Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide. Estudio de polimorfismos funcionales en genes candidatos

Universidad de Santiago de Compostela Facultad de Medicina y Odontología Departamento de Medicina Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela Laboratorio de Investigación 2 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide. Estudio de polimorfismos funcionales en genes candidatos Tesis Doctoral Julio Rodríguez López 2008 El Dr. Antonio González Martínez-Pedrayo, investigador principal del Laboratorio de Investigación 2 del Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela, y el Dr. Juan Jesús Gómez-Reino Carnota, Jefe del Servicio de Reumatología del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela y Profesor Titular del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela, CERTIFICAN QUE: El presente trabajo que lleva por título: Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide. Estudio de polimorfismos funcionales en genes candidatos,realizado por Julio Rodríguez López en el Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela bajo nuestra dirección, ha sido revisado y está en disposición de ser presentado para optar al grado de Doctor en Biología. Fdo: Dr. Antonio González Martínez-Pedrayo Fdo: Dr. Juan J. Gómez-Reino Carnota A la gente que me ha hecho ser como soy; excluyéndome a mí mismo... Hay que sufrir y trabajar mucho hasta dar con los colores, con el pincel y con el lienzo. E incluso entonces estaremos muy lejos aún de dominar el arte de vivir, aunque por lo menos, seremos dueños de nuestro propio taller. Friedrich Nietzsche Si un hombre comienza con certezas terminará dudando, pero si se contenta con empezar dudando, terminará poseyendo certezas Francis Bacon Ex nihilo nihil fit Agradecimientos Algunos dicen que la vida son las cosas que hacemos para algún día llegar a echarlas de menos. Supongo que eso es porque siempre nos gustaría estar haciendo aquello que nos hace felices, aquello que nos sale de dentro. Un día, cuando era niño, soñé con descubrir las reglas básicas que se encuentran por detrás de todo lo real, y ahora, mientras escribo esto, tomo conciencia de que estoy en el camino de hacerlo. Quizá nunca lo consiga, honestamente creo que la humanidad nunca lo conseguirá porque la vida es mucho más que números y fórmulas, y porque no nos va a dar tiempo antes de que destruyamos el planeta. Otros universos acaecerán, y quizás ellos sí lo llegarán a saber, pero no estaremos allí para comprobarlo, aunque igual alguno de nuestros inmortales átomos sí, pero lamentablemente, no seremos conscientes de ello. No me importa, porque la sensación de poner un granito de arena en el gran castillo del conocimiento es una de las más grandes del firmamento, y tan sólo por eso merece la pena estar vivo y viviendo. Y me siento satisfecho por ello, y NADIE puede cambiar mi opinión al respecto. Siempre he querido que llegara este momento, el de la consecución de todo un proceso, el de llegar a una meta que lleva revoloteando durante mucho tiempo en tu cabeza. Ha costado mucho esfuerzo, pero la satisfacción de estar cumpliendo un sueño ha sido energía más que suficiente para mantener una sempiterna sonrisa (aunque fuera interiormente) cada uno de los días que he pasado entre probetas, poyatas, pipetas, reactivos de SNaP Shot, estadísticas y secuencias. Primero, dar las gracias a TODO el mundo, por aguantarme. En segundo lugar al doctor Antonio González, mi director de tesis, por haber confiado en mí y permitirme acceder a este apasionante mundo de la investigación científica y aportar mi pequeña contribución; por darme la posibilidad de conocer como es la ciencia en país que cree en ella y la respeta (U.K.), por la ciclópea paciencia mostrada durante estos tres meses de interminables correcciones de la tesis, y por compartir (en parte) conmigo una visión de como se deben hacer las cosas, que por desgracia para nosotros y para el mundo en general, no tiene muy buena acogida mediática. Gracias también al doctor Juan J. Gómez-Reino codirector de mi tesis por ofrecerme la posibilidad de realizar mi labor en colaboración con el Servicio de Reumatología del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. Gracias, también, a todos aquellos participantes anónimos, pacientes y controles que por su labor altruista (¡existe el altruismo!) en favor de la ciencia me han permitido la posibilidad de hacer este estudio, así como a todos aquellos investigadores y clínicos que han colaborado directa o indirectamente en este trabajo. Mención especial al doctor John Loughlin de la Universidad de Oxford (ahora quizá Newcastle) y a todo el personal de su grupo de investigación por su hospitalidad, atención y docencia durante mi estancia en el Botnar Research Centre (Oxford University Institute of Musculoskeletal Sciences) durante los meses de junio y julio de 2007. Luego, agradecer a mis padres porque, desde el punto de vista genético, este trabajo les corresponde en un 50% a cada uno de ellos (descontando el porcentaje debido a cambios ambientales y culturales, pero eso lo dejo para un debate etólogo-político que ahora no viene al caso…), y desde el punto de vista espiritual (metafísico, trascendental, mental,…), por que son los mejores y nada más. A mi madre en especial, porque como dijo Saramago “A una madre se la quiere toda la vida con el mismo cariño, y cuando una madre se muere a cualquier edad se es niño”; y por el incontestable mérito de aguantar, con una paciencia que sólo las madres conocen, aquellas mis primeras parrafadas científicas por los ya lejanos años 90, cuando en primero de BUP descubrí por primera vez las leyes de Mendel y supe que mi destino había sido fijado para siempre. Por apoyarme siempre en mis controvertidas decisiones vitales y por no dejar de creer en mí por absurdas e ilusorias que sean mis aspiraciones (entre ellas la de cambiar, que no conquistar, el mundo). Es por las madres por las que había que levantar catedrales… Al resto de mi familia por estar siempre ahí. (No voy a calcular el tanto por ciento desde el punto de vista genético que les corresponde de este trabajo…ya bastante tengo con escribir esto…). Mención especial para mis hermanos pequeños, no sé exactamente por qué, supongo que porque son geniales y porque me han hecho descubrir una faceta (oculta) de mi personalidad que, de una manera imposible de abordar desde un punto de vista científico, me ha aprendido un poco más lo que es la vida y el vivir, y me han hecho madurar, alcanzar otro estadio de Erikson más. También a mi primo Miguel (Beckham) porque su emoción al ver mi primer artículo publicado me hizo corroborar que lo que estaba haciendo merecía la pena y mucho más. A todos mis compañeros de todos los laboratorios porque la compañía siempre es buena y el trabajo en conjunto es más ameno y más llevadero (¿siempre?) y, aunque no todos tengamos los mismos objetivos, en la medida de lo posible hemos sido capaces de compenetrarnos. No puedo mencionaros a todos y cada uno, pero siento que debo hacer algunas alusiones especiales por razones malamente disimuladas bajo una aparente estocástica, pero que espero entendáis y respetéis todos los demás. (Acordaos de que el orden de los factores no altera el resultado…) A Cristina (ex jefa del servicio técnico) por dejarme las pinzas para encender el coche y porque siempre lo da todo por los demás sin esperar recibir nada a cambio, y ese tipo de persona tiene que perdurar para bien de la humanidad. Desde el principio, cuando llegué aquí encerrado en un caparazón de hierro forjado, se acercó e intentó entenderme, comprenderme y tratar conmigo abiertamente, y eso tiene mucho mérito y, aunque parezca un arte sencillo, son muy contados aquellos que lo manejan con soltura y naturalidad. A Rebe porque en sí misma, mismamente es una gran persona y siempre ha sido ameno y divertido (y a veces peligroso) trabajar a su lado. Y también por los queiques, que no creo que nunca haya merecido ni la mitad de todos los que me ha regalado. A Marta (actual jefa del servicio técnico) por formar parte conmigo del frente revolucionario que combatió los envites del “lado oscuro de la fuerza”. A Marián porque creo que a todos nos ha contagiado un poco su serenidad y no nos ha venido mal. A Manuel por haber sido el contrapunto ideal a la hora de relajar el estrés del trabajo y por haberme ayudado desinteresadamente siempre que lo he necesitado. A Manolo por su original humor, por ese punto de vista distintamente calculado que siempre le aporta a todo y por las ayudas con las chicuadrado. A Rudi porque dudo mucho que pueda volver a encontrar a alguien con el que mantener esas apasionadas e interminables (no por interesantes si no por no existir final) discusiones sobre física cuántica, la no-existencia del tiempo, end of evangelion y demás frikadas manga, los gatos envenenados de Heissenberg, los artículos del Reverte, la posibilidad de reinventar (que no deconstruir) nuestra tan bonita y pluricultural y socialdemocratacapitalista sociedad actual … y por estar siempre creando (tol rato genialidades, tol rato…). A Samu porque es del barsa… y porque nos conocemos desde la carrera y, a pesar de algún que otro plantón, hemos recorrido más o menos juntos el duro camino que lleva a la consecución de una tesis doctoral y siempre es bueno tener a alguien al lado que sufra los mismos tormentos. A Manuel (biologuer) por haberlo dejado “a cuadros” cuando al empezar juntos el camino del tercer ciclo decidí separarme para dejarme llevar por lo que me decía mi instinto (y que no eran las microalgas… con todos mis respetos por otra parte), y por haber compartido conmigo cinco años de carrera y aquel T.A.D. en fisio vegetal que lo pasamos genial trabajando con plumífero en la cámara de frío, y que nos permitió sentirnos científicos por primera vez. A Elisa porque, sin hacer ningún ruido, ha sabido ganarse perfectamente su sitio, una actitud admirable, que no estaría de más que fuese copiada por algunas (muchas) personas, y por que le gusta Superstar y Zelda, y eso es difícil de encontrar. A Bruno porque hemos pasado muy buenos ratos recordando viejas películas acompañados de mala comida y parrafando a las ocho de la mañana (de la noche). A Isabel (Barcelona) por su ayuda en el diseño del maravilloso “sujetatapas de centrífuga” y por tener que aguantar más de cinco borderías marca de la casa. A Servet por su “mala leche” y demás repertorio espanglish que le fuimos enseñando. A Isa por las inacabables discusiones sobre política y demás movimientos socioculturales, por servir de modelo e inspiración y por su ayuda y paciencia en el inicio y final de mi formación; la paciencia más bien al final que al principio, pero bueno, ha sido un placer trabajar codo con codo con un espíritu tan temperamental y decidido. A Cristina (estudiante) por ofrecerme la posibilidad de enseñar (un poco de) aquello que había aprendido y porque le gusta Mozart, uno de mis ídolos y uno de los personajes que más me ha influido. A Yolanda porque sin su trabajo de recogida de muestras nunca podría llevar a cabo mi proyecto de investigación, y por ser mi taxista durante una temporada, hace ya bastante tiempo, y eso de aguantarme a las siete y media de la mañana recién levantado merece un monumento por lo menos…A Ezequiel porque por fin alguien se decidió a organizar pachangas en horario champions, a Roberto por su gloriosa “olimpiada de calceta”, a Ana, por compartir conmigo el esprín final de la tesis, a Miguel por ser socio del club de fans de Conchita Martínez (lo cual tiene mucho mérito) y a Sonia por la perseverancia que mostró para conseguir ver su sueño hecho realidad a pesar de todo y de todos, y eso es digno de admirar. A Carmen, Fran y Oreste les quiero agradecer su atención y asesoramiento siempre que les he pedido algún tipo de ayuda, además de alguna que otra charla interesante (de cine y fútbol básicamente (grande Dino Zoff)) en las pocas ocasiones que tuvimos oportunidad… A todos aquellos profesores (de colegio, instituto y universidad), personajes varios y medios audiovisuales y escritos (series de televisión, películas y libros) que me han hecho elegir ser como soy y amar el estudio y la investigación. También le quiero dedicar este trabajo a mis amigos de Carballiño y alrededores, en especial a Alfredo, por haber mostrado siempre un interés desinteresado por todo aquello que hacía, y por prestarme su incondicional apoyo siempre que lo he necesitado; a Pako,… por ser un gran tipo, el tipo más auténtico que he conocido. A Serxo por los buenos momentos de ocio que hemos pasado juntos alrededor del 2Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide THR Reemplazo total de la cadera (del inglés Total Hip Replacement) TIMP Inhibidor Tisular de Metaloproteasas TKR Reemplazo total de la rodilla (del inglés Total Knee Replacement) Tm Temperatura de disociación (del inglés Melting Temperature) Wnt “Sin alas” (del inglés wingless) Introducción Introducción 5 Introducción Artrosis La Artrosis u osteoartrtosis (OA) (OMIM 165720), es un tipo de artritis causada por un deterioro progresivo e ininterrumpido del cartílago articular, modificación del hueso subcondral e inflamación del tejido sinovial. Su nombre deriva del griego “osteo”, que significa “del hueso”, “arthro”, que significa “articulación”, e “itis”, que significa “inflamación”, aunque en muchos casos se observa muy poca o ninguna. Su patofisiología es en gran medida una incógnita, aunque se sabe que influyen tanto efectos mecánicos como biológicos que provocan la desestabilización del equilibrio existente entre síntesis y degradación de los componentes de la matriz extracelular (ECM) y hueso subcondral (Kuettner KE, et al, 1995). La OA puede afectar a todas las articulaciones sinoviales del cuerpo aunque principalmente se encuentra en la rodilla, cadera, mano y la columna vertebral. La OA tiene una prevalencia muy alta en la población adulta mundial y es la principal causa de incapacidad crónica, sobre todo debido a las afectaciones de la rodilla y la cadera. Además, los tratamientos actuales para la OA pueden mejorar la sintomatología pero no pueden frenar la progresión de la enfermedad, lo que hace que al llegar a altos niveles de severidad la única solución posible es el remplazo articular. Estas características provocan que la enfermedad tenga un impacto muy elevado en la salud pública, con el consiguiente coste substancial para el individuo y la sociedad (Van Saase JL et al, 1989) (Lawrence JS et al, 1966) (Global economics and health care burden of muscoloskeletal disease, 2001). En la OA se producen cambios morfológicos, bioquímicos, moleculares y biomecánicos tanto en los condrocitos como en la ECM. Esto trae como consecuencia la degeneración cartilaginosa en áreas de tamaño irregular, fibrilación, ulceración, esclerosis del hueso adyacente, quistes óseos subcondrales y osteofitos marginales. Cuando la enfermedad se hace clínicamente evidente, la OA se caracteriza por la presencia de dolor articular, rigidez de las articulaciones afectadas con la consecuente limitación de la función, crepitación y derrame articular esporádico con grados variables de inflamación local sin repercusión sistémica. (Kuettner KE et al, 1995). (Figura 1) 6Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Figura 1: Esquema de los cambios observados en una articulación con artrosis (derecha) comparados con una articulación normal ( iz q uierda ) En la OA se pueden distinguir dos subgrupos dependiendo del factor causal, la OA primaria o idiopática, cuya etiología es desconocida, y la OA secundaria que es debida a factores conocidos como alteraciones metabólicas, anormalidades anatómicas, traumatismos o artritis inflamatorias. Se ha propuesto que factores ambientales y antropométricos, como edad, sexo, obesidad o etnicidad puedan ser causas indirectas de la OA primaria, pero su papel no está muy bien definido y es algo confuso. En general, el cartílago de mucha edad tiene alteradas funciones básicas de los condrocitos y propiedades de la ECM, además de responder de manera menos eficiente a citoquinas y factores de crecimiento. Con la edad, factores neurológicos y mecánicos que pueden actuar como protectores de la articulación, como por ejemplo la propiocepción y la fuerza muscular, también pierden eficacia con lo que también pueden contribuir al desarrollo de la OA (Slemenda C et al, 1997). La OA es más frecuente en mujeres que en hombres aunque las diferencias dependen de la articulación. Por ejemplo, la OA de la rodilla es bastante más frecuente en mujeres que en hombres pero la diferencia se reduce mucho e incluso se iguala en el caso de la OA de la cadera (Danielsson L et al, 1997). En el caso de la OA de la mano, se ha visto que las mujeres tienen un riesgo 2.6 (95% CI 1.65-4.18) veces mayor de desarrollar OA que los hombres (Carman WJ et al, 1994). La manera en que el sexo puede influir en la susceptibilidad a la OA es a través de múltiples rutas que incluyen desde factores hormonales a Introducción 7 probabilidades de prácticas de riesgo, pasando por la existencia de un distinto ambiente mecánico en la articulación (fuerza muscular relativa a la masa corporal). La masa corporal es uno de los factores de riesgo que más influyen en el desarrollo de la OA. Estudios longitudinales han demostrado que las mujeres con un índice de masa corporal (BMI) alto tienen 2.07 veces (95% CI 1.67-2.55) más riesgo de sufrir OA de la rodilla, mientras este valor es de 1.51 veces en hombres. En este mismo estudio se observó que una disminución de 2 unidades en el BMI producía un descenso del riesgo de sufrir OA (O.R. 0.46 (95% I.C. 0.240.86) (Felson DT et al, 1997). Por otra parte, en la OA de la cadera o la OA de la mano, la importancia del BMI como factor de susceptibilidad no está muy clara y en algunos estudios incluso se llega a demostrar que no existe ninguna correlación entre estos dos factores (Reijman M et al, 2007) (Sowers MF et al, 1996). Últimamente se ha resaltado la importancia de los factores genéticos como en el riesgo de desarrollo y progresión de la OA. Varios estudios hechos con gemelos situaron la heredabilidad de la OA entre el 40 y un 79% dependiendo del fenotipo (Spector TD et al, 1996) (Zhang W et al, 2005). La evidencia del componente genético de la OA se ha hecho cada vez más manifiesta. Por otra parte en estos estudios también se ha resaltado la complejidad y heterogeneidad de la enfermedad. Genética de la OA La existencia de un componente genético como factor de riesgo en la OA es una evidencia desde que Stecher observara que los nódulos de Heberden eran tres veces más comunes de lo esperado en hermanas de pacientes (Stecher RM, 1955), y Kellgren mostrara que los parientes de primer grado de pacientes con OA generalizada tenían muchas más probabilidades de tener OA (Kellgren JH et al, 1963). Posteriormente, mediante estudios con gemelos y estudios de segregación se ha cuantificado este componente genético. El porcentaje de varianza atribuible a factores hereditarios ha variado de unos estudios a otros pero se sitúa entre el 39 y el 65% en la artrosis de la mano y la rodilla, sobre un 60% en la artrosis de la cadera y sobre un 70% en la artrosis de la columna. Estos datos en conjunto sitúan la heredabilidad de la OA en torno a un 50% (Spector TD, 2004) (Loughlin J, 2001). El valor de riesgo relativo entre hermanos (Ȝs) (que expresa el riesgo que tiene el hermano de un afectado a sufrir la enfermedad comparado con el riesgo que tiene la población en general) es alrededor de dos veces mayor que la población control en el caso de la OA de la cadera y hasta 12 veces mayor que en la población control en el caso de la OA de la rodilla (Chitnavis J et al, 1997). En estos estudios también se 8Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide ha mostrado que la OA es una enfermedad (1) compleja que no se hereda de una manera mendeliana simple, o sea que es multifactorial ya que depende de muchos genes con un efecto débil, y (2) de una gran heterogeneidad, porque los resultados dependen de la articulación afectada, siendo mayor en la mano, luego en la cadera y después en la columna (Riyazi, N et al, 2005); del sexo, siendo mayor en mujeres que en hombres (Carman WJ et al, 1994); y de la etnia, existiendo variabilidad entre los resultados obtenidos en distintas poblaciones. Para abordar el estudio de la genética de la OA e identificar genes de susceptibilidad, se han seguido distintas estrategias. Estas se pueden agrupar en tres categorías: estudios de genes candidato, estudios de ligamiento de genoma completo y estudios de ligamiento de escaneado fino. Estudios de genes candidato Los estudios de genes candidato se basan en los conocimientos sobre la biología y la patofisiología de la OA así como en resultados derivados de estudios de niveles de expresión para establecer los genes diana sobre los cuales realizar el estudio de asociación. Los candidatos iniciales en este tipo de estudios se centraron en los genes que codifican para las proteínas estructurales de la ECM. Entre ellos el candidato principal fue el COL2A1, que codifica para la cadena polipeptídica Į1 del colágeno tipo II, que es el principal componente en peso seco del cartílago articular. También se estudiaron otros colágenos como el colágeno tipo IX y tipo XI y genes que codifican para otros componentes de la ECM, entre los que destacan la proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) y el gen del agrecano AGC1. En general, estos estudios no obtuvieron resultados concluyentes que apoyen el papel de polimorfismos comunes no sinónimos en genes de proteínas estructurales de la ECM como factores de riesgo en la susceptibilidad a la OA (Loughlin J, 2001). También se estudiaron genes candidato que codifican proteínas implicadas en la densidad ósea. Estas proteínas fueron estudiadas ya que se ha visto que la esclerosis subcondral es una característica de las primeras fases de la OA en algunas articulaciones, y la hipótesis de que esta esclerosis puede afectar al cartílago modificando su resistencia a la carga mecánica. Los genes más estudiados han sido los del receptor de la vitamina D, VDR, y el gen del receptor estrogénico, ESR1 (Uitterlinden AG et al, 1997).Los primeros estudios mostraron que existía asociación con ambos genes y susceptibilidad a la OA, sin embargo estas asociaciones no fueron replicadas en estudios posteriores (Loughlin J et al, 2000). En el caso de ESR1, nuevos polimorfismos han sido estudiados obteniéndose resultados positivos, por lo que este gen sigue Introducción 9 siendo un buen candidato para explicar parte de la susceptibilidad a la OA (Bergink AP et al, 2003). Otra aproximación para descubrir nuevos genes candidato ha sido realizando análisis de los niveles de expresión en cartílago articular de pacientes con OA comparados con controles sanos. Una vez identificados los genes que muestran diferentes niveles de expresión se buscan variantes genéticas en estos y se testan en estudios de asociación. De esta manera se han encontrado asociaciones de susceptibilidad a la OA con los genes BMP2 (proteína morfogenéticas del hueso 2), CD36 (receptor de trombospondina y colágeno), COX2 (ciclooxigenasa) y NCOR2 (receptor nuclear corepresor). También se encontraron genes que están asociados, no con el desarrollo de la enfermedad sino con su progresión, como por ejemplo CILP (proteína de la cap intermedia del cartílago), OPG (osteoprogeterina) TNA (tetranectina) y SRI (receptor estrogénico Į). También se encontró un gen asociado con la prevalencia y la progresión de la enfermedad, el ADAM-12 (meteloproteasa). Aún así estás asociaciones no se mantuvieron en su mayoría cuando los resultados fueron corregidos por el número de test utilizados, tan sólo en el caso de el ADAM-12 la asociación continuó siendo significativa (Valdes AM et al, 2004). El gen de la calmodulina-1, CALM-1, es otro gen que se encuentra aumentado en pacientes con OA (Mototani H et al, 2005) La calmodulina-1, CALM-1, es una proteína intracelular que se une al Ca2+ e interacciona con un gran número de proteínas. En un estudio llevado a cabo por el grupo del Dr. Ikagawa se encontraron cinco SNPs (un SNP en la región promotora, dos SNPS