Control y eliminación de virus entéricos en moluscos bivalvos y agua mediante sistemas de depuración y desinfección solar

! ! ! ! ! ! ! ! Departamento!de!Microbiología!y!Parasitología! CIBUS‐Facultad!de!Biología! Universidad!de!Santiago!de!Compostela! ! ! ! ! ! Control!y!eliminación!de!virus!entéricos!en! moluscos!bivalvos!y!agua!mediante! !sistemas!de!depuración!y!desinfección!solar! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! David!Polo!Montero! 2014! ! ! ! ! ! ! ! Control!y!eliminación!de!virus!entéricos!en! moluscos!bivalvos!y!agua!mediante! !sistemas!de!depuración!y!desinfección!solar! ! ! ! ! ! ! Memoria!que!presenta! David!Polo!Montero! para!optar!al!grado!de! Doctor!en!Ciencias! Biológicas! ! ! ! ! ! ! ! ! Fdo:!David!Polo!Montero! Santiago!de!Compostela! Julio!2014! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Jesús!López!Romalde,!Catedrático!del!Departamento!de!Microbiologia! y!Parasitologia!de!la!Universidad!de!Santiago!de!Compostela! ! Informa:!!que!la!presente!Tesis!Doctoral!titulada:!“Eliminación!de!virus! entéricos! en! moluscos! bivalvos! y! agua”,! que! presenta! David! Polo! Montero!para!optar!al!grado!de!Doctor!en!Ciencias!Biológicas,!ha!sido! realizada! en! el! Departamento! de! Microbiología! y! Parasitología! bajo! nuestra! dirección,! y! considerando! que! se! haya! concluida,! autoriza! su! presentación! para! que! pueda! ser! juzgada! por! el! tribunal! correspondiente.! ! ! ! En!Santiago!de!Compostela,!a!!1!!de!!Septiembre!de!2014! ! ! ! ! ! Dr.!Jesús!L.!Romalde! ! ! ! ! ! Este!trabajo!fue!posible!gracias!a!una!subvención! del!Plan!Gallego!de!Investigación,!Desarrollo!e!Innovación!Tecnológica! (Consellería!de!Economía!e!Industria;!Xunta!de!Galicia)(Ref.:! 10MMA200010PR),!así!como!a!dos!Contratos!de!Investigación!con!el! Instituto!Tecnolóxico!para!o!Control!do!Medio!Mariño! (INTECMAR)(Refs.:!2007/CP746!y!2008/CP776).! ! ! Durante!el!desarrollo!del!mismo,!he!disfrutado! de!contratos!asociados!a!dichos!proyectos!y!! una!beca!del!Ministerio!de!Ciencia!e!Innovación!para!la!! financiación!de!estancias!en!la!Plataforma!solar!de!Almería!(PSA),! !del!Centro!de!Investigaciones!Energéticas,!! Ambientales!y!Tecnológicas!(CIEMAT).! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! La!ciencia!será!siempre!una!búsqueda,!jamás!un!descubrimiento!real.!Es! un!viaje,!nunca!una!llegada!(Karl!R.!Popper!1902‐1994)! ! En!principio,!la!investigación!necesita!más!cabezas!que!medios!! (Severo!Ochoa!1905‐1993)! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Publicaciones! ! Publicaciones!derivadas!de!la!presente!Tesis!Doctoral! ! Polo,!D.,!Álvarez,!C.,!Díez,!J.,!Manso,!C.F.,!Angulo,!M.,!Vilariño,!M.L.,!!Darriba,! S.,!Longa,!A.,!&!Romalde,!J.L.!(2013).!Bioaccumulation!and!removal!dynamics! of! murine! norovirus! in! Manila! Clams! (Venerupis' philippinarum)! and! mussels! (Mytilus' galloprovincialis).! En:! Molluscan' Shellfish' Safety,! Chapter:! 14,! Publisher:! Springer! Netherlands,! Editores:! Gilbert! Sauvé,! pp.165‐175.! DOI:10.1007/978‐94‐007‐6588‐7_14!ISBN:!Print!978‐94‐007‐6587‐0,!Online!978‐94‐007‐6588‐7.! ! Polo,!D.,!Álvarez,!C.,!Díez,!J.,!Darriba,!S.,!Longa,!A.,!&!Romalde,!J.L.!(2014).!Viral! elimination!during!commercial!depuration!of!shellfish.!Food!Control,!43,!206– 212.! Índice!de!impacto!2013:!2,819;!Q1!(17/123)!en!Food!Science!and!Technology.! ! Polo,! D.,! Álvarez,! C.,! Vilariño,! M.L.,! Longa,! A.,! &! Romalde,! J.L.! (2014).! Depuration!kinetics!of!Hepatitis!A!virus!in!clams.!Food!Microbiology,!39,!103– 107.! Índice!de!impacto!2013:!3,374;!Q1!(8/123)!en!Food!Science!and!Technology.! ! Polo,! D.,! Álvarez,! C.,! Longa,! A.,! &! Romalde,! J.L.! (2014).! Effectiveness! of! depuration! for! hepatitis! A! virus! removal! from! mussels! (Mytilus' galloprovincialis).!International!Journal!of!Food!Microbiology,!180,!24–29.! Índice!de!impacto!2013:!3,155;!Q1!(11/123)!en!Food!Science!and!Technology.! ! Polo,! D.,! Feal,! X.,! Varela,! M.F.,! Monteagudo,! A.,! Romalde,! J.L.! (2014).! Depuration! kinetics! of! murine! norovirus! in! shellfish.! Food! Research! International,!64,!182–187.! Índice!de!impacto!2013:!3,050;!Q1!(14/123)!en!Food!Science!and!Technology.! ! Polo,! D.,! Feal,! X.,! &! Romalde,! J.L.! (2014).! Mathematical! model! for! viral! depuration! kinetics! in! shellfish:! a! useful! tool! to! estimate! the! risk! for! the! consumers.!Emerging!Infectious!Diseases!(Enviado).! Índice!de!impacto!2013:!7,327;!Q1!(3/70)!en!Infectious!Diseases.! ! Polo,! D.,! García‐Fernández,! I.,! Fernández‐Ibáñez,! P.,! &! Romalde,! J.L.! (2014).! Solar! Water! Disinfection! (SODIS)! of! Hepatitis! A! virus! and! norovirus! under! natural!solar!conditions.!Journal!of!Applied!Microbiology!(Enviado).! Índice! de! impacto! 2013:! 2,386;! Q2! (69/165)! en! Biotechnology! and! Applied! Microbiology! ! ! Polo,! D.,! García‐Fernández,! I.,! Fernández‐Ibáñez,! P.,! &! Romalde,! J.L.! (2014).! Hepatitis! A! virus! and! norovirus! disinfection! by! solar! photo‐Fenton! systems! under!natural!solar!conditions.!Environment!International!(Enviado).! Índice!de!impacto!2013:!5,664;!Q1!(7/215)!en!Environmental!Sciences.! ! ! ! Otras!publicaciones!relacionadas!con!la!presente!Tesis!Doctoral! ! Vilariño,!M.L.,!Le!Guyader,!F.S.,!Polo,!D.,!Schaeffer,!J.,!Kröl,!J.,!&!Romalde,!J.L.! (2009).! Assesment! of! human! enteric! viruses! in! cultured! and! wild! bivalve! molluscs.!International!Microbiology,!12,!145–151.! Índice! de!impacto! 2013:!1,341;!Q3! (117/165)! en!Biotechnology!and!Applied! Microbiology.! ! Manso,! C.F.,! Polo,! D.,! Vilariño,! M.L.,! &! Romalde,! J.L.! (2010).! Genotyping! of! hepatitis! A! virus! detected! in! bivalve! shellfish! in! Galicia! (NW! Spain).! Water! Science!and!Technology,!61,!15–24.! Índice!de!impacto!2013:!1,212;!Q3!(44/79)!en!Water!Resources.! ! Polo!D.,!Vilariño,!M.L.,!Manso,!C.F.,!&!Romalde,!J.L.!(2010).!Imported!mollusks! and!dissemination!of!human!enteric!viruses.!Emerging!Infectious!Diseases,!16,! 1036–1038.! Índice!de!impacto!2013:!7,327;!Q1!(3/70)!en!Infectious!Diseases.! Polo,!D.,!Varela!M.F.,!&!Romalde,!J.L.!(2014).!Detection!and!quantification!of! Hepatitis! A! virus! and! norovirus! in! Spanish! authorized! shellfish! harvesting! areas.!International!Journal!of!Food!Microbiology,!(En!prensa).! Índice!de!impacto!2013:!3,155;!Q1!(11/123)!en!Food!Science!and!Technology.! ! ! ! ÍNDICE Abreviaturas y acrónimos ........................................................................................ i Tablas y figuras ...................................................................................................... iii Presentación y resumen .......................................................................................... v Presentación e resumo ............................................................................................ ix Presentation and summary .................................................................................. xiii 1. INTRODUCCIÓN GENERAL ......................................................................... 1 1.1. Enfermedades de transmisión alimentaria. Hacia un riesgo y una seguridad global .......................................................................................... 3 1.2. Virus entéricos de transmisión alimentaria ............................................. 4 1.2.1. Perspectiva histórica ........................................................................... 4 1.2.2. Características generales de los virus entéricos ................................. 8 1.2.3. Principales virus entéricos .................................................................. 9 1.3. Virus de la Hepatitis A ............................................................................. 10 1.3.1. Historia ............................................................................................. 10 1.3.2. Taxonomía y diversidad genética y antigénica ................................ 11 1.3.3. Estructura y organización genómica ................................................ 16 1.3.4. Replicación viral .............................................................................. 18 1.3.5. Cuadro clínico e inmunidad ............................................................. 21 1.3.6. Epidemiología y prevalencia ............................................................ 23 1.3.7. Vías de transmisión .......................................................................... 24 1.3.8. Estabilidad físico-química ................................................................ 25 1.3.9. Cultivo celular .................................................................................. 27 1.4. Norovirus ................................................................................................... 27 1.4.1. Historia .............................................................................................. 27 1.4.2. Taxonomía y diversidad genética y antigénica ................................ 29 1.4.3. Estructura y organización genómica ................................................ 32 1.4.4. Replicación viral .............................................................................. 34 1.4.5. Cuadro clínico e inmunidad ............................................................. 35 1.4.6. Epidemiología y prevalencia ............................................................ 37 ! 1.4.7. Susceptibilidad genética a NoV. El papel del grupo de antígenos histo-sanguíneos ............................................................... 39 1.4.8. Vías de transmisión .......................................................................... 41 1.4.9. Estabilidad físico-química ............................................................... 43 1.4.10. Cultivo celular ............................................................................... 44 1.5. Detección de HAV y NoV en alimentos .................................................. 45 1.6. Productos de especial prioridad .............................................................. 49 1.7. Virus entéricos en moluscos bivalvos ..................................................... 50 1.7.1. Los moluscos bivalvos como vectores de transmisión de virus entéricos ............................................................................................ 50 1.7.2. Modos de contaminación ................................................................ 54 1.7.3. Captación, acumulación y persistencia viral .................................... 57 1.7.4. Métodos de control y eliminación ................................................... 63 1.7.5. Legislación y control microbiológico para el producto final ........... 74 1.8. Virus entéricos en agua ............................................................................ 75 1.8.1. El agua como vector de transmisión de virus entéricos ................... 75 1.8.2. Virus entéricos en agua de consumo ................................................ 76 1.8.3. Virus entéricos en agua para irrigación ........................................... 80 1.8.4. Tratamiento de aguas residuales ...................................................... 82 1.8.5. Legislación ....................................................................................... 84 2. JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ................................................................ 85 3. RESULTADOS ................................................................................................ 91 3.1. Eliminación de virus entéricos en almeja y mejillón mediante sistemas de depuración ............................................................................ 93 3.1.1. Artículo 1. Viral elimination during commercial depuration of shellfish ............................................................................................. 95 3.1.2. Artículo 2. Depuration kinetics of Hepatitis A virus in clams ....... 105 3.1.3. Artículo 3. Effectiveness of depuration for hepatitis A virus removal from mussels (Mytilus galloprovincialis) ......................... 113 ! ! 3.1.4. Artículo 4. Depuration kinetics of murine norovirus in shellfish ........................................................................................... 121 3.1.5. Artículo 5. Mathematical model for the depuration kinetics of enteric viruses in shellfish ............................................................... 129 3.2. Eliminación de virus entéricos en agua mediante SODIS y sistemas foto-Fenton ............................................................................... 155 3.2.1. Artículo 1. Solar Water Disinfection (SODIS) of Hepatitis A virus and norovirus under field conditions ...................................... 157 3.2.2. Artículo 2. Hepatitis A virus and norovirus disinfection by solar photo-Fenton systems under field conditions ......................... 189 4. DISCUSIÓN GENERAL ............................................................................... 221 5. CONCLUSIONES .......................................................................................... 233 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 237 ! ! i! ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS (–) Polaridad negativa (+) Polaridad positiva a.C. antes de Cristo AdV Adenovirus Ag Antígeno/s AiV Aichi virus ANN Redes Artificiales Neuronales (del inglés Artificial Neural Networks) AOP Procesos Avanzados de Oxidación (del inglés Advanced Oxidation Processes) AsV Astrovirus bc Bicatenario BSC Células de riñón de mono verde Africano CoV Coronavirus CoxV Coxsackievirus DNA Ácido dexosirribonucleico (del inglés Deoxyribonucleic Acid) EchV Echovirus ECP Efecto citopático EDAR Estación Depuradora de Aguas Residuales EEUU Estados Unidos ELISA Ensayo por Inmuno-absorción Ligado a Enzimas (del inglés Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) EMCV Encefalomiocarditis virus ETA Enfermedad de transmisión alimentaria EV Enterovirus FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (del inglés Food and Agriculture Organization of the United Nations) FBVE Red Europea de Virus de transmisión alimentaria (del inglés, Food-Borne Virus in Europe) FCV Calicivirus Felino (de inglés, Feline calicivirus) FRhK Células de riñón de macaco FUT Fucosiltransferasa FUT Gen codificante para una fucosiltransferasa HAV Virus de la hepatitis A (del inglés, Hepatitis A Virus) HBGA Grupo de Antígenos de Histocompatibilidad sanguíneos (del inglés Histo-Blood Group Antigens) HBV Virus de la hepatitis B (del inglés, Hepatitis B Virus) HEV Virus de la hepatitis E HHP Alta Presión Hidrostática (del inglés, High Hydrostatic Pressure) Ig Inmunoglobulina IRES Sitio Interno de Entrada Ribosomal (del inglés Internal Ribosome Entry Site) ISO Organización Internacional para la Estandarización (del inglés International Organization for Standardization) IU Unidades Internacionales (del inglés, International Units) kb Kilobase kDa KiloDalton kGy KiloGrays Le Lewis mc Monocatenario ME Microscopía Electrónica MERS Síndrome Respiratorio de Oriente Medio (del inglés, Middle East Respiratory Syndrome) ! ii! MIE Microscopía Inmuno-Electrónica MNV Norovirus murino (de inglés, Murine norovirus) N-terminal Amino terminal NCR Región No Codificante (del inglés Non Coding Region) NIAID Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de EEUU (del inglés National Institute of Allergy and Infectious Disease) NLV Virus tipo Norwalk (del inglés, Norwalk-Like virus) NMP Número Más Probable NoV Norovirus NSSP Programa sanitario nacional de los EEUU para moluscos bivalvos (del inglés National Shellfish Sanitation Program) NTPasa Nucleótido trifosfatasa OMS Organización Mundial de la Salud ORF Pauta abierta de lectura (del inglés Open Reading Frame) P Dominio protuberante PaV Parvovirus PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PET Polietileno-Tereftalato PV Poliovirus RdRp RNA polimerasa dependiente de RNA (del inglés RNA dependent RNA polymerase) RIA Radioinmunoensayo RNA Ácido ribonucleico (del ingles Ribonucleic Acid) RNAm RNA mensajero RNasas Ribonucleasas RT Retrotranscripción RT-PCR Retrotranscripción asociada a la reacción en cadena de la polimerasa (del inglés Reverse transcription polymerase chain reaction) RT-qPCR Retrotranscripción asociada a la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (del inglés Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction ) RV Rotavirus SARS Síndrome Respiratorio Agudo Severo (del inglés, Severe Acute Respiratory Syndrome) SAT Sistemas de Alerta Temprana SaV Sapovirus SODIS Desinfección solar (del inglés Solar Disinfection) SRSV Virus pequeños de estructura redondeada (del inglés Small Round-Structure Viruses) TBEV Tick-Borne Encephalitis Virus RNAt ARN transferente (del inglés, Transfer RNA) UE Unión Europea ufc Unidades formadoras de colonia UV Ultravioleta VP Proteína viral (del inglés, Viral Protein) VPg Proteína viral unida al genoma (del inglés: virus protein genome linked) x g Unidades de fuerza centrífuga relativa ! En este listado no se incluyen unidades de medida, ni otras abreviaturas de términos científicos utilizados de forma convencional en publicaciones internacionales. ! iii! TABLAS Y FIGURAS TABLAS Tabla 1: Características de los principales virus entéricos ................................ 12 Tabla 2: Diferentes perfiles de unión de diferentes cepas de NoV a los HBGA .............................................................................................................. 