Estudio del efecto de la oligomerización sobre la selectividad funcional de receptores acoplados a proteínas G. Aplicación a la farmacología de la esquizofrenia

TESIS DE DOCTORADO ESTUDIO DEL EFECTO DE LA OLIGOMERIZACIÓN SOBRE LA SELECTIVIDAD FUNCIONAL DE RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G APLICACIÓN A LA FARMACOLOGÍA DE LA ESQUIZOFRENIA Laura Gómez García ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE MEDICAMENTOS SANTIAGO DE COMPOSTELA 2021 DECLARACIÓN DE LA AUTORA DE LA TESIS Dña. Laura Gómez García Título de la tese: Estudio del efecto de la oligomerización sobre la selectividad funcional de receptores acoplados a proteínas G. Aplicación a la farmacología de la esquizofrenia. Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mi para la obtención de otros títulos. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso de que el original no esté en la Escuela. En Santiago de Compostela, Julio de 2021. Firma electrónica DECLARACIÓN DE LOS DIRECTORES DE TESIS Dña. María Isabel Loza García En condición de: Titor/a e director/a D. José Manuel Brea Floriani En condición de: Director/a Título de la tese: Estudio del efecto de la oligomerización sobre la selectividad funcional de receptores acoplados a proteínas G. Aplicación a la farmacología de la esquizofrenia. INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dña. Laura Gómez García, bajo mi dirección/tutorización, y a utorizo a su presentación , considerando que reúne los r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director/tutor de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. En Santiago de Compostela, Julio de 2021 María Isabel Loza García José Manuel Brea Floriani FINANCIACIÓN Para la realización de la presente tesis doctoral se ha contado con la financiación otorgada por la Xunta de Galicia (GRC2014/011 y ED431C 2018/21), el ministerio de Economía y Competitividad (SAF2014-57138-C2-1-R y SAF2017-85225- C3-1-R) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). La doctoranda ha sido beneficiaria de la ayuda de apoyo a la etapa predoctoral en las universidades del SUG, en los organismos públicos de investigación de Galicia y en otras entidades del Sistema gallego de I+D+i, cofinanciadas parcialmente por el programa operativo FSE Galicia 2014-2020, concedida por la Consellería de Cultura, Educación y Ordenación Universitaria (convocatoria 2017). AGRADECIMIENTOS Es abrumador lo rápido que pasa el tiempo una vez echas la vista atrás y piensas en la fugacidad con la que ha pasado esta etapa de tu vida. Aunque si lo meditas con detenimiento, en realidad, has vivido cantidad de momentos únicos y has aprendido todo lo posible de esta experiencia para intentar sacarle el máximo jugo, y eso no habría sido posible sin todas las personas que te han acompañado de una manera u otra en esta aventura. En primer lugar, me gustaría agradecer a mis tutores, Pepo y Mabel, porque, a pesar de los vaivenes, no dejaron de confiar en mí y siempre me abrieron las puertas del grupo de investigación para poder desarrollar este trabajo en él. La perseverancia y la lucha contra la frustración cuando no salen las cosas creo que es de los mayores aprendizajes que me llevo, y en esto, Pepo, has tenido mucho que ver. Gracias por transmitirme esos valores. Igualmente, todo este trabajo no se puede acabar sin las personas que a diario forman parte de tu vida durante estos años y con las que compartes tantas horas. Siempre he recibido toda la ayuda que he necesitado y me he sentido arropada y comprendida por todos y cada uno de mis compañeros del grupo Biofarma, así que os doy las gracias a todos por acogerme y acompañarme cada día. En especial me gustaría agradecer a Silvia, porque desde ese turno de cultivos que nos unió, me has apoyado y enseñado mucho, pero es que, además, me has acompañado en todas mis historietas y nos hemos reído mucho juntas. Te tengo un cariño muy especial. Coincidir con personas que desde el inicio te lo ponen todo tan fácil y te devuelven las ganas de averiguar de qué va este mundillo y lo que te puede aportar toda esta etapa, es algo que no me esperaba encontrar en un principio, pero lo encontré contigo, Alex, desde que pisé este edificio por primera vez y me hiciste el “tour” por los laboratorios. Gracias por los buenos momentos que pasamos, gracias por enseñarme con esa pasión y gracias por facilitarme todo con tu sonrisa. Gracias por ser mi maestro Jedi. Por supuesto gracias a todos los Odiosos. Me habéis ido dejando sola aquí pero el tiempo compartido ha sido mucho, tanto dentro como fuera, comiendo mucho y rico, bailando y pasándolo bien por ahí, pero sobre todo acompañándonos a diario en esta etapa. Las gallinas por su experiencia y LAURA GÓMEZ GARCÍA 16 3.1 Aspectos generales .......................................................................... 74 3.2 Oligómeros relevantes en el sistema nervioso central. ............. 80 3.2.1 Heterodímero D2/5-HT2A. ………………………………………………. 84 ANTECEDENTES, HIPOTESIS Y OBJETIVOS ……………………………….. 89 Antecedentes ……………………………………………………………………………….. 91 Hipótesis ……………………………………………………………………………………… 93 Objetivo ……………………………………………………………………………………….. 93 MATERIALES Y MÉTODOS …………………………………………………………… 95 Materiales ……………………………………………………………………………………. 97 1. Reactivos generales ........................................................................ 97 2. Reactivos empleados en cultivos celulares .............................. 97 3. Reactivos empleados en ensayos funcionales ......................... 97 3.1 Reactivos farmacológicos ............................................................... 98 4. Reactivos empleados en ensayos de radiactividad. ............... 99 5. Reactivos empleados en ensayos de biología molecular ...... 99 5.1 Anticuerpos .................................................................................... 100 Métodos ………………………………………………………………………………………. 101 1. Cultivo celular. ................................................................................ 101 1.1 Línea celular. ................................................................................... 101 1.2 Mantenimiento celular. ................................................................. 101 1.3 Descongelación celular. ................................................................. 102 1.4 Expansión celular. .......................................................................... 102 1.5 Criopreservación celular. .............................................................. 103 2. Ensayos funcionales de medición de AMPc intracelular. ... 103 Índice 17 2.1 Ensayos de medida de formación de AMPc modulada por los receptores D2 y 5-HT7. .......................................................................... 105 Ensayos de medida de formación de AMPc modulada por heterodímero D2/5-HT2A. .....................................................................106 3. Ensayos funcionales de medida de acumulación de IP intracelular. ............................................................................................. 107 4. Ensayos funcionales de medida de movilización de calcio intracelular. ............................................................................................ 108 5. Ensayos de heterodimerización de los receptores D2 y 5- HT7. ............................................................................................................109 5.1 Preparación de muestras. .............................................................. 110 5.2 Coinmunoprecipitación y western blot. ...................................... 110 6. Modulación de la actividad de PKA. .......................................... 112 6.1 Medida de la expresión de PKA por western blot. ..................... 112 6.1.1 Preparación de muestras. ……………………………………………112 6.1.2 Western blot de proteínas fosforiladas………………………… 113 6.2 Medida de la actividad de PKA por inmunoensayo.................... 113 6.3 Medida de la fosforilación de CREB por tecnología Alpha®. ... 115 7. Análisis de datos. ........................................................................... 117 RESULTADOS. …………………………………………………………………………….. 121 1. Estudio de la señalización cruzada entre los receptores D2 y 5-HT7 y su farmacología. ...................................................................... 123 1.1 Estudio de la señalización cruzada entre los receptores D2 y 5- HT7.. …………………………………………………………………………………………..123 1.1.1 Los agonistas del receptor D2 modulan la vía de señalización de la serotonina a través del receptor 5-HT7. ……………………….124 1.1.2 Los antagonistas del receptor D2 no influyen en la vía de señalización de la serotonina a través del receptor 5-HT7……… 125 LAURA GÓMEZ GARCÍA 18 1.1.3 Los agonistas del receptor D2 modulan la vía de señalización del receptor 5-HT7 bloqueado por su antagonista específico SB269970. …………………………………………………………………….. 126 1.1.4 Los antagonistas del receptor D2 no modulan la vía de señalización del receptor 5-HT7 bloqueado por su antagonista específico SB269970. ……………………………………………………… 128 1.1.5 El efecto de la dopamina y el haloperidol en la señalización serotoninérgica del receptor 5-HT7 es mediado a través de la proteína Gi/o. ………………………………………………………………….. 129 1.2 La señalización cruzada entre los receptores D2 y 5-HT7 no se atribuye a una oligomerización de estos receptores. ………………… 132 1.2.1 Estudio de la expresión del receptor 5-HT7 endógeno en la línea celular de trabajo. ……………………………………………………. 132 1.2.2 Estudio de la expresión del receptor D2 sobreexpresado en la línea celular de trabajo. ……………………………………………………. 133 1.2.3 El cruce de la señalización de los receptores D2 y 5-HT7 no implica una estructura cuaternaria heterodimérica. ……………. 133 2. Estudio de la señalización intracelular cruzada del heterodímero D2/5-HT2A y su farmacología. .................................. 135 2.1 Estudio de la activación del receptor 5-HT2A y su efecto sobre la respuesta de la dopamina en el receptor D2. …………………………….. 135 2.1.1 La serotonina estimuló la producción de AMPc en presencia de forskolina en la línea celular que coexpresa los receptores D2 y 5-HT2A. …………………………………………………………………………... 136 2.1.2 El agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI, estimuló la producción de AMPc en presencia de forskolina en la línea celular que coexpresa los receptores D2 y 5-HT2A. ………………………….. 138 2.1.3 La producción de especies de inositol fosfato estimulada por los agonistas 5-HT2A, (±) DOI y serotonina, es independiente de forskolina. ………………………………………………………………………. 139 Índice 19 2.2 Estudio de la implicación de diferentes proteínas de la cascada intracelular de los receptores D2 y 5-HT2A en la señalización cruzada del heterodímero. …………………………………………………………………….. 141 2.2.1 El efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2, es independiente de la inhibición de la proteína Gi/o por la toxina pertussis……… 143 2.2.2 La inhibición de la proteína Gq por el compuesto YM-254890 revirtió el efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2. ………………… 146 2.2.3 La inhibición de la fosfolipasa C por el compuesto 48/80 revirtió el efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2. ………………… 149 2.2.4 El efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2 es independiente del calcio intracelular. ……………………………………………………… 152 2.2.5 El efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2 es independiente de la inhibición de la proteína Quinasa C por el compuesto Ro32- 0432. …………………………………………………………………………….. 157 2.2.6 La inhibición de la proteína quinasa A por el compuesto PKI14-22 revirtió el efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2. ………………………………………………………………………………………. 160 2.2.7 La actividad de la proteína quinasa A se vio modificada en presencia del agonista alucinógeno de 5-HT2A, (±) DOI. ……… 163 2.2.7.1 La actividad de la PKA aumentó en presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI. ……………………………………….. 164 2.2.7.2 La fosforilación de la PKA aumentó en presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI. ……………………………. 165 2.2.7.3 La activación de CREB aumentó en presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI. ……………………………………….. 167 LAURA GÓMEZ GARCÍA 20 DISCUSIÓN. ………………………………………………………………………………… 169 CONCLUSIONES. …………………………………………………………………………. 193 Conclusiones. ………………………………………………………………………………. 195 Conclusions. ………………………………………………………………………………… 197 REFERENCIAS. ……………………………………………………………………………. 199 ABREVIATURAS Y SIGLAS Abreviaturas y siglas 23 ABREVIATURAS Y SIGLAS (±) DOI (±)2,5-dimetoxi-4-iodoanfetamina 5-CT 5-carboxitriptamina 5-HT 5-hidroxitriptamina o serotonina 5-HT(1-7) Receptor de serotonina tipo 1-7 A(1-2) Receptor de adenosina tipo 1-2 AC Adenilato ciclasa ADN Ácido desoxirribonucleico Alpha® Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay AMPc Adenosin monofosfato cíclico ARIP. Aripiprazol ARN Ácido ribonucleico ATP Adenosin trifosfato BAPTA Ácido 1,2 Bis (2-animofenoxi) etano-N,N,N’,N’ tetraacético BCA Ácido bicinconínico BRET Energía de transferencia resonante bioluminiscente BSA Albúmina de suero bovino CaM Calmodulina CB(1-2) Receptor de cannabinoide tipio 1-2 CCR5 Receptor de quimioquinas C-C de tipo 5 CFP Proteína Fluorescente Cian CREB Proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc CTC Complejo Ternario Cúbico CXCR4 Receptor de quimioquinas C-X-C de tipo 4 D(1-5) Receptor de dopamina tipo 1-5 DA Dopamina DAG Diacilglicerol DARPP-32 Fosfoproteína regulada por dopamina y AMPc de 32 kDa DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMS-5 Manual Diagnóstico y Estadístico de desórdenes mentales quinta edición DMSO Dimetilsulfóxido E Eficacia EC50 Concentración estimuladora 50 ECL Bucle extracelular LAURA GÓMEZ GARCÍA 24 EDTA Ácido etilendiaminotetraacético EEM Error estándar de la media EFSK Eficacia máxima sobre el efecto de la FSK Emax Eficacia máxima del agonista EP1 Receptor de prostaglandina tipo 1 EPAC Proteína intercambiadora activada por AMPc ERK Quinasa regulada por factores extracelulares FBS Suero fetal bovino FDA Food and Drug Administration FRET Transferencia de energía resonante fluorescente FRT Diana Flp recombinante FSK Forskolina g Unidad relativa de medida de la aceleración igual a la aceleración de la gravedad GDP Guanosin difosfato GEF Factor de intercambio de nucleótidos de guanina GPCR Receptor acoplado a proteínas G GTP Guanosin trifosfato GABA(B1/B2) Receptores del ácido gamma-aminobutírico tipo B1/B2 h Hora H3 Receptor de histamina tipo 3 HALO. Haloperidol HBSS Solución salina tamponada de Hank HEK293 Células embrionarias de riñón humano HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperacinaetansulfónico HRP Peroxidasa de rábano HTRF Homogeneous Time Resolved Fluorescence IBMX 3-isobutil-1-metilxantina IC50 Concentración inhibitoria 50 ICD-11 Clasificación Internacional de Desórdenes decimoprimera edición ICL Bucle intracelular IP Inmunoprecipitación IPs Especies de inositol fosfato IP3 Inositol trifosfato KET. Ketanserina LSD Dietilamida del ácido lisérgico Abreviaturas y siglas 25 M2 Receptor muscarínico tipo 2 MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos mGlu(1/5) Receptor de glutamato tipo 1/5 min Minuto NMDA Ácido N-metil-D-aspártico PBS Tampón fosfato salino PDE Fosfodiesterasa PFC Córtex prefrontal PKA Proteína quinasa A PKC Proteína quinasa C PLA Ensayo de ligación por proximidad PLA2 Fosfolipasa A2 PLC Fosfolipasa C PTX Toxina Pertussis PVDF Fluoruro de polivinilideno QUIN. Quinpirol RIPA Ensayo de radioinmunoprecipitación rpm Revoluciones por minuto RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real SB Sustancia Negra SB. SB269970 SDS Dodecilsulfato sódico SST2 Receptor de somatostatina tipo 2 STAT Transductor de señal y activador de transcripción SULP. Sulpirida Tap. Tapsigargina TBS Suero tamponado con Tris TM Transmembrana TMB 3, 3’, 5, 5’ tetrametilbencidina VTA Área tegmental ventral YFP Proteína Fluorescente Amarilla (δ, κ, µ) OP Receptor opioide tipo δ, κ o µ LAURA GÓMEZ GARCÍA 32 disorders such as schizophrenia, leading to an improvement in new future antipsychotic drugs design. INTRODUCCIÓN Introducción 35 INTRODUCCIÓN 1. Receptores de membrana acoplados a proteínas G. Los receptores de membrana acoplados a proteínas G (GPCRs) son una superfamilia de siete dominios transmembrana altamente conservados que se caracterizan por transmitir señales al interior celular a través de la membrana plasmática interactuando con proteínas de unión a nucleótidos de guanina o proteínas G. Estos receptores son capaces de reconocer gran variedad de moléculas extracelulares entre las que se incluyen aminas, purinas y derivados de ácidos nucleicos, lípidos, péptidos y proteínas de diversos tamaños, odorantes, feromonas y fotones, neurotransmisores e iones como el calcio, entre otros (Pharmacology, Third Edition, 2003). Tras la unión de estos ligandos y la interacción a nivel intracelular con las proteínas G, se inicia una cascada de señalización dando lugar a múltiples procesos fisiológicos y patológicos (Venkatakrishnan et al., 2013). 