Análisis de la microbiota periodontopatógena en el síndrome de Down

TESIS DE DOCTORADO ANÁLISIS DE LA MICROBIOTA PERIODONTOPATÓGENA EN EL SÍNDROME DE DOWN Lourdes Nóvoa Garrido ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN CIENCIAS ODONTOLÓXICAS SANTIAGO DE COMPOSTELA 2021 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS Dña. Lourdes Nóvoa Garrido Título de la tesis: Análisis de la microbiota periodontopatógena en el síndrome de Down Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 03 de diciembre de 2021. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D./Dña. Pedro Diz Dios En condición de: Director/a Título de la tesis: Análisis de la microbiota periodontopatógena en el síndrome de Down INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dña Lourdes Nóvoa Garrido , bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación , considerando que reúne los r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 03 de diciembre de 2021 Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR/TUTOR DE LA TESIS D./Dña. Juan Blanco Carrión En condición de: Tutor/a y director/a Título de la tesis: Análisis de la microbiota periodontopatógena en el síndrome de Down INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dña Lourdes Nóvoa Garrido , bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación , considerando que reúne los r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de esta no incurre en las causas de abstención establecidas e n la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 03 de diciembre de 2021 Firma electrónica DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERÉS Dña. Lourdes Nóvoa Garrido declara no tener ningún conficto de intereses en relación con la Tesis Doctoral titulada: Análisis de la microbiota periodontopatógena en el síndrome de Down. En Santiago de Compostela, a 3 de Diciembre de 2021 Fdo. Lourdes Nóvoa Garrido 16 No ha sido sino con ayuda, tiempo y paciencia de Eliane y María, y de Candela y Gemma (aunque breve), que se han obtenido los registros y muestras de este estudio. El personal del laboratorio de la Facultad de Odontología de la Universidad Complutense de Madrid ha realizado un impecable procesado de las muestras, gracias a Ana O’Connor y a todos los que han trabajado en el laboratorio en este proyecto. Gracias al personal de FISABIO, que ha procesado y analizado las muestras vinculadas al estudio del microbioma. Quisiera agradecer a Fátima su desinteresada colaboración en la gestión del envío de las muestras. Gracias a la Prof.ª Elena Figuero por aquellas primeras y magníficas clases, irrepetibles e inolvidables, porque desde entonces ya no me he podido desprender de la metodología. A los profesores desde los inicios de la licenciatura hasta el final de mi máster, con especial cariño al Prof. Mouriño y al Prof. Selbmann; compañeros, entre ellos Olalla, Cristina, Leticia, Alex, Patricia, Estefanía, Yago y Pablo, con los que he compartido años de máster. A los que han sido y son alumnos, y demás servidores de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Santiago de Compostela; concretamente a una parte del Departamento de Cirugía y Especialidades Médico-Quirúrgicas, gracias. Agradezco a mi familia por ser un soporte y guía para mí, particularmente a mis padres. A mi madre, por la determinación que pongo en cada proyecto; a mi padre, porque de ti es el cariño que aplico a todo lo que hago. Gracias a los que han estado, a los que están y a los que estarán. 17 Me gustaría agradecer el apoyo que me han brindado, directa o indirectamente en esta larga trayectoria, aquellas personas que han dejado huella en mí. Entre ellas están Marisa, Espi, Ilda, Lola, Don Antonio, Don Pepe, Evelia, Toniño, Minda, Isabel, Xabier y Mª Fe; el Prof. Area, Pedro, Secundino y el Prof. Boullón. El Dr. Villalón, la Dra. Abeleira, la Dra. Mira, el Dr. Durán y el Dr. Sanromán; a Betti y Marisol, Gabriel, Erwin; y por supuesto, todas las auxiliares e higienistas. Ana y Viktor; Carmen, Bea y todos los amigos de las tardes de tertulia. Me gustaría agradecer a mis amigos de la internet por su guía, sus cuadernos, sus 1001 noches, su BD, su organización secreta y sus nuevas direcciones. El trabajo de tesis es un trabajo de campo, pero sobre todo de escritorio, quisiera agradecer a mi ordenador que ha pasado tantas horas conmigo escribiendo y puliendo el manuscrito de la tesis, y a mi almacen de cookies que ha alimentado mi motivación en las últimas semanas. Quisiera hacer una mención especial a Dolores, Sally y a Carmen, nuevamente, porque vuestras palabras han brillado y abierto muchos caminos para mí; no sé si algún día pueda alcanzaros, pero lo intentaré. Gracias a J.L., porque tu discurso ha inspirado este; a S.G., a J.N. y a M.M., porque vuestras vidas han sido toda una inspiración. Gracias a aquellas y aquellos que a pesar de las adversidades han sabido abrir y abrirse camino, además de haber cambiado la sociedad, aunque fuese un poquito; a pesar de que muchas y muchos no hayan sido testigos de ello e incluso hayan sufrido las consecuencias por ser unos adelantados a su tiempo. Por demostrarme que es posible 18 mantener la entereza a pesar de las circunstancias y crecer, sin importar la situación en la que te encuentres, aprovechándola para ser mejor y seguir tus propósitos como si intentases defying gravity, en pocas palabras: «Courage is one thing that no one can ever take away from you». The Wishing Spell, CHRIS COLFER Me gustaría seguir con un agradecimiento especial a Victoria y a Nona. A Victoria, por su incansable aliento a pesar de las muchas demoras, este es solo el inicio de muchos otros; a Nona, porque has sabido encontrarme, estar y mantenerte a mi lado como un apoyo inestimable, así espero que sea por mucho tiempo y en los proyectos que se están y estarán desarrollando. Para terminar, me gustaría recordar ese proceso maravilloso que se llama investigación, a todos los niveles y en todas las disciplinas, y cuanto puede mejorar nuestra sociedad, empezando por nosotros mismos; en palabras de Katalin Karikó: «The best of scientific discoveries is never straight line, it has twists and turns, and every junction requires international collaboration, colaborative effort, contribution from many, many scientists. But it is important keep asking questions and to stay curious. Leonardo Da Vinci claimed: “Experiments never err or expend, expectations do”. We are not deterred by failure but instead used to push us to think critically». 19 RESUMEN El síndrome de Down (SD) es una condición genética que afecta al cromosoma 21 y cursa con un fenotipo patognomónico, múltiples alteraciones sistémicas y unas manifestaciones orales características, entre las que se incluye la periodontitis. La determinación del patrón microbiológico periodontal en estos individuos ha sido objeto de escasas investigaciones hasta la fecha, y puede ser determinante para diseñar la estrategia terapéutica más adecuada. El objetivo de esta tesis fue determinar mediante secuenciación masiva (NGS) el microbioma oral de personas con SD, comparando los hallazgos con los obtenidos mediante técnicas microbiológicas convencionales como el cultivo y la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Con este motivo se diseñó un estudio observacional, analítico y transversal, en el que se incluyeron incialmente 124 individuos representativos de la población gallega con SD. Se registraron datos referentes a la historia médica y odontológica, además de realizar un examen del estado periodontal evaluando los indicadores clínicos más representativos: índice de placa, profundidad de sondaje, sangrado al sondaje y recesión radicular de los dientes de Ramjford. En base a estos hallazgos, los participantes se clasificaron en 3 grupos: 62 eran periodontalmente sanos (SD-S), 34 tenían gingivitis (SD-G) y 28 20 periodontitis (SD-P). Además, para realizar los análisis microbiológicos se obtuvo una muestra subgingival de aquellas localizaciones con parámetros clínicos más severos. Los participantes con SD-P eran mayores (p< 0,01) y tenían menor prevalencia de hipotiroidismo (p= 0,01), presentaban bolsas periodontales significativamente más profundas y mayor pérdida de inserción (p≤ 0,01). Los SD-G y los SD-P tenían niveles más altos de sangrado y placa dental que los SD-S. Para el análisis mediante NGS se obtuvieron muestras de ADN bacteriano de 50 individuos con SD y fenotipos periodontales extremos, 25 SD-P y 25 SD-S. Las muestras se analizaron secuenciando la región hipervariable V3-V4 del gen ARNr 16S utilizando el sistema MiSeq. Las afiliaciones taxonómicas se asignaron utilizando el clasificador bayesiano ingenuo integrado en los complementos QIIME2. La diferencia en la concentración de bacterias entre ambos grupos de participantes se evaluó mediante las pruebas de Wilcoxon y Kruskal-Wallis; la diversidad alfa de las especies identificadas se analizó utilizando los índices Observed, Chao1metric, ACE y Shannon, y la diversidad beta mediante análisis de coordenadas principales. Se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre SD-P y SD-S en relación a 21 géneros y 39 especies bacterianas. Los géneros Porphyromonas, Treponema, Tannerella y Aggregatibacter fueron más abundantes en el grupo SD-P que en el SD-S, al igual que otros géneros menos conocidos como Filifactor, Fretibacterium y Desulfobulbus. Entre las especies principales, Porphyromonas spp. y Tannerella spp. fueron las más abundantes en el grupo SD-P, mientras que Pseudomonas spp., Granulicatella spp. y Gemella spp. lo fueron en el SD-S. Mediante cultivo y qPCR se demostró que los recuentos totales de anaerobios, de T. forsythia y de E. corrodens eran 21 significativamente más altos en los pacientes SD-P que en los grupos restantes. En conclusión, el análisis microbiológico mediante secuenciación masiva permite afirmar que el microbioma subgingival de las personas con SD-P es más complejo y difiere sustancialmente del de las SD-S. PALABRAS CLAVE: periodontitis, Síndrome de Down, microbioma, cultivo, PCR, NGS 23 RESUMO A síndrome de Down (SD) é unha afección xenética que afecta ó cromosoma 21 e que presenta un fenotipo patognomónico, múltiples alteracións sistémicas e manifestacións orais características, entre elas a periodontite. A determinación do patrón microbiolóxico periodontal nestes individuos foi obxecto de escasa investigación ata a data, podendo ser determinante para deseñar a estratexia terapéutica máis adecuada. O obxectivo desta tese foi determinar mediante secuenciación masiva (NGS) o microbioma oral das persoas con SD, comparando os achados cos obtidos mediante técnicas microbiolóxicas convencionais como o cultivo e a reacción en cadea da polimerase cuantitativa (qPCR). Por esta razón deseñouse un estudo observacional, analítico e transversal, no que se incluíron inicialmente 124 individuos representativos da poboación galega con SD. Rexistráronse os datos referidos á historia clínica e odontolóxica, así coma a realización dun exame do estado periodontal avaliando os indicadores clínicos máis representativos: índice de placa, profundidade de sondaxe, sangrado á sondaxe e recesión radicular dos dentes de Ramjford. En base a estes achados, os participantes clasificáronse en 3 grupos: 62 estaban periodontalmente sans (SD-S), 34 tiñan xenxivite (SD-G) e 28 tiñan periodontite (SD-P). Ademais, para realizar as análises 24 microbiolóxicas, obtívose unha mostra subxingival daquelas localizacións con parámetros clínicos máis severos. Os participantes con SD-P eran maiores (p <0,01) e tiñan unha menor prevalencia de hipotiroidismo (p = 0,01), tiñan bolsas periodontais significativamente máis profundas e unha maior perda de inserción (p≤ 0,01). Os SD-G e os SD-P tiñan niveis máis altos de placa dental e sangrado que SD-S. Para a análise mediante NGS, obtivéronse mostras de ADN bacteriano de 50 individuos con DS e fenotipos periodontais extremos, 25 SD-P e 25 SD-S. As mostras analizáronse mediante a secuenciación da rexión hipervariable V3-V4 do xene de ARNr 16S mediante o sistema MiSeq. As afiliacións taxonómicas asignáronse mediante o clasificador bayesiano inxenuo integrado nos complementos QIIME2. A diferenza na concentración de bacterias entre ámbolos grupos de participantes avaliouse mediante as probas de Wilcoxon e Kruskal-Wallis; analizouse a diversidade alfa das especies identificadas mediante os índices Observed, Chao1metric, ACE e Shannon, e a diversidade beta mediante análise de coordenadas principais. Detectáronse diferenzas estatisticamente significativas entre SD-P e SD-S en relación con 21 xéneros e 39 especies bacterianas. Os xéneros Porphyromonas, Treponema, Tannerella e Aggregatibacter foron máis abundantes no grupo SD-P que no SD-S, ó igual que outros xéneros menos coñecidos como Filifactor, Fretibacterium e Desulfobulbus. Entre as principais especies, Porphyromonas spp. e Tannerella spp. foron as máis abundantes no grupo SD-P, mentres que Pseudomonas spp., Granulicatella spp. e Gemella spp. fórono para SD-S. O cultivo e a qPCR mostraron que os recontos totais de anaerobios, T. forsythia e E. corrodens foron significativamente máis elevados nos pacientes con SD-P que nos restantes grupos. 25 En conclusión, a análise microbiolóxica mediante secuenciación masiva permítenos afirmar que o microbioma subxingival das persoas con DS-P é máis complexo e difire substancialmente dos SD-S. PALABRAS CLAVE: periodontite, síndrome de Down, microbioma, cultivo, PCR, NGS LOURDES NÓVOA GARRIDO 32 2 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ........................................... 121 2.1. Objetivos secundarios ......... ¡Error! Marcador no definido. 2.1. Objetivo principal ................ ¡Error! Marcador no definido. 3 MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................... 125 3.1. Diseño del estudio .............................................................. 125 3.2. Criterios de selección ......................................................... 127 3.3. Registros demográficos y clínicos .................................... 127 3.4. Recolección de muestras y análisis microbiológico ..... 130 3.4.1. Recolección de muestras de biopelícula subgingival .................................................................. 130 3.4.2. Procesamiento microbiológico mediante cultivo .. 130 3.4.3. Procesamiento microbiológico mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa ................. 132 3.4.4. Procesamiento microbiológico mediante secuenciación de última generación ........................ 133 3.5. Análisis estadístico ............................................................. 135 4 RESULTADOS ............................................................................ 141 4.1. Características demográficas y clínicas del grupo de estudio ................................................................................... 141 4.2. Características demográficas y clínicas del grupo en el que se aplicó secuenciación de última generación ... 146 4.3. Análisis de la microbiota subgingival aplicando técnicas convencionales ..................................................... 148 4.4. Análisis de la microbiota subgingival aplicando secuenciación de última generación ................................ 152 Índice 33 5 DISCUSIÓN ............................................................................... 165 5.1. Limitaciones del estudio ................................................... 165 5.2. Características de la muestra y variables clínicas ......... 167 5.3. Análisis microbiológico .................................................... 173 6 CONCLUSIONES ...................................................................... 181 7 REFERENCIAS ......................................................................... 185 ANEXO I Comité de ética ....................................................... 251 ANEXO II Hojas de registro de datos ................................... 255 ANEXO III Registro de muestras microbiologías para cultivo ...................................................................... 259 ANEXO IV Artículo derivado .................................................. 263 35 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Representación de los complejos microbianos. .................... 54 Figura 2. Mecanismos de patogénesis de la periodontitis ...................... 98 Figura 3. Fases del estudio. .................................................................... 125 Figura 4. Reclutamiento global de los participantes del estudio. .... 141 Figura 5. Participantes en el análisis de secuenciación de última generación. .............................................................................. 146 Figura 6. Diversidad bacteriana encontrada en individuos con síndrome de Down periodontalmente sanos (6A) y con periodontitis (6B). ............................................................ 154 Figura 7. Curvas de rarefacción a nivel de filo, género y especie. ... 155 Figura 8. Análisis de diversidad bacteriana a nivel de filo, género y especie en personas con síndrome de Down con periodontitis (“Caso”) y periodontalmente sanos (“Control”). .............................................................................. 160 Figura 9. Análisis de coordenadas principales (PcoA) para evaluar la diversidad compartida entre la microbiota subgingival de individuos con síndrome de Down periodontalmente sanos y con periodontitis (diversidad beta). .................................................................... 161 37 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Características demográficas y médicas del grupo de estudio. .................................................................................... 142 Tabla 2. Características demográficas del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. ............................................................ 144 Tabla 3. Características clínicas del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. ............................................................ 145 Tabla 4. Características demográficas y médicas del subgrupo de estudio que participó en el análisis de secuenciación de última generación. .................................. 147 Tabla 5. Parámetros clínicos periodontales del subgrupo de estudio que participó en el análisis de secuenciación de última generación. ........................................................... 147 Tabla 6. Análisis mediante cultivo de la microbiota subgingival del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. ............................................................................ 149 Tabla 7. Análisis mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) de la microbiota subgingival del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. .......... 151 LOURDES NÓVOA GARRIDO 38 Tabla 8. Unidades taxonómicas operativas dominantes y sus proporciones (%) en todos los niveles taxonómicos, en muestras subgingivales de individuos con síndrome de Down periodontalmente sanos (SD-S) y con periodontitis (SD-P). ...................................................... 