Desarrollo de nuevas metodologías de preparación de muestra para la determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos en matrices medioambientales y alimentarias

 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Facultad de Química Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología Instituto de Investigación y Análisis Alimentario DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGÍAS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA LA DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS EN MATRICES MEDIOAMBIENTALES Y ALIMENTARIAS MARÍA TERESA PENA SENDÓN Memoria para optar al grado de Doctora en Química Santiago de Compostela, marzo de 2010 D. Antonio Moreda Piñeiro, Profesor Titular y Director del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, Informa: Que Dña María Teresa Pena Sendón ha realizado en este departamento el trabajo recogido en la memoria titulada “DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGÍAS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA LA DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS EN MATRICES MEDIOAMBIENTALES Y ALIMENTARIAS” bajo la dirección de las Profesoras Dña María del Carmen Casais Laíño y María del Carmen Mejuto Martí en el Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Química de la Universidad de Santiago de Compostela, que presenta para optar al grado de Doctora en Química. Y para que así conste, firmo el presente informe en Santiago de Compostela, marzo 2010 D. Antonio Moreda Piñeiro Dña María del Carmen Casais Laíño y Dña María del Carmen Mejuto Martí, Profesoras Titulares del Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Universidad de Santiago de Compostela, Autorizan: A la licenciada Dña María Teresa Pena Sendón a la presentación del trabajo recogido en la memoria titulada “DESARROLLO DE NUEVAS METODOLOGÍAS DE PREPARACIÓN DE MUESTRA PARA LA DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS EN MATRICES MEDIOAMBIENTALES Y ALIMENTARIAS” que ha realizado bajo su dirección en el Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología de la Facultad de Química de la Universidad de Santiago de Compostela, para optar al grado de Doctora en Química Y para que así conste, firmamos el presente informe en Santiago de Compostela, marzo 2010. Dña María del Carmen Casais Laíño Dña María del Carmen Mejuto Martí “O verdadeiro heroísmo consiste en trocar os anceios en realidades, as ideas en feitos” A. D. Rodríguez Castelao (1886-1950) There are some lovely places that stand out in my mind as being very special and magical, it’s impossible to say why... Maite ÍNDICE ÍNDICE CAPÍTULO I. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 1 CAPÍTULO II. INTRODUCCIÓN 5 1. HIDROCARBUROS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS 7 1.1. Definición, estructura y propiedades 7 1.2. Origen y fuentes 11 1.2.1. Formación de PAHs 11 1.2.2. Fuentes de emisión al medio ambiente 12 1.2.2.1. Fuentes naturales 12 1.2.2.2. Fuentes antropogénicas 13 1.3. Distribución en el medio ambiente 18 1.4. Toxicidad 30 1.4.1. Evaluación medioambiental 30 1.4.2. Toxicología y efectos para la salud 32 1.4.3. Metabolismo 35 1.5. Legislación 36 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 41 2.1. Métodos de preparación de muestras acuosas 42 2.1.1. Técnicas tradicionales 42 2.1.1.1. Extracción líquido-líquido 42 2.1.1.2. Extracción en fase sólida 42 2.1.2. Técnicas de microextracción 44 2.1.2.1. Microextracción con gota suspendida 45 2.1.2.2. Microextracción líquido-líquido dispersiva 47 2.1.2.2.1. Principios de la técnica 47 2.1.2.2.2. Variables que afectan al proceso de extracción 49 2.1.2.2.3. Aplicaciones de DLLME 51 2.1.2.2.4. Desarrollos recientes de DLLME 55 2.1.2.2.4.1. Líquidos iónicos como fase extractante 57 2.1.2.3. Microextracción en fase líquida con fibra hueca 60 2.1.2.4. Extracción con disolventes asistida por membranas 61 ÍNDICE 2.1.2.5. Microextracción en fase sólida 62 2.1.2.6. Extracción con barras agitadoras 63 2.1.3. Otras técnicas alternativas 65 2.1.3.1. Extracción por punto nube (cloud point extraction) 65 2.2. Métodos de preparación de muestras sólidas 66 2.2.1. Extracción Soxhlet 66 2.2.2. Extracción asistida por ultrasonidos 67 2.2.3. Extracción con fluidos supercríticos 68 2.2.4. Extracción asistida por microondas 70 2.2.4.1. Principios de la técnica 71 2.2.4.1.1. Calentamiento mediante energía de microondas 71 2.2.4.1.1. Mecanismo de extracción con disolventes 72 2.2.4.2. Variables que afectan al proceso de extracción 73 2.2.4.3. Aplicaciones de MAE 75 2.2.5. Extracción con líquidos presurizados 78 2.2.5.1. Principios de la técnica 79 2.2.5.1.1. Consideraciones físico-químicas 79 2.2.5.1.2. Mecanismo de extracción con disolventes 80 2.2.5.2. Variables que afectan al proceso de extracción 83 2.2.5.3. Aplicaciones de PLE 85 2.2.6. Dispersión de la matriz en fase sólida 88 2.2.6.1. Principios de la técnica 88 2.2.6.1.1. Etapas de la MSPD 89 2.2.6.2. Variables que afectan al proceso de extracción 90 2.2.6.3. Aplicaciones de la MSPD 92 2.3. Métodos de purificación de extractos 95 2.4. Métodos de determinación 97 2.4.1. Cromatografía líquida 97 2.4.1.1. Separación de PAHs mediante HPLC 98 2.4.1.2. Sistemas de detección 99 2.4.2. Cromatografía de gases 101 2.4.2.1. Separación de PAHs mediante GC 102 2.4.2.2. Inyección de grandes volúmenes 103 2.4.2.3. Sistemas de detección 104 BIBLIOGRAFÍA 107 ÍNDICE CAPÍTULO III. EXPERIMENTAL 149 1. PATRONES, DISOLVENTES Y REACTIVOS 151 1.1. Patrones comerciales 151 1.2. Reactivos, gases y disolventes 152 2. INSTRUMENTACIÓN Y MATERIAL 153 2.1. Material general 153 2.2. Instrumentación para la determinación 156 3. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES 157 3.1. Preparación de disoluciones estándar de analitos 157 3.2. Otras disoluciones 158 3.3. Fases móviles para HPLC 159 3.4. Conservación de las disoluciones 159 4. MUESTRAS ESTUDIADAS 159 4.1. Muestras y preparación de muestras 159 4.2. Determinación de la humedad y del contenido graso de las muestras. Análisis elemental 161 4.3. Contaminación de las muestras 162 4.4. Materiales de referencia 162 4.5. Conservación de las muestras 163 4.6. Determinación del residuo seco 163 5. ACONDICIONAMIENTO Y LIMPIEZA DEL MATERIAL 163 5.1. Acondicionamiento de adsorbentes 163 ÍNDICE 5.2. Lavado del material 164 6. GESTIÓN DE RESIDUOS 165 CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSION 167 1. DETERMINACIÓN DE PAHs EN MUESTRAS SÓLIDAS 171 1.1. Determinación de PAHs en material biológico 172 1.1.1. Introducción 172 1.1.2. Optimización de un método de extracción asistida por microondas para el análisis de PAHs en muestras de pescado Publicación I Optimization of a microwave-assisted extraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons from fish samples. 175 1.1.3. Consideraciones adicionales y conclusiones 193 1.2. Determinación de PAHs en lodos de depuradora de aguas residuales 195 1.2.1. Introducción 195 1.2.2. Procedimiento de preparación de muestras de lodo y suelo mediante extracción y saponificación asistidas por microondas Publicación II Sample preparation of sewage sludge and soil samples for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons based on one-pot microwave-assisted saponification and extraction. 199 1.2.3. Optimización de un procedimiento de preparación de muestra basado en la dispersión de la matriz en fase sólida para el análisis de PAHs en suelo Publicación III Optimization of the matrix solid-phase dispersion sample preparation procedure for analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils: Comparison with microwave-assisted extraction. 219 ÍNDICE 1.2.4. Desarrollo de un método de dispersión de la matriz en fase sólida para la determinación de PAHs en muestras de lodo Publicación IV Development of a matrix solid-phase dispersion method for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in sewage sludge samples. 241 1.2.5. Desarrollo de un procedimiento de preparación de muestras de lodo mediante extracción selectiva con líquidos presurizados Publicación V Development of a sample preparation procedure of sewage sludge sample for the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons based on selective pressurized liquid extraction. 271 1.2.6. Consideraciones adicionales y conclusiones 303 2. DETERMINACIÓN DE PAHs EN MUESTRAS ACUOSAS 317 2.1. Determinación de PAHs en agua 319 2.1.1. Introducción 319 2.1.2. Desarrollo de un método de microextracción líquido-líquido dispersiva para el análisis de PAHs en muestras de agua Publicación VI Development of an ionic liquid based dispersive liquidliquid microextraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples. 321 2.1.3. Consideraciones adicionales y conclusiones 353 CAPÍTULO V. CONCLUSIONES 357 ACRÓNIMOS 359 CAPÍTULO I JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS 1. PAHs 8 Acenafteno Ace Acenaftileno Acy Antraceno Ant Benzo[a]antraceno B[a]A Benzo[a]pireno B[a]P Benzo[b]fluoranteno B[b]F Benzo[c]fluoreno B[c]F Benzo[e]pireno B[e]P Benzo[g,h,i]perileno B[g,h,i]P Benzo[j]fluoranteno B[j]F Benzo[k]fluoranteno B[k]F Coroneno Cor Criseno Cris Dibenzo[a,h]antraceno DB[a,h]A Dibenzo[a,l]pireno DB[a,l]P Fenaleno Fenal Fenantreno Fen Fluoranteno Fluor Fluoreno Flu Indeno[1,2,3-c,d]pireno I[1,2,3-c,d]P 5-Metilcriseno 5-MC Naftaleno Naft Ovaleno Oval Pentaceno Pentac Perileno Peril Piceno Pic Pireno Pir Trinaftileno Trinaft Figura. II.1. Estructura molecular de algunos PAHs de interés CH3 II. INTRODUCCIÓN 9 Los PAHs son compuestos sólidos en condiciones ambientales, incoloros o de color blanco o amarillo pálido [5]. Son moléculas con muy baja solubilidad en agua, a la vez que elevada en disolventes orgánicos no polares, lo que les configura como compuestos típicamente microcontaminantes orgánicos, y con capacidad bioacumulativa [6]. Por lo general, un incremento en el peso molecular y en el número de anillos en su estructura, disminuyen su solubilidad en agua y su volatilidad [5,6]. En la tabla II.1 se recogen las propiedades físico-químicas de algunos PAHs, ya que son un factor clave a la hora de entender su comportamiento medioambiental. Como puede observarse, los valores de log Kow oscilan entre 3 y 7, que es generalmente considerado el rango de compuestos lipofílicos. Como consecuencia de sus elevados coeficientes de partición octanol-agua y baja solubilidad en agua, es de esperar que los PAHs se bioacumulen y se concentren en la fase orgánica de partículas sólidas de suelos y sedimentos, convirtiéndose en contaminantes orgánicos persistentes en el medio ambiente [2,3]. 1. PAHs 10 Tabla II.1. Propiedades físico-químicas de algunos PAHs de interés medioambiental [7]. Pv (kPa) 1.04 x 10-2 8.9 x 10-4 2.9 x 10-4 9.0 x 10-5 1.6 x 10-5 8.0 x 10-7 1.2 x 10-6 6.0 x 10-7 2.8x 10-8 8.4 x 10-8 --- 7.4 x 10-10 6.7 x 10-8 a 1.3 x 10-11 a 7.3 x 10-10 1.4 x 10-11 1.3 x 10-11 a 1.3 x 10-11 a --- Kow, coeficiente de partición octanol-agua; S, solubilidad en agua a 25 ºC; Pv, presión de vapor a 25 ºC (a) presión de vapor a 20 ºC log Kow 3.36 4.07 3.92 4.18 4.57 4.54 5.22 5.18 5.61 5.91 6.42 [9] 6.44 6.12 6.84 6.50 7.10 6.58 6.50 6.75 [10] S (mol L-1) 2.48 x 10-4 2.58 x 10-5 [8] 2.55 x 10-5 1.19 x 10-5 7.24 x 10-6 4.10 x 10-7 1.29 x 10-6 6.68 x 10-7 6.14 x 10-8 8.76 x 10-9 3.02 x 10-8 [9] 2.5 x 10-8 [8] 4.8 x 10-9 3.01 x 10-9 1.51 x 10-8 9.41 x 10-10 2.25 x 10-7 1.80 x 10-9 [8] --- Punto ebullición (ºC) 218 265 [8] 279 295 340 342 375 393 400 448 458 493 481 480 496 545 536 524 595 Punto fusión (ºC) 81 92 95 116 100 216 109 150 161 254 117 179 168 216 178 278 164 267 162 PM 128.2 152.2 154.2 166.2 178.2 178.2 202.3 202.3 228.3 228.3 242.3 252.3 252.3 252.3 252.3 276.3 276.3 278.4 302.4 Fórmula molec. C10H8 C12H8 C12H10 C13H10 C14H10 C14H10 C16H10 C16H10 C18H12 C18H12 C19H14 C20H12 C20H12 C20H12 C20H12 C22H12 C22H12 C22H14 C24H14 nº CAS 91-20-3 208-96-8 83-32-9 86-73-7 85-01-8 120-12-7 206-44-0 129-00-0 56-55-3 218-01-9 3697-24-3 129-97-2 205-99-2 207-08-9 50-32-8 191-24-2 193-39-5 53-70-3 191-30-0 Compuesto Naftaleno Acenaftileno Acenafteno Fluoreno Fenantreno Antraceno Fluoranteno Pireno Benzo[a]antraceno Criseno 5-Metilcriseno Benzo[e]pireno Benzo[b]fluoranteno Benzo[k]fluoranteno Benzo[a]pireno Benzo[g,h,i]perileno Indeno[1,2,3-c,d]pireno Dinbenzo[a,h]antraceno Dibenzo[a,l]pireno II. INTRODUCCIÓN 11 1.2. ORIGEN Y FUENTES 1.2.1. FORMACIÓN DE PAHs La combustión de hidrocarburos a temperaturas relativamente elevadas (superiores a 500 ºC) y con insuficiente oxígeno para la combustión completa, son las condiciones propicias para la formación de PAHs. El proceso transcurre a través de la formación de radicales libres, producidos por ruptura de enlaces C-C y C-H, que reaccionan entre sí [6]. Las cantidades de PAHs formadas, dependen de la temperatura de combustión y de la naturaleza de la materia orgánica implicada en el proceso. En estas reacciones se forman también PAHs alquil sustituidos, y como regla general, una temperatura de combustión más elevada conduce a PAHs menos sustituidos. En la figura II.2, podemos ver un posible mecanismo de formación de PAHs en la combustión de ciertas materias orgánicas [6]. C C C C C C C C Naftaleno C C C C TetralinaFenilbutil tetralinaBenzo[a]pireno  Figura II.2 Posible mecanismo de formación del Benzo[a]pireno. La formación geológica de los combustibles fósiles también puede generar PAHs, aunque mediante procesos algo diferentes. El material biológico que da origen al carbón y petróleo, evoluciona en este caso bajo presión y a temperaturas relativamente bajas (menos de 200 ºC), condiciones en las que pueden formarse ciertas cantidades de PAHs. De ahí que PAHs alquil sustituídos, se encuentren presentes en combustibles crudos y en materiales derivados de los mismos. La combustión de petróleo y carbón provoca la emisión de PAHs 1. PAHs 12 contenidos en esos combustibles y de nuevos PAHs que pueden producirse al quemarlos [3,6]. Otra posibilidad es la formación de PAHs mediante síntesis biológica, aunque esta vía de formación es claramente minoritaria cuando se compara con las anteriores. 1.2.2. FUENTES DE EMISIÓN DE PAHs AL MEDIO AMBIENTE Los PAHs emitidos al medio ambiente, son originados a partir de fuentes naturales y antropogénicas, siendo estas últimas las que originan una mayor contribución de estos contaminantes [1,3,6,11,12]. Como resultado de la enorme cantidad de fuentes de emisión y de su fácil difusión, los PAHs se han convertido en compuestos tóxicos ubicuos en el medio ambiente. A continuación, se recogen de manera más detallada las principales fuentes de emisión, en función de su naturaleza. 1.2.2.1. Fuentes naturales En la naturaleza, los PAHs pueden formarse a partir de tres vías fundamentales: (1) pirólisis de materiales orgánicos a alta temperatura; (2) diagénesis de material orgánico sedimentado a baja temperatura, para formar fuel fósil; y (3) biosíntesis directa mediante microorganismos y plantas [13]. Así, haciendo referencia a las fuentes naturales, se pueden destacar las filtraciones naturales de fuel fósil [14], los incendios forestales fortuitos, la actividad volcánica y la deposición atmosférica de contaminantes [3,15,16]. Además algunos PAHs pueden ser derivados de precursores biogénicos como pigmentos y esteroides [17,18], o productos de la biosíntesis de fitoplancton y bacterias [19]. Un número importante de PAHs se generan mediante precursores biogénicos, que son constituyentes comunes de la mayoría de las plantas superiores, a través de procesos diagenéticos. Algunos autores sugieren que los PAHs pueden ser sintetizados por algas unicelulares, plantas superiores o bacterias. Sin embargo, otros investigadores prefieren considerar que los organismos acumulan PAHs, en lugar de sintetizarlos [20]. Baumard y col. [21] han analizado sedimentos recogidos en diferentes puntos del oeste del Mar Báltico. Aunque la mayor parte de la contaminación se produce mediante procesos pirolíticos a alta II. INTRODUCCIÓN 13 temperatura, también se identificaron PAHs de origen diagenético, en uno de los puntos estudiados. También se han estudiado los PAHs en sedimentos de lago y suelos cercanos, en dos regiones europeas de alta montaña (Pirineos y Tatra). Se encontraron mezclas similares de PAHs en todos los casos, que indicaban el predominio de productos de combustión transportados por el aire. Sin embargo, los sedimentos mostraron la formación de grandes cantidades de perileno mediante transformación diagenética en las secciones profundas [22]. También se han propuesto algunas fuentes cósmicas [23,24] de PAHs, como por ejemplo las chondritas carbónicas, que se originan en el cinturón de asteroides [25]. Parece ser que los PAHs presentes en las chondritas, son el producto de una síntesis a elevada temperatura. Otra teoría, propone que son el resultado de las alteraciones térmicas de compuestos alifáticos pre-existentes. De todos modos, las alteraciones térmicas requieren la presencia de fases minerales a baja temperatura, tales como la magnetita y/o filosilicatos hidratados, para su formación [26]. 1.2.2.2. Fuentes antropogénicas La actividad humana está estrechamente relacionada con la emisión de PAHs al medio ambiente, ya que las principales vías de contaminación son de origen antropogénico. Dentro de estas fuentes, se pueden establecer cuatro categorías principales, dentro de las cuales se engloban la mayoría de las fuentes de emisión; fuentes domésticas, móviles, industriales y agrícolas [11,27]. Emisiones domésticas Las emisiones domésticas están fundamentalmente asociadas con la quema de carbón, aceite, gas, residuos u otras sustancias orgánicas [28]. Actividades domésticas que producen PAHs incluyen las calefacciones con madera o fuel fósil, el humo de tabaco, la incineración de residuos, el proceso de asado o ahumado de alimentos en prácticas de cocina, y el uso de motores de combustión internos [15,27,29,30]. Los sistemas de calefacción, como el uso de calderas, chimeneas, estufas y quemadores de aceite o gas, pueden incrementar las concentraciones de PAHs en 1. PAHs 14 el aire interior [29,30]. La combustión de biomasa en calderas utilizadas para calefacción doméstica, es una vía de emisión importante [31,32]. Esen y col. [33,34] han evaluado las concentraciones de PAHs en la atmósfera de una zona residencial de Turquía y encontraron niveles diez veces superiores durante el periodo invernal, debido principalmente a las emisiones a partir de las calefacciones. Un estudio realizado en China, demuestra que el uso de carbón bituminoso para el calentamiento de los hogares, origina elevadas concentraciones de PAHs [35]. Varios estudios han identificado el humo de tabaco como una de las principales fuentes de PAHs en ambientes interiores [36-39]. Las concentraciones de B[a]P encontradas en hogares de personas que consumen tabaco son 10 veces superiores que las encontradas en las residencias de los no-fumadores [40]. Lu y col. [41] han encontrado que más del 80% de B[a]P presente en las viviendas de Hangzhou (China) es originado por el humo de tabaco. En un estudio realizado recientemente se han encontrado concentraciones totales de 18 PAHs entre 1.45 a 6.82 µg m-3 por gramo de tabaco [39]. Por otro lado, Mannino y col. [42] encontraron que los niveles de PAHs en el polvo doméstico eran entre 2 y 16 veces mayores en los hogares de fumadores. El modo de preparación de alimentos, es otra de las fuentes que contribuye a la contaminación de ambientes interiores con PAHs [43-45]. Los niveles de PAHs dependen enormemente del método de preparación de los alimentos y del tipo de fuente de calor utilizada [46]. Los combustibles utilizados juegan también un papel fundamental en la emisión de estos contaminantes [47,48]. La OMS estimó que casi el 75% de la población en países como China, India, y el Sureste de Asia, y entre el 50-75% en Sur América y África, utilizan diariamente combustibles sólidos (madera, residuos agrícolas, estiércol seco de animales, etc.) para cocinar [49]. Este es un hecho de gran importancia, si consideramos que numerosos estudios han demostrado que las concentraciones de PAHs se incrementan enormemente durante la combustión de biomasa [50,51]. Figura II.3 Emisión de PAHs a través del humo de tabaco II. INTRODUCCIÓN 15 Chen y col. [52] han estudiado los niveles de PAHs en carne de pato, sometida a diferentes procesos de preparación. Las mayores concentraciones se encontraron cuando la carne se preparó a la parrilla con carbón vegetal, seguido por ahumado, asado y preparado al vapor. Perelló y col. [53] han evaluado los niveles de PAHs de diferentes productos alimenticios (sardinas, atún, merluza, filete de ternera, lomo de cerdo, pollo, cordero, judías verdes, patatas, arroz y aceite de oliva) antes y después de su preparación. En términos generales, las concentraciones más elevadas se encontraron en alimentos fritos, observándose valores especialmente elevados en pescados. Fuentes móviles Generalmente, cuando se habla de fuentes móviles, se hace referencia a la emisión de vehículos como aviones, embarcaciones, ferrocarriles, automóviles, autobuses, camiones, todoterrenos y maquinaria [11,54,55]. El transporte terrestre es, sin duda, una de las fuentes móviles más importantes. Numerosos estudios demuestran que las emisiones vehiculares representan una de las mayores vías de emisión de PAHs en áreas urbanas [56-60]. Tavares y col. [61] han medido las concentraciones de 10 PAHs en una estación central de autobuses en Londrina (Brasil), donde sólo circulan vehículos diesel. Las muestras fueron recogidas dentro de periodos de 24 horas durante 14 días consecutivos, y la concentración media de PAHs fue de 84.5 ng m-3. Las concentraciones de PAHs fueron menores el domingo, debido principalmente a la reducción del tráfico de autobuses en la estación. Además de las emisiones asociadas a la combustión en los motores del tráfico vehicular, también se producen emisiones a partir de las pérdidas de aceite, del desgaste de los frenos, la abrasión de los neumáticos y del asfalto utilizado en las carreteras [60]. Barcos, aviones y trenes también contribuyen de manera importante a la emisión de PAHs. Kholer y Kunniger [62] han estimado que cada año se emiten alrededor de 139 toneladas de estos contaminantes a partir de la creosota asociada a la red de ferrocarril suíza. Chen y col. [63] caracterizaron las emisiones a partir de un motor de helicoptero y encontraron concentraciones hasta 52 veces superiores que las encontradas en emisiones de motores de automóviles y aviones. La combustión que tiene lugar en los reactores de aviones, también constituye una vía de contaminación. La distribución espacial de las concentraciones de B[a]P en el 1. PAHs 16 suelo, ha permitido demostrar que un aeródromo militar, donde habitualmente despegan aviones, constituye una fuente importante de PAHs en la zona [64]. Los barcos también constituyen una fuente importante de emisión [65]. Cooper [66] ha evaluado la emisión de un barco durante sus actividades habituales de carga y descarga. Las emisiones totales de PAHs oscilaron entre 0.15-2 mg kW h-1, excepto para el barco que utiliza aceites residuales más pesados (9.5-11 mg kW h-1) que genera una mayor contaminación. La limpieza de los tanques de los petroleros en alta mar también se considera un foco de contaminación, pero sin duda uno de los problemas más importantes se centra en los derrames de fuel en las aguas [67-71]. Fuentes industriales Entre las fuentes industriales más importantes, se incluyen la producción primaria de aluminio (en particular aquellas plantas que utilizan el proceso de Soderberg), la producción de coque (por ejemplo, como parte de la producción de hierro y acero), creosota y conservación de la madera, incineración de residuos, fabricación de cemento, industrias petroquímicas y relacionadas, industrias de betún y asfalto, fabricación de neumáticos de caucho, y producción comercial de calor y energía [27,30,72]. Chen y col. [73] estudiaron los PAHs generados durante el proceso de pirólisis de residuos de neumáticos en una planta del Sur de Taiwan. El contenido total medio de estes contaminantes fue de 77 µg g-1, siendo el I[1,2,3-c,d]P, DB[a,h]A y B[a]P los compuestos mayoritarios. En un estudio realizado sobre 105 suelos del Norte de China, se han encontrado concentraciones extraordinariamente elevadas de PAHs. La muestra de suelo más contaminada (40692 ng g-1) fue recogida en una zona con gran actividad portuaria, donde se producen continuamente descargas de mineral, petróleo y carbón. A excepción de esta muestra, las mayores concentraciones de PAHs se Figura II.4 Fotografía de la playa de Ximprón (Lira, A Coruña) tras el derrame de fuel del Prestige en 2002. II. INTRODUCCIÓN 17 encontraron en suelos distribuídos alrededor de parques industriales (industria química y petro-química) [74]. Law y col. [75] evaluaron la contaminación de sedimentos, mejillones y crustáceos (langostas y cangrejos) a partir de una planta de producción de gas. El substrato recogido en el antiguo emplazamiento de la planta de producción de gas, presentaba unas concentraciones muy elevadas de PAHs (458000 µg kg-1). Esta fuerte contaminación está directamente relacionada con el uso de carbón, alquitrán y productos de refinería durante la producción de gas. Las concentraciones totales de PAHs en mejillones y crustáceos variaron entre 4.9 y 6450 µg kg-1. Las menores concentraciones se encontraron en crustáceos, mientras que los mejillones mostraban una fuerte contaminación (1260-6450 µg kg-1). Otros estudios demostraron la contaminación a partir de refinerías de petróleo [76], de una fundición de aluminio (Söderberg) [77], de plantas de reciclaje de residuos plásticos [78], y de industrias de hierro y acero [79]. Fuentes Agrícolas La quema de biomasa a cielo abierto, es una práctica tradicional muy común para la eliminación de residuos agrícolas y forestales (hojas, ramas, maleza, paja, etc.) y la preparación de los campos antes de una nueva cosecha. Sin embargo, además de causar la reducción de la humedad del suelo, el incremento de la erosión, la pérdida de nutrientes y la destrucción de la materia orgánica, este tipo de prácticas, son responsables de la emisión una gran cantidad de contaminantes. Así, la quema de desechos agrícolas, constituye una fuente importante de emisión de PAHs al medio ambiente [80-85]. Godoi y col.[86] estudiaron la emisión de PAHs durante la quema de caña de azúcar, y los niveles encontrados fueron similares a los encontrados en algunos centros urbanos. Jenkins y col. [87] estudiaron los factores de emisión para 19 PAHs mediante la quema de biomasa agrícola y forestal. Las emisiones variaron entre 5 y 683 mg kg-1, dependiendo principalmente de las condiciones de quemado y en menor medida del tipo de material quemado. Pereira Netto y col. [88] estudiaron suelos de un área agrícola, localizada en una región no-contaminada de Brasil, después de ser sometidos a la quema de 1. PAHs 24 La contaminación de aguas y sedimentos juega un papel importante en la entrada de PAHs en algunas especies acuáticas. Los factores de bioconcentración de PAHs son diferentes en función del organismo del que se trate. Especies que presentan una menor capacidad metabólica hacia los PAHs, como algas, moluscos, mariscos y los invertebrados más primitivos (protozoos, poríferos y cnidarios), acumulan altas concentraciones de estos contaminantes. Los peces generalmente no acumulan concentraciones elevadas de PAHs, ya que presentan un sistema que les permite metabolizarlos y excretarlos por la bilis [7,14]. En un estudio realizado en las costas de Japón, se han analizado PAHs en sedimentos y vida marina, con el objetivo de examinar los perfiles de bioacumulación y la toxicidad de estos contaminantes. Las concentraciones más altas se encontraron en organismos inferiores, como cangrejos y lombrices de mar, mientras que no se detectaron en peces costeros. La mayor bioacumulación en lombrices y cangrejos podría ser debida a la ingesta directa de partículas y sedimentos que están contaminados con PAHs [148]. En la tabla II.4 se recogen algunos ejemplos de los niveles de concentración encontrados en diferentes especies acuáticas. II. INTRODUCCIÓN 25 Tabla II.4 Concentraciones (ng g-1, peso fresco) encontradas en especies acuáticas de diferentes localizaciones. Tipo de matriz Procedencia Concentración (ng g-1) PAHs Ref Almejas España (Huelva) 40.4-52.3 16 [149] Almejas Japón (Mar Ariake) 6.3 ± 3.0 24 [148] Alburno Italia (Lago Iseo) 26.6 4 [150] Anchoa España (Cataluña) 6.80 16 [151] Atún España (Cataluña) 15.56 16 [53] Besugo España (Huelva) 65.7 16 [149] Breca China (Hong Kong) 12.3 16 [152] Caballa Portugal (Oporto) 3.34-5.03 16 [153] Cabeza de serpiente moteada India (Río Gomti) 12.85-34.89 16 [154] Cangrejo Egipto (Ismalia) 11.7 16 [155] Cangrejo Japón (Mar Ariake) 4.2 ± 1.4 a 24 [148] Carpa China (Río Yangtze) 0.00029-0.00744 16 [156] Carpa Italia (Lago Iseo) 64.8 a 4 [150] Gambas España (Cataluña) 15.88 16 [151] Jurel Portugal (Oporto) 0.73-4.80 16 [153] Langostinos España (Huelva) 8.22 16 [149] Lenguado España (Huelva) 71.4 16 [149] Lubina Portugal (Oporto) 11.63-17.04 16 [153] Lucio Italia (Lago Iseo) 25.0 a 4 [150] Mejillón Argentina (Estuario de Bahía Blanca) 384-1597 a 17 [134] Mejillón China (Hong Kong, Puerto Victoria) 600.4-22858.6 a 15 [157] Mejillón España (Cataluña) 22.44 16 [151] Mejillón Japón (Costa de Mikuni-cho) 20.0-30.3 7 [71] Merluza España (Cataluña) 6.06 16 [53] Mújol Egipto (Ismalia) 154.3 16 [155] Ostras España (Reserva Natural Urdaibai) 300-1400 a 16 [124] Ostras Japón (Mar Ariake) 6.3 ± 1.8 24 [148] Percebe Japón (Costa de Mikuni-cho) 5.3-17.0 7 [71] Pejerrey argentino Argentina (Estuario de Bahía Blanca) 1095 a 17 [134] Salmón Canadá (Vancouver) Estados Unidos (Alaska) 3.3-39.8 20 [158] Salmón España (Cataluña) 5.95 16 [151] Sardina España (Cataluña) 17.22 16 [53] Sardina Portugal (Oporto) 3.64-6.60 16 [153] Sepia España (Huelva) 21.8 16 [149] Verrugato croca Estados Unidos (Costa Sureste) 196 23 [159] a Concentraciones en peso seco Los peces y productos marinos, representan una parte importante de la dieta y por lo tanto una ruta de entrada de PAHs en el organismo humano. Sin embargo, no son los únicos alimentos en los que se han detectado estos contaminantes. Diferentes estudios han permitido poner de manifiesto las concentraciones de PAHs presentes en carne [53,155], vegetales [160,161], frutas [162], aceites [151,163] y cereales [151]. 1. PAHs 26 La contaminación de los alimentos se produce bien por la absorción de PAHs desde ambientes contaminados o bien por la forma de preparación de los mismos, ya sea por el tratamiento térmico en la preparación y manufactura, por contaminación accidental durante el procesado, aditivos y procesos de cocinado [1]. El ahumado de los alimentos también constituye una fuente importante de contaminación, especialmente cuando el proceso se realiza en condiciones no controladas [164,165]. Por ejemplo, pescado ahumado, en un horno tradicional que utiliza madera presenta una concentración de benzo[a]pireno entorno a 50 ng g-1 (peso seco) [166]. Un estudio realizado en Cataluña (España) sobre la exposición dietética a estas sustancias, encontró que los alimentos con mayores niveles de PAHs totales eran la carne y productos cárnicos (25.56 ng g-1), aceites y grasas (23.48 ng g-1) y cereales (20.44 ng g-1) [151]. Jánská y col. [162] realizaron una investigación para comprobar los niveles de contaminación de frutas y verduras en Moravia (República Checa). Los niveles medios de PAHs totales encontrados en frutas, fueron 9.30 ng g-1 en manzana, 6.82 ng g-1 en uva y 4.57 ng g-1 en albaricoque. En el caso de los vegetales, las mayores concentraciones se encontraron en repollo (13.14 ng g-1) seguido de perejil (9.22 ng g-1), coliflor (8.85 ng g-1), tomate (7.53 ng g-1) y pepino (5.48 ng g-1). Rojo-Camargo y col. [161] han publicado resultados similares, con concentraciones medias de 9.50 ng g-1 en tomate, 4.05 ng g-1 en manzanas y 3.87 ng g-1 en uvas. Además de estar relacionada con la contaminación de sedimentos y especies acuáticas, la contaminación del agua está directamente relacionada con la contaminación de lodos de depuradora y suelos. Tal y como puede observarse en la tabla II.3, el agua de lluvia y las aguas residuales contienen cantidades relativamente elevadas de PAHs. Estas aguas fluyen a través de la red de alcantarillado hasta llegar a las plantas de tratamiento de aguas residuales. Una vez allí, la naturaleza lipofílica de estos contaminantes, origina que se adsorban casi en su totalidad (<90%) a las partículas de los lodos [167]. Como consecuencia, las concentraciones de PAHs en lodos oscilan generalmente desde unos pocos microgramos hasta cientos de miligramos por kg de materia seca, en función del origen del agua residual y del nivel de mineralización de la materia orgánica [168,169]. II. INTRODUCCIÓN 27 En la tabla II.5 se presentan algunos ejemplos de las concentraciones encontradas en lodos de depuradoras de aguas residuales. Tabla II.5 Concentraciones (mg kg-1, peso seco) en lodos de depuradora de aguas residuales. Procedencia Origen Concentración (mg kg-1) PAHs Ref China (Wenzhou) Influente fábrica de cuero 2.61 15 [136] China (9 ciudades) Urbano 1.4-33 16 [170] China (Zhejiang) Industrial 33.73-82.58 16 [171] China (Beijing) Urbano 2.47-25.92 16 [172] China (Delta del río Yangtzé) Doméstico e industrial 0.0167-15.49 16 [173] Corea (Sur, Río Nakdong) Industrial 1.2-44.9 16 [174] España (Pamplona) Urbano e industrial 128-482 37 [175] España (Cataluña) Portugal (Porto) Doméstico, urbano e industrial 1.13-5.52 16 [169] España (Cataluña) Urbano e industrial 0.03-7.35 9 [176] España (Cádiz) Doméstico e industrial 1.95-10.10 16 [177] España (Madrid) Urbano, rural e industrial 0.39-6.39 27 [178] España (Sevilla) U r bano 0.22-2.67 16 [179] Francia (París) Doméstico e industrial 14-31 16 [180] Francia (Lorena) Urbano e industrial 17-73 16 [181] Italia (Venecia) Industrial y municipal 1.44 16 [137] Jordania (Karak) Urbano e industrial 0.029-0.039 16 [138] Kuwait Doméstico 1.56-6.18 16 [182] Polonia Industrial y municipal 2.04-3.64 16 [183] Polonia Municipal 0.94-1.31 16 [184] Reino Unido Doméstico, urbano e industrial 67-370 24 [185] Suíza Doméstico e industrial 1.00-22.64 16 [186] La mayoría de las plantas de tratamiento de aguas residuales reciben influentes urbanos y municipales, de origen doméstico e industrial. El origen de las aguas residuales determina la cantidad de contaminantes en el lodo resultante. Según Hua y col. [171] existe una importante relación entre la proporción de agua residual de origen industrial, recibida en las plantas de tratamiento de aguas residuales, y el contenido de PAHs en el lodo. Berset y col. [186] han encontrado que los niveles de PAHs en lodos de origen doméstico son menores que las concentraciones encontradas en lodos de origen industrial. Por su parte, Villar y col. [177] han encontrado que la concentración de PAHs en lodos es más alta en verano y otoño, lo que está asociado con el incremento estacional de la actividad industrial en la zona estudiada. 