Desarrollo de nuevos protocolos de PET cerebral preclínico para el estudio de tumores cerebrales

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC DAVID REY BRETAL 7HVLVGRFWRUDO '(6$552//2'(18(926 35272&2/26'(3(7 &(5(%5$/35(&/1,&23$5$ (/(678',2'(78025(6 &(5(%5$/(6 6DQWLDJRGH&RPSRVWHOD Programa de doctorado en Neurociencia y Psicología Clínica DAVID REY BRETAL - 1 - TESIS DOCTORAL DESARROLLO DE NUEVOS PROTOCOLOS DE PET CEREBRAL PRECLÍNICO PARA EL ESTUDIO DE TUMORES CEREBRALES DAVID REY BRETAL ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN NEUROCIENCIA Y PSICOLOGÍA CLÍNICA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 2 - DAVID REY BRETAL - 3 - DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS DESARROLLO DE NUEVOS PROTOCOLOS DE PET CEREBRAL PRECLÍNICO PARA EL ESTUDIO DE TUMORES CEREBRALES D. David Rey Bretal Presento mi tesis en base a la modalidad Monográfica con reproducción parcial o total de publicaciones, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, 16 de marzo de 2022 CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 4 - DAVID REY BRETAL - 5 - AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS DESARROLLO DE NUEVOS PROTOCOLOS DE PET CEREBRAL PRECLÍNICO PARA EL ESTUDIO DE TUMORES CEREBRALES Prof. Pablo Aguiar Fernández Prof. Álvaro Ruibal Morell INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D. David Rey Bretal, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo su presentación, considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 16 de marzo de 2022 CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 6 - DAVID REY BRETAL - 7 - AGRADECIMIENTOS Agradecer sempre é grato, tanto para o que agradece como para o que é agradecido, pero non é unha tarefa sinxela lembrarse de todos os que che axudaron durante o camiño. Polo tanto, comezo desculpándome por todos aqueles que non se atopen nestas liñas e que si deberían estalo. É obrigatorio comezar coa familia: meus pais, Ángela e José Manuel, os meus avós, Juan (a miña imaxe a seguir) e Angelita e a José e Juanita. Os seis son os fundamentos da miña personalidade. Contan que os primeiros anos da túa vida son determinantes para xerar a túa personalidade e que ata a adolescencia esa influencia está moi latente. Nesta familia o día a día é unha ensinanza constante: unha aprendizaxe continua, neste caso, a chave é ensinar e aprender sen notalo. Cando miro recordos de cando era cativo é o que sinto. Pode que eles non sexan conscientes, pero son os responsables da miña interese constante por adquirir coñecementos. Nunca lles poderei agradecer o suficiente o seu legado: discreción, humildade, naturalidade, constancia e devoción. Neste parágrafo tamén me gustaría facer unha especial alusión a Juan e a Ana, os cales sempre me trataron coma un fillo máis, coidándome e animándome para que ningunha barreira me deteña. A estas ensinanzas de coñecementos e valores únense outros familiares que non foron menos importante e cuxa lista é interminable, a todos eles, gracias. Sen cambiar directamente de tema é necesario un apartado especial, gustaríame agradecerlle ao meu imán todos estes anos xuntos. Todo o mundo pensa que temos unha relación especial, tendo en conta o ben que nos levamos para ter unha diferencia de idade de case 9 anos pero, aínda que el non sexa consciente disto, foi e será un pilar fundamental na obtención deste recoñecemento. A nosa paixón polos videoxogos uniunos e separounos de igual maneira, os enfados constantes por ver quen gañaba ou perdía foron parte do proceso, o cal recordo con agarimo. Lembra que podes conseguir o que desexes e, nos teus momentos máis baixos, terás un irmán sempre para o que necesites. Da miña educación, dende infantil ata secundaria, teño especiais recordos. Unha das mellores cousas que me sucedeu foi coñecer amizades incribles durante esas etapas. É certo que con grandes amigos, por motivos de traballo e estudos, a distancia provocou un afastamento da nosa relación pero, aínda así, recordo eses momentos con gran estima, a todos gracias por formar parte deste camiño. Agradecerlle aos meus amigos a gran influencia que tiveron en min durante todos estes anos, principalmente a Martín e Bea, a Tekken e Nerea, e a Marta. O feito de que se caractericen por un gran nivel intelectual e humano obríganme a intentar poñerme ao seu nivel, aínda que para iso, aínda falta… Antes de comezar a universidade aventureime no mundo da Formación Profesional, un sistema educativo moi ben estruturado que me permitiu adquirir coñecementos tanto de tipo teórico como de tipo práctico, dando un enfoque moi importante ás competencias que deben adquirir os futuros técnicos superiores. Durante este período coñecín a Berto, un gran amigo que me acompañou ata a universidade. A súa competitividade principalmente nos deportes, xunto coa miña, eran un cóctel explosivo de pique tras pique. Teño que recoñecer que no que respecta aos deportes, só lembro gañarlle unha vez, algo que teño que mellorar en próximos partidos de tenis… O meu interese pola investigación comezou neste intre, levado da man de dous grandes docentes e investigadores cos que tiven a oportunidade de facer as prácticas do ciclo, a Dra. Rosalía Gallego e o Dr. Tomás García-Caballero. Sen dúbida, son eles os responsables de que CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 8 - este facendo a tese de doutoramento, con estas palabras quero agradecer o bo trato que me brindáchedes durante os meses de prácticas e as palabras de motivación que me dades cada vez que nos atopamos de novo. Espero que con este traballo esteades orgullosos do que conseguíchedes, motivar a un rapaz a intentar chegar ao máis alto nivel educativo. Dende pequeno sempre quixen ser Fisioterapeuta, é máis, teño escritos da escola onde especificaba querer ser Fisioterapeuta do Real Madrid. Entre unhas cousas e outras, as ideas cambian, ás veces por mor de malos consellos do profesorado, e foi por iso polo que en bacharelato cambiei a miña idea de Fisioterapia por Medicina. A esixencia que me levou alcanzar notas moi altas acabou danando a miña saúde, derivando no que aínda fai poucos anos me diagnosticaron como migrañas vestibulais, o que por aquel entón eran simples vértigos. Con todo isto, e tras finalizar o ciclo, cabezota coma eu so, volvín a facer a antiga PAU para, outra vez, intentar estudar Medicina. De novo, non puido ser e, sinceramente, alégrome que así fora, anos despois percataríame que non estaba feito para ser médico, pero si para unha profesión moito máis próxima e centrada no benestar do enfermo, como é o caso da Enfermaría. Xa embarcado no mundo universitario fixen grandes amizades. Ao igual que pasa en todos os casos, de novo, a distancia e tomar camiños distintos fixo que separásemos o marabilloso grupo de “Enfermeruchos”, aínda que non foi así con todos. A Xaime teño que agradecerlle todo. Unha belísima persoa que, coma el diría: “Fuches o gran descubrimento de Enfermaría”. Sen dúbida, es e serás a persoa máis importante dese período académico, máis ca un amigo, considérote un irmán, unha persoa na que podo confiar cegamente. Aínda que non che fai falta, deséxoche o mellor, serás, sen dúbida, o mellor enfermeiro comunitario da historia. No ámbito docente, gustaríame destacar a varios profesores que me marcaron especialmente e que me axudaron durante o meu período de doutoramento. A Raquel Rodríguez, polos teus consellos, por ensinarme todo o entramado que existe tras a docencia universitaria, moitas gracias por invertir todo ese tempo en min. A Marcos Pazos, María Isabel Pérez, Silvia Novio, Pedro Faraldo e Chus, por confiar en min e darme a oportunidade de ser cotutor e docente dos alumnos, tanto de TFG como da especialidade Obstétrico Xinecolóxica, unha experiencia que gardo con agarimo e que sen vos, non sería posible. Para rematar neste apartado, gustaríame facer mención a Ana María Míguez que sempre confiou en min e quero agradecerlle todas as boas palabras que tivo durante os nosos encontros. Espero, algún día, poder devolvervos o favor a todos e axudarvos tanto como o fixéchedes comigo. Ao rematar o grao, aventureime, gracias a unha recomendación dun dos meus directores de tese, a facer o máster de Neurociencias co obxectivo de seguir os meus estudos enfocados na tese de doutoramento. Nesta etapa, coñecín a tres grandísimas persoas, ás que aínda hoxe en día comparto unha moi boa amizade. A Patri, Natalia e Paulo, polos vosos ánimos, por compartir a dureza deste proceso educativo e ser unhas belísimas persoas, foi unha honra coñecervos. Chegados á tese de doutoramento, gustaríame facer os agradecementos pertinentes aos meus directores, ao Dr. Álvaro Ruibal Morell e ao Dr. Pablo Aguiar Fernández, os cales fixéronme un oco nas súas desbordadas axendas para guiarme no meu período doutoral. Eles ensináronme as entrañas da investigación e a necesidade de compartir o que aprendes. Abríronme as portas sen dubidar nin un segundo, aínda que un enfermeiro non fora o perfil habitual dun investigador e, gracias a eles, aprendín un método de traballo conciso e constante. Que dúas eminencias coma eles me tratasen coma un máis enorgulleceume e alentoume dende o primeiro día. Gracias de corazón. DAVID REY BRETAL - 15 - RESUMEN CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 16 - DAVID REY BRETAL - 17 - RESUMEN La patología cerebral abarca una gran diversidad de afectaciones entre las que se encuentran las neoplasias. En España, la última estimación hace referencia a que en 2021 se alcanzó una cifra de 276.239 pacientes con tumores, de los cuales, el 2% representó neoplasias primarias del sistema nervioso central en el adulto y un 15% en los menores de 15 años clasificando, este último dato, como la segunda causa de mortalidad por tumores cerebrales pediátricos después de la leucemia. Con esta información se puede constatar que las neoplasias cerebrales en la edad adulta son poco frecuentes, representando una incidencia mayor en los varones (55%). En todos estos porcentajes, los meningiomas y los gliomas son los más comunes. Por otro lado, las metástasis son las neoplasias más frecuentes en el sistema nervioso central, entre los que destacan como principales factores de riesgo los pacientes con tumores mamarios, pulmonares y dérmicos, debido a su alto grado de metastatización. Aún así, la mayor parte de los tumores cerebrales tiene un carácter benigno (66%), aunque dichos tumores, por complicaciones ajenas a esta afectación, no son confirmados mediante histología, lo que la incidencia de tumores malignos podría estar cerca del 34% de la totalidad. En este caso las neoplasias malignas más frecuentes son el glioblastoma (3,2 por 100.000 habitantes), astrocitoma de grado III (0,51 por 100.000 habitantes) y el linfoma (0,43 por 100.000 habitantes). Con esta premisa, se denomina glioma al crecimiento incontrolado de las células gliales que se origina en el parénquima encefálico, las cuales pueden afectar también a la médula espinal. Estas células gliales son esenciales en el correcto funcionamiento del sistema nervioso, cuya función es aportar soporte a las células cerebrales, las neuronas. Los gliomas se clasificarán dependiendo del tipo de célula glial que esté involucrado en el desarrollo del tumor, así como de sus características genéticas. Por lo tanto, dentro de este tipo de patología, se pueden diferenciar tres tipos de tumores gliales: Astrocitoma, que a su vez incluyen astrocitomas, astrocitomas anaplásicos y glioblastomas; Ependimoma, formadas por ependimomas anaplásicos, ependimomas mixopapilares y gliomas subependimarios; Oligodendroglioma, formado por oligodendrogliomas, oligodendrogliomas anaplásicos y oligoastrocitoma anaplásico. Este tipo de tumores se desarrollan en el propio tejido intraparenquimatoso de forma difusa, sin estar totalmente delimitados del resto del parénquima. Su rápido crecimiento y la agresión del tejido normal circundante acaba afectando en la producción de una reacción denominada edema cerebral, lo que supone un peor funcionamiento a nivel neuronal y, por tanto, el aumento del volumen intracraneal. Todo esto conlleva el rápido crecimiento de la patología, lo que hace que, en sus zonas más internas, la llegada de la circulación sanguínea se vea comprometida, derivando en un proceso denominado como muerte celular o necrosis. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 18 - Estos tumores van a provocar dos tipos de sintomatologías: debido a la situación de hipertensión intracraneal que genera el crecimiento del tumor dentro del cráneo produce una sintomatología de cefalea, náuseas, vómitos y edema papilar y, de una forma progresiva, se afectará el nivel de conciencia; por otro lado, los síntomas focales pueden ser por déficit funcional, dependiendo de la localización tumoral y por irritación y exceso de función, lo que deriva en epilepsia parcial o focal. Dichos déficits neurológicos, al mismo tiempo, van a verse más o menos desarrollados dependiendo de la región del cerebro donde se inicia el desarrollo de la patología neuronal, al mismo tiempo que van a depender o no de que afecte a las zonas silentes del cerebro. Las pruebas diagnósticas se utilizan en dos fases, la primera para conocer la tipología de la neoplasia y la segunda, para comenzar la línea terapéutica que se llevará a cabo dependiendo del lugar y tipo de tumor. Si se sospecha de una neoplasia cerebral se realizarán una serie de pruebas y procedimientos como un examen neurológico o pruebas diagnósticas por imagen como la Resonancia Magnética (MR), la Tomografía Computarizada (CT) y la Tomografía por Emisión de Positrones (PET). Además del diagnóstico por imagen, suele ser común realizar un diagnóstico diferencial. Como último recurso, y que hoy en día no es habitual, se encuentra el diagnóstico quirúrgico, aunque la aparición de las técnicas por imagen ha provocado que la detección de los tumores cerebrales se realice de una manera más precoz que hace 20 años. Por consiguiente, se está cambiando la visión neuroquirúrgica de estas afectaciones, ya que los tumores se diagnostican con menor tamaño y, por lo tanto, con menos lesiones neurológicas. El tratamiento usado para la neoplasia del glioma depende del tipo, tamaño, grado y ubicación del mismo, así como de otros factores como la edad, el estado funcional del paciente, los antecedentes personales y los resultados de las pruebas hematológicas. Las medidas que se aplican en los distintos subtipos de gliomas recién diagnosticados son la extirpación del tumor mediante cirugía acompañada de terapias que reduzcan los signos y los síntomas causados por el tumor, como la quimioterapia y radioterapia, principalmente. Sin embargo, estos tratamientos convencionales son poco específicos, no siempre son efectivos y muy frecuentemente están acompañados de efectos adversos, por lo que resultaría interesante encontrar alternativas y tratamientos que sean más tolerables. Para ello es fundamental el uso de la investigación preclínica, debido a la falta de opciones para evitar el uso de animales de investigación. Los modelos de pequeños animales representan un puente crítico entre el descubrimiento a nivel molecular y la implementación de nuevos diagnósticos o de nuevos tratamientos clínicos, de una forma relevante. En etapas preclínicas del estudio de nuevas terapias es común el uso de animales de experimentación para estudiar la eficacia in vivo de nuevos tratamientos y compararlos, si es posible, con las terapias vigentes en la práctica clínica. En este ámbito, es común el uso de técnicas de imagen molecular preclínica como el PET, que permiten, entre otras cosas, realizar un análisis del metabolismo cerebral, por ejemplo, en modelos animales a los que se le ha inducido un tumor cerebral. El desarrollo de protocolos de adquisición y métodos de cuantificación adecuados para el estudio de glioma es fundamental, pues se trata de experimentos de una alta complejidad y que requieren de DAVID REY BRETAL - 19 - condiciones muy bien definidas para que las medidas obtenidas sean fiables. Por otro lado, los modelos animales varían entre la inducción química y el trasplante de células tumorales directamente en la región seleccionada, caracterizándose este último por tener un período de latencia más corto, un mejor control sobre la localización del tumor, produciendo neoplasias únicas e involucrando un coste menor. Una de las principales limitaciones de las técnicas de imagen preclínica PET es la estimación de la concentración del radiofármaco en sangre, que es fundamental para medir la actividad de radiofármaco que llega al tumor y la cantidad que continúa en circulación durante el procedimiento diagnóstico. Los métodos actuales de detección del contaje de trazador en circulación se limitan a la obtención, mediante contaje por goteo manual, del trazador de una forma muy rudimentaria, el cual limita la técnica. En los últimos años se han propuesto otros mecanismos, como la circulación extracorpórea, que reducirían los niveles de radiación manipulados por el investigador, y permitirían llevar a cabo nuevas estrategias terapéuticas ante patologías como el glioma. En este aspecto, dispositivos complementarios al PET como el equipo Swisstrace Twilite Two, aportan la tecnología necesaria para realizar un contaje en tiempo real de la cantidad de radiofármaco en la sangre a través de la mencionada circulación extracorpórea. Con el fin último de evaluar alternativas terapéuticas para el tratamiento de los tumores cerebrales como los gliomas, en la presente tesis doctoral se desarrolló y validó un protocolo de cirugía extracorpórea para cuantificar el metabolismo cerebral con 18F- fluorodesoxiglucosa (FDG) y, posteriormente, se realizaron estudios del metabolismo de la glucosa mediante PET con FDG en animales con diferentes niveles de glucemia. En la segunda parte de la tesis se desarrolló un modelo animal de glioblastoma para validar una nueva técnica de imagen PET con anticuerpos radiomarcados con 89Zr y estudiar la evolución del tumor. En primer lugar, respecto al estudio del nuevo protocolo de cirugía extracorpórea, se estudió la viabilidad de las derivaciones arterio-venosas dobles en ratas en la región inguinal y se analizaron las reproducibilidades de la Arterial Input Function (AIF) interanimal e intra-animal. Se realizaron estudios dinámicos de FDG PET cerebral para estimar las constantes cinéticas y la tasa metabólica cerebral de la glucosa, las cuales se obtuvieron a partir del análisis estándar de dos compartimentos tisulares y de Patlak. Los resultados demostraron que las AIF longitudinales de las derivaciones arterio-venosas dobles pueden obtenerse con un éxito muy alto en las cirugías. Además, proporcionaron mediciones de AIF con una alta reproducibilidad tanto inter-animal como intra-animal, incluidos en los modelos cinéticos. En vista de los resultados obtenidos, se puede comentar que se ha demostrado la viabilidad y la alta reproducibilidad de llevar a cabo mediciones de AIF longitudinales y, por tanto, de un modelado cinético preciso utilizando el protocolo de la derivación arterial propuesto. En segundo lugar, se seleccionaron tres grupos experimentales con diferentes rangos de glucemia: normal, hiperglucemia e hipoglucemia. Los resultados manifestaron que todos los protocolos juntos conducen a un amplio rango del nivel de glucosa dependiendo de las condiciones. En la cuantificación se mostró que el metabolismo cerebral global CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 20 - aumenta claramente entre los animales de glucagón y los de control y entre los de control y los de insulina. Con respecto a la modelización, los resultados muestran que el ajuste fue mejor cuando se utilizó el nivel de glucosa medido antes de la inyección de FDG. En el caso de la cuantificación regional, se confirmó que no hay diferencias significativas en el metabolismo de todo el cerebro, no obstante, los resultados mostraron que el metabolismo en las regiones del mesencéfalo y del cerebro central está ligeramente aumentado/disminuido con respecto a otras regiones del cerebro. De esta manera se puede exponer la importancia de la corrección de los datos de PET por el nivel de glucosa en sangre. En tercer y último lugar, se indujeron modelos de glioblastoma mediante la inyección de células F98 en la región frontal del cerebro. A continuación, se inyectó a los animales 89Zr-Bevacizumab o 89Zr-Aflibercept y se realizaron múltiples exploraciones PET de seguimiento tras la inducción del tumor. Los resultados mostraron que 89Zr-Bevacizumab presentaba una relación tumor-cerebro alta, sin embargo, el 89Zr-Aflibercept no atravesó la barrera hematoencefálica, por lo que no mostró ninguna captación en el interior del tumor. A nivel sistémico, la tasa de eliminación de los dos antiVEGF fue similar. 