156 Tabla 9. Diferencias a nivel de filo, género y especie de la abundancia relativa microbiana (%) en muestras subgingivales de individuos con síndrome de Down periodontalmente sanos (SD-S) y con periodontitis (SD-P). ..................................................................................... 158 39 ABREVIATURAS ACE Estimador de Cobertura basado en la Abundancia (por sus siglas en inglés) ADN Ácido desoxirribonucleico ANOVA Análisis de la varianza (por sus siglas en inglés) APC Células presentadoras de antígeno (por sus siglas en inglés) ARN Ácido ribonucleico ARNr Ácido ribonucleico ribosómico CCI Coeficiente de correlación intraclase CDT Toxina de distensión citoletal (por sus siglas en inglés) CE Comité de Ética DADA Algoritmo de eliminación de ruido de amplicón divisivo (por sus siglas en inglés) DE Desviación estándar et al. Et alii (locución latina que significa «y otros») FDI Federación Dental Internacional FISABIO Fundación para la Promoción de la Salud y la Investigación Biomédica HMP Proyecto Microbioma Humano (por sus siglas en inglés) LOURDES NÓVOA GARRIDO 40 HOMINGS Identificación de microorganismos orales humanos utilizando secuenciación de nueva generación (por sus siglas en inglés) IFN Interferón IL Interleuquina o interleucina IP Índice de placa LPS Lipopolisacárido Ltx Leukotoxina MMPs Metaloproteinasas de la matriz (por sus siglas en inglés) MNPs Fagocitos mononucleares (por sus siglas en inglés) NGS Secuenciación de nueva generación (por sus siglas en inglés) NK Células asesinas naturales (por sus siglas en inglés) WHO Organización Mundial de la Salud (por sus siglas en inglés) OTU Unidades taxonómicas operativas (por sus siglas en inglés) PCoA Análisis de Coordenadas Principales (por sus siglas en inglés) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (por sus siglas en inglés) PGE Prostaglandina (por sus siglas en inglés) PIC Pérdida de inserción clínica PMN Leucocitos polimorfonucleares PPAD Enzima peptidilarginina deiminasa PS Profundidad de sondaje Abreviaturas 41 QIIME Quantitative Insights Into Microbial Ecology qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (por sus siglas en inglés) RANKL Ligando de receptor activador para el factor nuclear κ B (por sus siglas en inglés) REC Recesión RIC Rango intercuartílico RTF Fluido de transporte reducido (por sus siglas en inglés) S Supuración SD Síndrome de Down SD-G Síndrome de Down con gingivitis SD-P Síndrome de Down con periodontitis SD-S Síndrome de Down periodontalmente sano sp. Especie (en plural, spp.) SS Sangrado al sondaje STROBRE Strengthening the Reporting of Observational studies in Epidemiology TGF Factor de crecimiento transformante (por sus siglas en inglés) Th Linfocitos T helper TNF Factor de necrosis tumoral (por sus siglas en inglés) Treg Linfocitos T reguladores UFC/ml Unidades Formadoras de Colonias por mililitro LOURDES NÓVOA GARRIDO 48 1.1.2 Etiología El desarrollo de la periodontitis es el resultado de la agregación de diferentes factores, siendo una enfermedad de carácter multifactorial (Papapanou et al., 2018). La presencia de microorganismos ha sido determinante para proporcionar las primeras teorías sobre la causa de la periodontitis, llegando a establecerse una serie de complejos en función de la presencia de determinadas bacterias en diferentes estadios clínicos de severidad periodontal en el huésped (Socransky et al., 1998). Sin embargo, se ha observado que no es exclusivamente la existencia de estas bacterias la que puede conducir al desarrollo de la enfermedad, sino la disrupción de la homeostasis de la microbiota en el ecosistema bucal (Hajishengallis & Lamont, 2012) y la respuesta del huésped (Lamont et al., 2018). Aunque la microbiota demuestra ser la causa necesaria para la presencia de periodontitis, otros factores pueden desencadenar su empeoramiento. Ciertos condicionantes que ejercen una función como modificadores en el avance de esta enfermedad bucal pueden ser controlados (hábito tabáquico, diabetes); no así aquellos inherentes al propio huésped o derivados de condiciones sistémicas adquiridas (estado inmune, medicación) (Lang & Bartold, 2018). 1.1.2.1 Determinantes microbiológicos Las bacterias son organismos procariotas unicelulares cuya primera evidencia fue registrada por Leeuwenhoek en las más de 200 cartas enviadas a la Royal Society en Londres; entre las muestras observadas pudo describir bacterias procedentes de la placa dental (Drews, 2000). Introducción 49 La placa dental es un agregado de microorganismos que conforman una estructura tridimensional organizada, una matriz que se desarrolla durante un periodo de 24 horas, conforme avanza el tiempo también va aumentando su complejidad, el número y el tipo de bacterias que la conforman. La deposición de esta a nivel bucal tiene lugar en diferentes localizaciones: sobre superficies duras como los dientes o rehabilitaciones protéticas, entre las células que conforman la lengua o a nivel subgingival entre la encía y el diente, entre otras. La observación de cambios de carácter inflamatorio en la encía debido al acúmulo de placa a nivel del surco gingival, orientó a los científicos de finales del siglo XIX a buscar teorías para explicar este fenómeno. Las primeras teorías hablaban de una inespecificidad en la placa dental, en la que el aspecto cuantitativo sería determinante en el desarrollo de las infecciones bucales (Black, 1884; Miller, 1890). Esta primera teoría se denominó “Teoría inespecífica de la placa” (Loesche, 1976). Sin embargo, esta teoría no explicaba aquellos casos en los que la remoción de la placa no aportaba una resolución de la patología clínica; por ello, se volvió a plantear una nueva teoría en la que cobró importancia la presencia de uno varios agentes patógenos determinados dentro de esa placa subgingival, estableciéndose la “Teoría específica de la placa” (Lindhe et al., 1973; Loesche, 1979). Al igual que en otros campos médicos en los que una bacteria era responsable de una patología, se pensó que podría ocurrir lo mismo con la periodontitis. En 1882, Robert Koch presentaba los hallazgos de sus investigaciones sobre la tuberculosis. Para llegar a ello aplicó LOURDES NÓVOA GARRIDO 50 una serie de postulados derivados de los trabajos de Loeffer, Klebs y Henle para establecer la causalidad en esa enfermedad bacteriana (Blevins & Bronze, 2010), que fueron los siguientes: 1) el agente debe ser aislado de cada caso de la enfermad; 2) no debe recuperarse de casos de otras formas de enfermedad o no patogénicos y 3) tras su aislamiento y crecimiento repetido en cultivo puro, el patógeno debe inducir la enfermedad en animales de experimentación (Haffajee & Socransky, 1994). Tomando como referencia estos postulados para la identificación de patógenos, Haffajee y Socransky (1994) realizaron una adaptación enfocada a la patología periodontal en base a la particularidad del ecosistema bucal y al observar que la aplicación de los postulados mencionados no respondía como se había predicho. Por tanto, para el estudio de los patógenos periodontales, concluyeron que se deben incluir criterios de asociación, eliminación, respuesta del huésped, factores de virulencia, estudios en animales y evaluación de riesgos; enunciando los siguientes criterios para la determinación de una especie como factor causante de periodontitis: 1) asociación, la especie debería encontrarse con mayor frecuencia y en mayor número en casos con infección que en individuos sin enfermedad periodontal, pero no se espera encontrar el patógeno en todos los casos debido a la falta de diferenciación de estos; 2) eliminación, la eliminación de una especie debería acompañarse de la remisión de la enfermedad periodontal; 3) respuesta del huésped, la producción de anticuerpos o una respuesta celular inmune ante una especie; 4) factores de virulencia, la producción de metabolitos potencialmente dañinos o determinadas propiedades de una especie podrían ser determinantes en el establecimiento de la periodontitis; 5) estudios en modelo animal, que demuestren una evidencia que sugiera que una especie microbiana podría tener una función importante en el desarrollo de la enfermedad Introducción 51 periodontal y 6) evaluación de riesgos, mediante estudios prospectivos basados en los hallazgos de los estudios anteriores potenciados por el desarrollo tecnológico, determinando el riesgo de progresión de la enfermedad. Ante la hipótesis de la periodontitis como enfermedad causada por una placa específica, se comenzaron a aplicar tratamientos basados en la administración de antibióticos (Loesche et al., 1977); sin embargo, a pesar de observarse una disminución de la microbiota, no se conseguían eliminar por completo los microorganismos sino que volvía a formarse la placa y se creaban resistencias (Kornman & Karl, 1982). Esta situación clínica sin resolución, propició una revisión de la anterior teoría inespecífica de la placa, para puntualizar que la presencia de determinados factores de virulencia de ciertos patógenos podría facilitar el desarrollo y la progresión de la periodontitis, debido a una ecología de placa desfavorable al hospedador y que favorecería el crecimiento de algunas bacterias de la microbiota indígena con capacidad patogénica (Theilade et al., 1986). El “Proyecto Microbioma Humano” (HMP) del Instituto Nacional de Salud (NIH) en Estados Unidos, se inició con la finalidad de caracterizar el microbioma presente en prácticamente todo el cuerpo humano (Proal et al., 2017), y determinar su importancia en la salud y en la enfermedad. Se han establecido hasta la fecha 48 hábitats microbianos en el organismo humano, representando la cavidad oral parte del 20% de los hábitats localizados en la región de la cabeza y el cuello (NIH, HMP Data Portal). La cavidad bucal es un ambiente dinámico, donde las fuerzas mecánicas, masticación, y los cambios químicos, pH, son habituales; además de poder estar presentes otros factores LOURDES NÓVOA GARRIDO 52 atribuidos al paciente, como el hábito tabáquico, y la presencia de nutrientes puede o no estar garantizada. Todas estas características contribuyen a generar un entorno exigente en el que la supervivencia microbiana no está asegurada (Kreth & Merritt, 2009), y permiten que la diversidad de microorganismos colonizadores se vea incrementada conformando el microbioma oral (Avila et al., 2009); una comunidad de especies que comprende no solo bacterias, sino hongos, virus entre otros (Berger et al., 2018; Morse et al., 2018; Deo & Deshmukh, 2019; Bandara et al., 2019; Radaic & Kapila, 2021), aunque habitualmente se conoce como microbioma bacteriano o bacterioma (Radaic & Kapila, 2021), debido a que son las bacterias las que conforman su mayor parte (Bandara et al., 2019). Se han identificado cerca de 700 especies bacterianas en la cavidad bucal (Kulik et al., 2001; Aas et al., 2005; Kreth & Merritt, 2009), lo que la convierte en la segunda comunidad bacteriana más grande en el cuerpo humano, después del intestino (Deo & Deshmukh, 2019). Debido a que es un entorno dinámico, las bacterias han evolucionado aprovechando estrategias de supervivencia específicas, como la co-agregación interespecie, dando lugar a los denominados biofilms o biopelículas (Berger et al., 2018). Las biopelículas se definen como “agregados de microorganismos en los que las células suelen estar embebidas en una matriz, de producción propia, de sustancias poliméricas extracelulares que se adhieren entre sí y/o a una superficie” (IUPAC Recommendations 2012). En 1931, con el desarrollo del primer prototipo de microscopio electrónio por Ernst Ruska y Max Knoll, se abría una gran posibilidad para determinar la estructura de los microorganismos. Así, mediante el uso de este dispositivo se desarrollaron estudios para determinar la Introducción 53 estructura de la placa dental (Theilade et al., 1976) y el estado de salud/enfermedad periodontal (Listgarten, 1976). Determinadas proteínas derivadas de la saliva permiten la adherencia inicial de los primeros colonizadores bacterianos, como bacterias del género Streptococcus y Actinomyces, que tras su adsorción directa sobre las superficies del huésped, como el diente, dan comienzo a la formación de una biopelícula (Takahashi & Nyvad, 2011; Nikitkova et al., 2013). La biopelícula oral proporciona a las bacterias que la conforman protección ante la inmunidad del hospedador, una mayor resistencia a los agentes antimicrobianos, pero también la diversidad bacteriana condiciona la progresión y la supervivencia de las especies sobre todo por los productos liberados por estas y la competencia por los nutrientes (Davies, 2003; Welin-Neilands & Svensater, 2007; Marsh & Devine, 2011). La composición y estructura de los microorganismos que conforman la placa subgingival fueron objeto de estudio por Socransky et al. (1998), establecieron una serie de complejos de acuerdo al desarrollo de la microbiota desde las primeras etapas hasta el desarrollo de periodontitis. Estos complejos confirmaron que los microorganismos que conforman la microbiota subgingival están estrechamente relacionados y, dependiendo de las condiciones en las que se hallen, tienden a agruparse. Se describieron 5 complejos, etiquetando una serie de microorganismos independientes, debido a su escasa relación entre ellos y con los demás complejos: Veillonella párvula, Actinomyces odontolyticus, Aggregatibacter actinomycetemcomitans serotipo b, Selenomonas noxia y Actinomyces oris, este último con nueva denominación (Henssge et al., 2009). Dentro de los 5 LOURDES NÓVOA GARRIDO 54 complejos se hace una diferenciación entre los colonizadores primarios y los secundarios, atribuyendo los primeros a los complejos verde, amarillo y violeta. En cuanto a los secundarios, el grupo amarillo abarca la parte de la microbiota que necesita de las primeras bacterias para poder establecerse, generando relaciones con los primeros. El último complejo, el denominado rojo, comprende a aquellos microorganismos con una mayor capacidad periodontopatógena y una estrecha relación entre ellos, asignado a: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia y Treponema denticola (Socransky et al., 1998; Socransky & Haffajee, 2005) (Figura 1). Figura 1. Representación de los complejos microbianos (adaptado de Socransky & Haffajee, 2005). Especies Actinomyces V. parvula A. odontolyticus P. gingivalis T. forsythia T. denticola E. Corrodens C. Gingivalis C. Sputigena C. Ochracea C. Concisus A. actino. a P. intermedia P. nigrescens P. micros F. nuc. Vicentii F. nuc. Nucleatum F. nuc. Polymorphum F. periodonticum S. mitis S. oralis S. sanguis Streptococcus sp. S. gordonii S. intermedia A. actino. b S. noxia C. showae S. constellatus E. nodatum C. rectus C. gracilis Introducción 55 Los cambios en las condiciones del entorno microbiológico, como el pH, contribuyen a condicionar la composición microbiológica. Estos cambios se generan por el crecimiento de determinadas bacterias y vienen acompañados de otros microorganismos, que generarán a su vez un ecosistema nuevo dentro de la biopelícula dental. Deben considerarse, entonces, las propiedades de la placa dental inherentes a la estructura de la biopelícula que conforman y a la composición microbiana, además de la relación dinámica que se establece entre el microambiente y la microbiota, para avanzar en el estudio de su comportamiento. De todo ello se sirvió Marsh para enunciar la llamada “teoría ecológica de la placa” (Marsh, 2003), en la que los factores del entorno microbiológico favorecen la selección y el crecimiento de patógenos específicos. Desde la perspectiva de la influencia ecológica en el comportamiento de la placa, aparece un nuevo postulado dejando entrever que la periodontitis podría ser consecuencia de una “alteración de la homeostasis” del tejido periodontal. La enfermedad periodontal sería el estado resultante de ese desequilibrio que desencadenaría una reacción inflamatoria. A pesar del carácter polimicrobiano de la periodontitis, las bacterias pertenecientes al complejo rojo serían patógenos clave para desencadenar la enfermedad, mientras que las bacterias comensales probablemente inducirían una respuesta de protectora (Darveau, 2010). Abundando en la idea anterior y aplicando por analogía el concepto de “especie clave” en macroecología, Hajishengallis et al., (2011) desarrolla el concepto de “patógeno clave”, definiéndolo como una especie primordial que apoya y conforma una comunidad microbiana que promueve la patogénesis de la enfermedad. Estas especies se encuentran en baja proporción y es suficiente para inducir una alteración de la homeostasis, LOURDES NÓVOA GARRIDO 56 empleando variaciones cuantitativas y cualitativas de composición de la microbiota comensal, un desequilibrio que puede conllevar a una pérdida ósea periodontal mediada por la nueva situación inflamatoria desarrollada (Hajishengallis et al., 2011). La teoría más recientemente aceptada tiene en cuenta las dos últimas aportaciones a la etiología periodontal, previamente mencionadas, que se integran para establecer el modelo de “sinergia polimicrobiana y disbiosis” (Hajishengallis & Lamont, 2012). Esta teoría manifiesta que la acción cooperativa de la microbiota favorecería un aumento en la capacidad de colonización, desarrollo o exacerbación de los síntomas de periodontitis cuando una bacteria se encuentra en presencia de otras, siempre teniendo en cuenta que se haya producido una alteración de la homeostasis como consecuencia de un desequilibrio en la composición de la microbiota comensal (Hajishengallis & Lamont, 2012). Además, en el desarrollo de la enfermedad, adquieren relevancia determinados patógenos periodontales: la figura del patógeno clave, como P. gingivalis, que influye en la intensidad de la respuesta del huésped, y de “patógenos accesorios”, como Streptococcus gordonii, microorganismos que en presencia de diferentes especies bacterianas pueden llegar a ejercer su potencial patogénico (Whitmore & Lamont, 2011). Sería, en este caso, la interacción entre estos dos tipos de patógenos la que provocaría un incremento de la virulencia de toda la comunidad bacteriana subgingival, como ocurre con Pg y Aa cuando interaccionan con Streptococcus gordonii (Sg) (Daep et al., 2011; Ramsey et al., 2011). Por lo tanto, para que surja una comunidad potencialmente patógena son imprescindibles una serie de requisitos mínimos: (a) las bacterias que la conforman deben expresar adhesinas Introducción 57 relevantes y receptores que permitan un buen acoplamiento de una comunidad heterogénea; (b) cada microorganismo que integre la comunidad será fisiológicamente compatible o al menos no incompatible; (c) la combinación de las actividades de la comunidad bacteriana se sobrepondrán a la respuesta inmunitaria innata y adquirida del hospedador (Sánchez, 2011). 