42 Tabla 3: Diferentes brotes asociados al consumo de moluscos bivalvos .......... 53 Tabla 4: Criterios de la UE para la clasificación de las áreas de cultivo de moluscos bivalvos ....................................................................................... 66 Tabla 5: Criterios NSSP para la clasificación de las áreas de cultivo de moluscos bivalvos ............................................................................................ 67 Tabla 6: Comparación de los tres principales sistemas de desinfección de agua utilizados durante el proceso de depuración ....................................... 69 FIGURAS Figura 1: Árbol filogenético de los géneros más representativos de la familia Picornaviridae ..................................................................................... 14 Figura 2: Clasificación genotípica y subgenotípica de HAV ............................ 15 Figura 3: Distribución geográfica de los genotipos de HAV ............................ 16 Figura 4: Representación esquemática de la estructura y organización genómica de HAV ........................................................................................... 17 Figura 5: Evolución de los títulos virales y signos clínicos durante una infección de hepatitis A ................................................................................... 22 Figura 6: Distribución geográfica de la prevalencia de antígeno anti- HAV ................................................................................................................. 24 Figura 7: Árbol filogenético de la familia Caliciviridae ................................... 30 Figura 8: Árbol filogenético de los diferentes genogrupos de NoV ................. 31 Figura 9: Representación esquemática de la estructura y organización genómica de NoV ............................................................................................ 34 ! x! dúas especies de bivalvos, en condicións de depuración aplicadas comercialmente nun centro autorizado e homologado, alongando o periodo de depuración ata os 7 días. Os resultados puxeron de manifesto a ineficacia dos procesos comerciais para a eliminación viral e observáronse certas diferencias no que respecta á capacidade depurativa das dúas especies de bivalvos. Intentouse a continuación profundizar no comportamento viral durante este tipo de procesos mediante o seu estudo nunha depuradora experimental. Estos ensaios compoñen os artigos (ii) “Cinética da depuración do virus da hepatite A en ameixas”, (iii) “Eficacia da depuración para a eliminación do virus da hepatite A en mexillóns (Mytilus galloprovincialis)” e (iv) “Cinética da depuración de norovirus murino en moluscos bivalvos”. Nos tres artígos observouse tanto unha dinámica de depuración compartida entre ámbolos dous moluscos como certas diferencias na súa capacidade depurativa. Tamén observáronse certas diferencias na capacidade de persistencia dos dous virus. Estos resultados deron lugar ó quinto artículo, (v) “Modelo matemático para a cinética de depuración viral en moluscos bivalvos: una ferramenta útil para estimar o risco para os consumidores”. Neste artigo, desenvólvese un modelo predictivo que caracteriza a cinética observada previamente e que pode predecir a carga viral en calquera momento da depuración coñecendo a tasa de filtración específica do molusco bivalvo e certas propiedades específicas do virus en cuestión, relacionadas coa súa capacidade de unirse, penetrar ou acumularse dentro das células e tecidos gastrointestinais do bivalvo. A segunda parte da tesis, relacionada coa desinfección viral mediante SODIS e foto-Fenton, inclúe dous artígos: (i) “Desinfección Solar de auga (SODIS) do virus da Hepatite A e norovirus baixo condicións solares naturais”. Neste artígo avalíase e compárase a eficacia do método SODIS para a desinfección de HAV e NoV en auga de bebida baixo condicións naturais. Os resultados indicaron que SODIS pode contribuir a reducir o risco de infección viral e apoia o seu uso como método de desinfección de auga alternativo e/ou de emerxencia para comunidades vulnerables. No segundo artígo (ii) ! xi! “Desinfección do virus da Hepatite A e norovirus mediante sistemas foto- Fenton baixo condicións solares naturais”, avalióuse comparativamente a eficacia do método SODIS, e os sistemas Fenton e foto-Fenton para a desinfección de HAV e NoV en auga como unha posible aplicación para a desinfección de auga de rego. Os resultados demostraron que os sitemas foto- Fenton poden reducir significativamente a presenza e a infectividade viral a temperaturas medias e sen unha fonte de luz intensa, e sitúan a este tipo de procesos como una alternativa prometedora, medioambientalmente máis sostible e barata que os procesos de desinfección convencionais. ! xiii! Presentation and summary Foodborne diseases of viral etiology represent one of the main challenges in global food security. The development of a large-scale trade without appropriate safety standards and microbiological procedures, from a virological standpoint, illustrates the current vulnerability of the global food market. In recent years, it has been demonstrated that viruses are one of the major cause of the increase of foodborne and waterborne illnesses worldwide. From an epidemiological point of view, norovirus (NoV) and hepatitis A virus (HAV) are the major foodborne viruses and focus the attention of this thesis. The overall objective of this work is to acquire a deeper knowledge on the control and elimination of HAV and NoV in bivalve molluscs and water by depuration and solar disinfection processes, respectively. The thesis presented below is divided into two main blocks: (i) a first part focuses on the study and evaluation of the efficacy and kinetics of viral clearance in bivalve molluscs subjected to purification processes and (ii) a second part focused on SODIS and photo-Fenton systems efficiency for viral disinfection of water. The first part, focused on viral clearance in bivalve molluscs, represents the largest part of this thesis and includes 5 scientific articles: (i) The first article entitled "Viral elimination during commercial depuration of shellfish" evaluated the purification efficiency for the elimination of HAV, NoV genogroups I and II, and F+RNA bacteriophages in pullet carpet shell clam (Venerupis pullastra) and Mediterranean mussel (Mytilus galloprovincialis) contaminated in the natural environment. The objective was to compare the behavior of these viruses in the two bivalve species, in commercial depuration conditions and in an authorized center, extending the depuration period to 7 days. Results showed the inefficiency of the commercial depuration processes ! xiv! for viral clearance as well as certain differences in the purification capacity of the two bivalve species. Further assays in an experimental depuration system were carried out to evaluate the viral behavior during these processes. These assays comprise articles (ii) "Depuration kinetics of hepatitis A virus in clams" (iii) "Effectiveness of depuration for hepatitis A virus removal from mussels (Mytilus galloprovincialis)" and (iv) "Depuration kinetics of murine norovirus in shellfish". These three articles showed a depuration dynamic shared by the different molluscan species but also some differences in their purification capacity. Certain differences in the persistence capacity of the two viruses were also observed. These results led to the development of the fifth article, (v) "Mathematical model for viral depuration kinetics in shellfish: a useful tool to estimate the risk for the consumers". In this article, a predictive model that characterizes the viral depuration kinetics previously observed was developed. The model can predict the viral load at any time of depuration knowing the specific filtration rate of bivalve mollusc and certain specific properties of the virus related to their ability to bind, penetrate or accumulate within cells and gastrointestinal tissues of the bivalves. The second part of the thesis, related to viral disinfection by SODIS and photo- Fenton, includes two articles: (i) "Solar Water Disinfection (SODIS) of hepatitis A virus and norovirus under natural solar conditions". This article evaluated and compared the effectiveness of SODIS method for the disinfection of HAV and NoV in drinking water under natural conditions. The results indicated that SODIS can contribute to reduce the risk of viral infection and supports its use as an alternative and/or emergency method of water disinfection for vulnerable communities. In the second article (ii) "Hepatitis A virus and norovirus disinfection by solar photo-Fenton systems under natural solar conditions", the effectiveness of the SODIS method, and Fenton and photo-Fenton systems for disinfection of HAV and NoV were comparatively ! xv! evaluated in water, as a possible application for the disinfection of irrigation water. Results showed that solar photo-Fenton systems can significantly reduce the viral presence and infectivity at medium temperatures and without a strong light source, highlighting these methods as a promising, environmentally sustainable and cheaper alternative to the conventional disinfection processes. ! INTRODUCCIÓN ! 3! Introducción 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Enfermedades de transmisión alimentaria. Hacia una un riesgo y una seguridad global Las enfermedades de transmisión alimentaria (ETA) constituyen uno de los problemas más serios para la salud humana en todo el mundo. A pesar de que existen más de 200 patógenos microbianos y agentes físicos o químicos causantes de transtornos tras su ingestión, son las enfermedades causadas por bacterias, virus, parásitos y priones las que concentran más esfuerzos y preocupación pública (Acheson, 1999). El cuadro clínico más común de estas enfermedades se caracteriza por síntomas gastrointestinales y diarrea. Alrededor de 2,2 millones de personas mueren cada año en el mundo debido a estas enfermedades, en su mayoría niños de países en vías de desarrollo (www.who.int/water_sanitation_health/diseases/ diarrhoea/en/). El aumento de la población humana, la creciente urbanización e industrialización y, en las últimas décadas, el gran desarrollo de un comercio alimentario cada vez más globalizado, son los factores principales que contribuyen a aumentar no sólo el número de casos, sino también su extensión y rapidez de transmisión. Otros factores que influyen en el aumento de ciertos tipos de ETA son la mejora de la logística y las condiciones de transporte, que permiten a los patógenos sobrevivir durante más tiempo en los alimentos y llegar en forma viable al consumidor. El aumento del turismo, nuevos hábitos alimentarios como el consumo de productos crudos o ligeramente cocinados, el auge de la comida rápida, la demanda de alimentos exóticos o de temporada durante todo el año, cambios en las prácticas agrícolas o incluso el cambio climático son factores que facilitan el aumento de las ETA (Newell et al., 2010; Quested et al., 2010). A esto hay que añadir que las poblaciones de estos patógenos no son estáticas y, aunque las prácticas de producción alimentaria cambian y mejoran, ciertos microorganismos son capaces de evolucionar, explotar nuevas oportunidades y generar nuevos problemas de salud pública (Tauxe et al., 2010). ! 10! Introducción y Duizer, 2004). Estos dos virus centran la atención de la presente tesis doctoral. 1.3. Virus de la Hepatitis A 1.3.1. Historia La hepatitis viral es una enfermedad conocida desde la antigüedad. Las primeras descripciones de ictericia epidémica se encuentran en la literatura china y en los trabajos de Hipócrates, que datan del s.V a.C. Durante los s. XVII y XVIII fueron frecuentes las epidemias en Europa entre la población civil y militar, sin embargo no fue hasta principios del s. XX cuando se empezó a sospechar que el agente infeccioso responsable podría ser un virus (Schmid, 2001). Durante esta época aparecieron evidencias de una segunda forma de hepatitis transmitida aparentemente a través del suero humano: la “hepatitis sérica”. El agente etiológico se denominó virus de la hepatitis B (HBV). Ésta enfermedad era claramente diferente de la “hepatitis infecciosa”, llamada hepatitis A, cuyo agente etiológico se denominó HAV (Hollinger y Emerson, 2007; Melnick, 1995; Sánchez-Tápias, 1995). Las dos enfermedades se diferenciaban claramente en el periodo de incubación (de 2 a 4 semanas en la hepatitis A y de 1 a 3 meses en la hepatitis B) y en la vía de transmisión (fecaloral en la hepatitis A y transmisión parenteral/sexual en la hepatitis B) (Hunter et al., 1997). Los primeros datos sobre las alteraciones que HAV producía en el hígado se produjeron en 1967 tras conseguir la propagación del virus en primates no humanos (Deinhardt et al., 1967). En 1973 se consiguieron visualizar por MIE las partículas víricas (Feinstone et al., 1973) y en 1979 se consiguió la multiplicación in vitro de HAV en células derivadas de hígado o riñón de mono (Provost y Hilleman, 1979). En los últimos 30 años se ha avanzado de forma espectacular en el conocimiento de la hepatitis A y su agente etiológico. Se ha conseguido clonar y secuenciar el genoma de HAV (Cohen et al., 1987a, b; Lemon et al., 1991, 1992; Linemeyer et al., 1985; Ticehurst et al., 1983), se ha estudiado su ! 11! Introducción estructura antigénica (Lemon et al., 1991), el mecanismo de replicación (Agnès et al., 1994; Bishop y Anderson, 1997a, 1997b), las mutaciones que permiten la adaptación al cultivo in vitro (Cohen et al., 1987a; Emerson et al., 1993; Graff et al., 1994; Zhang et al., 1995), y se han realizado estudios epidemiológicos (Jansen et al., 1990; Melnick, 1995; Papaevangelou, 1992; Robertson et al., 1991, 1992). La posibilidad de obtener grandes cantidades de virus en líneas celulares ha permitido la elaboración de vacunas basadas en virus inactivados y se ha evaluado su utilización para prevenir la enfermedad (Koff, 1998; Rosenthal, 1998). 1.3.2. Taxonomía y diversidad genética y antigénica HAV, clasificado dentro de la familia Picornaviridae, es el único miembro del género Hepatovirus (Minor, 1991). La familia Picornaviridae perteneciente al orden Picornavirales se compone en la actualidad de 46 especies agrupadas en 26 géneros: Aphtovirus, Aquamavirus, Avihepatovirus, Avisivirus, Cardiovirus, Cosavirus, Dicipivirus, Enterovirus, Erbovirus, Gallivirus, Hepatovirus, Hunnivirus, Kobuvirus, Megrivirus, Mischivirus, Mosavirus , Oscivirus, Parechovirus, Pasivirus, Passerivirus, Rosavirus, Salivirus, Sapelovirus, Senecavirus, Teschovirus y Tremovirus (Knowles et al., 2012; Adams et al., 2013) (Figura 1). Durante mucho tiempo se consideró a HAV como un miembro del género Enterovirus (serotipo 72) en base a sus similitudes físicas y epidemiológicas con este género. Sin embargo, las diferencias en la estructura, estabilidad, replicación y distancia genética del HAV con miembros de otros géneros dentro de la familia Picornaviridae sugirió su clasificación en un nuevo género (Palmenberg, 1989). ! 12! Introducción Tabla 1. Características de los principales virus entéricos Familia Género Especie tipo Otras especies relevantes Ac. Nucleico Tamaño del genoma (Kb) Simetría/ Morfología Tamaño (nm) Envoltura Cultivable Enfermedad Caliciviridae Norovirus Norwalk-virus Southampton virus Lordsdale virus Hawaii virus Snow Mountain virus RNAmc(+) 7,4-7,7 Icosaédrica 28-35 N N Gastroenteritis Sapovirus Sapporo virus RNAmc(+) 7,4-7,7 Icosaédrica 28-35 N N Gastroenteritis Picornaviridae Hepatovirus HAV RNAmc(+) 7,5 Icosaédrica 27-32 N Sa Inflamación del hígado. Hepatitis Enterovirus EV Poliovirus Coxsackievirus Echovirus RNAmc(+) 7,2-8,4 Icosaédrica 28-30 N Sa Poliomielitis Meningitis encefalitis Kobuvirus Aichivirus Po Kobuvirus Bo Kobuvirus RNAmc(+) 8.25 Icosaédrica 30 N S Gastroenteritis Salivirus Salivirus Klassevirus RNAmc(+) 8 Icosaédrica -- N -- Gastroenteritis Astroviridae Mamastroviridae Astrovirus RNAmc(+) 7,0-8,0 Icosaédrica 28-30 N Sa Gastroenteritis Hepeviridae Hepevirus HEV RNAmc(+) 7,2 Icosaédrica 32-34 N N Inflamación del hígado, Hepatitis Flaviviridae Flavivirus TBEV RNAmc(+) 9,5-12,5 Icosaédrica 45-60 N -- Encefalitis Coronaviridae Coronavirus Coronavirus SARS-CoV MERS-CoV RNAmc(+) 20-30 Helicoidal 80-220 S Sa Gastroenteritis Infección respiratoria Birnaviridae Picobirnavirus Picobirnavirus RNAmc(+) 4 Icosaédrica 35-40 N -- Gastroenteritis Parvoviridae Parvovirus Parvovirus DNAmc (-) 5 Icosaédrica 20-30 N N Gastroenteritis Reoviridae Rotavirus Rotavirus RNAbc 16-27 Icosaédrica 60-80 N S Gastroenteritis Adenoviridae Adenovirus Adenovirus DNAbc 28-45 Icosaédrica 70-90 N Sa Infección respiratoria, conjuntivitis, gastroenteritis a!No todas las cepas del género son cultivables. Las cepas silvestres son a menudo difíciles de cultivar ! 