1. PAHs 28 El suelo parece ser un depósito importante de PAHs a largo plazo y se considera un indicador fiable del estado de contaminación ambiental. La acumulación de los PAHs en suelos podría originar la contaminación de vegetales y por lo tanto entrar en la cadena alimenticia, originando la exposición directa o indirecta a humanos. Los PAHs son adsorbidos fuertemente a la fracción orgánica de los suelos. Algunos PAHs pueden ser degradados biológicamente en la capa aeróbica del suelo, pero este proceso es lento, debido a la adsorción a la fracción de carbón orgánico del suelo que reduce su biodisponibilidad [7]. Muchos estudios han publicado los niveles de contaminación de los suelos en diferentes regiones de la Tierra [20]. En la tabla II.6, se pueden observar algunos ejemplos. II. INTRODUCCIÓN 29 Tabla II.6 Concentraciones (mg kg-1, peso seco) de PAHs en suelos de diferentes lugares. Tipo de matriz Procedencia Concentración (mg kg-1) PAHs Ref Suelo contaminado (creosota) Australia (Australia Meridional) 7767 ± 1286 16 [187] Suelo Canadá (Revelstoke, Yoho, Observation) 0.002-0.79 16 [103] Suelo China (Wenzhou) 0.40-1.93 15 [136] Suelo China (Hangzhou) 0.060-0.62 10 [127] Suelo urbano China (Shangai) 0.44-19.70 22 [188] Suelo China (Wenling) 0.37-1.23 16 [189] Suelo agrícola China (Noreste) 0.6-12.36 16 [190] Suelo Corea del Sur 0.012-1.02 15 [146] Suelo de marisma Corea del Sur (Costa Sur y Oeste) 0.070-1.18 16 [191] Suelo agrícola Corea del Sur 0.023-2.83 16 [192] Suelo urbano Eslovenia (Ljubljana) 0.22-4.49 15 [193] Suelo agrícola España (Almería) 0.0015-0.37 18 [194] Suelo Estados Unidos (Texas) 0.0001-2.23 16 [195] Suelo India (Delhi) 1.06-9.65 16 [196] Suelo India (Delhi) 0.0024-0.0075 12 [197] Suelo de jardín doméstico Italia 0.040-5.28 13 [198] Suelo urbano Italia (Turín) 0.15-23.50 15 [193] Suelo Italia (Reserva Natural Isola delle Femmine) 0.035-0.55 16 [199] Suelo Japón 0.13 16 [200] Suelo Nigeria (Delta del Niger) 0.024-0.12 28 [201] Suelo Nigeria (Delta del Niger) 1.69x10-8–0.37 16 [202] Suelo contaminado (creosota) Noruega (Drammen) 5550 15 [203] Suelo urbano Noruega (Drammen) 38.0 15 [203] Suelo Noruega 0.009-1.05 15 [204] Suelo Pakistán (Peshawar) 80.4-113 7 [205] Suelo Reino Unido 0.042-11.20 15 [204] Suelo urbano Reino Unido (Glasgow) 1.49-51.82 15 [193] Suelo Sudáfrica (Triángulo del Vaal) 0.20-38.85 16 [206] Suelo Suíza 0.032-8.47 16 [207] Suelo industrial Turquía (Aliaga) 0.0011-4.63 15 [113] En un estudio realizado en Delhi (India) se investigó el impacto del tráfico vehicular en el estado de contaminación de los suelos [196]. Se analizaron suelos superficiales (0-5 cm) recogidos en zonas con tráfico, y un suelo de una zona rural. Las concentraciones totales de 16 PAHs en los lugares caracterizados por el tráfico oscilaron entre 1.06 y 9.65 mg kg-1, con un valor medio de 4.69 ± 3.03 mg kg-1; mientras que la concentración media encontrada en el suelo rural fue de 0.886 ± 0.303 mg kg-1. Khan y col. [205] desarrollaron un estudio similar en Peshawar (Pakistán) y encontraron que los suelos cercanos a las carreteras presentaban un alto nivel de contaminación. Las concentraciones totales de 7 PAHs en suelos 1. PAHs 30 oscilaron entre 80.4 y 113 mg kg-1, estableciéndose las emisiones vehiculares como principal fuente de contaminación. Las actividades industriales también figuran como una fuente importante de contaminación. Así, las concentraciones suma de 15 PAHs en suelos recogidos de 50 puntos diferentes, en la región industrial de Aliaga en Izmir (Turquía), variaron entre 0.011 y 4.628 mg kg-1. La distribución espacial de estas concentraciones indicó que en Aliaga, las plantas de acero, la refinería de petróleo y la planta petroquímica son las fuentes mayoritarias de PAHs en esta área [113]. De acuerdo con Vyskocil y col. [208] la concentración total de PAHs en suelos de un jardín infantil localizado en un área contaminada (0.132 mg kg-1) fue el doble que aquellas encontradas en jardínes infantiles situados en áreas no contaminadas (0.065 mg kg-1). 1.4. TOXICIDAD Los PAHs son contaminantes medioambientales que desatan un gran interés en el medio científico debido a su elevada toxicidad y su alto potencial carcinogénico y mutagénico [1,3,18,209-213]. La primera referencia histórica sobre la toxicidad de estos compuestos data de 1775, cuando el médico británico Percival Pott encontró cierta relación entre la profesión de deshollinador y el cáncer de escroto [214,215]. Dedujo que tras años y años de exposición al hollín, algunos trabajadores acababan por desarrollar este tumor maligno. Desde entonces, se ha realizado un gran esfuerzo investigador para poder establecer la relación entre estos compuestos y sus posibles efectos nocivos [216]. 1.4.1. EVALUACIÓN MEDIOAMBIENTAL En base a los efectos nocivos y la elevada toxicidad de estos contaminantes en los seres vivos y el medio ambiente, muchos compuestos de este grupo han sido considerados como contaminantes peligrosos por las asociaciones y organismos gubernamentales internacionales más relevantes. Desde 1950 la OMS dio recomendaciones para el establecimiento de registros de cáncer epidemiológicos y en 1965 fundó la Agencia Internacional de Investigación del Cáncer (International Agency for Research on Cancer, IARC), II. INTRODUCCIÓN 31 con centro en Lyon [217]. Este organismo realizó numerosas investigaciones y programas internacionales para llevar a cabo la identificación y evaluación de los riesgos asociados a la exposición de humanos a químicos carcinogénicos y mezclas complejas. El programa de monografías de la IARC ha evaluado el potencial carcinogénico de los PAHs y nitro-PAHs [218-220], así como los riesgos asociados a diferentes materiales y actividades relacionadas [221-224]. Por su parte, la OMS dedica una monografía [7] a los PAHs, en la cual se recogen las propiedades físicoquímicas, las principales fuentes de emisión, la distribución de estos contaminantes en el medio ambiente, así como una descripción detallada de los efectos nocivos y la toxicidad de estos compuestos. La IARC cataloga las sustancias según el conocimiento de su carcinogenia estableciendo varios grupos diferenciados [219,220]. En la tabla II.7 se recoge la clasificación que establece la IARC para diferentes PAHs y mezclas relacionadas. Tabla II.7 Clasificación establecida por la IARC para algunos PAHs y mezclas de interés [220]. Grupo 1 Benzo[a]pireno, gasificación de carbón, producción de coque, destilación de alquitrán de carbón, deshollinador de chimeneas, pavimentado con alquitrán, producción de aluminio Grupo 2A Ciclopenta[c,d]pireno, dibenz[a,h]antraceno, dibenzo[a,l]pireno, creosota, manufactura de carbón mediante electrodos Grupo 2B Benz[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno, benzo[j]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[c]fenantreno, criseno, dibenzo[a,h]pireno, dibenzo[a,i]pireno, indeno[1,2,3- c,d]pireno, 5-metilcriseno Grupo 3 Acenafteno, antraceno, benzo[b]criseno, benzo[g]criseno, benzo[a]fluoranteno, benzo[g,h,i]fluoranteno, benzo[a]fluoreno, benzo[b]fluoreno, benzo[c]fluoreno, benzo[g,h,i]perileno, benzo[e]pireno, coroneno, dibenz[a,c]antraceno, dibenzo[a,j]antraceno, dibenzo[a,e]fluorantano, dibenzo[def, mono]criseno dibenzo[h,rst]pentafeno, dibenzo[a,e]pireno, dibenzo[e,l]pireno, 1,4-dimetilfenantreno, fluoranteno, fluoreno, 1-metilcriseno, 2-metilcriseno, 3-metilcriseno, 4-metilcriseno, 6- metilcriseno, 2-metilfluoranteno, 3-metilfluoranteno, 1-metilfenantreno, perileno, fenantreno, piceno, pireno, trifenileno. Grupo 1, el compuesto es cancerígeno para los humanos. Grupo 2A, probablemente cancerígeno para los humanos. Grupo 2B, posiblemente cancerígeno para los humanos. Grupo 3, no clasificable como cancerígeno para los humanos. La EPA ha elaborado varias publicaciones relativas a la toxicidad y los efectos dañinos de los PAHs. Además ha clasificado 16 PAHs como contaminantes orgánicos prioritarios [225,226]. Estos son el naftaleno, acenafteno, acenaftileno, 1. PAHs 32 fluoreno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, benzo[a]antraceno, criseno, benzo[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[g,hi]perileno e indeno[1,2,3-c,d]pireno. Por otro lado, ha clasificado el benzo[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, criseno, dibenzo[a,h]antraceno e indeno[1,2,3-c,d]pireno como probables carcinógenos [227], y reconoce como carcinógenos mezclas de compuestos como por ejemplo el hollín, las emisiones de hornos de coque y el alquitrán de carbón, que contienen PAH [228]. La Agencia para Sustancias Tóxicas y el Registro de Enfermedades (Agency for Toxic Substances and Disease Registry, ATSDR) ha preparado un perfil toxicológico [8] que incluye información acerca de la toxicología y de los efectos adversos en la salud, y ha elaborado una lista de 17 compuestos del grupo de los PAHs, en base a su toxicidad, mayor riesgo de exposición, mayores concentraciones encontradas y el volúmen de información existente sobre ellos. La mayoría de los compuestos recogidos coinciden con los clasificados por la EPA como contaminantes prioritarios, exceptuando el naftaleno e incluyendo el benzo[e]pireno y el benzo[j]fluoranteno. Por otra parte, a lo largo de la década pasada, los PAHs se han situado en los primeros puestos de la lista de sustancias peligrosas de la Ley de Responsabilidad, Compensación y Recuperación Ambiental (Comprehensive Environmental Response Compensation, and Liability Act, CERCLA). Así, el benzo[a]pireno, benzo[b]fluoranteno y el grupo de los PAHs en general, se han situado entre los diez primeros puestos de un total de 275 sustancias [229]. En base a que existen suficientes evidencias de carcinogénesis en animales, el Programa Nacional de Toxicología (NTP) anticipa que contaminantes como el benzo[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno, benzo[j]fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[a]pireno, dibenzo[a,h]antraceno, dibenzo[a,e]pireno, dibenzo[a,h]antraceno, dibenzo[a,i]pireno, dibenzo[a,l]pireno, indeno[1,2,3-c,d]pireno y 5-metilcriseno, pueden ser considerados como carcinógenos en humanos [230]. 1.4.2. TOXICOLOGÍA Y RIESGOS PARA LA SALUD La genotoxicidad de los PAHs depende en gran medida de su estructura química, ya que ha sido asociada con el grado de no-planaridad de estos II. INTRODUCCIÓN 33 compuestos, así como a la existencia de la “región bahía”. El aumento de la reactividad en los PAHs no-planares se cree que es debido al aumento del carácter olefínico de algunos enlaces aromáticos en la molécula, mientras que la presencia de la “región bahía” le confiere a la molécula unas propiedades electrofílicas elevadas que permiten interaccionar con los enlaces covalentes [16,231]. La introducción de grupos metilo o de otro tipo en los anillos de estos compuestos produce una distorsión de la planaridad que algunas veces se traduce en mayor reactividad y carcinogenia. Entre los más peligrosos destacan los derivados del antraceno, molécula que curiosamente ella misma no es carcinogénica, pero sí las que contienen su estructura básica a la que se añade algún anillo bencénico (como benzo[a]antraceno, benzo[a]pireno y dibenzo[a,h]antraceno) y algunos sustituyentes como los grupo metilo. También es importante destacar que aunque algunos PAHs carecen de propiedades mutágenas y cancerígenas, tienen una función de co-cancerígenos cuando se aplican simultáneamente con sus homólogos cancerígenos [232]. La actividad genotóxica de los PAHs ha sido evaluada mediante estudios con diferentes animales [209], como por ejemplo mejillones expuestos al fuel derramado por el Prestige [70], roedores salvajes de un área de minería de hulla [233] o caracoles expuestos a materia particulada con concentraciones importantes de PAHs [234]. En todos los casos se han detectado daños serios en el ADN. Chakravarti y col. [235] han estudiado la formación de aductos estables de PAHs y ADN en piel de ratones y han observado que son responsables de mutaciones que dán lugar a papilomas y tumores. Los PAHs se bioacumulan en los tejidos grasos de algunos organismos marinos, relacionándose con la producción de lesiones de hígado y tumores en algunos peces [3], así como se piensa que juegan un papel importante en la devastación de las poblaciones de ballenas beluga en el río St. Lawrence [4,236]. Generalmente la exposición a niveles subletales de PAHs en el rango lipofílico de log Kow de 2 a 6, origina anormalidades morfológicas, fisiológicas y del desarrollo en pescados. Además se ha demostrado que la exposición a PAHs causa una importante reducción en la incubación de huevos y en la longitud y el peso de las larvas, así como aberraciones en cromosomas de pescado [3]. 1. PAHs 40 y, en el caso de los ya contaminados, identificarlos y caracterizarlos utilizando para ello una metodología normalizada y técnicamente rigurosa. En el 2005, mediante el Real Decreto 9/2005, del 14 de enero, se establece la relación de actividades potencialmente contaminantes del suelo y los criterios y estándares para la declaración de suelos contaminados [291]. Así, el Gobierno de España ha establecido niveles regulatorios para algunos PAHs en función de los usos del suelo, estableciendo límites máximos aceptables para 13 PAHs (naftaleno, 1 mg Kg-1; acenafteno, 6 mg Kg-1; fluoreno, 5 mg Kg-1; antraceno, 45 mg Kg-1; fluoranteno, 8 mg Kg-1; pireno, 6 mg Kg-1; benzo[a]antraceno, 0.2 mg Kg-1; criseno, 20 mg Kg-1; benzo[b]fluoranteno, 0.2 mg Kg-1; benzo[k]fluoranteno, 2 mg Kg-1; benzo[a]pireno, 0.02 mg Kg-1; dibenzo[a,h]antraceno, 0.03 mg Kg-1; indeno[1,2,3-c,d]pireno, 0.3 mg Kg-1 (concentraciones en peso seco)) en suelos destinados para actividades agrícolas, forestales y/o ganaderas. Las regulaciones españolas están orientadas en línea con la política de sustancias químicas de la EU. Obviamente, algunos aspectos de la regulación están enfocados específicamente a la situación española, como la distribución entre los poderes del gobierno nacional o de los gobiernos locales. Sin embargo, una parte importante de la propuesta está basada en los protocolos europeos de evaluación de riesgo, y por lo tanto, puede ser extrapolada a nivel europeo [292]. La Directiva 96/62/CE de la EU sobre la evaluación y gestión de la calidad del aire ambiente, establece una lista de los contaminantes atmosféricos que deben tenerse en cuenta en la evaluación y gestión de la calidad del aire ambiente, donde aparecen los PAHs [293]. Más adelante, con el fin de reducir al mínimo los efectos perjudiciales para la salud humana, la Directiva 2004/107/CE estableció un límite máximo de 1 ng m-3 para el benzo[a]pireno, siendo este compuesto el indicador del riesgo cancerígeno de los PAHs en el aire ambiente [294]. Finalmente hay que mencionar que en España se han considerado los riesgos asociados a la exposición laboral. El Real Decreto 665/1997 del 12 de Mayo sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes cancerígenos durante el trabajo, establece una serie de normas y medidas de seguridad e higiene para prevenir la exposición laboral de los trabajadores a una serie de sustancias entre las cuales figuran los hidrocarburos aromáticos policíclicos presentes en el hollín, alquitrán o la brea de hulla [295]. II. INTRODUCCIÓN 41 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS A pesar de los considerables avances tecnológicos en el campo analítico, la mayoría de los instrumentos no pueden procesar matrices complejas directamente. En la mayoría de los casos se requiere una etapa previa de preparación de muestra, mediante la cual se concentran los analitos de interés, y se obtiene un extracto limpio, compatible con el sistema analítico. En ocasiones, si la muestra es muy compleja, los extractos resultantes de la etapa de preparación de muestra, requieren un protocolo de limpieza adicional, antes de su análisis. Así, generalmente las metodologías se componen de tres partes claramente diferenciadas, preparación de muestra, purificación de extractos y determinación. En este capítulo II.2 se recogen los métodos de preparación de muestra, purificación de extractos y determinación, utilizados en el análisis de PAHs. Dentro de los métodos de preparación, se establece una diferenciación en base a la naturaleza de la muestra. En un primer capítulo II.2.1, se describen los fundamentos y aspectos generales, de algunas de las metodologías más relevantes para la preparación de muestras acuosas. Posteriormente en el capítulo II.2.2 se recogen los principales métodos de preparación de muestras sólidas. En ambos casos, se ofrece una explicación más pormenorizada de aquellas metodologías que se han utilizado en esta Tesis Doctoral. A continuación, se presentan los métodos de purificación más comunes (capítulo II.2.3) y finalmente en el capítulo II.2.4 se describen los métodos de determinación. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 42 2.1. MÉTODOS DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS ACUOSAS 2.1.1. TÉCNICAS TRADICIONALES 2.1.1.1. Extracción líquido-líquido La extracción líquido-líquido (liquid liquid extraction, LLE), basada en la transferencia de los analitos desde la muestra acuosa hacia un disolvente inmiscible en agua, es una técnica empleada habitualmente para la preparación de muestras acuosas. Por sus características, es una técnica especialmente apropiada para la extracción de PAHs, ya que son compuestos con un marcado carácter hidrofóbico y la extracción con un disolvente apolar resulta especialmente eficaz. De ahí, que la técnica haya sido aplicada para la extracción de estos compuestos de diferentes tipos de aguas medioambientales, como río [142], lluvia [296], lago [297] y agua de mar [298]. Los disolventes más utilizados para la extracción de PAHs son hexano [298,299], diclorometano [300-302] o mezclas de ambos [303]. De hecho, el diclorometano, es el disolvente utilizado en el método oficial EPA 550 [304], para la determinación de PAHs en aguas destinadas a consumo humano, y en el método EPA 610 [305], para la determinación de PAHs en aguas residuales. No obstante, LLE presenta ciertos inconvenientes, ya que se trata de una técnica lenta y laboriosa, con elevado consumo de disolventes, y con problemas adicionales, como la formación de emulsiones y/o la necesidad de etapas adicionales de evaporación de disolvente. 2.1.1.2. Extracción en fase sólida Otro método de preparación de muestra muy popular es la extracción en fase sólida (solid-phase extraction, SPE). Es una técnica de preparación y tratamiento de muestras, que está basada en la retención selectiva de los analitos sobre un adsorbente apropiado y en su posterior elución. Se trata de un proceso físico, en el que están implicadas, una fase sólida y un líquido. Los analitos presentan mayor atracción por la fase sólida, que por la matriz líquida de la II. INTRODUCCIÓN 43 muestra. Como la muestra pasa a través del lecho del adsorbente, los analitos se concentran en la superficie, mientras que otros componentes de la muestra no retenidos, pasan a través del mismo. Seleccionando adsorbentes adecuados se pueden conseguir extracciones muy selectivas. Esta técnica se ha aplicado en la extracción de PAHs de aguas de bebida [306,307], medioambientales [130,141,302] y residuales [137]. El C18 [126,308- 311] es, con diferencia, la fase más utilizada, pero también se han descrito algunas aplicaciones con fases como C8 [312,313], ciclohexil [141], o fases poliméricas, como discos de estireno-divinilbenceno [314], Oasis HLB (polímero macroporoso de poli(divinilbenceno-co-N-vinilpirrolidona) [130] o Strata-X (fase polimérica de estireno-divinilbenceno de superficie modificada) [315,316]. Los disolventes de elución más comunes son el acetonitrilo [302,312], metanol [317], 2-propanol [318], n-hexano [306,319], diclorometano [141,320], acetato de etilo [309,316], tetrahidrofurano [313], tolueno [307], o mezclas de ellos [130,137,315]. Aunque esta técnica utiliza menos volúmen de disolvente que LLE, la cantidad del mismo puede considerarse bastante importante, y normalmente se requieren pasos adicionales de concentración de los extractos. Por otro lado, aunque la SPE puede ser automatizada, esto conlleva un aumento en la complejidad y un coste adicional. En el caso concreto de los PAHs existen a mayores algunos inconvenientes, ya que es frecuente la pérdida de analitos debida a la adsorción de los mismos a las paredes de los recipientes y conductos por los que circula la muestra [320]. Este problema suele resolverse mediante la adición de un disolvente orgánico (metanol, acetonitrilo o 2-propanol) o un surfactante, que incrementan la solubilidad de los analitos en la muestra acuosa. Sin embargo, la concentración del disolvente orgánico, es un parámetro crítico en SPE. Si el porcentaje de disolvente añadido es bajo, probablemente no sea suficiente para solubilizar los PAHs de mayor peso molecular, produciéndose de igual manera las pérdidas por adsorción. Si por el contrario el porcentaje de disolvente orgánico es demasiado elevado, el volúmen de ruptura de los PAHs de bajo peso molecular, se verá reducido. Por lo tanto, se trata de un parámetro a tener en cuenta, que debe optimizarse en función del adsorbente y del disolvente utilizado [321]. Por otro lado, al tratar de conseguir un factor de concentración máximo, la eficiencia de la extracción disminuye de forma considerable para los PAHs más ligeros, que son menos retenidos por la fase 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 44 adsorbente, y que presentan un volúmen de ruptura menor. Otro problema asociado que limita la recuperación de los compuestos más ligeros, es la pérdida por volatilidad durante las etapas de secado del cartucho y de concentración de los extractos. Cabe mencionar en este sentido, que con el método oficial 550.1 descrito por la EPA, donde se utiliza SPE para la extracción de PAHs en aguas destinadas a consumo, mediante cartuchos de C18 o discos del mismo material, las recuperaciones para algunos de estos compuestos, son de un 50% aproximadamente [322]. 2.1.2. TÉCNICAS DE MICROEXTRACCIÓN La etapa de preparación de muestra está en continua evolución ya que es la causa más frecuente de pérdida de analitos y contaminaciones, y además origina un elevado consumo de tiempo, muestra y reactivos, en algunos casos caros y/o tóxicos. Por ello, la tendencia actual es eliminar todos o parte de estos problemas, o al menos reducirlos, mediante el desarrollo de nuevas técnicas de preparación de muestra o la modificación de las ya existentes, para hacerlas más rápidas, potentes y versátiles. La miniaturización se ha convertido en una tendencia dominante en la Química Analítica durante los últimos años, ya que presenta numerosas ventajas frente a las técnicas de preparación de muestra tradicionales. Algunas de ellas son la simplicidad, rapidez, economía, minimización de las etapas y de la manipulación de la muestra, mayor precisión y sensibilidad. Además, se minimiza la cantidad de muestra, el consumo de reactivos, y de disolventes caros y tóxicos, obteniéndose un sistema más ecológico [323-325]. En las últimas décadas, las técnicas de microextracción están jugando un papel importante en la determinación de PAHs, ya que cada vez son más las metodologías descritas para la extracción de estos analitos mediante técnicas como la microextracción en fase sólida (SPME), la extracción con barras agitadoras (SBSE), la microextracción en fase líquida (LPME), etc. En la figura II.6, se presenta un esquema, donde se recogen las principales técnicas de microextracción que han sido aplicadas para la determinación de estos compuestos, y posteriormente se hace una breve descripción de cada una de las técnicas. II. INTRODUCCIÓN 45 LLE Micro-LLE SPE Micro-SPE Con membrana HF-LPME MASE Directa DLLME SDME SPME SBSE Miniaturización  Figura II.6 Esquema de las técnicas de microextracción consideradas en este capítulo. 2.1.2.1. Microextracción con gota suspendida La microextracción con gota suspendida (single drop microextraction, SDME) fue desarrollada en la década de los 90, como un procedimiento de pretratamiento de muestra que minimiza el consumo de disolvente [326,327]. La fase extractante es una microgota de un disolvente orgánico, suspendida del extremo de la aguja de una microjeringa, y expuesta a la muestra (figura II.7) [327,328]. Después del periodo de extracción, la gota se retrae hacia la aguja de la microjeringa, y finalmente se inyecta en el sistema de medida. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 46 Microgota orgánica Aguja de microjeringa Microjeringa Muestra acuosa Barra agitadora Figura II.7 Representación esquemática de un sistema de microextracción de gota suspendida en la punta de una microjeringa. En este esquema se representa una de las modalidades de SDME, donde la gota de disolvente orgánico, inmiscible en agua, se encuentra inmersa directamente en la muestra. Otra alternativa es realizar el muestreo en espacio de cabeza [329,330]. Se trata de una técnica sencilla y rápida, de bajo coste, efectiva y que requiere pocos microlitros de disolvente en cada extracción [331]. Su principal desventaja es la inestabilidad de la gota, que en ocasiones causa problemas en la repetibilidad de la extracción [323]. Esta técnica ha sido aplicada con éxito, a la extracción de PAHs de muestras de agua de grifo, pozo, manantial, río [332], agua de piscina y aguas residuales [333]. Shariati-Feizabadi y col. [333] proponen un método de SDME en espacio de cabeza, utilizando una microgota de 3 µL de 1-butanol. Hou y col. [334] optan por la inmersión directa de 3 µL de tolueno. También se han encontrado aplicaciones en las que se utilizan líquidos iónicos (hexafluorofosfato de 1-octil-3-metilimidazolio ([C8MIM][PF6]), tris(pentafluoroetil)trifluorofosfato (FAP)) como fase extractante, mediante inmersión directa [332,335]. II. INTRODUCCIÓN 47 2.1.2.2. Microextracción líquido-líquido dispersiva La microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) fue introducida por Assadi y colaboradores en 2006 [336]. Se trata de una técnica de microextracción que ofrece importantes ventajas respecto a los métodos de extracción convencionales, ya que permite llevar a cabo la preparación de la muestra de una manera rápida y simple, con bajo coste, sin necesidad de utilizar grandes cantidades de disolventes orgánicos, y con posibilidad de combinarla con la mayoría de los métodos analíticos. Estas ventajas han originado que desde su introducción, haya sido utilizada para la extracción de una gran cantidad de contaminantes en muestras acuosas. 2.1.2.2.1. Principios de la técnica DLLME está basada en un sistema de disolventes ternario, donde se utiliza una mezcla de un disolvente de alta densidad, que actúa como extractante, y un disolvente polar, miscible en agua, que ejerce la función de dispersante. Los disolventes de extracción más comunes son disolventes orgánicos clorados. Algunos ejemplos son, el clorobenceno, tetracloruro de carbono, tetracloroetileno o cloroformo. Acetona, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano son los disolventes dispersantes utilizados generalmente. La mezcla apropiada de disolventes de extracción y dispersante se inyecta rápidamente en la muestra acuosa que contiene los analitos. Inmediatamente se produce una gran turbidez de la mezcla ternaria, debido fundamentalmente a la formación de gotas muy finas que están dispersadas a través de la muestra acuosa. El área superficial entre el disolvente de extracción y la muestra es muy elevada, por lo que el estado de equilibrio se alcanza rápidamente, y en consecuencia el tiempo de extracción es muy corto. De hecho, esta es una de las principales ventajas de DLLME [336,337]. Figura II.8 Fotografía de la muestra acuosa tras la inyección de la mezcla de disolventes. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 48 El siguiente paso es la etapa de centrifugación de la mezcla turbia, después de la cual se obtiene una fase sedimentada en el fondo del tubo. Por razones prácticas, se utilizan tubos de vidrio de fondo cónico, lo cual facilita la recuperación de la gota, que se lleva a cabo con una microjeringa. Los analitos de interés se concentran desde la muestra acuosa, en el pequeño volúmen de disolvente de extracción, de modo que en una única etapa se produce la extracción y concentración de los mismos. Finalmente, la determinación de los analitos de la fase sedimentada puede realizarse mediante análisis instrumental [336,337]. Recuperaciones y factores de enriquecimiento La influencia de las distintas variables, durante la etapa de optimización de un método de DLLME, se determina utilizando los factores de enriquecimiento (EF) y las recuperaciones (R). Los EFs se definen como el cociente entre la concentración de cada compuesto en la fase sedimentada y la concentración inicial en la muestra acuosa. Las recuperaciones se calculan como el producto de los EFs por el cociente entre el volúmen de la fase sedimentada y la fase acuosa multiplicando por cien. EF = C sed C 0 R= ŋ sed ŋ aq x 100 = C sed C 0 V sed V aq x x x 100  R= V sed V aq x 100EF  donde C0 y Csed son las concentraciones en la muestra y en la fase sedimentada respectivamente. ŋsed ŋaq es la cantidad de analito en la fase sedimentada y en la fase acuosa respectivamente y Vsed y Vaq son los volúmenes de la fase sedimentada y acuosa, respectivamente. Figura II.9 Fotografía de la separación de las fases tras la etapa de centrifugación. II. INTRODUCCIÓN 49 Las condiciones de extracción afectan al volúmen de gota sedimentada, por lo que es necesario utilizar tanto las recuperaciones como los factores de concentración en la optimización, buscando siempre en medida de lo posible los valores máximos para ambos parámetros. 2.1.2.2.2. Variables que afectan al proceso de extracción En DLLME, los factores que afectan a la eficiencia de la extracción son fundamentalmente el tipo y volúmen de disolvente de extracción y el tipo y volúmen de disolvente dispersante. La selección de un disolvente de extracción adecuado es el parámetro principal del proceso de DLLME. Los disolventes orgánicos son elegidos en base a su mayor densidad que el agua, capacidad de extracción por los compuestos de interés y buen comportamiento cromatográfico. El volúmen del disolvente de extracción tiene un efecto importante en el EF. El incremento del volúmen de extractante, se traduce en un aumento del volúmen de fase sedimentada, por lo que disminuye el EF. Sin embargo, la reducción del volúmen de extractante está determinada por la obtención de una gota sedimentada fácilmente manipulable. Por tanto, el volúmen de disolvente debe ser optimizado para conseguir, por un lado los mejores EFs, y por otro, un volúmen suficiente de fase sedimentada, que permita su análisis después de la centrifugación [336,337]. La miscibilidad del disolvente dispersante con el disolvente de extracción y con la fase acuosa, es esencial en la selección del mismo. El volúmen de disolvente dispersante afecta directamente al grado de dispersión del disolvente de extracción en la fase acuosa, y por lo tanto, a la eficiencia de extracción. Variaciones en el volúmen de disolvente dispersante también originan cambios del volúmen de la fase sedimentada. Para conseguir un volúmen constante de la fase sedimentada, es necesario realizar simultáneamente cambios en los volúmenes de dispersante y extractante. El volúmen de muestra y la solubilidad del disolvente de extracción, también juegan un papel importante en el volúmen de la fase sedimentada. Desde el punto de vista experimental, para obtener un volúmen constante de fase sedimentada es necesario realizar algunos experimentos iniciales de prueba y error [336-338]. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 56 fluidos biológicos [375]; matrices alimentarias, como leche, yema de huevo, aceite de oliva [376], miel [377], frutas [342,378] y pescados [379]; e incluso a muestras de suelo [380-382]. DLLME también se ha utilizado como técnica de purificación y concentración combinada con SPE [382-384]. Liu y col. [385] han desarrollado una metodología de SPE-DLLME-GC-ECD para la determinación de PBDEs en muestras de agua y plantas. Después de la preconcentración y purificación de las muestras en un cartucho de C18, 1 mL del eluyente, que contiene 22 µL de 1,1,2,2-tetracloroetano se inyecta rápidamente en 5 mL de agua pura. Después de la etapa de centrifugación, la fase sedimentada se inyecta en el GC-ECD. Bajo condiciones óptimas, los EFs oscilan entre 6838-9405. Montes y col. [386] proponen un método de SPE-DLLME para la determinación de fungicidas en muestras de vino. 20 mL de vino se concentran utilizando un adsorbente en fase reversa. A continuación, los compuestos de interés se eluyen con 1 mL de acetona. Este extracto se mezcla con 0.1 mL de 1,1,1-tricloroetano y la mezcla obtenida se añade a 10 mL de agua ultrapura. El método proporciona EFs entorno a 200 y se observa una mejora en la selectividad si se compara con el método de SPE simple. En 2007, se ha desarrollado una nueva aplicación de la técnica [387], donde se sustituyen los disolventes orgánicos clorados, por disolventes con bajos puntos de fusión y densidad inferior a la del agua, como el 1-undecanol, 1- dodecanol, 2-dodecanol, 1-tetradecilalcohol o el n-hexadecano [388,389]. En este caso, tras la etapa de centrifugación, la gota de extractante no se deposita en el fondo del tubo de extracción, sinó que flota sobre la superficie de la muestra. La recuperación del extractante se lleva a cabo mediante la solidificación de la gota orgánica flotante (solidification of floating organic drop, SFO). Leong y col. [390] desarrollaron un método de DLLME-SFO-GC-MS para llevar a cabo el análisis de compuestos orgánicos halogenados en muestras de agua. Una mezcla de 0.5 mL de acetona que contiene 10 µL de 2-dodecanol se inyecta rápidamente utilizando una jeringa, en 5 mL de la muestra acuosa. Después de centrifugar, las finas gotas de 2-dodecanol están flotando por la parte superior de la muestra acuosa. A continuación, el tubo que contiene la mezcla se introduce en un baño de hielo durante 5 min. Después de este tiempo, el 2-dodecanol solidificado se transfiere a un vial a temperatura ambiente hasta que pasa nuevamente a estado líquido. Finalmente, se inyectan 2 µL en GC-MS. Trabajando en estas condiciones se II. INTRODUCCIÓN 57 consiguen EFs y recuperaciones que varían entre 228-322 y 81-102%, respectivamente. Otra técnica relacionada es la emulsificación-microextracción asistida por ultrasonidos (ultrasound-assisted emulsification-microextracion, USAEME). Se trata de una técnica híbrida entre DLLME y la LLE asistida por ultrasonidos (ultrasoundassisted liquid-liquid extraction, USALLE). USAEME consiste en la adición del disolvente extractante a la muestra y someter la mezcla a radiación de ultrasonidos. Tras un tiempo de extracción, la mezcla se centrifuga y se obtiene la fase sedimentada [391]. A diferencia de DLLME, se utiliza un sistema binario de disolventes, ya que en este caso el disolvente dispersante se sustituye por el poder emulsionante de la radiación de ultrasonidos. Esta metodología se ha aplicado para la determinación de conservantes fenólicos [392], pesticidas [393], PCBs [394], PAHs [395] y PBDEs [396] en aguas. 2.2.2.2.4.1 Líquidos iónicos como fase extractante Los líquidos iónicos (ILs), también llamados líquidos iónicos a temperatura ambiente (“room-temperature ionic liquids”, RTILs), son sales líquidas a temperatura ambiente, debido a que presentan puntos de fusión inferiores a esta temperatura. Estos compuestos resultan de la combinación de un catión orgánico y un anión orgánico o inorgánico. La mayoría de los ILs estudiados están formados por los cationes 1-alquil-3-metilimidazolio ([CnMIM]), N-alquilpiridinio, tetralquilamonio, o tetraalquilfosfonio (figura II.10). Los aniones más utilizados son el hexafluorofosfato [PF6], tetrafluoroborato [BF4], trifluorometilsulfonato [CF3SO3], bis[(trifluorometil)sulfonil]amida [(CF3SO2)2N]N, trifluoroetanoato [CF3CO2], acetato [CH3CO2], nitrato y haluros [397-399]. NN R 1 + N R 1 + N + R 4 R 1 R 3 R 2 P+ R 4 R 1 R 3 R 2 1-alquil-3-metilimidazolio N-alquilpiridinio Tetraalquilamonio Tetraalquilfosfonio (R1,2,3,4, alquil) Figura II.10 Cationes de algunos de los líquidos iónicos más estudiados. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 58 Las propiedades fisicoquímicas de los ILs dependen de la naturaleza y tamaño del catión y del anión [400,401]. Por ello, debido a que la única combinación de cationes y aniones influye en las propiedades de los ILs, a estos disolventes se les ha denominado disolventes diseñados [402]. La tabla II.11 muestra algunas propiedades físicas de los ILs más utilizados en Química Analítica. Tabla II.11 Propiedades físicas de los ILs más utilizados en Química Analítica [403]. ILs Punto fusión (ºC) Densidad (g mL-1) Viscosidad (mPa s) Solubilidad en agua (g/100 mL) Conductividad (S cm-1) [C4MIM][PF6] 10, -8 1.36-1.37 (25ºC) 148-450 (25ºC) 1.88 0.14 (25ºC) [C6MIM][PF6] -61 1.29-1.31 (25ºC) 560-586 (25ºC) 0.75 [C8MIM][PF6] 22 1.20-1.23(25ºC) 682-710 (25ºC) 0.20 [CMIM][(CF3SO2)2N] -3 1.56 44 (20ºC) 0.84 (20ºC) [C2MIM][(CF3SO2)2N] -4 1.50 34 (20ºC) 1.77 0.88 (20ºC) [C4MIM][(CF3SO2)2N] 1.42 52 (20ºC) 0.80 0.39 (20ºC) [C6MIM][(CF3SO2)2N] 1.33 0.34 [C8MIM][(CF3SO2)2N] 1.31 0.21 [C4MIM][Cl] 65.41 1.10 (25ºC) Sólido Miscible Sólido [C2MIM][BF4] 15 1.28 (25ºC) 37 (25ºC) Miscible [C4MIM][BF4] -81 1.21 (25ºC) 180 (25ºC) Miscible 0.17 (25ºC) [C6MIM][BF4] 314 (20ºC) Miscible [C4MIM][CF3SO3] 16 1.29 (20ºC) 90 (20ºC) Miscible 0.37 (20ºC) Sus aplicaciones en Química Analítica, especialmente en la separación de analitos, son importantes debido a que poseen propiedades únicas tales como buena estabilidad térmica y oxidativa, conductividad iónica intrínseca, una amplia ventana de potenciales electroquímicos, excelentes propiedades de transferencia de calor, eficiente absorción y transmisión de microondas, viscosidad y densidad variables, miscibilidad selectiva con agua o disolventes orgánicos, síntesis económica, así como buena extractabilidad para compuestos orgánicos e iones metálicos. Sin embargo, las propiedades que los ha hecho más conocidos son su baja presión de vapor e inflamabilidad, incluso a elevadas temperaturas. Debido a estas últimas propiedades los ILs producen una cantidad mínima de compuestos orgánicos volátiles, el potencial inflamable se ve minimizado y pueden ser recuperados y reciclados, hecho que les ha proporcionado un papel importante dentro de la química verde debido a su carácter beneficioso para el medio ambiente [404,405]. II. INTRODUCCIÓN 59 Los ILs aparecen en la década de los noventa, principalmente para ser utilizados como medio de reacción y así reemplazar a los disolventes orgánicos convencionales [402,406]. Una década después han sido incorporados a muchas otras áreas y, recientemente, han captado el interés y la imaginación de la comunidad analítica. Así, en los últimos años han sido una pieza importante de las innovaciones en separaciones analíticas, espectrometría de masas, electroquímica, espectroscopía y química de sensores [399,401,403]. El número de publicaciones centradas en el uso de la microextracción líquido-líquido dispersiva con ILs (IL-DLLME) es aún muy reducido, y hay que destacar que hasta el momento de realización del trabajo recogido en esta memoria, no existía ningún método, donde se utilizaran IL-DLLME para la extracción de PAHs de aguas medioambientales. Las metodologías publicadas se centran en la determinación de pesticidas piretroides [407], aminas aromáticas [341], insecticidas heterocíclicos [360] y fenoles [408] en muestras acuosas. También se han descrito algunas aplicaciones de IL-DLLME para la extracción de drogas antiinflamatorias no esteroides en orina [373], pesticidas en frutas (tras una etapa previa de extracción mediante ultrasonidos) [378], así como la extracción de algunos lantanoides en polvo de dióxido de uranio [409]. Dentro de las aplicaciones de IL-DLLME, nos encontramos con que no existe un procedimiento estandarizado para la realización de la extracción. Algunos trabajos se basan en los principios básicos de DLLME y utilizan el IL en combinación con un disolvente dispersante, mientras que algunas aplicaciones se basan en un sistema binario de disolventes. La extracción de insecticidas heterocíclicos se lleva a cabo inyectando una mezcla de 0.052 g de [C6MIM][PF6] y 0.5 mL de metanol en la muestra acuosa [360]. Sin embargo, el método descrito para la extracción de aminas aromáticas [341] consiste en la mezcla directa del IL con la muestra acuosa. Generalmente, las metodologías en las que se prescinde de disolvente dispersante, requieren de algún procedimiento de mezcla del IL con la muestra acuosa. Se han descrito aplicaciones en los que se sigue el protocolo habitual de DLLME, seguido de agitación de la mezcla y centrifugación para la obtención de la fase sedimentada [341]. En otros casos, se procede de igual forma pero con control 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 60 de temperatura [407]. El IL se añade sobre la muestra y esta mezcla se mantiene a alta temperatura para favorecer la miscibilidad de las fases. Después se enfría en baño de hielo, para disminuir la solubilidad del extractante, y por último se centrifuga. Exceptuando el método de determinación de lantanoides, donde se utiliza ICP-OES; todas las aplicaciones mencionadas anteriormente utilizan HPLC como técnica de separación. La baja presión de vapor y elevada viscosidad de los ILs, impide su inyección directa en un cromatógrafo de gases, hecho que constituye la principal limitación del uso de ILs como fase extractante. No obstante, hay que destacar que recientemente, Aguilera-Herrador y col. [410-412] han desarrollado una interfase, que ha permitido el acoplamiento directo de la microextracción con gota colgante utilizando IL como fase extractante, con la cromatografía de gases. El dispositivo se coloca en el inyector del cromatógrafo, donde se lleva a cabo la desorción térmica de los analitos del IL y posteriormente se recoge libre de analitos, evitando el contacto con la columna cromatográfica. Por otro lado, Chisvert y col. [413] proponen el uso de un dispositivo basado en tubos de vidrio concéntricos, para llevar a cabo la desorción térmica de los analitos de la gota de IL (utilizada como fase extractante en la microextracción con gota suspendida), hacia el sistema de cromatografía de gases. La gota de IL se coloca dentro de un tubo de vidrio Pyrex (20 mm), y éste a su vez, se introduce en otro tubo de vidrio comercial (187 mm), que se utiliza habitualmente en procesos de desorción térmica, durante la extracción en fase sólida con barras agitadoras. Los extremos del tubo exterior se sellan con lana de vidrio, y el dispositivo completo se coloca en el sistema de termodesorción acoplado al cromatógrafo. De este modo, se evita que el IL entre en contacto con el sistema cromatográfico evitando problemas con el inyector y con la columna cromatográfica. 2.1.2.3. Microextracción en fase líquida con fibra hueca Pedersen-Bjergaard y Rasmussen introdujeron en 1999 la microextracción en fase líquida con fibra hueca (hollow fiber-liquid phase microextraction, HF-LPME) [414], como solución para mejorar la estabilidad de la gota en SDME. II. INTRODUCCIÓN 61 En HF-LPME, la fase extractante se encuentra en el interior de una membrana y no está en contacto directo con la muestra. Una fibra hueca, generalmente de polipropileno poroso, se empapa con un disolvente orgánico, con el fin de inmovilizarlo en los poros, mediante fuerzas capilares. En el interior de la membrana se introduce una fase aceptora, que puede ser el disolvente inmovilizado en los poros de la fibra, o bien una disolución acuosa ácida o alcalina. La fibra se expone a la muestra acuosa y los analitos se extraen a través de la fase orgánica de los poros, y pasan a la disolución aceptora del interior de la membrana. Para favorecer el proceso es habitual el uso de agitación [415,416]. Las fibras más utilizadas para la extracción de PAHs, son fibras de polipropileno, con diámetro interno de 600 µm, espesor de pared de 200 µm y tamaños de poro de 0.2 µm [133,417]. Los disolventes de extracción utilizados son n-hexano [418], tolueno [133] y 1-octanol [417]. En general, la eficiencia de la extracción lograda por HF-LPME es mayor que con SDME directa, ya que la fibra hueca permite el uso de velocidades de agitación mayores, que aceleran la cinética de la extracción. Además, el uso de la fibra hueca permite el análisis de muestras sucias. El pequeño tamaño de poro de la fibra permite la microfiltración de las muestras, produciendo así extractos muy limpios. En consecuencia, HF-LPME permite la extracción y preconcentración de analitos de muestras complejas de un modo simple y económico. 2.1.2.4. Extracción con disolventes asistida por membranas Los principios básicos de la extracción con disolventes asistida por membranas (membrane‐assisted solvent extraction, MASE), son similares a los de HF-LPME. Las principales diferencias se encuentran en el tipo de membrana utilizada y en el volúmen de disolvente, ya que en MASE se utilizan membranas hidrofóbicas no porosas, como el polietileno de baja densidad o el polipropileno de alta densidad, y mayores volúmenes de disolvente (hasta 1 mL). Los analitos orgánicos presentes en la muestra acuosa, difunden a través de la membrana y se concentran en el pequeño volúmen de disolvente orgánico [419-421]. Las ventajas de utilizar una membrana entre las dos fases es que se previene la formación de emulsiones, al mismo tiempo que excluye los compuestos macromoleculares y las partículas presentes en la muestra. Esto hace que la técnica 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 62 sea especialmente adecuada para muestras complejas con alto contenido en materia orgánica [419,422]. MASE es una técnica simple y con bajo consumo de disolvente y posibilidad de automatización y acoplamiento en línea con los instrumentos analíticos. Además, las membranas son lo suficientemente rígidas y estables para permitir la agitación de la muestra a gran velocidad [422,423]. La mayor desventaja de la técnica, es que no es apropiada para la extracción de analitos altamente hidrofílicos, muy solubles en la muestra acuosa, y con baja capacidad de difusión a través de la membrana. Esta técnica se ha aplicado para la extracción de PAHs de una gran diversidad de muestras, como agua de río [424], agua de mar [425], zumo [424,426], vino tinto y leche [424]. En la mayoría de las aplicaciones se utiliza una membrana de polipropileno de alta densidad y disolventes como ciclohexano [426], acetato de etilo [424] o mezclas de ambos [425]. 2.1.2.5. Microextracción en fase sólida La microextracción en fase sólida (solid-phase microextraction, SPME) es una técnica de preparación de muestra desarrollada por Belardi y Pawliszyn en 1989 [427]. Se basa en la utilización de una fibra de sílice fundida, recubierta con una fase estacionaria adsorbente de naturaleza polimérica. La fibra se expone a la muestra acuosa a analizar, bien mediante inmersión directa o muestreo en espacio de cabeza. Después de un tiempo de muestreo determinado, la fibra se retrae y la jeringa se retira del vial de muestreo. Inmediatamente después, la jeringa se introduce en el inyector de un instrumento analítico (GC o HPLC), donde los analitos son desorbidos térmicamente o por disolución en la fase móvil, según la técnica utilizada [428-430]. Los parámetros que afectan a la extracción son el recubrimiento polimérico de la fibra (la naturaleza química del analito determina qué tipo de fases deben usarse en la extracción), la temperatura y tiempo de extracción, el efecto salino, pH de la muestra, volúmen de muestra, agitación y derivatización. Se trata de un método portátil y simple, que puede ser automatizado y acoplado con instrumentación analítica. Además, la SPME evita el uso de II. INTRODUCCIÓN 63 disolventes orgánicos, tiene un elevado poder de concentración y no requiere grandes volúmenes de muestra. Las principales desventajas se centran en que los recubrimientos de la fibra son generalmente caros, y para algunas aplicaciones tienen tiempos de vida limitados, y que existe la posibilidad de efecto memoria. Existen numerosas aplicaciones de esta técnica a la extracción de PAHs de muestras acuosas. El recubrimiento de fibra más utilizado es el polidimetilsiloxano (PDMS) [431-433]. No obstante, existen algunas aplicaciones donde se opta por recubrimientos diferentes, como el PDMS/divinilbenceno [434,435], carbowax/divinilbenceno [434,436], poliacrilato [437,438], o recubrimientos basados en polianilina [436], dietoxidifenilsilano o (3-aminopropil)trietoxisilano [439]. 2.1.2.6. Extracción con barras agitadoras La extracción en fase sólida con barras agitadoras (stir bar sorptive extraction, SBSE) fue introducida por primera vez por Baltussen y col. [440] en 1999. En esta técnica se utilizan barras agitadoras (también llamadas twisters), recubiertas con una fase de PDMS, generalmente de 0.3-1 mm de espesor [441]. El proceso de extracción está basado en el equilibrio entre PDMS-agua y se basa en dos etapas, la extracción y la desorción [428,442]. La barra agitadora recubierta de polímero, se pone en contacto con la muestra que contiene los analitos, bien por inmersión directa (figura II.11a) o mediante muestreo en espacio de cabeza (figura II.11b) y se agita bajo condiciones controladas [442]. El tiempo de extracción se controla cinéticamente, y está determinado por el volúmen de muestra, la velocidad de agitación, la temperatura y las dimensiones de la barra agitadora, y debe optimizarse para cada aplicación [429,430,443]. Tras la etapa de extracción, la barra agitadora se retira, y se enjuaga con agua destilada para eliminar sales, azúcares, proteinas u otros componentes de la muestra. Posteriormente se seca con un papel limpio para eliminar el agua, y pasar a la etapa de desorción. La etapa de lavado no origina pérdida de los analitos, ya que están adsorbidos a la fase polimérica [442,444]. Figura II.11 Modos de extracción en SBSE; a) inmersión, b) espacio de cabeza. (a) (b) 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 64 Finalmente se realiza una etapa de desorción térmica o líquida. La mayoría de las aplicaciones de SBSE implican el uso de desorción térmica seguida por GC para recuperar los analitos concentrados en la barra agitadora recubierta. La desorción se realiza a temperaturas entre 150-300ºC y tiempos entre 10-15 min. Este tipo de desorción evita el uso de disolventes orgánicos y permite la introdución completa de los analitos extraídos, en el sistema cromatográfico. La desorción líquida es una alternativa cuando se analizan solutos térmicamente lábiles, cuando las separaciones se llevan a cabo utilizando cromatografía líquida, electroforesis capilar o si no se dispone del dispositivo de desorción térmica en GC. La barra agitadora se introduce en un disolvente o mezcla de disolventes para la desorción química de los analitos extraídos. El volúmen mínimo de disolvente debe garantizar la inmersión completa de la barra recubierta y, obviamente, los disolventes utilizados deben ser compatibles con el polímero. La principal desventaja de esta técnica, es que a nivel comercial sólo se dispone de barras agitadoras Twister® (Gerstel, Mülheim, Alemania), recubiertas de PDMS [430]. La baja polaridad de este polímero origina que estas barras agitadoras no sean adecuadas para la extracción de compuestos polares. Existen numerosas aplicaciones de esta técnica para la extracción de PAHs de muestras de aguas de diferente naturaleza [445-448]. Popp y col. [449] han aplicado la SBSE para la extracción de PAHs de muestras de agua de lluvia, subterráneas y agua residual procedente de una industria química. Una barra agitadora de 10 mm y 50 µL de PDMS se introduce en 10 mL de muestra acuosa. La extracción se realiza durante 60 min con una agitación de 1000 r.p.m. La desorción de los analitos se lleva a cabo en 150 µL de acetonitrilo, aplicando radiación de ultrasonidos durante 10 min. Los extractos resultantes se analizaron mediante HPLC-Flu. Utilizando este método se consiguieron recuperaciones entre 58-111% y límites de detección del orden del bajo ng L-1. La combinación de SBSEHPLC-Flu también se ha aplicado a la determinación de PAHs en aguas de bebida, utilizando barritas de 10 mm y 24 µL de PDMS. En este caso la extracción se lleva a cabo durante 40 min a 60ºC, obteniendo recuperaciones relativas entorno al 100% para todos los compuestos estudiados [125]. Por su parte, Lacorte y col. [450] proponen una metodología de SBSE-GC-MS para la determinación de 48 contaminantes orgánicos persistentes, entre los que se encuentran 16 PAHs, en muestras de hielo del Ártico. El proceso de extracción consiste en introducir una II. INTRODUCCIÓN 65 barrita agitadora de 20 mm de longitud y 10 mm de espesor de fase (126 µL de PDMS) en 100 mL de hielo derretido, y agitarlo durante 24 h a 900 r.p.m. A continuación, la barrita se retira con pinzas, se enjuaga con agua ultrapura y se seca con un papel. Finalmente, se lleva a cabo la desorción térmica y la determinación por GC-MS, obteniendo recuperaciones satisfactorias para todos los analitos estudiados. 2.1.3. OTRAS TÉCNICAS ALTERNATIVAS 2.1.3.1. Extracción por punto nube La extracción por punto nube (cloud point extraction, CPE) está basada en la separación de fases, que ocurre en disoluciones acuosas de surfactantes, cuando se altera la temperatura. En este tipo de extracción, la concentración de surfactante debe exceder un cierto umbral, denominado concentración micelar crítica, a partir de la cual los monómeros de surfactante tienden a agregarse para formar micelas y grandes coloides. La muestra se pone en contacto con el surfactante durante un periodo de tiempo corto. Los analitos se incorporan a los agregados micelares presentes en disolución. A continuación, se modifica la temperatura por debajo o por encima (según sea un surfactante no iónico o zwiteriónico, respectivamente) de su temperatura de punto nube. Esta temperatura se define como aquella a la cual la disolución adquiere una cierta turbidez, y dá lugar a la separación de dos fases, una acuosa, y otra donde se concentra la mayor cantidad de surfactante. Finalmente, se lleva a cabo una etapa de centrifugación, consiguiendo la concentración de los analitos en el pequeño volúmen (50-400 µL) de la fase rica en surfactante [451,452]. Esta técnica se ha utilizado para la extracción de PAHs de agua de consumo [453,454], medioambientales [128,453,455] y aguas residuales [128]. Los surfactantes más comunes son de tipo no iónico [453,456,457], como el Triton X- 114 o el Tergitol 15-S-7, aunque también se encuentran aplicaciones con surfactantes aniónicos [128,454,455] o con base de silicona [458]. El uso de CPE ofrece ventajas como la posibilidad de concentrar PAHs con elevadas recuperaciones y factores de preconcentración, evitar el uso de grandes 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 72 2.2.4.1.2. Mecanismo de extracción con disolventes La extracción asistida por microondas se basa en el uso de energía de microondas para conseguir que los compuestos de interés, pasen de la muestra (generalmente sólida) a un disolvente. El calentamiento por acción de la radiación de microondas, puede ocurrir por tres mecanismos [510], dependiendo de si se utiliza:  Un disolvente o mezcla de disolventes que presenten coeficientes de pérdida dieléctrica altos.  Una mezcla de disolventes con alta y baja polaridad dieléctrica.  La muestra tiene una pérdida dieléctrica alta en un disolvente de pérdida dieléctrica baja. La naturaleza de la muestra y el disolvente, juegan un papel fundamental en el proceso de extracción. En las extracciones realizadas con disolventes o mezcla de disolventes polares, el calentamiento ocurre por rotación de dipolos. Estos disolventes se caracterizan por tener elevados coeficientes de pérdida dieléctrica, lo que origina una temperatura elevada. Las altas temperaturas alcanzadas por el disolvente, aumentan la solubilidad del analito y aceleran la cinética de la desorción. Si la extracción se lleva a cabo con disolventes transparentes a la energía de microondas (coeficiente de pérdida dieléctrica bajo), que actúan únicamente como medio solubilizador de los analitos, las muestras suelen ser materiales biológicos o ambientales, caracterizados por un elevado contenido en agua libre dispersada en su estructura. El agua presente en los tejidos provoca un sobrecalentamiento en determinados puntos de la matriz y extrae los analitos solubilizándolos [462]. Instrumentación Las primeras aplicaciones de MAE se llevaron a cabo utilizando hornos microondas domésticos. Sin embargo, la aplicación de energía microondas a disolventes orgánicos inflamables constituye un serio riesgo, que ha derivado en el desarrollo de equipos adecuados para este tipo de aplicaciones. II. INTRODUCCIÓN 73 Los extractores utilizados para la extracción con microondas pueden clasificarse en dos grandes grupos. Por un lado nos encontramos con sistemas multimodo, en los que la radiación de microondas se dispersa en una cavidad en la que se encuentra la muestra, y por otro, sistemas de enfoque, en los que la energía incide sólo sobre la zona en la que se sitúa la muestra, sometida a un campo electromagnético más intenso que en el caso previo. Los sistemas multimodo, utilizan vasos cerrados, donde el disolvente puede calentarse por encima de su punto de ebullición, mejorando la velocidad de extracción y la eficiencia. Además, este sistema consta de varios vasos de extracción, que permiten procesar varias muestras simultáneamente, y ofrece la posibilidad de controlar la temperatura durante el proceso. Los sistemas de enfoque, trabajan a presión atmosférica en una celda abierta, y como consecuencia, la temperatura máxima está determinada por el punto de ebullición del disolvente. Lleva un sistema de reflujo en el vaso abierto, sometido a radiación continua cuya potencia puede ser modulada fijando el porcentaje de potencia durante la extracción. Estos sistemas utilizan un sistema de enfoque de la radiación de microondas, por lo que el calentamiento de las muestras es homogéneo y muy eficiente [508-510]. 2.2.4.2. Variables que afectan al proceso de extracción La naturaleza y volúmen de disolvente, la temperatura, el tiempo de extracción y la naturaleza de la matriz, son las principales variables a tener en cuenta a la hora de desarrollar un método de MAE [508-510]. En muchas de las aplicaciones, se opta por diseños experimentales factoriales o central compuestos, para encontrar las condiciones más favorables. En otros casos, se opta por la optimización clásica mediante prueba y error. La correcta elección del disolvente es fundamental para obtener un proceso de extracción óptimo. La selección del disolvente debe realizarse en base a tres premisas fundamentales. En primer lugar, hay que tener en cuenta las propiedades de los disolventes frente a las microondas. En el apartado anterior (2.2.4.1.1) ya se ha comentado que la absorción de microondas es proporcional a Figura II.12 Horno microondas multimodo 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 74 la constante dieléctrica del disolvente (ε’), y la conversión de esta energía en calor depende del factor de pérdida dieléctrica (ε’’). Por lo tanto, la eficiencia del calentamiento se expresa mediante el factor de disipación (tan δ). En la práctica, generalmente se considera que la absorción es proporcional a la polaridad del disolvente. Las moléculas polares y las disoluciones iónicas absorberán fuertemente energía de microondas, ya que presentan un momento dipolar permanente. Sin embargo, disolventes no polares, como hexano, no se calentarán cuando se expongan a microondas. En la tabla II.12, se recogen algunos parámetros físicos, incluyendo las constantes dieléctricas y los factores de disipación de algunos de los disolventes más comunes, utilizados en MAE. Tabla II.12 Permitividad dieléctrica y factores de disipación para algunos de los disolventes utizados en MAE (3 GHz, 25 ºC) [511]. Disolvente ε’ ε’’ tan δ x104 Acetato de etilo 6.02 3.2 5312 Acetona 21.1 11.5 5555 Acetonitrilo 37.5 2.3 620 Agua 76.7 12.0419 15700 Etanol 24.3 1.625 2500 Heptano 1.9 1.9 x10-4 1 Metanol 23.9 15.296 6400 NaCl (ac.) 0.1 M 75.5 18.12 2400 Tetracloruro de carbono 2.2 8.8x10-4 4 El segundo aspecto a tener en cuenta, es la interacción del disolvente con la matriz. Es importante que el disolvente presente la capacidad de penetrar en los poros de la matriz, a la hora de conseguir extracciones cuantitativas. Finalmente, un tercer aspecto a considerar, es la solubilidad de los analitos en el disolvente. El disolvente debería presentar alta selectividad, por los analitos de interés excluyendo las sustancias indeseadas de los componentes de la matriz. En cuanto al volúmen de disolvente, éste debe ser el suficiente para asegurar que toda la muestra esté inmersa en el mismo. Generalmente varía entre 10 y 30 mL, pero depende en gran medida del tipo y tamaño de muestra [510]. La temperatura es el parámetro más investigado en MAE, puesto que es un factor que afecta de manera importante a la eficiencia de la extracción. Cuando MAE se lleva a cabo en vasos cerrados, pueden utilizarse temperaturas superiores al punto de ebullición del disolvente. Estas elevadas temperaturas mejoran la eficiencia de extracción, ya que favorece la desorción de los analitos de los sitios II. INTRODUCCIÓN 75 activos de la matriz. Además, los disolventes incrementan su capacidad para solubilizar los analitos, al mismo tiempo que disminuye la tensión superficial y la viscosidad, favoreciendo la penetración del disolvente en la matriz. El tiempo de extracción generalmente presenta un efecto positivo en la extracción. Sin embargo, esto no se traduce en tiempos de extracción infinitamente largos, ya que a partir de cierto momento este parámetro deja de afectar al sistema. En el caso de compuestos termolábiles, tiempos de extracción prolongados favorecen la degradación. Finalmente, destacar que la naturaleza de la matriz y el contenido en humedad de la misma, también influyen en el sistema de extracción. Las moléculas de agua presentan un momento dipolar elevado, y absorben energía de microondas, favoreciendo el calentamiento de la muestra. Es importante controlar el contenido de humedad para obtener resultados reproducibles. Por otro lado, la naturaleza de la muestra es determinante a la hora de obtener extracciones más o menos selectivas. 2.2.4.3. Aplicaciones de MAE El interés de la extracción asistida por microondas se ha incrementado en los últimos años, y muchos laboratorios han estudiado las posibilidades analíticas de esta nueva técnica, aplicada a la extracción de compuestos orgánicos. Las aplicaciones de la extracción asistida por microondas se han centrado fundamentalmente en matrices sólidas de diversa naturaleza, tales como alimentos, materiales biológicos, suelos, sedimentos, partículas atmosféricas, etc. En estas matrices se han extraído grasas, vitaminas, productos naturales, contaminantes como pesticidas, fenoles, PAHs, PCBs, compuestos organometálicos, etc. También se ha utilizado la energía de microondas para la extracción de diferentes compuestos en muestras líquidas, como agua, vinos, leche, etc [462,494,509,510,512-515]. Teniendo en cuenta la enorme cantidad de aplicaciones existentes, en este apartado, nos centraremos en las metodologías desarrolladas para la extracción de PAHs en muestras sólidas (tabla II.13). 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 76 En 1994, López-Avila y col. [516] presentaron la primera publicación en la que se aplica MAE, para la extracción de varios tipos de contaminantes orgánicos persistentes (PAHs, fenoles y pesticidas organoclorados) en suelos. La extracción se realiza con hexano-acetona (1:1) y se estudian las recuperaciones a diferentes temperaturas y tiempos. En este estudio se demuestra que las recuperaciones de los PAHs incrementan de 70 a 75% cuando se incrementa la temperatura de 80 a 115 ºC. Sin embargo, un incremento de la temperatura a 145 ºC no mejora la eficiencia de la extracción. Además se demostró que 5 o 10 min son suficientes, para la extracción de la mayoría de los compuestos investigados. Pastor y col. [517] proponen un método donde se utiliza una mezcla de tolueno-agua (10:1) para la extracción de PAHs, DDTs y PCBs en sedimentos, pero según sus datos, las diferencias en las recuperaciones, cuando se utiliza este disolvente son muy pequeñas si se comparan con las obtenidas mediante hexanoacetona (1:1, v/v). Por su parte Pino y col. [518] optan por un medio micelar (0.02 M de polioxietileno 10 lauril éter) para la extracción de PAHs en sedimentos marinos, que parece ser una alternativa viable ya que permite la extracción selectiva de los analitos de interés. II. INTRODUCCIÓN 77 Tabla II.13 Aplicaciones de MAE para la extracción de PAHs de diferentes matrices sólidas. Matriz Muestra (g) Disolvente Tª (ºC) text (min) R (%) Ref. Aceite 1 35 mL KOH (MeOH) 1.5 M 130 10 84-103 [519] Carne ahumada 2 20 mL Hex 115 15 77-103 [520] Carne ahumada 0.4 20 mL Hex 120 20 75-103 [521] Galletas 5 10 mL Hex-Ace (1:1) --- 9 86-110 [522] Hojas de picea 5 50 mL Hex-Ace (3:2) 140 20 92-171 [523] Hojas de pino --- 90 mL Hex-DCM (1:1) --- 30 70-130 [524] Lodo 1 30 mL Hex-Ace (1:1) --- 10 56-75 [525] Lodo 1 60 mL Ace-Tol (1:1) --- 20 58-89 [470] Lodo 0.5 20 mL Hex-Ace (1:1) --- 2 69-110 [526] Lombrices 1 20 mL iPrOH-Ciclohex (1:1) 115 10 65-110 [527] Madera 4 30 mL AcN 120 15 91-109 [528] Mejillón 0.5 30 mL Hex-Ace (1:1) 130 20 --- [529] Partic. atm 0.01-0.05 20 mL Ace 80 10 --- [530] Partic. atm --- 30 mL AcN 110 20 62-112 [531] Partic. atm --- 20 mL Hex-Ace (1:1) --- 20 79-122 [532] Partic. atm --- 20 mL Ace-Tol (5:95) --- 20 77-116 [533] Pescado ahumado 0.4 20 mL Hex 120 20 78-108 [521] Polen 5 50 mL Hex-Ace (3:2) 140 20 119-192 [523] Sedimento 30 mL Hex-Ace (1:1) 115 5 75-137 [534] Sedimento 2 10 mL Tol-H2O (10:1) --- 6 97-107 [517] Sedimento 0.25 20 mL Ace-Ciclohex (2:3) 80 15 97 [535] Sedimento 1 15 mL Ace --- 15 --- [536] Sedimento 5 30 mL KOH (MeOH) 1M 150 30 36-118 [537] Sedimento 5 30 mL DCM-Ace Et (1:1) 150 30 51-84 [538] Sedimento marino 6 30 mL Hex-Ace (1:1) 120 15 52-164 [539] Sedimento marino 1.5 15 mL Hex-Ace (1:1) --- 6 92-105 [540] Sedimento marino 1 25 mL Hex-Ace (1:1) 110 10 47-102 [541] Sedimento marino 0.8 10 mL POLE 0.02 M --- 5 86-101 [518] Suelo 0.1-1 30 mL DCM --- 10 85-106 [542] Suelo 5 30 mL Ace 115 15 80-100 [543] Suelo 0.1-1 3 mL AcN --- 10 98-99 [544] Suelo 5 30 mL Hex-Ace (1:1) 115 10 65-115 [516] Suelo 3-6 22 mL NMP 130 60 117 [545] Suelo 2 40 mL Ace 120 20 75-105 [546] Suelo 1 20 mL Hex-Ace (1:1) --- 10 78-130 [547] Suelo 5 25 mL Hex-Ace (1:1) 110 10 61-126 [474] Suelo 1 10 mg fibra grafito 50 20 --- [548] Suelo 5 30 mL Hex-Ace (1:1) 115 10 47-111 [549] text, tiempo de extracción; R, recuperaciones; Part. atm, partículas atmosféricas; KOH (MeOH), disolución de hidróxido potásico en metanol; Hex, n-hexano; Hex-Ace, n-hexano-acetona; Hex-DCM, n-hexano-diclorometano; Ace-Tol, acetonatolueno; iPrOH-Ciclohex, 2-propanol-ciclohexano; AcN, acetonitrilo; Ace, acetona; Tol-H2O, tolueno-agua; Ace-Ciclohex, acetona-ciclohexano; DCM-Ace Et, diclorometano-acetato de etilo; POLE, polioxietileno 10 lauril éter; DCM, diclorometano; NMP, N-metil-2-pirrilodina; --- información no disponible en la publicación. Las mezclas de disolventes están referidas a v/v. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 78 Por su parte, Xu y col. [548] han desarrollado una metodología basada en el uso de un adsorbente sólido como medio extractante. Por primera vez, utilizan fibra de grafito para llevar a cabo la extracción de PAHs de muestras de suelo. Se introduce la muestra de suelo en el vaso de extracción, se añaden 10 mL de agua, y la fibra de carbono. La extracción tiene lugar a 50 ºC durante 20 min. Tras la etapa de extracción, se retira la fibra de carbono y se enjuaga con agua ultrapura. La desorción de los analitos se realiza con 150 µL de acetonitrilo, en un baño de ultrasonidos durante 5 min. Cuando se combina con MAE, este material muestra excelente capacidad de extracción para los PAHs. Los tiempos de extracción más habituales se encuentran entre 5-30 min, por lo que se trata de una técnica relativamente rápida, con un consumo moderado de disolventes. Por otro lado, gran parte de las aplicaciones desarrolladas, utilizan la extracción Soxhlet como método de referencia, y en la mayoría de ellas se demuestra que MAE proporciona recuperaciones del mismo orden, o incluso superiores. El gran inconveniente de esta técnica, es que generalmente, tras la etapa de extracción, se requiere de una etapa de centrifugación y de una o varias etapas de purificación de los extractos resultantes. 2.2.5. EXTRACCIÓN CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS La extracción con líquidos presurizados (pressurized liquid extraction, PLE), también conocida como extracción con fluidos presurizados (PFE), o por el nombre comercial, extracción acelerada por disolventes (ASE TM, Dionex, Sunnyvales, CA, USA), es una técnica de preparación de muestra, que combina la extracción con disolventes a temperaturas (50-200 ºC) y presiones elevadas (10-20 MPa). El uso simultáneo de presiones y temperaturas elevadas, conduce a procesos de extracción más rápidos que los procedimientos clásicos, utilizando volúmenes inferiores de disolventes. Se trata además, de una técnica altamente automatizada, por lo que es especialmente útil a la hora de realizar análisis de rutina [550,551]. II. INTRODUCCIÓN 79 2.2.5.1. Principios de la técnica 2.2.5.1.1. Consideraciones físico-químicas La utilización de disolventes líquidos a temperaturas y presiones elevadas mejora el rendimiento de las extracciones, frente a las realizadas a temperatura y presión atmosféricas, debido fundamentalmente a los efectos en la solubilidad y la transferencia de masa y la ruptura del equilibrio superficial [462,550,551]. 1. Efectos sobre la solubilidad y la transferencia de masa  El uso de elevadas temperaturas incrementa la capacidad de los disolventes para solubilizar los analitos de interés.  El incremento de la temperatura produce un incremento en las velocidades de difusión.  Si durante la etapa de extracción estática se introduce disolvente fresco, se favorece la transferencia de masa, incrementando la velocidad de extracción. 2. Ruptura del equilibrio superficial  Efecto de la temperatura: Un incremento de la temperatura favorece la ruptura de las fuertes interacciones soluto-matriz, originadas por enlaces de Van der Waals, enlaces de hidrógeno, e interacciones dipolares entre las moléculas de soluto y los sitios activos de la matriz. Además, temperaturas elevadas pueden disminuir la viscosidad de los disolventes, permitiendo una mejor penetración del mismo en las partículas de la matriz y, por tanto, mejorando la extracción. Una disminución de la tensión superficial del disolvente permitirá que los analitos se disuelvan más fácilmente en el disolvente de extracción.  Efecto de la presión: Si durante las extracciones se ejerce una presión suficiente sobre el disolvente, pueden utilizarse temperaturas superiores al punto de ebullición de los mismos, manteniendo en todo momento el disolvente en estado líquido. Por otro lado, el uso de presiones elevadas facilita la extracción de la muestra cuando los analitos permanecen 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 80 atrapados en los poros de la matriz. La presión fuerza al disolvente a entrar en contacto con áreas de la matriz que no serían accesibles cuando se utilizan condiciones atmosféricas. El uso de elevadas presiones forzará al disolvente a entrar en contacto con los analitos de los poros de la matriz. Por otro lado, los flujos presurizados también ayudan a la solubilización de burbujas de aire, de manera que el disolvente pueda entrar en contacto más rápidamente con la matriz de la muestra. La desorción de los analitos de las muestras sólidas puede describirse por los procedimientos representados en la figura II.13 [551]. Se pueden diferenciar tres procesos diferentes, que controlan el transporte de los analitos desde la matriz hasta el seno del disolvente durante la extracción: desorción desde una partícula sólida, difusión a través del disolvente localizado en el interior del poro de la partícula, y transferencia hacia el seno del flujo de disolvente (solubilización). 2.2.5.1.2. Mecanismo de extracción con disolventes Un procedimiento típico de PLE consta de una serie de etapas, que se describen a continuación. La preparación de muestra es una etapa esencial en todos los procedimientos de extracción con disolventes [551-553]. Mientras muchos tipos de muestras, pueden extraerse sin ningún pretratamiento, otras requieren de alguna manipulación para que tenga lugar una extracción eficiente. La difusión de los analitos de la muestra hacia el disolvente, puede incrementarse notablemente con la reducción del tamaño de partícula, y evitándo la agregación de las partículas de la muestra. Por ello, el proceso de PLE a menudo requiere de dispersión de la muestra con un material inerte como arena o tierra de diatomea. El secado de la muestra también es importante, especialmente, cuando se lleva a cabo la extracción de analitos apolares, utilizando disolventes apolares. Generalmente, agentes desecantes, como celulosa, sulfato sódico anhidro o tierra de diatomea, B-C: Difusión C-D: Solubilización A-B: Desorción Figura II.13 Representación de los procesos que tienen lugar durante la extracción. II. INTRODUCCIÓN 81 son empleados con este propósito. Otras alternativas son secado mediante hornos de vacío o liofilización, aunque estos no se recomiendan en el caso de extracción de compuestos volátiles. El uso de mezclas de disolventes polares y no polares (hexano-acetona, hexano-acetonitrilo, etc) pueden resultar adecuados para la extracción de muestras húmedas, haciéndo que la etapa de secado no sea crucial. Una vez que la muestra ha sido sometida a los pretratamientos oportunos, ésta se transfiere a la celda de extracción. Para evitar la obturación del sistema, es habitual colocar filtros de celulosa o de fibra de vidrio en los extremos de la celda. También es recomendable rellenar la celda con matrices inertes (arena, tierra de diatomea, etc.) para reducir el volúmen muerto. La celda se coloca en el sistema de PLE y posteriormente se carga en el horno. Se puede operar en dos modos diferentes, precalentamiento (preheat) o prellenado (prefill). En el modo de precalentamiento, el horno se calienta hasta la temperatura apropiada y, a continuación, la celda se carga en el horno. Después del tiempo necesario, el disolvente se introduce en la celda y comienza el proceso de extracción. En el modo de prellenado, la celda se llena con el disolvente, y posteriomente se carga en el horno. El modo de prellenado es recomendable para la extracción de compuestos termolábiles. El proceso de extracción puede realizarse en modo estático o en modo dinámico. En la extracción estática, la celda se introduce en el horno a la temperatura de extracción, se rellena con disolvente y se presuriza. Tras un cierto intervalo de tiempo (tiempo de equilibración), alcanza la temperatura deseada y se mantiene esa temperatura durante un tiempo controlado (tiempo de extracción estática). Se pueden efectuar uno o varios ciclos de extracción estática. A continuación, se abre la válvula estática y se recoge el disolvente en el vial de extracción. Posteriormente, la celda y los tubos conectores se enjuagan con un volúmen de disolvente fresco (flush volume), que viene expresado como tanto por ciento del volúmen de celda. Finalmente, todo el sistema se purga con nitrógeno Preparación de muestra y llenado de celda Figura II. 14 Etapas de un procedimiento de PLE. Colocación de la celda en el sistema de PLE Carga de la celda en el horno Llenado de la celda con disolvente Calentamiento y presurización de la celda Extracción estática/dinámica Transferencia del extracto al vial colector e introducción de nuevo disolvente Purga de la celda con nitrógeno presurizado Descarga de la celda 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 88 etapas de limpieza de los extractos antes de su análisis [551]. No obstante, esta última limitación es cada vez menos acusada, ya que en las últimas aplicaciones desarrolladas, se ha optado por introducir sólidos adsorbentes en la celda, consiguiendo extracciones cada vez más selectivas. 2.2.6. DISPERSIÓN DE LA MATRIZ EN FASE SÓLIDA En 1989, Barker y col. [587] introducen un nuevo procedimiento de preparación de muestra, mediante el cual se consigue la disrupción de la muestra y extracción de analitos de matrices sólidas o semisólidas, de manera simultánea. La dispersión de la matriz en fase sólida (matrix solid-phase dispersion, MSPD), combina aspectos de varias técnicas, para la disrupción de la muestra, y al mismo tiempo, genera un material que posee un carácter cromatográfico único, para la separación de los analitos de interés de una muestra dada. La MSPD ofrece además, la posibilidad de realizar un fraccionamiento completo de los componentes de la matríz, así como la capacidad de eluir selectivamente un único compuesto o varias clases de compuestos, de una misma muestra. La posibilidad de llevar a cabo la extracción y limpieza en una única etapa, conduce a una reducción del tiempo de análisis y del consumo de disolventes. 2.2.6.1. Principios de la técnica Originalmente, la MSPD implicaba la mezcla de una muestra sólida o semisólida, con un soporte sólido de sílice, previamente derivatizado para producir en su superficie una fase orgánica enlazada (p. ej. C18). Este soporte actúa como agente abrasivo, provocando la ruptura mecánica de la estructura de la matriz y consiguiendo su distribución sobre las partículas de adsorbente. Además, la presencia de una fase orgánica enlazada en el soporte sólido, proporciona una dimensión adicional al proceso, puesto que los componentes de la muestra se disuelven y dispersan en su superficie. Así, a través de las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas de los diferentes componentes de la muestra sobre la superficie de la fase enlazada, se produce una fase con características únicas, que permiten llevar a cabo la extracción del analito de interés [587,588,589]. En los últimos años, muchas aplicaciones de esta técnica han optado por la dispersión de la muestra con silicatos sin derivatizar (gel de sílice, arena, etc.) II. INTRODUCCIÓN 89 [590-592] u otros sólidos inorgánicos (Florisil, alúmina, etc) [178,593-598] que también provocan la disrupción de la muestra, pero que no poseen, aparentemente, las mismas propiedades dispersivas que el C18. 2.2.6.1.1. Etapas de la MSPD El proceso de MSPD consta de las siguientes etapas (figura II.17) [599,600]: 1] Una muestra líquida, viscosa, semisólida o sólida se transfiere a un mortero de vidrio o ágata, y se mezcla con un agente dispersante con ayuda de la mano del mortero, hasta conseguir la completa disrupción y dispersión de la misma. Normalmente la relación muestra/adsorbente varía entre 1:1 y 1:4. 2] La mezcla se empaqueta en una columna que, o bien se encuentra vacía, o contiene una o varias capas de adsorbentes, si el procedimiento incluye una etapa de limpieza, simultánea a la extracción. La columna es normalmente el cuerpo de una jeringa o un cartucho de extracción en fase sólida con una frita de acero inoxidable o polipropileno, un filtro de celulosa o un tapón de lana de vidrio en su parte inferior. También se coloca una segunda frita o tapón sobre la mezcla para llevar a cabo la compresión de la misma. La introducción de la mezcla en la columna de separación sigue los principios de la cromatografía de adsorción convencional, por lo que deben evitarse la formación de canales en la columna, y el material no debe estar demasiado compactado, para permitir el flujo de disolvente a través del sistema. 3] La elución de los analitos de interés se lleva a cabo con un disolvente orgánico adecuado, mientras que las interferencias de la matriz son selectivamente retenidas en la columna. Otra posibilidad, es la elución de los compuestos interferentes en una etapa de lavado, mientras que los analitos de interés permanecen retenidos en la columna. A continuación, se cambia el disolvente de elución y se extraen los analitos. Puesto que la totalidad de la muestra está presente en la columna, también es posible llevar a cabo eluciones múltiples o secuenciales de dicha muestra. De esta forma, se pueden aislar diferentes grupos de compuestos presentes en una misma muestra. La mayoría de las eluciones se lleva a cabo por gravedad, aunque en algunos casos, se aplica un poco de presión para controlar el flujo del disolvente de elución. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 90 Los extractos resultantes se pueden analizar directamente, o ser sometidos a etapas de limpieza adicionales. Mortero Agente dispersante Muestra Mano de mortero Muestra/agente dispersante Espátula Cuerpo de jeringa empleado como columna MSPD Columna empaquetada Frita Disolvente Elución de la muestra a gravedad o aplicando vacío Eluato ANÁLISIS 1] DISRUPCIÓN Y DISPERSIÓN 2] EMPAQUETADO DE COLUMNA 3] ELUCIÓN Muestra Cocolumna (opcional)  Figura II.17 Representación esquemática del proceso de MSPD. 2.2.6.2. Variables que afectan al proceso de extracción La selectividad del proceso de MPSD depende de la combinación de adsorbente y disolvente utilizados [588,599-601]. Las aplicaciones clásicas de MSPD utilizan adsorbentes de fase reversa como dispersantes. C18 es el adsorbente más utilizado, aunque también se han utilizado materiales como C8 y C30. En algunas aplicaciones, el C18 es sustituido por aminopropil, puesto que el carácter de intercambiador aniónico de los materiales amino parece mejorar la selectividad, II. INTRODUCCIÓN 91 cuando se utiliza para la extracción de muestras grasas complejas. Adsorbentes no enlazados de fase normal, como Florisil, alúmina y sílice, también han sido empleados como dispersantes en diversas metodologías de MSPD. Estos adsorbentes interaccionan con los componentes de la muestra sólo por adsorción y, obviamente, no disuelven la matriz de la muestra. Las propiedades de adsorción de estos adsorbentes pueden ser ajustadas, dependiendo de su contenido en agua o su carácter ácido o básico. Otra tendencia es utilizar materiales inertes como arena, tierra de diatomea, o celita en el proceso de MSPD. Se trata de alternativas de menor coste, pero con una selectividad limitada, ya que está controlada por la solubilidad de los componentes de la matriz en el disolvente de elución. Más recientemente se han desarrollado algunas aplicaciones con dispersantes menos convencionales como fibras de carbono activado o polímeros de impresión molecular. La elección del disolvente de elución, se lleva a cabo normalmente, en función de la polaridad de los analitos. Si se trata de analitos de baja polaridad, normalmente se utilizan disolventes apolares, como hexano, diclorometano, o mezclas de ambos; mientras que la elución de compuestos de polaridad elevada suele realizarse utilizando disolventes como acetonitrilo, acetona, acetato de etilo, agua o metanol. El volúmen de disolvente, es función de la aplicación puesto que depende en gran medida de la cantidad de muestra y adsorbente utilizados. La naturaleza de la matriz también afecta al proceso de extracción [588,599]. De hecho, en algunos casos es necesario alterar el estado de ionización de los componentes de la muestra, para asegurar la existencia de interacciones con la fase enlazada del soporte sólido y/o el disolvente de elución. Así, varios estudios han demostrado que la adición de agentes quelatantes, ácidos, bases, antioxidantes, etc. a la muestra durante la etapa de mezcla, afecta a la dispersión y elución de los analitos de la muestra. Otro parámetro que afecta a la selectividad del proceso, es la introducción de una etapa de limpieza en el sistema. En algunos casos, la elección de un agente dispersante y un disolvente adecuados, no es suficiente para conseguir extractos directamente analizables. Una alternativa utilizada habitualmente, es incluir una o varias capas de adsorbentes (co-columna), en la parte inferior del cartucho de MSPD, debajo de la muestra dispersada. Materiales como Florisil, sílice ácida, alúmina o carbono, han sido utilizados con esta finalidad. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 92 2.2.6.3. Aplicaciones de MSPD En los últimos años, se han incrementado de manera notable el número de aplicaciones de MSPD. El interés que ha despertado esta metodología, puede atribuirse en gran parte, a las ventajas asociadas a la técnica. Su versatilidad, y la posibilidad de realizar la extracción y limpieza en una sóla etapa, son los principales atractivos del método, ya que conducen a una reducción del tiempo dedicado a la preparación de la muestra, y permiten reducir el consumo de disolventes. La MSPD se ha aplicado a la extracción de una gran variedad de contaminantes de matrices alimentarias [602-604], biológicas [588,605,606] y medioambientales [600,601] (tabla II.15). No existen demasiadas aplicaciones de esta técnica para la extracción de PAHs. Crouch y Barker [605] proponen un método para la determinación de benzo[a]pireno en músculo de pescado, basado en MSPD y HPLC con detección de fluorescencia y UV. 0.5 g de pescado se mezclan con 2 g de C18. La mezcla se transfiere a una columna que contiene 2 g de Florisil y la elución se lleva a cabo con acetonitrilo, consiguiendo recuperaciones entre 74-112%. Loveland y col. [607] desarrollaron un método para aislar y determinar dibenzo[a,l]pireno en piensos de la trucha arco iris. La muestra se dispersa con C18 y la elución se lleva a cabo con hexano-benceno (4:1, v/v). Las recuperaciones de dibenzo[a,l]pireno oscilaron entre 101-107% con coeficientes de variación entre 1-7%. Por otra parte, Albero y col. [608] publicaron un método multiresiduo, para la determinación de PAHs en miel. El tratamiento de la muestra está basado en MSPD con algunas modificaciones. 1.5 g de miel se colocan en un tubo de vidrio y se mezclan con 1.5 mL de metanol, utilizando un vortex para la completa disolución de la muestra. 2 mL de la disolución se transfieren a una columna que contiene 2.5 g de Florisil y 1 g de sulfato sódico anhidro. La muestra de miel, se dispersa a través de la columna, con ayuda del metanol. La extracción de los analitos se lleva a cabo utilizando 5 mL de hexano-acetato de etilo (9:1, v/v), mediante un proceso asistido por ultrasonidos (2x15min). Los PAHs se determinaron mediante GC-MS, consiguiendo recuperaciones entre 80-101% y LODs entre 0.04-3 ng g-1. Pensado y col. [609] han descrito un método para la preparación de muestras de pescado. Se evaluaron diferentes soportes sólidos, así como la influencia del contenido graso de la muestra, en la eficiencia de la extracción. Bajo condiciones óptimas, la muestra se dispersa con C18 y sulfato sódico anhidro. Florisil y C18 son utilizados como II. INTRODUCCIÓN 93 cocolumna, mientras que la elución se lleva a cabo con acetonitrilo. Las recuperaciones obtenidas superan el 80% para todos los compuestos estudiados. Más recientemente, Sánchez-Brunete y col. [178] proponen un método de MSPD asistido por ultrasonidos, para la preparación de muestras de lodo. La muestra se dispersa con alúmina y la mezcla resultante se transfiere a una columna que contiene sulfato sódico anhidro. Los analitos se extraen con diclorometano, mediante un proceso asistido por ultrasonidos (10 min). El extracto resultante se somete a una etapa de limpieza adicional, utilizando 2 g de C18, y 10 mL de acetonitrilo para la elución. Trabajando en estas condiciones se obtienen recuperaciones en el rango de 85-108%. Otras aplicaciones recientes, utilizan MSPD para la extracción de PAHs de bivalvos [610], bitumen [611] y renacuajos [612]. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 94 Tabla II. 15 Condiciones utilizadas en algunas aplicaciones de MSPD. Analitos Matriz Dispersante Co-columna Disolvente R (%) Re f Alquilfenoles etoxilados Pescado (0.5 g) 2 g C18 3 g Alu 15 mL MeOH 97-100 [613] Aminas bioactivas T omate (1 g) 5 g Arena 15 mL HClO4 (0.6 M) 95-102 [592] Bactericidas fenólicos Polvo interior (0.5 g) 1.5 g C18 2 g Flo 10 mL AcN 80-114 [614] Benzo[a]pireno Pescado (0.5 g) 2 g C18 2g Flo 8 mL AcN 74-112 [605] Carbamatos Fruta (0.5 g) 0.5 g C8 10 mL DCM-AcN (6:4) 64-106 [615] Clenbuterol Hígado bovino (0.5 g) 2 g C18 20 mL AcN (1% Acet) 96 [616] Dibenzo[a,l]pireno Pienso (0.5 g) 2 g C18 2 g Flo 30 mL Hex-Benz (4:1) 101-107 [607] É steres organofosforados Polvo interior (0.5 g) 0.5 g Flo 0.5 g Alu 2.5 mL Ace 80-116 [593] Fenoles, bisfenoles Lodo y sedimento (0.2 g) 2 g Flo 1-2 g Flo 2.5 mL AcN 81-105 [595] Fentoato Suelo (4 g) 6 g Flo 30 mL Hex-Ace Et (7:1) 79-94 [617] Fungicidas Frutas y vegetales (0.5 g) 0.5 g C18 10 mL Ace Et 71-102 [618] Herbicidas Patatas (0.5 g) 0.5 g C8 3 mL fostato+10 mL MeOH 68-98 [619] Isoflavonoides Plantas (0.25 g) 0.5 g Oasis HLB 1 mL H2O-MeOH (0.02 mL NH4OH (25%) (95:5) --- [620] Isómeros hexaclorociclohexano Plantas (5 g) 0.5 g Flo/1 g MgSO4/0.5 g NaCl 2 g Alu/0.5 g Na2SO4 anh 20 mL Hex-Acet Et (70:30) 91-98 [621] Ocratoxina A Cereales (2.5 g) 1.5 g C8 20 mL MeOH-Fórm (99:1) 78-89 [622] PAHs Miel (1.5 g) 1.5 mL MeOH 2.5 g Flo / 1 g Na2SO4 anh 5 mL Hex-Ace Et (9:1) 80-101 [608] PAHs Músculo de pescado (0.2 g) 2 g C18 / 0.5 g Na2SO4 anh. 2 g Flo / 1 g C18 10 mL AcN 80-105 [609] PAHs L odo (2 g) 3 g Alu 12 mL DCM 85-108 [178] PAHs Bivalvos (0.1 g) 0.4 g C18 0.1 g Flo 1.2 mL AcN 52-100 [610] PAHs Bitumen (2 mL) 15 g Sil 5 g Alu/0.5 g Cu 80 mL Hex-Ace Et (4:1) 57-94 [611] PAHs Renacuajos (2 g) 10 g Sil/35 g Na2SO4 anh 30 g Na2SO4 anh 300 mL AcN 50-108 [612] PCBs, PBDEs, PBBs Pienso acuicultura (1.5 g) 1 g C18 2 g Sil ac/1.5 g Alu 30 mL Hex 50-96 [623] PCBs, PBDEs Matrices biológicas (0.5 g) 2 g Na2SO4 anh/1.5 g Flo 5 g Sil ác 20 mL Hex 74-99 [624] PCBs, pesticidas Alimentos grasos (0.5 g) 1.5 g Celita 5 g Flo 5 mL DMSO 61-98 [625] PCBs, OCPs Huevos (1 g) 2 g Flo 10 mL Hex-DCM (1:1) 82-110 [626] Pesticidas Suelo (10 g) 10 g Flo 50 mL DCM 72-105 [594] Pesticidas Fruta (0.5 g) 0.5 g C18 100 mL DCM-MeOH (1:1) 52-108 [627] Pesticidas Fruta (0.5 g) 0.5 g C8 15 mL DCM 74-84 [628] Pesticidas Soja (1 g) 2 g Sil 0.5 g C8 25 mL Acet Et-MeOH (4:1) 60-120 [590] Pesticidas Fruta (0.025 g) 0.025 C8 100 µL Acet Et 83-118 [629] Pesticidas T é (0.5 g) 2 g Flo 15 mL Hex-DCM (1:1) 80-97 [597] OCPs T abaco (5 g) 5 g Flo 5 g Flo 60 mL Hex 77-99 [630] Sulfonamidas Pollo (0.5 g) 2 g Alu 10 mL H2O-EtOH (3:7) 85-117 [598] Alu, alúmina; HClO4, ácido perclórico; Flo, Florisil; AcN, acetonitrilo; DCM-AcN, diclorometano-acetonitrilo; AcN (1% Acet); acetonitrilo que contiene 1% de ácido acético; Hex-Benz, hexano-benceno; Ace, acetona; Hex-Ace Et, hexano-acetato de etilo; Ace Et, acetato de etilo; fosfato; tampón fosfato 50 mM, pH 7.4; H2O-MeOH (0.02 mL NH4OH (25%)), agua-metanol (contiene 0.02 mL de hidróxido amónico al 25%); Mg2SO4, sulfato de magnesio; NaCl, cloruro sódico; Na2SO4 anh, sulfato sódico anhidro; MeOH-Fórm, metanol-ácido fórmico; DCM, diclorometano; Cu, polvo de cobre; Sil, sílice; PCBs, bifenilos policlorados; PBDEs, difeniléteres polibromados; PBBs, bifenilos polibromados; Hex, n-hexano; Sil ac, sílice ácida; DMSO, dimetilsulfóxido; OCPs, pesticidas organoclorados; Hex-DCM, hexanodiclorometano; DCM-MeOH, diclorometano-metanol; Ace Et-MeOH, acetato de etilo-metanol; H2O-EtOH, agua-etanol; ---información no disponible en la publicación; mezclas de disolventes referidas a v/v. II. INTRODUCCIÓN 95 2.3. MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE EXTRACTOS Independientemente de la técnica de extracción utilizada, los extractos pueden contener interferencias (lípidos, pigmentos, resinas, u otros componentes de la matriz), que causan problemas en el análisis de los PAHs. En muchas ocasiones, estos extractos deben someterse a etapas de purificación adecuadas, que permitan eliminar las sustancias indeseadas, antes de la determinación de los analitos. La elección de la técnica de purificación, está influenciada por la selectividad y sensibilidad que se desea alcanzar, así como por el método de determinación utilizado. El método de purificación más habitual es la SPE, pero existen otras posibilidades como el uso de inmunoadsorbentes, o la cromatografía de permeación sobre gel. Recientemente, también se encuentran aplicaciones en las que se utilizan técnicas de microextracción como etapa de limpieza. La SPE es la técnica clásica de purificación y fraccionamiento de extractos. Utilizando esta técnica, se consigue discriminar los componentes de la matriz y los analitos de interés, en función de la selectividad del adsorbente utilizado. Los métodos oficiales EPA 3630C, EPA 3610B y EPA 3620C, proponen respectivamente el uso de sílice, alúmina y Florisil, para la purificación de extractos orgánicos de muestras sólidas medioambientales [631-633]. Uno de los mayores problemas asociados con el análisis de matrices biológicas, es que la mayoría de ellas presentan un elevado contenido graso, lo que conduce a grandes cantidades de lípidos coextraídos, sobre todo si se lleva a cabo la extracción de compuestos apolares, como es el caso de los PAHs. La digestión ácida o la saponificación, son métodos destructivos, utilizados habitualmente para la eliminación de lípidos. La SPE es otra alternativa de uso frecuente. Sílice, Florisil y alúmina son los adsorbentes más comunes en este tipo de aplicaciones [461,552]. El lodo de depuradora de aguas residuales, está considerada como una de las matrices más complejas que existe, ya que contiene grandes cantidades de contaminantes de diferente naturaleza, lípidos y otro tipo de sustancias, que complican su análisis. La SPE también se ha utilizado como técnica de purificación de extractos de lodo. Oleszczuk y Baran [634] han estudiado diferentes tipos de 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 96 adsorbentes (C8, C18, C18 PolarPlus, sílice, fenilsilano y cianopropilsilano) para la purificación de extractos de lodo, en la determinación de PAHs, y encontraron el C18 como una de las mejores alternativas. La SPE también es el método más habitual para la limpieza de extractos de suelos y sedimentos [635]. Se han utilizado un gran número de adsorbentes (alúmina, Florisil, resinas de intercambio iónico, gel de sílice, C8, C18, fenilsilano, cianopropilsilano, etc.) para aislar contaminantes orgánicos de este tipo de extractos. Aplicaciones más concretas, han utilizado inmunoadsorbentes. Estos se basan en interacciones antígeno-anticuerpo selectivas y reversibles, que pueden retener contaminantes relacionados estructuralmente. Por ejemplo, Pérez y col. [636] han conseguido aislar selectivamente los PAHs de matrices medioambientales complejas (lodos y sedimentos), mediante una metodología basada en las interacciones antígeno-anticuerpo. Las muestras se extraen previamente, mediante USE con una mezcla de diclorometano-metanol (2:1, v/v), y los extractos resultantes se llevan a un volúmen final de 100 mL de agua, para realizar la extracción con los inmunoadsorbentes anti-fluoreno. Los resultados obtenidos, se compararon con aquellos obtenidos mediante procedimientos de limpieza convencionales, y se observó que con este método se conseguía una mejor selectividad para los PAHs, permitiendo su determinación a niveles de ppb. La cromatografía de permeación sobre gel (gel permeation chromatography, GPC), es otra de las alternativas. Aunque el número de aplicaciones es más limitado, esta técnica resulta especialmente útil, cuando se trata de remover material lipídico procedente de muestras biológicas. La EPA en su método 3640A [637], recomienda la GPC para la eliminación de lípidos, polímeros, proteinas, resinas naturales, componentes celulares, esteroides y compuestos de elevado peso molecular. Además considera esta técnica apropiada para analitos polares y no-polares, por lo que puede ser utilizada de manera efectiva para la limpieza de extractos que contengan un gran rango de analitos. Entre otras aplicaciones, la GCP ha sido empleada para la limpieza de extractos de pescado [562], lodo [182] y vegetación [638], en la determinación de PAHs. En la actualidad, muchas de las metodologías optan por acoplar técnicas de microextracción, como métodos de purificación de extractos. En una primera etapa, se lleva a cabo la extracción de los analitos de las matrices sólidas, utilizando técnicas como PLE, USE, Soxhlet, etc., y en segundo lugar, los analitos II. INTRODUCCIÓN 97 de interés se aislan del extracto mediante técnicas de microextracción. Por ejemplo, Ratola y col. [639] han desarrollado un método de HF-LPME, como un procedimiento de limpieza rápido y simple, utilizado en la determinación de PAHs en muestras vegetales complejas. HF-LPME permite eliminar las interferencias presentes en los extractos, dando lugar a cromatogramas (GC-MS) muy limpios, y evitando el deterioro de la columna cromatográfica. 2.4. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN La determinación de los PAHs se realiza habitualmente mediante HPLC o GC, acopladas a diferentes sistemas de detección. En este capítulo se describen aspectos prácticos de estas técnicas, enfocados al análisis de estos contaminantes. No se incluye una explicación pormenorizada de la teoría y fundamentos básicos de las técnicas cromatográficas, dado que existen numerosas publicaciones dedicadas a este fín [640-646]. 2.4.1. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA HPLC es la técnica de separación más ampliamente utilizada en la determinación de PAHs. Su éxito se debe a la posibilidad de actuar de forma muy precisa sobre la selectividad entre los compuestos a través de la elección de la columna y de la composición del eluyente, es decir, el sacar partido de las interacciones disolución/fase móvil/fase estacionaria. Además, la técnica de HPLC puede utilizarse para la determinación de un gran número de PAHs, incluso de elevado peso molecular, puesto que al contrario de lo que ocurre en GC, la volatilidad de los analitos no resulta un problema. La detección UV y de fluorescencia son las más populares para la determinación de los PAHs tras su separación mediante HPLC. La detección de fluorescencia presenta dos ventajas obvias sobre la detección UV, la gran selectividad y mayor sensibilidad. Ambos aspectos son cruciales puesto que las muestras medioambientales pueden contener bajos niveles de PAHs y gran cantidad de compuestos que pueden interferir en el análisis. 