1.1.2.2. Periodontopatógenos y factores de virulencia En estudios de identificación bacteriana diseñados con el objetivo de encontrar una causa que explicase la enfermedad periodontal (Socransky & Haffajee, 1994; Zambon, 1996), se observó que determinadas bacterias estaban asociadas con el estado de enfermedad; teniendo en cuenta la presencia de periodontitis, de lesiones activas en progresión y la respuesta al tratamiento en las localizaciones evaluadas, destacando 3 agentes patógenos como son: Aa, Pg y Tf (Socransky & Haffajee, 2002). En 1996, en el Taller Mundial de Periodoncia (WWP, por sus siglas en inglés) se constató el nivel de evidencia del papel de determinados patógenos en la etiológica de la periodontitis, determinando que para Aa, Pg y Tf había una evidencia sólida, mientras que esta era moderada para Td, Fn, Pi y el género Streptococcus (Consensus report, 1996). La capacidad de estos microorganismos para desencadenar periodontitis está relacionada con el grado de patogenicidad inherente a cada uno de ellos, y en función de esta habrá bacterias con mayor relevancia que otras en el proceso de establecimiento y progresión de la enfermedad. Esa patogenicidad asociada a cada microorganismo se cuantifica de forma objetivable mediante la virulencia, que se mide por el número de patógenos necesarios para causar una enfermedad (Sánchez, 2011). Esta virulencia se deriva de determinados LOURDES NÓVOA GARRIDO 64 necesidad de amplificar la respuesta inmunitaria en infecciones crónicas; si se detecta un aumento significativo de estas células, como consecuencia su actividad implicará destrucción de los tejidos (Kantarci & van Dyke, 2002). Esta función puede ser modificada por la acción de las gingipaínas expresadas por P. gingivalis, pudiendo facilitar la cronificación de la periodontitis (Bostanci et al., 2013). P. gingivalis puede replicarse e influir en la respuesta inmunitaria a través de vías de transducción de señales de las células epiteliales gingivales, (Lamont & Jenkinson, 1998), mediante la expresión de moléculas como la adenosina. A través del acoplamiento de la adenosina ⎯unida al receptor A2a⎯ que P. gingivalis podría mantenerse a nivel intracelular, quizás regulando a la baja la respuesta proinflamatoria (Spooner et al., 2014). ‘Bacterium actinomycetem comitans’ fue el primer nombre que se le dio al microorganismo descubierto por Klinger en 1912 (Klinger, 1912) aislado junto con Actinomyces procedentes de lesiones actinomicóticas humanas (Norskov-Lauritsen & Kilian, 2006); fue reclasificado posteriormente como Actinobacillus actinomycetemcomitans (Topley & Wilson, 1946) y después se propuso un nuevo cambio a Haemophilus actinomycetemcomitans (Potts et al., 1985) que no fue admitido por el Comité Internacional de Sistemática Procariota (ICSP, por sus siglas en inglés), conocido anteriormente como ICSB (Frederiksen, 1987); en cuanto a su especie actualmente se denomina Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Norskov-Lauritsen & Kilian, 2006). Taxonómicamente, A. actinomycetemcomitans pertenece al filo Proteobacteria, a la clase Gammaproteobacteria, del orden Pasteurellales, familia Pasteurellaceae y género Aggregatibacter. Dentro de este género se adscriben 3 especies que han Introducción 65 demostrado similitud filogenética entre ellas: Haemophilus aphrophilus, que incluye a H. paraphrophilus considerado antes una especie diferente, H. segnis y H. /A. actinomycetemcomitans. A. actinomycetemcomitans es un cocobacilo pequeño, anaerobio facultativo, no móvil, gram negativo, no esporulado y capnofílico, precisa para su crecimiento la presencia de CO2 entre el 5-10%. Su siembra en medio agar-sangre va a generar pequeños bastoncillos a lo largo de un periodo de 24 horas, se presentan aislados, en pares o agrupados con un diámetro de 0,5 mm o inferior, hasta alcanzar 1-2 mm a las 48h (Norskov- Lauritsen & Kilian, 2006). Aa posee ciertas características que le confieren un potencial de virulencia en el hospedador, controlando también la respuesta inmunológica (Oscarsson et al., 2019). Aa es una bacteria que expresa dos exotoxinas: una leucotoxina de la familia RTX (“repeat in toxin”) y una toxina de distensión citoletal (CDT, por sus siglas en inglés) (Henderson et al., 2010); estas toxinas también están presentes en otras patógenos gramnegativos (Faïs et al., 2016; Linhartová et al., 2010). La leukotoxina de esta bacteria se denomina LtxA debido a que dentro del operón ⎯región de ADN que codifica la expresión de proteínas⎯, de los 4 que expresa (ltxC, A, B y D, en orden de transcripción), el gen ltxA es el que genera la proteína LtxA (Lally et al., 1991). Esta toxina es capaz de desencadenar la muerte celular de diferentes poblaciones leucocitarias y evitar la fagocitosis de la bacteria (Johansson et al., 2000; Johansson, 2011; Johansson et al., 2017). LtxA es capaz de activar la degranulación de los neutrófilos induciendo la liberación masiva de enzimas LOURDES NÓVOA GARRIDO 66 lisosomales, de estructuras tipo red (NETs), de metaloproteinasas de la matriz y puede inducir la apoptosis linfocitaria (Johansson et al., 2000; Claesson et al., 2002; Hirschfeld et al., 2016). En los monocitos/macrófagos induce la activación y secreción de las enzimas proinflamatorias IL-1ß e IL-18, esto ocurre tras haber generado la activación del inflamasoma, complejo multiproteico que inicia una respuesta inflamatoria mediante la activación de precursores proinflamatorios de las interleuquinas como respuesta inmune innata (Martinon et al., 2002; Kelk et al., 2011; Åberg et al., 2015). Algunos de estos mecanismos celulares y humorales también están vinculados con procesos inflamatorios, como la periodontitis (Könönen et al., 2019). Se ha observado un aumento de la leucotoxicidad en presencia de Aa (Zambon, 1994) en individuos con periodontitis frente a individuos sin patología, descubriéndose a posteriori una diferencia en el tipo de promotor en el operón de la leucotoxina (Haubek, 2010) que generaría un genotipo específico de Aa conocido como el clon JP2 (Brogan et al., 1994); este clon aumenta la toxicidad de la LtxA y guarda una correlación la clínica severa y la rápida progresión de la periodontitis (Haubek et al., 2008). La genotoxina CDT se observó por primera vez en cultivos de Campylobacter spp. y Escherichia coli (Johnson & Lior, 1988). Su expresión por Aa es una característica única considerando la microbiota oral asociada con la aparición de periodontitis (Faïs et al., 2016). Esta toxina es un factor de virulencia que actúa a 3 niveles: (1) altera las barreras físicas mediante toxicidad epitelial, promoviendo la infección; (2) deteriora la respuesta inmunitaria adquirida mediante toxicidad linfocitaria; (3) promueve la inflamación mediante la expresión de citoquinas producidas por los macrófagos (Scuron et al, 2016). Sin Introducción 67 embargo, su acción más destacada es su capacidad de generar daños en el ADN de la célula diana (Lara-Tejero & Galan, 2000). Esta holotoxima está formada por 3 subunidades: CdtA, CdtB y CdtC; las subunidades A y C participan en la internalización de la subunidad B y esta es asimilada en el núcleo celular mediante translocación, ya que funcionalmente es homóloga a la desoxirribonucleasa I (DNasa I) (Boesze- Battaglia et al, 2016). La capacidad de esta toxina de deteriorar el ADN es la razón por la que la CDT puede comprometer la integridad y el estado de homeostasis de los tejidos, al actuar deteniendo el ciclo celular y desencadenando, eventualmente, la apoptosis de las células del periodonto como fibroblastos gingivales, células del ligamento periodontal (Belibasakis et al., 2002; Belibasakis et al., 2004), células epiteliales gingivales (Kang et al., 2005; Kanno et al., 2005; Alaoui-El-Azher et al., 2010; Damek-Poprawa et al., 2011), como también células de origen inmunitario como células T (Shenker et al., 1999), células B (Sato et al., 2002) y células mononucleares (Akifusa et al., 2001). Esta toxina también puede alterar la capacidad fagocítica y de producción de citocinas de los macrófagos (Akifusa et al., 2001), además de estimular la producción de citocinas proinflamatorias por la célula intoxicada (Belibasakis & Bostanci 2014) como interferón (IFN- ), IL-1, IL-6 e IL-8 (Akifusa et al., 2001). A. actinomycetemcomitans también es capaz, de forma independiente a esta toxina, de regular la expresión del inflamasoma (Oscarsson et al., 2008; Belibasakis & Johansson, 2012). La CDT es capaz de inducir la expresión del principal receptor del factor osteolítico activador del ligando del factor nuclear kappa-B (RANKL), una molécula crucial en la diferenciación de los osteoclastos y, en consecuencia, en la resorción ósea en la periodontitis (Belibasakis & Bostanci, 2012), LOURDES NÓVOA GARRIDO 68 aunque también actúa en las células del tejido conectivo periodontal (fibroblastos gingivales y células del ligamento periodontal) (Belibasakis et al., 2005a; b) y sobre células T (Belibasakis et al., 2008), potenciando la destrucción ósea en el periodonto. Aa presenta una membrana celular, al igual que otras especies gramnegativas, compuesta por lipopolisacáridos (LPS), una potente molécula proinflamatoria, formado por grupo de moléculas relacionadas estructuralmente, de las que existen 7 serotipos diferentes etiquetados con letras que van de la “a” a la “f” (Masoud et al., 1991; Perry et al., 1996 a, b; Kaplan et al., 2001). La presencia de LPS en el epitelio de unión genera una respuesta en las células epiteliales expresando IL-15, seguida de una mayor producción de IFN-γ y proliferación de células T (Suga et al., 2013). En los fibroblastos el LPS capaz de inducir un desequilibrio en la regeneración del tejido gingival al potenciar su función fagocítica del colágeno; además también estimula la producción de IL-6 e IL-8 (Takahashi et al., 2008). Se ha demostrado que la acción del LPS actuaría generando un bucle de retroalimentación negativa en la señalización de citocinas, impidiendo llegar a controlar la infección y cronificándola (Taganov et al., 2006). A nivel celular el LPS es capaz de influir en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por los neutrófilos, acelerándola; desempeñando estas células una función tanto defensiva como destructiva en la periodontitis (Nicu & Loos, 2016). Este componente bacteriano es un factor de virulencia que llega a ser un inductor más potente que Pg o Pi (Aida et al., 1995). El LPS tiene además funciones fisiológicas para Aa, participa en la secreción de leucotoxina (Fujise et al., 2008; Tang Introducción 69 et al., 2012), además de interactuar con moléculas del huésped, como la hemoglobina y la IL-8, pudiendo facilitar la adquisición de hierro y la alteración de las defensas del huésped (Grenier et al., 1997; Ahlstrand et al., 2018). Aa es uno de los periodontopatógenos que puede detectar y unirse a moléculas de señalización del huésped como las citocinas, IL-1β, IL-8 e IL-6 (Paino et al., 2011; Ahlstrand et al., 2017), e internalizarlas en su citoplasma; también es capaz de generar un cambio en las propiedades de la biopelícula al disminuir la actividad metabólica (Paino et al., 2012) y modificar la composición de la matriz extracelular (Ahlstrand et al., 2017; 2018). Muchas bacterias eliminan de forma natural vesículas de membrana durante su etapa de crecimiento, también conocidas como “secreción de tipo cero” o vesículas de membrana externa (Belibasakis et al., 2019); nanoestructuras esféricas limitadas por una membrana que se liberan de la membrana externa de la bacteria (Oscarsson et al., 2019). Su función principal es participar en la liberación de antígenos, ya que son liberadas por organismos comensales y patógenos en estudios in vivo e in vitro cuando infectan células huésped (Deatherage et al., 2012; Uhlin et al., 2014). A través de estas vesículas factores de virulencia como la CDT pueden transportarse a fibroblastos gingivales (Rompikuntal et al., 2012), al igual que exportar la leucotoxina a las células huésped (Kato et al., 2002; Karched et al., 2008) o transportar moléculas pequeñas como las que contribuyen a la resorción ósea o LPS (Iino & Hopps, 1984; Konig et al., 2016). Las bacterias que ingresan al torrente sanguíneo y causan infección, como Aa, la resistencia al suero representa un factor de virulencia importante (Asakawa et al., 2003; Sundqvist & LOURDES NÓVOA GARRIDO 70 Johansson, 1982). Esta característica permite a las bacterias evadir los mecanismos de la defensa inmunitaria presentes en el suero, como el sistema del complemento y los péptidos antimicrobianos (Berends et al., 2014; Hovingh et al., 2016; Abreu & Barbosa, 2017). Se ha observado que cuando Aa crece subgingivalmente se detecta de forma libre y a nivel medio en la bolsa periodontal (Noiri et al., 2001), su presencia en micocolonias o de forma aislada dentro del tejido conjuntivo gingival se ha evidenciado en casi todos los tejidos con periodontitis, correlacionándose su aumento con la presencia de Aa (Christersson et al., 1987). Además, también se ha podido observar la presencia de esta bacteria en células epiteliales gingivales (Colombo et al., 2007) o en estrecha relación con el infiltrado polimorfonuclear de la bolsa periodontal (Mendes et al., 2016), aunque su presencia tiene mayor frecuencia en tejidos de pacientes más jóvenes con periodontitis agresivas que en la periodontitis crónica o en salud (clasificación de 1999) (Willi et al., 2014). La unión a superficies bióticas u otras biopelículas mejora las propiedades de virulencia del Aa (Belibasakis et al., 2019) debido a su capacidad de regulación proteómica con respecto a otras especies bacterianas, siendo específica para cada especie, así en P. indermedia induce una regulación positiva contrariamente en C. rectus, S. anginosus y P. gingivalis, donde genera una regulación negativa. Estos hallazgos son coincidentes con el crecimiento competitivo entre P. gingivalis y Aa que se observa en una misma biopelícula (Takasaki et al., 2013). La presencia de Aa parece ser huésped-específica y suele formar parte de la microbiota inicial del individuo (Asikainen & Chen, 1999). Alguno de los linajes clonales de esta bacteria como el clon JP2 se ha asociado a las formas más graves de Introducción 71 periodontitis localizada de avance rápido (Haubek et al., 2008). La presencia de este microorganismo podría predisponer la formación de una microbiota que favoreciese el desarrollo de la periodontitis mediante su acción supresora de las defensas del huésped (Fine et al., 2019). Tannerella forsithia (Tf), denominación más actual de la bacteria (Sakamoto et al., 2002), fue identificada como "Bacteroides fusiforme" por Tanner et al. (1986) al comprobar la similitud entre los aislados encontrados en muestras de placa supra y subgingival, describiéndola como una basteria fusiforme anaeróbica gramnegativa y no móvil (McBride et al., 2003), que se aisla con frecuencia junto con P. gingivalis en casos de periodontitis crónica activa (clasificación de 1999) (Tanner & Bouldin, 1989; Tanner et al., 1998; Grossi et al., 1994; Grossi 2001). Esta bacteria se asocia con frecuencia con periodontitis severa (estadio III o IV) (Tanner et al., 1984; Socransky et al., 2002), más prevalente en grupos etarios de edad avanzada (Yang et al., 2004) y significativamente concentrada en localizaciones con sangrado al sondaje (Suda et al., 2004); una bacteria que forma parte del complejo rojo de Socransky et al. (1998) (Tanner et al., 1986). Tf pertenece al género Tannerella, familia Porphyromonadaceae, orden Bacteroidales, clase Bacteroidia, filo Bacteroidetes (Sakamoto et al., 2002). Esta bacteria presenta unos requisitos de crecimiento únicos (hemina, menadiona, L- cisteína y ácido N-acetilneuramínico) (Wyss, 1989) siendo difícil de cultivar. T. forsythia tiene una actividad peptidasa que degrada la benzoil-DL arginina-naftilamida (BANA), que parece estar relacionada con localizaciones que presentan destrucción del tejido periodontal (Takaishi et al., 2003). Además, mediante el gen sia HI (sialidasa) genera sialidasas, enzimas que rompen los enlaces estructurales de glicoproteínas y glicolípidos (Berry et LOURDES NÓVOA GARRIDO 72 al., 1988; Ishikura et al., 2003), modificando la capacidad del organismo hospedador para responder ante una infección bacteriana, además de contribuir a la destrucción tisular en estudios in vivo (Holt et al., 1999). Aunque T. forsythia es un microorganismo asacarolítico, se ha demostrado que produce una variedad de glicosidasas in vitro, detectándose un aumento de la actividad glucosidasa en el fluido gingival de sujetos con gingivitis y periodontitis (Beighton et al., 1992); este hecho unido a la alta disponibilidad de proteoglicanos en el periodonto (Bartold et al., 1982; Bartold, 1987) proporciona un excelente sustrato, favoreciendo la protección de Tf ante estas proteínas. T. forsythia prolifera especialmente en localizaciones con sulfuro positivo versus negativo, sugiriendo que los niveles de este compuesto en bolsas periodontales reflejan la proporción de bacterias que liberan o generan sulfuro (Torresyap et al., 2003). T. forsythia produce lipoproteínas (BfLP) que activan los fibroblastos gingivales con la finalidad de generar niveles elevados de IL-6, inductora de la resorción ósea mediante la formación de osteoclastos (Kotake et al., 1996) y de TNF-α; también es capaz de inducir la producción de células B (Kishimoto, 1989). T. forsythia puede contribuir a alterar los tejidos periodontales en procesos de periodontitis al desencadenar la apoptosis de la célula por acción de sus lipoproteínas (Hasebe et al., 2004). La mayoría de las bacterias, y especialmente las especies gramnegativas, incorporan a su membrana celular otra capa adicional formada por subunidades de proteínas o glicoproteínas (Sára et al., 2000) denominada "capa S", cuya función se ha sugerido que sería proporcionar al microorganismo una cubierta protectora frente al organismo Introducción 73 hospedador y las agresiones del entorno, además de participar en los mecanismos de adhesión y de reconocimiento de superficie, como los receptores de fagocitos (Baumeister & Engelhardt, 1987). Se descubrió una de estas capas en T. forsythia con capacidad antigénica que le permite mediar en la hemaglutinación y en la adhesión celular (Kerosuo, 1988), además, se ha sugerido que la principal proteína de superficie de la capa S de Tf no solo es antigénica, sino que favorece la interacción patógeno-inmunitaria exacerbando la respuesta inmunitaria durante la progresión de la periodontitis (Yoneda et al., 2003). En células como neutrófilos y linfocitos se ha observado una actividad citolítica de Tf como un indicador de inducción de apoptosis (Arakawa et al., 2000), esto podría considerarse como un mecanismo vinculado a la progresión de la periodontitis, pues esta especie bacteriana invade la bolsa periodontal junto con P. gingivalis y T. denticola. Esta función sería de utilidad ante la presencia de glóbulos blancos debida a la respuesta inmuno-inflamatoria generada, esto favorecería la colonización bacteriana de la bolsa y una rápida progresión de la enfermedad (Holt & Ebersole, 2005). P. gingivalis y T. forsythia son capaces de coagregarse con F. nucleatum, favoreciendo la colonización en la biopelícula subgingival (Kapatral et al., 2002); asimismo, junto con T. denticola podría proporcionar algún mecanismo molecular que promueva la interacción bacteriana (Ikegami et al., 2004). T. forsythia se considera junto con P. gingivalis y Td un miembro importante de la microbiota periodontoptógena y puede contribuir al desarrollo de enfermedades sistémicas graves, como enfermedades cardiovasculares (Scannapiecco, 1988). LOURDES NÓVOA GARRIDO 80 Dentro de la biopelícula tienen lugar asociaciones microbianas intragenéricas e intraespecíficas que se promueven bien mediante la coadhesión de las bacterias