en el intrón-1, un SNP en la región 3’ UTR y un SNP en el intrón-3) en fuerte desequilibrio de ligamiento (LD) asociados con susceptibilidad a la OA de la cadera (P<0.0006). De todos los SNPs asociados, el que estaba situado en el promotor del gen, fue considerado como el que tenía más posibilidades de ser funcional por lo que se realizaron estudios para saber qué efectos tenía sobre la expresión del gen. Los resultados obtenidos demostraron que el alelo asociado del SNP (alelo T) provocaba un descenso de la expresión de CALM-1. También demostraron que CALM-1 influía en la síntesis de colágeno tipo II y agrecano. De esta manera construyeron un modelo de actuación mediante el cual explicaron el papel de estos SNPs en la susceptibilidad a la OA. El alelo de susceptibilidad provocaría una menor expresión de la calmodulina lo que causaría una disminución en la síntesis de colágeno tipo II y agrecano y como consecuencia un cartílago más débil. Estudios posteriores sobre este gen en población asiática no han replicado estos resultados (no publicados), y hasta ahora no se han realizado más estudios al respecto. En general, estos estudios han aportado buenos resultados sobre la genética de la OA pero tienen una serie de limitaciones debidas por una parte al conocimiento incompleto de la biología 10 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide de la OA y que en ocasiones el genotipado de un número limitado de variantes dentro de los genes investigados reduce el poder estadístico de estos estudios. Dentro del estudio de genes candidato, Hay que destacar dos estudios llevados a cabo en población japonesa, estudios en los que se han encontrado dos nuevos genes que pueden tener mucha importancia en la explicación de la susceptibilidad a la OA primaria: el gen de asporina, ASPN (Kizawa H et al, 2005) y el gen del factor de crecimiento y diferenciación 5 GDF5 (Miyamoto Y et al, 2007). La asporina es una molécula de la ECM que pertenece a la familia de los proteoglicanos pequeños ricos en leucina (SLRP) a la que también pertenecen la decorina, el biglicano, la fibromodulina y la condroaderina (Henry SP et al, 2001). Los miembros de esta familia son capaces de interactuar con otros componentes de la ECM, como el colágeno, y con factores que residan temporalmente en la ECM, como el factor de crecimiento tumoral ȕ (TGF-ȕ). El gen de la ASPN se encuentra en la región cromosómica 9q22.31, una localización que no había sido previamente encontrada como ligada con la OA en los estudios de ligamiento de genoma completo. El grupo japonés que realizó el estudio de asociación, identificó un polimorfismo tipo microsatélite que estaba asociado con OA de la rodilla y de la cadera. Este microsatélite, situado en el exon 2 del gen, está formado por repeticiones de trinucleótidos que codifican residuos de ácido aspártico (D) y tiene diez alelos (10-19D). Los alelos asociados fueron el D14, aumentado en pacientes de la rodilla y la cadera, y el D13 aumentado en los controles, por lo que D14 sería un alelo de susceptibilidad y D13 de protección. Estos resultados los confirmaron en una cohorte japonesa independiente. Posteriormente, un estudio llevado a cabo en población china obtuvo resultados similares (Jiang Q et al, 2006). El grupo japonés también demostró que el alelo D14 de asporina, asociado con susceptibilidad a la OA, provocaba una mayor inhibición de la actividad de TGF-ȕ, lo que provocaba una menor síntesis de colágeno tipo II y agrecano. Esta es una hipótesis plausible para explicar porqué este alelo se encontró asociado con susceptibilidad a la OA en esta población y le da credibilidad al resultado. Estudios posteriores realizados en población caucásica no confirmaron totalmente lo obtenido en asiáticos con lo que se concluye que asporina es un locus de susceptibilidad a la OA pero su efecto es mucho mayor en poblaciones asiáticas que en poblaciones occidentales (Nakamura T et al, 2007). El factor de crecimiento y diferenciación 5, GDF5, también conocido como proteína morfogenética derivada de cartílago 1, ha sido el último gen que ha sido encontrado asociado con susceptibilidad a la OA por el grupo del Dr. Ikegawa (Miyamoto Y et al, 2007). GDF5 es un miembro de la superfamilia del TGF-ȕ y muy relacionado con la familia de las BMPs. Diversos estudios han demostrado que GDF5 está implicado en la formación de articulaciones y Introducción 11 es expresado en las regiones articulares muy precozmente en el desarrollo También se ha visto que estimula la síntesis de proteoglicanos en explantes de cartílago articular. En el estudio de asociación llevado a cabo por el grupo del Dr. Ikegawa, un SNP funcional situado en la región 5’ UTR del gen de GDF5, mostraba una asociación muy fuerte (P = 1.8 x 10–13) con OA de la cadera en dos poblaciones japonesas independientes, y este resultado fue replicado en una población china. Los autores demostraron que el alelo asociado provocaba una disminución de la expresión del gen y de esta manera explicaban la susceptibilidad a la OA. Los resultados obtenidos del estudio de asociación así como los estudios funcionales fueron replicados en población europea aunque la magnitud del efecto fue menor (Southam L et al, 2007). Estudios de ligamiento de genoma completo Los estudios de ligamiento de genoma completo se basan en análisis de la cosegregación de loci genéticos en familias con miembros afectados por una determinada enfermedad. Se estudian una serie de marcadores repartidos por todo el genoma en pequeñas familias. Si un marcador está en ligamiento con un locus de susceptibilidad, los miembros afectados de la misma familia tendrán el mismo alelo del marcador. De esta manera se observa en qué región cromosómica se encuentran los marcadores que segregan de una manera compartida entre los miembros afectados y se buscan posibles genes candidato en la enfermedad. Los estudios más importantes se realizaron sobre pequeñas familias con parientes afectados por OA recogidos en U.K. (OA de la cadera y la rodilla), Finlandia, EEUU e Islandia (OA de la mano). En el estudio del Reino Unido, realizado en Oxford por el grupo del Dr. John Loughlin, se observó una región de ligamiento en el cromosoma 2 para la OA de la cadera, y la posterior estratificación por sexos mostró también ligamiento en los cromosomas 6, 4 y 11. (Chapman K et al, 1999) (Loughlin J et al, 1999). El estudio finlandés, fue realizado en familias con miembros que tenían OA en articulaciones interfalángicas distales (DIP), y se obtuvo ligamiento en las regiones 2q, 4q, 7p y Xcen. (Leppävuori J et al, 1999), aunque los ligamientos de los cromosomas 2 y 4 no se solapaban con los encontrados en el estudio de Oxford. El estudio Islandés fue realizado en un gran número de familias en las que existían pacientes con OA de la mano y parientes afectados, obteniendo los mejores resultados en los cromosomas 2 y 4, aunque tampoco se solaparon con los resultados obtenidos por los grupos anteriores (Stefánsson SE et al, 2003). El estudio estadounidense fue realizado utilizando la cohorte de Framingham y la OA de la mano fue caracterizada radiográficamente. En este estudio fueron encontrados varios loci, 18 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide como la proteína similar a la Chitinasa 3, la proteína de matriz Gla/MGP, la Cromomodulina, la Condrocalcina, y PARP. Estos otros componentes minoritarios de la matriz desempeñan distintas funciones como facilitar el ensamblaje de los componentes de la matriz, el mantenimiento de las propiedades mecánicas del tejido, el secuestro de de factores de crecimiento como TGF-ȕ y proteasas de ECM en compartimentos específicos de la matriz (Kizawa H et al, 2005), e interacción con los condrocitos, por lo que se postula que puedan intervenir también en la regulación de actividades celulares. El condrocito El componente celular del cartílago está constituido únicamente por los condrocitos (Archer CW et al, 2003). La morfología del condrocito varía desde redondeada o poligonal en las zonas media y profunda del cartílago, hasta una forma discoidal más o menos aplanada que se puede encontrar en las zonas superficiales del cartílago. En el tejido humano adulto, los condrocitos ocupan tan solo el 2% del volumen total. Desde un punto de vista embriológico los condrocitos de los elementos articulares son derivados del mesodermo y los del esqueleto facial derivan directamente de la cresta neural. Los primeros condrocitos en diferenciarse surgen de una aglomeración de células mesenquimáticas en los sitios en los que se van a originar los elementos esqueléticos. En este proceso de diferenciación se produce la expresión de genes específicos del tejido como Sox9, L-Sox5, Sox6 y el gen del colágeno tipoIIA (Hall BK et al, 2000) (Hall BK et al, 1992). A continuación, los condrocitos que van a formar parte del cartílago articular persisten en ese estado de diferenciación mientras que los condrocitos de la zona de crecimiento epifisiario se transforman en condrocitos hipertróficos. Estos condrocitos hipertróficos situados dentro de la zona epifisiaria llevan a cabo el crecimiento del tejido mediante el incremento del número de células, síntesis de componentes de la ECM y el incremento del volumen celular en las últimas etapas de la diferenciación. El condrocito es una célula que posee los rasgos intracelulares característicos de una célula metabólicamente activa (gran retículo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi), debido a que su papel esencialmente es el de síntesis y degradación de los componentes de la ECM en la cual se encuentran embebidos. Una muestra de esto es que el mapa proteómico de los condrocitos humanos muestra que el 26% de las proteínas sintetizadas están implicadas en la organización celular, el 16% en la producción de energía, el 14% en el tráfico proteico, el 12% en el metabolismo, y el 12% en respuesta a estrés (Ruiz-Romero C et al, 2005) (Fig 5) Introducción 19 Figura 5: Micrografía electrónica de un condrocito. La forma de la célula puede variar de aplanada o discoide cerca de la zona superficial del cartílago articular, a una forma redondeada en las zonas media y profunda. (Tomado de Archer and Francis-West, Int. J. Biochem. Cell Biol 35:404-404, 2003) Función del cartílago articular La función del cartílago articular es la de proporcionar una superficie de contacto que facilita el movimiento de los componentes de la articulación. Se caracteriza por ser un tejido que produce una muy baja fricción, sufre un mínimo desgaste y tiene una gran resistencia a las fuerzas de tensión y compresión. Estas propiedades se derivan de la particular composición y estructura de los constituyentes del cartílago y de su distribución espacial en el tejido. Desde un punto de vista puramente biomecánico, el cartílago articular puede ser entendido como un material fibroso, poroso y permeable, el cual se encuentra saturado por un fluido intersticial, el agua (Mow VC et al, 1980). Esto hace que responda a las tensiones y la carga de una manera viscoelástica (dependiente del tiempo), anisótropa (dependiente de la dirección) y no lineal (dependiente de la magnitud de la tensión). El agua es el principal componente del cartílago. Esto le proporciona un gran apoyo mecánico al tejido en respuesta a una carga aplicada permitiéndole soportar grandes presiones mediante mecanismos de presurización (manteniendo la presión constante en el tejido) y disipación de la energía (Mow VC et al, 1980). De esta manera el agua absorbería la práctica totalidad de la carga (casi el 90%) y se reduciría el estrés mecánico sobre la fase sólida de la ECM (Park S et al, 2003). El segundo componente más abundante del cartílago, el colágeno, se encuentra en forma de fibras lo que le proporciona 20 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide al cartílago articular la propiedad de resistencia a la tensión. Las fibras de colágeno no se encuentran distribuidas de una manera homogénea en el tejido sino que su disposición varía dependiendo de la zona (en profundidad) del cartílago, lo que hace que las propiedades derivadas de las fibras de colágeno tampoco sean iguales en todas las zonas (Kempson GE et al, 1973) (Roth V et al, 1980). Las propiedades biomecánicas del cartílago van decayendo conforme aumenta la edad del individuo, especialmente una vez que se han sobrepasado los 30 años lo que conlleva un aumento de la susceptibilidad a sufrir OA (Kempson GE 1991). Los cambios en las propiedades biomecánicas del cartílago relacionados con la edad se cree que son debidos en parte a la acumulación de los denominados “productos finales avanzados de glicosilación no enzimática” (AGEs), que resultan de la reacción espontánea de azúcares reducidos con las proteínas de la ECM (Chen AC et al, 2002) (Reiser KM et al, 1998). El fluido sinovial también juega un papel significativo en la biomecánica del tejido articular ya que proporciona lubricación a la articulación constituyendo una capa fina de gran viscosidad que minimiza el contacto cartílago-cartílago bajo condiciones de compresión (Hou JS et al, 1992). Además, el fluido sinovial sirve como una fuente de moléculas lubrificantes y de nutrientes para el cartílago. Dentro de las moléculas lubrificantes destacan la lubricina y la “proteína de zona superficial” (SZP), que son adsorbidas por la superficie del cartílago y ayudan a reducir la fricción en las situaciones en las que se produce un contacto real entre las dos superficies cartilaginosas (Swann DA et al, 1985). La importancia de este tipo de moléculas ha sido demostrada ya que, por ejemplo, una pérdida de la función de SZP está asociada con la enfermedad de “fallo articular juvenil”. El aporte de nutrientes al cartílago es también una función muy importante realizada por la sinovia ya que el cartílago es un tejido avascular, aneural y alinfático, por lo que se encuentra aislado del torrente nutricional del organismo (Davies DV et al, 1962). Regulación del metabolismo del cartílago En el cartílago existe una gran regulación de la síntesis y degradación de los componentes de la ECM. Varios factores participan activamente en esta regulación, influyendo directamente en la bioquímica del condrocito. En condiciones fisiológicas, los componentes de la ECM del cartílago se encuentran en un estado de renovación lenta pero continua, mantenida por un equilibrio homeostático entre los procesos catabólicos y anabólicos del condrocito. Esta actividad se encuentra controlada por la interacción de factores genéticos y ambientales, entre los que se incluyen mediadores solubles como hormonas y citoquinas (IL-1, IL-6 o TNF Į) y la carga mecánica a la que esté sometida la articulación (Helminen HJ et al, 1983). De hecho Introducción 21 varios estudios han mostrado que la carga mecánica a la que está sometida la articulación es un factor crítico en la regulación de la actividad del condrocito in vivo (Guilak F et al, 1994). Los mecanismos celulares a través de los cuales la carga mecánica es convertida en una señal bioquímica aún distan de ser totalmente entendidos. En general la evidencia que existe hasta el momento sugiere que los condrocitos pueden transducir las señales mecánicas en señales bioquímicas a través de varias rutas de señalización intracelulares e intercelulares, incluyendo las vías clásicas de segundos mensajeros como el AMP cíclico (cAMP), inositol trifosfato o iones de calcio (Stockwell RA 1978). Se han llevado a cabo numerosos experimentos para intentar comprender este proceso siendo los explantes de cartílago sometidos a diferentes cargas (comprensión, tensión, cizalla, presión osmótica o hidroestática,…), los modelos que han generado mejores resultados (Guilak F et al, 1994). El consenso general es que la carga mecánica es necesaria para el mantenimiento de la salud del tejido articular. Existen evidencias de que la compresión estática y continuada, así como la inmovilización de la articulación, inhiben la síntesis de los compuestos de la ECM, mientras que cargas cíclicas e intermitentes activan el metabolismo del condrocito (Gray ML et a 1988l) (Sah RL et al, 1991) (Guilak F et al, 1994) (Torzilli PA et al, 1997). Además estas respuestas se dan en un rango muy amplio de magnitudes de carga y exhiben una dependencia de dosis, ya que si la carga es excesiva (durante largo tiempo o de una gran magnitud) tiene un efecto deletéreo, provocando la muerte de los condrocitos, disrupción del tejido e hinchazón (Chen CT et al, 2001) (Farquhar T et al, 1996). Estos resultados demuestran que el metabolismo basal del condrocito in vivo necesita estar activado, y no funciona correctamente en un estado de no estimulación e independencia de señales externas. Degradación de la matriz del cartílago: Proteasas de matriz extracelular El papel que juegan en el proceso de degradación de la matriz las proteasas de ECM es muy relevante y ha sido objeto de estudio intensivo. Estas proteasas son sintetizadas por los condrocitos como parte del proceso normal de remodelado de la ECM. La alteración de la regulación de la expresión y activación de estas proteasas es uno de los mecanismos propuestos para explicar el desplazamiento del equilibrio entre síntesis y degradación de los componentes de la matriz que se produce en la OA y la AR. Conocer las causas, tanto genéticas como bioquímicas que producen este desequilibrio y las proteasas que se encuentran alteradas, ayudaría en gran medida a diseñar fármacos para inhibir su actividad. 22 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide El grupo de las proteasas de ECM es muy heterogéneo. Aún así se pueden encontrar algunas características estructurales y funcionales comunes que nos permiten agrupar a las proteasas de ECM en seis tipos dependiendo de su mecanismo catalítico: Glutamil proteasas, Treonín proteasas, Cisteín proteasas, Aspartil proteasas, Serín proteasas y Metaloproteasas. Numerosas proteasas de los distintos grupos han sido asociadas a patología articular, pero las aspartil proteasas, las cisteín proteasas, las serín proteasas y, en especial, las metaloproteasas (ADAMTSs y MMPs), son las que parecen tener un protagonismo mayor (Brinckerhoff CE et al, 2002). Metaloproteasas Las metaloproteasas, también conocidas como metizincinas, son, con gran diferencia, los enzimas considerados más importantes en el cartílago artrósico. Su importancia se deriva del hecho de que los dos mayores componentes de la ECM, el colágeno tipo II y el agrecano, son degradados por componentes de este grupo. Las metaloproteasas son una superfamilia de enzimas caracterizados por poseer en su sitio activo un ion metálico (generalmente Zinc) que es fundamental para su función proteolítica, así como la existencia de una metionina altamente conservada que se encuentra situada muy próxima al sitio activo. Las metaloproteasas se dividen a su vez en cuatro grupos bien diferenciados: Las astacinas (zinc-endopeptidasa del cangrejo de río Astacus astacus) (Stocker W et al, 1991), las adamlisinas (zinc endopeptidasa del veneno de serpientes de la familia Crotalidae, ADAMS y ADAMTSs) (Shannon JD et al, 1989), las serralisinas (zinc-endopeptidasas secretadas por algunas bacterias del género Serratia (Nakahama K et al, 1986) y las metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs)(zinc endopeptidasas que degradan componentes de la ECM) (Nagase H et al, 1992). Las familias más importantes con actividad en el cartílago articular son dos, las metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs) y las adamlisinas (ADAMs y ADAMTS) Metaloproteasas de matriz extracelular, MMPs Los numerosos miembros de la familia de las MMPs son capaces de degradar un gran número de componentes de la ECM del cartílago. Hasta el momento se han detectado 24 genes distintos codificadores de MMPs en el genoma humano. Las MMPs han sido relacionadas sobre todo con cáncer y enfermedades cardiovasculares (López-Otín C et al, 2007) (Phatharajaree W, et al, 2007), aunque su importancia en la degradación de la ECM les haya hecho que ocupen un lugar destacado como candidatos a explicar las lesiones que ocurren en la OA y la AR. Dentro de las Introducción 23 MMPs, podemos distinguir seis subfamilias distintas: colagenasas, estromalisinas, gelatinasas, matrilisinas, MMP de membrana (MT-MMP) y otras MMPs. (Tabla1). Con respecto al cartílago, la MMP-1 (colagenasa intersticial), MMP-2 (72 kDa gelatinasa), MMP-3 (estromalisina), MMP-7 (Matrilisina), MMP-8 (colagenasa de neutrófilos), MMP-9 (95-kDa gelatinasa) y MMP-13 (colagenasa-3), son considerados los más importantes pues participan en la degradación del agrecano y el colágeno tipo II (Lee ER et al, 1998) (Mitchell PG et al, 1996). Los sistemas encargados de la regulación de las MMPs actúan fundamentalmente a tres niveles: regulación de la expresión, activación intra o extracelular de zimógenos, e inhibición por TIMPs (inhibidores endógenos específicos). El nivel de regulación transcripcional es el más importante pero también su complejidad es muy alta debido a que existen muchas variables a tener en cuenta (Crawford H. C et al, 1996). Hay diversos trabajos en los que se ha puesto de manifiesto la existencia de una estructura común de los promotores de las MMPs con la presencia de elementos reguladores de la expresión como la caja TATA, el motivo AP-1 y elementos PEA3 además de otros (Jonat C et al, 1990) (Gaire M et al, 1994). Estos motivos son sitios consenso de unión tanto para factores de crecimiento (c-fos, c-jun, EGF y Ets) como para activadores tumorales (McDonnell S et al, 1994) (Crawford HC et al, 1994). Además se ha visto que la respuesta a estos elementos es distinta dependiendo de las secuencias promotoras que se encuentran flanqueándolas, lo que indica que existen otros elementos reguladores que determinan la expresión de éstas MMPs (Gaire M et al, 1994). Numerosos estudios han relacionado polimorfismos en estas regiones reguladoras con susceptibilidad a distintas enfermedades (Decock J et al, 2007) (Baig S et al, 2007) (Holla LI et al, 2006), destacando así la importancia de este nivel de regulación. También influyen sobre los niveles de expresión de estas MMPs diversos factores como citoquinas proinflamatorias y los factores nucleares como NF-kappa-B (Westermarck J et al, 1999). Estos agentes pueden tener distintos efectos dependiendo de los tipos celulares en los que actúan, con lo que se añade un nivel más de complejidad adicional a la regulación transcripcional de las MMPs (Bond M et al, 1998). Post-traduccionalmente, el primer nivel de regulación es el de la activación. Las MMPs son secretadas como enzimas inactivas o zimógenos. En esta forma su protodominio se encuentra plegado de manera que una cisteína situada en el mismo interacciona con el zinc del sitio activo formando un enlace tiol, lo que se denomina “cysteine switch”. Al perder este protodominio el sitio activo queda libre y la MMP se transforma en un enzima activo. Este proceso se conoce con el nombre de activación y normalmente es un mecanismo autocatalítico (Nagase H et al, 1997). 