1.1 Estructura. Los primeros pasos para conocer la estructura de los GPCRs se dieron al conseguir la estructura bidimensional cristalizada de la rodopsina bovina (Figura 1A) (Schertler, Villa and Henderson, 1993; Palczewski et al., 2000). Unos años después, se cristalizó por primera vez el receptor humano β2 adrenérgico (Cherezov et al., 2007; Rosenbaum et al., 2007). Esto permitió un aumento muy rápido de las técnicas necesarias para conseguir la estructura cristalina de numerosos receptores (cristalografías con rayos X, criomicroscopía electrónica, resonancia magnética nuclear…). Gracias a los cristales de los diversos GPCRs se obtuvo información específica de su arquitectura tridimensional, los sitios de unión de sus ligandos y detalles atómicos de las interacciones entre ligando-receptor. Los estudios realizados concluyeron que los GPCRs comparten una estructura común basada en un polipéptido con un extremo amino terminal extracelular, un extremo carboxilo terminal intracelular. Poseen siete dominios transmembrana hidrofóbicos, consistentes en segmentos αhelicoidales, que se denominan TM1-TM7. Estas estructuras LAURA GÓMEZ GARCÍA 36 transmembrana están unidas entre sí por 3 bucles extracelulares (ECL1- ECL3) y tres intracelulares (ICL1-ICL3) (Figura 1B) (Lu and Wu, 2016). La longitud y composición del extremo amino o carboxilo terminal suele variar dependiendo del receptor y según su funcionalidad. Los bucles extracelulares y los sitios de unión a ligandos, normalmente localizados en el extremo amino, suelen ser lo que más diverge en la estructura de los GPCRs entre las distintas familias (Rosenbaum, Rasmussen and Kobilka, 2009). A consecuencia de estos bucles transmembrana se comenzó a utilizar el término de receptores 7TM para referirse también a los GPCRs. Figura 1. Estructura de los GPCRs. A) Estructura de la rodopsina. Con permiso de The American Association for the Advancement of Science (Palczewski et al., 2000). B) Esquema bidimensional de la estructura de los GPCRs. Imagen creada por la doctoranda en BioRender.com. El conocimiento de la estructura de los receptores siempre ha jugado un papel importante en el desarrollo de fármacos. Actualmente, gracias a los nuevos avances en la cristalografía de GPCRs, se dispone de 70 estructuras distintas de GPCRs y unos 200 complejos de ligando-receptor en todas las clases de GPCRs humanos (Isberg et al., 2016; Congreve et al., 2020). A B Introducción 37 1.2 Clasificación. Se han identificado alrededor de 800 GPCRs en humanos, de los cuales cerca de la mitad tienen funciones sensoriales, mediando olfato, gusto, percepción de la luz o señalización de feromonas (Mombaerts, 2004). Esta superfamilia de receptores comprende aproximadamente el 2% de todas las proteínas codificadas en el genoma humano y pueden clasificarse según su unión a los ligandos, su estructura o su fisiología. De manera general, el conjunto de GPCRs en animales vertebrados e invertebrados se clasifican usando el sistema A-F que los divide en seis subtipos según la homología en su secuencia básica (Clase A: similares a rodopsina; Clase B: receptores de secretina; Clase C: glutamato metabotrópicos; Clase D: receptores de feromonas de hongos; Clase E:receptores de AMPc; y Clase F: receptores frizzled/smoothened) (Alexander et al., 2019). Sin embargo, los estudios filogenéticos más destacados han demostrado que la mayoría de los GPCRs humanos pueden agruparse en cinco grandes familias, dando lugar al sistema de clasificación GRAFS (acrónimo de los grupos), (Fredriksson et al., 2003; Schiöth and Fredriksson, 2005) que comprende los siguientes grupos (Figura 2): 1) Glutamato: esta familia se compone de 15 receptores entre los que se encuentran ocho receptores de glutamato, dos receptores GABA, un receptor sensible a calcio y cuatro receptores del gusto. El sitio de reconocimiento de los ligandos específicos se encuentra en el extremo amino que forma como una cavidad característica denominada venus fly trap (Pin and Acher, 2002). 2) Rodopsina: es la familia más grande y dentro de ella se encuentran los GPCRs sensoriales. Se caracterizan por contener una serie de aminoácidos altamente conservados en los dominios transmembrana y suelen contener un puente disulfuro entre los bucles extracelulares 1 y 2. La unión de los ligandos específicos de esta clase de receptores se encuentra en los siete dominios transmembrana (Baldwin, 1994). A su vez, esta gran familia se divide en cuatro subfamilias (α, β, γ y δ). 3) Adhesión: esta familia de receptores se caracteriza por tener un extremo amino terminal considerablemente más largo que el resto LAURA GÓMEZ GARCÍA 38 de familias (entre 200 y 2800 aminoácidos) y en el que se encuentran varios dominios como regiones ricas en glicosilaciones, motivos con cisteínas conservadas y residuos de prolinas, que participan en la adhesión celular (Harmar, 2001). 4) Frizzled/Taste2: esta familia incluye dos tipos de receptores, 1) los receptores del gusto, que se expresan en la lengua y el epitelio del paladar y están relacionados con el sentido amargo del gusto; y 2) los receptores Frizzled, que controlan la localización, proliferación y polaridad celular durante el desarrollo mediante la unión de glicoproteínas llamadas Wnt (Slusarski, Corces and Moon, 1997). Esta familia también se caracteriza por presentar cisteínas altamente conservadas en el extremo amino que permiten la unión de los ligandos Wnt. 5) Secretina: los ligandos de esta familia de receptores son péptidos grandes que comparten un patrón de aminoácidos establecido y suelen actuar de una manera paracrina. El extremo amino terminal contiene puentes entre cisteínas conservados y es importante en la unión de los ligandos a estos receptores. Introducción 39 Figura 2. Árbol filogenético de las diferentes familias y subfamilias de GPCRs. Con permiso de Elsevier (Kufareva et al., 2011). 1.3 Aspectos farmacológicos de los GPCRs. 1.3.1 Modelos de activación de GPCRs. Históricamente, muchos de los conceptos funcionales relacionados con la interacción de los ligandos con los GPCRs fueron descritos basándose en fenómenos observacionales y estudios de unión de ligando realizados en sistemas recombinantes o endógenos. Hasta que no se produjeron avances tecnológicos en técnicas biofísicas y de alta resolución (como los rayos X, la cristalografía o las resonancias magnéticas nucleares) no se pudo estudiar en profundidad las interacciones ligando-receptor. En un inicio, los estudios bioquímicos sugirieron que la activación de los GPCRs generaba cambios en las hélices de los dominios transmembrana (Farrens et al., 1996). En la actualidad, gracias a la cristalografía y la microscopía crioelectrónica, se ha LAURA GÓMEZ GARCÍA 40 aumentado el conocimiento en las distintas conformaciones y estados de activación de los GPCRs (Wacker, Stevens and Roth, 2017). A lo largo de los años han ido surgiendo muchos modelos teóricos de la activación de los GPCRs para intentar explicar la respuesta que diferentes ligandos producían al unirse al receptor. El modelo de “dos estados” asume que los GPCRs existían en equilibrio entre dos estados: el receptor inactivo (R) y el receptor activo (R*) (Lefkowitz et al., 1993; Leff, 1995; Kenakin, 1996). Este modelo surgió de la observación del efecto de diferentes compuestos sobre órganos aislados e introdujo los conceptos iniciales de agonista y antagonista, siendo el agonista capaz de inducir o estabilizar la forma activa del receptor; mientras que el antagonista no tiene efecto en sí mismo, pero bloquea el sitio de unión al receptor impidiendo el efecto agonista. Gracias al desarrollo de técnicas bioquímicas de unión, se obtuvo la capacidad de caracterizar más moléculas involucradas en la farmacología de los receptores y su estado de activación. Esto permitió la introducción del modelo del complejo ternario de los GPCRs que fue publicado por primera vez por De Lean y colaboradores (De Lean, Stadel and Lefkowitzl, 1980), el cual describe que cuando el receptor es activado por un agonista, se mueve lateralmente en la membrana celular para unirse físicamente a la proteína G. La aparición de nuevos conceptos a tener en cuenta como la actividad constitutiva de los receptores, en la que la isomerización del receptor inactivo al receptor activo podía ocurrir de manera espontánea, independiente de la unión de ligandos (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002); o el agonismo inverso, hicieron surgir un nuevo modelo de la mano de Samama y colabores denominado modelo extendido del complejo ternario (ETC) (Samamasb et al., 1993). Este modelo tiene en cuenta dos estados del receptor cuando este no está unido a ligandos: el receptor activo (Ra) e inactivo (Ri); en él se involucra la proteína G como un nuevo participante del sistema y, en el estado de receptor activo, esta proteína se une al receptor y se produce la respuesta fisiológica. El ligando puede unirse a cualquier estado del receptor y también puede interactuar con el receptor activo unido a proteína G (RaG). La propensión del sistema de tener actividad constitutiva, es decir, cuando se genera de manera espontánea la Introducción 41 formación de especies activas del receptor unidas a proteína G (RaG), viene descrita por la constante alostérica L (L = [Ra]/[Ri]) (figura 3A). Como última modificación a tener en cuenta los modelos de activación del receptor, se consideró que el receptor en estado inactivo (Ri) también tiene la capacidad de unirse a la proteína G. Esto dio lugar a un modelo más complejo para los GPCRs que se denominó modelo de complejo ternario cúbico (CTC) (Figura 3B) (Kenakin, 2004b). Figura 3. Modelos de complejos ternarios para GPCRs. A) Modelo extendido del complejo ternario. B) Modelo cúbico del complejo ternario. Donde, Ra (receptor activo), Ri (receptor inactivo), G (proteína G), L (constante alostérica), A (ligando), Ka (afinidad del ligando), α (afinidad diferencial del ligando a Ra), γ (afinidad diferencial del ARa para G), β (afinidad diferencial del Ra para G). Con permiso de Elsevier (Kenakin, 2004b). En la actualidad, los compuestos se caracterizan por tres propiedades moleculares: la afinidad y eficacia para una diana biológica y la ocupación de la diana biológica en un sistema in vivo. Estas cualidades son únicas para cada complejo de ligando y receptor, de manera que se pueden usar para caracterizar la actividad farmacológica de un ligando para un receptor en un tipo celular concreto. La eficacia de un ligando es el efecto que tiene este sobre la estructura y las propiedades biofísicas de un receptor, y por tanto también de la respuesta biológica que desencadena. Dependiendo de cómo actúen estos ligandos en el receptor, bien sean naturales o sintéticos, se pueden agrupar en diferentes clases de eficacia (Figura 4): A B LAURA GÓMEZ GARCÍA 48 Figura 6. Ciclo de activación de la proteína G. El GPCR (rosa) unido a un ligando, provoca la liberación de GDP (naranja) de la subunidad Gα (azul), que se une a GTP (verde) y se disocia del complejo Gβγ (Verde y amarillo, respectivamente). Ambos complejos interaccionan con diferentes efectores (morado). La señalización se termina cuando las proteínas reguladoras de la señal de GPCRs (RGS) (rojo) se unen a Gα y se produce la hidrólisis de GTP a GDP. Con el permiso de Springer Nature (Oldham and Hamm, 2008). Las proteínas G se identifican y clasifican según su subunidad Gα. Basándose en las similitudes funcionales y secuenciales se pueden agrupar en cuatro tipos de proteínas G: Gαs, Gαi, Gαq y Gα12. 1) Dentro de la familia Gαs encontramos dos miembros: 1) Gαs, la cual se expresa en la mayoría de tipos celulares y tiene función estimuladora de la AC; 2) Gαolf que se expresa en las neuronas sensoriales olfatorias y tiene relación con la función olfativa. La vía de señalización de esta familia es la que se describió originalmente Introducción 49 y sirvió para estudiar conceptos como segundo mensajero, fosforilación de proteínas o transductores de señales (Neves, Ram and Iyengar, 2002). La Gαs estimula la activación de la adenilato ciclasa, que provoca un aumento de AMPc a partir de ATP, y este activa la vía de señalización a través de la proteína quinasa A (PKA). El AMPc es degradado por fosfodiesterasas. Además, el AMPc también actúa sobre las proteínas EPAC (proteínas intercambiadoras activadas por AMPc) que forman una familia de proteínas que intercambian nucleótidos de guanina y tienen efecto sobre pequeñas GTPasas denominadas Rap. La activación de Rap activa la vía de las MAPK quinasas (proteínas quinasas activadoras mitogénicas) (Marinissen and Gutkind, 2001). 2) La familia Gαi es la familia más amplia y diversa, se expresan en la mayoría de tipos celulares y tienen función inhibitoria. Algunos de los subtipos que incluyen esta familia son: Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαo, Gαt, Gαg y Gαz. Gαo se expresa principalmente en neuronas, Gαt se expresa en células del ojo (Gαt1 en los bastones del ojo y Gαt2 en los conos), Gαg se encuentra en células receptoras del gusto, y Gαz se expresa en tejido neuronal y plaquetas (Syrovatkina et al., 2016). Las proteínas G de esta familia tienen un efecto inhibitorio sobre la adenilato ciclasa, de manera que su activación conlleva una disminución del AMPc. Muchas hormonas importantes y neurotransmisores como la dopamina, la acetilcolina, la epinefrina y la serotonina se acoplan a través de diferentes GPCRs a proteínas G de este tipo para producir su respuesta celular. Además de la inhibición de la adenilato ciclasa, puede regular la actividad de quinasas c-Src que tiene efecto sobre los transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT) y sobre vías de señalización de Rap (Silva, 2004). 3) La familia Gαq en humanos incluye cuatro subtipos: Gαq y Gα11 que se encuentran expresadas ubicuamente, Gα14 que se expresa principalmente en tejidos de riñón, pulmón e hígado, y Gα16 que se expresa específicamente en células hematopoyéticas. La activación de estas proteínas lleva a la movilización de calcio como segundo mensajero a través de la estimulación y activación de la fosfolipasa LAURA GÓMEZ GARCÍA 50 C (PLC) que produce la hidrólisis de fosfatidilinositol bifosfato dando lugar a diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3). EL IP3 es el que media la liberación de calcio del retículo endoplasmático que puede activar canales de calcio de la membrana celular permitiendo el flujo de calcio extracelular al interior de la célula. El DAG, por su parte, capta la proteína quinasa C (PKC) a la membrana celular y la activa (Syrovatkina et al., 2016). 4) La familia Gα12 se compone de dos miembros: Gα12 y Gα13 que se expresan en la mayoría de células. Esta familia de proteínas G señalizan a través de Rho, que es una familia de pequeñas GTPasas que son modulas por factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEFs), y participan en la transformación celular y desarrollo embrionario (Kozasa et al., 1998; Seasholtz, Majumdar and Brown, 1999). Respecto al heterodímero Gβγ, la subunidad β tiene cinco subtipos Gβ1, Gβ2, Gβ3 y Gβ4 que se encuentran ampliamente distribuidos por todos los tejidos celulares y Gβ5 que difiere secuencialmente algo más de las anteriores y se encuentra distribuida principalmente en el cerebro. La subunidad γ tiene 13 tipos diferentes que son más diversos y con más variabilidad secuencial entre sí. Originalmente se pensaba que el heterodímero Gβγ servía como regulador negativo de la subunidad Gα, siendo necesaria su reagrupación para inactivarla y unirse de nuevo al receptor de membrana terminando el ciclo de actuación de la proteína G. Actualmente diversos estudios demuestran que la subunidad Gβγ puede modular diversos efectores por sí misma, alguno como la adenilato ciclasa y la fosfolipasa Cβ compartidos con la subunidad Gα (Taussig et al., 1994; Zhang et al., 1996). También actúa sobre, quinasas como la PI3, y canales de potasio Kir3 e inhibe canales de calcio dependientes de voltaje (Dupré et al., 2009) (Figura 7). Introducción 51 Figura 7. Vías de señalización de proteínas G. Imagen creada por la doctoranda en BioRender.com 1.5 Dianas terapéuticas. Los GPCRs no sensoriales median la señalización intracelular por diferentes ligandos y son la diana de la mayoría de los fármacos que se utilizan en la clínica, aunque solo una pequeña parte de ellos tienen un uso terapéutico (Overington, Al-Lazikani and Hopkins, 2006; Rask-Andersen, Masuram and Schiöth, 2014). Son considerados dianas farmacológicas de alto interés ya que regulan numerosos y diversos procesos fisiológicos y disponen de sitios de unión accesibles en la superficie de las membranas celulares para ser modulados por fármacos. Alrededor de 500 fármacos aprobados tienen como dianas GPCRs, es decir, aproximadamente entre un 27-34% de los compuestos aprobados por la FDA (Food and Drug Administration)(Overington, Al-Lazikani and Hopkins, 2006; Rask- Andersen, Masuram and Schiöth, 2014). Estos fármacos actúan sobre 107 GPCRs diferentes, lo que corresponde con un 27% de los GPCRs humanos no sensoriales. Más de la mitad del genoma humano codificado de los GPCRs no sensoriales continúa siendo terapéuticamente desconocido por lo LAURA GÓMEZ GARCÍA 52 que la investigación en esta área y el desarrollo de nuevas tecnologías para desarrollar nuevos fármacos es fundamental (Hauser et al., 2017). Los fármacos con GPCRs como diana de actuación se están expandiendo como tratamiento de nuevas enfermedades que hasta la fecha no se habían tratado a través de la modulación de GPCRs, como enfermedades metabólicas (Nauck et al., 2016), enfermedades oncológicas (Bar-Shavit et al., 2016), o enfermedades neurodegenerativas como el alzhéimer (Sushma and Mondal, 2019). El sistema nervioso central continúa siendo uno de los más representados en las indicaciones de fármacos con dianas en GPCRs. El 27% de todos los fármacos aprobados que tienen como diana GPCRs están destinados al tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central. Esto se correlaciona con que, según un análisis de la expresión basal de receptores del atlas de proteínas humanas (Uhlén et al., 2015), más de la mitad de los GPCRs no sensoriales se expresan en la corteza cerebral. Es por ello que, 142 compuestos que tienen como dianas GPCRs están actualmente en ensayos clínicos para indicaciones del sistema nervioso central (Hauser et al., 2017; Congreve et al., 2020). La interacción de múltiples neurotransmisores con GPCRs en el sistema nervioso central hace que estos sean prometedoras dianas terapéuticas para muchos desórdenes psiquiátricos y neurológicos como la esclerosis múltiple, la esquizofrenia, el alzhéimer o la enfermedad de Huntington, entre otros (Komatsu, 2015). Muchos de los fármacos conocidos tienen sus efectos terapéuticos en múltiples dianas farmacológicas, lo que se conoce como polifarmacología. En el caso de los GPCRs, es bastante frecuente que un mismo fármaco pueda tener diferentes receptores como dianas terapéuticas. A pesar de que la tendencia en el desarrollo de fármacos para GPCRs es buscar la selectividad por una diana, la polifarmacología puede contribuir al entendimiento y tratamiento de algunas enfermedades con múltiples dianas, como es el caso de la esquizofrenia en la que el haloperidol tiene efecto en receptores de dopamina y serotonina (Anighoro, Bajorath and Rastelli, 2014; Butini et al., 2016). Introducción 53 2. GPCRs de interés en la esquizofrenia. 