Células madre en la tiroides postnatal: identificación y función

TESE DE DOUTORAMENTO CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES POSTNATAL: IDENTIFICACIÓN Y FUNCIÓN Fernando Oroz Gonjar ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN ENDOCRINOLOGÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA / LUGO ANO 2020 DECLARACIÓN DO AUTOR/A DA TESE CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES POSTNATAL: IDENTIFICACIÓN Y FUNCIÓN D. Fernando Oroz Gonjar Presento a miña tese, seguindo o procedemento axeitado ao Regulamento, e declaro que: 1) A tese abarca os resultados da elaboración do meu traballo. 2) De selo caso, na tese faise referencia ás colaboracións que tivo este traballo. 3) A tese é a versión definitiva presentada para a súa defensa e coincide coa versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que a tese non incorre en ningún tipo de plaxio doutros autores nin de traballos presentados por min para a obtención doutros títulos. En Santiago de Compostela., 21 de junio de 2020 Asdo. .. AUTORIZACIÓN DO DIRECTOR / TITOR DA TESE CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES POSTNATAL: IDENTIFICACIÓN Y FUNCIÓN D./Dna. Clara Álvarez Villamarín INFORMA/N: Que a presente tese, correspóndese co traballo realizado por D/Dna. Fernando Oroz Gonjar, baixo a miña dirección, e a utorizo a súa presentación , considerando que reúne os r equisitos esixidos no R egulamento de Estudos de Doutoramento da USC, e que como director desta non incorre nas causas de abstención establecidas na Lei 40/2015. En Santiago de Compostela, 21 de junio de 2020 Asdo. ........... DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES El doctorando declara que no tiene ningún conflicto de interés. Este estudio ha sido financiado por la Agencia Estatal de Investigación y Fondo Social Europeo, Proyectos BFU2013-46109-R y BFU2016-76973-R FEDER Titulado: Implicaciones fisiopatológicas de los mecanismos de recambio y proliferación, benigna y maligna, de las células foliculares tiroideas humanas y de glándulas endocrinas, siendo investigador principal la Prof. Clara V Álvarez. El doctorando Fernando Oroz Gonjar ha sido financiado por una beca F.P.I. adscrita al proyecto BFU2013-46109-R FEDER, con el código BES-2014-071031 AGRADECIMIENTOS Índice 17 ÍNDICE ............................................................................................................................. 15 ABREVIATURAS ........................................................................................................... 22 INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 28 1 LA GLÁNDULATIROIDES ....................................................................................... 30 ANATOMÍA ............................................................................................................... 30 EL FENOTIPO TIROIDEO .............................................................................................. 32 ACCIONES Y METABOLISMO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS ...................................... 32 SÍNTESIS DE HORMONAS TIROIDEAS .......................................................................... 34 EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-TIROIDES ....................................................................... 36 2 PATOLOGÍAS TIROIDEAS POR HIPERPLASIA BENIGNA: EL BOCIO ....... 39 BREVE RESUMEN DE LOS TUMORES DE LA GLÁNDULA TIROIDES ............................... 39 BOCIO MULTINODULAR (MNG) ................................................................................ 41 EL HIPOTIROIDISMO. MODELOS ANIMALES DE HIPOTIROIDISMO PRIMARIO ............... 42 3 CÉLULAS MADRE ADULTAS (ASC) ..................................................................... 44 NICHO DE CÉLULAS MADRE ...................................................................................... 44 RUTAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN EL COMPORTAMIENTO DE LAS ASCS ....... 46 MARCADORES COMUNES EN ASCS ........................................................................... 48 ASCS EN ÓRGANOS ENDOCRINOS ............................................................................. 49 ASCS EN TIROIDES .................................................................................................... 51 CANCER STEM CELLS (CSCS) EN TIROIDES ................................................................ 52 4 SOX2 .............................................................................................................................. 53 CARACTERÍSTICAS GENERALES ................................................................................. 53 FUNCIONES DE SOX2 EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE DIFERENTES TEJIDOS .... 54 SOX2 ES ESENCIAL PARA EL MANTENIMIENTO DE LA CAPACIDAD “STEM” DE LAS CÉLULAS. ............................................................................................................................... 54 REGULACIÓN DE SOX2 .............................................................................................. 56 MOLÉCULAS REGULADAS MEDIANTE LA EXPRESIÓN DE SOX2 .................................. 56 OBJETIVOS .................................................................................................................... 59 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 63 1 EXPERIMENTOS IN VIVO ....................................................................................... 65 ASPECTOS ÉTICOS DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN ........................................... 65 MODELO DE RATÓN B6;129S-SOX2TM1(CRE/ERT2)HOCH/J Y B6- 129GT(ROSA)26SORTM2SHO/J ................................................................................................ 65 GENOTIPADO DE RATONES ........................................................................................ 67 Genotipado para B6;129S-Sox2tm1(cre/ERT2)Hoch/J ............................................... 67 Genotipado para Ratón B6-129Gt(ROSA)26Sortm2Sho/J .................................. 68 PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE TAMOXIFENO ................................................. 69 ADMINISTRACIÓN DE EDU (5-ETINIL-2’-DEOXIURIDINA) ......................................... 70 EXTRACCIÓN DE SUERO Y MEDICIÓN DE PESOS ......................................................... 70 HIPOTIROIDISMO MEDIADO POR PTU (PROPYLTHIOURACIL). ..................................... 70 PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES Y RECOGIDA DE MUESTRAS Y TEJIDOS ....................... 71 18 Preparación de las muestras para inmunofluorescencia ................................... 72 Preparación de muestras para el análisis del ARN. ......................................... 72 MODELO DE DESARROLLO DE LA TIROIDES .............................................................. 73 MODELO DE HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL ........................................................... 73 2 CULTIVO CELULAR ................................................................................................ 74 CULTIVOS PRIMARIOS DE CÉLULAS FOLICULARES TIROIDEAS HUMANAS .................. 74 Aspectos éticos ................................................................................................. 74 Cultivos celulares humanos ............................................................................. 74 Cultivos celulares de tejido de tiroides de ratón. Formación de tirosferas e inmunofluorescencia aplicada a las mismas. ................................................................... 75 3 ESTUDIO DE PROTEÍNAS ....................................................................................... 77 WESTERN BLOT ........................................................................................................ 77 Extracción de proteína ..................................................................................... 77 Método de extracción de proteína con SDS y tampón de Shlessinger ..... 77 Método de extracción de proteína de tejido de ratón ................................ 78 Cuantificación de la concentración de proteína ............................................... 78 Electroforesis y transferencia de proteínas ...................................................... 79 Inmunodetección .............................................................................................. 80 INMUNOFLUORESCENCIA E INMUNOHISTOQUÍMICA .................................................. 82 Inmunofluorescencia en tejidos de tiroides de ratón ........................................ 82 Inmunofluorescencia en cultivo. ...................................................................... 83 Inmunohistoquímica en tejido de tiroides de ratón .......................................... 84 Inmunofluorescencia con el uso de TSAs (Tyramide Signal Amplification) ... 85 ELISA .............................................................................................................. 85 MICROSCOPÍA .......................................................................................................... 86 Microscopía óptica ........................................................................................... 86 Microscopía confocal ....................................................................................... 86 Microscopía Light-Sheet .................................................................................. 86 4 ESTUDIOS DE ADN ................................................................................................... 88 EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE CULTIVO/TEJIDO ................ 88 GENOTIPADO DE RATONES ....................................................................................... 88 Extracción de ADN .......................................................................................... 88 5 ESTUDIOS DE ARN ................................................................................................... 88 EXTRACCIÓN ARN ................................................................................................... 88 SÍNTESIS DE ADNC A PARTIR DE ARN MEDIANTE RETROTRANSCRIPCIÓN. .............. 89 PCR CUANTITATIVA ................................................................................................. 89 6 ANALISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................ 90 TEST PARAMÉTRICOS ............................................................................................... 91 TEST NO PARAMÉTRICOS .......................................................................................... 91 RESULTADOS ............................................................................................................... 93 1 CARACTERIZACIÓN DE LA POBLACIÓN SOX2 EN RATONES NORMALES .................................................................................................................................................. 95 EXPRESIÓN DE SOX2 A NIVEL DE ARN. .................................................................. 95 Índice 19 CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE SOX2 ............................ 96 Expresión de Sox2 mediante Western-Blot en ratones ........................................ ................................................................................................................................... 97 Estandarización de la tinción de secciones de tejido de ratón hembra de 90 días por IHQ con diferentes anticuerpos de Sox2 .................................................................... 97 Colocalización de diferentes marcadores en las células Sox2 positivas en ratones hembras de 90 días. .......................................................................................................... 99 DISTRIBUCIÓN POSICIONAL DE LA POBLACIÓN SOX2 EN LA GLÁNDULA TIROIDES COMPLETA ........................................................................................................................... 110 DISTRIBUCIÓN DE LA POBLACIÓN SOX2 A TRAVÉS DE MICROSCOPÍA LIGHT-SHEET. ............................................................................................................................................ 111 2 MODELOS DE RECLUTAMIENTO DE CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES: TRACEADO DE LA POBLACIÓN SOX2 EN EL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXPEGFP ...................................................................................................................................... 113 CARACTERIZACIÓN EN LA TIROIDES DEL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP TRAS TAMOXIFEN (TAM) A TIEMPO CORTO O LARGO. .................................................................. 113 Inmunohistoquímica de SOX2 con tamoxifen a lo largo del tiempo frente a controles en la tráquea .................................................................................................... 113 Inmunofluorescencia para GFP en la tráquea y en la tiroides tras tamoxifen en ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP ................................................................................... ................................................................................................................................. 117 MODELO DE RECLUTAMIENTO INDUCIDO POR HIPOTIROIDISMO FARMACOLÓGICO .. 117 El hipotiroidismo inducido en ratones hembra mediante PTU disminuye la cantidad de T4 libre en sangre alcanzando niveles de hipotiroidismo moderado. ......... 118 Aumento en la expresión del ARN de SOX2 en ratones hipotiroideos de 3, 6 y 12 días ............................................................................................................................. 119 El hipotiroidismo de 12 días en ratones hembra C57BL/6 aumenta la expresión de la proteína SOX2 ....................................................................................................... 121 Expansión de la población de células SOX2 en ratones hipotiroideos de 12 días. ........................................................................................................................................ 122 TRAZAMIENTO DE CÉLULAS SOX2 EN RATONES HIPOTIROIDEOS FRENTE A CONTROLES EN EL MODELO B6;129S-SOX2TM1(CRE/ERT2)HOCH/J « RATÓN B6-129GT(ROSA)26SORTM2SHO/J (SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP) ......................................................................................... 124 3 HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL ...................................................................... 128 4 MODELOS DE DESARROLLO DE LA GLÁNDULA TIROIDES ..................... 138 5 GENERACIÓN DE TIROSFERAS ......................................................................... 146 GENERACIÓN DE TIROSFERAS PRIMARIAS ............................................................... 146 GENERACIÓN DE TIROSFERAS SECUNDARIAS Y TERCIARIAS .................................... 148 INMUNOFLUORESCENCIA EN TIROSFERAS ............................................................... 149 DIFERENCIACIÓN TIROSFERAS ................................................................................ 149 6 EXPRESIÓN DE SOX2 EN TEJIDO Y CULTIVO CELULAR DE TIROIDES HUMANO .............................................................................................................................. 152 EXPRESIÓN DE SOX2 TANTO EN CULTIVOS CELULARES DE TIROIDES NORMAL (T-NT) Y BOCIOS MULTINODULARES (T-MNG) COMO EN SUS PROPIOS TEJIDOS A NIVEL DE ARN MENSAJERO, PERO NO HAY DIFERENCIAS ENTRE ELLOS. ....................................................... 152 20 AUMENTO EN LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA SOX2 EN CULTIVOS HUMANOS DE BOCIO MULTINODULAR (T-MNG), COMPARADO CON TIROIDES NORMAL (T-NT) .......................... 154 Estudio de la expresión de proteína Sox2 en cultivos primarios humanos .... 154 Estudio de la expresión de proteína Sox2 en cultivos primarios de tiroides humano ........................................................................................................................... 155 DISCUSIÓN .................................................................................................................. 161 CONCLUSIONES ......................................................................................................... 173 LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 177 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................... 182 22 ABREVIATURAS FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 24 ABCG2: transportador de membrana ATP-binding cassette transporter G2. ASCs: Adult Stem Cells. Células madre adultas. ATC: Undifferentiated or Anaplastic Thyroid Carcinoma. Carcinoma Indiferenciado de Tiroides BMP Bone Morphogenetic Protein. BrdU Bromo-deoxiuridina. BSA: Bovine Seric Albumin. Albúmina de suero bovino. D1/D2/D3: Desyodasa 1, 2 y 3, respectivamente. DPPA4: Developmental pluripotency Associated 4. DTC: Differentiated Thyroid Carcinoma. Carcinoma diferenciado de tiroides. DUOX: Dual Oxydase. Edu: 5-etinil-2’-deoxiuridina. EGFP: Enhanced Green Fluorescent Protein. EGFR: Epidermal grow factor receptor. Receptor del factor de crecimiento epidérmico. ESCs: Embryonic Stem Cells. Células madre embrionarias. FGSC: Female germline stem cell. Célula madre germinal femenina. GFAP: Glial Fibrillary Acidic Protein. Proteína Ácida Fibrilar Glial. GFR a 2: GDNF Family Receptor a -2. Gli1: Zinc finger protein Gli1. GMO: Genetically Modified Organism. Organismo Genéticamente modificado. HMG: High-movility group. Grupo de alta movilidad. Dominio del ADN capaz de moverse rápidamente para regular el genoma. HFSCs: Hair follicle stem cells. Células madre del folículo piloso. HNF4 a : Hepatocyte nuclear factor a 4. Factor nuclear hepático a4. HSCs: Hematopoietic Stem Cells. Células Madre Hematopoyéticas. IAP: Inhibitor of apoptosis. iPSs: Induced Pluripotent Stem Cells. Células Madre Pluripotentes Inducidas. ISCs: Intestinal Stem Cells. Células Madre Intestinales. Klf4: Kruppel-like factor 4. LHX2: LIM homebox 2. Regulador transcripcional. MCT8/MCT10: Monocarboxylate Transporter. Transportadores de hormonas tiroideas. Abreviaturas 25 MIT/DIT: Mono-yodotironina / Di-yodotironina. MNG: Multinodular Goiter. Bocio Multinodular. NIS: Na+/I- Symporter. Simportador basal de yodo. NPY: Neuropeptide Y. NSCs: Neural Stem Cells. OATP1C1: Organic Anion Transporter Polypeptide. Polipéptido Transportador de Aniones Orgánicos. Oct4/POU5F1: Octamer-binding Transcription Factor 4. OSCs: Oogonial Stem Cells. PAX8: Paired Box Gene-8 Protein. Factor de transcripción determinante de la tiroides. PCR: Polymerase Chain reaction. Reacción en cadena de la polimerasa. PDTC: Poorly Differentiated Thyroid Carcinoma. Carcinoma de Tiroides Pobremente Diferenciado. Prop1: Prophet of Pit1. Factor de transcripción determinante de la hipófisis. PTH: Parathyroid Hormone. Hormona Paratiroidea. PTU: Propiltiouracilo SCs: Satellite Cells. Células satétite musculares. SDS: Sodium Dodecyl Sulfate. Dodecilsulfato sódico. Sf1: Steroidogenic factor 1. SHH: Sonic Hedgehog. Sox2: SRY-box 2. Sry: Sex-determining región Y. Región determinante del sexo Y. SVZ/SGZ: Subventricular/Subgranular Zone. Zona subventricular y Zona Subgranular. Regiones cerebrales donde se localizan células madre adultas neuronales. TAM: Tamoxifeno. T3/T4: Triyodotironina / Tetrayodotironina (Tiroxina). TBG: Thyroxine-binding Globulin, proteína transportadora de hormonas tiroideas. TCF4: factor de transcripción T-cell factor 4. Tg: Tiroglobulina. TPO: Tiroperoxidasa TRH: Thyrotropin-Release Hormone. Hormona liberadora de Tirotropina. TSH: Thyroid-Stimulating Hormone. Hormona estimuladora de Tiroides. