rectas de calibrado extraídas e inyectadas el mismo día que las muestras correspondientes. En el caso de muestras a concentraciones superiores al ULOQ, éstas fueron diluidas convenientemente y nuevamente analizadas. 9.1.2 RESULTADOS 9.1.2.1 CONDICIONES DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS La selección de iones para cada uno de los compuestos estudiados así como sus tiempos de retención y sus ventanas de detección se recogen en la siguiente tabla. Tabla 9.2. Selección de iones monitorizados para cada uno de los compuestos con sus ventanas de detección y sus respectivos tiempos de retención. Compuesto Ventana de detección (min) m/z seleccionadas* tr (min) COC 12,3-13,0 182, 198, 303 12,6 COC-d3 185, 201, 306 BE-TMS 13,0-14,5 240, 361 13,2 BE-TMS-d3 243, 364 COD-TMS 14,5-15,5 178, 234, 371 15,2 COD-TMS-d3 181, 237, 374 MOR-2TMS 15,5-16,2 236, 414, 429 15,7 MOR-2TMS-d3 239, 417, 432 6-MAM-TMS 16,2-18,1 287, 340, 399 16,6 6-MAM-TMS-d3 290, 343, 402 *El ión de cuantificación figura en negrita. Estos parámetros son prácticamente iguales que los del método descrito en el Capítulo 7 (véase Tabla 7.2). Existen pequeñas variaciones, por ejemplo en la ventana de detección de la COC y su respectivo derivado deuterado, que en el caso del meconio se Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 242 abre más tarde debido a que entre los 11,6 minutos (inicio de la ventana de detección de la COC en el método del pelo) y los 12,3 (inicio de la ventana en el caso del meconio) se observaban muchas interferencias en los cromatogramas que dificultaban el posterior análisis de los compuestos de interés. El criterio de selección de iones ha sido el mismo que el empleado en el caso de las muestras de pelo, sin embargo, para la mayoría de los analitos no se ha seleccionado como ión cuantificador el ión mayoritario debido a que este ión proporcionaba cromatogramas con muchas interferencias en las respectivas ventanas de detección de los analitos de interés, por lo que se optó por substituirlos por otros que causaran menos interferencias en el cromatograma. 9.1.2.2 SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA La separación cromatográfica fue realizada en las condiciones descritas en el apartado correspondiente de Material y Métodos. A través del programa cromatográfico empleado la separación de los compuestos se logró en menos de 17 minutos. En la Figura 9.2 se muestra el cromatograma en modo SIM del ión de cuantificación de cada uno de los compuestos analizados y sus respectivos derivados deuterados en una muestra blanco de meconio preparada a 400 ng/g. Como se puede observar, ninguno de los compuestos estudiados se solapa en el tiempo, por lo tanto la separación es completa (Resolución > 1). Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 243 Figura 9.2. Cromatograma en modo SIM del ión de cuantificación de cada uno de los compuestos estudiados y sus respectivos derivados deuterados en una muestra blanco de meconio preparada a 400 ng/g. 9.1.2.3 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN 9.1.2.3.1 SELECTIVIDAD En las ocho muestras blanco de meconio analizadas se comprobó que no existían interferencias con los analitos de interés, tanto para el ión de cuantificación como para el ión/iones de confirmación. La Figura 9.3 muestra el cromatograma en modo SIM de los iones de cuantificación de los compuestos analizados y sus respectivos derivados deuterados en una de las muestras blanco de meconio. Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 244 Figura 9.3. Cromatograma en modo SIM de los iones de cuantificación de los compuestos analizados y sus respectivos derivados deuterados en una muestra blanco de meconio. 9.1.2.3.2 LINEALIDAD, LÍMITES, PRECISIÓN, EXACTITUD Y RENDIMIENTO La linealidad de la relación de áreas compuesto/PI frente a la concentración teórica fue verificada en el método propuesto usando el modelo de mínimos cuadrados. Los coeficientes de regresión (r2) fueron superiores a 0,99 en todos los casos. El LOD observado para la COC, BE y COD fue de 30 ng/g, mientras que para la MOR y la 6-MAM fue de 20 ng/g. El LLOQ y el ULOQ, que se corresponden respectivamente con el valor inferior y superior de la recta de calibrado, fueron 40 y 2000 ng/g para todos los compuestos. Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 245 La precisión (intradía e interdía) expresada como CV y la exactitud (intradía e interdía) expresada como MRE, estudiadas ambas para el LLOQ (40 n/g), el ULOQ (2000 ng/g) y para un punto intermedio de la recta de calibrado (1000 ng/g), fueron menores del 15%, o del 20% en el caso del LLOQ, para todos los compuestos estudiados. El rendimiento del proceso de extracción calculado a dos valores de concentración intermedios (400 y 1000 ng/g), fue en todos los casos superior al 40%, variando éste entre el 44,19 y 85,57%. Los parámetros de validación obtenidos para cada uno de los compuestos han sido recogidos en la siguiente tabla. Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 246 Tabla 9.3. Principales parámetros de validación del método. Conc ng/g LOD ng/g LOQ ng/g Precisión y exactitud intradía (%) Precisión y exactitud interdía (%) R (%) LLOQ ULOQ CV MRE CV MRE COC 40 30 40 2000 18,28 7,000 15,75 9,318 400 53,91 1000 7,539 3,640 10,47 9,115 68,48 2000 2,510 2,620 4,194 1,772 Curva de calibración (n=6): A=0, B=0,00102±0,00004, r2=0,997±0,003 BE 40 30 40 2000 8,177 14,79 12,62 19,89 400 44,19 1000 4,781 11,16 5,815 5,832 61,08 2000 11,12 1,775 4,484 1,458 Curva de calibración (n=6): A=0, B=0,00118±0,00004, r2=0,993±0,004 COD 40 30 40 2000 19,57 0,500 9,898 16,83 400 65,11 1000 8,682 3,560 9,601 0,787 80,73 2000 7,633 4,883 5,188 5,840 Curva de calibración (n=6): A=0, B=0,0005±0,0001, r2=0,993±0,004 MOR 40 20 40 2000 3,331 18,91 6,689 13,13 400 54,24 1000 5,156 2,520 3,874 3,617 54,10 2000 3,086 3,312 5,753 1,612 Curva de calibración (n=6): A=0, B=0,0016±0,0001, r2=0,993±0,006 6- MAM 40 20 40 2000 7,032 18,57 14,04 22,59 400 62,25 1000 9,024 2,575 12,19 6,214 87,57 2000 1,243 3,475 3,561 0,613 Curva de calibración (n=6): A=0, B=0,0008±0,0001, r2=0,995±0,003 Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 247 9.1.2.4 APLICACIÓN A CASOS REALES Los resultados de GC-MS obtenidos para las 10 muestras de meconio positivas se muestran en la Tabla 9.4. Tabla 9.4. Resultados GC-MS de las 10 muestras de meconio positivas. Muestra Concentración (ng/g) COC BE COD MOR 6-MAM 1 985,9 780,4 - - - 2 785,4 572,9 154,3 325,7 232,4 3 754,3 452,5 - - - 4 525,3 321,4 600,4 825,3 1350 5 639,8 216,0 - - - 6 1259 954,8 235,7 125,6 264,6 7 743,9 864,0 - - - 8 1864 1594 124,7 214,3 893,3 9 45,38 50,12 - - - 10 227,0 126,4 60,95 124,9 100,9 De las 30 muestras analizadas, la COC y la BE en solitario han sido detectadas en 5 casos (17%) y asociadas a los opioides de estudio en otros 5 casos (17%). 9.2 EXTRACCIÓN CON BOND ELUT CERTIFY® El trabajo que a continuación se detalla ha sido publicado2 y dicha publicación se anexa al final de este capítulo. 9.2.1 MATERIAL Y MÉTODOS 9.2.1.1 INSTRUMENTACIÓN 9.2.1.1.1 INSTRUMENTACIÓN PARA LA PREPARACIÓN Y EXTRACCIÓN DE LA MUESTRA 9 Balanza analítica digital BP61S (Sartorious ® ). 9 Vórtex Reax 2000 (Heidolph ® ). 9 Centrífuga de sobremesa analógica Mixtasel (Selecta ® ). Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 254 El estudio de la linealidad ha sido realizado preparando controles de calibrado con muestras blanco de meconio con concentraciones de 20, 100, 200, 500 y 1000 ng/g (Tabla 9.5), las cuales fueron sometidas al proceso de tratamiento de las muestras previamente descrito. Para cada concentración, seis controles de calibrado han sido preparados en días diferentes. Tabla 9.5. Preparación de los controles de calibrado. 20 ng/g 100 ng/g 200 ng/g 500 ng/g 1000 ng/g SOL. 0,2 µg/ml 50 µl - - - - SOL. 0,5 µg/ml - 100 µl - - - SOL. 2 µg/ml - - 50 µl - - SOL. 5 µg/ml - - - 50 µl 100 µl PI 10 µg/ml - - - - 50 µl 9.2.1.8.3 LÍMITES El cálculo del LOD, LLOQ y el ULOQ ha sido realizado empíricamente analizando 5 replicados de muestras blanco de meconio con concentraciones decrecientes de los analitos de interés. 9.2.1.8.4 PRECISIÓN En el cálculo de la precisión se analizaron 5 replicados de una concentración el mismo día de análisis (precisión intradía) o en días distintos (precisión interdía). Se ha estudiado la precisión a tres niveles de concentración diferentes (LLOQ, ULOQ y un punto intermedio de la recta de calibración). 9.2.1.8.5 EXACTITUD En el cálculo de la exactitud se analizaron 5 replicados de una concentración el mismo día de análisis (exactitud intradía) o en días distintos (exactitud interdía), para tres niveles de concentración (LLOQ, ULOQ y un punto intermedio de la recta de calibración). 9.2.1.8.6 RENDIMIENTO En el cálculo del rendimiento se utilizaron 4 replicados para dos niveles de concentración (punto bajo y alto de la recta de calibración). Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 255 9.2.1.9 APLICACIÓN A CASOS REALES El método desarrollado ha sido aplicado a 3 muestras consecutivas del meconio (1er, 2o y 3er día post-nacimiento) de un recién nacido con síntomas de hiperexcitabilidad, en cuya madre había sido confirmado el consumo de drogas mediante la técnica EMIT en el propio hospital. La cuantificación de estas muestras se realizó con rectas de calibrado extraídas e inyectadas el mismo día que las muestras correspondientes. En el caso de muestras a concentraciones superiores al ULOQ, éstas fueron diluidas convenientemente y nuevamente analizadas. Junto con las muestras de meconio también han sido remitidas al Servicio de Toxicología del IUML de Santiago, muestras consecutivas de la orina (14, 34, 60, 80 y 103 horas) del recién nacido. Estas muestras han sido analizadas siguiendo procedimientos ya estandarizados en nuestro laboratorio3. Se realizó un cribado previo mediante el enzimoinmunoensayo COBAS y solamente en los casos en los que el cribado fue positivo a BE y/o MOR se realizó la confirmación y cuantificación mediante GC-MS. 9.2.2 RESULTADOS 9.2.2.1 CONDICIONES DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS La selección de iones para cada uno de los compuestos estudiados así como sus tiempos de retención y sus ventanas de detección se recogen en la siguiente tabla. Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 256 Tabla 9.6. Selección de iones monitorizados para cada uno de los compuestos con sus ventanas de detección y sus respectivos tiempos de retención. Compuesto Ventana de detección (min) m/z seleccionadas* tr (min) COC 13,1-14,2 182, 198, 303 13,8 COC-d3 185, 201, 306 BE-TMS 14,2-16,6 240, 361 14,9 BE-TMS-d3 243, 364 COD-TMS 16,6-18,8 178, 234, 371 17,9 COD-TMS-d3 181, 237, 374 MOR-2TMS 18,8-19,8 236, 414, 429 18,9 MOR-2TMS-d3 239, 417, 432 6-MAM-TMS 19,8-22,7 287, 340, 399 20,5 6-MAM-TMS-d3 290, 343, 402 *El ión de cuantificación figura en negrita. Tal como se observa en la tabla, los iones seleccionados han sido los mismos que en el método anteriormente descrito (véase Tabla 9.2). Existen pequeñas variaciones en las ventanas de detección que se deben sobre todo a las tareas de mantenimiento del cromatógrafo: limpieza, cambios en la columna (desgaste, ligeras variaciones en su longitud…). 9.2.2.2 SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA La separación cromatográfica fue realizada en las condiciones descritas en el apartado correspondiente de Material y Métodos. A través del programa cromatográfico empleado la separación de los compuestos se logró en menos de 21 minutos. En la Figura 9.4 se muestra el cromatograma en modo SIM del ión de cuantificación de cada uno de los compuestos analizados y sus respectivos derivados deuterados en una muestra blanco de meconio preparada a 1000 ng/g. Como se puede observar, ninguno de los compuestos estudiados se solapa en el tiempo, por lo tanto la separación es completa (Resolución > 1). Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 257 Figura 9.4. Cromatograma en modo SIM del ión de cuantificación de cada uno de los compuestos analizados y sus respectivos derivados deuterados en una muestra de meconio preparada a 1000 ng/g. 9.2.2.3 RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN 9.2.2.3.1 SELECTIVIDAD En las ocho muestras blanco de meconio analizadas se comprobó que no existían interferencias con los analitos de interés, tanto para el ión de cuantificación como para el ión/iones de confirmación. La Figura 9.3 muestra el cromatograma en modo SIM de los iones de cuantificación de los compuestos analizados en una de las muestras blanco de meconio. Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 258 Figura 9.5. Cromatograma en modo SIM de los iones de cuantificación de los compuestos analizados en una muestra blanco de meconio. 9.2.2.3.2 LINEALIDAD, LÍMITES, PRECISIÓN, EXACTITUD Y RENDIMIENTO La linealidad de la relación de áreas compuesto/PI frente a la concentración teórica, fue verificada en el método propuesto usando el modelo de mínimos cuadrados. Los coeficientes de regresión (r2) fueron superiores a 0,99 en todos los casos. El LOD observado para la COC y la COD fue de 5 ng/g, mientras que para la BE, MOR y 6-MAM fue de 10 ng/g. El LLOQ y el ULOQ, que se corresponden respectivamente con el valor inferior y superior de la recta de calibrado, fueron 20 y 1000 ng/g para todos los compuestos. La precisión (intradía e interdía) expresada como CV y la exactitud (intradía e interdía) expresada como MRE, estudiadas ambas para el LLOQ (20 n/g), el ULOQ (1000 ng/g) y para un punto intermedio de la recta de calibrado (500 ng/g), fueron menores del 15%, o del 20% en el caso del LLOQ, para todos los compuestos estudiados. El rendimiento del proceso de extracción calculado a dos valores de concentración intermedios (200 y 500 ng/g), fue en todos los casos superior al 40%, variando éste entre el 40,14 y 72,84%. Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 259 Los parámetros de validación obtenidos para cada uno de los compuestos han sido recogidos en la siguiente tabla. Tabla 9.7. Principales parámetros de validación del método. Conc ng/g LOD ng/g LOQ ng/g Precisión y exactitud intradía (%) Precisión y exactitud interdía (%) R (%) LLOQ ULOQ CV MRE CV MRE COC 20 5 20 1000 18,15 19,54 20,84 12,17 200 40,65 500 2,989 6,486 5,372 6,157 44,92 1000 5,422 9,263 1,129 1,380 Curva de calibración (n=6): A=0,007±0,003, B=1,523±0,081, r2=0,996±0,002 BE 20 10 20 1000 14,77 14,08 11,40 10,12 200 40,14 500 2,981 7,167 2,931 7,500 42,30 1000 5,667 7,357 0,598 1,564 Curva de calibración (n=6): A=0,018±0,011, B=1,970±0,039, r2=0,996±0,002 COD 20 5 20 1000 16,09 20,13 6,279 4,810 200 57,80 500 3,765 2,268 6,277 2,482 72,84 1000 5,729 9,358 1,582 0,465 Curva de calibración (n=6): A=0,083±0,008, B=1,274±0,050, r2=0,997±0,002 MOR 20 10 20 1000 8,155 17,52 15,05 23,74 200 60,67 500 3,554 4,567 7,290 5,527 59,45 1000 6,084 11,25 1,468 1,380 Curva de calibración (n=6): A=0,014±0,008, B=1,932±0,080, r2=0,996±0,003 6- MAM 20 10 20 1000 17,33 16,70 20,36 4,357 200 40,30 500 3,224 4,141 5,454 4,031 44,34 1000 6,046 10,52 1,347 0,922 Curva de calibración (n=6): A=0,010±0,006, B=1,155±0,058, r2=0,997±0,002 Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 260 9.2.2.4 APLICACIÓN A CASOS REALES En la Tabla 9.8 se muestran los resultados de screening de las muestras consecutivas de orina del recién nacido analizadas mediante COBAS. La cuantificación de las dos orinas con screening positivo indicó la presencia de COC, BE, COD y MOR en ambas muestras, siendo la concentración de BE mayor que la concentración de COC, y la concentración de COD mayor que la concentración de MOR. Tabla 9.8. Resultados del screening mediante COBAS de las muestras de orina del recién nacido. Hora BE MOR 14 + + 34 + + 60 - - 80 - - 103 - - Los resultados de GC-MS obtenidos para las 3 muestras de meconio analizadas han sido representados en un gráfico (Figura 9.6). En éste se puede observar la evolución de la distribución de las sustancias estudiadas en las muestras de meconio los días consecutivos al nacimiento. Los resultados demuestran la existencia de COC, BE, COD y MOR en los meconios del primer y segundo día, siendo, en ambos casos, la BE y la COD los compuestos mayoritarios. En el meconio del tercer día, las concentraciones de los compuestos estudiados fueron nulas. Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 261 Figura 9.6. Resultados GC-MS de las muestras de meconio consecutivas. Día 1 Día 2 Día 3 COD 1870 691 0 BE 974 264 0 MOR 304 136 0 COC 224 6 0 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 Concentración (ng/g) Experimental Determinación de cocaína y opioides en meconio por GC-MS 262 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. López P, Bermejo AM, Tabernero MJ, Fernández P, Alvarez I,. Determination of cocaine and heroin with their respective metabolites in meconium by gas chromatography-mass spectrometry. J Appl Toxicol 27(5) (2007) 464-471. 2. López P, Bermejo AM, Tabernero MJ, Cabarcos P, Alvarez I, Fernandez P. Cocaine and opiates use in pregnancy: detection of drugs in neonatal meconium and urine. J Anal Toxicol 33(7) (2009) 351- 355. 3. Álvarez I, Palos F, Bermejo AM, Fernández P, Tabernero MJ. Simultaneous determination of methadone, heroin, cocaine and their metabolites in urine using GC–MS. Anal Lett 39(7) (2006) 1393–1399. Anexos COCAINE IN MECONIUM BY GC-MS 469 Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2007; 27: 464–471 DOI: 10.1002/jat Table 3. Precision and accuracy obtained for analytes under investigation Intra-batch study (n = 5) Inter-batch study (n = 6) Concentration added C.V. Relative mean error C.V. Relative mean error (ng g−1) (%) (%) (%) (%) Cocaine 40 12.8 9.50 15.7 9.31 200 — — 12.1 7.95 400 — — 12.1 13.1 1000 7.56 3.64 10.3 9.11 1500 — — 4.07 0.80 2000 2.54 2.66 4.19 1.75 BE 40 8.16 14.8 12.6 19.9 200 — — 10.6 4.65 400 — — 9.97 1.55 1000 4.78 11.1 5.90 13.8 1500 — — 4.86 4.93 2000 11.1 1.75 4.48 1.45 Codeine 40 20.5 7.50 9.90 16.8 200 — — 9.22 14.9 400 — — 10.7 1.02 1000 7.71 2.80 10.7 0.79 1500 — — 11.0 3.52 2000 7.63 4.90 5.80 5.84 Morphine 40 3.33 18.9 6.69 13.1 200 — — 8.89 13.6 400 — — 9.45 6.87 1000 5.17 2.51 6.62 4.24 1500 — — 9.55 4.13 2000 3.08 3.30 5.54 2.45 6AM 40 7.02 18.6 11.8 19.1 200 — — 6.78 13.8 400 — — 10.3 5.65 1000 9.01 2.59 11.7 1.90 1500 — — 5.90 1.40 2000 1.25 3.50 4.62 2.00 These findings are in accordance with those reported by some authors, which found cocaine and 6AM as the most relevant analytes to indicate exposure to these illicit drugs (Pichini et al., 2005). Concerning opiates, the high concentration of 6AM in meconium samples confirmed heroin consumption and excluded, in the majority of cases, the use of over the counter anti-tussive, analgesic or anti-diarrhoeal preparations containing opiate-derivates. Conclusions The GC-MS method to analyse cocaine and opiates in meconium reported in this paper was validated in the range 40–2000 ng g−1, according to internationally acceptance criteria (Pichini et al., 2003). The method consists of sample preparation by liquid and solid-phase extraction, followed by chromatographic separation and detection in SIM mode, and it proved to be sensitive Table 4. Recovery of analytes under investigation Concentration Mean recovery CV Analyte n(ng g−1)(%)(%) Cocaine 4 400 52.8 9.43 1000 68.3 7.45 BE 4 400 42.1 15.0 1000 60.9 4.78 Codeine 4 400 64.6 2.25 1000 82.4 12.4 Morphine 4 400 53.8 4.24 1000 54.0 5.15 6AM 4 400 61.1 11.0 1000 87.4 14.2 470 P. LOPEZ ET AL. Copyright © 2007 John Wiley & Sons, Ltd. J. Appl. Toxicol. 2007; 27: 464–471 DOI: 10.1002/jat Figure 3. SIM chromatogram of an extract of sample 4 containing 525.3 ng g−1 cocaine, 321.4 ng g−1 BE, 600.4 ng g−1 codeine, 825.3 ng g−1 morphine and 1350 ng g−1 6AM. This figure is available in colour online at www.interscience.wiley.com/journal/jat analysis of the major metabolites of cocaine in meconium. J. Anal. Toxicol. 23: 446–451. Food and Drug Administration: U.S. Department of Health and Human Services, Guidance for Industry, Bioanalytical Method Validation. FDA [document on line] [cited 21 January 2003]. Available from URL: http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.pdf. Franke JP, de Zeeuw RA. 1998. Solid-phase extraction procedures in systematic toxicological analysis. J. Chromatogr. B 713: 51–59. Franssen RME, Stolk LML, wan der Brand W, Smith BJ. 1994. Analysis of morphine and amphetamine in meconium with immunoassay and HPLC-diode array detection. J. Anal. Toxicol. 18: 294–295. Howe T, Tsushima JH, Batra KK. 1994. 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After it was confirmed in the hospital that the mother had consumed drugs during pregnancy using an enzyme multiplied immunoassay technique, samples of the newborn’s urine and meconium were sent to our laboratory to observe the evolution in the distribution of cocaine and opiates during the days following birth. For urine analysis, screening was done with an immunoassay technique, and the confirmation was done by gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) according to a published method. A GC–MS method for simultaneous analysis of cocaine, benzoylecgonine, codeine, morphine, and 6-acetylmorphine in meconium is described. GC–MS confirmation of urine and meconium results showed consumption of cocaine and codeine during pregnancy and also showed the levels of drugs gradually declined, totally disappearing by the third day. Introduction Maternal cocaine use during pregnancy is a significant public health problem. The number of pregnant women using cocaine in society is increasing. This is a result of the increase of cocaine use in the general population due to the easy of availability of inexpensive cocaine, its addictive quality, and society’s permissive attitude towards substance abuse in general. Prenatal cocaine use is a serious problem in our society. Cocaine use in pregnancy is associated with obstetric complications to the mother, fetus and newborn. These effects depend on the dose, duration of drug ingestion and gestational age. Maternal complications of cocaine use in pregnancy include placental abruption (1–7), preterm labor (4,5,8), and death (2,5). Complications to the fetus include spontaneous abortion (4,5,8), congenital malformation (4,5,9), intrauterine growth restriction (IUGR) (2,4,5,10,11), abnormal CTG tracing (5), preterm delivery (4,5,11,12), and stillbirth (4,5). Effects on the newborn can include meconium stained liquor (5,10) and neonatal abstinence syndrome (NAS) (5,8), nevertheless the presence of NAS after cocaine use is less clear than after opiate use, with neurobehavioral abnormalities appearing 2-3 days after birth (10). Consumption of other substances of abuse such as alcohol, heroin or tobacco together with cocaine may act synergistically to worsen the adverse effects of cocaine on the newborn, fetus and mother. Various studies have documented that cocaine users during pregnancy are more likely than non-users to use other drugs, such as tobacco, alcohol and other substances of abuse (13). It is frequently difficult to obtain trustworthy information about the consumption of toxic substances during pregnancy. For this reason, the suspicion is often clinical and must be confirmed through biological matrices analysis. A newborn’s urine analysis helps identify some drug-exposed newborns, but not all. Detection of drugs in urine is only useful if exposure occurred in the last 3–7 days prior to delivery (11). Meconium is an optimal matrix for identifying in uterus exposure as it is considered to be static once deposited in the fetal intestine, thus being a preserved record of the ultimate exposure by the fetus (14). In spite of increased sample preparation time relative to blood and urine, meconium’s the long metabolite history, coupled with the ease and wide window of collection make meconium the ideal matrix for determining fetal drug use. Acid and methanolic extractions developed for immunoassays can be used to extract cocaine, opiates and metabolites from meconium with varying degrees of success (15–17). However, other extraction procedures with much higher sensitivity and lower limit of detection (LOD) have been development for gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS) (18) and high-performance liquid chromatography (HPLC) (19). Cocaine crosses the placental barrier by passive diffusion (20). Review of the literature shows several reports dealing with the analysis of meconium specimens for cocaine and/or opiates using different immunoassays (17–19,21–25). Confirmation of the presence of these analytes was carried out by techniques such as thin-layer chromatography (TLC) (26), HPLC (20,25), or GC–MS (20,23,27). The aim of this work was to validate a method that allows the determination of cocaine, benzoylecgonine (BE), codeine, morphine and 6-acetylmorphine (6AM) in meconium samples and to apply this method to meconium samples obtained the first three days of the birth of a newborn with symptoms of Cocaine and Opiates Use in Pregnancy Reproduction (photocopying) of editorial content of this journal is prohibited without publisher’s permission. Journal of Analytical Toxicology, Vol. 33, September 2009 * Author to whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]. P. López*, A.M. Bermejo, M.J. Tabernero, P. Cabarcos, I. Álvarez, and P. Fernández Institute of Legal Medicine, Forensic Toxicology Service, Faculty of Medicine, University of Santiago de Compostela, San Francisco, s/n, 15782, Santiago de Compostela, Spain Abstract hyperexcitability. With the same purpose, the newborn’s urine will also be analyzed with a previously published method (26) after a screening test. Experimental Reagents Methanol, acetonitrile, hexane and dicloromethane from Merck ® (Darmstadt, Germany) were gradient grade solvents. Cocaine, BE, codeine, morphine, and 6AM were purchased from Lipomed ® (Mundolsheim Cédex, France), and their respective deuterated-labeled analogues, cocaine-d 3 ,BE-d 3 , codeine-d 3 , morphine-d 3 ,6AM-d 3 solutions were purchased from Cerilliant ® (Round Rock, TX). KH 2 PO 4 ,Na 2 HPO 4 , C 2 H 3 O 2 Na, CH 3 COOH, ethyl acetate, 2-propanol, NH 4 OH, trimethylclorosilane (TMCS), and N,O-bis-trimethylsilyl-tri- fluoroacetamide (BSTFA) were obtained from Merck ® (Darmstadt, Germany). Sample specimens Urine (14, 34, 60, 80, and 103 h) and meconium (first, second, and third day) of a newborn with symptoms of hyperexcitability were sent to our laboratory the days following birth proceeding of the Clinical Hospital of Santiago de Compostela (Spain) to observe the evolution in the distribution of cocaine and opiate. Drug consumption in pregnancy was tested previously in the hospital in mother´s urine by Enzyme Multiplied Immunoassay