2.1 Aspectos generales de la esquizofrenia. La esquizofrenia es una enfermedad mental grave que se caracteriza por presentar desórdenes psiquiátricos, como delirios o alucinaciones, apatía y distanciamiento social, y deterioro cognitivo. Las alteraciones en la conducta, el pensamiento y la percepción de la realidad hacen de esta enfermedad una de las diez más discapacitantes a largo plazo. De los desórdenes psiquiátricos, la esquizofrenia es la que genera un mayor coste social y económico ya que requiere numerosos cuidados (Mueser and McGurk, 2004). Esta enfermedad afecta alrededor del 1% de la población mundial y, a pesar de las variaciones en la prevalencia e incidencia en los diferentes países, un estudio de la Organización Mundial de la Salud demuestra el desarrollo clínico de la esquizofrenia es similar en la mayoría de las culturas y países, tanto desarrollados como en desarrollo (Jablensky et al., 1992). La esquizofrenia se desarrolla normalmente en la edad adulta temprana o adolescencia tardía (entre los 16 y los 3 años) y de manera igualitaria en ambos sexos. Sin embargo, los hombres suelen tener un inicio más temprano de la enfermedad que las mujeres, y suelen desarrollar más síntomas negativos, peor funcionamiento social y en general peores consecuencias (Jablensky, 2000). 2.1.1 Etiopatología. Las causas de la esquizofrenia continúan siendo desconocidas, pero se considera un desorden multifactorial que puede desarrollarse por el conjunto de factores genéticos, factores ambientales (sobre todo durante el desarrollo embrionario) y factores sociales. Diversos estudios llevados a cabo en gemelos y adopciones demostraron que el riesgo de tener esquizofrenia aumentaba cuando se trataba de personas con parentesco familiar con pacientes esquizofrénicos, por lo que se dedujo que había una clara relación genética (McGuffin, Owen and Farmer, 1995; Cardno et al., 1999). Los estudios genéticos más recientes han demostrado un amplio número de variantes genéticas en pacientes con esquizofrenia, desde variaciones importantes en el número LAURA GÓMEZ GARCÍA 54 de copias hasta polimorfismos en un solo gen. Se estima que hay alrededor de 120 loci asociados al riesgo de desarrollar esquizofrenia, aunque estos marcadores de riesgo explican el 10% de los casos de esquizofrenia aproximadamente (Kahn et al., 2015). Estudios de asociación del genoma completo han identificado recientemente algún nuevo loci implicado en la esquizofrenia, pero aun así, solo explican el 32% de los casos de esquizofrenia (Xu et al., 2012; Ripke et al., 2013). Algunas variaciones raras en el número de copias, sobre todo asociadas al brazo largo del cromosoma 22, tienen alta penetrancia en esquizofrenia, pero estos casos solo se san en el 0.3% de todos los pacientes (Hiroi et al., 2013). Recientemente, se han encontrado nuevos aspectos interesantes que relacionan genes involucrados con el sistema inmune y procesos neuroinmunológicos con la patogenia de la esquizofrenia (Deakin, Lennox and Zandi, 2014; Needham and Zandi, 2014). Sin embargo, todavía se desconoce sobre cuántos y qué mecanismos patogénicos actúan estas variaciones genéticas e inmunológicas y cómo contribuyen a los procesos fisiopatológicos de la esquizofrenia. Además de los factores genéticos, existen factores ambientales, tanto biológicos como psicosociales que afectan al riesgo de desarrollar esquizofrenia. Por un lado, dentro de los factores ambientales biológicos se han descrito situaciones que aumentan el riesgo de padecer la enfermedad si se experimentan sobre todo en el proceso prenatal o perinatal. Algunas de las complicaciones se pueden dar durante el embarazo como infecciones víricas o bacterianas, malnutrición, diabetes o el consumo de tabaco y otras drogas (Takei et al., 1996; Thomas et al., 2001); o también en el momento del nacimiento, como partos prematuros, recién nacidos de bajo peso o que han sufrido hipoxia durante el parto (Cannon, Jones and Murray, 2002). Aunque muchas de estas complicaciones obstétricas no llevan al desarrollo de esquizofrenia, sí que pueden interaccionar con factores genéticos dando lugar a un aumento del riesgo. Por otro lado, numerosos factores psicosociales y sociodemográficos también han demostrado aumentar el riesgo de padecer esquizofrenia. En diversos estudios epidemiológicos se ha relacionado que la pobreza y la pertenencia a una clase social baja aumentan el riesgo, al igual que lo hace la vida en una urbe con respecto a la vida en zonas rurales (Bruce, Takeuchi Introducción 55 and Leaf, 1991; Peen and Dekker, 1997). Factores sociales como el estrés, la migración de personas o el abuso de drogas como el cannabis, juegan un papel fundamental durante la edad adulta, que sumado al resto de factores, puede provocar un mayor riesgo de desarrollar esquizofrenia (Arseneault et al., 2002; Henquet et al., 2005). 2.1.2 Hipótesis fisiopatológicas de la esquizofrenia. La esquizofrenia es un desorden psiquiátrico en el que está involucrada la desregulación de varios neurotransmisores en múltiples vías de señalización. Algunas de las hipótesis que se barajan para explicar los síntomas de esta enfermedad mental se describen a continuación. La hipótesis clásica y que mejor se conoce es la hipótesis de la dopamina, la cual se caracteriza por una hiperactividad dopaminérgica en la vía mesolímbica del cerebro, que principalmente afecta a receptores de dopamina D2. Asimismo, se comprobó que el bloqueo de estos receptores era un tratamiento útil frente a esta enfermedad (Carlsson and Lindqvist, 1963; Seeman and Lee, 1975). La vía mesolímbica proyecta neuronas desde el área tegmental ventral (VTA) al área del estriado ventral. La hiperactividad de la dopamina en estas áreas provoca los síntomas positivos de la enfermedad como delirios, paranoia y alucinaciones, frecuentemente auditivas. Además de esta vía, también se han estudiado otras vías dopaminérgicas afectadas que permiten explicar los diferentes síntomas de la enfermedad. La hipofunción de la vía mesocortical que proyecta neuronas dopaminérgicas desde la VTA hasta el córtex prefrontal (PFC) podría estar implicada en los síntomas negativos y alteraciones en la cognición. Por otro lado, la vía nigroestriada, cuyos haces se proyectan desde la sustancia negra (SB) hasta el estriado, podría estar implicada en los síntomas extrapiramidales provocados por los antipsicóticos que antagonizan el receptor D2. Finalmente, la vía tuberoinfundibular cuyas neuronas se encuentran en el hipotálamo, donde la dopamina inhibe la liberación de prolactina, por lo que la hiperprolactinemia típica de los efectos secundarios de los antagonistas de D2 podría deberse a la implicación de esta vía (Figura 8) (Klein et al., 2019). LAURA GÓMEZ GARCÍA 56 Figura 8. Vías dopaminérgicas afectadas en la esquizofrenia. Con permiso de Springer Nature, modificada de (Klein et al., 2019). Aunque la hipótesis de la hiperactivación dopaminérgica explica muchos de los síntomas de la esquizofrenia, diversos estudios consideran que otros sistemas de neurotransmisores están implicados en la fisiopatología de la enfermedad. La hipótesis serotoninérgica está basada en estudios que relacionan las drogas alucinógenas como el ácido lisérgico (LSD) cuya diana farmacológica es el receptor 5-HT2A y sus efectos psicoactivos, con los efectos antipsicóticos de los antagonistas de este receptor como la clozapina o la risperidona y su uso en el tratamiento de la esquizofrenia (Kapur and Remington, 1996; Meltzer and Massey, 2011). La hiperactivación de estos receptores y el exceso de serotonina en neuronas glutaminérgicas del córtex lleva a la liberación de glutamato y podría ser otra explicación para la patología de la esquizofrenia. De ahí surge la hipótesis glutaminérgica, que se basa en una hipoactividad de los receptores de glutamato NMDA (N-metil-D-aspartato). El glutamato es el neurotransmisor más abundante en el cerebro y las vías glutaminérgicas se extienden por el córtex, el sistema límbico y el tálamo implicadas en la esquizofrenia y, además, algunos antagonistas del receptor NMDA, como la fenciclidina y la ketamina provocan síntomas psicóticos similares a la esquizofrenia (Goff and Coyle, 2001; Farber, 2003; Coyle, Vía mesocortical Vía mesolímbica Vía nigroestriada Vía tuberoinfundibular Introducción 57 2006). La hipofunción de los receptores NMDA conduce a cambios estructurales y morfológicos en el cerebro que pueden resultar en el desarrollo de psicosis. Hay estudios que demuestran que algunos de los antipsicóticos de segunda generación pueden actuar sobre receptores NMDA y también influir en la transmisión de glutamato actuando en receptores de serotonina (Stone, Morrison and Pilowsky, 2007; Aringhieri et al., 2018). Es evidente que la fisiopatología de la esquizofrenia no puede ser explicada por una sola alteración molecular, sino que involucra anomalías en el sistema dopaminérgico, así como alteraciones en el sistema serotoninérgico y glutaminérgico provocando el funcionamiento aberrante de las interneuronas que, sumando a los factores genéticos y ambientales, dan lugar a una disfunción cognitiva, de comportamiento y social de los pacientes esquizofrénicos. 2.1.3 Síntomas y diagnóstico. La esquizofrenia se caracteriza por tres tipos de síntomas principales: positivos, negativos y cognitivos. Los síntomas positivos son síntomas psicóticos en los que se distorsiona la realidad y entre los que se encuentran alucinaciones visuales y auditivas, delirios, dificultad para organizar pensamientos y ejecución de movimientos extraños. Normalmente estos síntomas son puntuales y tienden a remitir, aunque algunos pacientes experimentan síntomas psicóticos residuales a largo plazo. Los síntomas negativos afectan a las emociones y a la conducta social, particularmente se desarrolla una pérdida de la motivación e iniciativa, dificultad para expresar emociones, reducción del habla y aislamiento social. Los síntomas cognitivos conllevan un trastorno del pensamiento, que se manifiesta como un discurso distorsionado o ilógico, un fallo en el uso del lenguaje de una manera racional. Los pensamientos no siguen una cadena lógica y una dirección, sino que se disparan sin coherencia. Los síntomas negativos y cognitivos tienden a cronificarse y se asocian con los efectos a largo plazo que afectan a las funciones sociales (Owen, Sawa and Mortensen, 2016). LAURA GÓMEZ GARCÍA 64 área ventral tegmental, el hipotálamo, zonas de la corteza, el septum, la amígdala y el hipocampo. Además, a nivel periférico este receptor se ha observado en retina y en la glándula pituitaria; y junto al resto de receptores de dopamina también se encuentra en el riñón, las glándulas adrenales, el tracto gastrointestinal, vasos sanguíneos y corazón (Missale et al., 1998; Vallone, Picetti and Borrelli, 2000). El receptor D2 se encuentra tanto en neuronas presinápticas como postsinápticas, lo que hace que tenga funciones específicas según la localización. Una de las mayores implicaciones de la dopamina está relacionada con la locomoción, por ello, la activación presináptica de receptores D2 disminuye la liberación de dopamina, dando lugar a una disminución de la actividad locomotora; mientras que la activación postsináptica estimula la locomoción. El hecho de que este receptor sea la diana de fármacos antipsicóticos, también lo ha relacionado con su implicación fundamental en desórdenes psiquiátricos. Fuera del sistema nervioso central, el receptor D2 media la regulación de la secreción de prolactina en la glándula pituitaria, media la secreción de aldosterona en la glándula adrenal, así como la función renal, la regulación de la presión sanguínea y la movilidad gastrointestinal (Beaulieu and Gainetdinov, 2011). Dentro del grupo de receptores D2, los receptores presentan perfiles farmacológicos distintos, aunque a veces es difícil encontrar diferentes compuestos que sean selectivos para cada receptor, sobre todo en el caso del receptor D2 y D3. Tampoco hay compuestos que discriminen entre la variante larga y corta del receptor D2. Todos comparten como agonista endógeno la dopamina, aunque tiene mayor afinidad por el receptor D3 y D4 que por el D2. Además de la dopamina, los agonistas apomorfina y bromocriptina son más selectivos por el receptor D2. En el caso de los antagonistas, el haloperidol y la espiperona son los que presentan una mayor afinidad por el receptor D2, aunque también presentan actividad antagonista la sulpirida, la clozapina y la clorpromacina (Missale et al., 1998). El receptor D2 está acoplado a la proteína Gαi que regula negativamente la producción de AMPc, dando lugar a la disminución de la actividad de PKA, la activación de canales de potasio y la modulación de otros canales iónicos. Se ha identificado que la activación de la proteína Gαi da lugar a la inhibición Introducción 65 de la AC5, mediante la activación del receptor D2 en el estriado (Lee et al., 2002). Como se comentado, la disminución del AMPc conlleva un descenso de la actividad de la PKA, la cual tiene varios sustratos que se ven afectados, como son la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB), receptores ionotrópicos de glutamato, algunos canales iónicos y la fosfoproteína regulada por dopamina y AMPc de 32 kDa (DARPP-32). Esta última proteína es un inhibidor potente de la proteína fosfatasa 1 (PP1) y es una de las más estudiadas en la vía de señalización de la dopamina ya que actúa como integrador y regulador de la plasticidad sináptica dependiente de dopamina en el estriado (Nair, Bhalla and Hellgren Kotaleski, 2016). Así mismo, la PKA también fosforila la proteína CREB en la serina 133 y se ha demostrado un aumento en la fosforilación de esta proteína al bloquear el receptor D2 con diversos antagonistas específicos como el haloperidol (Pozzi et al., 2003a) Además de la vía de señalización canónica a través de la subunidad Gαi, el receptor D2 también puede señalizar a través de la subunidad Gβγ. A través de esta subunidad puede activar otras AC como la AC2; puede estimular MAP quinasas como la quinasa regulada por la señal extracelular (ERK) que da lugar a la síntesis de AND y mitogénesis de muchos tipos celulares; aumenta la corriente de iones de K+ en la mayoría de áreas cerebrales dando lugar a una disminución de la excitabilidad celular; en interneuronas colinérgica inhibe canales de Ca2+ tipo N, inhibiendo la liberación de acetilcolina; y también puede activar la PLC que en última instancia da lugar a la reducción de las corrientes de Ca2+ a través de canales de tipo L. La activación de PLC puede llevar también a la activación de CREB, DARPP-32 o ERK de manera independiente de PKA (Figura 10) (Neve, Seamans and Trantham-Davidson, 2004). LAURA GÓMEZ GARCÍA 66 Figura 10. Vías de señalización del receptor D2 de dopamina. Imagen creada por la doctoranda en Biorender.com. La relación entre el receptor D2 y la esquizofrenia se hizo evidente casi simultáneamente con el descubrimiento de los receptores de dopamina ya que se observó el efecto antipsicótico del haloperidol al unirse a este receptor en 1975. Todos los antipsicóticos, tanto típicos como atípicos, tienen afinidad por este receptor. Esto, sumado a la hipótesis dopaminérgica de la esquizofrenia en la que se describe una hiperactividad dopaminérgica en la zona mesolímbica, hacen que el estudio de este receptor y sus ligandos sea de un alto interés para el tratamiento de la esquizofrenia (Seeman, 2006). Introducción 67 2.2.2 Receptores de serotonina 5-HT2A. La serotonina, 5-hidroxitriptamina (5-HT) es unos de los mensajeros químicos más estudiados debido al elevado número de procesos fisiológicos en los que interviene. Se sugirió su función como neurotransmisor en el sistema nervioso central puesto que se observó que se distribuía heterogéneamente por todo el cerebro (Amin, Crawford and Gaddum, 1954). La serotonina juega un papel importante en las funciones fisiológicas humanas a través de la interacción con 14 subtipos de receptores de serotonina, de los cuales 13 están acoplados a proteínas G y uno es un canal catiónico controlado por ligando (Berger, Gray and Roth, 2009). Algunas de las funciones fisiológicas en las que interviene la serotonina y sus receptores son el control de los ciclos de sueño y vigilia, locomoción, termorregulación, alimentación, dolor, migrañas, homeostasis, cognición y comportamiento sexual. Las alteraciones en el sistema serotoninérgico en el sistema nervioso central están implicadas en enfermedades neurodegenerativas, desórdenes psiquiátricos y control del estado de ánimo y emociones; también en enfermedades gastrointestinales, patologías cardiovasculares y de agregación plaquetaria. Los receptores de serotonina, que pertenecen a la clase A o similares a Rodopsina de la clasificación de los GPCRs, se subdividen en 6 grupos, 5- HT1 – 5-HT7, siendo el 5-HT3 la excepción ya que se corresponde con un canal iónico. A