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 32 EL FENOTIPO TIROIDEO Para la formación de las hormonas tiroideas, T4 o tiroxina y T3 o triyodotironina, son necesarios dos componentes principales: la tiroglobulina (Tg), proteína sintetizada por las células foliculares y secretada por el polo apical hacia la luz del folículo, y el yodo (I), procedente del torrente sanguíneo en forma de ion yoduro (I-) y captado por estas células para concentrarlo también en la luz folicular (imagen 1). Además de dichas moléculas, existen factores de transcripción igualmente necesarios para el correcto desarrollo y funcionamiento de la glándula. NKX2.1 (cuya proteína es clásicamente llamada factor de transcripción de tiroides 1 o TTF1) es un factor homeobox que se ha descrito como esencial para que la estructura de la glándula se desarrolle correctamente después de la especificación inicial en el endodermo, así como para su maduración5,6,7. El ratón knockout para TTF1 no desarrolla ni el epitelio folicular ni presenta células C, siendo imprescindible para ambas. PAX8 (Paired box gene-8 protein) es otro factor de transcripción esencial para la diferenciación de las células tiroideas perteneciente a la familia paired-box que se expresa en el epitelio folicular8. Se ha demostrado que la falta de dicho gen impide el desarrollo de las células que forman el epitelio de los folículos tiroideos pero no afecta a las células de calcitonina9. FOXE1 (Forhead box protein E1)/TTF2, es un factor de la familia forkhead que se expresa desde el inicio del desarrollo de la glándula10. Parece esencial en la especificación inicial de la glándula tiroides en el endodermo, ya que el ratón knockout presenta agenesia de tiroides y paladar hendido11. Estos tres factores de transcripción no son específicos de tejido tiroideo, pero su coexpresión simultánea en dicho tejido hace que la célula pueda diferenciarse en célula folicular de tiroides y pueda ejercer su función como productora y liberadora de hormonas tiroideas. Otras proteínas y enzimas también juegan un papel esencial para que el tirocito funcione correctamente. Los dos co-transportadores de yoduro, el simportador de Na+/I- llamado NIS o el antiportador de Cl-/I- Pendrina se requieren para el paso del yoduro al interior de la célula y después al coloide desde el torrente sanguíneo. (imagen 1). El complejo enzimático de la Tiroperoxidasa (TPO) junto a DUOX2 organifican el yoduro y hacen que dicho yodo se incorpore a la molécula de tiroglobulina en la luz del coloide. Por último, cabe destacar también el receptor de la hormona estimuladora de la tiroides (TSHR), principal regulador tanto de la síntesis, activando la expresión de todas estas proteínas del fenotipo, como de la secreción de las hormonas, además de ser responsable del trofismo del epitelio en cuanto a número de células. ACCIONES Y METABOLISMO DE LAS HORMONAS TIROIDEAS Las hormonas tiroideas regulan procesos metabólicos esenciales en el crecimiento y desarrollo; en la vida adulta, son las principales reguladoras del metabolismo basal12 (imagen 2)15. Está muy bien establecido que los niveles de hormonas tiroideas se encuentran directamente relacionadas con la masa corporal y el gasto energético13. Las hormonas tiroideas regulan procesos como el metabolismo del colesterol y los hidratos de carbono, activan el proceso de ß-oxidación de ácidos grasos y promueven la termogénesis. Son esenciales en el desarrollo del SNC durante la embriogénesis, ya que la falta de estas hormonas produce trastornos severos en el cerebro de individuos neonatos14. Introducción 33 Imagen 2. Vista general de los diferentes tejidos donde las hormonas tiroideas ejercen su acción. Reproducido con el permiso de Mullur et al ., 2014 15. Copyright © 2014 American Physiological Society. La mayoría de las acciones de las hormonas tiroideas sobre los tejidos se realizan mediante receptores nucleares que reconocen estas hormonas llamados THR (Thyroid Hormone Receptor), miembros de una superfamilia de factores de transcripción nucleares que responden a hormonas12 (imagen 2)15. Todos ellos comparten una estructura similar con un motivo de dedo de Zinc como dominio de unión al ADN, así como un dominio c-terminal que une coactivadores y correpresores12. Existen dos tipos de THR, la isoforma a y la ß; estos a su vez pueden sufrir modificaciones postraduccionales (como la sumoilación) que, dependiendo del tejido, harán que las hormonas ejerzan una acción u otra (algunas de ellas, dependiendo de la isoforma del THR, con efectos totalmente opuestos)16. Como se mencionó anteriormente, las hormonas tiroideas son el principal regulador del metabolismo energético, activando la fosforilación oxidativa mitocondrial mediante la activación de genes OXPHOS. Cuando la hormona se une a su receptor y forma un complejo, son capaces de unirse a secuencias específicas del ADN nuclear que también están presentes en el ADN de las mitocondrias, activando así en ambos genomas muchos de estos genes OXPHOS esenciales para que se produzca la fosforilación oxidativa17. La regulación específica de tejido para estas hormonas, además se realizarse mediante la expresión de diferentes isoformas de sus receptores, también se produce gracias a la interacción entre los niveles de hormonas circulantes y la conversión en el propio tejido de T4 a T3 y su transporte dentro de la célula diana. Por ejemplo, la respuesta al frío modulada por el tejido adiposo pardo implica la activación de receptores ß3-adrenérgicos. Estos promueven en el tejido un estado de “hipertiroidismo celular” producido por la activación de enzimas desyodasas tipo 2, implicadas en la conversión de T4 a su forma más activa T3. Todo esto produce la FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 34 activación de la transcripción de proteínas como UCP-1 que, en última instancia, desacoplan el proceso de generación de ATP en la fosforilación oxidativa en favor de la producción de calor18. Las acciones de las hormonas tiroideas sobre el metabolismo energético están bastante claras desde hace ya varias décadas; sin embargo, hasta hace solo diez años no se sabía que el SNC estaba muy implicado en estos eventos. Estudios en ratas demostraron que el hipotálamo es el principal regulador del balance energético de todo el organismo a través de la acción de las hormonas tiroideas en la ruta de AMPK. Para demostrarlo, utilizaron ratas hipotiroideas y ratas eutiroideass a las que se les administraba T3 directamente al cerebro; en ambos casos disminuía la actividad de AMPK, lo que incrementaba a su vez la actividad del Sistema Nervioso Simpático (SNS) activando marcadores termogénicos en el tejido adiposo marrón (BAT, Brown Adipose Tissue). Si se inhibía la ruta termogénica del núcleo ventromedial (VHM, Ventromedial Nucleus) del hipotálamo, la activación del BAT mediante hormonas tiroideas no se producía, revirtiéndose la pérdida de peso asociada al hipertiroidismo. El mecanismo regulatorio depende totalmente de AMPK, ya que la inhibición genética de esta proteína en el VHM de ratas eutiroideas induce pérdida de peso independiente de la alimentación, aumentando también la expresión de marcadores termogénicos en BAT19,20. SÍNTESIS DE HORMONAS TIROIDEAS El yodo que viaja por el torrente sanguíneo es captado por las células foliculares tiroideas a través de un mecanismo de transporte activo mediado por NIS (SLC5A5). Esta glicoproteína se encuentra presente en la membrana basal de los tirocitos, es decir, la parte celular en contacto con los capilares sanguíneos21. Además de expresarse en tiroides, NIS se expresa en otros tejidos como en las glándulas salivales, mucosa gástrica o en la glándula mamaria en periodo de lactancia; dependiendo del tejido donde se exprese, NIS puede sufrir diferentes modificaciones postraduccionales22,23. Aunque NIS tenga una alta afinidad por el yoduro, también se ha demostrado que es capaz de mediar el transporte de otros aniones, entre ellos perclorato24,25. Las Na+/K+ ATPasas son las responsables de que haya una diferencia de gradiente de Na+, el cual se encuentra mucho más concentrado en el exterior de la célula. Así, dos átomos de Na+ pasarán a través de NIS al interior celular a favor de gradiente junto con uno de yoduro en contra21. Para la correcta función de NIS es imprescindible su localización en el polo basal. Recientemente se ha identificado en el extremo citoplasmático C-terminal de NIS el motivo de aminoácidos responsable de esta localización, basado en Leucinas y aminoácidos ácidos (DD y EE), y conservada en todos los mamíferos26. Pendrina es el transportador encargado de que el yodo atraviese el polo apical de la célula folicular y llegue al coloide27. Esta proteína de membrana actúa como antiportador Cl-/I-, ya que expulsa iones yodo desde la célula a la luz del coloide a cambio de introducir un átomo de Clal citoplasma de la misma28. Pendrina se expresa exclusivamente en el oído interno, tiroides y riñón. Mutaciones en el gen de esta proteína transportadora originan el síndrome de Pendred, enfermedad caracterizada por sordera con malformaciones en el oído interno y aparición de bocios en etapas cercanas a la pubertad29,30. Normalmente los pacientes adultos son normotiroideos y no presentan niveles elevados en sangre de TSH. Hace algunos años, este laboratorio logró demostrar que tirocitos de pacientes con síndrome de Pendred eran capaces de almacenar hasta cinco veces más yodo en su interior que células de tiroides normal. La ausencia de alteraciones hormonales relacionadas con este evento se explicaría debido a que estas células son capaces de transportar el exceso de yodo hacia el coloide a través de la pendrina mutada o de otros transportadores, aunque de manera mucho más lenta31. Introducción 35 El yodo, una vez llega al interior del folículo, se une a residuos de tirosina situados en cadenas laterales de la molécula de tiroglobulina mediante reacción enzimática. Para que este proceso pueda llevarse a cabo, el yodo se oxida nada más entrar al coloide mediante una reacción catalizada por la enzima tiroperoxidasa o TPO, utilizando H2O2 como sustrato. La actividad enzimática de TPO es dependiente de su asociación con un grupo hemo32,33, ya que la inactivación química de su grupo prostético inactiva la enzima y su recombinación con otra proteína con grupo hemo restaura de nuevo su función34. TPO funciona como un dímero y se proponen varias posibles orientaciones de sus dos centros activos –dominios mieloperoxidasa- en Cis o en Trans, pero aún no resueltas35. Existen varios modelos animales en los que TPO deja de ser funcional, causando hipotiroidismos severos; los describiremos más adelante, en un apartado dedicado a dichos modelos. La producción de H2O2 necesaria para el proceso la realizan dos enzimas NADPH- dependientes llamadas DUOX 1 y 2 (Dual Oxidase 1 y 2 o THOX), descubiertas casi simultáneamente en dos laboratorios independientes36,37. DUOX1 y DUOX2 son dos genes contiguos en el cromosoma 15 junto con otros dos genes, DUOXA1 y DUOXA2, que son factores de maduración para que las oxidasas lleguen al polo apical38. El hecho de que DUOX2 está muy expresada en tiroides, que sólo las mutaciones de DUOX2 y DUOXA2 causan hipotiroidismo congénito en humanos, y que en modelos de ratón sólo la pérdida de Duox2 pero no Duox1 causa hipotirodismo indica que la enzima clave en tiroides es DUOX238. De hecho, algunas mutaciones de DUOX2 incluso están asociadas a disgénesis de la glándula tiroidea39. Sin embargo, recientemente se ha descrito un caso con mutación bialélica de DUOX2 y DUOX1 originando un fenotipo de hipotiroidismo muy marcado, sugiriendo que la actividad de DUOX1 compense la falta de DUOX2, y es por ello que las mutaciones de DUOX1 den un fenotipo más benigno que mutaciones en otros genes40. Tanto TPO como DUOX son glicoproteínas que se localizan en la membrana apical de las células foliculares de la tiroides. La Tiroglobulina (Tg) (330 kDa) es la proteína más abundante en la glándula tiroides, y especialmente en el coloide. La concentración en la luz del folículo puede llegar a alcanzar los 300 g/L y su principal función es la de proveer a la glándula de reservorio para la síntesis y acumulación de hormonas tiroideas41. Su producción está regulada por los mismos factores de transcripción específicos de tiroides que regulan la expresión de TPO: TTF1/NKx2.1, TTF2/FOXE2 y PAX842. La Tiroglobulina es una proteína glucosilada en 17 residuos distintos, contiene 60 puentes disulfuro intracatenarios y forma un dímero en el coloide adquiriendo un alto peso molecular y mucha estabilidad43. La Tg tiene 66 tirosinas en su secuencia pero sólo 30 de ellas se acoplan a yodo, y de estas últimas muy pocas van a ser donantes de su anillo yodado para la conjugación, y sólo cuatro van a ser aceptoras para formar tironinas44,45. Para la síntesis de hormonas tiroideas (T3 y T4) es necesaria la formación previa de dos tirosinas yodadas dentro de la Tg que, dependiendo si se unen uno o dos átomos de yodo previamente oxidado, se llamarán MIT (monoyodotirosina) o DIT (diyodotirosina), respectivamente. Muchos estudios han intentado demostrar el proceso exacto mediante el cual TPO cataliza la oxidación del yodo y su posterior unión al anillo de tirosina, pero el mecanismo todavía no está claro46,47,48. El paso final es el acoplamiento entre dos moléculas de DIT para formar la T4 o una molécula de MIT y una DIT para formar la T3. La reacción, como ya se dijo anteriormente, es catalizada por TPO y dependiente de H2O2, además de ser estrictamente dependiente de la estructura de la Tg49. Muy recientemente, se ha obtenido la estructura tridimensional por crio-microscopía electrónica del dímero de Tiroglobulina, y se ha confirmado ayudándose de un estudio mutacional y de síntesis in vitro50. Cada monómero tendrá un NTD-Core-Flap-Ar y CTD que se pliegan como formando un eslabón de una cadena. La estructura se basa en la dimerización FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 36 de los dominios C-terminales (CTD) de ambos monómeros, de forma que un NTD contacta con todos los dominios del monómero contrario. Se confirman 4 tirosinas aceptoras (A-Y24, B- Y2573, C-Y2766, y D-Y1310) y 5 tirosinas donantes (Y234 y Y149 donantes para A, Y2540 para B, Y2766 para C and Y108 para D). El sitio A está dentro del NTD, el sitio B y C quedan dentro del CTD, y el sitio D acerca el Flap del monómero contrario al NTD del primero. De cada dímero se obtienen 7 moléculas de T4, ya que el sitio C sólo es activo como aceptor en uno de los dos monómeros, mientras que los donantes parecen venir de ambos. Este trabajo seminal tiene sin embargo algunas cosas sin explicar, como por ejemplo que no hayan conseguido sintetizar T3 en su modelo. El mecanismo por el cual los folículos tiroideos generan las hormonas tiroideas funcionales a partir de las reservas de Tg madura están muy bien estudiados. Los tirocitos captan las moléculas de Tg mediante fagocitosis, aunque también se han propuesto otros mecanismos parecidos como la micro y la macropinocitosis51,52. Una vez dentro del tirocito, las Tg se fusionan con lisosomas que cortan los residuos de tironinas (principalmente T4 pero también T3) mediante escisión proteolítica. Se ha demostrado que las principales enzimas responsables de este proceso son las catepsinas, siendo las D, H y L las isoformas capaces de cortar moléculas de Tg53,54,55. La internalización de la Tg mediante endocitosis está regulada por la TSH52. La tiroxina tiene una vida media larga y una alta concentración en plasma sanguíneo. Esto es debido a su unión (junto con la T3 y otras yodotironinas) con las 3 principales proteínas transportadoras de hormonas tiroideas: TBG (thyroxine-binding globulin), TTR (transthyretin) y HSA (Human Serum Albumin); estas hormonas también pueden unirse a otras proteínas de la sangre tales como las lipoproteínas de alta densidad, pero sin apenas relevancia biológica56. Durante muchas décadas se pensaba que las hormonas tiroideas eran capaces de entrar a las células diana mediante difusión pasiva dada su naturaleza lipofílica. Sin embargo, evidencias publicadas a partir de los años 70 sirvieron para esclarecer que debía haber algún tipo de transportador específico y que la difusión pasiva hacia las células de la hormona, si la hubiera, sería limitado57,58. Hasta finales de los 90 no se empezaron a estudiar a nivel molecular el proceso mediante el cual las hormonas tiroideas atraviesan la membrana plasmática, momento en el que se descubrieron los principales transportadores: MCT8 y MCT10 (monocarboxylate transporter), OATP1C1 (Organic Anion Transporter Polypeptide) y, más recientemente, SLC17A459,60,61,62. Las desyodasas (DIO), enzimas transmembrana con su dominio catalítico orientado hacia el citosol63, son proteínas muy implicadas en las etapas finales del metabolismo de las hormonas tiroideas, así como de su inactivación en algunos casos. DIO1 y DIO2 son las encargadas de catalizar la conversión de T4 en T3, mucho más activa, pero con una vida media más corta que la primera. DIO3, por el contrario, se encarga de inactivar ambas hormonas64. EJE HIPOTÁLAMO-HIPÓFISIS-TIROIDES El eje hipotálamo-hipófisis-tiroides es el principal circuito regulador de la síntesis y secreción de hormonas tiroideas (imagen 3). Este sistema tiene como punto inicial el hipotálamo y sus neuronas productoras de TRH (Hormona Estimuladora de Tirotropina), que además de ser el principal estimulador de la liberación de TSH por parte de la adenohipófisis, interviene en otros procesos como el comportamiento frente a la comida o la termogénesis65. Existen varias zonas en el cerebro con neuronas productoras de TRH, pero solo aquellas localizadas en el núcleo paraventricular del hipotálamo son las responsables del control del eje. Las hormonas tiroideas ejercen una retroalimentación negativa sobre las neuronas TRH, ya que altos niveles de estas hormonas en sangre inhiben la secreción de más TRH, como se demostró en modelos Introducción 37 animales66. Además del control regulatorio negativo de las hormonas tiroideas, otros elementos relacionados con la nutrición, el metabolismo o el control de la temperatura también intervienen en la producción de TRH; entre ellos, entre ellos el neuropéptido Y (NPY), la leptina o la hormona estimuladora de melanocortina (a-MSH)67,68,69. La hipófisis, más concretamente la adenohipófisis o hipófisis anterior, es el segundo componente de este sistema y principal regulador de todo el sistema endocrino. Las células tirotropas son las encargadas de producir TSH cuando llegan estímulos de TRH por parte del hipotálamo. La TSH activa todos los pasos de la síntesis y secreción de hormonas tiroideas: aumenta la captación de yodo por los tirocitos, incorporación de este yodo a la Tg y producción de H2O2 por los mismos, cofactor esencial para la biosíntesis de hormonas. La endocitosis del coloide y la posterior hidrólisis de la Tg también se encuentran muy estimuladas por la TSH70. Además, la TSH tiene un papel esencial en la estimulación del crecimiento y maduración de los tirocitos70,71. El último componente del sistema, la propia glándula tiroides, ejerce una potente inhibición sobre en el hipotálamo en la liberación de TRH y sobre la hipófisis en la liberación de TSH. En este último caso, concretamente, las hormonas tiroideas regulan negativamente ambas unidades que conforman la TSH: la subunidad alfa y TSHß72. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 38 Imagen 3. Eje hipotálamo-hipófisis-tiroides. Las flechas en rojo indican regulación negativa y en verde regulación positiva. Reproducido de Ortiga-Carvalho et al., 20164. Copyright © 2016 American Physiological Society. En cuanto a los receptores, ya se habló de las acciones mediadas por la familia de receptores nucleares THR (receptor de hormonas tiroideas) en apartados anteriores, fundamentalmente de sus acciones sobre el genoma actuando como factor que regula muchos procesos transcripcionales. Estos receptores se localizan en el núcleo, donde se unirán al ADN mediante secuencias llamadas THEs (Thyroid Hormone Responsive elements) previa unión de ellos mismos con sus ligandos con una alta afinidad y especificidad12,73. El receptor de TSH (TSHR) Introducción 39 pertenece a la familia de receptores acoplados a proteínas G y se localiza en la membrana basolateral de los tirocitos74. Dependiendo de la concentración de THS en el microambiente, su mecanismo de acción puede encaminarse a la síntesis y secreción de hormonas tiroideas o a la activación de proliferación celular. En el primer caso, la TSH se unirá a su receptor produciendo la activación de la subunidad Gs de la proteína G, la cuál a su vez activa la adenilciclasa que aumentará los niveles de cAMP con la consecuente activación de PKA. Esta ruta de señalización es la responsable de la mayoría de los efectos que ejerce la TSH en el organismo4. Cuando la concentración de TSH llega a niveles más elevados, la vía de señalización cambia y en este caso se activan subunidades Gq que activarán a su vez la ruta del IP3 (Inositol trifosfato)- DAG (Diacilglicerol), aumentando el Ca2+ intracelular y la activación de PKC. Esta vía es responsable de la regulación del flujo de I-, la incorporación del mismo a la Tg y la generación de H2O270. 2 PATOLOGÍAS TIROIDEAS POR HIPERPLASIA: EL BOCIO BREVE RESUMEN DE LOS TUMORES DE LA GLÁNDULA TIROIDES Los tumores primarios pueden ser benignos o malignos, exceptuando si la neoplasia se origina en células C en cuyo caso el tumor solo puede ser maligno (aunque solo el 3% aproximadamente correspondería a este tipo de tumor)75. Los benignos, también llamados adenomas foliculares (más del 95% del total), representan la mayor parte de los tipos de tumores tiroideos en la población76. Los tumores malignos más comunes dentro de los órganos endocrinos corresponden a tumores tiroideos77; además, su incidencia ha aumentado un 4% en los últimos 20 años78,79. En términos generales en cuanto a su incidencia, es el segundo tipo de cáncer más común en mujeres y el séptimo en hombres en población de entre 20 y 49 años; en la población general, sería el quinto en incidencia en mujeres y el decimosexto en hombres80. Según la clasificación internacional de la OMS y dependiendo de dónde se origine, los tumores tiroideos pueden ser primarios, si se generan en la propia glándula tiroides o secundarios, si se originan en otros tejidos y mediante metástasis invaden el tejido tiroideo75(imagen 4). FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 40 Imagen 4. Modificado a partir del libro de la clasificación de tumores tiroideos de la OMS (Lloyd et al .,201776). Permitido por IARC. Los carcinomas de epitelio folicular se dividen en 3 grupos atendiendo a sus características histológicas y clínicas: • Carcinoma diferenciado (DTC “Differentiated Thyroid Carcinoma”), con un crecimiento lento y buena respuesta a la cirugía y al tratamiento con yodo radioactivo. Según el tipo de crecimiento, pueden dividirse, a su vez, en dos tipos. o Carcinoma papilar, que representa el 80% de todos los cánceres de tiroides y los principales responsables del aumento de incidencia de esta patología. Sus núcleos son muy característicos, suelen crecer en papilas e invaden por vía linfática. o Carcinoma papilar, que crece en folículos e invade por vía sanguínea. Introducción 41 • Carcinoma pobremente diferenciado (PDTC, “Poorly Differentiated Thyroid Carcinoma”) y • Carcinoma indiferenciado o anaplásico (ATC, “Undifferentiated or Anaplastic Thyroid Carcinoma”). Tiene una baja incidencia (2-5%), pero es el más agresivo de todos ( la mitad de los pacientes diagnosticados ya tienen metástasis). La media de supervivencia son 6 meses y tiene un 100% de mortalidad. BOCIO MULTINODULAR (MNG) El crecimiento excesivo de varias áreas de la glándula tiroides y su transformación estructural y/o funcional se conoce en clínica como bocio multinodular (MNG, multinodular goiter). Se ha descrito que hasta el 50% de la población general podría tener nódulos tiroideos aunque la mayoría no serían detectables por palpación y sería necesario el uso de otras técnicas como los ultrasonidos81,82. La etiología de la enfermedad tiene una parte genética y una esporádica. En cuanto a la aparición de la enfermedad por causas genéticas, aunque se ha demostrado en varias ocasiones la agregación familiar83,84, los estudios en dichas familias no han podido demostrar si la enfermedad es debida al componente genético que comparten estas familias o al componente ambiental. El MNG es la patología más común de la glándula tiroides; incluso en regiones no endémicas de bocio difuso por deficiencia de yodo, puede presentarse hasta en el 4% de la población general mayor de 30 años85. El factor ambiental más importante que contribuye a la aparición de bocio en casos esporádicos es la deficiencia de yodo85,86; de hecho, el tamaño de la glándula es inversamente proporcional a la excreción de yodo en la orina87. Otros factores como el género también están claramente implicados, ya que el ratio mujeres-hombres de bocio multinodular puede sobrepasar el 5:1 e incluso el 10:1, lo que deja muy claro que es mucho más frecuente en mujeres que en hombres. Existen más agentes de riesgo como podrían ser el tabaco88, el estrés emocional89 o ciertas drogas90. En endocrinología y según su fisiopatología, los bocios pueden dividirse en nontoxic goiter y TNG (Toxic Nodular Goiter). El primero corresponde a una expansión nodular o difusa sin procesos de inflamación o neoplasia y que no altera la función tiroidea normal. La evolución del nontoxic goiter varía a lo largo del tiempo: en fases iniciales, se produce una hiperplasia epitelial folicular de manera uniforme (bocio difuso) que aumenta la masa de la glándula; si el desorden persiste, la arquitectura tiroidea pierde uniformidad y se desarrollan áreas fibrosas intercaladas con áreas de hiperplasia focal (a lo que se le conoce como MNG o bocio multinodular). El TNG es el otro tipo de bocio en el que sí se produce una hiperfuncionalidad de la glándula. Esta enfermedad abarca desde la aparición de un único nódulo hiperfuncionante dentro de una tiroides multinodular a una glándula con múltiples áreas con hiperfunción (de ahí que pueda haber variantes genéticas entre nódulos). Por tanto, el crecimiento natural de los MNGs trae como consecuencia la aparición de varios nódulos. Si alguno de ellos adquiere características hiperfuncionantes (normalmente por mutaciones somáticas en la tirotropina o en la TSH) estaríamos hablando de un TNG; si no fuese el caso, correspondería con un nontoxic goiter91,92. La presencia de MNG en humanos siempre se ha asociado a un riesgo mucho más bajo de desarrollar cualquier tipo de neoplasia maligna en la tiroides que en casos donde se presenta un único nódulo. En los últimos años se ha demostrado que el riesgo de cáncer de tiroides es muy parecido tanto en individuos con un solo nódulo tiroideo como en aquellos que presentan algún tipo de MNG. De ahí que se deban monitorizar de la misma manera ambos casos ya que el riesgo de neoplasias es muy parecido93. Las causas que generan dicha hiperplasia todavía no FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 48 musculares para muchas enfermedades y en otros procesos inherentes al envejecimiento, como la sarcopenia146. MARCADORES COMUNES EN ASCS Una de las estrategias más utilizadas en la identificación de nuevas ASCs es mediante la utilización de marcadores proteicos que las diferencien del resto de células diferenciadas presentes en el tejido. Parece ser que algunos factores de transcripción muy presentes en el desarrollo embrionario también lo estarían en las ASCs de algunos tejidos. Sox2 es un factor de transcripción perteneciente a la familia de genes SOX que se identificó junto con el descubrimiento del factor determinante del sexo en mamíferos, Sry (Sexdetermining región Y)147,148 Se hablará más en detalle en el apartado específico para esta proteína. Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4), también conocido como POU5F1 (POU domain, class5, transcription factor 5), es un factor de transcripción implicado en el mantenimiento de la pluripotencia de células madre embrionarias (ESC)149 y el desarrollo embrionario. Oct4 controla importantes puntos de no retorno para formar el epiblasto y los diferentes precursores del endodermo150,151. Oct4 también es uno de los reprogramadores centrales para la formación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs, induced pluripotent stem cells) y también conocido como uno de los 4 factores de Yamanaka152. En tejidos adultos se han encontrado poblaciones de células Oct4 positivas en los folículos pilosos153 o en el endometrio humano154. Klf4 (Krüppel transcription factor 4) es un factor de transcripción caracterizado por tener en su estructura 3 motivos de dedos de Zinc en la secuencia carboxiloterminal155 y es una proteína muy implicada en diversos procesos celulares como el crecimiento celular, proliferación y diferenciación. Su regulación se produce tanto a nivel transcripcional como a nivel postranscripcional. Varios estudios muestran que la hipermetilazión de Klf4 en su promotor y la metilación de algunas histonas modulan su actividad en varios tipos de cáncer156,157,158. Micro-RNAs también son importantes moduladores de Klf4 en células madre y progenitoras, en la reorganización del sistema cardíaco y en procesos de tumorogénesis159,160,161. No podemos hablar de estos 3 factores de transcripción sin tener en cuenta Nanog; junto con Sox2, Oct4 y Klf4 forman lo que se conoce como “factores de Yamanaka”, las cuatro proteínas esenciales para que células diferenciadas se conviertan en células pluripotentes capaces de generar cualquier tipo de tejido, las llamadas iPSs (induced Pluripotent Stem cells)152. Existen muchos marcadores asociados a ASCs, aunque pocos son comunes a más de un tejido adulto. Además, dependiendo del estado de diferenciación en el que se encuentren, las ASCs pueden ir perdiendo marcadores y ganando otros progresivamente a la vez que se produce dicha diferenciación162. Se ha demostrado que distintos niveles en la expresión de CD150 y cKit determinan diferentes poblaciones de HSCs163. Las células madre epiteliales del folículo piloso (HFSCs, Hair follicle stem cells) se caracterizan por presentar altos niveles de integrinas (a4ß4 y a3ß1), keratinas (K5, K14 y K15) y otros marcadores de superficie celular como CD34, Lgr5 o TCF4 (T-cell factor 4)164,165,166. Estas células también expresan factores de transcripción tales como SOX9 o LHX2 (LIM homebox 2); estudios de pérdida de función muestran que estos factores son esenciales para mantener las características de célula madre en estas poblaciones167,168,169. En intestino de ratón, una proteína antes mencionada, Lgr5, es el principal Introducción 49 marcador de las ISCs (localizadas en la parte inferior de la cripta)125. A pesar de las grandes diferencias entre las IPSs y las HFSCs, comparten marcadores como el ya mencionado Lgr5 y otros como SOX9 y TCF4. También comparten rutas de señalización como la que implica a BMP (que promueve la quiescencia de estas células) o Wnt (crucial para la activación de las ISCs)170,171. Las células satélite del músculo (SCs) presentan a PAX7 (Paired box protein 7) como su marcador por excelencia172,173, aunque también se utilizan otros marcadores celulares para aislarlas como CD34 (del que ya hemos hablado en las HFSC) o CXCR4174. Por último, en los nichos del SNC también podemos encontrar algunos marcadores ya mencionados como Sox2, proteína que no deja de expresarse hasta etapas tardías del proceso de diferenciación de las ASCs en cerebro; otros marcadores específicos que caracterizan a estas células son GFAP (Glial fibrillary acidic protein) y Nestina175. Algunas enzimas implicadas en el metabolismo de las hormonas tiroideas también están muy presentes en nichos de células madre ya descritos y juegan un papel clave en su regulación. Este es el caso de las enzimas DIO2 y DIO3 presentes en las SCs encargadas de la regeneración del músculo. Al principio no se dio mucha importancia a la función de estas dos desyodasas ya que su expresión en el tejido es muy pobre, pero más adelante se observó que están altamente expresadas en las células madre musculares. Concretamente, la expresión de DIO2 aumenta en los primeros pasos en la diferenciación de las SCs y su actividad catalítica es esencial para la correcta formación y fusión de nuevas miofibrillas, como se demostró en ratones DIO2- knockout en los que se producía un retraso agudo en estos procesos de diferenciación. DIO3, en cambio, se expresa en fases todavía más tempranas ya que es esencial para la inactivación de la T3, proceso esencial en la proliferación previa diferenciación de las SCs107. ASCS EN ÓRGANOS ENDOCRINOS Han sido muchas las evidencias de poblaciones de ASCs en los diferentes órganos endocrinos. En algunos como el hipotálamo o la hipófisis estas poblaciones ya están muy bien caracterizadas y estudiadas; en otros, como el páncreas o la tiroides, no se han encontrado muchas evidencias que apoyen la existencia de nichos de células encargados de su renovación y mantenimiento. La hipófisis es el principal componente del sistema endocrino ya que regula el metabolismo, la reproducción, la respuesta al estrés, el crecimiento y otras muchas respuestas fisiológicas a través de la secreción de diversos tipos de hormonas169,176. Un gran número de trabajos han estudiado y caracterizado poblaciones de ASCs en la glándula. En 2005 se publicó el primer trabajo que describía la existencia de células madre en la adenohipófisis; en él se describe una población positiva para OCT4, Nanog y Sca1 con capacidad para bombear el Hoescht fuera de la célula y que forman clones de esferas en cultivo177. En 2008, se propuso una población Sox2+ en hipófisis de ratón que generaba esferas en cultivo mezcladas con células diferenciadas. En 2009, nuestro grupo demostró tanto en ratones como en humanos que ese nicho de ASCs localizado en la adenohipófisis coexpresaba tres de los cuatro factores de Yamanaka (Sox2- Oct4 y KLF4) junto a dos marcadores muy específicos, GFRa2 (GDNF Family Receptors a-2) y Prop1 (Prophet of Pit1), además de otros como ß-Catenina y E- cadherinas de una manera muy característica, sugiriendo una polarización del nicho128. Estas células también eran capaces de formar esferas en cultivo que pueden ser diferenciadas en células productoras de distintos tipos de hormonas hipofisarias128.Desafortunadamente, las células Sca1 eran también Sox2+, aunque no se correspondías con las ASCs hipofisarias y el mismo grupo que las había propuesto recapituló después sumándose a las evidencias del nuestro con marcadores como Sox2, Sox9, CD34 y CD133131. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 50 El córtex adrenal, lugar por excelencia donde se producen los compuestos esteroideos, libera glucocorticoides encargados de regular el metabolismo de la glucosa o las respuestas al estrés o la inflamación y mineralocorticoides, implicados en el control del volumen extracelular de fluidos, en el metabolismo del Na+ y están muy implicados en el control de la presión sanguínea. Se han identificado células en esta glándula endocrina capaces de autorrenovarse mediante el uso de ratones transgénicos178. Más adelante se describieron células Gli1(+) (Zinc finger protein Gli1) alojadas en los compartimentos capsular y subcapsular del córtex de ratones179 y ratas180. Las células más cercanas al límite con el córtex pueden perder su respuesta a SHH (Sonic Hedgehog) y adquirir la expresión de Sf1 (Steroidogenic factor 1) (ya descrito como esencial para el desarrollo de la glándula durante la embriogénesis181). Estas células progenitoras pueden convertirse en células maduras de las diferentes capas que conforman el córtex adrenal: pueden migrar a la Zona Glomerulosa (ZG) y secretar aldosterona o a la Zona Fascicular y Reticular (ZG) y convertirse en célula secretora de glucocorticoides179. En el testículo el proceso de formación de espermatozoides a partir de células progenitoras está bien identificado. Según la teoría actual, conocido como el modelo “As”, existen 3 tipos de células Tipo A clasificadas según su morfología (que representaría su estado de diferenciación): células As (células aisladas), Apr (cadenas de dos células conectadas) y Aal (cadenas de 4, 8, 16 o más células). Las SSCs serían las células As (que no sobrepasarían el 0,03% de la población total) que se dividen en 2 células hijas Apr las cuales se dividen para dar lugar a células Aal182,183. Las espermatogonias Aal son la fuente de los espermatozitos primarios que darán mediante divisiones haploides, en última estancia, los espermatozoides maduros184. En el ovario se pensó durante muchísimos años que los individuos nacen con todos los oocitos formados que irán liberando durante su vida; sin embargo, en 2004, investigadores cambiaron este concepto ya que observaron que el número de folículos sanos y atrésicos de ratones hembras no cuadraba con la teoría actual. Así se empezó a asentar la teoría de que podría haber células madre germinales femeninas (FGSCs, Femile germline stem cells y también conocidas como OSCs, oogonial stem cells)185. Más adelante un grupo de investigadores identificaron FGSCs en ratones neonatos y adultos mediante inmunofluorescencia analizando la incorporación de BrdU (Bromodeoxiuridina). Después consiguieron asilar estas células y mantenerlas en cultivo durante dos meses mientras que expresaban marcadores de línea germinal. El marcaje de estas poblaciones celulares mediante GFP y su implantación en ratones estériles demostró mediante análisis histológico la presencia de muchos oocitos en diferentes etapas del desarrollo, algunos de ellos marcados con este GFP186. Mediante el uso de trasplantes intragonadales de las FGSCs se consiguó restaurar la función ovárica y que los ratones pudieran tener crías de nuevo186,187,188. En el páncreas existen muchos estudios con diferentes teorías acerca de la capacidad de regeneración y de la existencia o no de ASCs en el mismo. Algunos investigadores postulan que la regeneración pancreática ocurre a través de la autorrenovación de sus propias células donde las células ß generarían nuevas células ß y las demás células acinares harían lo propio ellas mismas189,190,191,192 (algo parecido a lo que ocurre en el hígado cuando se produce daño hepático). Estudios más recientes han mostrado una alta heterogeneidad en las células ß de los islotes pancreáticos, identificando algunas mas inmaduras y con más capacidad proliferativa que otras. Esta diversidad podría explicar por qué algunas células ß presentan esa capacidad tan alta de división mientras que otras no193,194. Algunos estudios todavía más actuales describen poblaciones en el tejido ductal del páncreas que son capaces de generar células productoras de insulina en ratones, sugiriendo que existen poblaciones no endocrinas que pueden diferenciarse a productoras de insulina195. Introducción 51 ASCS EN TIROIDES Los primeros estudios orientados en identificar células madre en la tiroides adulta se diseñaron en ratones. En ellos se identificó una pequeña población que expresaban Oct4, nucleostemina y ABCG2 (ATP-binding cassette transporter G2) (que más tarde se identificó por su capacidad para bombear el marcador nuclear Hoetch), mientras expresaban marcadores fenotípicos a niveles muy bajos como Tg, el receptor de TSH, TPO o TTF1. A esta población se le denominó Side Population (SP)196. En humanos se realizaron estudios histológicos y cultivos celulares de bocios que mostraban una población celular también positiva para Oct4 y para otros marcadores de endodermo como Gata4 y HNF4a (Hepatocyte nuclear factor a4) mientras eran negativos para otros de fenotipo como Tg197. En base a estos estudios, se aislaron células procedentes de bocios humanos mediante citometría de flujo que mostraban características de ASCs: pequeño tamaño con un núcleo relativamente grande comparado con su citoplasma. También presentaban perfiles de expresión compatibles con poblaciones celulares no diferenciadas. Estas células representaban el 0,1% de la población total y fueron capaces de diferenciarlas in vitro en tirocitos maduros mediante tratamientos con TSH (5mU/mL) pero sin previa purificación. Detectaron mediante análisis de RT-PCR los marcadores ADCG2 y Oct4, aunque no fueron capaces, en cambio, de detectarlos mediante FACS; además, esta población era negativa para marcadores de fenotipo tiroideo como Tg, NIS, TSHR y TPO96. En 2008, investigadores generaron tirosferas en cultivo a partir de dispersiones celulares de tejido tiroideo humano cultivadas con EGF y BFGF198 .Estas esferas tenían capacidad autorreplicante y eran CD34+ CD45- TSHR-. Algunas de estas esferas ya eran positivas para hormonas antes de la diferenciación mientras que otras eran negativas. Eran capaces de producir hormonas tiroideas cuando se las trataba con medio de diferenciación pero el propio medio contenía suero bovino que contiene T4198. También se diferenciaban a adipocitos o células ß3-tubulina clase III positivas, sugiriendo quizá una mezcla de poblaciones198. Otros estudios basados en tiroidectomías parciales en ratones mostraron regiones proliferativas en ambos lóbulos. Se diseñaron microarrays posteriores que revelaron rutas de señalización embriogénicas que sugerían la existencia de células madre o progenitoras residentes en la glándula. La hormona T4, que disminuía sus niveles después de la tiroidectomía, recuperaba sus niveles fisiológicos en unas semanas; acorde con esto se detectaron aumentos en los niveles de TSH en los días posteriores a la intervención quirúrgica199. Estos estudios, sin embargo, no aclaraban si la regeneración de la tiroides venía de una población de ASCs, del propio epitelio tiroideo activado o de una población ajena no residente en la tiroides. Otros trabajos se centraron en observar la capacidad regenerativa de la glándula en patologías como la tiroiditis autoinmune (EAT, Experimental Autoimmune Thyroiditis). Utilizando ratones a los que se les reprodujo esta patología, detectaron niveles muy altos del marcador CD24 durante la reparación del tejido y niveles también elevados de Oct4 a los 100 días posteriores al EAT. Intentaron demostrar que CD24 es esencial para la regeneración de la tiroides en ratones CD24 null, pero encontraron que la capacidad regenerativa era aún mayor. La conclusión a la que llegaron fue que, probablemente, el aumento de los niveles de CD24 era debido a la alta infiltración de linfocitos circulantes que se producía cuando se inducía la enfermedad a los ratones200. Estudios de inmunofluorescencia en tejidos de bocios humanos observaron la presencia de algunas células Oct4 positivas, así como de células Oct4+/Gata-4+/HNF4a en cultivos celulares derivados de bocios humanos adultos, sugiriendo la presencia de células precursoras de endodermo197. También se ha descrito una Side Population (SP) en humanos con una ratio FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 52 elevado núcleo/citoplasma (típico de célula madre), siendo positivas para Oct4 y que conformaban el 0,1% de la población total. Además, dicha población era más elevada en bocios que en tiroides normal. Sin embargo, la SP no expresaba los marcadores de célula precursora de endodermo antes mencionados (Gata-4 o HNF4a), ni tampoco factores de diferenciación tiroideos como Tg, NIS, TPO o TSHR (que sí fueron detectados en la población de tejido restante). La SP era capaz de crecer y formar folículos en presencia de colágeno, añadiendo al medio EGF y FGF. Estos folículos estaban formados de hasta el 5% de células ABCG2+/Oct- 4+ (población SP) o Gata-4+/HNF4a (población no SP), ambas denominadas células madre tiroideas en este trabajo. En respuesta a suero y a TSH, las células in vitro comenzaban a expresar marcadores de fenotipo tiroideos (Pax8, NIS, TPO, TSHR y Tg) y dejaron de expresar los marcadores de célula progenitora de endodermo y de stemcell96. CANCER STEM CELLS (CSCS) EN TIROIDES Las CSCs son grupos de células presentes en muchos tipos de cáncer que, por sus características (patrones de comportamiento y expresión de marcadores), se cree que son las responsables del crecimiento y mantenimiento de la mayoría de los tumores. Además, muchas de ellas parecen ser las más resistentes a tratamientos con quimioterápicos. La existencia de CSCs en tiroides no ha sido demostrada, pero hay muchas evidencias que apoyan esta teoría. Así, existen tres teorías para explicar el origen de las CSCs en tiroides: • Los tirocitos diferenciados, a través de una serie de mutaciones, adquieren la capacidad de desdiferenciarse (probablemente mediante una transición de célula epitelial a célula mesenquimal) y formar estas CSCs201,202. • Otra propuesta es que las CSCs provienen de células embrionarias residuales, que tienen marcadores de célula madre y que residen en nichos sólidos en la glándula201,203. • La tercera teoría y la más apoyada es que estas CSCs provienen de ASCs propias de la tiroides que, mediante una serie de mutaciones, pierden su capacidad reguladora y comienzan a crecer sin control204. Esta última teoría es la más aceptada ya que combina el concepto de CSCs con el modelo de que múltiples mutaciones genéticas conducen a cáncer. Además, esta teoría explicaría por qué en los estudios de los subtipos de cáncer de tiroides más agresivos se encuentran más alteraciones genéticas, lo que se traduce en un comportamiento más agresivo. Hay estudios que evidencian una relación entre la vía de Wnt con las CSCs en tiroides; con esto además se quiere explicar la mayor tasa de cáncer en mujeres que en hombres, ya que se piensa que la vía de Wnt también puede ser activada a través de los estrógenos. Algunos estudios observan que los estrógenos circulantes incrementan las patologías tiroideas en mujeres a través de la activación de la ruta de PI3K y la consecuente represión de p27205. Estos trabajos creen que los estrógenos podrían ser reguladores de la función de las CSCs, ya que observan una mayor formación de tirosferas en cultivos de bocios humanos comparado con tiroides normal, en presencia de 17ß-estradiol (E2), aunque no se describe muy bien cómo definen o generan dichas tirosferas. Otro mecanismo por el que los estrógenos estarían implicados en las diferencias en cuanto a sexo de la prevalencia de estas patologías es mediante la vía de Wnt, ya que se han descrito conexiones entre las ß-cateninas y el receptor ER-a. Concretamente, este grupo demostró que estas dos proteínas son capaces de formar inmunocomplejos, además de ser reclutados recíprocamente a los promotores de sus genes diana206. En base a estos estudios, otros sugieren que la estimulación vía E2 se asocia con el Introducción 53 incremento en los niveles de ß-catenina, así como con el incremento de la invasión y migración de tumores tiroideos207. En los intentos de identificar la población responsable del crecimiento y resistencia de los tumores tiroideos, algunos investigadores han aislado pequeñas poblaciones celulares provenientes de PTCs (cáncer papilar de tiroides, el más común) a las que llamaron esferas tumorales. Estas esferas podían crecer in vitro indefinidamente y eran mucho más resistentes a los quimioterápicos que el resto de la población tumoral208. En otros estudios utilizaron líneas celulares cancerosas y cultivos celulares de pacientes con cáncer de tiroides para postular la presencia de CSCs. En ambos, observaron pequeñas poblaciones celulares que eran capaces de retener tinciones nucleares (característico de CSCs) y que expresaban el marcador SSEA-1 (Stage-specific Embryonic Antigen 1), además de otros marcadores de célula madre como Oct4, Sox2 y Nanog. También observaron que eran resistentes a los agentes quimioterápicos y tenían capacidad multipotente209. Para terminar, también hay estudios intentando relacionar la población SP encontrada en tejido de tiroides de ratón con las CSCs. Mediante microarrays de tejido en ratones, observaron que la expresión de la proteína estaniocalcina 1 (STC1) estaba presente en la población SP y ausente en la población no-SP, por lo que decidieron estudiar su expresión en líneas celulares humanas y de ratón derivadas de cáncer de tiroides. Así, demostraron una alta expresión de STC1 tanto en líneas celulares cancerosas de humanos como de ratón; el patrón de expresión de STC1 se correlacionaba inversamente con el estado de diferenciación de cada célula210. En resumen, todos los estudios publicados hasta ahora proponiendo la existencia de ASCs parenquimatosas en tiroides normal de modelos de roedor o en humano o en hiperplasia son de calidad media y poco mecanísticos. Las poblaciones no se han purificado ni caracterizado suficientemente con métodos aceptados en el campo de las stem cells y no ha habido un rastreo de estas poblaciones en la tiroides de modelos animales. Se sabe que la metodología en el campo de las células madre es muy importante ya que hay muchas poblaciones de células madre que engloban células endoteliales, mesenquimales y neurales además de las epiteliales parenquimatosas. Frente a la existencia de ASCs, la otra posibilidad propuesta es que el propio epitelio tiroideo es capaz de responder a la acción de TSH proliferando durante toda la vida y no necesita de ASCs. El epitelio tiroideo en condiciones normales tiene un bajo índice de proliferación y se calcula que cada célula se divide sólo cinco veces a lo largo de a vida del individuo211. Pero como se ha comentado más arriba, es posible que algunas poblaciones epiteliales diferenciadas, como las intestinales, se desdiferencien cuando hay una herida grave y retomen marcadores de células stem, comportándose como tales para la reparación tisular204. 