plactónicas o libres en saliva a microorganismos fijos a un sustrato o bien a través de la coagregación entre distintas especies bacterianas (Katharios-Lanwermeyer et al., 2014; Palmer, 2014). Tras esta fase se activa la maduración de la biopelícula derivada de la formación de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) mediada por F. nucleatum (He et al., 2012). F. nucleatum se puede considerar un patógeno periodontal, debido a su mayor prevalencia dentro de la biopelícula subgingival de bolsas periodontales profundas (Gursoy et al., 2008), pues desencadena la producción de metaloproteinasas de la matriz por parte del huésped, contribuyendo a establer un estado de inflamación periodontal que luego devendrá periodontitis (Gursoy et al., 2010). Estructuralmente F. nucleatum posee una envoltura celular con una membrana externa y otra interna, con un espacio periplásmico entre ellas que contiene una capa de peptidoglicanos (Desvaux et al., 2005). Esta membrana externa es rica en adhesina que permite su unión a diversas proteínas salivales y a otros microorganismos y sustratos del huésped (Kaplan et al., 2009; Coppenhagen-Glazer et al., 2015); pero tiene unas propiedades de virulencia adicionales importantes que incluyen su actividad hemolítica aumentada y la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) (Gaetti-Jardim Júnior & Avila- Campos, 1999; Okamoto et al., 2000; Yoshida et al., 2009); siendo capaz de invadir los tejidos (Strauss et al., 2011). La adherencia y la invasión son mecanismos esenciales para la colonización, la diseminación, la evasión de las defensas del huésped y la inducción de una respuesta inmunitaria. La Introducción 81 capacidad de invasión de F. nucleatum varía ampliamente entre las diferentes cepas (Strauss et al., 2011; Manson et al., 2014). F. nucleatum se coagrega con especies microbianas diferentes a nivel bucal (Rickard et al., 2003) y codifica varias adhesinas que facilitan este proceso (Kaplan et al., 2009; 2010; 2014); además, se une a una variedad de células: epiteliales y endoteliales, PMN, monocitos, eritrocitos, fibroblastos, células HeLa y células NK, así como a moléculas del huésped como macromoléculas salivales, proteínas de la matriz extracelular, IgG humana y cadherinas (Bachrach et al., 2005; Figuero et al., 2011). Por otra parte, Fn es capaz de invadir las células epiteliales y las endoteliales (Han et al., 2000; 2004). Se ha identificado una adhesina, FadA, a partir de F. nucleatum, que es capaz de unirse (Han, 2011) e invadir las células del huésped (Xu et al., 2007; Témoin et al., 2012b; Rubinstein et al., 2013); por ello FadA no es sólo una adhesina, sino también una invasina (Xu et al., 2007) que está codificada de forma única por dos especies estrechamente relacionadas, F. nucleatum y F. periodonticum, ausente en la mayoría de las otras especies de Fusobacterium (Han et al., 2005). Esta adhesina se detecta con más frecuencia en las muestras de placa dental de pacientes con gingivitis y periodontitis que en los controles sanos (Liu et al., 2014). La colonización bacteriana también depende de la capacidad del patógeno para obtener nutrientes esenciales (Tanaka et al., 2017). Los iones de metales de transición, como cobre, zinc, manganeso y hierro, están implicados en muchos procesos biológicos importantes (Hood & Skaar, 2012); de ahí que los patógenos hayan desarrollado sofisticados sistemas de adquisición para eliminar metales del entorno (Wakeman & Skaar, 2012), como restringir la disponibilidad de hierro del LOURDES NÓVOA GARRIDO 82 huésped, aunque durante la infección también se limita la disponibilidad de zinc y manganeso (Weinberg, 2009). F. nucleatum tiene una función clave en la activación del sistema inmunológico (Dale & Krisanaprakornkit, 2001; Joly et al., 2001; Dale & Krisanaprakornkit, 2005) provocando una variedad de respuestas del huésped (Mohri, 1997). Induce la producción de -defensina 2 (Xia et al., 1998), estimula los factores que predisponen al desarrollo de aterosclerosis (Elkaim et al., 2008) y activa la apoptosis de linfocitos (Coussens et al., 2011). F. nucleatum es también un potente estimulador de citocinas inflamatorias como IL-6, IL-8 y TNFα (Porembska et al., 2002; Förstermann et al., 2012). La unión de este microorganismo a las células NK activa las respuestas inflamatorias implicadas en la enfermedad periodontal (van der Reijden et al., 2006). Debido a que exhibe numerosas propiedades de virulencia, F. nucleatum puede tener un papel integral en la regulación de la formación de biopelículas orales y en su crecimiento posterior, observándose una disminución significativa en el total de unidades formadoras de colonias (UFC) en modelo in vitro en las biopelículas supragingivales que no contienen Fn (Guggenheim et al., 2001; Thurnheer et al., 2003). En biofilms subgingivales sin estreptococos o con estreptococos y actinomyces conjuntamente, se observó un distribución menos compacta y más dispersa de Fn dentro de la masa de biofilm (Ammann et al., 2013), lo que parece confirmar su relación funcional interespecie. F. nucleatum puede comunicarse con otras especies bacterianas en la biopelícula a través de moléculas de señalización sensibles al quórum (Frias et al., 2001), como el Introducción 83 autoinductor-2 (Jang et al., 2013a), que tiene la capacidad de regular la interacción con otras bacterias (Jang et al., 2013b). Se ha demostrado que diferentes subespecies de F. nucleatum pueden condicionar de distinta forma la función de los neutrófilos y la apoptosis por oxidación de estas células (Kurgan et al., 2017), lo que denota variaciones en sus propiedades de virulencia, algo que se confirma en el variado comportamiento de la biopelícula entre las subespecies según las condiciones microecológicas, habiéndose sugerido que F. nucleatum ssp. nucleatum es la subespecie mejor adaptada, como evidencia su mayor presencia y la distribución uniformemente dispersa a lo largo de la biopelícula en comparación con las otras subespecies (Thurnheer et al., 2019). La interacción entre C. albicans y F. nucleatum puede conducir a una atenuación mutua de su virulencia (Bor et al., 2016). Veillonella sp. puede favorecer el crecimiento de F. nucleatum en condiciones microaerofílicas o en presencia de S. gordonii (Zhou et al., 2017), que también ha mostrado un gran potencial de coagregación con F. nucleatum (Mutha et al., 2018). Se ha señalado que la unión de F. nucleatum ssp. polymorphum a S. mutans se puede atribuir a métodos de reconocimiento de algunas adhesinas de estas bacterias (Guo et al., 2017), que sirven como mecanismo de unión para las fusobacterias y dilucidan su alto potencial de virulencia, ya que la interacción interespecie de S. mutans es muy limitada (Wang et al., 2011). P. gingivalis, P. intermedia y C. rectus demostraron crecer mejor en presencia de F. nucleatum ssp. nucleatum a nivel subgingival (Antiabong et al., 2013; Thurnheer et al., 2019). También se observó una reducción en el número de S. oralis, un microorganismo comensal y una mejora significativa del crecimiento de F. nucleatum después de la incorporación de LOURDES NÓVOA GARRIDO 84 estreptococos (Ammann et al., 2013). Se han identificado redes de interacción entre F. nucleatum y Streptococcus mitis (Zhang et al., 2019b) o P. gingivalis (Mohammed et al., 2017). Se han observado diferencias en los patrones de crecimiento y localización de F. nucleatum en biopelículas según la subespecie (Thurnheer et al., 2019). Prevotella intermedia, esta es su última denominación aunque ha sufrido cambios a lo largo de los años (Hahnke et al., 2016), es un bacilo anaeróbico sacarolítico, pigmentado de negro. La especie bacteriana P. intermedia pertenece al género Prevotella, familia Prevotellaceae, orden Bacteroidales, clase Bacteroidia y filo Bacteroidetes. Inicialmente Pi incluía a P. nigrescens, sin embargo, posteriormente se propuso una nueva especie en base a su actividad peptidasa y diferencias en los perfiles enzimáticos (Gmür & Guggenheim, 1983; Shah & Gharbia, 1992; Hanke et al., 2016). P. intermedia ha sido reconocido como un patógeno periodontal putativo (Slots et al., 1986; Dzink et al., 1988). P. intermedia es parte de la microbiota oral comensal, se detecta en todos los grupos de etarios y en poblaciones diversas (Slots et al., 1986; van Oosten et al., 1988; Frisken et al., 1990; Rodenburg et al., 1990; Papapanou et al., 1993; Dahlén et al., 1995). Los estudios clínicos también muestran que P. intermedia está más vinculada a gingivitis y a la inflamación que con las bolsas severas y la progresión de la periodontitis, habiéndose cuestionado su asociación con los procesos destructivos de los tejidos periodontales (Moore et al., 1991). Incluso cuando Pi se detecta en bolsas profundas, es frecuente también hallarla en bolsas superficiales, la mucosa, las amígdalas, la lengua y la Introducción 85 saliva de adultos (van Winkelholl et al., 1988; Slots et al., 1990; Papapanou et al., 1993; Wolff et al., 1993). En muestras de bolsas periodontales profundas se ha observado una mayor frecuencia de Pi en comparación con P. nigrescens, mientras que se encontró una distribución equitativa en localizaciones con gingivitis que no mostraban progresión, apoyando así la diversidad patógena entre las dos especies (Dahlén et al., 1990; Gharbia et al., 1994; Gmür & Saxer, 1994). P. intermedia se ha asociado con gingivitis necrosante (Loesche et al., 1982), con peridontitis en individuos con diabetes tipo 1 (Zambon et al., 1988) y con gingivitis durante el embarazo (Kornman & Loesche, 1980). Pi es una bacteria que está presente con frecuencia en infecciones endodóncicas (Brook & Gober, 1983; Gharbia et al., 1994; Hafström et al., 1994), además de otras infecciones por anaerobios extraorales como afecciones pleuropulmonares, apéndicitis gangrenosa, y formación de abscesos en la región de la cabeza y el cuello (Finegold et al., 1993). Los inhibidores de la proteasa modulan la actividad de enzimas proteolíticas liberadas por los neutrófilos polimorfonucleares durante un proceso inflamatorio y puden contribuir a neutralizar la actividad de los patógenos invasores (Travis & Salvesen, 1983), protegen al huésped contra la destrucción tisular e impiden el crecimiento de ciertos patógenos periodontales, como P. gingivalis (Grenier, 1992). Algunas especies bacterianas que forman parte de la microbiota subgingival pueden producir inhibidores de la proteasa (Grenier, 1991), como es el caso de P. intermedia; este inhibidor actúa sobre diversas enzimas proteolíticas, además de ser capaz inhibir la actividad similar a la tripsina de P. gingivalis (Grenier, 1992). LOURDES NÓVOA GARRIDO 86 Pi y Pn demuestran tener una capacidad similar para hemaglutinar eritrocitos de origen animal y coagregarse con Streptococcus y Actinomyces spp., además comparten similitudes en reacciones bioquímicas, la producción de enzimas y la susceptibilidad a antibióticos (Dahlén et al., 1990; Dahlén et al., 1996). La periodontitis es una enfermedad inflamatoria crónica iniciada por un grupo de patógenos periodontales gramnegativos como P. gingivalis y P. intermedia que genera destrucción del tejido periodontal, mediada principalmente por citocinas inflamatorias y proteinasas que liberan las células inmunes y tisulares locales al ser activadas ante la presencia de patógenos periodontales y sus metabolitos (Darveau et al., 1997). Las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) desempeñan un papel fundamental en afecciones patológicas como el cáncer y las enfermedades inflamatorias, como la artritis reumatoide y periodontitis crónica, estas, junto a otras proteinasas, son responsables de la destrucción del tejido conectivo en la periodontitis (Birkedal-Hansen, 1993; Nagase & Woessner, 1999; Sorsa et al., 2004; 2006). P. intermedia puede contribuir a ello al inducir la producción de citocinas proinflamatorias por células epiteliales gingivales (Sugiyama et al., 2002) y por las células del ligamento periodontal (Yamamoto et al., 2006), siendo más prevalente en pacientes con destrucción periodontal (Socransky et al., 1998; Guan et al., 2008). Se ha observado un incremento en los niveles de MMP-9 en el tejido gingival, la placa dental, saliva y en el fluido crevicular gingival de pacientes con periodontitis de larga evolución (Ingman et al., 1994; Mäkelä et al., 1994; Westerlund et al., 1996; Pirilä et al., 2001; Smith et al., 2004). Además, P. intermedia podría incrementar la actividad de enzimas degradativas bajo ciertas condiciones y sustentar la progresión de la periodontitis (Maeda et al., 1998). Introducción 87 La capacidad de P. intermedia para interactuar con la laminima (Lm), una proteína de la membrana basal que abunda en el tejido periodontal, a través de ciertas proteínas de la superficie celular, podría contribuir en la colonización de la bolsa periodontal por esta bacteria (Kalfas et al., 1992). Se ha observado en Pi aisladas de bolsas periodontales que esta bacteria presenta diferentes tipos de fimbrias, adecuadas a su estructura, que le permiten aglutinar eritrocitos (Leung et al., 1996). Para el crecimiento de P. intermedia se requiere la presencia de hierro, que la bacteria obtiene por absorción de la hemoglobina mediante su unión con esta molécula (Leung et al., 1998). La capacidad de formación de polisacáridos intracelulares, además de la fermentación de glucosa mediante su metabolización podrían ser características que favorecerían la supervivencia de Pi y Pn a nivel supra y subgingival (Takahashi et al., 2000). Streptococcus, denominado así por Rosenbach en 1884 (Hardie, 1986), designa un género de bacterias pertenecientes a la familia Streptococcaceae, del orden Lactobacillales, clase Bacilli y filo Firmicutes. S. sanguinis forma parte del género mencionado y es una bacteria que puede ser un objeto de unión potencial para otros patógenos dentro de la placa dental, como sucede con F. nucleatum y con P. gingivalis, que puede unirse a varias especies de estreptococos a través de sus fimbrias, incluidos S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii y S. parasanguinis con la finalidad de formar biopelículas (Lamont et al., 1992; Bradshaw et al., 1998; Maeda et al., 2004). LOURDES NÓVOA GARRIDO 88 Además de su papel como colonizador primario en la cavidad bucal, S. sanguinis es más conocido por su participación en el desarrollo de la endocarditis y es reconocido por ser uno de sus 3 principales agentes etiológicos junto a los géneros estafilococos y enterococos (Cahill & Prendergast, 2016; Vogkou et al., 2016). Aunque S. sanguinis parece estar asociado con salud periodontal, no está claro si promueve la salud bucal o sobrevive mejor en localizaciones sanas; además, también es una bacteria que se coagrega con P. gingivalis y F. nucleatum (Zhu et al., 2018). Los Actinomyces orales son bacilos grampositivos que se encuentran entre los primeros microorganismos que colonizan superficies dentales prístinas y tienen capacidad de agruparse con otras bacterias colonizadoras tempranas como Streptococcus, con los que forman la base de la placa dental temprana (Diaz et al., 2006; Kolenbrander et al., 2006). Otras especies detectadas mediante cultivo que abundan en la placa subgingival de localizaciones sanas incluyen: Streptococcus sanguinis, S. oralis, S. intermedius, S. gordonii, Peptostreptococcus micros, Gemella morbillorum y Veillonella parvula, V. atypica, Capnocytophaga ochracea y C. gingivalis (Moore & Moore, 1994). En la periodontitis, las comunidades polimicrobianas inducen una respuesta disruptiva y destructiva del hospedador a través de un mecanismo general denominado sinergia polimicrobiana y disbiosis (Hajishengallis & Lamont, 2012). Los estudios basados en el cultivo tradicional identificaron una tríada de patógenos involucrada en la disrupción del estado de salud periodontal: P. gingivalis, T. forsythia y T. denticola (Holt & Ebersole, 2005; Socransky & Haffajee, 2005) (el complejo rojo); con posterioridad los avances en técnicas moleculares independientes del cultivo han ampliado la lista de Introducción 89 candidatos periodontopatógenos grampositivos como Filifactor alocis y Peptoanaerobacter stomatis, gramnegativos como Firmicutes (Dialister spp., Megasphaera spp. y Selenomonas spp.), especies de los géneros Prevotella, Desulfobulbus y Sinergistas, y otros (Dewhirst, 2010; Griffen et al., 2012; Abusleme et al., 2013; Dewhirst, 2016; Diaz et al., 2016). Las enfermedades periodontales se asocian con un microbioma gran diversad, que puede cambiar de forma sustancial entre individuos con periodontitis e incluso entre localizaciones en el mismo individuo (Moore et al., 1991; Diaz, 2012; Simón-Soro et al., 2013; Nowicki et al., 2018). El concepto de sinergia polimicrobiana, consiste en la colaboración bacteriana dentro de las comunidades de biopelículas con la finalidad de potenciar la colonización, la persistencia o la patogenicidad de los microorganismos que la conforman (Lamont et al., 2018). En experimentos en modelo animal se observó una patogenicidad elevada hallándose combinaciones de organismos en comparación con una infección monoespecie (Lamont & Hajishengallis, 2015; Chukkapalli et al., 2017; Ebersole et al., 2017); la sinergia puede surgir entre microorganismos que proporcionan un sustrato para la adhesión y la colonización de otros, por alimentación cruzada o por metabolismo de sustratos complejos (Murray et al., 2014; Short et al., 2014; Lamont & Hajishengallis, 2015; Hajishengallis & Lamont, 2016; Michi et al., 2016). Estas interacciones físicas entre organismos y la difusión de los factores solubles resultantes de cada bacteria pueden llegar a modular la expresión del gen de virulencia y nososimbiosis ⎯capacidad que tienen las bacterias de beneficiarse mutuamente en situaciones de enfermedad en el hospedador⎯ de estas (Hajishengallis & Lamont, 2016; Stacy et al., 2016). Como resultado de estas interacciones se producen infecciones mixtas, por ejemplo de S. gordonii y P. gingivalis, que dan como LOURDES NÓVOA GARRIDO 96 1.1.3. Patogenia La respuesta del organismo ante la presencia de periodontopatógenos ocasiona la liberación de mediadores inflamatorios a nivel de los tejidos periodontales, de ello se deriva la posterior destrucción tisular del componente óseo y del colágeno del periodonto (Schenkein et al., 2020). Las bacterias que participan de la comunidad de la biopelícula oral conforman un sistema biológico interespecies complejo, a la vez que establecen una simbiosis con el huésped (Avila et al., 2009; Dovrolis et al., 2019) y pueden condicionar su estado de enfermedad pero también de salud (Kreth & Merritt, 2009); de ahí su importancia en la maduración y el desarrollo de un sistema inmunológico adecuado, pues la función del sistema inmune no solo es de defensa del huésped, sino que también convive y protege a los microorganismos comensales de la microbiota oral en condiciones de salud (Petersen et al., 2014; Idris et al., 2017; Gao et al., 2018). Sin embargo, esta respuesta debe ser capaz de mantener un equilibrio evitando ser exacerbada para no comprometer los tejidos periodontales ni la viabilidad de las bacterias comensales (Sultan et al., 2018); del mismo modo, la microbiota se coordina para prevenir la colonización por patógenos (He et al., 2014). Este sinergismo es una consecuencia evolutiva ante el beneficio aportado por algunas bacterias (Baker & Edlund, 2019), que no se limita al ámbito oral (Duran-Pinedo, 2021), considerándose estos microorganismos parte de una microbiota oral saludable (García-Castillo et al., 2016; Mascitti et al., 2019). Estaríamos, por tanto, ante un sistema simbiótico de interacciones hospedador-microbioma que podría considerarse un estado de eubiosis o de equilibrio (Do et al., 2013; Zhang et al., 2019), aunque la población microbiana es diversa y difiere entre individuos sanos (Ding & Schloss, 2014; De Filippis et al., 2014; Introducción 97 Zaura et al., 2017); sin embargo, se pueden concretar dos estados de la comunidad microbiana oral con respecto al hospedador: salud o eubiosis y enfermedad o disbiosis (Takeshita et al., 2016). 