13! Introducción El estudio de la diversidad genética de HAV y su comparación con otros géneros se vio impulsada por la secuenciación del genoma completo de la cepa HM-175 y la utilización de regiones parciales del genoma altamente variables como la parte C-terminal de la región VP3, la parte N-terminal de la región VP1 y la región de unión VP1/VP2A (Jansen et al., 1990; Robertson et al., 1991, 1992). Mediante el análisis de la región VP1/VP2A, Robertson et al. (1992) sentaron las bases taxonómicas de HAV, estableciendo 7 genotipos distintos (I-VII), y definiendo el genotipo como un grupo de virus con más del 85 % de similitud en la secuencia nucleotídica. Los genotipos I y III se dividieron a su vez en dos subgenotipos, definiendo el concepto de subgenotipo como virus cuya secuencia no difiere en más de un 7,5 % entre sí (Nainan et al.,1991; Robertson et al., 1992; Tsarev et al., 1991). Posteriormente, Costa-Mattioli et al. (2003) han establecido relaciones filogenéticas utilizando la secuencia completa de VP1 (900 nucleótidos). Las conclusiones del trabajo determinaron que HAV se debe clasificar en 6 genotipos diferentes, 3 con origen humano (I – III) y 3 con origen en primates (IV – VI) (Figura 2). Esta es la clasificación reconocida actualmente. La secuenciación de la región VP1/VP2A sigue utilizándose, aunque también se secuencian la parte C-terminal de VP3 y la parte N-terminal de VP1 como una única región VP3-VP1 de 186 pares de bases. A pesar de las diferencias nucleotídicas entre las diferentes cepas, HAV muestra un alto grado de conservación antigénica, identificándose hasta la fecha un único serotipo causante de la infección en humanos (Lemon y Binn, 1983). Tampoco se han descrito diferencias en el transcurso de la enfermedad causada por diferentes cepas. Se postula que, a pesar de la variación genética, existen limitaciones estructurales en las proteínas de la cápside que obligan a mantener su estructura antigénica sin modificaciones. Este es el motivo por el que, tras la infección con HAV, el individuo adquiere generalmente inmunidad durante toda la vida contra posibles reinfecciones. Sin embargo, se han encontrado variantes virales con modificaciones vinculadas a sitios antigénicos. ! 14! Introducción Kobuvirus Salivirus Parechovirus Avihepatovirus Aquamavirus Fsb Hepatovirus Tremovirus Aphthovirus Erbovirus Cardiovirus Senecavirus Cosavirus Teschovirus Sapelovirus Enterovirus Figura 1: Árbol filogenético de los géneros más representativos de la familia Picornaviridae. La figura muestra la filogenia de 38 picornavirus representando la diversidad de especies de la familia. El análisis filogenético está basado en la familia de proteínas altamente conservadas 1B, 1C, 1D, 2C, 3C y 3D (Lauber y Gorbalenya, 2012). ! 15! Introducción La distribución geográfica a nivel mundial de los diferentes genotipos del HAV se muestra en la Figura 3. El genotipo I es el más prevalente en el mundo, y el subgenotipo IA más común que el IB. Ambos subgenotipos son detectados frecuentemente en Norteamérica, Sudamérica, Europa, China y Japón (Robertson et al., 1992; Costa-Mattioli et al., 2001a, 2001b). Variación nucleotídica 3% Figura 2: Clasificación genotípica y subgenotípica del HAV. La figura muestra los seis genotipos del HAV propuestos por Costa-Mattioli, 2003, y actualmente reconocidos. (Modificado a partir de Vaughan et al., 2014). ! 16! Introducción 1.3.3. Estructura y organización genómica HAV es un virus sin envoltura, sin estructuras superficiales y con un diámetro de 27-32 nm. Su cápside presenta simetría icosaédrica (Feinstone et al., 1973) (Figura 4). Tiene una densidad en cloruro de cesio de 1.33-1.34 g/mL y un coeficiente de sedimentación de 150-160 S en solución neutra de sacarosa (Ticehurst, 1983). A partir de suspensiones fecales o de cultivos infectados se han podido detectar partículas no infecciosas que podrían corresponder a proviriones inmaduros con o sin RNA (Bishop y Anderson, 1997a; Nüesch et al., 1989; Polish et al., 1999). El genoma viral está constituido por RNA monocatenario (mc) lineal de polaridad positiva (+) de unas 7,5 kilobases (Kb). A diferencia de muchos virus Figura 3: Distribución geográfica de los genotipos de HAV. Los genotipos aislados a partir de humanos están representados en negro y los genotipos aislados a partir de monos están representados en rojo. El genotipo IIIA asilado en primates autóctonos de Panamá está representado en verde (Cristina y Costa-Mattioli, 2007). ! 17! Introducción RNA, el genoma del HAV está altamente conservado, con una variación promedio de sólo 1-4 % (Cromeans et al., 2001). En la organización genómica de HAV se diferencian tres regiones (Figura 4): • Región no codificante (NCR, del inglés Non Coding Region) del extremo 5’. Es la región más conservada del genoma, con más de un 92 % de similitud entre las diferentes cepas (Hollinger y Emerson, 2007). El extremo 5’ NCR ORF IRES 5’NCR 3’NCR P1 P2 P3 VPg (3B) 1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3A 3B 3C 3D AAAAA Proteínas estructurales Proteínas no estructurales ★ VP1 2A VP3 VP4 VP2 2B 2C 3A 3B 3Cpro 3Dpol VP4 VP2 VP3 VP1 2A VP4 VP2 VP3 VP1 2A ★ ! ! ! ! ! ! ! ! Figura 4: Representación esquemática de la estructura y organización genómica del HAV. El genoma está compuesto por una cadena de RNA de polaridad positiva que contiene una pauta de lectura abierta (ORF) que codifica para una poliproteína procesable por la proteasa viral 3Cpro . La poliproteína es autoprocesada por la proteasa viral 3Cpro en todos los sitios de escisión ( ), con la excepción de dos divisiones hechas por proteasas distintas de la 3Cpro viral: una proteasa celular todavía por identificar ( ), que libera el fragmento 2A de la cápside, y una actividad proteolítica desconocida (), que participa en el último proceso de maduración de la cápside. NCR, Región No Codificante. IRES, Sitio Interno de Entrada del Ribosoma (modificado de Pintó et al., 2012). ! 18! Introducción representa un 10 % del genoma y se encuentra unido covalentemente a la proteína VPg (del inglés Viral Protein Genome linked). Esta región contiene el Sitio Interno de Entrada Ribosomal (IRES, del inglés Internal Ribosome Entry Site), una secuencia nucleotídica que permite el inicio de la traducción de proteínas. • Región no codificante del extremo 3’. El extremo 3’NCR tiene un tamaño mucho menor que el extremo 5’NCR y está poliadenilado. Es una región altamente variable entre cepas y con una estructura secundaria marcada. • Región codificante. Entre los dos extremos no codificantes se encuentra una única pauta de lectura abierta (ORF, del inglés Open Reading Frame) que codifica la poliproteína (P0) de aproximadamente 250 KDa. La ORF se encuentra dividida en tres regiones: P1, P2 y P3, procesadas a partir de la poliproteína P0. La región P1, dividida a su vez en 1A, 1B, 1C y 1D, codifica para proteínas estructurales o de la cápside VP4, VP2, VP3 y VP1, respectivamente. Las regiones P2 y P3 codifican para las proteínas no estructurales implicadas en la replicación (2A, 2B, 2C y 3A, 3B, 3C, 3D). Las proteínas 2B, 2C, 3A y 3B constituyen el complejo proteico VPg, cuya función se cree que es servir como cebador para la síntesis de RNA. La proteína 3Cpro es una proteasa responsable de la mayor parte del procesado posttranscripcional de la poliproteína P0 y la proteína 3Dpol, es una RNA polimerasa RNA dependiente (Cristina y Costa-Mattioli, 2007). 1.3.4. Replicación viral Una vez que HAV entra en contacto con la célula diana mediante un receptor de membrana especifico, el genoma viral se libera en el citoplasma celular e involucra la liberación de la proteína VP4 y la separación del RNA de la cápside, proceso denominado descapsidación (Bishop y Anderson, 1997a, b; Racaniello, 2001). A continuación comienza la replicación viral. El RNA (+) actúa como RNA mensajero (RNAm), uniéndose a los ribosomas de la célula y comenzando la traducción proteica. ! 19! Introducción La poliproteína P0 es procesada por la proteasa 3Cpro de forma simultanea a la traducción del RNA. El procesado proteolítico, comienza con el corte de la poliproteína y ocurre en la región de unión 2A/2B (Martin et al., 1995). El segmento formado por las proteínas no estructurales 2B-3D (incluyendo la proteasa 3Cpro y la polimerasa 3Dpol), es liberado a partir de los dominios P2 y P3 de la poliproteína, formando un complejo macromolecular replicativo que comienza la síntesis de nuevo RNA viral. Esto ocurre en las membranas del retículo endoplasmático de la célula (Gosert et al., 2000). El precursor estructural P1 es cortado de nuevo generando dos precursores de las proteínas de la cápside, VP0 y VP1-2A (Anderson y Ross, 1990). Mientras que VP0 es procesada por la proteasa 3Cpro (generando las proteínas VP4, VP3 y VP2), el caso de VP1-2A es distinto. La proteína 2A, que en otros picornavirus posee actividad proteolítica, en el caso del HAV es una extensión de la proteína estructural VP1 que actúa como señal primaria para el ensamblaje de la partícula viral. Durante la maduración de la cápside, 2A es eliminada por una proteína desconocida de la célula hospedadora (Morace et al., 2008) (Figura 4). Cuando el complejo replicativo está formado, el RNA viral es utilizado como molde para la replicación, la cual tiene lugar en dirección opuesta a la traducción (Gamarnik y Andino, 1998). Además de las proteínas virales, es necesaria la formación de los elementos de replicación en cis. Tras la traducción de las proteínas virales, la formación del complejo replicativo y de los elementos de replicación en cis, y la replicación del genoma viral, tiene lugar la encapsidación, maduración y liberación de las partículas virales a través de la membrana celular sin provocar un efecto citopático (ECP) acusado (Molla et al., 1991). La mayoría de picornavirus tienen cuatro polipéptidos en la cápside, incluida la proteína VP4 de pequeño tamaño localizada la parte N-terminal de la poliproteína. La poliproteína de HAV parece tener un polipéptido VP4 de un tamaño mucho menor que la mayoría de picornavirus. Además, en el resto de virus de esta familia ocurre una miristilación en VP4 importante para la morfogénesis del virión (Tesar et al., 1993) que no ocurre en el caso de HAV. ! 26! Introducción aguas residuales, sedimentos marinos y moluscos bivalvos (Hollinger y Emerson, 2007; Sobsey et al., 1988). HAV es resistente al calor, reteniendo su integridad e infectividad tras un tratamiento a 60 ºC a pH neutro durante 60 minutos. El virus se inactiva parcialmente tras 10-12 h a 56 ºC. Su resistencia al calor es mayor cuando se encuentra en alimentos, especialmente cuando se encuentra internalizado en los tejidos o matrices alimentarias, que le ofrecen protección (Hollinger y Emerson, 2007; Le Guyader y Atmar, 2008). Bajo refrigeración y condiciones de congelación los virus permanecen intactos e infecciosos durante varios años. Es también resistente al secado, permaneciendo infeccioso durante más de un mes a 25 ºC y 42 % de humedad y mostrando incluso mayor resistencia en condiciones de baja humedad y temperatura (McCaustland et al., 1982). Es capaz de sobrevivir en las manos de humanos y en fómites durante largos periodos (Mbithi et al., 1992). Estas características facilitan su transmisión por contacto persona a persona y a través de agua y alimentos contaminados. El virus es estable a pH 1 y sobrevive a un marinado ácido a pH 3,75 en mejillones durante al menos 4 semanas (Hollinger y Emerson, 2007; Hewitt and Greening, 2004). Aunque su infectividad decrece entre 2 y 5 log tras la su exposición a alcohol al 70 % durante 3 minutos, es resistente a varios disolventes incluyendo cloroformo, freón, éter al 20 %, o triclorofluoroetano (Hollinger y Emerson, 2007; Provost y Hilleman, 1979, Scholz et al., 1989). HAV no se inactiva con cloramina-T (1g/L durante 15 min a 20ºC) o ácido percloroacético (300 mg/L durante 15 min a 20 ºC) (Hollinger y Emerson, 2007). La irradiación gamma no es efectiva para su inactivación en frutas y verduras frescas (Bidawid et al., 2000), pero sí se inactiva mediante alta presión hidrostática (HHP, del inglés High Hydrostatic Pressure). La presión hidrostática utilizada actualmente como método de preservación isotérmico para alimentos perecederos, inactiva el HAV tras 5 minutos de exposición a 450 MPa (Kingsley et al., 2002a). ! 27! Introducción 1.3.9. Cultivo celular Algunas cepas de HAV pueden ser cultivadas en diferentes líneas celulares de primates incluyendo: células de riñón del mono verde africano (BSC-1), células de riñón de macaco (FRhK-4 y FRhK-6) y fibroblastos humanos. Las cepas salvajes son difíciles de cultivar y generalmente no producen ECP en cultivo celular. Debido a la ausencia de ECP, también se suele utilizar la inmunofluorescencia para la detección del antígeno del HAV en células infectadas. El virus tiene un crecimiento lento, y su rendimiento en cultivo celular es más bajo que otros picornavirus. Como consecuencia, el virus es difícil de identificar en muestras clínicas, alimento o muestras ambientales sólo mediante cultivo. Bajo condiciones normales el virus requiere tres semanas para su crecimiento in vitro. Sin embargo, mediante mutaciones se ha adaptado alguna cepa, como la HM-175, para una mejor replicación y la producción de un ECP más claro (Brack et al., 1998) y han sido extensivamente utilizadas en investigación. Estas cepas requieren menos tiempo para su cultivo in vitro y producen un ECP visible. Las técnicas moleculares como la PCR han llegado a ser el método preferente para la detección de virus en muestras no humanas (ver sección 1.5), mientras que el diagnóstico clínico suele estar basado en la respuesta inmune del paciente. 1.4. Norovirus 1.4.1. Historia En 1929, Zahorsky describe por primera vez una enfermedad denominada como “hemis -hiperémesis” o “enfermedad de los vómitos de invierno” (del inglés, Winter vomiting disease), caracterizada por una diarrea auto-limitada acompañada de náuseas, vómitos y dolor abdominal, típica de los meses de invierno (Zahorsky, 1929). Durante las cuatro décadas siguientes se documentaron múltiples brotes de enfermedades que coincidían clínica y epidemiológicamente con la descrita por Zahorsky (Cumming y McEvedy, 1969; Foley y Chin, 1959; Hopkins, 1958; ! 28! Introducción Ingalls y Britten, 1951; Miller y Raven, 1936; Riemann et al., 1945; Smillie et al., 1948; Levitt et al., 1970), realizándose, de manera infructuosa, numerosos intentos con el fin de cultivar in vitro el virus, así como estudios de infección con voluntarios para caracterizar el agente etiológico de la enfermedad (Blacklow et al., 1972; Clarke et al., 1972; Gordon, 1955; Gordon et al., 1947; Jordan et al., 1953; Kojima et al., 1948). Sin embargo, el agente causal no fue identificado hasta 1972, cuando Kapikian et al. visualizaron mediante MIE partículas virales en las heces de voluntarios inoculados con filtrados fecales procedentes de un grupo de estudiantes de una escuela de primaria en Norwalk (Ohio, Estados Unidos) que habían padecido un brote de gastroenteritis en 1968 (Kapikian et al., 1972). Observaron unas partículas víricas pequeñas y de aspecto redondeado, a las que denominaron virus Norwalk, considerado actualmente como el prototipo del género NoV. Desde la década de los 70, este tipo de virus eran conocidos como "Virus tipo Norwalk” (NLV, del inglés Norwalk-Like Virus) o “Virus pequeños de estructura redonda” (SRSV, del inglés Small Round Structure Viruses). Los primeros nombres de estos virus se determinaron por la ubicación en donde se detectó cada cepa (Norwalk, Hawaii) o por su apariencia física al visualizarlos por ME. El virus Norwalk fue el primer virus detectado que se asoció específicamente a casos de gastroenteritis aguda. En 1978 se produce en Australia, uno de los primeros brotes registrados de NoV de origen alimentario, asociado con el consumo de ostras (Murphy et al., 1979; Grohmann et al., 1980). Sin embargo, durante décadas, el estudio de su papel como agente causal de enfermedad se ha visto obstaculizada por la falta de sensibilidad de las técnicas de diagnóstico clásico y la imposibilidad de su cultivo celular. La clonación y secuenciación del genoma del virus Norwalk a principios de la década de los 90 (Xi et al., 1990) supuso un gran avance en el conocimiento de su estructura molecular, cambiando la comprensión de su importancia clínica y epidemiológica, y permitiendo el desarrollo de pruebas de diagnóstico. Su caracterización inicial situó al virus Norwalk como miembro de la familia Caliciviridae, dentro del género Norovirus. ! 29! Introducción 1.4.2. Taxonomía y diversidad genética y antigénica El género Norovirus, se clasifica dentro de la familia Caliciviridae, compuesta por 5 géneros (Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus y Nebovirus) (Clarke et al., 2012) (Figura 7). La familia Caliciviridae fue propuesta en el año 1974. Hasta entonces, los calicivirus constituían un género dentro de la familia Picornaviridae (Barry et al., 2008). Sin embargo, las diferencias morfológicas, como el tamaño o la densidad de la partícula viral, la composición de la cápside y el proceso de replicación, condujo a su clasificación dentro de una familia distinta (Burroughs y Brown, 1974). Históricamente, los análisis de reactividad cruzada mediante MIE en experimentos de infección con voluntarios fueron la base para la clasificación de NoV (Green et al., 1995; Lewis et al., 1995; Okada et al., 1990; Wyatt et al., 1974). Sin embargo, estas clasificaciones antigénicas resultaban muy poco precisas debido principalmente a reacciones cruzadas entre los anticuerpos (Ando et al., 2000). El serotipado directo de NoV mediante sero-neutralización todavía no es una técnica aplicable (Duizer et al., 2004) debido a la imposibilidad de cultivo de NoV, por lo que son la RTPCR y la secuenciación genómica las principales técnicas empleadas para la caracterización y la comprensión de las relaciones existentes entre las distintas cepas (Ando et al., 2000; Katayama et al., 2002). Actualmente, la caracterización de NoV se realiza en base a cuatro regiones del genoma, todas ellas conservadas. Estas regiones son la región A (el gen de la RdRp localizado en la ORF1), la región B (extremo 3’ de la ORF1), la región C (un fragmento corto próximo al extremo 5’ de la ORF2) y la región D (extremo 3’ de la ORF2) (Ando et al., 2000; Vinjé et al., 2004). El género NoV presenta una elevada variabilidad genética consecuencia de mutaciones puntuales y procesos de recombinación entre cepas durante la coinfección en una misma célula. Numerosos estudios establecen que la secuencia del gen de la cápside varía hasta en un 60 % entre los distintos genogrupos y hasta en un 57 % en los NoV humanos (Green et al., 1995; Katayama et al., ! 