89Zr- Aflibercept mostró un mayor SUV en el hígado que en la primera exploración con 89Zr- Bevacizumab. Por todo esto, los resultados sugieren que el Bevacizumab permanece en circulación sanguínea durante un período de tiempo más largo, teniendo la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica en fases tempranas del desarrollo del tumor, siendo una terapia antiVEGF más adecuada para tratar los glioblastomas que el Aflibercept. A modo de conclusión general, se puede comentar que la imagen molecular PET es una herramienta traslacional de gran utilidad para la preparación y evaluación de nuevos tratamientos en el campo de los tumores cerebrales. En la primera parte de la tesis hemos ampliado el conocimiento sobre el metabolismo cerebral y, así, ser más preciso a la hora de realizar estudios con anticuerpos para aplicar nuevas terapias ante patologías tumorales. Finalmente, los dos anticuerpos evaluados en esta tesis doctoral han demostrado, en el caso del Bevacizumab, una capacidad para incorporarse al tumor en estadios iniciales, a diferencia del Aflibercept, el cual no es capaz de penetrar en el tumor hasta estadios avanzados de la enfermedad, jugando un papel importante en las futuras terapias clínicas. DAVID REY BRETAL - 21 - ABSTRACT CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 22 - DAVID REY BRETAL - 23 - ABSTRACT Brain pathology encompasses a wide range of disorders, including neoplasms. In Spain, the latest estimate was of 276,239 patients with tumors in 2021, of which 2% represented primary neoplasms of the central nervous system in adults, and 15% in children under 15 years of age, which also represented the second cause of mortality in pediatric patients after leukemia. This information shows that brain neoplasms in adulthood are infrequent, with a higher incidence in males (55%). In all cases, meningiomas and gliomas are the most common. On the other hand, metastases are the most frequent neoplasms in the central nervous system, mainly from primary tumors of breast, lung and dermal tumors, due to their high degree of metastaticity. Even so, many brain tumors are benign (66%), although these tumors, due to complications unrelated to this affectation, are not confirmed by histology, so that the incidence of malignant tumors could be close to 34% of the total cases. In this case, the most frequent malignant neoplasms are glioblastoma (3.2 per 100,000 inhabitants), grade III astrocytoma (0.51 per 100,000 inhabitants) and lymphoma (0.43 per 100,000 inhabitants). According to this premise, glioma is the uncontrolled growth of glial cells originating in the brain parenchyma, which can also affect the spinal cord. These glial cells are essential for the proper functioning of the nervous system, whose function is to support the brain cells, the neurons. Gliomas will be classified depending on the type of glial cell involved in the development of the tumor, as well as its genetic profile. Therefore, gliomas can be classified into three types tumors: astrocytoma (consisting of astrocytoma, anaplastic astrocytoma and glioblastomas), ependymoma (consisting of anaplastic ependymomas, myxopapillary ependymomas and subependymal gliomas) and oligodendroglioma (consisting of oligodendrogliomas, anaplastic oligodendrogliomas and anaplastic oligoastrocytoma). Gliomas follow a diffuse grow in the intraparenchymal tissue, without being completely delimited from the rest of the parenchyma. Their rapid growth and the aggression of the surrounding normal tissue ends up affecting the generation of a phenomenon called cerebral oedema, that is, impairment at the neuronal level and, therefore, increase in the intracranial volume. All this leads to the rapid growth of the pathology, such that blood circulation is compromised, resulting in cell death or necrosis. Gliomas cause two types of symptomatology: due to the intracranial hypertension generated by the growth of the tumor inside the skull, the patients suffer from headache, nausea, vomiting and papillary edema and, progressively, the level of consciousness is also affected; on the other hand, the focal symptoms may be due to functional deficit depending on the tumor location, and due to excess of function, which leads to partial or focal epilepsy. These neurological deficits will be developed depending on the region of CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 24 - the brain where the neuronal pathology begins, as well as depending on whether the silent areas of the brain are affected. Diagnostic tests are used in two phases, the first to diagnose the type of neoplasm and the second to select the therapeutic line to be carried out, depending on the location and type of tumor. If a brain neoplasm is suspected, a series of tests and procedures will be carried out, such as neurological examination and diagnostic imaging tests, such as Magnetic Resonance Imaging (MRI), Computed Tomography (CT) and Positron Emission Tomography (PET). The advent of these imaging techniques has led to earlier detection of brain tumors than 20 years ago. Consequently, the neurosurgical view of these affectations is changing, as tumors are diagnosed at a smaller size and therefore with less neurological lesions. The treatment used for glioma neoplasia depends on the type, size, grade, and location of the glioma, as well as other factors such as age, functional status of the patient, medical history, and hematological test results. The measures applied in the different subtypes of newly diagnosed gliomas are surgery (removal of the tumor), chemotherapy, and radiotherapy. However, the current treatments are unspecific, ineffective and have side effects, so it would be a good option to find alternatives and more targeted and effective treatments. The use of preclinical research is essential, due to the lack of options to avoid the use of research animals. Small animal models represent a critical bridge between discovery at the molecular level and the implementation of new diagnostics or new clinical treatments. In the preclinical stages of new therapies, it is common to use experimental animals to study in vivo efficacy of the treatments and compare them with existing therapies in clinical practice. In this field, it is common to use preclinical molecular imaging techniques such as PET, which allow, among others, an analysis of the brain metabolism in animal models with brain tumors. The development of appropriate PET acquisition protocols and image quantification methods for the study of glioma is essential, as these experiments are highly complex and require well-defined conditions for reliable measurements. Moreover, animal models vary between chemical induction and transplantation of tumor cells directly into the selected region, the latter being characterized by a shorter latency period, better control over tumor localization, producing single neoplasms and involving lower cost. One of the main limitations of preclinical PET imaging techniques is the estimation of the concentration of the radiopharmaceutical in blood, which is essential to measure the radiopharmaceutical activity that reaches the tumor and the amount that remains in circulation during the diagnostic procedure. Current methods of detecting circulating radiopharmaceutical counts are limited to obtaining the tracer in a very rudimentary way by manual sampling, which limits the technique. In the last few years, other mechanisms have been proposed, such as extracorporeal circulation, which would reduce the levels of radiation manipulated by the researcher and would allow new therapeutic strategies to be implemented for pathologies such as glioma. For that reason, devices complementary to PET, such as the Swisstrace Twilite II, provide the necessary technology for real-time DAVID REY BRETAL - 31 - este último por ter un período de latencia máis curto, un mellor control sobre a localización do tumor, producindo neoplasias únicas e involucrando un coste menor. Unha das principais limitacións das técnicas de imaxe preclínicas PET é a estimación da concentración do radiofármaco en sangue, que é fundamental para medir a actividade de radiofármaco que chega ao tumor e a cantidade que continúa en circulación durante o procedemento diagnóstico. Os métodos actuais de detección da contaxe do trazador en circulación limítanse á obtención, mediante contaxe por goteo manual, do trazador dunha forma moi rudimentaria, o cal limita a técnica. Nos últimos anos propuxéronse outros mecanismos, coma a circulación extracorpórea, que reduciría os niveis de radiación manipulado polo investigador e permitiría levar a cabo novas estratexias terapéuticas ante patoloxías como o glioma. Neste aspecto, dispositivos complementarios ao PET como o equipo Swisstrace Twilite Two, aportan a tecnoloxía necesaria para realizar unha contaxe en tempo real da cantidade de radiofármaco no sangue a través de dita circulación extracorpórea. Co fin de avaliar alternativas terapéuticas para o tratamento dos tumores cerebrais coma os gliomas, na presente tese de doutoramento desenrolouse e avaliouse un protocolo de cirurxía extracorpórea para cuantificar o metabolismo cerebral con 18F- fluorodesoxiglucosa (FDG) e posteriormente realizáronse estudos do metabolismo da glucosa mediante PET con FDG en animais con diferentes niveis de glicemia. Na segunda parte da tese desenrolouse un modelo animal de glioblastoma para validar unha nova técnica de imaxe PET con anticorpos radiomarcados con 89Zr e estudar a evolución do tumor. En primeiro lugar, respecto ao estudo do novo protocolo de cirurxía extracorpórea, estudouse a viabilidade das derivación arterio-venosas dobres en ratas na rexión inguinal e analizáronse as reproducibilidades da Arterial Input Function (AIF) inter-animal e intraanimal. Realizáronse estudos dinámicos de FDG PET cerebral para estimar as constantes cinéticas e a taxa metabólica cerebral da glicosa, as cales se obtiveron a partir do análise estándar dos compartimentos tisulares e de Patlak. Os resultados amosaron que as AIF lonxitudinais das derivacións arterio-venosas dobres poden obterse cun éxito moi alto nas cirurxías. Ademais, proporcionaron medicións de AIF cunha alta reproducibilidade tanto inter-animal coma intra-animal, incluídos nos modelos cinéticos. En vista dos resultados obtidos, pódese comentar que demostrouse a viabilidade e a alta reproducibilidade de levar a cabo medicións de AIF lonxitudinais e, polo tanto, dun modelado cinético preciso usando o protocolo da derivación arterial proposto. En segundo lugar, seleccionáronse tres grupos experimentais con diferentes rangos de glicemia: normal, hiperglicemia e hipoglicemia. Os resultados manifestaron que todos os protocolos xuntos conducen a un extenso rango do nivel de glicemia dependendo das condicións. Na cuantificación mostrouse que o metabolismo cerebral global aumenta claramente entre os animais de glucagón e os de control e entre os de control e os de insulina. Con respecto á modelización, os resultados amosan que o axuste foi mellor cando se utilizou o nivel de glicosa medido antes da inxección de FDG. No caso da cuantificación rexional, confirmouse que non existen diferenzas significativas no CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 32 - metabolismo de todo o cerebro, non obstante, os resultados amosaron que o metabolismo nas rexións do mesencéfalo e do cerebro central están lixeiramente aumentadas/diminuídas con respecto a outras rexións do cerebro. Desta maneira pódese expoñer a importancia da corrección dos datos da PET polo nivel de glicosa no sangue. En terceiro e último lugar, inducíronse modelos de glioblastoma mediante a inxección de células F98 na rexión frontal do cerebro. A continuación, inxectouse aos animais 89Zr- Bevacizumab ou 89Zr-Aflibercept e realizáronse múltiples exploracións PET de seguimento trala indución do tumor. Os resultados amosaron que 89Zr-Bevacizumab presentaba unha relación tumor-cerebro, sen embargo, o 89Zr-Aflibecept non atravesou a barreira hematoencefálica, polo que non amosou ningunha captación no interior do tumor. A nivel sistémico, a taxa de eliminación dos dous antiVEGF foi similar. 89Zr-Aflibercept amosou un maior SUV no fígado na primeira exploración que 89Zr-Bevacizumab. Por isto, os resultados indican que o Bevacizumab permanece en circulación sanguínea durante un período de tempo máis longo, tendo a capacidade de atravesar a barreira hematoencefálica en fases temperás do desenrolo do tumor, sendo unha terapia antiVEGF máis axeitada para tratar os glioblastomas que o Aflibercept. A modo de conclusión xeral, pódese concluír que a imaxe médica por PET é unha ferramenta útil para a preparación e avaliación de novos tratamentos no campo do tumores cerebrais. Na primeira parte da tese ampliamos os coñecementos acerca do metabolismo cerebral e, así, ser máis precisos á hora de facer estudos con anticorpos para aplicar novas terapias ante patoloxías tumorais. Finalmente, os dous anticorpos nesta tese de doutoramento amosaron, no caso do Bevacizumab, unha capacidade para incorporarse ao tumor en estadios iniciais, a diferenza do Aflibercept, o cal non é capaz de penetrar no tumor ata estadios avanzados da enfermidade, xogando un papel importante nas futuras terapias clínicas. DAVID REY BRETAL - 33 - ABREVIATURAS - 2TCM: Dos compartimentos tisulares - 18F-CPFPX: [18F]-8-cyclopentyl-3(3-fluoropropyl)-1-propylxanthine - 18F-FDG: 2-desoxi-2[18F]fluoro-D-glucosa - 18F-FDOPA: [18F]-Fluoro-L-Dihy-droxyphenylalanine - 18F-FET: [18F]-fluoro-ethyl-tyrosine - 18F -flt: [18F]-fluoro-3'-deoxy-3'-L - 18F-FMISO: [18F]-fluoromisonidazole - 18F-FSPG: [18F]-(S)-4-(3-fluoropropyl)-L-glutamic acid - ADN: Ácido desoxirribonucleico - AIF: “Arterial input function” - ALA: “As Low As Reasonably Achievable” - antiVEGF: Agentes antiangiogénicos - AUC: Área bajo la curva - BCE: Bombas de circulación extracorpórea - BGL: Niveles de glucosa en sangre - BHE: Barrera hematoencefálica - C: Carbono - CBF: Flujo sanguíneo cerebral - CEBEGA: Centro de Biomedicina Experimental - CEC: Circulación Extracorpórea - CHUS: Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela - CIEMAT: Centro de Investigaciones Energéticas Medioambientales y Tecnológicas - cm: Centímetros - CMRglc: Tasa metabólica cerebral de glucosa - COV: Coeficiente de variación - Cp: Concentración plasmática en el tiempo - cps: Cuentas por segundo - Ct: Concentración tisular del trazador - CSN: Consejo de Seguridad Nuclear - CT: Tomografía Computarizada - DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - e+: Positrón - e-: Electrón - ENU: N-Ethyl-N-nitrosourea - F: Flúor - FDG: Fluorodesoxiglucosa o 2-fluoro-2-desoxi-D-glucosa - FOV: Field of View - FWE: Family-wise - GB: Glioblastoma - Gd-DTPA: Gadolinio-DTPA - GLUT-1: Transportador de glucosa cerebral tipo 1 - He: Helio - HIC: Hipertensión intracraneal - H&E: Hematoxilina y eoxina - IAEA: Organismo Internacional de Energía Atómica - ICRP: Comisión Internacional de Protección Radiológica CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 34 - - ICRU: Comisión Internacional de Unidades Radiológicas - IDIF: Image-Derived Input Function - INSST: Instituto Nacional de Seguridad y Salud en el Trabajo - K1: Constante de tasa de afluencia aparente - k2: Constante de tasa de eflujo - k3: Constante de tasa de fosforilación - k4: Constante de tasa de defosforilación - keV: Kilo-electrón voltio - kHz: Kilohercio - LC: Lumped constant - mAbs: Anticuerpos monoclonales - MAPMT: Tubos fotomultiplicadores multianódicos - MCA: Arteria cerebral media - mg/dl: Miligramos/decilitro - MLEM: Maximum-Likelihood Expectation-Maximization Algorithm - mm: Milímetros - MNU: N-metilnitrosourea - MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6 tetrahidropiridina - MR: Resonancia Magnética - MRf: Resonancia Magnética Funcional - MRglu: Tasa metabólica de glucosa - MS: Muestreo manual - N: Nitrógeno - ns: Nanosegundos - O: Oxígeno - PCV: Procarbazina, Lomustina y Vincristina - PET: Tomografía por Emisión de Positrones - PIGF: Factor de crecimiento placentario - PPE: Persona Profesionalmente Expuesta - ppm: Partes por millón - PPNE: Persona Profesionalmente No Expuesta - Rb: Rubidio - RCP: Pureza radioquímica - ROI: Región de interés - SNC: Sistema Nervioso Central - SPECT: Tomografía Computarizada con Emisión de Fotón Único - SUV: Valor de captación estandarizado - Sv: Sievert - T1/2b: Eliminación biológica mediante la excreción del radiofármaco y metabolitos - T1/2e: Periodo de semidesintegración efectiva - T1/2f: Periodo de semidesintegración radiactiva - TCA: Ácido tricloroacético - UI: Unidades de insulina - UNSCEAR: Comité Científico de las Naciones Unidas para el estudio de las Radiaciones Atómicas - VEGF: Factore de crecimiento endotelial vascular - VOI: Volumen de interés - Vt: Volumen de distribución - 89Zr: Zirconio-89 - µL: Microlitros DAVID REY BRETAL - 35 - - µm: Micrómetros - a: Alfa - b: Beta - g: Gamma CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 36 - DAVID REY BRETAL - 37 - CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 38 - DAVID REY BRETAL - 39 - INTRODUCCIÓN GENERAL 1. BASES Y FUNDAMENTOS FÍSICOS DE LA MEDICINA NUCLEAR 1.1.ORÍGENES DE LA MEDICINA NUCLEAR La Medicina Nuclear centra sus principios en la administración, a un ser vivo, de una sustancia emisora de radiaciones ionizantes denominada radiofármaco, que está formado bien por un radionúclido aislado o bien ligado a una molécula de interés biológico. En el momento en el que este radiofármaco es metabolizado en el órgano o tejido diana, la radiación que emite se puede detectar con diferentes tipos de equipos, desde los primeros sistemas basados en gammacámaras, hasta los equipos más modernos basados en las técnicas SPECT (Tomografía por Emisión de Fotón Único) y PET (Tomografía por Emisión de Positrones). Desde la emisión de la radiación hasta su detección en los diferentes equipos están involucradas múltiples interacciones al nivel de las leyes fundamentales de la Física. Por este motivo, la Medicina Nuclear representa uno de los campos de aplicación de los agentes físicos en medicina y, actualmente, está considerada como esencial tanto para estudiar los aspectos desconocidos del organismo como para el tratamiento de enfermedades [1]. Para poder alcanzar la definición anteriormente citada, es necesario recordar los acontecimientos que llevaron a lo que hoy en día se conoce como Medicina Nuclear [2]: 1895: Descubrimiento de los Rayos X - Roentgen. 1896: Descubrimiento de la radioactividad de uranio - Becquerel. 1898: Descubrimiento de la radioactividad natural - Marie Curie. 1913: Desarrollo del concepto de isotopía - Soddy. 1923: Primer uso de los trazadores en la exploración biológica - Hevesey. 1927: Puesta a punto de un detector de radiaciones - Geiger y Müller. 1931: Construcción del primer ciclotrón. 1934: Descubrimiento radioactividad artificial - Curie y Joliot. 1938: Primeros estudios de la fisiología del tiroides (131I). 1939: Primeras aplicaciones terapéuticas. 1946: Construcción del primer reactor productor de radionúclidos. 1951: Construcción del escáner con cristal de centelleo de yoduro sódico, que permite realizar las primeras gammagrafías - Reed y Libby. 1952: El término "Medicina Nuclear" sustituye al de "Medicina Atómica" que se había empleado hasta entonces. 1956: Desarrollo del radio Inmuno-Análisis. 1962: Aparición de los generadores de 99mTc, con cualidades idóneas como trazadores y posibilidades de unión a diversos fármacos. 1963: Construcción de la cámara de centelleo - Anger. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 40 - 1.2.ESTRUCTURA BÁSICA DE LA MATERIA A partir de los años 60, la Medicina Nuclear se desarrolla de forma imparable siendo de gran importancia la puesta en marcha, en los años 70, de las técnicas de SPECT cerebral y en los años 80 el inicio de los estudios de PET. Para entender los pilares básicos de la Medicina Nuclear es necesario conocer los fundamentos físicos sobre los que se sostiene, desde la estructura básica de la materia, concepto de radiactividad y el funcionamiento de los sistemas de detección de radiación. En la primera parte del siglo XX surgieron varios modelos que explicaban el origen de las fuerzas de enlace químico y, a su vez, las fuerzas moleculares. De todos ellos tuvo especial relevancia el modelo descrito por Rutherford, el cual definía al átomo como el elemento básico de la materia que está formado por un núcleo, que contiene protones (con una carga positiva) y neutrones (sin carga), y una corteza, formada por electrones (con carga negativa) moviéndose a su alrededor. Por otro lado, la teoría de Bohr describía los estados energéticos del electrón dentro del átomo, así los electrones se situaban en órbitas llamadas K, L, M, N, etc. Cada órbita presenta una energía bien definida y según se van alejando del núcleo presentan una energía mayor. La emisión o absorción de energía por parte del átomo se traduce en un cambio de órbita por parte del electrón, hacia órbitas de menor energía o mayor energía, respectivamente [3,4]. Teniendo en cuenta lo descrito anteriormente, los átomos se encuentran en un estado eléctrico neutro cuando el número de protones es igual al número de electrones, denominándose este número como número atómico o “Z”. La totalidad de las partículas que forman el núcleo (los protones y los neutrones) se les conoce como el número másico o “A” y el número de neutrones se nombra N, siendo N = A – Z. De esta manera, la composición del núcleo es AX, siendo X el nombre del elemento que se utilizará. Un ejemplo sería el átomo 18F. En este caso se indica un número atómico de 9 (Flúor) y un número másico de 18, por lo que el átomo 18F presenta 9 neutrones, 9 protones y 9 electrones. El número atómico de un átomo determina su posición en la tabla periódica y por tanto el tipo de elemento químico que representa. Sin embargo, pueden existir varios átomos de un mismo elemento químico, es decir, núcleos con el mismo número atómico y diferente número másico. Los diferentes átomos de un mismo elemento químico se denominan isótopos y algunos de ellos se caracterizan por ser inestables. La Medicina Nuclear se basa precisamente en el uso de estos isótopos inestables denominados radioisótopos o radionúclidos, que deben emitir radiación para alcanzar un estado estable, tal y como se explicará en la próxima sección. Estos radioisótopos son administrados al paciente o utilizados para realizar pruebas analíticas con fines principalmente diagnósticos y terapéuticos [5]. DAVID REY BRETAL - 47 - clasificar en Previstas (las que se asumen antes de la operación de las instalaciones) o Potenciales, que son las que podrían producirse por motivo de un fallo del sistema o un error de los procedimientos. En el caso de las exposiciones de carácter potencial el riesgo no es directamente aplicable a los límites de dosis, por lo que se le atribuye el término de límite de riesgo, el cual es necesario definir y cuantificar. Los límites que se establecen tanto para los trabajadores expuestos como para el público global no tienen en cuenta la dosis del fondo radiológico natural ni las derivadas de las exposiciones sanitarias y se expresan en el término de dosis efectiva, excepto la irradiación parcial de cristalino, piel y extremidades, en la que se utilizará la dosis equivalente (ver Tabla 1.1). Tabla 1.1: Límite de dosis establecido por el RD 1439/2010. PPE: Persona Profesionalmente Expuesta; PPNE: Persona Profesionalmente No Expuesta; mSv/año: El Sievert (medida del efecto sobre la salud) es la unidad de dosis que equivale a 1 J/kg. (Evalúa el daño biológico esperable según la dosis absorbida) CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 48 - 2. INTRODUCCIÓN A LA PET 2.1.BASES FÍSICAS El aspecto fundamental en la historia de la PET comienza con el descubrimiento teórico y experimental del positrón. El positrón (e+) es una partícula subatómica que posee la misma masa que el electrón (e-), pero con carga opuesta, y por ello se considera como la antimateria del electrón. Estas propiedades y su propio descubrimiento fueron predichas en 1927 por el físico francés Paul Adrien Maurice Dirac, el cual atribuyó al positrón la característica fundamental de que, al encontrarse con un electrón, estos se aniquilaban. Aunque esta predicción era correcta, fue necesario esperar hasta 1932 cuando el físico estadounidense Carl David Anderson observó por primera vez el positrón mientras fotografiaba los rastros de rayos cósmicos en una cámara de ionización [14]. A finales de los años cincuenta, el médico Gordon L. Brownell fue el pionero en aplicar las propiedades de la aniquilación de los positrones en la detección de los cánceres cerebrales con la ayuda de sistemas de detección muy simples. A pesar de que la instrumentación y la obtención de las imágenes con estos equipos no eran muy sofisticados, las imágenes obtenidas con respecto al resto de dispositivos de diagnóstico del momento eran sensiblemente mejores. Fue necesario esperar a 1961 para la creación de la primera cámara de positrones, pero su utilidad práctica como técnica diagnóstica no comienza a ser útil hasta que Michel Ter-Pogossian en los años setenta, uno de los considerados “padres” de la PET, describe los algoritmos que posibilitan la reconstrucción de los datos obtenidos para la generación de las imágenes. Debido a esta descripción, a mediados de 1975 el físico Michael E. Phelps desarrolló la versión más moderna de este equipo, lo que permitió centrarse en la producción de otros radionúclidos emisores de positrones y, así, poder aumentar la producción de los radiofármacos PET [15,16]. Todo esto llevó a definir lo que actualmente se conoce como PET, una técnica diagnóstica no invasiva que permite obtener imágenes para la detección y cuantificación de la actividad biológica de los diferentes fenómenos fisiológicos y patológicos otorgando una información funcional in vivo de dichos procesos. Tras la inyección por vía intravenosa del radiofármaco, los positrones emitidos por los radionúclidos recorren una distancia de unos pocos mm hasta encontrar un electrón y provocando la aniquilación. El resultado de esta aniquilación acaba generando dos fotones, con una energía de 511 KeV (como se había visto anteriormente, la unidad de energía), que viajan en la misma dirección, pero en sentidos opuestos, lo que permite que sean detectados por coincidencia de los rayos g (detección simultánea de los dos fotones) en los cristales de los detectores de la cámara PET y cuyo resultado determina las imágenes de la tomografía [17]. DAVID REY BRETAL - 49 - Además de todos los autores anteriormente citados, tiene especial relevancia Louis Sokoloff, un neurocientífico estadounidense considerado como el pionero en el campo de la imagen funcional del cerebro y, a su vez, uno de los “padres” de la Tomografía por Emisión de Positrones. La atribución de este papel es debido a que fue el principal investigador en demostrar, en tiempo real, la posibilidad de obtener imágenes derivadas del flujo sanguíneo en cerebros de animales utilizando trazadores con 2-desoxiglucosa. Sus estudios consiguieron explicar, mediante diferentes condiciones fisiológicas, las regiones del cerebro que estaban más activas dependiendo de la condición pautada y el momento dado. Con todo esto, se consiguió vincular las actividades metabólicas regionales a funciones cerebrales particulares, siendo esta investigación esencial en el estudio del mapeo cerebral [18]. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 50 - 2.2.INDICACIONES CLÍNICAS DE LA PET Los radioisótopos emisores de positrones más utilizados en la rutina clínica de la PET son producto de un acelerador de partículas denominado ciclotrón, de entre los que se encuentran el 11C, 13N, 15O y 18F. Estos permiten marcar radiactivamente cualquier sustancia, sustituyendo en su molécula átomos de C, N, O o H por los anteriormente mencionados. Por tanto, se pueden utilizar como radiofármacos para PET sustancias químicas que sean análogas a muchas moléculas endógenas, que se introducirán en distintos mecanismos bioquímicos [19,20]. Los radioisótopos mencionados anteriormente tienen un T1/2f corto, lo que permite su uso en la rutina clínica, pero esto también limita el uso de algunos de ellos (11C, 20.4 minutos; 13N, 10 minutos; 15O, 2 minutos) a centros PET con un ciclotrón en sus proximidades. Únicamente la estabilidad in vivo y el T1/2f del 18F (18F, 110 minutos) permiten su transporte a otras unidades o centros con tomógrafo PET, siendo este el único trazador que se puede emplear sin necesidad de disponer de un ciclotrón propio [20]. La molécula 18F-FDG, también conocida como fluorodesoxiglucosa o 2-fluoro-2- desoxi-D-glucosa, es uno de los radiofármacos más utilizados en la actualidad en la rutina clínica de la PET. Este radiofármaco es un análogo de la glucosa y, como ésta, penetra en las células empleando los transportadores de sodio-glucosa y los transportadores específicos de membrana, como el transportador de glucosa cerebral tipo 1 (GLUT-1). Una vez que esta se ha incorporado a las células, las hexocinasas la fosforilan y la convierten en FDG-6-P, la cual no sigue las vías metabólicas de la glucólisis o síntesis de glucógeno de la glucosa, quedando retenida en la célula. Esa retención depende de la cantidad de fosfatasas que haya en la célula, ya que esta enzima facilita la desfosforilación a FDG [21]. En nuestro organismo, a excepción de los hepatocitos, la concentración intracelular de fosfatasas es baja, por lo que la retención celular de FDG es, en condiciones de normalidad, la suficiente como para conseguir imágenes estáticas con la PET [22]. El modelo compartimental de la FDG está validado, por lo que es posible la obtención de imágenes paramétricas absolutas del consumo regional y global de glucosa en los diversos órganos. La cuantificación absoluta obliga a una metodología más exhaustiva, con adquisición dinámica de imágenes, infusión continua de FDG y extracción de sangre arterial, por lo que no se usa en la clínica debido a su complejidad. Esto conlleva que, los estudios clínicos, se ejecuten mediante la inyección intravenosa de FDG para estudios estáticos de cuerpo entero a partir de los 45 minutos post-inyección y a la cuantificación relativa. El radiofármaco FDG es el más empleado en la rutina clínica, cubriendo la práctica totalidad de las indicaciones clínicas. Sin embargo, existen otras indicaciones que actualmente ya se cubren con otros radiofármacos, que son capaces de proporcionar información sobre otros procesos biológicos más específicos: DAVID REY BRETAL - 51 - - Cardiología: La PET es uno de los métodos de referencia para el estudio del flujo sanguíneo y del metabolismo miocárdico. El flujo se estudia con radiofármacos como el 13N- amonio o el 82Rb (Rubidio-82). En estados en los que el corazón se encuentra en lo que se denomina isquemia miocárdica, hay una mayor utilización de glucosa, a través de la glucólisis anaerobia. Por lo tanto, la captación de radiofármacos como la FDG es un factor predictivo de la recuperación contráctil tras una correcta revascularización, existiendo una buena correlación entre dicha captación y la recuperabilidad de la función cardíaca [23]. - Inflamación y procesos infecciosos: En las lesiones inflamatorias e infecciosas se ha descrito una mayor captación de FDG. Ejemplos que podrían ser diagnosticados a través de esta técnica serían las sobreinfecciones de prótesis osteoarticulares, injertos vasculares, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, la sarcoidosis, la enfermedad inflamatoria intestinal crónica o el síndrome febril de origen desconocido. Aún teniendo toda esta información, la evidencia no es suficiente como para que la situación clínica contribuya a una indicación clínica de la PET como primera opción [24,25]. - Neurología: El cerebro tiene como sustrato energético la glucosa por lo que, en la actualidad, se acepta el uso de la PET con FDG como la forma más exacta de valorar el metabolismo cerebral. Para ello, el síndrome neurológico más estudiado con la técnica anteriormente citada es la demencia, ya que esta es capaz de detectar una disminución en el metabolismo regional en pacientes asintomáticos con riesgo genético de padecer esta clase de enfermedades. A su vez, es posible predecir su evolución, al igual que determinar cambios metabólicos en el córtex, coincidiendo con hallazgos obtenidos a través de la Resonancia Magnética (MR) en pacientes con deterioro cognitivo leve. Por tanto, la PET con FDG puede contribuir al diagnóstico diferencial de las demencias neurodegenerativas y diferenciar entre demencia tipo Alzheimer y pseudodemencia depresiva y, por supuesto, valorar la eficacia de los diferentes tratamientos disponibles en el mercado [26-27]. A pesar de todo lo mencionado, la gran sensibilidad diagnóstica de la PET con FDG en las demencias no ha sido suficiente para que sea establecida como una indicación clínica en este ámbito, seguramente debido al pobre impacto clínico de sus hallazgos, ya que estos no suponen grandes cambios en la estrategia terapéutica [34]. Para el estudio de las lesiones de las neuronas nigroestriatales en pacientes con enfermedad de Parkinson se utiliza la denominada [18F]Fluoro-L-Dihy- droxyphenylalanine (18F-FDOPA) (una forma fluorada de la L-DOPA sintetizada), la cual es capaz de detectar la hipocaptación estriatal de predominio putaminal, unilateral o bilateral asimétrica dependiendo de la fase evolutiva de este proceso [28,29]. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 52 - En el caso de las enfermedades cerebrovasculares como las isquemias o los infartos, estos pueden ser evaluados mediante estudios de PET con 15O. Este radiofármaco es utilizado en los estudios de neuroactivación cognitiva, sensorial o motora, que se emplean en la evaluación de la función cerebral [30]. Con respecto a los focos epileptógenos en pacientes con epilepsia refractaria al tratamiento, la técnica de PET con FDG es el método de estudio interictal de referencia para la localización prequirúrgica de lesiones temporales y, en menor medida, lesiones extratemporales [31,32]. - Oncología: La alta captación del radiofármaco en las neoplasias está íntimamente ligado a la celularidad tumoral y, por tanto, a la proliferación celular [33]. En el caso de la FDG, la alta tasa metabólica que presentan las células tumorales y la ausencia de fosfatasas en dichas células provoca una intensa retención metabólica de FDG-6-P, lo que permite diferenciar el tejido patológico del tejido sano [34]. Las principales características que permiten definir a la PET como una herramienta idónea en el diagnóstico oncológico son: 1. La posibilidad de hacer estudios volumétricos/tomográficos de cuerpo entero en la misma técnica de exploración. 2. La gran sensibilidad para la detección de lesiones tumorales, demostrando la posible infiltración tumoral en las adenopatías de tamaño normal y en los órganos que aún no presentan alteraciones anatómicas. 3. Las exploraciones tienen menos artefactos que los que se obtienen con la Tomografía Computarizada (CT) o la MR en la existencia de fibrosis cicatrizal residual postoperatorio. 4. La presencia de un alto valor predictivo negativo, describiendo muy pocos falsos negativos en esta prueba. Por el contrario, es necesario mencionar que los tumores necróticos, mucinosos y de bajo grado pueden captar poco radiofármaco por lo que, junto con los tumores de pequeño tamaño, pueden pasar inadvertidos. Así pues, los principales inconvenientes de esta técnica son [35,36]: 1. La dificultad para detectar masas tumorales muy pequeñas y micrometástasis demostraron no tener una buena acogida como técnica de cribado del cáncer en sujetos sanos. 2. Las falsas captaciones debido a procesos no malignos, tales como neumonías, bronquitis o abscesos. Estas captaciones, asociadas a procesos inflamatorios o infecciosos suelen ser inferiores a las lesiones neoplásicas. Aún así, todo esto puede conllevar a la descripción de falsos positivos en los procesos anteriormente mencionados. DAVID REY BRETAL - 53 - 2.3.BASES DE LA PET PRECLÍNICA Además de las indicaciones clínicas anteriormente expuestas, la imagen PET tiene un papel fundamental para estudiar las bases fisiológicas de las enfermedades humanas en modelos animales. Se trata de una técnica no invasiva, que permite hacer estudios longitudinales sin tener que sacrificar a los animales en distintos tiempos para estudiar lo que está ocurriendo en ese momento, como sucede, por ejemplo, tras la administración de ciertas terapias para una determinada patología. Por tanto, esta técnica permite visualizar, in vivo, precozmente y de forma eficiente, el cuerpo entero de un animal tras la administración de un radiofármaco, que irá a la diana que se pretende estudiar, proporcionando una investigación traslacional o puente desde estudios preclínicos a estudios clínicos. La técnica PET preclínica se complementa con otras muchas modalidades de imagen que tienen diferentes características de resolución espacial y de sensibilidad, y que se deben tener en cuenta a la hora de los diseños experimentales. La resolución espacial de los dispositivos PET preclínicos se encuentran entre los 700-1500 µm, mientras que el SPECT preclínico muestra una resolución espacial de 500-900 µm, CT preclínico se encuentra entre los 50-200 µm y MR preclínico sobre 25-200 µm. Con respecto al apartado de sensibilidad, los dispositivos PET y SPECT presentan una sensibilidad picomolar, mientras que los equipos MR y CT tienen una sensibilidad nanomolar [37]. Debido a todas estas ventajas y características complementarias, en los últimos años se han producido numerosos avances tecnológicos que han llevado a que actualmente existan diferentes dispositivos para realizar estudios de imagen multimodal en pequeños animales de experimentación, como los equipos microPET/CT, microPET/MR, microSPECT/CT, microMR y microCT. Todos estos equipos tienen resoluciones adecuadas para el estudio de roedores, principalmente rata y ratón. Esta tecnología aporta una gran información de los múltiples procesos biológicos que ocurren en el organismo, como puede ser el metabolismo de la glucosa, el estado de neuroreceptores y de neurotransmisores, el flujo sanguíneo, el consumo de oxígeno y la división celular, entre otros muchos. Además del estudio de los procesos biológicos, estas técnicas facilitan analizar diferentes patologías moleculares en modelos animales de enfermedades humanas, así como la evaluación preclínica de numerosas terapias, constituyendo una herramienta esencial en numerosas líneas de investigación biomédica. Estos dispositivos permiten obtener, como de un estudio clínico se tratase, la información necesaria para determinar la distribución del trazador a lo largo del organismo y así estudiar las patologías que se encuentran asociadas a diferentes órganos. Esta clase de estudios facilitan el análisis de las características de las patologías en los roedores para después, de una forma traslacional, aplicar las mismas terapias en humanos. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 54 - Debido a esta alta traslacionalidad, las áreas de aplicación de la imagen PET preclínica están íntimamente relacionadas con las indicaciones clínicas. Así pues, la oncología es una de las áreas más activas en este campo de investigación, ya que permite el estudio de las características de las células tumorales y de los procesos biológicos implicados en la carcinogénesis: proliferación, diferenciación, angiogénesis y apoptosis. Otro de los campos de estudio en los que se utiliza esta técnica es en la neurociencia, donde se permite visualizar los procesos de neurotransmisión, activación y funcionalidad cerebral alterados en patologías neurológicas, neurodegenerativas y alteraciones psiquiátricas como la depresión o la ansiedad. También, la cardiología es otro de los campos, pues evalúa la funcionalidad cardiovascular, la detección de enfermedades coronarias y el análisis de los infartos, como se ha visto recientemente [38]. Como se ha mencionado anteriormente, el uso de la técnica de la PET se debe complementar con la información obtenida mediante otros dispositivos de imagen, como puede ser el caso del CT. En este caso, lo que se utilizarían son rayos X que atraviesan al roedor y, en función de la atenuación de esos rayos, se obtendrá una imagen en 3 dimensiones que permitirá, con mayor precisión, localizar la región anatómica donde se encuentre una lesión o región de interés que se quiera estudiar y, de esta forma, permitir la realización de estudios cuantitativos. Este enfoque presenta una gran traslación clínica, ya que demuestra una alta resolución espacial para localizar anatómicamente la información de la PET. Se debe destacar que la experimentación animal está regulada para asegurar el correcto uso de los animales de experimentación, recogida por el Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia [39]. Para entender el concepto de imagen preclínica es necesario conocer la definición de procedimiento. Un procedimiento es cualquier uso, tanto invasivo como no invasivo, de un animal con fines de experimentación u otros como los educativos, que pueda causarle un nivel de dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero equivalente o superior al causado por la introducción de una aguja. A partir de ese momento, cualquier proceso de este tipo o más dañino, deberá ser autorizado mediante un Comité de Ética por la entidad competente encargada de la investigación. De este modo, se publicó en 1959, por parte de William Russell y Rex Burch, el libro en defensa de los animales, lo que derivó en un nuevo pensamiento acerca del cuidado de los mismos, creando lo que se conoce como el mecanismo de las Tres Erres, cuyo enfoque sigue la línea establecida por las técnicas de imagen PET preclínica al permitir estudiar in vivo los procesos biológicos [39, 40]: - Reemplazo: sustitución de animales in vivo por técnicas in vitro, como modelos de ordenadores, vídeos, simuladores u otros animales para obtener el mismo resultado. DAVID REY BRETAL - 55 - - Reducción: disminución del número de animales utilizados mediante un diseño experimental cuidadoso y la estandarización de los mismos, lo que conlleva una menor variabilidad de los resultados. Por tanto, se premia la utilización de menos animales por experimento, evitar experimentos innecesarios o repetitivos y programas de bioestadística. - Refinamiento: disminución del sufriente producido en los animales para mejorar no solo su bienestar, sino la calidad de los resultados. Para ello es necesario el enriquecimiento ambiental que permita cubrir las necesidades fisiológicas y de comportamiento y técnicas adecuadas de anestesia y de analgesia. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 56 - 2.4.ANATOMÍA Y ESTUDIO DE LA IMAGEN MOLECULAR PRECLÍNICA DE PET CEREBRAL La imagen molecular de PET cerebral abre numerosas posibilidades para implementar las técnicas de diagnóstico, diseño de nuevas terapias y validación y optimización del pronóstico de nuevos protocolos [41]. Estas técnicas establecen un puente esencial para trasladar los resultados obtenidos en modelos animales de experimentación a la práctica clínica. Debido a la gran calidad de imagen que se necesita para estudiar una región tan pequeña como puede ser el cerebro de los roedores, como los ratones o las ratas, se necesitan modalidades de imagen de alta resolución. Para ello, es imprescindible encontrar un balance entre la resolución espacial, la habilidad de un sistema de imagen para demostrar pequeños detalles, la sensibilidad y la capacidad del observador para dar como casos positivos los realmente enfermos ya que, si se quieren ver detalles muy pequeños, surge una disminución de la sensibilidad [42,43]. En este contexto se debe tener en cuenta la parte anatómica del cerebro de los roedores a la hora de realizar estas técnicas de imagen y sus diferencias con los humanos. Cada una de las estructuras cerebrales ha ido evolucionando en un grado diferente según la especie debido a sus necesidades individuales. Así, en los roedores se observan unos bulbos olfatorios relativamente más evolucionados que en los humanos y, sin embargo, los humanos presentan unas áreas del lenguaje relativamente más desarrolladas en la corteza cerebral. Las principales estructuras que permiten diferenciar ambos cerebros, además del tamaño, son la corteza cerebral y el bulbo olfatorio. La corteza corresponde a la estructura más amplia de ambos cerebros, pero la gran diferencia entre ambos es la inexistencia de pliegues en el cerebro del roedor, el cual es liso. Estos pliegues cerebrales, asociados a un aumento de la superficie del cerebro, permiten que esta estructura encaje dentro del cráneo permitiendo, a su vez, que la corteza sea mayor. Gran parte de la corteza humana está altamente relacionada con funciones cognitivas y del lenguaje, por lo que se cree que la diferencia de intelecto entre las ratas y los humanos está ligado a un mayor tamaño cortical en estos últimos. Con respecto al bulbo olfatorio, en humanos es prácticamente insignificante a diferencia del enorme bulbo olfatorio que presentan los roedores [44]. Esto está íntimamente relacionado con la interacción con el mundo que les rodea, es decir, el uso de su sentido del olfato como medio de supervivencia. DAVID REY BRETAL - 63 - 3. PRINCIPIOS DE LA NEOPLASIA CEREBRAL: EL GLIOMA 3.1.DEFINICIÓN DE GLIOMA Para entender la definición de una neoplasia como el glioma, es necesario mencionar la función y las partes de las que consta un órgano como el cerebro. El cerebro es la estructura encargada de la coordinación y del control del organismo. Se trata de una masa de tejido blando protegido por el hueso craneal y las membranas meníngeas (duramadre, aracnoides y piamadre), por donde fluye el líquido cefalorraquídeo encargado, entre otras funciones, de dar soporte y nutrición [57]. Esta estructura está constituida por el encéfalo (hemisferios cerebrales, tronco del encéfalo y cerebelo) y por la médula espinal, esta última alojada en una estructura ósea denominada columna vertebral, rodeada de las meninges y encargada de continuar con la comunicación con el resto del organismo. Los dos hemisferios cerebrales, anteriormente citados, están unidos por el cuerpo calloso y se dividen, a su vez, en varios lóbulos: frontal (razonamiento, emociones, parte del habla y movimientos), parietal (sensaciones del contacto, dolor, temperatura y parte del habla), temporal (memoria, sentido del oído y parte del habla) y occipital (visión). El tronco del encéfalo tiene la mayor ruta de comunicación entre el cerebro, la médula espinal y los nervios periféricos, incluyendo también la respiración, el ritmo cardíaco y aspectos primarios de la localización del sonido. Con respecto al cerebelo, se localiza en la parte posterior del cráneo y tiene, como función principal, el mantenimiento de la coordinación y del equilibrio [58]. El conjunto de todas las estructuras anteriormente mencionadas se denomina SNC [59]. Para conocer el comportamiento de los tumores cerebrales, es importante hacer hincapié en la función del líquido cefalorraquídeo, ya que no tiene drenaje linfático y su diseminación a través de la sangre es rara, por lo que los tumores cerebrales que se desarrollan como originarios del cerebro, es decir, de carácter primario, no suelen metastatizarse al resto del cuerpo [60,61]. En términos generales, se denomina neoplasia cerebral al crecimiento de una masa en el interior del cerebro. Como descripción global, se denomina glioma al crecimiento incontrolado de las células gliales que se origina en el parénquima encefálico, pudiendo afectar también a la médula espinal. Estas células gliales son fundamentales para el correcto funcionamiento del sistema nervioso, aportando soporte a las células cerebrales, las neuronas. Los gliomas se clasificarán dependiendo del tipo de célula glial que esté involucrado en el desarrollo del tumor, así como de sus características genéticas. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 64 - 3.2.EPIDEMIOLOGÍA En España, según los últimos registros poblacionales, se estimó que el cáncer en el año 2021 alcanzó los 276.239 casos de la población española, representando los tumores primarios del sistema nervioso central el 2% del total de estas neoplasias en el adulto y significando un 15% en los niños menores de los 15 años. Este último dato clasifica a los tumores cerebrales pediátricos como la segunda causa de muerte por cáncer, después de la leucemia [62]. Todo esto indica que, a diferencia de la edad pediátrica, en el caso de la edad adulta se trata de un tipo de neoplasia poco frecuente, presentando una incidencia mayor en los hombres (55%). Dentro de estos porcentajes, los meningiomas (afectación tumoral en las meninges) seguidos de los gliomas, como los oligodendrogliomas o los astrocitomas anaplásicos, son los más frecuentes. Si por el contrario se analizan los datos por grupos histológicos, las metástasis son las neoplasias más frecuentes en el sistema nervioso central, destacando como principales factores de riesgo los portadores de los tumores mamarios, pulmonares y dérmicos, ya que tienen un alto grado de metastatización. Teniendo en cuenta lo anterior, la mayor parte de los tumores cerebrales son benignos (66%), aunque muchos tumores benignos no son confirmados mediante histología, por lo que la incidencia de tumores malignos podría ser mayor del 34% recogido hasta la fecha. Las neoplasias malignas más frecuentes son el glioblastoma (3,2 por 100.000 habitantes), astrocitoma de grado III (0,51 por 100.000 habitantes) y el linfoma (0,43 por 100.000 habitantes). Por el contrario, los tumores benignos más frecuentes son el meningioma (7,93 por 100.000 habitantes), adenoma hipofisario (3,65 por 100.000 habitantes) y el Schwannoma (1,81 por 100.000 habitantes) [62]. La localización más frecuente de los tumores cerebrales son las meninges (36,1%) debido a la alta incidencia de meningiomas. De las neoplasias denominados intra-axiales, la localización más frecuente es el lóbulo frontal (8,6%), seguido del temporal (6,4%), parietal (4%) y el occipital (1,1%). Con respecto a otras ubicaciones, destacan la región hipofisaria y el conducto cráneo-cervical (16,2%), pares craneales (6,7%), cerebelo (2,6%), tronco cerebral (1,5%), sistema ventricular (1,1%) y glándula pineal (0,5%) [63]. Si la comparativa se realiza por edades, la incidencia total de tumores cerebrales es mayor en pacientes de avanzada edad, aquellas personas mayores de 85 años (81,16 por 100.000 habitantes) y menor en niños de entre 0-14 años (5,26 por 100.000 habitantes). Los astrocitomas pilocíticos, tumores de células germinales y tumores embrionarios son más frecuentes en los grupos de menor edad, disminuyendo su incidencia en los grupos de mayor edad, al contrario de lo que pasa con los meningiomas, cuya incidencia aumenta con aquella [64]. DAVID REY BRETAL - 65 - 3.3.FISIOPATOLOGÍA DE LOS GLIOMAS Como se ha visto hasta el momento, los gliomas son un tipo de neoplasia cerebral que se puede desarrollar tanto a nivel del cerebro como a nivel de la medula espinal. Los gliomas se clasifican dependiendo del tipo de célula glial involucrada en la formación del tumor y adquieren importancia las características genéticas, pues pueden ayudar a predecir el comportamiento de la neoplasia con el paso del tiempo. Por lo tanto, dentro de este tipo de patología, se pueden diferenciar tres tipos de tumores gliales [65]: - Astrocitoma, que a su vez incluyen astrocitomas, astrocitomas anaplásicos y glioblastomas. - Ependimomas, formadas por ependimomas anaplásicos, ependimomas mixopapilares y gliomas subependimarios. - Oligodendrogliomas, grupo formado por oligodendrogliomas, oligodendrogliomas anaplásicos y oligoastrocitoma anaplásico. En general, dependiendo del tipo de patología que padezca el paciente, el tratamiento y su pronóstico será distinto. Este tipo de tumores crecen en el propio tejido intraparenquimatoso de forma difusa sin estar totalmente delimitados del resto del parénquima. La rapidez de su crecimiento y la agresión del tejido normal circundante acaba derivando en la producción de una reacción denominada edema cerebral, ya que el tumor lesiona la barrera hematoencefálica (BHE). Esta barrera se presenta a nivel de la unión de la glía, la cual protege y aísla las neuronas del medio ambiente, con los capilares sanguíneos. Este edema extracelular supone el aumento de la cantidad de agua entre las células, lo que implica un peor funcionamiento a nivel neuronal y, por tanto, el aumento del volumen intracraneal [66]. Existe la posibilidad de que se segregue un líquido hiperproteico en el interior del tumor, lo que acaba adquiriendo un componente quístico, unilobulado o multilobulado, provocando que el ritmo de crecimiento de dicho tumor sea mayor que si se tratase de una simple división celular. Otra de las posibles situaciones que se pueden encontrar con este tipo de neoplasias es que el rápido crecimiento de la patología hace que en sus zonas más internas la llegada de la circulación sanguínea se vea comprometida, lo que acaba derivando en un proceso denominado muerte celular o necrosis. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 66 - 3.4.FACTORES DE RIESGO Y MANIFESTACIONES CLÍNICAS Existen muchos factores de riesgo asociados con la aparición de tumores cerebrales, pero solo los siguientes mencionados presentan una relación estudiada con la aparición de este tipo de neoplasias [67,68]: - Radiaciones ionizantes Con respecto a las radiaciones ionizantes, existe una relación causa-efecto bien descrita hasta la fecha. Los estudios realizados a la población expuesta a radiaciones desde la edad infantil, por estudios médicos, han demostrado estar relacionado con la aparición de tumores cerebrales años posteriores a la administración de tratamientos de radioterapia (linfoma, leucemia, hemangioma cutáneo, hipertrofia amigdaliana u otro tipo de patologías que requieran de esta terapia). Los tumores radioinducidos más frecuentes son los meningiomas y los gliomas, siendo mayor el riesgo de desarrollar el primero de ellos. El tiempo estimado entre la administración del tratamiento y la aparición de la neoplasia oscila entre los 9-18 años en los meningiomas y de 17 a 23 años en el caso de los gliomas. Además, existe una relación entre la dosis administrada y el riesgo de padecer la enfermedad [69,70]. - Susceptibilidad genética y molecular En los últimos años, este apartado ha obtenido una gran relevancia a la hora de hablar de los factores de riesgo de estas patologías. Aunque es cierto que la gran mayoría de los tumores cerebrales son esporádicos, existe una evidencia genética con respecto a su aparición. El ejemplo más característico son los pacientes con neurofibromatosis tipo I, asociados a los gliomas del nervio óptico o glioma de tronco y hemisferios. Características como la anteriormente citada permiten, mediante biomarcadores, conocer con una mayor certeza como será el pronóstico y la respuesta al tratamiento de una forma predictiva [71]. - Alergias y relaciones inmuno-mediadas Las alergias y las condiciones autoinmunes parece que están inversamente relacionadas con la aparición de la patología glial. Por eso, todo esto demuestra que existe una evidencia en los pacientes con asma, dermatitis atópica y rinitis alérgica asociados a un menor riesgo de aparición de los gliomas. La evaluación obtenida mediante este resultado incluyó un total de 3.450 pacientes diagnosticados con glioma y 1.070 con meningioma. Todo esto desencadenó que esta deficiencia inmunológica, o los tratamientos usados para esta, tenían un factor protector contra este tipo de neoplasias [72]. DAVID REY BRETAL - 67 - Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad, por su parte, pueden aparecer de muy diversas formas, dependiendo de la región del cerebro que se vea afectada por la neoplasia. Aún mencionando lo anterior, parece que existe una tendencia dependiendo del tipo de glioma que manifieste el paciente. Las crisis epilépticas suelen ser la forma más frecuente de presentar un glioma de carácter benigno, mientras que los gliomas malignos suelen ser menos epileptógenos y más productores de déficits neurológicos y de hipertensión intracraneal (HIC), acompañados de una evolución relativamente rápida de esta sintomatología [73]. En rasgos generales, este tipo de tumores van a provocar dos tipos de sintomatologías: - Sintomatología general a consecuencia de la situación de hipertensión intracraneal que genera el crecimiento del tumor dentro de la estructura rígida que es el cráneo; esto genera una sintomatología de cefalea, náuseas, vómitos y edema papilar. De una forma progresiva, se va a ver afectado el nivel de conciencia, siguiendo este orden: normal, bradipsiquia, desorientación temporo-espacial, estupor o agitación, coma con respuesta al dolor localizado y muerte cerebral. - Sintomatología focal, que puede ser de dos tipos: por déficit funcional, dependiendo de la localización tumoral (hemiplejia, afasia, hemiapnosia, dismetría y afectación de pares craneales) y por irritación y exceso de función, lo que deriva en epilepsia parcial o focal. El déficit funcional depende de la región del cerebro donde se inicia el desarrollo de la patología neuronal y de que afecte o no a las zonas silentes del cerebro [74]. - Lóbulo frontal: Disminución de la capacidad intelectual, alteraciones de la marcha y falta de control de los esfínteres. Si la región afectada es la región de Broca, podría generarse una afasia de Broca o incapacidad para decir lo que se piensa si el tumor crece en el lóbulo frontal izquierdo o dominante del lenguaje. - Región central o zona Rolándica: Pérdida de fuerza y sensibilidad en las extremidades contralaterales. - Lóbulo temporal: Pérdida de memoria, perdida de visión en la región contralateral (hemianopsia), alteraciones del lenguaje como la afasia de Wernicke (no entiende lo que se le dice) en el caso de que exista afectación del lado izquierdo o hemisferio dominante para el lenguaje. - Lóbulo occipital: Pérdida de la visión en el campo visual contralateral. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 68 - 3.5.MÉTODO DIAGNÓSTICO Las pruebas diagnósticas se utilizan principalmente en dos fases, la primera para conocer con la mayor seguridad posible la tipología de la neoplasia y, la segunda, para comenzar a trazar la línea terapéutica que se llevará a cabo dependiendo del lugar y tipo de tumor. En la actualidad, si se sospecha de una patología cerebral, como de una neoplasia a raíz de una crisis epiléptica que aparece, sin tener previas, por primera vez a partir de los 20 años [75,76], se realizarán una serie de pruebas y procedimientos como un examen neurológico o pruebas diagnósticas por imagen. El examen neurológico, el cual debe ir acompañado de una prueba analítica general para valorar indicadores de inflamación/infección y cuantificar las funciones de coagulación sanguínea, suele comprender el control de la visión, audición, equilibrio, coordinación, fuerza y reflejos. La dificultad, en una o más de las pruebas anteriormente citadas, puede determinar que parte del cerebro se puede ver afectado y a que tipo de lesión puede verse dañado. Una vez valorado este apartado y teniendo indicios de una posible patología, se procederá a la realización de las pruebas diagnósticas más importantes, MR, CT y PET [77,78]. - MR La resonancia magnética es una técnica de imagen no invasiva que permite obtener pruebas anatómicas tridimensionales de una forma detallada, sin el uso de radiación ionizante. Su uso está relacionado con la detección de enfermedades, el diagnóstico y la monitorización de tratamientos. Se basa en una sofisticada técnica de estimulación y detección del cambio de dirección del eje de rotación de los protones que se encuentran en el agua del que se componen los tejidos vivos. Para ello, la MR usa imanes que producen un potente campo magnético que obliga a los protones en el cuerpo a alinearse con dicho campo. Cuando se pulsa una corriente de radiofrecuencia a través de los pacientes, los protones son estimulados y giran fuera de equilibrio, lo que les obliga a luchar contra la fuerza de ese campo magnético [79]. Cuando se apaga el campo de radiofrecuencia, los sensores de la MR son capaces de detectar la energía liberada mientras los protones se realinean con el campo magnético. El tiempo en el que tarden los protones para realinearse con dicho campo, así como la cantidad de energía liberada, cambian dependiendo del entorno y la naturaleza química de cada molécula. Esto permite, al encargado de examinar dichas imágenes, de identificar la diferencia entre los varios tipos de tejidos basándose en las propiedades magnéticas de este campo. Para la obtención de estas imágenes, el paciente se tiene que colocar dentro de un imán y debe permanecer inmóvil durante la adquisición para que la imagen no presente ningún artefacto a causa del movimiento [80]. Los medios de contraste, como es el caso del Gadolinio, se administran al paciente por vía intravenosa, normalmente durante la adquisición, para aumentar la velocidad a la que los protones se realinean con el campo magnético, por lo que, cuanto más rápido se realineen los protones, más clara será la imagen que se obtiene. Al controlar el pulso de radiofrecuencia y las ondas de gradiente, programas computarizados producen secuencias de pulso específicas que determinarán cómo se DAVID REY BRETAL - 69 - obtiene una imagen (ponderado) y cómo aparecen los diversos tejidos. La magnitud y la velocidad de liberación de energía que se produce cuando los protones reanudan la alineación (relajación T1) y se balancean durante el proceso (relajación T2) se registran como intensidades de señal espacialmente localizadas por una bobina (antena) dentro del resonador magnético. De esta forma, las imágenes pueden ser ponderada en T1, en T2 o por densidad protónica. Una forma que permite seleccionar mejor la imagen dependiendo de la región a estudio es conocer que las imágenes ponderadas en T1 muestran de forma óptima la anatomía normal del tejido blando y grasa (lo que permite confirmar una masa que contiene grasa) y las imágenes ponderadas en T2 muestran de forma óptima el líquido y las alteraciones (como los tumores, inflamación o traumatismos). En la práctica, ambas imágenes proporcionan información complementaria, por lo que ambas son importantes para la caracterización de alteraciones. Un ejemplo más visual seria la presencia de tejido adiposo, que aparece con una señal de alta intensidad (brillante) en las imágenes ponderadas en T1 y relativamente con una señal de baja intensidad (oscuras) en las imágenes ponderas T2, mientras que el agua y los líquidos aparecen como señal de baja intensidad en las imágenes ponderadas en T1 y con una señal de alta intensidad en las imágenes ponderadas en T2 [81]. Los escáneres de la MR son los apropiados para la obtención de imágenes de las partes no óseas o de los tejidos blandos del cuerpo. La principal diferencia con respecto a la CT es que no usa rayos X, en este caso, radiación ionizante. El cerebro, la médula espinal y los nervios, así como los músculos, ligamentos y tendones, se ven mucho más claros con la MR que con el uso de la CT. En el caso del cerebro, la MR es tan precisa que puede diferenciar entre la materia blanca y la materia gris, por lo que su uso es ideal para diferenciar patologías cerebrales como pueden ser aneurismas o tumores cerebrales. Debido a que no usa radiaciones ionizantes, esta técnica es la modalidad de imágenes preferida en cuanto a la repetición de pruebas de diagnóstico se refiere, especialmente a nivel cerebral. El principal inconveniente de esta técnica es su alto coste económico, siendo superior al escaneo con las técnicas de CT [82]. La finalidad de su uso radica en la localización precisa de las patologías cerebrales como método diagnóstico para, posteriormente, aplicar un método quirúrgico con un margen de error muy reducido o la terapia correspondiente a la patología diagnosticada. Otra clase de MR especializada es la imagen por Resonancia Magnética Funcional (MRf). Es una técnica que es usada para observar las estructuras del cerebro y determinar qué áreas se activan o consumen más oxígeno durante la realización de una tarea cognitiva. Se utiliza para fomentar el conocimiento de la organización cerebral y ofrecer un mecanismo para evaluar el estado neurológico y el riesgo neuroquirúrgico al estudiar la región afectada del cerebro, por ejemplo por una neoplasia [83]. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 70 - - CT La tomografía computarizada permite evidenciar, mediante la emisión de rayos X, la obtención de imágenes de la región cerebral en forma de cortes desde diversos ángulos. Para conocer su funcionamiento, el emisor de rayos gira alrededor del paciente y los detectores situados en el lado opuesto recogen la radiación que le atraviesa. Los datos recogidos por los detectores se envían a un ordenador encargado de integrar y reconstruir la información obtenida presentándola como una imagen morfológica. Por tanto, de una forma rápida, permite determinar la existencia de lesiones intracerebrales, lesiones calcificadas, afectaciones en hueso o incluso si existen desplazamiento de estructuras. Todo esto permite distinguir, con gran resolución, las alteraciones que condicionan y localizan a los tumores. Por las características técnicas que presenta, el CT es idóneo para la visualización de hemorragias y de calcificaciones, pero muy limitado en los casos de sospecha de lesiones en la región inferior del encéfalo, ya sea cerebelo o tronco cerebral, debido a la presencia de artefactos técnicos que pueden aparecer. En general, para que la imagen tenga la mejor calidad posible y evitar, dentro de la medida de lo posible estos artefactos, es necesario la administración de contrastes yodados para mejorar la visualización de todas las estructuras a estudio [84]. Los principios de funcionamiento del CT se basan en que la fuente de radiación y los detectores están conectados de forma que tienen un movimiento sincrónico. Cuando el conjunto fuente-detector realiza un barrido o también denominado traslación a través del paciente, las estructuras internas del sujeto atenúan el haz en función de la densidad y el número de átomos de los tejidos de la zona. La intensidad de la radiación se detecta en función de ese patrón y se crea un perfil de intensidades o proyección. Cuando finaliza uno de los barridos, el conjunto fuente-detector gira y comienza un segundo barrido. Durante este, la señal vuelve a ser proporcional a la atenuación del haz, obteniendo así una segunda proyección. Esas proyecciones no se visualizan, si no que se almacenan de forma numérica en el ordenador, ya que el procesado de los datos se realiza mediante la superposición efectiva de cada proyección para reconstruir la estructura anatómica que corresponde a ese corte [85]. Cuanto mayor sea el número de barridos exploratorios que efectúe el sistema, mayor será el número de datos que se enviará al ordenador, reproduciendo con mayor fidelidad la imagen del órgano a estudio. En la práctica, el número de barridos se encuentra limitado por el tiempo que dura la exploración y la dosis recibida por el paciente. Por tanto, cuanto más rápida sea el estudio, menor será la probabilidad de movimientos del paciente reduciendo el número de artefactos producidos durante el escaneo. Es por eso por lo que es necesario buscar la relación más adecuada entre el mínimo tiempo y la menor dosis de radiación, lo que permita obtener la cantidad de proyecciones necesarias para que se reconstruya la imagen con la calidad suficiente para estudiar la estructura que se quiera analizar [86]. La principal finalidad de esta técnica es la obtención, de forma rápida, de un diagnóstico para su posterior estudio minucioso de la terapia más indicada. DAVID REY BRETAL - 71 - - PET En el APARTADO 2 del presente capítulo: INTRODUCCIÓN A LA PET (los subapartados 2.1 y 2.2), se hace mención del funcionamiento y la composición de la PET, así como una breve descripción de la historia de esta técnica diagnóstica. Las pruebas citadas hasta este apartado son pruebas de neuroimagen estructural o anatómica a diferencia de la PET que es una técnica biológica que permite el estudio exhaustivo de los tumores cerebrales. En concreto, en los tumores cerebrales como los gliomas, esta técnica permite estudiar el metabolismo cerebral y diferenciar entre tumores agresivos, así como entre neoplasias y el seguimiento de los tumores tratados con radioterapia o radionecrosis [87-90]. Además del diagnóstico por imagen, se realiza un diagnóstico diferencial, que puede ayudar en ciertas situaciones, completando la información anteriormente mencionada: - Con los abscesos cerebrales, ya que en la imagen CT o incluso en la MR, son muy similares. - Con las metástasis cerebrales de otro origen. En las tumoraciones intra o extraparenquimatosa, ya que puede ser difícil de diferenciar un glioma periférico de un meningioma. La arteriografía o angiografía (con el uso de rayos X y de contrastes yodados, permite evaluar el interior de las arterias del organismo, como las cerebrales) en estos casos, puede ayudar en el diagnóstico [90]. - Si se puede tratar de otro tumor de origen intraparenquimatoso. En estos casos, es importante descartar otras neoplasias de origen neuronal o linfomas. - En el caso de un glioma, la diferenciación entre un astrocitoma, un oligodendroglioma o un ependimoma: 1. Oligodendroglioma: se caracteriza por la presencia de calcio en su interior, con límites precisos, sin edema cerebral circundante y de gran tamaño. Su localización más frecuente suele ser en el lóbulo frontal. Son mucho menos frecuentes que los astrocitomas y suelen desarrollarse en edades jóvenes [91]. 2. Ependimoma: La mayor parte de la masa tumoral se encuentra en los ventrículos cerebrales. Su mayor frecuencia radica en los niños y jóvenes [92]. 