24 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Recientemente se han verificado nuevos mecanismos de activación de las MMPs en las que participan otras MMPs como la MT1-MMP (metaloproteasa de membrana 1) (Knauper V et al, 1996), proteínas como RECK y TFPI-2, y el sistema plasminógeno-plasmina (Oh J et al, 2001) (Herman MP et al, 2001).El último nivel de regulación de las MMPs es la inhibición por TIMPs (Inhibidores Tisulares de Metaloproteasas). Los TIMPs son inhibidores endógenos específicos que ejercen parte de su acción inhibidora sobre miembros de esta familia aunque también actúan sobre otras proteasas (Brew K et al, 2000). Se han caracterizado 4 miembros de la familia llamados TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 y TIMP-4. TIMP-1 y TIMP-2 son capaces de inhibir la actividad de todas las MMPs conocidas en una unión estiquiométrica 1:1, por lo que se puede decir que su actividad no es muy específica (Sato H et al, 1992). Los TIMP modulan la actividad de las MMPs por unión directa al sitio activo o la forma precursora inactiva de la MMP. Con respecto a la regulación de los TIMP cabe destacar que factores activadores del catabolismo de la ECM como la interleucina-1 (IL-1) y el factor de necrosis tumoral-Į (TNF-Į) inhiben su expresión en condrocitos (Lotz M et al, 1991). Se ha propuesto que la regulación fina de la renovación de la ECM en el cartílago depende del balance entre la actividad de MMPs y TIMPs, y alteraciones en este sistema de equilibrio han sido relacionados con niveles excesivos de degradación de la ECM similares a los observados en la OA y la RA (Cawston TE et al, 1995). Introducción 25 Tabla 1: Miembros de la familia de las Metaloproteasas de matriz extracelular (MMPs), clasificadas en seis grupos de acuerdo con su organización en dominios Grupo Enzima MMP Sustrato in vivo Colagenasas Colagenasa-1 Colagenasa-2 Colagenasa-3 Colagenasa-4 MMP-1 MMP-8 MMP-13 MMP-18 Colágeno (tipo I, II, III, VII, VIII, X y XI) Colágeno (tipo I, II y III), agrecano Colágeno (tipoI, II, III, IV, VI, IX, X y XI) Colágeno tipo I (rata) Colágeno telopéptidos, componentes de la matriz (gelatina, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, estactina, perlecano, ...) Estromalisinas Estromalisina-1 Estromalisina-2 Estromalisina-3 MMP-3 MMP-10 MMP-11 Matrilisinas Matrilisinas –1 Matrilisina-2 MMP-7 MMP-26 Colágeno (tipo I y IV), componentes de la matriz. Gelatinasas Gelatinasa-A Gelatinasa-B MMP-2 MMP-9 Colágeno, componentes de la matriz, Citoquinas proinflamatorias Colágenos, componentes de la matriz MT-MMPs MT1-MMP MT2-MMP MT3-MMP MT5-MMP MT4-MMP MT6-MMP MMP-14 MMP-15 MMP-16 MMP-24 MMP-17 MMP-25 Colágenos componentes de la matriz, Otras proteasas (activación) Otras MMPs Metaloestatasa ------- Enamelisina X-MMP(xenopus) CA-MMP CMMP (gallus) Epilisina MMP-12 MMP-19 MMP-20 MMP-21 MMP-23 MMP-27 MMP-28 Colágenos, componentes de la matriz Colágenos componentes de la matriz Agrecano, amelogenina. Gelatina Gelatina Gelatina desconocido 26 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Familia ADAMTS Las ADAMTS son enzimas con múltiples dominios que poseen una serie de características conservadas entre los distintos miembros de la familia como son la posesión de un péptido señal y un protodominio, un sitio catalítico con un átomo de zinc unido al sitio activo, una región similar a la desintegrina, una zona de repeticiónes de trombospondina-1 (TSR), un dominio rico en cisteína, y una región “spacer” libre de cisteína que en muchos miembros de la familia es seguida de nuevo por otra región TSR y un dominio C-terminal (Apte SS et al, 2004). Las ADAMTS-1,-4, -5, -9, y -15 poseen la capacidad de degradar el agrecano cortándolo en el sitio de corte exclusivo de agrecanasas situado entre los dominios G1 y G2 de la molécula (Glu373– Ala374) (Figura 6). Figura 6: Representación esquemática de la molécula de agrecano y sus sitios de corte. El agrecano tiene dos sitios de corte situados en el dominio G1/G2 IGD. El sitio de corte Asn341–Phe342 es el sitio de corte principal de las MMPs, mientras que el Glu373–Ala374 es el principal sitio de corte de las agrecanasas. También existen otros cuatro sitios de corte más en la zona rica en condroitina sulfato en los que al menos se sabe que pueden cortar ADAMTS-4 y -5. Las flechas negras indican los sitios de corte. (Tomado de 169 Porter S et al,. The ADAMTS metalloproteinases. Biochem J. 2005 Feb 15; 386(Pt 1):15-27. Review Introducción 27 Diferentes experimentos han puesto de manifiesto que las principales agrecanasas in vivo son ADAMTS-4 y -5 (Porter S et al, 2005) (Nagase H, 2003). Estudios de expresión en cartílago de pacientes con OA, mostraron que ADAMTS-1, -4, -5, -9 y -15, las cuales son todas agrecanasas, se encontraban disminuidas, mientras que ADAMTS-2, -12, -14, y -16, las cuales participan principalmente en la ruta anabólica, estaban aumentadas en comparación con los niveles obtenidos en cartílago control (Kevorkian L et al, 2004). El cartílago examinado en este experimento se corresponde con fases tardías de la OA por lo que no es representativo de la regulación de esos genes en fases tempranas de la OA, que es precisamente donde se produce la mayor degradación del agrecano. Experimentos con ratones knockout para ADAMTS-5 y ADAMTS-4, han puesto de manifiesto que la ADAMTS-5 es la principal agrecanasa in vivo (Glasson SS et al, 2005) (Stanton H et al, 2005). En estos experimentos, usando modelos murinos de OA y RA inflamatoria respectivamente,se demostró que en los ratones knockout para ADAMTS-5, pero no aquellos para ADAMTS-4, se producía una disminución de la degradación de agrecanos de la ECM. Como consecuencia, los ratones knockout de ADAMTS-5 desarrollaban una menor erosión articular y posterior lesión de la articulación que los ratones control. Estos resultados han sido muy importantes, pues ponen de manifiesto la importancia de la actividad de un sólo enzima en el mantenimiento de la integridad del tejido articular y abren las puertas a una posible diana terapéutica en la OA o la RA. En todo caso, la importancia de este enzima en humanos no es del todo clara y son necesarios más estudios para una correcta comprensión de su función. Algunos genes de ADAMTS son inducidos por factores de crecimiento, citoquinas inflamatorias y hormonas, siendo una regulación muy específica: Así, por ejemplo, TGF-ȕ induce la expresión de ADAMTS-4 pero no de ADAMTS-5 en sinoviocitos tipo fibroblasto (Kashiwagi M et al, 2004) y la hormona triiodothyronine (TE) produce la sobreexpresión de ADAMTS-5 pero no de ADAMTS-4 en la placa de crecimiento del cartílago durante la osificación endocondral. (Makihira S et al, 2003). La regulación de las ADAMTS por TIMPs también es muy importante. Su labor es mucho más selectiva que la vista en las MMPs, donde un solo TIMP regulaba la actividad de un gran espectro de enzimas. En el caso de las ADAMTS, ADAMTS-4 y -5 son inhibidas por TIMP-3, pero no por TIMP-2, -1 o -4, y ADAMTS-1 es inhibida por TIMP-3 y TIMP-2, pero no por TIMP-1 o -4 (Kashiwagi M et al, 2001). Esta selectividad sugiere que variaciones específicas en los niveles de expresión y activación de los TIMPs pueden ser muy importantes a la hora de estudiar las ADAMTSs en relación con la OA. 34 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Degradación del cartílago por las proteasas de matriz extracelular en artrosis El estudio de la degradación de la ECM en situaciones normales y patológicas sugiere que es un proceso en etapas, en el que las MMPs y las agrecanasas desempeñan papeles específicos y secuenciales. El espectro de proteasas de matriz extracelular expresadas por el tejido articular es suficiente por sí mismo para destruir completamente el colágeno estructural y el resto de los componentes de la ECM del cartílago y de las membranas basales. La proteolisis y la consecuente pérdida del agrecano ocurre en las primeras fases del proceso de degradación del cartílago, mientras que el catabolismo de la estructura fibrilar de colágeno ocurre tardíamente y representa el punto de no retorno en el daño articular (Jubb KW et al, 1980). El agrecano puede ser degradado tanto por agrecanasas como por las MMPs. Los resultados experimentales utilizando ensayos in vitro con explantes de cartílago tratados con IL1, TNF-Į o ácido retinoico, muestran que en la degradación del agrecano también podemos diferenciar dos etapas: en una primera etapa la degradación del agrecano sería llevada a cabo sólo por las agrecanasas, mientras que en etapas más tardías también pasarían a efectuar esta actividad degradativa las MMPs (Little CB et al, 2002) (Little CB et al, 1999). Se ha observado que los fragmentos de agrecano derivados de la actividad degradativa de las MMPs (neoepitopos VDIPEN) se encuentran abundantemente en el cartílago articular normal y su cantidad va aumentando con la edad, sin embargo estos neoepitopos no están significativamente incrementados en el cartílago de pacientes con OA o RA. Además, estudios inmunohistoquímicos llevados a cabo en cartílago de pacientes con OA o RA muestran que los neoepitopos VDIPEN no colocalizan con los derivados de la actividad degradativa de las agrecanasas (neoepitopos NITEGE) (Lark MW et al, 1997). En las primeras fases de la OA, lo neoepitopos NITEGE se encuentran abundantemente en el líquido sinovial, mientras que los derivados de las MMPs permanecen mayoritariamente en el cartílago (la ratio NITEGE/VDIPEN pasa de 2.5 en el líquido sinovial normal a 12 en el artrósico), lo que parece indicar que la actividad de las agrecanasas in vivo es destructiva para la matriz mientras que la actividad de las MMPs no lo es, reduciéndose al corte del extremo C-terminal de los monómeros de agrecano, dejando el resto de la molécula intacto (Sandy JD et al, 2001). Por su parte, las MMPs tomadas en conjunto son capaces de degradar la totalidad de los componentes de la ECM. Las colagenasas (MMP-1, -8 y -13), las gelatinasas A y B (MMP-2 y - 9 respectivamente), las estromalisinas (MMP-3, -10 y -11) y las matrilisinas (MMP-7 y -26) se expresan todas en niveles bajos en el tejido articular normal, sin embargo su expresión está muy incrementada en la OA y la RA (Yoshihara Y et al, 2000). La actuación de estos enzimas se Introducción 35 produce en cascada. Las MMPs son sintetizadas como zimógenos o enzimas inactivos y en su activación pueden participar diversos factores, entre ellos las MMPs de membrana. En la OA y la RA tan sólo MT1y MT3-MMP juegan un papel importante. MT1y MT3-MMP contribuye a la degradación de la matriz básicamente de una manera indirecta ya que activan a proMMP-2 y proMMP-13 mediante corte proteolítico, permitiendo que estos enzimas degraden colágeno, gelatinas y proteoglicanos (Knauper V et al, 1996) (Imai K et al, 1997). El colágeno está en forma de triple hélice siendo esta una estructura muy resistente que sólo puede ser rota por las colagenasas. MMP-13 se expresa en condrocitos y degrada colágeno tipo II preferentemente, teniendo 10 veces más actividad que MMP-1 sobre este colágeno. MMP-1 y MMP-8 son sintetizadas por los sinoviocitos y neutrófilos respectivamente y presentan su mayor actividad enzimática sobre el colágeno tipo III (MMP-1) y el colágeno tipo I (MMP-8) (Burrage PS et al, 2006). Por ello, se piensa que MMP-13 tiene un efecto primordial como colagenasa. Idea reforzada por diversos experimentos realizados en animales (Neuhold LA et al, 2001). Una vez que el colágeno ha sido degradado por las colagenasas, los fragmentos del colágeno desnaturalizado pueden ser degradados aún más por el efecto de las gelatinasas (MMP-2 y MMP-9). A continuación la degradación del resto de los componentes de la ECM es llevada a cabo por las estromalisinas y las matrilisinas. Las estromalisinas (MMP-3, -10 y -11) pueden degradar fibronectina, laminina, elastina y agrecano. Además MMP-3 puede actuar en las primeras fases de la degradación activando por corte a la pro-MMP-1 (Unemori E. N. et al, 1991). Por su parte las matrilisinas (MMP-7 y -26) pueden degradar proteoglicanos y son inducidas por TNF-Į e IL-1 beta (Ohta S et al, 1998). De esta manera, la actividad coordinada de las proteasas de ECM es por sí misma capaz de provocar la rotura de la integridad de la articulación por degradación de las fibras de colágeno y los demás constituyentes de la ECM trayendo como consecuencia la pérdida de su función, tal como se observa en la OA y la RA. Sin embargo, este esquema de actuación, está incompleto ya que todavía no se sabe si hay alguna proteasa extra en alguno de los pasos, o si este es exactamente el orden en que se producen las lesiones articulares en la OA. Artritis Reumatoide y proteasas de matriz extracelular La RA se trata en este trabajo sólo por la posible repercusión que las variantes genéticas en proteasas de ECM puedan tener en esta enfermedad y en la susceptibilidad a la RA, tanto desde el punto de vista de la degradación de la ECM como de su participación indirecta en los procesos de inflamación. La RA comparte con la OA la erosión del cartílago articular aunque 36 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide los mecanismos de iniciación y la localización de las lesiones son diferentes. El efecto observado en la RA es secundario a un proceso de inflamación crónico de tipo sistémico y con implicación del sistema inmunológico que afecta fundamentalmente a las articulaciones periféricas con distribución simétrica. Este proceso está mediado por una red interdependiente de citoquinas, prostanoides y enzimas proteolíticos (Dinarello C et al, 2002). La RA se caracteriza por dolor, rigidez, hinchazón, pérdida de la movilidad, y puede llegar a provocar la destrucción de la arquitectura de la articulación causando graves deformidades (Bresnihan B et al, 1998). Su evolución es progresiva o con remisiones y exacerbaciones, acompañándose en ocasiones de alteraciones en diferentes órganos como vasculitis, pleuritis o pericarditis. La prevalencia de la RA es bastante elevada, afectando a un 1% de la población y siendo más frecuente en mujeres que en hombres en una relación de 3:1. La etiología de la RA es desconocida pero el componente genético se estima que explica alrededor del 50% de la varianza en la susceptibilidad a la enfermedad (Harney S et al, 2002). Las proteasas de ECM en AR Debido a su función, las proteasas de ECM se han señalado como posibles efectores a la hora de explicar parte de la susceptibilidad a la RA (Mengshol JA et al, 2002). Se puede señalar un doble papel, por una parte participan en la degradación de la ECM del cartílago y el hueso de una manera similar a la ya revisada en el caso de la OA, y por otra, juegan un papel importante en el proceso inflamatorio (Firestein GS et al, 2003) (Martel-Pelletier J et al, 2001) (Parks WC et al, 2004). Estudios recientes han mostrado que MMP-3 es la proteasa más abundante en la RA tanto en las primeras etapas de la enfermedad como en estados más avanzados. En este estudio también se observó que la concentración sérica de MMP-3 estaba fuertemente correlacionada con la severidad de la RA y que los niveles en suero de esta metaloproteasa podían ser utilizados como marcadores para predecir el daño articular (Yamanaka H et al, 2000). Sin embargo, estudios de asociación con polimorfismos reguladores en la región promotora de esta proteasa no han encontrado asociación con susceptibilidad a la RA (Tsukahara S et al, 2008) aunque sí se ha visto asociación con progresión radiográfica (Nemec P et al, 2007). Otros estudios muestran que los niveles de MMP-1, MMP-9 y MMP-13 también se encuentran elevados en el suero de pacientes con RA (Fiedorczyk M et al, 2006). Con respecto a las otras proteasas de ECM, destacan algunos trabajos que resaltan el papel de ADAMTS-12 y ADAMTS-7 por su participación en la degradación de la proteína oligomérica de la matriz (COMP) (Liu CJ et al, 2006) (Liu CJ et al, 2006(2)). Introducción 37 En lo que respecta al papel de las proteasas de ECM en la inflamación, varios trabajos señalan el papel de MMP-2 y MMP-9, y también de la ADAM-15. Se ha visto que los niveles de expresión de MMP-2 y MMP-9 se encuentran aumentados en pacientes con RA, aunque sus efectos parecen antagónicos (Burrage PS et al, 2006). En el caso de MMP-2 se ha visto que tiene efectos anti-inflamatorios degradando moléculas biológicamente activas como citoquinas, quimiocinas o receptores de factor de crecimiento (Xue M et al, 2007). Por el contrario, MMP-9 puede actuar como enzima proinflamatorio facilitando la infiltración leucocitaria y activando a otras proteasas (Nemec P et al, 2007). ADAM-15 por su parte participa en los fenómenos de inflamación mediante mecanismos de interacción célula-célula, interacción célula-ECM y actividad de podado celular (Charrier-Hisamuddin L et al, 2007). Hipótesis Hipótesis 41 Hipótesis 1. Las proteasas de ECM son importantes en múltiples procesos en OA y RA. La degradación del cartílago es el más evidente, pero también juegan un papel relevante en la activación de otras proteasas, liberación de factores solubles secuestrados en la matriz, desactivación de mediadores inflamatorios y regulación de la interacción entre los condrocitos y la matriz. 2. Es muy difícil determinar qué funciones de las proteasas dependen específicamente de alguna de ellas ya que su actividad in vitro es bastante redundante. 3. La investigación genética permite identificar proteasas críticas como aquellas que muestran frecuencias alélicas diferentes en pacientes con OA y RA en relación con cambios modestos en los niveles de expresión o en la función. 4. La solidez de las conclusiones de la investigación genética depende de su potencia estadística, por lo tanto, la obtención de grandes tamaños muestrales y la replicación en estudios independientes son requisitos imprescindibles para el progreso de esta área de investigación biomédica. Objetivos 50 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide b. Artritis reumatoide Publicación 3 •Rodriguez-Lopez J, Perez-Pampin E, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A Regulatory polymorphisms in extracellular matrix protease genes and susceptibility to rheumatoid arthritis: a case-control study Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R1 (1 November 2005) 2. Estudios de replicación a FRZB Publicación 4 •Rodriguez-Lopez J, Pombo-Suarez M, Liz M, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A. Further evidence of the role of frizzled-related protein gene polymorphisms in osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Aug; 66(8):1052-5. Epub 2007 Jan 19 b. ASPN Publicación 5 •Rodriguez-Lopez J, Pombo-Suarez M, Liz M, Gomez-Reino JJ, Gonzalez A Lack of association of a variable number of aspartic acid residues in the asporin gene with osteoarthritis susceptibility: case-control studies in Spanish Caucasians Arthritis Research & Therapy 2006, 8:R55 (10 March 2006). Publicación 6: •Nakamura T, Shi D, Tzetis M, Rodriguez-Lopez J, Miyamoto Y, Tsezou A, Gonzalez A, Jiang Q, Kamatani N, Loughlin J, Ikegawa S. Meta-analysis of association between the ASPN D-repeat and osteoarthritis. Hum Mol Genet. 2007 Jul 15; 16(14):1676-81. Epub 2007 May 20. PMID: 17517696. Resultados, discusión y procedimiento experimental 51 c. GDF5 Publicación 7: a. Southam L & Rodriguez-Lopez J, Wilkins JM, Pombo-Suarez M, Snelling S, GomezReino JJ, Chapman K, Gonzalez A, Loughlin J. An SNP in the 5'-UTR of GDF5 is associated with osteoarthritis susceptibility in Europeans and with in vivo differences in allelic expression in articular cartilage. Hum Mol Genet. 2007 Sep 15; 16(18):2226-32. Epub 2007 Jul 6. PMID: 17616513 Publicación 8: •Kay Chapman1, Atsushi Takahashi2, Ingrid Meulenbelt3, Chris Watson, Julio Rodriguez-Lopez, Rainer Egli1, Aspasia Tsezou, Konstantinos N.Malizos, Margreet Kloppenburg, Dongquan Shi, Lorraine Southam, Ruud van der Breggen, Rachelle Donn, Jianghui Qin, Michael Doherty, P Eline Slagboom, Gillian Wallis, Naoyuki Kamatani, Qing Jiang, Antonio Gonzalez, John Loughlin and Shiro Ikegawa. A meta-analysis of European and Asian cohorts reveals a global role of a functional SNP in the 5’ UTR of GDF5 with osteoarthritis susceptibility. Hum Mol Genet. 2008 Feb 24 Resultados, discusión y procedimiento experimental 53 1. Proteasas de matriz extracelular a. Artrosis a.1 ADAMTs y Adamlisinas (ADAMs) Resultados, discusión y procedimiento experimental 55 ARTHRITIS & RHEUMATISM Vol. 58, No. 2, February 2008, pp 435–441 DOI 10.1002/art.23201 © 2008, American College of Rheumatology Genetic Variation Including Nonsynonymous Polymorphisms of a Major Aggrecanase, ADAMTS-5, in Susceptibility to Osteoarthritis Julio Rodriguez-Lopez, 1 Zehra Mustafa, 2 Manuel Pombo-Suarez, 1 Konstantinos N. Malizos, 3 Ignacio Rego, 4 Francisco J. Blanco, 4 Aspasia Tsezou, 3 John Loughlin, 2 Juan J. Gomez-Reino, 5 and Antonio Gonzalez 1 Objective. Given the recent characterization of ADAMTS-5 as the main aggrecanase of cartilage destruction in mouse models, we explored whether genetic variation and, in particular, putative damaging polymorphisms in the ADAMTS-5 gene modify susceptibility to osteoarthritis (OA). Methods. Two likely deleterious nonsynonymous single-nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified in ADAMTS-5 by bioinformatics analysis, rs2830585 in exon 5 affecting a thrombospondin 1 motif, and rs226794 in exon 7. Exploration of their role was carried out in 3 steps, discovery, extension, and replication, on samples obtained from 4 European Caucasian collections, comprising a total of 2,715 patients with knee, hip, or hand OA and 1,185 OA-free controls. In addition, 6 tagSNPs were studied to fully evaluate genetic variation in the ADAMTS-5 locus. Results. Initial analyses of 2 sample collections (n ⴝ277 and n ⴝ159) showed a trend toward decreased frequency of the putative deleterious allele of rs226794 among patients with severe knee OA (Pⴝ0.047 versus controls). However, results in patients with knee OA from 2 additional sample collections (n ⴝ360 and n ⴝ 265) did not confirm this trend. No association was found with hip OA or hand OA. None of the other SNPs or haplotypes constructed with these SNPs showed a significant association with OA susceptibility. Conclusion. Use of several collections of OA samples allowed us to obtain sound evidence against the participation of genetic variation in ADAMTS-5 in OA susceptibility. These results indicate the need to further explore the function of this aggrecanase in human OA to determine whether it is as critical as has been observed in mouse models. Primary osteoarthritis (OA) is a complex disease without obvious causes, in which a major genetic component has been demonstrated (1,2). This etiologic component accounts for a large fraction of disease variability, with heritability estimates of ⬃50%. Candidate gene approaches have already allowed identification of some of the genetic variants that modify OA susceptibility. The genetic effects of each of these polymorphisms are small. Nevertheless, they provide exciting starting points for new hypotheses and for the exploration of disease mechanisms in OA. In the present study we explored genetic variation in a critical protease in the initial stages of OA, ADAMTS-5, and, in particular, in 2 nonsynonymous single-nucleotide polymorphisms (nsSNPs) that are likely to affect the function of ADAMTS-5 (by altering the amino acid sequence of the protein). This protease Supported by the Instituto de Salud Carlos III (Spain), with participation from the European Union FEDER Fund, and by the Fundacion MMA (Spain). Mr. Rodriguez-Lopez is recipient of a Spanish Ministry of Education scholarship. Dr. Pombo-Suarez is recipient of a Fundacion Espan˜ola de Reumatologia bursary. Dr. Loughlin’s work was supported by Research into Ageing (UK) and the Arthritis Research Campaign (UK). 1 Julio Rodriguez-Lopez, MSc, Manuel Pombo-Suarez, MD, Antonio Gonzalez, MD, PhD: Hospital Clinico Universitario Santiago, Santiago de Compostela, Spain; 2 Zehra Mustafa, MSc, John Loughlin, PhD: University of Oxford, Oxford, UK; 3 Konstantinos N. Malizos, MD, PhD, Aspasia Tsezou, PhD: University of Thessaly, Larissa, Greece; 4 Ignacio Rego, MSc, Francisco J. Blanco, MD: CH Universitario Juan Canalejo, A Corun˜a, Spain; 5 Juan J. Gomez-Reino, MD, PhD: Hospital Clinico Universitario Santiago, and University of Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, Spain. Address correspondence and reprint requests to Antonio Gonzalez, MD, PhD, Laboratorio de Investigacion 2, Hospital Clinico Universitario de Santiago, Travesia de Choupana s/n, 15706 Santiago de Compostela, Spain. E-mail: Antonio.Gonzalez.Martinez. [email protected]. Submitted for publication April 24, 2007; accepted in revised form November 5, 2007. 