Technnique (EMIT). Apparatus Screening tests were carried out on COBAS INTEGRA 400 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) and GC–MS analysis on a Hewlett-Packard ® 6890 series GC equipped with a mass selective detector Hewlett-Packard ® 5973 Inert (Agilent Technologies, Spain). Analysis of urine samples by COBAS and GC–MS A previous screening of urine samples have done using the immunoassay COBAS. Posterior the confirmation was done to each sample applying a method previously published for our laboratory (26) consisting in a liquid–liquid extraction with Toxitubes A followed by GC–MS analysis. Analysis of meconium samples by GC–MS Extraction Meconium (0.5 g) with the I.S. (50 μL, 10 ng/μL) was transferred into 25-mL screw-capped glass tubes and 4 mL of methanol were added. The samples were shaken for 10 min. After centrifugation at 2000 rpm for 10 min the organic layer was dried under nitrogen. The dried extracts were then dissolved in 2 mL phosphate buffer pH 6 and applied on a Bond Elut solid-phase extraction (SPE) column (130 mg, 3 mL), which had been preconditioned with 3 mL of methanol followed by 3 mL of distilled water and 2 mL phosphate buffer pH 6. The cartridge was then washed with 3 mL of distilled water, 1 mL of sodic acetate buffer (pH 4), 3 mL of ethyl acetate/hexane (1:1) and finally 3 mL of methanol. The analytes were eluted with 3 mL of dicloromethane/2-propanol (80:20) +2%NH 4 OH, and the eluent was evaporated to dryness under a gentle nitrogen stream. Derivatization A 40-μL volume of BSTFA/TMCS (99:1) was added to the dried extracts. The tubes were tightly closed, vortex mixed (10 s), and heated at 100ºC for 20 min. And finally, after cooling at room temperature, 1 μL was injected into the GC. GC–MS analysis GC conditions. A 30 m × 250 μm HP-5 column (0.25 μm film thickness) was operated with a temperature program of 90ºC (1 min) to 190ºC (1 min) at 30ºC/min, then to 260ºC (4 min) at 8ºC/min and finally to 290ºC (10 min). Helium was used as a carrier gas at a flow rate of 1 mL/min. The injector was maintained at 240ºC and operated for 2 min in splitless mode. MS conditions. The mass selective detector was kept at 300ºC, the ion source at 250ºC, and the quadrupole at 100ºC. The mass analyzer operated by electron impact (70eV) in selected ion monitoring (SIM) acquisition mode. Table I shows retention times and selected ions for the analytes of interest and their corresponding internal standards. Validation of the method Prior to application the method to meconium samples, it has been tested using the following criteria. Selectivity. A total of eight meconium samples from newborns of mothers who stated they had never consumed cocaine and/or opiates, were extracted and analysed for assessment of potential interferences from endogenous substances. The apparent response at the retention times of the analytes under investigation was compared to the response of analytes at the limit of quantitation. Linearity. Solutions were prepared in the range of 20 to 1000 ng/g. For each standard curve, five different concentrations were used, not including the blank matrix. The regression line was calculated by the method of least squares, and linearity was expressed by the correlation coefficient (r 2 ). Journal of Analytical Toxicology, Vol. 33, September 2009 228 Table I. Retention Times and Selected Ions of the Analytes and the Corresponding Internal Standards Time (min) Selected Mass-to- Analyte Retention Charge Ratios* Cocaine 13.8 182, 198, 303 Cocaine-d 3 185, 201, 306 BE 14.9 240, 361 BE-d 3 243,364 Codeine 17.9 178, 234, 371 Codeine-d 3 181, 237, 374 Morphine 18.9 236, 414,429 Morphine-d 3 239, 417,432 6AM 20.5 287, 340,399 6AM-d 3 290, 343,402 * Quantifying ions are in bold. Limit of detection (LOD) and quantification (LOQ). LOD was defined as the concentration with a signal-to-noise (S/N) ratio of at least 3 and acceptable precision and accuracy. LOQ was the lowest standard with an S/N ratio of at least 10 and acceptable precision and accuracy. Both parameters were determined empirically by analysis of a series of decreasing concentrations of the drug-fortified meconium in five replicates. Precision and accuracy: Precision and accuracy were evaluated over the linear dynamic range for three different concentrations: low limit of quantitation (LLOQ), intermediate concentration, and upper limit of quantitation (ULOQ). Intraday precision and accuracy was assessed with five determinations per concentration in one day, while interday precision and accuracy was evaluated by six determinations per concentration in different days. Precision (coefficient of variation) was calculated as (standard deviation/mean) × 100, while accuracy was calculated as (mean concentration quality control – nominal concentration)/nominal concentration) × 100. Recovery: Recovery or extraction efficiency (%) for each analyte was determined at low and high concentration levels, and calculated comparing the areas of peaks after extraction of samples with the internal standard and the drugs, with those peaks obtained after extraction of samples only with the internal standard and subsequently spiked with the drugs at the same concentrations. Results and Discussion Urine results The analysis of mother’s urine done in the Clinical Hospital of Santiago de Compostela (Spain) was positive for cocaine and opiates using EMIT, but this result was not confirmed by any other method. Table II shows the results of newborn’s urine screening with COBAS. These results have been confirmed using GC–MS. This confirmation demonstrates that the positive result for cocaine was due to the presence of benzoylecgonine and cocaine in minor measure. In the case of the opiates, urine GC–MS confirmation demonstrates that the positive result was to the presence of codeine and morphine, but 6-AM was not detected. Meconium results Validation of the method Selectivity. No additional peak due to endogenous substances that could have interfered with the detection of compounds of interest was observed in their retention times (Figure 1). Linearity, LODs, and LOQs. Table III shows the results of linearity and the LODs and LOQs. Linear calibration curves were obtained with an average correlation coefficient higher than 0.99 for the compounds of interest. LODs and LOQs obtained with this method are lower than those obtained previously in a published paper for our laboratory (28); therefore, this method of extraction is more sensitive. Precision, accuracy, and recovery. Table IV provides the results obtained for recovery and intra- and interday precision and accuracy. Precision and accuracy of analytes under investigation at reported concentrations satisfactorily met the international established acceptance criteria (29). Higher results of recovery using Bond Elut cartridges suggested that this cartridge is better for extracting the analytes of interest than other cartridge used in our laboratory for extract the same analytes (28). Mean recoveries were lower at a low analyte concentration than at a high analyte concentration. Application of the method A representative chromatogram of the sample of meconium obtained the first day is presented in Figure 2. Figure 3 shows the table with the results of the GC–MS analyses of the meconium samples and the graphical representation of these results. Observing the graph it is possible to see clearly that as the days passed, the quantity of drugs is declining, reaching to eliminate the third day. On the other hand, as we have seen for the urine, GC–MS results for the meconium demonstrate the existence of benzoylecgonine, cocaine, codeine, and morphine in meconium samples, being benzoylecgonine and codeine the principal compounds. The presence of cocaine and benzoylecgonine in meconium was attributed to transfer across the placenta from the mother (30,31), and the presence of codeine in higher concentration than morphine in conjunction with the abstinence Journal of Analytical Toxicology, Vol. 33, September 2009 229 Figure 1. GC–MS chromatogram of a blank sample of meconium. Table II. Screening Results of Urine Samples. Hour Day Cocaine Opiates 14 1 + + 34 2 + + 60 3 – – 80 4 – – 103 5 – – Table III. Results of the Calibration Method Calibration Correlation LOD LLOQ Compound Curve Coefficient (r 2 ) (ng/g) (ng/g) Cocaine y = 0.007 + 1.523x 0.996 5 20 BE y = 0.018 + 1.970x 0.996 10 20 Codeine y = 0.083 + 1.274x 0.997 5 20 Morphine y = 0.014 + 1.932x 0.996 10 20 6AM y = 0.010 + 1.155x 0.997 10 20 syndrome during the first hours after bith (typical of heroin consumption during gestation) led us to think that the mother’s consumption was mainly codeine. Conclusions The GC–MS method to analyze cocaine and opiates in meconium reported in this paper was validated according to internationally acceptance criteria and provides a wide window for the detection of fetal exposure to cocaine and opiates. The analysis of meconium demonstrated the exposure to cocaine and codeine during the last 20 weeks of gestation (32), whereas urine was only able to prove that these drugs had been consumed in the last hours prior to birth. Therefore, meconium can be considered an alternative for the assessment of exposure to drugs during pregnancy that cause alterations in newborns presenting symptoms of hyperexcitability, as was the case in this study. References 1. C. Christensen. Management of chemical dependence in pregnancy. Obstet. Gynecol. 51(2): 445–455 (2008). 2. Y. Oyelese and C.V. Ananth. Placental abruption. Obstet. Gynecol. 108(4): 1005–1016 (2006). 3. U. Von Mandach. Drug use in pregnancy. Therapeutische Umschau 62(1): 29–35 (2005). 4. O. Fajemirokun-Odudeyia and S.W. Lindow. Obstetric implications of cocaine use in pregnancy: a literature review. Eur. J. Obst. Gynecol. Reprod. Biol. 112: 2–8 (2004). 5. E. Sheiner, I. Shoham-Vardi, M. Hallak, A. Hadar, L. Gortzak- Uzan, M. Katz, and M. Mazor. Placental abruption in term pregnancies: clinical significance and obstetric risk factors. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 13(1): 45–49 (2003). 6. C.V. Ananth and A.J. Wilcox. 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GC–MS chromatogram of meconium sample obtained on the first day. Figure 3. GC–MS results from meconium samples. Table IV. Precision, Accuracy, and Recovery Obtained for Analytes Investigated Precision and Precision and Accuracy Accuracy Intraday Interday Concentration Recovery (n=5) (n=5) Compound (ng/g) (%) CV MRE CV MRE Cocaine 20 18.1 19.5 20.8 12.2 100 200 40.6 500 44.9 2.99 6.49 5.37 6.16 1000 5.47 9.26 1.13 1.38 BE 20 14.8 14.1 11.4 10.1 100 200 40.1 500 42.3 2.98 7.21 2.93 7.50 1000 5.67 7.36 0.60 1.56 Codeine 20 16.1 20.1 6.28 4.81 100 200 57.8 500 72.8 3.76 2.27 6.28 2.48 1000 5.73 9.36 1.58 0.46 Morphine 20 8.15 17.5 15.0 23.7 100 200 60.7 500 59.4 3.55 4.57 7.29 5.53 1000 6.08 11.2 1.47 1.38 6AM 20 17.3 16.7 20.4 4.36 100 200 40.3 500 44.3 3.22 4.14 5.45 4.03 1000 6.05 10.5 1.35 0.92 Journal of Analytical Toxicology, Vol. 33, September 2009 Journal of Analytical Toxicology, Vol. 33, September 2009 231 13. C. Johanson and C.R. Schster. Cocaine. 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Capítulo Experimental: Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 270 Figura 10.3. Protocolo de recogida de datos maternos (Página 2). - Consumo durante el embarazo: o Hábitos tóxicos:  Niega consumo:  NO  SI  Tabaquismo:  <10 cigarrillos/día  10-20  >1 paquete/día.  Alcohol:  Esporádico Fin de se mana  Diario. Cantidad: ______________________________________________________________  Cannabis:  NO  SI  Cocaína:  NO  SI  Drogas de diseño:  NO  SI  ADVP: ________________________________________________________  Metadona:  No  SI. Dosis: _____________________________________ o Trimestre:  Primero  Segundo  Tercero. o Inicio:  Antes  Durante. o Frecuencia:  Esporádico  Habitual. - Consumo previo al embarazo: o Tiempo o edad desde el inicio del consumo:______________________________ o Tipo de droga:  Ninguna  Tabaco  Alcohol  Cannabis  Cocaína  Drogas de diseño  ADVP  Metadona. Página 2 de 3 Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 271 Figura 10.4. Protocolo de recogida de datos maternos (Página 3). - Tratamiento farmacológico recibido durante la gestación: ______________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ - Complicaciones/ ingresos durante el embarazo: ______________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ - Screening de tóxicos en orina: o Gestación:  Negativo  Positivo: _____________________________________ _________________________________________________________________ o Postparto:  Negativo  Positivo: _____________________________________ _________________________________________________________________ Página 3 de 3 Experimental Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 272 Figura 10.5. Protocolo de recogida de datos del recién nacido (Página 1). PROTOCOLO DE RECOGIDA DE DATOS DEL RECIÉN NACIDO - Edad gestacional: ____ semanas - PRN: ___________ gr PC: ___________ cm Longitud: ___________ cm. - Sexo: ________________________________________________________________ - Cultivo del tercer trimestre: ______________________________________________ - Modalidad de parto:  Eutócico  Instrumental  Cesárea. Motivo de la cesárea: _____________________________________________________________________ - Sufrimiento fetal: ______________________________________________________ - Apgar: _______________________________________________________________ - Reanimación:  Superficial  O2+ambú  Intubación. - Ingreso en UCI:  NO  SI. Motivo:_______________________________________ - Datos relevantes de la explotación física: ___________________________________ _____________________________________________________________________ - Screening de tóxicos en orina:  Negativo  Positivo _________________________ ___________________________________________________________________ - Clínica del síndrome de abstinencia:  No  Si:  Leve  Moderado  Severo _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ - Días de ingreso: _______________________________________________________ - Tratamiento farmacológico del síndrome de abstinencia:  NO  SI: ____________ _____________________________________________________________________ - Secuelas a corto plazo: _________________________________________________ - Serologías al nacimiento: _________________________________________ Página 1 de 1 Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 273 10.1.2 TAMAÑO MUESTRAL Del total de consentimientos se han excluido del estudio a 7 parejas madre-recién nacido, 6 por no disponer de la muestra materna o por ser ésta insuficiente para realizar el análisis y 1 por no poder disponer del meconio del recién nacido. Por lo tanto, el número final de parejas incluidas en el estudio fue de 90. 