Estudio de asociación de la enfermedad de Parkinson con genes que codifican sustratos de la parkina y las subunidades del proteasoma en una muestra de población gallega

Memoria para optar al grado de doctor Universidad de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Medicina Estudio de asociación de la enfermedad de Parkinson con genes que codifican sustratos de la parkina ylas subunidades del proteasoma en una muestra de población gallega Ángel Sesar Ignacio 2014 DIRECTORES Alfonso Castro García María Jesús Sobrido Gómez Alfonso Castro García, profesor titular del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, director de la Unidad de Trastornos del Movimiento del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, y María Jesús Sobrido Gómez, doctora en Medicina, directora del Grupo de Genética de Enfermedades Neurológicas del Insituto de Investigación Sanitaria de Santiago de Compostela, CERTIFICAN que el presente trabajo titulado Estudio de asociación de la enfermedad de Parkinson con genes que codifican sustratos de la parkina y las subunidades del proteasoma en una muestra de población gallega se ha realizado bajo su dirección por el licenciado en Medicina Ángel Sesar Ignacio yse encuentra en condiciones de presentarse y defenderse como tesis doctoral ante el tribunal correspondiente en la Universidad de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, 23 de abril de 2014 ALFONSO CASTRO GARCÍA MARÍA JESÚS SOBRIDO GÓMEZ Universidad de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Medicina A la memoria de mi abuela Mercedes (1914 – 1997) por el amor incondicional a sus nietos. El esfuerzo merece la pena. Siempre nos hace mejores. Decís vosotros que los tiempos son malos. Sed vosotros mejores, y los tiempos serán mejores. Vosotros sois los tiempos. AGUSTÍN DE HIPONA ABREVIATURAS EMPLEADAS ASN sinucleína αoalfasinucleína CMA autofagia mediada por chaperonas (chaperone mediated autophagy) DAT transportador de dopamina (dopamine transporter) DUB enzima desubicuitinadora (desubiquitinating enzyme) EP enfermedad de Parkinson FDR proporción de falsos positivos (false discovery rate) GWAS estudio de asociación de todo el genoma (genomewide association study) HW Hardy-Weinberg (equilibrio de) kb kilobase (1000 pares de bases) LD desequilibrio de la unión (linkage desequilibrium) MAF frecuencia de alelo menor (minor allele frequency) Mb megabase (1000 kb) OR cociente de probabilidades (odds ratio) pb pares de bases PCR reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) SNP polimorfismo de un único nucleótido (single nucleotied polymorphism) SYT sinaptotagmina (familia de proteínas) SYT11 sinaptotagmina XI (gen) UPR respuesta a proteínas mal plegadas (unfolded protein response) UPS sistema ubicuitina proteasoma (ubiquitin proteasome system) UTM Unidad de Trastornos del Movimiento 1 I. Introducción. Justificación del estudio 7 II. Hipótesis 9 III. Objetivos del estudio 11 IV. Antecedentes y estado actual del tema. Revisión bibliográfica 11 i. La enfermedad de Parkinson: definición, diagnóstico e importancia epidemiológica 13 ii. Etiología de la enfermedad de Parkinson 14 1. Factores ambientales relacionados con la enfermedad de Parkinson 16 2. Formas monogénicas de la enfermedad de Parkinson 17 2.1 Enfermedad de Parkinson de herencia autosómica dominante 17 2.1.1 PARK 1. Mutaciones del gen SNCA 21 2.1.2 PARK8. Mutaciones del gen LRRK2 23 2.1.3 tros síndromes parkinsonianos monogénicos con herencia autosómica dominante 25 2.2 Enfermedad de Parkinson de herencia autosómica recesiva 25 2.2.1 PARK2. Mutaciones del gen de la parkina 31 2.2.2 PARK6. Mutaciones del gen PINK1 32 2.2.3 PARK7 33 2.2.4 Otros síndromes parkinsonianos monogénicos con herencia autosómica recesiva. 34 3. Alteraciones genéticas que incrementan la susceptibilidad de padecer enfermedad de Parkinson 37 iii. Fisiopatología molecular de la enfermedad de Parkinson 37 1. El sistema ubicuitina proteasoma y el estrés del retículo endoplásmico. 37 1.1. El proceso de ubicuitinización proteica 41 1.2. El proteasoma 47 1.3. Estrés proteico y formación de agresomas 49 1.4. Agregación proteica, sistema ubicutina proteasoma y enfermedad de Parkinson 53 2. La mitocondria y el estrés oxidativo en la enfermedad de Parkinson 55 3. La vía lisosomal y la enfermedad de Parkinson 57 iv.Los estudios de asociación en enfermedades complejas. Los polimorfismos genéticos 61 1. El problema de los estudios de asociación 61 1.1. La hipótesis enfermedad común variante común 63 1.2. La maldición de la dimensión 64 1.3. La subestructura poblacional 67 1.4. El parentesco oculto 67 2. Los bloques haplotípicos. El desequilibro del ligamiento (LD) 69 3. Cálculo del desequilibrio de ligamiento 71 4. Características de la población de estudio. El equilibrio de Hardy Weinberg (EHW) 73 5. Estudios de asociación alélica. Modelos de herencia 75 6. El control de calidad de las muestras 76 7. Imputación de datos no obtenidos ÍNDICE 77 V. Material y métodos 77 i. Selección de pacientes y controles 77 1. Población de estudio y característica de la muestra 78 2. Grupo de estudio. Criterios de inclusión 78 3. Grupo control. Criterios de inclusión 80 4. Reclutamiento y toma de muestras 83 ii. Análisis genético 83 1. Estudio de asociación 83 1.1 Selección de genes candidatos 86 1.2 Selección de SNP 87 1.3 Extracción de ADN 87 1.4 Métodos de genotipado 88 1.4.1 Genotipado por SNPlex® 89 1.4.2 Genotipado por MassArray (Sequenom®) 90 1.5 Métodos y análisis estadísticos 92 1.6 studio de replicación 92 2. Estudio de factores monogénicos 93 2.1 Análisis de mutaciones por secuenciación 94 2.2 Análisis de dosis génica por MLPA® 95 2.3 Caracterización clínica y genealógica de las familias con formas monogénicas 96 iii. Aspectos éticos 99 VI. Resultados 99 i. Construcción de una colección de casos y controles para investigación en EP 100 ii. Estudio de asociación 101 1. Genes que previamente habían demostrado asociación con EP 105 2. Genes que codifican las subunidades del proteasoma 106 3. Genes que codifican las subunidades de parkina, otras proteínas con función de ligasa de ubicuitina y proteínas relacionadas con el estrés proteico 109 iii. Caracterización de pacientes y familias con formas monogénicas de EP 109 1. Pacientes y familias con mutación en LRRK2 111 2. Pacientes y familias con mutación en PARK2 115 VII. Discusión 115 i. Colección casos y muestras para investigación en EP 117 ii. Estudio de asociación 119 1. Factores genéticos de susceptibilidad a EP previamente validados en diversas poblaciones: MAPT yLRRK2 121 2. Proteasoma y proteínas relacionadas 123 3. Región genómica entre SYT11 yRAB21 133 4. Interpretación global del estudio de asociación 134 iii. Determinantes monogénicos de EP: LRRK2 y PARK2 139 VIII. Conclusiones 141 IX. Perspectivas futuras ÍNDICE 145 Anexo I Comunicaciones y publicaciones derivadas de este trabajo 147 Anexo II Criterios de Gelb, Oliver y Gilman para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson (Gelb et al, 1999) 151 Anexo III Criterios de la UK Parkinson’s Disease Brain Bank Society para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson (Hughes et al, 1992a) 153 AnexoIV Consentimiento informado de pacientes 157 Anexo V Consentimiento informado de los controles 159 AnexoVI Método de selección de SNP aplicado en este estudio. Búsqueda de SNP para estudios de asociación. 169 Anexo VII Características de los SNP analizados 181 Bibliografía ÍNDICE Estudio de asociación de la enfermedad de Parkinson con genes que codifican sustratos de la parkina ylas subunidades del proteasoma en una muestra de población gallega Ángel Sesar Ignacio La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno degenerativo de varias áreas neuronales que da lugar a síntomas motores (temblor, rigidez, bradicinesia, alteraciones del equilibrio...) y no motores (alteraciones autonómicas, psiquiátricas, digestivas, olfatorias). La incidencia y la prevalencia de la EP varían según la población estudiada. Tomando como referencia estudios epidemiológicos realizados en otros lugares de España, en Galicia podría haber entre 4000 y 7000 afectados. El gasto sanitario ocasionado es elevado. Solo en medicación, sin incluir los tratamientos de infusión, el coste medio puede estar en torno a los 5000E(Richy et al,2013). En el caso de EP avanzada tratada con medicación en infusión (apomorfina o levodopa intraduodenal) el total anual es de entre 15 000 y 60 000E.El coste de la colocación del dispositivo de estimulación subtalámica en los casos de EP avanzada quirúrgica se estima en 30 000E. A ello hay que añadir las complicaciones derivadas de las limitaciones producidas por la EP (caídas, infecciones, accidentes...). La causa de la EP se desconoce en la mayoría de los casos. En una minoría de pacientes, la enfermedad es monogénica. Estas variantes de EP son enfermedades genéticas mendelianas y se clasifican dentro de un grupo denominado con la abreviatura PARK, seguida de un número ordinal (PARK1 a PARK18, hasta la fecha). La utilidad de una nosología basada en el locus génico es objeto de debate, ya que no todas estas formas responden a los criterios diagnósticos de la EP clásica. La mayoría de los casos de EP, sin embargo, no tienen causa monogénica y se incluyen en las llamadas enfermedades complejas o comunes. Estas enfermedades ocurren por la acción conjunta de una serie de genes o variaciones genéticas que interaccionan con factores ambientales. En cualquier caso la división clásica entre gen y ambiente probablemente es cada vez más difusa. Hay que tener en cuenta que en las enfermedades mendelianas la penetrancia depende en ocasio- INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO z1 I. Introducción. Justificación del estudio nes del ambiente o de la interacción con otros genes. Sucede lo mismo con la distinción entre herencia mendeliana (enfermedades raras, genéticas) y multifactorial (enfermedades comunes, complejas). De esta manera las herramientas habituales para estudiar las primeras (ligamiento, análisis gen a gen) y las segundas (estudios de asociación) deben considerarse como un continuo. El descubrimiento de las formas monogénicas de EP, además de confirmar la existencia de heterogeneidad genética en la EP, ha permitido profundizar en el conocimiento de la fisiopatología molecular de esta entidad. Así la alfasinucleína (ASN) mutada o en exceso, cuyo gen SNCA se altera en PARK1, da lugar a la formación de precipitados tóxicos para la neurona. La parkina, cuyo gen es PARK2,tiene función de ligasa de ubicuitina. Las mutaciones de PARK2 son la causa de la EP homónima. La ubicuitina es necesaria para la degradación de proteínas mediante el proteasoma, un complejo de proteasas. La propia parkina interviene, junto con PINK1 (proteína alterada en PARK6), en la mitofagia. Diversos trabajos basados tanto en cultivos celulares, modelos animales como en el estudio de los propios pacientes con EP han mostrado la alteración de diversas vías o estructuras en la EP. En la actualidad se han implicado de una u otra manera el estrés oxidativo, la función mitocondrial, el sistema ubicuitina proteasoma (UPS) y la vía lisosomal. Los estudios de asociación son la herramienta clave para poder relacionar una enfermedad compleja, en este caso la EP, con genes de susceptibilidad. El conocimiento de los factores genéticos relacionados con una determinada enfermedad es importante para mejorar el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de dicha enfermedad. Los estudios de asociación se basan en el análisis de polimorfismos de los genes en cuestión, principalmente los SNP (polimorfismos de base única). Se compara si hay diferencias significativas en las frecuencias alélicas o genómicas de los SNP en casos (pacientes) y en controles (sujetos sanos). En general los estudios de asociación genética se han basado en la premisa enfermedad común – variante común (la variante genética que confiere susceptibilidad a cierta enfermedad común es la misma –una variante frecuente– en la mayor parte de los pacientes con dicha enfermedad). Los resultados obtenidos hasta la fecha, no obstante, parecen contradecir en muchos casos esta premisa, pues la frecuencia e intensidad de las asociaciones han sido menores de lo es- 2zINTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO El objetivo general de este estudio es contribuir al conocimiento de los factores genéticos de susceptibilidad a la EP idiopática que puedan servir para mejorar la comprensión de los mecanismos etiopatogénicos de la EP, proponer nuevas dianas terapéuticas o desarrollar pruebas diagnósticas de utilidad clínica. Para ello nos hemos propuesto los siguientes objetivos específicos: 1. Construir una colección bien caracterizada de pacientes y controles, representativa de la población gallega, que sirva para dar continuidad a una línea estable de investigación en el futuro. 2. Validar en población gallega la asociación de factores de riesgo genético a EP descritos en otras poblaciones. 3. Averiguar si genes del sistema ubicuitina proteasoma y proteínas identificadas como sustratos de la parkina pueden estar involucrados en la susceptibilidad a la EP idiopática. 4. Conocer las formas monogénicas y sus características en los pacientes de la muestraque cumplían ciertas condiciones. OBJETIVOS DEL ESTUDIO z9 III. Objetivos del estudio i. La enfermedad de Parkinson: definición, diagnóstico e importancia epidemiológica La EP es un trastorno degenerativo que clínicamente se caracteriza por: 1) una combinación de bradicinesia con rigidez o temblor, 2) que se suele presentar de forma asimétrica, 3) muestra una notable respuesta al tratamiento con medicación dopaminérgica, y 4) la respuesta se mantiene durante algunos años (Fahn y Jankovic, 2007). Histopatológicamente muestra: 1) pérdida neuronal progresiva en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) y en otras áreas neuronales (bulbo olfatorio, locus coeruleus,núcleos del rafe, núcleo motor dorsal del vago, corteza cerebral, sistema nervioso autónomo), y 2) inclusiones intracitoplasmáticas eosinofílicas que desplazan el resto de los componentes celulares, denominadas cuerpos de Lewy (Jellinger, 2005). Algunas de las formas monogénicas de la EP no se ajustan exactamente a la definición clásica. Por ejemplo, en la mayoría de los casos secundarios a mutación de gen PARK2 yen algunos por mutación del gen LRRK2 no se observan cuerpos de Lewy (Shulman et al,2011). Las manifestaciones clínicas y la evolución en estos casos también pueden ser diferentes de la EP idiopática. El descubrimiento de estas formas monogénicas, junto con la variabilidad evolutiva que muestran los paciente con EP idiopática, ha llevado a pensar que lo que se llama EP sea en realidad un grupo de enfermedades con un mecanismo patogénico similar. El diagnóstico de la EP se basa en los hallazgos clínicos. Aunque en la actualidad se siguen empleando los criterios de UK Parkinson’s Disease Society Brain Bank (Hughes et al,1992a, Hughes et al, 1992b), especialmente en los ensayos clínicos, con el advenimien- to de las formas monogénicas de la enfermedad han perdido cierta precisión. Parael diagnóstico de la EP,tal vez los criterios de Gelb (Gelb et al,1999) sean más adecuados de acuerdo con el conocimiento actual de la enfermedad. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z11 IV. Antecedentes y estado actual del tema. Revisión bibliográfica Por el momento no existe ningún marcador biológico con la especificidad y sensibilidad suficientes para realizar el diagnóstico con razonable seguridad. Desde hace algunos años se dispone del SPECT (single photon emission computed scan)con ßCIT (2ß-car- bometoxi-3ß-4-iodofenil tropano), que permite determinar si existe degeneración de la vía nigroestriada. Sin embargo, este fenómeno no es patognomónico de la EP puesto que sucede en otros parkinsonismos degenerativos. Además en numerosos estudios se ha descrito un grupo de pacientes, los llamados SWEDD (subjects without evidence of dopaminergic degeneration), que cumplen los criterios clínicos de la enfermedad pero muestran una SPECT normal (Sixel-Döring et al,2011). La precisión diagnóstica resulta más complicada en las primeras fases de la enfermedad, puesto que otros parkinsonismos degenerativos (atrofia multisistema, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad por cuerpos de Lewy) pueden cursar inicialmente con manifestaciones clínicas y respuesta al tratamiento similares a la EP. Al cabo de un tiempo estas enfermedades evolucionan de manera diferente a la EP. En unos pocos casos este período puede ser de varios años. El diagnóstico diferencial mejoracon el seguimiento de los pacientes durante meses o años. La EP es la segunda enfermedad neuronal degenerativa en importancia epidemiológica, tras la enfermedad de Alzheimer. La prevalencia de la enfermedad varía según las áreas estudiadas. En 2 revisiones exhaustivas de estudios epidemiológicos en diferentes poblaciones se obtuvo una prevalencia global de entre 18 y 418 (Zhang et al,1993) y de entre 57 y 230 casos por 100 000 habitantes (Muangpaisan et al,2011) respectivamente paratodas las edades. La disparidad entre las cifras tal vez se deba a diferencias metodológicas. La prevalencia se asocia con la edad. Alrededor del 1%de los mayores de 60 años padecen EP (Nussbaum et al,2003). El porcentaje se incrementa al 5 % en los mayores de 85 (Fahn, 2003). Los estudios sobre la incidencia también han dado cifras muy distintas, entre 7,9 y 19 nuevos casos anuales por 100 000 habitantes en la población general (Muangpaisan et al,2011), con diferencias entre 0,8 en los menores de 29 años y 304,8 en los mayores de 65 (Bower et al,1999). Algunos estudios sugieren que la incidencia es ligeramente superior en varones (de Lau y Breteler, 2006). 12 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Los estudios realizados entre la población española de diferentes lugares han hallado prevalencias de entre 166 y 270 casos por 100 000 en la población general (Artacoz Sanz et al,1995; Criado Álvarez et al,1998; Martínez Suárez y Blázquez Menes, 2000). Es- to significaría un número total de pacientes en España de entre 80 y120 000. En Galicia existe un estudio de prevalencia de la enfermedad en la Isla de Arosa. Se trata de un estudio puerta a puerta realizado en sujetos mayores de 65 años (Seijo-Martínez et al, 2011). El resultado fue una prevalencia del 2% (prevalencia ajustada 1,7%), mayor que en otras zonas estudiadas. Si se extrapolan los datos anteriormente indicados de prevalencia en toda España, en Galicia habría entre 4000 y 7000 afectados. ii. Etiología de la enfermedad de Parkinson Clásicamente, las causas de las enfermedades se solían dividir en genéticas y ambientales. Ambos tipos se consideraban compartimientos estancos. Las enfermedades genéticas suelen dividirse entre enfermedades mendelianas y las comunes o complejas. Las enfermedades mendelianas suceden por una mutación en un gen. En las enfermedades complejas, la acción conjunta de una serie de genes, junto con interacciones ambientales, da lugar a una mayor susceptibilidad para padecer la enfermedad. En la actualidad, la EP esporádica se incluye, como la hipertensión arterial o la diabetes mellitus tipo II, dentro de las llamadas enfermedades complejas, cuyoorigen se atribuye a la interacción entre factores ambientales y factores intrínsecos del individuo. Esta categoría no incluyelas formas monogénicas de EP, que representan menos del 5% de todas las EP. Los métodos empleados para investigar las causas de estas tres categorías de enfermedad de acuerdo con su patogenia son diferentes: estudios epidemiológicos en el caso de enfermedades ambientales, análisis de ligamiento en enfermedades monogénicas y estudios de asociación en las enfermedades complejas o comunes. Lo cierto es, sin embargo, que los límites entre estas tres categorías son cada vez más difusos. La patogenia de la EP tan solo se conoce parcialmente. Se han descrito diferentes mecanismos implicados, como el estrés oxida- ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z13 tivo, la inflamación, la disfunción mitocondrial, las alteraciones del sistema ubucuitina proteasoma (UPS) en relación con el estrés proteico, y, en los últimos años, las alteraciones lisosomales (Przedborski, 2007). Se desconoce si todos ellos operan en todos los casos de EP. Si bien se han descrito relaciones de estos mecanismos entre sí, tampoco se sabe cuál es el que desencadena la enfermedad, o si son todos ellos consecuencia de un fenómeno desconocido que los precede. 