3. Astrocitoma: Es importante valorar el grado de agresividad ya que son tumores frecuentes y, dependiendo de la edad, se dan diferentes tipos. En el caso de los niños, hay localizaciones típicas de astrocitomas benignos, como en el nervio óptico, cerebelo y tronco cerebral, siendo raros los astrocitomas con características malignas. En los jóvenes, suelen cursar con crisis epilépticas y cursar con su localización más frecuente en la corteza cerebral. Suelen presentar características de tumores benignos. En los adultos es más frecuente la lesión que genera una mayor agresividad de la neoplasia. Para finalizar, en edades avanzadas, los astrocitomas son más agresivos, como en el grupo de los adultos de edad avanzada. Los glioblastomas multiformes se hacen indiferenciables de un astrocitoma de grado IV, basándose en los estudios por imagen. Es la anatomía CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 72 - patológica (biopsia quirúrgica) la que determinará si se trata de uno u otro tipo de afectación [93]. - Para conocer datos que indiquen el grado de agresividad o grado de Kernohan (clasificación no aplicable a los pacientes pediátricos) se recomienda el uso de: MR, espectroscopia o PET. El diagnóstico quirúrgico, con la aparición de la MR, CT y PET, ha provocado que la detección de los tumores cerebrales se realice de una manera más precoz que hace 20 años y, por tanto, está cambiando la visión neuroquirúrgica ya que los tumores se diagnostican con menor tamaño y, por consiguiente, con menos lesiones neurológicas. Todo esto obliga a la preparación de las intervenciones con el objetivo de extirpar el máximo de la lesión manteniendo al paciente íntegro, dentro del punto de vista neurológico. Las biopsias, en estos casos, son esenciales y necesarias para el diagnóstico, ya que es la única prueba que permite llevar a cabo el análisis de la muestra del tumor, ya sea mediante una biopsia estereotáxica o con cirugía abierta. Esto motiva a que el planteamiento requiera del proceso preoperatorio conveniente para analizar el mapa neurológico del paciente y, así, obtener todos los datos de carácter anatómico y funcional y la máxima resección tumoral, con la obtención de muestras. Todo esto permite, al equipo de cirugía, tener todos los conocimientos acerca del área donde se encuentra la patología y así determinar sus límites reales. DAVID REY BRETAL - 79 - 38. Kirk Robert G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique. The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Sci Technol Human Values. 2018;43(3):622-648. 39. Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia. (Boletín Oficial del Estado, número 34, de 08 de febrero de 2013). Disponible en: https://www.boe.es/buscar/pdf/2013/BOE-A- 2013-1337-consolidado.pdf 40. Russell W M, Burch R L. The principles of humane Experimental Technique. En: Russell W M, Burch R L, editor. Methuen and Co LTD, London;1959. Pp 14-51 41. Krishnamoorthy S, Blankemeyer E, Mollet P, Surti S, Holen R V, Karp J S. Performance evaluation of the MOLECUBES B-CUBE-a high spatial resolution and high sensitivity small animal PET scanner utilizing monolithic LYSO scintillation detectors. Phys Med Biol. 2018;63(15):155013 42. Mittra E S, Koglin N, Mosci C, Kumar M, Hoehne A, Keu K V et al. Pilot Preclinical and Clinical Evaluation os (4S)-4-(3-[18F]Fluoropropyl)-L-Glutamate(18F-FSPG) for PET/CT Imaging of Intracranial Malignancies. PLoS One. 2016;11(2):e0148628 43. Pampaloni MH, Nardo L. PET/MRI radiotracer beyond ¹⁸F-FDG. PET Clin. 2014 Jul;9(3):345-9. 44. Stakic J, Suchanek J M, Ziegler G P, Griff E R. The source of spontaneous activity in main olfatory bulb of the rat. PLoS One. 2011;6(8):e23990. 45. Smith N, Saunders D, Jensen R L, Towner R A. Association of decreased levels of lipopolysaccharide-binding protein with OKN-007-induced regression of tumor growth in an F98 rat glioma model. J Neurosurg. 2019;1-9. 46. Ismail F S, Moinfar Z, Prochnow N, Dambach H, Hinkerohe D, Haase C G et al. Dexamethasone and levetiracetam reduce hetero-cellular gap-junctional coupling between F98 glioma cells and glial cells in vitro. J Neurooncol. 2017;131(3):469-476. 47. Bilzer T, Reifenberger G, Wechsler W. Chemical induction of brain tumors in rats by nitrosoureas: molecular biology and neuropathology. Neurotoxicol Teratol. 1989;11(6):551-6. 48. Rushing E J, Watson M L, Schold S C, Land K J, Kokkinakis D M. Glial tumors in the MNU rat model: induction of pure and mixed gliomas that do no require typical missense mutations of p53. J Neuropathol Exp Neurol. 1998;57(11):1053-60. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 80 - 49. Druckrey H, Ivankovic S, Preussmann R. Teratogenic and carcinogenic effects in the offspring after single injection of ethylnitrosourea to pregnant rats. Nature. 1966;210(5043):1378-9. 50. Prezado Y, Jouvion G, Guardiola C, Gonzalez W, Juchaux M, Bergs J et al. Tumor Control in RG2 Glioma-Bearing Rats: A comparison Between Proton Minibeam Therapy and Standard Proton Therapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2019;104(2):266-271. 51. Desmarais G, Charest G, Therriault H, Shi M, Fortin D, Bujold R et al. Infiltration of F98 glioma cells in Ficher rat brain is temporary stimulated by radiation. Int J Radiat Biol. 2016;92(8):444-50. 52. Barth R F, Kaur B. Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology: the C6, 9L, T9, RG2, F98, BT4C, RT-2 and CNS-1 gliomas. J Neurooncol. 2009;94(3):299- 312. 53. Kobayashi N, Allen N, Clendenon N R, Ko L W. An improved rat brain-tumor model. J Neurosurg. 1980;53(6):808-15 54. Auer RN, Del Maestro R F, Anderson R. A simple and reproducible experimental in vivo glioma model. Can J Neurol Sci. 1981;8(4):325-31 55. Benda P, Lightbody J, Sato G, Levine L, Sweet W. Differentiated rat glial cell strain in tissue culture. Science. 1968;161(3839):370-1. 56. Wang T-C, Hsiao I-T, Cheng Y-K, Wey S-P, Yen T-C, Lin K-J. Noninvasive monitoring of tumor growth in a rat glioma model: comparison between neurological assessment and animal imaging. J Neurooncol. 2011;104(3):669-78. 57. Raichle M E. Two views of brain function. Trends Cogn Sci. 2010;14(4):180-90. 58. Raichle M E, Mintun Mark A. Brain work and brain imaging. Annu Rev Neurosci. 2006;29:449-76. 59. McDonald Skye. Emotions Are Rising: The Growing Field of Affect Neuropsychology. J Int Neuropsychol Soc. 2017;23(9-19):719-731. 60. Wolf A, Kondziolka D. Brain metastases: radiosurgery. Handb Clin Neurol. 2018;149:129-135. 61. Seoane, De Mattos-Arruda L. Brain metastasis: new opportunities to tackle therapeutic resistance. Mol Oncol. 2014;8(6):1120-31. DAVID REY BRETAL - 81 - 62. Sociedad Española de Oncología Médica. Tumores Cerebrales. 2019. Disponible en: https://seom.org/info-sobre-el-cancer/tumores-cerebrales 63. McNeill K A. Epidemiology of Brain Tumors. Neurol Clin. 2016;34(4):981-998. 64. Butowski N A. Epidemiology and diagnosis of brain tumors. Continuum (Minneap Minn). 2015;21(2 Neuro-oncology):301-13. 65. Collins V P. Brain tumours: classification and genes. J Neurol Neurosurg Psichiatry. 2004;75 Suppl 2(suppl 2):ii2-11. 66. Collins V P. Gliomas. Cancer Surv. 1998;32:37-51. 67. Ostrom Q T, Bauchet L, Davis F G, Deltour I, Fisher J L, Eastman C et al. The epidemiology of glioma in adults: “a state of the science” review. Neuro Oncol. 2014;16(7):896-913. 68. Inskip P D, Tarone R E, Brenner A V, Fine H A, Black P M, Shapiro W R et al. Handedness and risk of brain tumors in adults. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2003;12(3):223-5. 69. Yamanaka R, Hayano A, Kanayama T. Radiation-induced gliomas: a comprehensive review and meta-analysis. Neurosurg Rev. 2018;41(3):719-731. 70. Aherne N J, Murphy B M. Radiation-Induced Gliomas. Crit Rev Oncog. 2018;23(1- 2):113-118. 71. Melin B S, Barnholtz-Sloan, Wrensch M R, Johansen C, Il’yasova D, Kinnersley B. Genome-wide association study of glioma subtypes identifies specific differences in genetic susceptibility to glioblastoma and non-glioblastoma tumors. Nat Genet. 2017;49(5):7 72. Gohar M K, Ammar M G, Alnagar A A, Abd-ElAziz H A. Serum IgE and Allergy Related Genotypes of IL-4R and IL-13 Genes: Association with Gliomas Susceptibility and Glioblastoma Prognosis. Egypt J Immunol. 2018;25(1):19-33. 73. Pietilä S, Ala-Houhala M, Lenko H L, Harmoinen A P, Turjanmaa V, Mäkipernaa A. Renal impairment and hypertension in brain tumor patients treated in childhood are mainly associates with cisplatin treatment. Pediatr Blood Cancer. 2005;44(4):363-9. 74. Hansen A, Pedersen C B, Minet L R, Beier D, Jarden J O, Sogaard K. Hemispheric tumor location and the impact in health-related quality of life, symptomatology, and functional performance outcomes in patients with glioma: an exploratory crosssectional study. Disabil Rehabil. 2019;1-7. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 82 - 75. Englot D J, Chang E F, Vecht C. Epilepsy and brain tumors. Handb Clin Neurol. 2016;134:267-85. 76. Goldstein E D, Feyissa A M. Brain tumor related-epilepsy. Neurol Neurochir Pol. 2018;52(4):436-447. 77. Luo Qian, Li Y, Luo L, Diao W. Comparisons of the accuracy of radiation diagnostic modalities in brain tumor: A nonrandomized, nonexperimental, cross.-sectinoal trial. Medicine (Baltimore). 2018;97(31):e11256. 78. Fink J R, Muzi M, Peck M, Krohn K A. Multimodality Brain Tumor Imaging: MR Imaging, PET, and PET/MR Imaging. J Nucl Med. 2015;56(10):1554-61. 79. Barkovich M J, Barkovich A J. MR Imaging of Normal Brain Development. Neuroimaging Clin N Am. 2019;29(3):325-337. 80. Lequin M, Hendrikse J. Advanced MR Imaging in Pediatric Brain Tumors, Clinical Applications. Neuroimaging Clin N Am. 2017;27(1):167-190. 81. Villanueva-Meyer J E, Mabray M C, Cha S. Current Clinical Brain Tumor Imaging. Neurosurgery. 2017;81(3):397-415. 82. Mabray M C, Cha S. Advanced MR Imaging Techniques in Daily Practice. Neuroimaging Clin N Am. 2016;26(4):647-666. 83. Stein T, Moritz C, Quigley M, Cordes D, Haughton V, Meyerand E. Functional connectivity in the thalamus and hippocampus studied with functional MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 2000;21(8):1397-401. 84. Seeram E. Computed Tomography: A Technical Review. Radiol Technol. 2018;89(3):279CT-302CT. 85. Useche J N, Bermudez S. Conventional Computed Tomography and Magnetic Resonance in Brain Concussion. Neuroimaging Clin N Am. 2018;28(1):15-29. 86. Berti V, Mosconi L, Pupi A. Brain: normal variations and benign findings in fluorodeoxyglucose-PET/computed tomography imaging. PET Clin. 2014;9(2):129- 40 87. Herholz K, Langen K-J, Schiepers C, Mountz J M. Brain tumors. Semin Nucl Med. 2012;42(6):356-70. DAVID REY BRETAL - 83 - 88. Singnukar A, Poon R, Metser U. Comparison of 18F-FDG-PET/CT and 18F-FDG- PET/MR imaging in oncology: a systematic review. Ann Nucl Med. 2017;31(5):366- 378. 89. Boellaard R, O’Doherty M J, Weber W A, Mottaghy F M, Lonsdale M N, Stroobants S G et al. FDG PET and PET/CT: EAM procedure guidelines for tumour PET imaging: version 1.0. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2010;37(1):181-200. 90. Li W, Xu F, Schär M, Liu J, Shin T, Zhao Y et al. Whole-brain arteriography and venopraphy: using improved velocity-selective saturation pulse trains. Magn Reson Med. 2018;79(4):2014-2023. 91. An Y-S, Yoon J-K, Lee S J, Jeong E, Kim I-H. Anaplastic Oligodendroglioma Found as an Incidental Photopenic Lesiono n 18F-FP-CIT PET/CT Image. Clin Nucl Med. 2019;44(3):e168-e169. 92. Bouallègue F B, Vauchot F, Menjot de Champfleur N, Mariano-Goulart D. Pineal Anaplastic Ependymoma With Multifocal Intradural Extramedullary Metastases on MRI and 18FDG-PET. Clin Nucl Med. 2018;43(9):e319-e321. 93. Hashimoto S, Inaji M, Nariai T, Kobayashi D, Sanjo N, Yokota T et al. Usefulness of [11C] Methionine PET in the Differentiation of Tumefactive Multiple Sclerosis from High Grade Astrocytoma. Neurol Med Chir. 2019;59(5):176-183. 94. Bush N A, Chang S M, Berger M S. Current and future strategies for treatment of glioma. Neurosurg Rev. 2017;40(1):1-14. 95. Chen R, Smith-Cohn M, Cohen A L, Colman H. Glioma Subclassifications and Their Clinical Significance. Neurotherapeutics 2017;14(2):284-297. 96. Eckel-Passow J E, Lachance D H, Molinaro A M, Walsh K M, Decker P A, Sicotte H et al. Glioma Groups Base don 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. N Engl J Med. 2015;372(26):2499-508. 97. Latysheva A, Emblem K E, Brandal P, Vik-Mo E O, Pahnke J, Roysland K et al. Dynamic susceptibility contrast and diffusion MR imaging identify oligodendroglioma as defined by the 2016 WHO classification for brain tumors: histogram analysis approach. Neuroradiology. 2019;61(5):545-555. 98. Zhou Min, Niu C, Jia L, He H. The value of MGMT promote methylation and IDF-1 mutation on diagnosis of pseudoprogression in patients with high-grade glioma: A meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2019;98(50):e18194. CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN GENERAL - 84 - 99. Wick W, Weller M, Bent M, Sanson M, Weiler M, Deimling A et al. MGMT testing - - the challenges for biomarker-based glioma treatment. Nat Rev Neurol. 2014;10(7):372-85. 100. Garzon-Muvdi T, Kut C, Li X, Chaichana K L. Intraoperative imaging techniques for glioma surgery. Future Oncol. 2017;13(19):1731-1745. 101. Hervey-Jumper S, Berger M S. Maximizing safe resection of low- and high-grade glioma. J Neurooncol. 2016;130(2):269-282. 102. Hart M G, Grant G RI, Solyom E F, Grant R. Biopsy versus resection for highgrade glioma. Cochrane Database Syst Rev. 2019;6(6):CD002034. 103. Gupta N, Goumnerova L C, Manley P, Chi S N, Neuberg D, Puligandla M et al. Prospective feasibility and safety assessment of surgical biopsy for patients with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro Oncol. 2018;20(11):1547- 1555. 104. Azambuja J H, Silveira E F, Carvalho T R, Oliveira P S, Pacheco S, Couto C T. Glioma sensitive or chemoresistant to temozolomide differentially modulate macrophage protumor activities. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 2017;1861(11 pt A):2652-2662. 105. Zhang L, Wu X, Luo C, Qian J, Lu Y. Chemotherapy plus radiotherapy versus radiotherapy alone in patients with anaplastic glioma: a systematic review and metaanalysis. J Cancer Res Clin Oncol. 2013;139(5):719-26. 106. Braun K, Ahluwalia M S. Treatment of Glioblastoma in Older Adults. Curr Oncol Rep. 2017;19(12):81. 107. Batash Ron, Asna N, Schaffer P, Francis N, Schaffer M. Glioblastoma Multiforme, Diagnosis and Treatment; Revent Literature Review. Curr Med Chem. 2017;24(27):3002-3009. DAVID REY BRETAL - 85 - CAPÍTULO II: JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS GENERALES CAPÍTULO II: JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS GENERALES - 86 - DAVID REY BRETAL - 87 - JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS GENERALES 1. JUSTIFICACIÓN El glioma es una patología oncológica basada en el crecimiento incontrolado de células gliales y que puede afectar, de forma indiferenciada, tanto al cerebro como a la médula espinal. Esta patología provoca una sintomatología variada como cefalea, nauseas, vómitos, confusión, pérdida de memoria, cambios en la personalidad, problemas de equilibrio, incontinencia urinaria, alteraciones en la visión, dificultades en el habla y convulsiones, una sintomatología muy limitante y agresiva que acaba mellando en el día a día del paciente con este tipo de neoplasia. Los datos epidemiológicos indican que, España, presenta una incidencia baja, pero representa una causa de mortalidad importante, destacando un 15% en los niños menores de 15 años, lo que se traduce en la segunda causa de muerte por cáncer, después de la leucemia. Las técnicas diagnósticas de las que se disponen hoy en día para detectar esta patología abarcan desde el examen neurológico al uso de técnica de imagen como la MR, la CT y la PET. Todas ellas forman un abanico de posibilidades para el diagnóstico de esta patología, siendo fundamental la combinación de varias técnicas de imagen para asegurar el correcto diagnóstico y precisar el nivel de agresividad de la misma. Los tratamientos basados en cirugía y quimioterapia no funcionan, demostrando una supervivencia muy corta (15-18 meses tras la intervención). Para el avance de nuevos tratamientos (como los que presentan un enfoque biológico), es necesario reorientar las técnicas de diagnóstico, desde una visión morfológica (actualmente basada en CT y MR) hacia una visión molecular (PET), como la Medicina Nuclear. La investigación de nuevas terapias y métodos diagnósticos se apoya en el uso de modelos preclínicos y, por tanto, es necesario el desarrollo de técnicas de imagen PET preclínico que permitan guiar los nuevos tratamientos y convertirse en métodos diagnósticos para seleccionar los pacientes candidatos al tratamiento y personalización de los mismos. Únicamente de esta forma se podrá alcanzar una verdadera personalización de los tratamientos. Sin embargo, el uso de técnicas de imagen preclínica PET para el estudio del cerebro presenta múltiples desafíos y limitaciones que deben ser abordadas: - En primer lugar, es fundamental el uso de nuevas tecnologías de cuantificación de la actividad radiactiva en sangre arterial, dejando atrás métodos más rudimentarios como el contaje manual, que permiten conocer, de una forma más precisa, la concentración del radiofármaco en tiempo real, y en particular el transporte de monosacáridos, como es el caso de la glucosa, a través de la BHE. CAPÍTULO II: JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS GENERALES - 88 - - La medida de la actividad radiactiva en sangre arterial limita el seguimiento longitudinal de un modelo en diferentes tiempos, por lo que es necesario que estos nuevos métodos de cuantificación se pueden realizar varias veces sobre el mismo animal. De lo contrario, la aplicabilidad de estos métodos sería muy limitada, pues se estaría perdiendo la mayor potencialidad de las técnicas de imagen preclínica. - El estudio del metabolismo cerebral mediante PET está limitado por la presencia de glucosa en sangre, que compite con la FDG inyectada para la realización del estudio PET. La regulación de la dieta no es suficiente para el control de los niveles de glucosa en sangre y por tanto la técnica PET tiene una fuente de incertidumbre asociada a este efecto que debe ser tomada en consideración. - La presencia de la BHE puede interferir en los estudios de imagen PET, especialmente en aquellos casos en los que el radiofármaco empleado no es capaz de atravesar la BHE, como es el caso de los anticuerpos monoclonales. Es necesario conocer en detalle cómo se comportan los anticuerpos monoclonales ante la BHE a lo largo del desarrollo del tumor. DAVID REY BRETAL - 95 - 2. INTRODUCCIÓN La perfusión cerebral, también conocida como flujo sanguíneo cerebral (CBF), es la tasa de aporte sanguíneo al tejido cerebral. Este concepto hace referencia al flujo sanguíneo a nivel de los capilares tisulares, en contraste con el flujo sanguíneo en las arterias principales. La perfusión cerebral, generalmente, se mide en unidades de mL g-1 min-1 y, en la materia gris de tejido sano, generalmente se suministra aproximadamente 60mL (100g)-1 min-1 de sangre. En el caso de la materia blanca en tejido sano tiene aproximadamente 1/3 de ese valor, por eso los mapas de CBF tienen una materia gris muy contrastada con respecto a la materia blanca. Este flujo es de gran relevancia en el estudio de la fisiología y el funcionamiento cerebral, ya que es responsable del suministro de oxígeno y de nutrientes a los tejidos, al igual que de la eliminación de los productos de deshecho. La viabilidad de cualquier tejido depende de un suministro de sangre regular, por lo que una interrupción en la perfusión puede provocar, no solo un mal funcionamiento del mismo, si no también la necrosis del tejido afectado. La función cognitiva está respaldada por un aumento asociado al flujo sanguíneo cerebral en las regiones específicas y, por ello, un correcto flujo condiciona el funcionamiento normal o anormal del cerebro [1]. Como definición, el parámetro “arterial input function” (AIF) hace referencia a la concentración del radiofármaco en plasma arterial medido a lo largo del tiempo. Desde un punto de vista histórico, uno de los primeros informes de medición de AIF lo realizaron Bruce Rosen y colaboradores, hace más de dos décadas. En su estudio pionero, estos autores compararon la arteria femoral mediante una muestra directa de sangre en un modelo canino de hipercapnia con una región de interés sobre la arteria cerebral media (MCA). Los resultados mostraron importantes datos con los obtenidos de muestras simultáneas de sangre extraídas de la arteria [2]. La AIF puede ser obtenida mediante diferentes técnicas, como métodos invasivos de muestreo continuo de sangre, métodos invasivos de muestras de sangre arterial obtenidas en diferentes tiempos tras la inyección del radiofármaco, métodos mínimamente invasivos basados en la función de entrada estimado a partir de la información previa obtenida de una población anterior o mediante una “image-derived input function” (IDIF) obtenida mediante la creación de una región de interés (ROI) sobre una arteria o región ventricular [3]. Un estudio o escaneo dinámico es un proceso en el cual las imágenes 2D o 3D se adquieren una y otra vez durante un período de tiempo, formando una serie temporal de “datasets” de imágenes 2D/3D. Así, durante la exploración PET dinámica, las imágenes se adquieren en el mismo momento en el que se administra el radiofármaco, obteniéndose los primeros fotogramas de imágenes durante 5 segundos de duración para conocer y precisar la dinámica del radiofármaco. Posteriormente, los fotogramas siguientes son adquiridos durante 30 segundos [4]. CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 96 - Teniendo de referencia lo anteriormente mencionado, los estudios de la PET, fundamentales para el estudio de las características mencionadas, pueden llegar a agruparse dependiendo del objetivo final del mismo, pudiendo diferenciarse las PET de carácter clínico y las PET de carácter preclínico, cuya principal diferencia está ligada con el sujeto al que está dirigida la técnica, el ser humano o roedores. A su vez, dependiendo del enfoque del estudio que se pretenda realizar y lo que se pretenda observar, los estudios se pueden subdividir en dos grupos, los estudios estáticos o también denominados como clásicos y los estudios dinámicos o en tiempo real. A continuación, se realizará una breve descripción de cada uno de los enfoques de estos estudios [5,6]: - Estudios estáticos o clásicos: hacen alusión a los estudios cuya principal característica es la estabilidad de la distribución del trazador o, lo que se puede considerar como estable, transcurrido cierto tiempo en el organismo o estructura de estudio. Es común en este campo los estudios con FDG, con un tiempo de espera tras la administración del radiofármaco de 60 minutos antes de la adquisición de las imágenes de estudio [5]. - Estudios dinámicos o en tiempo real: al contrario de lo mencionado anteriormente, los