su vez, la familia de receptores 5-HT1 tienen 5 subtipos (5- HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-HT1E y 5-HT1F), la de 5-HT2 tiene 3 subtipos (5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2C,); y la de 5-HT5 tiene 2 subtipos (5-HT5A y 5-HT5B) (Humphrey, Hartig and Hoyer, 1993). Los receptores de la familia 5-HT2 comparte una alta homología en la secuencia (entre un 46-50% de similitud) y tienen vías de señalización similares. En particular, el receptor 5-HT2A está formado por 471 aminoácidos y presenta varias glicosilaciones. En humanos, el gen de este receptor se encuentra en el cromosoma 13q14-q21 y tiene tres intrones (Figura 11). Se produce una variante truncada por splicing alternativo que se ha localizado en cerebro, pero no tiene diferencias funcionales o de unión a ligandos (Guest et al., 2000). Este receptor está implicado en numerosas funciones biológicas como la contracción muscular, la división y LAURA GÓMEZ GARCÍA 68 crecimiento celular, ya que posee actividad mitótica; y a nivel cerebral, está involucrado en varios procesos neurofisiológicos. Figura 11. Estructura cristalina del receptor 5-HT2A unido a risperidona (PDB 6A93) (Kimura et al., 2019). Los estudios con radioligandos específicos, hibridación in situ de ARN mensajero y RT-PCR han confirmado una distribución del receptor 5-HT2A similar en el cerebro de diferentes especies de mamíferos. Principalmente, este se distribuye por la corteza cerebral (sobre todo en la lámina I y IV donde se expresa en neuronas piramidales e interneuronas), en la ínsula, algunos núcleos del tronco cefálico y en el sistema límbico. A nivel periférico se han encontrado receptores en células musculares lisas vasculares y gastrointestinales, en plaquetas y en la retina (Leysen, 2004). Al tratarse de un receptor de serotonina, la serotonina tiene efecto agonista sobre este receptor, además se ha comprobado que al activar el receptor induce agregación plaquetaria en las plaquetas (De Clerck et al., 1984). Además de este agonista endógeno, los agonistas que más utilizan para el estudio de los efectos funcionales de este receptor son el 4-iodo, 4- bromo o 4-metil 1(2,5 dimetoxifenil)-2-aminopropano, denominados DOI, DOB o DOM, respectivamente. Estos agonistas, al igual que la mescalina o el LSD que también actúan como agonistas de este receptor aunque no son Introducción 69 selectivos exclusivamente para él, tienen efectos alucinógenos, por lo que son buenas herramientas farmacológicas para el estudio del receptor pero no tienen ninguna aplicación clínica (Fiorella, Rabin and Winter, 1995). Por otro lado, los antagonistas de este receptor tienen efecto clínico en algunos de los síntomas de la esquizofrenia, de ahí que muchos de los antipsicóticos de segunda generación o atípicos tengan como diana este receptor, como la clozapina o la risperidona. La ketanserina se utiliza también como herramienta farmacológica de estudio siendo un antagonista específico (Leysen, 2004). El receptor 5-HT2A está acoplado a la proteína Gαq que de manera canónica activa la PLC, dando lugar a la hidrólisis de PIP2 en DAG y IP3. Esto lleva a un aumento en la acumulación de Ca2+ intracelular que promueve la activación de canales de calcio y de la PKC. Esta vía de señalización es la que se da de manera mayoritaria, pero se ha observado que este receptor puede inducir muchas vías diferentes dependiendo también del tipo celular. Por otro lado, se ha observado que algunos agonistas sesgados pueden activar la fosfolipasa A2 (PLA2) dando lugar a la liberación de ácido araquidónico (AA) mediado a través de la activación de la proteína Gα12 y Rho y la activación de p38 en células NIH3T3(Kurrasch- Orbaugh et al., 2003). En neuronas piramidales del córtex prefrontal, la estimulación del receptor 5-HT2A promueve la inhibición del flujo de calcio a través de canales de calcio dependientes de voltaje y reduce las corrientes persistentes de Na+, a través de la vía de señalización Gq/PLC/PKC, lo que puede modular negativamente la plasticidad sináptica de las dendritas. Diferentes mecanismos de señalización intracelular pueden dar lugar a la activación de ERK en varios tejidos. En algunas neuronas, la activación del receptor media la activación de ERK independientemente de PLC y PKC, sino a través de vías de señalización dependiente de Ras y Raf y la activación de quinasas. La activación de ERK puede provocar cabios neuronales a largo plazo (Figura 12) (Quinn et al., 2002). LAURA GÓMEZ GARCÍA 70 Figura 12. Vías de señalización del receptor 5-HT2A. Imagen creada por la doctoranda en Biorender.com. Modificada de (Masson et al., 2012). La implicación del receptor 5-HT2A en la esquizofrenia surgió a partir del efecto antipsicótico que presentaban algunos antagonistas de este receptor, tratando síntomas positivos y negativos. Esta relación con la esquizofrenia se ha corroborado gracias a varios estudios en los que se muestra una gran reducción de la unión al receptor 5-HT2A por parte de ligandos específicos en el córtex prefrontal, tanto en tejido post mórtem de pacientes esquizofrénicos como en estudios in vivo (Rasmussen et al., 2010; Selvaraj et al., 2014). 2.2.3 Receptores de serotonina 5-HT7. Como se ha comentado anteriormente, el receptor de serotonina 5-HT7 pertenece a la familia de los receptores de serotonina y es el que se identificó más recientemente dentro de la familia de GPCRs Introducción 71 serotoninérgicos. Este subtipo de receptor está implicado numerosos procesos fisiológicos y patológicos del sistema nervioso central, como el ritmo circadiano, el movimiento ocular en la fase REM del sueño, depresión, termorregulación, ansiedad, esquizofrenia, nocicepción, epilepsia y memoria. Fue clonado por primera vez en 1993 (Lovenberg et al., 1993). El gen se localiza en el cromosoma humano 10q21-q24 y contiene tres intrones por lo que el ARN mensajero puede sufrir splicing alternativos que dan lugar a tres variantes en humanos que se diferencian en la cola carboxilo terminal intracelular, 5-HT7a, 5-HT7b y 5-HT7d (Heidmann et al., 1997; Vanhoenacker, Haegeman and Leysen, 2000). Esto puede dar lugar a diferentes perfiles farmacológicos, sin embargo, no se han descrito variaciones en la cascada de transducción intracelular (Figura 13). Figura 13. Estructura y secuencia aminoacídica del receptor 5-HT7. En rosa se indican las mutaciones in vitro que reducen la unión o potencia de los ligandos en más de 5 veces; y en amarillo las mutaciones que no tienen efecto o el efecto que tienen es menor de 5 veces. Imagen obtenida de la base de datos de GPCRs (gpcrdb.com). LAURA GÓMEZ GARCÍA 72 Este receptor se encuentra ampliamente distribuido por todo el sistema nervioso central y periférico mostrando una mayor expresión en el hipotálamo, tálamo, hipocampo y regiones de la corteza (Varnäs et al., 2004). También se ha detectado en células del musculo liso cardiovasculares, gastrointestinales y del sistema reproductivo, donde este receptor tiene función relajante (Inoue et al., 2003; Jähnichen, Glusa and Pertz, 2005; Janssen et al., 2005). Existen numerosos agonistas no selectivos de este receptor como la serotonina (5-HT), el carboxitriptamina (5-CT) y la 8-hidroxi-2- dipropilamino tetralina (8-OH-DPAT) que no presentan una afinidad muy alta por este (a excepción de la serotonina que presenta una Kd = 2.9 nM (Vanhoenacker, Haegeman and Leysen, 2000)), pero que se utilizaron en diversos ensayos para su estudio. Más recientemente, se identificaron agonistas selectivos para este receptor como AS-19, LP-211 y E-55888, así como numerosos antagonistas selectivos, como el compuesto SB-258719, SB-269970, SB656104 y JNJ-18038683 (Nikiforuk, 2015). Además, numerosos antipsicóticos como la risperidona, clozapina, lurasidona y amisulprida presentan afinidad por este receptor, al igual que compuestos alucinógenos como el LSD, pero no son selectivos de 5-HT7. El receptor 5-HT7 está acoplado a una proteína Gαs de modo que su estimulación provoca la activación de la adenilato ciclasa que conlleva un aumento del AMPc. La coexpresión de varias isoformas de AC con el receptor 5-HT7 humano en células HEK293 ha demostrado que la activación de Gαs activa la AC5. También se ha observado una activación de la AC1 y AC8 que son insensibles a Gαs, pero sensibles a calcio/calmodulina (Ca2+/CaM). De hecho, la activación del receptor conlleva el aumento de Ca2+ independiente de PIP2 o PKC, a través de la actividad de AC1 y AC8. Estos subtipos de AC son específicos de células neuronales y se expresan en áreas como el hipotálamo o el hipocampo, donde también se localiza el receptor 5-HT7 (Baker et al., 1998). El aumento de AMPc tras la activación del receptor provoca por un lado la activación de PKA que fosforila a CREB (proteína de unión al factor de transcripción CRE); y por otro lado la despolarización de las neuronas, de manera independiente a la activación de PKA, aumentando la corriente catiónica de manera no selectiva o a través de canales de potasio (Bonsi et al., 2007). En células HEK el AMPc y el Ca2+ Introducción 73 contribuyen a la activación de la vía de ERK a través de factores de intercambio de nucleótidos de guanina, Ras. En cultivos de neuronas hipocampales transfretadas con el receptor 5-HT7, también se activa la vía de señalización de ERK a través de factores de intercambio de guanina Epac, más que a través de PKA (Lin et al., 2003). Además, se ha observado que el receptor puede acoplarse también a la proteína G12 en células fibroblásticas NIH3T3 desencadenando una señalización a través de la GTPasa RhoA que resulta en la modificación de la morfología celular e induce la formación de filopodios (Figura 14) (Kvachnina et al., 2005). Figura 14. Vías de señalización del receptor 5-HT7. Imagen creada por la doctoranda en Biorender.com. Modificada de (Masson et al., 2012). La implicación del receptor 5-HT7 en la esquizofrenia ya se observó desde que se comprobó que este receptor es diana de antipsicóticos tanto típicos como atípicos por lo que parte de los efectos de estos fármacos pueden estar mediados por esta vía (Roth et al., 1994). Se ha demostrado LAURA GÓMEZ GARCÍA 80 Como se ha comentado, la oligomerización de GPCRs puede llevar a perfiles de señalización muy diferentes a los que tienen los receptores individualmente. La superficie de unión a ligandos varía, dando lugar a múltiples combinaciones posibles de bolsillos de unión donde interaccionar con lo ligandos. Las diversas interacciones alostéricas que pueden suceder en estas situaciones provocan una alteración de la farmacología de estos complejos. La formación de dímeros y oligómeros puede alterar la eficiencia de los fármacos y compuestos alostéricos que modulan la señalización positiva o negativamente. Se ha comprobado que algunos dímeros tienen funciones farmacológicas diferentes a los monómeros y son de gran relevancia a la hora de desarrollar futuros fármacos. Por ejemplo, la unión de agonistas o antagonistas al receptor β2 adrenérgico o al receptor de oxitocina OT, cuando estos se encuentran formando un heterodímero, da lugar a la activación de ERK (Wrzal et al., 2012). También ocurre con el heterodímero CB1/CB2, en los cuales se reduce la señal de ERK a través de AMPc cuando se unen antagonistas a los receptores, que se conoce como crossantagonismo, y tiene mucha relevancia en el tratamiento del alzhéimer (Navarro et al., 2018). Por otro lado, el heterodímero 5-HT1A/5-HT7 ha permitido demostrar que la dimerización de los receptores es dinámica, y que fluctúa en relación a la expresión de los monómeros en cada momento de maduración celular y tipo celular. Esto tiene relevancia a nivel a nivel cerebral, donde las neuronas más inmaduras expresan un mayor porcentaje del heterodímero, que da lugar a una supresión de la señalización a través de Gi mediada por el receptor 5-HT1A; sim embargo, a medida que se produce la maduración neuronal disminuye la expresión del receptor 5-HT7 y el receptor 5HT1A forma homodímeros que presentan una farmacología diferente a la del heterodímero (Prasad, Ponimaskin and Zeug, 2019). Asimismo, la selectividad funcional que presentan los fármacos antipsicóticos típicos y atípicos sobre el receptor 5-HT2A se ha asociado a procesos de dimerización de este receptor (Brea et al., 2009). 3.2 Oligómeros relevantes en el sistema nervioso central. Como se ha comentado anteriormente, más de la mitad de los GPCRs no sensoriales se expresan en el sistema nervioso central, y cerca del 30% Introducción 81 de los fármacos comercializados frente a GPCRs están destinados al tratamiento de desórdenes mentales. Es por ello que se está empezando a considerar que la oligomerización de los GPCRs tiene un alto impacto en las alteraciones neurológicas y por tanto su estudio es relevante a la hora de desarrollar nuevos tratamientos. Se han descrito múltiples hetero- y homodímeros en el sistema nervioso central sobre todo de las familias de receptores de glutamato, adenosina, dopamina, serotonina y cannabinoides: - Receptores opiáceos y de cannabinoides. Los opiáceos y cannabinoides se usan para el tratamiento del dolor neuropático, y los receptores diana de estos fármacos presentan diversas similitudes en cuanto a anatomía y comportamiento. Se han descrito heterodímeros entre el receptor CB1 y los receptores opioides κO, δO o µO en los que se ha demostrado una potenciación del 9-tetrahidrocanabinol en el efecto opiáceo de la morfina en modelos animales (Cichewicz, 2004). Además, también se han descrito heterodímeros entre receptores opioides y receptores de quimioquinas, como el CXCR4 que forma dímeros con κOP y δOP; o el CCR5 que dimeriza con µOP (Chen et al., 2004). La activación de CXCR4 lleva a una disminución del efecto analgésico in vivo (Finley et al., 2008). Se ha demostrado que los receptores de cannabinoides como el CB1 forman dímeros con receptores de dopamina como el D2 in vitro. En células HeK293 y cultivo de neuronas primarias del estriado se ha demostrado una señalización preferente a través de Gs y no Gi al co-estimular ambos receptores (Kearn et al., 2005). Por otro lado, también se ha demostrado la formación de heterodímeros CB1/A2A in vitro e in vivo, dando lugar a un crosstalk funcional entre ambos receptores, mediando efectos motores (Carriba et al., 2007). - Receptores de adenosina y glutamato. Los receptores de adenosina se expresan por todo el cuerpo y están implicados en diversos procesos fisiológicos y patológicos no solo a nivel neurológico. Se ha identificado la heterodimerización de los receptores A1 y A2A in vitro e in vivo, y un crosstalk funcional entre ellos que provoca una LAURA GÓMEZ GARCÍA 82 disminución de la afinidad de los agonistas de A1 cuando se activa el receptor A2A, que puede jugar un papel en la tolerancia a los efectos psicoestimulantes de la cafeína (Ciruela et al., 2006). Los receptores metabotrópicos de glutamato también suelen formar homodímeros y heterodímeros con la combinación de los diferentes subtipos de receptores que forman parte de esta familia. Además, se ha identificado el heterodímero A1/mGlu1α en células HEK293 y sinaptosomas del cerebelo de rata y se ha sugerido su implicación de la neuroprotección, siendo potencial para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas como el alzhéimer (Ciruela et al., 2001). También se ha identificado la interacción física entre el receptor A2A y mGlu5 in vitro, e in vivo se ha demostrado que los efectos anti-parkinsonianos de los antagonistas de mGlu5 se ven potenciados al antagonizar el receptor A2A (Kachroo et al., 2005). - Receptores GABAérgicos. Los receptores GABAB son el ejemplo más representativo y mejor estudiado de heterodimerización de receptores de manera obligada, ya que son necesarias las subunidades GABAB1 y GABAB2 para que el receptor sea funcional. El receptor GABAB1 contiene el bolsillo de unión a ligandos, mientras que el receptor GABAB2 se acopla a la proteína G para transducir la señal (Marshall et al., 1999). También se ha observado que el receptor GABAB2 interacciona física y funcionalmente con el receptor muscarínico M2, ambos expresados en el córtex somatosensorial, y que el receptor GABAB1 forma heterodímeros con el receptor sensible a calcio CaS en neuronas del hipocampo (Chang et al., 2007; Boyer et al., 2009). - Receptores dopaminérgicos. Se han descrito numerosos ejemplos de heterodimerización entre receptores de dopamina, tanto de la misma familia como de otras, y la implicación en patología neurológicas como el Párkinson, discinesia o esquizofrenia (Missale et al., 2010). El heterodímero D1/D2 se ha descrito in vivo y se ha observado que es capaz de señalizar a través de proteína Gq movilizando calcio lo que puede contribuir a la plasticidad sináptica (Lee et Introducción 83 al., 2004). También se ha demostrado que este complejo puede unirse al receptor de histamina H3 indicando la implicación postsináptica de este receptor en la modulación de la transmisión dopaminérgica. El receptor D1 también forma heterodímeros con el receptor D3 (Hounsou et al., 2015). El receptor D2, por su parte, también forma otros heterodímeros con múltiples receptores de distintos tipos, por ejemplo, el receptor de somatostatina SST2 (ambos se co-localizan en el córtex, sustancia negra y estriado) (Baragli et al., 2007); el receptor de prostaglandinas EP1 (Kitaoka et al., 2007); o el receptor de adenosina A2A (con el cual se han descrito complejos en el estriado) (Canals et al., 2003). - Receptores serotoninérgicos. Los receptores de serotonina son una de las familias más amplias de GPCRs y están implicados en numerosas enfermedades del sistema nervioso central como la depresión, la ansiedad o la esquizofrenia. Se han observado numerosos complejos entre receptores de serotonina. La mayoría de los receptores 5-HT2 forman homodímeros entre ellos, además también se han observado heterodímeros entre los subtipos 2A/2B, 2A/2C y 2B/2C. Por otro lado, se ha descrito el heterodímero 5-HT1A/5-HT7 en células de neuroblastoma; y el heterodímero 5-HT1A/5-HT2A en células piramidales en el hipocampo de ratas. En ambos casos parece que los heterodímeros llevan a una señalización asimétrica de unas vías efectoras sobre otras (Maroteaux, Béchade and Roumier, 2019a). El receptor 5-HT1A dimeriza también con el receptor opioide µO y con el receptor D2 de dopamina, pudiendo ser regulado diferencialmente por distintos antipsicóticos (Szlachta et al., 2018). El receptor 5-HT2A junto con el receptor metabotrópico de glutamato mGlu2 forma un heterodímero que juega un papel importante en la ansiedad y enfermedades psicóticas. Ambos receptores son capaces de aumentar o disminuir la afinidad de los ligandos cuando son activados con sus agonistas, hasta llegar a un equilibrio entre las vías de señalización Gi/Gq (González-Maeso et al., 2008). LAURA GÓMEZ GARCÍA 84 Asimismo, el receptor 5-HT2A forma heterodímeros con el receptor de dopamina D2 convirtiéndolos en una diana interesante para el tratamiento de la esquizofrenia con antipsicóticos. 