1. FACTORES AMBIENTALES RELACIONADOS CON LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Los factores ambientales más estudiados en la EP son los tóxicos. Algunos estudios han relacionado la EP con la polución industrial, profesiones como la de soldador o minero, el agua de pozo o ciertos pesticidas. Hay más evidencia de la asociación inversa entre la enfermedad y el consumo de tabaco, café o té (Wildefeldt et al, 2011). Se conocen una serie de toxinas neurales que actúan sobre el sistema dopaminérgico. La 1-metil- 4-fenil-1, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) se descubrió como componente de una droga de diseño. Su metabolito activo, el MPP+ destruye el sistema dopaminérgico nigroestriado, mediante daño selectivo mitocondrial. Provoca un parkinsonismo agudo, que responde a la levodopa, pero cuyo curso es muy diferente del crónico y progresivo de la EP (Langston et al,1983, Ballard et al,1985). El herbicida paraquat tiene una estructuramolecular semejante al MPP+. Interfiere en la cadena respiratoria, de modo que da lugar aun incremento del estrés oxidativo y de la muerte celular. Produce parkinsonismo en la rata (McCormack et al,2003). Se ha sugerido una relación entre el uso de este herbicida y la incidencia de enfermedad de Parkinson en granjeros (Tanner et al,2011). La rotenona, utilizada como insecticida, provoca en ratas intoxicadas crónicamente la degeneración del sistema nigroestriado, con inclusiones parecidas a los cuerpos de Lewy. Actúa produciendo daño mitocondrial, mediante la unión al complejo I. Para conseguir este efecto, la administración ha de hacerse mediante infusión continua. No afecta al sistema nervioso por vía oral (Sherer et al, 14 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 2003). Pese a esto y a que se degrada fácilmente en el suelo, se ha mostrado que, como el paraquat, puede tener algún papel en la incidencia de EP en trabajadores del campo (Tanner et al,2011). La exposición continuada en el tiempo al manganeso puede constituir un factor de susceptibilidad para padecer EP esporádica (Luchinni et al,2007, Squitti et al,2009). En los últimos años se ha relacionado el manganeso con la agregación de ASN (Cai et al, 2010). El uso de estas sustancias es relativamente restringido por lo que solamente podrían, en al mejor de los casos, explicar una pequeña parte de los casos esporádicos de EP. Además puede haber diferencias interindividuales en sujetos expuestos a estos tóxicos. Se ha mostrado en una población expuesta a pesticida que los individuos con una actividad baja o nula de CYP2D6 (citocromo P450 2D6) tenían el doble de riesgo de padecer EP, mientras que sujetos no expuestos con este déficit presentaban el mismo riesgo que la población general (Elbaz et al,2004). ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z15 PARK Gen Locus Herencia Inicio PARK1 SNCA 4q22.1 Dominante Temprano PARK2 PARK2 6q25-q27 Recesiva Juvenil/Temprano PARK3 SPR 2p13 Dominante Tardío PARK5 UCHL1 4p14 Dominante Tardío PARK6 PINK1 1p35-p36 Recesiva Temprano PARK7 PARK7 1p36 Recesiva Temprano PARK8 LRRK2 12q12 Dominante Tardío PARK9 ATP13A2 1p36 Recesiva Enfermedad Kufor Rakeb EP temprana PARK10 USP24 1p32 Dominante Tardío PARK11 ¿GiGYF2? 2q36-q37 Dominante Tardío PARK12 Desconocido Xq21-q25 Recesiva Tardío PARK13 Omi/HTRA2 2p12 No determinada Tardío PARK14 PLA2G6 22q13.1 Recesiva Distonía parkinsonismo juvenil con respuesta a levodopa PARK15 FBXO7 22q12.3 Recesiva Síndrome piramidal de inicio temprano con parkinsonismo PARK16 Desconocido 1q32 No determinada No determinado PARK17 VPS35 16q13 Dominante Tardío PARK18 EIF4G1 3q27 Dominante Tardío Tabla 1. Genes alterados que dan lugar a las formas monongénicas PARK de EP o parkinsonismo que responde a medicación dopaminérgica (explicación a lo largo del texto) 2. FORMAS MONOGÉNICAS DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON Hasta finales de los años 90, la hipótesis ambiental era la más aceptada para explicar el origen de la EP. Aunque alrededor de un 15 % de los pacientes tenían antecedentes familiares, se interpretaba que compartían algún factor ambiental causante de la enfermedad. Esto cambió notablemente a partir de 1997, cuando se describió que una mutación de la proteína sinucleína α(ASN) causaba una forma de EP muy poco frecuente que se transmitía de forma autosómica dominante (Polymeropoulos et al,1997). En los años siguientes se fueron describiendo nuevas formas monogénicas de la enfermedad. En la actualidad estas formas mendelianas se incluyen dentro de las PARK, de las que hay 17 formas, numerados del 1 al 18. En ocasiones el nombre de la enfermedad genética coincide con el del gen, como en el caso de PARK2 o PARK7. PARK4 ha pasado a incluirse dentro de PARK1, ya que corresponde a una triplicación del gen SNCA,que codifica la ASN. Probablemente la clasificación necesite algún tipo de revisión, pues el PARK9 o síndrome de Kufor-Rakeb no cumple los criterios de EP,si bien quizá tampoco PARK2 los cumpla, al menos de forma estricta, puesto que la histopatología no muestra cuerpos de Lewy. En los casos de PARK1, PARK2, PARK6, PARK7, PARK8, PARK9, PARK13, PARK14, PARK15, PARK17 y PARK18 se ha determinado cuál es el gen mutado (tabla 1). En los casos de PARK3, PARK 5, PARK10 y PARK11 la asociación con EP de los genes atribuidos no parece tan clara. En otros casos (PARK12 o PARK16) solo se conoce el locus. Además de las formas PARK, mutaciones de otros genes (tabla 2) pueden dar lugar a cuadros similares, al menos clínicamente, a la EP. 16 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Otros genes relacionados con EP/parkinsonismo monogénico Gen Locus Herencia Inicio GBA 4q22.1 Aumenta susceptibilidad en heterocigosis Temprano ATXN2 12q24.1 Dominante Tardío ATXN3 14q21 Dominante Tardío DNAJC6 1p31.3 Recesiva Juvenil POLG1 15q26.1 Dominante Tardío Tabla 2. Otros genes que dan lugar a formas monogénicas de EP o parkinsonismo que responde a medicación dopaminérgica (explicación a lo largo del texto) 2.1 Enfermedad de Parkinson de herencia autosómica dominante 2.1.1 PARK1. Mutaciones del gen SNCA La primera mutación patogénica de la EP fue la descrita en el gen SNCA (Synuclein alpha), situado en el locus 4q22.1 (4: 90645250 - 90759447). Codifica la proteína ASN. Este gen contiene 6 exones y ocupa 117 Kb. El exón 1 no se traduce. El gen contiene un promotor en la región 5’ llamado REP1. La regulación de la síntesis de la ASN se lleva a cabo: 1) a través de este promotor, 2) mediante corte y empalme alternativo (splicing) y 3) mediante la acción de micro- ARN (revisado en Venda et al,2010) La alteración de este gen es una causa muy poco frecuente de EP. Se han descrito 4 mutaciones puntuales: AT53 (Polymeropoulos et al,1997), A30P (Krüger et al,2001), E46K (Zarranz et al,2004) y probablemente H50Q, hallada inicialmente en el cerebro de un paciente (Proukakis et al,2013) y posteriormente en un paciente con EP familiar (Appel-Cresswell et al,2013). El fenotipo de la enfermedad es similar a la esporádica si bien la edad de inicio es más temprana, alrededor de los 50, y el deterioro cognitivo ocurre con más frecuencia. De hecho, en el caso de la familia con la mutación E46K, coexisten individuos con fenotipo EP e individuos con fenotipo enfermedad con cuerpos de Lewy. La penetrancia de la mutación del gen SNCA es de alrededor del 85% (Nuytemans, 2010). Además el gen SNCA puede producir EP familiar por duplicación (Ibáñez et al,2004) o triplicación (Singleton et al,2003). En el primer caso el fenotipo es similar a la EP idiopática, con un ligero adelanto en la edad de comienzo. Cuando hay triplicación la enfermedad comienza de forma temprana con trastorno autonómico y deterioro cognitivo precoz. Previamente las duplicaciones y triplicaciones se incluían en PARK4. La ASN es una proteína de 140 aminoácidos perteneciente a la familia de las sinucleínas. Contiene un extremo N-terminal constituido por dos regiones helicoidales αinterrumpidas, una región central hidrofóbica y una región C-terminal rica en prolina y en residuos acídicos de glutamato y aspartato. El extremo N-terminal tiene un motivo hexamérico anfipático, que sirve de unión a los lípidos de la membrana. Contiene varias repeticiones de 11 aminoáci- ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z17 dos con el motivo KTKEGV. La región central se conoce como el componente no amilodeo ß de la placa (NACP) y es la parte que tiende a agregarse (figura 1) (Dev et al,2003). Las 4 mutaciones puntuales descritas se localizan en la región anfipática (Venda et al,2010). La ASN se expresa en neuronas corticales, neuronas dopaminérgicas, noradrenérgicas, células endoteliales y plaquetas. Se localiza en el citoplasma o unida a la membrana. Existe un equilibrio entre ambas formas (Farrer, 2006). En el citoplasma carece de estructurasecundaria. La que se une a los lípidos de la membrana adopta una estructura helicoidal α(Olanow y McNaught, 2011). Se une de forma preferente a liposomas fosfolipídicos que contienen grupos acídicos (Davidson et al,1998). Se colocaliza con las proteínas y los lípidos de las balsas lipídicas, estructuras clave en la formación de organelas membranosas (Fortin et al,2004). Ala ASN se le atribuyen funciones de unión a ácidos grasos, regulación de enzimas, transportadores y neurotransmisores, así como un papel en la supervivencia neuronal (Devet al,2003). En cultivos celulares protege las gotas lipídicas de la hidrólisis (Cole et al, 2002). Se ha descrito que la ASN se une a la proteína SNARE (soluble N-etylmaleimide sensitive factor attachment protein). Esta molécula interviene en la fusión de las vesículas con la membrana plasmática (Burre et al,2010, Chandra et al,2005). Además ASN inhibe la hidroxilasa de tirosina (TH) (Pérez et al,2002) y la descarboxilasa de aminoácido aromático (AADC) (Tehranian et al,2006), enzimas claveen la síntesis de dopamina. En cultivos de neuronas mesencefálicas inhibe el transportador vesicular de monoaminas (VMAT2) (Lotharius et al,2002). También se ha mostrado que en condiciones normales reduce la formación del transportador de 18 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 1. Estructura de la sinucleína alfa. Explicación en el texto sómica dominante. El gen codifica una proteína homónima que ejerce de factor de iniciación para la traducción de diversos genes relacionados con la mitocondria, la supervivencia y el crecimiento celular. La clínica es similar a la EP esporádica, con progresión más lenta y funciones cognitivas conservadas (Chartier Harlin et al,2012). Las mutaciones de los genes ATXN2 (ataxina 2, 12q24.1, 12: 111890018 - 112037480) y ATXN3 (ataxina 3, 14q21, 14: 92524896 - 92572965), causantes de las atrofias espinocerebelosas SCA2 y SCA3 pueden dar lugar a un síndrome parkinsoniano clínicamente idéntico al de la EP esporádica (Socal et al,2009, Bettencourt et al,2011). 2.2 Enfermedad de Parkinson de herencia autosómica recesiva 2.2.1 PARK2. Mutaciones del gen de la parkina El gen PARK2 se ubica en el locus 6q25.2-27 (6: 161768590 - 163148834) (Matsumine et al,1997). Consta de 12 exones separados por grandes regiones intrónicas. En total el gen contiene 1,53 Mb. Codifica la parkina, una proteína de 465 aminoácidos (52 Kd) muy conservada en las especies (Equipoada et al,1998). Consta de un dominio UBL (ubiquitin like)en el fragmento N-terminal y 2dominios dedo RING (Really interesting new gene), que flanquean un dominio IBR (in between ring), en el extremo C-terminal (Beasley et al,2007) (figura 5). Parece que UBL es importante en el reconocimiento de sustratos. Los dominios dedo RING se unen al cinc y con mucha frecuencia se relacionan con las rutas de ubicuitinación (Joazeiro y Weissman, 2000). El promotor de este gen también regula el gen inmediatamente anterior, llamado PACRG (PARK2 coregulated), cuya función es desconocida (West et al,2003). ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z25 Figura 5. Estructura de la parkina. Explicación en el texto La enfermedad se transmite de forma autosómica recesiva, con una penetrancia próxima al 100 % (Klein et al,2007). El 50 % de la EP juvenil y el 10 % de EP de comienzo tardío con historia familiar presentan mutaciones en parkina (Lücking et al,2000). También se han descrito en casos sin historia familiar (Lüking et al,2000). Algunas familias con parkina mutada no responden al modelo de herencia recesiva, lo que sugiere un mecanismo de haploinsuficiencia (Farrer et al,2001). Las mutaciones pueden afectar a cualquier tramo del gen, y sus consecuencias son similares, lo que significa que toda la proteína es necesaria para cumplir su función. Se han descrito múltiples mutaciones del gen PARK2:eliminaciones parciales de uno o varios exones, desplazamiento del marco de lectura, mutaciones puntuales tanto de parada como de cambio de sentido, duplicaciones o triplicaciones de exones. (Bekris et al, 2010). La clínica de la enfermedad puede ser similar a la EP clásica, sobre todo si el comienzo es después de los 40. No obstante un número importante de pacientes presenta algunas características particulares: distonía del pie, hiperreflexia en las extremidades inferiores, fluctuaciones diurnas y mejoría con el sueño, muy buena respuesta a la levodopa mantenida durante el tiempo, discinesias precoces y progresión lenta. Se han hallado mutaciones con fenotipos de parálisis supranuclear progresiva, EP con temblor esencial o síndrome de piernas inquietas (Nuytemans et al, 2010) La histopatología de la EP por mutación de PARK2 también difiere de la EP clásica. En general no se producen cuerpos de Lewy. La pérdida neuronal ocurre exclusivamente en la parte compacta de la sustancia negra(SNpc) y en el locus coeruleus (Mori et al,1998). Se ha descrito una mutación con cuerpos de Lewy, en la que la parkina tiene una actividad parcial (Farrer et al,2001). No hay parkina en los cuerpos de Lewy (Pawlyk et al,2003). 26 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 6. La parkina actúa como ubicuitina ligasa, permitiendo la unión de ubicuitina al sustrato proteico. La ubicuitina ejerce el papel de marcador paraque el sustrato entre en el proteasoma. La ubicuitina se monomeriza antes de entrar en el proteasoma La parkina se localiza predominantemente en el citoplasma, pero también se ubica en las vesículas sinápticas, el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico y la membrana externa de la mitocondria (Bekris et al,2010). Se le atribuye función de ligasa de ubicuitina (Imai et al,2000, Shimura et al,2000, Zhang et al,2000) (figura 6). La ubicuitina es una proteína que actúa com marcador de otras proteínas a las que se une. Las ligasas de ubicuitina (E3) son un grupo de unas 75 enzimas que catalizan el último paso de la unión de la ubicuitina a la proteína diana. La función de la ubicuitinación es múltiple. La más frecuente y conocida tiene que ver con la degradación proteica. Las proteínas ubicuitinadas de este modo entran en el proteasoma, donde se reducen a pequeños péptidos (Glickman y Ciechanover, 2002). Cada una de las ligasas de ubicuitina actúa sobre un número de proteínas que le sirven de sustrato. La parkina se ha relacionado con varias proteínas a las que presumiblemente ayudaría a ubicutinar.Se ha pensado que la acumulación de estos sustratos en la neurona podría dar lugar o contribuir su muerte, si bien por el momento esto no se ha podido confirmar. La parkina interacciona con las enzimas conjugadoras de ubicuitina (E2) UbcH7 y UbcH8, y también con las E2 asociadas al retículo endoplásmico UBC6 y UBC7 (Imai et al,2001). Las E2 intervienen en el paso previo a la ubicuitinación. Además de las E2, hay un número sorprendentemente alto de proteínas que se han relacionado con la parkina. Sería de esperar que una ligasa de ubicuitina interaccionase con unas pocas proteínas, por lo que es probable que algunas de estas moléculas no sean verdaderos sustratos o que la parkina tenga alguna otra función como se describe más adelante. Las proteínas que se han asociado ala parkina son (tabla 3): 1. Sinfilina 1:se desconoce su función. Interactúa con la ASN (Engelender et al,1999) y forma parte de los cuerpos de Lewy (Wakabayashi et al,2000). Se ha encontrado en SNCAIP, el gen que codifica esta proteína, una mutación de cambio de sentido en 2 pacientes con EP esporádica (Marx et al,2003). La parkina ubicuitina la sinfilina 1, cuando se sobreexpresa con ASN (Chung et al,2001). La sinfilina 1 también interacciona con la subunidad PSMC4 (S6ATPasa) del proteasoma (Marx et al,2007), estructura muy relacionada con la patogenia de la EP (ver más adelante). ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z27 2. CDCrel-1 (cell division control related protein 1): pertenece a una familia de GTPasas llamada septinas, que intervienen en el ciclo celular.Se expresa principalmente en el sistema nervioso, donde se asocia a las vesículas sinápticas (Zhang et al,2000, Dent et al,2002). Se han hallado acúmulos de esta proteína en cerebros de pacientes con EP por mutación de PARK2 (Choi et al,2003). En ratones transgénicos en los que la proteína se sobreexpresa se ha observado degeneración neuronal (Dong et al,2003). Se ha mostrado en modelos de Drosophila que la sobreexpresión de la septina 4, proteína homóloga de la humana CDCrel-1, resulta tóxica para las neuronas dopaminérgicas (Muñoz Soriano y Paricio, 2007). 3. GPR37 (Probable G-protein coupled receptor 37):también llamada Pael-R (Parkin-associated endothelin receptor-like receptor). Actúa en la señalización celular. Se expresa sobre todo en los oligodendrocitos, pero también en neuronas de la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) y neuronas catecolaminérgicas. En cultivos tiende a agregarse y provocar la muerte celular. En estas condiciones, parece que parkina actúa a través del retículo endoplásmico inhibiendo este fenómeno. Es probable que GPR37 regule la cantidad de dopamina en las neuronas de la sustancia negra. Un aumento de su expresión da lugar a toxicidad neuronal mediada por dopamina. Se ha hallado GPR37 en el cerebro de pacientes con mu- 28 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Posibles sustratos de la parkina Proteína Función Sinfilina 1 Desconocida CDCrel-1 Ciclo celular GPR37 Señalización celular αSp22 ASN glicosilada Sinaptotagmina 11 Inhibición de la exocitosis AIMP2 Traducción proteica Ciclina E Ciclo celular Septina 5 Ciclo celular FUPB1 Desarrollo de oligodendrocitos PARIS Represor de PGC-1α Tabla 3. Posibles sustratos de la parkina taciones de PARK2 (Imai et al,2001). Su sobreexpresión en modelos murinos da lugar a muerte neuronal por estrés del retículo endoplásmico y toxicidad dopaminérgica. Este fenómeno es mayor si no se expresa parkina (Equipoao et al, 2007). En el modelo Drosophila produce degeneración de neuronas dopaminérgicas (Yang et al,2003). Se ha detectado en los cuerpos de Lewy, pero no en las inclusiones oligodendrogliales de la atrofia multisistema (Murakami et al,2004). 4. α αSp22: ASN glicosilada. Interacciona con la parkina y se ha encontrado en cerebros de pacientes con mutaciones de PARK2 (Shimura et al, 2001). 5. Sinaptotagmina XI: Se ha relacionado con la inhibición de la exocitosis (Wang et al, 2009). Su expresión disminuye con parkina. Forma parte de los cuerpos de Lewy (Huynh et al, 2003). 6. AIMP2 (aminoacyl-tRNA synthetase complex interacting multifunctional protein 2): También conocida como p38. Forma parte de un complejo clave para la traducción proteica. Su sobreexpresión da lugar a muerte celular o formación de agresomas (Corti et al, 2003). Se ha descrito en los cuerpos de Lewy. Se incrementa en ratones defectivos para parkina y en cerebros de sujetos con mutación en el gen PARK2. Ejerce su papel tóxico activando la PARP1 (Poly ADP-ribose polymerase 1), una proteína inductora de la apoptosis (Lee et al, 2013). 7. Ciclina E: modula el ciclo celular, mediante la regulación de las cinasas dependientes de ciclina (CDK). Forma parte del complejo parkina-hSel-10-Cullin-1. Se ha encontrado en cerebros de pacientes con EP (Staropoli et al, 2003). 8. SEPT5 v2/CDCrel2: pertenece al grupo de las septinas, de estructura muy similar a CDCrel-1 (Choi et al, 2003). 