Nanocomposites plasmónicos para manipulación de moléculas en célula viva

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Aitor Álvarez Lorenzo Tesis doctoral Nanocomposites plasmónicos para manipulación de moléculas en célula viva Santiago de Compostela, 2023 Programa de doctorado en Ciencia de Materiales TESIS DE DOCTORADO NANOCOMPOSITES PLASMÓNICOS PARA MANIPULACIÓN DE MOLÉCULAS EN CÉLULA VIVA Aitor Álvarez Lorenzo ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA DE MATERIALES SANTIAGO DE COMPOSTELA AÑO 2023 DECLARACIÓN DEL AUTOR/A DE LA TESIS D./Dña. Aitor Álvarez Lorenzo Título de la tesis: Nanocomposites plasmónicos para manipulación de moléculas en célula viva Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) De ser el caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. 4) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide la versión impresa con la presentada en formato electrónico. Y me comprometo a presentar el Compromiso Documental de Supervisión en el caso que el original no esté depositado en la Escuela. En Santiago de Compostela, 20 de junio de 2023. Firma electrónica AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS Nanocomposites plasmónicos para manipulación de moléculas en célula viva D. Pablo Alfonso del Pino González de la Higuera D. Pablo Taboada Antelo INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por D. Aitor Álvarez Lorenzo, bajo nuestra dirección, y a utorizamos su presentación , considerando que reúne l os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directores de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declararamos también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 20 de julio de 2023 Aitor Álvarez Lorenzo 8 TABLA DE CONTENIDOS Lista de figuras .................................................................................................................. 13 Lista de tablas .................................................................................................................... 21 LISTA DE ACRÓNIMOS Y ABREVIACIONES ........................................................... 24 Lista de publicaciones ....................................................................................................... 27 Agradecimientos ................................................................................................................ 30 Resumen ............................................................................................................................ 32 Resumo .............................................................................................................................. 38 Abstract ............................................................................................................................. 44 Objetivos ........................................................................................................................... 50 1. Introducción y estado del arte ....................................................................................... 54 1.1. Conceptos generales ............................................................................................... 54 1.1.1. Los inicios de la nanotecnología ..................................................................... 54 1.1.2. Clasificación de los NMs................................................................................. 55 1.1.3. Proceso de crecimiento de las NPs inorgánicas .............................................. 56 1.1.4. Síntesis y caracterización de NPs inorgánicas ................................................. 58 1.1.5. Funcionalización y estabilidad coloidal de las NPs inorgánicas ..................... 59 1.1.5.a. Funcionalización con PEG ....................................................................... 59 1.1.5.b. Funcionalización recubriendo con polímeros anfifílicos ......................... 61 1.1.6. Caracterización de NPs.................................................................................... 61 1.1.7. Propiedades y bioaplicaciones de NPs inorgánicas ......................................... 63 1.1.8. Toxicidad de las NPs inorgánicas.................................................................... 64 1.2. NPs plasmónicas ..................................................................................................... 65 1.2.1. La teoría de Mie............................................................................................... 66 1.2.2. Aplicaciones de las NPs plasmónicas.............................................................. 67 1.3. Marcos organometálicos ......................................................................................... 68 1.4. NPs magnéticas ...................................................................................................... 72 1.4.1. Magnetismo ..................................................................................................... 72 1.4.2. Histéresis ......................................................................................................... 73 1.4.3. Magnetismo a escala nano ............................................................................... 73 1.4.4. Hipertermia ...................................................................................................... 74 1.5. NPs de paladio ........................................................................................................ 76 2. Métodos y materiales .................................................................................................... 80 LISTA DE FIGURAS 15 negativamente coloreados en rojo (software Pymol®)139 (A). Migración de los AuNRs PEGilados con diferentes cantidades de BSA adsorbidas en su superficie. La movilidad electroforética relativa del complejo AuNRs@BSA se calcula como la distancia que ha migrado cada banda correspondiente de AuNRs@BSA normalizada por la distancia del control AuNRs (sin proteína) (B) .................................................................................................................... 