3.2.1 Heterodímero D2/5-HT2A. Los receptores D2 y 5-HT2A están implicados y juegan un papel fundamental en el efecto de los fármacos antipsicóticos y, por tanto, en el tratamiento de la esquizofrenia y otros desórdenes mentales. El efecto del antagonismo de estos receptores en los síntomas psicóticos y la colocalización de los mismos en neuronas dopaminérgicas llevó a la motivación de estudiar la heterodimerización de estos receptores. Diversos estudios muestran que estos receptores se expresan en neuronas dopaminérgicas en el área central tegmental del mesencéfalo, en la pars compacta de la sustancia negra, en el núcleo arqueado del hipotálamo y el córtex prefrontal (Fuxe et al., 2014). En el año 2010 se describió por primera vez mediante técnicas de BRET (transferencia de energía de resonancia bioluminiscente) la existencia del heterodímero funcional en células co-transfectadas (Borroto-Escuela et al., 2010). También en el mismo año se demostró mediante el empleo de técnicas de espectroscopia fluorescente y microscopia fluorescente a tiempo real basadas en FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescente) la presencia de este heterodímero en células HEK293 cotransfectadas (Łukasiewicz et al., 2010). En este estudio también se describió la interacción entre ambos receptores, sugiriendo la implicación de los residuos básicos de arginina del IC3 del receptor D2 y los residuos de ácido glutámico de la cola del carboxilo terminar del receptor 5-HT2A en la formación del heterodímero. Es interesante destacar que el mutante del receptor 5-HT2A H452Y, cuyo polimorfismo está asociado en humanos a la resistencia del tratamiento con el antipsicótico atípico, clozapina, tiene menos capacidad de dimerizar con el receptor D2 que el receptor 5-HT2A salvaje (Łukasiewicz et al., 2011). La formación de complejos diméricos D2/5-HT2A en el cerebro humano se observó unos años más tarde mediante ensayos de proximidad de Introducción 85 ligación (PLA) en zonas del estriado dorsal y núcleo accumbens (Borroto- Escuela et al., 2013). La señalización intracelular del receptor 5-HT2A está ligada a la proteína Gq que activa la producción de inositol fosfato y la movilización de calcio; mientras que el receptor D2 se acopla a la proteína Gi inhibiendo la producción de AMPc (Figura 19). Los diversos estudios funcionales llevados a cabo con el heterodímero D2/5-HT2A han generado resultados variados y a veces contradictorios. Figura 19. Vías de señalización canónicas del heterodímero D2/5-HT2A. Imagen realizada por la doctoranda. Por un lado, se ha descrito que la expresión del receptor D2 aumenta la eficacia del agonista alucinógeno (±) DOI, pero no la serotonina, para señalizar a través de la vía Gq del receptor 5-HT2A. Esto puede demostrar que el crosstalk entre ambos receptores ocurre por una estabilización de la conformación del receptor 5-HT2A alterada por el receptor D2 que se comporta de manera alostérica. Además, la activación del receptor D2 con LAURA GÓMEZ GARCÍA 86 su agonista específico quinpirol, promueve una mayor unión del agonista alucinógeno (±) DOI a su receptor ( Figura 20) (Albizu et al., 2011). Figura 20. Modelos de crosstalk del heterodímero D2/5-HT2A según Albizu y colaboradores. Con permiso de Elsevier (Albizu et al., 2011). Borroto-Escuela y colaboradores comprobaron que la activación del receptor D2 con quinpirol provoca un aumento de la potenciación de la vía de señalización Gq por los agonistas 5-HT y TCB2 mediado por receptor 5- HT2A. Sin embargo, la serotonina y el agonista específico de 5-HT2A, TCB2, producen una neutralización del efecto activador del agonista quinpirol en el receptor D2 mediante ensayos del gen reportero de CRE-luciferasa en células HEK293 (Borroto-Escuela et al., 2010). Por el contrario, los agonistas alucinógenos del receptor 5-HT2A, LSD y (±) DOI, en concentraciones del rango nanomolar, producen un aumento del reconocimiento y la señalización a través del receptor D2 por sus agonistas (Borroto-Escuela et al., 2014). Los efectos psicóticos de los agonistas alucinógenos del receptor 5-HT2A pueden estar involucrados en la potenciación de la señal del protómero D2 del heterodímero D2/5-HT2A en el estriado ventral. Esto también da un nuevo enfoque al entendimiento del mecanismo de acción de los fármacos antipsicóticos atípicos. El heterodímero D2/5-HT2A es un ejemplo de la regulación cruzada asimétrica y dependiente de ligando, en la que se produce una transactivación del receptor 5-HT2A por los agonistas del receptor D2, y una transinhibición del receptor D2 por algunos agonistas del receptor 5-HT2A (Maroteaux, Béchade and Roumier, 2019b). Introducción 87 En estudios previos realizados en el grupo de investigación al que pertenece la doctoranda, se caracterizó farmacológicamente el heterodímero D2/5-HT2A en células HEK293 que coexpresan ambos receptores. Se comprobó, al igual que en estudios de Albizu y colaboradores, que la expresión del receptor D2 aumenta la eficacia del agonista alucinógeno del receptor 5-HT2A (±) DOI para la producción de inositol fosfato a través de la vía de señalización Gq, mostrando un efecto alostérico positivo; mientras que provocó una reducción del efecto antagonista del aripiprazol sobre el receptor 5-HT2A, mostrando un efecto alostérico negativo. Asimismo, la coexpresión con el receptor 5-HT2A produjo un aumento de la afinidad de la clozapina por el receptor D2. Además, la activación del receptor D2 con su agonista endógeno dopamina, no modificó la potencia y eficacia de los agonistas o antagonistas del receptor 5-HT2A; pero el bloqueo del receptor con sulpirida, antagonista específico, disminuyó la capacidad de (±) DOI de producir especies de inositol fosfato a través del receptor 5- HT2A. El principal hallazgo fue que la activación del receptor 5-HT2A por el agonista alucinógeno (±) DOI modificó la señalización de la dopamina a través del receptor D2, de manera que la dopamina tiene una menor eficacia para activar el receptor, sin variar la capacidad de esta de unirse a él, sugiriéndose que la modulación alostérica que provoca el (±) DOI tiene que ser a nivel de la señalización intracelular. El (±) DOI también moduló el efecto de los antipsicóticos sobre el receptor D2, sugiriendo una modulación alostérica tras la activación del receptor 5-HT2A que provoca unos perfiles de actuación de los antipsicóticos típicos característicos y diferentes a los perfiles de los antipsicóticos atípicos. El bloqueo con ketanserina del receptor 5-HT2A también provocó una reducción de la eficacia de la dopamina para activar el receptor D2, pero no tuvo efecto en el antagonismo de los antipsicóticos en este receptor. LAURA GÓMEZ GARCÍA 88 ANTECEDENTES, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Materiales y métodos 97 MATERIALES 1. Reactivos generales. Las sales utilizadas en los distintos tampones NaCl, LiCl, KCl, KH2PO4, NaH2PO4 y Trizma® base fueron suministradas por Sigma Aldrich. El tampón HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution), el ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinetanosulfonico (HEPES), el metanol, el glicerol y el detergente Teewn 20 también fueron suministrados por Sigma Aldrich. El dodecilsulfato sódico (SDS) y el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) fueron suministrados por Thermo Fisher. El azul de bromofenol, el ácido fórmico y la glicinal fueron suministrados por Panreac. La albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin, BSA) fue suministrada por Roche. 2. Reactivos empleados en cultivos celulares. El medio de cultivo empleado DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) libre de piruvato, de alta concentración de glucosa (4.5 g/L) y con L-glutamina, el suero fetal bovino dializado (FBS), la tripsina suplementada con ácido etildiaminotetracético (EDTA) y la poli-D-lisina fueron suministrados por Thermo Fisher. La penicilina y estreptomicina, el dimetilsulfóxido (DMSO) y la doxiciclina fueron suministrados por Sigma Aldrich. La geneticina G418, la higromicina B Gold y la blasticidina fueron suministrados por Invivogen. 3. Reactivos empleados en ensayos funcionales. Para los ensayos funcionales de medición de AMPc se emplearon placas de cultivo multipocillo half area de 96 pocillos de Thermo Fisher. Se utilizó el kit comercial HTRF-cAMP dynamic kit de Cisbio. Para los ensayos funcionales de movilización de calcio intracelular se emplearon placas de cultivo multipocillo negras de fondo transparente de LAURA GÓMEZ GARCÍA 98 384 pocillos de Grenier. Se utilizó el kit comercial Fura-2 QBTTM Calcium Kit de Molecular Devices. Para los ensayos funcionales de medición de la actividad de proteína Quinasa A se empleó el kit comercial PKA Kinase Activity Assay Kit de Abcam. Para los ensayos funcionales de medición de la fosforilación de la proteína CREB se utilizaron dos kits comerciales: AlphaLISA® SureFire® UltraTM CREB Total Assay Kit y AlphaLISA® SureFire® UltraTM p-CREB (Ser133) Assay Kit de Perkin Elmer. 3.1 Reactivos farmacológicos. - Dopamina de Sigma Aldrich. - Serotonina de Sigma Aldrich. - (±)2,5-dimetoxi-4-iodoanfetamina ((±) DOI) de Sigma Aldrich. - SB269970 de Tocris. - Clozapina de Sigma Aldrich. - Haloperidol de Sigma Aldrich. - Quinpirol de Sigma Aldrich. - Sulpirida de Sigma Aldrich. - Aripiprazol de Sequoia Research Products. - Toxina Pertussis de Sigma Aldrich. - YM-254890 de Grupo 3 S.L. - Compuesto 48/80 de Sigma Aldrich. - Ro32-0432 de BioGen. - PKI 14-22 de Tocris. - (IBMX) de Sigma Aldrich. - Forskolina de Sigma Aldrich. Materiales y métodos 99 - Probenecid de Thermo Fisher. - Ácido 1,2 Bis (2-animofenoxi) etano-N,N,N’,N’ tetraacético (BAPTA) de Sigma Aldrich. - Tapsigargina de Sigma Aldrich. 4. Reactivos empleados en ensayos de radiactividad. Para los ensayos funcionales de medición de inositol fosfato se emplearon placas de cultivo multipocillo transparentes estériles de 96 pocillos de Grenier. También se emplearon placas multipocillo Flexiplate de 96 pocillos de Perkin Elmer. El radioligando [3H]-myo-inositol (20,3 Ci/mmol) y las RNA YSi Binding SPA Beads fueron suministrados por Perkin Elmer. El etanol absoluto fue suministrado por Panreac. 5. Reactivos empleados en ensayos de biología molecular. Para la preparación de los lisados celulares se empleó el tampón comercial de radioinmunoprecipitación RIPA Lysis Buffer de Santa Cruz Biotecgnologies. La Protein G-Sepharose® fue suministrada por Sigma Aldrich. El inhibidor de fosfatasas PhosSTOPTM fue suministrado por Roche. El kit comercial para medir la concentración de proteína DCTM Protein Assay fue suministrado por Bio-Rad. Para lo ensayos de western blot se empleó el marcador de peso molecular Precision Plus Protein® Dual Color y las membranas Immun- Bolt® PVDF de Bio-Rad, el tampón de carga Bolt® LDS 4X y los geles SDSPAGE BoltTM 4-12% Bis-Tris Plus de Thermo Fisher. El papel Whatman utilizado para la transferencia fue suministrado por Sigma Aldrich. El reactivo de bloqueo Immunoblot Blocking Reagent fue suministrados por Millipore. El revelado de las membranas se realizó con el kit comercial Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent y las películas de revelado LAURA GÓMEZ GARCÍA 100 Amersham Hyperfilm ECL de GE Healthcare y el revelador y fijador GBX de Carestream Kodak®. Anticuerpos. - Anticuerpo monoclonal de ratón Anti-FLAG® M2 (ref F1804) de Sigma Aldrich. - Anticuerpo monoclonal de conejo Anti-5HT7 (ref ab128892) de Abcam. - Anticuerpo secundario de cabra Anti-conejo ligado a peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) (ref 7074P2) de Werfen. - Anticuerpo secundario de cabra Anti-ratón ligado a peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) (ref ab205719) de Abcam. - Anticuerpo monoclonal de conejo Anti-PKA R2/PKR2 (ref ab32514) de Abcam. - Anticuerpo monoclonal de conejo Anti-PKA R2/PKR2 (Phospho S99) (ref ab32390) de Abcam. - Anticuerpo monoclonal de ratón Anti-β-Actin (8H10D10) ligado a peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase, HRP) (ref 12262) de Cell Signaling. Materiales y métodos 101 MÉTODOS 1. Cultivo celular. Línea celular. En este trabajo se ha empleado la línea celular de riñón embrionario humano (human embryonic kidney) HEK 293 Flp-InTM T-RexTM myc-5-HT2A- CFP/ FLAG-D2-YFP. Esta línea celular se caracteriza porque expresa de manera constitutiva el receptor de dopamina D2 unido por su extremo carboxilo a la proteína amarilla fluorescente (Yellow Fluorescent Protein, YFP) y por su extremo amino al epítopo FLAG; y de manera inducible mediante doxiciclina el receptor de serotonina 5-HT2A, ligado a la proteína cian fluorescente (Cyan Fluorescent Protein, CFP) por su extremo carboxilo y al epítopo c-Myc por su extremo amino. La línea celular se generó en el Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC) por el Dr. Juan López Giménez. Para ello se utilizó la tecnología Flp-InTM que permite la integración y expresión de los genes de interés en células de mamífero en una posición del genoma específica. El sistema Flp-InTM consiste en la introducción de un sitio FRT (Flp Recombination Target) en el genoma de la línea celular empleada en la que, posteriormente, se integra un vector de expresión con el gen de interés a través de una recombinasa Flp que media la recombinación del ADN en el sitio FRT. La tecnología T-RexTM se basa en la introducción de un plásmido con el gen que expresa un represor de tetraciclinas (represor tet) que se une al operador tet2, que se encuentra antes de la región codificante del gen de interés, impidiendo su transcripción. La expresión del gen de interés se puede inducir mediante la adición de tetraciclinas, como la doxiciclina, que se une al represor tet liberándolo del operador tet2 y permitiendo la transcripción. Mantenimiento celular. El mantenimiento de la línea celular se llevó a cabo empleando el medio de cultivo DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) libre de piruvato, de alta concentración de glucosa (4.5 g/L) y con L-glutamina, suplementado con 10% de suero fetal bovino (Fetal Bovine Serum, FBS) dializado sin trazas de tetraciclina para no interferir en la inducción del receptor 5-HT2A y con 1% de penicilina-estreptomicina. Además, se LAURA GÓMEZ GARCÍA 102 añadieron antibióticos de selección para asegurar la correcta expresión de los genes de interés. Se añadió higromicina B 100 mg/ml, para asegurar la expresión de las células que expresan la resistencia a este antibiótico de selección y por ende la expresión del represor de tetraciclinas sin el cual no podríamos desarrollar la tecnología T-RexTM y llevar a cabo la inducción del receptor 5-HT2A. Además, se añadió geneticina G418 1 mg/ml para la selección de las células que expresan el gen de resistencia a este antibiótico y que permite seleccionar la expresión del receptor de dopamina FLAG-D2- YFP y se completó con blasticidina 1 mg/ml para seleccionar las células que expresan el gen de resistencia a este antibiótico y, por consiguiente, el receptor c-Myc-5-HT2A-CFP. Las células se mantuvieron y cultivaron en una atmósfera de 37 oC, una presión relativa de CO2 del 5% y una humedad relativa del 95% en incubadores de cultivo celular. La manipulación se llevó a cabo en cabinas de flujo laminar vertical en condiciones de esterilidad. Descongelación celular. Para llevar a cabo la descongelación de las células se retiró el criotubo almacenado en nitrógeno líquido y, una vez se descongeló, se resuspendieron las células en el medio de mantenimiento indicado. Para eliminar posibles restos del medio de congelación el cual está compuesto, entre otras cosas, por el agente crioprotector dimetilsulfóxido (DMSO) que es tóxico para las células, se centrifugaron las células durante 8 minutos a 1000 rpm. Al sedimentarse las células, se retiró el sobrenadante, se resuspendieron las células en el medio de mantenimiento y se sembraron en un frasco de cultivo (flask) de 25 cm2 o 75 cm2 dependiendo de la confluencia de las células del vial de partida. Expansión celular. Cuando la confluencia celular en el recipiente de cultivo fue de un 80- 90% se llevó a cabo la expansión celular. En primer lugar, se retiró el medio de cultivo y se lavaron las células con tampón fosfato salino (Phosphate Buffer Saline, PBS) compuesto por NaCl 136 mM; KH2PO4 1.47 mM; NaH2PO4 8 mM, KCl 2.68 mM para eliminar los restos de medio que puedan quedar. Se añadió tripsina, una enzima proteolítica que permite romper las uniones entre las células y las uniones de estas con el recipiente de cultivo, consiguiendo que las células queden en suspensión. Tras 1 o 2 Materiales y métodos 103 minutos de incubación, se paró la reacción de la tripsina añadiendo el propio medio de cultivo y se homogeneizaron las células antes de transferirlas a un nuevo flask de cultivo en la dilución correspondiente dependiendo de lo requerido. En el caso de necesitar un número concreto de células para el desarrollo de un ensayo, se hizo un recuento celular por mililitro para lo que se utilizó el contador electrónico automático VI-Cell™ XR (Beckman Coulter Life Sciences). Se diluyeron las células para obtener el número necesario en el volumen específico de cada ensayo y se sembraron en la placa multipocillo correspondiente previamente tratada con poli-D-lisina, que es un compuesto sintético que mejora la adherencia de las células a la superficie de la placa, a una dilución 1:5 en PBS durante 30 minutos. Criopreservación celular. La criopreservación de las células se realizó cuando la confluencia en el flask de cultivo de 75 cm2 era de un 80-90%. Para ello se lavaron y se tripsinizaron las células como se ha explicado anteriormente y se centrifugaron durante 8 minutos a 1000 rpm. El sedimento celular se resuspendió en medio de congelación que consiste en FBS dializado suplementado con 10% de DMSO que es un agente crioprotector que evita que se formen cristales en el interior de la célula cuando se produce el proceso de congelación. Las células se congelaron en criotubos de manera gradual primero a -80 oC y, finalmente, en nitrógeno líquido. 