435 56 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide seems critical in the catabolic component of OA because it is involved in degradation of aggrecan, which is one of the major components of cartilage extracellular matrix. Loss of aggrecan precedes collagen damage at the beginning of the OA lesion (3). Recent evidence indicates that, in vivo, the only critical aggrecanase, at least in mice, is ADAMTS-5 (4,5). Its absence was observed to prevent lesions in animal models of OA and inflammatory arthritis. Herein we studied 8 SNPs that cover genetic variation in ADAMTS-5 and its neighboring sequences. Two of these SNPs were nsSNPs that were shown, by bioinformatics analysis, to be deleterious in ADAMTS-5 function. The remaining 6 were tagSNPs. The results of our study, however, did not reveal any significant effect on OA susceptibility. PATIENTS AND METHODS Patients and controls. Three of the 4 sample collections that were used for our study have been described previously (6–8). Collections were obtained from the Hospital Clinico de Santiago in Spain, from the University of Thessaly in Greece, from the Institute of Musculoskeletal Sciences at Oxford in the UK, and from the Hospital Juan Canalejo in Corunna, Spain. The collection from Santiago included samples from patients with severe primary OA who were undergoing total hip replacement (THR) (307 patients, of whom 185 were women and 122 were men) or total knee replacement (TKR) (277 patients, of whom 223 were women and 54 were men) and patients with hand OA (242 patients, of whom 213 were women and 27 were men, with unrecorded data for 2 patients). Controls comprised 294 subjects (115 women and 179 men) older than age 55 years who did not show clinical manifestations compatible with OA; only 31.6% of the recruited control subjects older than age 55 years passed this selection. The median age of the control subjects was 68 years (interquartile range 61–75 years) at the time of recruitment. The collection from Thessaly included samples from 159 patients with OA who had undergone TKR (139 women and 20 men) and 193 control subjects (137 women and 56 men). The control subjects were older than age 45 years and were free of clinical OA. The collection from Oxford comprised 360 samples from patients with OA who had undergone TKR (196 women and 164 men), 1,105 samples from patients with OA who had undergone THR (629 women and 476 men), and samples from 698 control subjects (356 women and 342 men). The control subjects had no signs or symptoms of arthritis or joint disease (pain, swelling, tenderness, or restriction of movement). The median age of the control subjects at the time of recruitment was 69 years (range 55–89 years). Due to ethical and financial constraints, the hip and knee joints of the control subjects were not subjected to radiographic analysis. The collection of samples from Corunna was obtained from patients with clinically symptomatic and radiographically confirmed knee OA (265 patients, of whom 222 were women and 43 were men). All patients and controls gave their informed consent for the study. Each collection of samples was obtained with the approval of the respective ethics committees. SNP selection. Seven nsSNPs in ADAMTS-5 were found in the dbSNP database, of which 2, rs2830585 G/A (R614H in exon 5) and rs226794 C/T (P692L in exon 7), were predicted to be both frequent in and deleterious for ADAMTS-5 protein function. Functional prediction was done using SIFT software (9). TagSNPs were selected from the HapMap CEPH (Utah residents with ancestry from northern and western Europe) database and included the aforementioned nsSNPs of the ADAMTS-5 gene as well as 10 kb of flanking sequence to each side (Figure 1). The tagSNPs were selected using Haploview software, in which an r 2 threshold of 0.8 was applied in the pairwise correlation, and SNPs with a minor allele frequency ⬍10% were excluded. Genotyping. The rs226794 nsSNP and the 6 tagSNPs (rs3746836, rs162495, rs162488, rs9984329, rs233896, and rs233601) were genotyped by single-base extension with the SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) in 2 independent assays. A fluorescence 5⬘exonuclease assay that was designed as a TaqMan Genotyping Assay (Applied Biosystems) was used to genotype the rs2830585 nsSNP. Several samples with different genotypes were sequenced to check the accuracy of the results (details on the oligonucleotide sequences are available online at http:// bioinformatics.cesga.es/supmat/). The genotype call rate was 0.98 for both rs226794 and rs2830585 across sample collections and across patients and controls. For the tagSNPs, the genotype call rate was 0.85 in UK samples, 0.93 in Greek samples, and 0.97 in Spanish samples. Genotype frequencies were in Hardy-Weinberg equilibrium. Figure 1. Map of linkage disequilibrium (D⬘) of the 8 tag singlenucleotide polymorphisms in the ADAMTS-5 gene. 436 RODRIGUEZ-LOPEZ ET AL Resultados, discusión y procedimiento experimental 57 Statistical analysis. Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK) and Haploview software were used for the data analyses. Allele frequencies as well as odds ratios and their 95% confidence intervals were calculated. Comparison of allele frequencies was performed with a chi-square test. Evidence of a gene-dose effect was evaluated with univariate logistic regression, applying an additive genetic model. Estimation of the linkage disequilibrium of haplotype frequencies and comparison of those frequencies between patients and controls were carried out with Haploview software. Data from the populations of Spain, Greece, and the UK were combined for assessment by Mantel-Haenszel test, using 2 ⫻2 contingency tables that were stratified by sample collection. Homogeneity of the effect size across collections was assessed with the Breslow-Day test. Correlation analysis, Student’s t-test, and chi-square analysis were used to explore possible associations of OA clinical features with the genotypes at the 2 nsSNPs. Available information on the demographic and clinical characteristics of the patients in the Santiago collection comprised sex, age at disease onset, age at surgery, time from disease onset to surgery, body mass index, assessment of pain and disability on a visual analog scale, family medical history, presence of Heberden’s or Bouchard’s nodes, and OA in other joints. Control subjects were also analyzed for age at recruitment. RESULTS Discovery step. Our initial analysis involved genotyping 2 nsSNPs of ADAMTS-5, rs2830585 G/A, which provokes an R614H substitution in exon 5, and rs226794 C/T, which codes for a P692L change in exon 7, in the 3-branched OA sample collection from Santiago. No significant differences were detected between any of these 3 OA groups and the controls (Table 1). However, there was a trend toward significance in the decreased frequency of the minor allele, T, of rs226794 among the OA patients who underwent TKR as compared with the control subjects (frequency of T allele 8.2% in OA TKR patients versus 11.5% in control subjects; P⫽0.06). Analysis of the genotype frequencies showed a dose effect of the T allele of rs226794, with the differences between OA TKR patients and controls approaching significance (frequencies of CC, CT, and TT 83.9%, 15.7%, and 0.4%, respectively, in OA TKR patients versus 79.4%, 18.2%, and 2.4%, respectively, in control subjects; Pfor trend ⫽0.06). No differences between female and male subjects were observed in these analyses of the OA TKR and control sample sets. Furthermore, there was a lack of effect of the rs226794 nsSNP among patients with hand OA and among OA patients who underwent THR, as determined in samples from the Santiago collection. The latter finding was confirmed in a large number of samples from the Oxford collection (Table 1). The other nsSNP, rs2830585, showed a trend that was contrary to our hypothesis. Frequencies of the putative damaging allele (the A allele) in rs2830585 were seemingly larger in the OA patients compared with the control subjects (Table 1), especially in the group of patients with hand OA (23.0% versus 18.5% in controls; P⫽0.08). Genotypes at the 2 nsSNPs did not correlate with Table 1. Frequencies of alleles of the 2 putative damaging nonsynonymous single-nucleotide polymorphisms in ADAMTS-5 in different groups of patients with osteoarthritis (OA) and OA-free controls* Collection, group rs226794 C/T P692L rs2830585 G/A R614H T allele, % POR (95% CI) A allele, % POR (95% CI) Santiago Control (n ⫽588) 11.5 – – 18.5 – – OA TKR (n ⫽554) 8.2 0.06 0.68 (0.5–1.0) 21.0 0.3 1.16 (0.9–1.6) THR (n ⫽614) 11.3 0.9 0.98 (0.7–1.4) 20.5 0.4 1.13 (1.0–1.8) Hand OA (n ⫽484) 9.6 0.3 0.81 (0.5–1.2) 23.0 0.08 1.31 (1.0–1.8) Thessaly Control (n ⫽386) 9.8 – – OA TKR (n ⫽318) 8.0 0.4 0.80 (0.5–1.4) Oxford Control (n ⫽1,396) 11.1 – – OA TKR (n ⫽720) 11.2 0.9 1.01 (0.8–1.4) THR (n ⫽2,210) 9.9 0.3 0.88 (0.7–1.1) Corunna Knee OA (n ⫽530) 11.1 0.8† 0.96 (0.7–1.4)† *OR⫽odds ratio; 95% CI ⫽95% confidence interval; n ⫽number of alleles; TKR ⫽total knee replacement; THR ⫽total hip replacement. † Compared with Santiago controls. ADAMTS-5 SNPs IN OA SUSCEPTIBILITY 437 58 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide the clinical features of OA in any of the patient groups, nor did the genotypes correlate with the age at recruitment in the OA-free controls. Specifically, the putative protective alleles were not more frequent in older control subjects; among the 40 control subjects older than age 79 years, the frequency of the rs226794 T allele was 11.5%, and the frequency of the rs2830585 A allele was 21.2%. The 2 nsSNPs showed linkage disequilibrium, as evaluated with the D⬘parameter (D⬘⫽0.67), but there was a very weak correlation in their genotypes (r 2 ⫽ 0.012). Haplotype estimation from the genotypes of the 2 nsSNPs in the Santiago sample collection revealed only 3 of the 4 possible haplotypes (GC, AC, and GT) that accounted for ⬎99% of all chromosomes. The unique haplotype containing the minor allele of the rs226794 SNP (haplotype GT in the rs2830585, rs226794 order) was slightly less frequent in the OA patients who underwent TKR than in the control subjects (frequency of GT 7.5% in OA TKR patients versus 10.9% in controls; P⫽ 0.048). Since this was the only haplotype with the minor rs226794 allele, this result was equivalent to the findings with regard to rs226794 allele frequencies. Multivariate logistic regression analysis showed a lack of detectable interaction between the 2 nsSNPs (results not shown). None of the analyses showed a significant effect in the OA patients who underwent THR or in the patients with hand OA from the Santiago collection. Extension step. Given the suggestive evidence for an effect of the rs226794 SNP in OA TKR patients from the Santiago collection, we analyzed additional OA TKR samples from Thessaly. In this extension step (Table 1), the frequency of the T allele of the rs226794 SNP was not significantly different between OA TKR patients and controls, although the nominal percentage was smaller among the OA TKR patients. Combined analysis of the Santiago and Thessaly OA TKR samples (Table 2) showed a slightly significant difference compared with controls, indicating that the T allele of this nsSNP could be less frequent among OA TKR patients. Genotype analysis of these data yielded results similar to those for the allele frequencies (P⫽0.024 for OA patients who underwent TKR versus control subjects). As a result, we decided to replicate this analysis in other sample collections. Replication steps. The rs226794 SNP was genotyped in the 360 OA TKR samples and 698 control samples from the Oxford collection. The frequency of the minor allele of rs226794 was not different in the OA TKR patients compared with the control subjects (Table 1). Combined analysis of the Santiago, Thessaly, and Oxford OA TKR sets, using the Mantel-Haenszel approach, showed a lack of association of this nsSNP with TKR in these patients (Table 2), indicating that this polymorphism does not modify susceptibility to severe knee OA requiring joint replacement. Results from each collection and the combined results from the 3 collections were similar between female and male subjects (Table 2). We also obtained an additional sample collection from Corunna, Spain, a town near Santiago, that contained samples from patients with symptomatic and radiographic knee OA (without the need for TKR). Comparison of the frequency of the T allele of the rs226794 nsSNP in these patients with that in the control Table 2. Effect of the rs226794 nonsynonymous single-nucleotide polymorphism in different combined collections of samples from OA TKR patients and controls* Collections, group Mantel-Haenszel test Breslow-Day test, P†T allele, % OR (95% CI) P Santiago and Thessaly Control (n ⫽974) 11.1 – – – OA TKR (n ⫽872) 7.9 0.73 (0.5–1.0) 0.047 0.7 Santiago, Thessaly, and Oxford Control (n ⫽2,370) 11.0 – – – OA TKR (n ⫽1,592) 9.5 0.87 (0.7–1.1) 0.2 0.3 Female Control (n ⫽1,216) 10.9 – – – OA TKR (n ⫽1,116) 9.0 0.88 (0.7–1.2) 0.4 0.8 Male Control (n ⫽1,154) 11.1 – – – OA TKR (n ⫽476) 10.6 0.97 (0.7–1.4) 0.9 0.8 * See Table 1 for definitions. † Test of heterogeneity. 438 RODRIGUEZ-LOPEZ ET AL Resultados, discusión y procedimiento experimental 59 subjects from Santiago showed that the frequency of this allele was not decreased in the OA TKR patients (Table 1). TagSNP and haplotype analyses. To further investigate the possible involvement of ADAMTS-5 genetic variation, we selected tagSNPs that, together with the 2 nsSNPs, cover the gene and its neighboring sequences. We studied them in all of the OA TKR and control samples. None of the tagSNPs was found to be associated with susceptibility to OA, when analyzed with a Mantel-Haenszel test that accounted for the different sample collections (Tables 3 and 4). Two of the tagSNPs showed significant effect heterogeneity between the collections. The frequency of the minor allele rs233601 was significantly greater in Spanish OA TKR patients compared with Spanish controls and UK or Greek OA TKR patients or controls. The frequency of the minor allele rs162495 was significantly lower in Greek OA TKR patients compared with Greek controls and Spanish or UK OA TKR patients or controls. These differences were most likely due to chance fluctuations and were not related to OA susceptibility. In addition, haplotypes of the tagSNPs were estimated, because they could be used to uncover genetic effects of polymorphisms that have not been genotyped. However, the frequencies of the haplotypes of the tagSNPs were not different between the OA TKR patients and controls (Table 5). DISCUSSION Study of genetic susceptibility factors in OA requires large sample collections to differentiate between genuine effects and random variation in genotype frequencies (1,2). In the present study we used a sufficiently large and varied amount of DNA samples to obtain sound conclusions. One of the explored nsSNPs, rs2830585, showed unpromising results in our initial analyses, and was therefore not studied further. The other nsSNP, rs226794, appeared promising in patients with severe knee OA in the first 2 collections analyzed. However, the results from 2 additional sample collections did not confirm this trend. These observations led us to conclude that our initial results were most likely due to chance variation. In addition, we were able to Table 3. Associations of alleles of the ADAMTS-5 tag single-nucleotide polymorphisms (tagSNPs) in OA TKR patients and controls from the combined Spanish, Greek, and UK sample collections* TagSNP Minor allele, % Mantel-Haenszel test Breslow-Day test, P† Controls (n ⫽1,710) OA TKR (n ⫽1,562) OR (95% CI) P rs233601 (T/C) 25.1 24.9 1.01 (0.86–1.19) 0.91 0.023 rs233896 (A/C) 42.3 43.2 0.96 (0.83–1.11) 0.61 0.86 rs9984329 (A/G) 37.8 37.7 1.01 (0.87–1.67) 0.91 0.28 rs162488 (G/A) 32.3 31.6 1.03 (0.89–1.21) 0.62 0.25 rs162495 (A/G) 37.5 35.0 1.11 (0.76–1.05) 0.15 0.04 rs3746836 (C/T) 25.8 28.0 1.14 (0.96–1.35) 0.12 0.22 * TagSNPs are listed in 5⬘–3⬘order. See Table 1 for other definitions. † Test of heterogeneity. Table 4. Frequencies of alleles of the 6 tag single-nucleotide polymorphisms in OA TKR patients and controls from each sample collection* Collection, group rs233601 (T/C) rs233896 (A/C) rs9984329 (A/G) rs162488 (G/A) rs162495 (A/G) rs3746836 (C/T) C allele, % PC allele, % PG allele, % PA allele, % PG allele, % PT allele, % P Santiago Control (n ⫽588) 25.8 – 40.1 – 37.7 – 30.2 – 37.4 – 26.5 – OA TKR (n ⫽524) 31.5 0.04 41.1 0.72 33.7 0.17 29.5 0.81 39.6 0.46 25.1 0.61 Thessaly Control (n ⫽386) 24.0 – 43.4 – 37.3 – 30.7 – 38.4 – 26.5 – OA TKR (n ⫽318) 21.3 0.40 45.9 0.51 39.2 0.62 34.8 0.26 28.7 0.01 28.7 0.53 Oxford Control (n ⫽736) 25.2 – 43.6 – 38.3 – 35.0 – 37.2 – 24.8 – OA TKR (n ⫽720) 21.6 0.11 43.6 1.00 40.1 0.50 31.7 0.19 34.4 0.29 29.8 0.04 * See Table 1 for definitions. ADAMTS-5 SNPs IN OA SUSCEPTIBILITY 439 66 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide The ADAMTS family is also of great interest in OA because it contains all the known aggrecanases (ADAMTS-1, -4, -5, -8, -9, -15); enzymes that cut the aggrecan core protein in a particular site that seems critical for cartilage damage in arthritis (15). One of the aggrecanases, ADAMTS-5 has been shown to be necessary for cartilage damage in murine models of arthritis (16, 17). However, it is unknown if it is as crucial in humans as in these models (18). We have recently shown that two putative damaging nsSNPs in the ADAMTS5 gene are not associated to OA protection and, more generally, that genetic variation in this gene seems irrelevant for OA predisposition (19). Other three ADAMTS, ADAMTS-2, -3 and -14, are involved in processing of collagen precursors, type I, II or III procollagen, and receive the name of procollagen-Npropeptidases because they cleave the N-terminal propeptide. In addition, some of the ADAMTS are able to degrade other matrix components apart from aggrecan and, in this way, they could be involved in OA. None is known to interact with integrins in spite of their disintegrin-like domain (15). Systematic analyses of gene expression in OA cartilage by microarray hybridization have shown a few significant changes among ADAM and ADAMTS proteases, down-regulation of ADAM8 in early OA (20), and increase in ADAM12 in damaged regions versus preserved cartilage (21). In contrast, studies addressing specifically the genes of these proteases have shown a wide array of changes in OA (22, 23)::: up-regulation of ADAMTS-2, -10 and -16 in OA cartilage and synovium; up-regulation of ADAMTS-3, -7, -12, -14, -15, -18 and -20 only in OA cartilage with no changes in synovium; up-regulation of ADAMTS-8, -13 and -17 only in synovium; and down-regulation of ADAMTS-1, -4, 5 and -9 in OA cartilage and synovium. Also indicative of the possible relevance of some ADAM or ADAMTS proteases are studies showing genetic association to OA of a nsSNP in ADAM12 (24). Here, we have examined genomic sequences of all the ADAMTS and ADAM members looking for nsSNPs. Those predicted to be damaging for protein function were studied in several sets of samples including a variety of OA phenotypes and one came out as associated with OA in ADAMTS14. MATERIAL AND METHODS Patients and controls Six already described sample collections of European Caucasians were used (19, 25-29). Details of patient and control selection are omitted here. They were divided in two sets, a first set included samples with a severe OA phenotype in which all SNPs were analyzed in the Santiago Resultados, discusión y procedimiento experimental 67 laboratory. The second set, included other OA phenotypes in which only the rs4747096 SNP was studied in three different laboratories. The first set included samples from three collections, the Hospital Clinico de Santiago in Spain; the Institute of Musculoskeletal Sciences, University of Oxford in the UK; and the Departments of Biology and Genetics and of Orthopaedics, University of Thessaly in Greece. The Santiago collection included patients with severe primary OA that were undergoing total hip replacement (THR; 307 subjects, 185 women and 122 men) or total knee replacement (TKR; 262 patients, 211 women and 51 men) and patients complaining of hand OA (HOA; 242 subjects, 213 women, 27 men and 2 unrecorded). Controls were 294 subjects (115 women and 179 men) older than 55 years that did not show clinical manifestations of OA. The Oxford’s collection was of 1105 THR samples (629 females and 476 males), 360 TKR samples (196 women, 164 men), and 698 controls (356 women, 342 men). The Thessaly’s collection included 159 TKR patients (139 women, 20 men) and 193 controls (137 women, 56 men). Therefore, the first set amounted to 1412 THR, 781 TKR, 242 HOA and 1185 control samples. The second set of sample collections was made of 265 clinically symptomatic and radiographically confirmed knee OA (KOA; 222 women and 43 men) from the Hospital Juan Canalejo, A Corunna in Spain (this collection did not include controls); 358 generalized OA samples (292 women and 66 men of Dutch ancestry sib pairs) from the Genetics osteoARthritis and Progression (GARP) study and 712 controls (409 women, 303 men) of the Leiden University Medical Centre in the Netherlands; and 317 controls and 159 OA samples (all women) selected randomly (a subject from each twin pair) from the UK Adult Twin Registry of the Twin Research and Genetic Epidemiology Unit in London. OA in this later collection was defined as radiographic OA of the hand (n =72), knee (n = 71) or hip (n =71; 5 of them also with OA in the knee). Patients and controls from every collection gave their informed consent. Each collection of samples has obtained the approval of the relevant ethics committee. SNP prediction The gene sequences of the 18 ADAM and the 18 ADAMTS (except the previously studied ADAMTS5 (19)) proteases whose genome sequence is available were searched for nonsynonymous SNPs (nsSNPs) in the dbSNP database of the NCBI. The 152 nsSNPs that were found were filtered for validation status considering information in the same database. The likely functional consequences of the nsSNPs were assessed with two prediction softwares: SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) (30) (available at http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html) that uses alignment to orthologous and homologue protein sequences to determine if the specific 68 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide aminoacid is conserved, and PolyPhen (Polymorphism Phenotyping) (31) (available at http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/index.html) that is based on empirical rules derived from phylogenetic and structural information that are applied to the sequence. Four nsSNPs were predicted as likely deleterious: rs1054480 C/T or P1177S in exon 22 of ADAMTS2, rs4747096 A/G or E1049G in exon 21 of ADAMTS14, rs1019747 T/C or S104P in exon 3 of ADAMTS16, and rs3740199 G/C or G48R in exon 2 of ADAM12. We also searched the PubMED bibliographic database for functional evidence of SNPs modifying ADAM or ADAMTS expression, but none was found. nsSNP Genotyping The three sample collections of the first set and the Corunna collection were genotyped by multiplex single-base extension in Santiago. Primers and probes for the four nsSNPs were designed with the FastPCR (obtained from Dr Ruslan Kalendar, University of Helsinki) and Primer3 softwares (Steve Rozen et al) (available at http://frodo.wi.mit.edu/). PCR fragments were amplified in a multiplex PCR reaction (Qiagen Multiplex PCR, Valencia, CA, USA). Oligonucleotide sequences and PCR conditions are detailed in Supplementary Table 1. PCR products were purified by digestion with Exonuclease I (Epicentre, Madison, WI, USA) and shrimp alkaline phosphatase (Amersham Biosciences, Barcelona, Spain). Single-base extension reactions were done with the SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Samples were analyzed in the ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Several samples with different genotypes were sequenced to check for accuracy of results with the Big Dye Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). The rs4747096 nsSNP was studied also in samples from the Leiden (GARP) and London (UK Adult Twin Registry) collections. The Leiden samples were genotyped by mass spectrometry (the homogeneous MassARRAY system; Sequenom, San Diego, CA), using standard conditions. The London samples were genotyped at Kbioscience Ltd (Hertfordshire UK) using the KASPar chemistry, which is a competitive allelespecific PCR genotyping system using FRET quencher cassette oligos (http://www.kbioscience.co.uk/genotyping/genotyping-chemistry.htm). Statistical analysis A customized version of the Statistica (Statsoft, Tulsa OK) software was used thoroughly. Allele frequencies, odds ratios (O.R.) and their 95% confidence intervals (95% CI) were calculated. Comparison of allele frequencies was done using two by two contingency tables with chi-square tests. This type of analysis was used also for carrier analysis. Evidence of a gene dose effect was evaluated with univariate logistic regression applying an additive genetic model Resultados, discusión y procedimiento experimental 69 (codes were: 0 for AA, 1 for Aa and 2 for aa genotypes). For stratification analysis, female patients were compared with female controls and male patients with male controls. Data from populations of Santiago, Thessaly and Oxford were combined using the Mantel-Haenszel test for the 2 x 2 contingency tables stratifying by collection of samples. Homogeneity of effect size across collections was assessed with the Breslow-Day test. Power and sample size calculations were done with the Power and Sample Size software for a value of α = 0.05 (32). The Leiden collection required specific assays to compensate for familial relationships: strength of association was assessed with logistic regression analysis performed in STATA and robust standard errors were estimated from the variance between sib pairs. RESULTS Search for SNPs likely to affect function of any of the ADAM or ADAMTS proteases (except ADAMTS5) lead to the selection of four nsSNPs that were likely to have deleterious effects according to prediction softwares. These four nsSNPs were studied in three sample collections that included 1412 THR, 781 TKR, 242 HOA and 1185 control samples from Santiago (Spain), Thessaly (Greece) and Oxford (United Kingdom). Genotyping was successful in most samples with a uniform and high calling rate (mean = 0.98) and with results that were in HardyWeinberg equilibrium in each of the sample collections. Allele frequencies (Table 1) showed that the nsSNPs rs1054480 in ADAMTS2 and rs1019747 in ADAMTS16 were unrelated with any of the OA phenotypes analyzed, TKR, THR or HOA. Analysis of combined data across the three sample collections confirmed the lack of association (Table 2). The ADAMTS2 and ADAMTS16 nsSNP showed pooled Mantel-Haenszel odds ratios that were indistinguishable from 1 in analyses of TKR and THR patients. These results were not affected by stratifying by gender (Table 2). Analogously, the allele frequencies of the rs3740199 nsSNP in ADAM12 were similar in cases and controls (Table 1), but there were two particularities with this nsSNP. First, it showed significant association in THR males from the Santiago collection (60.8 % of allele C vs. 52.2 % in controls, p = 0.04). However, this difference was not confirmed in THR males from the Oxford collection (46.2 % vs. 46.4 % in controls) and was not present in the joint analysis (Table 2). Second, this ADAM12 SNP showed different allele frequencies depending on the population, with the lowest MAF in the Oxford controls and the highest in the samples from Thessaly (Table 1; Oxford vs. Thessaly p = 2.2 x 10-7; Oxford vs. Santiago p = 0.0003). 