30! Introducción 2002; Vinjé et al., 2000). Este nivel de diversidad es mucho mayor que el de otros virus RNA de cadena sencilla, lo que sugiere que NoV evoluciona más rápidamente. A pesar de esto, la dinámica evolutiva de NoV sigue siendo en gran medida desconocida (Zheng et al., 2006) Con el fin de establecer un sistema de clasificación estándar para NoV, Zheng et al. (2006) realizaron un estudio filogenético detallado en base a la secuencia completa de la ORF2. La elección de esta región se debió a que, dado que codifica para la proteína estructural VP1 que contiene receptores celulares y determinantes inmunológicos, podría relacionar serotipos y fenotipos virales. Norovirus Lagovirus Nebovirus Vesivirus Sapovirus 0,1 Figura 7: Árbol filogenético de la familia Caliciviridae construido a partir del análisis de la región codificante para la RNA polimerasa RNA dependiente (RdRp). Modificado de Simmonds et al., 2008). ! 31! Introducción Además, es una región de una longitud suficiente como para permitir una adecuada diferenciación entre cepas. La clonación del genoma de NoV, además de la ya mencionada aplicación en las técnicas moleculares como la RT-PCR, permitió expresar in vitro proteínas víricas en sistemas de expresión procariotas y eucariotas. Basándose en estas técnicas, se han clasificado los NoV en cinco genogrupos (GI-GV) con 32 genotipos, definidos por tener al menos un 80 % de identidad sobre la secuencia total de la cápside (Ando et al., 2000; Zheng et al., 2006) (Figura 8). Las cepas pertenecientes a los genogrupo GI, GII y GIV infectan a los seres humanos, mientras que las pertenecientes a los genogrupos GIII y GV infectan animales. Los genogrupos I y II son los más diversos, contando con 8 y 19 genotipos distintos, respectivamente (Zheng et al., 2006, 2010). Dentro del GII, además de las cepas humanas existen 3 genotipos porcinos. Dentro del GIV, GI GII GIII GIV GV 10 cambios/100 residuos Figura 8: Árbol filogenético de los diferentes genogrupos de NoV construido en base a la secuencia completa de la proteína de la cápside. (Modificado de Martella et al., 2007) ! 32! Introducción junto con las cepas humanas, existe un genotipo que infecta al león (Martella et al., 2007). El GIII incluye cepas bovinas, clasificadas en dos genotipos distintos. El GV consta de un único genotipo murino (Zheng et al., 2006). La cepa de origen murino, MNV-1, es el único NoV capaz de crecer en cultivo celular (Karst et al., 2003). Recientemente, se ha propuesto un nuevo genogrupo (GVI) con una única cepa de origen canino (Mesquita et al., 2010). 1.4.3. Estructura y organización genómica NoV es un virus sin envoltura con simetría icosaédrica y un diámetro entre 27 y 30 nm. El genoma viral consiste en una molécula lineal de RNAmc (+) de entre 7,3 y 8,3 Kb, y un contenido de guanina-citosina (G+C) entre el 45 y el 56 % (van der Poel, 2000). El genoma viral se organiza en: • El extremo 5’NCR, a la que se encuentra covalentemente unida la proteína VPg, la cual tiene un papel fundamental en la infectividad y en el comienzo de la traducción. • El extremo 3’NCR del genoma se encuentra poliadenilado. La función de esta cola de poli A es dar estabilidad a la molécula de RNA y ayudar a la traducción (Cubitt et al., 2003). • La región codificante está formada por tres pautas abiertas de lectura (ORF1, ORF2 y ORF3), que codifican los genes estructurales y no estructurales (Green, et al., 2001). La ORF1, situada en el extremo 5’, codifica una poliproteína de 194 KiloDaltons (KDa) que es escindida por la proteasa viral 3CLpro en 6 proteínas no estructurales, implicadas en la replicación y transcripción viral: (i) la proteína N-terminal (N) de 37 KDa, (ii) una nucleótido trifosfatasa (NTPasa) de 40 KDa, (iii) la proteína p22 de 20,2 KDa, (iv) la proteína VPg de 15,8 KDa, (v) una proteasa (3CLPro) de 19,3 KDa y (vi) una RdRp (Pol) de 56,8 KDa (Belliot et al., 2003). ! 33! Introducción La ORF2, codifica la proteína principal de la cápside (VP1), de un tamaño de 60 KDa. La estructura atómica de esta proteína, determinada mediante cristalografía de rayos X, consta de (i) un dominio protuberante (P), dividido a su vez en dos subdominios, P1 y P2, y (ii) un dominio cubierta (S) (del inglés Shell). El dominio S, altamente conservado, constituye la región más interna de la cápside que envuelve al genoma viral. El dominio P, unido al S, forma las protuberancias de estructura arqueada que surgen de la cubierta y es de naturaleza más variable. El subdominio P1, moderadamente conservado, es una región de unión entre S y P2. El subdominio P2, se sitúa en la superficie del virus y es codificado por la región más variable del genoma (Chakravarty et al., 2005; Tan y Jiang, 2010), posee receptores para la unión a la célula hospedadora, por lo que se considera responsable de la antigenicidad viral (Figura 9). La ORF3, es una región variable del genoma que codifica para una proteína estructural (VP2) de 23 KDa. La función de esta proteína se asocia con la regulación de la expresión en cis de VP1 y la estabilización de la estructura viral (Bertolotti-Ciarlet et al., 2003) (Figura 9). La autoordenación de la proteína VP1 en pseudo-partículas virales (VLP, del inglés Virus-Like Particles) es un proceso eficiente que no requiere ni del RNA ni de la proteína menor VP2. La cápside viral está compuesta por 90 dímeros de la VP1 que se disponen formando una cubierta de la cuál salen 90 capsómeros a modo de protuberancias y dispuestos de tal manera que forman 32 cavidades en la superficie de la partícula viral. ! 34! Introducción 1.4.4. Replicación viral La replicación tiene lugar en el citoplasma de los enterocitos, previa interacción entre el virus y la célula huésped, mediante receptores específicos y la liberación del genoma viral en el citoplasma celular. Estas primeras interacciones no se conocen en detalle, pero se sabe que el reconocimiento del receptor es esencial para el ciclo infectivo de NoV. El genoma viral, de sentido positivo, juega a su vez el papel de RNAm. La polimerasa RdRp utiliza el genoma viral como molde para la síntesis de una hebra de RNA ORF 5’NCR 3’NCR ORF1 ORF2 VPg p48 NTPasa p22 VPg Pol AAAAA Proteínas no estructurales Proteínas estructurales ORF3 3CLPro VP1 VP2 Cápside P1 P2 S N P1 Dominio S Dímero Monómero a a a Dominio P2 Dominio P1 Región N-terminal ★ ★ ★ ★ ★ Figura 9: Representación esquemática de la estructura viral y organización genómica de NoV. El genoma se divide en tres pautas abiertas de lectura: ORF1, 2 y 3. ORF1 codifica las proteínas no estructurales: p48, NTPasa, p22, VPg, 3CLPro y Pol. Los sitios de escisión de la proteasa se indican mediante estrellas. La ORF2 codifica la cápside viral (VP1) y la ORF3 codifica una proteína estructural menor (VP2). Las proteínas VP1 y VP2 vienen codificadas a partir de un ARN subgenómico unido a VPg. En la ORF2, N es el brazo N- terminal (verde) y S se refiere a la región interior, la parte más conservada de la cápside (amarillo). El dominio P, dividido en P1 y P2 (azul y rojo, respectivamente) conforma la superficie del virus, de la que P2 es su dominio más variable y expuesto (Modificado de Donaldson et al., 2010) . ! 35! Introducción complementaria de sentido negativo, la cual será transcrita en más copias de genoma RNA (+) que a su vez servirán para codificar la síntesis de las proteínas estructurales VP1 y VP2 empezando por el extremo 3’ de la hebra de RNA (+) y con implicación de proteínas celulares (Gutierrez-Escolano et al., 2003). La traducción inicial del genoma viral está mediada por interacciones entre la proteína VPg, ligada al genoma, con los mecanismos de traducción celular. El RNA se une a los ribosomas celulares y comienza la traducción proteica. La ORF1 es traducida en una poliproteína que será digerida por la proteasa vírica 3CLPro para dar lugar a otras seis proteínas: p48, NTPasa, VPg (que se une al final 5’ para iniciar la traducción), una polimerasa RpRd y la propia 3CLPro. Dichas proteínas no estructurales intervienen en los procesos de copia del RNA(+) a RNA(-) que será utilizado como cadena molde para generar un RNA subgenómico (+) de unas 2,8 Kb. Éste RNA subgenómico será traducido para producir la proteína mayoritaria de la cápside (VP1) y unas cuantas moléculas de la proteína secundaria de la cápside (VP2), que finalmente se autoensamblarán generando las partículas virales. La ausencia de actividad correctora en la polimerasa produce una tasa de error relativamente alta durante la transcripción. Esta es la causa de que NoV, al igual que otros virus RNA, sean genéticamente muy diversos y altamente adaptables a diferentes condiciones. 1.4.5. Cuadro clínico e inmunidad Los síntomas descritos para la gastroenteritis asociada a la infección con NoV incluyen náuseas (79 %), vómitos (69 %), diarrea (66 %), fiebre leve (37 %), escalofríos (32 %), dolor abdominal (30 %), mialgias (26 %) y cefalea (22 %) (Kaplan et al., 1982). Las heces no suelen presentar sangre ni moco. El período de incubación promedio es de 24 a 48 horas (periodo en que la trasmisión es máxima), y los síntomas se suelen resolver en 12-72 horas (Kaplan et al., 1982), a pesar de que, en algunos casos, su duración pueden alargarse, principalmente en ancianos, niños o individuos inmunocomprometidos (Lopman et al., 2004a; Murata et al., 2007). En los ! 42! Introducción Tabla 2: Diferentes perfiles de unión de diferentes cepas de NoV a los HBGA. +, Unión; N, No unión; NE, No ensayado Existe una variedad de factores que contribuyen a la alta capacidad de transmisión de NoV. Entre ellos está la alta estabilidad en el medio ambiente y resistencia a diferentes agentes físicos y químicos (Duizer et al., 2004), la baja dosis infectiva requerida para una infección sintomática (10 patículas virales o incluso menos) (Teunis et al., 2008), así como su acumulación y liberación prolongada en el tiempo (más de tres semanas después de la resolución de los síntomas) y en un elevado número de partículas virales en las heces (105-109 Cepa Genogrupo/ genotipo A B H1 H2 H3 Lea Leb Lex Ley Referencia Norwalk I.1 + + + + + (Huang et al., 2005) GI.1 1968 I.1 + + + (Lindesmith et al., 2010) GI.1 2001 I.1 + + + (Lindesmith et al., 2010) GI.2 1999 I.2 + + + (Lindesmith et al., 2010) Desert Shield I.3 N N N N N N N N N (Shirato, 2011) GI.3 1999 I.3 + (Lindesmith et al., 2010) VA115 I.3 N N N N N N N N N (Shirato, 2011) GI.4 2000 I.4 + + + (Lindesmith et al., 2010) Boxer I.8 + + (Huang et al., 2005) Hawaii II.1 + + + (Huang et al., 2005) Snow Mountain II.2 + + NE NE (Tan and Jiang, 2007) BUDS II.2 + + (Huang et al., 2005) Mexico II.3 + + + (Huang et al., 2005) GII.3 TV II.3 + + (Cannon et al., 2009) VA387 II.4 + + + + + + (Huang et al., 2005) Grimsby II.4 + + + + + + (Tan and Jiang, 2007) GII.4 1987 II.4 + + (Lindesmith et al., 2008) GII.4 1997 II.4 + + + + + (Lindesmith et al., 2008) GII.4 2002 II.4 + + (Lindesmith et al., 2008) GII.4 2002a II.4 + + + (Lindesmith et al., 2008) GII.4 2004 II.4 N N N N N N N N N (Lindesmith et al., 2008) GII.4 2005 II.4 N N N N N N N N N (Lindesmith et al., 2008) GII.4 2006 II.4 + + + (Cannon et al., 2009) MOH II.5 + + (Huang et al., 2005) VA207 II.9 + + (Huang et al., 2005) Paris island II.13 + + + (Huang et al., 2005) OIF II.16 + (Huang et al., 2005) ! ! 43! Introducción partículas/g de heces). Todos estos factores aumentan el riesgo de diseminación secundaria, sobretodo debido a una inadecuada manipulación alimentaria (Evans et al., 2002; Kirkwood y Streitberg, 2008; Marks et al., 2003; Parashar et al., 2001; Patel et al., 2009). Generalmente, la capacidad de infección mediante transmisión directa se mantiene, como promedio, sólo un día. Sin embargo, la larga duración de la secreción viral en las heces aumenta la capacidad de infección mediante transmisión ambiental (Lopman et al., 2012). Su alta diversidad antigénica (Zheng et al., 2006), y la ausencia de una inmunidad a largo plazo (Parrino et al., 1977), conducen a muchas reinfecciones a partir de la misma o diferentes cepas de NoV y a la dificutad de desarrollar vacunas efectivas. Los datos epidemiológicos indican que existen diferencias entre genogrupos en lo que respecta a sus vías de transmisión (Kroneman et al., 2008; Nordgren et al., 2009). Las cepas del GII suelen asociarse a casos con una transmisión mediante contacto persona-persona, mientras que las cepas de GI muestran una mayor prevalencia en los brotes de transmisión por agua y alimentos (Kroneman et al., 2008; Verhoef et al., 2010). Los estudios parecen indicar que esto es debido a una mayor resistencia de las cepas del GI frente a factores ambientales, favoreciendo su persistencia ambiental más a largo plazo (da Silva et al., 2007; Nordgren et al., 2009). En general, todas estas características hacen de NoV un patógeno con una alta capacidad de transmisión. De hecho, está considerado un agente de uso potencial en bioterrorismo de categoría B, según el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de EEUU (NIAID, del inglés National Institute of Allergy and Infectious Disease). 1.4.9. Estabilidad físico-química La ausencia de un ensayo de infectividad para NoV ha lastrado desde su descubrimiento una adecuada evaluación de su resistencia a diferentes agentes desinfectantes y características de supervivencia, pudiendo evaluar su infectividad solo mediante estudios de dosis-respuesta en experimentos con voluntarios. Esto ha dirigido los esfuerzos hacia el estudio de otros géneros, ! 44! Introducción como modelo de NoV humanos, que tienen similitudes estructurales o genéticas y que son fácilmente cultivables dentro de la familia Caliciviridae, incluyendo el calicivirus felino (FCV) o el norovirus murino (MNV) (Dolin et al., 1971; Green et al., 2001). En lo que respecta estrictamente a NoV, los estudios indican una amplia resistencia a la temperatura, pH y condiciones ambientales. Estudios en humanos indican que puede mantenerse infectivo tras someterse a 60ºC durante 30 min. La infectividad de NoV se mantuvo tras 3 horas a pH 2,7 a temperatura ambiente o tratándolo con éter al 20 % a 4 ºC durante 18 h (Dolin et al., 1971; Green et al., 2001). Keswick et al. (1985) describieron la resistencia a la desinfección por cloro libre en voluntarios después de una dosis de 3,75 mg/L de cloro libre durante 30 min, mientras que PV y RV se inactivaron completamente bajo las mismas condiciones. Duizer et al. (2004), detectaron mediante RT-PCR RNA viral de NoV GII.4 después de un tratamiento de 3.000 mg/L de cloro libre y 10 minutos de tiempo de contacto. Teniendo en cuenta los tratamientos de cloración comunes (1 mg/L de concentración media de cloro libre y 60 minutos de tiempo de contacto medio en EEUU), estos resultados implican un elevado riesgo de gastroenteritis por NoV a través del el agua potable clorada (AWWA, 2000; Payment et al., 1991; White, 1999). Sin embargo, el virus es inactivado tras el tratamiento con 10 mg/L de cloro, que es la concentración aplicada en los suministros tras un evento de contaminación (Green et al., 2001). 1.4.10. Cultivo celular Hasta la fecha todos los intentos para propagar las cepas humanas de NoV han sido infructuosos. Se han evaluado más de 26 líneas celulares diferentes combinadas con una variedad de medios de cultivo y condiciones de crecimiento pero sin obtener ECP o replicación (Duizer et al., 2004). Recientemente se ha conseguido mediante un cultivo tridimensional un pase in vitro con éxito tanto de GI como de GII (Straub et al., 2007), aunque este trabajo no ha vuelto a ser confirmado por otros laboratorios. ! 45! Introducción Se han realizado grandes avances gracias al crecimiento en cultivo celular de la cepa MNV, que actualmente está considerada como el mejor modelo de NoV humano (Wobus et al., 2004). Aunque no existe tampoco un modelo animal para NoV, sí se ha documentado la replicación de cepas humanas en primates no humanos y cerdos (Cheetham et al., 2006; Rockx et al., 2005; Subekti et al., 2002). La ausencia de un cultivo in vitro para NoV también ha impedido el desarrollo de las técnicas tradicionales inmunológicas y serológicas, debido a la falta de antígenos necesarios para la producción de anticuerpos. 