9. FUPB1 (far upstream element (FUSE)-binding protein 1): se ha relacionado con el desarrollo de los oligodendrocitos (Bettegowda et al, 2011). Se acumula en ratones defectivos para parkina (Ko et al, 2006) ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z29 10. PARIS (parkin interacting substrate): en modelos de ratones defectivos para parkina se ha mostrado acumulación en el cerebro de esta proteína. En condiciones normales se ubicuitina y degradada mediante parkina. Si esto no ocurre, se produce degeneración neuronal. PARIS se une a PGC-1α(proliferator-activated receptor gamma (PPAR- γ ) coactivator 1 α ), que impide su transcripción y favorece la pérdida neuronal (Shin et al, 2011). Además de la función de ubicuitinación, formando cadenas de ubicuitina que se unen en el residuo Lys48 para la degradación del sustrato por el proteasoma, la parkina tiene capacidad de ligar ubicuitina en otras posiciones. Se ha mostrado que interviene en la monoubicutinación múltiple (Hampe et al, 2006), así como en la poliubicuitinación en Lys63 (Doss-Pepe et al, 2005). La poliubicuitinación en Lys63 de sinfilina 1 (Lim et al, 2005) o de DJ1 (Olzmann et al, 2007) mal plegada podría contribuir a su estabilización y a su inclusión en los cuerpos de Lewy. La parkina interacciona con las tubulinas αy ß. Los heterodímeros formados por estas dos proteínas forman los microtúbulos (Heald y Nogales, 2002). Con el exceso de parkina se vuelven inestables (Ren et al, 2003). La parkina se une fuertemente a la tubulina y a los microtúbulos, donde se ha propuesto que realiza funciones de estabilización ante tóxicos como el MPP+ y la rotenona, de ubicuitinación de proteínas transmembrana como el transportador de dopamina (DAT) y de fijación citoplásmica de factores de transcripción que regulan proteínas como la monoaminooxidasa (MAO) (Di Napoli M et al, 2007) En los últimos años se ha descrito que la acción conjunta de PINK1 y de parkina interviene en la mitofagia. La mitofagia consiste en la autofagia de las mitocondrias dañadas. Una de las primeras señales que indican un mal funcionamiento de la neurona es la pérdida del potencial de membrana (Kim et al, 2007). En cultivos de células He- La (Narendra et al, 2008) y en la Drosophila (Ziviani et al, 2010), a los que se ha alterado químicamente el potencial de membrana, se ha mostrado un transporte masivo de parkina desde el citoplasma a la mitocondria, donde mediante el sistema ubicuitina proteasoma degrada numerosas proteínas de la membrana externa mitocondrial. Para que ocurra este desplazamiento de parkina es necesaria 30 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA la presencia de PINK1, que también se acumula en la membrana despolarizada (Narendra et al, 2010). Posteriormente la mitocondria dañada mediante el transporte microtubular alcanza la región perinuclear, rica en lisosomas, donde se degrada mediante autofagia (Vives-Bauza et al, 2010, Vives Bauza y Przedborski, 2011). Otra función que se ha asignado a la parkina es la de represión de la expresión del gen de la proteína proapoptótica p53, mediante la unión directa en el núcleo al promotor de esta proteína (da Costa et al, 2009). Se ha mostrado que la parkina interacciona con subunidades del proteasoma como PSMD4 (Rpn10), PSMC5 (Rpt6) y PSMA7 (α4). La sobreexpresión de parkina potencia la actividad del proteasoma (Um et al, 2010). Las principales funciones de la parkina se resumen en la tabla 4. No se sabe de qué manera la parkina protege la neurona dopaminérgica, aunque hay algunos indicios 1) inhibe la hiperexcitabilidad provocada por el kainato en cultivos celulares, probablemente por aceleración del metabolismo de la ciclina E (Staropoli et al, 2003), 2) degrada la GPR37 y la AIMP2 en casos de exceso de estas proteínas (Corti et al, 2003; Imai et al, 2001), 3) se une a la tubulina y a los microtúbulos estabilizándolos (di Napoli M et al, 2007), 4) su aumento en cultivos produce resistencia a estímulos que activan la apoptosis (Darios et al, 2003). 2.2.2 PARK6. Mutaciones del gen PINK1 El gen PINK1 se encuentra en el locus 1p35-p36 (1: 20959948 - 20978004). Codifica la proteína homónima, llamada phosphatase ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z31 Función celular de la parkina Actividad de ligasa de ubicuitina Ubicuitinación Lys48 para degradación mediante UPS Ubicuitinación Lys63 Monoubicuitinación múltiple Estabilización de los microtúbulos Degradación de mitocondrias dañadas mediante autofagosomas (junto con PINK1) Represión de p53 (proteína proapoptótica) Potenciación de la actividad del proteasoma Tabla 4. Funciones celulares de la parkina and tensin homolog (PTEN)-induced putative kinase. Contiene 8 exones, con una extensión de 1,8 Kb. La proteína, de 581 aminoácidos, posee un dominio de unión a la mitocondria (MTS en el extremo N-terminal y un dominio serina / treonina, con actividad cinasa en el extremo C-terminal (Valente et al, 2001) (figura 7). Se localiza en la matriz mitocondrial y en el espacio intermembranas (Valente et al, 2004, Silvestri et al, 2005). La mutación de este gen da lugar a una forma de EP que se hereda de forma autosómica recesiva, con penetrancia casi completa. Las características clínicas son similares al PARK2, si bien se han descrito casos aislados con demencia. Suponen entre el 1 y el 3 % de las formas de EP de inicio temprano de ascendencia europea (Valente et al, 2001, Valente et al, 2004, Bonifati et al, 2005). PINK1 se localiza en la mitocondria. Se trata de una proteína que interviene en la respuesta de la mitocondria al estrés celular y oxidativo, de modo que ejerce un efecto protector mediante la fosforilación de ciertas proteínas mitocondriales (Valente et al, 2004). Se ha propuesto su intervención en el tráfico mitocondrial (Weihofen et al, 2009), el estrés oxidativo, la eficacia de la respiración mitocondrial (Liu et al, 2009) y su permeabilidad (Gandhi S et al, 2009). Ya se ha señalado que junto con la parkina, PINK1 interviene en la mitofagia. Además PINK1 regula la actividad ligasa de ubicuitina de la parkina mediante su fosforilación (Sha et al, 2010). Se han descrito 28 mutaciones patogénicas de forma concluyente, de cambio de sentido, sin sentido y de cambio de lectura de marco (Cruts et al, 2012, Nuytemans et al, 2010) 2.2.3 PARK7 El gen PARK7 (parkinson protein 7) se encuentra en el locus 1p36.23 (1: 8021714 - 8045342). Consta de 7 exones, que ocupan 32 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 7. Estructura de la proteína PINK2 0,949 Kb. Codifica la proteína DJ1, de 189 aminoácidos (Bonifati et al, 2003). La mutación de PARK7 causa una variedad de la EP, que se hereda de forma autosómica recesiva, de inicio antes de los 40 años. Pueda además cursar con síntomas psiquiátricos o demencia (Abou-Sleiman et al, 2004) DJ1 es una proteína predominantemente citoplasmática, también se localizada en la mitocondria (Zhang L et al, 2005). Parece que actúa como antioxidante, mediante la formación de puentes disulfuro en el residuo de cisteína de la posición 106 (Canet Avilés et al, 2004). Se piensa que inhibe la agregación de ASN (Canet Avilés et al, 2004) y que representa un papel neutralizador de radicales libres (Taira et al, 2004). También se le ha atribuido función de ligasa de ubicuitina en un complejo formado con parkina y PINK1 (Xiong et al, 2009). La proteína se expresa en todo el organismo. En el sistema nervioso se localiza en las neuronas y en las células de la glía (Bandopadhyay et al, 2004). En la actualidad se han descrito 6 mutaciones de cambio de sentido, una por deleción y otra por duplicación parcial (Cruts et al, 2012, Nuytemans et al, 2010). 2.2.4 Otros síndromes parkinsonianos monogénicos herencia autosómica recesiva. PARK9 se produce por una alteración del gen ATP13A2, localizado en 1p36 (1: 17312453 - 17338467). Este gen codifica la proteína homónima, una ATPasa tipo P que se ubica en la membrana lisosomal. Se le ha atribuido un papel protector contra los metales pesados mediante transporte lisosomal (Gitler et al 2009, Schmidt et al, 2009). La mutación de este gen en ambos alelos da lugar al síndrome de Kufor Rakeb, una forma muy infrecuente de parkinsonismo que comienza en la segunda década y se asocia a demencia, piramidalismo y parálisis supranuclear de la mirada. La respuesta a la levodopa es buena. (Williams et al, 2005). PARK14 ocurre por la mutación del gen PLA2G6 (phospholipase A2 group VI), que codifica una fosfolipasa A2 independiente de calcio. Se localiza en 22q13.1 (22: 38507502 - 38577857). La mutación de este gen da lugar a un síndrome de parkinsoniano de inicio temprano, progresión rápida, con distonía y demencia (Yoshino et al, 2010). ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z33 PARK15 ocurre por la mutación del gen FBXO7, que codifica la proteína homónima F-box only protein 7, en el locus 22q12.3 (22: 32870707 - 32894818). Da lugar al llamado síndrome piramidal parkinsoniano, con parkinsonismo que responde a la levodopa, espasticidad, distonía e hiperreflexia. Las funciones cognitivas son normales (Zhao et al, 2011). PARK12 es la única forma de EP hereditaria que está ligada al cromosoma X. Se conoce el locus, Xq21-q25 (Pankratz et al, 2003). En una familia con parkinsonismo juvenil se ha identificado una mutación en homocigosis en el gen DNAJC6 (DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 6), localizdo en 1p31.3 (1: 65720133 - 65881552) que codifica la chaperona auxilina, perteneciente a la familia HSP40 y cuya función es facilitar la actividad ATPasa (Edvardson et al, 2012) 3. ALTERACIONES GENÉTICAS QUE INCREMENTAN LA SUSCEPTIBILIDAD DE PADECER ENFERMEDAD DE PARKINSON En la actualidad, tanto los estudios de genes candidatos como los análisis de asociación de todo el genoma (GWAS), basados en la búsqueda de polimorfimos espaciados a lo largo de todos los cromosomas sin hipótesis previas, han permitido confirmar el efecto de algunos genes en la susceptibilidad de padecer EP (tabla 5). Se han encontrado asociaciones que implican un aumento de susceptibilidad para los portadores, y otras de protección. Los cuatro genes que han mostrado una mayor consistencia en su relación con la EP son GBA, SNCA, LRRK2 y MAPT. Los familiares de pacientes con enfermedad de Gaucher tienen mayor riesgo de padecer enfermedad de Parkinson. La enfermedad de Gaucher se engloba dentro de las llamadas enfermedades de depósito lisosomal. Se hereda de forma autosómica recesiva. Se produce por mutaciones del gen GBA (1q21, 1: 155204239 - 155214653), que codifica la glucocerebrosidasa. Esta enzima de 497 aminoácidos metaboliza la glucosilceramida, un lípido que forma parte de la membrana plasmática. La enfermedad afecta a las vísceras y al sistema nervioso central (Neumann et al, 2009). 34 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA te al sustrato (Glickman y Ciechanover, 2002). Habitualmente están en el citoplasma (Weissman, 2001). La E3, o ligasa de ubicuitina, une la ubicuitina activada al sustra- to. Si se precisa una cadena de poliubicuitina, sucesivos monómeros se van uniendo al resto de lisina correspondiente del monómero anterior, siguiendo la ruta enzimática descrita (Glickman y Ciechanover, 2002). En algunos casos la proteína que cataliza la unión de varias cadenas de ubicuitina es diferente a la E3. Este grupo de proteínas se denominan E4 (Koegl et al, 1999). La ubicuitina se libera antes de entrar en el proteasoma y se monomeriza mediante las DUB (Glickman y Ciechanover, 2002). E3 pueden ser proteínas únicas o complejos proteicos. Las primeras, a su vez, se dividen en HECT (homologous to the E6AP carboxyl terminus) y RING (really interesting new gene). Pueden transportar la cadena de ubicuitina al sustrato o unirse a ambos y facilitar la unión (Glickman y Ciechanover, 2002) Dentro de los complejos E3, uno de los mejor caracterizados es el grupo SCF (SKP1-culina-proteína FBox), que ubicuitina IκBα(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha), IκBß, ciclina E, p27 y otras proteínas que intervienen en la regulación del ciclo celular (Nakayama y Nakayama, 2005). Esta proteína se ha mostrado que disminuye en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) de los pacientes con EP (Grünblatt et al, 2004). Este fenómeno podría explicar la susceptibilidad de la SNpc a diferentes tipos de estrés como el metabolismo del hierro, el metabolismo de la dopamina, la acumulación de proteínas, la inhibición del proteasoma (Grünblatt et al, 2004). Se ha diseñado un modelo murino de EP mediante el silenciamiento del gen SKP1A (Fishman-Jacob et al, 2009) Existen unas 25-30 E2 y unas 1000 E3. La combinación de ambas enzimas puede ser específicas para cada uno de los genes del genoma (Hegde et al, 2004). 1.2 El proteasoma El proteasoma es un conjunto de complejos proteolíticos multiméricos celulares. En la célula puede existir en forma de 20S y de 26S. El 20s es la parte catalítica del complejo (Hegde y Upadhya, 2011). Se une a diferentes reguladores. El más importante es el 19 S o P700, ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z41 con el que forma el proteasoma 26S (figura 10). Otros complejos reguladores son el PA28α/ß (o 11S), PA28γo PA200 (Cook y Petrucelli, 2009). Además de la función catalítica, tanto los proteasomas 20S (Petit et al 1997) como los 26S tienen actividad ARNasa (Kulichkova et al, 2010), que se regula específicamente durante la diferenciación celular y la apoptosis (Konstantinova et al, 2008). El proteasoma constituye el 1 % del total de las proteínas de la célula. Su concentración varía según la actividad metabólica proteica de la célula. Se localizan en el citoplasma y en el núcleo fundamentalmente, aunque en menor medida también en el citoesqueleto y en el retículo endoplásmico (Coux et al, 1996). El proteasoma 20S es una estructura proteica que tiene forma de barril de 14,8 nm de longitud y 1,3 nm de diámetro (Amici y Eleuteri, 2007). Está constituido por 28 subunidades αy ß dispuestas en 4 anillos de 7 unidades cada uno ordenados como α-ß–ß-α. En las células eucariotas cada una de las 7 unidades αo ß es diferente y está codificada por un gen específico. Las subunidades αse numeran de α1 a α7. Las subunidades ß también se numeran de ß1 a ß7. En los mamíferos el proteasoma por acción del interferón γse transforma en inmunoproteasoma, que interviene en el procesado del antígeno. En estos casos las subunidades ß1, ß2 y ß5 se ven reemplazadas por ß1i, ß2i y ß5i. Las subunidades αtambién se denominan PSMA (proteasome subunit alpha-type), seguidas del correspondiente número del 1 al 7, que no coincide con el de α. Las subunidades ß también se denominan PSMB (proteasome subunit beta type) (tabla 6). Los genes que codifican estas proteínas tienen su mismo nombre (Sorokin et al, 2009). La estructura de 4 anillos del proteasoma 20S permite la formación de 3 cámaras: 2 antecámaras que limitan una cámara central 42 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Tabla 6. Nomenclatura en mamíferos de las subunidades del proteasoma Nomenclatura en mamíferos de las subunidades del proteasoma 20S Subunidad Mamíferos Subunidad Mamíferos α1PSMA6 ß1PSMB6 α2PSMA2 ß2PSMB7 α3PSMA4 ß3PSMB3 α4PSMA7 ß4PSMB2 α5PSMA5 ß5PSMB4 α6PSMA1 ß6PSMB1 α7PSMA3 ß7PSMB4 formada por los 2 anilos ß, donde se localiza la parte catalítica de la estructura (Coux et al, 1996). Los extremos del proteasoma, constituidos por los anillos α, forman un canal central muy estrecho y limitado por las terminaciones N de las 7 subunidades α(Groll et al, 2000). La parte catalítica del proteasoma es una proteasa de treonina, situada en el extremo N-terminal de la subunidad ß (Löwe et al, 1995). El antibiótico lactacistina inhibe el proteasoma uniéndose a la treonina del N terminal ß (Imajoh-Ohmi et al, 1995). En el proteasoma 20S se han descrito tres clases de actividades: 1) actividad parecida a la quimotripsina (ChT-L), que lisa los residuos hidrofóbicos, 2) actividad parecida a la tripsina ((T-L), que lisa los residuos básicos, y 3) actividad hidrolizadora de los péptidos peptidilglutamina (PGPH) o actividad parecida a la caspasa, que lisa los residuos acídicos Estas actividades se han atribuido respectivamente a ß1, ß2 y ß5 (Amici y Eleuteri, 2007). En el proteasoma de los mamíferos se han descrito 2 actividades adicionales, preferentemente sobre aminoácidos ramificados (BrAAP) y sobre pequeños aminoácidos neutros (SNAAP) (Orlowski et al, 1993). La parte catalítica rompe las proteínas en péptidos de 3 a 32 aminoácidos (Kisselev et al, 1998). Las poblaciones de 20S existen de forma independiente del proteasoma 26S. Se localizan en el citoplasma y en el núcleo. Degradan algunas proteínas (de vida corta, mutadas, defectuosas) ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z43 Figura 10. Estructura del proteasoma de 26S, formado por el complejo core de 20S, con 2 anillos internos ß y 2 externos a, y el complejo regulador 19S, a su vez compuesto de base y cubierta independientemente de la ubicuitina y del ATP (Sorokin et al, 2009). En el núcleo el proteasoma 20S regula el catabolismo de las histonas (Ullrich y Grune, 2001). 19S es el principal complejo regulador. Se une al proteasoma 20S, formando el proteasoma 26S, del que existen 2 isoformas, RP1CP y RP2CP, según 19S se una a uno o a ambos extremos del proteasoma 20S (Brooks et al, 2000). El complejo 19S es clave para el reconocimiento selectivo del sustrato unido a la ubicuitina y su posterior transporte al proteasoma 20S (Wójcik y de Martino, 2007). La estructura de 19S contiene unas 17 subunidades, que se agrupan en dos divisiones llamadas base y cubierta. La base consta 6 unidades ATPasa (pertenecientes a las AAA, ATPasas asociadas con actividades celulares diversas), denominadas Rpt (regulatory particle tripleA-ATPasa), numeradas del 1 al 6. En los mamíferos, estas subunidades se nombran como PSMC (proteasome 26S subunit ATPase). Se numeran del 1 al 6, pero estos números no coinciden con los asignados a Rpt (Sorokin et al, 2009). Las 6 subunidades PSMC se colocan en forma de anillo alrededor de las subunidades no ATPásicas Rpn (regulatory particle non-ATPase) 1 y 2 (Da Fonseca y Morris, 2008, Rosenzweig et al, 2008), denominadas en los mamíferos PSMD (proteasome 26S subunit non-AT- Pase) 2 y 1 (en este caso tampoco coinciden los números) (ver figura 10). Rpn10 (PSMD4) ejerce de intermediario entre la base y la cubierta (Riedinger et al, 2004). Estas tres unidades no ATPásicas (PSMD) de la base contienen los dominios KEKE (Realini et al, 1994) y LRR (Lupas et al, 1999), que están implicados en la unión proteína-proteína. La cubierta está formada por otras 8 unidades, todas ellas no AT- Pásicas: PSMD3 (Rpn), PSMD12 (Rpn5), PSMD11 (Rpn6), PSMD6 (Rpn7), PSMD7 (Rpn8), PSMD13 (Rpn9), PSMD14 (Rpn11) y PSMD8 (Rpn12). Otras subunidades, como PSMD10, PSMD11 o SHFM1 se pueden unir al proteasoma en determinadas circunstancias (Sorokin et al, 2009) (tabla 7). Las subunidades de la cubierta comparten una secuencia de unos 200 aminoácidos llamada dominio PCI (proteasome, COP9, iniciation factor 3) (Hofmann y Bucher, 1998). Además tienen un dominio, de 120 aminoácidos, llamado MPN (Mpr1p/Pad1p N-terminus), importante para la función de PSMD7 y PSMD14 (Glickman y Ciechanover, 2002). 44 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA El acoplamiento entre el complejo regulador 19S y el proteasoma 20S depende de ATP. Las subunidades de la base PSMD2 (Rpn1) y PSMD1 (Rpn2) se unen al anillo α(da Fonseca y Morris, 2008). En la célula hay un equilibrio dinámico entre los proteasomas 20S y 26S (Hendil y Hartmann-Petersen, 2004) El complejo regulador 19S actúa como intermediario entre el sustrato proteico ubicuitinizado y el complejo proteolítico 20S. Sus funciones son las siguientes: 1. reconocimiento de la ubicuitina, mediante PSMD4 (Rpn10) principalmente, a través del motivo LALAL (Riedinger et al, 2010). 