70 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide The rs4747096 A/G nsSNP in ADAMTS14 was significantly associated to OA in two groups of patient samples (Table 1). The clearest difference was between Oxford TKR patients and controls (allele G frequencies 21.6 vs. 16.0 %, respectively). The significant increase in the allele G frequency was restricted to TKR women of this collection (24.6 % vs. 15.7 % in female controls) with an O.R. of 1.75 (95 % C.I = 1.3-2.4). The TKR men from Oxford showed a G allele percentage that was not significantly larger than in men controls (18.0 % vs. 16.4 %, respectively). There was some indication of a dominant effect of the G allele in the Oxford’s TKR women because the association was stronger in carrier analysis (O.R. = 2.05, 95% C.I. 1.4-3.0; p = 0.0001) than in allelic analysis (above) or with an additive genotype model (O.R. = 1.78, 95% C.I. 1.3-2.4; p = 0.0003). TKR samples from the Santiago collection showed also a modest increase in the G allele frequency (Table 1), but it was not significant. The Thessaly samples were neutral, or slightly in the same direction than the Oxford samples (O.R. for women = 1.10, 95% C.I. = 0.7-1.7). Pooled analysis of the three groups of TKR patients showed significant association that was specific of women (Table 2; O.R.M-H for women = 1.41, 95 % C.I = 1.1-1.8). TKR men showed a non-significant increase in G allele frequency. Pooled carrier analysis across the three TKR collections showed a slightly stronger association than allelic analysis (O.R.M-H of carrier females = 1.47, 95% C.I. 1.1-1.9; p = 0.0036). The second group of patients that showed significant association to the ADAMTS14 nsSNP was the HOA group from Santiago, which was the unique available with this phenotype. In this instance, the rare G allele was also more frequent in patients than in controls (Table 1; O.R. = 1.37, 95 % C.I = 1.0-1.9), but the increase was similar in women (O.R. = 1.43, 95 % C.I = 0.92.2) and men (O.R. = 1.47, 95 % C.I = 0.7-3.1). Carrier analysis showed a similar strength of association (O.R. = 1.44, 95 % C.I = 1.00-2.1) as well as the additive genotype analysis (O.R. = 1.37, 95 % C.I = 1.0-1.9). In addition to the TKR and HOA significant associations, it was notable that the same allele of the ADAMTS14 nsSNP showed a trend to be more frequent also in the two available groups of THR patients (Table 1). These changes were very modest but they became near significant (p = 0.08) in the combined analysis (Table 2). Carrier analysis of the two sample collections together also showed a near significant association (p = 0.07; O.R.M-H = 1.18, 95 % C.I = 0.9-1.5). Given the interesting results obtained with the rs4747096 ADAMTS14 nsSNP we extended our analysis to other collections of OA samples (Table 3). The Corunna samples were of symptomatic knee OA and were compared with the Santiago controls, as Santiago and Corunna share the same population and are only 60 Km apart. This group showed also a nominal increase in G allele frequency, but only among women (17.9 % vs. 15.2 % in controls) and this change Resultados, discusión y procedimiento experimental 71 was not significant (O.R. = 1.21, 95 % C.I. = 0.8-1.9). The samples from the GARP study have been selected for sib pair concordance in a generalized OA phenotype. They showed no change in the frequency of the rs4747096 alleles. Finally, we obtained rs4747096 genotypes from some samples with radiographic OA of the UK Adult Twin Registry. They did not show significant frequency changes (Table 3), but this collection was the single one in which OA patients showed a nominal decrease in the frequency of the minor allele of the rs4747096 nsSNPs. DISCUSSION This study has examined genetic association with some SNPs likely to have functional effects on a group of genes of potential importance in OA, the ADAMTS and ADAM proteases (11, 15, 22-24). It was not intended as a comprehensive assessment of these two protease families because genetic variation in these genes is much wider than the four nsSNPs studied here. It will not be even a comprehensive analysis of nsSNPs in these genes as new SNPs have continued to be described specially in some of the less studied proteases. Selection of putative deleterious nsSNPs increases the chances of finding an association in a genetic study (33, 34). However, even in this subgroup of nsSNPs the most likely outcome is lack of association. In agreement with this expectation, we did not find association with three of the four nsSNPs studied, in ADAMTS-2, -16 and ADAM-12, respectively. Only the ADAM12 rs3710199 nsSNP deserves a specific commentary because this nsSNP has previously been studied in relation with knee OA susceptibility. The rare allele of this nsSNP has been associated to the presence of osteophytes and change in osteophyte grade in a prospective study of UK women with radiographic knee OA (24). A subsequent study in UK patients with symptomatic knee OA showed no association with this nsSNP, although a haplotype of the ADAM12 gene was associated (35). Our results confirm the lack of association of this SNP with severe knee OA (TKR) and indicate that it is not associated to THR or HOA. However, it should be noted that osteophyte formation and other polymorphisms in the ADAM12 gene were not addressed in our study. The rs4747096 nsSNP in ADAMTS14 showed significant association to severe OA. Association was clear with severe knee OA, the TKR group, and especially in women from the UK. In addition, association was present in clinical hand OA, HOA. The strength of association was similar in HOA and in TKR females as evaluated by the O.R. (1.37 vs. 1.41, respectively). However, the limited number of available HOA samples made this result more uncertain than the obtained in TKR females. We also noted a near significant association to severe hip OA, the 72 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide THR group. In this case, the effect size was lower (O.R. = 1.14), but the large sample size of our THR group (1412 patients) allowed for better detection sensitivity. These are promising but no definitive results. The association to TKR and HOA will require additional studies for confirmation (but one already communicated, see below). Also additional studies will be needed to delineate the effects that this ADAMTS14 nsSNP could have in other OA forms. We already tried to obtain more information by analyzing the ADAMTS14 nsSNP in other three sample collections. Unfortunately, the results were inconclusive. The symptomatic KOA collection from Corunna showed a trend to increased frequency of the G allele in the women’s group, consistent with the observed in TKR women. No change was observed in the generalized OA patients from the GARP study or in the radiographic OA samples from the UK Twin registry. These three collections were of different OA phenotypes and each of them provided limited statistical power. These two aspects make the results in these three collections of uncertain interpretation. Available evidence shows that each OA phenotype is dependent on different genetic factors or with different strength (1-3). Our data in the first set of samples seem to indicate that the ADAMTS14 nsSNP shows also a variable effect depending on joint and gender. In addition, effects of the ADAMTS14 nsSNP are small and their demonstration requires large studies. Sample sizes large enough to detect with 80 % power a difference with O.R. = 1.3 were only available in the pooled analyses of TKR and of THR patients because over 700 cases and 700 controls are needed. Confidence on the association between symptomatic knee OA in women and ADAMTS14 genetic variation has been reinforced by results of a WGAS done in the UK and communicated in a recent meeting (36). This study has analyzed more than 400 000 SNPs spread over the genome in female knee OA patients and the SNPs showing the largest differences were genotyped in additional collections of samples totalling more than 3000 women. One of the few SNPs that remained associated after replication was a SNP in the forth intron of ADAMTS14 that showed a pooled O.R.M-H = 1.2 (95 % C.I. = 1.02-1.41). This study did not overlap with the samples included in our TKR collections. Therefore, two independent studies with a similar OA phenotype and large sample sizes have found association with SNPs in the ADAMTS14 gene. Further analyses will be necessary to show conclusively if the E1049G change determined by the rs4747096 nsSNP is a functional polymorphism or if other functional polymorphisms are present in the ADAMTS14 gene. The 22 exons of the ADAMTS14 gene are spread over 89.6 Kb in chromosome 10q22.1. This gene was not cloned until 2001 (37) and little is still known about its functions (38, 39). The rs4747096 nsSNP determines a change of glutamic acid for glycine in exon 21 in a segment of Resultados, discusión y procedimiento experimental 73 the protein of unclear functional significance. This aminoacid change was predicted as damaging by PoylPhen, a software application that evaluates several characteristics including hydrophobicity, stability, binding, proximity to active sites, homology…(31) Its predictions of damaging changes have specificity over 90 % (40). A glutamic acid in this position is exclusive of the human ADAMTS14 gene. Glycine is likely the ancestral allele as this is the aminoacid in ADAMTS14 orthologues in chimpanzee and rhesus macaque. However, the glutamic acid allele is more common than the glycine allele in Europeans, Africans and Asians, raising the possibility of some advantage associated to it that will support its positive selection in humans. However, little can be said about this or the possible consequences of the aminoacid change until more is known about the function of ADAMTS14. Most available information has been inferred by its similarity to two other ADAMTS, ADAMTS-2 and -3. It has 63 % homology to ADAMTS-3 and 56 % to ADAMTS-2 (37). The three are required for cleaving the Ntelopeptides of procollagen before the collagen monomers can be incorporated into fibers. Expression of the three propeptidases has been found to be up-regulated in OA cartilage (22, 23). This over-expression can be related with cartilage repair and production of matrix components as part of the anabolic compensation to cartilage degradation. ADAMTS-14 is produced in a latent form and, after activation, it processes procollagen I in an in vitro system. However, no other substrates have been examined (39). The relevance of ADAMTS-14 activity on procollagen I is unclear as it is not able to replace ADAMTS-2 deficiency in Ehlers-Danlos syndrome type VIIC. In conclusion, we have found that a change of glutamic acid for glycine in ADAMTS14 was associated with severe knee OA in females and with clinical hand OA. The first association was more robust because of the larger samples size and because of evidence from other study of association between ADAMTS14 genetic variation and knee OA in females. Our results suggested also that the same nsSNP could have association, but weaker, with severe hip OA. These results require confirmation in well powered studies. Also, a systematic study of the gene variation should be done to uncover possible additional polymorphisms. Other OA phenotypes we have examined showed lack of association. The incomplete knowledge of ADAMTS14 functions hampers prediction of its possible role in OA, but it is likely that deficient ADAMTS14 could lead to collagen fibers with incompletely processed collagen that will provoke detrimental effects on cartilage matrix structure and function. 74 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide ACKNOWLEDGEMENTS We thank Carlos Lopez Otin from the University of Oviedo for advice on ADAMTS14, Manuel Calaza for his help in customizing Statistica software, and Cristina Fernandez for her outstanding technical work. This project was financed by the Fundacion MMA (Madrid, Spain). JR-L is the recipient of a scholarship of the Spanish Ministry of Education. MP-S received a bursary from the Fundacion Española de Reumatologia (Madrid) and a Post-MIR contract from the Instituto de Salud Carlos III (Madrid). The Oxford study was supported by Research into Ageing and by The Arthritis Research Campaign. The Leiden University Medical Centre, the Dutch Arthritis Association and Pfizer Inc., Groton, CT, USA supported the GARP study and controls (Leiden samples). The genotyping of Leiden samples was supported by the Netherlands Organization of Scientific Research (MW 904-61-095, 911-03-016, 917 66344 and 911-03-012), Leiden University Medical Centre and the Centre of Medical System Biology (CMSB). REFERENCES: 1. Spector TD, MacGregor AJ. Risk factors for osteoarthritis: genetics. Osteoarthritis Cartilage 2004; 12 Suppl A:S39-44. 2. Ikegawa S. New gene associations in osteoarthritis: what do they provide, and where are we going? Curr Opin Rheumatol 2007; 19:429-34. 3. Loughlin J, Chapman K. Molecular Genetics of Osteoarthritis. In: Moskovitz R, Altman R, Hochberg MC, Buckwalter J, Goldberg V, editors. Osteoarthritis. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2007. p. 127-36. 4. Kizawa H, Kou I, Iida A, Sudo A, Miyamoto Y, Fukuda A, et al. 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Está formada por pacientes con OA primaria severa de la cadera que han sufrido remplazo articular total (THR; 307 sujetos, 185 mujeres y 122 hombres) o remplazo articular total de la rodilla (TKR; 277 pacientes, 223 mujeres y 54 hombres) y pacientes aquejados de OA de la mano (HOA; 242 sujetos, 213 mujeres, 27 hombres y 2 no catalogados). El grupo control estaba formado por 294 sujetos (115 mujeres y 179 hombres) mayores de 55 años, los cuales no presentaban ninguna manifestación clínica compatible con OA (tan sólo el 31.6% de los controles reclutados mayores de 55 años pasaron esta selección) (Tabla R.1). Los controles tenían una media de edad de 68 años (rango intercuartílico: 61-75 años) en el momento de la recogida. Debido a restricciones éticas y financieras, las articulaciones de la cadera y la rodilla de los controles no fueron sometidas a análisis radiográfico. Todos los pacientes y controles dieron su consentimiento informado para la participación en el estudio y la colección de muestras y el diseño del estudio obtuvieron la aprobación del Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia. Hombres Mujeres Total Controles 179 115 294 THR 122 185 307 TKR 54 223 277 HOA 27 213 242b a Se refiere al apartado: resultados, procedimiento experimental y discusión (R) b Dos muestras en este grupo sin dato de sexo Selección de SNPs En este estudio se realizó una selección de SNPs reguladores y SNPs codificadores no sinónimos (nsSNPs). Los nsSNPs se obtuvieron de la base de datos de SNPs del NCBI-Entrez. Fueron encontrados varios nsSNPs para cada locus y sólo uno de ellos, rs2250889 C/G (R574P en el exon 4 de MMP-9), fue escogido para el estudio ya que presentaba las características de Tabla Ra.1: Relación de pacientes y controles de la colección de Santiago. Los datos se muestran también estratificados por sexo y articulación. THR: remplazo articular de la cadera. TKR: remplazo articular de la rodilla. HOA: OA de mano 84 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide estar validado y de afectar probablemente al correcto funcionamiento de la proteína. Dicha predicción fue hecha con el software SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) (Ng PC et al, 2006) (disponible en http://blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html), el cual utiliza alineamientos de secuencias de proteínas ortólogas y homólogas para determinar la conservación de aminoácidos específicos. Otro software también utilizado fue PolyPhen (Polymorphism Phenotyping) (Sunyaev S, et al, 2000) (disponible en http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/index.html), el cual está basado en reglas empíricas sencillas que se aplican a la información de la secuencia, de la filogenia y de la estructura de la proteína para caracterizar la sustitución de los aminoácidos, pero con este software no se identificó ningún nsSNP de MMPs como probablemente dañino. Los polimorfismos reguladores fueron escogidos usando la base de datos de PubMed. Se buscaron SNPs de los que existía evidencia experimental de un efecto regulador y que afectasen a genes de MMPs posiblemente implicadas en el desarrollo y progresión de la OA. Se escogieron 16 SNPs y un microsatélite. Estos polimorfismos se encuentran localizados en 7 MMPs: tres en MMP-1; cuatro en MMP-2; uno en MMP-3; dos en MMP-7; tres en MMP-8; dos SNPs y un microsatélite en MMP-9 y uno en MMP-13 (Tabla R.2) Genotipado Todos los SNPs, excepto el microsatélite de MMP-9, fueron genotipados utilizando single-base extensión con el SNaPshot Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los primers fueron diseñados con los software FastPCR (obtained from Dr Ruslan Kalendar, University of Helsinki) y Primer3 (Rozen S et al, 2000) (disponible en http://frodo.wi.mit.edu/). Los fragmentos de PCR fueron amplificados en reacciones de PCR multiplex (Qiagen Multiplex PCR, Valencia, CA, USA). Los productos de PCR fueron purificados por digestión con Exonuclease I (Epicentre, Madison, WI, USA) y Shrimp Alkaline Phosphatase (Amersham Biosciences, Barcelona, Spain). Las reacciones de SNaPshot fueron hechas siguiendo las especificaciones del kit. Las muestras fueron posteriormente analizadas en un ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Varias muestras con diferentes genotipos fueron secuenciadas para chequear la exactitud de los resultados con el Big Dye Ready Reaction Kit (Applied Biosystems). El microsatellite de MMP-9 fue amplificado con primers de PCR marcados con FAM. Posteriormente el tamaño de los productos de PCR (indicativo de los distintos alelos del polimorfismo) fue determinado por electroforesis capilar en un ABI prism 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Resultados, discusión y procedimiento experimental 85 MMP Cromosoma Posición en Cromosomaa Posición inicio transcripcióna Número de identificación Alelos Efecto alelo raro MMP-9 20q 44069383 -1562 rs3918242 C/T Up 44070820 (~)-80 rs3222264 microsatélite - 44075813 +574 rs2250889 C/G Del MMP-2 16q 54069038 -1575 rs243866 G/A Down 54069307 -1306 rs243865 C/T Down 54069823 -790 rs243864 T/G - 54069879 -735 rs2285053 C/T Down MMP-7 11q 101906843 -155 rs11568819 C/T Up 101906871 -183 rs11568818 A/G Up MMP-8 11q 102100876 +17 rs2155052 C/G Up 102101273 -381 rs1320632 T/C Up 102101690 -799 rs11225395 C/T Up MMP-1 11q 102174440 -340 rs514921 A/G Down 102174619 -519 rs1144393 A/G Down 102175707 -1607 rs11292517 A/G Up MMP-3 11q 102221162 -1171 rs3025058 T/C Up MMP-13 11q 102331749 -77 rs2252070 T/C Up aEn pares de bases Tabla R.2: Polimorfismos estudiados en MMPs. Se señala la posición en el cromosoma y en relación con el inicio de la transcripción. Nótese que 5 MMPs están en el cluster de MMps situado en el cromosoma 11q. También se indican los alelos común y raro y el efecto que el alelo raro produce sobre la expresión o actividad de la proteína. Up: eleva el nivel de expresión. Down: baja el nivel de expresión. – no se conoce. Del: afecta negativamente a la actividad de la proteína. 