4 SOX2 CARACTERÍSTICAS GENERALES Sox2 es un factor de transcripción perteneciente a la familia de genes SOX que se identificó con el descubrimiento del factor determinante del sexo en mamíferos, Sry (Sex-determining región Y)147,148. Sry tiene un dominio característico de alta movilidad (HMG, High-movility group) que se une al ADN de manera muy específica. Básicamente, cualquier proteína que contenga un domino HMG con una secuencia de aminoácidos que comparta, al menos, un 50% con la secuencia del HMG de Sry pertenecen a la familia SOX (Sry-related HMG box). Existen 20 genes diferentes de SOX entre humanos y ratones, los cuales se clasifican en diferentes grupos FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 54 de la A a la H212. SOX2 es miembro de la familia Sox2B1 y es el miembro mejor estudiado de esta. Funcionalmente, Sox2 está involucrado en pluripotencialidad, determinación del destino celular y cáncer. Sox2 regula la autorrenovación en células madre embrionarias (ESCs) tanto de humano como de ratón. También es muy importante para el mantenimiento de la capacidad pluripotente de muchas ASCs, como ocurre en el SNC o en la piel; además es uno de los factores críticos para generar las IPSs mediante el cóctel de Yamanaka152. La expresión ectópica de este factor de transcripción se ha asociado con la aparición y desarrollo de distintos tipos de cáncer en tejidos adultos como el de mama o el de pulmón213. FUNCIONES DE SOX2 EN EL DESARROLLO EMBRIONARIO DE DIFERENTES TEJIDOS Sox2 se expresa inicialmente en el trofoectodermo y en el blastocisto, aunque más adelante quedará restringido a este último214. Si este factor de transcripción se elimina en el zigoto, se produce una muerte repentina del embrión debido a fallos en la formación del epiblasto215. Después de la gastrulación, Sox2 se vuelve a restringir y solo se expresa en ciertos tejidos: neuroectodermo, arcos braquiales, endodermo del tracto digestivo y células germinales primordiales215,216,217. A parte de la importancia de Sox2 en el sistema nervioso, también está muy presente en el desarrollo de otros muchos órganos. En el desarrollo del sistema sensorial, Sox2 es clave para el desarrollo del oído interno ejerciendo de mediador en la señal por Notch, lo cual sugiere que el destino de cada célula en este órgano es definido por Notch y, a su vez, regulado por Sox2. Además, Sox2 actúa como señalizador, enviando señales a varios efectores con funciones críticas en el desarrollo de este sistema218. En la lengua, Sox2 se expresa en las células epiteliales basales para regular la diferenciación de células progenitoras de endodermo en células sensoriales del gusto o en diferentes tipos de keratinocitos219. Sox2 también se expresa en el endodermo que origina el tracto digestivo, el esófago y la parte anterior del estómago, donde este factor de transcripción se expresa a altos niveles. Tiene un papel crítico en los límites para la formación del epitelio escamoso del esófago y estómago anterior y la parte granular del estómago posterior de manera directa o indirecta, reprimiendo genes en el epitelio220. Durante el desarrollo de la piel, Sox2 se expresa inicialmente en células mesenquimales llamadas en este caso “condensados dermales”, precursores del folículo piloso que formarán de manera eventual vainas y papilas dermales221. SOX2 ES ESENCIAL PARA EL MANTENIMIENTO DE LA CAPACIDAD “STEM” DE LAS CÉLULAS. Estudios in vitro demostraron que la deleción de parte del gen de Sox2 resulta en una diferenciación muy temprana de las células asociadas al trofoectodermo, indicando que Sox2 es esencial para el mantenimiento de las ESCs222. En etapas tempranas del desarrollo, Sox2 dirige a algunas ESCs en el desarrollo del ectodermo, mientras que Oct4 y Nanog promueven la diferenciación de las ESCs a mesodermo223. En el SNC, concretamente en la retina, Sox2 controla la proliferación y diferenciación de sus células mediante la activación directa del gen Notch224. La pérdida de expresión de Sox2 en células progenitoras de la retina detiene la proliferación y estimula la diferenciación, mientras que un desequilibrio en sus niveles de expresión conduce a patologías como la microftalmia225. Introducción 55 En algunos casos, Sox2 también promueve la diferenciación celular. En la formación de oligodendrocitos, Sox2 estimula el aumento de los niveles de expresión de miR145, que inhibe la aparición de determinados factores de diferenciación para favorecer así la expresión de otros, lo que se traduce en última instancia en la formación de los oligodendrocitos226. En células de Schwann, Sox2 estimula la mielinización de axones en el Sistema Nervioso Periférico227. En los últimos años se ha demostrado que Sox2 también es clave en los procesos de mielinización y remielinización en la etapa adulta, ya que es un regulador esencial para las OPCs (oligodendrocytes precursor cells). Si se elimina selectivamente este factor de transcripción en las OPCs, disminuye su densidad y el número de OPCs proliferantes, así como la cantidad de nuevos oligodendrocitos211. En 2011 realizaron un mapeado con algunos órganos para evaluar la expresión de Sox2 en tejidos adultos228. Confirmaron la expresión del factor de transcripción en algunas zonas del cerebro, la retina, lengua, tráquea y epitelio bronquial. La expresión de Sox2 también en testículo, cérvix, estómago glandular y epitelio escamoso fue totalmente inesperado. Para comprobar la importancia de Sox2 en estos tejidos, generaron un modelo de ratón en el que se producía la ablación del gen de Sox2 en un mecanismo inducido por TAM. Esto condujo a una apoptosis masiva de células Sox2+, con efectos dramáticos en la homeostasis de los tejidos que tenía como consecuencia la muerte del ratón a las dos semanas de vida. De esta manera se comprobó la importancia de Sox2 para el mantenimiento de muchas ASCs228. Como ya dijimos, Sox2 es un marcador diferencial para las ASCs localizadas en la SVZ y SGZ del cerebro122. Cuando se elimina la expresión de esta proteína se altera la autorrenovación y proliferación de las NSCs, ya que estimula la salida del ciclo celular y, en consecuencia, diferenciación229. La glía de Müller se considera que son las NSCs de la retina, ya que pueden reentrar en ciclo celular y mantener el potencial de diferenciación de neuronas en adultos. La expresión de Sox2 en este tipo celular en la etapa postnatal mantiene sus características progenitoras, por lo que se deduce que la expresión de Sox2 en la glía de Müller después del nacimiento es crucial para promover la quiescencia de estas células230. En estudios más recientes se ha demostrado que el número de células de Müler Sox2 positivas disminuye con el envejecimiento y que la haploinsuficiencia de Sox2 causa pérdida de visión en ratones. Además observan que Sox2 es esencial para la transmisión de la información entre conos y bastones, lo que sugiere que esta proteína sería crucial en el envejecimiento de las células que forman la retina231. El nicho de células madre descrito en hipófisis (células GPS, llamadas así por la coexpresión de GFRa2 y Prop1 y por su capacidad Stem) también expresa Sox2 como factor de transcripción esencial para el mantenimiento de este nicho, junto con Sox9 y Oct4. En este caso, aún siendo Sox2 esencial para el mantenimiento del nicho, no es exclusivo del mismo, ya que también se expresa en células diferenciadas128. Este hallazgo es otra prueba más de que los nichos se definen por la coexpresión de un conjunto de marcadores que, separados, pueden estar presentes en células madre en diferentes estados de diferenciación o incluso en células ya diferenciadas. Estudios de rastreo celular en los que se utilizaron modelos de ratón similares a los de este trabajo demuestran que, durante el desarrollo, las diferentes líneas celulares que se forman en la hipófisis provienen de células Sox2-Sox9 positivas alojadas en el nicho. En ratones adultos, este nicho puede movilizarse y diferenciarse en el tipo de célula endocrina que se requiera en ese momento232. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 56 REGULACIÓN DE SOX2 En las primeras etapas del desarrollo del sistema nervioso, los niveles de expresión de Sox2 son críticos para el destino neuronal de varias poblaciones de ESCs. STAT3 regula directamente la expresión de Sox2 y, entre ambos, regulan a su vez la de Nestina, lo cual conduce al compromiso de las ESCs a convertirse en progenitoras del sistema nervioso233. La expansión de estos progenitores neuronales también se regula mediante Sox2, pero en este caso a través de un loop de EGFR-Sox2-EGFR (Epidermal grow factor receptor) que estimula la división de estas células en el desarrollo de embriones de ratón234. En cerebro adulto de ratones se encontró que los reguladores de ciclo celular E2f3a y E2f3b regulan a su vez los niveles de Sox2, controlando así la proliferación de NSCs235. El represor p21 se une al promotor de SOX2 en NSCs y directamente anula su expresión; de manera inesperada, el aumento de la expresión de Sox2 en ratones K.O. para p21 se traduce en daño al ADN con la consiguiente aparición de genes supresores de tumores como p53 o p19arf, lo cual provoca mecanismos que promueven senescencia de las NSCs235,236. Factores extrínsecos presentes en el microambiente pueden regular también la expresión de Sox2. La hipoxia, por ejemplo, es conocida como un factor activador en la expresión de Sox2; como resultado, se produce una activación de CD133 que conduce a cáncer de pulmón237. Se han identificado 3 sitios donde Sox2 puede ser fosforilado: S249, S250 y S251. También se ha comprobado que esta fosforilación promueve la sumoilación, evitando así la unión de la proteína con el ADN238,239. Los resultados sobre las consecuencias de estas modificaciones postranscripcionales son confusos ya que algunos estudios afirman que la fosforilación de Sox2 aumenta la eficiencia en la inducción de iPSCs240, lo que resultaría contradictorio. Se identificó un residuo de lisina acetilada como responsable de la translocación de Sox2 del núcleo al citoplasma. Bloqueando la acetilación de esta lisina se produce la retención de Sox2 en el núcleo, sosteniendo su expresión en los genes diana241. Por último, se ha encontrado un nuevo regulador esencial para Sox2 que podría tener muchas implicaciones en el futuro: PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase I), proteína con funciones esenciales en la remodelación de la cromatina y los sitios accesibles de la misma; también funciona como enzima para varias modificaciones postranscripcionales. En este trabajo se demuestra que PARP1, además de sus funciones ya descritas, actúa como regulador para muchos procesos transcripcionales en los que está implicado Sox2, proponiendo una nueva forma de unir este factor de transcripción al ADN242. Así, Sox2 ya no solo se uniría al DNA a través de sus motivos de unión típicos, sino que se abriría un campo totalmente nuevo en el que Sox2 podría interactuar con muchas otras regiones de la doble cadena. MOLÉCULAS REGULADAS MEDIANTE LA EXPRESIÓN DE SOX2 Desde el descubrimiento de esta proteína, aunque muchos estudios se han centrado en identificar reguladores de la misma, otros lo han hecho en los mecanismos que esta molécula es capaz de regular. Las moléculas clave para el mantenimiento de la pluripotencialidad de las ESCs, como son Oct4, Nanog o DPPA4 (Developmental pluripotency Associated 4) estás reguladas directamente por Sox2243. Recientemente se ha demostrado que Sox6, una proteína de la subfamilia SoxD implicada en la regulación de los precursores de los oligodendrocitos, es una diana directa para Sox2 en el SNC. Estudios realizados in vivo en ratones confirmaron a Sox6 como diana molecular de Sox2; juntos forman un complejo que se encarga de inhibir la diferenciación prematura durante la neurogénesis244 Sox2 controla el nicho de NSCs en el hipocampo de ratones neonatos manteniendo su supervivencia mediante mecanismos paracrinos regulando directamente SHH245. Otros estudios Introducción 57 apoyan esta idea del papel clave de Sox2 en la supervivencia de las NSCs. Por ejemplo, se ha identificado que Sox2 activa la expresión de un gen llamado survivina, miembro de la familia IAP (Inhibitor of apoptosis), para prevenir la muerte programada de las NSCs mediante la interacción con XIAP (X-linked IAP), otra proteína de la familia IAP246. También se han demostrado interacciones entre Sox2 y ß-catenina para estimular la expresión de la Ciclina D1 en células de cáncer de mama, promoviendo también la proliferación celular y la tumorogénesis247. Estos hallazgos fueron apoyados posteriormente mediante otros estudios que afirmaban que la propia ß-catenina es capaz de aumentar la propia expresión de Sox21. Materiales y Métodos 65 1 EXPERIMENTOS IN VIVO ASPECTOS ÉTICOS DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Los procedimientos realizados con animales fueron llevados a cabo bajo la supervisión del Comité bioético de la Universidad de Santiago de Compostela (procedimiento de la Profesora Clara Álvarez Villamarín: 15003/14/005) y siguiendo la normativa vigente: v Ley 6/2013, de 11 de junio, de modificación de la Ley 32/2007, de 7 de noviembre, para el cuidado de los animales, en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio (BOE de 12 de junio de 2013). v Decreto 296/2008 del 30 de diciembre, relacionada con la protección de animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, incluida la docencia, y por el que se crea el Registro de los centros de cría, de suministradores y usuarios, así como la Comisión Gallega de Bienestar de los Animales de Experimentación. v Directiva 2010/53/UE del Parlamento Europeo y del Consejo del 22 de septiembre, adoptaron la Directiva 2010/63/UE, relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos. v Real decreto 53/2013 del 6 de junio, en el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia. v Orden ECC/566/2015 del 20 de marzo, por la que se establecen los requisitos de capacitación que debe cumplir el personal que maneje animales utilizados, criados o suministrados con fines de experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia. Durante el desarrollo de este trabajo se han tenido en cuenta el bienestar animal, intentando reducir el estrés, el dolor o el daño duradero en los animales. De acuerdo con articulo 4 del real decreto 53/2013, se implementa el Principio de las “3 erres”, es decir, reemplazo, reducción y refinamiento de los procedimientos. De esta manera se ha intentado reducir el número de experimentos realizados con animales y evitando el uso innecesario de animales dentro de los mismos, sin que afecte o comprometa el resultado de los experimentos. Para poder llevar a cabo los experimentos con animales se obtuvo el título correspondiente: Curso de Experimentación Animal Categoría B según RD1201/2005, RD 53/2013 y 2010/63 UE, acreditado por la Comunidad de Madrid. MODELO DE RATÓN B6;129S-SOX2TM1(CRE/ERT2)HOCH/J Y B6- 129GT(ROSA)26SORTM2SHO/J Para estudiar el comportamiento de las células SOX2 positivas en tiroides de roedores se utilizaron estos dos modelos de ratón genéticamente modificado GMO (genetically modified organism) que, cruzados entre ellos, generan un nuevo modelo en el que las células que expresen SOX2 pueden seguirse a lo largo del tiempo gracias al reportador EGFP (proteína verde fluorescente). Para entender mejor el modelo de ratón obtenido, se hablará primero de sus progenitores (imagen 7): FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 66 Þ Ratón B6;129S-Sox2tm1(cre/ERT2)Hoch/J Uno de los dos alelos del gen Sox2 se sustituye por la lectura para la transcripción de una proteína quimera, CreERTT2. Esta actúa como Cre-recombinasa, una enzima capaz de interactuar con sitios LoxP en el genoma con diferentes resultados dependiendo la disposición y el número de dichas secuencias LoxP. Además, la Cre-recombinasa en este modelo de ratón es inducible por Tamoxifeno (T-5648, Sigma), lo que significa que la enzima Cre solo se activa cuando este compuesto es administrado al animal. Dado que esta secuencia genómica altera de manera significativa el locus del gen Sox2, los ratones mutantes homozigotos no son viables ya que SOX2 es una proteína esencial en el desarrollo del individuo. Por tanto, estos ratones siempre han de mantenerse en heterozigosis. Þ Ratón B6-129Gt(ROSA)26Sortm2Sho/J Este modelo tiene el gen para la proteína EGFP insertado en el locus de un alelo del gen 129Gt(ROSA)26Sor, un ARN no codificante (ARNnc) expresado en la amplia mayoría de células. Además, posee en su secuencia un codón de STOP flanqueado por dos sitios LoxP entre el promotor de 129Gt(ROSA)26Sor y EGFP. Este modelo puede mantenerse en homozigosis, es decir, con los dos alelos mutados, ya que los ratones generados son viables, fértiles, normales en tamaño y no presentan ninguna anormalidad física o de comportamiento. Þ Ratón B6;129S-Sox2tm1(cre/ERT2)Hoch/J « Ratón B6-129Gt(ROSA)26Sortm2Sho/J Este es el resultado del cruce entre los dos modelos de ratón explicados anteriormente. Cuando se administra tamoxifeno al individuo, la Cre-Recombinasa se activa (en aquellas células donde SOX2 se exprese suficientemente) y ejerce una acción de corte y empalme cuando encuentra dos sitios LoxP en la misma cadena de ADN (imagen 7). Como resultado, el codón de STOP que había entre los dos sitios LoxP se elimina y la proteína EGFP comienza a sintetizarse. Desde el punto de vista fisiológico, esto se traduce en que todas las células que en el momento de la administración de tamoxifeno estén expresando SOX2, comenzarán a producir también EGFP de manera constitutiva y, sobretodo, ya independiente de la expresión de SOX2. Materiales y Métodos 67 Imagen 7. Esquema simplificado de la generación de ratones GMO dobles mutantes y mecanismo mediante el cual las células Sox2 expresarán la proteína GFP de manera constitutiva mantengan o no la expresión de dicho SOX2. Cuando a un ratón GMO doble mutante se le administra TAM, la Cre-R estará presente sólo en células que expresen SOX2 en ese momento y, por tanto, solo en ellas cortará los dos sitios LoxP para que la proteína EGFP se exprese constitutivamente gracias a su asociación con el promotor fuerte ROSA26 . Por tanto, podemos afirmar con seguridad que cualquier célula productora de EGFP o bien expresa SOX2 o bien lo ha expresado en algún momento de su vida. Los ratones tienen un background genético proveniente de ratones C57BL/6J, la cepa de roedor más usada en investigación. Por eso, todos los ratones wildtype usados como control serán C57BL/6J. GENOTIPADO DE RATONES Como ya se explicó previamente en el modelo de ratón GMO, no todos los ratones generados expresan el genotipo de nuestro interés. Para utilizar solo ratones dobles mutantes y, o bien descartar o bien utilizar como control negativo aquellos que no lo sean, se corta un pedazo de cola para su posterior genotipado. Genotipado para B6;129S-Sox2tm1(cre/ERT2)Hoch/J Para este gen en concreto, los ratones que tengan mutado un alelo de Sox2 (recordemos que los dos mutados hacen que el ratón sea inviable) presentarán una banda de 100pb. La electroforesis se realiza en un gel de agarosa al 3% y el protocolo de la PCR es el que sigue: • 2.5 µL buffer 10x • 0.5 µL DNTPS 10 Mm • 0.2 µL FastGene® Taq DNA Polymerase LS21 • 19.9 µL H2O mQ FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 68 • 0.5 µL forward 10 µM • 0.5 µL reverse 10 µM El cóctel con todos los componentes se introduce en un termociclador (T100™ Thermal Cycler 1861096 BIORAD) y se configura de la siguiente manera (tabla 1): Tabla 1 Configuración del termociclador para el genotipado de ratones GMO Sox2-Cre Paso Temperatura, ºC Tiempo Número de ciclos Desnaturalización inicial 95 3 min 1 Desnaturalización 94 30 seg 40 Hibridación 52 30 seg Extensión 72 1 min Extensión final 72 10 min Los cebadores usados para dicha reacción están formados por estas secuencias de nucleótidos (tabla 2). Tabla 2. Cebadores utilizados para la amplificación del gen en cuestión Cebadores Secuencia 5’/3’ Forward GCGGTCTGGCAGTAAAAACTATC Reverse GTGAAACAGCATTGCTGTCACTT Aquellas calles que presenten una banda de 100pb corresponderán con individuos mutantes para dicho gen, es decir, poseerán un alelo de Sox2 con la proteína quimera SOX2-Cre; en las calles donde no se aprecie banda será porque dicho individuo es de tipo wild type (imagen 8). Imagen 8. Imagen de un gel de agarosa correspondiente al genotipado de ratones Sox2-Cre Genotipado para Ratón B6-129Gt(ROSA)26Sortm2Sho/J Este gen, en cambio, puede