2. unión al sustrato, a cargo las subunidades de la base, que además retienen el sustrato en el proteasoma para su posterior desdoblamiento y correcta orientación, de forma que pueda entrar en el proteasoma 20S (Braun et al, 1999) 3. desdoblamiento y translocación del sustrato, para esto es necesaria la hidrólisis del ATP, que realizan las subunidades PSMC (Rpt) (Lee C et al, 2001) ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z45 Tabla 7. Nomenclatura en levaduras y en mamíferos de las subunidades del proteasoma 19S. Nomenclatura en levaduras y en mamíferos de las subunidades del proteasoma 19S Levaduras Mamíferos Levaduras Mamíferos Rpt1 PSMC2 Rpn1 PSMD2 Rpt2 PSMC1 Rpn2 PSMD1 Rpt3 PSMC4 Rpn3 PSMD3 Rpt4 PSMC6 Rpn4 Rpt5 PSMC3 Rpn5 PSMD12 Rpt6 PSMC5 Rpn6 PSMD11 Rpn7 PSMD6 Rpn8 PSMD7 Rpn9 PSMD13 Rpn10 PSMD4 Rpn11 PSMD14 Rpn12 PSMD8 Rpn13 Rpn15 SHFM1 S5b PSMD5 p28 PSMD10 p27 PSMD9 4. desubicutinación, la cadena de ubicuitina se libera del sustrato antes de entrar en el proteasoma 20S. El primer paso se realiza a través de PSMD14 (Rpn11), que necesita el concurso del ion Zn+2 (Yao y Cohen, 2002). Después intervienen otras DUB que se unen al proteasoma, rompen el enlace con el sustrato y dividen la cadena de polibicuitina en monómeros listos para reutilizar (Amerik y Hochstrasser, 2004) Las DUB rompen las moléculas de ubicuitina en el extremo C-ter- minal del último resto de glicina en la posición Gly76 (Oh et al, 2007). Permiten mantener una cantidad adecuada de moléculas de ubicutina para que pueda ejercer sus funciones biológicas (Amerik y Hochstrasser, 2004). Además del complejo regulador 19S, existen otras proteínas que pueden unirse al proteasoma 20S y modificar su actividad. Las más importantes son la familia PA28 α, ß y γ(11S REG α, ß y γ) y la proteína P200. Ambas son independientes del ATP y permiten la hidrólisis de pequeños péptidos (Dubiel et al, 1992, Iwanczyk et al, 2006). PA28αy ß se han relacionado con la presentación antigénica (Rechsteiner et al, 2000). Se han descrito proteasomas híbridos con 20S unido a 19S en un extremo y a P28 en el opuesto (Tanahashi et al, 2000). P200 parece que también desempeña un papel en la reparación del ADN (Ustrell et al, 2002). Algunas subunidades del proteasoma modifican su actividad al fosforilarse mediante la cinasa A de proteína (PKA). Este proceso, que afecta a PSMA2 (α2), PSMA4 (α3), PSMA6 (α1), PSMB3 (ß3), PSMB4 ß7 y PSMB7 (ß2), incrementa la actividad parecida a la quimotripsina y parecida a la caspasa (Zong et al, 2006). En el caso de PSMA2 (α2) la fosforilación es necesaria para que el proteasoma se localice en el núcleo (Benedict et al, 1995). Por tanto, para que ocurra una degradación proteica a través de UPS, es necesario que se verifique la unión del sustrato a una cadena de poliubicuitina. El complejo regulador 19S del proteasoma reconoce al sustrato unido al marcador, desdobla la proteína y la transfiere a la cámara proteolítica del proteasoma 20S (figura 11). Antes de que esto último suceda la ubicuitina se desprende del sustrato mediante las DUB. En general, este proceso sirve para degradar las proteínas en péptidos cortos. En algunos casos, sin embargo, el producto resultante es la forma activa de la proteína, 46 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA como ocurre con la familia de factores de transcripción NF-κB. Las formas activas de estas proteínas se producen tras la acción del sistema ubicutina proteasoma sobre sus precursores (Coux y Goldberg, 1998). 1.3 Estrés proteico y formación de agresomas Las proteínas se secretan en el retículo endoplásmico rugoso por la acción de múltiples ribosomas. Recién formadas, las proteínas no tienen estructura secundaria. Se pliegan con la ayuda de las chaperonas, sobre todo de la familia Hsp70 (heat shock protein) y Hsp90, que, entre otras funciones, impiden su agregación evitando la exposición de superficies hidrofóbicas o restos de cisteína no pareados de las cadenas proteicas. Algunas modificaciones de las cadenas polipeptídicas, como la N-glicosilación o la formación transitoria de puentes disulfuro, facilitan el plegamiento proteico. Las proteínas plegadas adecuadamente se transfieren al aparato de Golgi, donde continúan su maduración. Las proteínas mal plegadas se quedan retenidas durante un tiempo en el retículo endoplás- ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z47 Figura 11. Proceso de unión del sustrato a la cubierta del proteasoma 26S, con monomerización de la ubicuitina y entrada y posterior degradación del sustrato (modificado de http://info. agscientific.com/adv ancing-biochemical- research/) mico, donde continuará la acción de las chaperonas. En caso de que estas no consigan su objetivo, la cadena mal plegada se transporta al citoplasma (retrotransposición), donde se degrada mediante UPS (revisado por Benyair et al, 2011). Cuando en el retículo endoplásmico hay un exceso de proteínas mal plegadas, defectuosas, mutadas o agregadas se produce el llamado estrés del retículo endoplásmico. Las causas son diversas: envejecimiento celular, alteraciones del metabolismo del calcio, infecciones virales, mutaciones, déficit de glucosa o hipoxia. Para evitar el colapso del sistema, se pone en marcha la respuesta a las proteínas mal plegadas (UPR, unfolded protein response) que consiste en: 1) incremento de la retrotransposición al citoplasma para que UPS actúe sobre las proteínas defectuosas, 2) aumento de la actividad de las chaperonas, buscando una mejoría del plegamien- to proteico, y 3) disminución de la traducción proteica (revisado por Chakrabarti et al, 2011). En caso de que la UPR no sea suficiente para mantener la viabilidad celular pueden ocurrir 3 fenómenos: 1) inducción de autofagia (Bernales et al, 2006) 2) formación de agresomas (ver a continuación), 3) activación de proteínas apoptóticas que dan lugar a la muerte celular (Shore et al, 2011) (figura 12) Los agresomas están formados por inclusiones proteicas que se localizan en el centro organizador de los microtúbulos (o centrosoma en las células animales). Se forman mediante el transporte retrógado de los agregados proteicos a través de los microtúbulos hasta el centrosoma (Johnston et al, 1998). En células HeLa la inhibición del proteasoma da lugar a la formación de agresomas (Wójcik et al, 1996). Por otro lado, la despolimerización de los microtúbulos frena la formación del agresoma (Johnston et al, 1998, García Mata et al, 1999). El agresoma está compuesto entre otras estructuras por chaperonas, fragmentos de proteasoma, filamentos intermedios tipo III, especialmente la proteína acídica fibrilar glial (GFAP) y la vimentina. Esta última forma una capa externa que rodea al resto de la estructura (Thibodeau et al, 2007). Los agresomas ejercen un efecto protector sobre la célula, aislando agregados proteicos que de otra manera resultarían tóxicos. Una vez formado el agresoma puede persistir en la célula o degradarse, probablemente por mecanismos de autofagia (Jänen et al, 2010). 48 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.4 Agregación proteica, sistema ubicutina proteasoma y enfermedad de Parkinson Los sistemas de control de calidad de las proteínas son especialmente activos en el sistema nervioso central. Las neuronas solo pueden obtener energía mediante el ciclo de Krebs. La presencia de oxígeno da lugar a metabolitos que oxidan neurotransmisores y a un aumento de radicales libres. Esta situación puede incrementar la cantidad de proteínas dañadas. Para evitar daño celular actúa el sistema de degradación de proteínas. El funcionamiento correcto de este sistema es además necesario para mantener las neuronas estructuralmente viables (Keller et al, 2004). En la EP se han observado agregados proteicos sobre todo de ASN. Estos agregados ocurren bien por alteraciones del gen SNCA (mutaciones, duplicaciones o triplicaciones), bien por modificaciones de la proteína por otras causas. En la EP esporádica se desconoce por qué la ASN se agrega. La ASN no se degrada habitualmente mediante el sistema UPS (Shimura et al, 2001). El exceso de ASN interacciona con la cubierta 19S y altera la función ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z49 Figura 12. Plegamiento normal de las proteínas y estrés del retículo endoplásmico. Explicación en el texto. RE retículo endoplásmico, UPS sistema ubicuitina proteasoma, UPR respuesta a proteínas mal plegadas (modificado de http://pdbj.org/eprot s/index_en.cgi?PDB:2 RIO) del proteasoma 26S, en concreto de la subunidad PSMC3 (Rpt5) (Snyder et al, 2003). En las mutaciones de parkina se han constatado acumulaciones de algunos de sus sustratos como GPR37 (Pael-R) (Imai et al, 2001), CDCrel (Choi et al, 2003), ciclina E (Staropoli et al, 2003), AIMP2 (p38) (Ko et al, 2005) o FUBP1 (Ko et al, 2006). Estos acúmulos ocurren en otras células además de las neuronas dopaminérgicas. Dado que solo estas últimas degeneran, deben existir otros factores coadyuvantes. AIMP2 (p38) también se ha hallado en acúmulos en cerebros de pacientes con EP idiopática (Ko et al, 2005). La parkina ejerce un importante efecto protector celular ante diversas agresiones como en la disfunción del proteasoma (Tsai et al, 2003), el exceso de ASN (Petrucelli et al, 2002) o la excitotoxicidad inducida por el kainato (Starlopoli et al, 2003) Otra proteína que se agrega en la EP es la sinfilina 1. Forma parte de los cuerpos de Lewy y puede formar inclusiones por sí misma en su forma ubicuitinada. Se une tanto a la parkina como a la ASN (Eyal y Engelender, 2006). También interacciona con el proteasoma, en concreto con la subunidad PSMC4 (Rpt3) (Marx et al, 2007) Los agregados proteicos más característicos de las neuronas de los pacientes con EP son los cuerpos de Lewy. No se han observado en los casos de mutación de PARK2 y en algunos pacientes con mutación de LRRK2. Se han descrito en cerebros de ancianos sin enfermedades degenerativas. Se trata de unas estructuras eosinofílicas de 8-30 µm de diámetro formadas por material granular que se dispone centralmente y una capa externa formada por filamentos en forma radial. Aunque el componente principal de los cuerpos de Lewy es la ASN, están formados por otras muchas proteínas: neurofilamentos, ubicuitina, sinfilina 1, torsina A, enzimas ubicuitinadoras y desubicuitinadoras, proteínas ubicutinadas, proteínas de golpe de calor (sobre todo Hsp70 y Hsp90) o fragmentos de proteasoma (Olanow et al, 2004). Algunas de las proteínas que componen estas estructuras forman parte del sistema de regulación proteico de la neurona. En la actualidad se cree que los cuerpos de Lewy desempeñan el papel de agresomas. De este modo secuestrarían los agregados proteicos neurotóxicos y los aislarían del ambiente celular. Los cuerpos de Lewy muestran tinción positiva para tubulina-γy pericentrina, ambos marcadores específicos de los agresomas (Olanow et al, 2004). 50 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA proceso de macroautofagia, disminuye la agregación de ASN (Spencer et al, 2009). Por el contrario, la inhibición de CMA favorece las formas insolubles de ASN (Vogiatzi et al, 2008). La sobreexpresión de ASN mutada inhibe la CMA (Xilouri et al, 2009). La sobreexpresión de PINK 1 incrementa la autofagia (Michiorri et al, 2010). La mutación p.G2019S de LRRK2 aumenta las vacuolas autofágicas (Plowey et al, 2008). En cerebros de pacientes con EP hay acumulación de autofagosomas (Mizushima et al, 2008). Los cuerpos de Lewy pueden degradarse mediante autofagia (Fortun et al, 2003) Ya se ha tratado la mayor susceptibilidad que presentan los portadores heterocigotos de mutaciones en el gen GBA, relacionado con alteraciones lisosomales para padecer enfermedad de Parkinson. Recientemente se ha sugerido que polimorfismos del gen SCARB2 (scavenger receptor class B, member 2) podrían constituir un factor de riesgo para la EP. SCARB2 (localizado en 4q21.1) codifica LIMP2 (lysosomal integral membrane protein 2), una proteína transmembrana ubicua, con fuerte presencia en los endosomas y lisosomas (Michelakakis et al, 2012). También se ha observado que UCHL1 interacciona con Hcc70, Hsp90 y con LAMP A2. En cultivos celulares la mutación I93M de UCHL1 inhibe la CMA, vía a través de la que se degrada, al menos parcialmente ASN (Kabuta et al, 2008). iv. Los estudios de asociación en enfermedades complejas. Los polimorfismos genéticos. La EP esporádica se incluye dentro de las enfermedades comunes o complejas. Las enfermedades complejas ocurren por la acción combinada de genes ubicados en múltiples locus. El efecto individual de cada uno de ellos es pequeño. Estos genes interaccionan entre sí y a su vez lo hacen con factores ambientales. El componente genético de las enfermedades complejas, mucho más frecuentes que las mendelianas, se estudia en poblaciones no emparentadas mediante los estudios de asociación. Los estudios de asociación se basan en el análisis de locus de ADN polimórfico. En la mayor parte del genoma, la secuencia de ADN es idéntica para todos los seres humanos. Estos locus que no varían son locus ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z57 monomórficos. En una proporción de locus se han detectado una serie de variantes que tienden a mantenerse a lo largo de generaciones. Consisten en cambios de bases o repeticiones en las secuencias de ADN. Este hecho da lugar a que para un determinado locus existan 2 o más alelos que se expresan de forma diferente en diferentes individuos. El análisis de asociación genética consiste en la comparación de las frecuencias alélicas de estos polimorfismos entre casos (pacientes) y controles (sujetos sanos). Una diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de un determinado polimorfismo entre los casos y los controles significa una posible relación (factor de riesgo o factor protector) del locus que contiene el polimorfismo con la enfermedad o rasgo fenotípico en estudio. Puede suceder que dicho locus no se relacione directamente con la enfermedad pero se herede en bloque con el verdadero locus causal (ver más adelante) Los estudios de asociación tratan de explicar la heredabilidad de un rasgo o de una enfermedad, que se define como la parte de la variación fenotípica que se debe a la variación genética aditiva (Visscher et al, 2008). Su valor varía entre 0 y 1. De forma ideal, los estudios de asociación deberían identificar todos los locus implicados y caracterizar las complejas relaciones que se establecen entre ellos. Los SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) son los polimorfismos más simples y más empleados en los estudios de asociación (Hartwell et al, 2011a) (figura 14). Consisten en el cambio de una única base nucleotídica, de modo que el locus resultante presenta únicamente 2 alelos La frecuencia del alelo menor (MAF) ha de ser mayor del 1 %. Si es inferior se hablará de variante rara, no de SNP. Los SNP representan la mayor parte de la variabilidad genética entre individuos. Sus principales ventajas son su simplicidad, que facilita el análisis automatizado a gran escala, su estabilidad, su 58 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 14. SNP consistente en un cambio de adenina (A) por timina (T) abundancia (aproximadamente uno cada 1000 pares de bases) y su distribución homogénea por todo el genoma. La mayor parte de los SNP no alteran la función génica por encontrarse en regiones que no se expresan. Algunos pueden localizarse en secuencias codificantes (cSNP) (Cargill et al, 1999) o en regiones reguladoras (rSNP) (Hudson, 2003). Los análisis genómicos de los genetistas James Watson y Craig Venter mostraron respectivamente 1 096 873 y 924 333 SNP, de los que 2641 y 2374 respectivamente dieron lugar a cambios en los aminoácidos de las proteínas implicadas (Hartwell et al, 2011a). La figura 15 (en la página siguiente) representa de forma muy esquemática el fundamento de los estudios de asociación. El sujeto sano y el sujeto que presenta una enfermedad compleja tienen la misma estructura en los genes A, B, D y E. Los alelos de los SNP de estos genes muestran una frecuencia similar. Las frecuencias de los alelos del SNP del gen C son muy diferentes. Si se demuestra que esta diferencia entre sujetos sanos y enfermos es estadísticamente significativa existe una alta probabilidad de que el gen C esté relacionado con la patogenia de la enfermedad o esté asociado a un factor patogénico. Según el número de SNP analizados y la hipótesis de partida los estudios de asociación pueden dividirse en (Zondervan, 2011): 1. Estudios de genes candidatos. Se analizan aquellos genes que forman parte de una ruta biológica sobre la que existe cierta evidencia experimental de su implicación en el desarrollo de una determinada enfermedad. Se seleccionan varios SNP que cubren toda la extensión del gen en estudio. En muchos casos varios SNP forman bloques haplotípicos (ver más adelante). De cada bloque solo se estudia un SNP, el llamado tagSNP. Este es el tipo de estudio con el que se ha hecho este trabajo. 2. Genome Wide Association Studies (GWAS). Son estudios de asociación de todo el genoma. En este caso no hay hipótesis previa. Se emplean módulos de genotipado genéricos que cubren parte o la totalidad del genoma, con mayor o menor cobertura 500k – varios millones de SNP. El genoma humano comprende aproximadamente 3200 Mb, de modo que se pue- ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z59 60 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Figura 15. Fundamento de los estudios de asociación. Se basan en las diferencias de frecuencias de ciertos SNP entre los sujetos sanos y los pacientes con enfermedades complejas. Explicación en el texto de capturar gran parte de la variabilidad del genoma mediante el concepto de bloques de desequilibrio de ligamiento (ver más adelante). De los 20 000 genes que posee el genoma humano, 8000 se expresan en todas las células y tejidos y 6000 únicamente en el cerebro. Es decir, en el cerebro se expresan un total de 14 000 genes (Purves et al, 2013). 1. PROBLEMAS DE LOS ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN 1.1. La hipótesis enfermedad común variante común Los estudios de asociación suelen asumir la hipótesis enfermedad común – variante común (Lander, 1996, Chakravarti, 1999). Es decir, las variantes comunes (SNP con frecuencias superiores al 1 % de la población) modifican el riesgo en la mayoría de enfermedades complejas. Los resultados de los estudios de asociación realizados hasta la fecha, sin embargo, han sido poco concluyentes y parecen cuestionar esta hipótesis. Aunque los estudios de asociación, especialmente los GWAS, han identificado gran cantidad de polimorfismos de numerosos rasgos, tan solo han permitido explicar una pequeña parte de la heredabilidad (Mahen, 2008). En general, identifican variantes con efectos muy pequeños, con un cociente de probabilidades (Odds ratio, OD) de entre 1,1 y 1,3, es decir los portadores del SNP analizado incrementan el riesgo de padecer la enfermedad en 10 - 30 % respecto al riesgo de los no portadores. Es probable que haya otras variantes no detectadas porque aumentan el riesgo en valores más pequeños, quizás menores del 1 %. Por tanto, tal vez las enfermedades complejas estén causadas por una conjunción de variantes comunes y raras (Pritchard, 2001, Cirulli y Goldstein, 2006). Un ejemplo muy ilustrativo es la estatura de los individuos. Aunque se trata de un rasgo, se analiza de forma similar a las enfermedades complejas mediante estudios de asociación. Se sabe que la heredabilidad de la altura es muy grande, en concreto de 0,8. Es decir el 80% de la variación fenotípica depende de factores genéticos aditivos (Silventoinen, 2003). Diversos GWAS, sin embargo, no han conseguido explicar más del 0,16 de la variación fenotípica ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z61 (Visscher et al, 2011). Aplicando un método de análisis en que se consideran en conjunto todos los SNP implicados el valor se incrementa a 0,45. Aun así, no se detecta el 0,35 de variación fenotípica que depende de factores genéticos (Yang et al, 2010). Esta proporción de la heredabilidad que los GWAS no pueden explicar se denomina heredabilidad perdida. Existen por lo tanto, serias dificultades para descifrar el componente genético de las enfermedades complejas. Algunas de las razones de las limitaciones de los estudios de asociación para detectar factores genéticos de susceptibilidad, para detectar la heredabilidad perdida, son las siguientes (Manolio et al, 2009): 1. Variantes comunes. Cada una de ellas con un efecto muy pequeño, de modo que se necesita identificar una gran cantidad para determinar la asociación 2. Variantes raras. Que las variantes de susceptibilidad aparezcan en menos del 1 % de la población. 3. Epistasis. La expresión de un determinado genotipo viene condicionada por la acción de determinados alelos pertenecientes a otros genes, bien en heterocigosis (epistasis dominante) o en homocigosis (epistasis recesiva). 4. Interacciones gen-ambiente. Determinados gen o genes tienen efecto solo en presencia de determinados factores ambientales. 5. Infraestimación del ambiente compartido por una misma familia 6. Posible papel de otros polimorfismos que, hasta ahora, no se valoraban como los CNVs (copy-number variations). En la figura 16 se expresa gráficamente el problema para determinar la parte genética de las enfermedades complejas. Las variantes comunes implicadas en las enfermedades complejas tienen un efecto en la OR muy pequeño, al contrario que las mutaciones causantes de enfermedades mendelianas, de muy baja frecuencia, pero con una enorme probabilidad de causar la enfermedad. Como se planteará en la discusión, puede que algún alelo al que se le atribuye un papel patogénico en enfermedades mendelianas, sea, tal vez, una variante de baja frecuencia con efecto intermedio alto (OR intermedio alta) sobre la enfermedad. 