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 104 2.4.2.3. Sistemas de detección Uno de los detectores más utilizados es la espectrometría de masas de impacto electrónico (EI) con cuadrupolo. A pesar de la pobre fragmentación que sufren los PAHs, utilizando este sistema de detección, se producen señales intensas de los iones moleculares [666]. La monitorización del ión selectivo (SIM) en GCEI/MS, presenta ciertas ventajas sobre el modo full-scan, como por ejemplo, los bajos límites de detección que se consiguen. En general, se trata de un sistema fácil de utilizar y de un coste razonable, lo que ha originado que GC-EI/MS se convirtiese en una de las técnicas habituales para la determinación de estos contaminantes. La ionización química negativa y positiva (PCI y NCI, respectivamente) son modos de ionización alternativos a EI/MS. Los métodos convencionales de ionización química, utilizan metano como gas reactivo, obteniendo espectros de masa similares a aquellos producidos mediante GC-EI/MS. Otros gases reactivos son dimetil éter, tetrametilsilano, amonio, dióxido de carbono o mezclas de gases [679]. Riahi y col. [680] estudiaron la separación de 5 grupos de isómeros de PAHs mediante GC-PCI/MS, utilizando amonio y dimetil éter como gases reactivos. Los resultados demostraron que el dimetil éter es más selectivo para este grupo de compuestos. Yurchenko y Mölder [681] han utilizado GC-PCI/MS para el análisis de PAHs en pescado fresco y ahumado, aceite de oliva y aceite de colza, empleando amonio como gas reactivo. Los límites de detección y las recuperaciones oscilaron entre 0.24-0.27 ppb y 75-87%, respectivamente, para los seis PAHs estudiados. GC-NCI/MS fue el método utilizado para la determinación de PAHs, nitroPAHs y oxiPAHs en muestras de suelo urbano y partículas atmosféricas [682]. Aunque NCI generalmente produce menor sensibilidad, se ha demostrado que si se utiliza metano como gas reactivo, se consigue un método sensible y selectivo con los PAHs isoméricos [666]. Otra alternativa es MS con trampa de iones (IT/MS). Esta técnica se ha utilizado para la determinación de PAHs en agua de mar, mejillones [298], sedimentos [683] y lodo [182]. Los analizadores de IT son rápidos, ya que un barrido completo del rango habitual de trabajo (10-650 m/z) se obtiene en 1 s o menos. No obstante presentan ciertas limitaciones, dado que las trampas de iones almacenan todos los iones producidos en la fragmentación de la muestra y los van II. INTRODUCCIÓN 105 filtrando progresivamente, no es posible la selección de iones discontinuos como en el modo SIM. A pesar de este inconveniente desde el punto de vista de su aplicación en análisis de ultratrazas, las trampas de iones presentan la ventaja frente a los cuadrupolos, de ser muy fácilmente configurables para el trabajo con MS/MS e incluso MSn. Dentro de esta modalidad, la disociación mediante colisión inducida (CID), ha mostrado elevada sensibilidad para el análisis de PAHs en aceite de motor usado [684]. GC-FID es un método que todavía se sigue utilizando en la actualidad. Una ventaja asociada a este sistema de detección, es que la respuesta es proporcional al número de carbonos, por lo que se pueden cuantificar compuestos dentro del mismo grupo de isómeros, incluso si no se dispone de patrones de calibración de todos ellos. En la literatura, se encuentran numerosas aplicaciones de GC-FID para la determinación de PAHs en muestras medioambientales. Algunos ejemplos son el análisis de estos contaminantes, en partículas aéreas [685], agua [686] y sedimentos [687]. No obstante, si se trata de muestras de elevada complejidad, lo más común es utilizar GC-MS para la determinación, puesto que permite obtener mayor exactitud que los métodos de detección universales. Además de conseguir mayor sensibilidad (tabla II.19), la selectividad asociada a la naturaleza del detector (MS) permite minimizar las interferencias de otras sustancias procedentes de la matriz. Tabla II. 19 Límites de cuantificación instrumentales (µg L-1) para los PAHs, utilizando distintos sistemas en cromatografía de gases. PAHs GC-FID GC-EI-MS GC-EI-MS/MS LVI-GC-EI-MS LVI-GC-EI-MS/MS Naftaleno --- 0.43 4.76 0.20 0.013 Acenaftileno --- 0.71 2.03 0.61 0.029 Acenafteno --- 0.83 1.33 0.66 0.0075 Fluoreno 3330 0.78 1.25 0.11 0.0072 Fenantreno 4640 0.46 0.93 0.11 0.0057 Antraceno 3530 0.65 1.04 0.15 0.0071 Fluoranteno 4240 0.67 0.57 0.12 0.0046 Pireno 3790 0.73 0.70 0.12 0.0050 Benzo[a]antraceno 3730 2.50 0.23 0.35 0.0034 Criseno 3000 3.33 0.34 0.25 0.0029 Benzo[b]fluoranteno 3520 3.03 1.27 0.68 0.0098 Benzo[k]fluoranteno 5680 4.76 1.72 0.71 0.0097 Benzo[a]pireno 6200 10 3.57 0.73 0.017 Dibenzo[a,h]antraceno 3440 14.29 0.40 2.24 0.040 Benzo[g,h,i]perileno 8000 11.11 3.57 1.54 0.045 Indeno[1,2,3-c,d]pireno 8250 7.69 2.56 0.56 0.033 Vol iny (µL) 1 1 1 25 25 Ref. [688] [469] [182] [529] [529] 2. MÉTODOS DE ANÁLISIS 106 En los últimos años, TOF/MS combinado con GC o LC ha despertado gran interés en el análisis medioambiental [689-691]. Uno de los aspectos más importantes de este método de detección, es que se puede adquirir la masa exacta, la información de full-scan y los datos cuantitativos en periodos de tiempo cortos. Además, debido a su elevado poder de resolución de masas, TOF/MS permite mejorar la relación señal/ruído, respecto al uso de un cuadrupolo simple. Este método de determinación ha sido aplicado en el análisis de PAHs en sedimentos, té [692] aceite vegetal [693] y cenizas [694]. GC acoplado a MS con radioisótopo (isotope-ratio mass spectrometry, IRMS) es otra de las alternativas utilizada para la determinación de PAHs. Hace aproximadamente una década, se demostró que las fuentes de emisión de PAHs al medio ambiente, podían determinarse mediante medidas del isótopo de carbono de los PAHs individuales [695,696]. En esta técnica, GC está acoplada a un horno de combustión, de modo que la composición isotópica del CO2 resultante, es continuamente analizada, utilizando un analizador MS de sector magnético. La relación entre el compuesto específico y el isótopo de carbono (13C/12C), sirve para determinar cuantitativamente las fuentes de emisión de estos contaminantes, y se ha aplicado a estudios de contaminación del ambientes marinos, lacustres y terrestres [697-699]. BIBLIOGRAFÍA  107 BIBLIOGRAFÍA [1] R. G. Harvey, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Wiley-VCH, New York (1997). [2] P. Henner, M. Shiavon, J. L. Morel, È. Lichtfouse, Analusis Mag. 25 (1997) 56. [3] D. W. Connell, Basic Concepts of Environmental Chemistry, Taylor & Francis Group, Boca Ratón, New York (2005). [4] C. Baird, Química Ambiental, 2ª ed., Reverté S. A., Barcelona (2001). [5] A. K. Haritash, C. P. Kaushik, J. Hazard. Mater. 169 (2009) 1. [6] C. Orozco, A. Pérez, M. N. González, F. J. Rodríguez, J. M. Alfayete. 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Thus, the weight of residues in extracts (see Table 1) was taken into account in choosing the most suitable solvent, and the mixture of hexane-acetone (1:1) was accordingly selected. 30 mL Hexane 25 mL CH 2 Cl 2 25 mL ACN 25 mL Acetone 25 mL Hex: Ace 0 20 40 60 80 100 120 Anth B[a]A Chry B[e]P B[b]F B[ghi]P I[123cd]P Fig. 1 Effect of extraction solvent on the recovery of some representative PAHs by MSPD extraction. Hex: n-hexane, CH2Cl2: dichloromethane, ACN: acetonitrile, Ace: acetone, Hex-Ace: hexane-acetone (1:1, v/v). Sample: spiked soil (concentrations obtained with the MAE procedure, see Fig. 3). 4.1.3. Effect of modifier addition The final stage of optimization of the MSPD procedure consisted of evaluation of the effect of the amount of alkaline added when the samples were blended. Preliminary assays showed that this treatment was important in terms of minimising extract residues and maximising recoveries of PAHs. A series of experiments was carried out in which different amounts of alkali were added. For most of the analytes, recoveries were on average 30-50% lower (see Fig. 2) in the absence of alkaline treatment. As expected, recoveries increased as the amount of alkali increased, until a constant value was reached. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 233 The overall results showed that the combined effect of Florisil® as solidphase, 500 µL of saturated methanolic potassium hydroxide solution as additive, 0.5 g of Florisil® and 0.5 g of silica as clean-up layers and 6 mL of hexane-acetone (1:1, v/v) as elution solvent makes this extraction procedure suitable for determining 16 PAHs in a complex matrix such as soil. Typical chromatograms obtained with spiked soil under MSPD and MAE optimized conditions are shown in Fig. 3. Very similar chromatographic clean profiles were obtained with both MSPD and MAE procedures, thus confirming that the MSPD procedure can be use to produce soil extracts ready for further separation and analysis. 0 20 40 60 80 100 120 Chry B[e]P B[b]F B[a]P B[ghi]P I[123cd]P Without additive 250 µL KOH (MeOH) sat 500 µL KOH (MeOH) sat 750 µL KOH (MeOH) sat Fig. 2 Effect of the amount of saturated methanolic potassium hydroxide solution on the efficiency of the MSPD extraction for some representative PAHs. KOH (MeOH) sat: saturated methanolic potassium hydroxide solution. Sample: spiked soil (concentrations obtained with the MAE procedure, see Fig. 3). J. Chromatogr. A 1165 (2007) 32 234 min 0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 a b 1 2 3 4 5 6 8 7 10 9 11 12 13 14 15 16 1 23 4 5 6 8 7 10 9 11 1213 14 15 16 Fig. 3 Chromatograms obtained by fluorescence detection, and corresponding to (a) spiked soil extract obtained by MAE and (b) spiked soil (diluted 1:5) extract obtained by MSPD. Peak assignment: 1, Naph (39.07 ng g-1); 2, Ace (38.96 ng g-1); 3, Flu (21.54 ng g-1); 4, Phen (138.88 ng g-1); 5, Anth (26.38 ng g-1); 6, Flt (153.95 ng g-1); 7, Pyr (186.91 ng g-1); 8, B[a]A (33.13 ng g-1); 9, Chry (74.16 ng g-1); 10, B[e]P (65.18 ng g-1); 11, B[b]F (76.40 ng g-1); 12, B[k]F (20.59 ng g-1); 13, B[a]P (45.86 ng g-1); 14, DB[a,h]A (10.10 ng g-1); 15, B[g,h,i]P (47.47 ng g-1); 16, I[1,2,3-cd]P (69.67 ng g-1). 4.2. Performance of the analytical procedure Calibration curves were prepared at five levels. Each calibration level was injected twice. The range of concentrations and other calibration figures of merit, as well as the detection (LOD, s/n=3) and quantification (LOQ, s/n=10) limits for the proposed method are summarized in Table 2. The results show that all the analytes were quantified far below the limit imposed by current regulations [4]. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 235 Table 2 Regresion analysis, LODs and LOQs of the proposed analytical procedure. Compound Calibration range (ng mL-1) Calibration equation Slope standard error Intercept standard error Correlation coefficient LOD S/N=3 (ng g-1) a LOQ S/N=10 (ng g-1) a Naph 1-200 y=6.1948x-1.9559 0.01 1.3 0.9996 0.2 0.6 Ace 1-200 y=7.1117x+0.2985 0.03 3.2 0.9999 0.1 0.4 Flu 0.2-40 y=30.859x+2.0327 0.1 2.3 0.9999 0.03 0.08 Phen 0.1-20 y=27.522x-1.8729 0.08 0.8 0.9999 0.05 0.2 Anth 0.1-20 y=34.767x-1.7347 0.1 1.1 0.9999 0.02 0.07 Flt 0.2-40 y=3.6434x-0.8683 0.01 0.3 0.9999 0.1 0.5 Pyr 0.1-20 y=16.776x-0.9578 0.08 0.8 0.9999 0.04 0.1 B[a]A 0.1-20 y=32.068x-0.4474 0.05 0.5 1 0.007 0.02 Chry 0.1-20 y=1.7574x+0.0078 0.007 0.07 0.9999 0.2 0.6 B[e]P 0.2-40 y=2.1948x+0.2507 0.006 0.1 0.9999 0.1 0.4 B[b]F 0.2-40 y=10.349x+0.9212 0.03 0.6 0.9999 0.02 0.07 B[k]F 0.1-20 y=57.919x+2.4665 0.1 1.2 0.9999 0.004 0.01 B[a]P 0.1-20 y=34.237x-1.287 0.09 0.9 0.9999 0.007 0.02 DB[a.h]A 0.2-40 y=16.265x-1.2747 0.07 1.5 0.9999 0.02 0.06 B[ghi]P 0.2-40 y=23.456x-2.9172 0.09 1.8 0.9999 0.02 0.05 I[123-cd)P 0.1-20 y=3.5162x-0.1079 0.02 0.2 0.9999 0.06 0.2 a Concentration on dry weight basis. Recoveries were evaluated by processing soil samples with standard additions at concentrations ca. 0.5, 1, 1.5, and 2 times the actual concentrations in original samples (Table 3). As previously reported [13], significant losses of some PAHs are produced during the solvent evaporation stages associated with sample preparation procedures. These losses were taken into consideration and recoveries for the overall analytical process were calculated from the slope of the addition graph. The extraction process was highly efficient, with recoveries higher than 94% and relative standards deviations lower than 2% (Table 4). J. Chromatogr. A 1165 (2007) 32 236 Table 3 Average concentrations and intermediate precision of the analysis of nonspiked soil samples. Compound MSPD MAE (ng g-1 dm) S.D. (n=6) (ng g-1 dm) S.D. (n=5) Naph 46.65 0.87 46.82 1.73 Ace 5.26 0.26 5.47 0. 3 Flu 8.72 0.71 10.39 0.36 Phen 31.40 1.13 33.27 1.74 Anth 2.95 0.04 2.94 0.09 Flt 38.21 1.37 36.23 0.89 Py r 27.31 0.30 26.34 2.08 B[a]A 9.85 1.01 7.29 0.44 Chry 27.24 0.49 27.35 1.76 B[e]P 18.03 0.24 17.97 0.95 B[b]F 23.21 0.82 21.28 1.72 B[k]F 8.17 0.10 8.02 0.66 B[a]P 13.94 0.06 9.43 0.82 DB[a,h]A 2.82 0.05 2.73 0.08 B[ghi]P 16.12 0.13 15.96 0.74 I[123-cd)P 17.67 0.24 17.33 0.47 Intermediate precision was assessed by a series of six independent experiments carried out on different days, with non-spiked soil. The MSPD and MAE techniques were compared for the same soil. Average concentrations (on a dry mass basis) and precision between days are reported in Table 4. The degree of precision obtained with MSPD was similar to that obtained with the MAE procedure and there was good agreement between MAE measurements and MSPD evaluated concentrations. Furthermore, to check the performance of the analytical procedure, six samples of BCR 524 industrial soil reference material were processed by the described procedure. There was good agreement between the values obtained and the certified values (see Table 5 for mean concentrations and confidence intervals). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 237 Table 4 Recoveries and R.S.D.s for the extraction procedure applied to real soil samples. Compound Recovery (%) (slope x 100) R.S.D. (%) (slope error x 100) Naph 94.3 0.9 Ace 100.1 1.9 Flu 102.6 1.5 Phen 99.1 1.5 Anth 99.9 1.6 Flt 97.4 0.9 Py r 97.2 1.5 B[a]A 103.9 1.4 Chry 99.9 0.2 B[e]P 101.3 0.5 B[b]F 100.9 1.8 B[k]F 98.7 1.7 B[a]P 97.6 1.2 DB[a,h]A 98.6 0.7 B[ghi]P 99.1 0.6 I[123-cd)P 101.0 1.9  Table 5 Measured concentrations and confidence intervals compared with certified concentrations for BCR 524 reference material. Compound BCR 524 MSPD MAE [13] Certified (µg g-1) Measured (µg g-1) x  2S.D. (n=6) Measured (µg g-1) x  2S.D. (n=5) Py r 173  11 182  5 179.9  0.1 B[a]A 22.5  1.8 22.6  0.7 23.0  0.1 B[e]P 10.6  1.4 11.8  0.4 11.5  0.6 B[b]F 13.5  1.6 14.9  0.5 14.9  0.6 B[k]F 6.2  0.6 6.6  0.3 6.4  0.05 B[a]P 8.6  0.5 9.0  0.1 9.0  0.04 I[123-cd]P 5.1  0.4 5.3  0.1 5.3  0.1  J. Chromatogr. A 1165 (2007) 32 238 5. CONCLUSIONS To the best of our knowledge, the proposed procedure constitutes the first application of the MSPD technique to the determination of PAHs in soil samples. The method allows extraction and clean-up to be carried out in a single step, without additional purification of extracts. Extraction conditions were carefully selected to achieve maximal recovery of the PAHs contained in soil samples while eliminating most of the interfering matrix components. The results demonstrate that the accuracy, precision and selectivity of the proposed method are satisfactory for analysis of PAHs. Quantification limits achieved by the method allow the application of the procedure below the levels imposed by existing regulations. The method requires a small sample size and offers considerable savings in terms of solvent consumption, cost of materials, sample manipulation and time involved. Acknowledgements This research was financially supported by the Spanish Ministry of Education and Science (project CTQ2006-03334/BQU), E.U. FEDER funding and the Xunta de Galicia (project PGIDIT06PXIB237039PR). REFERENCES [1] Polynuclear aromatic compounds, Part 1. Chemicals, Environmental and Experimental Data, IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, vol. 32, IARC, Lyon, 1983. [2] D. Mackay, W.Y. Shiu, K.C. Ma, Illustrated Handbook of Physical-Chemical Properties and Environmental Fate for Organic Chemicals, in: Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Polychlorinated Dioxins and Dibenzofurans, vol II, Lewis Publishers, Boca Raton, 1992. [3] K.S. Park, R.S. Sims, R.R. 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Acetonitrile and methanol (gradient-grade, Lichrosolv), and n-hexane, acetone and dichloromethane (Suprasolv) were purchased from Merck (Darmstadt, Germany). Ultrapure water was produced by means of a Milli-Q system supplied by Millipore (Bedford MA, USA). Hydrochloric acid (36%) was supplied by Prolabo (Fontenay-Sous-Bois, France). EPA-610 Polycyclic aromatic hydrocarbon mixture and B[e]P (solid, 98.5%) were supplied by Supelco (Bellefonte PA, USA) and D[a,l]P (10 ng µL-1) were from Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany) potassium hydroxide (Pellets, 85%+, AC), Florisil (60-100 mesh), octyldecylfuntionalized silica gel (70-230 mesh, 9-12% carbon loading), aluminum oxide activated neutral (150 mesh) and sea sand (50-70 mesh) were purchased from Sigma–Aldrich (Madrid, Spain), and silica gel (230-400 mesh) was obtained from Merck. Silica gel and Florisil contain appreciable traces of PAHs and consequently require some washing before application of MSPD. Sorbents were pre-washed in columns with a hexane-acetone (50:50, v/v) mixture and stored dry before use. For some experiments the normal-phase materials were activated at 105 ºC for 48 h and then allowed to cool down in a desiccator before being used in the MSPD cartridge. Anhydrous sodium sulphate was supplied by Panreac (Barcelona, Spain). Standard reference material (CRM) BCR 088 was supplied by the Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM, Geel, Belgium) and RTC-CNS312-04 reference material was obtained from LGC Standards (Teddington Middlesex, UK). Durapore filters (Millex GV, 13 mm, 0.22 µm) were supplied by Millipore. Silica (Sep-Pak, 500 mg), Florisil (Sep-Pak, 900 mg), Oasis HLB 3 cc (60 mg) and Oasis MAX 3 cc (60 mg) cartridges were obtained from Waters. Microwave-assisted extractions (MAE) were performed with an Ethos E-320 (1000 W) Microwave Extraction System (Millestone, Leutleirch, Germany) equipped with 12 vessels, each of nominal volume 100 mL. The maximum values of temperature and pressure inside the extraction vessels were 260 ºC and 35 bar (500 psi). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 249 2.2. Samples Sewage sludge sample (S1) used to develop and optimize the procedure was obtained from a wastewater treatment plant (WWTP) located in Lugo (Galicia, northwest Spain). The municipal WWTP receives mainly urban wastewater, but also receives industrial waters principally of dairy plants, effluents of hospitals and the municipal slaughterhouse. The reference materials, BCR 088 and RTC-CNS312-04, are dried sewage sludges. Additionally, real samples were used to test the applicability of proposed method. A sewage sludge sample (S2) was obtained in 2000 during interlaboratory exercises and three secondary sewage sludge samples (S3, S4, S5) produced by different treatments, were collected in different points of Galicia. The humidity of the materials was gravimetrically evaluated after drying sample portions of materials in an oven at 105 ºC for 2h. The lipid content of samples was evaluated by means of the Bligh and Dyer method [27]. Information about studied samples is compiled in Table 1. As can be seen, materials with different characteristics (lipid content and total carbon) and treatments were taken for this study. Spiked samples were prepared with sewage sludge by adding a standard solution of analytes in acetonitrile. Sewage sludge (S1) was spiked with PAHs at levels between 0.05 and 5 µg g-1, taking into account the concentration values in blank sample. The spiking procedure consisted of mixing, 20 g of sewage sludge sample with 10 mL of a standard solution of studied PAHs in acetonitrile. The mixture was mechanically stirred and allowed to air dry at room temperature for 24 h with occasional mixing. This procedure was carried out several months before sample analysis and all spiked and non-spiked sewage sludge samples were then lyophilized and stored in amber glasses at 4 ºC. Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 250 Table 1 Characterization of sewage sludge samples. Sewage sludge samples RTC-CNS312-04 - 8.4 6.1 Elemental analysis (%) 30.4 4.3 1.3 Ana. Dig., stabilisation by anaerobic digestion; F. Band, dewatering by filter band (include treatment with polielectrolites); polielect., chemical conditioning with polielectrolites; F. Press, dewatering by filter press; centrifuge, dewatering by centrifuge; lime stab., chemical stabilisation by lime; (-) not available. BCR088 - 12.1 9.0 27.1 3.1 1.6 S5 Lime stab., Polielect., F. press 3.8 1.3 21.7 2.6 0.2 S4 Ana. dig., Polielect., Centrifuge 5.4 8.9 35.9 6.1 0.8 S3 Polielect., F. Press 6.6 6.3 38.0 6.4 0.9 S2 - 5.8 3.8 17.3 1.1 0.5 S1 Ana.dig., F. Band 6.1 2.9 14.1 1.9 0.6 Sample treatment Humidity (%) Lipid content (%) Carbon Nitrogen Sulphur IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 251 2.3. Sample preparation 2.3.1. MSPD procedure Under the finally optimized conditions, 0.2 g (weighed accurately) of lyophilized sample was first soaked in 1 mL of saturated methanolic potassium hydroxide solution in a glass mortar, then 1 g of Florisil and 0.5 g of anhydrous sodium sulphate were added and the mixture was thoroughly blended with the pestle to obtain the complete disruption and dispersion of the sample on the solid support. When blending was complete (after 1 min), the homogeneous mixture was packed into a column containing (from bottom to top) a layer of 1 g of Florisil and another layer of 2 g of silica. These materials act as co-column or clean-up phases in the cartridge elution. A second frit was placed on the top of the sample before careful compression with a plunger. Finally, the target compounds were eluted from the packet columns with 6 mL of dichloromethane-methanol (90:10, v/v) mixture. The extract was concentrated to 0.5 mL under a stream of nitrogen in the Turbo Vap. Then, 2 mL of acetonitrile (ACN) was added and the mixture again concentrated to 0.5 mL. The final concentrated extract was then transferred to a 1 mL volumetric flask and the volume made up to the mark with water. The extract was filtered through a 0.22 µm Durapore filter and 25 µL were injected into the HPLC system. 2.3.2. MAE procedure Sewage sludge samples were also analysed according to the previously reported saponification-extraction method for PAHs [13]. Briefly, this procedure involves the simultaneous microwave-assisted extraction of PAHs with n-hexane and the hydrolysis of samples with methanolic potassium hydroxide at 129 ºC for 17 min, followed by centrifugation and purification with silica and Florisil cartridges. The MAE procedure was used as reference method in the optimization of the MSPD procedure. 2.4. Chromatographic separation A binary solvent system made of acetonitrile and water was used for chromatographic separations at 1.5 mL min-1. The gradient elution program was as Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 252 follows: initial conditions, 50% ACN for 3 min, then a linear ramp to 100% ACN within 17 min and holding at 100% for 8 min. The column temperature was set at 35 ºC. Detection was performed at selected fluorescence wavelength programming to obtain the better sensitivity and minimal interference. The excitation/emission wavelengths pairs (nm) were set as follows: 267/330 for Naph; 275/315 for Ace and Flu; 247/357 for Phe; 238/418 for Anth, Flt and Pyr; 286/410 for B[a]A and Chry; 294/425 for B[e]P, B[b]F, B[k]F, B[a]P, DB[a,l]P, DB[a,h]A and B[g,h,i]P; and 245/500 for I[1,2,3-cd]P. 3. RESULTS AND DISCUSION 3.1. Optimization of conditions for matrix solid-phase dispersion The selectivity of the MSPD procedure depends on the sorbent/solvent combination used. Most applications of MSPD have used a reversed-phase material, particularly C18 and C8; silica, Florisil and chemically modified sorbents are used less frecuently [19]. In recent years, alternative support materials, such as acidic silica, sand, celite, diatomaceous earth, acrylic polymers, alumina, Oasis HLB (a macroporous poly(divinylbenzene-co-N-vinylpyrrolidone) polymer) and molecularly imprinted polymers (MIPs) have been used to enhance the selectivity of the MSPD process [20]. The nature of the elution solvent is also important since the target analytes should be efficiently desorbed while the remaining matrix components should be retained in the column [21]. On the other hand, the intentional ionization or suppression of ionization of analytes and matrix components can greatly affect to nature of interactions of specific target analytes with the matrix and the eluting solvent and should be considered as a variable for attaining reproducible and efficient extractions. This may be accomplished by adding acids, bases, salts, chelating or de-chelating agents, antioxidants, etc, at the time of sample blending and/or as an additive to the eluting solvent [19]. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 253 3.1.1. Preliminary extraction assays The first extraction assays were carried out using the previously reported MSPD method for extraction of PAHs from soil samples [23]. Unsatisfactory results suggest that a very complex matrix such as sewage sludge requires specific methodologies which should be carefully optimised to obtain good performance in terms of recovery values and extract cleanness. Therefore, a new method for determination of PAHs from sewage sludge was developed. Initial experiments were performed with silica, C18 or Florisil as dispersants. The use of water and anhydrous sodium sulphate in the dispersion, using C18 as solid support, has a positive effect on the extraction efficiency. The addition of 200 µL of water and 0.5 g of anhydrous sodium sulphate in dispersion stage was shown to be satisfactory. A hexane-dichloromethane (50:50, v/v) mixture (15 mL) was initially selected as the extraction solvent and 2 g of silica and 1 g of Florisil as clean-up layers. Extracts obtained with silica appeared more sample matrix coextractive, while no significant differences were found when the samples were dispersed with C18 or Florisil. Both sorbents provided higher recoveries and lower sample matrix residues than silica, although yet unsatisfactory. Also, acetonitrile and hexane-acetone (50:50, v/v; 15 mL) mixture, employing C18 as dispersant, provided unsatisfactory recoveries. Different amounts of organic solvents (methanol and n-hexane- dichloromethane (50:50, v/v) mixture) as well as hydrochloric acid (10%) were also tested as modifiers in the sample blending stage with Florisil but these additives did not enhance either recoveries or extract clean-up. 3.1.2. Optimisation of dispersion conditions On the basis of these preliminary assays, sorbents with different physical and chemical properties were tested as solid supports for matrix dispersion in alkaline medium. Sand, Oasis MAX, Oasis HLB, alumina, Florisil, activated Florisil, as well as some combinations of them were assayed to assess the sorbents effect on the yield and selectivity of the MSPD process. It should be noted that Oasis HLB and MAX were always used in combination with another solid sorbent (sand, Florisil or anhydrous sodium sulphate) allowing a better blending step. Oasis cartridges Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 254 were cut and the appropriate amounts of these polymeric materials were weighted to be used in different experiments. As shown in Fig. 1, best results in terms of recovery and residue values were obtained when Florisil was used as dispersant. On the other hand, Florisil in combination with anhydrous sodium sulphate produced lower residues than Florisil alone (see table 2). 0 20 40 60 80 100 120 Pyr B[a]A B[e]P B[a]P I[1,2,3-cd]P Recovery (%) 1 g sand [27.2 ± 1.5] 1 g sand + 0.12 g MAX [26.4 ± 1.1] 1 g Flo act [31 ± 1] 1 g Alu [35.6 ± 2.6] 1 g sand + 0.12 g HLB [36 ± 0.5] 1 g Flo + 0.12 g HLB [25 ± 1.4] 1 g Flo [25 ± 1] Fig. 1 Influence of different sorbents used as dispersants on the recovery of some representative PAHs in spiked sewage sludge sample by MSPD extraction, using 10 mL of dichloromethane-methanol (90:10, v/v) mixture as elution solvent, 500 µL of saturated methanolic potassium hydroxide solution as additive and 2 g silice and 1 g Florisil as clean-up layers. MAX, Oasis MAX; Flo act, activated Florisil; Alu, neutral alumina; HLB, Oasis HLB; Flo, Florisil. Values in brackets correspond to residues (average (mg g-1 sample) ± standard deviation (n=3)) of spiked sewage sludge extracts. Data for triplicate extraction. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 255 Table 2 Amount of residue in sewage sludge extracts and values of recovery of analytes obtained by different MSPD conditions. Results Recoveries (%)c 80 75 64 92 98 99 96 73 67 99 100 100 64 79 99 95 99 101 95 0.2 g Spiked sewage sludge sample. Data for three replicates. Alu, neutral alumina; HLB, Oasis HLB; Flo, Florisil; Sil, silica; Na2SO4, anhydrous sodium sulphate; KOH, saturated methanolic potassium hydroxide solution; DCM, dichloromethane; MeOH, methanol. a Amounts of solvent or saturated methanolic potassium hydroxide solution added in the blending step. b Average (mg g-1 sample) of three determinations ± standard deviation. c Average of 17 PAHs recoveries, calculated considering values obtained with MAE procedure [13]. Residue (mg g-1)b 39.3 ± 3.3 16.6 ± 2.3 40.1 ± 5 35.8 ± 0.7 35.5 ± 3.2 36 ± 0.5 46.4 ± 2.9 19.9 ± 0.7 40.8 ± 2.7 25 ± 1 22.2 ± 0.2 18 ± 0.3 14.0 ± 3.2 17.2 ± 1.0 22.7 ± 0.7 17.6 ± 0.2 17.8 ± 0.5 17.4 ± 0.5 18 ± 1.1 MSPD conditions Extraction solvent 10 mL DCM-MeOH (90:10, v/v) 10 mL DCM-MeOH (80:20, v/v) 10 mL DCM-MeOH (90:10, v/v) 10 mL DCM-MeOH (90:10, v/v) 6 mL DCM-MeOH (90:10, v/v) Co-column 3 g Sil 3 g Alu 2 g Flo+1 g C18 2 g Flo+1 g Alu 2 g Flo+1 g Sil 2 g Sil+1 g Flo 3 g Flo 3 g Flo 2 g Flo+0.12 g HLB 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo 2 g Sil+1 g Flo Type of additivea 500 µL KOH 500 µL KOH 500 µL KOH 1000 µL KOH 1250 µL KOH 1500 µL KOH 500 µL KOH 1000 µL KOH 1250 µL KOH 1500 µL KOH 1000 µL KOH Dispersant 1 g Sand+0.12 HLB 1 g Flo 1 g Flo+0.5 g Na2SO4 1 g Flo+1 g Na2SO4 1 g Flo+0.5 g Na2SO4 Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 256 A series of experiments were carried out adding different amounts of alkali in the dispersion stage. As can be seen in Fig. 2, for most of the analytes, recoveries were on average 20–60% lower in the absence of alkaline treatment. Recoveries increased and the residues values decreased as the amount of alkali increased, until a constant value (1mL) was reached. It should be stressed that the amount of anhydrous sodium sulphate is also critical. As can be seen in Table 2, the experiments with 1250 -1500 µL of methanolic saturated potassium hydroxide and 0.5 g of anhydrous sodium sulphate provided lower recoveries as compared to similar experiments involving 1 g of anhydrous sodium sulphate. 0 20 40 60 80 100 120 Flt Pyr B[e]P DB[a,h]A I[1,2,3-cd]P Recovery (%) Without additive [36.8 ± 1] 250 µL KOH [28.0 ± 1.8] 500 µL KOH [25 ± 1] 750 µL KOH [22.9 ± 1.4] 1000 µL KOH [17.6 ± 0.2] 1250 µL KOH [17.8 ± 0.5] a 1500 µL KOH [17.4 ± 0.5] a Fig 2 Effect of the amount of saturated methanolic potassium hydroxide solution on the extraction efficiency for some representative PAHs in spiked sewage sludge sample. MSPD conditions were 1 g of Florisil and 0.5 g of anhydrous sodium sulphate (a1 g of anhydrous sodium sulphate) as dispersant, 2 g silice and 1 g Florisil as clean-up layers and 10 mL of dichloromethane-methanol (90:10, v/v) mixture as elution solvent. KOH, saturated methanolic potassium hydroxide solution. Values in brackets correspond to residues (average (mg g-1 sample) ± standard deviation (n=3)) of spiked sewage sludge extracts. Data for triplicate extraction. At the time of testing dispersant, several clean-up schemes (Table 2) were assayed with the aim of providing sample extracts clean enough for direct injection in the HPLC column, while keeping high recoveries in the PAHs extraction from sewage sludge samples. As can be seen, Florisil (3 g) or neutral alumina (3 g) as co-column, reduced the amount of sample matrix residues although were unable to provide satisfactory extraction yields. Then, different amounts of Florisil (1 or 2 g) were IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 257 assayed in order to evaluate the recoveries and the results demonstrated that lower amounts of Florisil provided a higher residue and highly turbid extracts. Finally the combination of silica (2 g) and Florisil (1 g) appeared as the better alternative for removing sample matrix interfering compounds, and providing high recoveries for all the target analytes and clean extracts that can be directly injected in the chromatograph. 3.1.3. Effect of the solvent on extraction efficiency Several elution solvents, such as acetonitrile, dichloromethane, acetone, hexane-acetone (50:50, v/v), hexane-dichloromethane (50:50, v/v) and different dichloromethane-methanol mixtures, were tested for extraction of the PAHs from the dispersed sewage sludge samples. 