1.5. Detección de HAV y NoV en alimentos Hasta la introducción de los métodos moleculares los virus entéricos eran identificados principalmente por ME. Los avances metodológicos (básicamente de tipo molecular como la RT-PCR y secuenciación) para la detección de virus entéricos no cultivables como NoV o de difícil cultivo (HAV, AsV, AdV, RV) han clarificado en los últimos años el papel que juegan ciertos alimentos en la transmisión de estos virus y su alta prevalencia en el medio ambiente. Estos métodos moleculares son actualmente los más empleados para la identificación de virus entéricos en alimentos aunque otros como la técnica de ELISA, el radio-inmunoensayo (RIA) y el cultivo celular (para los virus cultivables) siguen utilizándose. La ventaja de los métodos basados en el cultivo celular es que pueden ser tanto cuantitativos como cualitativos, generando resultados no ambiguos con respecto a la presencia viral y su infectividad. Incluso cuando un brote viral esta ligado epidemiológicamente al consumo de un determinado alimento, la carencia de métodos de detección sensibles y fiables complica la confirmación. Los ensayos de infectividad no son, a día de hoy, un método útil para la detección de HAV y NoV. En relación a las técnicas inmunológicas empleadas en el diagnóstico clínico de HAV, estas están enfocadas a la detección de anticuerpos anti-HAV generados por la infección viral, principalmente Ig-M e Ig-G (Nainan et al., 2005, 2006), mientras que la detección de antígenos (Ag) ! 46! Introducción es poco común. A pesar de que existen este tipo de sistemas para la detección de NoV en muestras fecales (Atmar y Estes, 2001), la sensibilidad incluso de los kits para la detección del Ag no es lo suficientemente alta para ser empleados en escenarios con poca concentración viral, como ocurre con los alimentos. Todo esto hace de las técnicas de amplificación genómica la mejor opción para el desarrollo de protocolos de detección viral de alta sensibilidad. La RT-PCR convencional es la técnica más común para la detección viral en alimentos. En los últimos años, ha habido también un gran avance gracias a la RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) que, mediante sondas fluorescentes, permite no solo la detección sino también la cuantificación. De hecho, se ha desarrollado recientemente un método estándar basado en RT-qPCR para la detección y cuantificación de NoV y HAV en productos alimenticios, con vistas a ser incorporada a la legislación europea como método de referencia (ISO/TS 15216). Tanto HAV como NoV son virus RNA que desarrollan complejas poblaciones de genomas mutantes o cuasi especies gracias a la alta tasa de error de sus polimerasas durante la replicación (Domingo y Holland, 1997). Debido a esto, el primer paso para el diseño de un ensayo de RT-PCR es a selección de cebadores y sondas altamente conservados. Las regiones de RNA que contienen complejas estructuras multidominio, la mayoría involucradas en la traducción y/o replicación suelen ser regiones altamente conservadas (Ehrenfeld y Teterina, 2002; Paul, 2002). Como todos los picornavirus, HAV contiene este tipo de regiones en los extremos finales 5’ NCR y 3’ NCR de su genoma (Pöyry et al., 1992). La traducción en los picornavirus es “cap-independentiente” (no depende de la metilación de la guanina del extremo 5’ del RNAm para la iniciación de la traducción) y el reclutamiento de la maquinaria traduccional tiene lugar en el IRES, sitio contenido en la región 5’NCR. Esta región es particularmente adecuada como secuencia diana de amplificación en ensayos diagnósticos (Costafreda et al., 2006; Costa-Mattioli et al., 2003; Jothikumar et al., 2005). Sin embargo, los calicivirus carecen de una región 5’NCR, y en particular de un IRES en su ! 47! Introducción genoma, y por otro lado las regiones 3’NCR presentan problemas de longitud de secuencia para su utilización. Como consecuencia, para el caso de NoV se requieren métodos que incluyan varios conjuntos de sondas y cebadores para poder abarcar la diversidad de estos virus y no es suficiente un único ensayo (Atmar y Estes, 2001; Vinjé et al., 2003). Una alternativa a estos sistemas múltiples de sondas y cebadores es el diseño de una pareja de cebadores y sonda que incluya codones para la metionina y el triptófano (familias de aminoácidos de codón único), debido a que cualquier mutación en estos sitios sería no sinónima y por tanto menos propensa a suceder. Estudios recientes han demostrado la presencia de regiones de relativamente alto grado de conservación en la región de unión 3’ORF1 y 5’ORF2 (Figura 11). Esta región se utiliza actualmente de manera habitual como zona diana para la amplificación por RT-qPCR (Kageyama et al., 2003; Loisy et al., 2005a). AUG A Genogrupo I Genogrupo II Posición nucleotídica Posición nucleotídica Similitud Similitud Región altamente conservada Región altamente conservada ORF1 ORF1 ORF2 ORF3 ORF2 ORF3 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 B C 0,5 1,0 0,5 1,0 Figura 11: (A) Estructura secundaria de la 5’NCR de la cepa HM-175 de HAV (Modificado de Brown et al., 1994). (B y C) Análisis de la variabilidad del genoma completo de NoV GI (B) y GII (C). La similitud media dentro de cada genogrupo se representa en línea de puntos (Modificado de Kageyama et al., 2003) ! 48! Introducción Estos métodos de detección no proporcionan resultados a nivel de genotipo. Para el genotipado de NoV, los sistemas están basados en análisis de secuencia de las regiones de la polimerasa y la cápside previo ensayo de RT-PCR convencional (Vinjé et al., 2003, 2004). Para HAV la región más ampliamente utilizada para el genotipado es la región 2A N-terminal, la cual está incluida en un fragmento más largo correspondiente a la región de unión VP1-VP2A. Sin embargo, también se ha sugerido que el análisis de la región VP1 entera mejoraría la discriminación entre genotipos (Costa-Mattioli et al., 2003). Junto a la elección del sistema de amplificación, otro punto clave en la detección de virus entéricos en alimentos y otras matrices, es la elección de un control del proceso de extracción del RNA viral. Desde un punto de vista puramente estructural, las partículas virales con simetría T=3 de aproximadamente 30 nm de diámetro parecen ser las más apropiadas, como los colifagos MS2 (familia Leviviridae), ampliamente utilizados como sustitutos o modelos de virus entéricos. Sin embargo, en el caso de MS2, además de que pueden estar presentes en la muestra diana (Chung et al., 1998), la cubierta de la partícula a pesar de ser similar en tamaño a las de NoV y el HAV, no tiene similitud estructural a nivel proteico con los virus RNA icosaédricos eucariotas (Fauquet et al., 2005). La mejor estrategia es por tanto utilizar un virus no patogénico de características similares a las de los virus problema, como otros miembros de las familias Picornaviridae y Caliciviridae. Actualmente, la cepa MC0 de Mengovirus, serológicamente indistinguible del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) pero no patogénica para humanos u otros animales debido a que carece de la cola poli (C) de la 5’NCR, está siendo empleada como control del proceso de extracción de ácido nucleico de virus entéricos en alimentos (Costafreda et al., 2006; Osorio et al., 1996). Entre los miembros de la familia Caliciviridae, FCV y en particular, MNV constituyen los mejores modelos para el NoV humano (Cannon et al., 2006; Wobus et al., 2004, 2006). ! 49! Introducción 1.6. Productos de especial prioridad La contaminación de alimentos por virus entéricos puede ocurrir en cualquier fase de la cadena de producción (cultivo, extracción, procesado, distribución o manipulación). La gran mayoría de las ETA de etiología viral se pueden agrupar en dos categorías en función del tipo de alimento involucrado y la fase en la que se produce la contaminación: • Alimentos frescos mínimamente procesados, como los moluscos bivalvos, vegetales como frutas, verduras, hortalizas, cereales y el agua, típicamente contaminados en el medioambiente durante la producción primaria. El factor clave que influye en el riesgo de contaminación de un producto fresco es la calidad del agua (bien sea de bebida, de irrigación o cultivo como por ejemplo en el caso de moluscos bivalvos). • Productos contaminados durante su procesado, preparación y/o manipulación a través de personas infectadas. El riesgo de contaminación está íntimamente relacionado con las condiciones de higiene de los trabajadores y manipuladores en contacto con el alimento. Se incluyen en este grupo alimentos que se suelen consumir fríos, crudos o poco cocinados (pan y productos de repostería, comida rápida, ensaladas, frutas, verduras, embutidos). Actualmente, existen cinco combinaciones de virus de transmisión alimentaria y productos ampliamente reconocidas como de especial prioridad para el Codex Alimentarius (http://www.who.int/foodsafety/micro/ jemra/meetings/virus/en/). (i) NoV y HAV en moluscos bivalvos: La infección con NoV y HAV a través del consumo de moluscos bivalvos han sido ampliamente documentada en todo el mundo hasta llegar a convertirse en uno de los productos con un riesgo más alto de transmisión de virus entéricos (Lees, 2000). (ii) NoV y HAV en productos frescos: La presencia de NoV y HAV en productos frescos como verduras, frutas y hortalizas y su relación con grandes brotes internacionales está también bien documentada (Le Guyader et al, 2004; ! 50! Introducción Wheeler et al., 2005). La principal fuente de contaminación se cree que está relacionada con la contaminación del agua utilizada para su irrigación. (iii) NoV y HAV en alimentos preparados: La principal vía de contaminación en este tipo de alimentos es mediante la contaminación a partir de individuos infectados implicados en la manipulación del alimento y sin unas correctas práctica higiénicas (de Wit et al., 2003). (iv) RV en el agua utilizada para la preparación de alimentos: Los RV del grupo A son la causa más frecuente de hospitalización por enfermedad diarreica y muertes en niños, sobre todo en los países no industrializados. La utilización de la leche en polvo reconstituida con agua contaminada, parece una fuente probable aunque las evidencias son difíciles de obtener (Duffy et al., 1986). (v) Virus emergentes en productos básicos seleccionados: Los brotes de virus de reciente aparición asociados a alimentos suelen ser escasos pero tienen un impacto potencialmente muy alto. Los ejemplos del SARS y la gripe aviar así como la transmisión alimentaria relativamente incontrolada de otros virus menos peligrosos, ponen de manifiesto la dificultad de manejo de dichos eventos, sobre todo con patógenos con una eficiente capacidad de transmisión a través de los alimentos. En estos casos, la vigilancia sistemática de las ETA y el rápido intercambio internacional de datos, puede ayudar en la identificación temprana de este tipo de brotes. 1.7. Virus entéricos en moluscos bivalvos 1.7.1. Los moluscos bivalvos como vectores de transmisión de virus entéricos Los moluscos (Mollusca, del latín molluscum "blando") bivalvos (Bivalvia, bi = dos; valvia = valva o placa) o lamelibranquios, son animales con simetría bilateral, cuerpo blando comprimido lateralmente y protegido por dos piezas o valvas. Son animales de tipo infaunal o epifaunal, en su mayoría ! 51! Introducción estáticos (a excepción de Pectínidos, como la vieira), que se alimentan mediante filtración. Los moluscos bivalvos han sido una fuente importante de alimento desde tiempos prehistóricos. Desde hace décadas, la creciente demanda de moluscos a nivel mundial como proteína de consumo ha llevado a un importante desarrollo de este sector productivo dentro del campo de la acuicultura. Galicia cuenta con más de 1,660 kilómetros de costa, incluyendo las islas del litoral, con una topografía especial, caracterizada por la presencia de rías. Estas rías tienen una alta productividad primaria y están especialmente adaptadas a la producción de moluscos bivalvos. España es, con diferencia, el mayor productor de mejillón (Mytilus galloprovincialis) de Europa y el segundo del mundo (con una producción anual de alrededor de 300.000 toneladas) (FAO, 2010), y Galicia representa el 95% de la producción total española. Por otra parte, la explotación de otras especies como almejas (Venerupis pullastra, V. descussatus, V. philippinarum), berberechos (Cerastoderma edule), ostras (Ostrea edulis, Crassostrea gigas), vieiras (Pecten maximus, Chlamys opercularis) y navajas (Ensis spp. y Solen spp.) a partir de bancos naturales, son también muy importantes. Especies como las ostras, mejillones y almejas pueden sobrevivir durante períodos relativamente largos fuera del agua y son históricamente objeto de comercio en fresco. Otras especies, como berberechos y vieiras son menos resistentes y normalmente comercializados como producto refrigerado o procesado. La naturaleza filtradora de los bivalvos los convierten en vehículos de concentración, acumulación, transmisión y diseminación de una gran cantidad de microorganismos presentes en sus aguas de cultivo, entre ellos diferentes patógenos humanos de tipo bacteriano, vírico o protozoario. A pesar de que algunas enfermedades son consecuencia de la presencia natural de algunos patógenos marinos (Vibrio parahaemolyticus,!V. alginolyticus, V. vulnificus), la mayoría tienen su origen en la contaminación de sus aguas de cultivo con aguas fecales (Lees, 2000) (Tabla 3). ! 58! Introducción 1977). Una vez atrapadas, las partículas entran en la boca hacia el esófago por medio de unos palpos. La digestión se lleva a cabo en dos fases: una extracelular en el estómago y otra intracelular en los divertículos digestivos. El órgano principal de la digestión extracelular es el estilo cristalino. A medida que gira va liberando enzimas que inician el proceso de digestión del alimento retenido en el mucus. Las partículas de comida son seleccionadas o reordenadas de nuevo en el estómago, por acción de los cilios de las células epiteliales, de acuerdo con su tamaño, densidad y digestibilidad, y son, o bien rechazadas en el intestino medio y expulsadas como pseudoheces o recirculadas hacia los divertículos digestivos para una mayor degradación. Las partículas recirculadas se someten a una degradación mecánica y química, y los productos de este proceso entran en la glándula digestiva donde tiene lugar la digestión intracelular. Los nutrientes son transportados a la hemolinfa, amebocitos, y el tejido conectivo periglandular. El material no digerido se acumula dentro de las células digestivas, que rompen su polo apical y liberan el contenido de cuerpos residuales y lisosomas a través del intestino, donde se lleva a cabo la re-absorción de algunos nutrientes. El material de desecho se consolida en el intestino y el recto y es expulsado a través del ano en la corriente exhalante (Gosling, 2003). A pesar de no ser parte de la dieta de los bivalvos, los virus entéricos, cuando están presentes en sus aguas de producción, son también atrapados en el mucus, ingeridos y bioacumulados por los bivalvos. Sin embargo, los mecanismos exactos de captación, acumulación y persistencia viral en los moluscos bivalvos permanecen aun en gran medida por esclarecer. La captación viral se produce, en un primer paso, por adsorción de las partículas virales a la mucosidad existente en las branquias, principalmente por atrapamiento mecánico y unión iónica. Se ha sugerido que esta unión iónica de los virus al mucus se produce a través de los radicales sulfato de los polisacáridos existentes en los compuestos mucoides. También se ha sugerido que la salinidad del mucus, el pH y/o propiedades de la superficie viral podrían ! 59! Introducción influir en dicha adsorción y en el tipo de virus adsorbido (Bedford et al., 1978; Di Girolamo et al., 1977). A partir de ahí, los virus contenidos en el mucus siguen la misma ruta que los alimentos. Parte son eliminados en las pseudoheces asociados a materia orgánica y productos de desecho y otra parte entra en los divertículos digestivos. A B Saco del estilo Intestino Estilo cristalino rotatorio Estómago Glándulas digestivas Esófago C Esófago Escudo gástric o Área de clasificación Cilios Partículas grandes hacia el intestino Cordón mucoso rotatorio con partículas asociadas Partículas pequeñas transportadas hacia la glándula digestiva Figura 13: Representación de la circulación del material dentro del estómago y estilo cristalino de la mayoría de lamelibranquios. (A) Vista externa del estómago y el saco del estilo. (B) Corte transversal que muestra la dirección y los movimientos del alimento. Las partículas de comida en el agua entrante son atrapadas en un cordón mucoso que se mantiene en rotación gracias al estilo cristalino. En el área de clasificación se dirigen las partículas grandes hacia el intestino y las pequeñas partículas de alimentos hacia las glándulas digestivas. (C) Acción de clasificación de los cilios (Modificado de Pechenik, 1991). ! 60! Introducción La glándula digestiva o hepatopáncreas es el lugar principal de bioacumulación de los virus entéricos y el órgano diana utilizado ya comúnmente para la detección de estos patógenos (Di Girolamo et al., 1977; Romalde et al., 1994). Una vez en los divertículos digestivos, algunos virus son eliminados a través de las heces, una vez finalizado el proceso digestivo. Sin embargo, se ha observado que parte de la carga viral es transportada a través de las paredes del tracto digestivo hacia zonas interiores. Se han detectado HAV y NoV en células basales del epitelio digestivo, en el lumen del tracto digestivo, en el interior de las células gastrointestinales (CG) y en hemocitos, tanto en el epitelio digestivo como en el tejido conectivo (Le Guyader et al., 2006b; A B C D Borde ciliado Epitelio del conducto secundario Epitelio del túbulo Porción de conducto inhalante no ciliado Porción de conducto exhalante ciliado Conductos principales ciliados Estómago Conductos secundarios no ciliados Túbulos digestivos Cilios Lumen Núcleo de amebocito Fibras musculares Gránulos basales Capas de colágeno Figura 14: (A) Sección que muestra la unión claramente definida entre el epitelio de un conducto secundario y el de un túbulo digestivo en Mytilus edulis. (B) Sistemas de conductos de los divertículos digestivos. (C) Representación de un conducto principal de los divertículos digestivos. (D) Sección transversal de un túbulo de los divertículos digestivos de Venerupis pullastra mostrando la disposición de los cilios (Modificado de Owen, 1955). ! 