62 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.2. La maldición de la dimensión Otras limitaciones de los estudios de asociación tienen que ver con la metodología. Uno de los principales problemas de estos estudios, principalmente GWAS, es la maldición de la dimensión (curse of dimensionality) (Bellman, 1961) Existe un elevado número de variables predictoras en relación al número de observaciones. Estas variables están potencialmente correlacionadas y además pueden interactuar (en un sentido biológico o estadístico) en su asociación con la variable respuesta. En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas o adaptado otras existentes para este tipo de datos, que permiten abordar el problema de la dimensión: Clasification and Regression Trees (CART), Randomforest, Logic Regression, Multifactor Dimensionality Reduction (MDR)… Estos métodos se basan en la reducción de la dimensión, la selección de variables o el análisis directo de un gran número de variables. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z63 Figura 16. Relación entre la frecuencia alélica y el efecto (OR) sobre la enfermedad estudiada. Explicación en el texto (modificado de Manolio et al, 2009). Una de las aproximaciones para abordar este problema la constituyen las técnicas de selección de variables. Esta selección de variables se puede hacer empleando métodos univariantes o multivariantes (Urrea, 2009). 1. Univariantes. Es la aproximación más habitual en este tipo de estudios. Se establecen unos criterios para medir la asociación de cada una de las variables predictoras con la respuesta y se determinan las más significativas según un umbral preestablecido. Esta aproximación univariante de selección de variables presenta varios inconvenientes: z No permite considerar la existencia de posibles correlaciones. Por tanto no es posible medir el efecto combinado de diferentes locus y se infraestima la contribución genética en presencia de interacciones (Heidema et al, 2006) z El problema de las comparaciones múltiples. Al estudiar la asociación de diferentes marcadores de manera independiente la probabilidad de error tipo I se incrementa y hay que realizar ajustes para corregir el nivel de significación: Bonferroni, False Discovery Rate (FDR)... Esta corrección implica que la probabilidad de detectar un efecto cuando realmente está presente disminuya, de modo que se pueden estar perdiendo asociaciones débiles. 2. Multivariantes. Las variables predictoras se consideran en un contexto dinámico. Permiten incorporar interacciones entre las variables. 1.3. La subestructura poblacional Las poblaciones estudiadas pueden ser genéticamente homogéneas, de modo que los individuos se cruzan al azar con cualquier otro individuo de la población (panmixia) o puede estar dividida en diferentes subpoblaciones, cada una con una estructura genética propia por diferente origen, en las que los individuos de cada subpoblación tienden a cruzarse entre sí. En este último caso se dice que la población está estructurada o estratificada. Las diferencias étnicas de estos tipos de población representan un factor de 64 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA confusión para los estudios de asociación, puesto que las diferencias de frecuencias en un polimorfismo entre los casos (pacientes) y los controles puede deberse a estas diferencias y no a la enfermedad que se estudia (Astle y Balding, 2009). Una forma de evitar este factor de confusión consiste en utilizar para los estudios de asociación poblaciones genéticamente homogéneas de un tamaño no demasiado pequeño. En caso contrario puede surgir como otro factor de confusión el parentesco oculto, que se trata más adelante. Han de ser, por tanto, poblaciones con tasas de inmigración bajas. Las poblaciones europeas son, en general, bastante homogéneas genéticamente (Lao et al, 2008). Hay que tener en cuenta que las inmigraciones son un fenómeno relativamente reciente, que comenzó a mediados del siglo XX. Tradicionalmente eran los europeos los que emigraban a otros continentes. No siempre se dispone de la posibilidad de estudiar poblaciones homogéneas genéticamente. Si la población estudiada no presenta esta característica se pueden aplicar diversos métodos estadísticos, como la prueba de Armitage (Devlin y Roeder, 1999), para calcular el factor de inflación (λ), es decir, la variación en los resultados de los estudios de asociación que se debe a la estructura poblacional y no a la enfermedad que se estudia. La población gallega se incluye dentro de las genéticamente homogéneas, debida a la baja incidencia de imigración. La historia de la población gallega comenzó con la llegada del hombre moderno a la Península Ibérica, hace unos 40 000 años, procedente en su mayoría de Oriente Próximo (Bosch et al, 2001, Salas et al, 1998). La segunda gran oleada de migraciones a Europa, ocurrida en el Neolítico, procedente de Oriente Medio, tuvo menor importancia en la Península Ibérica, especialmente en el Norte y Oeste (Bosch et al, 2001, Salas et al, 1998). Las colonizaciones posteriores de los celtas, procedentes del Norte de Europa, y de los romanos tuvieron relativamente poca importancia en el acervo genético de la población gallega, puesto que el número de invasores siempre fue muy bajo respecto a la población autóctona (Salas et al, 1998). Esta tónica se mantuvo en la Edad Media, en la que Galicia se vio invadida por los suevos (unos 30 000 sujetos), visigodos (unos 200 000 en toda la Península Ibérica poblada por unos 4 000 000 habitantes) y los musulmanes procedentes del Norte de África que ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z65 apenas ocuparon Galicia durante 50 años. Otras migraciones sucedidas en esta época fue la de bretones que huían de los invasores germánicos en el siglo VI, judíos y francos a través del Camino de Santiago (Pallarés, 2005). Algunos estudios de genética de poblaciones han mostrado, sin embargo, la presencia de haplogrupos en la población gallega procedentes del Norte de África e, incluso, de África subsahariana. Una parte se atribuye al intercambio de población durante la romanización, la invasión musulmana (mayoritariamente de etnia bereber) y el comercio de esclavos. El resto de los haplogrupos se remontan a finales del Paleolítico, hace unos 11 000 años (Cerezo et al, 2012) Sobre la inmigración en la Edad Moderna, en el período entre 1480 y 1835 se han realizado diversos estudios que concluyen que desde el punto de vista demográfico las inmigraciones tuvieron una importancia mínima. En 1791 se contabilizaron 649 cabezas de familia extranjeros (Salas Ausens, 2004), sobre una población de 1 345 805 (Fernández Cortizo, 1997). A finales del siglo XVIII comenzaron a establecerse comerciantes catalanes que iniciaron la industria de la salazón. Llegaron a ser unos 15 000 si bien no todos vivían permanentemente en Galicia (Meijide Pardo, 1969). Además entonces había algunas industrias florecientes como el papel, el textil y los astilleros, que atraían mano de obra foránea (Rey Castelao, 1994). La caída de esta industria en los años 1830 cortó de raíz la inmigración y dio lugar a una emigración masiva, que duró 150 años, primero a Iberoamérica y a partir de la Segunda Guerra Mundial a Europa Central hasta los años 1970 (de Juana López y Vázquez González, 2005). En los últimos 25 años Galicia ha visto un aumento de la población extranjera, que en la actualidad es de 97 863 personas, lo que supone un 3,56 % de la población total (datos del Instituto Nacional de Estadística, 1 de enero de 2014). Dado que es un fenómeno históricamente reciente su influencia en el acervo genético gallego es nula. 66 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA prueba de Fisher,..). De este modo se comprueba si la población considerada está en equilibrio de HW. En los estudios de asociación es necesario verificar que los SNP genotipados se encuentran en equilibrio de HW en la población considerada. Si esto no se cumple, las comparaciones entre casos y controles resultan muy complicadas ya que no se podrá determinar si una asociación dada tiene que ver con la enfermedad o con la heterogeneidad de la población. 5. ESTUDIOS DE ASOCIACIÓN ALÉLICA. MODELOS DE HERENCIA El genotipo de un individuo para un determinado marcador viene dado por la combinación de los dos alelos en el locus considerado. Si se denominan los dos posibles alelos como A y a, asumiendo a como el alelo más frecuente o natural (wild type) y A el alelo menos frecuente, existen tres posibles genotipos: el genotipo AA será el homocigoto para el alelo menos frecuente, Aa el heterocigoto y aa el homocigoto para el alelo más frecuente. Por lo tanto, para cada SNP hay tres posibles genotipos. Basándose en este hecho, se pueden evaluar diferentes modelos genéticos para describir la relación entre el genotipo de un individuo y el fenotipo o rasgo. En el contexto de los estudios de asociación genética, el fenotipo se refiere la presencia o ausencia de una determinada enfermedad. En una escala binaria se denomina Y, de modo que Y = 1 afectados (casos) Y = 0 no afectados (controles) En el caso de enfermedades mendelianas los modelos genéticos son determinísticos: el genotipo determina el fenotipo. En el caso de las enfermedades complejas, la relación entre el genotipo y el fenotipo es más compleja. Se establece una relación probabilística, el genotipo influye en las probabilidades de desarrollar la enfermedad. Dado el genotipo de un individuo (G), el efecto probabilístico del locus en el fenotipo Y viene descrito por P(Y|G), que se denomina función de penetrancia y define la probabilidad de enfermedad condicionada al genotipo (Laird y Lange, 2011) ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z73 Los cuatro modelos de herencia más empleados en genética estadística son los siguientes: 1. Modelo codominante. Es el más general. Se consideran los tres genotipos por separado suponiendo que cada uno proporciona un riesgo de enfermedad diferente. No se hacen otras consideraciones P (Y=1|AA) ≠P (Y=1|Aa) ≠P (Y=1|aa) 2. Modelo dominante. Solo es necesaria una copia del alelo de riesgo para tener un efecto sobre el genotipo. Supone que una única copia del alelo A es suficiente para modificar el riesgo y poseer dos copias del alelo lo modifica en igual magnitud. P (Y=1|AA) = P (Y=1|Aa) = 1 y P (Y=1|aa) = 0 3. Modelo recesivo. Son necesarias dos copias del alelo de riesgo A para modificar el riesgo de enfermedad. P (Y=1|aa) = P (Y=1|Aa) = 0 y P (Y=1|AA) = 1 4. Modelo aditivo. Dependiendo de la escala, la probabilidad del genotipo heterocigoto están entre la de los dos homocigotos. El riesgo asociado al heterocigoto es intermedio entre los dos homocigotos. En escala lineal: P (Y=1|Aa) = 0,5 [(Y=1|AA) + (Y=1|aa)] En escala log (multiplicativa): ——————————————— P (Y=1|Aa) = √P(Y=1-AA) P(Y=1|aa) Estos genotipos, que constituyen variables categóricas se recodifican como variables numéricas o indicadoras. A continuación se muestra la codificación de los genotipos según los diferentes modelos genéticos. 74 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Genotipo Codominante Dominante Recesivo Aditivo aa 0 0 0 0 0 Aa 1 0 1 0 1 AA 1 1 1 1 2 6. EL CONTROL DE CALIDAD DE LAS MUESTRAS Antes de proceder al análisis estadístico de la muestras obtenidas han de aplicarse una serie de controles de calidad que descarten la eventual existencia de sesgos (Anderson et al, 2010). El control de calidad se aplica tanto a los individuos como a los marcadores. En el caso de los individuos, deben determinarse para su posible descarte: 1. individuos con información discordante en cuanto al sexo, 2. individuos que sobrepasan un umbral (entre 3-7 %) de genotipos perdidos, 3. individuos duplicados o emparentados, 4. individuos con diferentes orígenes genéticos. En cuanto a los marcadores, ha de considerarse la exclusión de: 1. SNP con un exceso de genotipos perdidos, 2. SNP que se desvíen del equilibrio de Hardy Weinberg en el grupo control, 3. SNP con diferencias importantes en cuanto a genotipos perdidos entre los casos y los controles, 4. marcadores con una frecuencia del alelo menor (MAF) muy baja. Los genotipos perdidos se determinan mediante programas matemáticos denominados algoritmos de determinación del genotipo, que estiman la probabilidad de los posibles genotipos en un determinado marcador (p.e. AA, AT, TT). Se establece un umbral. Si la probabilidad de alguno de los genotipos no supera este umbral, será un genotipo perdido. Para un determinado genotipo (G) se aplica la proporción dela tasa de determinación por muestra (call rate per simple) para calcular los genotipos perdidos por cada SNP. ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA z75 nº de individuos con G perdido Tasa de determinación por muestra=————————————————————————— nº total de individuos Para el cálculo de la proporción de genotipos perdidos en un individuo dado: nº de SNP con genotipos perdidos Genotipos perdidos por individuo=——————————————————————————— nº total de SNP analizados (Sullivan y Purcell, 2010) 7. IMPUTACIONES DE DATOS NO OBTENIDOS Los métodos de imputación se basan en la comparación de los polimorfismos de una localización cromosómica pertenecientes a una muestra de individuos de una población genéticamente homogénea con un panel de referencia formado por individuos genotipados en locus similares de una población genéticamente similar (Howie et al, 2009). El panel de referencia más empleado es el proyecto internacional HapMap. Estos métodos se basan en dividir los SNP genotipados en dos grupos: 1. tipados (T), que se encuentran en la muestra y en el panel de referencia, 2. no tipados (U), que no se encuentran en la muestra y sí en el panel de referencia. Se asume que los haplotipos que muestran coincidencias en T, también las mostrarán en U. De este modo se extrapolan los resultados de los marcadores de la muestra a los marcadores de referencia del panel, con lo que se incrementa el número de marcadores del haplotipo de la muestra. Los métodos de imputación emplean algoritmos matemáticos y pueden estimar con gran exactitud genotipos no observados, de modo que la probabilidad de encontrar asociaciones verdaderas es mayor. 76 zANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA i. Selección de pacientes y controles 1. POBLACIÓN DE ESTUDIO Y CARACTERÍSTICAS DE LA MUESTRA La población del estudio la constituyeron pacientes diagnosticados de EP, originarios de la Comunidad Autónoma de Galicia (población 2 747 559 habitantes, datos del Instituto Nacional de Estadística, 1 de enero de 2014). Por razones logísticas, la mayoría de ellos pertenecían al área sanitaria de Santiago de Compostela. No existen estudios epidemiológicos sobre el número de pacientes con EP en el área sanitaria de Santiago. Aplicando estudios de prevalencia en la población general realizados en otras áreas de España (Artacoz Sanz et al,1995; Criado Álvarez et al,1998; Martínez Suárez y Blázquez Menes, 2000) se puede estimar un número entre 750 y 1000 personas con la enfermedad. Esta prevalencia permitió garantizar que se alcanzaría un número mínimo de 200 casos para incluir en la presente investigación. La diversidad genética de la población de estudio es muy baja (Flores et al, 2004). La situación geográfica de Galicia, en el noroeste peninsular y aislada por cadenas montañosas del resto de la Península ha hecho que las inmigraciones fuesen, hasta tiempos recientes, irrelevantes como se expuso anteriormente (Brion et al, 2004). Esta característica socio-geográfica de Galicia hace que, para polimorfismos autosómicos comunes, no exista estratificación genética relevante en la población gallega. Por ello se trata de una población adecuada para estudios genéticos basados en un diseño de de casos y controles con marcadores autosómicos frecuentes, aunque en este tipo de poblaciones es necesario tener más cautela cuando se usan marcadores genéticos poco frecuentes o raros (MAF <5%) debido a la posible existencia de parentesco oculto. MATERIAL Y MÉTODOS z77 V. Material y métodos 2. GRUPO DE ESTUDIO. CRITERIOS DE INCLUSIÓN El diagnóstico de la enfermedad de basa exclusivamente en criterios clínicos. Para minimizar sesgos de selección solamente se incluyeron los pacientes que cumplieron los criterios de Gelb et al, 1999, para el diagnóstico probable de EP (Anexo II). Se descartaron los criterios de la UK Parkinson’s Disease Brain Bank Society (Hughes et al,1992b) porque excluye la enfermedad en el caso de tener más de un familiar afectado (Anexo III). El que los criterios de Gelb para diagnóstico probable de EP requiera un mínimo de 3 años de evolución de la enfermedad disminuye la probabilidad de incluir otros parkinsonismos degenerativos. La inclusión se realizó de acuerdo a los siguientes criterios: a. Diagnóstico de EP probable según los criterios de Gelb (AnexoII). b. Al menos 3 abuelos de padres gallegos c. Obtención de consentimiento informado (Anexo IV) No se incluyeron en el estudio de asociación miembros de la misma familia. Tampoco se incluyeron pacientes con mutaciones conocidas de los genes PARK2 oLRRK2,ya que su patogenia es diferente de la EP idiopática. No se consideró límite de edad. Las variables clínicas que se midieron en estos pacientes figuran en la tabla 9. 3. GRUPO CONTROL. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Se analizó un grupo control de sujetos sin EP. Para evitar sesgos de selección se trató de minimizar la posibilidad de que los sujetos de este grupo desarrollasen EP, por lo que se aplicaron los siguientes criterios de inclusión: a. Edad mayor de 60 años b. Ausencia de datos de parkinsonismo en la exploración neurológica c. Al menos 3 abuelos de padres gallegos 78 zMATERIAL Y MÉTODOS d. Ausencia de antecedentes de parkinsonismo por fármacos e. Ausencia de antecedentes familiares de EP f. Ausencia de historia de depresión g. Ausencia de otra enfermedad neurológica relevante h. Obtención de consentimiento informado (Anexo V) El criterio a. se incluyó porque la posibilidad de desarrollar la enfermedad disminuye conforme decrece la esperanza de vida. Por esta razón solamente se incluyeron personas de edad media avanzada (mayores de 60 años). El criterio c. se justifica para igualar la variable origen geográfico al grupo de pacientes y minimizar un posible efecto de estratificación genética poblacional en las presumibles diferencias observadas. Los criterios d. y e. se establecieron con el fin de excluir a sujetos que tienen una mayor predisposición a padecer la EP. También se ha constatado que en pacientes con EP la depresión puede formar parte de la enfermedad y anteceder a los problemas motores, por lo que se prefiere excluir a sujetos con este trastorno psiquiátrico (criterio f). En cuanto a los datos de los sujetos control tan solo se incluyó el sexo y la edad en el momento en que se tomó la muestra. MATERIAL Y MÉTODOS z79 Variables clínicas que se evaluaron en el grupo de pacientes. Variable Definición Escala Edad Edad en el momento Años cumplidos del diagnóstico Sexo Hombre / Mujer Síntoma predominante Síntoma que domina inicialmente T / BR* Años de evolución Años desde el inicio de la EP Años Complicaciones precoces Discinesias o fluctuaciones SÍ / No en los 3 primeros años Antecedentes familiares EP o demencia en Sí (1º / 2º grado) / No familiares de 1º o 2º grado *T:temblor; BR: bradicinesia-rigidez Tabla 9. Variables clínicas que se evaluaron en el grupo de pacientes. 