1.1.3.1. Estado de disbiosis en la microbiota oral Ante la presencia de factores ambientales como el tabaco o la mayor presencia de un determinado patógeno comensal pueden causar una disrupción en el equilibrio del ecosistema microbiano (Méthot & Alizon, 2014; Kilian et al., 2016), a pesar de la resiliencia inherente al microbioma oral para mantener su estado de simbiosis frente a las alteraciones (Rosier et al., 2018), generando un estado de disbiosis (Petersen & Round, 2014). Este estado en el que el equilibrio del ecosistema oral está alterado puede generar diferentes situaciones: que exista una pérdida total de la diversidad microbiana, una pérdida de los microorganismos beneficiosos o la difusión de los microorganismos patógenos (Radaic & Kapila, 2021). En esta situación de desequilibrio el organismo tratará de restablecer la homeostasis activando una serie de mecanismos tanto pertenecientes a la inmunidad innata como adaptativa, emitiendo respuestas celulares y humorales (Akinkugbe et al., 2015; Ebersole et al., 2013; 2016; 2017), de forma conjunta con la microbiota autóctona (Roberts & Darveau, 2015) con la finalidad de controlar a los patógenos invasores, al mismo tiempo, los microorganismos periodontopatógenos (Slots & Genco, 1984; Hajishengallis, 2015) emprenderán una serie de acciones para eludir o interrumpir la defensa iniciada por el hospedador (Contreras et al., 2014; Slots, 2015). LOURDES NÓVOA GARRIDO 98 Figura 2. Mecanismos de patogénesis de la periodontitis (adaptado de Kornman, 2008). PMNs, polimorfonucleares; LPSs, lipopolisacáridos; MMPs, metaloproteinasas de la matriz. En una situación de disbiosis (Figura 2) se produce un cambio desde un estado de salud, a una situación de inflamación, bien sea gingivitis o periodontitis, observándose un aumento progresivo del flujo del líquido crevicular gingival, indicativo de este cambio de estado (Ozkavaf et al., 2000; Hatipoglu et al., 2007). Asimismo, la tolerancia al oxígeno también disminuye, ya que es característica de comunidades microbianas asociadas preferentemente con salud y gingivitis (Loesche, 1969; Diaz et al., 2002), comenzando a ser notorio un aumento de la expresión de citoquinas, quimiocinas y metaloproteinasas tanto en los tejidos periodontales como en el líquido crevicular gingival; esta situación permite el paso a un estado de inflamación que se puede observar en los pacientes con periodontitis (Assuma et al., 1998; Gainet et al., 1998; Romanelli et al., 1999). Además, los leucotrienos B4 y la prostaglandina E2 (PGE2), entre otros mediadores lipídicos, también están aumentados en esta fase temprana de la inflamación (Solomon et al., 1968; Klein & Raisz, 1970; Raisz & DESAFÍO MICROBIANO RESPUESTA INMUNOINFLAMATORIA DEL HUESPED METABOLISMO DEL TEJIDO CONECTIVO Y ÓSEO SIGNOS CLÍNICOS DE ENFERMEDAD INICIAL Y PROGRESIÓN FACTORES DE RIESGO GENÉTICOS FACTORES DE RIESGO AMBIENTALES Y ADQUIRIDOS Anticuerpos PMNs LPSs Otros factores de virulencia Citoquinas y prostanoides MMPs Introducción 99 Koolemans-Beynen, 1974; Offenbacher et al., 1986), especialmente la PGE2 en el líquido crevicular gingival de los pacientes con periodontitis severa y gran actividad bacteriana (Offenbacher et al., 1984), como también la actividad de la ciclooxigenasa, especialmente ciclooxigenasa‐2 (ElAttar, 1976; ElAttar, 1982; 1984; Pouliot et al., 2000). Esta fase aguda de la inflamación depende de otro tipo de mediadores, de origen lipídico, para que puedan restituir la homeostasis tisular (Serhan et al., 2008; Serhan, 2014). De este modo, se estimularía la producción de lipoxina A4, de leucotrieno B4 y de PGE por los neutrófilos con la finalidad de detener la destrucción tisular derivada del proceso inflamatorio generado, esto ocurre sobre todo en periodontitis de avance rápido (Offenbacher et al., 1986; Pouliot et al., 2000). En lesiones periodontales crónicas también se activa la producción de lipoxinas derivada de una hiperactivación de los linfocitos neutrófilos, pero no llega a ser suficiente para resolver la inflamación (Fredman et al., 2011). A nivel subgingival en individuos con periodontitis, se observa un aumento de la carga bacteriana derivado de las especies dominantes, exacerbando la inflamación clínica (Abusleme et al., 2013); este cambio en la ecología de la microbiota oral es fundamental para poder impulsar el crecimiento de microorganismos asociados a periodontitis mediante la degradación tisular del colágeno del periodonto o de hierro procedente de grupos hemo (Hajishengallis, 2014; Diaz et al., 2016). Este hecho fomenta el crecimiento de bacterias proteolíticas y sacarolíticas subgingivales (Duran-Pinedo et al., 2014) y favorece la expansión de especies patobiontes inflamofílicas (Hajishengallis, 2014) a expensas de la falta de adaptación de otras especies a las nuevas condiciones ambientales, generando un desequilibrio en la comunidad LOURDES NÓVOA GARRIDO 100 (Hajishengallis, 2014; Diaz et al., 2016; Herrero, 2018). Por tanto, una biopelícula originalmente eubiótica habrá pasado a una disbiótica con capacidad para inducir citocinas proinflamatorias por parte de las células del huésped, empeorando el estado de periodontitis por un incremento de iones potasio derivado de los metabolitos procedentes de la destrucción tisular (Bang et al., 1973; Herrero, 2018; Yost et al., 2015). Esta mayor producción de citoquinas provoca una disminución en la producción de βdefensina por las células epiteliales gingivales ⎯factor protector del huésped⎯ (Rosan & Lamont, 2000; Yost et al., 2017). Parece haber una relación recíproca de causa y efecto entre disbiosis e inflamación, aunque no se ha aclarado si la disbiosis es causa o consecuencia de una enfermedad inflamatoria, como la periodontitis (Dalal & Chang, 2014), ya que la inflamación favorece el crecimiento selectivo de comunidades disbióticas y este estado alterado de la microbiota exacerba la inflamación, impulsando la propia disbiosis (Hajishengallis, 2014; Diaz et al., 2016; Lee et al., 2016; Nassar et al., 2017; Yost et al., 2017; Herrero, 2018). Así, para la adquisición de nutrientes, estas comunidades necesitan cierto grado de inflamación, aunque deben regular a la baja la respuesta inmune del hospedador para su autoprotección (Finlay et al., 2006); una situación que las bacterias periodontopatógenas han solventado al manipular la respuesta del hospedador, separando el proceso inflamatorio de la actividad bactericida. Por ello, la actividad de P. gingivalis sobre los leucocitos, que perjudica su función bactericida, beneficiaría a la comunidad microbiana al mismo tiempo que promueve la respuesta inflamatoria (Daep et al., 2011; Hajishengallis et al., 2011; Maekawa et al., 2014; Makkawi et al., 2017; Wang et al., 2010; Liang et al., 2011). Introducción 101 1.1.3.2. Respuesta inmune en la periodontitis La presencia de biopelículas que contienen complejos microbianos que incluyen P. gingivalis, T. forsythia y T. denticola junto con la interacción de los mecanismos de defensa del huésped son determinantes en el desarrollo de la periodontitis (Socransky et al., 1998); sin embargo, una bacteria como A. actinomycetemcomitans que está presente en población general y en sujetos portadores sin expresión clínica ni progresión de la periodontitis, se ha relacionado con una periodontitis de progresión rápidad periodontal (Cullinan et al., 2003). Por tanto, aunque la mayoría de las personas mantienen un estado de eubiosis en lo referente a la microbiota bucal, un incremento de microorganismo o bien un estado inmunitario deficiente pueden alterar este equilibrio, siendo la disbiosis un estado dependiente de una interacción microbiota-sistema inmune donde la respuesta inmune que se desencadena tendría emplicaciones estructurales en los tejidos periodontales; además, hay que tener en cuenta el impacto de otros factores ambientales que podrían exacerbar esta respuesta (Cullinan et al., 2001; Seymour & Taylor 2004). Los mecanismos inmunitarios adaptativos están implicados en la patogenia de la enfermedad periodontal, esto se demostró con la presencia de células plasmáticas en los tejidos gingivales afectados de periodontitis por Brandtzaeg y Kraus en 1965 (Suárez et al., 2020); aunque posteriormente, se destacaría la importancia de la inmunidad celular en este proceso inflamatorio (Ivanyi & Lehner, 1970), predominantemente de células B y plasmáticas (Mackler et al., 1977; Seymour et al., 1978; Seymour & Greenspan 1979; Berglundh et al., 2011), modificando el patrón celular predominante de células T observado en la gingivitis (Seymour et al., 1979). Mediante estos hallazgos histológicos se ha establecido una diferenciación entre las etapas de desarrollo de la enfermedad periodontal LOURDES NÓVOA GARRIDO 102 (gingivitis y periodontitis), de modo que se diferencia un periodo "inicial", que se correspondería clínicamente con la gingivitis y la presencia de lesiones "establecidas" y "avanzadas", que varían en su expresión clínica y grado de destrucción (Page & Schroeder, 1976). La lesión establecida se caracteriza por la presencia de linfocitos y células plasmáticas en el tejido conectivo periodontal (Mackler et al. 1977; Seymour et al., 1978; Seymour & Greenspan 1979), siendo la mayoría células B portadoras de inmunoglobulina que conducen a una degradación tisular progresiva y al desarrollo de una bolsa periodontal, aunque a nivel del área gingival son predominantes las células T. La migración de linfocitos polimorfonucleares (PMN) en el epitelio de la bolsa periodontal genera un aumento de la permeabilidad y ulceración del epitelio gingival que promueve una mayor afluencia de productos microbianos y en consecuencia de citocinas inflamatorias como la interleucina-1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y la prostaglandina E2 (PGE2) (Gemmell et a., 1997) generando una cronificación del estado inflamatorio y de la destrucción tisular a nivel periodontal (Reynolds & Meikle, 1997). Esta situación puede agravarse y progresar, estableciendo una lesión avanzada, de características similares excepto por una mayor e importante pérdida de unión entre los tejidos periodontales, consecuencia de la perpetuación de la respuesta inflamatoria, debida a la producción de metaloproteinasas de la matriz (MMP) por fibroblastos hiperestimulados mediante la liberación de citoquinas inflamatorias (Birkedal-Hansen, 1993). El tejido periodontal no solo está expuesto a la colonización bacteriana, lo que propiciaría una disrupción del estado de homeostasis de la microbiota oral y elevaría la patogenicidad de Introducción 103 toda la comunidad microbiana, sino que al desempeñar una función de barrera inmunitaria también está continuamente expuesto a otros estímulos físicos y químicos derivados de funciones biológicas que pueden favorecer el tránsito a un estado disbiótico (Hajishengallis et al., 2012; Moutsopoulos & Konkel, 2018). Mediante la interacción del microbioma con las células del tejido periodontal ⎯células epiteliales de la mucosa y fibroblastos gingivales, además de otros inmunocitos derivados de las agresiones fisiológicas del entorno bucal, como fagocitos mononucleares (MNP), células presentadoras de antígenos (APC) y subconjuntos específicos de células T (como células Th17) ⎯ se genera la liberación de la IL-1, la IL-6 y del factor de necrosis tumoral (TNF), entre otras citoquinas proinflamatorias, que se destacan por sus efectos pleiotrópicos en la promoción de linfocitos y destrucción de tejidos (Hajishengallis, 2015). La estimulación de IL-1 y de IL-6 conduce a la activación de determinadas vías de señalización y a la maduración y diferenciación de células concretas que podrían generar un mecanismo de retroalimentación derivado de la liberación de citoquinas (Hajishengallis et al., 2017). Sin embargo, los estudios muestran resultados contradictorios en cuanto a la relación entre la patogenia y la respuesta inmune a la periodontitis sin aclarar su mecanismo (Gaffen & Hajishengallis, 2008). Las citocinas proinflamatorias con mayor protagonismo en la respuesta inmune vinculada a la periodontitis pertenecen a las Familias de IL-1, IL-6 y TNF. La familia IL-1 incluye IL- 1α, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36, IL- 37 e IL-38, citocinas involucradas en respuestas inmunes tanto innatas como adaptativas, habiéndose demostrado su relación con estados de inflamación (Mantovani et al., 2019). Aunque la LOURDES NÓVOA GARRIDO 104 función de la IL-37 en la patogenia de la periodontitis, se reconoce como una citoquina antiinflamatoria con un efecto regulador negativo contra la inflamación (Dinarello, 2018). Se ha demostrado que los polimorfismos genéticos en IL-1  , IL-1R e IL-1N están relacionados con la susceptibilidad a la periodontitis (Lavu et al., 2015), siendo la IL-1β la que induce la proliferación y la activación de células Th1 y Th2, y demostrándose que la cantidad total de esta interleuquina en el líquido crevicular gingival (GCF) está relacionada con la gravedad de la periodontitis, observándose su descenso tras el tratamiento periodontal (Ben-Sasson et al., 2009; Gilowski et al., 2014; Reis et al., 2014); además, la IL-1α impulsa una respuesta inmunitaria de tipo III al ayudar a la IL-23 y la IL-6 en la activación de las células Th17 y en la expresión de IL- 17(Langrish et al., 2005; Mills et al., 2013). La IL-18 se reconoce como un inductor del interferón (IFN) y un activador de células NK (asesinas naturales) y de células Th1, que se relacionan con la respuesta inmune tipo I (Okamura et al., 1995). Esta interleuquina también presenta polimosfismos vinculados con un aumento del riesgo de periodontitis (Li et al., 2014; Tanaka et al., 2017), estando aumentada su concentración en el GCF, la saliva y el suero en pacientes con periodontitis de larga evolución y disminuyendo tras el tratamiento de la periodontitis (Figueredo et al., 2008; Pradeep et al., 2009; Özçaka et al., 2011; Sánchez-Hernández et al., 2011; Campos et al., 2012; Nair et al., 2016). La expresión de esta IL es regulada positivamente por la presencia de P. gingivalis activa y su lipopolisacárido (LPS) (Hamedi et al., 2009; Yee et al., 2012), además, esta IL estimula la expresión de metaloproteinasas ante la presencia de patógenos bacterianos generando una pérdida ósea de etiología inflamatoria (Yoshinaka et al., 2014; Wang et al., 2019). Introducción 105 La IL-33 también se expresa en el tejido periodontal de pacientes con periodontitis crónica, su expresión puede ser inducida por gingipaína, fimbrias y lipopéptidos de P. gingivalis, como se ha observado en estudios in vitro e in vivo en modelo animal, además de ser capaz de inducir la destrucción del hueso alveolar (Köseoğlu et al., 2015; Malcolm et al., 2015; Lapérine et al., 2016; Tada et al., 2016; 2017). Desde que se identificó, la familia de IL-6 ha aumentado considerablemente (Sehgal et al., 1989), observando entre sus características destacan funciones pleiotrópicas en la respuesta inmune, en la hematopoyesis, en el metabolismo óseo y el cáncer; además, la IL-6 ha demostrado estar vinculada con con el riesgo y la patogenia de la periodontitis y tiene un efecto proinflamatorio sobre la respuesta inmune adaptativa implicando el desarrollo de células plasmáticas y la producción de inmunoglobulinas y participa también en la diferenciación de los osteoclastos y la resorción ósea. La expresión de esta IL en los inicios de la periodontitis parece ser clave en la fase temprana y aguda de esta enfermedad. Asimismo, la presencia del polimorfismo IL-6 174G / C de la IL-6 está asociado con una mayor susceptibilidad a la periodontitis crónica. Sin embargo, la que IL-11 y la IL-3567 parecen tener funciones antiinflamatorias (Jones et al., 2010; Lin et al., 2015; Hasegawa et al., 2016; Zhu et al., 2016; De Benedetti et al., 2006; Wu et al., 2017; Jones et al., 2018). La IL-6 se secreta a partir de muchos tipos de células inmunitarias activadas, incluyendo células dendríticas (DC), macrófagos, células B y células T, y células no inmunes, incluidos fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales (Bettelli et al., 2006; Duhen et al., 2009; Heink et al., 2017); además, es capaz de unirse a monocitos y linfocitos (Kang et al., 2019). La producción de IL-6 puede desencadenarse por la LOURDES NÓVOA GARRIDO 112 aumento en la progresión de la periodontitis, estimándose que los fumadores tienen un mayor riesgo de sufrir periodontitis avanzada, una respuesta más pobre al tratamiento periodontal y una mayor frecuencia de recurrencia de la periodontitis (Leite et al., 2018). Cuanto mayor es el consumo más empeora el estado periodontal, incluso en pacientes incluidos en programas de mantenimiento, con un incremento significativo de bolsas periodontales con un sondaje de 5 mm o superior (Matuliene et al., 2008). La periodontitis afecta a todos los grupos etarios, pero son los pacientes de mayor edad los que habitualmente requieren un manejo más complejo, en buena medida por el consumo crónico de múltiples fármacos (polifarmacia). Por ejemplo, determinados principios activos como los bloqueantes de los canales de calcio pueden provocar agrandamientos gingivales (Seymour, 2006), mientras que los antidepresivos inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina reducen la pérdida de inserción clínica y la reabsorción del hueso alveolar en pacientes con periodontitis (Hakam et al., 2021). Como ya hemos señalado, algunas afecciones sistémicas como las enfermedades coronarias, los partos prematuros con neonatos de bajo peso y la artritis reumatoide, podrían estar condicionados por la composición de la microbiota oral (Kumar, 2013; Maddi & Scannapieco, 2013; Hajishengallis, 2015). En el caso de la artritis reumatoide, la enzima peptidilarginina deiminasa (PPAD), producida exclusivamente por P. gingivalis, puede citrulinar proteínas del huésped, que luego inducirán la producción de autoanticuerpos (Potempa et al., 2017). Introducción 113 Los pacientes diabéticos tienen un riesgo 2 ó 3 veces mayor de desarrollar periodontitis que la población general (Preshaw et al., 2019); a menudo presentan signos clínicos y radiográficos de periodontitis avanzada, incluyendo inflamación gingival, aumento de bolsas periodontales y de pérdida de inserción, así como pérdida ósea severa y edentulismo prematuro. Se ha demostrado que los pacientes con diabetes mal controlada tienen un mayor riesgo de presentar periodontitis severa (Tsai et al., 2002), y que existe una relación bidireccional entre la diabetes y la periodontitis, afectando negativamente la inflamación gingival a los niveles de glucemia (Preshaw et al., 2012). El término enfermedad cardiovascular incluye trastornos ateroscleróticos que afectan principalmente a las arterias coronarias, el árbol cerebrovascular y la circulación vascular periférica (Sanz et al., 2020). Algunos procesos morbosos de carácter crónico e inmuno-inflamatorio como la artritis reumatoide, la psoriasis, el lupus eritematoso sistémico y la periodontitis, incrementan significativamente el riesgo de presentar eventos cardiovasculares (Roth et al., 2015). Se ha señalado que las formas avanzadas de periodontitis se asocian de forma significativa e independiente con una mayor mortalidad de origen cardiovascular (Linden et al., 2012; Sharma et al., 2016); para explicar esta relación se han propuesto diversos mecanismos como las bacteriemias recurrentes, un incremento sustancial de la proteína C reactiva y el estrés oxidativo (Schenkein & Loos, 2013). Se ha argumentado que esta asociación entre la periodontitis y determinadas enfermedades sistémicas podría explicarse por la capacidad de muchos microorganismos orales para alterar el estado inmune del hospedador y para trasladarse LOURDES NÓVOA GARRIDO 114 desde el entorno oral a otras zonas de la economía (Cugini et al., 2013; Whitmore & Lamont, 2014; Atanasova & Yilmaz, 2014). 