61! Introducción McLeod et al., 2009a; Provost et al., 2011; Romalde et al., 1994). La internalización de las partículas virales intactas en las CG, en los hemocitos o el tejido conectivo podría proporcionar una explicación para la baja eficiencia de los procesos de depuración de moluscos para la eliminación de ciertos virus como HAV y NoV. Además, se ha descubierto recientemente la existencia de unos antígenos presentes en las CG de ostras, almejas y mejillones muy similares al HBGA humanos, y se ha demostrado la unión específica de NoV a las CG del tracto digestivo de los moluscos a través de estos antígenos (Le Guyader et al., 2006b; Tian et al., 2006, 2007). Concretamente, se ha observado que las partículas virales de NoV se unen específicamente a los conductos digestivos (intestino medio, conductos principales y secundarios y túbulos digestivos) de Figura 15: Representación de la circulación de fluidos y partículas dentro de los divertículos digestivos de la almeja (Modificado de Owen, 1955). ! 62! Introducción ostra (Le Guyader et al., 2006b; Tian et al., 2006), almeja y mejillón (Tian et al., 2007) a través de una estructura de tipo carbohidrato con un residuo terminal N-acetilgalactosamina mediante un enlace tipo-α. Este tipo de residuo equivaldría al HBGA del tipo-A. Como se ha explicado anteriormente las cepas pertenecientes al genogrupo GI y GII de NoV presentan diferentes patrones de unión con las diferentes estructuras de carbohidratos de la familia del HBGAs. A pesar de que existe una gran variedad de perfiles de unión, en este caso las cepas pertenecientes a GI se verían más favorecidas para su unión a los conductos digestivos de estos moluscos. Esto sugiere una posible co-evolución entre NoV (principalmente cepas pertenecientes a GI), su hospedador y los moluscos bivalvos como vector de transmisión (Le Guyader et al., 2006b). Esto, además de proporcionar a ciertos virus un mecanismo para evitar entrar en el sistema digestivo y ser degradados, favorecería la bioacumulación y concentración selectiva de ciertos virus como el virus Norwalk sobre otros incapaces de unirse específicamente a estos tejidos y por lo tanto no transmisibles mediante este hospedador intermediario (Maalouf et al., 2011; Nappier et al., 2008). Se ha demostrado por ejemplo que NoV GI requiere 30 copias de RNA viral/L de agua para conseguir una bioacumulación de 1 copia de RNA/g de tejido de ostra, mientras que para NoV GII se necesitaron ~1200 copias de RNA viral/L de agua para una acumulación de 1 copia de RNA/g de tejido de ostra (Le Guyader et al., 2012; Maalouf et al., 2011). De hecho, y como ya se ha mencionado, los datos epidemiológicos muestran una predominancia de las cepas de GI en los brotes de gastroenteritis asociados al consumo de moluscos, mientras que las de GII predominan en transmisiones alimentarias mas relacionadas con la infección durante la manipulación o por contacto persona-persona (Le Guyader et al., 2012; Maalouf et al., 2011; Verhoef et al., 2010). Otros genogrupos de NoV, como el GIII bovino, presentes en aguas costeras en altas concentraciones no son bioacumulados de manera eficiente, probablemente debido a la falta del ligandos específicos en los moluscos (Zakhour et al., 2009, 2010). ! 63! Introducción Existen además otros factores que podrían influir en la mayor o menor presencia viral en bivalvos pero cuya implicación continúa sin estar clara, como por ejemplo la existencia de un número limitado de sitios para la adsorción viral, tanto en el mucus como en los tejidos digestivos (Bedford et al., 1978), la influencia del ciclo gametogénico y el desarrollo gonadal, o el contenido en glucógeno (Burkhardt y Calci, 2000), que a su vez podría influir en ciertos patrones de estacionalidad de brotes por NoV. La gónada y la masa visceral son los principales sitios de acumulación de glucógeno (Ojea et al., 2002), y el nivel de la producción de mucus por lo general se relaciona con el contenido de glucógeno en el tejido conectivo y el desarrollo gonadal (Galtsoff, 1964). Incluso se ha sugerido que la expresión estacional de estos ligandos podría conducir a diferentes eficiencias de bioacumulación de ciertas cepas de NoV a lo largo del año (Maalouf et al., 2010). 1.7.4. Métodos de control y eliminación La mayoría de los países desarrollados han adoptado una serie de controles sanitarios sobre la producción de moluscos bivalvos. Su principal característica es el uso de los indicadores bacterianos de contaminación fecal, cuyos niveles determinan el tratamiento apropiado al que se someterá el producto. Estos indicadores fecales son cuantificados bien en los propios moluscos (UE) o en sus aguas de producción (EEUU) (Lees et al., 2010). La medida más eficaz para evitar la contaminación de los moluscos bivalvos es su cultivo en áreas con una buena calidad microbiológica, sin embargo, el procesamiento posterior del producto proporciona una opción práctica para los casos en los que exista dicha contaminación. Las estrategias para prevenir, controlar y reducir la contaminación microbiana en los bivalvos pueden agruparse en: medidas previas a su recolección (es decir, el control de sus zonas de producción) y estrategias posteriores a su recolección. ! 64! Introducción 1.7.4.1. Estrategias de control previas a la recolección Estas estrategias están enfocadas a obtener una mejora en la calidad de las agua de cultivo y la prevención de vertidos de aguas residuales, principal vía de contaminación de los bivalvos. Identificar las fuentes de contaminación y los factores y condiciones responsables del riesgo de contaminación viral en un lugar específico, así como la adopción de medidas de carácter temporal como el cierre de determinadas zonas de producción son cruciales para reducir los riesgos. En este sentido, el modelado microbiano en ambientes costeros y los sistemas de alerta temprana (SAT) pueden ser herramientas útiles para limitar o prevenir dicha contaminación (Pommepuy et al., 2005). Los sistemas de modelado microbiano se clasifican en dos categorías principales: los modelos estadísticos y los modelos dinámicos basados en procesos. Los modelos estadísticos se basan en una modelización lineal o análisis de regresión logística entre los parámetros medioambientales y la contaminación fecal, prediciendo la contaminación microbiana que resulta de aportes de aguas residuales o de fuentes no puntuales en una zona determinada, de acuerdo con las condiciones ambientales (Gourmelon et al., 2010). Otro tipo de modelo estadístico son las Redes Neuronales Artificiales (ANN, del inglés Artificial Neural Networks). Las redes neuronales son una alternativa eficaz a las técnicas más tradicionales de análisis estadístico cuando se trata de hacer aproximaciones hacia funciones no lineales. Estos modelos estadísticos tienen ciertas limitaciones debido a que no tienen en cuenta el tipo de entrada de la contaminación, el transporte, la tasa de descomposición microbiana o distribución espacial y temporal. Los modelos dinámicos basados en procesos se desarrollaron en parte para superar las limitaciones anteriores (Brion et al., 2005). Estos modelos se basan en el desarrollo a su vez de diferentes submodelos: (i) un modelo hidrodinámico que proporciona los coeficientes de mezcla y distribución de la contaminación, (ii) un modelo de dispersión que integra el transporte y la ! 65! Introducción difusión de las bacterias/virus, y (iii) un modelo biológico de descomposición microbiana dependiente de las condiciones ambientales (luz, temperatura y asociación a los sedimentos) (Gourmelon et al., 2010). Con respecto a los SAT, su objetivo principal es obtener datos en tiempo real y en puntos clave, cerca de las zonas de producción, de ciertos parámetros como las precipitaciones, variaciones de salinidad, red de alcantarillado, actividades agrícolas, condiciones climáticas en la cuenca, brotes de enfermedades virales en la población local, procesos de mezcla y transporte dominantes. La información se recopila en una base de datos y es enviada de manera inmediata a un ordenador, que sintetiza la información y da la alarma si los parámetros exceden unos valores predefinidos. Sus funciones serían la gestión del riesgo, notificación de eventos, cierre de zonas de producción, cálculo del tiempo de cierre y fecha de re-apertura (Le Saux et al, 2006;. Gourmelon et al, 2010). El control de la entrada de contaminación fecal en las propias zonas de producción, sería el enfoque más eficaz contra la presencia de virus entéricos en los moluscos. Sin embargo, la creciente urbanización costera y el elevado coste de inversión para la implementación de EDAR, especialmente cuando el cultivo de bivalvos es muy disperso o el coste no guarda proporción con el valor del producto, hace difícil evitar esta contaminación. Por el contrario, otras vías de entrada de contaminación fecal son más fáciles de evitar, como las descargas de aguas residuales desde las embarcaciones, mediante la adopción de sencillas medidas como una mayor concienciación de los trabajadores, la instalación de contenedores para los desperdicios en los muelles o la adopción de sanciones por su incumplimiento. Aunque las normas actuales aplicables a los moluscos bivalvos son eficaces contra la transmisión de enfermedades bacterianas, su cumplimiento no garantiza la ausencia de virus entéricos en el producto final (Romalde et al., 2002). Los sistema de clasificación de las zonas de producción determinan si la zona se puede utilizar o no para la producción y el nivel de tratamiento ! 66! Introducción (depuración, reinstalación, tratamiento térmico) que debe ser aplicado a los bivalvos cosechados antes de su comercialización. Hay dos sistemas principales en uso en el mundo. Uno de ellos es el de la UE (Regulación EC No 854/2004) y el otro es el de EEUU (Programa Nacional de Saneamiento de Moluscos bivalvos, NSSP). Tanto la legislación de la UE como la de EEUU utilizan métodos de clasificación basados en concentraciones de indicadores bacterianos establecidos para cada nivel de contaminación o categoría. Sin embargo, en la UE los indicadores fecales se miden en la carne de los moluscos mientras que en los EEUU los indicadores se miden en las aguas de cada zona de producción (Tablas 4 y 5). Tabla 4: Criterios de la UE para la clasificación de las zonas de cultivo de moluscos bivalvos. *(NMP) número más probable. 1 La autoridad competente tiene la potestad para prohibir cualquier producción o recogida de moluscos bivalvos en áreas consideradas no adecuadas por razones de salud. 2 El método de referencia viene dado por la ISO 16649-3. 3 Por referencia cruzada a partir de la Regulación (EC) Nº 854/2004, vía Regulación (EC) Nº 853/2004, y Regulación (EC) No 2073/2005. 4 Regulación (EC) Nº 1021/2008. 5 Regulación (EC) Nº 854/2004. Clase1 Criterio microbiológico2 Tratamiento postrecolección requerido A Los moluscos bivalvos vivos de estas áreas no deben exceder 230 (NMP*) E. coli/100 g de carne y líquido intravalvar 3. Ninguno B Los moluscos bivalvos vivos de estas áreas no deben exceder, en un 90% de las muestras, 4.600 E. coli/100 g de carne y líquido intravalvar. En el 10% restante de las muestras, los moluscos bivalvos vivos o deben exceder los 46.000 E. coli/100 g de carne y líquido intravalvar 4. Depuración, reinstalación o procesado por un método aprobado C Los moluscos bivalvos vivos de estas áreas no deben exceder los límites de 46.000 E. coli/100 g de carne y líquido intravalvar de un ensayo de 5 tubos, tres diluciones NMP5. Reinstalación o procesado por un método aprobado ! ! 67! Introducción Table 5: Criterios NSSP para la clasificación de las áreas de cultivo de moluscos bivalvos. 1 Valores para el ensayo de 5 tubos dilución decimal. Los valores son diferentes al 90% de confianza para los ensayos de 3-tubos NMP y filtración en membrana mTEC. 2 La determinación del estado del área aprobada debe estar basada en un mínimo de 15 muestras para cada estación de muestreo. 3Las áreas pueden ser restringidas condicionalmente cuando éstas están sujetas a eventos de contaminación predecibles: estas zonas permanecen cerradas durante el evento de contaminación y un período posterior que permita su limpieza natural. 4 Se pueden utilizar otras consideraciones distintas a la concentración de contaminantes para declarar una zona prohibida. En otros países como Nueva Zelanda y Canadá, se han adoptado sistemas híbridos como enfoque práctico para el comercio con Europa o Estados Unidos. Estos programas consisten esencialmente el seguimiento de la contaminación tanto en el agua de mar como en los tejidos del molusco. El control del agua puede establecer la clasificación basal para una zona de producción, sin embargo tras un evento de contaminación la reapertura de las zonas de producción se basarían en un retorno de la concentración de los indicadores bacterianos en los tejidos a niveles predefinidos. 1.7.4.2. Estrategias de control posteriores a la recolección A pesar de que la reducción de la contaminación a través de procedimientos posteriores a la recolección es menos eficaz que la prevención de la contaminación en las zonas mismas de producción, estos procesos representan una opción práctica cuando las aguas están sujetas a cierto grado de contaminación. Aunque la contaminación viral puede ser debida a malas Clasificación Coliformes totales/100 mL agua Coliformes fecales/100 mL agua Tratamiento requerido Media geométrica 90% confianza1 Media geométrica 90% confianza 1 Área autorizada 2 !70 !230 !14 !43 Ninguno Área restringida3 !700 !2300 !88 !260 Depuración o reinstalación en un área autorizada Área prohibida Sin estudio sanitario o incumplimiento de las condiciones para zonas autorizadas o restringidas4 Recolección no permitida ! ! 74! Introducción contenido de agua (Grove et al., 2009; Tang et al., 2010; Kingsley, 2002a, 2006, 2007; Kingsley y Chen, 2009). Aún no está claro si las altas presiones requeridas para la reducción de NoV en los moluscos (600 MPa) serán viables desde el punto de vista comercial y/o aceptadas por los consumidores pues induce una apariencia blanquecina y de cocción ligera. Irradiación Existen otros métodos pero de incierta o dudosa eficacia para la eliminación de virus en moluscos, como la irradiación UV o radiación ionizante. De nuevo la variabilidad en los resultados entre estudios puede de ser atribuida, a la utilización de diferentes virus, especie de molusco, métodos de exposición y composición de la matriz. La radiación UV es eficaz en la reducción viral en la superficie del producto, pero no tiene poder de penetración para inactivar los virus en el interior de los tejidos (de Roda Husman et al., 2004; Richards et al., 2010). En cuanto a la radiación ionizante, los niveles requeridos para inactivar un 90-95% de estos virus (≥ 3 kGy) deteriora las propiedades organolépticas del producto además de tener unos costes elevados (Di Girolamo et al., 1972; Jung et al., 2009; Mallet et al., 1991). 1.7.5. Legislación y control microbiológico para el producto final. Según el reglamento (CE) nº 2073/2005 de la comisión de 15 de noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos aplicables a los productos alimenticios, los moluscos bivalvos destinados al consumo fresco no deben superar las 230 E. coli (NMP)/100 g de carne y liquido intravalvar. Deberán a su vez carecer de Salmonella en 25 g de producto. En algunos países hay requisitos adicionales para los moluscos procesados. Por ejemplo, en Japón, además del requisito estándar de 230 E. coli (NMP)/100 g de carne y liquido intravalvar, el recuento de bacterias no debe superar los 50.000 por gramo y V. parahaemolyticus no debe superar los 100 NMP/g. ! 75! Introducción 1.8. Virus entéricos en agua 1.8.1. El agua como vector de transmisión de virus entéricos La escasez de agua es uno de los principales problemas con los que se enfrentan las sociedades humanas en este siglo. El crecimiento de la población y la industrialización están aumentando las presiones sobre los suministros locales y regionales de agua necesarios para el riego, usos industriales y domésticos. A esto hay que sumarle nuevas incertidumbres en el suministro de agua dulce y las futuras demandas consecuencia del cambio climático (ONU, 2013). La presencia de virus entéricos en el agua constituye un problema de especial preocupación debido a su alcance y complejidad y cuyas consecuencias aún no han sido plenamente evaluadas. El desarrollo tecnológico e industrial, el aumento de la calidad y ritmo de vida, y la concentración poblacional en zonas de alta densidad durante las pasadas décadas, en especial en los países en vías de desarrollo, han provocado la necesidad de diversificación de las fuentes de abastecimiento tanto de agua potable como para fines agrícolas, llevando a una intensificación del uso de aguas superficiales y acuíferos subterráneos. Sin embargo, las aguas superficiales reciben el impacto de las aguas residuales urbanas o comunitarias contaminadas con material fecal, aumentando el riesgo de contaminación viral a través de diferentes rutas (Figura 16). Cuando el agua contaminada es utilizada directamente como agua de bebida representa un importante peligro para el consumidor. Sin embargo, la infección puede ocurrir también como consecuencia de su utilización para la irrigación de cultivos, el lavado y procesado de alimentos o la producción de hielo. Además de la infección a través de la ruta alimentaria, la infección con virus entéricos puede ser adquirida a través de la exposición ambiental, como aguas recreacionales o aerosoles (Koopmans et al., 2002; Sinclair et al., 2009; Wyn- Jones et al., 2011). ! 