86 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Las secuencias de oligonucleótidos utilizados para el genotipado se muestran en la tabla R.3. El porcentaje de genotipos válidos fue alto (0.98 para todos los SNPs). Las frecuencias genotípicas estaban en equilibrio Hardy-Weinberg (HWE) para todos los SNPs. Análisis estadístico El software STATISTICA (Statsoft, Tulsa OK) fue utilizado para el análisis de los datos. Se calcularon frecuencias alélicas, odds ratios (O.R.) y los intervalos de confianza (95% CI). La comparación de las frecuencias alélicas fue hecha utilizando una tabla de contingencia dos por dos con un test de chi-cuadrado. Evidencia de un efecto de dosis génica fue evaluada con regresión logística univariable usando un modelo genético aditivo (Los códigos fueron: 0 para el genotipo AA, 1 para el genotipo Aa y 2 para el genotipo aa). Para el análisis estratificado, los pacientes mujeres fueron comparados con los controles mujeres y los pacientes hombres con los controles hombres. El estudio de “desequilibrio de ligamiento” (LD), la estimación de las frecuencias haplotípicas y la comparación de las mismas entre pacientes y controles fue realizada con el software Haploview. Para el estudio del microsatélite de MMP9, la comparación de frecuencias alélicas fue llevada a cabo usando tablas de contingencia 2 x n después de colapsar columnas de baja frecuencia utilizando la opción T2 del software Clump (Sham PC et al, 1996). El análisis del poder del estudio fue determinado con el software Power and Sample Size para un valor de α = 0.1 (Dupont WD et al, 1990). Resultados, discusión y procedimiento experimental 87 a Orientación de la sonda: R = reverse; F = forward b En mayúsculas oligonucleótido de secuencia no humana MMP Polimorfismo Primer de PCR Sonda de SNaP Shot a MMP-9 -1562 C/T Izquierdo agagccgggatggaaatc Derecho agcctccctcactcctttct acagagagagtctggacacgtgggg (R) (~)-80 Izquierdo FAMgacttggcagtggagactgcgggca Derecho cacccctccttgacaggcaa +574 C/G Izquierdo tggcgattctctgagggcag Derecho cttgactgatggggattgacc gagggaaagtaggtaactaaccagagaagaagaaaagcttcttggagagc (F) MMP-2 -1575 G/A Izquierdo acacccaccagacaagcctg Derecho acagggtgaggggatggagc GCTAATccgcagagacttttctagctgtgatgatcaagacataatc b (F) -1306 C/T Izquierdo caagccgcagagacttttcta Derecho tcaggtcgaatcccaatttt gtgacttctgagctgagacctgaagagctaaagaggt (R) -790 T/G Izquierdo tcgctttctttgccatcttgg Derecho gttggaaccagagcgactcc tgcatactgttttatcagtggggtctttgtgacctctatc (F) -735 C/T Izquierdo tcgctttctttgccatcttgg Derecho gttggaaccagagcgactcc GACGATGCTAATatttctatctcatcctgtgaccgagaatgcggac (F) MMP-7 -155 C/T Izquierdo ccatctttcccctgtatgga Derecho ttctcagcctcgaatgtgg gaactttgaaagtatgtgttatttttcattaactaaaacgaggaagtattacatc (R) -183 A/G Izquierdo ccatctttcccctgtatgga Derecho ttctcagcctcgaatgtgg catggagtcaatttatgcagcagacagaaaaaaaaatcctttgaaagac (F) Tabla R.3: Primers de PCR y sondas utilizadas en el estudio 88 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide a Orientación de la sonda: R = reverse; F = forward b En mayúsculas oligonucleótido de secuencia no humana MMP Polimorfismo Primer de PCR Sonda de SNaP Shota MMP-8 +17 C/G Izquierdo tgcttcatattcctgatgcagc GCTGTGACGATGCTAATaagagagctgtgagtgacacatgatgctgtgaac (F) Derecho tttctgtccctctgggtagg -381 T/C Izquierdo acatcctccagaagcagctc TATCGCGCTGTGACGATGCTAATggaccaaggagcccaactagagaatctctgtactta (R) Derecho ttgggaccaaggagcccaac -799 C/T Izquierdo tctcccttgtcttctgcctg Derecho catcttcacatagccttgggag GATGCTAATcaagtgggagactaccatgcagagc (F) MMP-1 -340 A/G Izquierdo gcttgagccaccatgcctgg Derecho gcgaaggagacacactctgc GTGACGATGCTAATGccatggtctttttgaaaaagactggttctgatggtcataab (R) -519 A/G Izquierdo gcttgagccaccatgcctgg Derecho gcgaaggagacacactctgc attaagggaagccatggtgctatcgcaatagggt (F) -1607 A/G Izquierdo tcacttcagtggcaagtgttct Derecho tggtgctaggcagcatttat cctcttgaactcacatgttatgccacttagatgaggaaattgtagttaaataattagaaag (F) MMP-3 -1171 T/C Izquierdo tggccaaatattttccctgta Derecho gagctctgggctcaagtgat aaatattttccctgtatttcaatcaggacaagacatggttttt (F) MMP-13 -77 T/C Izquierdo tgcttcttcccacagtatcca Deerecho tcgtcaagtttgcgagtcac ttatggataggtttccacttcc (R) Tabla R.3 continuación Resultados, discusión y procedimiento experimental 89 Resultados Estudio de Desequilibrio de ligamiento Se realizó un estudio de desequilibrio de ligamiento (LD) entre los SNPs situados en un mismo gen y entre los situados en las MMPs del cluster de MMPs del cromosoma 11q. El estudio de desequilibrio de ligamiento realizado con los SNPs que se encontraban en el cluster de MMPs del cromosoma 11q reveló que, en general, el LD era muy débil entre SNPs que no se encontraban en el mismo gen. Tan sólo el caso del SNP -340 de MMP-1 mostró un LD relativamente alto con los SNPs -381 y +17 de MMP-8 (D’ = 0.72). También se observó un cierto LD entre el SNP -1171 de MMP-3 y el SNP -1607 de MMP-1 (D’ = 0.59) (Figura R.1). El análisis de la r2 demostró que la correlación entre genotipos era muy baja entre los SNPs de distintos genes. Tan sólo en el caso del SNP MMP-3 -1171 se muestra un valor ligeramente elevado de r2 con los SNPs MMP-1 -1607 y MMP-1 -519 (0.17 y 0.19 respectivamente). Los Figura R.1: Desequilibrio de ligamiento (LD) según el parámetro D’ entre los 10 polimorfismos existentes en las MMPs encontradas en el cluster de MMPs del cromosoma 11q. El color rojo indica D’ = 1 y LOD  2. En el bloque se muestran los tres SNPs de MMP-8 con un alto LD junto con el SNP -340 de MMP-1, que muestra una D’ bastante alta con +17 y -381 (D’ = 0.72). 90 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide SNPs que se encuentran en un mismo gen tampoco muestran valores de r2 muy significativos excepto en el caso de los SNPs MMP-8 +17 y MMP-8 -381, que presentan una r2 de 0.98 (Figura R.2). Entre los SNPs situados dentro de un mismo gen, los situados en MMP-2 mostraron un gran desequilibrio de ligamiento con altos valores de D’ y r2(Figura R.3). En la figura se puede observar como los SNPs -1575, -1306 y -790 están correlacionados con valores de r2muy altos mientras el SNP -735 es independiente. En el caso de los SNPs -1562 y +574 del gen MMP-9, se observó un valor de D’ elevado (0.92) pero sin embargo el valor de r2fue de cero (datos no mostrados). El resto de MMPs estudiadas se encuentran en el cluster de MMPs del cromosoma 11q por lo que sus valores de D’ y r2se pueden ver en las figuras R.1 y R.2. Figura R.2: Desequilibrio de ligamiento (LD) según el parámetro r2 entre los 10 polimorfismos existentes en las MMPs encontradas en el cluster de MMPs del cromosoma 11 q . Resultados, discusión y procedimiento experimental 91 Frecuencias alélicas pacientes y controles Para analizar si SNPs en proteasas de ECM eran factores de riesgo para OA, comparamos frecuencias alélicas de pacientes y controles, estratificando por la articulación afectada (THR, TKR o HOA). El estudio se realizó en primer lugar sobre la población en general y posteriormente se realizó una estratificación por sexos. En el caso de los pacientes de THR se encontró que de los dieciséis SNPs estudiados, catorce de ellos tenían frecuencias similares en pacientes y controles. Tan sólo dos SNPs en el gen de MMP-2, presentaron diferencias significativas entre pacientes THR y controles (-790 T/G; -1575 G/A) (Tabla R.4). Para discernir si los SNPs de MMP-2 asociados eran independientes entre sí o si los efectos podrían ser atribuirse a desequilibrio de ligamiento entre ellos, se hizo un análisis de los genotipos mediante regresión logística condicional. En este análisis se tomaba como base el SNP asociado de manera más significativa (SNP principal) y se testaba la asociación de los otros SNPs utilizando un modelo condicionado de dos variables (el SNP que se testaba más el SNP principal). De esta manera, si el SNP testado dejaba de estar asociado y el principal seguía estándolo, se concluía que su efecto no era independiente del SNP principal. Si los dos SNPs dejaban de estar asociados, entonces era que el efecto podía ser explicado por los dos en conjunto o por separado. En MMP-2, los dos SNPs asociados tienen una r2muy elevada y, por lo tanto, cualquiera de ellos o los dos pueden explicar la asociación. Figura R.3: Desequilibrio de ligamiento (LD) según el parámetro D’ y r2 entre los 4 polimorfismos estudiados en el gen MMP-2. 98 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % La estratificación por sexos mostró que existían SNPs con diferencias significativas entre pacientes y controles en mujeres y en hombres. En las mujeres se encontraron diferencias en los tres SNPs de MMP-8 estudiados (+17 C/G; -381 T/C y -799 C/T). Estos cambios fueron en el mismo sentido que los encontrados en mujeres con THR y mujeres con TKR. En el SNP -340 A/G de MMP-1 se observó también una disminución del alelo raro en mujeres similar a la observada en mujeres con THR y mujeres con TKR.A su vez también se observaron cambios no significativos en los SNPs -790 T/G y -735 C/T de MMP-2 y -519 A/G de MMP-1 (Tabla R.11). Al igual que en los anteriores análisis, se hizo un estudio de las frecuencia genotípicas mediante regresión logística condicionada en los casos en los que se encontró más de un SNP asociado dentro del mismo gen para discernir a cuál de los SNPs era debido el efecto observado. En el caso de MMP-8, los SNPs +17 C/G y -381 T/C tenían una distribución de frecuencias exactamente iguales por lo que ya se demuestra que no son independientes. Se tomó como SNP MMP Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) MMP-9 -1562 C/T 14.85 13.79 ns 0.92 (0.65-1.30) +574 C/G 3.57 4.18 ns 1.18 (0.63-2.20) MMP-2 -1575 G/A 19.90 21.46 ns 1.10 (0.81-1.48) -1306 C/T 19.45 21.04 ns 1.10 (0.82-1.49) -790 T/G 19.22 21.67 ns 1.16 (0.86-1.57) -735 C/T 15.48 13.09 ns 0.82 (0.58-1.67) MMP-7 -155 C/T 4.93 4.34 ns 0.87 (0.49-1.55) -183 A/G 45.75 44.01 ns 0.93 (0.73-1.19) MMP-8 +17 C/G 7.65 10.94 0.06 1.48 (0.97-2.26) -381 T/C 7.85 10.94 0.08 1.44 (0.95-2.19) -799 C/T 38.44 40.49 ns 1.10 (0.85-1.40) MMP-1 -340 A/G 33.39 30.93 ns 0.89 (0.68-1.17) -519 A/G 34.71 37.80 ns 1.14 (0.88-1.48) -1607 A/G 46.76 48.54 ns 1.07 (0.84-1.37) MMP-3 -1171 T/C 50.17 49.59 ns 0.98 (0.77-1.24) MMP-13 -77 T/C 32.42 31.77 ns 0.97 (0.74-1.28) Tabla R.10: Frecuencias alélicas de los SNPs estudiados en controles y pacientes HOA. Resultados, discusión y procedimiento experimental 99 a Se muestra la frecuencia del alelo raro en % de referencia el -381 T/C por los resultados observados en TKR mujeres. El análisis del SNP - 799 C/T, demostró que este SNP no tenía un efecto independiente ya que su p valor pasaba de de 0.02 a 0.31, sin embargo el SNP -381 T/C sí seguía estando significativamente asociado. En MMP-1, el análisis demostró que los dos SNPs asociados, el SNP -519 A/G y el -340 A/G, no eran independientes por lo que el efecto puede deberse a cualquiera de los dos o a los dos conjuntamente. También en este caso se hizo el análisis de regresión logística condicionada de los SNPs -381 T/C de MMP-8 y -340 A/G de MMP-1. El resultado mostró que en este caso, a diferencia de lo observado en mujeres con TKR, el SNP causante del efecto era el -381 T/C ya que seguía manteniendo su nivel de significación. Al igual que lo dicho anteriormente, este resultado debe tomarse con cautela debido a que ambos SNPs están bastante separados y la r2 entre ellos es pequeña (r2 = 0.022). MMP Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) MMP-9 -1562 C/T 17.83 13.24 ns 0.70 (0.45-1.09) +574 C/G 2.61 4.29 ns 1.67 (0.65-4.27) MMP-2 -1575 G/A 16.96 22.33 ns 1.41 (0.93-2.13) -1306 C/T 16.96 22.17 ns 1.39 (0.92-2.11) -790 T/G 16.52 22.82 0.05 1.49 (0.98-2.27) -735 C/T 17.83 12.62 0.07 0.67 (0.43-1.04) MMP-7 -155 C/T 5.65 4.69 ns 0.82 (0.40-1.68) -183 A/G 48.70 45.77 ns 0.89 (0.64-1.23) MMP-8 +17 C/G 4.78 11.17 0.004 2.50 (1.27-4.93) -381 T/C 4.78 11.17 0.004 2.50 (1.27-4.93) -799 C/T 30.43 39.80 0.018 1.51 (1.07-2.13) MMP-1 -340 A/G 40.27 31.68 0.03 0.69 (0.49-0.97) -519 A/G 28.51 35.22 0.09 1.36 (0.95-1.95) -1607 A/G 50.88 49.29 ns 0.93 (0.68-1.29) MMP-3 -1171 T/C 47.37 48.59 ns 1.05 (0.76-1.45) MMP-13 -77 T/C 31.30 31.18 ns 0.99 (0.69-1.43) Tabla R.11: Frecuencias alélicas de los SNPs estudiados en controles y pacientes HOA mujeres. 100 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide El estudio llevado a cabo en los hombres mostró que existían diferencias significativas en uno de los SNPs estudiados de MMP-1, concretamente el -519 A/G. También se encontró que había un cambio entre pacientes y controles en el caso del SNP -183 A/G de MMP-7, pero este no llegaba a ser significativo (Tabla R.12). aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % Frecuencias haplotípicas pacientes y controles El análisis de haplotipos apenas aportó nuevas diferencias significativas con respecto al estudio de frecuencias alélicas. El único resultado distinto fue el de los haplotipos de MMP-8 en hombres con THR, ya que no se había encontrado nada parecido en el análisis de frecuencias alélicas (Tabla R.13). El haplotipo asociado en MMP-8, C-T-C, está formado por los alelos que provocan una disminución de la expresión de MMP-8. Este haplotipo se encontró aumentado en los casos que es el mismo efecto que se observó para +17 C/G y -381 T/C en el estudio de frecuencias alélicas en hombres con THR. De todos modos, este efecto sólo se vio en ese subgrupo de pacientes siendo el contrario que el observado en todos los demás, por lo que puede haberse debido a fluctuaciones al azar de las frecuencias alélicas provocadas por el pequeño MMP Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) MMP-9 -1562 C/T 12.92 19.23 ns 1.60 (0.75-3.42) +574 C/G 4.19 3.70 ns 0.88 (0.19-3.96) MMP-2 -1575 G/A 21.79 15.38 ns 0.65 (0.29-1.44) -1306 C/T 21.07 12.96 ns 0.56 (0.24-1.28) -790 T/G 20.95 13.46 ns 0.59 (0.25-1.35) -735 C/T 13.97 15.38 ns 1.12 (0.49-2.52) MMP-7 -155 C/T 4.47 1.85 ns 0.40 (0.05-3.10) -183 A/G 43.85 31.48 0.08 0.58 (0.32-1.08) MMP-8 +17 C/G 9.50 9.62 ns 1.01 (0.37-2.72) -381 T/C 9.83 9.62 ns 0.97 (0.36-2.61) -799 C/T 43.58 46.00 ns 1.10 (0.61-1.99) MMP-1 -340 A/G 28.90 23.91 ns 0.77 (0.38-1.58) -519 A/G 38.70 58.70 0.01 2.25 (1.20-4.20) -1607 A/G 50.88 49.29 ns 0.94 (0.68-1.29) MMP-3 -1171 T/C 51.99 57.41 ns 1.24 (0.69-2.22) MMP-13 -77 T/C 33.15 36.36 ns 1.15 (0.60-2.21) Tabla R.12: Frecuencias alélicas de los SNPs estudiados en controles y pacientes HOA hombres. Resultados, discusión y procedimiento experimental 101 tamaño muestral de los varones con THR (n = 122). Además, Se encontraron asociaciones con los haplotipos definidos en MMP-1 y MMP-2 en pacientes con THR (Tabla R.13). Los resultados obtenidos en MMP-2 representan la idea de que los tres SNPs que mostraron asociación, -1575 G/A, -1306 C/T y -790 T/G, son indistinguibles pues los alelos asociados con THR se encuentran exclusivamente en el único haplotipo asociado: A-T-G-C. Haplotipo Controles Casos P valor Total MMP2 -1575/-1306/-790/-735 G-C-T-C 64.9 60.7 ns A-T-G-C 18.7 24.3 0.019 G-C-T-T 15.0 13.3 ns Mujeres MMP2 -1575/-1306/-790/-735 G-C-T-C 65.7 59.7 ns A-T-G-C 15.6 24.7 0.008 G-C-T-C 16.9 13.5 ns MMP1 -340/-519/-1607 A-A-G 26.3 27.4 ns A-G-A 20.1 29.4 0.01 G-AG 21.5 17.0 ns A-A-A 12.0 10.0 ns G-A-A 11.8 7.4 ns G-G-A 5.1 5.0 ns Hombres MMP8 +17/-381/-799 C-T-C 55.6 65.3 0.02 C-T-T 34.6 28.1 ns G-C-T 9.5 6.6 ns Tabla R.13: Distribución de las frecuencias de los haplotipos de MMPs que han mostrado asociación con THR. Se muestran los haplotipos con una frecuencia superior al 5%. Los resultados pertenecen al estudio global así como los derivados de la estratificación por sexos. 102 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Los haplotipos de MMP-1 fueron muy informativos. Por una parte, el análisis con los tres SNPs mostró que son totalmente independientes (ya sugerido por el análisis de LD, Figura R.2). Se observaron 6 haplotipos con frecuencia mayor del cinco por ciento y alguno de ellos se encontró asociado en el subgrupo de mujeres con THR (Tabla R.13). Estos resultados parecen contradictorios con los encontrados en los SNPs por separado (Tabla R.4 a R.12), por lo que se realizó un nuevo análisis de haplotipos de MMP-1 tomando únicamente los SNPs -340 A/G y - 519 A/G, que fueron los que se encontraron asociados de manera individual. Como se vio que este tipo de análisis era más coherente con los resultados de los SNPs individuales, y como los SNPs mostraban un escaso LD, se aplicó a todos los fenotipos (Tabla R.14). Haplotipo Controles Casos P valor THR mujeres -340/-519 A-A 37.7 37.0 ns G-A 33.8 24.7 0.017 A-G 22.0 31.4 0.013 G-G 6.5 7.0 ns TKR mujeres -340/-519 A-A 36.9 39.3 ns G-A 34.6 25.1 0.009 A-G 22.8 32.3 0.01 G-G 5.7 3.4 ns HOA mujeres -340/-519 A-A 38.2 40.4 ns G-A 33.3 24.4 0.01 A-G 21.5 27.9 ns G-G 7.0 7.4 ns HOA hombres -340/-519 A-A 38.7 25.3 ns G-A 22.6 18.4 ns A-G 32.3 49.7 0.02 G-G 6.4 6.6 ns Tabla R.14: Distribución de las frecuencias de los haplotipos de MMP-1 con los SNPs -340 A/G y -519 A/G que han mostrado asociación con THR, TKR y HOA. Se muestran los haplotipos con una frecuencia superior al 5%. Resultados, discusión y procedimiento experimental 103 Este análisis muestra cuatro haplotipos frecuentes, dos de ellos son neutros en todas las comparaciones, A-A y G-G. Los otros dos son diferentes entre casos y controles en una parte de los análisis. Este patrón nos muestra claramente que el alelo A de -340 A/G sólo predispone a OA en el haplotipo con el alelo G del SNP -519 A/G, ya que el haplotipo A-A es neutro. De forma similar, el alelo G del SNP -340 A/G sólo protege de OA en el haplotipo G-A y no en el haplotipo G-G. Por lo tanto, el efecto de estos dos SNPs es interdependiente y sólo se observa en combinaciones específicas de los alelos, lo que sugiere una relación funcional entre ambos (Tabla R.14). El estudio de los haplotipos en relación con el grupo de pacientes con TKR, mostró asociación sólo en el subgrupo de las mujeres, tanto en MMP-2 como en MMP-1. El haplotipo de MMP-2 fue el mismo asociado con THR, y, por lo tanto, los efectos de estas variantes parecen similares en estos dos grupos de OA (Tabla R.15). La asociación con MMP-1 se debe a dos haplotipos incompatibles en los dos SNPs y de efectos contrarios, A-G asociado con susceptibilidad, y G-A asociado con protección. Este es un resultado similar al obtenido en el grupo de THR y ya comentado (Tabla R.14). Haplotipo Controles Casos P valor MMP2 -1575/-1306/-790/-735 G-C-T-C 60.2 65.4 ns A-T-G-C 15.9 23.8 0.02 G-C-T-T 14.1 17.2 ns MMP1 -340/-519/-1607 A-A-G 25.4 27.8 ns A-G-A 20.3 29.2 0.01 G-A-G 22.2 15.4 0.03 A-A-A 11.6 11.5 ns G-A-A 12.3 9.6 ns G-G-A 5.3 3.4 ns Tabla R.15: Distribución de las frecuencias de los haplotipos de MMPs que han mostrado asociación con TKR (sólo en mujeres). Se muestran los haplotipos con una frecuencia superior al 5%. 104 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide En cuanto a la OA de la mano, se encontraron diferencias significativas en los haplotipos de MMP-1, ya comentados (Tabla R.14), y dos efectos significativos en la distribución de haplotipos de MMP-8 en mujeres (Tabla R.16). Los dos haplotipos que mostraron asociación, de los tres observados, tuvieron efectos opuestos, luego parece que los SNPs +17 C/G y -381 T/C, que están en casi completo LD, tienen un efecto independiente y opuesto al del SNP -799 T/C. Sin embargo, estos resultados son muy sorprendentes pues la asociación de estos dos haplotipos es la opuesta a la observada en los varones con THR, en los que el haplotipo C-T-C estuvo aumentado en pacientes y el haplotipo G-C-T mostró una tendencia a estar disminuido (Tabla R.12). También se realizó un análisis de haplotipos con los SNPs de las MMPs del cluster de MMPs del cromosoma 11q. El objetivo fue el de estudiar la posibilidad de que algún haplotipo pudiese incluir SNPs no analizados en el estudio pero que se encontrase en LD con los SNPs estudiados. Los resultados no mostraron ninguna diferencia significativa entre pacientes y controles (Datos no mostrados) Microsatélite de MMP-9 Pacientes y controles fueron genotipados para un polimorfismo funcional tipo microsatélite en la región promotora del gen MMP-9. Este microsatélite consiste en repeticiones del dinucleótido CA. En población humana existen nueve alelos distintos de este microsatélite (aunque en algunas ocasiones se encontraron diez) repartidos entre trece y veinticuatro repeticiones. Previamente, se había demostrado la funcionalidad de este microsatélite con ensayos reporter y EMSA. Se observó que se producía un aumento de la expresión en las construcciones que portaban por encima de veintitrés repeticiones y que esta variación de la expresión era debida a Haplotipo Controles Casos P valor MMP8 +17/-381/-799 C-T-C 68.6 60.1 0.03 C-T-T 26.6 28.7 ns G-C-T 4.7 10.8 0.0083 Tabla R.16: Distribución de las frecuencias de los haplotipos de MMPs que han mostrado asociación con HOA (sólo en mujeres). Se muestran los haplotipos con una frecuencia superior al 5% Resultados, discusión y procedimiento experimental 105 diferencias en la unión de factores de transcripción (Peters DG et al, 1999). En nuestro estudio, los datos de genotipado en pacientes de OA y controles fueron analizados con el software Clump (Sham PC et al, 1996) (ver métodos). No se encontró ningún resultado significativo en ninguno de los fenotipos de OA estudiados (Tabla R.17). La estratificación por sexos tampoco reveló ninguna asociación (Tabla R.18 y R.19). Alelosa <14 14 15 19 20 21 22 23 24 P valorb Controles 0.00 54.45 2.57 0.68 1.03 19.86 14.90 5.65 0.86 THR 0.32 50.98 2.46 1.80 1.48 22.13 15.25 4.92 0.66 0.64 TKR 0.18 53.64 2.73 1.14 2.55 19.64 14.18 4.00 1.64 0.24 HOA 0.21 56.02 2.07 1.45 2.07 16.60 15.98 4.77 0.83 0.47 anúmero de repeticiones b Obtenido de tablas contingencia 2 x n después de colapsar columnas de baja frecuencia anúmero de repeticiones b Obtenido de tablas de contingencia 2 x n después de colapsar columnas de baja frecuencia Alelosa <14 14 15 19 20 21 22 23 24 P valorb Controles 0.00 53.10 2.21 0.44 1.33 20.35 14.16 7.52 0.00 THR 0.54 49.46 2.17 1.90 2.45 23.37 14.95 4.62 0.54 0.39 TKR 0.23 52.70 2.70 1.35 2.93 19.82 14.86 3.60 0.23 0.18 HOA 0.23 52.70 2.70 1.35 2.93 16.67 16.90 3.99 0.23 0.22 Tabla R.17: Frecuencias alélicas del microsatélite (CA) situado en la región promotora del gen MMP-9 en los g ru p os de p acientes y controles estudiados. Los datos son dados como % en la p oblación g eneral. Tabla R.18: Frecuencias alélicas del microsatélite (CA) situado en la región promotora del gen MMP-9 en los grupos de mujeres pacientes y controles estudiados. Los datos son dados como %. 106 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide anúmero de repeticiones b Obtenido de tablas de contingencia 2 x n después de colapsar columnas de baja frecuencia Discusión Se encontraron diversas asociaciones significativas entre polimorfismos presentes en MMPs y susceptibilidad a OA en los tres fenotipos de la enfermedad estudiados. El elevado número de asociaciones puede reflejar la importancia de este grupo de proteasas en la OA. También es posible que este número sea debido a que esta familia de proteasas es la más estudiada y, por lo tanto, hay más SNPs funcionales definidos. Además, las diferencias encontradas en MMP-8 y MMP-1 pueden no ser independientes pues estos dos genes se encuentran en LD. Por otra parte, contribuye a mitigar el entusiasmo con estos resultados el análisis de la potencia estadística post-hoc. Sólo fue de magnitud suficiente en los SNPs de MMP-2 asociados en THR (0.8 para detectar un efecto de odds ratio de 1.4). Por el contrario, fue marcadamente débil en los análisis estratificados por sexos o en los SNPs +17 C/G y -381 T/C de MMP-8 debido a su baja frecuencia. Por todo esto, los resultados obtenidos deben ser tomados con relativa prudencia. MMP-1 es una colagenasa (colagenasa-1) que degrada el colágeno nativo tipo-II y -III. Se ha visto que la expresión de MMP-1 se encuentra influenciada por el efecto de citoquinas proinflamatorias como IL1-ȕ (Klatt AR et al, 2006), aunque no existen diferencias en los niveles de expresión entre pacientes de OA y controles (Kevorkian L et al, 2004). Los SNPs que se vieron asociados con OA en este trabajo son SNPs funcionales que afectan al nivel de transcripción, pero los estudios funcionales que se han realizado no guardan correlación con los efectos observados (Pearce E et al, 2005). Así, por ejemplo, en ensayos tipos EMSA se vio que Alelosa 14 15 19 20 21 22 23 24 P valorb Controles 55.31 2.79 0.84 0.84 19.55 15.36 4.47 0.84 THR 53.31 2.89 1.65 0.00 20.25 15.70 5.37 0.83 0.99 TKR 57.55 2.83 1.89 0.94 18.87 11.32 5.66 0.94 0.48 HOA 55.77 0.00 5.77 0.00 17.31 9.62 11.54 0.00 0.32 Tabla R.19: Frecuencias alélicas del microsatélite (CA) situado en la región promotora del gen MMP-9 en los grupos de hombres pacientes y controles estudiados. Los datos son dados como %. Resultados, discusión y procedimiento experimental 107 el alelo G del SNP -340 A/G une proteínas nucleares, mientras que no lo hace el alelo A. Sin embargo, los estudios reporter muestran que la expresión depende del haplotipo -519/-340 y no del alelo -340 A/G aislado. Por lo tanto, no tiene sentido explorar sus efectos por separado. Así, se ha visto que de los cuatro haplotipos posibles con estos dos SNPs, dos producen niveles elevados de transcripción en ensayos reporter, A-A y G-G, y dos producen niveles bajos, G-A y A-G. Estas diferencias se han demostrado también en los mRNAs extraídos de tejidos (Pearce E et al, 2005). Por lo tanto, es sorprendente que los dos haplotipos estén asociados con un nivel disminuido de expresión y, sin embargo, nosotros hayamos encontrado que uno de ellos es de susceptibilidad y otro es de protección. Esta paradoja nos lleva a desconfiar de nuestros resultados, como también las diferencias notables entre las frecuencias alélicas en controles mujeres y hombres (especialmente en el SNP -340 A/G que pasa de 40.3% a 28.9%). Sin embargo, nuestros resultados son muy similares a los obtenidos en dos colecciones demuestras en relación con el infarto de miocardio (Pearce E et al, 2005). También en este caso, el haplotipo G-A fue protector y el haplotipo A-G fue de susceptibilidad. Estos datos, de replicarse, indican que en estos haplotipos de MMP-1 hay interacciones funcionales entre los dos SNPs que se nos escapan y que deben ser investigadas. También hemos encontrado asociación con otra colagenasa, MMP-8 (colagenasa-2). MMP-8 es la colagenasa de neutrófilos, que también degrada colágeno nativo tipo-II y -I. Los SNPs analizados en este estudio son funcionales (Wang H et al, 2004) y los alelos de los SNPs individuales aumentados en pacientes con OA, +17 G en el grupo de mujeres con TKR y con HOA, y -381 C en mujeres con TKR, provocan un aumento de la expresión de MMP-8. Un haplotipo formado por los alelos G y C de estos dos SNPs más el alelo T del SNP -799 C/T se ha visto que provoca un aumento de hasta tres veces en el nivel de transcripción de MMP-8 en células de trofoblasto, y se ha visto asociado con la ruptura prematura de membranas (Wang H et al, 2004). En nuestro análisis de haplotipos los resultados positivos que hemos obtenido no son muy fiables puesto que el haplotipo C-T-T se encuentra aumentado en los hombres con THR, y por el contrario, está disminuido en mujeres con HOA (Tabla R.13 y R.15). Esto puede deberse al marcado contraste en las frecuencias del alelo raro del SNP -799 C/T entre las mujeres y varones de nuestra población control (30.4% vs 43.6%, respectivamente). Esta variación, probablemente debida al azar, condiciona todos los análisis que incluyen este SNP. El mismo tipo de diferencia se observó en los SNPs -381 T/C y +17G/C que mostraron frecuencias notablemente menores en las mujeres controles que las observadas en los varones (4.8 vs >9.5 respectivamente). Por lo tanto, los resultados obtenidos en MMP-8 necesitan, todavía con más claridad que el resto, replicación en nuevos estudios. 