10.1.3 POBLACIÓN ESTUDIADA La población estudiada incluyó a mujeres del área urbana de Vigo y de las parroquias limítrofes (área rural) con un nivel socioeconómico medio. Ninguna de las mujeres incluidas en el estudio era inmigrante. La edad de estas gestantes estaba comprendida entre los 19 y los 42 años, con una edad media de 32 años. Ninguna admitió consumo crónico ni esporádico de COC y/o HER durante la gestación. 10.1.4 TIPO DE MUESTRAS ANALIZADAS 10.1.4.1 VELLO PÚBICO MATERNO Se recogieron muestras de vello púbico de las mujeres gestantes que aceptaron participar en el estudio. Éstas fueron obtenidas a partir del rasurado del parto gracias a la colaboración de las auxiliares clínicas de la sala de partos. Estas muestras fueron introducidas en bolsas plásticas para su traslado al Servicio de Toxicología del IUML de Santiago, en donde fueron adecuadamente identificadas y almacenadas a temperatura ambiente hasta su análisis. 10.1.4.2 MECONIO DEL RECIÉN NACIDO Las muestras de meconio fueron recogidas del pañal de los recién nacidos incluidos en el estudio durante las primeras 24 horas de vida. Su traslado al laboratorio se realizó en botes plásticos convenientemente introducidos en neveras. En el laboratorio, las muestras fueron adecuadamente identificadas y almacenadas a una temperatura de - 20ºC hasta su análisis. Experimental Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 274 10.1.5 DETERMINACIÓN DE COCAÍNA Y/O OPIOIDES EN MUESTRAS DE VELLO PÚBICO MATERNO Y MECONIO Para la determinación de COC, BE, COD, MOR y 6-MAM en las muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido ha sido realizado un screening previo mediante la técnica ELISA. Para las muestras de pelo se ha empleado un método previamente estandarizado en la Università Cattolica del Sacro Cuore durante mi estancia predoctoral en Roma. Aplicando esta técnica a 48 muestras de pelo y comparando los resultados con los obtenidos mediante un método de LC-MS/MS, previamente validado en dicho laboratorio, se ha observado una sensibilidad del 89,5% y una especificidad del 100% para la técnica ELISA1. El screening de las muestras de vello púbico fue realizado al extracto de pelo obtenido por sonicación del mismo durante 4 horas con 1 mL de agua:ácido fórmico 0,1% a temperatura ambiente. El screening de las muestras de meconio fue realizado al extracto metanólico obtenido por agitación y posterior centrifugación del mismo con 2 mL de metanol. Los resultados de screening positivos para la BE y/o la MOR fueron confirmados y cuantificados utilizando los métodos GC-MS descritos en los capítulo 7 y 9 (segunda parte) para las muestras de vello púbico y meconio, respectivamente. Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 275 10.2 RESULTADOS Los resultados de confirmación mediante GC-MS de las muestras de vello púbico y de meconio del recién nacido con screening positivo se muestran en la Tabla 10.2. Tabla 10.1. Resultados GC-MS de las muestras con screening positivo. Concentración vello púbico materno (ng/mg) Concentración meconio (ng/g) COC BE COD MOR 6- MAM COC BE COD MOR 6- MAM 1 <LOD 0 <LOD 0 0,564 0 0 <LOD <LOD 0 2 0,582 0 0 0 0 0 0 0 <LOD 0 3 0,565 0 0 0 0 0 0 0 <LOD 0 4 0 0 0 7,347 0 0 0 0 24,34 0 5 0 0 <LOD 0 0 0 0 45 0 0 6 45,41 18,72 0 0 0 2363 3854 0 0 0 7 0,741 0,632 1,523 0 0 10,74 16,57 5,558 <LOD 0 8 0 0 0,518 0 0 0 0 0 0 0 9 0,874 0,724 0,853 4,906 0 185 611 144 2483 0 10 1,328 0,793 0 0 0 53,31 51,72 0 <LOD 0 10.3 ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS 10.3.1 ANÁLISIS ESTADÍSTICO BÁSICO 10.3.1.1 MATRIZ DE DATOS En base a los resultados obtenidos mediante el análisis de GC-MS se ha realizado una matriz de datos (Tabla 10.2) con el fin de establecer dos tipos de correlación: correlación entre los cinco analitos y correlación entre las dos muestras. En cada columna de esta matriz se ha representado una variable. Las variables con las que hemos trabajado son 10: concentración de COC en la madre, COC (M); concentración de COC en el recién nacido, COC (RN); concentración de BE en la madre, BE (M); concentración BE en el recién nacido, BE (RN); concentración de COD en la madre, COD (M); concentración de COD en el recién nacido, COD (RN); concentración de MOR en la madre, MOR (M); concentración MOR en el recién nacido, MOR (RN); concentración de 6-MAM en la madre, 6-MAM (M) y concentración 6-MAM en el recién nacido, 6-MAM (RN). Todas estas concentraciones han sido expresadas en ng/mg. En cada una de las filas de la matriz se han representado los resultados GC-MS positivos a alguno de los compuestos estudiados Experimental Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 276 en alguna de las matrices analizadas. Cuando el resultado GC-MS fue <LOD o 0, en la matriz de datos se ha indicado el valor del LOD correspondiente, pues los valores 0 son anulados por el programa, por lo que no se podrían establecer las correlaciones. Tabla 10.2. Matriz de datos. COC (M) COC (RN) BE (M) BE (RN) COD (M) COD (RN) MOR (M) MOR (RN) 6- MAM (M) 6- MAM (RN) 1 0,040 0,005 0,040 0,010 0,020 0,005 0,040 0,010 0,564 0,010 2 0,582 0,005 0,040 0,010 0,020 0,005 0,040 0,010 0,050 0,010 3 0,565 0,005 0,040 0,010 0,020 0,005 0,040 0,010 0,050 0,010 4 0,040 0,005 0,040 0,010 0,020 0,005 7,347 0,024 0,050 0,010 5 0,040 0,005 0,040 0,010 0,020 0,045 0,040 0,010 0,050 0,010 6 45,41 2,363 18,72 3,854 0,020 0,005 0,040 0,010 0,050 0,010 7 0,741 0,011 0,632 0,017 1,523 0,001 0,040 0,010 0,050 0,010 8 0,040 0,005 0,040 0,010 0,518 0,005 0,040 0,010 0,050 0,010 9 0,874 0,185 0,724 0,611 0,853 0,144 4,906 2,483 0,050 0,010 10 1,328 0,053 0,793 0,052 0,020 0,005 0,040 0,010 0,050 0,010 10.3.1.2 PRETRATAMIENTO DE LOS DATOS Nuevamente ha sido necesario homogenizar los datos para conferir la misma importancia o peso a cada una de las variables. El pretratamiento de datos usado en este estudio ha sido el mismo que en el Capítulo 8, la transformación rango medio y valor central. La matriz de datos normalizada se puede observar en la Tabla 10.3. Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 277 Tabla 10.3. Matriz de datos normalizada. COC (M) COC (RN) BE (M) BE (RN) COD (M) COD (RN) MOR (M) MOR (RN) 6- MAM (M) 6- MAM (RN) 1 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -0,94 -1,00 -1,00 1,00 0,00 2 -0,98 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -0,94 -1,00 -1,00 -1,00 0,00 3 -0,98 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -0,94 -1,00 -1,00 -1,00 0,00 4 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -0,94 1,00 -0,99 -1,00 0,00 5 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -0,38 -1,00 -1,00 -1,00 0,00 6 1,00 1,00 1,00 1,00 -1,00 -0,94 -1,00 -1,00 -1,00 0,00 7 -0,97 -0,99 -0,94 -1,00 1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 0,00 8 -1,00 -1,00 -1,00 -1,00 -0,34 -0,94 -1,00 -1,00 -1,00 0,00 9 -0,94 -0,85 -0,93 -0,69 0,11 1,00 0,33 1,00 -1,00 0,00 10 1,00 -0,96 -0,92 -0,98 -1,00 -0,94 -1,00 -1,00 1,00 0,00 10.3.1.3 MATRIZ DE CORRELACIÓN Una vez normalizados los datos se ha construido una matriz de correlaciones cuadrada (Tabla 10.4), usando el programa Statistics, y se ha comprobado numéricamente qué variables han aportado correlación numérica (≥0,70). Experimental Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 278 Tabla 10.4. Matriz de correlaciones. COC (M) COC (RN) BE (M) BE (RN) COD (M) COD (RN) MOR (M) MOR (RN) 6-MAM (M) 6-MAM (RN) COC (M) COC (RN) 0,67 BE (M) 0,69 1,00 BE (RN) 0,65 1,00 0,99 COD (M) -0,28 -0,17 -0,16 -0,14 COD (RN) -0,19 -0,07 -0,12 0,01 0,29 MOR (M) -0,24 -0,13 -0,16 -0,09 0,05 0,44 MOR (RN) -0,15 -0,04 -0,08 0,04 0,37 0,96 0,49 6-MAM (M) 0,37 -0,17 -0,15 -0,19 -0,29 -0,21 -0,24 -0,17 6-MAM (RN) Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 279 Podemos observar en la tabla que para la concentración de 6-MAM en el recién nacido no se ha establecido correlación alguna debido a que ésta ha sido negativa en todos los casos. 10.3.1.3.1 CORRELACIÓN COC-BE Y COD-MOR-6-MAM La COC y la BE se correlacionan bien en la madre y en el recién nacido, con coeficientes de correlación para el recién nacido de 1 y para la madre de 0,69 (Figuras 10.6 y 10.7, respectivamente). Figura 10.6. Correlación COC (RN)-BE (RN). Scatter p lot: COC ( RN ) vs. BE ( RN ) ( Casewise MD deletion ) BE ( RN ) = , 01242 + , 99801 * COC ( RN ) Correlation: r = , 99662 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 COC (RN) -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 BE (RN) 0,95 Conf.Int. Experimental Aplicación a muestras de vello púbico materno y meconio del recién nacido 286 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. López P, Martello S, Bermejo AM, De Vincenzi E, Tabernero MJ, Chiarotti M. Validation of screening (by ELISA) and confirmation (by LC-MS/MS) methods for cocaine in hair after an easy extraction. Anal Bioanal Chem (En prensa). Anexos ORIGINAL PAPER Validation of ELISA screening and LC–MS/MS confirmation methods for cocaine in hair after simple extraction P. López &S. Martello &A. M. Bermejo & Eleonora De Vincenzi &M. J. Tabernero &M. Chiarotti Received: 30 November 2009 / Revised: 23 March 2010 /Accepted: 23 March 2010 #Springer-Verlag 2010 Abstract This article describes an easy and innovative extraction procedure for cocaine and its primary metabolite, benzoylecgonine (BE), from hair consisting of sonication with H 2 O/0.1% formic acid for 4 h. The same extract was used for screening with an enzyme-linked immunoassay (ELISA) and confirmation by liquid chromatography– tandem mass spectrometry (LC–MS/MS). For the ELISA screening test a cutoff of 0.5 ng/mg was used according to the Society of Hair Testing recommendations. LC–MS/MS limits of detection (LODs) were established to be 10 pg/mg and 1 pg/mg for cocaine and BE, respectively. Linearity was obtained over a range of 0.2–5 ng/mg for BE (target analyte) in the ELISA screening test, while in the LC–MS/ MS method the range was 0.10–10 ng/mg for cocaine and 0.01–10 ng/mg for BE. Intra- and interbatch coefficients of variation and mean relative errors were less than 20% for all analytes and concentrations studied. The validated ELISA and LC–MS/MS methods were applied to 48 hair samples and the results of both methods were compared; ELISA demonstrated a sensitivity and specificity of 89.2% and 10.8%. Keywords Hair .Cocaine .Benzoylecgonine .ELISA . LC/MS/MS Introduction The importance of hair analysis in drug testing has rapidly grown in recent years. Nowadays hair analysis is routinely used as a powerful tool for the detection of illicit drug use. As a biological matrix, hair offers particular advantages: it can be easily obtained without pain, it is not easily adulterated and, due to its stability, it can be stored and transported without requiring specific precautions. Moreover, drugs are capable of surviving for hundreds of years in the hair shaft under favorable conditions (protected from light and humidity), so the window for drug detection is very long, providing a retrospective history of an individual’s drug use if multisectional analysis is used. After an initial lag time of approximately 8 h for drug entering hair from sweat or between 5 and 10 days for drugs incorporated into hair from blood, the slow growth of hair at about 1 cm per month gives a window of detection equal to the length of the hair. A critical problem of traditional hair analysis is the decontamination of the hair prior to analysis. Cleaning external contamination from the hair sample is necessary for two reasons. First, residues of hair care products (wax, shampoo, hair sprays) as well as sweat, sebum, and dust typically present on hair may increase analytical noise/ background. Second, drugs can adhere from the individual’s environment thus potentially contributing to incorrect test results. This type of environmental contamination is quite common for individuals involved with illegal drugs. Therefore, the first wash solution should