76! Introducción 1.8.2. Virus entéricos en agua de consumo La escasez de agua y la falta de acceso a servicios de saneamiento en los países pobres y/o en desarrollo siguen siendo un problema de salud global. El consumo de agua no tratada o tratada de forma inadecuada es una de las principales rutas de transmisión de enfermedades entéricas, sobretodo en los países pobres o en vías de desarrollo (Boschi-Pinto et al., 2009; Fewtrell et al., 2005). A pesar de ciertos avances hacia los Objetivos de Desarrollo del Milenio, más de 768 millones de personas (~ 11% de la población mundial) carecen de acceso a una fuente saneada de agua potable (ONU, 2013). Los estudios indican que la contaminación fecal del agua de consumo está muy extendida en todo el mundo. Una gran proporción de la población Excreciones animales Excreciones humanas Aguas recreacionales Agua Potable Moluscos bivalvos Aerosoles Cultivos vegetales Aguas superficiales Aguas subterráneas Aguas marinas Aguas de riego Aguas residuales Abono con fangos y purines Infiltración Nuevo hospedador humano Figura 16: Vías de contaminación de los virus entéricos transmitidos a través del agua (Modificado de Melnick et al., 1978) ! 77! Introducción mundial, especialmente en países del África subsahariana, el sur de Asia o América Latina y el Caribe, así como de zonas rurales utiliza agua contaminada con material fecal. Se cree además que esta contaminación fecal del agua de consumo está incluso subestimada por asumir el riesgo cero en fuentes de agua saneadas (Bain et al., 2014). Las fuentes de agua saneadas son aquellas que protegen el agua, tanto subterránea como superficial, de la contaminación exterior por medio de tuberías u otros sistemas. Sin embargo, muchos de estos sistemas son de mala calidad o de plástico mucho más vulnerables a las agresiones y daños físicos externos (Dongdem et al., 2009). Se ha documentado un alto grado de contaminación en sistemas saneados de países de bajos ingresos y zonas rurales debido por ejemplo a un suministro de agua intermitente o de larga distancia, recarga artificial de acuíferos de aguas subterráneas con aguas superficiales contaminadas o con aguas residuales, revestimientos de pozos defectuosos, etc. (Center y Knox, 1991; Chapron et al, 2000; Bain et al., 2014; Dongdem et al., 2009). Junto a otros patógenos bacterianos como E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, y parásitos como Cryptosporidium y Giardia, un gran porcentaje de los casos de morbilidad y mortalidad por enfermedad diarreica y/o gastrointestinal asociada al consumo de agua son causados por los virus entéricos. A pesar de que NoV y HAV son las principales causas de brotes virales transmitidos por el agua a nivel mundial, la infección por RV es la principal causa de morbilidad y mortalidad infantil en países en desarrollo. A pesar de que el abastecimiento de agua potable en los países desarrollados es por lo general seguro, los brotes de asociados al consumo de agua siguen documentándose periódicamente. Mead et al. (1999) estimaron que un 60 % de las infecciones por NoV en EEUU se producen a través de agua contaminada. La mayoría de los brotes asociados con agua potable en EEUU desde 1971 hasta 2006 (87,2%) tuvieron su origen en los suministros de agua públicos (Craun et al., 2010). Muchos de ellos se produjeron como consecuencia del consumo de agua subterránea sin tratar (30%) o tratada inadecuadamente (22%), agua superficial tratada inadecuadamente (16%), deficiencias en los ! 78! Introducción sistemas de distribución (10%) o por consumo de aguas superficiales sin tratar (3%). El agente etiológico causante de estos brotes solo fue determinado en el 55,4 % de los casos (Figura 17). Las técnicas de desinfección utilizadas comúnmente para el agua de consumo, como la cloración (mediante el uso de cloro y derivados), UV-C y la ozonización, que son en general altamente eficientes contra las bacterias y relativamente efectivos contra virus (dependiendo del tipo) y muchos protozoos, tienen sin embargo una serie de desventajas. La desinfección mediante radiación UV-C o el empleo de ozono, tienen asociados unos elevados costes de instalación, electricidad y de mantenimiento. Además la ozonización y el uso del cloro puede producir compuestos secundarios peligrosos para la salud, como los trihalometanos, por lo cual siguen siendo muy criticados como tratamientos de agua de consumo e incluso de agua para irrigación. Se hace necesaria la búsqueda de métodos alternativos para la desinfección de agua de consumo para solventar los problemas y limitaciones anteriormente mencionadas. Los método alternativos deben ser de bajo coste, de bajo consumo energético, sostenibles medioambientalmente y no presentar efectos adversos para la salud. En este sentido, la desinfección solar y los Procesos Avanzados de Oxidación (AOP) (del inglés Advanced oxidation processes) como la foto-catálisis han emergido recientemente como estrategias prometedoras. La desinfección solar, también denominada SODIS, es un método para el tratamiento descentralizado de agua y su almacenamiento recomendado entre otros por la OMS como método alternativo de uso doméstico en países en vías de desarrollo y tras catástrofes naturales (Acra et al., 1989; McGuigan et al., 2012; Sommer et al., 1997). Consiste en la exposición de pequeños volúmenes de agua (hasta 2 L) contenidos en botellas transparentes de plástico (normalmente de polietileno-tereftalato, PET) a la acción directa de la radiación solar durante al menos 6 h (o 2 días consecutivos si hay más de un 50 % de nubosidad) durante el periodo de máxima intensidad solar (McGuigan et al., ! 79! Introducción 2012). El efecto biocida del método SODIS se debe a la acción combinada y sinérgica de la porción UV de la radiación solar y la temperatura alcanzada en el agua. La eficacia del proceso depende principalmente de la irradiación, temperatura, turbidez, oxígeno disuelto y la resistencia del microorganismo (Malato et al., 2009). Etiología desconocida Químicos Parásitos Virus Etiología mixta Bacterias (no-Legionella) Legionella Etiología desconocida Químicos Parásitos Virus Etiología mixta Bacterias (no-Legionella) Legionella Etiología desconocida Químicos Parásitos Virus Etiología mixta Bacterias (no-Legionella) Legionella % de brotes Figura 17: Porcentajes de las etiologías de los brotes asociados a los sistemas públicos de agua desde 1971 hasta 2006 (n = 680). Los brotes asociados con Legionella sólo se registraron entre 2001 y 2006. (Modificado de Craun et al., 2010). ! 80! Introducción 1.8.3. Virus entéricos en agua para irrigación. Además del consumo de agua no tratada o tratada de forma inadecuada como ruta de transmisión de virus entéricos, el consumo de diferentes productos vegetales, consumidos crudos o mínimamente procesados, proporcionan un importante foco de transmisión de virus entéricos, principalmente debido a la utilización de agua contaminada con material fecal para la irrigación de dichos cultivos. La utilización de aguas residuales, lodos de depuradora y material fecal humano o animal, diluido o en crudo, es una práctica muy extendida y con una larga tradición, en muchos países de todo el mundo como una fuente de nutrientes para los cultivos (Jiménez et al., 2010). Con los años, se ha vuelto menos popular en los países desarrollados, con la mejora de las tecnologías de tratamiento y una mayor conciencia de los problemas ambientales y de salud asociados con dicha práctica. Por el contrario, en las regiones áridas y los países en vías de desarrollo, los cuales representan actualmente el 75 % de las tierras de regadío mundial, la reutilización de aguas residuales crudas o diluidas sin tratar o parcialmente tratadas para el riego es una práctica muy común contra la escasez y la demanda de agua (Jiménez et al., 2010; WWAP, 2012 ). Actualmente, el riego de los cultivos con aguas residuales o agua contaminada con materia fecal desempeña un papel muy importante en la transmisión mundial de patógenos entéricos. El aumento en el número de brotes asociados a este tipo de productos durante las dos últimas décadas se corresponde con un aumento en su demanda, su expansión en el mercado globalizado y su forma de consumo, crudos o mínimamente procesados (Cheong et al., 2009; Gerba y Choi, 2006; Sivapalasingam et al., 2004). Una amplia variedad de frutas y vegetales se han asociado con grandes brotes (a menudo internacionales) tanto de NoV como de HAV. Algunos brotes de HAV se han asociado con consumo de tomates (Petrignani et al., 2010), cebollas (Detinger et al., 2001; Wheeler et al., 2005), frambuesas (Ramsay y Upton, 1989; Reid y Robinson et al., 1987), fresas (Hutin et al., 1999; Niu et ! 81! Introducción al., 1992) y arándanos (Calder et al., 2003). NoV por su parte es el principal responsable de la mayoría de brotes por consumo de apio (Warner et al., 1991), diversas frutas (Cotterelle et al., 2005; Hjertqvist et al., 2006; Korsager et al, 2005), lechuga (Ethelberg et al., 2010) y melón (Bowen et al., 2006). Katzenelson et al. (1976) demostraron que las comunidades israelíes utilizando los efluentes de aguas residuales para el riego tuvieron un aumento de la incidencia de la hepatitis infecciosa, en comparación con otras comunidades. Cheong et al. (2009), detectaron y asociaron la presencia de diversos virus entéricos, incluidos AdV, EV, NoV and RV, en agua subterránea utilizada para la irrigación de diferentes vegetales. Una de las estrategias emergentes más prometedoras para la desinfección del agua son los AOP. A pesar de que existen diferentes AOP que utilizan diferentes sistemas de reacción, todos ellos están basados en la generación físico-química de especies transitorias, principalmente radicales hidroxilo (•OH), altamente eficientes en la oxidación de la materia orgánica. Entre los diferentes AOP, los procesos de Fenton homogéneo y foto-Fenton han atraído un gran interés en el campo de la desinfección solar (Malato et al., 2009). Los procesos de Fenton homogéneo se basan en la formación de •OH cuando, en ausencia de radiación solar, el peróxido de hidrógeno (H2O2) se descompone por la presencia en el agua de iones de Fe+2 (Chong et al., 2010; Pignatello et al., 2006). Las ecuaciones (Ec.) 1, 2 y 3 representan dicho proceso. (Ec. 1) (Ec. 2) (Ec. 3) En presencia de radiación UV-visible de longitudes de onda hasta los 600 nm, la reacción mejora en comparación con la reacción en condiciones de Fe2++H2O2!Fe3++OH "+•OH Fe3++H2O2!Fe2++HO2 •+H+ Fe3++HO2 •!Fe2++O2+H+ ! 82! Introducción oscuridad debido a la producción adicional de más •OH (Mailhot et al., 2002) según la Ec. 4. (Ec. 4) Esta reacción ocurre por la foto-reducción de las principales complejos del Fe3+, principalmente Fe(OH)2+, hacia Fe2+, que cierra el ciclo foto-catalítico y conduce a la generación continua de •OH, mientras que elimina la necesidad de adición de más Fe+2 (Pignatello et al., 2006). En la reacción de foto-Fenton influyen factores como el pH, la cantidad de Fe2+ disuelto, la concentración de H2O2, temperatura, radiación y la presencia de otros iones y materia orgánica disuelta (Chong et al., 2010; Malato et al., 2009). 1.8.4. Tratamiento de aguas residuales Aunque la recogida de aguas residuales data de tiempos remotos, el tratamiento para su depuración es relativamente reciente, situándose a finales del s. XIX y principios del s. XX (Cooper, 2001). El primer caso que constató la necesidad imperiosa de tratar el agua residual se remonta a 1855, cuando John Snow demostró la vinculación de un brote de cólera en Londres y la contaminación por agua residual del Río Támesis (Cooper, 2001). El grado de reducción de los virus entéricos varía de acuerdo con el sistema de tratamiento de aguas residuales utilizado, el tiempo de residencia, tipo de virus, la concentración inicial de aguas residuales en bruto, la radiación solar, la temperatura, la adsorción, la destrucción enzimática, y la depredación por bacterias y protozoos (Arraj et al., 2005). Los procesos de tratamiento de aguas residuales incluyen procesos físicos, químicos y biológicos, tales como filtración, y la coagulación, oxidación y cloración. En los sistemas de tratamiento de aguas residuales municipales convencionales, los virus entéricos se eliminan mediante una combinación de adsorción irreversible e inactivación mediante desinfectantes (Charles et al., 2008). Los virus presentes en aguas pueden estar libres en flotación o asociados Fe3++HO2 •!Fe2++O2+H+ ! 83! Introducción a partículas sólidas. Los procesos físicos como la sedimentación, filtración, floculación y coagulación eliminan los virus adsorbidos en estas partículas. La eficacia de la eliminación viral varía dependiendo de las afinidades de adsorción de las partículas virales y los adsorbentes, la saturación de sustrato, potencial redox y el oxígeno disuelto del sistema (Schijven y Hassanizadeh, 2000; Templeton et al., 2008). Los adsorbentes potenciales de los virus en el agua incluyen la arena, la arcilla, las bacterias, coloides en suspensión y sedimentos (Templeton et al., 2008). La interacción entre la partícula viral y los adsorbentes es una función del punto isoeléctrico del virus, y de la partícula adsorbente, así como de la hidrofobicidad de esta última. Las tasas de extracción viral mediante estos procesos dependen en gran medida del pH, la saturación de sustrato, potencial redox y el oxígeno disuelto del sistema o la velocidad del flujo del efluente (Charles et al., 2008). Estos procesos físicos eliminan alrededor del 90-99% de la carga viral de las aguas residuales (Ueda et al., 2004). La eliminación adicional de contaminantes biológicos se consigue mediante la desinfección, que puede utilizar cloro, ozono, ácido peracético y/o irradiación UV (Mezzanotte et al., 2007). Los desinfectantes químicos inactivan los virus mediante oxidación o desintegración de la partícula viral, o por inhibición de la actividad celular en el caso de otros microorganismos (Cho et al., 2003). La desinfección por UV, se basa en la formación de dímeros de pirimidina en el DNA/RNA del organismo objetivo, impidiendo su replicación (Kurosaki et al., 2007). La presencia de partículas en suspensión que reducen o impiden por completo el contacto entre el agente desinfectante y el organismo es uno de los principales factores que afectan al proceso de inactivación viral mediante desinfección (Templeton et al., 2008). Las partículas orgánicas afectan negativamente la desinfección viral mediante agentes químicos a causa de un aumento en la demanda de desinfectante a medida que penetran en la superficie de la partícula. La estructura de la partícula viral y la porosidad de las partículas en suspensión ! RESULTADOS ! 93! Resultados ! 3.1.!Eliminación de virus entéricos en almeja y mejillón mediante sistemas de depuración Artículo 1. Viral elimination during commercial depuration of shellfish. Artículo 2. Depuration kinetics of Hepatitis A virus in clams. Artículo 3. Effectiveness of depuration for hepatitis A virus removal from mussels (Mytilus galloprovincialis). Artículo 4. Depuration kinetics of murine norovirus in shellfish. Artículo5. Mathematical model for the depuration kinetics of enteric viruses in shellfish: a useful tool to estimate the risk for the consumers. ! ! 95! Resultados ! RESUMEN En este estudio se evaluó la eficacia de la depuración para la eliminación del virus de la hepatitis A (HAV), norovirus (NoV) genogrupos I (GI) y II (GII), y bacteriófagos F+RNA (F+RNA) en almeja babosa (Venerupis pullastra) y mejillón mediterráneo (Mytilus galloprovincialis). El objetivo principal fue comparar el comportamiento de los diferentes patógenos bajo condiciones de depuración aplicadas comercialmente durante 7 días en un centro homologado. Para la cuantificación de los F+RNA se utilizó el método estándar de doble capa de agar (ISO 10705-1). Para la cuantificación de HAV y NoV GI y GII, se utilizó el método estándar ISO/TS 15216, recientemente publicado y basado en la RT-PCR en tiempo real. La reducción de los F+RNA mostró una cinética de depuración de dos fases. Las tasas medias de reducción fueron de 1 unidad logarítmica (Log) en almeja y 2 Log en mejillón, con niveles residuales después del proceso de 6,3×103 y 8,3×101 F+RNA/100 g, respectivamente. Por su parte, HAV, NoV GI y NoV GII se detectaron de forma intermitente a lo largo de todo el proceso, en concentraciones que oscilaron entre 103 y 105 copias de RNA/g de tejido digestivo (TD). NoV GI mostró los mayores niveles de contaminación seguido de NoV GII y HAV. Después de siete días de depuración, tanto HAV, como NoV GI y GII se detectaron en almeja, sin embargo, en mejillón sólo se encontró NoV GI al final del proceso. En general, las almejas mostraron tasas de depuración más lenta y mayores niveles de contaminación para todos los virus analizados. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956713514001479 ! Artículo 1: Viral elimination during commercial depuration of shellfish. Polo, D., Álvarez, C., Díez, J., Darriba, S., Longa, A., & Romalde, J.L. Food Control, 43, 206–212. (2014) Índice de impacto 2013: 2,819. Q1 (17/123) en Food Science and Technology ! 97! Resultados RESUMEN En este estudio se evaluó la eficacia de la depuración y la dinámica de eliminación del virus de la hepatitis A (HAV) bajo condiciones experimentales en almejas de Manila sometidas previamente a un proceso de bioacumulación con este virus. Para ello se llevaron a cabo cinco ensayos independientes en un sistema experimental cerrado con un volumen total de aproximadamente 1.750 l, y utilizando lotes de 60 kg de almeja. La técnica utilizada para la cuantificación viral fue la RT-PCR en tiempo real. Se llevaron a cabo ensayos de infectividad al final del proceso de depuración. A pesar de que las concentraciones finales, después de 7 días de depuración, se mantuvieron relativamente altas y con capacidad infectiva, se observó una reducción media en los niveles de HAV de 1,4 Log (93,1%). Esta reducción mostró una cinética de eliminación en dos fases, con una rápida reducción inicial del virus durante las primeras 72 h de depuración, con una disminución media de HAV de 0,6 Log (69%) en el número de copias de RNA/g de tejido digestivo, y una estabilización posterior con una tasa de depuración más lenta en los días restantes. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0740002013002323 Artículo 2: Depuration kinetics of Hepatitis A virus in clams. Polo, D., Álvarez, C., Vilariño, M.L., Longa, A., & Romalde, J.L. Food Microbiology, 39, 103–107. (2014) Índice de impacto 2013: 3,374. Q1 (8/123) en Food Science and Technology ! 99! Resultados ! RESUMEN En este estudio se evaluaron la cinética y la eficacia de la depuración del virus de la hepatitis A (HAV) bajo condiciones experimentales en mejillón mediterráneo (Mytilus galloprovincialis) previamente sometido a procesos de bioacumulación. Se realizaron siete ensayos independientes (cada uno con 70 kg de mejillón) en un sistema experimental cerrado durante 7 días y utilizando dos temperaturas de agua diferentes (13 y 17 °C). Para la cuantificación viral se empleó la técnica de RT-PCR en tiempo real con sondas TaqMan. Se llevaron a cabo también ensayos cualitativos de infectividad para evaluar la presencia de partículas virales infecciosas al final del periodo de depuración. Los ensayos de depuración mostraron una reducción promedio en los niveles de HAV de aproximadamente 1,1 unidades logarítmicas (Log) (aproximadamente un 90 % de reducción). A pesar de esta reducción, las cargas virales medias en los bivalvos al final del proceso se mantuvieron en niveles relativamente elevados (6,5×103 copias de RNA/g de tejido digestivo) y con capacidad infectiva. Se observó también una correlación positiva entre la concentración inicial y final de carga viral. La reducción del HAV mostró una cinética de eliminación bifásica, con una reducción rápida del virus durante las primeras 24-48 h de depuración, y una estabilización posterior con una tasa de depuración más lenta hasta el final del proceso. URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160514001640 Artículo 3: Effectiveness of depuration for hepatitis A virus removal from mussels (Mytilus galloprovincialis). Polo, D., Álvarez, C., Longa, A., & Romalde, J.L. International Journal of Food Microbiology, 180, 24–29. (2014) Índice de impacto 2013: 3,155. Q1 (11/123) en Food Science and Technology ! 106! Resultados ! Mathematical model for viral depuration kinetics in shellfish: a useful 1 tool to estimate the risk for the consumers 2 3 David Polo1, Xabier Feal2, and Jesús L. Romalde1* 4 5 1Departamento de Microbiología y Parasitología, CIBUS-Facultad de Biología, and 6 2Departamento de Física de Partículas e IGFAE. Universidad de Santiago de 7 Compostela, 15782, Santiago de Compostela, Spain. 8 9 10 11 Submitted to: Emerging Infectious Diseases, August 2014 12 13 14 15 16 * Corresponding author 17 Phone: +34 881816908 18 Fax: +34 881816966 19 E-mail: [email protected] 20 21 22 D. Polo, M.Sc. is currently a Ph.D. student developing his thesis on depuration of 23 enteric viruses from shellfish. 24 25 ! 107! Resultados ! Abstract 26 Enteric virus depuration from shellfish is a complex biological process that may be 27 influenced by biological properties of the mollusc and/or virus species. On the basis of 28 previous experimental data, a mathematical model was developed to characterize the 29 kinetics of viral elimination during the depuration process. It was observed that 30 although viral loads decay along depuration, a residual viral load remains at the end of 31 the process suggesting a decomposition of viral load in a diluted load (susceptible of 32 depuration) and a non-diluted load (unavailable to depurate). The model yielded a 33 general equation, which can predict the viral load at any depuration time knowing the 34 specific filtration rate and specific viral properties. The mathematical model can be 35 combined with quantitative risk assessment calculations to determine the safety of the 36 depurated shellfish, which can be very helpful not only for shellfish producers but also 37 to public health authorities. 38 39 Keywords: Mathematical model, shellfish depuration, Hepatitis A virus, Murine 40 norovirus. 41 42 43 ! 108! Resultados ! ! Predictive models are increasingly accepted as an integral interdisciplinary knowledge 44 in microbiology. They can reduce the reliance on culture-based techniques, which are 45 normally limited in the case of unculturable or hardly culturable viruses like NoV and 46 HAV, providing a rapid availability of results required in the framework of food 47 security. From this point of view, they emerge as a useful tool for dealing with the 48 challenge of sanitary risk of the viral depuration process. 49 Depuration is a statutory requirement in many countries for marketing of fresh shellfish 50 (1). The process exploits the natural shellfish pumping activity to purge their intestinal 51 contents, decreasing the likelihood of infectious agents transmission to consumers. Viral 52 depuration is widely known to be less effective than bacterial depuration and the 53 compliance of shellfish products with current sanitary standards (uniquely based on 54 bacterial indicators) cannot guarantee the viral absence (2–5), a fact evidenced by the 55 periodic outbreaks of Hepatitis A and gastroenteritis following the consumption of 56 depurated shellfish (6–9). The severe impact of the viral enteric diseases on human 57 populations has brought awareness by governmental authorities worldwide. From a 58 viral standpoint, shellfish depuration is a complex biological process that may be 59 influenced by biological properties of the mollusc and/or viral species. The efficacy of 60 viral depuration, the time required for a significant reduction of the viral load and the 61 specific behavior of different viruses in different bivalve species are critical issues for 62 the development of new and improved shellfish sanitary controls, purification 63 processes, and the enactment of viral legislation for these products. 64 Previous experimental results obtained with different virus and shellfish species showed 65 a similar pattern of depuration (see Supplementary Material)(10–12). Data showed that 66 viral loads at the initial stage of depuration quickly decay until reaching some threshold 67 of viral contamination that depuration may not removed, suggesting a decomposition of 68 ! 109! Resultados ! ! viral load in a diluted viral load (susceptible of being depurated by physical 69 mechanisms) and a non-diluted viral load (sequestered in non-digestive-tract tissues and 70 thus unavailable to remove by physical depuration). 71 It was questioned, if an undergoing simple law dictating such behaviour exists, taking 72 as assumptions how and where virus accumulation occurs and how viral load is 73 removed. A simple model was derived from the following hypothesis: (I) some amount 74 of clean flux of water (proportional to the shellfish filtration rate) enters the digestive 75 tissues (II) the diluted viral load present there randomly diffuses to reach a new 76 isotropic concentration of equilibrium (III) same amount of contaminated flux is spelled 77 and (IV) there could be some non-diluted residual viral load. In these hypothesis a linear 78 differential equation relating viral load variation with time, filtration rate of the shellfish 79 and residual viral load was deduced. The solution to this equation fitted the behaviour of 80 the previous experimental data with a high degree of accuracy. 81 We propose the simplest model, in which some part of the viral load is bound to the 82 gastrointestinal cells of the digestive tissues by specific viral ligands or receptors or 83 enclosed in the non-conductive parts outside the conductive lumen torrent (and thus 84 unable to be removed by simple drift)(9, 13–15), while the rest remains diluted in the 85 lumen of the conductive tissues. Thereby, we decompose virus count in two parts: 86 !!!!!!!! the subscripts meaning diluted and residual. After the bioaccumulation process the 87 residual viral load goes to a constant value. If environment changes, however, only the 88 diluted part could vary with time. 89 !!!!!!!!! Digestive conductive tissue was idealized as a volume !! resulting of the sum of all its 90 conductive cavities and a volume !! representing all the other spaces where the residual 91 ! 110! Resultados ! ! viral load could be permanently attached or immobilized. When depuration starts, in a 92 infinitesimal time !" digestive tissue absorbs a!!" volume of clean water, meaning that 93 virus concentration in the!!! volume of the digestive tissue instantly decreases 94 to!!!!!!!!!!!!"). At the same time a similar amount of contaminated liquid is 95 expelled out which contains!!"!!!!!!!!!!!!") virus. Thereby, in a small!!" the 96 variation in the virus count at the digestive tissue is 97 !" !!!!!!" !!!!! !!!!! !!!!" !" Dividing both sides by !" and taking the !" !! limit when !" !!! holds, them 98 !!!!!! !" !! !!!!! !! !" !" Interested in the total viral load take it into account that, as !! is constant in time then 99 !"!!! !" !! !!!!! !! !" !" The rate of clean water entering the digestive tissue per unit of time, !"!!", was 100 assumed to be proportional to the filtration rate of the individual, and denoting by!! this 101 fraction. Then 102 !"!!! !" !!!!!!!!!!" !! The parameter !!!"!!! is denoted as the decay rate of viral load. By solving the 103 above first order linear differential equation, the instant viral load at time ! is found 104 !!!!!!!!!!!!!!!!" 105 It is convenient to take the equation in its concentration form instead of absolute viral 106 counts to avoid dependence on initial absolute contamination, by dividing both sides 107 by!!! 108 !!!!!!!!!!!!!!" [1] 109 ! 111! Resultados ! where!!!!! is the total viral load at instant !, value 1 meaning initial concentration,!!! is 110 the constant residual load, ! the decay rate. A particular case consists in the absence of 111 residual load, making !!!! in the last equation. Meaning of all used symbols can be 112 found in Table 1. 113 In this proposed model two separated demeanours were found (Figure 1). The first one 114 is related to the residual viral load, which can be null or positive, and its value depends, 115 in principle, on the particular ability of a specific viral species or strain to remain 116 attached to molecular receptors present on gastrointestinal cells, penetrate to the non-117 conductive parts of the digestive tissue like connective tissue or hemocytes, or on the 118 particular tolerance or capacity of a certain shellfish species to bioaccumulate certain 119 viral species (e.g. amount and/or distribution of viral ligands or receptors, hemocytes, 120 etc)(15–18). The second demeanour concerns only to the ability of the host to drift the 121 dilute content of the viral load, which depends only on kinematic factors like the 122 fraction of filtration which goes through the digestive gland, the filtration rate of the 123 species and the size or the structure of the digestive tissues. 124 As !! increases (species with higher filtration rates or smaller digestive tissues) the 125 quickest the depuration occurs. The biggest/smallest !! is, the less/more purified the 126 specimen could be. 127 The validity of the model could be checked by reproducing (I) the decaying exponential 128 law and the existence of residual values in Equation 1 and, once accomplished this, (II) 129 the independence of the decay rate on the particular viral characteristics and its 130 proportionality with the filtration rate of the host. 131 Experimental data in the case of HAV (Figure 2a) showed decaying rates of !!!!!" !132 !!!"!!"#$!!!for mussels (Mytilus galloprovincialis) and !!!!!" !!!!"!!"#$!!in 133 clams (Venerupis philippinarum). Small residual loads of !!!!!!!"!were found in 134 ! 112! Resultados ! ! mussels and of!!!!!!!!" in clams. Experimental data in the case of MNV-1 (Figure 135 2b) showed decaying rates of!!!!!!" !!!!!!!"#$!! in mussels and !!!!!" !136 !!!"!!"#$!!in clams, and bigger residual loads of !" !!" in mussels and !" !!"!in 137 clams. Although slight differences were found in the decay rates of both viral species, 138 big uncertainties in the determination of the MNV-1 decay rates make both values 139 compatible. Thereby, evidence was found that the decay rate does not depend on the 140 virus (as the model predicts) but it does on the filtration rate of the host. Additionally, 141 magnitude orders report that the proportionality factor between filtration rate and 142 filtration rate fraction ! in the digestive tissue is very small, thus only a small amount of 143 the flux which the shellfish pumps enters the digestive gland. 144 Using our fitted values of the decay rates, a weighted averaged decay rate of ! = 145 0.985 was found for M. galloprovincialis and ! = 0.453 for V. philippinarum, yielding a 146 quotient of q = 2.18. If the biggest contribution to the possible variation of the decay 147 rate of a particular species is its own filtration rate, then a similar quotient between the 148 decay rates should be found in the quotient of filtration rates. Indeed (see supplementary 149 material) using Labarta et al. (19) filtration rate of f=5.25 l/h for M. galloprovincialis 150 and Nakamura (20) filtration rate of f = 2.3 l/h for V. philippinarum a quotient of q= 151 2.28 is found, which is in accordance with the quotient of decay rates. This means that, 152 as predicted by our model, but without data from more species, the average rapidity in 153 which depuration occurs in mussels compared with clams (more than a factor 2) is 154 possibly due to the filtration rate of the species being twice, and thus independent of the 155 virus characteristics. 156 The advantages of having developed a mechanistic mathematical model from basic 157 physical principles instead of an empirical model from the experimental data become 158 now evident. For example, since decay rate of depuration is deduced proportional to 159 ! 113! Resultados ! filtration rate, decay rates for shellfish species different than those for which decay rates 160 were empirically found can be predicted (Table 2). Another predictive tool arises 161 inverting the model equation. By doing so the depuration time needed to achieve a 162 particular value of virus concentration!! per gram of digestive tissue is found 163 !! ! !!" !!!!! !!!! Knowing !!, the initial viral count, the decay rate ! of the particular species, and the 164 residual virus count !! calculated through !!!!!!!, the minimal time of depuration 165 from which total viral concentration falls below a desired value is deduced. Values of 166 typical contamination in a particular environment can be used then to determinate the 167 requirements of depuration. 168 This integration of predictive microbiology in the process of viral clearance can become 169 a prediction tool in depuration controls, useful for the rational and efficient design of 170 new and improved depuration systems. In addition, it can be of great importance for the 171 regulations on sanitary standards and policy decisions based on quantitative viral risk 172 assessment during the purification process (see Supplementary Material), as well as for 173 the establishment of future critic viral values in depurated shellfish. 174 175 176 Acknowledgements 177 This work was supported in part by Grant 10MMA200010PR from Xunta de Galicia 178 (Spain). 179 180 Conflict of Interest 181 The authors declare no conflict of interest. 182 183 ! 114! Resultados ! ! REFERENCES 184 1. European Regulation (EC) Nº 854/2004 of the European Parliament and of the 185 Council of 29 April 2004 laying down specific rules for the organization of official 186 controls on products of animal origin intended for human consumption. Off J Eur 187 Union 2004;L226: 83–127. 188 2. Schwab KJ, Neill FH, Estes MK, Metcalf TG, Atmar RL. 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