estudios con un carácter dinámico muestran el movimiento del trazador durante la adquisición de la imagen, lo que permite obtener una visión global del recorrido y de lo que está ocurriendo en cada momento. En este caso, la adquisición de las imágenes se produce al mismo tiempo que la inyección del radiofármaco, lo que permite ver la distribución de la sustancia radiactiva por todo el organismo. La principal aplicación de este tipo de estudios es el desarrollo de fármacos o el estudio de patologías de las que se desconoce el funcionamiento del trazador [6]. Aunque los estudios de carácter dinámico tienen un gran interés en el campo de la investigación, y principalmente en el campo de la neurociencia, su aplicación se ha visto limitada por la necesidad implícita de disponer de medidas de la concentración de radiofármaco en sangre arterial a lo largo del tiempo. De manera convencional se han utilizado sistemas de recolección de sangre a través de la vena dorsal o lateral en la cola del animal. Estos sistemas de rutina permiten la obtención de una pequeña cantidad de sangre pero, en el caso de los roedores, esto puede suponer una gran limitación debido al reducido volumen sanguíneo que presentan. Por lo tanto, con respecto a lo mencionado, no debe ser utilizada en todos los estudios que requieran una valoración constante del flujo sanguíneo. Dicha restricción motivó al desarrollo de diferentes métodos alternativos: - Muestreo de volúmenes mediante microfluido: Esta técnica presenta como objetivo principal la simplificación y automatización del procedimiento de la toma de muestras sanguíneas en ratones, para que la PET en roedores puede aplicarse de forma rutinaria. El mencionado sistema consiste en un chip de dimetilsiloxano con una capa fluídica que contiene entrada/salida de sangre, una entrada/salida del bloque de heparina y un depósito de sangre. En este caso, para que el sistema funcione correctamente es necesario la canalización de la arteria femoral del roedor que, posteriormente, será DAVID REY BRETAL - 97 - conectado al chip para mantener un flujo constante de sangre. Una vez finalizada la intervención, se inyecta el radiofármaco a estudio para poder obtener las imágenes PET correspondientes. Este sistema, presenta el gran inconveniente de la generación del correspondiente chip y la consiguiente intervención para la circulación de la sangre a través del chip [7]. - Uso de sondas-ß de medición: A diferencia del muestreo manual, el cual es poco preciso en animales de tamaño reducido por la limitación del volumen de sangre, este sistema microvolémico se basa en la detección directa de positrones sin una bomba peristáltica. En esta ocasión es necesaria la canulación del roedor pero seleccionando la arteria carótida y la vena yugular. Una vez finalizada la intervención se colocará al animal en el interior de la PET a la vez que se inyecta la solución radiactiva para la obtención de las imágenes pertinentes. Con este mecanismo se obtendrá una curva de tiempo-actividad en sangre con un nivel de sensibilidad adecuado para la mayoría de los estudios con una finalidad farmacocinética [8]. - Image-Derived Input Function: A pesar de los métodos físicos, el principal foco de investigación se ha centrado en el desarrollo del método IDIF, donde la radiactividad sanguínea se estima directamente a partir de las imágenes dinámicas de PET, no siendo necesaria la implementación de cirugías para mantener un flujo constante de sangre. La generación del IDIF a partir del análisis simple de los volúmenes de la acumulación de sangre en regiones como el hígado o los ventrículos cardíacos también demuestra dificultades, presentando defectos en la absorción de FDG, siendo mucho más impreciso [9]. Con la premisa de que los estudios dinámicos de PET cerebral representan una herramienta fundamental para el desarrollo de nuevos fármacos y el estudio de nuevas afectaciones, se ha implementado un protocolo de obtención de reproducción interanimal a través de la información cuantitativa de la concentración del radiofármaco a lo largo del tiempo en el organismo de un roedor. Sin embargo, la mayor dificultad de este tipo de investigaciones es el muestreo arterial para medir la concentración de la actividad en sangre, siendo necesaria su estandarización y su evaluación detallada. 3. MATERIAL Y MÉTODOS Preparación del animal El presente trabajo se llevó a cabo con ratas macho Sprague-Dawley (con un peso promedio de 310g) suministradas por las instalaciones de animales de la Universidad de Santiago de Compostela. Antes de los estudios, los animales estuvieron en jaulas individuales bajo condiciones controladas de temperatura (21 ± 2ºC) y humedad (60 ± 5%), con ciclos día-noche regulados por luz artificial (12/12h) y alimentados ad libitum. Se llevaron a cabo todas las directrices institucionales y/o nacionales para el uso y cuidado CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 98 - de los animales. Todos los experimentos con animales siguieron la Directiva de la UR 2010/63/UE para la experimentación con animales, siendo aprobados por la Red Gallega de Comités de Ética de la Investigación y cumplieron las directrices ARRIVE [10]. Bases de la cirugía y la circulación extracorpórea en preclínica En el caso de la circulación extracorpórea para roedores, la cual no involucra una intervención cardíaca, el procedimiento es distinto y más simple que en humanos. Para la realización de la cirugía, es necesario la creación de un protocolo específico para el sistema de muestreo de sangre arterial, el cual será usado para la obtención, en tiempo real, de la actividad en sangre que presenta el roedor. El procedimiento que se ha llevado a cabo para la presente tesis doctoral consta de los siguientes materiales (ver Figura 3.1 y Figura 3.2): - Soluciones: 1. Heparina sódica (1%, 5%) en solución inyectable. 1.1. Catéteres de la bomba peristáltica: [Heparina]0 = 1000UI/mL (5% heparina). [Heparina]1 = 200UI/20mL. 200UI x 1mL/1000UI = 0,2mL heparina; 0,2mL heparina x 20mL = 4mL. heparina + 16mL suero fisiológico. 1.2. Catéteres del paquete vascular femoral: [Heparina]0 = 1000UI/mL (1% heparina). [Heparina]1 = 50UI/20mL. 50UI x 1mL/1000UI = 0,05mL heparina; 0,05mL heparina x 20mL = 1mL. heparina + 19mL suero fisiológico. 2. Cloruro sódico al 0,9% en solución para perfusión intravenosa. 3. Peróxido de hidrógeno 4,9%. 4. Alcohol 70º. 5. Povidona yodada. 6. Agua. - Material de limpieza: 7. Bastoncillos de algodón higiénicos. 8. Algodón. 9. Papel absorbente. - Sistema de circulación: 10. Catéter de politeno de calibre fino PE 50 (0,58mm ID; 0,96mm OD). 11. Catéter de politeno de calibre fino PE 10 (0,28mm ID; 0,61mm OD). 12. Puntas romas (23G). 13. Jeringas de 2mL, 5mL y 10mL. 14. Tubo de bomba peristáltica. DAVID REY BRETAL - 99 - - Material quirúrgico: 15. Microtijeras. 16. Tijeras de punta fina o Iris. 17. Protectores para instrumental quirúrgico. 18. Pinza de punta curva o Bonn. 19. Fórceps estándar recto de tamaño pequeño y grande. 20. Hilo de sutura 4-0. 21. Fórceps de canulación para vasos sanguíneos. 22. Mosquito fórceps. 23. Pinza Halsey. 24. Anillos para fórceps. - Equipamiento técnico: 25. Cama térmica para mantener la temperatura corporal del animal entre los 36 y 37ºC. 26. Lupa binocular con cámara fotográfica. 27. Cámara de inducción. 28. Equipo de anestesia de isoflurano. 29. Adaptador para el cabezal de medición de sangre arterial. Figura 3.1: Representación del material quirúrgico necesario para la realización de la circulación extracorpórea. En la figura se puede observar la heparina sódica al 1% y 5% en solución inyectable (1), cloruro sódico al 0,9% en solución para perfusión intravenosa (2), bastoncillo para la eliminación del tejido conectivo (7), los catéteres de politeno de calibre fino PE 50 y PE 10 con sus respectivos calibres (10-11), jeringas de 2mL (13), tubo para bomba peristáltica (14) y adaptador (29). CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 100 - Figura 3.2: Representación del material quirúrgico necesario para la realización de la cirugía extracorpórea. En la figura se puede observar microtijeras (15), tijeras de punta fina o tijeras Iris (16), las pinzas de curva o Bonn (18) fórceps estándar recto de tamaño pequeño y grande (19), hilo de sutura de 4-0 (20), fórceps de canulación para vasos sanguíneos (21), mosquito fórceps (22) y pinza Halsey (23). Escáner Albira PET/CT El dispositivo del que dispone actualmente el Centro de Biomedicina Experimental (CEBEGA), es el escáner Albira PET/CT, diseñado y desarrollado para el estudio de roedores. Su característica más destacable es el hecho de su composición con cristales centelleantes monolíticos, ya que la mayoría de los sistemas PET se basan en detectores pixelados, ya sea en cristales de centelleo o en detectores de estado sólido a temperatura ambiente. En el dispositivo que se presenta, los subsistemas se unen en una combinación común con PET en la parte delantera y CT en la parte trasera. La cama de imagen tiene suficiente movimiento con las dos modalidades, lo que permite llegar a un campo axial de hasta 220mm. El sistema CT consiste en un tubo de rayos X de microfoco que utiliza una radiografía de 50kV con un tamaño de punto focal de 35m y un detector de panel plano pixelado. El tubo de rayos X está sellado y tiene un ánodo de tungsteno fijo, además, el conjunto de elementos está empaquetado dentro de un cable de acero inoxidable con un blindaje a 0,25mR/h a 5cm. La refrigeración se coloca dentro del tubo para mejorar la disipación del calor y la fuente de rayos X de microfoco se opera de forma continua, entregando un haz de rayos X de cono con una corriente máxima de 1mA. El sensor de imagen de rayos X consiste en una matriz pixelada de 2400 x 2400 cubriendo una superficie de 120 x 120 mm2, lo que permite una resolución nominal de 8lp/mm (pares de líneas por milímetro) [11]. Este sistema PET se compone de ocho módulos extraíbles e idénticos formando un octágono, en donde cada módulo presenta un grosor de 10mm de cristal LYSO monolítico acoplado a un MA-PMT H8500 de Hamamatsu Photonics. Los cristales seleccionados son continuos para que estos detectores puedan tener una mayor eficacia que los que están DAVID REY BRETAL - 101 - basados en cristales pixelados, junto con una excelente resolución espacial. Además, presenta una reducción del número de señales MA-PMT, aunque en este caso se extraen cinco señales dedicadas a la determinación de la posición. Un circuito adicional, incorporado en la red de ánodos resistivos, mide el ancho de la distribución de la luz, que es directamente el borde “Field of View” (FOV) transaxial. La ventana de tiempo puede variar entre 3 a 11ns, aunque en el modo de funcionamiento normal, este valor se establece entorno a los 5 ns. Este subsistema PET tiene un FOV axial de 40mm y un FOV transaxial de 80mm de diámetro, funcionando en modo de adquisición de datos en 3D [12]. Las imágenes PET se pueden reconstruir utilizando algoritmos de máxima probabilidad 3D y maximizando la expectativa del subconjunto ordenado (MLEM y OSEM) (ver Figura 3.3, Figura 3.4 y Figura 3.5). Con este equipo se realiza una adquisición dinámica, justo en el momento de la administración del radiofármaco F18-FDG, de 60 minutos, cuyo protocolo se lleva a cabo centrando el cerebro en el FOV del equipo. Para la reconstrucción, se debe tener en cuenta que se trata de un estudio de carácter dinámico y que no se hace corrección por decaimiento isotópico (“Decay”). Antes de la finalización del PET, en concreto los 15 minutos previos, se detiene su medición, ya que es el tiempo necesario para poder desconectar la circulación extracorpórea del dispositivo y evitar el movimiento de la camilla. En consecuencia, no se tienen en cuenta los últimos tres frames para el análisis cuantitativo (ver Tabla 3.1). Tabla 3.1: Tabla representativa del protocolo de adquisición con el micro PET/CT Albira. Este protocolo se lleva a cabo para tener controlado el tiempo de adquisición exacto y contemplar, sin problemática, los primeros 10 frames, donde se podrá observar el pico de administración del radiofármaco y como este se distribuye de forma homogénea por el organismo con el paso del tiempo. Todo esto está aplicado para el estudio de circulación extracorpórea con el Swisstrace Twilite II. CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 102 - Figura 3.3: Ilustración del dispositivo de microPET/CT Albira Bruker. En la ilustración se puede observar la antigua localización del dispositivo en el Servicio de Medicina Nuclear del Hospital Clínico Universitarios de Santiago de Compostela (CHUS), previamente a su traslado al CEBEGA. Figura 3.4: Ilustración del interior del dispositivo de microPET/CT Albira. Se puede observar en la imagen el anillo de PET (1) y el anillo del CT (2) a través de los cuales se realiza la adquisición de las imágenes para su posterior reconstrucción y visualización. 1 2 DAVID REY BRETAL - 103 - Figura 3.5: Ilustración de la camilla del dispositivo microPET/CT Albira. En esa camilla del dispositivo es donde se situará el roedor para realizar las pruebas pertinentes. En el interior de la camilla se puede observar una boquilla, necesaria para que el animal esté en continuo flujo del anestésico isoflurano, para asegurar que el roedor esté anestesiado durante el proceso de adquisición de las imágenes, ya sean de PET, CT o ambas. Dispositivo de muestreo sanguíneo Swisstrace Por otro lado, con respecto al sistema de muestreo sanguíneo Swisstrace Blood Sampler Twilite Two, el núcleo de dicho sistema es un cabezal de medición compacto, el cual ha sido creado a partir de un metal sólido (Tungsteno), protegiendo los cristales de LYSO de la radiación externa, lo que le permite ser preciso con la medición de la actividad sanguínea que pasa por su interior. Este cabezal presenta unas dimensiones del 80 x 62 x 56mm, con un peso aproximado de 6kg. Este tipo de cristales se caracterizan por su rápida descomposición, su alto rendimiento luminoso y su alta densidad, siendo un material ideal para su uso en Medicina Nuclear. Los centelleos se transmiten a la unidad de detección de fotones a través de dos guías de luz flexibles de alta eficacia, donde los conectores de LYSO presentan una longitud de entre 2, hasta 10m para PET/MR con acoplador óptico. La estructura no consta de componentes electrónicos en el cabezal del sensor, evitando de este modo cualquier problema de interferencia electromagnética con el resto de los dispositivos. Su doble uso, tanto en roedores como en humanos, le permite tener el siguiente rendimiento [13]: - ID del catéter de 0,28mm: 0,2cps/kBq/mL (ratón). - ID del catéter de 0,58mm: 0,8cps/kBq/mL (rata). - ID del catéter de 1,00mm: 2,4cps/kBq/mL (humano). Además, presenta una linealidad completa de hasta 6000cps, con una desviación de 10000cps, que corresponde al 1% (ver Figura 3.6). CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 104 - Figura 3.6: Ilustración del equipo de muestreo de sangre arterial Swisstrace Blood Sampler Twilite Two. Además de este dispositivo, en la parte superior izquierda (1) se puede observar la bomba peristáltica, una bomba hidráulica que alterna los mecanismos de compresión y relajación de ambos catéteres con el objetivo de dirigir el contenido que transporta en la dirección programada, encargada de la circulación de la sangre de forma extracorpórea y, a la derecha, encima del dispositivo (2), el cabezal encargado de la medición de la actividad de sangre arterial. En la región derecha (3), separada del equipo, se puede observar el equipo de anestesia necesario para que el roedor se encuentre bajo el flujo de isoflurano a lo largo de todo el estudio. El equipo consta de un panel táctil que sirve tanto como interfaz de usuario como para mostrar el estado actual y los valores medidos durante el estudio. Todo esto le permite ser un sistema de medición del curso temporal de la radiactividad en sangre con una alta resolución temporal tanto, como se ha mencionado, en pequeños como en grandes sujetos para la experimentación, con una frecuencia de muestreo de 1kHz máximo. Los requisitos del sistema soportan el sistema operativo de 64bits de Windows 10, 8, 7, MacOSX y Linux, con hasta 4GB de Ram, siendo su uso idóneo para obtener datos en conjunto con el equipo de PET para preclínica. Con la ayuda del adaptador del equipo de circulación extracorpórea, se introduce el catéter de la arteria femoral en el cabezal de medición de la actividad. Tras realizar la unión de los catéteres a la bomba peristáltica y de la introducción del catéter arterial en el detector del sistema de circulación, se deja capturar al equipo la actividad ambiental durante dos minutos para tener de referencia este valor con respecto al que después se obtendrá una vez que se introduzca la radiación. Una vez terminado el proceso de adquisición, se procede a lanzar el estudio PET y, posteriormente, la administración de la 18F-FDG en uno de los extremos habilitados en la bomba peristáltica para iniciar el estudio. El método para finalizar la técnica se completa con una administración intracardíaca de 10mL de Cloruro Potásico intraperitoneal. DAVID REY BRETAL - 111 - del trabajo, en la que se pretendía evaluar la reproducibilidad de las medidas de las curvas de actividad en sangre en un grupo de animales sanos con diferentes características. Empleamos una muestra de 11 animales con pesos variables, de los cuales fueron operados con éxito 10/11, mostrando que nuestro protocolo conduce a una eficiencia alta en la generación de la circulación extracorpórea (91% de éxito en la cirugía). El principal motivo del fracaso de uno de los sujetos fue debido a una obstrucción de la arteria femoral, debido a la pérdida de sangre a la que se sometió el roedor a la hora de canalizar la vena femoral. Esta hemorragia, la cual no fue superior a 2 mL, generó dicha obstrucción de la arteria debido a la pérdida de flujo, lo que impidió canalizar dicho vaso y por lo tanto, finalizar la cirugía con éxito. Obviamente este animal no se incorporó al análisis. Sobre los 10 animales operados con éxito se realizó un estudio de PET cerebral para observar el efecto de la medida de actividad en sangre sobre los parámetros cinéticos obtenidos a través de esta técnica de imagen. Los resultados mostraron que los AIF pueden ser generados con una alta reproducibilidad inter-animal y una tasa de muestreo suficiente para capturar con precisión la función de pico, con un pico bien definido de 544 ± 65kBq/cm3 centrado en 21,5 ± 0,5 segundos después de la inyección del bolo, que es completamente inalcanzable utilizando las medidas derivadas de MS. Con todo esto, la comparativa de AIF e IDIF demostró que los valores obtenidos con IDIF tanto en cava como en corazón se encuentran claramente por debajo del pico obtenido con AIF, aunque la liberación de FDG a la sangre se produzca de una forma similar en ambas, sin llegar a converger a cero. La puesta en marcha de este protocolo permitirá a la unidad de imagen del CEBEGA el desarrollo de estudios de imagen dinámicos, que aportan información adicional sobre las imágenes estáticas que se obtienen actualmente. Obviamente se trata de un procedimiento muy complejo que no se realizará de rutina, pero diversos trabajos con métodos de muestreo similares ya han mostrado que estos estudios puede aportar información de gran valor diagnóstico, por ejemplo para diferenciar entre tumores cerebrales frente al tejido necrótico [16]. 6. CONCLUSIÓN Se ha conseguido implementar un nuevo protocolo de cirugía extracorpórea con un 91% de éxito que permite estimar la concentración de radiofármaco en sangre arterial en tiempo real mostrando que los AIF pueden generarse con una alta reproducibilidad interanimal y una alta tasa de muestreo, al mismo tiempo que se determinó que las diferencias longitudinales de IDIF fueron superiores a las de “Real-time AIF”. CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 112 - 7. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue, parcialmente, apoyado por los proyectos ED431F 2017/04 (Xunta de Galicia), EAPA_791/2018 (Interreg UE) y RYC-2015/17430 (Ramón y Cajal, Pablo Aguiar). Artículo reproducido con permiso de SPRINGER NATURE. 8. CONFLICTOS DE INTERÉS Los autores declaran no tener conflictos de interés. 9. CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES DRB realizó las operaciones y redactó el manuscrito; AM preparó las figuras y contribuyó al análisis de los datos; NGL verificó los métodos analíticos y elaboró casi todos los detalles técnicos; AFF y JSR ayudaron a analizar los resultados; AR ayudó a diseñar e instruir el experimento; PA concibió el estudio y revisó el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito. DAVID REY BRETAL - 113 - 10. REFERENCIAS 1. Slupe AM, Kirsch JR. Effects of anesthesia on cerebral blood flow, metabolism, and neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(12):2192-2208. 2. Bourassa-Moreau B, Lebel R, Gilbert G, Mathieu D, Lepage M. Increased precision in the intravascular arterial input function with flow compensation. Magn Reson Med. 2019;82(5):1782-1795. 3. Naganawa M, Gallezot J, Shah V, Mulnix T, Young C, Dias M et al. Assessment of population-based input functions for Patlak imaging of whole body dynamic 18 F- FDG PET. EJNMMI Phys. 2020;7(1):67. 4. O’Sullivan F, Kirrane J, Muzi M, O’Sullivan JN, Spence AM, Mankoff DA et al. Kinetic Quantification of Cerebral PET-FDG studies without Concurrent Blood Sampling: Statistical Recovery of the Arterial Input Function. IEEE Trans Med Imaging. 2010;29(39):610-624. 5. Listewnik MH, Piwowarska-Bilska H, Kurantowicz M, Ostrowski M, Borowiecki A, Safranow K et al. Semi-quantitative method for the assessment of focal lesions in parathyroid scintigraphy with relation to histopathology: a prospective study. Nucl Med Rev Cent East Eur. 2017;20(1):18-24. 6. Danesh-Sani SH, Zakavi SR, Oskoueian L, Kakhki VR. Comparison between 99mTc- sestamibi gated myocardial perfusion SPECT and echocardiography in assessment of left ventricular volumes and ejection fraction--effect of perfusion defect and small heart. Nucl Med Rev Cent East Eur. 2014;17(2):70-4. 7. Musteata FM. Pharmacokinetic applications of microdevices and microsampling techniques. Bioanalysis. 2009;1(1):171-85 8. Convert L, Morin-Brassard G, Cadorette J, Archambault M, Bentourkia M, Lecomte R. A new tool for molecular imaging: the microvolumetric beta blood counter. J Nucl Med. 2007;48(7):1197-206. 9. He X, Wedekind F, Kroll T, Oskamp A, Beer S, Drzezga A et al. Image-Derived Input Functions for Quantification of A1 Adenosine Receptors Availability in Mice Brains Using PET and [18F]CPFPX. Front Physiol. 2020;10:1617. 