be tested or stored for subsequent analysis to exclude the possibility that a positive analytical result originated from this type of environmental contamination [1]. In a controlled study Kintz et al. [2] found that cocaine concentration in hair ranged from 0.5 to 216.5 ng/mg, P. López :A. M. Bermejo :M. J. Tabernero Institute of Legal Medicine, Faculty of Medicine, University of Santiago de Compostela, San Francisco, s/n, 15782 Santiago de Compostela, Spain S. Martello (*):E. De Vincenzi :M. Chiarotti Institute of Legal Medicine, Faculty of Medicine, Catholic University of the Sacred Heart, Largo Francesco Vito 1, 00168 Rome, Italy e-mail: [email protected] Anal Bioanal Chem DOI 10.1007/s00216-010-3684-x benzoylecgonine (BE) from 0.1 to 33.7 ng/mg, methylecgonine from 0.1 to 12.8 ng/mg, cocaethylene from 0.1 to 10.3 ng/mg, norcocaine from 0.00 to 0.70 ng/mg, and anhydroecgonine from 0.2 to 2.4 ng/mg. In view of these results cocaine should be a primarily target compound in hair. A correct procedure for toxicological analysis, especially in forensic and epidemiological studies, involves two different steps: screening and confirmation. Usually an immunoassay followed by a chromatographic method is performed: the first step allows for a preliminary monitoring of a large number of samples in a reduced period of time, while the second step provides the required specificity by giving structural information [1]. Although the first hair analysis for drugs was performed by radioimmunoassay (RIA) [3], these immunoassays have not gained general acceptance because they are available for a limited number of illicit drugs (or metabolites), and are not generally specific. Immunoassay drug testing kits originally developed for urine are of insufficient sensitivity for use in hair extracts [4]. Nevertheless, in recent years some enzyme-linked immunoassay (ELISA) tests for opiates [5,6], cocaine [6], amphetamines [7], benzodiazepines [8], and methadone [9] have been developed and proven to be sufficiently sensitive for use in hair analysis. The most popular method to confirm screening results is gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC– MS) [6,10–13]. The combination of liquid chromatography and mass spectrometry (LC–MS) is useful for hair analysis because it eliminates the GC-dependent complications of volatility, stability, and derivatization. An efficient use of LC in hair analysis is only possible with coupled tandem MS/MS because this biological matrix contains low levels of drugs. A number of papers using LC–MS/MS in hair analysis have been published including detection of nicotine [14–16], ethylglucuronide [17], cocaine and its metabolites [14–16,18,19], opiates [14–16,18–20], benzodiazepines [14–16,18,19,21,22], and amphetamines [14–16,18,19]. The aim of this study was to validate an easy and innovative extraction procedure for cocaine and its primary metabolite, BE, from hair specimens and to perform analysis of the same extract by an ELISA screening test, followed by a confirmation method, LC–MS/MS. Experimental Samples Forty-eight hair samples were obtained from people ranging from 20 to 40 years of age; 25 samples were from known drug abusers; 13 were from people whose drug use status was unknown; 10 samples were from volunteers (3 female and 7 male) who declared to have never used cocaine or other illicit drugs. None of the samples were chemically colored. All samples were collected from the vertex posterior area as close as possible to the scalp. The proximal and distal ends were carefully identified. Sectional analysis was performed with hair samples longer than 10 cm. The hair samples were cut into segments of 2 cm, corresponding to a 2-month growth period. All samples were stored at room temperature prior to analysis. Chemical and reagents All solvents used were of high-performance liquid chromatography (HPLC)-grade obtained from Merck (Darmstadt, Germany). LC/MS water Chromasolv and formic acid were also purchased from Riedel-de Haën Sigma-Aldrich (Seelze, Germany). Tween® 80 was purchased from Panreac (Barcelona, Spain). Cocaine, BE, and their respective deuterium-labelled analogs, cocaine-d 3 and BE-d 3 , were purchased from LCG Promochem (Teddington, UK). Cozart® ELISA Cocaine Metabolite Forensic Kit was purchased from Cozart® (Oxfordshire, UK). Each kit contains an anti-cocaine metabolite coated plate (anticocaine metabolite monoclonal antibody immobilized on a polystyrene plate supplied in dry form), enzyme conjugate (cocaine metabolite derivate labelled with horseradish peroxidase > 0.1% (v/v) and diluted in a protein matrix with stabilizers), wash buffer (0.1% surfactant), substrate solution (< 0.05% 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB), stop solution (1 mol/L sulfuric acid), negative calibrator (protein matrix negative for BE), and positive calibrators (protein matrix containing 10, 50, and 300 ng/mL BE). Preparation and conservation of the stock solutions Stock standard solutions at a concentration of 1 mg/mL were stored in acetonitrile for cocaine and in methanol for BE in volumetric glassware. Working solutions were prepared by dilution of the stock standards with methanol and stored at −20°C until analysis. Preparation and conservation of the calibrating samples Calibrating samples for ELISA analysis were prepared spiking blank hair samples (20–40 mg) with 0.0, 0.2, 0.5, 1, 2, and 5 ng/mg of BE. For LC–MS/MS analysis calibrating samples were prepared by spiking blank hair samples with 0.0, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 2.5, 5.0, and 10.0 ng/mg for cocaine and 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, and 10.0 ng/mg for BE. P. López et al. Preparation of the samples Decontamination The decontamination procedure was performed by washing twice in 5 mL of a 0.1% solution of Tween® 80 for 10 min, and rinsing twice with 5 mL of distilled water to eliminate the external contamination. The second wash solution was tested to exclude external contamination. After drying, each sample was cut into 1-mm segments with clean surgical scissors and then 20–40 mg of hair was weighted into a labelled vial. Extraction The weighed hair samples were prepared for analysis by sonication for 4 h in 0.4 mL of H 2 O/formic acid at room temperature. A 200-µL aliquot was used in the ELISA screening test and the other aliquot for the LC–MS/MS confirmation. For LC–MS/MS analysis, deuterated internal standards (IS) were used; 0.5 ng/mg of cocaine-d 3 and 0.05 ng/mg of BE-d 3 were added into the 200-µL aliquot which was then vortexed before injection of 10 μL into the LC–MS/MS system. ELISA analysis The instrumentation used for ELISA analysis was a DSX™ Fully Automated System (Cozart®, Oxfordshire, UK). Ten-µL of hair extracts (or calibrating samples) was added to each well of the antibody-coated microtitre plate. After addition of 100 μL of working enzyme conjugate to each well, incubation at room temperature was performed for 30 min. The plate was then washed four times with 350 μLwash buffer using a plate washer to remove any excess of enzyme material. After these washes, 100 μL of substrate solution was added to each well and incubated for an additional 30 min. Finally, 100 μL of stop solution was added to each well to terminate the reaction, and the absorbance was read at 450 nm using a microplate reader within 15 min. LC–MS/MS analysis Cocaine and BE in hair were measured by using a ThermoFisher Surveyor® LC pump coupled with an LXQ ion trap mass spectrometer, using electrospray ionization with positive ion polarity mode (ThermoFisher, San Jose, USA). The sample injection was performed by using a ThermoFisher Surveyor® Autosampler AS. All data were acquired and interpreted by using XCalibur™software, version 2.0. Chromatographic separation was performed on a Synergi Polar RP column (150×2.0 mm, 4 μm) protected by a guard column with identical packing material (4×2.0 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). The gradient elution program is reported in Table 1. All analytes were identified in positive ion mode; the source parameters are reported in Table 2. Identification and quantification was based on selected reaction monitoring (SRM) with the following MS/ MS transitions: m/z304→150–182 for cocaine (m/z 307→153–185 for cocaine-d 3 ) and m/z290→150–168 for BE (m/z293→153–171 for benzoyecgonine-d 3 ). The ion m/z182 and 185 for cocaine and cocaine-d 3 , and the ion m/z 168 and 171 for BE and BE-d 3 were chosen for the quantification, according to the fragmentation pattern reported in Fig. 1. Validation of the methods The method has been submitted to full validation which was performed according to the recommendations of the US Food and Drug Administration (FDA) [23]and International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) [24]. The parameters that were analyzed in both methods are: calibration curve, precision, accuracy, sensitivity, and specificity. For the LC–MS/MS method the matrix effect and the deuterated compound stability were also analyzed. Table 1 LC gradient elution program Time (min) Solvent A (%) Solvent B (%) Solvent C (%) 0.00–6.00 70.00 10.00 20.00 7.00–12.00 50.00 10.00 40.00 13.00–20.00 30.00 10.00 60.00 21.00–30.00 70.00 10.00 20.00 Solvent A 0.01% formic acid, solvent B methanol, solvent C acetonitrile Table 2 LC–MS/MS source parameters Parameters Value Spray voltage (kV) 5 Sheath gas pressure (arbitrary units) 20 Aux gas pressure (arbitrary units) 8 Spray current (μA) 0.8 Isolation width 2 Capillary temperature (°C) 300 Capillary offset (V) 17 Tube lens offset (V) 55 Validation of screening and confirmation methods for cocaine in hair after simple extraction Cross-reactivity of the ELISA method was not measured because percentages of cross-reactivity are reported by the manufacturer in each kit. Calibration curve Linearity was performed by calculation of the regression line expressed by the correlation coefficient (R 2 ). BE calibration was done over a maximum concentration range from 0.2 to 5 ng/mg for ELISA, and for LC-MS the range was 0.10– 10 ng/mg for cocaine and 0.01–10 ng/mg for BE. In both methods, five aliquots were performed for each level. Precision and accuracy Precision and accuracy were evaluated over the linear dynamic range at three different concentrations: lower limit of quantification (LLOQ), intermediate concentration, and upper limit of quantification (ULOQ). Intraday precision and accuracy were assessed with five determinations per 100 150 200 250 300 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Relative Abundance 168.14 272.31 150.14 124.09 290.37 91.02 249.08 230.22 205.11191.90 182.21 150.15 304.47 108.04 272.29 212.38 244.1891.01 NL: 4.65E3 beg_coc_FULLSCAN#197 -276 RT: 2.57-3.51 AV: 10 F: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [75.00-300.00] NL: 3.51E3 beg_coc_FULLSCAN#397 -443 RT: 5.19-5.71 AV: 6 F: ITMS + c ESI Full ms2 [email protected] [80.00-320.00] Fig. 1 Full MS/MS spectra of BE (a) and cocaine (b) Table 3 ELISA validation results for BE BE CV (%) Mean relative error (%) ng/mg Intraday Interday Intraday Interday 0.2 9.771 14.27 3.532 19.27 2 4.936 8.336 4.943 5.756 5 5.421 0.232 6.110 1.840 A=0.150±0.037, B=0.5432±0.022, R 2 =0.995±0.003 Table 4 LC–MS/MS validation results for cocaine and BE CV (%) Mean relative error (%) ng/mg Intraday Interday Intraday Interday Cocaine a 0.10 3.4 2.9 8.7 8.6 0.5 1.8 2 4.9 5.9 10 0.68 0.8 0.3 1.2 BE b 0.01 8.9 7.8 0.5 4.7 0.05 6.5 1.7 2.3 5.6 10 3.9 3.3 4.9 6.9 a y=5.4908x+0.3014, R 2 =0.99, s=0.003–0.02 b y=8.3984x+0.3473, R 2 =0.99, s=0.0004–0.005 P. López et al. RT: 0.00 - 11.64 SM: 7G 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Time (min) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 Relative Abundance 0 50 100 RT: 3.08 MA: 760 SN: 14 5.75 9.94 7.42 3.54 11.50 6.461.32 9.084.04 7.72 1.62 5.10 0.51 RT: 3.05 MA: 233133 SN: 1016 4.31 4.71 6.02 6.52 7.43 7.78 9.95 10.519.301.28 2.140.17 RT: 5.63 MA: 6914 SN: 25 10.679.76 3.511.04 4.77 6.54 8.101.90 8.757.49 4.373.06 RT: 5.64 MA: 1169215 SN: 4860 7.10 7.56 8.56 9.22 10.639.882.01 4.890.25 3.471.51 4.532.67 NL: 5.47E1 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [104.00-106.00, 149.00-151.00, 167.00-169.00] MS LOD02 NL: 1.75E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [150.00-154.00, 170.00-172.00] MS LOD02 NL: 3.98E2 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [81.00-83.00, 149.50-150.50, 181.50-182.50] MS LOD02 NL: 6.33E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [84.00-86.00, 150.00-156.00, 184.00-186.00] MS LOD02 BE BE-d3 COCAINE-d3 RT: 0.16 - 10.35 SM: 7G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Time ( min ) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 Relative Abundance 0 50 100 RT: 3.08 MA: 2635 SN: 47 5.60 10.043.44 4.091.32 7.525.20 8.43 9.086.961.02 2.432.13 6.41 RT: 3.05 MA: 221506 SN: 606 3.95 4.46 4.86 6.02 6.37 10.007.787.18 8.24 8.791.890.42 2.390.98 RT: 5.63 MA: 21526 SN: 85 10.07 7.293.46 7.806.592.45 3.920.69 9.31 4.52 1.04 8.962.10 RT: 5.64 MA: 1126094 SN: 3333 6.60 7.20 7.86 8.41 8.87 9.622.06 4.891.660.95 3.372.77 3.78 NL: 1.85E2 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [104.00-106.00, 149.00-151.00, 167.00-169.00] MS LOQ02 NL: 1.67E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [150.00-154.00, 170.00-172.00] MS LOQ02 