1.1.4. Clasificación de la periodontitis La información disponible de carácter epidemiológico, etiológico y patogénico de la periodontitis, ha obligado a introducir modificaciones en su clasificación (Armitage et al., 1999), para poder incorporar los nuevos conocimientos y facilitar el diagnóstico de sus diferentes formas de presentación (Papapanou et al., 2018). Según la Organización Mundial de la Salud, «La salud es un estado de completo bienestar físico, mental y social, y no solamente la ausencia de afecciones o enfermedades» (WHO, 1948); de acuerdo con esta definición, la salud periodontal se definiría como la ausencia de enfermedad clínica, sin signos de inflamación, concomitante a un estado inmunoinflamatorio de homeostasis (Chapple et al., 2018). La inflamación gingival es uno de los indicadores clave para determinar la salud del periodonto, si bien se considera que una leve inflamación gingival y por tanto la presencia de un mínimo sangrado asociado con un infiltrado inflamatorio, pueden ser compatibles con este estado de eubiosis (Chapple et al., 2018). La gingivitis es una afección inflamatoria del periodonto derivada del acúmulo de placa dental de forma sostenida a nivel del margen gingival del diente, cuya remisión a un estado de salud es posible de forma completa al eliminar este agente causal (Loe et al., 1965); la higiene oral se considera una medida de prevención primaria de la enfermedad periodontal, ya que aplicando medidas de higiene es posible mantener un buen Introducción 115 estado de salud periodontal a largo plazo, evitando la progresión de gingivitis a periodontitis (Schroeder & Lindhe, 1975; Ramseier et al., 2017). La periodontitis es una enfermedad inflamatoria asociada a la presencia de bacterias y a la respuesta inmune del huésped ante estos patógenos; su definición ha cambiado recientemente, enfocándose en simplificar y especificar mejor sus diferentes formas clínicas, incorporando para ello estadios y grados que reflejen la severidad y la extensión del proceso así como su complejidad, lo que permite estimar el riesgo de progresión y su impacto potencial sobre la salud (Tonetti et al., 2018). En esta nueva clasificación de las enfermedades periodontales, a diferencia de la anterior (Armitage et al., 1999), atendiendo a su fisiopatología se han identificado 3 formas diferentes de periodontitis: periodontitis propiamente dicha, periodontitis necrotizante y periodontitis como manifestación directa de una condición sistémica (Tonetti et al., 2018). 1.1.4.1 Periodontitis como manifestación de una condición sistémica La presencia de periodontitis concomitantemente con determinadas condiciones sistémicas, obligó a considerar esta situación en la clasificación de las enfermedades periodontales de 1999 (Armitage et al., 1999), y su importancia se ha mantenido hasta la clasificación actual (Jepsen et al., 2018). Existen determinadas enfermedades o condiciones sistémicas asociadas a una mayor destrucción de tejido periodontal, condicionada por la inflamación que se genera en la periodontitis, que se han clasificado en desórdenes de origen genético y no genético (Albandar et al., 2018). LOURDES NÓVOA GARRIDO 116 Entre las alteraciones no genéticas se incluyen las inmunodeficiencias adquiridas (como la infección por VIH), algunas enfermedades inflamatorias como la epidermólisis bullosa o la artritis reumatoide, y otros desórdenes que pueden alterar la patogénesis de las enfermedades periodontales como el estrés emocional, la depresión y el consumo de tabaco (Albandar et al., 2018). En cuanto a las alteraciones genéticas, cabe destacar las que afectan a la mucosa oral, al tejido conectivo y las alteraciones metabólicas y endocrinas como la diabetes mellitus, entre otras. Sin embargo, también existen condiciones genéticas que provocan una alteración a nivel inmunológico con repercusión en los tejidos periodontales, como el síndrome de Papillon- Lefèvre, la neutropenia cíclica o el síndrome de Down (Albandar et al., 2018). 1.2. SÍNDROME DE DOWN Y PERIODONTITIS El síndrome de Down (SD) es una enfermedad genética causada principalmente por la presencia de un cromosoma extra en el par 21 ⎯trisomía 21⎯ (Lejeune et al., 1959). Los pacientes con SD tienen un fenotipo característico asociado con discapacidad intelectual (Abanto et al., 2011), que a menudo coexiste con trastornos inmunológicos y otras complicaciones sistémicas, como cardiopatías congénitas, disfunción tiroidea y determinadas manifestaciones orales. Las personas con SD tienen una mayor prevalencia y presentan formas más severas de periodontitis que la población general (Khocht & Albandar, 2014), aunque no se ha alcanzado un consenso definitivo sobre esta afirmación (Amano et al., 2000; Cavalcante et al., 2012; Scalioni et al., 2018). En muchos Introducción 117 pacientes se observa una pérdida de inserción periodontal a temprana edad, que podría deberse a alteraciones inmunológicas que comprometen la modulación de la expresión de determinadas moléculas proinflamatorias (Cavalcante et al., 2012), que son inherentes a esta condición y que aumentan la predisposición a infecciones (Ram & Chinen, 2011). Se ha confirmado que existe una relación entre ciertas subpoblaciones de linfocitos T y algunas metaloproteinasas (tipos 3, 8 y 9) que podrían inducir la proliferación de células linfoides y aumentar el riesgo de pérdida de estructuras periodontales de soporte (Tsilingaridis et al., 2014). Además, podrían inhibir la acción de reguladores endógenos que ejercen una función negativa sobre la inflamación; en este sentido, se ha constatado una atenuación de la expresión de genes que codifican la expresión de estos reguladores como el de la IL-10 (Cavalcante et al., 2012) y el del interferón (Tanaka et al., 2012). Teniendo como referencia la clasificación actual de las enfermedades periodontales (Caton et al., 2018), la periodontitis en individuos con SD se etiquetaría como una “periodontitis como manifestación de una enfermedad o condición sistémica”, dado que este trastorno genético es una condición sistémica que afecta al curso de la enfermedad periodontal, favoreciendo la aparición temprana de una periodontitis severa (Jepsen et al., 2018). En estos pacientes, se ha sugerido que una microbiota subgingival específica (Khocht et al, 2012; Martinez-Martinez et al., 2013), junto con una respuesta alterada del huésped ⎯inherente a este síndrome⎯ (Khocht et al., 2014), podrían inducir una situación de disbiosis que favorecería el desarrollo de la periodontitis (Hajishengallis & Lamont, 2012. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS . 121 2 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS Existe escasa evidencia científica de una microbiota subgingival específica en pacientes con SD con periodontitis, y los pocos estudios microbiológicos disponibles han reportado resultados contradictorios. Algunos investigadores han descrito un patrón microbiológico característico, en el que Tannerella forsythia es la especie bacteriana predominante, seguida de Treponema denticola y Porphyromonas gingivalis, con una prevalencia significativamente mayor en los pacientes con periodontitis que en los periodontalmente sanos (Martinez- Martinez et al., 2013). Sin embargo, en otros estudios no se confirmó un patrón específico de la microbiota (Khocht et al., 2012). Estas diferencias podrían deberse a la heterogeneidad de las tecnologías aplicadas para la identificación la bacteriana, que van desde los cultivos tradicionales a las sondas de ADN, la hibridación ADN-ADN en tablero de ajedrez (Khocht et al., 2012) y la reacción en cadena de la polimerasa (Martinez- Martinez et al., 2013). Aunque estos métodos son muy específicos, no son lo suficientemente sensibles para detectar una concentración reducida de unidades formadoras de colonias bacterianas y no permiten identificar un número considerable de especies bacterianas. En consecuencia, en el presente trabajo se plantean los siguientes objetivos: LOURDES NÓVOA GARRIDO 128 Las evaluaciones clínicas no se realizaron en entornos profesionales (clínicas/sillones dentales), sino en espacios cotidianos habilitados para tal fin (ej. sillas convencionales en los talleres de los centros); esto, junto con la condición específica de los participantes en términos de cooperación, impidió realizar una evaluación clínica de la boca completa y un registro radiográfico. Se realizó un examen oral registrando el número y el tipo de dientes remanentes, aplicando la nomenclatura de la Federación Dental Internacional (FDI). Se evaluó el estado periodontal para determinar la presencia/ausencia de salud gingival en las localizaciones seleccionadas. Debido a las limitaciones de colaboración por parte de algunos participantes, para minimizar la duración de la exploración la exploración se limitó a los 6 “dientes de Ramfjord”, que atendiendo a su posición según la nomenclatura de la FDI se corresponden con: 16, 21, 24, 36, 41 y 44 (Ramfjord, 1959). En 4 localizaciones de cada diente (distal, vestibular, mesial y lingual/palatino) se registraron las siguientes variables clínicas: _ Índice de placa. Se valoró la presencia/ausencia (sí/no) de placa dental visible alrededor del diente (IP) (O`Leary, 1972). _ Presencia/ausencia (sí/no) de supuración (S). Las siguientes mediciones se realizaron utilizando una sonda periodontal. _ Profundidad de sondaje (PS). Definida como la distancia desde el fondo de la bolsa periodontal hasta el margen gingival de cada localización. Se midió mediante el uso de una sonda periodontal (PCP UNC15), ejerciendo una fuerza no superior a los 20-25g y su valor se expresó en milímetros. Material y métodos 129 _ Sangrado al sondaje (SS). Se registró la presencia/ausencia (sí/no) de sangrado a los 15-30s tras el sondaje de cada localización con una sonda periodontal (PCP UNC15), ejerciendo una fuerza no superior a los 20-25g (Ainamo & Bay, 1975). _ Recesión (REC). Se definió como la distancia desde el margen gingival a la línea amelocementaria. _ Pérdida de inserción clínica (PIC). Se calculó en base a los valores de los registros PS y REC. Con la finalidad de garantizar la fiabilidad de los registros clínicos cuantitativos se realizó una calibración previa del investigador asignado y se analizó el coeficiente de correlación intraclase (CCI). La calibración se alcanzó a través de varias sesiones en las que se efectuaron mediciones repetidas, hasta que el investigador clínico demostró un CCI superior a 0,75 en todas las variables periodontales analizadas; finalmente, el valor medio del CCI fue de 0,87 (intervalo de confianza del 95%= 0,75-0,98). Aplicando las definiciones modificadas de “caso” propuestas en el marco de la “Clasificación de Enfermedades y Condiciones Periodontales y Periimplantarias” (Caton et al., 2018), el grupo de estudio se categorizó como: _ Síndrome de Down periodontalmente sanos (SD-S): PS< 4 mm y SS detectado en no más de dos localizaciones (menos del 10% del total) (Chapple et al., 2018). _ Síndrome de Down con gingivitis (SD-G): PS< 4 mm y SS detectado en más de dos localizaciones (más del 10% del total) (Chapple et al., 2018). _ Síndrome de Down con periodontitis (SD-P): PS ≥ 4 mm en al menos una localización (Tonetti et al., 2018). LOURDES NÓVOA GARRIDO 130 3.4. RECOLECCIÓN DE MUESTRAS Y ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 3.4.1. Recolección de muestras de biopelícula subgingival Se recolectaron muestras subgingivales de 4 localizaciones por cuadrante, seleccionadas en base a criterios clínicos, concretamente las que tenían una PS más profunda con SS (Mombelli et al., 1991). La toma de las muestras se realizó después de aislar la zona mediante rollos de algodón y retirar la biopelícula (o en su caso el sarro) supragingival. A continuación, se insertaron 2 puntas de papel estériles de tamaño mediano (Maillefer, Ballaigues, Suiza) consecutivamente en cada localización seleccionada lo más subgingivalmente posible durante 10 s (Mombelli et al., 1991). Las 8 puntas de papel se agruparon en un vial que contenía 1,5 mm de fluido de transporte reducido (RTF) (Syed & Loesche, 1972) y se enviaron al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Odontología de la Universidad Complutense de Madrid (España), para ser procesadas en el plazo de 24 h. 3.4.2. Procesamiento microbiológico mediante cultivo En el laboratorio, las muestras recibidas se agitaron mediante vórtex durante 2 in y se diluyeron 100 μL en 900 μL de solución salina tamponada con fosfato (la mitad del volumen se reservó para su análisis mediante reacción en cadena de la polimerasa); a continuación se realizaron diluciones seriadas (1:10) y se sembraron alícuotas de 0,1 ml del contenido de los viales en dos medios de cultivo diferentes: el medio selectivo Dentaid-1 para la detección de A. actinomycetemcomitans (Alsina et al., 2001) y un medio agar sangre no selectivo (Blood Agar Base, Oxoid, Basingstoke, Inglaterra), suplementado con Material y métodos 131 hemina (5 mg / L) (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), menadiona (1 mg / L) (Merck, Darmstadt, Alemania) y 5% de sangre de caballo estéril (Oxoid), para la detección de los patógenos periodontales diana, incluyendo Capnocytophaga spp., C. rectus, E. corrodens, F. nucleatum, P. gingivalis, P. intermedia, P. micra, T. forsythia, A. odontolyticus y para efectuar un recuento total de bacterias anaerobias. Las placas de agar sangre no selectivas se incubaron de 7 a 14 días de forma anaeróbica (80% N2, 10% CO2 y 10% H2). A partir de estas placas, la identificación bacteriana se basó en la tinción de Gram y la morfología celular, la aerotolerancia, la producción de catalasa, y la aplicación de pruebas bioquímicas estándar (RapID ™ ANA II System, Remel, Lenexa, KS, EE. UU.). Para la detección de A. actinomycetemcomitans crecidos en medio selectivo Dentaid-1, las muestras se incubaron durante 3 días en aerobiosis con 5% de CO2 a 37 °C. La identificación se basó en la morfología típica de su colonia (estructura interna en estrella), su reacción catalasa positiva y el uso de una serie de enzimas específicas (RapID™ NH System, Remel, Lenexa, KS, USA). Se calcularon los recuentos totales y los recuentos de colonias representativas en las placas más adecuadas. Las colonias sospechosas se identificaron mediante microscopía, tinción de Gram y actividad enzimática. Los recuentos se expresaron en unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) de la muestra original. LOURDES NÓVOA GARRIDO 132 3.4.3. Procesamiento microbiológico mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa • Extracción del ADN genómico total El ADN total se extrajo de las muestras subgingivales utilizando un kit comercial (MolYsis Complete 5, Molzym Gmbh & Co. KG. Bremen, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante (se siguió el protocolo para la extracción de ADN bacteriano desde el paso 6, evitando las fases preliminares). El ADN extraído se eluyó en 100 µL de agua destilada estéril (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania) y se congeló a -20 ºC para su posterior análisis. • Reacción en cadena de la polimerasa Para detectar y cuantificar el ADN bacteriano se utilizó la tecnología de PCR cuantitativa múltiple (qPCR) (Marin et al., 2019). La secuencia de los cebadores y las sondas utilizadas para A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis y T. forsythia, dirigidas contra el gen 16S rRNA ya se ha detallado previamente (Boutaga et al., 2003; 2005). La amplificación por PCR se realizó en un volumen total de mezcla de reacción de 10 µL, que incluía 5 µL de mezcla maestra de 2 TaqMan (LC 480 Probes Master, Roche Diagnostic GmbH), concentraciones óptimas de cebadores y sonda de hidrólisis (300, 300 y 200 nM para A actinomycetemcomitans; 300, 300 y 300 nM para P. gingivalis; 300, 300 y 200 nM para T. forsythia) y 2,5 µL de ADN de las muestras. El control negativo consistió en 2,5 µl de agua estéril. Las muestras se sometieron a un ciclo de amplificación inicial de 95ºC durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95ºC durante 15s y 60ºC durante 1 min en termociclador LightCycler® 480 II (Roche Diagnostic GmbH). Cada muestra de ADN se analizó por duplicado. Material y métodos 133 Todos los ensayos se realizaron utilizando curvas de calibración con un rango de detección cuantitativa lineal establecido por el rango de pendiente de 3,3–3,6 ciclos/década logarítmica, r2> 0,997 y un rango de eficiencia de 1,9–2,0. La cuantificación se basó en curvas estándar, que se construyeron trazando los valores del ciclo de punto de cruce generados a partir de qPCR frente a ADN extraído de diluciones seriadas 10 veces de ADN genómico purificado de cada bacteria (log UFC/ml). 