2. Ensayos funcionales de medición de AMPc intracelular. Los ensayos funcionales de medición de AMPc que se han desarrollado en este trabajo tienen como objetivo estudiar la funcionalidad de los receptores que señalizan a través de proteínas Gs o Gi/o, así como la señalización intracelular de cada uno de ellos y el posible cruzamiento entre las distintas vías de señalización y en qué punto de la cascada celular se produce este crosstalk. Para ello se utilizó el kit comercial HTRF-cAMP dynamic kit (Cisbio) el cual se basa en la tecnología HTRF® (Homogeneous Time Resolved Fluorescence) que permite la transferencia de energía entre dos fluoróforos, LAURA GÓMEZ GARCÍA 104 un donante y un aceptor, cuando se encuentran próximos, también denominado este efecto como transferencia de energía de resonancia (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET). El método consiste en un inmunoensayo de competición entre el AMPc nativo que se produce en la célula y el AMPc marcado con el fluoróforo d2 (aceptor) por la unión del anticuerpo monoclonal Anti-AMPc marcado con el fluoróforo Europium Cryptate (donante). La excitación del fluoróforo donante Cryptate por una fuente de energía lleva a la emisión de energía a una longitud de onda de 620 nm, de manera que, si el fluoróforo aceptor d2 se encuentra próximo, se produce una transferencia de energía excitándose y emitiendo energía a una longitud de onda de 655 nm. Por tanto, la señal específica de FRET es inversamente proporcional a la concentración de AMPc en la célula. Figura 23. Fundamento de la tecnología HTRF® en inmunoensayos competitivos de AMPc. Imagen realizada por la doctoranda con BioRender.com. Materiales y métodos 105 Ensayos de medida de formación de AMPc modulada por los receptores D2 y 5-HT7. Los ensayos funcionales se realizaron en la línea celular de estudio HEK 293 Flp-InTM T-RexTM myc-5-HT2A-CFP/ FLAG-D2-YFP la cual expresa de manera endógena el receptor 5-HT7. Se sembraron 40000 células por pocillo en placas half area de 96 pocillos estériles de fondo blanco, previamente tratadas con poli-D-lisina, en medio de cultivo DMEM alto en glucosa y se incubaron durante 24 horas a 37 oC y 5% de CO2. El tampón de ensayo, Stimulation Buffer suplementado con 3-isobutil- 1-metilxantina (IBMX) 500 μM, se preparó mediante sonicación durante 30 minutos. Se incubaron las células 5 minutos a 37 oC, se añadieron los compuestos antagonistas y agonistas del receptor de dopamina D2 a diferentes concentraciones y se incubaron durante 10-20 minutos a 37 oC. Tras este tiempo, se añadieron curvas del agonista del receptor 5-HT7, la serotonina (curvas de 10-10 a 10-4 M); o del antagonista, SB269970 (curvas 10-11 a 10-5 M) y se incubaron durante 10 minutos a 37 oC. Finalmente, las células se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente con los reactivos del kit comercial, AMPc marcado con el fluoróforo d2 y Anti-APMc marcado con el fluoróforo Cryptate, diluidos 1:20 en el Lysis Buffer. Se midió el ratio de intensidad de emisión fluorescente 665/662 nm de longitud de onda en el lector de microplacas Ultra Evolution (TECAN). En todos los ensayos, se utilizó como control basal los niveles de AMPc en ausencia de compuestos, y como control máximo los niveles de AMPc producidos por la estimulación de las células con serotonina 1 μM. Para la confirmación del efecto de los compuestos agonistas y antagonistas del receptor D2 de dopamina sobre la señalización del receptor de serotonina 5-HT7 estimulado por su agonista, serotonina, o su antagonista, SB269970, se realizaron ensayos de inhibición de la proteína Gi/o acoplada al receptor D2 mediante la adición de la Toxina Pertussis a 0,05 µg/ml y 0,1 µg/ml, tres horas antes de comenzar el ensayo. LAURA GÓMEZ GARCÍA 112 6. Modulación de la actividad de PKA. Se desarrollaron ensayos de western blot para medir activación de proteínas por fosforilación y se empleó el kit comercial PKA Kinase Activity Assay (Abcam) para cuantificar su actividad en lisados parcialmente purificados. Por último, se utilizó otro kit comercial AlphaLISA® SureFire® UltraTM Assay Kit (Perkin Elmer) para medir la cantidad de proteína CREB fosforilada que es un sustrato específico de la PKA. Medida de la expresión de PKA por western blot. Preparación de muestras. Las células HEK 293 Flp-InTM T-RexTM myc-5-HT2A-CFP/ FLAG-D2- YFP se sembraron en placas de cultivo de 100 mm y se crecieron hasta que se llegó a una confluencia del 80%. Se trató con doxiciclina 10 ng/ml durante 24 horas y durante el proceso de estimulación con los compuestos se mantuvo el medio de cultivo con IBMX 500 µM para inhibir el efecto de las fosfodiesterasas. En primer lugar, se añadió el antagonista 5-HT7, el compuesto SB269970 1 µM y se incubó 5 minutos a 37 oC. El agonista alucinógeno (±) DOI 0,1 µM se incubó, en los casos necesarios, durante 10 minutos a 37 oC. A continuación, se adicionó la dopamina 1 nM y se incubó 20 minutos a 37 oC y, por último, se estimuló la adenilato ciclasa con forskolina 10 µM durante 30 minutos a 37 oC. En los casos en los que había que preparar lisados celulares estimulando con el inhibidor de PKA, el PKI14-22, se hizo a una concentración de 40 µM 3 horas antes de empezar el ensayo. Se lavaron las células con PBS frío, se retiró y, posteriormente, se añadió 1 ml de tampón RIPA 1X frío por placa de cultivo suplementado con ortovanadato sódico al 1 %, una solución de inhibidores de proteasas al 1 %, fluoruro de fenilmetilsulfonilo al 1 % y un comprimido por cada 10 ml de tampón de un cóctel de inhibidores de fosfatasas, Phostop®. Las células se recogieron con un rascador de plástico estéril y las suspensiones se transfirieron a tubos nuevos que se homogeneizaron por rotación durante 1 hora a 4 oC. Tras la incubación, se centrifugaron las muestras a 12000g durante 30 minutos a 4 oC, los sobrenadantes se recogieron y se cuantificó la cantidad de proteína mediante el ensayo de ácido bicinconínico (BCA). Todo el procesamiento de los lisados se hizo en hielo a 4 oC. Materiales y métodos 113 Western blot de proteínas fosforiladas. Se incubaron distintas cantidades de muestra 20 µg de proteína durante 5 minutos a 95 oC en tampón de carga Bolt™ dodecilsulfato de litio 4X. Se cargaron las muestras en geles de poliacrilamida SDS-PAGE Bolt™ 4-12 % Bis-Tris Plus y se desarrolló la electroforesis a 165 voltios durante 30 minutos en tampón de electroforesis, MES 1 X. Tras la activación previa de la membrana de polifluoruro de vinilideno en metanol durante 1 minuto, se humedeció en tampón de transferencia durante 10 minutos. Se desarrolló una transferencia semiseca a 15 voltios durante 90 minutos. A continuación, se lavaron las membranas en tampón de lavado TBS- T 3 veces durante 5 minutos en agitación y se bloquearon con el tampón de bloqueo TBS-T suplementado con BSA al 3% durante 1 hora en agitación. Se lavaron las membranas y se añadieron los anticuerpos primarios diluidos en el tampón de bloqueo: 1) el anticuerpo monoclonal de conejo para medir la PKA total, Anti-PKA R2/PKR2 1:10000; y 2) el anticuerpo monoclonal de conejo para medir la PKA fosforilada, Anti-PKA R2/PKR2 (phospho S99) 1:1000. Se empleó como control de carga el anticuerpo antiβ-actina ligado a HRP a una dilución de 1:30000. Tras una incubación en agitación de 16 horas a 4 oC, se lavaron las membranas con TBS-T y se añadió el anticuerpo secundario anti-conejo ligado a peroxidasa de rábano (Horseradish Peroxidase, HRP) 1:5000 durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación. Se realizó el revelado de las membranas con el kit comercial ECL Prime Western Blotting Detection Reagent y las películas fotográficas X50 Hyperfilm® enhanced chemiluminiscence. Medida de la actividad de PKA por inmunoensayo. Para la realización de estos ensayos se empleó el kit comercial PKA Kinase Activity Assay (Abcam). Se basa en la cuantificación, por un cambio colorimétrico, de la PKA capaz de fosforilar un sustrato específico que está inmovilizado en las placas multipocillo que suministra el propio kit. La PKA activa y presente en los lisados celulares fosforila el sustrato en presencia de ATP. El sustrato fosforilado es reconocido específicamente por un anticuerpo primario que, posteriormente, es reconocido por un anticuerpo LAURA GÓMEZ GARCÍA 114 secundario ligado a HRP. El ensayo se resuelve mediante la adición del sustrato TMB (3,3′,5,5′-Tetrametilbencidina) que produce un compuesto soluble azul en presencia de la peroxidasa que puede ser leído a 665 nm. Esta reacción se detiene mediante la adicción de una solución ácida, que forma un producto de reacción amarillo que permite una medición precisa de la intensidad a 450 nm. De esta manera, la cantidad de sustrato fosforilado por PKA es directamente proporcional a la intensidad de color medida a una longitud de onda de 450 nm en un lector de placas. Figura 42. Esquema de la metodología empleada en el kit comercial PKA Kinase Activity Assay (Abcam). Imagen realizada por la doctoranda con BioRender.com. La preparación de las muestras de lisados celulares fue igual que en el caso de los ensayos cualitativos que se llevaron a cabo para la detección de PKA por western blot. Tras la preparación de los lisados celulares estimulados con distintas condiciones se optimizó la cantidad de proteína necesaria para desarrollar el ensayo de manera correcta y se seleccionó 50 ng/ml de proteína por pocillo. El desarrollo del ensayo se desempeñó de acuerdo con lo descrito en las indicaciones del kit facilitadas por el fabricante. Brevemente, Se Materiales y métodos 115 prepararon las muestras y el control positivo (PKA activa purificada aportada por el fabricante) en un volumen final por pocillo de 30 µl. Se añadieron 10 µl de ATP para que pueda llevarse a cabo la fosforilación del sustrato específico por parte la PKA activa que hay en la muestra celular y se incubó a 30 oC durante 90 minutos con agitación intermitente cada 20 minutos. Se eliminó el medio y se añadieron 40 µl del anticuerpo primario PKA phosphospecific substrate antibody, que se incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos con agitación intermitente cada 20 minutos. Tras cuatro lavados con tampón de lavado se incubó con el anticuerpo secundario ligado a HRP durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación intermitente cada 10 minutos. Se repitieron los lavados antes de añadir el sustrato de la peroxidasa, el sustrato TMB, que se incubó durante 40 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se añadió la solución de parada y se midió la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de 450 nm en el lector de microplacas Ultra Evolution (TECAN). Medida de la fosforilación de CREB por tecnología Alpha®. Para la realización de estos ensayos se emplearon dos kits comerciales AlphaLISA® SureFire® UltraTM Assay Kit (Perkin Elmer), uno de ellos para medir la cantidad total de proteína CREB y otro para cuantificar la cantidad de proteína fosforilada. La proteína CREB es un sustrato específico de la PKA que la fosforila en la Serina 133 (Gonzalez and Montminy, 1989), por tanto, medimos de manera indirecta la activación de la PKA. Los kits se basan en el empleo de microesferas y la tecnología Alpha® (Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay). La microesfera aceptora esta recubierta de un agente CaptSureTM que inmoviliza el anticuerpo específico para reconocer la proteína fosforilada. La microesfera donante está recubierta de estreptavidina la cual es capaz de capturar el anticuerpo biotinilado que reconoce otro epítopo de CREB. LAURA GÓMEZ GARCÍA 116 Figura 25. Esquema de la tecnología AlpaLISA® en la que se basa el kit comercial AlphaLISA® SureFire® UltraTM Assay Kit (Perkin Elmer). Imagen realizada por la doctoranda con Biorender.com. La tecnología Alpha consiste en la excitación de la microesfera aceptora por parte de la donante cuando estas se encuentran en proximidad debido a que la proteína a estudiar se encuentra fosforilada y es reconocida por ambos anticuerpos. La cantidad de luz emitida es directamente proporcional a la cantidad de proteína fosforilada presente en la muestra. El desarrollo del ensayo se desempeñó de acuerdo con lo descrito en las indicaciones del kit facilitadas por el fabricante. Brevemente, se sembraron 30000 células por pocillo en 200 µl de medio de cultivo completo en placas transparentes estériles. Se trataron las células con doxiciclina 10 ng/ml y se incubaron durante 24 horas a 37 oC y 5% de CO2. Al día siguiente, se retiró el medio de cultivo y se estimularon las células según las diferentes condiciones a estudiar, diluyendo los compuestos en 50 µl de medio de cultivo libre de suero. Durante el proceso de estimulación con los compuestos se mantuvo el medio de cultivo con IBMX 500 µM para inhibir el efecto de las fosfodiesterasas. En primer lugar, se añadió el antagonista 5-HT7, el compuesto SB269970 1 µM y se incubó 5 minutos a 37 oC. El agonista alucinógeno (±) DOI 0,1 µM se incubó, en los casos necesarios, durante 10 minutos a 37 oC. A continuación, se adicionó la dopamina 1 nM y se incubó 20 minutos a 37 oC y, por último, se estimuló la adenilato ciclasa con forskolina 10 µM durante 30 minutos a 37 oC. En los casos en los que se estudió el efecto del inhibidor de PKA, el PKI14-22, se Materiales y métodos 117 hizo una incubación previa de 3 horas antes de empezar el ensayo a una concentración de 40 µM. El lisado celular se llevó a cabo utilizando 60 µl del tampón de lisis aportado por el fabricante y agitando la placa a 350 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron 30 µl de los lisados a una placa de 96 pocillos half area blanca y se añadió también 30 µl del control positivo aportado en el kit. A continuación, se añadieron 15 µl de las microesferas aceptoras correspondientes a cada kit (CREB total o CREB fosforilada) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras la incubación, se repitió el paso con las microesferas donantes realizando el proceso en oscuridad. En este caso la incubación fue durante toda la noche. Por último, se procedió a la lectura de la señal Alpha® en el lector de microplacas Enspire® (Perkin Elmer). 7. Análisis de datos. Para el análisis y procesamiento de datos se utilizó el programa informático GraphPad Prism® versión 7.00. Todos los resultados se representaron como la media ± error estándar de la media (Standar Error of the Mean, SEM). La comparación estadística entre los parámetros de interés de las curvas sigmoidales concentración-respuesta o las medidas de intensidad de las distintas señales estudiadas se realizó mediante el uso del test t de Student desapareado y paramétrico. Se evaluó la diferencia significativa entre los distintos parámetros marcando la significación estadística en α=0.05, es decir, con un intervalo de confianza del 95%. Se emplearon los siguientes parámetros farmacológicos: - Concentración media máxima eficaz (EC50), que permite compara las potencias de los distintos compuestos. - Efecto máximo (Emax), que permite comparar la eficacia del compuesto. - Efecto máximo de la forskolina 1 µM (EFSK), que permite compara la eficacia del compuesto, cuando estamos estudiando la vía de LAURA GÓMEZ GARCÍA 118 señalización a través de una proteína Gi que produce la disminución de los niveles de AMPc. En los ensayos funcionales, tanto de medida de AMPc como de IP, se representaron curvas con la ecuación dosis-respuesta sigmoidea, que muestra la respuesta como logaritmo de la concentración: 𝐸 = 𝐸basal +𝐸max − 𝐸 basal 1 + 10𝑙𝑜𝑔 𝐸𝐶50−𝑋 Donde E es la respuesta obtenida a una concentración X de compuesto, Ebasal es la respuesta mínima que tienen las células en ausencia de compuesto, Emax es la respuesta máxima y EC50 (o IC50 en el caso del estudio de compuestos antagonistas) es la potencia del compuesto agonista. Es la concentración a la que se obtiene la mitad de la respuesta máxima. Los datos obtenidos de los diferentes ensayos se estandarizaron siempre en base a una respuesta máxima y una mínima de la siguiente manera: - En los ensayos de medición de AMPc los datos se normalizaron a la respuesta mínima o basal que es en ausencia de estímulo y representa el 0%, y a la respuesta máxima o 100% que se consideró la estimulación con forskolina 1 µM o serotonina 1 µM dependiendo del ensayo. - En los ensayos de medición de IPs, los datos también se normalizaron a la respuesta máxima que se consideró el 100% cuando se estimuló con serotonina 1 µM o DOI 0,1 µM, y a la respuesta mínima sin estímulo o basal que se consideró el 0%. - En todos los ensayos de calcio se normalizaron los datos con respecto al nivel basal o 0% y respecto a la señal máxima correspondiente a la estimulación con (±) DOI 0,1 μM. Se representó el ratio entre las medidas obtenidas a una intensidad de 340 nm y las medidas obtenidas a 380 nm correspondiente a unidades de fluorescencia relativas (RFU). Materiales y métodos 119 - En los ensayos de medida de la PKA los datos se normalizaron con respecto a la respuesta mínima o blanco del ensayo que se consideró el 0%, y a la respuesta máxima que se consideró el 100% y se corresponde con la señal de la PKA purificada activa que suministra el fabricante del kit. - En los ensayos de western blot de proteínas fosforiladas se densitometraron las muestras reveladas utilizando el programa informático ImageJ®. Los resultados obtenidos de proteína total y proteína fosforilada se representaron utilizando la siguiente fórmula: 𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑃𝐾𝐴 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎 = 𝑃𝐾𝐴 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑜𝑟𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎 (𝑓𝑃𝐾𝐴) 𝑃𝐾𝐴 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 (𝑡𝑃𝐾𝐴) - En los ensayos de medida de la fosforilación de CREB los datos se normalizaron con respecto a la respuesta mínima (condiciones en las que no se utilizaba muestra celular) que se consideró el 0%, y a la respuesta máxima correspondiente con el control positivo de CREB fosforilada suministrada por el fabricante del kit y que se consideró el 100%. LAURA GÓMEZ GARCÍA 120 RESULTADOS LAURA GÓMEZ GARCÍA 128 Tabla 5. Respuesta inhibitoria del antagonista SB269970 (IC50 y porcentaje de inhibición sobre la respuesta máxima de 5-HT) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia de agonistas del receptor D2: dopamina (DA) 1 µM, quinpirol (QUIN) 1 µM y aripiprazol (ARIP) 0.1 µM. Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por duplicados. *p valor <0.05; **p valor <0.01; ***p valor <0.001 (test t de Student). AGONISTA D2 ANTAGONISTA 5-HT7 IC50 (nM) REDUCCIÓN RESPUESTA MÁXIMA A AGONISTA (%) - SB269970 20,9 ± 1,4 - DA 1 µM SB269970 31,8 ± 4,7 93.6 ± 1.9** QUIN 1 µM SB269970 6,99 ± 30 88.8 ± 4.5*** ARIP 0.1 µM SB269970 66,3 ± 1,9* 33.4 ± 4.1** 1.1.4 Los antagonistas del receptor D2 no modulan la vía de señalización del receptor 5-HT7 bloqueado por su antagonista específico SB269970. Se evaluó el efecto de los antagonistas de D2 sobre la serotonina mediado por el receptor 5-HT7 cuando este receptor está bloqueado por su antagonista específico SB269970. Para ello, se construyeron curvas concentración-respuesta del antagonista en presencia de serotonina 1 µM en ausencia o presencia de sulpirida 0 haloperidol 0.1 µM (Figura 27). L o g [S B 2 69 97 0] (M ) % A c um u lac ió n d e A M P c es tim u la d o p or 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -40 0 40 80 120 160 200 240 S B 2 6 9 9 7 0 S B + S U LP . 0 .1u M L o g [S B 2 69 97 0] (M ) % A c um u lació n d e A M P c e stim u la do p or 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -40 0 40 80 120 160 200 240 S B 2 6 9 9 7 0 S B + H A LO . 0.1 uM A B Figura 27. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc del antagonista SB269970 estimulado por 5-HT 1 µM en ausencia (-●-) y en presencia ( ) de antagonistas del receptor D2: sulpirida 0,1 µM (A) y haloperidol 0,1 µM (B). Se Resultados 129 representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por duplicados. Se observó que los antagonistas de D2 no modificaron el efecto de la serotonina a través del receptor 5-HT7 antagonizado por SB269970 (Tabla 6). Tabla 6. Respuesta inhibitoria del antagonista SB269970 (IC50 y porcentaje de inhibición sobre la respuesta máxima de 5-HT) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia de antagonistas del receptor D2: sulpirida (SULP) 0,1 µM y haloperidol (HALO) 0,1 µM. Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por duplicados. ANTAGONISTA D2 ANTAGONISTA 5-HT7 IC50 (nM) REDUCCIÓN RESPUESTA MÁXIMA A AGONISTA (%) - SB269970 20.9 ± 1.4 - SULP 0,1 µM SB269970 56.6 ± 1.7 26.6 ± 6.2 HALO 0.1 µM SB269970 23.4 ± 1.7 14.2 ± 4.0 1.1.5 El efecto de la dopamina y el haloperidol en la señalización serotoninérgica del receptor 5-HT7 es mediado a través de la proteína Gi/o. Con el fin de determinar si el efecto que se muestra de los agonistas y antagonistas de D2 es mediado por la proteína Gi acoplada a este receptor, se utilizó la toxina pertussis, que inhibe la proteína Gi impidiendo su unión al receptor (Tamura et al., 1982). Se construyeron curvas concentración-respuesta de 5-HT o SB269970 en presencia de 5-HT 1 µM y se incubaron con el agonista D2 de referencia, dopamina 1 µM (Figura 28 y Tabla 7) o en antagonista referente, haloperidol 0.1 µM (Figura 29 y Tabla 8). Se trataron las células con toxina pertussis 0.05 µg/ml o 0.1 µg/ml. Se observó que el tratamiento con la toxina revierte el efecto inhibitorio de la dopamina sobre la respuesta máxima de la serotonina a través del receptor 5-HT7 ya que también se LAURA GÓMEZ GARCÍA 130 observó en presencia del antagonista específico del receptor, el compuesto SB269970. L o g [ S e r o t o n i n a ] ( M ) % A c u m u la c ió n d e A M P c - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 4 0 0 4 0 8 0 120 160 200 5 -H T 5 - H T + D A 1 u M 5 - H T + D A 1 u M + P T X 0 .0 5 u g / m l 5 - H T + D A 1 u M + P T X 0 . 1 u g / m l L o g [ S e r o t o n in a ] ( M ) % A c u m u l a c i ó n d e A M P c - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 4 0 0 4 0 8 0 120 160 200 5 -H T 5 - H T + H A L O 0 . 1 u M 5 - H T + H A L O 0 .1 u M + P T X 0 . 0 5 u g / m l 5 - H T + H A L O 0 .1 u M + P T X 0 .1 u g / m l A B Figura 28. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc inducido por 5- HT (●), en presencia del agonista dopamina 1 µM (A) o del antagonista haloperidol 0.1 µM (B) de D2 ( ), en presencia del agonista o antagonista y PTX 0.05 µg/ml ( ) y en presencia del agonista o antagonista y PTX 0.1 µg/ml ( ). Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. Tabla 7. Potencia y eficacia (EC50 y Emax) de la serotonina (5-HT) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia de dopamina 1 µM o haloperidol 0.1 µM y PTX 0.05 µg/ml o 0.1 µg/ml. Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. COMPUESTOS DOPAMINA HALOPERIDOL EC50 (nM) EMAX (%) EC50 (nM) EMAX (%) 5-HT 460 ± 1.2 123 ± 4.8 443 ± 1.2 153 ± 6.2 Ago/Antago D2 804 ± 1.3 37.5 ± 2.5 757 ± 1.2 182 ± 6.2 PTX 0.05 µg/ml 627 ± 1.3 67.5 ± 4.1 685 ± 1.2 182 ± 8.6 PTX 0.1 µg/ml 873 ± 1.3 123 ± 7.2 959 ± 1.3 202 ± 11 Resultados 131 L o g [ S B 2 6 9 9 7 0 ] ( M ) % A c u m u la c ió n d e A M P c e s t im u l a d o p o r 5 - H T 1 u M - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 4 0 0 4 0 8 0 120 S B 2 6 9 9 7 0 S B + D A 1 u M S B + D A 1 u M + P T X 0 .0 5 u g /m l S B + D A 1 u M + P T X 0 . 1 u g / m l L o g [ S B 2 6 9 9 7 0 ] ( M ) % A c u m u l a c ió n d e A M P c e s t im u l a d o p o r 5 - H T 1 u M - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 4 0 0 4 0 8 0 120 S B 2 6 9 9 7 0 S B + H A L O 0 .1 u M S B + H A L O 0 . 1 u M + P T X 0 . 0 5 u g / m l S B + H A L O 0 . 1 u M + P T X 0 .1 u g / m l AB Figura 29. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc del antagonista SB269970 estimulado por 5-HT 1 µM (●), en presencia del agonista dopamina 1 µM (A) o del antagonista haloperidol 0.1 µM (B) de D2 ( ), en presencia del agonista o antagonista y PTX 0.05 µg/ml ( ) y en presencia del agonista o antagonista y PTX 0.1 µg/ml ( ). Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. Tabla 8. Respuesta inhibitoria del antagonista SB269970 (IC50 y porcentaje de inhibición sobre la respuesta máxima de 5-HT) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia de dopamina 1 µM o haloperidol 0.1 µM y PTX 0.05 µg/ml o 0.1 µg/ml. Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. COMPUESTOS DOPAMINA HALOPERIDOL IC50 (nM) REDUCCIÓN RESPUESTA MÁXIMA AGONISTA (%) IC50 (nM) SB 7.27 ± 1.5 - 11.8 ± 1.4 Ago/Antago D2 5.30 ± 1.9 75 ± 1.6 14.8 ± 1.3 PTX 0.05 µg/ml 9.22 ± 1.4 15.5 ± 3.5 16.0 ± 1.5 PTX 0.1 µg/ml 13.4 ± 1.7 22.4 ± 4.5 12.9 ± 1.5 LAURA GÓMEZ GARCÍA 132 1.2 La señalización cruzada entre los receptores D2 y 5-HT7 no se atribuye a una oligomerización de estos receptores. Una vez estudiado el cruzamiento en la señalización intracelular a nivel del segundo mensajero AMPc de ambos receptores, se caracterizó la expresión de estos receptores en la línea celular de estudio. Primero se evaluó la expresión endógena del receptor 5-HT7 por las células HEK293 mediante técnicas de western blot. Posteriormente, con el fin de estudiar la formación de complejos heteroméricos entre estos receptores, se desarrollaron ensayos de coinmunoprecipiración y técnicas de western blot. 1.2.1 Estudio de la expresión del receptor 5-HT7 endógeno en la línea celular de trabajo. Para comprobar la expresión del receptor endógeno 5-HT7 se optimizaron ensayos de western blot para confirmar la expresión del receptor. Se observó una banda de 55 KDa de mayor intensidad a medida que se aumentó la cantidad de proteína, que se corresponde con el peso molecular del receptor 5-HT7 según la bibliografía (54 KDa)(Recombinant Anti-5HT7 Receptor antibody [EPR6271] (ab128892) | Abcam) (Figura 30). 10 20 40 50 (µg) 75 KDa 50 KDa Figura 30. Western blot del lisado de células de la línea celular de trabajo. Se usaron cantidades crecientes de proteína (10, 20, 40 y 50 µg de lisado). Se marcó con el anticuerpo anti-5HT7 1/500 y se reveló con el anticuerpo anti-conejo-HRP 1/5000. Se muestra una imagen representativa de dos experimentos independientes. Resultados 133 1.2.2 Estudio de la expresión del receptor D2 sobreexpresado en la línea celular de trabajo. Se evaluó la expresión del receptor D2, que en la línea celular de estudio se expresa unido al epítopo FLAG, un polipéptido de ocho aminoácidos que se utiliza como marcador de proteínas y que ayuda a su detección y análisis (Einhauer and Jungbauer, 2001). Se realizaron ensayos de western blot con distinta cantidad de proteína de la línea celular de estudio. Se Observó una banda creciente a medida que la cantidad de proteína era mayor con un peso molecular aproximado de 70 KDa correspondiente al receptor unido al epítopo FLAG (Figura 31). 10 20 40 50 (µg) 75 KDa 50 KDa Figura 31. Western blot del lisado de células de la línea celular de trabajo. Se usaron cantidades decrecientes de proteína (10, 20, 40 y 50 µg de lisado). Se marcó con el anticuerpo anti-FLAG 1/2000 y se reveló con el anticuerpo anti-ratón-HRP 1/10000. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. 1.2.3 El cruce de la señalización de los receptores D2 y 5-HT7 no implica una estructura cuaternaria heterodimérica. Una vez comprobada por western blot la expresión de ambos receptores y optimizada la concentración de anticuerpo necesaria para reconocerlos, se realizaron experimentos de co-inmunoprecipitación con el fin de estudiar la formación de complejos entre ambos receptores. Para ello se usó el anticuerpo anti-FLAG que reconoce el epítopo FLAG unido al receptor D2 y se precipitó usando una matriz de proteína G en la que quedan retenidos los anticuerpos. A continuación, las muestras precipitadas se incubaron con el anticuerpo anti-5HT7 y se revelaron por western blot. LAURA GÓMEZ GARCÍA 134 No se observaron bandas inmunorreactivas frente al receptor 5-HT7 en las muestras inmunoprecipitadas (IP). Estas bandas se observaron en las muestras control de los lisados celulares previos a la inmunoprecipitación (L) y en el sobrenadante que se descarta en el proceso de la inmunoprecipitación (S) (Figura 32) tanto en la línea de trabajo como en la línea control wild type (WT). A IP L S B IP L S 75 KDa 50 KDa HEK D2/5HT7 HEK 293 WT Figura 32. Western blot del lisado de células de la línea celular de trabajo (A) y de la línea HEK 293 wild type (B). Se muestra el resultado de la coinmunoprecipitación (IP), el lisado sin coinmunoprecipitar (L) y el sobrenadante de la coinmunoprecipitación (S). La coinmunoprecipitación se realizó con el anticuerpo anti-FLAG 1/2000. Se marcó con anti-5-HT7 1/500 y se reveló con el anticuerpo anticonejo-HRP 1/5000. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes. Como control del proceso de inmunoprecipitación, se revelaron las muestras con el anticuerpo anti-FLAG que se usa en la precipitación. Se observó una banda correspondiente al receptor D2 en las muestras inmunoprecipitadas (IP) reveladas con el anti-FLAG (Figura 33). IP L IP L 75 KDa 50 KDa HEK D2/5HT7 HEK 293 WT Resultados 135 Figura 33. Western blot del lisado de células de la línea celular de trabajo. Se muestra el resultado de la coinmunoprecipitación (IP) y el lisado sin coinmunoprecipitar (L). La coinmunoprecipitación se realizó con el anticuerpo anti- FLAG 1/2000. Se marcó con el anticuerpo anti-FLAG 1/2000 y se reveló con el anticuerpo anti-ratón-HRP 1/10000. Se muestra una imagen representativa de dos experimentos independientes. La confirmación de la ausencia de formación de un dímero entre el receptor D2 y 5-HT7 permitió estudiar el heterodímero D2/5-HT2A y su señalización cruzada intracelular sin la interferencia del receptor 5-HT7. 2. Estudio de la señalización intracelular cruzada del heterodímero D2/5-HT2A y su farmacología. Los receptores D2 y 5-HT2A forman complejos heterodiméricos en la membrana celular como se ha descrito en modelos in vitro (Borroto-Escuela et al., 2010; Łukasiewicz et al., 2010) y en cerebro humano (Borroto-Escuela et al., 2013). Además, en trabajos anteriores realizados en nuestro grupo de investigación se observó una modulación funcional mediada por agonistas del receptor 5-HT2A sobre la señalización del receptor D2 (Gómez, 2017). Con el fin de estudiar el cruzamiento en la señal de estos dos receptores, se llevaron a cabo ensayos funcionales mediante la medición de distintos segundos mensajeros como AMPc, IPs o Ca2+. Se utilizaron inhibidores a diferentes niveles de las cascadas intracelulares para evaluar la implicación de cada molécula en la modulación de la respuesta funcional. 2.1 Estudio de la activación del receptor 5-HT2A y su efecto sobre la respuesta de la dopamina en el receptor D2. En una primera aproximación, se evaluó la capacidad de los agonistas del receptor 5-HT2A de movilizar AMPc a través de la estimulación de este mismo. El receptor está acoplado a la proteína Gq que moviliza la formación de IPs y Ca2+ de manera canónica (Masson et al., 2012). Además, se estudió el efecto de la forskolina sobre la estimulación de la adenilato ciclasa, ya que en los ensayos de medición de la acumulación LAURA GÓMEZ GARCÍA 136 de AMPc del receptor D2 es necesario la estimulación de la AC por este compuesto debido a que el receptor está acoplado a una proteína Gi y medimos la capacidad que tiene de disminuir la producción de AMPc. Se evaluó, por tanto, cómo afecta la formación del heterodímero a la señalización de la dopamina sobre el receptor D2 en presencia de los de agonistas 5-HT2A estimulando o no la AC con la forskolina. Para ello se utilizó la línea celular HEK 293 Flp-InTM T-RexTM myc-5- HT2A-CFP/ FLAG-D2-YFP que expresa el receptor D2 de manera constitutiva y el receptor 5-HT2A de manera inducible. Por otro lado, se utilizó una línea HEK293 Flp-InTM T-RexTM myc-5-HT2A que expresa exclusivamente el receptor 5-HT2A. En todos los ensayos realizados se utilizó el antagonista del receptor 5-HT7 SB269970 para bloquear la señal de este y que no interfiriese en los resultados obtenidos. 2.1.1 La serotonina estimuló la producción de AMPc en presencia de forskolina en la línea celular que coexpresa los receptores D2 y 5-HT2A. Se evaluó el efecto de la serotonina, agonista endógeno del receptor 5- HT2A y su capacidad de movilizar AMPc a través de este receptor cuando se expresa de manera individual o como heterodímero con el receptor D2. También se comprobó el efecto que tiene la estimulación de la AC con forskolina sobre el efecto de este agonista en la acumulación de AMPc. Para ello se construyeron curvas concentración-respuesta de serotonina en ausencia o presencia de forskolina 1 µM en las diferentes líneas celulares. Se observó que en ausencia de forskolina la serotonina no movilizó AMPc en ninguna de las líneas celulares estudiadas. Sin embargo, la activación de AC mediada por FSK indujo un aumento concentración dependiente de AMPc cuando se expresan el heterodímero D2/5-HT2A, pero no se observó este efecto cuando los receptores se expresan de forma independiente (Figura 34). Resultados 137 - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 1 0 0 0 100 200 300 400 500 600 D2 L o g [ S e r o t o n in a ] ( M ) % A c u m u la c i ó n d e A M P c - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 1 0 0 0 100 200 300 400 500 600 5 - H T 2 A L o g [ S e r o t o n in a ] ( M ) % A c u m u la c i ó n d e A M P c - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 1 0 0 0 100 200 300 400 500 600 D2/ 5 - H T 2 A L o g [ S e r o t o n in a ] ( M ) % A c u m u la c i ó n d e A M P c A B C Figura 34. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc del agonista 5- HT en ausencia (-●-) y en presencia (-●-) de forskolina 1 µM, en células no tratadas (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h (C), y en células que solo expresan el receptor 5-HT2A (B). Se representa la media ± EEM de cuatro experimentos independientes realizados por triplicados. Para confirmar que el efecto de movilización de AMPc por parte de la serotonina se producía a través del receptor 5-HT2A y no del receptor endógeno 5-HT7 que se expresa de manera endógena en la línea celular HEK293 y que está acoplado a proteína Gs, se utilizó el antagonista específico de 5-HT2A ketanserina a una concentración 1 µM (Figura 35). Se observó que, en presencia de ketanserina 1 µM, se revirtió el efecto de movilización de AMPc de la serotonina a una concentración de 0.1 µM, disminuyendo la respuesta máxima respecto al efecto potenciador de la forskolina de 235% ± 13.3 a 135% ± 9.3 (Tabla 9). 0 100 200 300 D2/5-H T 2A L o g [S e ro to n in a ] (M ) % A cu m u lación de A M P c 5-HT 5-H T + K et. 1 uM 5-H T + F SK 1 uM 5-H T + K et. 1 u M + F S K 1 uM Figura 35. Representación de la acumulación de AMPc del agonista 5-HT (0.1 µM), en ausencia (negro) y en presencia (negro rayado) de forskolina 1 µM; y en presencia del antagonista 5-HT2A, ketanserina 1 µM, en ausencia (gris) y en presencia forskolina LAURA GÓMEZ GARCÍA 144 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 40 80 120 160 200 Lo g[T PX ] (u g/m l) % A cu m u la c ió n d e A M P c es tim ula d o p o r F S K (1 u M ) 16h S in in cu bació n p revia D2/5 -H T 2A -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 40 80 120 160 200 Lo g[T PX ] (u g /m l) % A cu m u la ció n d e A M P c es tim ulad o p o r F S K (1 u M ) 2h S in in cubació n p re via D2/5 -H T 2A -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 40 80 120 160 200 Lo g[T PX ] (u g /m l) % A cu m u la ció n d e A M P c es tim ulad o p o r F S K (1 u M ) 1h S in in cubació n p re via D2/5 -H T 2A Figura 41. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc inducido por la toxina pertussis en presencia de dopamina 1 µM sin incubación previa (-●-) y a diferentes tiempos de incubación (16, 2 y 1 hora) (- -) en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por triplicados. Tabla 12. Potencia (EC50) de la toxina pertussis en la acumulación de AMPc a diferentes tiempos en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por duplicados. SIN INCUBACIÓN PREVIA INCUBACIÓN 16H INCUBACIÓN 2H INCUBACIÓN 1H EC50 (µg/ml) - - 0.035 ± 1.6 0.073 ± 4.1 Una vez optimizadas las condiciones del inhibidor, se construyeron curvas concentración-respuesta de dopamina en presencia del agonista alucinógeno (±) DOI 0.1 µM y se incubaron en ausencia y en presencia de la toxina (Figura 42). Resultados 145 -12 -10 -8 -6 -4 0 50 100 150 200 250 300 D2 L o g [D o p a m in a] (M ) % A c um u la ció n d e A M P c e stim u la d o p o r F S K (1 u M ) D A D A + (± )D O I 0 .1 uM D A + (± )D O I 0.1 u M + P TX 0.05 ug /m l -12 -1 0 -8 -6 -4 0 50 100 150 200 250 300 D2/5-H T 2A L o g [D o p am in a ] (M ) % A c um u la ció n d e A M P c e stim u la d o p o r F S K (1 u M ) D A D A + (±)D O I 0 .1 uM D A + (±)D O I 0.1 u M + P TX 0.0 5 ug /m l A B Figura 42. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc inducido por el agonista D2 dopamina, en ausencia (-●-), en presencia del agonista alucinógeno 5- HT2A, (±) DOI 0.1 µM (-●-) y, adicionalmente, en presencia de la toxina pertussis 0.05 µg/ml (- -) en células no tratadas (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h (B). Se representa la media ± EEM de cinco experimentos independientes realizados por triplicados. La toxina pertussis inhibió la señalización de la dopamina por completo a través del receptor D2, impidiendo la disminución de AMPc con valores de respuesta máxima de 222% ± 16 en células que solo expresan D2 y 245% ± 17 en células que expresan el heterodímero (Tabla 13). Sin embargo, el efecto de modulación del agonista (±) DOI no se vio modificado en presencia del inhibidor. Tabla 13. Potencia y eficacia (EC50 y EFSK) de la dopamina (DA) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A (±) DOI 0.1 µM y la toxina pertussis (PTX) 0.05 µg/ml en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de cinco experimentos independientes realizados por triplicados. COMPUESTOS D2 D2/5-HT2A EC50 (nM) EFSK (%) EC50 (nM) EFSK (%) DA 145 ± 2.2 112 ± 6.6 93.6 ± 2.8 125 ± 8.6 DA + (±) DOI 212 ± 2.0 146 ± 6.2 219 ± 1.9 209 ± 8.8 DA + (±) DOI + PTX 41.7 ± 4.3 222 ± 16 285 ± 33 245 ± 17 LAURA GÓMEZ GARCÍA 146 2.2.2 La inhibición de la proteína Gq por el compuesto YM-254890 revirtió el efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2. Con el fin de comprobar la implicación de la proteína Gq en el efecto modulador del agonista (±) DOI se utilizó el inhibidor YM-254890. Se optimizó el tiempo de incubación y la concentración de compuesto necesario para inhibir el efecto de la proteína Gq, para lo cual se construyeron curvas concentración-respuesta de este y se incubaron a diferentes tiempos (Figura 43 y Tabla 14). Se observó que el efecto del inhibidor no variaba a lo largo del tiempo, por lo que se seleccionaron unas condiciones de tratamiento de 50 nM sin incubación previa para realizar los ensayos posteriores. L og [Y M -2 54 8 90 ] (M ) % A cu m u lac ió n d e IP s es tim u la do p o r 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -40 0 40 80 120 160 24 h S in incub ac ión p re via D2/5 -H T 2A L og [Y M -2 5 48 90 ] (M ) % A cu m u lac ió n d e IP s es tim u la do p o r 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -40 0 40 80 120 160 6 h S in incub ación p revia D2/5 -H T 2A L og [Y M -2 5 48 90 ] (M ) % A cu m u lac ió n d e IP s es tim u la do p o r 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -40 0 40 80 120 160 1 h S in incub ación p revia D2/5 -H T 2A Figura 43. Curvas concentración-respuesta de acumulación de IPs del compuesto YM- 254890 estimulado por serotonina 1 µM sin incubación previa (-●-) y a diferentes tiempos de incubación (24, 6 y 1 hora) (- -) en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por duplicados. Tabla 14. Potencia (EC50) de YM-254890 en la acumulación de IPs a diferentes tiempos en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por duplicados. SIN INCUBACIÓN PREVIA INCUBACIÓN 24H INCUBACIÓN 6H INCUBACIÓN 1H EC50 (nM) 10.5 ± 1.4 6.2 ± 1.9 6 ± 1.8 2.4 ± 1.5 Para comprobar el efecto del inhibidor en la acumulación de IPs, se construyeron curvas concentración-respuesta del agonista (±) DOI en ausencia y presencia del compuesto YM-254890 50 nM y se observó que la Resultados 147 señalización a través de proteína Gq se inhibía por completo (Figura 44 y Tabla 15). D2/5-H T 2A L o g [(± )D O I] (M ) % A c u m ula ció n d e IP s -12 -10 -8 -6 -4 -200 0 200 400 600 800 (±)D O I (±)D O I + Y M -254 890 50 nM Figura 44. Curvas concentración-respuesta de acumulación de IPs inducidos por el agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI, en ausencia (-●-) y en presencia del compuesto YM-254890 50 nM (-●-) en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por triplicados. Tabla 15. Potencia (EC50) de (±) DOI en ausencia y presencia del inhibidor YM-254890 50 nM en la acumulación de IPs en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por triplicados. (±) DOI (±) DOI + YM-254890 (50 NM) EC50 (nM) 228 ± 1.3 - Con el fin de estudiar el efecto modulador del agonista (±) DOI sobre la señalización de dopamina, se construyeron curvas concentraciónrespuesta del agonista de D2 en ausencia y presencia de (±) DOI 0.01 µM y tratadas con el inhibidor de Gq (Figura 45). LAURA GÓMEZ GARCÍA 148 -12 -10 -8 -6 -4 0 50 100 150 200 250 D2 L o g [D o p am in a] (M ) % A cu m u la ció n d e A M P c e stim ula d o p o r F S K (1 u M ) D A D A + (± )D O I 0 .1 uM D A + Y M -2 5 489 0 50 nM D A + (± )D O I + Y M -2 548 90 -12 -1 0 -8 -6 -4 0 50 100 150 200 250 D2/5-H T 2A L o g [D o p am in a] (M ) % A cu m u la ció n d e A M P c e s tim ula d o p o r F S K (1 u M ) D A D A + (± )D O I 0 .1 uM D A + Y M -2 54 89 0 50 nM D A + (± )D O I + Y M -25 48 90 A B Figura 45. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc inducido por el agonista D2 dopamina, en ausencia (-●-), en presencia del agonista alucinógeno5- HT2A, (±) DOI 0.1 µM (-●-), en presencia del compuesto YM-254890 50 nM (- -) y en presencia de (±) DOI 0.1 µM y del compuesto YM-254890 50 nM (- -) en células no tratadas (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h (B). Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. Se observó una reversión estadísticamente significativa (p valor = 0,0035, test t de Student) del efecto modulador de (±) DOI en las células que expresan el heterodímero disminuyendo los valores de respuesta máxima de 205% ± 13 en ausencia del inhibidor a 126% ± 5.8 con el tratamiento de YM254890, siendo esta respuesta similar a la de la dopamina en ausencia del agonista (±) DOI (133% ± 8.3) (Tabla 16). Tabla 16. Potencia y eficacia (EC50 y EFSK) de la dopamina (DA) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A (±) DOI 0.1 µM y el inhibidor de Gq YM-254890 (YM) 50 nM en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. **p valor <0.01 (test t de Student). COMPUESTOS D2 D2/5-HT2A EC50 (nM) EFSK (%) EC50 (nM) EFSK (%) DA 234 ± 1.2 119 ± 5.8 207 ± 2.0 133 ± 8.3 DA + (±) DOI 216 ± 1.2 150 ± 6.6 391 ± 2.6 205 ± 13** DA + YM 153 ± 1.1 118 ± 6.0 105 ± 1.5 133 ± 8.3 DA + (±) DOI + YM 233 ± 1.3 98.3 ± 5.1 166 ± 4.0 126 ± 5.8** Resultados 149 2.2.3 La inhibición de la fosfolipasa C por el compuesto 48/80 revirtió el efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2. Una vez confirmado que el efecto depende de la vía de señalización mediada por Gq se estudió la implicación de la PLC. Para ello, primero se optimizaron las condiciones de uso del compuesto inhibidor 48/80, se construyeron curvas concentración-respuesta durante distintos tiempos de incubación y se midió la acumulación de IPs (Figura 46). Se observó que el efecto del inhibidor era óptimo cuando se trataba las células sin incubación previa a una concentración de 30 µM (Tabla 17). L og [4 8 /4 0] (M ) % A cu m u lac ió n d e IP s es tim u la do p o r 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -50 0 50 100 150 24 h S in incu bació n p revia D2/5 -H T 2A L og [4 8 /4 0] (M ) % A cu m u lac ió n d e IP s es tim u la do p o r 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -50 0 50 100 150 6 h S in incu bació n previa D2/5 -H T 2A L og [4 8 /4 0] (M ) % A cu m u lac ió n d e IP s es tim u la do p o r 5 -H T (1 u M ) -12 -10 -8 -6 -4 -2 -50 0 50 100 150 1 h S in incu bació n previa D2/5 -H T 2A Figura 46. Curvas concentración-respuesta de acumulación de IPs del compuesto 48/80 estimulado por serotonina 1 µM sin incubación previa (-●-) y a diferentes tiempos de incubación (24, 6 y 1 hora) (- -) en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por duplicados. Tabla 17. Potencia (EC50) del compuesto 48/80 en la acumulación de IPs a diferentes tiempos en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por duplicados. SIN INCUBACIÓN PREVIA INCUBACIÓN 24H INCUBACIÓN 6H INCUBACIÓN 1H EC50 (µM) 2.3 ± 1.6 - - - Además, se comprobó que la acumulación de IPs estimulada por (±) DOI se inhibía en presencia del compuesto 48/80 a una concentración de 30 µM (Figura 47 y Tabla 18). LAURA GÓMEZ GARCÍA 150 D2/5 -H T 2A L o g [(± )D O I] (M ) % A c u m u lació n d e IP s -12 -10 -8 -6 -4 -200 0 200 400 600 800 (±)D O I (± )D O I + 4 8/80 30 u M Figura 47. Curvas concentración-respuesta de acumulación de IPs inducidos por el agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI, en ausencia (-●-) y en presencia del compuesto 48/80 30 µM (-●-) en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por triplicados. Tabla 18. Potencia (EC50) de (±) DOI en ausencia y presencia del compuesto 48/80 30 µM en la acumulación de IPs en células tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de un experimento realizado por triplicados. (±) DOI (±) DOI + C-48/80 (30 µM) EC50 (nM) 217 ± 1.4 - Con el fin de estudiar el efecto modulador del agonista (±) DOI sobre la señalización de dopamina, se construyeron curvas concentraciónrespuesta del agonista de D2 en ausencia y presencia de (±) DOI 0.01 µM y tratadas con el compuesto 48/80 a 30 µM (Figura 48). Resultados 151 -12 -10 -8 -6 -4 0 50 100 150 200 250 D2 L og [D o p am in a ] (M ) % A c um u la c ió n d e A M P c e s tim u la d o p o r F S K (1 u M ) D A D A + (±)D O I 0 .1 u M D A + C .48 /80 30 u M D A + (± )D O I 0.1 uM + C .48/80 -12 -10 -8 -6 -4 0 50 100 150 200 250 D2/5-H T 2A L o g [D o p am in a] (M ) % A c um u lac ió n d e A M P c e stim u la d o p o r F S K (1 u M ) D A D A + (±)D O I 0 .1 u M D A + C .48 /80 30 uM D A + (± )D O I 0.1 uM + C .48 /80 A B Figura 48. Curvas concentración-respuesta de acumulación de AMPc inducido por el agonista D2 dopamina, en ausencia (-●-), en presencia del agonista alucinógeno 5- HT2A, (±) DOI 0.1 µM (-●-), en presencia del compuesto 48/80 30 µM (- -) y en presencia de (±) DOI 0.1 µM y del compuesto 48/80 30 µM (- -) en células no tratadas (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h (B). Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. Se observó una reversión estadísticamente significativa (p valor EC50 = 0.0178 y p valor EFSK = 0.0441, test t de Student) del efecto modulador de (±) DOI en las células que expresan el heterodímero disminuyendo los valores de respuesta máxima de 187% ± 10 en ausencia del inhibidor a 116% ± 7.3 con el tratamiento del compuesto 48/80, siendo esta respuesta similar a la de la dopamina en ausencia del agonista (±) DOI (126% ± 6.3) (Tabla 19). Tabla 19. Potencia y eficacia (EC50 y EFSK) de la dopamina (DA) en la acumulación de AMPc en ausencia o presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A (±) DOI 0.1 µM y el inhibidor de PLC compuesto 48/80 30 µM en células no tratadas y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h. Se representa la media ± EEM de tres experimentos independientes realizados por triplicados. *p valor <0.05 (test t de Student). COMPUESTOS D2 D2/5-HT2A EC50 (nM) EFSK (%) EC50 (nM) EFSK (%) DA 133 ± 1.8 150 ± 7.6 178 ± 1.1 126 ± 6.3 DA + (±) DOI 109 ± 1.5 186 ± 7.7 139 ± 1.4* 187 ± 10* DA + 48/80 621 ± 3.0 133 ± 8.0 255 ± 1.4 128 ± 6.6 DA + (±) DOI + 48/80 846 ± 1.8 129 ± 5.5 644 ± 1.7* 116 ± 7.3* LAURA GÓMEZ GARCÍA 152 2.2.4 El efecto modulador del agonista de 5-HT2A, (±) DOI, sobre la señalización de la dopamina en el receptor D2 es independiente del calcio intracelular. Con el objetivo de estudiar la implicación del calcio intracelular en la modulación de la señal de la dopamina por (±) DOI, se llevaron a cabo ensayos con el quelante de calcio el ácido 1,2 bis (2-animofenoxi) etano- N,N,N’,N’ tetraacético (BAPTA) y con el inhibidor de la Ca2+ ATPasa del retículo endoplasmático (tapsigargina), que evita que el calcio sea captado por el retículo aumentándolo en el citosol. Para ello, primero se optimizaron las condiciones de uso de cada uno de estos compuestos. Se incubaron distintas concentraciones de BAPTA (1 o 2 mM) en presencia del agonista (±) DOI y se midió la movilización de calcio (Figura 49). Se observó que tras una incubación de 1 hora con el quelante a una concentración 1 mM disminuía la señalización a través de calcio mediada por (±) DOI hasta niveles basales, por lo que se seleccionaron estas condiciones. D2 [(± ) D O I] (M ) N o T to. B A PT A 1 m M B AP TA 2 m M 0 50 100 150 3 40 /3 80 ra tio (R F U ) 10 -5 M 10 -9 M B a sa l D2/5-H T 2A [(± ) D O I] (M ) N o T to. B A PT A 1 m M B AP TA 2 m M 0 50 100 150 3 40 /3 80 ra tio (R F U ) 10 -5 M 10 -9 M B a sa l A B Figura 49. Movilización de calcio en células no tratadas (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h (B) incubadas con el quelante de calcio, BAPTA 1 mM o 2 mM, en presencia del agonista alucinógeno 5-HT2A, (±) DOI. Se representa la media ± EEM de un experimento representativo realizado por triplicados. Por otro lado, se optimizó la concentración de tapsigargina en ausencia y presencia del quelante de calcio, BAPTA. Para ello se estudiaron distintas concentraciones de tapsigargina en presencia de (±) DOI 0.01 µM y en ausencia o presencia de BAPTA 1 mM (Figura 50). Resultados 153 Se observó que aumentaba la señalización de calcio a medida que la concentración de tapsigargina era mayor, sin embargo, disminuye en presencia del quelante BAPTA a 1 mM. Además, se observó un aumento en la movilización de calcio estadísticamente significativo con un intervalo del 99% de confianza (p valor= 0.005, test t de Student) entre el control basal en presencia de BAPTA 1 mM y el tratamiento con tapsigargina 10 µM y BAPTA 1 mM, de manera que la tapsigargina tiene capacidad a esa concentración de movilizar calcio aún a pesar del efecto quelante del BAPTA. Por ello, se seleccionaron diferentes condiciones para estudiar este efecto: tapsigargina 1 y 10 µM en ausencia y presencia de BAPTA 1 mM. D2 [T h a p sig a rg in a] (M ) N o T to. B AP TA 1m M 0 50 100 150 Ta p. 1 0 -5 + (± ) D O I 0 ,0 1 M Ta p. 1 0 -6 + (± ) D O I 0 ,0 1 M 3 4 0/3 80 ra tio (R F U ) Ta p. 1 0 -7 + (± ) D O I 0 ,0 1 M B a sa l D2/5-H T 2A [T h a p sig a rg in a] (M ) N o T to. B A PTA 1m M 0 50 100 150 Ta p. 1 0 -5 + (± ) D O I 0,0 1 M Ta p. 1 0 -6 + (± ) D O I 0,0 1 M 3 4 0/3 80 ra tio (R F U ) Ta p. 1 0 -7 + (± ) D O I 0,0 1 M B a sa l A B Figura 50. Movilización de calcio en células no tratadas (A) y tratadas con doxiciclina 10 ng/ml durante 24h (B) incubadas con tapsigargina a distintas concentraciones y en presencia de (±) DOI 0.1 µM, pretratadas o no con BAPTA 1 mM. Se representa la media ± EEM de un experimento representativo realizado por triplicados. **p valor <0.01 (test t de Student). Una vez optimizadas las condiciones de empleo de los inhibidores, se estudió primero el efecto del quelante BAPTA individualmente en el efecto modulador del agonista (±) DOI en la respuesta de la dopamina sobre el receptor D2. Para ello se construyeron curvas concentración-respuesta de dopamina en ausencia y presencia de (±) DOI 0.01 µM y se trataron previamente 1 hora con BAPTA 1 mM (Figura 51). ** **