NL: 1.13E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [81.00-83.00, 149.50-150.50, 181.50-182.50] MS LOQ02 NL: 5.89E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [84.00-86.00, 150.00-156.00, 184.00-186.00] MS LOQ02 COCAINE COCAINE-d3 BE-d3 BE a b Fig. 2 BE and cocaine chromatograms of LOD (a) and LOQ (b) Validation of screening and confirmation methods for cocaine in hair after simple extraction concentration in 1 day, while interday precision and accuracy were evaluated by five determinations per concentration on different days. Precision (coefficient of variation, CV) and accuracy (mean relative error, MRE) were calculated by applying Eqs. 1and 2, respectively: CV ¼s xi 100 ð1Þ MRE ¼xix x100 ð2Þ sbeing the standard deviation, xithe mean of the observed concentrations, and xthe real concentration. According to FDA criteria [23], precision and accuracy determined at each concentration level studied should not exceed 15% except for the LLOQ, where it should not deviate by more than 20%. Sensitivity and specificity of the ELISA method The sensitivity and specificity were calculated by applying Eqs. 3and 4, respectively, which requires the total number of true positives (TP), true negatives (TN), false positives (FP), and false negatives (FN) to be counted. Sensitivity ¼TP 100 TP þFN ð3Þ Specificity ¼TN 100 TN þFP ð4Þ For evaluating these parameters, the validated ELISA and LC–MS/MS methods for the extraction of cocaine and BE from hair were applied to 48 hair specimens: 10 samples from non drug abusers, 25 from known drug abusers, and 13 from people whose drug use status was unknown. All the specimens were analyzed for cocaine and BE, according to the developed and validated methods, and the screening results were compared with those obtained by applying the validated LC–MS/MS method. Sensitivity and specificity of the LC–MS/MS method The sensitivity of the LC–MS/MS method was analyzed by calculating the limit of detection (LOD) and limit of Fig. 3 Typical chromatogram of a volunteer’s (blank) hair sample P. López et al. quantification (LOQ) defined as the lowest concentration with a signal-to-noise ratio (S/N) of at least 3 and 10, respectively, and with an acceptable precision and accuracy. Both parameters were determined empirically by analysis of a series of decreasing concentrations of the drug-fortified hair in three replicates. For determining the specificity of the LC–MS/MS method a total of four blank hair samples from volunteers who had never consumed cocaine were extracted and analyzed for assessment of potential interferences from endogenous substances. The apparent response at the retention times of the analytes under investigation was compared with the response of analytes at the lower limit of quantification (LLOQ). Matrix effect These parameters were assessed by following the recommendations of Matuszewski et al. [25]. Matrix effect is defined as the effect of co-eluting residual matrix component on the ionization of the target analytes and is a limitation commonly associated with LC–MS analysis. Precision and/or accuracy of the method could be compromised by an enhancement or suppression of analyte response due to matrix effects. Matrix effect was calculated at 0.5, 1.0, and 5.0 ng/mg for cocaine and 0.05, 1.0, and 5.0 ng/mg for BE by comparing average peak areas in four different blank hair eluates fortified before sonication with those obtained with analytes prepared in mobile phase at the same concentrations. The matrix effect was calculated by Eq. 5: ME ¼B A100 ð5Þ Abeing the average peak areas of the analytes prepared in mobile phase, and Bthe average peak areas of the eluates fortified before sonication. Deuterated compound stability Before performing the validation of the LC–MS/MS method, the addition of deuterated analogs (cocaine-d 3 and BE-d 3 ) to the sample was studied. Deuterated compound stability during sonication was evaluated by processing two sets of blank hair spiked at three levels of deuterated. The first set was spiked before sonication and the second set after sonication. RT: 0.19 - 11.21 SM: 7G 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Time (min) 0 50 100 Relative Abundance 0 50 100 Relative Abundance 0 50 100 Relative Abundance 0 50 100 Relative Abundance RT: 3.14 AA: 224093 RT: 6.26 AA: 10346 RT: 3.15 AA: 53467 RT: 4.70 AA: 392 RT: 6.16 AA: 1270689 RT: 6.11 AA: 301221 NL: 8.99E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [149.00-151.00, 167.00-169.00, 289.00-291.00] MS ICIS 1P08_coc NL: 2.12E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [150.00-154.00, 170.00-172.00] MS ICIS 1P08_coc NL: 6.09E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [149.50-150.50, 181.50-182.50, 303.00-305.00] MS ICIS 1P08_coc NL: 1.44E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 [email protected] [152.00-154.00, 184.00-186.00, 306.00-308.00] MS ICIS 1P08_coc Fig. 4 Typical chromatogram of a drug abuser’s hair sample Validation of screening and confirmation methods for cocaine in hair after simple extraction   11.4.2.3 RELACIÓN ENTRE EL CONSUMO MATERNO Y LAS POSIBLES ALTERACIONES EN EL RECIÉN NACIDO ........................................................ 312 11.4.2.4 INCIDENCIA DEL CONSUMO DE COCAÍNA Y OPIOIDES EN EL EMBARAZO…… ............................................................................................ 312 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 314 Discusión 291   Tal como se ha señalado en el Apartado de Justificación y Objetivos, la principal finalidad de esta Tesis Doctoral ha sido demostrar la posibilidad de utilización de muestras biológicas alternativas para la detección del consumo de drogas durante el periodo de gestación. En base a esto hemos juzgado de interés desarrollar un método analítico para determinar COC y opioides dado que, en la práctica, la asociación de estas drogas es muy frecuente. Las matrices biológicas que se han utilizado en esta Tesis fueron el pelo (vello púbico y cabello) y el meconio. Por una parte, el vello púbico y/o el cabello materno pueden informarnos de si ha existido consumo por parte de la mujer embarazada, sin embargo, no se tiene la certeza de que este consumo se haya producido durante la gestación. Las matrices que sí pueden informarnos sobre consumo en este periodo son el cabello del recién nacido y el meconio. A través del análisis del cabello del recién nacido la ventana de detección se establece en las últimas 16 semanas de gestación, ya que es a partir de la vigésima semana del embarazo cuando el cabello del recién nacido empieza a formarse. Con el fin de ampliar dicha ventana se ha empleado el meconio que empieza a formarse entre la duodécima y decimosexta semana de gestación, por lo que la ventana de detección se amplía a las últimas 20-24 semanas del embarazo. A continuación se discutirán aquellos aspectos más relevantes de los métodos analíticos desarrollados y su aplicación a muestras reales. 11.1 DETERMINACIÓNDECOCAÍNAYOPIOIDESENPELO PORGC‐MS 11.1.1 HIDRÓLISIS Una fase crítica del análisis de las muestras de pelo es el aislamiento de los analitos de la matriz queratínica en la cual están atrapados. En la literatura se describen diversos métodos para el aislamiento de las drogas ilícitas de la matriz queratínica. Éstos se basan en el uso de metanol, ácidos acuosos, o soluciones tampón, en digestiones alcalinas con hidróxido sódico acuoso y en digestiones enzimáticas1-3. La SFE también ha sido utilizada para extraer las drogas ilícitas de las muestras de pelo2,4-6, sin embargo, según Pragst y Balikova2 este método es poco utilizado debido a su alto coste. Discusión Discusión  292  El uso de condiciones alcalinas drásticas, utilizando hidróxido sódico acuoso, conduce a una eficiente solubilización de las matrices queratínicas, sin embargo, estas condiciones se deben evitar a la hora de determinar compuestos inestables en condiciones alcalinas, como por ejemplo, la COC1. Del mismo modo, las soluciones acuosas ácidas también pueden hidrolizar algunos analitos, por ejemplo, la hidrólisis parcial de COC a BE o de 6- MAM a MOR2. De acuerdo a los resultados del tercer ensayo de aptitud organizado por la SoHT (Society of Hair Testing) 7 la hidrólisis ácida puede ofrecer un mayor rendimiento para la COC y los opiáceos así como para sus metabolitos, en comparación con los rendimientos obtenidos utilizando hidrólisis enzimática o metanólica. Sin embargo, las conclusiones de este estudio no son totalmente fiables debido a la alta RSD. Cuando es necesario aislar analitos de estabilidades diferentes bajo las mismas condiciones, lo más útil es realizar pretratamientos del pelo utilizando pHs moderados. En estos casos, son preferibles tratamientos previos de la muestra basados en extracciones con metanol o hidrólisis enzimática. El uso de metanol como disolvente ofrece la ventaja sobre los métodos de digestión enzimática de que se pueden realizar inyecciones directas en el GC sin realizar la limpieza de los extractos de pelo. Sin embargo, generalmente se obtienen recuperaciones incompletas del analito y formación de ésteres metílicos derivados2. Los tratamientos basados en enzimas proteolíticas son muy útiles para la extracción de drogas ilícitas del pelo ya que al requerir condiciones de pH y temperatura moderadas, no tiene lugar la hidrólisis de los analitos. La hidrólisis enzimática consiste en la reducción de los puentes disulfuro de las queratinas bajo determinadas condiciones de pH, temperatura y fuerza iónica. Después de la acción de la hidrólisis enzimática, una fracción variable del analito es liberada de la matriz del pelo y puede ser adecuadamente medido. La pronasa E y la proteinasa K son las enzimas más comúnmente utilizadas para la hidrólisis de proteínas del pelo1,2,8-11, aunque también ha sido utilizada una mezcla αglucuronidasa/arilsulfatasa12. Offidani y cols.8 mejoraron la hidrólisis enzimática del cabello con DTT y dodecil sulfato sódico durante el tratamiento enzimático. La presencia de DTT aumenta el rendimiento de extracción del analito (COC) cuando el reactivo se incuba con la muestra de cabello durante8,11 o antes9,10 de la hidrólisis enzimática. Discusión 293  Para la extracción de los opioides (COD, MOR y 6-MAM) y de la COC y su metabolito BE, se ha observado que los rendimientos de extracción son mayores cuando se utilizan hidrólisis enzimáticas que cuando se utiliza la hidrólisis alcalina o la extracción con metanol13. Por este motivo, en esta Tesis se ha decidido emplear la hidrólisis enzimática en el tratamiento previo de las muestras de pelo. Sin embargo, una importante desventaja de la hidrólisis enzimática es el tiempo necesario para completar el proceso de hidrólisis, comúnmente en el rango de 6 a 24 h. Este hecho, junto con el uso de un método de limpieza eficiente, hace que la hidrólisis enzimática del pelo sea una metodología tediosa y laboriosa. Actualmente este inconveniente ha sido solventado gracias a la aplicación de la energía de ultrasonidos al proceso de hidrólisis14, sin embargo, en el momento de la validación del método analítico para la determinación de COC, BE, COD, MOR y 6-MAM en las muestras pelo aún no había sido demostrada la aplicabilidad de la energía de ultrasonidos en la hidrólisis enzimática del pelo, por lo que la validación ha sido realizada por el método convencional. Anteriormente, la energía de ultrasonidos había sido aplicada con éxito para acelerar la hidrólisis enzimática en materiales biológicos para la extracción de elementos traza y especies organometálicas, reduciendo el tiempo de hidrólisis a 30 min usando baños de ultrasonidos15 y a 2 min usando sondas ultrasónicas16. Sin embargo la energía de ultrasonidos no había sido aplicada a la extracción de drogas ilícitas. Las ondas de ultrasonido promueven un aumento de la presión y la temperatura debido al colapso de la burbuja (inducen procesos de cavitación). El colapso asimétrico de la cavidad cuando una fase sólida se encuentra inmersa en una fase líquida produce chorros de alta velocidad de líquido que impactan en la superficie del sólido17. Según lo propuesto por Wolf y cols.18, cuando se extraen metaloproteínas a partir de materiales biológicos bajo ondas de ultrasonido, estos impactos rompen las membranas celulares y el contenido citosólico es más fácilmente atacado por las enzimas, permitiendo un menor tiempo de pretratamiento15. Discusión Discusión  294  11.1.2 PROCESODEEXTRACCIÓN En el desarrollo de este método analítico se ensayaron distintos cartuchos de SPE con rellenos basados en sílica C18 (Bond Elut Certify), rellenos de copolímero hidrofílicolipofílico (Oasis HLB) y rellenos de intercambio catiónico (Oasis MCX). Los que dieron mejores resultados en términos de rendimiento y de obtención de extractos más “limpios” fueron los cartuchos Oasis HLB. Estos cartuchos están rellenos, como ya se ha mencionado en el Capítulo 7, por un copolímero macroporoso, poli-(divinilbenceno-co-N- vinilpirrolidona) (Figura 11.1) con balance hidrofílico-lipofílico. El monómero hidrofílico proporciona propiedades humectantes, lo que permite trabajar con el relleno seco sin pérdida de recuperación y de reproducibilidad. Por otro lado, el monómero lipofílico proporciona propiedades de fase reversa para la retención de los analitos, los cuales son retenidos en su forma no ionizada en este tipo de rellenos apolares. Además esta peculiar composición presenta una elevada resistencia a pHs extremos. Figura 11.1. Estructura de la poli-(divinilbenceno-co-N-vinilpirrolidona).  