albergar el constructo LoxP-EGFP en ambos alelos y los individuos serán perfectamente viables; el modelo funciona tanto con un alelo mutado como con los dos. La electroforesis en este caso se realiza en un gel de agarosa al 1,8% y el protocolo de la PCR es similar al anterior: • 2.5 µL buffer 10x • 0.5 µL DNTPS 10 Mm • 0.2 µL FastGene® Taq DNA Polymerase LS21 • 18.8 µL H2O mQ • 0.5 µL forward 10 µM Materiales y Métodos 69 • 0.5 µL forward 10 µM • 1 µL reverse común 10 µM El cóctel con todos los componentes se introduce en un termociclador (T100™ Thermal Cycler 1861096) y se configura de la siguiente manera (tabla 3): Tabla 3 Configuración del termociclador para el genotipado de ratones GMO LoxP-EGFP Paso Temperatura, ºC Tiempo Número de ciclos Desnaturalización inicial 95 3 min 1 Desnaturalización 94 30 seg 40 Hibridación 58 30 seg Extensión 72 1 min Extensión final 72 10 min Los cebadores usados para dicha reacción estás formados por estas secuencias de nucleótidos. Tabla 4. Cebadores utilizados para la amplificación del gen en cuestión Cebadores Secuencia Forward mutante 3’-AAGACCGCGAAGAGTTTGTC-5’ Forward wild type 3’-GGAGCGGGAGAAATGGATATG-5’ Reverse común 3’-AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT-5’ Como se puede observar en la imagen 9, se detectan dos tipos de bandas en el gel de electroforesis: aquellas formadas por 320pb que corresponderían a individuos con el alelo mutado LoxP-EGFP y aquellas con 600pb para los wild type. Si en una calle específica se observan ambas bandas, este ratón sería heterocigoto (imagen 9). Imagen 9. Imagen de un gel de agarosa correspondiente al genotipado de ratones LoxP-EGFP PREPARACIÓN Y ADMINISTRACIÓN DE TAMOXIFENO Se pesa el tamoxifeno (T5648, SIGMA), dependiendo de la cantidad que se quiera preparar, para dejarlo a una concentración final de 20 mg/mL en aceite de maíz (C8267, SIGMA). Su administración puede ser tanto vía subcutánea como intraperitoneal; nosotros escogimos esta última debido a que observamos mejores resultados. En el caso de la administración de tamoxifeno en neonatos, escogimos la vía subcutánea debido a que el peritoneo del ratón recién nacido es muy pequeño. Se administraron 5 dosis en días consecutivos y, en todos los casos, dicha dosis fue de 0,2 mg/g de peso del ratón. En los FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 70 experimentos con neonatos la dosis se redujo a la mitad y se administró durante 2 días consecutivos. ADMINISTRACIÓN DE EDU (5-ETINIL-2’-DEOXIURIDINA) El EdU es un compuesto análogo al BrdU (5-Bromo-2’-deoxiuridina) y que, por tanto, actúa intercalándose entre las bases de ADN cuando una célula entra en fase S de ciclo celular. De esta manera, administrando el compuesto al ratón, se podrá detectar posteriormente mediante inmunofluorescencia y así observar células que han entrado en división. El compuesto se disuelve en agua destilada (20mg/mL) y se administra al animal vía intraperitoneal a una concentración de 0,2mg/g de peso, con dos inyecciones 12 y 24 horas antes del momento de su sacrificio. EXTRACCIÓN DE SUERO Y MEDICIÓN DE PESOS Los pesos de los animales se recogieron mediante una báscula de precisión (Kern EMB 1200- 1) y se tomaron el día del inicio de cada experimento, el día del sacrificio y el día situado entre el inicio y el final. En experimentos de 3 días solo se recogen peso el día inicial y el final. v La sangre se extrae directamente del ventrículo izquierdo del corazón del animal con una jeringuilla (aguja de 25G x 5/8”) hasta obtener un volumen aproximado de 1 mL. v Para favorecer la coagulación, las muestras de sangre se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. v Se centrifugan a 13000rpm durante 30 minutos a 4ºC. Se recoge el sobrenadante que corresponde al suero y se hacen alícuotas que se almacenan a -20ºC para su posterior análisis. Aquellos sueros hemolizados o contaminados con glóbulos rojos se descartan de dichos análisis para evitar que interfieran con la medición y la correcta interpretación de los resultados. Para monitorizar el peso de los ratones en los experimentos de hipotiroidismo, se midieron estos valores el primer y último día del experimento, así como a la mitad del mismo. Por ejemplo, para ratones a los que se les indujo un hipotiroidismo de 12 días, los pesos se recogieron el día 1, 6 y 12 mediante una báscula de precisión. HIPOTIROIDISMO MEDIADO POR PTU (PROPYLTHIOURACIL). El PTU (P3755, SIGMA) es una molécula capaz de inhibir la producción de hormonas tiroideas mediante su interferencia con la enzima TPO (tiroperoxidasa), encargada de mediar la incorporación de iones yodo (I-) a la molécula de tiroglobulina (Alexander, 1959). Además, se ha descrito que el PTU actúa como un potente inhibidor de la deionidasa 1 (DIO1) en mamíferos, siendo sus efectos nulos para las deionidasas 2 y 3 (Larsen 1995 Annu Rev). El PTU se administra a los ratones a través del agua de bebida a una concentración del 0.1%. Debido al mal sabor que genera este compuesto, se añade también un modificador de sabor al 0.2% (Tang®, sabor frutas del bosque). Se debe monitorizar el consumo de agua en los animales tratados para asegurarnos que beben cantidades de agua adecuadas. El diseño del experimento consiste en inducir hipotiroidismo de distinta duración (3 días, 6 días y 12 días) a varios grupos de ratones con sus respectivos controles. A estos controles se les administrará agua de bebida con el modificador de sabor, pero sin PTU. Cada grupo se compone de 6 ratones hembras de 90 días de edad con agua y comida ad libitum. La inducción del hipotiroidismo se realizará en 3 experimentos independientes: uno para extracción de ARN y el estudio del transcriptoma, otro para el estudio de proteínas mediante Western-Blot y, por último, otro para inmunofluorescencia que dividiremos, a su vez, Materiales y Métodos 71 en dos grupos (ratones normales para estudiar las células SOX2 y ratones GMO para seguir dichas células mediante la expresión de EGFP). Imagen 10. Esquema de los diferentes experimentos realizados a los grupos de ratones tratados con PTU para la inducción del hipotiroidismo Hay que tener en cuenta que en el experimento en el que se utilizan los ratones Sox2-Cre- ERT2/LoxP-EGFP, además del PTU, debe administrarse tamoxifeno para así inducir el mecanismo de la Cre-Recombinasa y que las células SOX2 comiencen a expresar EGFP. En la imagen 10 se muestra un esquema del diseño experimental para una mejor comprensión del mismo. PERFUSIÓN DE LOS ANIMALES Y RECOGIDA DE MUESTRAS Y TEJIDOS Una vez finalizado el experimento en cuestión, los ratones se retiran de la sala de estabulado y se anestesian (tabla 5) antes de introducirlos en una campana de extracción para comenzar el proceso de perfusión. Para asegurarnos de que los ratones están bajo los efectos de anestesia FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 72 profunda, se utiliza el reflejo palpebral. El proceso se realiza en una campana debido a la toxicidad de la formalina. Tabla 5. Componentes utilizados para la preparación de anestesia para ratón Componentes Volumen Stock Referencia Ketamina (Ketamidor) 1mL 100mg/mL Richterpharma Hidrocloruro de xilacina (Rompun) 250µL 20mg/mL Bayer Suero fisiológico 6mL 0,9% NaCl Vitulia Los animales se perfunden con 50mL de suero glucosado al 5% para eliminar toda la sangre y que esta no interfiera con los resultados debido a su alta tasa de autofluorescencia. A continuación, se perfunden con otros 50mL de formalina tamponada al 10% para la fijación de los tejidos. Dependiendo del tamaño del tejido, este deberá permanecer más o menos tiempo en formalina. En el caso de tejido de tiroides de ratón, se deja 24 horas en este compuesto para completar el proceso de fijado. Preparación de las muestras para inmunofluorescencia El procedimiento de parafinado es realizado por el Servicio de Histología del CIMUS y se describe a continuación: v Las tiroides que están en una solución de 10% de formalina, se incuban durante al menos 24h en etanol al 70% y se colocan en distintos “cassettes” debidamente etiquetados. v Las muestras se incluyen en parafina mediante el sistema de Leica TP1020 Semi- Enclosed Benchtop Tissue Processor, donde se van moviendo automáticamente las muestras a distintas cubetas con distintas soluciones y cuyos pasos son: ! Deshidratación: 70% etanol (1hora), 96% etanol (3 incubaciones de 1hora y media) y 100% etanol (3 incubaciones de 1hora y media). ! Lavado: xileno, 2 incubaciones de 2 horas. ! Infiltración con parafina: parafina, 2 incubaciones de 2 horas. v Se retiran los cassettes y se forman los bloques de parafina usando el EG1150H Modular Tissue Embedding Center. Las muestras pueden ser guardadas a temperatura ambiente hasta su uso. v Unos minutos antes de proceder al seccionamiento de la muestra se dispone el bloque de parafina en hielo para facilitar el corte de la muestra y por lo tanto, el mantenimiento de las estructuras. v Se realizan secciones de 3-4 µm de grosor y se colocan en un baño a 55ºC. v Por último, estas secciones se montan en los portaobjetos, procurando poner en el mismo las muestras que se quieran comparar. La cuantificación de las imágenes obtenidas de las inmunofluorescencias se realiza con el programa Fiji-Image J 1.51 y CellProfiler 3.1.9. Preparación de muestras para el análisis del ARN. Con los ratones profundamente anestesiados, se procede a retirar la parte de la tráquea en la que se localiza la tiroides. Se coloca toda la pieza en una lupa binocular y con ayuda de unas microtijeras se separan los lóbulos tiroideos de la tráquea. Ambos lóbulos se colocan en un eppendorf con Trizol™ (15596026, Invitrogen) que previamente estará en hielo. Para la Materiales y Métodos 73 tráquea, se extrae la mucosa raspando el tejido con ayuda de un bisturí. Las muestras se guardan a -20ºC hasta su procesamiento. MODELO DE DESARROLLO DE LA TIROIDES Se inyectó TAM (0,1 mg/g de peso del ratón) a varias camadas de ratones Sox2-Cre- ERT2/LoxP-EGFP el día postnatal P1 mediante vía subcutánea, ya que la cavidad peritoneal es demasiado pequeña y corremos el riesgo de pinchar algún órgano. Los neonatos permanecen con sus madres igual que las camadas normales y, en el momento del destete (28 días), se extrae un pedazo de cola para su genotipado. Los ratones que no poseen en ninguno de sus alelos la proteína recombinante SOX2-Cre se descartan, ya que no tienen validez en el experimento. Los individuos con los dos genes modificados (ya descrito en el apartado 5.2) se sacrifican a la edad de 90 días, una vez han alcanzado plena madurez. Para los controles de este experimento se utilizó otro grupo de ratones Sox2-Cre- ERT2/LoxP-EGFP aplicándose el mismo procedimiento, pero estos se sacrificaron a los 2 días desde el momento de la inyección con TAM, es decir, en P3 (día 3 desde su nacimiento). MODELO DE HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL Los animales fueron anestesiados mediante ketamina-xilacina, como ya vimos en apartados anteriores. • Una vez anestesiado, el animal se coloca boca arriba sobre la superficie de una lupa estereoscópica (2,5x de aumentos), ajustando el campo de visión a la zona del cuello. • Se realiza una incisión longitudinal en el cuello de unos 2 cm de longitud y se separa la piel con cuidado. Se coloca un fórceps para mantener la piel abierta. • Mediante un corte vertical se retiran las glándulas submaxilares hasta llegar al músculo de la tráquea. • Con ayuda de unas micropinzas y un bisturí se levanta el músculo traqueal para cortarlo longitudinalmente sin romper el cartílago de la tráquea, ya que sería causa de muerte para el animal. El corte de dicho músculo se realiza únicamente para localizar el lóbulo de la tiroides; una vez realizado el procedimiento, el músculo de la tráquea se vuelve a juntar y este cicatrizará sin necesidad de sutura. • Se localiza el lóbulo derecho de la tiroides y se procede a retirar lo máximo posible del mismo con unas microtijeras. • Cuando se haya extraído la mayor parte posible del lóbulo, se vuelven a colocar lo mejor posible las glándulas submaxilares, se retira el fórceps que sujetaba la piel y se procede a suturar al animal. • Para una mejor recuperación, los animales ya operados se alojan en una cama térmica a 37ºC y, una vez despiertos, se vuelven a estabular en sus respectivas cajas. Durante la monitorización del individuo mientras se despierta, se le administra desinfectante e ibuprofeno en pomada para evitar posibles infecciones y mejorar el proceso de recuperación. Se administra una dosis de TAM por día durante 5 días consecutivos, dándose la primera dosis en el momento de finalizar la intervención quirúrgica, cuando el ratón todavía está bajo los efectos de la anestesia. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 80 Se cargan las muestras en el gel con tampón de carga 1X (Stock 5X: 50% glicerol, 10% ß- Mercaptoetanol, 0,5% azul de bromofenol, 0,4M Tris-HCl pH 6,8 y 10%SDS) hasta un volumen máximo de 20µLpara el peine de 15 o 18 pocillos y 40µLpara el peine de 10 pocillos. El gel se coloca en la cubeta con 1L de tampón de electroforesis 1X (Stock 10X 2L: 60g Tris-Base, 288g de Glicina y 20g SDS) Se procede a realizar la electroforesis del gel a un amperaje constante de 15mA durante 2 horas y media. A continuación, se realiza la transferencia del gel a una membrana (Immun-Blot PVDF 0,2µm, 162-0177, Biorad) mediante el sistema de transferencia semiseco (Z34 050-2, Sigma). Los tampones para la transferencia se preparan como se indica en la tabla 12. Tabla 12. Tampones para la transferencia de geles SDS-PAGE Tampones Reactivos Para 1L C 0,25M Tris 200mL 20% Isopropanol 200mL Agua destilada Hasta 1L B 1,25M Tris 20mL 20% Isopropanol 200mL Agua destilada Hasta 1L A 0,4M Ácido 6-aminocaproico en Tris 0,25M 100mL 20% Isopropanol 200mL Agua destilada Hasta 1L v Se corta 1 membrana de un tamaño de 10x8cm y se incuba en metanol durante 1 minuto en agitación constante. v Para hidratar la membrana se incuba durante 5 minutos en agua en agitación constante. v Se estabiliza en tampón de transferencia (tampón B) durante 5 minutos. v El gel se incuba durante 3 minutos en tampón A. v Se cortan papeles whatman del mismo tamaño que la membrana. Se mojan 3 en tampón C y se colocan en el sistema de transferencia. v Encima de estos, se colocan dos papeles mojados en B, la membrana, el gel y 4 papeles mojados en A. v Se cierra correctamente el sistema de transferencia y se corre a un voltaje constante de 0,8mA/cm2 durante 2 horas. Inmunodetección v Una vez finalizada la transferencia se lava la membrana durante 5 minutos en agua destilada para eliminar los restos del gel de acrilamida y de los tampones. v A continuación, se bloquea la membrana durante 2 horas a temperatura ambiente en agitación (tabla 13). La solución de bloqueo utilizada ha de ser la misma que la requerida por cada anticuerpo primario. Materiales y Métodos 81 Tabla 13. Soluciones de bloqueo utilizadas en la inmunodetección Soluciones de bloqueo Reactivos Referencias y Stock I-Block™ 2g/L I-Block™ T2015, Thermo Fisher Scientific 1X TBS Stock 10X TBS (0,2M Tris, 1,37M NaCl). Se ajusta el pH a 7,6. Se calienta en agitación sin que llegue a hervir hasta su completa disolución WestVision™ Block and Diluent Ready to use SP-7000, Vector Laboratories v Los anticuerpos primarios utilizados poseen condiciones específicas en cuanto al tiempo de incubación, temperatura de esta y concentración adecuada en una de las soluciones de bloqueo previamente descritas. Así, en la tabla 114 se recogen las diferentes condiciones para cada uno. Tabla 14. Relación de anticuerpos primarios utilizados en la inmunodetección Anticuerpo primario Referencia y proveedor Epitopo Concentración Solución Incubación Especie huesped SOX2 sc-59730, Sta Cruz Biotech (SCBT) Total 1:5000 WestVision™ 8h a 4ºC y 1h a 25ºC R TTF1 (SPT-24) NCL-L-TTF-1, Leica Biosystems 123aa (N-terminal) 1:1000 I-Block™ 8h a 4ºC y 1h a 25ºC M GAPDH (6C5) CB1001, Merk Millipore Total 1:5000 I-Block™ 1h 25ºC M ß-Actina (AC-74) A5316, Sigma Total 1:5000 I-Block™ 1h 25ºC M v Se lava la membrana 3 veces a intervalos de 5minutos en solución de lavado (1X TBS y 0,3% Tween20® (P9416, Sigma)). v La membrana se incuba durante 1 hora con el anticuerpo secundario específico (tabla 15) en la misma solución utilizada en el bloqueo y en la incubación con el primario. El anticuerpo secundario utilizado viene determinado por el tipo de huésped en el que se generó el anticuerpo primario y permite detectar y amplificar la señal del mismo. Tabla 15. Relación de anticuerpos secundarios utilizados en la inmunodetección. La solución en la que se incuban los secundarios será I-Block exceptuando las incubaciones con Sox2, en la que el anticuerpo secundario también se diluye en WestVision™ Anticuerpo Secundario Referencia Concentración Solución Incubación Polyclonal Goat Anti-Rabbit IgG-HRP A0545, Sigma 1:10000 I-Block™ 1hora 25ºC Polyclonal Rabbit Anti-Mouse Inmunoglobulins-HRP P0260, Dako 1:5000 I-Block™ 1hora 25ºC v Se lava la membrana 3 veces a intervalos de 5minutos en solución de lavado. v La membrana se coloca sobre una superficie lisa y se añade un volumen adecuado de sustrato quimioluminiscente Pierce ECL Western (32106 Thermo Scientific). Este volumen de ECL depende del tamaño de la membrana: 0,125mL de ECL cada cm2 de membrana. Los dos reactivos que componen el ECL deben mezclarse en el momento de su FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 82 uso en proporción 1:1; uno de ellos es fotorreactivo, por lo que debe protegerse de la luz en todo momento. v Se incuba la membrana durante 1 minuto a temperatura ambiente. v Para detectar la luz emitida resultante de la reacción del sustrato con la peroxidasa, se coge la membrana con unas pinzas, se retira el exceso de ECL y se coloca en un cassete de auto-radiografía. v Se utilizan películas fotográficas (FUJI Medical X-Ray Film nº8U) y se revelan a distintos tiempos en función de la señal obtenida con revelador y fijador en una sala oscura. En algunos casos se requiere incubar la misma membrana con distintos anticuerpos primarios sucesivos, por lo que se realiza un procedimiento que retira el anticuerpo anterior sin alterar la detección del siguiente: v Se lava la membrana 4 veces a intervalos de 5minutos en solución de lavado. v En un baño caliente a 55ºC se incuba la membrana con 25mL de solución de estripado (62,5mM Tris-HCl pH6,8, 2%SDS y 100mM ß-Mercaptoetanol) durante 30 minutos. v La membrana se lava 10 veces con solución de lavado en agitación durante 30 minutos. v Se procede con el bloqueo de la membrana y la incubación con otro anticuerpo diferente, alternando siempre anticuerpos de distintas especies. INMUNOFLUORESCENCIA E INMUNOHISTOQUÍMICA Inmunofluorescencia en tejidos de tiroides de ratón Todas las inmunofluorescencias se realizaron en secciones de tejido de ratón de 4 µm de grosor, previamente fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) según el protocolo utilizado en clínica gracias al sistema EnVision FLEX System (Dako). El método de perfusión de animales e inclusión de sus tejidos en parafina se trató en el apartado de “experimentos in vivo”. Cuando los cortes del tejido se han colocado en el portaobjetos, se procede al desparafinado del mismo. Esto se realiza colocando la muestra en una estufa a 37 ºC durante al menos una hora. Debido a que la parafina es un compuesto hidrófobo, el tejido previamente se tiene que deshidratar y, una vez desparafinado, volver a rehidratarse. Los procesos de deshidratación y rehidratación de las muestras se realizan sumergiendo el tejido en concentraciones cada vez mayores o menores de alcohol, respectivamente. Una vez finalizado el proceso de recuperación antigénica mediante PTLink (DAKO, Agilent) y en tampón TE (Tris-EDTA), las muestras se lavan con PBS para eliminar cualquier resto de parafina que todavía pudieran contener. A continuación, las muestras se incuban en una cámara húmeda a 4ºC durante 8 horas con el anticuerpo primario correspondiente. En la siguiente tabla se recogen los diferentes anticuerpos utilizados en el trabajo, así como sus respectivas concentraciones y tampones utilizados para su incubación (tabla 16). Tabla 16. Anticuerpos primarios utilizados en las inmunofluorescencias Anticuerpo primario Referencia y proveedor Especie Incubación Tejido Cultivo SOX2 Seven-Hills Bioreagents R 1:1000 50% NHS 8h 4ºC 1:2000 20% NHS 8h 4 ºC GFP AvesLab, GFP-1010 C 1:1500 20% NHS 8h 4 ºC TTF1 (SPT-24) CB1001, Merk Millipore M 1:500 8h 4 ºC 1:200 8h 4 ºC Materiales y Métodos 83 Anticuerpo primario Referencia y proveedor Especie Incubación Tejido Cultivo PAX8 (MRQ-50) 363M, Cell-Marque M 1:200 8h 4 ºC 1:100 8h 4 ºC Tiroglobulina GA509, Agilent DAKO R Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT NIS HPA049055, Merk R 1:300 8h 4 ºC AECK (Citokeratinas totales) M3515, Agilent DAKO M Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT p63 IR662r, Agilent DAKO M Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT ß-catenina GA70261 M Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT E-cadherina GA05961 M Rtu 8h 4 ºC ó 1h RT Una vez acabada la incubación con el anticuerpo primario, las muestras se lavan con PBS durante 5 min 3 veces para retirar el exceso de anticuerpo y a continuación de incuban con el anticuerpo secundario. Después de realizan otros 3 lavados con PBS, se añade medio de montaje (Fluoro-Gel, 17985-10, Electron microscopy Sciences) con 2mg/mL de DAPI (D9542, Sigma) y se monta el cubreobjetos. La mayoría de las imágenes de las muestras se obtienen con el microscopio confocal Leica TC SP5-AOBS. En los casos restantes, se obtienen con el microscopio de fluorescencia Olympus IX51/U-RFL-T/TH4-200 acoplado a la cámara Olympus DP72. Inmunofluorescencia en cultivo. El protocolo llevado a cabo es similar tanto para los cultivos celulares de tiroides humano como para los cultivos de tirosferas y su posterior diferenciación. v Se retira el medio de cultivo a las células y se lavan con PBS. v Se añade formalina al 5% diluída en PBS y se deja a temperatura ambiente 20 min. v 3 lavados con PBS de 5 min cada uno. v Se incuba con PBS + Triton™ X-100 0,1% durante 1h. v 3 lavados con PBS de 5 min cada uno. v Incubación con el anticuerpo primario. v 3 lavados con PBS de 5 min cada uno. v Incubación con el anticuerpo secundario. v Lavado y montaje de la muestra. En la tabla 17 se recogen los anticuerpos secundarios utilizados en ambos métodos. Cabe destacar que siempre se utilizan anticuerpos preabsorbidos F(ab’)2: en ellos, se realiza una digestión enzimática previa para eliminar parte de la fracción constante del anticuerpo. De esta manera, el anticuerpo es mucho más pequeño que el original sin perder propiedades de adhesión a su antígeno (ya que la fracción que reconoce el epítopo no se toca), por lo que aumenta su capacidad de penetración. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 84 Tabla 17. Anticuerpos secundarios utilizados para inmunofluorescencia Anticuerpo secundario Referencia y proveedor Incubación (diluidos en PBS) Tejido Cultivo Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti- Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch, 715-546-151 1:1000 1h RT 1:600 1h RT Cy™3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti- Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch, 711-166-152 1:1000 1h RT 1:600 1h RT Alexa Fluor® 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti- Chicken IgY (IgG) (H+L) Jackson ImmunoResearch, 703-546-155 1:1000 1h RT 1:600 1h RT Alexa Fluor® 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti- Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch, 715-606-150 1:1000 1h RT 1:600 1h RT Inmunohistoquímica en tejido de tiroides de ratón Las muestras se desparafinan y se les realiza el pretratamiento con el PTLink (DAKO, Agilent) de la misma manera que las inmunofluorescencias. v Las muestras se lavan una vez con PBS y se bloquean con peroxidasa al 3% durante 10 minutos. v 3 lavados durante 5 minutos con PBS. v Incubación con anticuerpo primario 30 minutos a temperatura ambiente (RT). v Las muestras se lavan una vez con PBS. v Incubación con el mismo anticuerpo secundario (Agilent, DAKO EnVision™ System, HRP) durante 30 minutos a temperatura ambiente. v Se lavan las muestras con PBS. v Revelado de muestras con DAB (3,3-Diaminobencidina). v A continuación, se contratiñe con Hematoxilina de Mayer durante 10 minutos. v Por último, se deshidratan las muestras y se realiza el montaje de estas. § Este proceso es válido únicamente cuando se utilizan anticuerpos de ratón o conejo, ya que el anticuerpo secundario solo reconoce estas dos inmunoglobulinas. Para la tinción con el anticuerpo de Sox2 procedente de cabra, se añade un paso más: se utiliza un anticuerpo ConejoantiCabra que reconocerá el anticuerpo de Sox2 y, a su vez, podrá ser reconocido por el anticuerpo secundario IgG anti-conejo/ratón (Agilent, DAKO EnVision™ System, HRP), conjugado con un polímero marcado con peroxidasa. Tabla 18. Anticuerpos primarios utilizados en las inmunohistoquímicas Anticuerpo primario Referencia y proveedor Especie Sox2 Seven-Hills Bioreagents R Sox2 AvesLab, GFP-1010 C GFP Abcam, ab6556 R Materiales y Métodos 85 Inmunofluorescencia con el uso de TSAs (Tyramide Signal Amplification) Esta técnica se basa en los trabajos previos de nuestro grupo en microscopía confocal128,129 y de los grupos de Mezey, que propuso la utilización de microondas por primera vez250, y de Ginty y Stack que utilizaron la técnica para colocalizar REa (Receptor de Estrógenos alfa) y RA (Receptor de Andrógenos) en testículo o cáncer de mama por microscopía óptica, respectivamente251,252. En ellos se intenta la inmunofluorescencia múltiple utilizando diferentes anticuerpos secundarios o utilizando secundarios no validados clínicamente. En nuestra técnica, las secciones fueron sometidas a una técnica de doble inmunofluorescencia en ciclos, usando siempre el mismo anticuerpo secundario validado clínicamente, lo que supone una modificación sobre las técnicas habituales de tinción. La doble tinción se realizó sobre la misma sección de tejido desparafinada, incubando en ciclos sucesivos con los distintos anticuerpos primarios y el mismo secundario, todos ellos clínicamente validados. El marcaje se hizo mediante Tyramide Signal Amplification (TSAs), moléculas sustrato de la enzima HRP con la que está marcado el anticuerpo secundario. HRP une covalentemente TSA a la cadena lateral del aminoácido tirosina253,254. De esta forma, se forman aductos covalentes O-O` de tirosina que resisten calor y pH, al contrario que los enlaces iónicos característicos de las uniones de los anticuerpos. Tras cada ciclo de marcaje se realiza un paso de desnaturalización mediante calor y pH250. Esto libera los anticuerpos unidos mediante enlace iónico, pero mantiene las TSAs unidas covalentemente a las proteínas. En nuestro caso, solo utilizamos esta técnica para localizar las células Sox2 positivas y células productoras de Calcitonina en la misma sección de tejido. Debido a que los dos anticuerpos funcionan perfectamente por separado (la Calcitonina, de hecho, está validada clínicamente), decidimos utilizarlos juntos mediante la técnica de TSAs (ya que los dos anticuerpos proceden de conejo y no podríamos hacer una inmunofluorescencia normal). El protocolo es similar al utilizado para las inmunohistoquímicas, pero se modifica a partir de la adición del anticuerpo secundario: v Después de incubar con el anticuerpo secundario conjugado con HRP, se realizan dos lavados de 5 minutos con TBS 1X + 0,1% Tween20. v Incubar 5 minutos con TSA Fluorescein (NEL760001KT, Perkin Elmer, Waltham) 1:200 diluido en 1X plus Amplification Diluent (Perkin Elmer, Waltham) a temperatura ambiente durante 5 min. Aquí se está realizando el marcaje de Calcitonina, ya que fue el primer anticuerpo utilizado. v Tres lavados de 5 minutos con TBS 1X + 0,1% Tween20. v Colocar los portaobjetos sobre el fondo de un recipiente de plástico (12x9x6 cm) (Toth et al, 2007) lleno con 200 ml de tampón TE 10 mM, pH 9.0. Calentar en el microondas (700W) durante 2 min 25 seg al 100% de potencia, hasta llevar al punto de ebullición, pero sin hervir. Inmediatamente, bajar la potencia al 20% durante 15 min. Dejar enfriar en el tampón durante 30 min a temperatura ambiente. v Se repiten todos los pasos exactamente igual, utilizando el segundo anticuerpo, en nuestro caso Sox2. Se añade TSA Cyanine 3 (NEL760001KT o NEL744001KT, Perkin Elmer, Waltham) 1:200 diluida en 1X plus Amplification Diluent (Perkin Elmer, Waltham) a temperatura ambiente durante 5 min. ELISA Se realizó un ELISA para determinar la cantidad de hormona T4 libre en el suero de ratones tratados para hipotiroidismo a diferentes días, con sus respectivos controles. El protocolo utilizado fue el descrito por el proveedor salvo una variación: se incubaron los pocillos pretratados de la placa del ELISA con los sueros de los ratones media hora antes FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 86 de empezar el protocolo. Esto facilita que las proteínas que tienen que ser detectadas tengas más oportunidad de entrar dentro de la curva. MICROSCOPÍA Hay que aclarar que todas las fotografías mostradas de inmunofluorescencia fueron tomadas con microscopía confocal, a excepción de la diferenciación de tirosferas, que no fue posible. Estas últimas, junto con las fotos de inmunohistoquímica, se adquirieron con microscopía óptica. Los videos de tejidos en 3D que se mostrarán en la presentación fueron adquiridos mediante microscopía light-sheet. Microscopía óptica Se utilizó un microscopio Olympus IX70/IX51, con objetivos de 20X y 40X. El software utilizado fue CellSense® v1.6. Microscopía confocal Para la adquisición de imágenes cin esta técnica se utilizó un microscopio confocal de banda ancha (Leica TC SP5-AOBS) con láser blanco (470-670 nm) y láser ultravioleta, a través del objetivo seco 20X y a través del objetivo 63X oil con 1,4 de apertura numérica. El software para el tratamiento de imágenes fue el LAS AF (Leica Application Suite Advanced Fluorescence), donde se tomaban planos seriados de 0,5 µm de forma secuencial bidireccional. En la siguiente tabla se recogen los diferentes canales utilizados con sus respectivas características. Tabla 19. Características de cada canal utilizado en microscopía confocal. Canal Fluoróforo λEx (nm) λEm (Rang, nm) Pasadas(Line/Frame average) Ch01 DAPI 405 414-479 2/2 Ch02 Alexa Fluor 488 492 499-547 4/3 Ch03 Cyanine 3 552 565-624 3/2 Ch04 Cyanine 5 594 609-648 2/2 Ch05 Transiluminación DIC (Differential interference contrast) Microscopía Light-Sheet Este tipo de microscopía se basa en la adquisición de imágenes 3D de un órgano entero o una parte de este gracias a la proyección de seis hojas de luz que inciden sobre la muestra, tres a cada lado. Mediante una cámara de alta resolución sCMOS localizada perperdicularmente a las hojas de luz y moviendo la muestra a través de dichas hojas, se generan las imágenes 3D que serían imposibles mediante microscopía confocal debido a su baja capacidad de penetración en la muestra. El microscopio utilizado en este trabajo fue el Light-Sheet Ultramicroscope II (Miltenyi), con una configuración de objetivo 2X (Olympus MVPLAPO) combinado con un único zoop óptico (Olympus MVX-10 zoom) y una cámara CMOS (Andor Neo NEOCM). Hay que destacar que para utilizar esta tecnología se debe clarificar la muestra previamente, es decir, hacerla transparente. Para ello se pueden utilizar diferentes técnicas basadas en métodos acuosos u orgánicos; la utilización de uno u otro dependerá del tipo de inmunofluorescencia que se quiera realizar en el tejido o del grado de conservación de las estructuras que lo componen255,256. Materiales y Métodos 87 Después de realizar muchas pruebas con diferentes métodos de clarificación, tanto acuosos como orgánicos, nos decantamos por uno de los métodos orgánicos que, además, se produce de manera comercial, evitando así posibles problemas que puedan tener otros protocolos que no están tan estandarizados. Los componentes están basados en un compuesto comercial llamado VISIKOL®. El protocolo para realizar el procedimiento de clarificado se obtiene de la página web www.visikol.com, donde dependiendo del órgano, de la especie y del tamaño del mismo, la página te genera un protocolo individualizado que a nosotros, personalmente, nos funcionó bastante bien. Así, el protocolo utilizado por nosotros fue el siguiente: • Preparación de la muestra: o Etanol 50% - 30 min. o Etanol 25% - 30 min. o Etanol 10% - 30 min o PBS – 1 hora (x2) o Permeabilitation buffer (VISIKOL) – 90 min. o PBS – O/N (overnight) • Permeabilización o PBS – 30 min. o Metanol 50%/PBS – 45 min. o Metanol 70%/dH2O – 45 min. o Metanol 100% - 2 h. o Metanol 80%/DMSO – 1 h (x2) o Metanol 80%/ dH2O – 45 min. o Metanol 50%/PBS – 45 min o PBS – 30 min (x2) o PBS/1%TritonX-100 – 45 min (x2) o Tampón de permeabilización(1) • Tinción o Tampón de bloqueo(2) o Anticuerpo primario* [1:100] (diluído en tampón de anticuerpos(3)) – 3 días o Tampón de lavado(4) o Anticuerpo secundario* [1:600] (diluído en tampón de anticuerpos) – 3 días • Clarificado o Metanol 50%/PBS o Metanol 70%/PBS o Metanol 100% o Visikol-HISTO™ o Visikol-HISTO2™ (conservar aquí la muestra indefinidamente) (1)PBS/0,2% TritonX-100/0,3M Glicina/20% DMSO (2) PBS/0,2% TritonX-100/6% NHS (Normal Horse Serum)/10%DMSO (3)PBS/0,2% Tween®20/Heparina 10µg/µL/ 3% NHS/5% DMSO (4)PBS/0,2 Tween®20/Heparina 10µg/µL *Los Anticuerpos fueron los mismos que se utilizaron para las inmunofluorescencias (rabbitSOX2 – Seven Hills) (Donkey antiRabbitCy™3 – Jackson ImmunoResearch), ya citados en la Tabla 16 y 17 FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 88 4 ESTUDIOS DE ADN EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN A PARTIR DE CULTIVO/TEJIDO Para la extracción de ADN de los cultivos celulares primarios de tiroides se utiliza el kit DNeasy blood & tissue kit 50 (Cat.69504, QIAGEN). En el caso de tejidos, el kit utilizado es Allprep DNA/RNA Mini kit 50 (Cat. 80204, QIAGEN). Para la cuantificación tanto de tejido como de cultivo celular el kit utilizado fue el QuantifilerTM Human DNA Quantification Kit (Cat.4343895, Thermo Fisher Scientific). A continuación, dicha cuantificación se mide con el equipo 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). GENOTIPADO DE RATONES Extracción de ADN Se preparan 200 mL para hacer el stock de tail buffer a partir de los componentes referidos en la tabla 19. Tabla 20. Componentes para la preparación del tail buffer Reactivos tail buffer Referencia 4mL de NaCl 5M S9888, Sigma 2mL Tris 1M pH 9,5 --- 400µL EDTA 0,5M pH8 E9884, Sigma 20 mL SDS 10% L4509, Sigma Se añade agua miliQ hasta un volumen final de 200mL Añadimos en el eppendorf que contiene la cola del ratón que se quiere genotipar 150µL de tail buffer y otros 5µL de Proteinasa K (EO0491, Thermo Scientific). Se coloca la mezcla en el termoblock a 55ºC, hasta que la cola esté completamente deshecha. A continuación, se centrifugan dutante 5 minutos a 2000 rpm. Se recoge 90 µL de sobrenadante y se descarta lo demás. Se añade a dicho sobrenadante el doble de etanol absoluto frío (en este caso, 180 µL). A continuación, se centrifugan durante 5 minutos a 10000 rpm. Se decanta el sobrenadante a mano ya que el precipitado de ADN quedará adherido al fondo del eppendorf. Se deja secar unos 10 minutos. Se añaden 50µL de agua miliQ y se aplica un vórtex. Para la realización de la PCR se usará 1µL. 5 ESTUDIOS DE ARN EXTRACCIÓN ARN La extracción de ARN de tejidos humanos se realiza mediante el kit Allprep DNA/RNA Mini kit 50 (Cat. 80204, QIAGEN). Para la extracción de ARN de cultivos primarios humanos se usa TRIzol™ (15596026, Invitrogen) y se siguen las indicaciones descritas por el proveedor. El RNA obtenido se trata con 1U de DNasaI libre de RNAasas (EN0521, Thermo Fisher) durante 30 min a 37 ºC. Después se purifica mediante el kit GeneJET RNA Cleanup and Concentration Micro kit (K0842, Thermo Fisher). Materiales y Métodos 89 Para la extracción de ARN a partir de tejidos o cultivos de ratón también se usa TRIzol, pero el ARN obtenido no se purifica, ya que debido a la pequeña cantidad de células no es posible alcanzar un rendimiento adecuado de la columna. Una vez extraído, se determina la cantidad de ARN presente en la muestra y se procede a su cuantificación con la ayuda de un espectofotómetro (Nanodrop 2000, Thermo Fisher) (ratio deseable A260/280=2-2,2). SÍNTESIS DE ADNC A PARTIR DE ARN MEDIANTE RETROTRANSCRIPCIÓN. En primer lugar, hacemos un pretratamiento de la muestra con ADNasa (es independiente del primer pretratamiento descrito más arriba; esto se realiza para asegurarnos que el ADN queda totalmente eliminado: v Se incuba 1µg de ARN total con 1 U de ADNasaI libre de ARNasas (EN0521, Thermo Fisher), 1µL de tampón 10X con MgCl2 y agua hasta un volumen final de 10µL a 37ºC durante 30 minutos. v Para inactivar la ADNasaI se añade 1µL de EDTA y se incuba a 65ºC durante 10 minutos en un termoblock. La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realiza mediante una transcripción inversa (RT-PCR) del ARN de partida: v Se añaden 1,5µL de 10mM dNTPs, 0,1 µL de cebadores aleatorios y agua destilada hasta un volumen final de 30µL. v Se incuba durante 10 minutos a 65ºC. v Se añaden 6µl del tampón 5X First-Strand, 3 µL de 0,1M DTT, 1µL de RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 U/µL) y se incuba a 37ºC durante 2 minutos. v Se añaden 1,5µL de 300 UI MMLV (28025-013, Invitrogen, USA). v En un termociclador se aplica el protocolo descrito en la tabla 20. Tabla 21. Protocolo utilizado para la RT-PCR Temperatura (ºC) Tiempo 25 10 min 37 50 min 42 30 min 95 5 min PCR CUANTITATIVA Para cuantificar la expresión de ARN una vez sintetizado el ADNc, se realiza una PCR cuantitativa (qPCR); las cantidades de reactivos varían dependiendo de si los cebadores son comerciales, diseñados por el grupo o cebadores Brilliant III Ultra-Fast SYBR MasterMix (600882, Agilent Technologies) validados previamente (tabla 21). FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 96 Figura 1. La expresión del ARNm de Sox2 pero no de Tshr se incrementa tras la pubertad en la glándula tiroides de ratones hembras, pero no de machos. Expresión del ARNm de Sox2 (A, C) y Tshr (B, D) en hembras y machos a 15, 30, 60 y 90 días. Se utilizó el epitelio de la tráquea como control positivo de la expresión de Sox2. A) Expresión de Sox2 en la tiroides de ratones de diferentes edades. Izquierda: ratones hembras de 15, 30, 60 y 90 días. Derecha: ratones machos de 30, 60 y 90 días. B) Expresión de Tshr en los mismos grupos de edad. C) Comparación de la expresión de Sox2 entre sexos en grupos de la misma edad. D) Comparación de la expresión de Tshr entre sexos en grupos de la misma edad. En las gráficas se representan la media±el error estándar de Taqman qRT-PCR con un tamaño muestral (n) mostrado encima de cada barra. Se utiliza un test de Kruskal-Wallis para los apartados A y C; y un test de Mann-Whitney para los apartados B y D; *p≤0,05, **p≤0,01 y ***p≤0,001. CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA DE SOX2 Expresión de Sox2 mediante Western-Blot en ratones No siempre las diferencias encontradas en la cuantificación del ARNm de un gen coinciden con la de la expresión de su proteína en un tejido. Para comprobar los resultados obtenidos en el apartado anterior, cuantificamos la expresión de la proteína total de SOX2 en ratones individuales de ambos sexos a dos edades distintas mediante western blot (Figura 2). Como se puede observar, la proteína SOX2 se detecta al peso correcto mediante comparación con el epitelio de la tráquea, tomado como control positivo por su abundancia (Figura 2A). El western se rehibridó para ß-actina, una proteína de citoesqueleto tomada como control de carga en cada calle. Cuantificamos la expresión relativa de SOX2 (Figura 2B). Pudimos observar cómo SOX2 es significativamente más abundante en tiroides de ratones hembras comparadas con machos de la misma edad. Lo más destacado es que el resultado en adultos (90 días) confirma el resultado obtenido para el ARNm. 0 10 20 160 200 DmRNA/Tbp n=5 n=4 n=4 n=9 n=6 n=6 Hembras Machos 15 30 60 90 30 60 90 2x n=7 * * Sox2 TiroidesTráquea Días 0 1 2 3 4 DmRNA/Tbp n=4 n=9 30 días ns 0 1 2 3 4 5 DmRNA/Tbp n=5 n=3 n=4 n=6 n=9 n=5 n=6 Hembras Machos 15 30 60 90 30 60 90 Días 2x Tshr TiroidesTráquea 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 DmRNA/Tbp n=3 n=9 30 días ns 0 5 10 15 DmRNA/Tbp n=4 n=6 60 días ns Sox2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 DmRNA/Tbp n=4 n=5 60 días ns Tshr 0 5 10 15 20 25 DmRNA/Tbp n=7 n=6 90 días ** macho hembra 0 1 2 3 4 DmRNA/Tbp n=6 n=6 90 días macho hembra ns A B C D Resultados 97 Figura 2. La expresión de la proteína SOX2 en la glándula tiroides es significativamente mayor en ratones hembras que en machos. Expresión de proteínas en ratones individuales machos y hembras de 30 y 60 días. El epitelio de la tráquea se utilizó como control positivo. A) Western blot para SOX2 y la proteína de citoesqueleto a-tubulina. B) Cuantificación de la expresión específica de SOX2 en tiroides comparando el grupo de hembras y machos a cada una de las dos edades. Se representa la media±el error estándar de la intensidad de las bandas a partir del western blot, con un tamaño muestral (n) mostrado encima de cada barra. Se utiliza un test de Mann- Whitney. *p≤0,05. En conjunto, nuestros resultados podrían sugerir que las hembras adultas podrían tener más población celular SOX2+ que los machos adultos. Esto podría estar relacionado con unos mayores requerimientos funcionales de la tiroides en el sexo femenino inducidos bien por factores hormonales o genéticos, como ha sido descrito previamente en humanos270,271,272. A partir de ese momento, y sabiendo la importancia del sexo en la patología hiperproliferativa benigna y maligna de la tiroides, realizamos nuestros siguientes experimentos fundamentalmente en hembras. Estandarización de la tinción de secciones de tejido de ratón hembra de 90 días por IHQ con diferentes anticuerpos de Sox2 Nuestro siguiente paso fue localizar qué células expresaban SOX2 en la glándula tiroides para ver dónde se localizaban y cómo se disponían en el tejido. Mediante técnicas de inmunohistoquímica en secciones de tejido fijado y parafinado (Formalin-fixed Paraffinembedded, FFPE) realizamos una primera estandarización de la tinción de SOX2 en la tiroides de ratones, un tejido que al tener coloide lleno de tiroglobulina glicosilada provoca ciertos problemas técnicos en la detección de proteínas. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 98 Para ello utilizamos dos anticuerpos anti-SOX2: uno procedente de conejo y otro de cabra. Con ambos anticuerpos observamos una tinción nuclear clara del epitelio de la tráquea, tomado como control positivo (Figura 3A, asteriscos). En la tiroides, la tinción no fue tan abundante ni intensa. Sin embargo, con ambos anticuerpos observamos una tinción específica de células individuales que estaban situadas por el exterior de los folículos, y algunas en íntimo contacto con el epitelio folicular (Figura 3B). Con ambos anticuerpos tuvimos el mismo resultado (comparar en la Figura 3B, la derecha con la izquierda). Figura 3. Las células SOX2+ son distintas al epitelio folicular, pero están íntimamente asociadas con éste. Inmunohistoquímica en ratones hembra de 90 días (marrón) contrateñido con hematoxilina diluida para revelar los núcleos (azul). Se utilizaron dos anticuerpos de SOX2 de distinta especie: conejo (rSOX2) y cabra (gSOX2). A) Las secciones de tráquea (asteriscos) muestran que el epitelio es completamente positivo, con una tinción nuclear, para SOX2 con el anticuerpo rSOX2 (izquierda) y con el anticuerpo gSOX2 (derecha). En la tiroides no se detecta tinción en el epitelio folicular. B) En las secciones de tiroides, a mayor aumento, se observa el marcaje positivo con ambos anticuerpos de células Sox2 (señaladas con asteriscos); estas células se disponen normalmente en la zona interfolicular. Resultados 99 Aunque tanto el anticuerpo de cabra273,274 como el de conejo275,276 están citados en literatura y ambos son válidos para estas técnicas, nos decantamos por este último debido a que en la tinción con el anticuerpo de cabra aparecía señal difusa de manera inespecífica en partes de restos de sangre en vasos sanguíneos, e incluso a veces se unía al coloide (no mostrado), dando una señal de fondo molesta que con el anticuerpo de conejo no teníamos. Esto no pasaba cuando incubábamos con el anticuerpo secundario sólo, por lo que dedujimos que era background proveniente del goat-anti-SOX2. Colocalización de diferentes marcadores en las células Sox2 positivas en ratones hembras de 90 días. Para caracterizar las células SOX2 encontradas estudiamos marcadores que pudieran coexpresarse con SOX2 mediante tinciones dobles por inmunofluorescencia. Utilizamos el anticuerpo de SOX2 junto con marcadores de tipo celular (filamentos intermedios), fenotipo de epitelio endocrino de la tiroides y otros marcadores típicos ya descritos en poblaciones de células madre de otros órganos. Nuestra primera tinción fue identificar el tipo celular de la población SOX2. La colocalización con citokeratinas fue definitoria, como se pudo observar al teñir con AECK, una mezcla de dos anticuerpos (AE1 y AE3) que detecta muchos tipos de queratinas. El anticuerpo AE1 detecta citokeratinas de la subfamilia A (CK10, CK13, CK14, CK15, CK16 y CK19); el anticuerpo AE3 detecta citokeratinas de la subfamilia B (CK1, CK2, CK3, CK4, CK5, CK6, CK7 y CK8) (Figura 4A). Observamos que el epitelio folicular es positivo para citokeratinas, como se espera ya que es epitelial, pero en las células SOX2 se colocalizan ambas tinciones demostrando que la población SOX2 es epitelial. La intensidad del marcaje es mayor en las células SOX2 comparada a las células foliculares, aunque puede haber diferencias de tamaño entre las dos poblaciones celulares que originen una diferencia aparente. En esta caracterización inicial estudiamos la colocalización con otras proteínas asociadas a la membrana plasmática como son ß-catenina y E-Cadherina. La ß-catenina es una proteína asociada a la cara citoplasmática de la membrana, mientras que E-Cadherina es una proteína transmembrana donde se anclan los filamentos del citoesqueleto para formar uniones entre células epiteliales como desmosomas y bandas de adhesión. En resultados anteriores de nuestro propio grupo, demostramos que las células madre GPS de la hipófisis co-expresan de forma intensa ambas proteínas128,129. Las células SOX2 expresaban ß-catenina, que rodeaba el marcaje nuclear (Figura 4B). Ninguno de estos marcajes colocalizaba subcelularmente, puesto que SOX2 era nuclear, y las otras dos proteínas están relacionadas con la membrana plasmática. Pero pudimos observar alguna célula con núcleo SOX2 positivo completamente rodeada de bcatenina. Las células SOX2 colocalizaron con E-Cadherina, aunque este marcador se expresaba de forma poco intensa en comparación con su expresión fuerte en el epitelio folicular, negativo para SOX2 (Figura 4C). El siguiente paso fue teñir para los dos factores de transcripción de fenotipo tiroideo, TTF1 y PAX8, que colocalizan en el epitelio folicular desde el desarrollo embrionario. Las células SOX2 positivas lo eran también para TTF1, aunque con mucha menos intensidad que el epitelio folicular tiroideo (Figura 5A-B). Nosotros definimos estas células a partir de ahora como SOX2+/TTF1low partir de ahora. Estas células SOX2+/TTF1low eran negativas para PAX8 (Figura 5C-D). FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 100 Figura 4. Las células SOX2 expresan citokeratinas, b -Catenina y E-Caderina. Inmunofluorescencias dobles estudiadas con microscopía confocal para identificar a las células Sox2 positivas (marcaje nuclear, rojo) frente a las proteínas asociadas a la membrana (marcaje citoplasmático, verde). A) SOX2 colocaliza con citokeratinas que también se expresan en el epitelio folicular. La tinción parece más intensa en las células SOX2. B) Las células SOX2+ coexpresan ß-catenina que rodea el marcaje nuclear. C) SOX2 colocalizan con E-cadherina, aunque no la sobreexpresan como ocurría en el caso de citokeratinas, y el marcaje parece más intenso en el epitelio folicular. Resultados 101 Figura 7 (parte 2) Figura 4 (parte 2) FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 102 Figura 5. Inmunofluorescencia para estudiar la colocalización de SOX2 con los factores de transcripción característicos de epitelio folicular. A) Las células SOX2+ co-expresan el factor de transcripción TTF1 característico de tiroides. Este marcaje siempre es más débil que las demás células que componen el tejido, catalogadas por nosotros como “Sox2+TTF1low” e indicadas con flechas. B) Campo a menor aumento para dar una visión global de este resultado en el lóbulo tiroideo. C) Las células Sox2+ son negativas para PAX8, aunque las células del epitelio folicular de la glándula son PAX8+, algunas con más intensidad que otras por razones de la sección. D) Otro campo distinto en otro lóbulo tiroideo demostrando de nuevo que las células SOX2 no expresan PAX8. Resultados 103 Figura 5 (parte 2) FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 104 En la glándula tiroides hay dos poblaciones epiteliales endocrinas, el epitelio folicular secretor de hormonas tiroideas de origen endodérmico y las células C productoras de Calcitonina cuyo origen embrionario es aparentemente la cresta neural según experimentos clásicos en embrión de pollo277, aunque hay cierto debate sobre ello con experimentos más recientes proponiendo que su origen embrionario es endodérmico278,279. Nuestro siguiente paso fue estudiar si las células SOX2 eran células C. Como se puede observar en la Figura 6, ninguno de los campos fotografiados presentó co-localización entre Calcitonina y SOX2. Se puede observar además que las zonas de la tiroides donde hay abundancia de células C tienen pocas células SOX2, y viceversa. p63 es una proteína nuclear que en epitelios glandulares exocrinos se expresa en células basales, que son las células madre (por ejemplo, próstata o mama). También, en el epitelio de vías aéreas las células p63 se consideran las células madre desde la época embrionaria, más restringidas en su potencialidad tras el nacimiento280,281. En la tiroides, p63 es el marcaje encontrado en los llamados “nidos sólidos” en tiroides humano que se propusieron como agrupaciones de células madre de tiroides282,283,284. En la base de datos Human Protein Atlas, tres anticuerpos validados para tinción en FFPE de tiroides humano, detectaban p63 en mayor o menor porcentaje de células (desde <25% hasta >75%) (https://www.proteinatlas.org/ENSG00000073282-TP63/tissue/thyroid+gland). Nuestro resultado fue muy interesante. p63 mostró un marcaje nuclear abundante en el epitelio folicular tiroideo negativo para SOX2 (Figura 7). Pero entre la población SOX2 pudimos observar una sub-población donde SOX2 y p63 colocalizaban, mientras que otra subpoblación era absolutamente negativa para p63 (Figura 7). Ambas poblaciones estaban entremezcladas, con alguna célula aislada tanto SOX2+p63- como SOX2+P63+. Resultados 105 FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 112 Vídeo 1. SOX2· en glándulas tiroides de ratones C57BL6/J hembra adulta (>90 días) mediante microscopía 3D Light-sheet. Se muestra un esquema de la altura a la que se han extraído con Imaris las secciones mostradas a partir del vídeo registrado en el microscopio Light-Sheet. La fluorescencia roja muestra la tinción de células o grupos de células con SOX2, con tinción conocida en el epitelio de la tráquea que actúa como control positivo y no varía en las diferentes alturas. Resultados 113 2 MODELOS DE RECLUTAMIENTO DE CÉLULAS MADRE EN LA TIROIDES: RASTREO DE LA POBLACIÓN SOX2 EN EL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP Una vez caracterizada en lo posible la población SOX2 quisimos hacer estudios funcionales. Para ello, nuestro siguiente grupo de experimentos utilizó el modelo de rastreo con GFP con la obtención del ratón Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP a partir del cruce de la cepa Sox2-CRE-ERT2 +/-228 y la cepa LoxP-EGFP +/+286. Si todo funcionase correctamente, las células SOX2 no expresarían EGFP en ausencia de tratamiento inductor, a pesar de expresar Cre-ERT2. Cuando se inyecta Tamoxifen (TAM) la proteína Cre-ERT2 que es citoplasmática e inactiva se vuelve dimérica y nuclear al activarse el fragmento derivado del receptor de estrógenos (ERT2). La parte recombinasa actúa sobre los locus LoxP permitiendo la expresión de EGFP bajo la expresión del promotor del locus ROSA26, de expresión ubicua en ratones287. El tiempo que se necesita desde la inyección de TAM hasta la detección de GFP en células SOX2 depende mucho del órgano y tejido estudiado, y debe caracterizarse cuidadosamente. CARACTERIZACIÓN EN LA TIROIDES DEL MODELO SOX2-CRE-ERT2/LOXP-EGFP TRAS TAMOXIFEN (TAM) A TIEMPO CORTO O LARGO. Inmunohistoquímica de SOX2 con tamoxifen a lo largo del tiempo frente a controles en la tráquea Antes de todo quisimos comprobar que el modelo de ratón funcionaba correctamente. Para ello, administramos a ratones adultos la misma concentración de TAM (vía intraperitoneal) en una inyección al día y en días consecutivos, pero variando el número de dosis. Así, llamamos tiempo corto cuando administramos dos dosis de TAM y tiempo largo cuando se administran cuatro dosis. Los ratones fueron sacrificados al día siguiente a la administración de la última inyección y las secciones se tiñeron para GFP que detecta también la proteína EGFP. El epitelio de la tráquea está compuesto por una capa de células en la que la mayoría de las células son positivas para SOX2. Gracias a esta numerosa expresión de SOX2 fue fácil comprobar el correcto funcionamiento del modelo. Como se aprecia en la Figura 9, comprobamos que también expresaban gran cantidad de GFP en la tráquea cuando a los ratones se les administraba TAM y que, además, esta cantidad de GFP variaba dependiendo del número de dosis de TAM, siendo la tinción con GFP menos numerosa o en parches cuando se administraban dos dosis (Figura 9A, izquierda), y más numerosa o continua cuando se administraban cuatro dosis (Figura 9B, izquierda). Al estudiar la glándula tiroides de estos ratones, también pudimos observar células teñidas para GFP, aunque menos intensas que la tráquea y muy aisladas, demostrando de nuevo que este tejido tiene células SOX2, pero que éstas son mucho menos abundantes que en el tejido respiratorio (Figura 9A-B, derecha). Al no hacer una tinción exhaustiva de las glándulas completas, y debido a la desigual distribución de la población SOX2 en la tiroides y ser el número de células detectado por sección pequeño no encontramos diferencias cuantitativas en la tiroides entre el tratamiento corto y largo (Figura 9A-B, derecha). Sin embargo, la tinción fue específica de la existencia de recombinación genética ya que ratones normales inyectados con TAM por cuatro días no presentaron tinción para GFP ni en la tráquea ni en la tiroides (Figura 9C). FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 114 Figura 9. Nuestro Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP es un modelo cuantitativo para estudiar la expresión de SOX2. Se muestran secciones teñidas para inmunohistoquímica de GFP contrateñidas para hematoxilina en ratones a los que se les inyectó TAM durante un tratamiento corto (2 días) o largo (4días). A) Izquierda: Tras un tratamiento corto con TAM, el epitelio de la tráquea se vuelve positivo para GFP en forma de parches alejados entre sí interpuestos con células negativas. Derecha: en la tiroides se detectan células GFP en localizaciones compatibles con nuestra población SOX2. B) Izquierda: Tras un tratamiento largo con TAM, el epitelio de la tráquea aparece de forma prácticamente continua teñido para GFP. Derecha: En la tiroides, se observa un número de células GFP discreto que no aparenta tener variaciones con el tratamiento corto debido al bajo número de células SOX2. C) Las secciones de ratones con genotipo normal wildtype son negativas para GFP tanto en la tráquea como en la tiroides a pesar de recibir el mismo tratamiento con TAM, demostrando la validez del modelo. Resultados 115 Inmunofluorescencia para GFP en la tráquea y en la tiroides tras tamoxifen en ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP Como la inmunohistoquímica no nos permite realizar dobles y triples tinciones, estandarizamos la doble tinción de GFP asociada a SOX2 por inmunofluorescencia para ver la relación de las células SOX2 con las GFP. En la tráquea vemos una vez más cómo hay una alta expresión de SOX2 nuclear y su consecuente relación directa con la expresión de GFP citoplasmática (Figura 10A). El marcaje fue específico puesto que animales del mismo genotipo en ausencia de TAM, no pudimos detectar células GFP+SOX2 dobles positivas en la tráquea (Figura 10B). En la tiroides no ocurría lo mismo, ya que fue difícil encontrar células SOX2 positivas que también lo fueran para GFP. Directamente fuimos a la zona de la tiroides donde sabíamos que SOX2 era muy abundante (medio-superior). Incluso en estas secciones, donde había un porcentaje alto de células SOX2, la expresión doble de GFP y SOX2 fue escasa (Figura 10C). Se observa que de las cuatro células GFP mostradas, dos tienen su núcleo completo dentro de la sección detectado por la intensidad del DAPI. Sólo estas dos células fueron doble positivas para SOX2 y GFP. La tinción fue específica, ya que si omitimos los anticuerpos primarios no detectamos señal de GFP ni de SOX2 (Figura 10D). Nuestra conclusión es que la expresión del locus ROSA26 en la mayor parte de las células SOX2 de la tiroides es baja, bien porque en tiroides no se exprese ese promotor de forma intensa, o bien porque la mayoría de las células SOX2 permanecen en un estado de baja actividad. De cualquier modo, las células SOX2 que sí expresan GFP pudieran tener un recambio rápido como lo indica el hecho de que dos de las tres células GFP con núcleo no expresen SOX2, aunque una explicación alternativa como hemos apuntado arriba es que el núcleo no esté incluido completamente en la sección (Figura 10C). FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 116 Figura 10. Marcaje SOX2-GFP en la tráquea y en la glándula tiroides tras el tratamiento con TAM. Inmunofluorescencia doble para GFP y SOX2 en secciones de ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP a los que se les administró TAM o Vehículo durante 4 días. A) En la tráquea, prácticamente todo el epitelio muestra SOX2 en el núcleo y GFP en el citoplasma. B) Esto no sucede si se inyecta vehículo en vez de TAM, y el epitelio de la tráquea SOX2 positivo no expresa GFP. C) En la tiroides se buscó una sección con abundancia de células SOX2 (tercio medio-superior) pero sólo cuatro de esas células son GFP. Las dos células en las que el DAPI demuestra que la sección contiene el núcleo completo, son doble positivas para SOX2 (nuclear) y GFP (citoplasmático). D) Si omitimos los anticuerpos primarios, no se obtiene marcaje (Control negativo). Resultados 117 Figura 10 (parte 2) MODELO DE RECLUTAMIENTO INDUCIDO POR HIPOTIROIDISMO FARMACOLÓGICO FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 118 Hasta este momento habíamos caracterizado una pequeña población SOX2 rodeando al epitelio tiroideo, cuyos marcadores TTF1+low/PAX8-neg/p63+/- eran compatibles con células madre, y que teníamos un modelo con el que podíamos rastrearlas, decidimos estudiar sus implicaciones funcionales. Para ello, y dada la dificultad de obtener ratones con el genotipo adecuado y por la regla de las 3R de la experimentación animal, decidimos realizar en paralelo el estudio del recambio normal de la glándula adulta con el estudio del reclutamiento tras un estímulo. Nos preguntamos entonces, si en una situación de requerimiento funcional de la glándula tiroides, esta población se activaba. El hipotiroidismo inducido en ratones hembra mediante PTU disminuye la cantidad de T4 libre en sangre alcanzando niveles de hipotiroidismo moderado. Basándonos en los protocolos descritos en la literatura decidimos utilizar el hipotiroidismo (HT) farmacológico inducido por propiltiouracilo (PTU), como modelo conocido de requerimiento funcional en la tiroides109,110,111. Nuestro objetivo era establecer un hipotiroidismo relativamente moderado compatible con un buen funcionamiento del eje hipotálamo-hipofiso-tiroideo. Y para ello, comenzamos estudiando qué pasaba con la población SOX2 en ratones normales tras hipotiroidismo inducido con PTU. Para estandarizar el protocolo tratamos ratones C57BL/6J hembra de 90 días de edad, durante días progresivos (Figura 11) y se les extrajo sangre para su posterior medición mediante un ELISA de T4 libre en suero (FT4; Figura 12). Nuestro kit considera la normalidad para población humana entre 0,8-2 ng/dL. En roedores no hay rango admitido, pero se asumen niveles equivalentes. Figura 11. Protocolo de hipotiroidismo inducido por PTU. Esquema temporal de los experimentos de hipotiroidismo (HT) inducido con PTU realizados en ratones normales C57BL/6J. Resultados 119 Se observa una disminución progresiva de esta hormona conforme pasan los días con el tratamiento, comparado con los controles (Figura 12). Aunque a día 3 la FT4 todavía está en valores inmediatamente por debajo de la normalidad, ya ha disminuido significativamente. A partir del día 6 de tratamiento los ratones entran en niveles de hipotiroidismo franco que se mantiene hasta los 12 días donde termina el experimento. Figura 12. La FT4 desciende progresivamente en ratones hembra tras el tratamiento con PTU. ELISA de T4 libre en ratones hembra C57BL/6 tras tratamiento con PTU (propiltiouracilo). Gracias a la acción inhibidora de este compuesto frente a la proteína TPO, la glándula es incapaz de unir el yoduro (I-) a la tiroglobulina y la síntesis de hormonas no se produce correctamente. En la gráfica se representa la media±el error estándar con un tamaño muestral (n=6). Se utiliza un test ANOVA de una vía seguido de una corrección de Dunnett; *p≤0,05, **p≤0,01 y ***p≤0,001. Aumento en la expresión del ARN de SOX2 en ratones hipotiroideos de 3, 6 y 12 días Cuando se comprobó que el PTU funcionaba correctamente disminuyendo la cantidad de FT4 en sangre y originando así ratones hembra C57BL/6 HT, se quiso observar la expresión de genes característicos del epitelio folicular, los de fenotipo tiroideo (Tshr, Nis (Slc5a8), Pds (Slc26a4), Tg, Tpo, Duox2) frente a la expresión de Sox2, que representaría a la población celular no folicular que estamos investigando (Figura 13). PTU inhibe la organificación de yoduro a yodo, y la yodación de la Tiroglobulina por inhibición del complejo Tpo/Duox2288. Además, inhibe a la enzima Desyodasa D1 impidiendo la conversión de T4 a T3 en los grandes órganos (hígado, riñón), pero también la degradación de T3 a T2, y la generación de rT3288. Como era de esperar, inmediatamente (3 días) tras el comienzo de la administración de PTU los genes del receptor de Tsh y de los transportadores de yoduro (Nis, Pds) se inducen, probablemente para intentar compensar la falta de hormona mediante una mayor respuesta funcional a la Tsh en el epitelio folicular (Figura 13A). Mientras que el Tshr sigue aumentado a medida que prosigue el tratamiento a 6 y 12 días, no así lo hacen los genes de transportadores, probablemente por un efecto Wolff-Chaikoff antes el exceso de Yoduro libre no organificado289. Por el contrario, no observamos ningún incremento significativo de expresión en Tg, Tpo o Duox2 excepto una pequeña inducción inicial (Figura 13B). Esto podría ser porque al haber FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 120 suficiente enzima, o incluso un acúmulo de Tg no yodada, aunque no sea funcional, no se pueda activar ningún mecanismo de inducción de estos genes. Figura 13. Incremento específico en la expresión de ARNm de Sox2 a largo plazo tras el hipotiroidismo inducido con PTU. Expresión en glándula tiroides de ratones hembra C57BL/6 hipotiroideos de 3, 6 y 12 días de cada ARN mensajero de genes de interés (barras azules o rojas) en relación al gen control housekeeping Tbp. A) Genes de membrana plasmática del polo basal como Tshr, Slc5a (Nis) y Slc26a4 (Pendrin), B) Genes de polo apical como Tg, Tpo y Duox2. C) el gen Sox2 (barras rojas). D) En la hipófisis midió la expresión del ARNm de Tshb Se observa que dicha expresión es significativa en individuos con hipotiroidismo de 12 días. En las gráficas se representan la media±el error estándar de Taqman qRT-PCR con un tamaño muestral (n) mostrado encima de cada barra. Para las comparaciones globales se utiliza un Kruskal-Wallis seguido de una corrección de Dunnett; para la comparación de dos grupos se utiliza Mann-Whitney; *p≤0,05, **p≤0,01. En relación con la cantidad de expresión de Sox2 en la tiroides, se puede observar que PTU induce un aumento tardío significativo y muy marcado a los 12 días de hipotiroidismo (Figura 13C). Resultados 121 Cuando observamos lo que pasa en la hipófisis, podemos ver que inicialmente, 3 días, no hay ningún incremento de expresión, pero a los 6 días se incrementa mucho la expresión del gen Tshb, que continúa posteriormente aumentado (Figura 13D). Justo después, a los 12 días es cuando aparece el incremento en Sox2 en la tiroides, sugiriendo que pueda estar relacionado. El hipotiroidismo de 12 días en ratones hembra C57BL/6 aumenta la expresión de la proteína SOX2 Para estudiar si los datos obtenidos de ARN coinciden con la expresión de SOX2 en proteína, se extrajo la proteína total de tejidos de tiroides de ratones hipotiroideos de 12 días junto con la proteína total de ratones controles. Todo ello se midió mediante la técnica Western-Blot (Figura 14A). Figura 14. Incremento de la proteína SOX2 en hipotiroidismo de 12 días. A) Western blot para la proteína SOX2 de extractos proteicos de tiroides tratados con vehículo (Control) o PTU (HT) durante 12 días. La membrana se rehibridó para ß-actina tomado como control de carga o housekeeping. B) Cuantificación relativa de la proteína SOX2 respecto de ß-actina. En la gráfica se representa la media±el error estándar con un tamaño muestral (n=6). Se utiliza un test de Mann-Whitney bilateral; *p≤0,05, **p≤0,01 y ***p≤0,001. Se produce un aumento significativo de la detección de la proteína SOX2 en ratones hembra C57BL/6J a los que se les ha inducido hipotiroidismo durante 12 días en comparación con los ratones control (Figura 14B). En conjunto los datos de ARNm (Figura 13C) y de proteína (Figura 14) nos están indicando que o bien se induce específicamente este gen Sox2 como resultado del hipotiroidismo, o bien lo que estamos observando es una expansión de la población celular SOX2 positiva que nos lleva a un aumento relativo respecto al epitelio folicular. A B FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 128 3 HEMITIROIDECTOMÍA PARCIAL La diferenciación de células GFP a epitelio folicular tras 12 días de rastreo e hipotiroidismo existía, pero no era una diferencia tan marcada comprada con los ratones control. Pensamos que podrían estar pasando dos cosas. O bien el recambio era muy lento para poder ser observado con tan sólo 12 días, o bien el propio tratamiento con PTU podría interferir con dicho recambio, al inhibir la enzima TPO en la tiroides (y la DIO1), pudiendo ser estas mismas enzimas claves, de alguna forma, para el proceso de diferenciación a tirocito maduro. Por otra parte, una