3.4.4. Procesamiento microbiológico mediante secuenciación de última generación Para aplicar la secuenciación de última generación (Por sus siglas en inglés NGS), se seleccionaron 50 muestras al azar procedentes de los participantes que tenían un fenotipo periodontal extremo, 25 de individuos con periodontitis y 25 periodontalmente sanos, y se procesaron mediante la técnica Illumina® Sequencing (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). • Secuenciación de genes de ARNr 16S Después de extraer el ADN genómico aplicando la metodología descrita en la sección previa, se procedió a su análisis mediante la secuenciación de la región hipervariable del gen V3-V4 del ARNr 16S utilizando el sistema MiSeq (Illumina, San Diego, CA, EE.UU.). La selección de la región V3- V4 se basó en el hecho de que proporciona una caracterización más precisa de las muestras de microbioma que V1-V2 (Teng et al., 2018) y V1-V3 (Fouhy et al., 2016). Los amplicones del gen 16S ADNr se obtuvieron aplicando el protocolo Illumina de preparación de la biblioteca de secuenciación metagenómica del gen 16S ADNr (Cod. 15044223 Rev. A: Illumina). A las LOURDES NÓVOA GARRIDO 134 secuencias específicas del gen se añadieron secuencias de nucleótidos que sobresalen del adaptador de Illumina. Los cebadores se seleccionaron siguiendo las recomendaciones de Klindworth et al. (2013) [Cebador directo= 5J TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG; Cebador inverso= 5J GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATCC]. Se empleó ADN genómico microbiano (5 ng/µl en Tris 10 mM pH 8,5) para iniciar el protocolo. Después de la amplificación del gen de ADNr 16S, la etapa de multiplexación se realizó utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT (FC-131-1096; Illumina). Analizamos 1 µL del producto de PCR en un chip Bioanalyzer DNA 1000 para verificar el tamaño. A continuación, las bibliotecas se secuenciaron utilizando una serie de dos pares de 300 pb (kit de reactivos MiSeq v3 [MS-102-3001]); Illumina) en un secuenciador MiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina). La evaluación de la calidad se realizó mediante el programa prinseq-lite (Schmieder et al., 2011). Los datos se obtuvieron mediante una canalización ad hoc escrita en el entorno RStatistics (R Core Team, 2012), haciendo uso de varias bibliotecas de código abierto. Los datos se agruparon y estratificaron según el archivo de metadatos proporcionado por el usuario. El análisis se realizó en la Fundación para la Promoción de la Salud y la Investigación Biomédica (FISABIO) de la Comunitat Valenciana, Valencia, España. Material y métodos 135 • Asignación taxonómica Se analizaron los datos de secuencia obtenidos de MiSeq utilizando el cebador QIIME2 (Caporaso, et al., 2010). En resumen, la eliminación de ruido, la unión de extremos emparejados y el agotamiento de quimeras se realizaron a partir de datos de extremos emparejados utilizando el cebador DADA2 (Callahan et al., 2016). Las afiliaciones taxonómicas se asignaron utilizando el clasificador bayesiano ingenuo integrado en los complementos QIIME2, utilizando un umbral de similitud del 97%. La base de datos utilizada para esta asignación taxonómica fue SILVA_release_132 (Quast et al., 2013). 3.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Para el análisis de los datos se utilizó el software estadístico IBMR SPSS Statistics 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EE.UU.). Se propusieron como variables principales de resultado los recuentos bacterianos y la frecuencia de detección de cada especie diana. No se pudo realizar un cálculo del tamaño muestral ante la heterogeneidad de los resultados microbiológicos obtenidos en investigaciones previas. Por tanto, se seleccionó una muestra de conveniencia, ostensiblemente mayor que las de los estudios publicados hasta la fecha: 30 pacientes con SD y periodontitis (Klindworth et al., 2013), o bien 40 (Fouhy et al., 2016), 67 (Wang et al., 2013) o 70 (Caporaso et al., 2010) sujetos con SD independientemente de su estado de salud gingival. Las variables clínicas de las localizaciones seleccionadas en los dientes de Ramfjord y las proporciones de los patógenos LOURDES NÓVOA GARRIDO 136 diana, se expresaron como medias y desviación estándar (DE). La unidad de análisis fue el paciente. Los resultados de las variables microbiológicas cuantificables se expresaron como la mediana ⎯con su rango intercuartílico (RIC) ⎯ o la media ⎯con su DE⎯ de los valores de UFC/ml. Para determinar la normalidad de la distribución, se realizó la prueba de Shapiro-Wilk (en grupos con tamaños muestrales por debajo de 30) o la prueba de Kolmogorov-Smirnov (en grupos con un tamaño muestral mayor a 30). Las diferencias entre los 3 grupos (SD-S, SD-G y SD-P) se compararon mediante el test ANOVA de una vía o el test de Kruskal-Wallis para las variables cuantitativas, y se emplearon los test de Chicuadrado o Fisher para las variables categóricas. El nivel de significación estadística se estableció en p< 0,05. No fue posible calcular a priori el tamaño muestral para efectuar el análisis mediante NGS, porque no se disponía de información previa sobre microbiomas orales de individuos con SD analizados mediante esta técnica; por ello, se seleccionó una muestra de conveniencia de 25 pacientes con periodontitis y 25 periodontalmente sanos, similar a la incluida previamente por Martinez-Martinez et al. (2013) en un estudio microbiológico de periodontitis y SD que realizaron aplicando técnicas microbiológicas convencionales. En la serie seleccionada para analizar mediante NGS, se realizó un valoración de cada variable demográfica y clínica del estudio a nivel de individuo. Los datos se expresaron en forma de media y DE, prevalencia y proporciones (%). Después de evaluar la normalidad de la distribución de las variables (aplicando la prueba de Kolmogorov-Smirnov), se compararon Material y métodos 137 los resultados obtenidos entre los grupos SD-P y SD-S utilizando la prueba T de Student para las variables cuantitativas y la prueba de Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher para las variables categóricas. El nivel de significación estadística se estableció en p< 0,05. En términos de análisis de diversidad y significación, los datos obtenidos en el formato de matriz de observación biológica se sometieron a un análisis estadístico utilizando el entorno R (R Core Team, 2012). La profundidad de secuenciación de las muestras se evaluó utilizando el índice de Shannon. Se aportaron resultados descriptivos de la concentración de las principales especies bacterianas y de la composición taxonómica de la microbiota de cada muestra. Las diferencias en el contaje bacteriano entre los grupos SD-P y SD- S se analizaron mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon y Kruskal-Wallis entre varios factores de metadatos. El paquete phyloseq R permitió aplicar 4 métricas no basadas en la filogenia, a saber, las especies observadas, Chao1metric, estimadores de cobertura basados en abundancia (ACE) y el índice de Shannon para evaluar la diversidad alfa; este último representa una aproximación cuantitativa de la diversidad que existe dentro de una comunidad bacteriana. Se aplicó un análisis de coordenadas principales (PCoA) con distancias UniFrac ponderadas para evaluar la diversidad beta, que representa una aproximación cuantitativa de la diversidad compartida entre distintas comunidades bacterianas. LOURDES NÓVOA GARRIDO 144 Tabla 2.Características demográficas del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. SD-S ( n = 62) SD-G (n= 34) SD-P ( n = 28) ANOVA valores p Edad media DE min max media DE min max media DE min max todo SD-S SD-G SD-P años 21,4 7,5 6 40 22,6 6,0 11 34 27,9 7.2 10 42 <0,01* 1,00 0,01* <0,01* Sexo fem. masc. % fem. % masc. fem. masc. % fem. % masc. fem. masc. % fem. % masc. todo SD-S SD-G SD-P n (sujetos) 27 35 43,5% 56,5% 18 15 54,5% 45,5% 10 18 35,7% 64,3% 0,33 0,92 0,42 1,45 Nº Cond. Sist. 0 0 ≥ 2 % 0 % 0 % ≥ 2 0 0 ≥ 2 % 0 % 0 % ≥ 2 0 1 ≥ 2 % 0 % 0 % ≥ 2 todo SD-S SD-G SD-P n (sujetos) 31 18 13 50,0% 29,0% 21,0% 13 15 6 38,2% 44,1% 17,7% 17 9 2 60,7% 32,1% 7,1% 0,52 1,51 0,53 1,48 Cond. Espec. n (sujetos) n (no) n (sí) % (no) % (sí) n (no) n (sí) % (no) % (sí) n (no) n (sí) % (no) % (sí) todo SD-S SD-G SD-P Cardiovascular 62 0 100,0% 0,0% 34 0 100,0% 0,0% 27 1 96,4% 3,6% 0,22 1,35 0,93 Cardiopatías 55 7 88,7% 11,3% 30 4 88,2% 11,8% 23 5 82,1% 17,9% 0,69 3,00 2,16 1,51 Hipotiroidismo 36 26 58,1% 41,9% 19 15 55,9% 44,1% 25 3 89,3% 10,7% 0,01* 2,51 0,01* 0,01* Toma tiroxina 37 25 59,7% 40,3% 20 14 58,8% 41,2% 25 3 89,3% 10,7% 0,01* 2,81 0,02* 0,01* SD-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-G, síndrome de Down con gingivitis; SD-P, síndrome de Down con periodontitis; DE, desviación estándar; min,mínimo; max,máximo; Cond. Sist., condición sistémica; Cond. Espec., condición específica; fem, femenino; mas, masculino. * Valor p ≤ 0,05. Resultados 145 Tabla 3. Características clínicas del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. SD-S (n=62) SD-G (n=34) SD-P (n=28) Kruskal-Wallis Localizaciones Dientes de Ramfjord Localizaciones Dientes de Ramfjord Localizaciones Dientes de Ramfjord Localizaciones Dientes deRamfjord Mediana RIC Mediana RIC Mediana RIC Mediana RIC Mediana RIC Mediana RIC todo SD-G SD-P SD-S todo SD-G SD-P SD-S PB 2,00 0,25 2,04 0,17 2,25 0,50 2,10 0,26 3,25 0,75 2,68 0,63 <0,01* 0,06 <0,01* <0,01* <0,01* 0,25 <0,01* <0,01* PB proximal 2,08 0,25 2,25 0,33 3,00 0,65 <0,01* 0,07 <0,01* <0,01* REC 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,45 0,42 PIC 2,00 0,25 1,88 0,42 2,25 0,50 1,67 0,47 3,25 0,75 2,81 0,63 <0,01* 0,25 <0,01* <0,01* <0,01* 0,15 <0,01* <0,01* SS 0,0% 0,0% 4,2% 8,3% 25,0% 25,0% 25,0% 21,1% 50,0% 50,0% 35,4% 29,2% <0,01* <0,01* 0,51 <0,01* <0,01* 0,00 1,00 <0,01* IP 0,5% 0,5% 45,8% 45,8% 75,0% 50,0% 81,3% 43,8% 75,0% 43,8% 77,5% 41,7% <0,01* 0,01* 1,00 <0,01* <0,01* <0,01* 1,00 <0,01* IP inter prox. 58,3% 66,7% 85,4% 35,4% 83,3% 33,3% <0,01* <0,01* 1,00 <0,01* SD-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-G, síndrome de Down con gingivitis; SD-P, síndrome de Down con periodontitis; RIC, rango intercuartílico; PB, profundidad de bolsa; REC, recesión; PIC, pérdida de inserción clínica; SS, sangrado al sondaje; IP, índice de placa; * Valor p ≤ 0,05. LOURDES NÓVOA GARRIDO 146 4.2. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS Y CLÍNICAS DEL GRUPO EN EL QUE SE APLICÓ SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN De los 124 participantes se seleccionaron 50 con fenotipo periodontal extremo, 25 SD-S y 25 SD-P (Figura 5). No se detectaron diferencias significativas en la edad media entre ambos subgrupos (p= 0,063). La distribución por sexos fue similar y tampoco había diferencias en la prevalencia de enfermedades cardiovasculares ni de otras condiciones sistémicas. Sin embargo, el hipotiroidismo resultó más prevalente en los individuos SD-S (p= 0,008) (Tabla 4). Figura 5. Participantes en el análisis de secuenciación de última generación. SD, síndrome de Down; SD-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-G, síndrome de Down con gingivitis; SD-P, síndrome de Down con periodontitis Emparejamiento por EDAD 124 Participantes SD 99 Participantes SD 25 SD-S 25 SD-P SD-S SD-G SD-P incipiente Resultados 147 Tabla 4. Características demográficas y médicas del subgrupo de estudio que participó en el análisis de secuenciación de última generación. Muestra total SD-S SD-P p* Edad (años) Media(SD) 26,8 (6,56) 25,1 (6,18) 28,6 (6,61) 0,063 Sexo Masculino, n (%) 29 (58) 14 (56) 15 (60) 0,774 Femenino, n (%) 21 (42) 11 (44) 10 (40) 0,774 Condición sistémica Alguna, n (%) 21 (42) 11 (44) 10 (40) 0,774 Enfermedad cardíaca, n (%) 6 (12) 1 (4) 5 (20) 0,189 Hipotiroidismo,n (%) 12 (24) 10 (40) 2 (8) 0,008 Toma tiroxina, n (%) 12 (24) 10 (40) 2 (8) 0,008 Otras condiciones, n (%) 6 (12) 3 (12) 3 (12) 1,000 SD-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-P, síndrome de Down con periodontitis Los parámetros clínicos periodontales fueron significati– vamente diferentes entre los grupos SD-P y SD-S (p< 0,001) para las variables PB, SS, PIC e IP (Tabla 5). Tabla 5. Parámetros clínicos periodontales del subgrupo de estudio que participó en el análisis de secuenciación de última generación. Muestra total SD-S SD-P P * Media DE Media DE Media DE PB 2,39 0,47 2,07 0,11 2,72 0,47 <0,0001 PIC 2,45 0,59 2,08 0,13 2,81 0,65 <0,0001 REC 0,08 0,25 0,02 0,06 0,14 0,35 0,0985 SS 19,9 17,8 7,7 7,7 32,2 16,7 <0,0001 IP 56,5 31,5 41,8 30,3 71,2 25,8 0,0006 SD-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-P, síndrome de Down con periodontitis; DE, desviación estándar; PB, profundidad de bolsa; PIC, pérdida de inserción clínica; REC, recesión; SS, sangrado al sondaje; IP, índice de placa LOURDES NÓVOA GARRIDO 148 4.3. ANÁLISIS DE LA MICROBIOTA SUBGINGIVAL APLICANDO TÉCNICAS CONVENCIONALES A continuación se describen solo someramente los resultados obtenidos mediante el cultivo y la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa, ya que han sido objeto de un análisis más exhaustivo en otro trabajo ajeno a esta tesis doctoral. • Cultivo Los recuentos anaeróbicos totales fueron significativamente más altos en SD-P que en SD-S (p< 0,01). Sólo 4 especies bacterianas consideradas “especies diana” (P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia y E. corrodens) mostraron un aumento general en la frecuencia de detección, recuentos y proporciones, a medida que empeoraba el estado periodontal. Los mayores recuentos y proporciones de P. micra y A. odontolyticus se detectaron en SD-S. C. rectus y Capnocytophaga spp. presentaron mayores recuentos, proporciones y frecuencias en SD-G. A. actinomycetemcomitans no se detectó en ninguna de las muestras analizadas con los métodos de cultivo utilizados. Finalmente, en SD-P las frecuencias de detección, proporciones y recuentos de E. corrodens fueron significativamente mayores que en SD-S (p= 0,01, p= 0,01 y p= 0,01, respectivamente) (Tabla 6). Resultados 149 Tabla 6. Análisis mediante cultivo de la microbiota subgingival del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. SD-S (n= 62) SD-G (n= 34) SD-P (n= 28) Recuentos (Valor p) Frecuencia de detección (Valor p) Recuento (UFC/ml) Mediana RIC n (+) Prev. Mediana RIC n (+) Prev. Mediana RIC n (+) Prev. Todo Todo SD-S SD-G SD-P Anaerobios totales 1.435.000 1.617.500 1.735.000 2.402.500 4.065.000 4.957.500 < 0,01* A. actinomycetemcomitans 0 0 62 0 0,0% 0 0 34 0 0,0% 0 0 28 0 0,0% P. gingivalis 0 0 62 11 17,7% 0 0 34 7 20,6% 0 7505 28 8 28,6% 0,37 0,50 2,20 1,40 0,73 P. intermedia 0 625 62 22 35,5% 0 1250 34 14 41,2% 600 9000 28 15 53,6% 0,13 0,27 1,74 0,99 0,32 T. forsythia 580.645 0 62 1 1,6% 0 60.000 34 3 8,8% 0 0 28 2 7,1% 0,23 0,21 0,38 3,00 0,68 P. micra 0 0 62 4 6.5% 0 0 34 2 5.9% 0 0 28 0 0,0% 0,40 0,20 3,00 1,49 0,92 F. nucleatum 20.000 33.250 62 60 96,8% 20.000 68.125 34 29 85,3% 20.000 27.750 28 27 96,4% 0,99 0,10 0,28 0,63 3,00 C. rectus 0 0 62 3 4,8% 0 0 34 4 11,8% 0 0 28 2 7,1% 0,47 0,48 0,72 2,04 1,93 E. corrodens 0 0 62 8 12,9% 0 0 34 6 17,6% 0 10.000 28 11 39,3% 0,01* 0,01* 1,67 0,17 0,01* Capnocytophaga spp. 0 0 62 6 9,7% 0 0 34 7 20,6% 0 0 28 3 10,7% 0,25 0,32 0,63 1,47 3,00 A. odontolyticus 0 0 62 5 8,1% 0 0 34 1 2,9% 0 0 28 1 3,6% 0,54 0,49 1,25 1,47 1,98 UFC, unidades formadoras de colonias/mililitro; SD-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-G, síndrome de Down con gingivitis; SD-P, síndrome de Down con periodontitis; RIC, rango intercuartílico; n, número de muestras; (+), muestras con detección de patógeno; prev., frecuencia de detección del patógeno diana; A. actinomycetemcomitans, Aggregatibacter actinomycetemcomitans; P. gingivalis, Porphyromonas gingivalis; T. forsythia, Tannerella forsythia; P. micra, Parvimonas micra; F. nucleatum, Fusobacterium nucleatum; C. rectus, Campylobacter rectus; E. corrodens, Eikenella corrodens; A. odontolyticus, Actinomyces odontolyticus. LOURDES NÓVOA GARRIDO 150 • Reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) Los recuentos bacterianos obtenidos mediante qPCR fueron significativamente más altos en SD-P que en SD-S (p= 0,01) y SD-G (p= 0,02) (Tabla 7). La frecuencia de detección y los recuentos de A. actinomycetemcomitans fueron exiguos en todos los subgrupos (SD-S, SD-G y SD-P); aunque en números absolutos sus frecuencias y recuentos resultaron mayores en individuos con periodontitis, las diferencias no fueron estadísticamente significativas. P. gingivalis, también mostró frecuencias y recuentos aparentemente mayores en SD-P, pero las diferencias con respecto a los otros dos subgrupos no fueron estadísticamente significativas. Se detectaron frecuencias elevadas de T. forsythia en todos los subgrupos (67,9% en SD-P, 47,0% en SD-G y 48,8% en SD-S), pero estas no alcanzaron diferencias estadísticamente significativas; sin embargo, los recuentos bacterianos fueron mayores en SD-P que en SD-G (p= 0,02) y que en SD-S (p= 0,01). Resultados 151 Tabla 7. Análisis mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR) de la microbiota subgingival del grupo de estudio en conjunto y distribuido en subgrupos en base al estado de salud periodontal. Muestra total (n= 124) Recuentos (UFC/ml) media DE n (+) prev. A. actinomycetemcomitans 6857 41,713 124 11 8,87% P. gingivalis 64.064 458.060 124 15 12,10% T. forsythia 342.644 1.755.259 124 65 52,42% SD-S ( n = 62) SD-G ( n = 34) SD-P ( n = 28) Recuentos (UFC/ml) media DE n media DE n media DE n A. actinomycetemcomitans 406 2077 62 5601 22.125 34 22.668 83.438 24 P. gingivalis 5591 35.883 62 6396 33.297 34 263.564 947.768 23 T. forsythia 88.497 249.908 62 45.934 99.763 34 1.265.688 3.569.224 9 SD-S ( n = 62) SD-G ( n = 34) SD-P ( n = 28) Recuentos (Valor p Kruskal-Wallis) Frecuencia de detección (Valor p ) Recuentos (UFC/ml) mediana RIC n (+) prev. mediana RIC n (+) prev. mediana RIC n (+) prev. todo SD-S SD-G SD-P todo SD-S SD-G SD-P A. actinomycetemcomitans 0 0 62 4 6,45% 0 0 34 3 8,82% 0 0 24 4 14,29% 0,41 0,51 2,09 2,07 0,75 P. gingivalis 0 0 62 6 9,68% 0 0 34 4 11,76% 0 0 23 5 17,86% 0,41 0,56 2,22 2,16 0,92 T. forsythia 0 15.625 62 30 48,39% 0 17.875 34 16 47,06% 22.350 1.372.000 9 19 67,86% 0,01* 1,00 0,02* 0,01* 0,18 2,70 0,30 0,26 UFC, unidades formadoras de colonias/mililitro; DE, desviación estándar; A. actinomycetemcomitans, Aggregatibacter actinomycetemcomitans; P. gingivalis, Porphyromonas gingivalis; T. forsythia, Tannerella forsythia; n, número de muestras; (+), muestras con detección de patógeno; prev., frecuencia de detección del patógeno diana; RIC, rango intercuartílico; D-S, síndrome de Down periodontalmente sano; SD-G, síndrome de Down con gingivitis; SD-P, síndrome de Down con periodontitis. LOURDES NÓVOA GARRIDO 152 4.4. ANÁLISIS DE LA MICROBIOTA SUBGINGIVAL APLICANDO SECUENCIACIÓN DE ÚLTIMA GENERACIÓN Tras la extracción de ADN y la amplificación por PCR, se secuenciaron las muestras subgingivales. Después del filtrado de calidad, la eliminación de ruido, la unión de extremos emparejados y el filtrado de quimeras, en el análisis se incluyeron 50 muestras (25 SD-S y 25 SD-P). Se asignaron un total de 5.623.126 de lecturas (mediana/muestra= 114.757; rango= 85.827-142.134) que se distribuyeron en unidades taxonómicas operativas (OTU). La profundidad de secuenciación fue de 2.226.567 de lecturas para SD-S y de 2.331.571 de lecturas para SD-P, resultando similar en ambos subrupos. Las OTU se clasificaron en 13 filos: Firmicutes (37,17%), Bacteroidetes (19,04%), Proteobacteria (18,20%), Fusobacteria (15,04%), Actinobacterias (3,70%), Espiroquetas (2,79%), Epsilonbacteraeota (2,10%), Patescibacterias (1,36%), Synergistetes (0,51%), Chloroflexi (0,04%), Tenericutes (0,03%), Cyanobacteria (0,02%) y Elusimicrobia (0,01%). Estos OTUS además se ordenaron en 20 clases, 41 órdenes, 75 familias, 158 géneros y 403 especies. La diversidad se resume en la Figura 6, que se generó utilizando el navegador jerárquico Krona (Ondov et al., 2011). Resultados 153 Figura 6A. Diversidad bacteriana encontrada en individuos con síndrome de Down periodontalmente sanos. A Anexo 2 257 REGISTRO DE DATOS PERIODONTALES CLÍNICOS (Dientes de Ramfjord) FECHA / / IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no M D V P IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no M D V P IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no M D V P IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no M D V P IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no M D V P IP: sí/no PS:_ _ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__ / RC:__ SS sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no IP: sí/no PS:__/ RC:__ SS: sí/no M D V P   ANEXO III REGISTRO DE MUESTRAS MICROBIOLOGÍAS PARA CULTIVO Anexo 3 261  263 ANEXO IV ARTÍCULO DERIVADO The Subgingival Microbiome in Patients with Down Syndrome and Periodontitis Lourdes Nóvoa1, María del Carmen Sánchez2, Juan Blanco1,*, Jacobo Limeres 1ORCID, Maigualida Cuenca2, María José Marín2, Mariano Sanz2, David Herrera2 ORCID andPedro Diz 1 1. Medical-Surgical Dentistry Research Group, Health Research Institute of Santiago de Compostela, University of Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain 2. Etiology and Therapy of Periodontal Diseases Research Group, University Complutense of Madrid, 28040 Madrid, Spain * Author to whom correspondence should be addressed. J. Clin. Med. 2020, 9(8), 2482; https://doi.org/10.3390/jcm9082482 Contribución específica en la publicación: Conceptualización, metodología e investigación: planteamiento y desarrollo inicial de los procesos microbiológicos. Adquisición de datos. Redacción y revisión crítica del manuscrito original. Índices de calidad: La revista donde fue publicado el artículo presenta actualmente un índice de impacto de 4.241 (2021 Journal Citation Reports), 7 citas en Scopus (revisado el 8 de febrero de 2022) y con una posición en el cuartil 1 (Q1) en la categoría General medicine and internal science. LOURDES NÓVOA GARRIDO 264 Autorización de la revista: La revista Journal of Clinical Medicine, perteneciente a la editorial MDPI (Multidisciplinary Digital Publishing Institute), en la que se ha publicado este artículo, permite la reutilización del artículo por parte de la autora como parte de su tesis: https://www.mdpi.com/openaccess Abstract Objective: To describe the subgingival microbiome of individuals with Down syndrome (DS). Methods: We conducted a cross-sectional observational study that obtained bacterial DNA samples from 50 patients with DS, 25 with periodontitis (PDS) and 25 with a healthy periodontal condition (HDS). The samples were analyzed by sequencing the 16S rRNA gene V3–V4 hypervariable region using the MiSeq System. Taxonomic affiliations were assigned using the naïve Bayesian classifier integrated in QIIME2 plugins. We evaluated the difference in bacteria abundance between the sample groups using Wilcoxon and Kruskal–Wallis tests. We evaluated the alpha diversity of the identified species using the Observed, Chao1metric, ACE and Shannon indices and evaluated beta diversity with principal coordinate analysis (registration code: 2018/510). Results: Twentyone genera and 39 bacterial species showed a significantly different abundance between the study groups. Among the genera, Porphyromonas, Treponema, Tannerella and Aggregatibacter were more abundant in the PDS group than in the HDS group, as were the less commonly studied Filifactor,  265 Fretibacterium and Desulfobulbus genera. Among the species, Porphyromonas spp. and Tannerella spp. were the most abundant in the PDS group; the most abundant species in the HDS group were Pseudomonas spp., Granulicatella spp. and Gemella spp. Conclusion: Well-recognized periodontal pathogens and newly proposed pathogenic taxa were associated with periodontitis in patients with DS. Keywords: Down syndrome; periodontitis; microbiome; microbial community; DNA sequencing https://www.mdpi.com/2077-0383/9/8/2482 LOURDES NÓVOA GARRIDO 272 J. Clin. Med. 2020,9, 2482 6of11 At the genus level, the five most abundant genera in the HDS group were Streptococcus (19.55%), Fusobacterium (6.72%), Neisseria (6.15%), Pseudomonas (5.73%) and Veillonella (4.56%) (Table 3). In contrast, Streptococcus (23.55%), Fusobacterium (7.48%), Neisseria (5.93%), Porphyromonas (4.59%) and Treponema (4.10%) were the most abundant genera in the PDS group (Table 3). The PDS group harbored higher levels of recently described new putative pathogens, such as species of the genera Filifactor, Fretibacterium and Desulfobulbus [ 27 ]. In total, 21 genera were identified with a significantly different abundance between the groups, including Paludibacteraceae F0058 (p<0.001), Tannerella (p=0.029) and Fretibacterium (p=0.0371) with a significant abundance in the PDS group compared with the HDS group, as well as Pseudomonas (p=0.0028), which were more abundant in the HDS group (Table S1). Table 3. Dominant operational taxonomic units and their proportions (in percentage) in the patients with Down syndrome and periodontitis or a healthy periodontal condition, at all taxonomic levels. Phylum Class HDS PDS HDS PDS Firmicutes 38.00 Firmicutes 44.04 Gammaproteobacteria 28.16 Bacilli 29.27 Proteobacteria 28.23 Bacteroidetes 20.23 Bacilli 26.63 Bacteroidia 20.23 Bacteroidetes 14.56 Proteobacteria 12.04 Bacteroidia 14.56 Gammaproteobacteria 11.83 Fusobacteria 9.42 Fusobacteria 11.09 Fusobacteriia 9.42 Fusobacteriia 11.09 Actinobacteria 4.11 Spirochaetes 4.10 Negativicutes 7.67 Negativicutes 8.66 Epsilonbacteraeota 2.58 Actinobacteria 3.71 Actinobacteria 4.04 Spirochaetia 4.10 Spirochaetes 1.78 Epsilonbacteraeota 2.49 Clostridia 3.65 Clostridia 6.02 Patescibacteria 1.17 Patescibacteria 1.74 Campylobacteria 2.58 Actinobacteria 3.42 Synergistetes 0.11 Synergistetes 0.39 Spirochaetia 1.78 Campylobacteria 2.49 Cyanobacteria 0.03 Chloroflexi 0.08 Gracilibacteria 0.16 Coriobacteriia 0.30 Order Family HDS PDS HDS PDS Lactobacillales 23.63 Lactobacillales 26.69 Streptococcaceae 19.56 Streptococcaceae 23.55 Betaproteobacteriales 10.60 Bacteroidales 16.02 Neisseriaceae 7.67 Veillonellaceae 8.66 Fusobacteriales 9.42 Fusobacteriales 11.09 Veillonellaceae 7.06 Fusobacteriaceae 7.48 Bacteroidales 9.40 Selenomonadales 8.66 Fusobacteriaceae 6.72 Neisseriaceae 7.23 Selenomonadales 7.67 Betaproteobacteriales 7.71 Prevotellaceae 5.75 Prevotellaceae 6.13 Pseudomonadales 5.73 Clostridiales 6.02 Pseudomonadaceae 5.73 Porphyromonadaceae 4.59 Pasteurellales 5.35 Spirochaetales 4.10 Pasteurellaceae 5.35 Spirochaetaceae 4.10 Flavobacteriales 4.87 Pasteurellales 3.5 Carnobacteriaceae 3.77 Leptotrichiaceae 3.61 Clostridiales 3.65 Flavobacteriales 3.37 Enterobacteriaceae 3.47 Pasteurellaceae 3.50 Enterobacteriales 3.47 Bacillales 2.57 Flavobacteriaceae 3.32 Flavobacteriaceae 3.16 Genus Species HDS PDS HDS PDS Streptococcus 19.56 Streptococcus 23.55 Streptococcus u. spp.a 17.83 Streptococcus u. spp. 21.48 Fusobacterium 6.72 Fusobacterium 7.48 Fusobacterium u. spp. 6.72 Fusobacterium u. spp. 7.35 Neisseria 6.15 Neisseria 5.93 Pseudomonas u. spp. 5.73 Neisseria u. spp. 4.73 Pseudomonas 5.73 Porphyromonas 4.59 Granulicatella u. spp. 3.63 Veillonella u. spp. 4.11 Veillonella 4.56 Treponema 2 4.10 Neisseria u.b. 3.28 Paludibacteraceae F0058 u. spp. 3.05 Granulicatella 3.77 Veillonella 4.10 Haemophilus u. spp. 2.59 Granulicatella u. spp. 2.86 Haemophilus 3.33 Leptotrichia 3.61 Delftia u. spp. 2.52 Porphyromonas u. spp. 2.23 Capnocytophaga 3.18 Capnocytophaga 3.16 Neisseria u. spp. 2.44 Gemella u. spp. 1.89 Gemella 2.99 Gemella 2.57 Stenotrophomonas u. spp. 2.28 Tannerella u. spp. 1.56 Leptotrichia 2.71 Granulicatella 2.91 Gemella u. spp. 1.79 Porphyromonas u. spp. 1.43 Abbreviations: HSD, Down syndrome with healthy periodontium; PSD, Down syndrome with periodontitis. Table 3shows the dominant species in both groups. Streptococcus spp. was the most abundant species in both the HDS and PDS groups (17.83% and 21.5%, respectively), followed by Fusobacterium spp. (6.72% and 7.35%, respectively). The most abundant species in the HDS group included those of the Pseudomonas,Granulicatella and Gemella genera. In the PDS group, in contrast, the most abundant species were those of the Porphyromonas and Tannerella genera. Table S1 shows the 39 bacterial species with significant differences between the HDS and PDS groups. As shown in Figure S3B, the average richness measured by the Observed, Chao1 and ACE indices was higher in the samples from the PDS group than in samples from the HDS group, although without statistical significance. The ACE and Shannon diversity indices had an identical trend. Thus, the relative abundance of each bacterium was more balanced in the samples from the HDS group than Anexo 4 273 J. Clin. Med. 2020,9, 2482 7of11 in samples from the PDS group, and there were more bacteria with low relative abundance in the samples from the PDS group. The Simpson index confirms this fact, demonstrating greater uniformity at all taxonomic levels in the HDS group, although without significant differences. To evaluate the similarity of the microbial community structure among the samples and thereby explore the relationships between the bacterial communities in the PDS and HDS groups, we performed a PCoA. The results showed a distinction between the microbial compositions of the two groups at all taxonomic levels, given that the PDS and HDS groups could not be grouped into one cluster (Figure S4). The HDS group appeared more clustered, unlike the PDS group, which appeared more dispersed. The clusters showed that dispersion was produced by 20% of the periodontitis samples, which presented a dissimilar bacterial community among all samples. 4. Discussion The present study aimed to describe (through the use of NGS) the subgingival microbiome of patients with DS and periodontitis and compare it with the microbiome of patients with DS without periodontitis. The results have shown significant differences between the oral microbiome of the HDS and PDS groups at various taxonomical levels. The PDS group harbored higher levels of well-recognized periodontal pathogens, such as Tannerella, Treponema,Porphyromonas and Aggregatibacter (p<0.05), as well as recently described new putative pathogens, such as Peptostreptococcus,Filifactor,Fretibacterium and Desulfobulbus [ 25 ], all of which demonstrated greater relative abundance at the genus level in the PDS group. In contrast, a set of bacterial species, including Veillonella,Neisseria,Gemella and Granulicatella were significantly frequent in the samples from the HDS group. These results agree with those of studies on the subgingival microbiota and microbiome in the general population [ 28 – 32 ]. However, there are some discrepancies, mainly in certain species considered compatible with periodontal health such as those from the Streptococcus and Selenomonas genera that were more abundant in the samples from the PDS group than from the HDS group. We found higher levels of alpha diversity in the PDS group when compared with the HDS group, although these differences were not statistically significant. This diversity might be associated with the patients’ reduced immune competence or with a richer environment in nutrients as a result of the onset of periodontitis, which is in line with previous studies that reported higher bacterial community diversity in different “stages” of periodontitis, when compared with individuals with a healthy periodontal condition [33–35]. Although various studies have characterized the subgingival microbiome in patients with and without periodontitis using metagenomic approaches [ 36 , 37 ], the present study is, to the best of our knowledge, the first to evaluate the subgingival microbiome of patients with DS using NGS technology. Our findings corroborate those of previous studies that reported higher mean counts of all “red complex” species and lower counts of Actinomyces in patients with periodontitis using checkerboard DNA–DNA hybridization [ 6 ], as well as a higher prevalence of Tannerella,Treponema, Porphyromonas and Aggregatibacter genera in patients with periodontitis (using PCR) [ 7 ]. It stands to reason that the analysis performed using NGS in the present study not only corroborates the results using other techniques but also makes the techniques more comprehensive because the use of NGS techniques results in high throughputs, enabling the processing of thousands or even millions of sequences, which can result in the inaccurate identification of microbial taxa, including uncultivable organisms and those present in small numbers. The results from this study, however, also present certain limitations. At the microbiological level, certain taxa cannot be distinguished with species-level taxonomic resolution when the 16S rRNA sequencing employed the QIIME pipeline for the downstream taxonomic classification, which might result in some unclassified OTUS such as Porphyromonas_Unidentified at the species level [ 38 – 41 ]. To solve this limitation, other authors have analyzed the reads generated by MiSeq with HOMINGS, an in silico probe-based platform [42]. LOURDES NÓVOA GARRIDO 274 J. Clin. Med. 2020,9, 2482 8of11 At the clinical level, the periodontal diagnosis was based on the clinical assessment restricted to the Ramfjord teeth, which were chosen to facilitate the examination of the special patient population included in the study and due to the well-known evidence that partial-mouth recording systems might present adequate accuracy. Differences at baseline (although not statistically significant) should also be discussed as a limitation because the PDS group was slightly older, while the HDS group more frequently had thyroid diseases and were taking drugs for the condition. Finally, a larger sample size would have been desirable; however, there were no previous studies for a proper sample size calculation. We therefore selected a convenience sample [7]. 5. Conclusions Considering the abovementioned limitations of this cross-sectional study, the use of 16S rRNA-based NGS analysis of subgingival samples from patients with Down syndrome suggests a quite distinct subgingival microbiome in periodontitis versus that of periodontally healthy controls. The PDS group showed a more complex bacterial composition with a higher number of pathogens but not at the expense of a depletion of host-compatible species. Well-recognized periodontal pathogens (including Porphyromonas,Treponema,Tannerella and Aggregatibacter) as well as newly proposed pathogenic taxa (Peptostreptococcus,Filifactor,Fretibacterium and Desulfobulbus) were associated with periodontitis in the patients with Down syndrome. Supplementary Materials: The following are available online at http://www.mdpi.com/2077-0383/9/8/2482/s1. The following files will be loaded as supplementary material in the submission procedure: Scheme S1. STROBE Statement—Checklist of items that should be included in reports of cross-sectional studies. Figure S1: Flow diagram for the selection of individuals with Down syndrome included in this study with periodontitis (PDS) and healthy periodontium (HDS), Figure S2: Summary of the overall diversity in the patients with Down syndrome with periodontitis (A) and healthy periodontium (B), at all taxonomic levels, Figure S3: (A) Rarefaction curves and (B) principal coordinate analysis of the microbial composition of samples according to disease status (periodontitis [case] and healthy periodontal condition [control]), based on phylum level, genus and species data, Figure S4: Beta diversity analysis. Plots were generated using weighted UniFrac distances. Circles in green and orange represent different periodontal bacterial community clusters from periodontitis (case) and healthy periodontal condition (control), respectively, at all taxonomic levels, Table S1: Differences in microbial relative abundance (in percentages) evaluated using the Wilcoxon and Kruskal–Wallis tests between samples from patients with Down syndrome and periodontitis or a healthy periodontal condition at the phylum, genus and species levels. Only taxa that were significantly different between the two groups (p≤0.05) are presented. Author Contributions: L.N. contributed to the concept, data acquisition, drafting and critical review of the manuscript; M.d.C.S., J.B. and J.L. contributed to the data analysis and critical review of the manuscript; M.C. and M.J.M. contributed to the data acquisition and critical review of the manuscript; M.S. and D.H., P.D. contributed to the data analysis and interpretation and critical review of the manuscript. All authors gave final approval and agree to be accountable for all aspects of the work. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript. Funding: This project was co-funded by Xunta de Galicia under Ignicia Programme, Axencia Galega de Innovaci ó n, GAIN (12/08/2016; GRANT_NUMBER: IN855A). Acknowledgments: The participation of M.C. S á nchez in the project occurred within the activities of the Extraordinary Chair of DENTAID, University Complutense of Madrid, Spain. The authors wish to thank the members of the Foundation for the Promotion of Health and Biomedical Research of the Valencia Region for their technical assistance. Conflicts of Interest: The authors declare that they have no conflict of interest. References 1. Lejeune, J.; Gautier, M.; Turpin, R. Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. [Study of somatic chromosomes from 9 mongoloid children]. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1959 ,248, 1721–1722. [PubMed] 2. 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Periodontal health and gingival diseases and conditions on an intact and a reduced periodontium: Consensus report of workgroup 1 of the 2017 World Workshop on the Classification of Periodontal and Peri-Implant Diseases and Conditions. J. Clin. Periodontol. 2018 ,20, 68–77. [CrossRef][PubMed] 15. Tonetti, M.S.; Greenwell, H.; Kornman, K.S. Staging and grading of periodontitis: Framework and proposal of a new classification and case definition. J. Clin. Periodontol. 2018,20, S149–S161. [CrossRef][PubMed] 16. Mombelli, A.; McNabb, H.; Lang, N.P. Black-pigmenting gram-negative bacteria in periodontal disease. II. Screening strategies for detection of P. gingivalis. J. Periodontal. Res. 1991,26, 308–313. [CrossRef] 17. Syed, S.A.; Loesche, W.J. Survival of human dental plaque flora in various transport media. Appl. Microbiol. 1972,24, 638–644. [CrossRef] 18. Teng, F.; Darveekaran Nair, S.S.; Zhu, P.; Li, S.; Huang, S.; Li, X.; Xu, J.; Yang, F. 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R: The R Project for Statistical Computing; R Foundation for Statistical Computing: Vienna, Austria, 2012; ISBN 3-900051-07-0. Available online: http://www.R-project.org/(accessed on 1 August 2019). 23. Caporaso, J.G.; Kuczynski, J.; Stombaugh, J.; Bittinger, K.; Bushman, F.D.; Costello, E.K.; Fierer, N.; Peña, A.G.; Goodrich, J.K.; Gordon, J.I.; et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat. Methods 2010,7, 335–336. [CrossRef][PubMed] 24. Callahan, B.J.; McMurdie, P.J.; Rosen, M.J.; Han, A.W.; Johnson, A.J.; Holmes, S.P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat. Methods 2016,13, 581–583. [CrossRef][PubMed] 25. Quast, C.; Pruesse, E.; Yilmaz, P.; Gerken, J.; Schweer, T.; Yarza, P.; Peplies, J.; Glöckner, F.O. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids. Res. 2013,41, D590–D596. [CrossRef][PubMed] 26. Ondov, B.D.; Bergman, N.H.; Phillippy, A.M. 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