Discusión 295   El pH de las muestras que eluyen a través de los cartuchos es de suma importancia y la recuperación depende de la forma ionizada o no ionizada de los analitos19. Por este motivo, la optimización de las distintas etapas de lavado y de elución de estos cartuchos ha sido realizada a partir del protocolo genérico de extracción, teniendo en cuenta las propiedades físico-químicas de los compuestos estudiados. Así, la carga de la muestra y el segundo lavado con un porcentaje de metanol del 20% fueron realizados a pH básico, el cual favorecía la retención de los analitos en los cartuchos. La elución fue realizada con metanol a pH ácido (metanol + 2% de ácido acético) favoreciendo de esta manera el paso de los analitos a su forma ionizada, la cual presentaba más afinidad por el solvente de elución que por el relleno del cartucho. 11.1.3 DERIVATIZACIÓN En cromatografía de gases, en ocasiones es necesario derivatizar algunos compuestos, principalmente los que tienen grupos funcionales polares (hidrógenos activos), con el fin de mejorar su volatilidad, su estabilidad térmica y en algunos casos la sensibilidad en la detección. El proceso de derivatización empleado en esta Tesis ha sido la sililación. Ésta consiste en la sustitución de un hidrógeno activo de un grupo funcional por un grupo sililo, el cual está formado por un átomo de silicio trisustituido. El proceso de sililación de forma general se representa de la siguiente manera: H-Y + (R3)Si -X  Y- Si(R3) + X-H El reemplazamiento del hidrógeno activo por el grupo sililo produce efectos importantes en la molécula del soluto: (a) reduce su polaridad, (b) reduce la posibilidad de formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares y (c) aumenta la volatilidad y la estabilidad térmica. Dado que las reacciones de sililación de los compuestos de interés en la muestra a analizar son reacciones lentas a temperatura ambiente, se ha elevado la temperatura a 100ºC y se ha utilizado TMCS como catalizador. De este modo se ha conseguido acelerar la reacción sin provocar reacciones secundarias. Discusión Discusión  296  Las reacciones de sililación que han tenido lugar en los compuestos estudiados son las que a continuación se indican (Figuras 11.2-11.5). Figura 11.2. Reacción de sililación de la BE. Figura 11.3. Reacción de sililación de la COD. Figura 11.4. Reacción de sililación de la MOR. Discusión 297   Figura 11.5. Reacción de sililación de la 6-MAM. En el caso de la COC, dado que en su estructura no existen hidrógenos activos, la reacción de sililación no ha tenido lugar. En la BE, la sililación se ha producido en el grupo ácido carboxílico y en los opioides en el grupo alcohol. En la MOR se ha producido una doble sililación debido a la presencia de dos grupos alcohol en su estructura. 11.1.4 METODOLOGÍAANALÍTICA La GC-MS es una técnica analítica eficaz para la identificación y cuantificación de drogas en toxicología forense. Ésta y la LC-MS son las técnicas más utilizadas en la detección de COC y opioides en muestras de pelo para determinar el consumo durante el embarazo, tal como se ha indicado en el Capítulo 4. Esto se debe a que son técnicas altamente sensibles, requisito imprescindible en los análisis de pelo y meconio donde las concentraciones esperadas de los analitos son bajas. En el método analítico desarrollado, la elección de los PI se realizó en base a la norma general que debe cumplir todo PI, esto es, debe poseer una elevada semejanza estructural con los analitos objeto de análisis, ya que de este modo todos los procesos que pueda sufrir la muestra hasta su análisis ocurrirán en la misma extensión tanto para los analitos como para el PI (dilución, extracción, etc.). Además también es importante que el PI seleccionado no se encuentre presente en la muestra a analizar. Por este motivo se decidió utilizar los PI deuterados, que presentan propiedades fisicoquímicas similares a los compuestos de interés y no se encuentran presentes en las muestras de pelo.  Discusión Discusión  298  Para la separación cromatográfica de los analitos de interés se ensayaron distintos programas de temperaturas, consiguiendo una adecuada separación en menos de 17 minutos, con un tiempo total de análisis de 19 minutos. 11.1.5 ANÁLISISDELOSRESULTADOSDEVALIDACIÓN Tal como se ha comentado en la validación de los métodos analíticos desarrollados en esta Tesis, ésta ha sido realizada según criterios recomendados en algunas revisiones y los establecidos por organismos estadounidenses e internacionales20-23. Los parámetros de validación recomendados (selectividad, linealidad, límites, precisión intradía e interdía, exactitud intradía e interdía y rendimiento) fueron aplicados para los analitos estudiados. El LOD observado para la COC, BE y MOR fue de 0,04 ng/mg, para la COD 0,02 ng/mg y para la 6-MAM 0,05 ng/mg. El LLOQ y el ULOQ fueron 0,5 y 20 ng/mg para todos los compuestos investigados. En la mayoría de los trabajos publicados las sensibilidades obtenidas son menores a las del método propuesto24-36. Sin embargo, existen algunos métodos en la bibliografía que presentan sensibilidades iguales o superiores para alguno de los analitos, siendo inferiores para el resto37-40. Tan sólo se han encontrado ocho trabajos donde las sensibilidades igualan o mejoran a las obtenidas en el método propuesto en esta Tesis41- 47. Cabe indicar que de estos métodos solamente tres45,46 han sido totalmente validados, sin embargo, en ninguno de ellos han sido incluidos todos los analitos de interés. En cuanto a los restantes parámetros de validación, el método analítico cumplió todos los criterios en relación con la selectividad, linealidad, precisión, exactitud y rendimiento. Por lo tanto, el método desarrollado en esta Tesis ha sido el primero completamente validado que permite la determinación simultánea de COC, BE, COD, MOR y 6-MAM en muestras de pelo mediante GC-MS. Discusión 299  11.1.6 APLICACIÓNACASOSREALES El método desarrollado ha sido aplicado a 20 casos reales recibidos en el Servicio de Toxicología del IUML de Santiago procedentes de consumidores de COC y/o HER (screening positivo a COC y/o MOR). Las concentraciones de los casos positivos a COC oscilaron entre 0,10 y 93,8 ng/mg, con un valor medio de 10,1 ng/mg para la COC; y entre 0,19 y 55,7 ng/mg, con un valor medio de 5,65 ng/mg para la BE. En el caso de los positivos a los opioides en estudio, las concentraciones de COD oscilaron entre 0,29 y 5,11 ng/mg, con un valor medio de 2,14 ng/mg; para la MOR entre 0,61-31,1 ng/mg, con un valor medio de 9,02 ng/mg y para la 6-MAM entre 0,23 y 158 ng/mg, con un valor medio de 39,0 ng/mg. Estos niveles, que están en concordancia con los indicados en otros estudios (Véase Tabla 11.1), son muy variables, lo que pone de manifiesto la enorme variabilidad existente entre los individuos y que puede deberse a que se trate de consumidores esporádicos o crónicos (desarrollo de tolerancia) o a factores genéticos (toxicogenética). Tabla 11.1. Revisión bibliográfica de los niveles de concentración hallados en muestras de pelo. REFERENCIA Concentración pelo (ng/mg) COC BE COD MOR 6-MAM Wang26 0,4-172,7 0,1-24,4 0,2-0,3 0,2-1,3 0,1-1,6 Kintz29 0,4-78,4 0,0-36,3 0,1-19,6 0,2-27,1 0,0-84,3 Gaillard30 0,9-242 0,3-71,3 0,1-11,5 0,4-44,6 0,7-131,2 Cordero35 0,6-24,5 0,2-5,4 1,2-5,6 0,2-30 0,1-71,1 Moeller37 0,2-8,3 0,1-2,5 0,2-1,7 0,4-4,1 1,2-10,4 Montagna42 0,58-5,31 1,33-3,96 0,49-1,39 0,79-4,14 1,26-17,3 Lachenmeir44 0,01-21,37 0-10,51 0-1,84 0,03-11,87 0,04-30,01 Es necesario señalar que en la mayoría de los casos analizados, las mayores concentraciones han sido obtenidas para la COC y la 6-MAM, lo cual nos lleva a pensar que ambos analitos son buenos marcadores del consumo de COC y HER, respectivamente. La BE también es considerada un buen marcador del consumo de COC en el pelo y así lo han reflejado en su estudio Katikaneni y cols.48. En cuanto a los indicadores del consumo de HER en el pelo, Iwersen y cols.49 consideran que la MOR y la 6-MAM son los analitos idóneos para este fin, lo que concuerda con los datos obtenidos en este trabajo.  Discusión Discusión  306  vez que se obtenían extractos más “limpios” gracias a la última etapa de lavado con metanol. Cabe señalar que la SPE es la técnica de referencia para la extracción de la COC y los opioides en estudio de las muestras de meconio, sin embargo algunos autores optan por utilizar la LLE60. 11.3.3 ANÁLISISDELOSRESULTADOSDEVALIDACIÓN El LOD observado para la COC, BE y COD utilizando los cartuchos Oasis HLB fue de 30 ng/g, mientras que para la MOR y la 6-MAM fue de 20 ng/g. La utilización de cartuchos Bond Elut ha permitido obtener LODs considerablemente más bajos, mejorando así la sensibilidad del método. Los límites obtenidos mediante estos cartuchos fueron de 5 ng/g para la COC y la COD y de 10 ng/g para el resto de los analitos estudiados. Esta disminución en los límites de detección puede ser atribuida a que, como ya se ha mencionado en el apartado anterior, la utilización de cartuchos Bond Elut permite la obtención de extractos más “limpios” y por lo tanto los cromatogramas tendrán menos interferencias. Existen pocos métodos publicados que consigan igualar o superar las sensibilidades obtenidas mediante la utilización de los cartuchos Bond Elut. Solamente se han encontrado tres trabajos en los que se obtienen mejores sensibilidades, pero solamente para el caso de la BE (Abusada y cols.61: 6,52 ng/g, Lombardero y cols.62: 5 ng/g y Lewis y cols.63: 5 ng/g). En cuanto a los restantes parámetros de validación, ambos métodos analíticos cumplieron todos los criterios en relación con la selectividad, linealidad, precisión, exactitud y rendimiento. No ha sido publicado ningún método completamente validado para la determinación simultánea de los cinco analitos de interés en muestras de meconio mediante GC-MS, por lo que los métodos presentados en esta Tesis son los primeros completamente validados para este fin. Discusión 307   11.3.4 APLICACIÓNACASOSREALES 11.3.4.1 EXTRACCIÓNCONWATERSOASIS®HLB El método desarrollado ha sido aplicado a 30 muestras de meconio procedentes del Servicio de Neonatología del Hospital Clínico de Santiago de Compostela y remitidas al Servicio de Toxicología del IUML de Santiago tras observase una sospecha clínica de consumo de drogas durante el embarazo. Las concentraciones de los casos positivos a COC oscilaron entre 45,38 y 1864 ng/g, con un valor medio de 783 ng/g para la COC; y entre 50,12 y 1594 ng/g, con un valor medio de 593,2 ng/g para la BE. En el caso de los positivos a los opioides en estudio, las concentraciones de COD oscilaron entre 60,95 y 600,4 ng/g, con un valor medio de 235,2 ng/g; para la MOR entre 124,9 y 825,3 ng/g, con un valor medio de 323,2 ng/g y para la 6-MAM entre 100,9 y 1350 ng/g, con un valor medio de 568,2 ng/g. Estos niveles están en consonancia con los obtenidos en estudios similares realizados por otros autores (Tabla 11.5). Tabla 11.5. Revisión bibliográfica de los niveles de concentración hallados en muestras de meconio. REFERENCIA Concentración meconio (ng/g) COC BE COD MOR 6-MAM DiGregorio50 100-560 100-480 - - - ElSohly60 35-1519 - 21-144 39-507 - Abusada61 8,3-2918,8 193,1-2666,4 - - - Browne64 240-780 - - - - Casanova65 16-2917 112-3090 - - - Lewis66 5-10000 5-10000 - - - Moriya67 - 487-1730 - - - Oyler68 44,2-1294,3 52,7-1296,7 - - - Es necesario señalar que en la mayoría de las muestras de meconio analizadas, la concentración de COC fue mayor que la de BE y la concentración de 6-MAM mayor que la de MOR y COD. Según algunos autores, la COC y la 6-MAM pueden considerarse como los mejores indicadores diagnósticos del consumo de COC y HER, respectivamente, en las muestras de meconio69,70. Este hecho ilustra la acumulación del principio activo y/o metabolitos  Discusión Discusión  308  primarios de la droga en esta matriz junto con la escasa presencia de metabolitos secundarios, lo que concuerda con estudios previos en modelos animales y humanos que demuestran que las drogas intactas se pueden acumular en el líquido amniótico con la posibilidad de reciclado a la circulación y persistencia en el feto71,72, y que los procesos metabólicos y de eliminación en el feto en desarrollo son bastante diferentes de los descritos en adultos73. En base a estos estudios, las altas concentraciones de COC y 6-MAM encontradas en el meconio confirman el consumo materno de COC y HER, respectivamente. Se excluye, por tanto, el consumo de antitusígenos que se dispensan sin receta, analgésicos o preparados antidiarreicos que contienen derivados opiáceos. 