tercera alternativa sería que se necesite una cantidad mayor de T3 localmente para que pueda haber diferenciación terminal a tirocito a partir de células madre. Figura 20. Modelo de hemitiroidectomía parcial (HemiTx) en ratón Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP. A) Esquema a lo largo del tiempo en el que se incluyen todas las etapas, desde la resección quirúrgica de media glándula tiroides derecha (HemiTx), el tratamiento con TAM y el tracing durante los siguientes 10 días. B) Foto de uno de los ratones donde muestra la vía quirúrgica de llegada al lóbulo derecho de la tiroides y se observa que la cirugía no afecta a los músculos del lado izquierdo, y distienden sin lesionar la mayoría de los músculos del lado derecho. En los ratones hemitoidectomizados (HemiTx) se extrajo con un corte y una pequeña pinza la mayor parte del lóbulo derecho de la tiroides. En los animales controles (Sham) solamente Resultados 129 Para intentar resolver la relevante cuestión de si nuestra población SOX2 de la tiroides participan en el recambio funcional de la glándula (Cell Turnover) decidimos completar nuestro estudio con otro modelo en el que se indujese recambio, pero sin comprometer la diferenciación ni las concentraciones locales de T3 activa. Decidimos entonces emplear un modelo de daño mecánico parcial para reemplazar al modelo químico de PTU y así evitar la interferencia de cualquier compuesto externo al proceso de regeneración y diferenciación de la glándula. Se sabe que la hepatectomía parcial290 o la pancreatectomía parcial291, activan el reservorio de células madre induciendo su reclutamiento y diferenciación. En la Figura 20A se detalla nuestro complejo diseño experimental, que incluye una nueva técnica quirúrgica no descrita previamente en la literatura. Lo primero que hicimos es diseñar un protocolo quirúrgico de tiroidectomía parcial en ratones, que mantuviese intactos los músculos de la deglución y accesorios de la vía respiratoria relacionados con la laringe. (Figura 20B). Una vez adquirida la destreza para realizar la hemitiroidectomía, se utilizaron ratones hembras adultas Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP a los que se les aplicó una hemitiroidectomía parcial del lóbulo derecho seguida de la administración de TAM intraperitoneal para la activación del modelo genético (Figura 20A). Los ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP tiroidectomizados y sham fueron sacrificados el día 15 después de la cirugía (Figura 19A). Como se administran 5 inyecciones de TAM en días consecutivos nada más finalizar la operación se implementa, por tanto, un tracing de 10 días (Figura 20A). Cuando se analizó mediante inmunofluorescencia para GFP el tracing en la hemi-tiroides izquierda de las ratonas con HemiTx derecha, se observaron grandes poblaciones de células GFP positivas, con una media superior al 30% de las células de cada tiroides (Figura 21). En los ratones Sham la cantidad de células GFP era prácticamente indetectable (Figura 21). Figura 21. Acumulación masiva de células GFP en la tiroides izquierda de ratones hembra Sox2-Cre- ERT2/LoxP-EGFP 10 días tras hemitiroidectomía (HemiTx) del lado derecho. Porcentaje de células GFP positivas en hembras de 90 días a las que se les realizó una hemitiroidectomía parcial del lóbulo derecho, comparadas con ratones a los que se les realizó el mismo proceso quirúrgico, pero sin extracción de tiroides (Sham). En la gráfica se representa la media±el error estándar con un tamaño muestral (n) representado encima de cada barra. Se utiliza un test de Mann-Whitney bilateral; **p≤0,01. El siguiente paso fue estudiar si esas células GFP expresaban SOX2 o si por el contrario expresaban marcadores de diferenciación. (Figura 22). Como podemos observar, el número de células SOX2 se mantuvo bajo, aunque las células SOX2+GFP aparecían en parejas, como si se hubieran dividido. Las células GFP+ negativas para SOX2 fueron abundantes. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 130 Figura 22. Colocalización de GFP y SOX2 en la tiroides de ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP 10 días tras hemitiroidectomía (HemiTx). Campos representativas del lóbulo tiroideo izquierdo de ratones hembra Sox2- Cre-ERT2/LoxP-EGFP hemitiroidectomizados. Resultados 131 Figura 22 (parte 2) Para demostrar que las células GFP positivas se habían diferenciado a tirocito maduro y eran funcionales, utilizamos marcajes para Tg y NIS en inmunofluorescencias dobles con GFP de la hemi-tiroides izquierda para estudiar la colocalización de dichos marcadores. En las Figuras 23 y 24 se observa que la mayoría de las células GFP positivas, tan abundantes, encontradas en las tiroides de ratones hembra Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP diez días después de la hemitiroidectomía son doble positivas para GFP y Tg (Figura 23) y para GFP y NIS (Figura 24) como se deduce de su intenso pseudocolor amarillo en la suma de canales. En ambas figuras se puede observar cómo la tinción de GFP es citoplasmática, la tinción de Tg tiene refuerzo de membrana en polo apical y tiñe también el coloide, y la tinción de NIS tiene refuerzo en polo basal donde se concentra esta proteína. Pues bien, en la fusión de colores se observa el color amarillo en el polo apical cuando la fusión es con Tg pero en cambio en el polo basal cuando la fusión es con NIS, y por fuera se ve una línea roja que corresponde a la membrana plasmática sólo con NIS y no con GFP como es lógico. Esto indica que todas esas células GFP se han diferenciado a epitelio folicular. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 132 Figura 23. Diferenciación de células GFP en epitelio folicular secretor de Tg por su polo apical en la tiroides de ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP 10 días tras hemitiroidectomía (HemiTx). Campos representativas del lóbulo tiroideo izquierdo de ratones hembra Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP hemi-tiroidectomizados de su lado derecho y controles (Sham), tras diez días de tracing. Se observa coexpresión de GFP (verde) con Tg (rojo) dando un color amarillo en la fusión de canales que se concentra en el polo apical del epitelio folicular, indicando que células Sox2 se han diferenciado y comienzan a producir y secretar dicha Tg. La Tg secretada se acumular en el coloide fuera de las células. Resultados 133 Figura 25 (parte 2) FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 134 Figura 24. Diferenciación de células GFP en epitelio folicular captador de yoduro a través de NIS por su polo basal en la tiroides de ratones Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP 10 días tras hemitiroidectomía (HemiTx). Campos representativas del lóbulo tiroideo izquierdo de ratones hembra Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP hemitiroidectomizados de su lado derecho y controles (Sham), tras diez días de tracing. Se observa coexpresión de GFP (verde) con NIS (rojo) dando un color amarillo en la fusión de canales que se concentra en el polo basal del epitelio folicular, indicando que células Sox2 se han diferenciado en células que captan yoduro de la sangre. Los folículos con epitelio amarillo, aun así, se ven rodeados de una delgada línea roja que corresponde al NIS localizado en la membrana plasmática del polo basal. Resultados 135 Figura 24 (parte 2) En conclusión, de estos experimentos, se demuestra que la tiroides de ratonas adultas es capaz de responder a daño mecánico estimulando una pequeña población de células SOX2 capaces de proliferar y, en última instancia, diferenciarse a células foliculares tiroideas que además son funcionales. Nuestro último razonamiento vino de la siguiente pregunta. Si tras la HemiTx se reclutan células SOX2 para luego diferenciarse, estas deberían activarse de alguna forma para empezar a proliferar antes de la diferenciación. Para comprobar que quisimos comprobar si el aumento en el porcentaje de células Sox2 positivas era consecuencia de su activación y proliferación. Para poder responder a esta FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 136 pregunta utilizamos ratones hembra C57BL/6 en los que 3 días tras la HemiTx se inyectaron dos pulsos de EdU, uno cada 12 horas, antes del sacrificio (Figura 25). Figura 25. Incremento de la proliferación de la población SOX2 inmediatamente tras la HemiTx. Campos representativas de ratones hembra 3 días después de la HemiTx (A) y Sham (B) con marcajes dobles para EdU (verde) y SOX2 (rojo) que dan un color amarillo en la combinación. Se aprecian células dobles positivas para Sox2 Resultados 137 y EdU en individuos HemiTx. No se encontraron estos marcajes dobles en individuos Sham. C) Epitelio del esófago, donde se produce un alto recambio celular, hay muchas células dobles positivas SOX2-EdU. Figura 25 (parte 2) FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 144 Figura 29. Tracing corto a dia P3 de neonatos inyectados con TAM a P1 demuestran que sólo parte de la población SOX2 expresa GFP. Campos representativas de tiroides de ratones hembra Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP a dia P3, dos días después de la inyección de TAM. A) Casi la totalidad de la glándula está exenta de expresión de GFP; sólo algunas células SOX2 positivas lo eran también para GFP. B) Como primer control negativo se muestra un ratón al que no se le administró TAM a P1, y por tanto es negativo para GFP. C) Como segundo control se muestra una sección de ratón Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP inyectado con TAM en el que se omitió anticuerpo primario de SOX2, y por tanto no muestra marcaje en el canal rojo. Se marcaron algunos folículos con líneas naranjas en la combinación con DIC, para indicar la situación de las células SOX2 y GFP, o las dobles. Resultados 145 Figura 29 (parte 2) FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 146 Todos los controles realizados salieron correctos, tanto el control del ratón no inyectado con TAM que no tiene GFP, como el control del ratón en el que se omitió el anticuerpo primario para SOX2, que no presenta marcaje SOX2 (Figura 29). Esto indica que el marcaje genético inicial a P1 del modelo Sox2-Cre-ERT2/LoxP-EGFP -TAM es exclusivo de las células SOX2 y que de ellas derivan todas las encontradas en el adulto.Para demostrar que las células SOX2 se activan y son las responsables del desarrollo de la tiroides, se sacrificaron también ratones a día P3 para ver que únicamente las células SOX2 en ese momento eran positivas para GFP, como se observa en la figura 29. 5 GENERACIÓN DE TIROSFERAS Las células madre adultas deben cumplir ciertas características para ser consideradas como tales. Por una parte, in vivo en el órgano deben presentar marcadores de células madre; mantenerse quiescentes, pero poder ser activadas ante un requerimiento funcional; ser capaces de diferenciación terminal al parénquima de ese tejido. Por otra parte, in vitro tras ser purificada la población, las células madre deben poder crecer en ausencia de suero, en forma de esferas con el medio más común que incluye los dos suplementos comerciales N2 y B27115,128. Esas esferas deben conservar los marcadores presentes en la población original, ser capaces de crecer en una dilución muy baja, ser capaces de autorrenovación y, por último, ser capaces de diferenciación in vitro. Nuestra población Sox2 de la tiroides cumplía bien las características de célula madre adulta in vivo. Procedimos entonces a explorar sus características in vitro. GENERACIÓN DE TIROSFERAS PRIMARIAS Desgraciadamente, carecíamos de un marcador de superficie que nos permitiese purificar nuestra población SOX2+ por sorter o por métodos magnéticos (se intentaron ambas cosas basándonos en varios marcajes funcionales como EGFP y tamaño, pero el porcentaje era tan bajo que no tuvimos éxito). Procedimos entonces a realizar los experimentos con una dispersión celular de toda la tiroides de ratones hembra de 30 días, asumiendo que la población de células madre SOX2+ sería la que formaría tiroesferas, y la que podría diferenciarse a epitelio folicular. Para ello se disgregaron a célula única tiroides de ratón hembra y se sembraron en placas con el medio de cultivo de crecimiento de esferas de células madre adultas, a una densidad baja de 1000-500 células por pocillo de plato mw6, lo que supone 500-250 células/mL respectivamente. Pasados tres días desde el sembrado, la mayoría de las células sembradas comenzaban a presentar eventos de muerte celular excepto alguna célula que era capaz de mantenerse viva y crecer a lo largo de los subsiguientes días, generando estructuras esféricas a las que hemos llamado “tirosferas” (Figura 30A). Dichas tirosferas seguían creciendo conforme pasaban los días. En los días 7 y 9 estas esferas habían duplicado e, incluso, triplicado su tamaño y número de células que las conformaban (Figura 30A). Nuestro número encontrado de esferas en cultivos repetidos fue alrededor de 5 esferas/pocillo, independientemente de sí sembrábamos 500 o 1000 células/mL (Figura 31A). Si calculamos que el porcentaje de células SOX2 en la tiroides adulta normal nos sale por debajo del 0,3%, más bien cercano al 0,25% en ratones hembra de 30 días (Figura 8, contaje de porcentaje de células SOX2 en ratones hembra de 30 días; Figura 15, contaje en el experimento de hipotiroidismo a ratones hembra controles tratados con vehículo) podríamos esperar un máximo de 7 esferas en 1000 células/mL y 4 esferas en 500 células/mL. Por lo tanto, la eficiencia de esferas obtenidas coincide en su mayor parte con lo esperado, por lo que sugiere que las tirosferas derivan de nuestra población SOX2+. El porcentaje de esferas Resultados 147 obtenidas sobre células totales sembradas fue más eficaz en la menor concentración (Figura 31B). Quizás el exceso de grumos de células muertas más numerosos en 1000 células/mL condicione el crecimiento de las tiroesferas. Figura 30. Crecimiento de Tiroesferas en cultivo in vitro a partir de una dispersión de células tiroideas de ratón hembra adulta (90 días). Microscopía de contraste de fases con un objetivo de 40X en el seguimiento de tirosferas vivas en diferentes estadíos. A) Crecimiento de las esferas a lo largo de los días. B) Tirosferas secundarias generadas mediante disgregación de las esferas primarias. C) Tirosferas terciarias generadas mediante disgregación de las esferas secundarias. D) Cultivos derivados de Tirosferas sembradas con suero y medio de diferenciación (TSH). Tienen aspecto de tirocitos en cultivo y forman estructuras foliculares 3D. FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 148 Figura 31. Obtención de Tiroesferas en cultivo in vitro a partir de una dispersión de células tiroideas de ratón hembra adulta (90 días). A) Tirosferas totales generadas por pocillo a partir del sembrado de 1000 ò 500 en cél/mL con 3 mL por pocillo. B) Formación de tirosferas expresado en porcentaje sobre células totales sembradas. GENERACIÓN DE TIROSFERAS SECUNDARIAS Y TERCIARIAS A continuación, se quiso comprobar si las células que conformaban estas esferas eran capaces de volver a generar más tirosferas a partir de una única célula. Para ello, se disgregaron mecánicamente hasta conseguir células individualizadas y se volvieron a sembrar en un medio similar al usado en la formación de las esferas primarias (Figura 30B). Se sembraron unas 10 células/pocillo mw6 (~3 células/mL) y se obtuvieron tras 9 días hasta 10 esferas por pocillo. Repitiendo exactamente el mismo procedimiento, se comprobó que estas células eran capaces de volver a generar estas estructuras esféricas con formación de esferas terciarias (Figura 30C). n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 Día 3 Día 5 Día 7 Día 9 0 2 4 6 8 Nº Tirosferas/pocillo Tirosferas totales 1000 cél. 500 cél n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 n=6 Día 3 Día 5 Día 7 Día 9 0.0 0.5 1.0 1.5 % tirosferas sobre cél. sembradas % Tirosferas 1000 cél. 500 cél. A B Resultados 149 INMUNOFLUORESCENCIA EN TIROSFERAS Nuestro siguiente paso fue comprobar si estas tirosferas, -que crecían en medio de cultivo de stem-cell sin suero, y con la forma esperada de stem-cell adultas (esferas flotantes) y el número esperado si creciesen a partir de nuestra población SOX2 de la tiroides-, expresaban los mismos marcadores que habíamos encontrado en el estudio de tejido, sobre todo el factor de transcripción SOX2. Para ello hicimos tinciones de estas tirosferas mediante inmunofluorescencias. Pudimos observar que las tirosferas expresan SOX2 (Figura 32A). Las esferas expresaban bajos niveles de TTF1, comparando con alguna célula folicular aislada que seguía viva alrededor (Figura 32B). Y las esferas eran absolutamente negativas para Tg (Figura 32C). Figura 32. Caracterización de las Tirosferas mediante expresión de marcadores. Estudio por microscopía confocal de la expresión de SOX2 (A), TTF1 (B) y TG (C) de tirosferas obtenidas 9 días en cultivo. DIFERENCIACIÓN TIROSFERAS Una siguiente condición que faltaba es demostrar que esas esferas de células SOX2+ pero negativas para marcadores de epitelio folicular, eran capaces de diferenciarse in vitro. Para inducir la diferenciación añadimos un medio con suero, que induce adherencia al plato a las pocas horas, y hormonas importantes para el mantenimiento del fenotipo folicular tiroideo entre las que se encuentra la TSH, hormona hipofisaria que mantiene el trofismo en la tiroides. Se pipeteó una esfera individualizada en plato multipocillo de plástico. Tras la adición del medio de diferenciación, las tirosferas comienzan a adherirse al plato. Las células se mantuvieron con ese medio durante 14 días. Tras este período los pocillos se fijaron y tiñeron para Tiroglobulina (Figura 33). FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 150 Figura 33. Diferenciación de Tiroesferas a epitelio folicular. Fotos representativas de inmunofluorescencia de tirosferas diferenciadas tras 14 días en medio con TSH y hormonas. Las células se fijaron y tiñeron para TG y TTF1. A) Se muestran diferentes campos de diferentes cultivos. Se observa cómo las tirosferas se han adherido a la placa de cultivo y comienzan a formar estructuras parecidas a folículos. Además, expresan marcadores de fenotipo diferenciado tiroideo como TTF1 y Tg. B) La omisión de anticuerpos primarios no dio señal (Cneg 1º). Resultados 151 Figura 33 (parte 2) FERNANDO JOSÉ OROZ GONJAR 152 Como se observa en la figura 33, las células obtenidas a partir de tirosferas SOX2/lowTTF1 negativas para Tiroglobulina se convierten en células de intenso marcaje nuclear para TTF1, capaces de expresar esta proteína clave de la función tiroidea tras su diferenciación. 6 EXPRESIÓN DE SOX2 EN TEJIDO Y CULTIVO CELULAR DE TIROIDES HUMANO EXPRESIÓN DE SOX2 TANTO EN CULTIVOS CELULARES DE TIROIDES NORMAL (T-NT) Y BOCIOS MULTINODULARES (T-MNG) COMO EN SUS PROPIOS TEJIDOS A NIVEL DE ARN MENSAJERO, PERO NO HAY DIFERENCIAS ENTRE ELLOS. Una vez caracterizadas y descritas estas poblaciones de células madre presentes en la glándula tiroides de ratones, quisimos observar si existe una población análoga en tejido de tiroides humano. Estudios ya publicados en nuestro laboratorio demuestran que, en la hipófisis, otra glándula endocrina, se conserva la localización, estructura anatómica y marcadores expresados de células madre entre roedores y humanos115,128,. Nosotros teníamos la ventaja de poseer la colección TIROCHUS que reúne tejidos y cultivos del mismo paciente procedentes de cirugía de tiroides de nuestro hospital. Comenzamos por analizar la expresión de SOX2 y genes de fenotipo tiroideo a nivel de ARN mensajero en una serie de tejidos humanos de tiroides normal (TH-NT) y bocio multinodular (Multinodular Goiter o MNG, TH-MNG). Las características de la serie en cuanto a sexo (M=mujer; H=hombre) y edad fueron tenidas en cuenta, pero corresponden a la distribución del número de pacientes que afrontan cirugía por enfermedad hiperplásica benigna de tiroides, en su mayoría mujeres80. Esta serie constaba de 15 TH-NT (11 M+ 4H) y de 18 THMNG (19M + 3H). La edad media entre ambos grupos fue de 48,5±4 años en TH-NT y 51,2±3,4 años en TH-MNG y no presentó diferencias significativas (p=0,615, distribución normal de las variables con el test D’Agostino & Pearson; t-test paramétrico). El ARNm de SOX2 se expresaba de forma detectable en tejido tiroideo normal y en bocio multinodular (Figura 33A derecha), pero no hay diferencias entre ambos grupos en cuanto a su expresión. Al mismo tiempo, estudiamos si existía positividad para SOX2 en cultivos primarios establecidos a partir de esos tejidos (T-NT y T-MNG). Es importante indicar que en nuestros cultivos la proporción de células de epitelio folicular es superior al 95%248.En este caso nuestra serie consistía en 15 cultivos T-NT y 22 T-MNG. Las edades de ambos grupos, aunque cercanas, sí que tuvieron diferencias significativas siendo 43,8±3,9 para T-NT y 53,4±2,4 para T-MNG (p=0,035; distribución normal de las variables con el test D’Agostino & Pearson; t-test paramétrico). Resultados 153 Figura 34. Detectable expresión del ARNm de SOX2 en muestras de glándula tiroides y cultivos de epitelio folicular tiroideo. La serie se compone de tejidos normales (TH-NT) y de bocio multinodular (TH-MNG), y cultivos derivados de tejidos normales (T-NT) y de bocio multinodular (T-MNG). A) Expresión relativa del ARNm de SOX2. B) Expresión relativa del ARNm de PAX8. C) Expresión relativa del ARNm de TTF. Se representa la media±el error estándar de Taqman qRT-PCR con un tamaño muestral (n) mostrado encima de cada barra. Se utiliza un test de Mann-Whitney. **p≤0,01. Se encontró expresión de SOX2 en los cultivos, marcadamente menor que en los tejidos. Pero no se encontraron diferencias en la expresión del ARNm de SOX2 entre ambos grupos de cultivos (Figura 33A centro). La expresión del ARNm de SOX2 no se correlacionó significativamente con la edad del paciente: r de Pearson=0.133, p=0.318 (n=15) para TH-NT, y r=-0.189, p=0.226 (n=18) para TH-MNG. Los datos de esta correlación sugieren que si Δ PAX8/TBP mRNA T-NT T-MNG TH-NT TH-MNG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Comercial normal thyroid tissue 6X n=15 n=22 n=15 n=18 0.0192 * 0.0784 PAX8 Δ SOX2/TBP mRNA T-NT T-MNG TH-NT TH-MNG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Comercial normal thyroid tissue 6X n=15 n=22 n=15 n=18 SOX2 Δ TTF1/TBP mRNA T-NT T-MNG TH-NT TH-MNG 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Comercial normal thyroid tissue 6X n=15 n=22 n=15 n=18 0.0044 ** TTF1 A A B A B C