114 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide a Orientación de la sonda: R = reverse; F = forward b En mayúsculas oligonucleótidode secuencia no humana c Se utilizó un primer interno que hibridase en la repetición Alu debido a que el tamaño de esta era de 316pb Serín proteasa Polimorfismo Primer de PCR Sonda de SNaP Shot a PLAT Alu I/D Izquierdo tccgtaacaggacagctcacFAM Derecho tcttgaccttgcagcacacc Interno gtgctgggattacaggcgtg c +164 C/T Izquierdo agaaccctgacggatctgac Derecho acgaggaccagggcatcagc cctgatggcgtctggcctcc (R) -7351 C/T Izquierdo agcggcgagtcctgtgatgc Derecho tgcactccagcctgggagac catggctgtgtctggggc (R) PLAU +141 C/T Izquierdo tggttgagtcttccctgagg Derecho tccccttccaccccactgtc catgcaccatgcactcttggacaagc (F) +4065 G/A Izquierdo actgggaagataggctctgc Derecho tctgggcagccagcacccag atgcctgagggtaaagctattgtcgttc (R) PAI-1 -844 T/C Izquierdo agcacaccctgcaaacctgc Derecho ccttgtctggctgaggttgg caggagaccaacgtgtaagtttcacttc (R) -675 G/A Izquierdo gggcacagagagagtctgga Derecho cccctagtgttcagcttgga acagagagagtctggacacgtgggg (F) Tabla R.22.: Primers de PCR y sondas utilizadas en el estudio Resultados, discusión y procedimiento experimental 115 Resultados Frecuencias alélicas pacientes y controles Para analizar si SNPs en proteasas de Serina de ECM eran factores de riesgo para OA, comparamos frecuencias alélicas de pacientes y controles, estratificando por la articulación afectada (THR, TKR o HOA). Al igual que en las MMPs, el estudio se realizó en primer lugar sobre la población en general y posteriormente se realizó una estratificación por sexos. En el caso de los pacientes de THR se encontró que de los siete polimorfismos estudiados, cinco de ellos tenían frecuencias similares en pacientes y controles. Tan sólo dos polimorfismos, el PLAT Alu I/D y el SNP PAI-1 -844 T/C,presentaron diferencias significativas entre pacientes THR y controles (Tabla R.23). Los resultados que se obtuvieron después de la estratificación por sexos no mostraron ningún resultado significativo y tan sólo mostraron cambios reseñables en el caso de los SNPs -844 G/A de PAI-1 en mujeres y +164 C/T de PLAT en hombres. (Tablas R.24 y R.25). Este resultado del SNP +164 C/T de PLAT es muy cuestionable dado la baja frecuencia del alelo raro de este SNP. aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 37.76 43.77 0.03 1.28 (1.02-1.62) +164 C/T 1.36 2.51 ns 1.86 (0.78-4.43) -7351 C/T 31.40 35.52 ns 1.20 (0.95-1.53) PLAU +141 C/T 16.33 17.73 ns 1.10 (0.81-1.19) +4065 G/A 36.73 34.49 ns 0.91 (0.71-1.15) PAI-1 -844 T/C 46.26 40.26 0.04 0.78 (0.62-0.98) -675 G/A 47.28 51.83 ns 1.20 (0.91-1.57) Tabla R.23: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes THR. 116 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % En el grupo de pacientes con OA de la rodilla, tan sólo se encontró un resultado significativo (PAI -1 -675 G/A). También se encontraron cambios importantes en las frecuencias entre pacientes y controles en el caso del SNP +4065 G/A de PLAU aunque estas no llegaron a ser significativas. (Tabla R.26). La estratificación por sexos mostró que las frecuencias en pacientes y controles eran bastante similares en todos los polimorfismos estudiados en las mujeres (Tabla R.27), mientras que en los hombres, se encontró un resultado significativo (PAI-1 -675 G/A), aunque hay que tomarlo con cierta cautela debido a que el número de hombres TKR es pequeño (Tabla R.28). Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 39.57 45.38 ns 1.27 (0.91-1.77) +164 C/T 2.17 2.25 ns 1.03 (0.33-3.20) -7351 C/T 34.35 37.57 ns 1.15 (0.81-1.62) PLAU +141 C/T 16.96 17.13 ns 1.01 (0.65-1.57) +4065 G/A 37.39 33.61 ns 0.85 (0.60-1.19) PAI-1 -844 T/C 46.09 38.52 0.07 0.73 (0.52-1.02) -675 G/A 45.65 50.00 ns 1.19 (0.82-1.73) Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 36.59 41.32 ns 1.22 (0.87-1.70) +164 C/T 0.84 2.92 0.05 3.55 (0.91-13.89) -7351 C/T 29.49 32.33 ns 1.14 (0.80-1.63) PLAU +141 C/T 15.92 18.75 ns 1.22 (0.79-1.87) +4065 G/A 36.31 36.13 ns 1.00 (0.72-1.42) PAI-1 -844 T/C 46.37 42.44 ns 0.85 (0.61-1.19) -675 G/A 48.32 54.92 ns 1.30 (0.86-1.97) Tabla R.24: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes THR mujeres. Tabla R.25: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes THR hombres. Resultados, discusión y procedimiento experimental 117 aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 37.76 41.27 ns 1.16 (0.91-1.47) +164 C/T 1.36 0.94 ns 0.69 (0.22-2.12) -7351 C/T 31.40 33.91 ns 1.12 (0.87-1.44) PLAU +141 C/T 16.33 15.09 ns 0.91 (0.66-1.26) +4065 G/A 36.73 31.73 0.08 0.80 (0.62-1.02) PAI-1 -844 T/C 46.26 44.62 ns 0.93 (0.74-1.19) -675 G/A 47.28 40.23 0.02 0.75 (0.59-0.95) Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 39.57 43.24 ns 1.16 (0.84-1.61) +164 C/T 2.17 0.93 ns 0.42 (0.11-1.59) -7351 C/T 34.35 33.57 ns 0.97 (0.69-1.36) PLAU +141 C/T 16.96 15.19 ns 0.88 (0.57-1.35) +4065 G/A 37.39 31.90 ns 0.78 (0.56-1.10) PAI-1 -844 T/C 46.09 43.81 ns 0.91 (0.66-1.26) -675 G/A 45.65 42.38 ns 0.87 (0.63-1.21) Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 36.59 33.02 ns 0.85 (0.54-1.35) +164 C/T 0.84 0.98 ns 1.17 (0.12-11.38) -7351 C/T 24.49 35.29 ns 1.30 (0.82-2.10) PLAU +141 C/T 15.92 14.71 ns 0.91 (0.49-1.69) +4065 G/A 36.31 31.00 ns 0.79 (0.49-1.27) PAI-1 -844 T/C 46.37 48.00 ns 1.07 (0.68-1.66) -675 G/A 48.32 31.37 0.002 0.49 (0.31-0.78) Tabla R.26: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes TKR. Tabla R.27: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes TKR mujeres. Tabla R.28: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes TKR hombres. 118 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide El estudio de asociación en pacientes con OA de la mano mostró que las frecuencias de los siete polimorfismos estudiados fueron similares entre pacientes y controles tanto en la población general como en las subpoblaciones de hombres y mujeres no encontrándose ninguna diferencia significativa. Tan sólo en el caso del SNP PAI-1 -675 G/A se observó una cambio destacable en las frecuencias, pero este no llegó a ser significativo (Tablas R.29, R.30 y R.31) aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 37.76 38.84 ns 1.05 (0.82-1.34) +164 C/T 1.36 2.29 ns 1.70 (0.68-4.26) -7351 C/T 31.40 29.87 ns 0.93 (0.71-1.21) PLAU +141 C/T 16.33 17.29 ns 1.07 (0.78-1.48) +4065 G/A 36.73 37.12 ns 1.02 (0.79-1.31) PAI-1 -844 T/C 46.26 47.16 ns 1.03 (0.82-1.32) -675 G/A 47.28 41.21 0.05 0.78 (0.61-0.99) Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 39.57 38.97 ns 0.97 (0.70-1.35) +164 C/T 2.17 2.61 ns 1.20 (0.41-3.51) -7351 C/T 34.35 28.96 ns 0.78 (0.55-1.10) PLAU +141 C/T 16.96 18.25 ns 1.10 (0.71-1.67) +4065 G/A 37.39 38.35 ns 1.04 (0.75-1.45) PAI-1 -844 T/C 46.09 46.32 ns 1.01 (0.73-1.39) -675 G/A 45.65 41.90 ns 0.86 (0.62-1.19) Tabla R.30: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes HOA mujeres. Tabla R.29: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes HOA. Resultados, discusión y procedimiento experimental 119 aSe muestra la frecuencia del alelo raro en % Serín proteasa Polimorfismo ControlesaCasosaP valor O.R. (95% C.I.) PLAT (Alu) Intron 8 I/D 36.59 37.04 ns 1.02 (0.56-1.84) +164 C/T 0.84 0.00 ns - -7351 C/T 29.49 37.50 ns 1.43 (0.77-2.68) PLAU +141 C/T 15.92 11.11 ns 0.66 (0.29-1.61) +4065 G/A 36.31 26.92 ns 0.64 (0.34-1.24) PAI-1 -844 T/C 46.37 54.00 ns 1.36 (0.75-2.46) -675 G/A 48.32 38.89 ns 0.68 (0.38-1.22) Tabla R.31: Frecuencias alélicas de los polimorfismos estudiados en controles y pacientes HOA hombres. 120 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Extensión del estudio de la repetición Alu de PLAT en OA Con el objetivo de confirmar los resultados obtenidos en la colección de Santiago, el polimorfismo repetición Alu del gen PLAT, fue también estudiado en otras dos poblaciones europeas independientes: la colección de Tesalia (Grecia) y la colección de Oxford (Reino Unido). Los resultados obtenidos en la población española no se confirmaron en ninguna de las otras dos poblaciones, no encontrándose asociación ni en el análisis global ni en la estratificación por sexos (Tabla R.32). PLAT Alu (I/D) Colección Grupo D % p O.R. (95% C.I.) Tesalia Control (n = 386) 37.77 Control mujeres (n = 274) 39.31 Control hombres (n = 112) 33.96 TKR (n = 318) 43.06 0.17 1.24 (0.91-1.70) TKR mujeres (n = 278) 42.00 0.54 1.12 (0.78-1.59) TKR hombres (n = 40) 50.00 0.08 1.94 (0.92-4.13) Oxford Control (n= 1396) 42.12 Control mujeres (n = 712) 42.77 Control hombres (n = 684) 41.45 TKR (n = 720) 40.66 0.52 0.94 (0.78-1.13) TKR mujeres (n = 392) 41.44 0.67 0.95 (0.73-1.22) TKR hombres (n = 328) 39.75 0.61 0.93 (0.71-1.22) THR (n= 2210) 41.58 0.75 0.98 (0.85-1.12) THR mujeres (n = 1258) 42.31 0.84 0.98 (0.81-1.18) THR hombres (n = 952) 40.60 0.73 0.97 (0.79-1.18) Tabla R.32: Frecuencias alélicas de la repetición Alu de PLAT en pacientes y controles de las dos poblaciones estudiadas. N se refiere al número de alelos, I = presencia de la repetición Alu; D = ausencia de la repetición Alu. Resultados, discusión y procedimiento experimental 121 El análisis conjunto de las tres colecciones puso de manifiesto la ausencia de asociación con OA en los dos subgrupos de pacientes estudiados. La estratificación por sexos tampoco mostró ningún resultado positivo (Tabla R.33) Mantel-Haenszel Test Grupo Individuos Pvalor OR M-H Interacción M-H Controles combinados (Santiago, Tesalia, Oxford) 1185 Controles mujeres combinados (Santiago, Tesalia, Oxford) 608 Controles hombres combinados (Santiago, Tesalia, Oxford) 577 TKR combinados (Santiago, Tesalia, Oxford) 782 0.49 1.05 (0.92-1.20) 0.30 TKR mujeres combinados (Santiago, Tesalia, Oxford) 546 0.79 1.02 (0.86-1.22) 0.60 TKR hombres combinados (Santiago, Tesalia, Oxford) 236 0.99 0.99 (0.80-1.25) 0.17 Controles combinados (Santiago, Oxford) 992 Controles mujeres combinados (Santiago, Oxford) 471 Controles hombres combinados (Santiago, Oxford) 521 THR combinados (Santiago, Oxford) 1412 0.34 1.06 (0.94-1.19) 0.05 THR mujeres combinados (Santiago, Oxford) 814 0.64 1.04 (0.90-1.22) 0.18 THR hombres combinados (Santiago, Oxford) 598 0.58 1.05 (0.88-1.25) 0.26 Tabla R.33: Análisis de asociación de la repetición Alu de PLAT en controles y pacientes de THR y TKR en p oblación caucásica ( Santia g o , Tesalia y Oxford. ) 122 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Análisis de las frecuencias haplotípicas El estudio de LD en las proteasas de serina se realizó en los tres genes analizados (PLAT, PAI-1 yPLAU). El LD existente entre los polimorfismos de un mismo gen fue lo suficientemente alto como para justificar un análisis de haplotipos tanto en valores de D’ como en valores de r2 (datos no mostrados). El análisis de haplotipos no aportó ningún resultado adicional con respecto al estudio de frecuencias alélicas. El único resultado positivo fue encontrado con el haplotipo T-G de PAI-1 en OA de la mano (Tabla R.34). El haplotipo T-A refleja el efecto protector observado con el alelo raro del SNP -675 G/A. Sin embargo, el haplotipo asociado, TG, muestra un efecto contrario de susceptibilidad que no se apreciaba en el estudio de los SNPs por separado y que sugiere algún tipo de interacción entre los SNPs, o la presencia de otros SNPs con repercusión en la OA de la mano. Estos dos SNPs muestran una D’ de 0.93 y una r2 de 0.62 (Datos no mostrados). En el caso de PLAT se encontró un haplotipo que presentaba diferencias en su distribución de frecuencias entre pacientes con THR y controles, pero estas no llegaban a ser significativas (p = 0.07) (Datos no mostrados). Discusión En el grupo de Serín proteasas estudiadas, se encontraron diversas asociaciones con susceptibilidad a la OA en los tres fenotipos estudiados. Concretamente, con la repetición Alu en el intrón 8 de PLAT y el SNP -844 T/C de PAI-1 en el grupo THR, aunque la asociación de la repetición Alu no fue confirmada, el SNP -675 G/A de PAI-1 en el grupo TKR y con un haplotipo de PAI-1 en el grupo HOA. PLAT codifica para el activador tisular del plasminógeno. Su papel en enfermedades articulares ha sido estudiado sobre todo en relación a la artritis reumatoide (RA), encontrándose que en los pacientes con RA se observa una baja expresión de PLAT (Busso N et al, 1997) (SanchezHaplotipo Controles Casos P valor Total PAI-1 -844/-675 C-G 44.9 46.3 ns T-A 45.9 40.3 ns T-G 7.8 11.8 0.03 Tabla R.34: Frecuencias de los haplotipos estimados a partir de los SNPs estudiados en PAI-1 en controles y pacientes con OA de la mano. Resultados, discusión y procedimiento experimental 123 Pernaute O et al, 2003) (So AK et al, 2003). En la OA, también se observó un descenso de la expresión de PLAT en pacientes comparado con controles (Busso N et al, 1997) y, aunque, esta diferencia de expresión no llegó a ser significativa, sugiere que PLAT puede estar implicado en la patogénesis de la OA. El papel de PLAT en la OA sería indirecto, agravando la inflamación secundaria a la enfermedad por acumulación de fibrina. De esta manera contribuiría a la activación de MMPs por parte de citoquinas proinflamatorias, lo que traería como consecuencia una aceleración de la degradación del cartílago. (Busso N et al, 2002). La repetición Alu que nosotros encontramos asociada en pacientes con THR españoles altera los niveles de expresión de PLAT. En concreto, el alelo D (ausencia de la repetición Alu), que se encontró aumentado en los pacientes con THR, se correlaciona con bajos niveles de PLAT en plasma (Jern C et al, 1999). Este dato ha sido corroborado por nuestro laboratorio en colaboración con el laboratorio del Dr John Loughlin de la Universidad de Oxford mediante análisis de expresión alélicas diferencial en tejido sinovial de pacientes con OA (Datos no mostrados). Sin embargo, el intento por confirmar la asociación de la repetición Alu en pacientes con THR en muestras independientes produjo resultados negativos. Además, el análisis conjunto de las poblaciones estudiadas mostró que no había diferencias ni en THR ni en TKR. Estos resultados indican que no existe asociación entre la repetición Alu de PLAT y susceptibilidad a la OA. A su vez, esto indica que posiblemente nuestros primeros resultados se debieran a variaciones al azar de las frecuencias alélicas. Otro de los resultados positivos encontrados en Serín proteasas se corresponde con los SNP de PAI-1. PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeno-1) es otro miembro del sistema plasminógeno-plasmina (PAs). Su función, como su nombre indica, es la de inhibir los activadores del plasminógeno, PLAT y PLAU (Andreasen PA et al, 1990). Los estudios que se han realizado sobre PAI-1 y su posible papel en la OA están basados en que sus niveles se encuentran aumentados en pacientes con OA (Busso N et al, 1997). Su posible acción en la degradación del cartílago es a través de la actividad proteolítica mediada directamente por la plasmina, o indirectamente a través de la activación de proteasas de matriz extracelular por la propia plasmina o por citoquinas proinflamatorias. En nuestro estudio, los dos SNPs analizados en PAI-1 se encuentran asociados con alguna forma de OA. Como los efectos descritos para los alelos raros de estos dos SNPs son opuestos, cabría esperar que los cambios en la distribución de las frecuencias también lo fueran. Sin embargo, el alelo C del SNP -844 T/C está disminuido en el grupo de pacientes con THR y el alelo A del SNP -675 G/A está disminuido en el grupo de pacientes con TKR y muestra una tendencia a la disminución en los pacientes con OA de mano. No está claro como se puede 130 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Arthritis Research & Therapy Vol 8 No 1 Rodriguez-Lopez et al. Page 4 of 7 (page number not for citation purposes) software. This software checks the relative fitting to data of a series of genetic models that include parameters for additive, dominance and epistatic interactions between two genes. The model that best accounted for the data was the model assuming additive effects of both SNPs, without dominance or interactive components. Five of the studied ECM protease genes (MMP7,MMP1, MMP3 and MMP13) are in a MMP cluster that covers 500 kb in chromosome 11q and includes at least another five MMPencoding genes. Therefore, we checked if they were in LD and if the haplotypes defined by them were associated with RA as a way to explore possible effects in the region not accounted for by the studied SNPs. There was significant LD between the two SNPs in MMP7 (-181 A/G and -153 C/T), between the MMP1 -1607 1G/2G and MMP3 -1171 6A/5A SNPs, and between MMP13 -77 A/G and two other SNPs (MMP3 -1171 6A/5A and MMP7 -153 C/T). Comparison of the frequencies of the haplotypes defined by the pairs of SNPs in LD did not disclose significant differences between RA patients and controls (not shown). Discussion The lack of association with RA of seven of the regulatory SNPs in ECM proteases was somehow unexpected because they affect proteases with a recognized role in RA [7-9] and because the size of the study allowed for detection of modest effects (for example, the post hoc power to detect an excess of the T allele of the MMP9 SNP was 87% for a risk ratio of 1.2). In fact, there is much more published evidence supporting the involvement of some of the ECM proteases that did not show association in our study than the two that were associated with RA. This is especially clear for the metalloproteinases MMP13, MMP1, MMP3 and MMP9. We also analyzed the possibility of cooperation or of cumulative effects between these SNPs with regard to their association with RA. It would be a mistake, however, to interpret too strongly these results as questioning the importance of these six ECM proteases in RA. At least two factors moderate a conclusion of this type. The multiplicity of control mechanisms of ECM protease activity, of which transcription regulation is only one of importance, compartmentalization by pericellular accumulation, activation by cleavage of latent pro-enzymes and inhibition by specific proteins being the others [7,8]. Also, variation in these proteases could impinge on other aspects of disease progression different from disease susceptibility, although we did not find significant association with any of the clinical features available for study. They did not include disease activity indexes or quantitative assessment of bone erosions, however, which could be more informative of the possible involvement of these SNPs. This seems the case for the SNP in MMP3 found in previous studies to be associated with quantitatively evaluated RA erosions [3,5], but not to RA susceptibility [3,6]. It is also possible that the SNP in MMP1 predisposes to some RA features because there are reports of association with RA inflammatory activity [4] or with RA erosions [6] although these associations were not found in other studies [2]. The two regulatory SNPs that showed moderate association with RA susceptibility cause lower transcription of their respective genes, PLAT and MMP2. Both of them seem genuine associations because they have been found in a hypothesis driven case-control study and have shown modest effects, in the range that is expected in complex diseases and specifically in RA [1]. The size of the study, 550 cases and 642 controls, effectively prevents interference from random variation of allelic frequencies, which is the major cause of false positive results in genetic association studies [24]. In this regard, it is reassuring that about 90% of the associations shown in studies involving more than 150 cases and controls Table 2 Allele frequencies of the nine regulatory single nucleotide polymorphisms in extracellular matrix proteases Gene SNP Allele RA patients Controls OR pSex-adjusted OR Change in transcriptiona MMP1 -1607 1G/2G 2G 47.8 48.2 0.98 0.8 0.96 Up MMP2 -1306 C/T T 24.5 20.3 1.27 0.01 1.27 Down MMP3 -1171 6A/5A 5A 50.5 51.7 0.95 0.5 0.96 Up MMP7 -181 A/G G 43.8 45.3 0.94 0.4 0.95 Up -153 C/T T 5.0 5.1 0.99 0.9 0.98 Up MMP9 -1562 C/T T 14.3 13.6 1.05 0.6 1.02 Up MMP13 -77 A/G A 68.0 65.6 1.13 0.2 1.09 Up PLAT -7351 C/T T 36.4 32.1 1.21 0.03 1.20 Down PAI-1 -675 5G/4G 4G 47.6 46.8 1.03 0.7 1.05 Up Frequency values for rheumatoid arthritis (RA) and controls are percentages. aReported upor downregulation of gene expression determined by the mentioned allele. MMP, matrix metalloproteinase; OR, odds ratio; PAI, plasminogen activator inhibitor; PLAT, plasminogen activator, tissue type; SNP, single nucleotide polymorphism. Resultados, discusión y procedimiento experimental 131 Available online http://arthritis-research.com/content/8/1/R1 Page 5 of 7 (page number not for citation purposes) have subsequently been replicated, as pointed out in a recent meta-analysis [24]. Finally, population stratification, another widely claimed cause of spurious association results, is not a significant concern in this study as all cases and controls comprised a very homogenous population. They resided in a largely rural area where immigration has been very restricted. Specifically, 71.8% of the RA patients and 74.0% of the controls had all known ancestors from the same province (Corunna), and 95.4% of the RA patients and 95.3% of the controls were from the same historic region (Galicia, composed of four of the 52 Spanish provinces). In addition, analysis of data restricted to study participants with all known ancestors from Galicia or from Corunna gave similar results to those from the whole study. Nevertheless, circumspection should be exercised in interpreting these associations until the results can be replicated. PLAT participation in RA has been related to fibrin accumulation in RA synovial cavities [25-27] and the association found here could be involved in this process. A contributing factor in the increase of fibrin could be the lower or unchanged expression of PLAT in RA synovium compared to healthy synovium [28,29], which would cause the availability of plasmin, the major fibrinolytic enzyme, to be restricted. A putative protective role for PLAT in arthritis has also been shown in experimental models of RA [30,31]. As the T allele of PLAT -7351 disrupts a GC box in the PLAT enhancer [17,32] it could contribute to the insufficient fibrinolysis and, thus, to RA. Other processes in which hypofibrinolysis is a contributing disease mechanism, such as myocardial infarction [33] and lacunar stroke [34], have also been associated with the T allele of the PLAT -7351 C/T SNP and these two diseases are observed at increased rate in RA. Very few studies have addressed the role of MMP2 in RA. It has been assumed that MMP2 promotes RA by participating in cartilage degradation and by activating pro-inflammatory mediators based on its in vitro reactivity [8,9]. However, MMP2 levels and activity seem to be unaltered in human RA [35-37] and in experimental models of RA [38]. In addition, MMP2 plays a suppressive role in the pathogenesis of antibody-induced arthritis, as shown by an exacerbated disease in MMP2 deficient mice [39]. A likely mechanism for MMP2mediated protection against RA involves the inactivation of chemokines (CCL7 and SDF1), thereby limiting inflammatory infiltration [40,41]. Consistent with a protective role for MMP2 in RA, the allele associated with increased RA susceptibility in our study is the low-expression allele [42,43]. The in vivo relevance of this change has been demonstrated by the association of the MMP2 -1306 C/T SNP with several types of cancer [43-48], although a recent report showed no association with chronic periodontitis [49], a disease with many similarities to RA with respect to inflammation and ECM proteases [50]. Our study indicates that both SNPs act independently in their contribution to RA liability. This conclusion is consistent with the independent roles proposed for the two proteases for their putative protective effect in RA. Interaction with other gene polymorphisms should be explored as it is likely that variants of cytokine genes that are important in RA and that trigger ECM protease gene expression, especially tumor necrosis factor and interleukin-1 but also interleukin-6, epidermal growth facFigure 1 Genotype frequencies (%) of single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with rheumatoid arthritis (RA)Genotype frequencies (%) of single nucleotide polymorphisms (SNPs) associated with rheumatoid arthritis (RA). (a) The PLAT -7351 C/T and (b) the MMP2 -1306 C/T SNP in controls (blank columns) and RA patients (filled columns). Error bars represent the 95% confidence interval. 