0 20 40 60 80 100 120 Pyr B[k]F B[a]P I[1,2,3-cd]P Recovery (%) ACN [19.5 ± 1.3] Hex-Ace [22.1 ± 1.3] DCM [12.4 ± 1.8] Ace [28.0 ± 1.8] Hex-DCM [11.7 ± 1.9] DCM-MeOH (95:5; v/v) [19.3 ± 0.8] DCM-MeOH (90:10; v/v) [36.0 ± 0.5] Fig. 3 Recoveries of some representative PAHs in spiked sewage sludge sample with different elution solvents, during the optimisation step. MSPD conditions were 500 µL of saturated methanolic potassium hydroxide solution as additive, 1 g of sand and 0.12 g of Oasis HLB as dispersant and 2 g silice and 1 g Florisil as clean-up layers. Solvent volume for elution 15 mL, except in DCM-MeOH (90:10, v/v) mixture with 10 mL. ACN, acetonitrile; Hex- Ace, hexane-acetone (50:50, v/v) mixture; DCM, dichloromethane; Ace, acetone; Hex-DCM, hexane-dichloromethane (50:50, v/v) mixture; DCM-MeOH (95:5, v/v), dichloromethanemethanol (95:5, v/v) mixture; DCM-MeOH (90:10, v/v), dichloromethane-methanol (90:10, v/v) mixture. Values in brackets correspond to residues (average (mg g-1 sample) ± standard deviation (n=3)) of spiked sewage sludge extracts. Data for triplicate extraction. As can be seen in Fig. 3, dichloromethane provided recoveries about 80% for almost all target compounds. The dichloromethane-methanol (95:5, v/v) Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 264 Table 6 Comparative data of the developed MSPD method with other procedures described in literature for the determination of PAHs in sewage sludge. MSPD proposed method 0.2 DCM-MeOH (9:1) 6 10 min Built inc HPLC-Flu 76-104d <6 0.0001-0.005 Low The 16 PAHs listed in the US Environmental Protection Agency (US EPA) priority list were considered on these papers. B[e]P was also included in MAE [13], while B[e]P and DB[al]P were including in this MSPD work. 27 PAHs were considered in MSPD [26] Tol, toluene; Hex, n-hexane; DCM, dichloromethane; MeOH, methanol; Hex-DCM (1:1), hexanedichloromethane (50:50, v/v) mixture; DCM-MeOH (9:1), dichloromethane-methanol (90:10, v/v) mixture; SPE, solid-phase extraction; GPC, gel permeation chromatography; HPLC-Flu, HPLC- fluorescence detection; GC-MS/MS, gas chromatographymass spectrometry/ mass spectrometry. a MSPD assisted by sonication; b Solvent consumption only in extraction stage; solvent consumption in clean-up and solvent exchanges not included; c The extraction and clean-up of samples were carried out in a single step; d Losses values associated with solvent evaporation processes were taken into account for recovery calculations; e Values calculated considering data provided by authors in the paper. MSPDa [26] 2 DCM 15 20 min SPE GC-MS 85-108 <11 0.0001-0.002 Low MAE [13] 0.2 Hex 10 23 min SPE HPLC-Flu 91-101 d <6 0.0002-0.01 Medium PLE [11] 2.5 Hex-DCM (1:1) 60 20 min SPE+GPC GC-MS/MS 60-93 <42 0.0001-0.002e Medium SFE [28] 1 CO2 (5% Tol) 11.5 40 min Not required HPLC-Flu 35-95 <20 0.04-5 Medium Sonication [12] 1 MeOH 50 25 min SPE HPLC-Flu 50-99 <17 0.0002-0.08 Low Soxhlet [11] 2.5 Hex-DCM (1:1) 150 18 h SPE+GPC GC-MS/MS 66-92 <17 0.0001-0.002 e Low Soxhlet [28] 1 Tol 80 8 h Not required HPLC-Flu 63-99 <22 0.05-5 Low Parameters Sample amount (g) Extraction solvent Solvent consumptionb (mL) Extraction time Clean-up Determination Extraction efficiency (%) Reproducibility (R.S.D. %) LOQ (µg g-1) Cost IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 265 Extraction and clean-up were carried out in a single step in the proposed MSPD method, while PLE involves multi step clean-up process, such as clean-up by SPE and GPC, and additional evaporation process. Sonication and MSPD assisted by sonication may be an interesting and cheap alternative technique but also requires clean-up of extracts by SPE. The Soxhlet extraction should not be ignored as it allows efficient extraction, using very cheap equipment. Its main drawbacks are, of course, the large solvent volumes used and the long extraction times required. Lower solvent consumption implies cost reduction, waste disposal and less exposure to solvent vapours. In summary, the optimised MSPD procedure appears to be an advantageous alternative when compared to the other extraction techniques. The main drawback is that experimental conditions should be carefully optimised in order to ensure efficient extraction but the proposed MSPD method provides quantification limits and extraction efficiencies similar to the other techniques, with the advantages of being faster and using low volumes of organic solvents. 3.4. Application to real sewage sludge samples The applicability of the proposed MSPD method was tested by the determination of PAHs in five sewage sludge samples (S1-S5), differing in the type of wastewater and the applied treatment technology. It is interesting to note that all samples were processed by an alternative technique (MAE) [13] and there was good agreement between MAE measurements and MSPD evaluated concentrations. As can be seen in Table 7, PAHs were detected in all of the samples. Total concentrations for the PAHs analysed between 1.1 and 10.3 mg kg-1 (dm, dry mass basis) were found in sewage sludge samples. It should be stressed that the value of 10.3 mg kg–1 appeared only in the sewage sludge sample coming from the interlaboratory exercises. Remaining sludge samples exhibit contents of the PAHs not exceeding 8.1 mg kg-1 (sum of the 17 PAHs considered in this study). The PAHs concentrations obtained in this study are similar to those found in literature [26,29]. Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 266 Table 7 Concentration of PAHs found in different sewage sludge samples by MSPD procedure. Compound S1 S2 S3 S4 S5 Naph 0.1  5.3 0.2  0.2 0.1  1.7 0.3  2.3 0.4  0.2 Ace 0.03  3.1 n.d n.d 0.2  0.7 n.d Flu 0.1  0.3 0.3  0.05 0.1  3.9 0.5  0.7 0.1  3.8 Phe 0.8  0.7 1.1  1.6 0.2  2.7 3.9  3.6 0.4  0.8 Anth 0.04  0.7 0.1  5.3 0.01  2.6 0.2  0.7 0.02  5.4 Flt 0.7  2.6 1.8  2.4 0.2  2.3 1.0  0.6 0.3  2.2 Py r 0.6  3.8 1.6  1.3 0.2  0.9 1.1  4.3 0.2  5.7 B[a]A 0.1  1.7 0.4  11.4 0.02  1.6 0.1  1.4 0.03  0.3 Chry 0.3  1.2 1.2  0.6 n.d n.d n.d B[e]P 0.2  1.6 1.0  5.5 0.1  0.6 0.6  1.4 0.1  1.5 B[b]F 0.1  0.2 0.8  9.9 0.04  5.1 0.1  1.3 0.1  2.9 B[k]F 0.1  0.2 0.3  11.8 0.01  0.8 0.03  3.9 0.01  4.0 B[a]P 0.1  0.2 0.5  11.4 0.03  1.2 0.05  5.8 0.03  2.1 DB[a,l]P n.d n.d n.d n.d n.d DB[a,h]A 0.02  2.8 0.2  15.5 0.002  8.7 n.d n.d B[g,h,i]P 0.1  1.3 0.6  1.6 0.1  0.3 0.1  4.4 0.04  1.0 I[1,2,3-cd]P 0.1  0.5 0.5  5.7 0.02  1.2 0.05  0.5 0.02  6.6  PAHs 3.5 10.3 1.1 8.1 1.7 Average (µg g –1)  relative standard deviation (R.S.D. %); concentrations on dry weight basis; n=3 replicates per sample; n.d, no detected;  PAHs, sum of 17 PAHs considered in this study. Regarding the contribution of each individual PAHs, the highest concentration was found for Phe, Flt and Pyr. The most toxic of all PAHs, B[a]P, was also found with concentrations that varied beetwen 0.03 and 0.5 µg g-1. High concentrations of Phe and Pyr could be explained because the sewage water received in WWTP is mainly of domestic origin. Charbroiling of meat accounts for a major source of these compound together with Anth and Flt, in households. B[ghi]P together with Chry and I[1,2,3-cd]P are compounds whose source can been attributed principally to pyrolitic process, probably arising from urban traffic [30]. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 267 4. CONCLUSIONS An analytical methodology for the determination of PAHs in sewage sludge was developed. The results showed good performance of the analytical protocol. Quantification limits achieved by the method allow the application of the procedure below the levels imposed by existing regulations. Recoveries using MSPD extraction were in all cases satisfactory, offering good agreement with the certified values and also comparable with the results obtained using MAE. The proposed procedure offers significant saving of reagents and time compared to other techniques used being capable of providing a rapid isolation of the target analytes as was demonstrated by processing real samples, a reference material and a certified reference material. In summary, this method constitutes a significant advance in simplicity and efficiency, which makes it possible to screen many samples and can be used for routine monitoring, including routine quality control of sewage sludge to be used on agricultural landfilling according to the future European Union sludge directive, characterizations of contaminated sites and monitoring of remedial processes. Acknowledgements This research was financially supported by the Spanish Ministry of Education and Science (project CTQ2006-03334/BQU), E.U. FEDER funding and the Xunta de Galicia (project PGIDIT06PXIB237039PR). T. Pena gratefully acknowledges her doctoral FPI grant from the Spanish Ministry of Education and Science. REFERENCES [1] E.Z. Harrison, S.R. Oakes, M. Hysell, A. Hay, Sci. Total Environ., 367 (2006) 481. [2] L. Bontoux, M. Vega, D. Papameletiou, Urban wastewater treatment in Europe: what about the sludge?, IPTS Report, 23 (1998) 5. [3] E. Abad, K. Martínez, C. Planas, O. Palacios, J. Caixach, J. Rivera, Chemosphere, 61 (2005) 1358. Anal. Chim. Acta 626 (2008) 155 268 [4] H.R. Rogers, Sci. Total Environ., 185 (1996) 3. [5] E. Manoli, C. Samara, J. Environ. Qual., 28 (1999) 176. [6] P.E.T. Douben, PAH: An Ecological Perspective, Willey, New York, 2003. [7] K.E.C. Smith, M. Green, G.O. Thomas K.C. Jones, Environ. Sci. Technol., 35 (2001) 2141. [8] R.G. Harvey, Polycyclic aromatic hydrocarbons, Wiley-VCH, New York 1996. [9] C.A. Menzie, B.B. Potocki J. Santodonato, Environ. Sci. Technol.,26 (1992) 1278. 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DESARROLLO DE UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE LODO MEDIANTE EXTRACCIÓN SELECTIVA CON LÍQUIDOS PRESURIZADOS Publicación V DEVELOPMENT OF A SAMPLE PREPARATION PROCEDURE OF SEWAGE SLUDGE SAMPLES FOR THE DETERMINATION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS BASED ON SELECTIVE PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 Doi:10.1016/j.chroma.2009.11.081 IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 273 DEVELOPMENT OF A SAMPLE PREPARATION PROCEDURE OF SEWAGE SLUDGE SAMPLES FOR THE DETERMINATION OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS BASED ON SELECTIVE PRESSURIZED LIQUID EXTRACTION Mª Teresa Pena, Mª Carmen Casais, Mª Carmen Mejuto, R. Cela Dpto. Química Analítica, Nutrición y Bromatología. Instituto de Investigación y Análisis Alimentario, Universidad de Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain Abstract An automated, simple and sensitive method based on selective pressurized liquid extraction (SPLE) was developed for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in sewage sludge samples. The new sample preparation procedure consists of on-line clean-up by inclusion of sorbents in the extraction cell, and combines elevated temperatures and pressures with liquid solvents to achieve fast and efficient removal of target analytes from complex sewage sludge matrices. The effects of various operational parameters (e.g. sample pretreatment, extraction solvent, temperature, pressure, static time, etc.) on the performance of SPLE procedure were carefully investigated, obtaining the best results when SPLE conditions were fixed at 140 ºC, 1500 psi, static time of 5 min and n-hexane as extraction solvent. A new programmed temperature vaporization-gas chromatography-tandem mass spectrometry method based on large volume injection (PTV-LVI-GC-MS/MS) was also developed and analytical determinations were performed by high performance liquid chromatography coupled with fluorescence detection and GC-MS/MS. The extraction yields for the different compounds obtained by SPLE ranged from 84.8% to 106.6%. Quantification limits obtained for all of these studied compounds (between 0.0001 and 0.005 µg g-1, dry mass) were well below the regulatory limits for all compounds considered. To test the accuracy of the SPLE technique, the optimized methodology was applied to the analysis of a certified reference material (sewage sludge (BCR088)) and a reference material (sewage sludge (RTC-CNS312-04)), with excellent results. Keywords: Polycyclic aromatic hydrocarbons; Sewage sludge analysis; Selective pressurized liquid extraction; Liquid chromatography; Gas chromatography J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 280 Obviously, the solvent change stage was not necessary to GC-MS/MS analysis. Therefore, 1 mL of SPLE extract was directly filtered through a 0.22 µm Durapore filter and 25 µL was injected into the GC-MS/MS system. 2.4. Instrumental analysis 2.4.1. HPLC-fluorescence detection analysis HPLC chromatographic separations were developed in a system comprising a 600E pump with a gradient controller (Waters, Milford, MA, USA) and a fluorescence detector (Flu) (HP Series 1100, Agilent, Waldbrom, Germany).The injector (Rheodyne Model 7725i, Cotati, CA, USA) was fitted with a 20 µL loop. Analytical column temperatures were controlled with a MetaTherm 9540 oven, (MetaChem, Torrance, CA, USA). The analytical column was a 250 mm x 4.6 mm I.D. Waters PAH C18 column, (particle size 5 µm). A Waters guard-pak, with Nova- Pak C18 inserts, was used to protect the analytical column (both purchased from Waters). Agilent Chemstation Software (Rev. A. 06.03 [509]) was used for data acquisition. A binary solvent system made of ACN and water was used for chromatographic separations at 1.5 mL min-1. The gradient elution program was as follows: initial conditions, 50% ACN for 3 min, then a linear ramp to 100% ACN within 17 min and holding at 100% for 8 min. The column temperature was set at 35 ºC. Detection was performed at selected fluorescence wavelength programming to obtain the better sensitivity and minimal interference. The excitation/emission wavelengths pairs (nm) were set as follows: 267/330 for Naph; 275/315 for Ace and Flu; 247/357 for Phe; 238/418 for Anth, Flt and Pyr; 286/410 for B[a]A, Chry and 5-MC; 294/425 for B[e]P, B[b]F, B[k]F, B[a]P, DB[al]P, DB[ah]A and B[ghi]P; and 245/500 for I[1,2,3-cd]P. 2.4.2. PTV-LVI-GC-MS/MS analysis In order to validate the developed analytical methodology and for comparative purposes, some sewage sludge samples were also analyzed by GCMS/MS method, using LVI. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 281 The PTV-LVI-GC-MS/MS analysis was performed using a Varian 450-GC gas chromatography (Varian Chromatography Systems, Walnut Creek, CA, USA) coupled to an ion trap mass spectrometer Varian 240-MS with a waveboard for multiple MS (MSn) analysis operating in the external trap mode. The chromatograph was equipped with an automatic injector CP-8400 autosampler and a 1079 programmed temperature vaporization (PTV) injector (both from Varian) with a split liner with frit (3.4 mm x 5.0 mm x 54mm, Siltek deactivated) (Restek, Bellefonte, PA, USA). The system was operated by Varian MS Workstation v6.9.1 software. Separation was carried out on a J&W HP-5MS capillary column (30m x 0.25mm I.D., 0.25 µm film thickness) from Agilent Technologies (Palo Alto, CA, USA). Helium (purity 99.999%; Carburos Metálicos, A Coruña, Spain) was employed as carrier gas at a constant column flow of 1.5 mL min-1. The GC oven temperature was programmed from 60 ºC (held 3 min) to 230 ºC at 15 ºC min-1; then, ramped to 250 ºC min-1 at 10 ºC min-1, increased at a rate of 3 ºC min-1 up to 280 ºC (held 3 min) and finally increased to 300 ºC at 3 ºC min-1 (held 2 min). The total running time was 38 min. Aliquots of 25 µL of sample extract were injected into the GC system operating at a syringe injection flow rate of 20 µL s-1. The initial injector temperature of 60 ºC was held for 0.3 min and then increased at 100 ºC min-1 to 300 ºC (held 25 min). The injector split ratio was initially set at 20:1. The splitless mode was switched on from 0.3 to 3 min. At 3 min, the split ratio was set at 50:1 and reduced to 20:1 at 10 min. Cryogenic cooling with CO2 was applied when the injector temperature was 280 ºC in order to reach the initial injector temperature as fast as possible before continuing with the next injection. The ion trap mass spectrometer was operated in the electron impact (EI) ionization positive mode (+70eV) using an external ionization configuration. The trap, manifold and transfer line temperatures were maintained at 220, 40 and 300 ºC, respectively. General parameters were as follows: filament/multiplier delay, 6.5 min; multiplier offset +200 V, filament emission current 90 µA, automatic gain control target value 5000 counts, and collision induced dissociation (CID) waveform, resonant. Specific conditions for each target compound are listed in Table 2. The target analytes were identified by retention times and EI-MS/MS libraries of standards. J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 282 Table 2 Selected MS/MS experimental parameters and retention times of target compounds. Compound Retention time (min) Parent ion (m/z) Excitation storage level (V) Excitation amplitude (V) Quantification ion (m/z) Naph 7.72 128 48.8 1.4 102 Acy 10.32 152 57.9 2.0 150 Ace 10.60 153 58.3 1.2 152 Flu 11.46 166 63.3 1.2 165 Phe 13.01 178 67.8 1.7 176 Anth 13.09 178 67.8 1.7 176 Flt 14.96 202 77.0 2.8 200 Py r 15.36 202 77.0 2.8 200 B[a]A 17.92 228 86.9 2.5 226 Chry 18.01 228 86.9 2.5 226 B[b]F 21.29 252 96.0 3.7 250 B[k]F 21.38 252 96.0 3.7 250 B[e]P 22.29 252 105.2 3.4 250 B[a]P 22.48 252 105.2 3.4 250 I[1,2,3-cd]P 27.01 276 105.2 4.3 274 DB[ah]A 27.18 278 105.9 3.8 276 B[ghi]P 28.18 276 105.2 4.3 274 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. PTV-LVI-GC-MS/MS optimization Optimization of the chromatographic conditions was accomplished using a standard mixture solution of all target compounds in n-hexane. Firstly, different oven programs were tested in order to obtain a suitable separation of the studied PAHs. The injector program was based on a previously reported PTV-LVI-GC-MS/MS methodology [32] for analysis of PAHs in water but parameters such as injector heating rate and injection volume were evaluated to obtain good sensitivity and improve the peak shapes. In order to investigate the influence of the heating rate, a standard mixture of PAHs was repeatedly injected, using different injector programs. The initial temperature (60ºC) was increased to 300 ºC at 70 ºC min-1, 100 ºC min-1 and 180 ºC min-1. All studied compounds showed better responses at higher heating rates, IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 283 the influence of the heating rate being more pronounced for less volatile PAHs. The PAHs responses decreased slightly at 100 ºC min-1 whereas an important decreasing of the signal was observed at 70 ºC min-1. The opposite effect was observed in the peak shapes, obtaining a deterioration of peak shape (mainly for more volatile compounds) by increasing the heating rate at 180 ºC min-1. Therefore, 100 ºC min-1 was chosen as the optimum injector heating rate in order to avoid peak distortion while obtaining high responses for the target compounds. The effect of injection volume was also investigated. Different injection volumes (7, 14, 25, 50 and 70 µL) were tested to obtain the higher sensitivity without deterioration of peak shape. The experimental results showed that the sensitivity was increased with increasing the injection volume from 7 to 25 µL while keeping good shape of peaks. However, distorted and/or double peak were observed when the injection volumes were increased to 50 and 75 µL. Consequently, an injection volume of 25 µL was established. The MS/MS detection mode was chosen and the conditions were carefully optimized to improve the selectivity and sensitivity of PAH determinations. A parent ion was chosen for each compound by taking into account their m/z and their relative abundance (both as high as possible) in order to increase sensitivity. The optimization of the excitation amplitude voltage for each PAH was carried out using the automated method development option included in the MS/MS software tool kit. The optimum valued for this parameter was reached when the secondary spectrum showed multiple and intense product ions while the parent ion intensity remained at around 10%. The effect the CID amplitude was studied in the resonant and nonresonant modes for every compound. Poor fragmentation was obtained in nonresonant mode and the resonant waveform type was required for obtaining a suitable dissociation of the PAHs. Optimized MS/MS conditions for each target compound are detailed in Table 2. 3.2. Optimization of conditions for SPLE To achieve fast and efficient extraction of analytes from solid matrices using PLE, proper operational parameters (sample preparation, temperature, pressure, extraction time, number of cycles and flush volume) and an appropriate extraction solvent or mixture solvents, with polarities closely matching that of the target compounds, should be selected. Thus, the effect of the different extraction J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 284 parameters on the extraction efficiency was evaluated to obtain optimal extraction conditions for PAHs from sewage sludge samples. 3.2.1. Sample treatment optimization Sample preparation is an essential part of every solvent-based extraction procedure. While many sample types can be efficiently extracted without any pretreatment, other samples require some manipulation for an efficient extraction to occur. The effect of sample matrix depends on sample composition. Solid environmental samples, such as sewage sludge, sediments or soils, can differ significantly in their physical-chemical properties, type of compounds present or particles size. These parameters affect the sorption and retention of analytes [21]. On the other hand, the complexity of an analytical procedure increases with the number of organic compounds present in the sample. Thus, sewage sludge is often regarded as one of the worst environmental matrices to extract as it can contain high concentrations of organic chemicals and their degradation products as well as high amounts of organic matter. In order to solubilize the analytes during the extraction, proper conditions should be used to overcome the interactions between the organic fraction and target compounds. This often results in dirty extracts that present large concentrations of co-extracted substances and require extensive clean-up steps before the final analysis. In-depth clean-up of extracts prior to chromatographic analysis can be avoided by performing an in situ clean-up step by adding certain sorbents to the PLE cells. In this way, lipids and other coextractable materials are prevented from coming out to the extract. To the best of our knowledge, the application of PLE with in-cell clean-up to the determination of PAHs in sewage sludge has only been reported by Trably et al. [8]. This method involves the extraction of 14 PAHs at 120 ºC using a hexaneacetone (50:50, v/v) mixture as extraction solvent and 1 g of alumina as clean-up sorbent inside cell. The first extraction assays were carried out using the previously reported PLE with in-cell clean-up method [8] but dark-coloured extracts resulted with high residues after solvent evaporation (Table 3). Therefore, the sample extracts were not clean enough for direct injection in the chromatographic systems (HPLC-Flu and GC-MS/MS). IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 285 Unsatisfactory results obtained in preliminary assays suggested that very complex sewage sludge samples can require some treatment before extraction by PLE. In some applications, the sample is mixed and dispersed with solid sorbents before loading it in the PLE cell. De la Cal et al. [33] described a SPLE method for the analysis of polybrominated diphenyl ethers congeners in sediment samples. Spiked samples were ground with alumina and cooper (1:2:2) and the mixture was loaded into the extraction cell on top of alumina. Later Losada et al. [34] reported a SPLE method for polybrominated diphenyl ethers in fish. The sample was mixed with Na2SO4 at a fish Na2SO4 ratio of 1:20 in a mortar until a homogeneous mixture was obtained. The mixture was loaded into the cell on top of 20 g of Florisil. Consequently, a second series of experiments were performed including a sample dispersion stage. Although the dispersion and the clean-up sorbents were adapted from an optimized MSPD procedure for sewage sludge, developed in our laboratory [16], a series of experiments were carried out to assess the effect of additive (KOH (MeOH) sat.) and Na2SO4 on the yield and selectivity of the PLE process. Previous studies showed that these parameters were important in terms of minimizing extract residues and maximizing recoveries of PAHs [14, 16]. Therefore, different volumes of additive (0, 0.5, 1, 1.5 mL) as well as amounts of Na2SO4 (0.5, 1, 1.5 and 2 g) were tested to achieve the optimal conditions. The obtained results were in good agreement with those obtained in the previous studies. As expected, the alkali treatment has a strong positive effect. Recoveries increased and the residue amounts decreased as the amount of alkali increased (Table 3). The recoveries obtained with 0.5 mL of KOH (MeOH) sat. were on average 10-40% lower than with 1 mL of additive. With regard to the amount of Na2SO4, it is interesting to mention that it is closely related with the amount of additive. As can be seen in Table 3, 0.5 g of Na2SO4 was enough to provide good recoveries when 1 mL of alkali was added in the blending stage. However, an increasing of alkali to 1.5 mL required 1.5 g of Na2SO4 to achieve good results in terms of recovery. In summary, the sample preparation was demonstrated be a critical step in the determination of PAHs from complex matrices. The sample treatment enhances the yield of extraction and provides the additional advantage of decreasing the amount of co-extracted substances, producing directly analysable extracts by HPLC-Flu and GC-MS/MS. Therefore, the sample was dispersed in a glass mortar by using 1 mL of KOH (MeOH) sat. as additive and 1 g of Florisil and 0.5 g of Na2SO4. Two filters and a layer of sand were placed at the end of the PLE cell. Then, the J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 286 clean-up sorbents (1 g of Florisil followed by 2 g of silica) were introduced into the cell, followed by the dispersed sample. Finally, the remaining free space of the cell was filled up with sand to minimize cell void volume. These conditions were employed in all subsequent experiments. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 287 Table 3 Amount of residue in sewage sludge extracts and values of recovery of analytes obtained by different SPLE conditions. Recoveries (%)d 97 [16]e 78 95 98 84 78 88 96 99 82 [8] 99 [16]e 88 83 70 73 84 79 99 0.2 g of sample. Data for three replicates. Flo, Florisil; Na2SO4, anhydrous sodium sulphate; KOH, saturated methanolic potassium hydroxide solution; MeOH, methanol; DCM-MeOH, dichloromethane-methanol (90:10, v/v) mixture; Hex, n-hexane; Hex-Ace, hexane-acetone (50:50, v/v) mixture; (---) not employed. a Amounts of solvent or saturated methanolic potassium hydroxide solution added in the blending step. b Remaining PLE operational parameters were in all experiments 1500 psi, 1 static cycle of 5 min and 60 s of purge. c Average (mg g-1 sample) of three determinations ± standard deviation. d Average of PAHs recoveries, calculated considering values obtained with MSPD procedure [16]. e Recoveries calculated considering values obtained with MAE procedure [14]. f Cell, 1 g alumina followed by 0.5 g of sample and 1.5 g of diatomaceous earth; PLE conditions, 1500 psi, 2 cycles of 5 min and 60 s of purge. Results Residue (mg g-1)c 22 ± 1 13 ± 3 16 ± 3 18 ± 2 29 ± 1 40 ± 2 32 ± 3 26 ± 1 27 ± 1 79 ± 5 20 ± 1 21 ± 1 22 ± 1 20 ± 2 22 ± 1 24 ± 1 23 ± 1 24 ± 1 PLE conditionsb Tª, flush volume --- 100 ºC, 50% 100 ºC, 50% 120 ºC, 50% 120 ºC, 50% 100 ºC, 50% 100 ºC, 50% 100 ºC, 50% 120 ºC, 50% 120 ºC, 60%f --- 120 ºC, 70% 120 ºC, 70% 120 ºC, 70% 120 ºC, 70% 120 ºC, 70% 120 ºC, 70% 140 ºC, 100% Extraction solvent DCM-MeOH Hex Hex Hex Hex Hex-Ace Hex-Ace Hex-Ace Hex-Ace Hex-Ace DCM-MeOH Hex Hex Hex Hex Hex Hex Hex Sample treatment conditions Type of additivea 1 mL KOH 0.5 mL KOH 1 mL KOH 1 mL KOH 1 mL MeOH --- 0.5 mL KOH 1 mL KOH 1 mL KOH --- 1 mL KOH 1 mL KOH 1 mL KOH 1.5 mL KOH 1.5 mL KOH 1.5 mL KOH 1.5 mL KOH 1 mL KOH Dispersant 1 g Flo + 0.5 g Na2SO4 --- 1 g Flo + 0.5 g Na2SO4 1 g Flo + 0.5 g Na2SO4 1 g Flo + 1 g Na2SO4 1 g Flo + 0.75 g Na2SO4 1 g Flo + 1 g Na2SO4 1 g Flo + 1.5 g Na2SO4 1 g Flo + 2 g Na2SO4 1 g Flo + 0.5 g Na2SO4 Sample Pooled sample BCR088 J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 288 3.2.2. Solvent extraction choice Optimization of the extraction process generally begins with an appropriate choice of the extraction solvent. The extraction of solid environmental samples, which consist of complex mixtures of different species at different concentration levels, is a complicated task. At elevated temperature and pressure, the extraction process proceeds faster, but the selectivity decreases, because the analytes are not the only compounds solubilized. Therefore, the extraction solvent must be able to solubilize the analytes of interest, minimizing the co-extraction of other matrix components. Consequently, the polarity of the extraction solvent should closely match that of the target compounds. It is also important to take into account the compatibility with the later treatment steps as well as the volatility of solvent if extract concentration is necessary. In this study, extraction solvents were chosen on the basis of those employed in previously reported methodologies for the determination of PAHs from environmental matrices (sewage sludge and soil) [14, 16, 35]. Thus, a series of experiments were performed in order to evaluate the extraction capability of nhexane, a hexane-acetone (50:50, v/v) mixture and a dichloromethane-methanol (95:5, v/v) mixture. As can be seen in Fig. 1, the dichloromethane-methanol (95:5, v/v) mixture provided better recovery values than n-hexane and hexane-acetone (50:50, v/v). However, this mixture provided extra interferences, as evidenced by yellow extracts with larger residue obtained after solvent evaporation. Experimental data did not show significant differences between n-hexane and the hexaneacetone (50:50, v/v) mixture in terms of recovery. However, lower sample matrix residues were found when n-hexane was used as extraction solvent; therefore, nhexane was chosen and used in further experiments. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 289 Recovery (%) 0 20 40 60 80 100 120 Phe Flt Pyr B[e]P Hex [13.1 ±2.6] Hex-Ace [31.6 ±2.8] DCM-MeOH [62.3 ±9.1] Fig. 1 Recoveries of some representative PAHs in pooled sewage sludge sample with different extraction solvents, during the optimization step. PLE conditions were 100 ºC, one cycle of 5 min. and 50% of flush volume. Hex, n-hexane; Hex-Ace, hexane-acetone (50:50, v/v) mixture, DCM-MeOH, dichloromethane-methanol (95:5, v/v) mixture. Values in brackets correspond to residues (average (mg g-1 sample) ± standard deviation (n=3)) of pooled sewage sludge extracts. Data for triplicate extraction. 3.2.3. Optimization of SPLE parameters Once the sample treatment conditions and the solvent extraction were established, initial experiments were carried out in order to evaluate the effect of the pressure on the extraction efficiency of SPLE. The application of high pressure allows maintain the solvent in the liquid state while above their atmospheric boiling points. Furthermore, the use of high pressures facilitates extraction of analytes that have been trapped in matrix pores since the pressure forces the solvent into areas of the matrices that would not normally be contacted by solvent using atmospheric conditions [20, 21]. Pooled sample of sewage sludge was extracted at 1500 and 1700 psi. The obtained results showed that an increase in the extraction pressure had no significant improvement in the extraction efficiencies, data not shown. In agreement with previously published results [20, 28] for PLE, pressure was found to play no role other than to keep the extraction solvent liquid at the high temperatures used. Therefore, an extraction pressure of 1500 psi was chosen and used in further experiments. The purge time controls the period during which nitrogen is passing through the stainless steel cell to sweep away all the solvent wetting the sample and the cell filling, at the end of the static extraction cycle. Purge time was set at default J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 296 Time (min) 0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 30 Fluorescence intensity 1 3 4 5 6 7 8 9 10 12 13 14 15 17 18 19 (a) Time (min) 16 kCounts 8101214 0 100 200 300 400 500 600 700 1 2 3 4 5 6 78 Ion: 102+150+152+165+176+200 m/z 17.5 20.0 22.5 25.0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 kCounts 15.0 9 10 13 14 12 15 Ion: 226+250 m/z 25 26 27 28 29 30 31 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 kCounts 19 17 18 Ion: 274+276 m/z (b) 5 6 13 14 12 15 Fig. 4 Chromatograms obtained by (a) HPLC-Flu and (b) PTV-LVI-GC-MS/MS, corresponding to reference material (RTC-CNS312-04) extracts. Peak assignments as in Fig. 3. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 297 Table 5 Measured concentrations and confidence intervals vs. certified and reference values in BCR088 and RTC-CNS312-04. RTC-CNS312-04 Measured (µg g-1) X ± 2SD (n=4) PTV-LVI-GC-MS/MS 2.94 ± 0.44 2.50 ± 0.63 3.29 ± 0.67 2.27 ± 0.25 0.56 ± 0.03 1.57 ± 0.36 3.94 ± 0.33 4.56 ± 0.14 1.53 ± 0.26 1.17 ± 0.12 0.25 ± 0.06 0.60 ± 0.01 0.77 ± 0.03 0.43 ± 0.05 0.69 ± 0.07 0.43 ± 0.01 Concentrations in dry weight basis. a Acy was not analyzed by HPLC-Flu Measured (µg g-1) X ± 2SD (n=7) HPLC-Flu 3.10 ± 0.39 3.42 ± 0.36 2.31 ± 0.06 0.56 ± 0.07 1.89 ± 0.09 4.66 ± 0.15 4.43 ± 0.73 1.45 ± 0.20 1.22 ± 0.11 0.28 ± 0.03 0.68 ± 0.07 0.90 ± 0.09 0.44 ± 0.02 0.79 ± 0.09 0.55 ± 0.04 Reference values (µg g-1) 2.58 ± 0.53 2.42 ± 0.53 2.99 ± 0.46 2.01 ± 0.32 0.46 ± 0.11 1.67 ± 0.27 4.19 ± 0.57 4.17 ± 0.51 1.45 ± 0.18 1.12 ± 0.15 0.24 ± 0.05 0.68 ± 0.09 0.87 ± 0.12 0.41 ± 0.07 0.84 ± 0.17 0.54 ± 0.12 BCR088 Measured (µg g-1) X ± 2SD (n=4) PTV-LVI-GC-MS/MS 2.12 ± 0.10 0.91 ± 0.14 1.04 ± 0.11 1.21 ± 0.09 0.55 ± 0.01 0.84 ± 0.08 0.85 ± 0.11 Measured (µg g-1) X ± 2SD (n=7) HPLC-Flu 2.09 ± 0.14 0.86 ± 0.06 1.11 ± 0.09 1.12 ± 0.11 0.53 ± 0.04 0.86 ± 0.07 0.81 ± 0.05 Certified values (µg g-1) 2.16 ± 0.09 0.93 ± 0.09 1.02 ± 0.07 1.17 ± 0.08 0.57 ± 0.05 0.91 ± 0.09 0.81 ± 0.06 Compound Naph Acya Ace Flu Phe Anth Flt Pyr B[a]A Chry B[e]P B[b]F B[k]F B[a]P DB[ah]A B[ghi]P I[1,2,3-cd]P J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 298 The applicability of the proposed SPLE method was tested by determination of PAHs in several sewage sludge samples. All samples were also processed by two alternative techniques using MAE [14] and MSPD [16], with good agreement between the sample preparation techniques. Total concentrations between 1.1 and 479.6 µg g-1 were found in sewage sludge samples. As can be seen in Table 6, two samples (S5 and S6, coming from highly industrialized areas) exhibited high contents of PAHs, exceeding the EU legal limit for the sum of selected PAHs. The PAHs levels in the remaining samples were below the maximum allowed concentrations. Table 6 Concentration of PAHs found in different sewage sludge samples by PLEHPLC-Flu. Compound S1 S2 S3 S4 S5 S6 Naph 0.15 ± 0.8 --- 0.3 ± 2.7 4.2 ± 2.9 7.6 ± 4.1 90.7 ± 3.1 Ace n.d 0.2 ± 0.5 n.d 0.5 ± 5.5 0.8 ± 2.4 17.6 ± 4.6 Flu 0.05 ± 8.7 0.4 ± 6.8 0.09 ± 2.6 0.4 ± 0.9 2.2 ± 6.1 43.1 ± 4.0 Phe 0.25 ± 6.1 4.1 ± 0.9 0.5 ± 3.6 1.8 ± 6.2 14.9 ± 3.4 207.0 ± 6.3 Anth 0.01 ± 2.9 0.2 ± 4.6 0.02 ± 3.0 0.1 ± 3.7 0.5 ± 5.1 3.9 ± 7.8 Flt 0.20 ± 7.4 n.d 0.3 ± 0.7 0.7 ± 1.9 7.2 ± 3.9 87.2 ± 4.8 Pyr 0.20 ± 8.4 1.1 ± 1.3 0.2 ± 1.6 0.4 ± 0.6 4.3 ± 4.0 29.8 ± 4.9 B[a]A 0.02 ± 2.5 0.1 ± 1.1 0.03 ± 2.1 0.04 ± 3.0 0.1 ± 1.8 0.3 ± 5.2 Chry n.d n.d n.d n.d n.d n.d 5-MC n.d n.d n.d n.d n.d n.d B[e]P 0.08 ± 4.0 0.6 ± 1.1 0.1 ± 11.5 n.d n.d n.d B[b]F 0.04 ± 2.5 0.1 ± 1.7 0.05 ± 2.2 0.1 ± 4.0 n.d n.d B[k]F 0.01 ± 6.7 0.03 ± 11.0 0.02 ± 7.1 0.03 ± 6.8 n.d n.d B[a]P 0.03 ±4.0 0.1 ± 9.6 0.03 ± 5.4 0.03 ± 8.6 n.d n.d DB[al]P n.d n.d n.d n.d n.d n.d DB[ah]A 0.003 ± 2.5 n.d n.d n.d n.d n.d B[ghi]P 0.05 ± 4.1 0.1 ± 4.2 0.04 ± 2.8 0.04 ± 4.2 n.d n.d I[1,2,3-cd]P 0.02 ± 1.9 0.05 ± 3.5 0.03 ± 1.9 0.03 ± 5.6 n.d n.d ∑PAHs leg 0.9 6.0 1.3 4.0 29.3 384.6 ∑PAHs 1.1 7.1 1.8 8.4 37.5 479.6 Average (µg g-1) ± relative standard deviation (RSD, %); concentration on dry weight basis; n=3 replicates per sample; n.d., not detected; (-), not available; ΣPAHs leg, sum of PAHs considered in EU legislation; ΣPAHs, sum of PAHs considered in this study. The optimized SPLE procedure appears to be an advantageous alternative, being fast (one single static cycle of 5 min is employed) and simple, avoiding use of IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 299 chlorinated solvents, using low volumes of organic solvents and requiring small amounts of sample. 