10. Kilkenny C, Browne W, Cuthill IC, Emerson M, Altman DG (2010) Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol 160(7):1577–1579. CAPÍTULO III: MEDIDAS DE ARTERIAL INPUT FUNCTION EN TIEMPO REAL PARA ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICO - 114 - 11. Sánchez F, Oreo A, Soriano A, Correcher C, Conde P, González A, et al. ALBIRA: a small animal PET/SPECT/CT imaging system. Med Phys. 2013;40(5):051906. 12. Spinks TJ, Karia D, Leach MO, Flux G. Quantitative PET and SPECT performance characteristics of the Albira Trimodal pre-clinical tomograph. Phys Med Biol. 2014;59(3):715-31. 13. Swisstrace GMBH. 2018. Disponible en: https://www.swisstrace.ch 14. Pandey SK, Kaur J, Easwaramoorthy B, Shah A, Coleman R, Mukherjee J. Multimodality imaging probe for positron emission tomography and fluorescence imaging studies. Mol Imaging. 2014;13:1-7. 15. Miwa K, Inubushi M, Takeuchi Y, Katafuchi T, Koizumi M, Saga T, Sasaki M. Performance characteristics of a novel clustered multi-pinhole technology for simultaneous high-resolution SPECT/PET. Ann Nucl Med. 2015;29(5):460-6. 16. Bolcaen J, Lybaert K, Moerman L, Descamps B, Deblaere K, Boterberg T et al. Kinetic Modeling and Graphical Analysis of 18F-Fluoromethylcholine (FCho), 18F- Fluoroethyltyrosine (FET) and 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) PET for the Fiscrimination between High-Grade Glioma and Radiation Necrosis in Rats. PLoS One. 2016;11(8):e0161845. DAVID REY BRETAL - 115 - CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION - 116 - DAVID REY BRETAL - 117 - CAPÍTULO IV 1. RESUMEN Los estudios preclínicos de PET cerebral dinámico están limitados por la necesidad de realizar medidas de la AIF durante la adquisición. En este sentido, el uso de una derivación arterio-venosa es un método prometedor para la generación de “Real-time AIF”, pero su aplicación en estudios longitudinales no es viable, principalmente debido a las cirugías complejas que involucra y las altas tasas de fracaso. En este capítulo, se ha estudiado la viabilidad y reproducibilidad para llevar a cabo una estrategia de derivación arterio-venosa doble, que permita realizar estudios longitudinales de PET cerebral dinámico. Para ello, se estudió la viabilidad de las derivaciones arterio-venosas dobles en ratas en la región inguinal derecha e izquierda y se evaluó la reproducibilidad de la AIF inter-animal e intra-animal. Por otro lado, también se obtuvo una medida de IDIF, para comparación con la AIF. Siguiendo esta metodología, se realizaron estudios dinámicos de FDG PET cerebral para estimar las constantes cinéticas y la CMRglc obtenidas a partir del análisis estándar 2TCM y de Patlak, empleando tanto AIF como IDIF. En primer lugar, los resultados demostraron que las AIF mediante las derivaciones arterio-venosas dobles pueden obtenerse con una tasa de éxito de la cirugía muy alta (100%). Estos resultados proporcionaron mediciones de AIF altamente reproducibles intra-animal (5- 10%). En esta situación, los modelos cinéticos también aportaron buenos resultados, mostrando que tanto las constantes cinéticas como la CMRglc pueden estimarse eficazmente sin sesgo asociado a la doble derivación. Por otro lado, la comparativa con las medidas de IDIF longitudinal mostraron que también es un método válido y que no muestra sesgo a lo largo del tiempo. Sin embargo, las medidas de IDIF mostraron mayores incertidumbres intra-animal que las AIF. Este trabajo demuestra la viabilidad y la alta reproducibilidad de la realización de mediciones de AIF longitudinales y, en consecuencia, de un modelado cinético preciso utilizando el método de la derivación arterial. Palabras clave: Arterial Input Function, Tasa de glucosa metabólica cerebral, PET dinámico, Modelado cinético, PET preclínico. CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION - 118 - DAVID REY BRETAL - 119 - 2. INTRODUCCIÓN Los estudios de PET cerebral dinámico representan la técnica de referencia para la evaluación in vivo del intercambio de fármacos o radiotrazadores a través de la BHE, la unión de receptores o las tasas de metabolismo y perfusión. En particular, el PET dinámico con [18F]F-FDG se utiliza habitualmente para estimar la Tasa Metabólica Cerebral de Glucosa (CMRglc) mediante un modelo de 2 compartimentos tisulares (2TCM) [1] o, alternativamente, el análisis gráfico de Patlak [2]. La mayoría de los modelos cinéticos requieren de la estimación de la concentración de FDG en el plasma arterial a lo largo del tiempo (AIF) y la concentración de FDG en el tejido diana (curva de tiempo-actividad tisular) para proporcionar las constantes cinéticas que describen el transporte de la glucosa a través de la barrera [3]. Actualmente, estos estudios tienen un gran interés en aquellos modelos animales en los que se están evaluando nuevos fármacos o radiotrazadores. Sin embargo, siguen viéndose obstaculizados por el complejo procedimiento relacionado con la medición precisa de AIF. El modelo estándar para adquirir la AIF se basa en el muestreo manual (MS) mediante un catéter colocado a nivel arterial. Como alternativa, la AIF también puede estimarse a partir de imágenes de PET utilizando la captación de FDG en un volumen de interés colocado sobre los ventrículos cardíacos o en un vaso de gran tamaño (IDIF). Ambos métodos presentan importantes limitaciones. El método MS, considerado como la técnica de referencia en los estudios humanos, tiene importantes limitaciones en los estudios preclínicos, principalmente debido al pequeño volumen de sangre en los roedores. En estos casos, el método MS puede producir una pérdida importante de volumen de sangre que afecta a la estabilidad fisiológica [4]. Además, el método MS proporciona un muestreo muy pobre (pocas medidas) y, en consecuencia, estimaciones inexactas de la posición del pico de AIF. Esto es especialmente preocupante para el modelado de radiotrazadores de dinámica rápida, como la FDG, lo que afecta negativamente a las constantes cinéticas obtenidas [5]. Por otro lado, las alternativas basadas en estimaciones de IDIF pueden estar muy sesgadas por el ruido estadístico y el spill-over de los tejidos circundantes, que depende del efecto de volumen parcial [6,7]. Se han propuesto diferentes métodos alternativos al método MS para reducir la pérdida de volumen sanguíneo y aumentar la tasa de muestreo de las estimaciones de AIF [8,9]. El presente trabajo se centra en el uso de una de las soluciones más prometedoras que se basa en las derivaciones arterio-venosas. Este método requiere el uso de un dispositivo que consiste en catéteres conectados a una bomba peristáltica, un detector de centelleo compacto y blindado colocado cerca del animal, conectado al mismo tiempo de tal manera que la sangre circula externamente en un sistema cerrado y pasa a través de los detectores de radiactividad (CAPÍTULO III) [4]. Trabajos anteriores han demostrado que esta derivación arterio-venosa puede ser considerada como una alternativa precisa y eficiente para la generación de AIF con alta tasa de muestreo y sin pérdida de volumen sanguíneo [10-14]. Sin embargo, la realización de estudios PET repetidos en el tiempo utilizando derivaciones arterio-venosas se considera un reto técnico debido a la CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION - 120 - complicada cirugía que requiere este método [10]. Se debe hacer mención que la aplicación de derivaciones arterio-venosas en estudios PET longitudinales se ha utilizado escasamente [13] y sigue siendo un procedimiento poco utilizado. En este trabajo se ha estudiado la viabilidad de una estrategia de doble cirugía para realizar estudios de PET dinámicos longitudinales con “Real-time AIF” en ratas. La estrategia que se ha seguido ha sido diseñada específicamente para aumentar la reproducibilidad de las medidas resolviendo los problemas anteriormente mencionados. 3. MATERIAL Y MÉTODOS Preparación del animal El presente trabajo se realizó con ratas macho Sprague-Dawley (con un peso promedio de 323 ± 30g) suministradas por las instalaciones de animales de la Universidad de Santiago de Compostela. Antes de los experimentos, los animales fueron mantenidos en jaulas individuales bajo condiciones controladas de temperatura (21 ± 2ºC) y humedad (60 ± 5%), con ciclos día-noche regulados por luz artificial (12/12h) y alimentados ad libitum. Se siguieron todas las directrices institucionales y/o nacionales aplicables para el cuidado y uso de los animales. Todos los experimentos con animales cumplieron las directrices ARRIVE [15] y se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva de la UR 2010/63/UE para la experimentación con animales, siendo aprobados por la Red Gallega de Comités de Ética de la Investigación. Protocolo de derivación arterio-venosa Se evaluó la viabilidad de realizar derivaciones arterio-venosas longitudinales a lo largo del tiempo en el mismo animal siguiendo el protocolo de generación de circulación extracorpórea, que supone el método de MS. Esta cirugía requirió una optimización y entrenamiento previos para sortear los desafíos que surgen al realizar evaluaciones repetidas en un mismo animal. Cada rata fue colocada en la mesa de operaciones bajo un 2% de isoflurano para realizar una cirugía aséptica con cateterización de la arteria y vena femoral derecha. Se utilizó una combinación de catéteres de polietileno (PE10 con 0,28mm de diámetro interior, 0,61mm de diámetro exterior; PE50 con 0,58mm de diámetro interior, 0,96mm de diámetro exterior) llenos de solución salina heparinizada (50UI/mL) para realizar el cateterismo. Se sujetaron los catéteres con seda trenzada 4-0 rodeando los vasos y se completó la intervención con tres puntos de sutura para asegurar la zona de la cirugía. Tras la optimización de la intervención mencionada, se definió el protocolo óptimo utilizando catéteres fusionados P10 y P50 para facilitar la cateterización de los vasos. Se utilizaron diferentes longitudes de catéter para cada vaso de 0,6mm (PE10) y 47mm (P50) para las arterias y 0,7mm (P10) y 38mm (P50) para las venas. Basándose en la experiencia previa, la buena evolución de los animales, sin mostrar signos de infección tras la cirugía, fue la principal razón para descartar el tratamiento con DAVID REY BRETAL - 127 - Figura 4.5. Constantes cinéticas y tasas metabólicas en el primer estudio (barras grises) y en el segundo estudio (barras blancas) obtenidas del 2TCM (a1, a2, b1, b2) y del análisis gráfico de Patlak (c1, c2) utilizando “Real-time AIF” (promediado en 5 ratas) y obtenidas del 2CTM (d1) y del análisis gráfico de Patlak (d2) utilizando IDIF. CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION - 128 - 5. DISCUSIÓN Se ha evaluado la viabilidad y la reproducibilidad de los estudios de PET dinámicos longitudinales utilizando mediciones de “Real-time AIF” aplicando un nuevo método de derivación arterial basado en una estrategia de doble cirugía. Los hallazgos presentados en este trabajo representan una contribución para ayudar a que el método de derivación arterial se convierta en el método estándar para los estudios PET dinámicos preclínicos, en particular, cuando el radiotrazador estudiado requiere una estimación precisa del pico de AIF. Esta afirmación se justifica en base a tres cuestiones principales, que se discuten ampliamente a continuación. El trabajo proporciona un nuevo impulso a las ventajas previamente reportadas del método de derivación arterial con respecto al método estándar de MS [10-12, 17, 18]. Todas las AIF se generaron con una alta tasa de éxito de las cirugías y, por tanto, evitando la pérdida de sangre, un problema importante de los métodos de MS en pequeños animales [4,5]. En esta cuestión, se confirma que el método de derivación arterial puede considerarse un método preciso con una alta tasa de muestreo para la generación de “Real-time AIF” que evita las limitaciones del método estándar de MS. Con todo esto, el trabajo aborda una de las cuestiones más preocupantes que hay que llevar a cabo para considerar la derivación arterial como el nuevo método de referencia para la generación de AIF. En este caso, nos enfrentamos al reto de realizar mediciones longitudinales de AIF en ratas utilizando el método de la derivación arterial. Hasta la fecha, ha habido pocos intentos. La primera idea se basaba en el uso de catéteres fijos [19]. Sin embargo, este método mostraba múltiples problemas cuando hay que realizar evaluaciones repetidas durante varios días, como las infecciones de la piel, especialmente importantes en animales inmunodeprimidos y, además, los catéteres suelen ser arrancados por los animales. Otra propuesta se basó en cánulas subcutáneas tras la cateterización de la arteria femoral derecha y la vena femoral izquierda, lo que permitió realizar con éxito estudios de PET longitudinales en 2 ratas [13, 20]. Sin embargo, es conocido que la heparinización diaria de los catéteres puede dar lugar a una inestabilidad hemodinámica en los días siguientes y, basándonos en nuestra experiencia, este problema suele provocar una fuerte hemorragia, con la consiguiente preocupación por la reproducibilidad e, incluso, la muerte de los animales. En este sentido, habría sido conveniente abordar la tasa de éxito y la reproducibilidad del procedimiento propuesto en [20], en un mayor número de animales. En cambio, el presente trabajo permitió asegurar la viabilidad del procedimiento propuesto, mostrando bajas tasas de fracaso durante el ensayo (4/18 cirugías fallaron en los experimentos preliminares para el entrenamiento y 0/5 en los experimentos incluidos en este trabajo). Esta alta tasa de éxito se debe a que los vasos operados están completamente cauterizados y la incisión se sutura después de la primera cirugía. El motivo de las cirugías fallidas fue la obstrucción de la arteria femoral, sin relación aparente con la estrategia de la doble cirugía. Debemos mencionar que la derivación arterial doble podría ser inapropiada cuando estos fallos de la cirugía tienen DAVID REY BRETAL - 129 - consecuencias importantes, por ejemplo, cuando se utilizan modelos animales muy caros o los animales se estudian durante un seguimiento largo. Otra cuestión que debe aclararse es el efecto de la cauterización de los vasos en la perfusión sanguínea a lo largo del miembro posterior operado. En nuestro trabajo estudiamos la perfusión de la extremidad posterior antes y 48 horas después de la cirugía mediante SPECT con 99mTc-tetrofosmina, mostrando que la extremidad posterior operada recuperó la perfusión. Por último, el trabajo evalúa, por primera vez, la reproducibilidad longitudinal de 2TCM y Patlak para FDG obtenidas a partir de estas medidas de AIF mediante nuestro método de derivación arterio-venosa doble. Los resultados indicaron que los AIF longitudinales pueden generarse con precisión, mostrando incertidumbres intra-animal muy bajas, en torno al 5-10%, y sin sesgo a lo largo del tiempo, originado por la estrategia de la doble cirugía. Por otro lado, los resultados indicaron que el IDIF longitudinal también puede generarse sin sesgo a lo largo del tiempo, pero mostrando mayores incertidumbres intra-animal. Las altas incógnitas de las estimaciones de IDIF pueden explicarse por la duración del marco PET en el momento inicial, la subestimación del pico y el efecto de volumen parcial [6, 7, 21]. La figura 4.4 muestra que los frames adquiridos de 15 segundos en el momento inicial impiden capturar el pico de forma eficiente y, por tanto, conducen a subestimaciones del IDIF durante el primer minuto. Aunque el uso de frames de tiempo más cortos se ha propuesto como una solución factible [22], requeriría aumentar la actividad inyectada de FDG para adquirir suficientes recuentos y, en este caso, el rango dinámico máximo del escáner PET casi se alcanza utilizando las actividades inyectadas para este trabajo. Con respecto a la modelización cinética, se obtuvieron estimaciones similares de CMRglc a partir de los modelos 2TCM y Patlak utilizando “Real-time AIF” (que es lo que se espera para FDG), pero en cambio, Patlak proporcionó estimaciones de CMRglc significativamente más bajas cuando se utilizó IDIF. Esto se debe a que el efecto de volumen parcial conduce a sobreestimaciones de IDIF en los últimos fotogramas, cuando la captación de FDG en miocardio es alta, lo que afecta directamente al análisis gráfico de Patlak y genera un sesgo entre 2TCM y Patlak. Se supone que este problema puede abordarse utilizando correcciones del coeficiente de recuperación para compensar los recuentos de derrame del miocardio o, incluso, a partir de delineaciones precisas de las VOI de IDIF en otras regiones anatómicas utilizando imágenes de MR corregidas [23-25]. En este sentido, se demostró que puede resolverse parcialmente utilizando estimaciones de IDIF de la vena cava directamente en las imágenes PET [26, 27]. En este último apartado, se demostró que el método de derivación arterial basado en una estrategia de doble cirugía y en métodos IDIF adecuadamente optimizados puede proporcionar una alta reproducibilidad longitudinal de los AIF y de las estimaciones de los modelos cinéticos. CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION - 130 - 6. CONCLUSIONES El uso del método de derivación arterial basado en una estrategia de doble cirugía es factible para llevar a cabo estudios de PET dinámicos longitudinales con una alta tasa de éxito de las cirugías, una alta reproducibilidad y, en consecuencia, un modelado cinético preciso, lo que ayuda a resolver uno de los principales retos pendientes del método de derivación arterial para ser considerado como el “gold standard” en los estudios de PET dinámicos preclínicos. 7. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue, parcialmente, apoyado por los proyectos ED431F 2017/04 (Xunta de Galicia), EAPA_791/2018 (Interreg UE) y RYC-2015/17430 (Ramón y Cajal, Pablo Aguiar). Artículo reproducido con permiso de SPRINGER NATURE. 8. CONFLICTOS DE INTERÉS Los autores declaran no tener conflictos de interés. 9. CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES DRB realizó las operaciones y redactó el manuscrito; AM preparó las figuras y contribuyó al análisis de los datos; NGL verificó los métodos analíticos y elaboró casi todos los detalles técnicos; AFF y JSR ayudaron a analizar los resultados; AR ayudó a diseñar e instruir el experimento; PA concibió el estudio y revisó el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito. DAVID REY BRETAL - 131 - 10. REFERENCIAS 1. Sokoloff L, Reivich M, Kennedy C et al (1977) The [14C] deoxyglucose method for the measurement of local cerebral glucose utilization: theory, procedure, and normal values in the conscious and anesthetized albino rat. J Neurochem 28:897–916 2. Patlak CS, Blasberg RG, Fenstermacher JD (1983) Graphical evaluation of blood-to- brain transfer constants from multiple-time uptake data. J Cereb Blood Flow Metab 3(1):1–7 3. Alf MF, Martić-Kehl MI, Schibli R, Krämer SD (2013) FDG kinetic modeling in small rodent brain PET: optimization of data acquisition and analysis. Eur J Nucl Med Mol I 3:61 4. Weber B, Burger C, Biro P, Buck A (2002) A femoral arteriovenous shunt facilitates arterial whole blood sampling in animals. Eur J Nucl Med Mol Imaging 29:319–323 5. Pain F, Lanièce P, Mastrippolito R, Gervais P, Hantraye P, Besret L (2004) Arterial input function measurement without blood sampling using a beta-microprobe in rats. J Nucl Med 45(9):1577–1582 6. Fang YH, Muzic RF Jr (2008) Spillover and partial-volume correction for imagederived input functions for small-animal 18F-FDG PET studies. J Nucl Med 49(4):606– 614 7. Zanotti-Fregonara P, Chen K, Liow JS, Fujita M, Innis RB (2011) Image-derived input function for brain PET studies: many challenges and few opportunities. J Cereb Blood Flow Metab 31(10):1986–1998 8. Wu HM, Sui G, Lee CC, Prins ML, Ladno W, Lin HD et al (2007) In vivo quantitation of glucose metabolism in mice using small-animal PET and a microfluidic device. J Nucl Med 48(5):837–845 9. Convert L, Morin-Brassard G, Cadorette J, Archambault M, Bentourkia M, Lecomte R (2007) A new tool for molecular imaging: the microvolumetric beta blood counter. J Nucl Med 48:1197–1206 10. Weber B, Spath N, Wyss M et al (2003) Quantitative cerebral blood flow measurements in the rat using a beta-probe and H2 15º. J Cereb Blood Flow Metab 23:1455–1460 11. Alf MF, Wyss MT, Buck A, Weber B, Schibli R, Kramer SD (2013) Quantification of brain glucose metabolism by 18F-FDG PET with real-time arterial and image derived input function in mice. J Nucl Med 54:132–138 CAPÍTULO IV: VIABILIDAD DE ESTUDIOS LONGITUDINALES DE PET CEREBRAL DINÁMICO CON MEDIDAS EN TIEMPO REAL DE ARTERIAL INPUT FUNCTION - 132 - 12. Roehrbacher F, Bankstahl JP, Bankstahl M et al (2015) Development and performance test of an online blood sampling system for determination of the arterial input function in rats. EJNMMI Phys 2:1–19 13. Warnock GI, Aerts J, Bahri MA, Bretin F, Lemaire C, Giacomelli F et al (2014) Evaluation of 18F-UCB-H as a novel PET tracer for synaptic vesicle protein 2ª in the brain. J Nucl Med 55(8):1336–1341 14. Herde AM, Keller C, Sephton SM, Mu L, Schibli R, Ametamey SM et al (2015) Quantitative - 132 - áter - 132 - n - 132 - emission tomography of mGluR5 in rat brain with [(18) F]PSS232 at minimal invasiveness and reduced model complexity. J Neurochem 133(3):330–342 15. Kilkenny C, Browne W, Cuthill IC, Emerson M, Altman DG (2010) Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol 160(7):1577– 1579 16. Huang Q, Massey JC, Mińczuk K, Li J, Kundu BK (2019) Noninvasive determination of blood input function to compute rate of myocardial glucose uptake from dynamic FDG PET images of rat heart in vivo: comparative study between the inferior vena cava and the left ventricular blood pool with spill over and partial - 132 - áter - 132 - n corrections. Phys Med Biol 64(16):165010 17. Pain F, Laniece P, Mastrippolito R et al (2000) SIC, an intracerebral radiosensitive probe for in vivo neuropharmacology investigations in small laboratory animals: theoretical considerations and practical characteristics. IEEE Trans Nucl Sci 47:25–32 18. Napieczynska H, Kolb A, Katiyar P, Tonietto M, Ud-Dean M, Stumm R et al (2018) Impact of the arterial input function recording method on kinetic parameters in smallanimal PET. J Nucl Med 59(7):1159– 1164 19. Jespersen B, Knupp L, Northcott CA (2012) Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. J Vis Exp 59:3496 20. Huang CC, Wu CH, Huang YY, Tzen KY, Chen SF, Tsai ML, Wu HM (2017) Performing repeated quantitative small-animal pet with an arterial input function is routinely feasible in rats. J Nucl Med 58(4):611–616 21. Park M-J, Fung GS, Yamane T, Kaiser F, Fukushima K, Higuchi T (2013) Assessment of partial - 132 - áter - 132 - n effect in small animal cardiac PET imaging using Monte Carlo simulation. J Nucl Med 54(suppl 2):1638 DAVID REY BRETAL - 133 - 22. Kim