132 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide Arthritis Research & Therapy Vol 8 No 1 Rodriguez-Lopez et al. Page 6 of 7 (page number not for citation purposes) tor, platelet-derived growth factor, basic fibroblast growth factor and transforming growth factor-beta, potentiate the effect of the SNPs studied here. In the same way, it is possible that variants of the genes encoding chemokines that are cleaved by MMP2 could interact with the -1306 C/T SNP in determining increased RA susceptibility. Conclusion It seems that genetic variants affecting transcription of ECM proteases are not major contributors to RA susceptibility. It is possible, however, that some play a minor role as shown here for the PLAT and MMP2 SNPs. These associations need to be confirmed, although it is already possible to see that the likely effects of these SNPs are consistent with previous evidence supporting a protective effect of the two proteases in arthritis. Confirmation of these associations will lend support to this hypothesis and will show how important it is to define the participation of each ECM protease in joint pathology before trying to manipulate them therapeutically. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors' contributions All authors contributed to the final manuscript. In addition, JRL did the genotyping and participated in the design of the study and the analysis of results, EP-P reviewed all the clinical data from the patients and selected them according to the ACR classification criteria, JG-R participated in the selection of patients, and AG coordinated the study and participated in its design, experiments, analysis and in the writing of this manuscript. Acknowledgements We thank sample donors for their collaboration and Drs Antonio Mera, Manuel Caamaño, Jorge Blanco and Santos Insua for providing access to their patients. Lorena Fernandez-Blanco collaborated in the selection of the functional SNPs. We thank also Yolanda Lopez-Golan and Fina Meijide for their help in recruiting study participants. This project was supported by grant PI02/0713 from the Instituto de Salud Carlos III (Spain) with participation of funds from FEDER (European Union). JR-L is the recipient of a scholarship of the National Program for the Training of University Professors of the Spanish Ministry of Education. AG was supported by the Instituto de Salud Carlos III (Spain). References 1. Harney S, Wordsworth BP: Genetic epidemiology of rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 2002, 60:465-473. 2. Constantin A, Lauwers-Cances V, Navaux F, Abbal M, van Meerwijk J, Mazieres B, Cambon-Thomsen A, Cantagrel A: Collagenase1 (MMP-1) and HLA-DRB1 gene polymorphisms in rheumatoid arthritis: a prospective longitudinal study. J Rheumatol 2002, 29:15-20. 3. 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[email protected] Accepted 13 January 2007 Published Online First 19 January 2007 ........................ Ann Rheum Dis 2007;66:1052–1055. doi: 10.1136/ard.2006.065938 Objective: To replicate the association of frizzled-related protein (FRZB) non-synonymous polymorphisms with osteoarthritis (OA) susceptibility. Methods: Three groups of Spanish patients with OA were included: with total joint replacement due to primary OA in the hip (n = 310), or the knee (n=277), or with hand OA (n=242). Controls were more than 55 years old and did not show OA (n= 294). SNPs rs288326 (R200W) and rs7775 (R324G) were genotyped. Results: There were no significant differences in allele frequencies between controls and each of the three groups of OA patients. However, allele G of the R324G SNP showed a trend to be more frequent in patients with a clinical OA syndrome at multiple joints (p= 0.07), specifically in women of the total hip replacement group (8.3% in patients without other affected joints, 13.1% with one, 15.9% with two and 24.1% with more than two additional joints, p for trend =0.008). Conclusions: No direct replication of previous OA association findings was obtained but the results suggest that the R324G SNP of the FRZB gene may have an effect in OA development in multiple joints, with a specific severe involvement of the hip in women. This phenotype could reconcile previous studies that showed association either with generalised OA or with hip OA in women. It is well known that osteoarthritis (OA) is the commonest form of joint disease and a leading cause of disability in older people, 1 but while some people develop OA changes in their 40s and 50s, others enjoy long lives without joint problems. Several factors play a role in the variable OA risk, including age, sex, genetics, ethnicity, behavioural influences, obesity and occupation. 2 Genetic factors have been shown to account for between 40% and 85%, depending on the phenotype considered, of the variance in liability to OA and they contribute to a twofold to fivefold increase in OA risk in patient siblings. 3 However, each genetic factor has a modest effect and, consequently, their identification and study are difficult. 24 A further complication of research in OA derives from a variety of disease phenotypes that seem to depend on different susceptibility factors 24 and could be related to different pathogenic mechanisms. 5 Therefore genetic variants predisposing to OA in one joint do not have, in general, the same effect in other joints and may even differ between men and women. 6 Our current knowledge of the disease is too crude to explain these differential effects, or to identify differences between these joint-specific factors and others that seem to predispose to OA more broadly. In spite of these difficulties, several genetic factors have been shown reproducibly to participate in OA predisposition, such as polymorphisms in the oestrogen receptor a gene (ESR1) or the interleukin 1 (IL1) cluster and a repeat polymorphism in the asporin gene. 27 A series of recent studies show some evidence implicating non-synonymous single nucleotide polymorphism (nsSNPs) of the frizzled-related protein (FRZB) gene, coding for the secreted frizzled-related protein 3 (SFRP3), in a couple of OA phenotypes. The first evidence was obtained by linkage analysis of UK sibling pairs concordant for total hip replacement (THR) for primary OA. 8 FRZB is in the linked locus, in chromosome 2q, and is a likely candidate because, as in its role of inhibitor of WNT signalling, it is involved in bone and joint development. 9–11 Association to a nsSNP (rs7775 causing a R324G substitution) in FRZB was found in female probands. Replication of the association in the THR female subset of a case-controlled UK cohort in the same report strengthened the case for a direct role of the R324G SNP of FRZB in severe hip OA in women. 8 There was also evidence of a possible effect of another FRZB nsSNP (rs288326 causing a R200W substitution) only in women bearing both the G allele of R324G and the W allele of R200W. Functional experiments showed that the 324G allele of SFRP3 is less effective in blocking WNT signalling, an effect that will be related to a decreased sequestration of WNT ligands in the extracellular space. Additional experiments showed that other SNPs in the FRZB promoter do not significantly affect transcription levels and are unlikely to be alternative causal variants. 12 A subsequent study has obtained confirmatory evidence for the role of the FRZB nsSNPs in radiographic hip OA characterised by severe joint space narrowing in women. 13 In this case the effect was mainly associated with the R200W SNP, although carriage of both the R200W and R324G rare alleles was a risk factor. Another study showed an effect of the R200W SNP, but not of the R324G SNP, in the difference between women with THR and women with osteoporosis but not in the comparison with healthy controls. 14 Neither of these two replication studies included patients with OA in other joints or men with hip OA. A broader range of OA phenotypes was explored in a third replication study that included both male and female subjects with radiographic OA in the hip or in multiple joint regions in a population-based cohort. 15 They also included sibling pairs selected for the presence of symptomatic OA at multiple sites. In this study the OA predisposition effect of the FRZB nsSNPs was only evident for the R324G SNP and in patients with polyarticular OA (no sex effect was mentioned) but not in those with hip OA. Therefore, it seems that there is already convincing evidence, though not completely conclusive, of the involvement in OA of nsSNPs in the FRZB gene. However, there are still many unresolved questions including whether they play a role only in women, only in hip OA, or in polyarticular OA, or if each of the two non-synonymous SNPs Abbreviations: FRZB, frizzled-related protein; HOA, hand osteoarthritis; OA, osteoarthritis; THR, total hip replacement; TKR, total knee replacement 1052 www.annrheumdis.com on 28 September 2007 ard.bmj.comDownloaded from 138 Factores genéticos implicados en el desarrollo de la artrosis y la artritis reumatoide has an effect on their own or whether both rare alleles need to be present in the same subject. We have tried to address some of these outstanding questions. MATERIAL AND METHODS Patients and controls Selection criteria and patient characteristics have been described. 16 In brief, subjects were recruited from patients undergoing total hip replacement (THR) or total knee replacement (TKR) only if a rheumatologist considered them to suffer from severe primary OA (a directed questionnaire, the clinical history and radiographs previous to surgery were reviewed). A third group included patients attending the rheumatology unit because of hand OA (HOA) complaints who fulfilled American College of Rheumatology classification criteria. 17 The presence of chronic pain and incapacity in other joint regions different from the one motivating recruitment of the patients, as well as hand deformities in THR and TKR patients, were recorded. These manifestations were considered as evidence of clinical OA by a rheumatologist after excluding other causes by means of anamnesis following a directed questionnaire and review of the clinical history. Radiographs of the additional joint regions were not a requisite. Controls were older than 55 years. Only the 31.6% who were free of clinical manifestations compatible with OA (radiographic examination was not performed) were included. This selection introduced a bias in the controls: of the 929 voluntary donors 58.2% were women, but after exclusion of those with features compatible with OA only 39.1% were women. Accordingly, comparisons were stratified by sex. The final numbers in each group are shown in table 1. This study was approved by the Ethical Committee for Clinical Research of Galicia and all participants gave their written informed consent. All were of Spanish origin and resided in the reference area of the hospital. Genotyping Peripheral blood samples were used to obtain DNA. TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) 59nuclease assays were used to genotype two non-synonymous FRZB SNPs: rs288326 C/T that causes the R200W substitution in exon 4 and rs7775 C/ G producing the R324G substitution in exon 6. Primers and fluorescence-labelled probes were designed and synthesised by Applied Biosystems and their sequences are available from the authors. TaqMan reactions were performed in a total volume of 10 ml containing 24 ng genomic DNA following the Applied Biosystems protocol. A Chromo4 real-time PCR system (MJ Research, Waltham, MA) was used to run these assays. Several samples with different genotypes were sequenced with the Big Dye Ready Reaction Kit (Applied Biosystem) to test the accuracy of the genotypes. Statistical analysis Statistical analysis was carried out with the Statistica software (Statsoft, Tulsa OK). Allele frequencies, odds ratios (OR) and their 95% confidence intervals were calculated. Comparison of allele frequencies was done using a two-by-two contingency table with a X 2 test. Evidence of a gene dose effect was evaluated with univariate logistic regression applying an additive genetic model (codes were: 0 for AA, 1 for Aa and 2 for aa genotypes). Multivariate logistic regression was used to evaluate the effect of the two nsSNPs together. The effect of genotypes in number of OA localisations was determined via logistic regression. Linkage disequilibrium, estimation of haplotype frequencies and comparison of those frequencies between patients and controls were made with the Haploview software. RESULTS Three groups of patients have been included and their characteristics are shown in table 1. We have included in this table the percentages of patients showing clinical manifestations compatible with OA affectation in multiple joint regions. Controls were older than 55 years and selected to be free of symptomatic OA. Numbers of men in the TKR and HOA groups were small and results relative to them should be taken with caution. Power to detect an effect with OR = 2.0 in the THR patients was over 0.98, and for an OR = 1.5 it was 0.65 for the R324G SNP and 0.75 for the R200W SNP. Valid genotypes for the two FRZB nsSNPs were obtained in 98.7% of the subjects. Their frequencies were in accordance with the Hardy–Weinberg equilibrium. In contrast with what could be expected based on some previous reports, 813 the frequencies of the rare alleles of the R324G SNP and of the R200W SNP were not significantly elevated in women with hip OA compared with healthy controls (table 2). In addition, women with the other two OA phenotypes, TKR and HOA that were studied for the first time Table 1 Characteristics of patients and controls included in the different groups Characteristics OA patients ControlsTHR TKR HOA Number of subjects 310 277 242 294 Sex (% women, women/total) 60.6 80.5 88.4 39.1 188/310 223/277 214/242 115/ 294 Age of disease onset (median IQR*) 61 56 50 55–67 50–63 44–56 Age at recruitment (median IQR) 69 69 61 68 64–73 64–72 54–68 61–75 BMI (median IQR) 30.1 32.9 28.3 27.7– 32.9 29.9– 36.0 26.0– 31.3 OA in other joint regions % (number) No other region 42.6 (132) 35.0 (97) 44.2 (107) 1 region 31.3 (97) 31.8 (88) 30.2 (73) 2 regions 16.1 (50) 22.4 (62) 14.5 (35) .2 regions 10.0 (31) 10.8 (30) 11.1 (27) THR, total hip replacement; TKR, total knee replacement; HOA, hand osteoarthritis. *IQR, Interquartile range. Table 2 Minor allele frequencies*of the two nsSNPs of FRZB Women Men Total R324G Controls 11.6 (26/224) 10.7 (38/354) 11.1 (64/578) THR 14.1 (52/368) 9.7 (23/236) 12.4 (75/604) TKR 11.0 (49/444) 12 (13/104) 11.3 (62/548) HOA 12.1 (51/420) 9 (5/54) 11.8 (58/474) R200W Controls 11.3 (26/230) 17.6(63/358) 15.1 (89/588) THR 9.9 (37/372) 14.0 (34/242) 11.6 (71/614) TKR 13.5 (59/436) 16 (17/106) 14.0 (76/542) HOA 11.8 (50/422) 9 (5/54) 11.5 (55/476) *Frequencies expressed as % and number of minor alleles/total number of alleles. This frequency was significantly larger than in female controls (p =0.03). However, 126 additional male controls showed a W allele frequency (11.5%) very similar to the female frequency. THR, total hip replacement; TKR, total knee replacement; HOA, hand osteoarthritis. Frizzled-related protein gene polymorphisms 1053 www.annrheumdis.com on 28 September 2007 ard.bmj.comDownloaded from Resultados, discusión y procedimiento experimental 139 in relation with these SNPs, did not show differences from controls. In the same way, there were not differences between male patients from any of the three patient groups and male controls (as mentioned male numbers in the TKR and, specially, in the HOA groups were small). Similar negative results were observed in the genotype analysis of the two nsSNPs using an additive genetic model (not shown). A previous report has indicated that the G allele of the R324G SNP is associated with polyarticular OA. 15 We have found some supportive evidence by comparing the frequencies of this SNP in patients with manifestations compatible with OA in additional joint regions. Notably, the strength of the association increased with the number of joint regions involved. There was a near significant trend when men and women from the three patient groups were considered together, but the relationship became clear after stratifying by groups of patients (table 3). The effect was restricted to patients of the THR group, with no differences in the other two groups: TKR and HOA. Further stratification by sex showed that the association was exclusively observed in women (table 4). Women in the TKR and the HOA groups did not show this association. Frequencies of the R200W SNP, on the other hand, did not show any relationship with the number of additional joint regions with OAcompatible affectation (data not shown). Finally, there was some previous evidence of a collective effect of the rare alleles of the two nsSNPs in OA susceptibility. 813 The two FRZB SNPs were not in linkage disequilibrium (D9= 0.07, r 2 = 0.003) in our samples as in all the previously studied populations. The haplotype frequency distribution was not different between THR women and controls, or between the other groups of patients and controls (not shown). In addition, there was not any evidence of a collective effect of the two SNPs in the number of additional joint regions involved. However, it should be noted that the rare alleles of the two nsSNPs appear together in very few subjects, given their low frequency and lack of linkage disequilibrium, and this study lacks power to detect a moderate effect of such a rare event. DISCUSSION Progressively, new genetic factors that seem implicated in OA susceptibility have been reported. 24 Evidence involving several of them starts to be compelling though it is not yet clear if any has reached a level of confirmation that could be taken as definitive. Experience in the study of other complex diseases, where rarely a genetic variant is consistently found to have the same effect in different studies, has led some authors 18 to think that only very significant and straightforward results, not involving analysis of subphenotypes or subgroups of patients, should be considered as evidence of a true genetic effect. However, research into OA has been providing examples of variants that show association in successive studies in spite of modest p values and of being restricted to a limited phenotype in the wide spectrum of the disease. In the case of the FRZB gene, some evidence of an effect of two nsSNPs in OA susceptibility has already been found in the four studies that have been conducted. 813–15 In each case the effect has been modest at best, with p values barely below 0.05, and always restricted to a subgroup of patients. In addition, the evidence of association has not been identical but with particular aspects in each case. Our results should be considered within this framework. The nsSNP that we have found associated, R324G, has been the susceptibility SNP in two of the previous studies, 815 and is also the SNP that has been shown to have a functional effect. 8 This makes it likely that it will be a genuine OA susceptibility variant. In contrast, the R200W SNP was associated with OA susceptibility only in two studies 13 14 and no functional consequences have been found for this nsSNP. 8 This makes it less likely that it will have an independent effect by itself. Some of the previous reports have obtained evidence of an increased susceptibility due to the concurrent presence of the rare alleles of these two nsSNPs. 813 We did not find any evidence of this, but due to the rarity of the presence of the two rare alleles in the same subject (expected frequency of about 1%) it will be necessary to use very large sample sizes to address this point adequately. The most interesting aspect of our study was the suggestion of a particular subgroup of patients where the effect of FRZB seems more likely: women who were recruited because of THR by primary OA and had referred clinical complaints compatible with OA in other joint regions. The strength of the association increased with the number of additional joint regions affected. This phenotype is interesting because it can be regarded as compatible with that found in previous studies and provides a way to conciliate evidence that previously seemed contradictory. In effect, FRZB association with OA has been restricted to women, as in our results, in the only study where sex has been analysed. 8 Also, only hip OA, apart from polyarticular forms of OA, has been found to be associated with nsSNPs in FRZB. We have expanded the range of OA forms studied to TKR and HOA, but they did not show evidence of association. Finally, there was also a study showing association to polyarticular OA but not to hip OA. 15 We interpret our results as a possible bridge between the association with hip OA and Table 3 Minor allele frequencies*of the two nsSNPs of FRZB in patients with OA stratified by number of joint regions in addition to the one that had determined patient recruitment showing OA compatible features Number of additionally affected joint regions p for trend012.2 R324G All groups 10.1 12.2 13.4 14.5 0.05 67/662 62/506 39/290 25/172 THR 9.7 12.2 14.3 22 0.01 25/258 23/188 14/98 13/60 TKR 10.3 13.4 11.3 9 0.9 20/194 23/172 14/124 5/58 HOA 10.5 11.0 16 13 0.3 22/210 16/146 11/68 7/54 R200W All groups 12.9 11.8 11.1 13.8 0.9 86/666 60/508 32/288 24/174 THR 13.0 8.8 10.0 17 0.9 34/262 17/192 10/100 10/60 TKR 16.7 12.9 12.5 12 0.2 32/192 22/170 15/120 7/60 HOA 9.4 14.4 10 13 0.5 20/212 21/145 7/68 7/54 *Frequencies were expressed as % and number of minor alleles/total number of alleles. THR, total hip replacement; TKR, total knee replacement; HOA, hand osteoarthritis. Table 4 Minor allele frequencies*of the R324G SNP in patients of the THR group stratified by sex Number of additionally affected joint regions p for trend012.2 Women 8.3 13.1 16 24 0.008 8/96 17/130 14/88 13/54 Men 10.5 10 0 0 0.3 17/162 6/58 0/10 0 *Frequencies were expressed as % and number of minor alleles/total number of alleles. 1054 Rodriguez-Lopez, Pombo-Suarez, Liz, et al www.annrheumdis.com on 28 September 2007 ard.bmj.comDownloaded from