4. RECLUTAMIENTO Y TOMA DE MUESTRAS La mayoría de los pacientes (73,7%) se reclutaron de las consultas de la Unidad de Trastornos del Movimiento del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. El 26,3% restante de los pacientes se enviaron del Hospital General de Vigo, del Hospital de Pontevedra y del Hospital San Rafael de La Coruña, donde se evaluaron por otros neurólogos del equipo investigador. Los criterios de selección para los pacientes se diseñaron buscando la mayor especificidad posible, por lo que no se realizó la inclusión de ningún paciente en el caso de que hubiese duda o información incompleta. Elobjetivo de esta selección fue evitar incluir en la medida de lo posible pacientes que no tuviesen realmente EP. La Unidad de Trastornos del Movimiento (UTM) del Servicio de Neurología del Hospital Clínico comenzó a finales de los 80 como una consulta semanal monográfica a cargo de uno de los directores de este trabajo. En dicha consulta se veían pacientes con EP y otros trastornos del movimiento y se infiltraba toxina botulínica. En los años siguientes la UTM fue creciendo con un aumento progresivo del número de consultas semanales. En 2001, en colaboración con los servicios de Neurocirugía y Neurofisiología, se comenzó con el tratamiento quirúrgico de la EP avanzada y otros trastornos del movimiento. Desde 2004 la UTM está formada por 3 neurólogos, entre los que están uno de los directores de este trabajo y el autor. Además de la colaboración permanente con miembros de los servicios de Neurocirugía y Neurofisiología para la realización de cirugía de estimulación cerebral profunda, la UTM cuenta también con una neuropsicóloga. En la actualidad se realizan 3 consultas semanales de trastornos del movimiento, 3 consultas de EP avanzada, 2 de valoración prequirúrgica y seguimiento posquirúrgico, 2 consultas para tratamiento con toxina botulínica. Cada mes se consultan 80 – 100 pacientes con EP. La UTM es centro de referencia nacional para cirugía de EP yotros trastornos del movimiento. A finales de 2013 se habían llevado a cabo 206 cirugías de estimulación cerebral profunda. Además se tratan de forma rutinaria EP avanzada con tratamientos de infusión (apomorfina y levodopa duodenal). A finales de 2013 se habían colocado 163 infusores de apomorfina, de los que 69 estaban activos, y 6 infusores de levodopa intraduodenal, 4 activos. 80 zMATERIAL Y MÉTODOS Por lo tanto se trata de una unidad con una amplia experiencia en el diagnóstico y tratamiento de la EP en todas sus fases evolutivas. Durante el período de abril de 2005 a febrero de 2007 en las consultas de la UTM, a los pacientes, evaluados por el autor, que cumplían los criterios previamente establecidos se les propuso participar en el estudio. Aunque se disponía de bases de datos de pacientes, no fue necesario recurrir a este método para el reclutamiento. El elevado volumen de consulta de pacientes con EP llevado a cabo mensualmente en la UTM garantizaba alcanzar el número de casos previstos en un tiempo razonable, con un reclutamiento prospectivo. Todos los pacientes candidatos para el estudio ya se habían diagnosticado previamente al día del reclutamiento, pues uno de los criterios de inclusión era que llevasen un mínimo de 3 años con síntomas motores. El diagnóstico de la EP fue clínico, basándose en la presencia de bradicinesia con rigidez o temblor, afectación asimétrica y respuesta mantenida a la medicación dopaminérgica. No se realizaron pruebas complementarias diagnósticas ya que no son necesarias según los criterios aplicados en la actualidad internacionalmente para el diagnóstico de la EP. Si bien a alguno de los pacientes se le había realizado un SPECTBCIT en fases anteriores de la enfermedad, cuando el diagnóstico no era tan claro. Se incluyeron algunos pacientes que cumplían los criterios, vistos por primera vez en la UTM, previamente diagnosticados en otras áreas sanitarias. Los pacientes con algún síntoma que no encajase con el tiempo de evolución de la enfermedad (p.e. disfagia, alteraciones autonómicas, caídas frecuentes u oftalmoplejia en estadios intermedios) ocon síntomas atípicos (p.e. síndrome cerebeloso) no se incluyeron. La falta de respuesta al tratamiento en estadios muy avanzados no fue criterio de exclusión, ya que es una manifestación de la evolución natural de la EP. En las entrevistas se explicó a los pacientes en qué consistía el estudio, su objetivo principal, metodología y riesgos, y si estaban de acuerdo en donar una muestra de ADN, previa firma de un consentimiento informado específicamente diseñado y aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica de Galicia (AnexoIV). Se recalcó que la participación era completamente voluntaria, que no se beneficiarían directamente del estudio, que solamente el equipo investigador conocería el origen de las muestras y que no se les co- MATERIAL Y MÉTODOS z81 municaría ningún resultado a título individual, salvo en aquellos casos en que se identificase la presencia de una mutación patogénica (es decir, que se diagnosticase una forma mendelianas de la enfermedad). Alos pacientes que refirieron antecedentes familiares de EP se les solicitó una información más detallada de sus relaciones familiares y de los parientes afectados para poder realizar un árbol genealógico. Los datos clínicos de los pacientes, codificados, junto con las variables clínicas consideradas (ver apartado 2), se introdujeron en una base de datos construida específicamente para esta investigación mediante el programa Microsoft Excel®. Los controles se reclutaron, siguiendo los criterios del apartado 3, en diversos centros de Galicia, la mayoría de ellos en el área sanitaria de Santiago de Compostela y algunos en el área de La Coruña. Se siguieron diferentes estrategias: 1. Cónyuges de los pacientes del estudio 2.Sujetos sin datos de enfermedad degenerativa ni otras patologías relevantes que acudieron a la consulta de Neurología por otros motivos o como acompañantes 3. Visitas programadas a centros de salud, asociaciones y residencias de mayores. Alos posibles controles se les explicó en qué consistía el estudio ysi estaban de acuerdo en donar una muestra de su ADN previo consentimiento informado (Anexo V). Como en el caso de los pacientes, se insistió en la voluntariedad, confidencialidad de los datos y ausencia de beneficio directo paraellos y de comunicación de resultados. Los datos codificados de los sujetos control, se introdujeron en la base de datos construida con el programa Microsoft Excel®. Tanto para los pacientes como para los sujetos control, la toma de muestra se hizo en la propia consulta (o en los centros que se visitaron). Se extrajeron 20ml de sangre periférica por venopunción en 2 tubos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de 10 ml. 82 zMATERIAL Y MÉTODOS plied Biosystems), con una resolución inferior a 2 nucleótidos. Los lecturas de los genotipos se generan con el software GeneMapper v3.5. 1.4.2. Genotipado por MassArray (Sequenom®) MassArray (Sequenom®) es una plataforma para análisis cuantitativo de frecuencias alélicas mediante espectrometría de masa, que alcanza un alto nivel de eficiencia a través del análisis multiplex de SNP (potencialmente hasta 10-12 por reacción) y de mezcla (pooling)de muestras de ADN (Bansal et al., 2002). En cada reacción se utilizan 25 ng de ADN, dos cebadores específicos para el locus de interés diseñados con el software MassARRAY®Assay Design yun cebador universal marcado con biotina. Los productos de PCR se inmovilizan sobre partículas paramagnéticas cubiertas con estreptavidina y se obtiene de cada producto mediante desnaturalización una cadena única que será utilizada para la reacción de extensión del primer (MassEXTEND). Para esta reacción se utiliza un cebador específico y una mezcla de terminación de tres dideoxinucleótidos. Los productos así obtenidos se resolubilizan del soporte sólido y 15 nl de muestra se transfieren con un pipeta piezoeléctrica a un chip de silicona sobre el que tiene lugar el análisis mediante láser con el espectrómetro de masa MassARRAYde SEQUENOM.El analizador MassARRAYutiliza una técnica de espectrometría de masa con deabsorción/ ionización láser asistida por matriz - tiempo de vuelo (MALDI-TOF). En cada ensayo se pueden analizar dos chips, cada uno con 384 productos. Un software incluido con el sistema (MassARRAY  Typer)se utiliza parala recogida y el análisis de los datos. Para la determinación de frecuencias alélicas se procesan los espectros de masa y se calcula el área bajo cada pico individual (representando un alelo) dividida por la suma total de área de los picos. Estas áreas representan la estimación de frecuencias alélicas. Se ha validado este método de mezcla de muestras para el cálculo de frecuencias alélicas y se ha estimado que el margen de error es de un 4 % (Bansal et al.,2002). MATERIAL Y MÉTODOS z89 1.5 Métodos y análisis estadístico El análisis del poder estadístico se realizó empleando del software Quanto v.1.2.4 (Gauderman et al,2006). Mediante un modelo logarítmico aditivo, este estudio presenta un poder estadístico de 0.80 para detectar tamaños de efecto moderados (OR ≥1,7 con un error tipo I de 0,05) para SNP con MAF>0,10. Con el mismo modelo genético, considerando que muchos SNP alcanzan MAF hasta de 0,40 el tamaño del efecto detectado podría llegar a OR =1,4 para detectar tamaños de efecto menores, la muestra de este estudio es escasa. El control de calidad de los datos de genotipado se realizó siguiendo las recomendaciones para estudios de asociación de genes candidatos (Anderson et al,2010). Las diferencias significativas en los genotipados entre casos y controles se valoraron mediante la prueba exacta. La tasa de determinación (call rate) mínima parapasar el control de calidad se estableció en 0,80 por muestra y 0,95 por SNP, respectivamente. Es decir, las muestras que no superaron un 80% de SNP genotipados, así como los SNP que no superaron un 95% de muestras genotipadas, no se incluyeron en el análisis final. Además, se excluyeron todos los marcadores con MAF <0,10 así como los SNP que no estuviesen en equilibrio de Hardy Weinberg en controles (p <0,01). El análisis de asociación se llevó a cabo utilizando el paquete SNPassoc R package,perteneciente al programa de estadística R. Se aplicó una regresión logística (González et al,2007) con un modelo logarítimo aditivo. La regresión logística se basa en la ecuación: Yi=α+βXi donde Yirepresenta el genotipo (en este caso EP), Xicorresponde al genotipo de cada individuo (en este caso el alelo menor), βindica cómo varía Ysegún X y αes el valor que tomaría Ysi X fuese 0. Otra manera de calcular la regresión logística es con el cociente de probabilidades (odds)entre la probabilidad del genotipo, p(Yi), y la probabilidad de su ausencia, 1 – p(Yi): p(Yi) ODDS = —————= eα + βXi 1–p(Yi) 90 zMATERIAL Y MÉTODOS Con el modelo logarítmico aditivo se considera que el riesgo de los heterocigotos es intermedio entre ambos homocigotos. La significación estadística se valoró mediante la prueba de razón de verosimilitud (likelihood ratio test,LRT), aplicando la ecuación: LRT = 2(lnLiknull –lnLiklogadditive) ln (o log) es el logaritmo neperiano o natural (logaritimo cuya base es al número e), siendo 1 e = lim (1 + ——)n n→∞n Liknull es la probabilidad de que X = 0, es decir de que el genotipo considerado no se relacione con el fenotipo. Liklogadditive es la probabilidad de que X tome el valor que le atribuye en este caso el modelo log-additive. Las pruebas de corrección múltiple se realizaron mediante el False Discovery Rate (FDR) con el paquete informático qvalue R (Storey et al,2003). LD y el análisis de los bloques haplotípicos, tanto en la muestra como en los datos de HapMap se llevaron a cabo con Haploview 4.2 (Barret et al,2005) Para los genes que mostraron SNP con asociación nominal (p<0,05) se realizó una imputación de variantes en regiones candidatas mediante el programa IMPUTE v2.2® y un panel de referencia de múltiples poblaciones (Howie et al,2009). El análisis de asociación de las variantes imputadas –junto con las genotipadas– se llevó a cabo con SNPTESTv2®(Marchini et al,2007). Se realizaron dos análisis estadísticos de forma independiente, con sus correspondientes pruebas de corrección múltiple. Por un lado se consideraron los resultados obtenidos en los polimorfismos de los genes del proteasoma y por otro lado se agruparon el resto de los polimorfismos. Los resultados obtenidos tanto en el genotipado como en la imputación de marcadores se compararon mediante un metanálisis con PDGene (http://www.pdgene.org/) con asociaciones previamente descritas en población española. PDGene es un recurso muy MATERIAL Y MÉTODOS z91 útil para comparar los resultados obtenidos con las asociaciones descritas previamente. Presenta los resultados ya publicados por separado o en metanálisis que incluyen tanto genes como polimorfismos. 1.6 Estudio de replicación Una vez obtenidos los resultados, el estudio de asociación se replicó en una muestra perteneciente a otra población completamente diferente. Esta muestra consistía en 260 controles y 273 pacientes con EP de Ciudad de México y áreas próximas. Los pacientes se reclutaron en la Unidad de Trastornos del Movimiento del Instituto de Neurología y Neurocirugía (INN). Se diagnosticaron según los criterios de UK PD Society Brain Bank.Los controles no tenían historia familiar de trastornos del movimiento. Tanto los pacientes como los controles pertenecían al grupo étnico mestizo mexicano de al menos 3 generaciones. El estudio se aprobó por el comité de ética del INN y todos los pacientes firmaron un consentimiento informado. Los genes con asociación nominal significativa, aún no validados en población española, se analizaron en la muestra de replicación. El método de análisis de las variantes genotipadas e imputadas fue el mismo que se aplicó en la muestra de estudio. Con el fin de no desestimar regiones potencialmente asociadas, se consideraron también marcadores sugestivos de asociación aunque no hubiesen alcanzado significación estadística. 2. ESTUDIO DE FACTORES MONOGÉNICOS Los pacientes portadores de mutaciones en alguno de los genes responsables de formas mendelianas de EP no se incluyeron en el estudio de asociación. Estos casos se caracterizaron con mayor detalle, tanto desde el punto de vista clínico como familiar/genealógico. El análisis de determinantes monogénicos consistió en el despistaje de mutaciones en genes causantes de EP y se llevó a cabo en pacientes con historia familiar de EP o edad de inicio juvenil. Este análisis directo se realizó para los siguientes genes: 92 zMATERIAL Y MÉTODOS a. PARK2:se llevó a cabo la búsqueda de mutaciones puntuales en toda la región codificante por secuenciación directa, así como análisis de dosis génica con MLPA®. b. SNCA: se realizó secuenciación directa y análisis de dosis con MLPA®. c. LRRK2 (PARK8): se efectuó la secuenciación de los exones 31 (p.R1441C, p.R1441G, p.R1441H) y 41 (p.G2019S, p.I2020T), para la detección de las mutaciones más frecuentes. d. PINK1,DJ1,UCHL1 yATP13A2:se llevó a cabo análisis de dosis génica con MLPA®. Las técnicas de análisis genético parala búsqueda de mutaciones en los genes citados fueron las siguientes: 2.1 Análisis de mutaciones por secuenciación El protocolo de secuenciación comprende la amplificación por PCR de los exones codificantes, en algunos casos toda la región codificante (PARK2) y en otros solo algunos exones en los que se hayan descrito mutaciones frecuentes. Para el diseño de cebadores flanqueantes se utilizó el software Primer3 (http://www.genome. wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi). Para excluir la posibilidad de amplificación inespecífica, los cebadores se alinearon con las secuencias de ADN depositadas en las bases de datos públicas en NCBI utilizando BLAST (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/blast.cgi). Los productos de PCR se purificaron mediante digestión por ExoSapIT® y se procedió a continuación a las reacciones de secuenciación con química BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems®). Las sales contaminantes y los terminadores no incorporados se eliminaron mediante filtración con el equipo Montage- SEQ96® (Millipore). Los productos se separaron por electroforesis capilar en un ABI3730xl (Applied Biosystems®). Los electroferogramas se analizaron con el paquete informático Staden. MATERIAL Y MÉTODOS z93 2.2. Análisis de dosis génica por MLPA® (multiplex ligationdependent probe amplification) (Shouten et al., 2002) Mediante MLPA® es posible realizar una cuantificación relativa simultánea de más de 40 fragmentos diferentes de ADN. Esta técnica, similar en muchos aspectos a SNPlex®, consiste en una combinación de 1) ligación selectiva de un par de sondas específicas cuando están hibridadas a una diana a la que son 100 % complementarias, 2) posterior amplificación de los productos de la ligación mediante PCR con un único par de cebadores complementarios a los extremos de las sondas ligadas, 3) separación de los productos amplificados por electroforesis capilar y 4) detección y cuantificación de los productos mediante fluorescencia. Existen múltiples equipos comerciales (MRC Holland)que contienen sondas diseñadas contra dianas de interés agrupadas en función del síndrome clínico (por ejemplo, el equipo para EP contiene sondas dirigidas a genes causantes de esta enfermedad) con un nivel de resolución particularmente apto para la detección de deleciones, duplicaciones y triplicaciones. La cuantificación se realiza mediante la comparación de superficies bajo los picos de fluorescencia generados por los cebadores marcados e incorporados en cada produc- to. Las sondas se diseñana contra dianas de 50-70 nucleótidos, lo que permite interrogar la dosis de un exón determinado. Por cuestiones de economía y eficiencia del diseño, no todos los exones de los genes asociados a cierta enfermedad están incluidos en un equipo comercial determinado, generalmente se incluyen todos los exones de los genes más relevantes o de mayor prevalencia. Se empleó el equipo SALSA® MLPA® P051-C1/P052-C1 (MRC- Holland)diseñado especialmente paraEP.Este equipo permite identificar las siguientes alteraciones en los genes causantes de EP: a. SNCA:el equipo comercial utilizado detecta cambios de dosis en los 6 exones codificantes del gen. Este equipo contiene, además, una sonda específica para detectar la mutación p.A30P. b. PARK2:el equipo permite detectar alteraciones de dosis en cualquier región del gen de la parkina, pues contiene dos sondas diferentes para cada uno de los 12 exones del gen. 94 zMATERIAL Y MÉTODOS c. LRRK2:el equipo incluye sondas solamente para 7 de 51 exones. Además, tiene una sonda específica para detectar la mutación más frecuente p.G2019S. d. PINK1:el equipo utilizado permite detectar cambios de dosis en cada uno de los 8 exones de este gen. e. DJ1:se detectan 4 de 7 exones de este gen. f. UCHL1:se analizan 4 de los 9 exones codificantes mediante el equipo empleado. g. ATP13A2: el equipo de MLPA® utilizado contiene sondas para analizar 4 de los 29 exones del gen. h. Además de las sondas paralos genes PARK indicados, el equipo SALSA® MLPA® P051-C1/P052-C1 contiene algunas sondas para el gen GCH1,implicado en la distonía que responde a levodopa. 2.3. Caracterización clínica y genealógica de familias con formas monogénicas En el caso de aquellos pacientes en los que se identificaron mutaciones causales en genes de EP se procedió a citarlos para darles el resultado, explicándoles en qué consistía su enfermedad, por qué se producía y las repercusiones familiares a la luz de los conocimientos actuales. Además se realizó una revisión detallada de la historia, una nueva exploración clínica más detallada y se profundizó en la historia familiar. Una vez informados, aquellos familiares que lo deseasen pudieron realizarse un análisis genético predictivo, previa explicación de que no hay ningún tratamiento preventivo para la EP. Se usó el programa Progeny® para construir los árboles genealógicos. MATERIAL Y MÉTODOS z95 iii. Aspectos éticos El estudio se autorizó por parte del Comité de Ética del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. Las principales consideraciones éticas que se han tenido en cuenta en este estudio son las siguientes: 1. Relativas a la utilización y almacenamiento de muestras de origen humano. Se han respetado la declaración de la UNESCO sobre el genoma y los derechos humanos, así como la Declaración de Helsinki con respecto a la investigación en humanos. En adaptación al Real Decreto 1716/2011, de 18 de noviembre, de tratamiento de muestras con fines de investigación biomédica, una vez concluido el estudio las muestras han pasado a incorporarse en la colección registrada C.0001360 parala línea de investigación de enfermedades neurológicas, cuya responsable es la Dra. María Jesús Sobrido. 2. Relativas a la realización de análisis genéticos con fines de investigación y de diagnóstico. Se respetaron los preceptos establecidos en la Ley14/2007, de 3 de julio, de investigación biomédica. 3. Relativas a la confidencialidad de la información personal y clínica. Dado que el estudio implica la recogida de datos personales (edad, sexo), así como datos referidos a la enfermedad, es necesario garantizar la confidencialidad del manejo de estos datos (Ley Orgánica 15/99 de Protección de Datos de carácter Personal). Para ello, el formulario de recogida de datos clínicos para cada sujeto del estudio estuvo codificado, código que se aplicó también a su muestra de sangre. Solo los miembros del equipo de investigación involucrados en el reclutamiento del paciente han tenido acceso a la información que correlacionaba el código con la identidad del sujeto. 