SJ et al (2008) Kinetic modeling of 3’-Deoxy-3’ -18F- fluorothymidine for quantitative cell proliferation imaging in subcutaneous tumor models in mice. J Nucl Med 49:2057–2066 23. Fung EK, Carson RE (2013) Cerebral blood flow with [15º] - 133 - áter PET studies using an image-derived input function and MR-defined carotid centerlines. Phys Med Biol 58(6):1903–1923 24. Islam MM, Tsujikawa T, Mori T, Kiyono Y, Okazawa H (2017) Estimation of arterial input by a noninvasive image derived method in brain H215O PET study: confirmation of arterial location using MR angiography. Phys Med Biol 62(11):4514–4524 25. Deidda D, Karakatsanis NA, Robson PM et al (2019) Hybrid PET/MR kernelised expectation maximisation reconstruction for improved image-derived estimation of the input function from the aorta of rabbits. Contrast Media Mol Imaging 2019:3438093 26. Lanz B, Poitry-Yamate C, Gruetter R (2014) Image-derived input function from the vena cava for 18F-FDG PET studies in rats and mice. J Nucl Med 55(8):1380–1388 27. Thackeray JT, Bankstahl JP, Bengel FM (2015) Impact of imagederived input function and fit time intervals on Patlak quantification of myocardial glucose uptake in mice. J Nucl Med 56(10):1615–1621 CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 134 - DAVID REY BRETAL - 135 - CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 136 - DAVID REY BRETAL - 143 - Figura 5.1. BGL (mg/dL) a lo largo del procedimiento PET (“Baseline”, antes de la inyección de FDG, antes de la exploración PET y después de la exploración PET) para los grupos control (fila superior), insulina (fila central) y glucagón (fila inferior). Figura 5.2. Se puede observar que el rango de BGL basal se extendía desde 100mg/dL hasta 200mg/dL dependiendo de las condiciones de ayuno o no ayuno. En cambio, el histograma antes de la FDG, antes de la PET y después de la PET mostró un rango más amplio de BGL como resultado de los diferentes protocolos. CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 144 - Cuantificación global de FDG PET cerebral La Figura 5.3 muestra la captación de FDG cerebral en términos de SUV a lo largo de los diferentes grupos y protocolos (fila superior). Esta figura también ilustra ejemplos de las imágenes PET FDG cerebrales co-registradas al “standard template” obtenidas para diferentes animales (de izquierda a derecha, control sin ayuno, control en ayunas 12-24h, control en ayunas 48h, grupos de 1UI/kg de insulina, 2-6 UI/kg de insulina, 1mg/kg de glucagón y 2mg/kg de glucagón). Los resultados muestran que el metabolismo cerebral global aumenta claramente entre los animales de glucagón y los de control y entre los de control y los de insulina. Además, en los animales sin ayuno de glucagón y control se observan claramente las glándulas Harderianas, que generan recuentos de “Spill-out” hacia el cerebro. En cambio, el metabolismo de estas glándulas disminuyó cuando se aplicó el ayuno y de forma más drástica cuando se administró insulina. La comparación estadística entre grupos y protocolos proporcionó diferencias significativas en el metabolismo de todo el cerebro entre grupos (control, glucagón e insulina) y protocolos (ANOVA de una vía p-valor =6E-32), excepto para el grupo de glucagón, que no mostró diferencias significativas entre las dosis probadas. Figura 5.3. Captación de FDG en el cerebro en términos de SUV a lo largo de los grupos y protocolos (fila superior). Ejemplos de imágenes PET coronales de los diferentes grupos y protocolos: control sin ayuno, control 12-24h ayuno, control 48h ayuno, insulina 1UI/kg, insulina 2-6UI/kg, glucagón 1mg/kg y glucagón 2mg/kg (fila inferior). Modelización del SUV de todo el cerebro a lo largo del rango de BGL La Figura 5.4 muestra la variación del SUV de todo el cerebro a lo largo del rango de BGL probado. Se puede observar que es posible modelar con precisión utilizando ajustes exponenciales, proporcionando un mejor ajuste a los datos que el enfoque lineal. Los resultados muestran que el ajuste fue mejor cuando se utilizó el BGL medido antes de la inyección de FDG (MSE=0,28). Este modelo exponencial (a=7,588 y b=0,0069) se DAVID REY BRETAL - 145 - empleó para estimar los factores de escala necesarios para la normalización global entre grupos y protocolos con el fin de referir todas las imágenes a la BGL media del grupo de normoglucemia en ayunas de 24h (BGL=100). Los factores de escala oscilaron entre 0,5 para la BGL mínima y 5 para la BGL máxima. Tras el escalado, los valores de SUV cerebral se mantuvieron estables a lo largo de todo el rango de valores de BGL, mostrando un SUV medio=3,80 ±0,65, en lugar de un SUV medio= 2,99 ±2,01. Figura 5.4. Captación de FDG en el cerebro en término de SUV en todo el cerebro a lo largo del rango de BGL medido al inicio, antes de la FDG, antes de la PET y después de la PET, y los correspondientes ajustes polinómicos y lineales (primera y segunda fila). Factores de escala obtenidos del ajuste polinómico a los datos de BGL medidos antes de la PET; y valores de SUV corregidos por BGL referidos a BGL=100mg/dL (fila inferior). Normalización global y cuantificación regional de la FDG PET cerebral La Figura 5.5 representa el metabolismo regional en términos de SUV para las diferentes regiones del cerebro y para el cerebro global después de la normalización global mencionada. Como se esperaba, la prueba Post-Hoc de ANOVA confirmó que no hay diferencias significativas en el metabolismo en el cerebro global, confirmando que la normalización global basada en el modelo anterior funciona correctamente. Respecto al análisis regional, no se muestran diferencias en el cerebro anterior (valor p=0,12), la corteza (valor p=0,286) ni en el cerebro posterior (valor p=0,496). No obstante, los resultados mostraron que el metabolismo en las regiones del mesencéfalo (valor p=5,7E-5) y del cerebro central (valor p=0,0015) está ligeramente CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 146 - aumentado/disminuido con respecto a otras regiones del cerebro a lo largo del rango de BGL. Por ejemplo, el metabolismo aumenta preferentemente en las regiones del mesencéfalo y del cerebro central cuando los BGL disminuyen, lo que da lugar a diferencias en el patrón del metabolismo cerebral cuando se consideran estos BGL extremos (Figura 5.2). Figura 5.5. Captación regional de FDG en el cerebro en términos de SUV regional (cerebro anterior, corteza, cerebro medio, cerebro posterior, regiones del cerebro central) a lo largo de los diferentes grupos (control, glucagón e insulina) y protocolos (después de referir todas las imágenes al BGL medio en el grupo de normoglucemia en ayunas). 5. DISCUSIÓN Es bien conocido que los niveles de glucosa en sangre afectan a la captación de [18F]- FDG en los órganos, entre los que destaca el cerebro. Tanto los estudios de PET en humanos como en roedores que evalúan la captación de [18F]-FDG [28] demuestran que la hiperglucemia disminuye la captación de [18F]-FDG como resultado de la competencia entre esta y la glucosa endógena para su transporte al interior de las células. Para minimizar la variabilidad inducida por el nivel de glucosa en los resultados de los estudios DAVID REY BRETAL - 147 - estáticos de PET con [18F]-FDG, se ha utilizado el ayuno, junto con algunos fármacos para reducir o aumentar la glucemia [29]. En el entorno clínico, los pacientes deben ayunar de 4 a 6 horas antes de la correspondiente prueba pero, en los roedores, el ayuno ronda las 6 horas, siendo necesario ampliar esta extensión de tiempo para eliminar el contenido gástrico por completo. Basándonos en estas consideraciones, llevamos a cabo una investigación basada en el ayuno para investigar el efecto que tienen los diversos niveles de glucosa en diferentes situaciones para su posterior captación cerebral de [18F]- FDG en ratas. Es conocido que el SUV cambia con el nivel de glucosa, denominado SUVglc, utilizado ampliamente en el ámbito clínico [30,31]. Cabe señalar que es necesario hacer mención a que el SUV normalizado a la dosis inyectada y al peso del individuo es un índice semicuantitativo de la tasa de captación neta de [18F]-FDG y no es una medida cuantitativa de la BGL. Estudios dinámicos como el de Wong y colaboradores [32] determinaron que la BGL cerebral medida no se correlacionaba directamente con el nivel de glucosa en sangre al igual que tampoco con la condición dietética, a diferencia que la tasa de captación de [18F]-FDG, la cual si variaba inversamente con los niveles de glucosa en sangre. En este contexto, afectaciones cerebrales como la demencia o los estadios iniciales de neoplasias pueden verse afectados durante los diagnósticos por las variaciones asociadas a los niveles de glucosa en sangre. La actividad metabólica cerebral de la glucosa es un índice de la función y la densidad sináptica [33,34]. La capacidad de medir el metabolismo regional de la glucosa mediante [18F]-FDG-PET ha ofrecido una visión profunda de las fases preclínicas de diversas patologías y ha demostrado un gran potencial como complemento diagnóstico de los pacientes con déficits cognitivos, ya sean derivados por la demencia [35] o por neoplasias como los glioblastomas [15]. Además, al reconocer patrones específicos del metabolismo cerebral de la glucosa, se pueden diferenciar patologías como el Alzheimer de otras enfermedades neurodegenerativas y subtipos de demencia [36]. En concreto, en la demencia, la pérdida de actividad neuronal efectiva se refleja en el hipometabolismo cortical de la glucosa siendo la información de la CMRgl proporcionada por la [18F]-FDG-PET, la cual se considera un biomarcador de imagen con una buena sensibilidad en el diagnóstico de la demencia temprana [37,38]. Sin embargo, la interpretación del metabolismo aberrante sigue siendo confusa. El hecho de que las ratas con demencia como el Alzheimer muestren un hipometabolismo cerebral de la glucosa se debe posiblemente a las deficiencias en la señalización de la insulina, principalmente [9]. Los cambios patológicos, en estas vías de señalización, afectan a la supervivencia neuronal, a la homeostasis energética, a la expresión génica y a los procesos de memoria [39,40]. Con respecto a otras patologías, la enfermedad de Parkinson [12,13] con hipometabolismo en áreas como la corteza motora, la SN y el núcleo tegmental pedunculopontino conducen al déficit conductual, en el que estudios como el de Casteels y colaboradores [41] informan que, en modelos de rata con lesión por 6-OHDA, se han podido observar niveles reducidos de metabolismo de la glucosa en la región motora, sensorial y SN ipsilateral a la lesión en comparación con los del hemisferio contralateral. En contraposición a esas afectaciones, en las neoplasias cerebrales la captación de [18F]- CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 148 - FDG del tumor y el contraste de la imagen son menores en el estado de no ayuno (niveles altos de insulina y glucosa) que en el estado de ayuno (niveles bajos de insulina y glucosa) [15]. Además, la insulina aumenta notablemente la captación de [18F]-FDG por parte de los músculos esqueléticos y el miocardio, aunque en general no tiene ningún efecto sobre la captación de [18F]-FDG de las células cancerosas [28]. Finalmente, la biodistribución de la [18F]-FDG con respecto a la anestesia ha sido detallado por Lee y colaboradores [42] con ketamina/xilazina y pentobarbital. En este trabajo nos centramos, entre otras cuestiones, en las observaciones con isoflurano. Es conocido que la xilacina y el isoflurano suprimen la secreción de la insulina [42,43], sin embargo, los efectos de la xilacina parecen ser más intensos debido a que esta genera una gran hiperglucemia (>300mg/dL), incluso cuando roedores se encuentran en ayunas durante al menos 8 horas. Al mismo tiempo, algunos estudios demuestran que protocolizar un ayuno de 20 horas antes de la inyección de [18F]-FDG atenúa la hiperglucemia que induce la xilacina [15,42]. La problemática radica en que el ayuno prolongado conduce a la pérdida de peso y, por lo tanto, puede repercutir en el seguimiento del tratamiento. En nuestro caso confirmamos que la anestesia con isoflurano sólo provoca un modesto aumento de los niveles de glucosa en sangre en los animales en ayunas y sin ayunas, lo que sugiere que su efecto sobre la secreción de insulina es relativamente menor. Teniendo de referencia los estudiado, se han analizado un amplio rango de BGL desde la normoglucemia, la hiperglucemia y la hipoglucemia en ratas, estas dos últimas inducidas a través de la administración del glucagón y la insulina para la obtención de los límites de glucemia permitidos. Con este planteamiento, se propuso la finalidad de utilizar dichos datos para la proporción de información de PET corregidos por BGL cerebral. Los descubrimientos presentados en este trabajo representan un aporte para demostrar que la metodología del estudio cerebral en roedores debe tener unas recomendaciones específicas para la exploración de los sujetos que presenten una BGL extrema, muy superior a los rangos normales, como podría ser el caso de roedores diabéticos. Todo esto se demuestra centrándose en que el trabajo se enfoca para impulsar las ventajas mencionadas acerca de la estandarización preclínica de los niveles de glucosa cerebral [24-27]. Los resultados demuestran que el metabolismo cerebral global sufre un aumento entre los roedores a los que se les ha administrado glucagón y los de control, al igual que se puede constatar que el metabolismo, en regiones como el mesencéfalo (p=5,7E-5) y el cerebro central (p=0,0015), se encuentra aumentado o reducido si se tienen de referencia otras regiones del cerebro en los distintos rangos de BGL [18,21,23]. Además, la variación del SUV cerebral se puede modelar con precisión a partir de ajustes exponenciales, promocionando una mejor adaptación que el enfoque lineal. DAVID REY BRETAL - 149 - 6. CONCLUSIONES En este trabajo se ha realizado una caracterización completa de la influencia de los niveles de glucosa en sangre sobre la cuantificación del metabolismo cerebral mediante PET con FDG. La modelización de esta caracterización permite la implementación de un nuevo método para estimar con precisión el metabolismo cerebral a lo largo de un rango amplio de niveles de glucemia, desde animales con niveles de glucosa elevado, como roedores diabéticos, o en estudios que impidan el uso del ayuno por su metodología, hasta modelos animales con niveles de glucosa extremadamente bajos. 7. AGRADECIMIENTOS Este trabajo fue, parcialmente, apoyado por los proyectos ED431F 2017/04 (Xunta de Galicia), EAPA_791/2018 (Interreg UE) y RYC-2015/17430 (Ramón y Cajal, Pablo Aguiar). 8. CONFLICTOS DE INTERÉS Los autores declaran no tener conflictos de interés. 9. CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES DRB realizó las pruebas y redactó el manuscrito; LGV preparó las figuras y contribuyó al análisis de los datos; NGL y AM verificaron los métodos analíticos y elaboraron casi todos los detalles técnicos; MPF, AFF y JSR ayudaron a analizar los resultados; AR ayudó a diseñar e instruir el experimento; PA concibió el estudio y revisó el manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito. CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 150 - 10. REFERENCIAS 1. Toyama H, Ichise M, Liow J-S, Modell KJ, Vines DC, Esaki T, et al. Absolute quantification of regional cerebral glucose utilization in mice by 18F-FDG small animal PET scanning and 2-14C-DG autoradiography. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2004 Aug;45(8):1398–405. 2. Assadian S, Aliaga A, Del Maestro RF, Evans AC, Bedell BJ. FDG-PET imaging for the evaluation of antiglioma agents in a rat model. Neuro-Oncol. 2008 Jun;10(3):292–9. 3. Fu Y, Ong L-C, Ranganath SH, Zheng L, Kee I, Zhan W, et al. A Dual Tracer 18F- FCH/18F-FDG PET Imaging of an Orthotopic Brain Tumor Xenograft Model. PloS One. 2016;11(2):e0148123. 4. Vállez García D, Otte A, Dierckx RAJO, Doorduin J. Three Month Follow-Up of Rat Mild Traumatic Brain Injury: A Combined [18F]FDG and [11C]PK11195 Positron Emission Study. J Neurotrauma. 2016 15;33(20):1855–65. 5. Brabazon F, Wilson CM, Shukla DK, Mathur S, Jaiswal S, Bermudez S, et al. [18F]FDG-PET Combined with MRI Elucidates the Pathophysiology of Traumatic Brain Injury in Rats. J Neurotrauma. 2017 01;34(5):1074–85. 6. Fu Y-K, Chang C-J, Chen K-Y, Hwang L-C, Wu K-H, Chang K-W, et al. Imaging of regional metabolic activity by (18)F-FDG/PET in rats with transient cerebral ischemia. Appl Radiat Isot Data Instrum Methods Use Agric Ind Med. 2009 Oct;67(10):1743–7. 7. Yuan H, Frank JE, Hong Y, An H, Eldeniz C, Nie J, et al. Spatiotemporal uptake characteristics of [18]F-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose in a rat middle cerebral artery occlusion model. Stroke. 2013 Aug;44(8):2292–9. 8. Macdonald IR, DeBay DR, Reid GA, O’Leary TP, Jollymore CT, Mawko G, et al. Early detection of cerebral glucose uptake changes in the 5XFAD mouse. Curr Alzheimer Res. 2014;11(5):450–60. 9. Lu Y, Ren J, Cui S, Chen J, Huang Y, Tang C, et al. Cerebral Glucose Metabolism Assessment in Rat Models of Alzheimer’s Disease: An 18F-FDG-PET Study. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 2016;31(4):333–40. 10. Waldron A-M, Wyffels L, Verhaeghe J, Richardson JC, Schmidt M, Stroobants S, et al. Longitudinal Characterization of [18F]-FDG and [18F]-AV45 Uptake in the Double Transgenic TASTPM Mouse Model. J Alzheimers Dis JAD. 2017;55(4):1537–48. 11. Casteels C, Lauwers E, Bormans G, Baekelandt V, Van Laere K. Metabolicdopaminergic mapping of the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson’s disease. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2008 Jan;35(1):124–34. DAVID REY BRETAL - 151 - 12. Jang DP, Min H-K, Lee S-Y, Kim IY, Park HW, Im YH, et al. Functional neuroimaging of the 6-OHDA lesion rat model of Parkinson’s disease. Neurosci Lett. 2012 Apr 4;513(2):187–92. 13. Lerner RP, Bimpisidis Z, Agorastos S, Scherrer S, Dewey SL, Cenci MA, et al. Dissociation of metabolic and hemodynamic levodopa responses in the 6- hydroxydopamine rat model. Neurobiol Dis. 2016 Dec;96:31–7. 14. Soto-Montenegro ML, Vaquero JJ, Pascau J, Gispert JD, García-Barreno P, Desco M. Detection of visual activation in the rat brain using 2-deoxy-2-[(18)F]fluoro-D: - glucose and statistical parametric mapping (SPM). Mol Imaging Biol. 2009 Apr;11(2):94–9. 15. Fueger BJ, Czernin J, Hildebrandt I, Tran C, Halpern BS, Stout D, et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2006 Jun;47(6):999–1006. 16. Sijbesma JWA, van Waarde A, Vállez García D, Boersma HH, Slart RHJA, Dierckx RAJO, et al. Test-Retest Stability of Cerebral 2-Deoxy-2-[18F]Fluoro-D-Glucose ([18F]FDG) Positron Emission Tomography (PET) in Male and Female Rats. Mol Imaging Biol. 2019;21(2):240–8. 17. Bascuñana P, Thackeray JT, Bankstahl M, Bengel FM, Bankstahl JP. Anesthesia and Preconditioning Induced Changes in Mouse Brain [18F] FDG Uptake and Kinetics. Mol Imaging Biol. 2019;21(6):1089–96. 18. Schiffer WK, Mirrione MM, Dewey SL. Optimizing experimental protocols for quantitative behavioral imaging with 18F-FDG in rodents. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2007 Feb;48(2):277–87. 19. Wong K-P, Sha W, Zhang X, Huang S-C. Effects of administration route, dietary condition, and blood glucose level on kinetics and uptake of 18F-FDG in mice. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2011 May;52(5):800–7. 20. Toyama H, Ichise M, Liow J-S, Vines DC, Seneca NM, Modell KJ, et al. Evaluation of anesthesia effects on [18F]FDG uptake in mouse brain and heart using small animal PET. Nucl Med Biol. 2004 Feb;31(2):251–6. 21. Shimoji K, Ravasi L, Schmidt K, Soto-Montenegro ML, Esaki T, Seidel J, et al. Measurement of cerebral glucose metabolic rates in the anesthetized rat by dynamic scanning with 18F-FDG, the ATLAS small animal PET scanner, and arterial blood sampling. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2004 Apr;45(4):665–72. 22. Kreissl MC, Stout DB, Wong K-P, Wu H-M, Caglayan E, Ladno W, et al. Influence of dietary state and insulin on myocardial, skeletal muscle and brain [F]- fluorodeoxyglucose kinetics in mice. EJNMMI Res. 2011 Jul 6;1:8. CAPÍTULO V: EFECTO DEL NIVEL DE GLUCOSA EN SANGRE SOBRE LA CUANTIFICACIÓN DE ESTUDIOS DE PET CEREBRAL DINÁMICOS - 152 - 23. Eskian M, Alavi A, Khorasanizadeh M, Viglianti BL, Jacobsson H, Barwick TD, et al. Effect of blood glucose level on standardized uptake value (SUV) in 18F- FDG PET- scan: a systematic review and meta-analysis of 20,807 individual SUV measurements. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2019;46(1):224–37. 24. Deleye S, Verhaeghe J, wyffels L, Dedeurwaerdere S, Stroobants S, Staelens S. Towards a reproducible protocol for repetitive and semi-quantitative rat brain imaging with (18) F-FDG: exemplified in a memantine pharmacological challenge. NeuroImage. 2014 Aug 1;96:276–87. 25. Alf MF, Duarte JMN, Schibli R, Gruetter R, Krämer SD. Brain glucose transport and phosphorylation under acute insulin-induced hypoglycemia in mice: an 18F-FDG PET study. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2013 Dec;54(12):2153–60. 26. Rey-Bretal D, Moscoso A, Gómez-Lado N, Fernández-Ferreiro A, Silva-Rodríguez J, Ruibal Á, et al. Feasibility of Longitudinal Brain PET with Real-Time Arterial Input Function in Rats. Mol Imaging Biol. 2020 Nov 17; 27. Patlak CS, Blasberg RG, Fenstermacher JD. Graphical evaluation of blood-to-brain transfer constants from multiple-time uptake data. J Cereb Blood Flow Metab Off J Int Soc Cereb Blood Flow Metab. 1983 Mar;3(1):1–7. 28. Wahl RL, Henry CA, Ethier SP. Serum glucose: effects on tumor and normal tissue accumulation of 2-[F-18]-fluoro-2-deoxy-D-glucose in rodents with mammary carcinoma. Radiology. 1992;183(3):643-7. 29. Hildebrandt IJ, Su H, Weber WA. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 2008;49(1):17-26. 30. Herholz K. The role of PET quantification in neurological imaging: FDG and amyloid imaging in dementia. Clin Transl Imaging. 2014;321–330. 31. Thientunyakit T, Sethanandha C, Muangpaisan W, Chawalparit O, Arunrungvichian K, Siriprapa T et al. Relationships between amyloid levels, glucose metabolism, morphologic changes in the brain and clinical status of patients with Alzheimer’s disease. Ann Nucl Med. 2020;337–348. 32. Wong KP, Sha W, Zhang X, Huang SC. Effects of administration route, dietary condition, and blood glucose level on kinetics and uptake of 18F-FDG in mice. J Nucl Med. 2011;52(5):800-7. 33. Sokoloff L. Relation between physiological function and energy metabolism in the central nervous system. J Neurochem. 1977;29:13–26. 34. Liu X, Erikson C, Brun A. Cortical synaptic changes and gliosis in normal aging, Alzheimer’s disease and frontal lobe degeneration. Dementia. 1996;7:128–134.