4. CONCLUSIONS A new SPLE process has been developed and validated for the first time for the determination of 19 PAHs in complex sewage sludge matrices. Extraction conditions were carefully selected to achieve maximal recovery of PAHs contained in sewage sludge while eliminating most of the interfering matrix components. Sample treatment combined with the use of solid sorbents in the extraction cell allowed obtaining a directly analyzable extract. Another advantage of the proposed methodology is that most of the steps involved in the sample preparation procedure are performed automatically and up to 24 samples can be processed sequentially and unattended. Combining the efficiency with the automation of PLE significant improvements in the PAHs analysis throughput can be attained. A PTV injection method was optimized for the GC-MS/MS analysis of PAHs. PTV injections offers the possibility of introducing large volumes of sample into the GC system, which improves the sensitivity, detection and quantification limits with respect to those obtained by conventional split/splitless injection. Thus, sewage sludge extracts obtained using the developed SPLE procedure were successfully analyzed by the optimized PTV-LVI-GC-MS/MS method and HPLC-Flu. In summary, the developed methodology shows good performance, providing good recoveries for all studied compounds and allows the determination of PAHs in the low “microgram per kilogram” range in a reproducible and simple way. The proposed methodology appears to be a sensitive, selective and reliable analytical method, suitable to high throughput monitoring the PAHs concentrations in sewage sludge as established by the EU Regulations. Acknowledgements This research was financially supported by the Spanish Ministry of Education and Science (project CTQ2006-03334/BQU), E.U. FEDER funding and the Xunta de Galicia (project PGIDIT06PXIB237039PR). T. Pena gratefully acknowledges her FPI contract from the Spanish Ministry of Education and Science. J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 300 REFERENCES [1] L. Bontoux, M. Vega, D. Papameletiou, 1998. Urban wastewater treatment in Europe: what about the sludge? IPTS Report, pp. 5-14. [2] I. Aparicio, J.L. Santos, E. Alonso, Waste Manage. 29 (2009) 1747. [3] E. Erikson, N. Christensen, J.E. Schmidt, A. Ledin, Desalination 226 (2008) 371. [4] E.Z. Harrison, S.R. Oakes, M. Hysell, A. Hay, Sci. Total Environ. 367 (2006) 481. [5] R. Duarte-Davidson, K.C. 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RESULTADOS Y DISCUSIÓN 301 [17] C. Miège, J. Dugay, M.C. Hennion, J. Chromatogr. A 995 (2003) 87. [18] P. Oleszczuk, S. Baran, J. Hazard. Mat. B 113 (2004) 237. [19] C. Miège, M. Bouzige, S. Nicol, J. Dugay, V. Pichon, M.C. Hennion, J. Chromatogr. A 859 (1999) 29. [20] B.E. Richter, B.A. Jones, J.L. Ezzel, N.L. Porter, Anal. Chem. 68 (1996) 1033. [21] H. Giergielewicz-Mozajska, L. Dabrowski, J. Namiesnik, Crit. Rev. Anal. Chem. 31 (2001) 149. [22] M.M. Schantz, Anal. Bioanal. Chem. 386 (2006) 1043. [23] P. Canosa, D. Pérez-Palacios, A. Garrido-López, M.T. Tena, I. Rodríguez, E. Rubí, R. Cela, J. Chromatogr. A 1161 (2007) 105. [24] M. García-López, I. Rodríguez, R. Cela, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6986. [25] J. Radjenovic, A. Jelic, M. Petrovic, D. Barceló, Anal. Bioanal. Chem. 393 (2009) 1685. [26] W. Wang, B. Meng, X. Lu, Y. Liu, S. Tao, Anal. Chim. Acta 602 (2007) 211. [27] V. Fernández-González, E. Concha-Graña, S. Muniategui-Lorenzo, P. López- Mahía, D. Prada-Rodríguez, J. Chromatogr. A 1196-1197 (2008) 65. [28] N. Alexandrou, M. Smith, R. Park, K. Lumb, K. Brice, Intern. J. Environ. Anal. Chem. 81 (2001) 257. [29] N. Ratola, S. Lacorte, A. Alves, D. Barceló, J. Chromatogr. A 1114 (2006) 198. [30] V. Yusà, O. Pardo, P. Martí, A. Pastor, Food Addit. Contam. 22 (2005) 482. [31] P. Manirakiza, A. Covaci, P. Schepens, J. Food Comp. Anal. 14 (2001) 93. [32] C. Feigel, GC/MS Varian Application Note 45, GC/MS/MS analysis of PAH’s in water using large volume injections, Varian Chromatography Systems, Walnut Creek, CA, USA. Available in www.varianinc.com. [33] A. de la Cal, E. Eljarrat, D. Barceló, J. Chromatogr. A 1021 (2003) 165. J. Chromatogr. A 1217 (2010) 425 302 [34] S. Losada, F.J. Santos, M.T. Galcerán, Talanta 80 (2009) 839. [35] M.T. Pena, M.C. Casais, M.C. Mejuto, R. Cela, J. Chromatogr. A 1165 (2007) 32. [36] Dionex Application Note ASE 208, Methods optimization in accelerated solvent extraction, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, 2004. Available in www.dionex.com. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 303 1.2.6. CONSIDERACIONES ADICIONALES Y CONCLUSIONES A lo largo del Capítulo 1.2, se han expuesto los resultados obtenidos en el desarrollo de varias metodologías para el análisis de PAHs en muestras de lodo y suelo, mediante HPLC-Flu y GC-MS/MS, empleado las técnicas de MAE, MSPD y PLE para la extracción de los analitos de la matriz. La extracción selectiva de compuestos específicos de muestras de lodo es una tarea muy complicada, porque los lodos contienen una gran variedad de componentes y contaminantes, que difieren en polaridad y naturaleza química, además de grandes cantidades de carbón. Por otro lado, la naturaleza hidrofóbica de los PAHs, conduce a una fuerte adsorción en la materia orgánica y los ácidos húmicos de los suelos, lo que dificulta su extracción. Generalmente, se requieren métodos de extracción y limpieza muy eficientes, para llevar a cabo la correcta determinación analítica. En este trabajo, se han desarrollado metodologías rápidas y sencillas para el análisis de PAHs en muestras de lodo y suelo, mediante las cuales se consiguen extracciones cuantitativas de los contaminantes estudiados, así como bajos límites de cuantificación, que permiten su determinación a los niveles establecidos en la legislación existente. A continuación, se exponen, de un modo más concreto, algunas conclusiones y consideraciones adicionales relacionadas con cada uno de los trabajos de investigación desarrollados en este Capítulo 1.2. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE LODO Y SUELO MEDIANTE EXTRACCIÓN Y SAPONIFICACIÓN ASISTIDAS POR MICROONDAS Por primera vez, se ha utilizado la energía de microondas para llevar a cabo simultáneamente, la extracción de los PAHs y la hidrólisis del material lipídico de muestras de lodos y suelos. A pesar de que ciertas condiciones de extracción, como tiempo, temperatura y volúmen de disolvente, fueron adoptadas del trabajo previamente desarrollado para pescados; la diferente naturaleza de la matriz, hizo necesario la 1. MUESTRAS SÓLIDAS 304 optimización de parámetros, como el disolvente de extracción y el protocolo de limpieza de los extractos. Además, se evaluó la influencia del tratamiento alcalino en la limpieza de los extractos y en la recuperación de los analitos. Utilizando n-hexano como disolvente de extracción y una disolución saturada de hidróxido potásico en metanol para la saponificación de las muestras, se consigue la extracción cuantitativa de todos los compuestos estudiados. El tratamiento alcalino ejerce una clara influencia positiva en la recuperación de los analitos y en la limpieza de los extractos. La inclusión de una etapa de digestión alcalina durante la extracción, produce la ionización de compuestos ácidos, tales como derivados fenólicos y sustancias húmicas, dificultando su transferencia al disolvente de extracción no-polar y liberando los analitos asociados a estos componentes de la matriz. Así, las recuperaciones obtenidas para la mayoría de los analitos en ausencia de hidrólisis alcalina fueron entre 40-60% menores. La purificación de los extractos resultó más efectiva cuando se utiliza un cartuchos de silice y Florisil conectados en serie, acondicionados con 4 mL de diclorometano y 4 mL de hexano-diclorometano (1:1, v/v) y elución con 8 mL de la misma mezcla. El método desarrollado para muestras de lodos, se aplicó a suelos agrícolas e industriales, obteniendo excelentes resultados en ambos casos, lo que demuestra la gran aplicabilidad de la metodología optimizada. Finalmente, el método se validó utilizando materiales de referencia certificados (BCR088 (lodo) y CRM 524 (suelo industrial)). OPTIMIZACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE MUESTRA BASADO EN LA DISPERSIÓN DE LA MATRIZ EN FASE SÓLIDA PARA EL ANÁLISIS DE PAHs EN SUELO El método desarrollado constituye la primera aplicación de MSPD para la determinación de PAHs en suelos. La optimización de las variables de extracción resultó ser un parámetro clave a la hora de obtener recuperaciones cuantitativas de los analitos. El IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 305 tratamiento alcalino de la muestra en la etapa de dispersión, y la elección del disolvente de elución adecuado, fueron factores de gran importancia para conseguir resultados satisfactorios. El tratamiento alcalino favorece la extracción de contaminantes orgánicos que están asociados u ocluídos en la materia orgánica del suelo, y que son de difícil acceso para los disolventes. La hidrólisis de la materia orgánica rompe enlaces ésteres y origina la descomposición de la cadena húmica macromolecular, favoreciendo la llegada del disolvente a los contaminantes orgánicos. Los compuestos orgánicos que están asociados a la materia orgánica mediante enlaces hidrolizables, serán liberados en estas condiciones. Por otro lado, las condiciones alcalinas originan una extensión de la estructura molecular polimérica, como resultado de repulsiones mutuas entre grupos cargados negativamente (carboxilos, fenólicos e hidroxilos). Esto también mejora la accesibilidad del disolvente dentro de la estructura macromolecular, favoreciendo la extracción de los contaminantes. Como resultado, los PAHs adsorbidos, se vuelven más accesibles al disolvente y se consigue una extracción más eficiente. Así, 2 mL de acetona o 6 mL de una mezcla hexano-acetona (1:1, v/v), son suficientes para la extracción cuantitativa de todos los PAHs estudiados. Respecto a la limpieza de los extractos, la combinación de sílice y Florisil en la co-columna fue la opción más efectiva a la hora de eliminar los compuestos interferentes, produciendo mejores resultados en términos de recuperación y limpieza de los extractos. Así, se consigue la extracción y limpieza en una sóla etapa, reduciendo el tiempo de análisis, el consumo de disolventes y la manipulación de la muestra. En definitiva, la optimización de los parámetros de extracción ha permitido obtener excelentes recuperaciones (94.3-102.6%) para todos los PAHs estudiados. El método se ha validado utilizando un material de referencia certificado, obteniendo buena concordancia entre los valores encontrados y los valores certificados en el material; y además se ha establecido una comparación entre los 1. MUESTRAS SÓLIDAS 312 En las tablas IV.2 y IV.3 se observa que los resultados obtenidos mediante las diferentes metodologías estudiadas son comparables entre sí, no observándose variaciones importantes en las concentraciones de PAHs. La diferencia más notable se encuentra en los valores del residuo seco, obtenidos tras llevar a sequedad mediante corriente de nitrógeno, un determinado volúmen de extracto. En todos los casos, los valores más bajos se obtienen mediante MAE, observándose una mayor diferencia en aquellas muestras que presentan un elevado contenido lipídico. Esta tendencia resulta razonable, ya que mediante esta metodología, la saponificación de los lípidos se lleva a cabo con un volúmen elevado (4 mL) de una disolución de hidróxido potásico en metanol, y está favorecida por el calentamiento mediante energía de microondas. Además, este protocolo incluye una etapa de centrifugación seguido de una etapa de limpieza adicional mediante SPE, con cartuchos de sílice y Florisil conectados en serie. En el caso de MSPD y PLE, se utiliza un menor volúmen de disolución alcalina para la saponificación, y además en el caso de MSPD se lleva a cabo a temperatura ambiente, por lo que probablemente el proceso no sea tan exhaustivo. Tabla IV.3 Concentraciones (µg g-1 ± 2 SD) de PAHs encontradas en muestras reales mediante los tres métodos propuestos. PAHs Pool lodos con adición Muestra 1 MAE (n=3) MSPD (n=6) PLE (n=7) MAE (n=3) MSPD (n=3) PLE (n=3) Naft 0.47 ± 0.02 0.432 ± 0.006 0.50 ± 0.07 4.3 ± 0.2 4.2 ± 0.6 4.2 ± 0.2 Ace 0.56 ± 0.02 0.591 ± 0.004 0.68 ± 0.08 0.44 ± 0.04 0.396 ± 0.07 0.46 ± 0.05 Flu 0.37 ± 0.02 0.446 ± 0.001 0.47 ± 0.03 0.45 ± 0.03 0.45 ± 0.02 0.438 ± 0.008 Fen 3.338 ± 0.008 3.211 ± 0.006 3.4 ± 0.1 1.86 ± 0.004 1.876 ± 0.017 1.8 ± 0.2 Ant 0.276 ± 0.002 0.263 ± 0.002 0.25 ± 0.05 0.10 ± 0.01 0.093 ± 0.004 0.088 ± 0.007 Fluor 1.335 ± 0.006 1.297 ± 0.004 1.2 ± 0.1 0.78 ± 0.02 0.75 ± 0.04 0.70 ± 0.03 Pir 1.099 ± 0.005 1.095 ± 0.002 1.09 ± 0.05 0.44 ± 0.02 0.44 ± 0.02 0.386 ± 0.005 B[a]P 0.324 ± 0.004 0.311 ± 0.002 0.32 ± 0.02 0.036 ± 0.001 0.038 ± 0.003 0.037 ± 0.002 Cris 2.147 ± 0.003 2.154 ± 0.007 2.17 ± 0.09 n.d. n.d. n.d. B[e]P 0.842 ± 0.01 0.84 ± 0.01 0.83 ± 0.08 n.d. n.d. n.d. B[b]F 0.508 ± 0.009 0.506 ± 0.003 0.51 ± 0.08 0.060 ± 0.003 0.057 ± 0.002 0.056 ± 0.004 B[k]F 0.35 ± 0.05 0.330 ± 0.001 0.34 ± 0.03 0.028 ± 0.001 0.026 ± 0.001 0.026 ± 0.004 B[a]P 0.357 ± 0.03 0.350 ± 0.001 0.33 ± 0.02 0.03 ± 0.01 0.027 ± 0.005 0.028 ± 0.005 DB[a,l]P 0.044 ± 0.001 0.045 ± 0.001 0.04 ± 0.01 n.d. n.d. n.d. DB[a,h]P 0.40 ± 0.07 0.384 ± 0.002 0.36 ± 0.05 n.d. n.d. n.d. B[g,h,i]P 0.25 ± 0.05 0.221 ± 0.001 0.23 ± 0.02 0.042 ± 0.001 0.041 ± 0.003 0.042 ± 0.004 I[1,2,3-c,d]P 0.150 ± 0.005 0.114 ±0.004 0.15 ± 0.02 0.036 ± 0.001 0.033 ± 0.001 0.030 ± 0.003 Residuo a 7.2 ± 0.5 21.6 ± 1.6 21.8 ± 0.9 10.2 ± 1.4 104.2 ± 2.6 20.4 ± 2.1 Residuo sin SPE a 29.1 ± 1.6 48.0 ± 6.8 C (%) 32.6 42.3 Lípidos (%) 6.2 20.8 Concentraciones referidas a peso seco; pool de lodos con adición, mezcla de lodos con adición entre 0.1 -1 µg g-1; a residuo (mg g-1) ± SD; residuo sin SPE, se refiere al residuo seco obtenido con MAE sin etapa de limpieza mediante SPE; n.d., no detectado; C (%), porcentaje de carbono que contiene la muestra; lípidos (%), porcentaje de lípidos que contiene la muestra. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 313 Sin embargo, a pesar de que los residuos obtenidos con MSPD y PLE son ligeramente más elevados que los correspondientes a MAE, la limpieza de los extractos se realiza de manera simultánea a la extracción de los analitos, mediante el uso de co-columna y limpieza en celda, respectivamente. De este modo, se consiguen importantes ventajas en términos de tiempo de preparación de muestra, y en el caso de la MSPD también de un ahorro considerable de disolvente. Es importante destacar que no se apreciaron diferencias importantes en los perfiles cromatográficos obtenidos mediante HPLC con detector de fluorescencia para los diferentes extractos. En las figuras IV.1 y IV.2 se representan a modo de ejemplo los cromatogramas de los extractos del material de referencia BCR088 y de la muestra 1. En definitiva, se proponen tres procedimientos de preparación de muestra, que serán elegidos en función de las necesidades de cada laboratorio y de los medios que este disponga. MAE y PLE requieren una inversión inicial debido al elevado coste de los equipos de extracción, mientras que MSPD sólo requiere de una mano y mortero de vidrio, por lo que el coste es muy bajo. Sin embargo, si lo que se persigue es la automatización, para llevar a cabo el análisis de un número elevado de muestras, la mejor opción es PLE, ya que permite realizar hasta 24 extracciones de manera desatendida. 1. MUESTRAS SÓLIDAS 314 0 20 40 60 80 1 2 3 4 56 7 8 10 11 12 13 15 16 17 0 5 10 15 20 25 0 25 50 75 100 125 150 175 0 25 50 75 100 125 150 175 3 478 10 11 12 13 16 17 5 6 1 15 9 100 200 1 2 3 4 5 6 78 910 11 12 13 14 15 16 17 14 0 20 40 60 80 270/293 100 9 Tiempo (min) Intensidad de fluorescencia a) b) c) Columna Vydac 201TP52 Columna Waters PAH C 18 Columna Waters PAH C 18 Figura IV.1 Cromatogramas de los extractos de lodo BCR088 obtenidos mediante a) MAE-HPLC- Flu, b) MSPD-HPLC-Flu, c) PLE-HPLC-Flu. Asignación de los picos: 1, naft; 2, ace; 3, flu; 4, fen; 5, ant; 6, fluor; 7, pir; 8, B[a]A; 9, cris; 10, B[e]P; 11, B[b]F; 12, B[k]F; 13, B[a]P; 14, DB[a,l]P; 15, DB[a,h]P, 16, B[g,h,i]P, 17, I[1,2,3-c,d]P. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 315 Tiempo (min) 0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 100 Intensidad de fluorescencia 1 2 3 4 56 7811 12 13 16 17 1 2 3 4 56 7 811 12 13 16 17 12 3 4 56 7 811 12 13 16 17 a) b) c) Figura IV.2 Cromatogramas de los extractos de la muestra 1 obtenidos mediante a) MAE-HPLC- Flu, b) MSPD-HPLC-Flu, c) PLE-HPLC-Flu. Asignación de los picos: 1, naft; 2, ace; 3, flu; 4, fen; 5, ant; 6, fluor; 7, pir; 8, B[a]A; 9, cris; 10, B[e]P; 11, B[b]F; 12, B[k]F; 13, B[a]P; 14, DB[a,l]P; 15, DB[a,h]P, 16, B[g,h,i]P, 17, I[1,2,3-c,d]P. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 317 2. DETERMINACIÓN DE PAHs EN MUESTRAS ACUOSAS La contaminación del agua constituye uno de los principales problemas ambientales. Cantidades ingentes de sustancias originadas en la actividad humana son vertidas al mar, a los ríos, arroyos y lagos. Pesticidas, desechos químicos, metales pesados, residuos radiactivos, hidrocarburos, plaguicidas y plásticos, son algunas de las sustancias que se encuentran, en cantidades mayores o menores, al analizar las aguas de los más remotos lugares del mundo. Los PAHs están considerados como serios contaminantes del agua. A pesar de su marcado carácter hidrofóbico, estos contaminantes están presentes en el medio acuático, como consecuencia de su fuerte adsorción a materia particulada y sedimentos. Además, la gran cantidad de fuentes que emiten PAHs al medio ambiente, contribuye a que la contaminación en los sistemas de almacenamiento, en las fuentes de abastecimiento subterráneas y superficiales, así como en otros cuerpos de agua, sea un hecho que ocurra con relativa frecuencia. En base a la gran distribución y a los efectos nocivos que ejercen estos contaminantes, y teniendo en cuenta que el agua es uno de los recursos naturales fundamentales, resulta de gran importancia llevar a cabo controles preventivos que permitan evaluar la calidad de la misma. La determinación de PAHs en aguas no es una tarea sencilla. La mayoría de los problemas asociados con la determinación de estos contaminantes en muestras acuosas, están derivados de las bajas concentraciones en las que se encuentran, como consecuencia de su baja solubilidad en agua. Otros factores que dificultan su determinación son las pérdidas durante las etapas de muestreo y almacenamiento, debido fundamentalmente a la tendencia de los PAHs a adsorberse a las paredes de los recipientes que contienen las muestras. Por otro lado, la cuantificación de rutina de PAHs en aguas a los bajos niveles establecidos por la EPA y la EU, requiere el desarrollo de métodos analíticos que proporcionen extracciones muy eficientes, y que permitan su determinación de manera simple, rápida y con bajo coste. Como se ha mencionado previamente (Capítulo II.2.1), las técnicas más comunes de extracción de PAHs en muestras de agua son LLE y SPE. Sin embargo, estas técnicas son tediosas y presentan numerosas desventajas, tales como un elevado consumo de disolvente y formación de emulsiones estables en LLE, 2. MUESTRAS ACUOSAS 318 adsorciones muy fuertes y en algunos casos irreversibles en SPE, y posibles pérdidas de moléculas volátiles durante la etapa de concentración de disolvente en ambas técnicas. Otra desventaja, es que generalmente requieren grandes volúmenes de muestra. Las tendencias actuales en Química Analítica, están dirigidas hacia la simplificación de la preparación de muestra. Así, el desarrollo de metodologías precisas y sensibles, a la par que rápidas y simples, se ha convertido en un importante objetivo. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 319 2.1. DETERMINACIÓN DE PAHs EN AGUA 2.1.1. INTRODUCCIÓN El objetivo de este apartado es describir el desarrollo de un método de determinación de PAHs en agua, utilizando DLLME como técnica de extracción y concentración y HPLC con detección de fluorescencia como técnica de análisis. Una de las ventajas más sobresalientes que caracteriza a la DLLME y principal causa de su elección, es que aúna en una sola etapa extracción y concentración de los analitos, hecho que simplificaría sobremanera los análisis a realizar. A priori, se le presuponían algunas ventajas que mejorarían las conocidas limitaciones de técnicas más convencionales; entre ellas, su sencillez y la escasa cantidad de disolvente requerido. En el momento de desarrollar este trabajo, se presentaba un inconveniente adicional, ya que la mayoría de las aplicaciones de DLLME utilizan un disolvente orgánico clorado, que en nuestro caso, resulta incompatible con el sistema de determinación. Para solventar este problema, se plantea la posibilidad de utilizar un líquido iónico como disolvente de extracción. Las propiedades físicoquímicas de los ILs dependen de la naturaleza y tamaño del catión y del anión que los forman. Por tanto, podemos ajustarlas variando la estructura y combinaciones de cationes y aniones, siendo esta versatilidad una de las principales características de estos materiales. En base a los fundamentos de la técnica de extracción utilizada, el disolvente de extracción debe ser inmiscible en agua, y a su vez debe presentar capacidad de extracción para los analitos. Así, los ILs estudiados en este trabajo, pertenecen a la familia hexafluorofosfato de 1-alquil-3-metilimidazolio. Se trata de ILs inmiscibles en agua, que presentan cadenas alquílicas de diferente longitud en el catión imidazolio. Estas cadenas le confieren carácter apolar y disminuyen la solubilidad en agua, favoreciendo el paso de los PAHs de la muestra de agua hacia el disolvente de extracción. Como se ha mencionado anteriormente, la baja polaridad de los PAHs determina una de las principales dificultades a la hora de su análisis en muestras de agua. Su carácter hidrófobo es tal, que los PAHs tienden a adsorberse en cualquier material sólido (paredes de vidrio de recipientes, conductos por los que pasa la 2. MUESTRAS ACUOSAS 320 muestra, etc.) causando importantes pérdidas durante el muestreo, almacenamiento y en algunos casos durante el análisis. La adición de un disolvente orgánico miscible con el agua en el momento del muestreo, evita las pérdidas por adsorción del recipiente en el que la muestra será almacenada. Sin embargo, este es un factor a tener en cuenta a la hora de desarrollar un método de análisis, ya que la presencia de un disolvente orgánico en la muestra, puede influir en el sistema de extracción. En consecuencia, se ha evaluado la influencia de la adición de un disolvente orgánico en la etapa de muestreo, en la eficiencia del proceso de extracción de los analitos. Así, se ha optimizado el tipo de disolvente y el porcentaje del mismo. Por otro lado, se han estudiado los diferentes factores influyentes en el proceso de DLLME, evaluando la recuperación de los analitos y los factores de enriquecimiento. Así, se han optimizado parámetros como tiempo de extracción, tiempo de centrifugación, tipo y volúmen del disolvente de extracción, tipo y volúmen del disolvente dispersante, etc. Una vez optimizado el método de extracción, se han estudiado los parámetros analíticos del método propuesto, y finalmente, éste se aplica al análisis de diferentes muestras de agua (grifo, botella, fuente, pozo, río, agua de lluvia y agua residual). Los resultados obtenidos se resumen en la publicación que se incluye a continuación. 2.1.2. DESARROLLO DE UN MÉTODO DE MICROEXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA PARA EL ANÁLISIS DE PAHs EN MUESTRAS DE AGUA Publicación VI. “Development of an ionic liquid based dispersive liquid-liquid microextraction method for the analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons in water samples”, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 (pág. 321). 2.1.2. DESARROLLO DE UN MÉTODO DE MICROEXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO DISPERSIVA PARA EL ANÁLISIS DE PAHs EN MUESTRAS DE AGUA Publicación VI DEVELOPMENT OF AN IONIC LIQUID BASED DISPERSIVE LIQUIDLIQUID MICROEXTRACTION METHOD FOR THE ANALYSIS OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS IN WATER SAMPLES J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 Doi:10.1016/j.chroma.2009.07.032 J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 328 2.2. Samples Nine water samples were selected for validating the optimised method. These include tap, bottled, fountain and well waters, rainwater, two contaminated not drinking river waters, treated wastewater and raw wastewater. Tap water was collected from our own laboratory after flowing for 10 min. Bottled water was acquired from a local market. Fountain, well, river waters and rainwater were taken from different points of Galicia (northwest Spain). The treated and raw wastewaters were obtained from a wastewater treatment plant (WWTP) also located in Galicia. All samples were collected in amber glass bottles, stored in the dark at 4 ºC and analyzed within 48 h of collection. The treated and raw wastewaters were firstly filtered through glass fibre filters and secondly through a 0.45 µm micropore membranes. It should be stressed that to avoid losses of PAHs during storage and manipulation and ensure consistent recoveries, 10% (v/v) of 2-propanol was added to the sample waters containers before samples collection. 2.3. Sample preparation 2.3.1. DLLME procedure Under the finally optimised conditions, a 10 mL aliquot of the water sample containing 10% (v/v) of 2-propanol was placed in a conical bottom glass tube. DLLME was performed by a rapid injection of 1 mL acetone (disperser solvent), containing 50 µL of [C8MiM][PF6] (extraction solvent), to the water sample using a micropipette. It should be noted that the extraction mixture was prepared beforehand by weighting with analytical balance, because of [C8MiM][PF6] is too viscous to be exactly transferred by micropipette or syringe. The injection of the extraction mixture led to a cloudy sample solution. Then, the tube was cooled in an ice-water bath for 2 min to enhance the extraction of PAHs from the sample solution into the tiny droplets of [C8MiM][PF6]. The final step of the microextraction procedure was centrifugation (5 min at 4000 rpm) to collect the dispersed ionic liquid in the bottom of the conical test tube. The upper aqueous phase was removed with a Pasteur pipette and the IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 329 volume of sedimented phase (27±1 µL) was measured using a 100 µL microsyringe. The ionic liquid extract is too viscous to be injected directly in the HPLC system, thus it was diluted with methanol to 0.5 mL. Then, the extract was filtered through a 0.22 µm Durapore filter and 20 µL were injected into the HPLC system. 2.3.2. LLE procedure Some water samples (well, rainwater and raw wastewater) were also analysed according to a previously reported liquid-liquid extraction method for PAHs [9]. Briefly, this procedure involves the LLE with dichloromethane, followed by drying the organic extract with anhydrous sodium sulphate, concentration of extract under nitrogen stream and final solvent exchange to acetonitrile. 2.4. Chromatographic separation A binary solvent system made of acetonitrile and water was used for chromatographic separations at 1.5 mL min-1. The gradient elution program was as follows: initial conditions, 50% acetonitrile for 3 min, then a linear ramp to 100% acetonitrile within 17 min and holding at 100% for 8 min. The column temperature was set at 35ºC. Detection was performed at selected fluorescence wavelength programming to obtain the better sensitivity and minimal interference. The excitation/emission wavelengths pairs (nm) were set as follows: 267/330 for Naph; 275/315 for Ace and Flu; 247/357 for Phe; 238/418 for Anth, Flt and Pyr; 286/410 for B[a]A, Chry and 5-MC; 294/425 for B[e]P, B[b]F, B[k]F, B[a]P, DB[a,l]P, DB[a,h]A and B[g,h,i]P; and 245/500 for I[1,2,3-cd]P. 3. RESULTS AND DISCUSSION The extraction efficiency of IL-DLLME procedure depends of some important experimental parameters which should be investigated in detail. The effects of addition of organic solvent, type and volume of extraction solvent, type and volume of disperser solvent, effect of the salt addition, extraction time and centrifugation time were studied. In order to evaluate the above-cited factors, enrichment factors (EFs) and extraction recoveries have been used. EFs were defined as the ratio between the concentration of each compound in the settled phase and the initial J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 330 concentration of analyte in the aqueous sample. Recoveries were calculated as the product of EFs by the ratio between the volumes of the sedimented phase and the water sample, multiplied by 100. Optimization of IL-DLLME conditions was performed using ultrapure water samples spiked with PAHs concentrations between 1 and 15 µg L-1, depending on the considered species and each data point was obtained from the mean value of three extractions. 3.1. Optimisation of conditions for dispersive liquid-liquid microextraction 3.1.1. Operational parameters IL-DLLME is known to be a fast method, in which the more time consuming steps are usually the extraction and centrifugation of the sample solution. Thus, both parameters were firstly studied in order to reduce the time in further experiments. A series of experiments were carried out using different extraction ways in the IL-DLLME method. Fig. 1 compares the recovery values obtained by using manual shaking, ice-water bath, leave to stand and sonication. Efficient extractions were achieved with manual shaking, sonication and ice-water bath. Thus, on the basis of simplicity and lower cost of proposed method, in further experiments, the sample solution was cooled with ice-water bath. Recovery (%) Leave to stand a [79 µL] Ice-water a [81 µL] Manual shaking a [80 µL] Sonication a [82 µL] 0 20 40 60 80 100 120 Flu Phe B[a]P DB[a,h]A B[g,h,i]P Fig. 1 Recoveries of some representative PAHs in spiked ultrapure water with different extraction modes, during the optimisation step. IL-DLLME conditions were 10 mL of water sample containing 10 % (v/v) of 2-propanol; 1 mL acetone as disperser solvent, 100 µL of [C8MiM][PF6] as extraction solvent and centrifugation for 5 min at 4000 rpm. Values in brackets correspond to settled phase volume; data for triplicate extractions; a 2 min. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 331 The extraction involves a transferring process of target compounds from the aqueous phase into the ionic liquid phase which is time dependent. Thus, extraction time is one of the most important factors in most of the extraction procedures, especially in microextraction methods such as SPME and LPME. In this experiment, extraction time means the time from the moment that the solution containing the acetone-[C8mim][PF6] mixture was put into ice water bath until starting to centrifuge. To evaluate the optimum extraction time, experiments were carried out in a period of 0, 1, 2, 5, 10, 20, 30 and 40 min, respectively. Other experimental conditions were 10 mL of water containing 10% (v/v) of 2-propanol, 1 mL of acetone as disperser solvent, 100 µL of [C8mim][PF6] as extraction solvent and centrifugation for 5 min (4000 rpm). The results indicated that the extraction equilibrium was attained within 2 min and longer extraction time would not affect the extraction efficiency appreciably. In further experiments, the cloudy solution was just allowed to stand into ice-water bath for 2 min before being centrifuged. The centrifugation also plays an important role in the separation procedure. The ionic liquid settled in the conic tube bottom during this process. In order to investigate the centrifugation time, experiments were performed by centrifuging for 5, 10 and 20 min at 4000 rpm after extraction. Similar results were achieved using centrifugation times comprised between 5 and 20 min. Thus, the lower value (5 min) was selected to speed up sample preparation. On the other hand, assays performed with centrifugation times lower than 5 min provided unsatisfactory results. Another important factor to consider in the development of an extraction method for PAHs is their strong adsorption onto the surface of containers, which is a consequence of their high hydrophobicity and results in considerable losses of these pollutants during storage of samples [29]. The adsorption can be prevented by the addition to the sample of an organic solvent [30] (e.g. acetonitrile, 2- propanol or methanol) in percentages between 10% and 40% (v/v), but its effect on efficiency of IL-DLLME process must be checked. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 332 In order to evaluate this effect, different solvents (methanol, acetonitrile and 2-propanol) were tested in the present paper. 10 mL of Milli-Q water with 10% (v/v) of organic solvents previously mentioned were analysed by IL-DLLME. Comparison of the data obtained revealed similar recovery values for 2-propanol (91-101%), acetonitrile (88-103%) and methanol (79-102%). However, lower settled phase volumes and consequently higher EFs (Fig. 2) were obtained with 2- propanol; therefore, 2-propanol was chosen and used in further experiments. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Ace Flt Chry B[e]P B[a]P B[g,h,i]P EFs i-PrOH [27 µL] ACN [40 µL] MeOH [34 µL] Fig.2 Influence of the addition of different organic solvents on the enrichment factors of the ILDLLME method. Data for 10 mL of water using 1 mL of acetone containing 50 µL of [C8MiM][PF6]. Extraction in an ice-water bath for 2 min; centrifugation for 5 min (4000 rpm). Mean values for n=3 replicates. Values in brackets correspond to settled phase volume; EFs, enrichment factors; i-PrOH, 2-propanol; ACN, acetonitrile, MeOH, methanol. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 333 Table 1 Recoveries ± RSD (%) achieved for different volumes of organic solvent. Compound Without addition [36 µL]a 5 % i-PrOH [36 µL]a 10 % i-PrOH [27 µL]a 15 % i-PrOH [20 µL]a 20 % i-PrOH [10 µL]a Naph 92.8 ± 0.2 89.7 ± 1.7 91.3 ± 0.1 66.9 ± 4.8 42.0 ± 12.5 Ace 96.6 ± 0.3 91.0 ± 4.6 96.9 ± 0.1 76.3 ± 4.8 51.3 ± 11.2 Flu 99.8 ± 1.2 95.6 ± 1.8 98.1 ± 0.4 81.5 ± 4.3 56.3 ± 10.5 Phe 98.9 ± 0.3 89.2 ± 13.1 99.9 ± 0.6 86.3 ± 5.2 61.1 ± 10.8 Anth 97.0 ± 0.6 94.8 ± 2.0 98.7 ± 0.3 84.3 ± 5.0 60.9 ± 9.6 Fluo r 96.5 ± 0.5 93.5 ± 4.2 100.2 ± 0.5 86.7 ± 5.4 63.8 ± 9.9 Py r 85.9 ± 1.3 86.5 ± 2.9 101.3 ± 0.8 86.6 ± 8.1 63.1 ± 10.2 B[a]A 89.0 ± 1.0 88.7 ± 3.1 98.3 ± 0.3 87.7 ± 5.0 66.9 ± 8.7 Chry 89.6 ± 1.2 89.2 ± 3.5 99.7 ± 0.4 87.9 ± 5.3 66.1 ± 8.8 5-MC 89.6 ± 1.2 90.9 ± 2.4 98.2 ± 1.1 88.6 ± 4.6 67.2 ± 9.2 B[e]P 87.8 ± 0.7 87.7 ± 3.0 98.2 ± 0.7 87.9 ± 6.2 66.9 ± 9.2 B[b]F 88.3 ± 0.6 88.8 ± 2.2 97.0 ± 0.3 88.0 ± 5.1 67.1 ± 8.6 B[k]F 87.7 ± 1.1 88.7 ± 3.0 96.9 ± 0.2 89.0 ± 5.3 67.7 ± 8.6 B[a]P 87.6 ± 0.4 88.5 ± 2.4 99.4 ± 0.5 89.6 ± 5.7 68.0 ± 8.5 DB[a,l]P 82.5 ± 1.0 82.4 ± 2.5 92.7 ± 0.6 87.6 ± 6.6 66.1 ± 8.7 DB[a,h]A 81.9 ± 0.5 81.6 ± 2.2 90.9 ± 0.3 86.3 ± 5.8 64.7 ± 8.6 B[g,h,i]P 80.9 ± 1.2 81.4 ± 4.0 95.9 ± 0.2 88.1 ± 6.8 66.3 ± 8.6 I[1,2,3-cd]P 84.2 ± 1.5 87.8 ± 1.8 93.3 ± 1.0 85.8 ± 4.0 64.2 ± 7.5 Data for 9 mL of water (adding different volumes of organic solvent) using 1 mL of acetone containing 50 µL of [C8MiM][PF6]. Extraction in an ice-water bath for 2 min; centrifugation for 5 min (4000 rpm); n=3 replicates. a Volume of the settled phase; i-PrOH: 2-propanol. Different percentages of 2-propanol were also assayed in order to evaluate the organic solvent effect on the yield of the IL-DLLME process. Fortified aqueous samples were analysed with IL-DLLME after previous 2-propanol addition (0%, 5%, 10%, 15% and 20% (v/v)). Results demonstrated that 2-propanol concentration was a critical parameter. As can be seen in Table 1, for most of the analytes, the recovery values increased with 2-propanol concentration, probably because the addition of 2-propanol decreased the adsorption of PAHs on the tube surface. Another possible reason is that the addition of 2-propanol increased the diffusion rate of PAHs from water sample to IL. However, the recovery values as well as the settled phase volume, decreased when 2-propanol percentages were higher than 10%. This fact could be due to the increase of PAHs solubility in the 2-propanol- water mixture and subsequent reduction of PAHs partitioning in favour of the IL. Taking into account these results, a percentage of 10% (v/v) of 2-propanol was adopted as the maximum allowable in the following studies. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 334 3.1.2. Type and volume of extraction solvent The selection of an appropriate extraction solvent has a main role in DLLME process, in order to achieve good recovery, EFs and selectivity of the target compounds. Therefore, kind and volume of the solvent was studied and optimised. Extraction solvent should have special characteristics including low solubility in water, extraction capability of interested compounds, higher density than water and it should also show a good chromatographic behaviour. Most of the halogenated solvents applied in DLLME have all of above properties, but these compounds are highly toxic and their use is not desirable. ILs represent a good and efficient alternative for the conventional organic chlorinated solvents in DLLME procedure. In this study, three ILs including [C4MiM][PF6] (density,1.36 g mL-1), [C6MiM][PF6] (density, 1.29 g mL-1) and [C8MiM][PF6] (density,1.22 g mL-1) were compared as extraction solvents. The alkyl part of the 1-alkyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate has significant influence on its physical and chemical properties, such as density, viscosity, and solubility [31] that might affect the extraction efficiency of target analytes. In order to evaluate the effect of extraction solvent, a series of sample solutions were tested using 1 mL of acetone containing 100 µL of ionic liquid. Significant differences were not found between [C6MiM][PF6] and [C8MiM][PF6] whereas low recovery values (29.6-48.9%) were obtained when [C4MiM][PF6] was tested as extraction solvent (data not shown). Moreover, sedimented phase volumes lower than 5 µL were obtained, causing predictable difficulties and systematic errors in its removal with a microsyringe. Therefore, [C4MiM][PF6] was not further considered. Preliminary assays demonstrated that the extraction step (ice-water bath) was important in terms of maximising recoveries of PAHs. Thus, [C6MiM][PF6] and [C8MiM][PF6] provided similar satisfactory results when the ice-water bath extraction step was included in the analytical procedure, so no clear distinction between both extractans can be made. Therefore, in a second series of experiments, the extraction capability of [C6MiM][PF6] and [C8MiM][PF6] was evaluated in absence of the ice-water bath extraction step. To do this, 10 mL spiked water samples were extracted using 1 mL of acetone containing 100 µL of IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 335 each IL extractant. The injection of the extraction mixture led to a cloudy sample solution which was centrifuged for 5 min at 4000 rpm. As can be seen in Fig. 3, [C8MiM][PF6] provides higher extraction efficiency (67.5-87.7%) than [C6MiM][PF6] (21.0-41.9%) when the ice-water bath extraction step is not included in the procedure. Taking into account that the densities and water solubility of 1-alkyl-3- methylimidazolium hexafluorophosphate decreases as the 1-alkyl group is lengthened, it seems reasonable that hydrophobic compounds such as PAHs exhibit more affinity for [C8MiM][PF6], which was finally selected as extractant. Recovery (%) 0 20 40 60 80 100 Naph Phe Pyr Chry B[a]P [C 6 MiM][PF 6 ][C 8 MiM][PF 6 ] Fig. 3 Influence of extraction solvent on the recovery of some representative PAHs in spiked ultrapure water by IL-DLLME, using 10 mL of water sample (10 % (v/v) of 2-propanol), 50 µL of ionic liquid and 1 mL of acetone as disperser solvent. Centrifugation 5 min at 4000 rpm. Data for triplicate extraction; [C8MiM][PF6], 1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate; [C6MiM][PF6], 1-hexyl-3- methylimidazolium hexafluorophosphate. The volume of extraction solvent was another important factor that could affect the extraction efficiency. To examine the effect of the extraction solvent volume, solutions containing different volumes of ionic liquid were subjected to the same IL-DLLME procedure. Thus, the effect of ionic liquid volume on the extraction efficiency was studied by using 1 mL of acetone containing different volumes of [C8MiM][PF6] (20, 30, 40, 50, 60, 80 and 100 µL). The volume of [C8MiM][PF6] had determined the occurrence of the cloudy state of sample solution. Thus, when 20 µL of [C8MiM][PF6] were employed, the mixture presented uniform transparent aspect, and no settled phase was visible at the bottom of the conical tube after centrifugation. Phases separation was never observed employing volumes lower than 30 µL. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 336 Fig. 4 depicts the extraction efficiency versus volume of extraction solvent for some representative PAHs. As can be seen, the range of recovery increased gradually when the volume of [C8MiM][PF6] was increased from 30 to 50 µL, remaining constant from 50 to 100 µL, which indicates the quantitative extraction and high distribution coefficients of PAHs in these conditions. Obviously, by increasing the volume of extraction solvent from 50 to 100 µL the volume of settled phase increases (27-81 µL); therefore, enrichment factors decrease from 300-334 to 99-123. Then, 50 µL [C8MiM][PF6] was chosen as the optimum extraction solvent volume in order to obtain high enrichment factor, low detection limit and good recovery, while keeping easy the extracts recoveries and manipulation. Recovery (%) 0 20 40 60 80 100 120 30 µ L 40 µ L 50 µ L 60 µ L 80 µ L 100 µ L Pyr B[a]P Flu Fig. 4 Effect of the volume of 1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate on the recovery of some representative PAHs in spiked ultrapure water obtained by IL-DLLME. Extraction conditions: 10 mL water (10 % (v/v) of 2-propanol), 1 mL of acetone containing different volumes of ionic liquid, extraction in ice-water bath for 2 min and centrifugation for 5 min at 4000 rpm. Mean values for triplicate extraction. 3.1.3. Type and volume of disperser The extraction solvent will disperse as very fine droplets, when rapidly injected with a disperser solvent in the aqueous sample. Thus, relative miscibility of the disperser solvent with the extraction solvent (ionic liquid) and aqueous phase is the most important factor affecting the selection on disperser solvent. Acetone, acetonitrile and methanol, exhibit adequate properties and were selected as disperser solvent. Then, the effect of these solvents on the performance of ILDLLME was investigated. For this purpose, a series of sample solutions were studied by using 1 mL of each disperser solvent containing 50 µL [C8MiM][PF6]. Experimental data did not show any difference between experiments in terms of recovery, data not given. However, the highest settled phase volume was obtained IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 337 when acetonitrile was employed as disperser, and consequently, the enrichment factors were lower for all studied compounds. Significant differences were not found between methanol and acetone; but the less toxicity and the low cost of acetone make it a better choice. The effect of acetone volume was also investigated. Different volumes of acetone (0.5, 1 and 1.5 mL) were tested to obtain the best results in terms of recovery and EFs. As can be seen in Fig. 5, similar recovery values were obtained when 0.5 and 1 mL were employed. However, the extraction efficiency was considerably reduced with increasing of acetone from 1 to 1.5 mL. On the other hand, by increasing the volume of acetone, the volume of sedimented phase was decreased due to increased solubility of ionic liquid in the sample solutions. Taking into account that enrichment factors are dependent of the yield of the extraction as well as the size of the settled phase, a decreasing of volume of sedimented phase provides a increasing of enrichment factors. Based on these results, 1 mL was chosen as the disperser volume. Recovery (%) 0.5 mL [34 µL] 1 mL [27 µL] 1.5 mL [19 µL] 0 20 40 60 80 100 120 Naph Ace Anth B[k]F I[1,2,3-cd]P Fig. 5 Influence of the disperser solvent volume on recoveries of the IL-DLLME method. Extraction conditions: sample, 10 mL (10 % (v/v) of 2-propanol); extraction solvent, 50 µL [C8MiM][PF6]; disperser solvent, acetone; extraction, ice-water bath (2 min); centrifugation, 5 min (4000 rpm.). Values in brackets correspond to settled phase volume. Data refer to three independent determinations. 3.1.4. Effect of ionic strength Salt was often added into the sample solution for improving the extraction efficiency in most traditional extraction processes. Thus, the salting-out effect has been commonly used in LLE, SPME and LPME. Generally, addition of salt decreased the solubility of analytes in the aqueous sample and enhances their partitioning into J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 344 Finally, Table 5 summarizes the analytical characteristics of previously published extraction techniques for the determination of PAHs in water samples. ILDLLME, LPME and SBSE gave significantly higher recovery values. However, LPME method exhibits high quantification limits, while the SBSE method requires high extraction times, increasing the overall sample treatment time. The remaining methods provide lower recovery values, probably due to losses of some PAHs in solvent evaporation process in LLE or drying of cartridges in SPE. The previously reported DLLME method shows lower recovery and higher quantification limits than the proposed procedure. Thus, the optimised IL-DLLME procedure appears to be an advantageous alternative when compared to the other extraction techniques, with the advantages of being faster, simple and using smaller volumes of organic solvents. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 345 Table 5 Comparative data of the developed IL-DLLME method with other procedures described in literature for the determination of PAHs in water samples. IL-DLLME proposed method 10 [C8MiM][PF6] 0.05 2 HPLC-Flu 90-102 <6 0.1-7.0 18 a Solvent consumption only in extraction stage; solvent consumption in clean-up, solvent exchanges and cartridges activation not included. b Time employed in extraction stage; any other operations were not included. c Values calculated considering data provided by authors in the paper. d Number of PAHs studied in each procedure. Hex, n-hexane; Hex-DCM, hexane-dichloromethane (50:50,v/v) mixture; Tol, toluene; GC-MS/MS, gas chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry; HPLC-UV, HPLC-UV detection; - not available. DLLME [15] 5 C2Cl4 0.008 Seconds GC-FID 60-111 <11 23.3-100.0 c 16 LPME [14] 15 [C8MiM][PF6] 0.003 30 HPLC-Flu - <12 - 12 LPME [13] 3 Tol 0.003 20 HPLC-UV 89-102 <9 3333.3-11666.7c 6 SBSE [12] 100 Not required Not required 720 GC-MS 90-104 <15 0.3-9.5 8 SPME [11] 18 Not required Not required 70 GC-MS/MS 60-102 <14 0.1-1.0 27 SPE [10] 50 Hex-DCM 5 50 HPLC-Flu 67-99 <5 0.7-56.2 17 LLE [9] 250 DCM 90 6 HPLC-Flu 51-104 <11 0.1-4.4 15 LLE [8] 300 Hex 77 72 HPLC-Flu 81-106 <14 0.1-0.4 15 Parameters Sample amount (mL) Extraction solvent Solvent consumption (mL) a Extraction time (min) b Determination technique Extraction efficiency (%) Precision (RSD %) LOQ (ng L-1) PAHs number d J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 346 3.3. Application to real water samples The applicability of the proposed IL-DLLME method was tested by the determination of PAHs in nine different water samples (tap, bottled, fountain, well, two contaminated rivers, rainwater, treated and raw wastewater). It is interesting to note that three different samples (well water, rainwater and raw wastewater) were also processed by an alternative technique (LLE) [9]. Obviously, standard addition protocol was used as quantification technique to samples that showed matrix effects (river samples, treated wastewater and raw wastewater), whereas external calibration was employed with remaining water samples. As can be seen in Table 6, the PAHs levels were well below the maximum allowed concentrations in all tested samples. Total concentrations (sum of 18 PAH) between 127.8 and 413.2 ng L-1 were found in drinking waters (tap, bottled, fountain, well) whereas rainwater exhibited concentration values between 7.1 and 110.6 ng L-1. Low concentrations of PAHs were found in river samples but it should be noticed that the river samples were collected during a rainy period. Fig. 6 depicts typical chromatograms obtained for spiked and non-spiked well water samples working in the optimal conditions described. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 347 Table 6 Concentration of PAHs found in different water samples by IL-DLLME procedure. Treated wastewater 269.2 ± 12.1 501.1 ± 10.4 606.1 ± 5.1 40.0 ± 4.0 16.4 ± 1.0 n.d. 12.8 ± 0.3 n.d. n.d. n.d. n.d. 14.9 ± 1.1 2.0 ± 2.5 2.4 ± 0.9 n.d. n.d. 8.4 ± 2.2 n.d. 1473.2 Average (ng L-1) ± relative standard deviation (RSD %); n=3 replicates per sample; n.d., not detected; ∑PAHs, sum of 18 PAHs considered in this study. River 2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 8.7 ± 1.0 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 8.7 River 1 n.d. n.d. n.d. 9.9 ± 11.8 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 9.9 Rainwater 110.6 ± 5.2 34.9 ± 11.7 n.d. 18.8 ± 6.0 n.d. n.d. 7.1 ± 4.5 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 171.3 Well 245.2 ± 7.7 65.0 ± 4.6 n.d. 47.8± 3.5 8.1 ± 2.3 19.7 ± 2.5 15.0 ± 9.3 n.d. n.d. n.d. n.d. 5.0 ± 10.4 0.8 ± 11.6 3.5 ± 5.5 n.d. n.d. 3.1 ± 11.0 n.d. 413.2 Fountain 84.1 ± 2.1 38.8 ± 2.6 n.d. 5.9 ± 2.0 n.d. n.d. 6.3 ± 8.2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2.8 ± 7.3 n.d. 137.8 Bottled 174.5 ± 1.5 43.0 ± 4.7 n.d. 30.9 ± 7.4 n.d. n.d. 9.6 ± 8.2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2.4 ± 1.0 n.d. 260.4 Tap 89.4 ± 1.7 27.0 ± 0.1 n.d. 5.5 ± 0.1 n.d. n.d. 3.7 ± 0.2 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2.2 ± 0.4 n.d. 127.8 Compound Naph Ace Flu Phe Anth Fluor Pyr B[a]A Chry 5-MC B[e]P B[b]F B[k]F B[a]P DB[a,l]P DB[a,h]A B[g,h,i]P I[1,2,3-c,d]P ∑PAHs J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 348 Fluorescence Intensity Time (min) 0 50 100 150 200 250 300 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 1 2 3 45 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 4 567 12 13 14 17 (a) (b) 3 Fig. 6 Chromatograms obtained by HPLC-fluorescence detection, corresponding to (a) spiked well water at concentrations from 0.4–6 µg L-1 and (b) non-spiked well water extracts obtained using IL-DLLME developed procedure. Peak assignment: (1) Naph, (2) Ace, (3) Flu, (4) Phe, (5) Anth, (6) Flt, (7) Pyr, (8) B[a]A, (9) Chry, (10) 5-MC, (11) B[e]P, (12) B[b]F, (13) B[k]F, (14) B[a]P, (15) Db[a,l]P, (16) DB[a,h]A, (17) B[g,h,i]P and (18) I[1,2,3-cd]P. Treated wastewater exhibited concentrations at levels of 1473.2 ng L-1 whereas any target compounds were detected in raw wastewater. Thus, the concentration of target compounds appeared to be higher in the effluent than the influent. This trend matches with that reported by Bergqvist et al [34]. The release of PAHs in the effluents from municipal wastewater treatment plants might increase the environmental contamination by readily bioavailable pollutants in the recipient waters. In some cases, trace concentrations of toxic organic pollutants are also removed, as a side-effect of the intended treatment. The high lipophilicity of PAHs increases their adsorption to the small particles in the wastewater during the treatment process. Thus, pollutants present in the wastewater might re-partition between the water phase and particle phase during the course of the chemical and biological processes involved in the wastewater treatment. The increase in the concentration of these compounds during the treatment process is a concern for the treatment method and maybe also for the outside environment. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 349 Regarding the contribution of each individual PAHs, two- and threering compounds such as naph, ace and phen predominate, whereas the concentration of the high-molecular weight (five- and six-ring) compounds remained below 12.3 ng L-1. The most toxic of all PAHs, B[a]P, was only found in well water and treated wastewater at concentration values of 3.5 and 2.0 ng L-1, respectively. Finally, it should be mentioned that the PAHs concentrations obtained in this study are similar to those found in literature [11, 35]. 4. CONCLUSIONS An analytical methodology for the determination of PAHs in water samples was developed. The high affinity of [C8MiM][PF6] to the target analytes permits extraction and preconcentration of the PAHs into one step, offering significant saving of reagents and time compared to other techniques. Additionally, the use of ionic liquid involves some advantages such as the reduction of exposure to toxic solvent, possibility of obtained more reproducible results since evaporation of extractant is not required and obtaining a directly analysable extract in a shortsingle step. The wide applicability of the procedure was verified by considering sample matrices of different complexity. Matrix effects were observed when analysing the more complex samples (contaminated river samples, treated wastewater and raw wastewater). Therefore, standard addition protocol was employed as quantification technique in these type of samples, whereas external calibration was used with remaining matrices. In summary, the developed methodology shows good performance of the analytical protocol, exhibits excellent recoveries for all studied compounds and allows the determination of the PAHs in the low “nanogram per liter” range in a reproducible and simple way. Acknowledgements This research was financially supported by the Spanish Ministry of Education and Science (project CTQ2006-03334/BQU), E.U. FEDER funding and the Xunta de J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 350 Galicia (project PGIDIT06PXIB237039PR). T. Pena gratefully acknowledges her doctoral FPI grant from the Spanish Ministry of Education and Science. REFERENCES [1] R.G. Harvey, Polycyclic aromatic hydrocarbons. Wiley-VCH New York 1996. [2] ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry). Toxicological profile for polycyclic aromatic hydrocarbons. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Atlanta, G.A. 1995. [3] United States Environmental Protection Agency, National Primary Drinking Water Standards, 2003. Available in http://www.epa.gov/safewater. [4] World Health Organization (WHO), Guidelines for Drinking Water Quality, First Addenndum to Third Eddition, Geneva 2006. [5] Directive 98/83/EC, 1998, Official Journal of the European Communities L-330 (5th December, 1998). Council Directive (3rd November, 1998) relative to the quality of waters intended for human consumption. [6] Directive 2006/0129 of the European Parliament and of the Council on environmental quality standards in the field of water policy and amending Directive 2000/60/EC, European Commission, Brussels, 2006. [7] Directive 2008/105/EC, 2008, Official Journal of the European Communities L- 348/84 (24 th December, 2008). Council Directive (16 th December, 2008) on environmental quality standards in the field of water policy, amending and subsequently repealing Council Directives 82/176/EEC, 83/513/EEC, 84/156/EEC, 84/491/EEC, 86/280/EEC and amending Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council. [8] D.M. Brum, R.J. Cassella, A.D. Pereira, Talanta 74 (2008) 1392. [9] L. Pensado, E. Blanco, M.C. Casais, M.C. Mejuto, E. Martínez, A.M. Carro, R. Cela, J. Chromatogr. A 1056 (2004) 121. [10] O. Delhomme, R. Rieb, M. Millet, Chromatographia 65 (2007) 163. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 351 [11] V. Fernández, E. Concha, S. Muniategui, P. López, D. Prada, J. Chromatogr. A 1176 (2007) 48. [12] C. Huertas, J. Morillo, J. Usero, I. Gracia-Manarillo, Talanta 72 (2007) 1149. [13] L. Hou, H.K. Lee, J. Chromatogr. A 976 (2002) 377. [14] J. Liu, G. Jiang, Y. Chi, Y. Cai, Q. Zhou, J. Hu, Anal. Chem. 75 (2003) 5870. [15] M. Rezaee, Y. Assadi, M.-R.M. Hosseini, E. Aghaee, F. Ahmadi, S. Berijani, J. Chromatogr. A 1116 (2006) 1. [16] M. García, I. Rodríguez, R. Cela, J. Chromatogr. A 1166 (2007) 9. [17] H. Farahani, P. Norouzi, R. Dinarvand, M. Reza, J. Chromatogr. A 1172 (2007) 105. [18] Y.C. Fan, Z.L. Hu, M.L. Chen, C.S. Tu, Y. Zhu, Chin. Chem. Lett 19 (2008) 985. [19] M. Koel, Crit. Rev. Anal. Chem. 35 (2005) 177. [20] J. Liu, J.A. Jönsson, G. Jian, Trends Anal. Chem. 24 (2005) 20. [21] A. Berthod, S. Carda-Broch, Annals of Marie Curie Fellowships 3 (2004) 1. [22] G.A. Baker, S.N. Baker, S. Pandey, F.V. Bright, Analyst 130 (2005) 800. [23] M. Cruz-Vera, R. Lucena, S. Cárdenas, M. Valcárcel, J. Chromatogr. A 1202 (2008) 1. [24] V. Pino, Q.Q. Baltazar, J.L. Anderson, J. Chromatogr. A 1148 (2007) 92. [25] E. Aguilera-Herrador, R. Lucena, S. Cárdenas, M. Valcárcel, J. Chromatogr. A 1201 (2008) 106. [26] Q. Zhou, X. Zhang, J. Xiao, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 4361. [27] Y. Liu, E. Zhao, W. Zhu, H. Gao, Z. Zhou, J. Chromatogr. A 1216 (2009) 885. [28] Q. Zhou, H. Bai, G. Xie, J. Xiao, J. Chromatogr. A 1188 (2008) 148. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 6356 352 [29] L. Wolska, M. Rawa-Adkonis, J. Namiesnik, Anal. Bioanal. Chem. 382 (2005) 1389. [30] L.H. Keith, Environmental Sampling and Analysis: A practical guide, Lewis Publishers, NY, 1991. [31] S. Chun, S.V. Dzyuba, R.A. Bartsch, Anal. Chem. 73 (2001) 3737. [32] A.E. Visser, R.P. Swatloski, W.M. Reichert, S.T. Griffin, R.D. Rogers, Ind. Eng. Chem. Res 39 (2000) 3596. [33] M.T. Pena, L. Pensado, M.C. Casais, M.C. Mejuto, R. Cela, Anal. Bioanal. Chem. 387 (2007) 2559. [34] P.-A. Bergqvist, L. Augulyte, V. Jurjonienè, Water, Air, Soil Pollut. 175 (2006) 291. [35] P. Popp, C. Bauer, L. Wennrich, Anal. Chim. Acta 436 (2001) 1. IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 353 2.1.3. CONSIDERACIONES ADICIONALES Y CONCLUSIONES En este trabajo se ha desarrollado una metodología analítica basada en DLLME y HPLC-Flu, utilizando un líquido iónico como extractante. Aunque la DLLME ya había sido aplicada anteriormente para la extracción de PAHs en aguas, este método constituye la primera aplicación de DLLME, utilizando un IL como disolvente de extracción de estos analitos. La elevada afinidad del [C8MiM][PF6] por los PAHs, permite llevar a cabo la extracción y concentración de los analitos en una sóla etapa. La mayor longitud de la cadena alquílica presente en el catión imidazolio, le confiere menor solubilidad en agua, que sus homólogos [C4MiM][PF6] y [C6MiM][PF6], favoreciendo la extracción de los PAHs desde la fase acuosa hacia el [C8MiM][PF6]. El uso de un líquido iónico como disolvente de extracción, proporciona ventajas adicionales, frente a los disolventes orgánicos convencionales, ya que se obtiene un extracto compatible con el sistema cromatográfico utilizado, que puede inyectarse directamente sin necesidad de realizar un cambio de disolvente. De este modo se evitan las etapas de evaporación, que generalmente traen como consecuencia pérdidas de los analitos más volátiles. Como consecuencia, se consigue la determinación de los analitos de un modo más reproducible, con rendimientos de extracción entorno al 100% para todos los compuestos estudiados. La optimización de los parámetros de extracción ha permitido obtener excelentes recuperaciones (90.3% a 103.8%) para todos los compuestos estudiados, así como elevados factores de enriquecimiento (301 a 346). Mediante la adición de un 10% de 2-propanol en la etapa de muestreo, se evita la adsorción de los PAHs sobre las paredes del recipiente, obteniendo resultados reproducibles (R.S.D.< 5.7%). La metodología propuesta es altamente sensible. Los límites de cuantificación obtenidos, del orden del bajo ng L-1 (0.1-7 ng L-1) permiten la determinación de los analitos a los niveles establecidos por la EPA y la EU para aguas de bebida y aguas superficiales. Además se trata de un método sencillo, rápido y de bajo coste, tanto en consumo de disolventes como en tiempo de análisis. ACRÓNIMOS 361 ACRÓNIMOS ADN Desoxyribonucleic acid Ácido desoxirribonucleico AEDT Ethylenediaminetetracetic acid Ácido etilendiaminotetracético ASE Assisted solvent extraction Extracción asistida por disolventes ATSDR Agency for toxic substances and disease registry Agencia para sustancias tóxicas y el registro de enfermedades CAS Chemical abstract service --- CBs Chlorobenzenes Clorobencenos CERCLA Comprehensive environmental response compensation, and liability act Ley de responsabilidad, compensación y recuperación ambiental CID Collision induced dissociation Disociación inducida por colisión [CnMIM] [PF6] 1-alkyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate Hexafluorofosfato de 1-alquil-3- metilimidazolio CPE Cloud point extraction Extracción por punto nube CRM Certified reference material Material de referencia certificado DAD Diode array detector Detector de diodos en serie DDT Dichloro-diphenyl-trichloroethane Dicloro-difenil-tricloroetano DLLME Dispersive liquid‐liquid microextraction Microextracción líquido‐líquido dispersiva ECD Electron capture detector Detector de captura de electrones EDAR Sewage treatment plant Estación depuradora de aguas residuales EF Enrichment factor Factor de enriquecimiento EI Electron impact Impacto electrónico ACRÓNIMOS 362 EPA Environmental Protection Agency Agencia de protección del medio ambiente ET-AAS Electrothermal atomic absorption spectrometry Espectrometría de absorción atómica electrotérmica EU European Union Unión Europea FID Flame ionization detector Detector de ionización de llama Flu Fluorescence detector Detector de fluorescencia FPD Flame photometric detector Detector fotométrico de llama GC Gas Chromatography Cromatografía de gases GPC Gel permeation chromatography Cromatografía de permeación en gel HF-LPME Hollow fiber-liquid phase microextraction Microextracción en fase líquida con fibra hueca HPLC High performance liquid cromatography Cromatografía líquida de alta resolución IARC International agency for research on cancer Agencia internacional de investigación del cáncer ICP Inductively coupled plasma Plasma de acoplamiento inducido ILs Ionic liquids Líquidos iónicos IRMS Isotope-ratio mass spectrometry Espectrometría de masas con radioisótopo IT Ion trap Trampa de iones Kcw Partition constant carbon‐water Constante de partición carbón‐agua Kow Partition constant octanol‐water Constante de partición octanol‐agua LLE Liquid-liquid extraction Extracción líquido-líquido ACRÓNIMOS 363 LODs Limit of detection Límite de detección LOQs Limits of quantification Límites de cuantificación LPME Liquid‐phase microextraction Microextracción en fase líquida LVI Large volume inyection Inyección de grandes volúmenes MAE Microwave-assisted extraction Extracción asistida por microondas MASE Membrane‐assisted solvent extraction Extracción con disolventes asistida por membranas MASP Microwave-assisted sample preparation Preparación de muestra asistida por microondas MS Mass spectrometry Espectrometría de masas MSPD Matrix solid-phase dispersion Dispersión de la matriz en fase sólida NCI Negative chemical ionization Ionización química negativa NIST National institute of standard and technology Instituto nacional de estándares y Tecnología NTP National toxicology program Programa nacional de toxicología OES Optical emission spectrometers Espectrometro de emisión óptica OMS World Health Organization Organización mundial de la salud OPPs Organophosphorus pesticides Pesticidas organofosforados PAH Polycyclic aromatic hydrocarbons Hidrocarburos aromáticos policíclicos PBDEs Polybrominated diphenyl ethers Difeniléteres polibromados PCBs Polychlorinated biphenyls Bifenilos policlorados PCI Positive chemical ionization Ionización química positiva PDMS Polydimethylsiloxane Polidimetilsiloxano ACRÓNIMOS 364 PFE Pressurized fluid extraction Extracción con fluidos presurizados PLE Pressurized liquid extraction Extracción con líquidos presurizados PM Molecular mass Peso molecular ppb Part per billion Partes por billón PTFE Polytetrafluoroethylene Politetrafluoroetileno PTV Programmed-temperature vaporizing Vaporización a temperatura programada R Recovery Recuperacion rpm Revolution per minute Revoluciones por minuto RSD Relative standard deviation Desviación estándar relativa RTILs Room temperature ionic liquids Líquidos iónicos a temperatura ambiente SBSE Stir bar sorptive extraction Extracción con barras agitadoras SD Standard deviation Desviación estándar SDME Single drop microextraction Microextracción con gota suspendida SFE Supercritical fluid extraction Extracción con fluidos supercríticos SFO Solidification of floating organic drop Solidificación de la gota orgánica flotante SIM Single ion monitoring Monitorización de un solo ión SIMS Secondary ion mass spectrometry Espectrometría de masas de iones secundarios SPE Solid-phase extraction Extracción en fase sólida SPME Solid-phase microextraction Microextracción en fase sólida TOF Time of flight Tiempo de vuelo ACRÓNIMOS 365 USALLE Ultrasound‐assisted liquid‐liquid extraction Extracción liquid‐líquido asistida por ultrasonidos USAEME Ultrasound‐assisted emulsification extraction Emulsificación‐microextracción asistida por ultrasonidos USE Ultrasound-assisted solvent extraction Extracción asistida por ultrasonidos UV Ultraviolet Ultravioleta VWD Variable wavelength detection Detector de longitud de onda variable [Document text truncated for crawler view.]