4. Relativas a la voluntariedad y confidencialidad de la participación. A fin de solicitar su consentimiento expreso para la participación en el estudio, tanto a los pacientes como a los 96 zMATERIAL Y MÉTODOS controles se les informó de manera sencilla y comprensible sobre el objetivo y procedimiento de la investigación (anexo II). Específicamente, se les resaltó que no recibirían remuneración alguna y que la decisión o no de participar no influiría en la asistencia médica que fuesen a recibir. Se tuvo especial cuidado de no ejercer ningún tipo de influencia en la libre decisión de participar. 5. Relativos a los resultados del estudio. Se informó a los pacientes y se incorporó a su historia clínica el resultado de los estudios de genes causales conocidos. En el caso del estudio de asociación se mantuvo la confidencialidad sobre el resultado del análisis genético de los sujetos estudiados, resultado que no se incorporó a la historia clínica. MATERIAL Y MÉTODOS z97 OR = 0,70). El polimorfismo rs356219, previamente asociado a EP en población asturiana (Mata et al,2011), pudo imputarse en la muestra de este estudio, con valor p = 0,0099 y OR = 1,34. Los SNP que mostraron asociación junto con el imputado formaron un bloque haplotípico como se muestra en las figuras 20A y B, calculados respectivamente según los valores de D’ y r2. Los resultados de los SNP que mostraron asociación con MAPT / CRHR1 y SNCA se muestran en la tabla 11. Se incluye una columna con los resultados del metanálsis de PDGene para cada polimorfismo. 2. GENES QUE CODIFICAN LAS SUBUNIDADES DEL PROTEASOMA En la muestra de población gallega, se encontraron asociaciones nominales (p <0,05) para 14 SNP pertenecientes a 7 genes que codifican subunidades del proteasoma PSMA1, PSMA3, PSMA6, PSMC3, PSMD1, PSMD6 yPSMD7 (ver tabla 12). La asociación más destacada correspondió al polimorfismo rs10838708 perteneciente a PSMC3 (p = 0,0013, OR = 0,68). Según los cálculos realizados con los genotipos obtenidos, los SNP de este gen que mostraron asociación nominal formaron un bloque haplotípico (fig 21A y B). RESULTADOS z105 en el estudio asociación significativa con la EP Metanálisis Mata (2011) con PdGene Asturias Valor p Valor q OR (IC 95%) valor p /OR Valor p /OR 0,00395 0,0734 0,65 (0,49 - 0,88) 0,0002 / <1 0,00624 0,0927 0,67 (0,50 - 0,89) 0,0017 / <1 0,03667 0,3168 1,32 (1,02 – 1,73) NS 0,00390 0,0735 0,65 (0,49 – 0,88) <5E-08 / 0,78 0,0003 / 0,79 0,00037 0,0273 1,60 (1,23 – 2,08) NS 0,0027 - 0,65 (0,49 – 0,87) <5E-08 / 0,79 0,00357 0,0735 1,61 (1,16 – 2,23) NS 0,0099 - 1,34 (1,04 – 1,71) <5E-08 / 1,28 0,0006 / 1,23 0,01687 0,2090 1,35 (1,05 – 1,73) <5E-08 / 1,27 0,04688 0,3168 0,70 (0,50 – 1,00) <5E-08 / 0,78 pacientes con EP en la muestra es H1/H1 IC 95 % Intervalo de confianza 95% En este caso, ninguna de estas asociaciones permaneció significativa tras aplicar FDR. Las variantes obtenidas se analizaron en la muestra de replicación pero no se obtuvieron en ella resultados de asociación estadísticamente significativa. Tampoco los resultados correspondientes al metanálisis de PDGene paraestos polimorfismos mostraron asociación alguna. 3. GENES QUE CODIFICAN SUSTRATOS DE LA PARKINA,OTRAS PROTEÍNAS CON FUNCIÓN DE LIGASA DE UBICUITINA Y PROTEÍNAS RELACIONADAS CON EL ESTRÉS PROTEICO El estudio de asociación con el resto de los genes analizados fue negativo para los polimorfismos de CCNE1, GPR37, HSBP2, NOB1, SEP5, SKP1 ySNACIP.Tampoco se encontró asociación con los 6 polimorfismos analizados que en el estudio de Maraganore habían mostrado asociación con EP.Se halló asociación, nominal, con SYT11.De este gen se analizaron en la muestra inicial 3 SNP que no se habían descrito previamente en la literatura. De estos 3 SNP analizados, 2 de ellos mostraron asociación nominal con EP: rs3820594 (p = 0,0378, OR = 1,32) y rs729022 (p = 0,0384, OR = 1,30). El tercer SNP analizado, rs12563627 no llegó aalcanzar significación estadística (p = 0,06541, OR = 1,27 (0,98 - 1,63)). Estos SNP están en LD relativamente fuerte en esta muestrainicial (r2=0,77). Sin embargo, haciendo el cálculo con los datos de HapMap II estos SNP podrían pertenecer a diferentes bloques haplotípicos en la población caucásica. rs3820594 se sitúa en la región 5´UTR, rs729022 en la región 3´UTR, mientras 106 zRESULTADOS Izquierda: Figura 21A. Bloque haplotípico formado por los SNP de PSMC3 según el valor de D’ Derecha: Figura21B Bloque haplotípico formado por los SNP de PSMC3 según el valor de r2 rs12563627 se aloja fuera de la región codificante en sentido 3’. Se trató de llevar a cabo la imputación genotípica en la muestra inicial de los 2 polimorfismos relacionados con SYT11 previamente asociados a EP en la literatura. No fue posible imputar el genotipo de rs202015799 (no estaba depositado en las bases de datos utilizadas). Sí pudo imputarse el genotipo de rs34372695, sin resultado significativo de asociación (p = 0,19). El SNP de SYT11 rs729022, uno de los 2 que mostraron asociación nominal en la muestra inicial, se analizó en la muestra de replicación. El SNP rs3820594, que también presentó asociación a EP en la muestra inicial, no pudo incluirse para el genotipado multiplex en el estudio de replicación –no fue posible encajarlo en el diseño de cebadores– por lo que se sustituyó por rs822508, del mismo bloque haplotípico. También se incluyó el polimorfismo rs12563627, aunque no había llegado a alcanzar significación estadística nominal en la muestra inicial. Para estos tres polimorfismos el estudio de replicación confirmó la asociación nominal y además los 3 SNP resultaron estar en LD completa, r2≥0,98 también en la población mexicana (ver figuras 22A y B). Además, la imputación de genotipos para el SNP rs34376925, previamente asociado a EP en la literatura, mostró la asociación más fuerte (p = 0,00003, OR = 2,07) Los resultados tanto en la muestra inicial como en la muestra de replicación, junto con los resultados del metanálisis de PDGene,se exponen en la tabla 13. RESULTADOS z107 Izquierda: Figura 22A. Bloques haplotípicos de SYT11 calculados según el valor de D’ Derecha: Figura22B. Bloques haplotípicos de SYT11 calculados según el valor de r2 108 zRESULTADOS SNP de SYT11 que mostraron asociación nominal con EP. rs729022 en el mismo bloque haplotípico que rs3820594 sustituye a este en el estudio de replicación Muestra inicial Muestra de replicación SNP Gen Posición G/I1Alelos Alelo A menor MAF Valor p Valor q OR (IC 95%) menor MAF Valor p OR (IC 95%) rs3820594 SYT11 1: 155829511 G C/T T 0,281 0,04570 0,3168 1,31 (1,00–1,72) rs202015799 SYT11 1: 155839054 I C/T T NA NA NA NS NS rs822508 SYT11 1: 155850558 G C/T - - - C 0,464 0,0187 1,33 (1,05-1,68) rs729022 SYT11 1: 155852123 G A/G G 0,324 0,03425 0,3168 1,31 (1,02–1,69) A 0,460 0,0352 1,29 (1,02-1,64) rs12563627 SYT11 1: 155862966 G C/T T 0,343 0,06541 0,4052 1,27 (0,98–1,63) C 0,449 0,0242 1,32 (1,04-1,68) rs343726952SYT11/RAB25 1: 156030037 I C/T T NS NS NS 0,00003 2,07 (1,24-3,87) sTabla 13. SNP de SYT11 que mostraron asociación nominal con EP. rs729022 en el mismo bloque haplotípico que rs3820594 sustituye a este en el estudio de replicación. En este estudio se incluye rs12563627 que no había resultado significativo en el estudio de asociación inicial. La imputación del SNP descrito previamente rs34372695 mostró asociación únicamente en el estudio de replicación. En rs729022 y rs12563627 los alelos con menor frecuencia en la muestrainicial y en la de replicación son diferentes. 1Genotipado / imputado. 2rs34372695 es el único SNP de los genotipados o imputados que resulta positivoen el metanálisis con PDGene, con p = 0,0267 y OR <1 IC 95%: Intervalo de confianza 95%. NA: no aplicable. NS: no significativo Características de la enfermedad en pacientes con mutación p.G2019S Paciente Sexo Edad de Duración Síntoma Antecedentes inicio (años) inicio familiares PARK8-1 M 39 6 Temblor No PARK8-2 M 62 15 Bradicinesia Hermana, 2sobrinos PARK8-3 M 71 12 Temblor Hermana, 2hijos PARK8-4 M 45 7 Temblor No PARK8-5 M 28 32 Distonía No PARK8-6 M 43 5 Bradicinesia No PARK8-7 V 58 3 Bradicinesia Padre Tabla 14. Características de la enfermedad en los pacientes con la mutación p.G2019S iii. Caracterización de pacientes y familias con formas monogénicas de EP Se llevó a cabo una revisión detallada, clínica y genealógica, de aquellos casos con mutación en genes conocidos causantes de EP familiar: se hallaron 7 casos con la mutación p.G2019S en LRRK2 y 2pacientes con mutación de PARK2 en homocigosis. No se detectaron mutaciones de SNCA.Tampoco se identificaron las otras mutaciones de LRRK2 descritas en los exones secuenciados (p.R1441C, p.R1441G y p.R1441H en el exón 31 y p.I2020T en el exón 41) 1. PACIENTES Y FAMILIAS CON MUTACIÓN EN LRRK2 Las características de los pacientes portadores de la mutación p.G2019S se resumen en la tabla 14. Todos ellos presentaron este cambio nucleotídico en heterocigosis. La edad media de presentación fue 49,43 (±14,86) y el tiempo medio de evolución 11,43 (± 9,98). 4 pacientes habían comenzado la enfermedad antes de los 45 años. 3 pacientes presentaron antecedentes familiares: 1 varón que había comenzado a los 58 años cuyo padre había padecido EP y 2mujeres que eran hermanas. Una de ellas tenía 2 hijos afectados. Las pacientes PARK8-2 y PARK8-3 son hermanas y pertenecen a una familia cuyos progenitores eran primos hermanos. Estas 2 mujeres pertenecen a una familia de 6 hermanos. Los 4 hermanos restantes no padecieron EP. De estos 4, 2 mujeres eran sordomundas. RESULTADOS z109 bloque haplotípico que rs3820594 sustituye a este en el estudio de replicación Muestra de replicación Alelo Valor q OR (IC 95%) menor MAF Valor p OR (IC 95%) 0,3168 1,31 (1,00–1,72) NA NA NS NS - - C 0,464 0,0187 1,33 (1,05-1,68) 0,3168 1,31 (1,02–1,69) A 0,460 0,0352 1,29 (1,02-1,64) 0,4052 1,27 (0,98–1,63) C 0,449 0,0242 1,32 (1,04-1,68) NS NS 0,00003 2,07 (1,24-3,87) PARK8-3 tiene 2 hijos (PARK8-3A y PARK8-3B) que padecen EP. PARK8-3B presenta la misma mutación que su madre, p.G2019S en LRRK2. PARK-8 3A, sin embargo, no es portador de ninguna de las mutaciones más frecuentes de LRRK2 que se analizaron. PARK8-2, de 77 años, comenzó con EP a los 62. Los síntomas iniciales fueron dificultad para realizar movimientos de precisión con las extremidades izquierdas y para caminar. Cuando consultó hacía 9meses que presentaba la clínica. Se trató con medicación dopaminérgica, inicialmente ropinirol hasta 16 mg. Posteriormente se añadió levodopa. La respuesta fue buena hasta los 9 años de evolución. Entonces comenzó con fluctuaciones y discinesias. La medicación dejó de ser efectiva durante las 24 horas del día. Además en los momentos de máximo beneficio del tratamiento, la paciente presentaba discinesias, sobre todo en el cuello y la región orofacial. Pese al ajuste de la medicación oral no mejoró el control motor. Alos 10 años de evolución se colocó un infusor de apomorfina. En la actualidad la dosis de este fármaco es de 7 mg por hora durante 16 horas. Además se trata con levodopa. La paciente presenta buen control motor de forma permanente sin discinesias. Nunca ha tenido temblor PARK8-3 consultó hace 12 años, cuando tenía 71, por temblor de 6meses de evolución. En aquel momento afectaba a la extremidad 110 zRESULTADOS Figura 23. Árbol genealógico de PARK8-2 (flecha) y PARK8-3 (hermana). Dos hermanas sordomudas se marcan en azul superior derecha, con predominio de reposo, y un cierto componente postural. Entonces apenas mostraba ligera rigidez y bradicinesia. Se trató con levodopa a dosis bajas y se mantuvo con buen control motor durante varios años. El temblor se hizo bilateral, la bradicinesia se incrementó y también se hizo bilateral. Sin embargo, la respuesta a la dopa, cuya dosis se fue aumentando moderadamente, continuó siendo buena. Cuando llevaba 12 años de evolución, la paciente sufrió un importante empeoramiento de sus síntomas, con incremento del temblor, de la rigidez y de la bradicinesia. El temblor apenas se modificó al subir la dosis de levodopa. La rigidez y la bradicinesia mejoraron de forma importante. Se mantuvo en esa situación hasta su fallecimiento 4 meses después por una neumonía. PARK8-3A acudió por primera vez a la consulta hace 2 años, cuando tenía 58, por un cuadro de 2 años de evolución de temblor y torpeza en las extremidades izquierdas. En la exploración se apreció un síndrome rígido acinético con temblor de resposo en las extremidades izquierdas. Se trató con 8 mg de rotigotina. El cuadro mejoró de modo que en la actualidad solo se aprecia una levebradicinesia izquierda. El paciente sigue con su actividad laboral normal. Este paciente no es portador de la mutación p.G2019S ni de ninguna otra conocida. RESULTADOS z111 PARK8-3B, de 57 años, consultó hace 6 meses por torpeza y temblor en las manos, especialmente en la derecha. En la exploración se apreció un síndrome rígido acinético, con temblor de reposo, de predominio derecho. Mejoró inicialmente con 8 mg de rotigotina. Posteriormente se añadió levodopa a dosis bajas. En la actualidad apenas presenta leve bradicinesia derecha. Este paciente es portador de la mutación p.G2019S. El árbol genealógico (figura 23) resume esta familia extensa en la que hay pocos afectados (uno de ellos no portador de ninguna mutación conocida). A todos los pacientes se les explicó lo que se conoce del significado de la mutación, así como las incertidumbres todavía existentes sobre su penetrancia y variabilidad en las manifestaciones clínicas, con las posibles implicaciones para sus descendientes. Se les ofreció la posibilidad de consulta genética a sus familiares. 2. PACIENTES Y FAMILIAS CON MUTACIONES DE PARK2 Se hallaron 2 casos índice homocigotos paramutaciones de PARK2,PARK2-1 y PARK2-2A. PARK2-1 es una mujer de 40 años sin antecedentes familiares. Sus padres no son parientes. Tiene una hermana sana de 37 años. La paciente comenzó a los 14 años con temblor de reposo y postural y gran amplitud de predominio derecho. Tras probar varios fármacos (betabloqueantes, anticolinérgicos, primidona, clonacepam) se hizo, cuando tenía 20 años, una prueba con dosis bajas de levodopa. La respuesta fue muy buena, con gran mejoría del temblor. Posteriormente se retiró la levodopa. El temblor recidivó y la paciente desarrolló una importante distonía del tronco. Se reintrodujo la levodopa a dosis bajas, con lo que desapareció la distonía y el temblor volvió a mejorar. El cuadro se mantuvo estable durante 10 años. Inicialmente se diagnosticó de distonía que responde a la dopa (DRD). Sin embargo, al cabo de ese tiempo, el cuadro empezó a fluctuar y comenzó con torpeza y rigidez en las extremidades derechas. Un SPECT con BCIT demostró degeneración bilateral de la neurona presináptica dopaminérgica, lo que descartaba definitivamente el diagnóstico de DRD. El análisis genético por MLPA mostró la presencia en homocigosis de una deleción en el exón 4 de 112 zRESULTADOS PARK2.Se incrementaron las dosis de levodopa y se introdujeron agonistas. Los síntomas continuaron respondiendo muy bien a la medicación dopaminérgica. En la actualidad se trata con levodopa, 600 mg al día, y pramipexol, 3,15 mg diarios. Mantiene un buen control motor sin apenas fluctuaciones, con leve bradicinesia y temblor postural moderado derechos. El caso PARK2-2A presenta una importante historia familiar con 2hermanos varones y 2 primos hermanos afectados (varón y mujer). Todos ellos presentaron la mutación c.255delA, que corresponde a una deleción en heterocigosis de un residuo adenina en el exón 2 del gen, que modifica el marco de lectura y da lugar a la aparición de un codón de parada prematurayauna proteína truncada (p.D52MfsX29: NP_004553.2). Los padres de PAK2-2A eran primos segundos (ver árbol genealógico en la figura 24). PARK2-2A, varón de 61 años, comenzó a los 30 años con temblor de reposo y postural en las extremidades derechas y en la cabeza. Se trató con anticolinérgicos y levodopa. Unos 12 años después del inicio comenzó con fluctuaciones y discinesias de beneficio de dosis. Se incrementó la levodopa, se retiraron los anticolinérgicos y se añadieron agonistas dopaminérgicos. Tras ajustar la medicación desaparecieron las fluctuaciones. Se mantienen las discinesias, que afectan sobre todo a la región orofacial y cervical y en menor medida a las extremidades superiores. Son de beneficio de dosis RESULTADOS z113 Figura 24. Árbol genealógico de PARK2A, paciente índice (flecha) con mutación en PARK2. Sus padres eran consanguíneos. Tiene 2 hermanos y 2 primos hermanos afectados con la misma mutación. Ver leyenda en la figura 19 de moderada intensidad y las tolera bien. En la actualidad, globalmente, el control motor es bueno con bradicinesia ligera moderada de predominio derecho. Se trata con levodopa, 800 mg diarios, y pramipexol, 3,15 mg diarios. PARK2-2B, varón de 62 años, hermano del anterior, comenzó a los 30 años con temblor y torpeza en las extremidades derechas. Se trató con medicación dopaminérgica y la respuesta motora fue buena durante 5 años. A partir de entonces comenzó con fluctuaciones y discinesias. Los ajustes de medicación le permitieron un control de la enfermedad bastante aceptable durante 25 años. En los últimos 2 años, sin embargo, los ajustes de medicación oral fueron ineficaces. El paciente presenta hasta 5 horas al día con mal control junto con importantes discinesias de baneficio de dosis. Se le propuso tratamiento con estimulación subtalámica, infusión de levodopa o de apomorfina pero no lo consideró. PARK2-2C, varón de 60 años, hermano de los anteriores, comenzó con la enfermedad alrededor de los 40 años. Inicialmente mejoró con medicación dopaminérgica, pero a los 6 años empezó con flucturaciones y discinesias. No se dispone de datos de su situación actual pues prefiere no acudir a revisión. PARK2-2D, mujer de 69 años, prima hermana de los anteriores comenzó con temblor en las extremidades derechas a los 57 años. Sus padres no estaban emparentados, aunque eran de la misma zona. El temblor era de predominio en reposo, y se acompañaba de bradicinesia ligera derecha. Se ha mantenido estable desde el inicio de los síntomas con 300 mg de levodopa y 1 mg de rasagilina. En la actualidad apenas muestrabradicinesia derecha. PARK2-2E, varón de 60 años, hermano de la anterior comenzó a los 35 años con temblor y torpeza en las extremidades derechas. Respondió bien a la medicación dopaminérgica durante 7 años. Posteriormente hubo de modificarse frecuentemente el tratamiento por fluctuaciones y discinesias. En 2008 se colocaron sendos estimuladores subtalámicos, que se retiraron por infección. Ese mismo año se inición apomorfina en infusión continua. En la actualidad presenta buen control motor durante todo el día con bradicinesia y rigidez de grado levemoderado y discinesias leves o moderadas. 114 zRESULTADOS gen HNMT (histamine N-methyltransferase) en 214 pacientes y 295 controles de Madrid y Extremadura, y la de Lorenzo et al (2011) con el SNP rs11856808 del gen LINGO1 (leucine rich repeat and Ig domain containing 1)en 721 pacientes y 1117 controles de varias zonas de España. En la tabla 16 se resumen los estudios de asociación con EP publicados hasta la fecha en población española. 