11.3.4.2 EXTRACCIÓNCONBONDELUTCERTIFY® El método desarrollado ha sido aplicado a 3 muestras consecutivas del meconio (1er, 2o y 3er día postnacimiento) de un recién nacido con síntomas de hiperexcitabilidad, en cuya madre había sido confirmado el consumo de drogas mediante la técnica EMIT en el propio hospital. Muestras consecutivas de la orina (14, 34, 60, 80 y 103 horas) del recién nacido también han sido analizadas utilizando el enzimoinmunoensayo COBAS. La confirmación de los casos positivos ha sido realizada mediante GC-MS. De los análisis de las muestras de orina y meconio se demuestra la existencia de COC, BE, COD y MOR, siendo la BE y la COD los analitos mayoritarios. La presencia de COD en mayor concentración que la MOR, junto con el hecho de que durante las primeras horas de vida del recién nacido no se hayan observado síntomas asociados al síndrome de abstinencia (típico del consumo de HER durante la gestación), nos lleva a pensar que el consumo materno de opioides fue predominantemente COD. Los análisis de las muestras consecutivas, tanto de orina como de meconio, ponen de manifiesto una disminución de la cantidad de droga a medida que los días pasan, desapareciendo al tercer día postnacimiento. Resultados similares han sido encontrados por otros autores65,67. Discusión 309  La presencia de tóxicos en el meconio del segundo día se debe a que la evacuación completa del meconio es lenta, por lo que algunos autores74 afirman que la detección de droga en el meconio con fines de diagnóstico es factible aún transcurridos 2-3 días desde el parto. Sin embargo, en nuestro estudio hemos observado que el meconio del tercer día está ya libre de droga. Esto se explica debido a que el meconio de los dos primeros días es un meconio que se ha formado en el útero y por lo tanto refleja la exposición a drogas de la madre, mientras que a partir del tercer día las heces son probablemente una mezcla de meconio y de heces formadas después del nacimiento (exentas de droga). 11.4 APLICACIÓNAMUESTRASDEVELLOPÚBICO MATERNOYMECONIO 11.4.1 RESULTADOS Los métodos de determinación de COC y opioides en pelo y en meconio (usando extracción con cartuchos Bond Elut Certify) fueron aplicados a 90 muestras pareadas de vello púbico materno y meconio del recién nacido recogidas entre abril y junio de 2007, tal como se ha indicado en el Capítulo 10. El rango de concentraciones detectado mediante GC-MS en los casos positivos para cada uno de los analitos analizados se resume en la siguiente tabla. Tabla 11.6. Rango y valor medio de las concentraciones detectadas en cada una de las muestras. Comp Rango vello púbico (ng/mg) Valor medio vello púbico (ng/mg) Rango meconio (ng/g) Valor medio meconio (ng/g) COC 0,565-45,41 8,25 10,74-2363 653 BE 0,632-18,72 5,217 16,57-3854 1133 COD 0,518-1,523 0,965 144-5,558 54,85 MOR 4,906-7,347 6,126 2483-24,34 1254 6-MAM 0,564 0,564 0 0 En las muestras de vello púbico positivas puede observarse, en la mayoría de los casos, que la concentración de COC es superior a la concentración de BE. Sin embargo en las muestras de meconio, excepto en un caso, la concentración de BE ha sido superior a la concentración de COC.  Discusión Discusión  310  En cuanto a los opioides, no es posible establecer una clara relación entre ellos en las muestras de vello púbico y de meconio puesto que no han sido detectados conjuntamente en la mayoría de los casos. Solamente se ha podido establecer relación entre la COD y la MOR en un único caso en el que ambos analitos estaban presentes, siendo la MOR el analito mayoritario tanto en el vello púbico como en el meconio. En lo referente a la relación entre la concentración de analito encontrada en el vello púbico y en el meconio, cabe indicar que, en la mayoría de los casos, la concentración de analito encontrada en el vello púbico ha sido superior a la encontrada en el meconio. Estos resultados concuerdan con los indicados en estudios similares (Tabla 11.7). Tabla 11.7. Revisión bibliográfica de los niveles de concentración hallados en muestras de pelo materno y de meconio del recién nacido. Comp DiGregorio50 Vinner51 Potter75 Rango pelo M (ng/mg) Rango meconio (ng/g) Rango pelo M (ng/mg) Rango meconio (ng/g) Rango pelo M (ng/mg) Rango meconio (ng/g) COC 1,8-421 100-5600 - - - - BE 1,3-183,6 100-4800 0,8-3,1 0 - - COD - - - - 2,0-27,6 15-162 MOR - - - - 2,9-16,9 12-2125 6-MAM - - - - 2,4-32,6 0 Los valores reflejados en la tabla para las muestras maternas se refieren a cabello y no a muestras de vello púbico. No se ha encontrado en la bibliografía ningún estudio donde se relacione el vello púbico materno con el meconio del recién nacido. Sin embargo, tal como se ha explicado anteriormente, algunos estudios establecen que la concentración de drogas encontrada en el vello púbico es más alta que la encontrada en el cabello. 11.4.2 ANÁLISISDELOSRESULTADOS 11.4.2.1 ANÁLISISESTADÍSTICOBÁSICO La matriz de correlación ha demostrado que existe una buena correlación entre la COC y la BE en la madre, lo que quiere decir que la concentración de BE aumenta proporcionalmente en todas las muestras al aumentar la concentración de COC. En este Discusión 311   caso, a diferencia de lo que ocurría en la aplicación a muestras de vello púbico materno y cabello del recién nacido, la correlación observada entre la COC y la BE en la madre ha sido más baja que en el recién nacido. Para los opioides estudiados solamente se ha encontrado correlación para la COD y la MOR en el recién nacido, es decir, que la concentración de MOR aumenta proporcionalmente en todas las muestras al aumentar la concentración de COD. Es necesario indicar que los opioides estudiados han sido detectados en un bajo número de casos. La 6-MAM ha sido negativa en el recién nacido en todos los casos y en la madre solo ha sido positiva en uno, donde la concentración encontrada ha sido muy baja, lo que implica que no ha existido consumo de HER en los casos analizados. De la misma forma, se ha demostrado que existe una buena correlación entre las muestras de vello púbico materno y las de meconio del recién nacido para la COC y la BE, es decir, que las concentraciones de COC y de BE en el recién nacido aumentan proporcionalmente en todas las muestras al aumentar la concentración de COC en la madre, y las concentraciones de COC y BE en el recién nacido aumentan proporcionalmente en todas las muestras al aumentar la concentración de BE en la madre. Sin embargo, para los opioides estudiados no se han podido establecer correlaciones entre la madre y en el recién nacido. 11.4.2.2 RELACIÓNENTRELOSRESULTADOSPOSITIVOSYNEGATIVOS ENLAMADREYELRECIÉNNACIDO Se ha establecido también una relación entre las muestras de vello púbico materno y las de meconio del recién nacido en función de si los resultados de screening y/o confirmación han sido positivos o negativos para cada uno de los analitos estudiados. En base a esto se ha observado una buena concordancia en los resultados de positividad y negatividad para los compuestos estudiados (COC: 98%, BE: 100%, COD: 98%, MOR: 100% y 6-MAM: 99%). Ostrea y cols.77 han observado para la COC una mejor correlación en las muestras de cabello materno y meconio del recién nacido (COC: 96% y HER: 73%). En nuestro caso sólo son significativas las correlaciones observadas para la COC, la BE y la COD, pues la MOR y la 6-MAM han sido detectadas en un bajo número de casos.  Discusión Discusión  312  La falta de concordancia observada se debe sobre todo a la existencia de resultados positivos para la madre y negativos para el recién nacido, lo que puede ser atribuido a la falta de suficiente muestra de meconio en algunos recién nacidos o al escaso consumo materno durante el embarazo. 11.4.2.3 RELACIÓNENTREELCONSUMOMATERNOYLASPOSIBLES ALTERACIONESENELRECIÉNNACIDO En lo referente a las patologías detectadas en uno de los recién nacidos (cir, nacimiento mediante cesárea y bajo peso) cabe señalar que ha sido en el meconio de este recién nacido en el que se ha detectado una mayor concentración de COC y BE. En el vello púbico de la madre también han sido detectadas altas concentraciones de estos analitos, sin embargo, en ambas muestras la concentración de opioides ha sido negativa. Estos resultados concuerdan con los presentados en un estudio anterior llevado a cabo por Mirochnick y cols.76 en el que demostraron que la concentración de BE detectada en el meconio del recién nacido está inversamente relacionada con el crecimiento fetal (peso, tamaño y circunferencia de la cabeza al nacer), lo que indica que existe una relación dosis-respuesta entre la exposición prenatal a la COC y el retraso del crecimiento fetal. 11.4.2.4 INCIDENCIADELCONSUMODECOCAÍNAYOPIOIDESENEL EMBARAZO La tasa de positivos a COC, opioides o combinación de ambas fue superior en las muestras de vello púbico materno que en las de meconio, lo que concuerda con los resultados obtenidos por otros autores77-79. El análisis del vello púbico materno y del meconio del recién nacido demostraron una positividad para la COC del 4% y del 2%, respectivamente; para los opioides del 3 y del 2%, respectivamente; y para la combinación de COC y opioides del 2% en ambas muestras analizadas. Esta incidencia es relativamente baja si se compara con la prevalencia de drogas observada en América que se sitúa entre el 0,5 y el 50%, como ya se ha comentado anteriormente. Sin embargo esta incidencia ha resultado ser más elevada que la encontrada en dos estudios similares llevados a cabo en Barcelona, donde Discusión 313   el análisis de la orina materna demostró una positividad del 0,8% para la COC y del 1,7% para la HER80, y en el otro estudio70 la prevalencia observada en el meconio fue del 2,6% para la COC y del 4,7% para la HER. La entrevista materna realizada a las mujeres incluidas en el estudio no detectó ningún caso de consumo, ni crónico ni esporádico, de COC y/o HER durante la gestación, observándose nuevamente una infradeclaración del consumo de drogas por parte de la mujer embarazada. Es necesario indicar también que mediante sospecha clínica solamente se habría podido detectar la exposición intrauterina a drogas en uno de los 90 recién nacidos (1,1%), en base a los síntomas que éste presentaba (cir, nacimiento mediante cesárea y bajo peso), sin embargo los otros 9 casos positivos, puestos de manifiesto mediante los análisis de ambas muestras, pasarían desapercibidos durante la estancia de la madre y el recién nacido en el hospital, puesto que las madres no se incluían en el perfil típico de consumo y los recién nacidos no manifestaban ningún síntoma. Esto datos ponen de manifiesto que el consumo de ciertas drogas de abuso durante la gestación puede estar infradiagnosticado en el medio hospitalario.   Discusión Discusión  314  REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Chiarotti M. Overview on extraction procedures. Forensic Sci Int 63(1-3) (1993) 161-170. 2. Pragst F, Balikova M A. State of the art in hair analysis for detection of drug and alcohol abuse. Clin Chim Acta 370(1-2) (2006) 17-49. 3. Srogi K. Hair analysis as method for determination of level of drugs and pharmaceutical in human body: Review of chromatographic procedures. Anal Lett 39(2) (2006) 231-258. 4. Morrison JF, Chesler SN, Yoo WJ, Selavka CM. Matrix and modifier effects in the supercritical fluid extraction of cocaine and benzoylecgonine from human hair. Anal Chem 70(1) (1998) 163-172. 5. Allen DL, Oliver JS. The use of supercritical fluid extraction for the determination of amphetamines in hair. Forensic Sci Int 107(1-3) (2000) 191-199. 6. 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Todos los parámetros y criterios de validación se situaron dentro de los valores admitidos en las guías de las diferentes organizaciones internacionales. 2. El proceso de extracción utilizado en ambas muestras fue la extracción en fase sólida. El mismo proceso de extracción utilizando columnas Oasis® HLB ha proporcionado excelentes rendimientos en las muestras de pelo y meconio, sin embargo en el caso del meconio, con el empleo de columnas Bond Elut Certify® se consiguieron límites de detección y cuantificación más bajos. 3. El método de determinación de los cinco analitos en pelo fue aplicado con éxito a muestras de pelo pertenecientes a consumidores de cocaína y/o heroína, siendo la cocaína y la 6-monoacetilmorfina los principales analitos encontrados. 4. El análisis del meconio consecutivo de un recién nacido con síntomas de hiperexcitabilidad ha demostrado que a partir del tercer día las drogas y sus metabolitos desaparecen del meconio. 5. Los métodos analíticos de determinación de los cinco analitos en pelo y meconio fueron aplicados a muestras pareadas de vello púbico materno y cabello del recién nacido y a muestras también pareadas de vello púbico materno y meconio del recién nacido. La incidencia de los opioides, así como de la combinación de cocaína y opioides ha sido baja en los casos analizados, mientras que la incidencia de la cocaína se ha situado entre el 2 y el 41%, observándose una mayor tasa de resultados positivos en las muestras maternas.  Conclusiones Conclusiones 326  6. Se han observado en algunos recién nacidos de madres consumidoras de cocaína, alteraciones clínicas tales como síndrome de abstinencia neonatal, bajo peso, crecimiento intrauterino retardado, parto prematuro y nacimiento mediante cesárea. Sin embargo, en otros recién nacidos expuestos a cocaína y/o opioides en el embarazo, no se ha observado ningún síntoma, por lo que el análisis de estas muestras (pelo y meconio) sirve para detectar este consumo de drogas oculto, proporcionando la base para un tratamiento médico y un seguimiento social adecuado. 7. Se ha constatado una falta de veracidad en las declaraciones de las mujeres embarazadas sobre el consumo de drogas, siendo ésta incompleta o inexistente, lo que convierte al análisis del pelo y del meconio en una herramienta analítica fundamental y con una mayor fiabilidad que la entrevista materna para la identificación de los recién nacidos expuestos a drogas de abuso durante el embarazo.