2. PROTEASOMA Y PROTEÍNAS RELACIONADAS Como se trató con detalle en la sección Antecedentes el sistema UPS se ha relacionado con la patogenia de la EP. La agregación pro- DISCUSIÓN z121 Tabla 16. Estudios de asociación de EP publicados en población española ACT actin likeprotein, AOC1 amine oxidase, copper containing 1, APOE apolipoproteína E, BDNF brain derived neurotrophic factor, FGF20 fibroblast growth factor 20, GIGYF2 GRB10 interacting GYF protein 2, HNMT histamine N-methyltransferase, LINGO1 leucine rich repeat and Ig domain containing 1, MAPT microtubule-associated protein tau, SNCA sinucleína alfa, TF transferrina. Estudios de asociación de EP publicados en población española Autor Año N casos N controles Área geográfica Genes Polimorfismos Resultado Agúndez 2008 214 295 Madrid, HNMT rs11558538 Positivo Extremadura AOC1 His645Asp Negativo Blázquez 2006 276 212 Salamanca APOE ε4/ ε4 Negativo Cardo 2012 1135 772 Asturias, Navarra SNCA rs356165 Positivo Ezquerra 2005 210 102 Barcelona TF G258S Negativo Ezquerra 2011 505 233 Barcelona MAPT rs242557 Positivo Gao 2010 193 300 Sevilla BDNF G196A Negativo Lorenzo 2011 721 1117 Varias LINGO1 rs11856808 Positivo Mata 2011 1441 1161 Asturias, Navarra MAPT rs1800547 Positivo SNCA rs356219 Positivo De Mena 2010 512 268 Asturias FGF20 rs12720208 Negativo Muñoz 1999 71 109 Barcelona ACT ACT-AA Negativo Pastor 2001 117 90 Barcelona SNCA -164insA/ Negativo C-116G Samaranch 2010 147 70 Navarra GIGYF2 p.P1238insAGC Negativo p.Q1249del Negativo p.L1230_Q1237del Negativo teica es clave para que ocurra EP. Dado que una de las funciones de UPS es la eliminación de proteínas no necesarias mediante el proteasoma, previo marcaje con ubicuitina, el papel de este sistema en la EP se ha estudiado detalladamente. Los estudios previos para analizar la posible existencia de asociación entre las subunidades del proteasoma y la EP son escasos. En una cohorte de sujetos con EP alemanes se describió una variante en el gen de la subunidad ATPásica del proteasoma 19S PSMC4 (S6), que podría actuar como factor de riesgo para EP (Wahl et al, 2008). La variante en cuestión consiste en una inserción/deleción de una secuencia nucleotídica corta en el intrón 5 (c.579 + 29 41de- linsGTTGGAG), mucho más frecuente en pacientes que en controles (OR = 4,28, p = 0,032)), asociación especialmente significativa para el subgrupo de pacientes que habían comenzado con la enfermedad antes de los 50 años. Las subunidades ATPásicas del proteasoma (PSMC1-6) pertenecen a la familia AAA, ATPasas Asociadas con diversas Actividades celulares, entre las que se encuentran, por ejemplo, el transporte de endosomas, control de calidad y autofagia, modelado de membranas, función de microtúbulos y citoesqueleto (Sorokin et al,2009). La espastina (Hazan et al, 1999) o la torsina A (Konakova et al, 2001), responsables respectivamente de la paraplejía espástica familiar tipo 4 (SPG4) y la distonía de torsión (DYT1) también pertenecen a esta familia de proteínas. Parece, por tanto, haber evidencias que apuntan a la existencia de un vínculo entre estas proteínas y enfermedades neurológicas degenerativas, que tienen en común el depósito de proteinas mal plegadas. Se ha mostrado que ASN inhibe la función proteasómica interaccionando con PSMC3 (S6’ o tbp1) (Snyder et al, 2003). La ataxina 7, cuya mutación produce atrofia espinocerebelosa 7 (SCA7), interacciona con la unidad PSMC1 (S4) (Matilla et al,2001). PSMC4 se relaciona con sinfilina 1 (Marx et al, 2007), sustrato de la parkina, que además se une a asn (Eyal y Engelender, 2006). Se ha mostrado que ambas proteínas, PSMC4 y sinfilina 1, interaccionan entre sí, se localizan conjuntamente en la célula, constituyen cuerpos de inclusión que funcionan como agresomas y forman parte de los cuerpos de Lewy (Marx et al, 2007). Es interesante el hecho de que que se ha descrito una mutación de cambio de sentido en 2 pacientes con EP esporádica en el gen que codifica la sinfilina 1 (SNCAIP)(Marx et al,2003). 122 zDISCUSIÓN Todos estos datos sugieren la posible contribución de los genes que codifican las subunidades del proteasoma en el mecanismo patogénico y susceptibilidad a la EP. No obstante, son datos aún escasos y serán precisos estudios más exhaustivos para validar el papel de estos factores genéticos relacionados con el proteasoma y su papel celular. 3. REGIÓN GENÓMICA ENTRE SYT11 YRAB25 Hasta la fecha, se han publicado 3 estudios que mostraron asociación entre SYT11 osus proximidades y la EP (Nalls et al,2011, Sharma et al,2012, Pihlstrøm et al,2013). El primero es un GWAS en el que se hallaron varias asociaciones con polimorfismos de diferentes genes. En los otros dos estudios se intentaron replicar los resultados del primer trabajo y en ambos casos se detectó una asociación significativa con polimorfismos de SYT11. Con anterioridad a estos tres trabajos, un estudio de asociación entre SYT11 y EP realizado con 393 pacientes no había mostrado resultados estadísticamente significativos (Glass et al,2004). No tenemos conocimiento de ningún estudio de asociación entre SYT11 yEP en población española. Ninguno de los GWASincluyó pacientes españoles. La primera asociación con EP descrita para el gen SYT11, rs202015799 (Nalls et al,2011) corresponde a un polimorfismo intrónico. Curiosamente, en las dos réplicas realizadas se estudió el SNP rs34372695 que, de hecho, no se encuentraen localización intragénica en SYT11 sino que se sitúa sentido 3’ fuerade SYT11, en concreto a 176 kb, en el gen RAB25.(Sharma et al,2012, Pihlstrøm et al,2013). En la muestra inicial de población gallega se detectó una asociación nominal con el alelo Tdel SNP rs3820594, situado en la región 5´UTR de SYT11 y con el alelo G de rs729022, situado en 3´UTR. El alelo Tde rs12563627, localizado entre SYT11 yel gen contiguo RIT1 no alcanzó significación estadística (p = 0,065, OR 1,27 [0,98 -1,63]). Estos SNP se encuentran cercanos a rs202015799 y muy alejados de rs 34372695 (Figura 25). En la muestra de replicación se observó asimismo una asociación nominal significativa entre la EP y variantes de SYT11.Como se in- DISCUSIÓN z123 dicó en el apartado resultados, rs3820594 se sustituyó por rs822508. Los MAF de rs729022 y de rs12563627 en la población mexicana fueron diferentes de los de la población gallega. Ambos MAF, A y C respectivamente, se asociaron a EP en la muestra de replicación. Es decir, la replicación del SNP asociado sucedió con el alelo contrario al de la muestra inicial. Si el alelo del SNP asociado en este caso a EP variase en poblaciones similares, probablemente se trataría de una asociación espuria. El que ocurraen poblaciones diferentes no anula la asociación. Lin et al (2007) denominan a este fenómeno genético flip-flop (biestable). Lo atribuyen a diferencias en el ambiente y en el acervo genético de las poblaciones, que pueden condicionar diferentes interacciones multigénicas (efecto multilocus). Por otro lado, los patrones de LD pueden ser completamente diferentes en poblaciones no relacionadas puesto que dependen de la historia de la población, la deriva genética, la tasa de recombinación y el equilibrio mutación selección. Pese a las diferencias en las frecuencias alélicas y estructura entre las poblaciones de las muestras de Galicia y de México se logró replicar la asociación. No se puede descartar la influencia de estratificación poblacional en la muestra mexicana, si bien tanto casos como controles son muestras de la misma población mestiza. La contribución genética de la población mestiza de Ciudad de México está constituida por un 69% de origen indoamericano, 26% europeo, sobre todo español y 5% africano (Juárez-Cedillo et al 2008). Hay pocos estudios de asociación en población mestiza indoameri- 124 zDISCUSIÓN Figura 25. Representación esquemática de la región genómica que se extiende entre SYT11 y RAB25, con todos los genes que hay entre ambas localizaciones. cana. En la tabla 17 se resumen los estudios de asociación con EP realizados en población mexicana. En la región genómica de 211,05 kb (0,211 Mb) comprendida entre SYT11 yRAB25,además de estos dos genes se ubican varios otros: RIT1,SNORA42,KIAA0907,RXFP4,ARHGEF2,SSR2, UBQLN4 yLAMTOR2,que se resumen en la tabla 18 (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/omim/) y figura 25. SYT11 se sitúa en el locus 1q22 (1: 155829260 – 155854990). Aunque todos los estudios previos se refieren a la asociación entre EP y SYT11,sin hacer mención a otros genes en las proximidades, no es posible establecer en la actualidad de manera definitiva cuál es el posible elemento funcional relevante en dicha asociación. El gen más próximo a uno de los SNP asociados en estudios previos, RAB25 está constituido por 5 exones. Sus coordinadas son 156030966 - 156040295. Codifica la proteína homónima RAB25, member Ras oncogene family,de 217 aminoácidos (He et al,2002). No se ha identificado expresión de esta proteína en el sistema nervioso. La familia Ras (Rat sarcoma)está constituida por GTPasas de pequeño tamaño que actúan en el tráfico de membrana. RAB25 colabora en numerosas funciones: transmisión de señales, proliferación celular, apoptosis, organización microtubular, recliclado del receptor de la transferrina, transporte transcelular de la inmunoglobulina A o tráfico de integrinas. Interviene en la génesis y extensión de tumores del tubo digestivo, ovario, mama o riñón (Agarwal et al,2009), aunque, paradójicamente, también desempeña un papel de supresión tumoral en determinadas circunstancias (Nam et al,2010). RAB25 se relacio- DISCUSIÓN z125 Estudios de asociación con EP realizados en población mexicana Autor Año N casos N controles Población Genes Polimorfismos Resultado Gallegos 2009 105 107 Mestiza APOE ε3 Protector ε4Positivo López 2007 229 229 Mestiza APOE ε3/ ε3 Positivo ε4/ ε4Positivo Martínez 2010 117 122 Mestiza PARK2 Ser167ASN Negativo Val380Leu Negativo Ramírez Jirano 2006 51 125 Mestiza SNCA -116C-G Negativo Ramírez Jirano 2007 51 125 Mestiza SNCA IVS4+66A-G Negativo Tabla 17. Estudios de asociación con EP realizados en población mexicana na estrechamente con las integrinas α2, α5y β1, proteínas que interviene en las uniones celulares (Krishnan et al,2013). En concreto RAB25 se ocupa de la vuelta a la superficie celular de fragmentos proteicos previamente internalizados. Esta relación es claveparala extensión tumoral (Caswell et al,2007). Se ha descrito un incremen- to o disminución de otras proteínas RAB en el cerebro de rata tratada con clozapina (Kontkanen et al,2001). Curiosamente el exceso de ASN altera la formación de vacuolas en un estadio muy inicial debido a su interacción con una proteína de la familia RAB, RAB1a (Winslow et al,2010). Dado que la proteína RAB25 no se ha descrito en el sistema nervioso, en el momento actual resulta complicado relacionarla con la patogenia de enfermedades degenerativas neurológicas. De los otros genes próximos a SYT11 en sentido 3’ ninguno se ha asociado con la EP (Lill et al,2012). Se trata de genes muy variados, que incluyen un gen anidado (Kumar, 2009) codificante de ARN, SNORA42.Se encuentra dentro del gen KIAA0907.En esta 126 zDISCUSIÓN Características de los genes situados entre SYT11 y RAB25 Símbolo Coordinadas Nombre Producto del gen genómicas (NCBI) completo del gen genético Función RIT1 1:155.867.599 – Ras-like without Ras-like protein GTPasa 155.881.193 CAAX 1 without CAAX 1 motif 1 SNORA42 1:155.889.700 - Small nucleolar RNA, Small nucleolar RNA, Gen ARN 155.889.833 H/ACA box 42 H/ACA box 42 KIAA0907 1:155.882.836 – KIAA0907 UPF0469 Protein Proteína de gran 155.904.188 KIAA0907 tamaño y función desconocida RXFP4 1:155.911.480 – Relaxin/insulin-like Relaxin/insulin-like Receptor acoplado 155.912.625 family peptide family peptide aproteína G (GPR) receptor 4 receptor 4 ARHGEF2 1:155.916.630 – Rho guanine Rho guanine Se une a Rho 155.948.336 nucleotide exchange nucleotide exchange (una GTPasa) factor (GEF) 2 factor (GEF) 2 SSR2 1:155.978.838 – Signal sequence Signal sequence Proteína de señal 155.990.757 receptor, beta receptor, beta del retículo (translocon-associated endoplásmico protein beta) UBQLN4 1:156.005.091 – Ubicuilina 4 Ataxin-1 ubiquitin-likeRegula la degradación 156.023.515 interacting protein de la conexina 43. (A1Up) Interacciona con la ataxina 1 LAMTOR2 1:156.024.516 – Late endosomal Mapbpip interacting Posible papel 156.028.300 /lysosomal adaptor, protein en la biogénesis MAPK and MTOR del endosoma activator 2 Tabla 18. Características de los genes situados entre SYT11 y RAB25 región genómica se han encontrado 2 SNP que se han asociado a enfermedades del sistema nervioso. En concreto rs228301, situadoen RIT1,se ha relacionado con los trastornos de atención (Sonuga Barke et al,2008) y rs2364403, localizado en ARHGEF2 podría tener que ver con la edad de inicio de la esclerosis lateral amiotrófica (ALSGEN Consortium, 2013). ARHGEF2 (Rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 2)codifica la proteína homónima de 985 aminoácidos. Las GTPasas pequeñas relacionadas con Rho intervienen en la señalización entre el espacio extracelular y en núcleo. Los factores de intercambio del nucleótico guanina (GEF) como ARHGEF2 permiten el intercambio de GDP por GTP en las proteínas Rho (Krendel et al,2002). Las mutaciones del gen ALS2 (alsina) dan lugar a una forma juvenil recesiva de esclerosis lateral amiotrófica (ELA), a esclerosis lateral primaria y a una forma de paraparesia espástica hereditaria ascendente infantil. La proteína homónima que codifica este gen contiene tres dominios GEF,uno de ellos para proteínas Rho (Yamanaka et al,2003). De especial interés por su relación con el proteasoma puede ser UBQLN4 (ubicuilina 4). Codifica una proteína de 4,0 Kb y 661 aminoácidos llamada A1Up (ataxin-1 ubiquitin-likeinteracting protein), que interacciona tanto con la ataxina 1 natural como con la mutada por repeticiones de poliglutamina. Esta mutación da lugar a la ataxia espinocerebelosa tipo 1 (SCA1) (Davidson et al, 2000). A1Up pertenece a la familia de proteínas UbL-UBA, que tienen que ver con UPS. Contiene un dominio N-terminal UbL (ubiquitin like), 4 motivos STI1 que se unen a chaperoninas y un dominio C-terminal UBA (ubiquitin associated). UbL se une a la unidad no ATPasa del proteasoma 19S PSD4 (S5a, Rpn10). La ataxina 1 mutada dificulta esta unión. UBA determina la localización y estabilidad de la proteína y se une a ubicuitina. A1Up estabiliza la ataxina (Riley et al,2004). La proteína homóloga a A1Up en la levadura y el ratón CIP75 regula la degradación de la proteína conexina 43, situada en las uniones intercelulares comunicantes (gap) (Li et al,2008), por un mecanismo independiente de la ubicuitina (Su et al,2010). Las sinaptotagminas (SYT) son un grupo de 17 proteínas transmembrana que intervienen en la regulación del tráfico tanto a través de la membrana plasmática como a través de la membrana de las vesículas. Desempeñan un papel clave en la transmisión sinápti- DISCUSIÓN z127 ca mediante la exocitosis de vesículas que contienen neurotransmisores (Chapman, 2008, http://www.genenames.com). SYT 1-7 y 9-13 se expresan sobre todo en neuronas, aunque también en las células de la glía (Glavan et al,2009). Las SYTconstan de un dominio N-terminal con 4-62 aminoácidos dentro de la vesícula presináptica, un dominio corto transmembrana y un dominio extravesicular citoplasmático con dos lugares C2, C2A y C2B unidos entre sí (Südhof, 2002, Chapman, 2008). En algunas SYT(SYT1, 2, 3, 5, 6, 7, 9 and 10) C2A y C2B actúan como sendos lugares de unión a iones Ca+2 (Fernández Chacón et al, 2002). En ausencia de calcio, los fosfolípidos de membrana y los dominios C2 de las SYTmuestran una fuerte repulsión entre sí, debido aque ambos están cargados negativamente. La unión del calcio con C2A activa la exocitosis mediante la fusión entre la membrana vesicular y la membrana plasmática. El dominio C2B también tiene capacidad de unión al calcio, aunque mucho menor (Fernández Chacón et al,2002). C2B también se une a AP-2 (clathrin assembly protein-2). Este complejo interviene en la endocitosis y en el reciclaje de la membrana plasmática (Zhang et al,1998). La afinidad de C2A y C2B por el calcio se incrementa 1000 veces en presencia de los fosfolípidos de las membranas (Zhang et al,1998). En el momento en que el botón presináptico se despolariza se abren los canales de calcio dependientes del voltaje (VDCC), que dan lugar a la entrada masiva de este ion. La unión al calcio es imprescindible para que las SYT actúen en los procesos de fusión de membranas previos a la exocitosis. Para ello necesitan activar el complejo proteico SNARE (Soluble NSF Attachment Protein Receptor). SNARE consta de 4 cadenas proteicas, divididas en una parte vesicular (V-SNARE), formada por la sinaptobrevina/VAMP (vesicle-associated membrane protein), y una parte transmembrana (T-SNARE), formada por la sintaxina y por SNAP 25 (25-kD synaptosomal-associated protein), esta última formada a su vez por 2 cadenas. En concreto las SYT se unen a la sintaxina. Este anclaje doble a los fosfolípidos de la membrana vesicular y de la membrana plasmática es crucial para que se produzca la fusión de las membranas y la exocitosis (Malsam et al,2008, Yoon y Shin, 2009) (figura 26). Como se indicó en la sección Antecedentes,la ASN favorece la formación del complejo SNARE. Dos estudios han sugerido diferentes 128 zDISCUSIÓN mecanismos. En el primero se muestraque la ASN revierte los efectos negativos de la pérdida de la proteína sináptica CSPα(cysteinstring proteinα )en un grupo de ratones con déficit de esa proteína. CSPαpresenta actividad cochaperona y se postula que contribuye a la eliminación de moléculas tóxicas en la sinapsis. Tambien es necesaria para ensamblar los componentes de SNARE. En los ratones defectivos el proceso de ensamblaje, inicialmente alterado por la falta de CSPα,se compensa mediante la acción de ASN (Chandraet al, 2005). Otro estudio mostró que ASN se une a la parte vesicular de SNARE, sinaptobrevina/VAMP, lo que favorece el ensamblaje de los componentes proteicos del complejo (Burre et al,2010). Se ignora la función de las SYTque no se unen al calcio, SYT 4, 8, 11, 12, 13 y 15, y que, por lo tanto, no interaccionan con SNARE. Se ha propuesto que tal vez inhiban la exocitosis, mediante el bloqueo de la unión de las otras SYT con SNARE (Bhalla et al,2008). Por otra parte, se ha sugerido que algunas SYT (1, 2, 4, 7, 10 y 11) podrían desempeñar algún papel en la plasticidad neuronal. Se han mostrado cambios en la expresión génica de las SYT relacionados con la respuesta inflamatoria, con el tráfico de membrana o con la formación de sinapsis que se habían perdido (Glavan et al,2009). DISCUSIÓN z129 Figura 26. El complejo SNARE, formado por sinaptobrevina, sintaxina y SNAP25 provoca la exocitosis mediante la fusión de las membranas plasmática y de la vesícula. Para activarse necesitan de ciertas sinaptotagminas. La entrada de calcio en el botón presináptico permite que la sinaptotagmina se una a la sintaxina y se inicie la exocitosis. Se desconoce la función de las sinaptotagminas que no se unen al calcio (modificado de https: //wiki.brown.edu/con fluence/display/BN0 193S04/SNARE) Además de regular la exocitosis de las vesículas sinápticas, las SYTtambién intervienen en la exocitosis de hormonas (Gustavsson yHan, 2009) del acrosoma de los espermatozoides (Roggero et al, 2007), fagocitosis (Arango Duque et al,2013) y en la desgranulación de las células mastoideas (Melicoff et al,2009). El gen SYT11 tiene una longitud de 5 kb y consta de 4 exones (Glass et al,2004). Codifica una proteína homónima de 431 aminoácidos que se expresa en la mayoría de las áreas encefálicas tanto en las neuronas como en los astrocitos, donde es la SYT más abundante (Mittelsteadt et al,2009). Es de las SYTque aparece con mayor frecuencia en las células CA1 del hipocampo (Glavan et al, 2009) También se expresa en células no nerviosas (von Poser et al, 1997). La sinaptotagmina XI (SYT11) se colocaliza con la parkina alrededor de la membrana nuclear y en las neuritas (Huyhn et al, 2003). Es más abundante en la terminal presináptica (vesículas y membrana presináptica) que en las dendritas postsinápticas. Está presente en las terminales presinápticas tanto excitatorias como inhibitorias. Probablemente forma complejos multiméricos (Yeo et al 2012). SYT11 se diferencia de otras SYT en un resto de serina que sustituye a uno de los 5 restos de aspartato necesarios para la unión con calcio en el sitio C2A (von Poser et al,1997). Muestrauna gran homología con SYT4. Ambas se incluyen en las SYT de clase 4 (Yeo et al,2012). Los dominios de SYT11 son: domino vesicular (resto de aminoácido 1-15), transmembrana (16-36) y citoplásmico (37- 431). Dentro de este último se encuentran C2A (resto de aminoácidos 174-262) y C2B (resto de aminoácidos 304-397) (http://www.uniprot.org/uniprot/Q9BT88)(figura27). Se desconoce la función de SYT11. Se ha sugerido un papel en la regulación negativa de la transmisión presináptica rápida. (Wang et al,2001). Se han considerado otras funciones como regulación de la liberación de neurotransmisor y el tráfico postsináptico (Yeo et al,2012). También se ha relacionado con la plasticidad neuronal (Glavan et al,2009). Un estudio mostró que SYT11 se une a KIF1A (Kinesin family member 1A). Las cinesinas son una familia de proteínas que favorecen el transporte anterógrado de vesículas a través de los microtúbulos en las terminales presinápticas, así como el transporte de las mitocondrias. Es probable que SYT11 sea necesario para que la carga se una a la molécula transportadora (Park 130 zDISCUSIÓN