113 Figura 24: Interacciones de los AuNRs@BSA PEGilados con células: Internalización celular de AuNRs@BSA en células HeLa después de 3 h de incubación analizada por citometría de flujo. El incremento en la intensidad de fluorescencia media (IFM) para la intensidad de fluorescencia de la fluoresceína (FITC) demuestra la internalización de los AuNRs debido al marcado de la BSA con la sonda fluorescente (A). Internalización celular de AuNRs y AuNRs@BSA en células HeLa después de 18 h de incubación analizada por citometría de flujo. El incremento de IFM de la fluorescencia de la rodamina, demuestra la internalización de los AuNRs marcados con rodamina (B). Experimentos en tubo de ensayo de liberación de BSA desde la superficie de los AuNRs en diferentes medios (tampón PBS y medios de células completas) desencadenada por la irradiación con un láser de 805 nm de longitud de onda, durante 3 min y una potencia de 4 W/cm2 (C). Internalización celular de AuNRs@BSA en células HeLa después de 3 h de incubación analizada por citometría de flujo. Aumento de la IFM de la internalización de AuNRs en células HeLa antes y después de la irradiación con láser. Las barras de error representan la desviación estándar entre tres réplicas. En todos los datos, la significación estadística se evaluó mediante la prueba t: cada muestra se comparó con la muestra sin tratamiento (ns, no significativa; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001).......................... 115 Figura 25: Esquema representativo de la síntesis de AuNR@ZIF-8............................... 116 Figura 26: Imágenes de SEM con detector InLens a 5 kV, representativa de las AuNR@ZIF-8 utilizando diferentes concentraciones de CTAB durante la síntesis: 0,2 g.l-1(A), 0,4 g.l-1(D); 0,6 g.l-1 (G) y 0,8 g.l-1 (H). imágenes de SEM obtenidas con detector As y representaciones correspondientes de los histogramas de frecuencia del tamaño del diámetro medio del círculo que rodea una partícula AuNR@ZIF-8, obtenidos a partir de la medida de 50 AuNR@ZIF-8, utilizando diferentes concentraciones de CTAB: 0,16 g.l-1 (B,C) y 0,4 g.l-1 (E,F). ................................................................................................................................................ 117 Figura 27: Tamaño hidrodinámico promediado en número medido a lo largo de 144 h (escala Log2) con DLS de los AuNR@ZIF-8 utilizando diferentes lavados y sintetizados en presencia de 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1(B) de CTAB. Los lavados marcados (*) indica que en la siguiente medida los AuNR@ZIF-8 se agregaron.................................................................. 118 Figura 28: Imágenes de SEM con detector SE2 a 5 kV, representativas de las AuNR@ZIF8 redispersados en PSF y lavados con MeOH (A), H2O (B) y PSF (C); redispersados en H2O y lavados con H2O (D) y MeOH (E); lavados y redispersados en MeOH (F). ......................... 120 Figura 29: Esquema representativo de la reacción de 20 mmoles de poli(isobutilen-altmaleico anhídrido) y 15 mmoles de MeOH dando lugar al PMA, polímero anfifílico formado por un esqueleto hidrofílico (rojo) al que se anclan cadenas hidrofóbicas de MeOH (azul). 121 Figura 30: Esquema representativo de la funcionalización de los AuNR@ZIF-8 con PMA. ................................................................................................................................................ 121 Figura 31: Imágenes de SEM a diferentes magnificaciones representativas de los: AuNR@ZIF-8@PMA tras 144 h dispersos en agua con detectores InLens (A); AsB (B) a 20 kV y detector SE2 a 3 kV (C). Tamaño hidrodinámico en número medio medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8@PMA (D). Potencial zeta trans la funcionalización con Aitor Álvarez Lorenzo 16 PMA (E). Espectro normalizado de los AuNR@ZIF-8 con el pico del LSPR centrado a 782 nm, y espectro de los AuNR con el LSPR centrado a 768 nm (F). ............................................... 122 Figura 32: Imagen de TEM representativa de las AuNPs (A). Representación de los histogramas de frecuencia de tamaño correspondientes a la distribución numérica N (N = 300) del diámetro de las AuNPs según lo determinado a partir del análisis de imágenes TEM (B). Espectro de absorción UV-Vis de las AuNPs, que muestra su pico de resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR) en λ = 515 nm (C). Micrografía SEM representativa de las AuNSs, detector InLens a 3 kV(D). Espectro de absorción UV-Vis de las AuNSs que muestra su pico de resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR) en λ = 725 nm. ................. 124 Figura 33: Esquema representativo de la síntesis de AuNS@ZIF-8 ............................... 124 Figura 34: Imagen de SEM con detector AsB a 30 kV, representativa de los AuNS@ZIF8 y las correspondientes representaciones de los histogramas de frecuencia del tamaño del diámetro medio (obtenidos a partir de la medida de 50 AuNS@ZIF-8), calculados mediante la envolvente formada por un círculo que rodea un AuNS@ZIF-8 a diferentes concentraciones de AuNSs: 1 nM (A, B), 2 nM (C, D), 3 nM (E, F), 4 nM (G, H), 5 nM (I, J) y 6 nM (K, L). .. 127 Figura 35: Relación entre el tamaño de los AuNS@ZIF-8 y la concentración de AuNSs utilizadas para sintetizar los NCs. Espectro de absorción UV-Vis de los AuNS@ZIF-8 que muestra su pico de LSPR en torno a λ = 743 nm ................................................................... 127 Figura 36: Imagen de SEM a 20 kV, representativa de las AuNS@ZIF-8 con detector SE2 (A) y AsB (B). Estructura del 4-MBA y sus señales Raman más intensas (C). Estructura de RoB y sus señales Raman más intensas (D). .................................................................................. 128 Figura 37: Espectros Raman del 4-MBA medido en una dispersión acuosa de NC a 0,1 nM y una concentración de 4-MBA de 10-5 M comparado con el espectro del 4-MBA en agua y el tapón de polipropileno sobre el que se realizan las medidas (A). Espectro Raman de la RoB medido en una dispersión acuosa de NC a 0,1 nM y una concentración de RoB de 10-3 M comparado con el espectro de la RoB en agua junto con el tapón de sobre el que se realizan las medidas (B). Espectros Raman del 4-MBA medidos en dispersiones acuosa de NC: a 0,1 nM y una concentración de 4-MBA de 10-5 M a diferentes números de adquisiciones (C), a diferentes concentraciones de NC y 30 acumulaciones (D). Todos los espectros fueron adquiridos utilizando un láser de 785 nm a una potencia láser de 60 mW y 0,5 s de tiempo de integración. ............................................................................................................................. 129 Figura 38: Espectros Raman del 4-MBA medidos en dispersiones acuosas de NC a 0,25 nM a diferentes concentraciones de 4-MBA (A) y detalle del espectro de la sonda entre 1040 y 1110 cm-1 (B). Correlación entre la concentración de 4-MBA y la intensidad de la señal Raman a 1074 cm-1). Los puntos se ajustaron mediante un análisis de regresión lineal (y = 6,2 × 107 x + 98,3, r2 = 0,999) (C). Todos los espectros fueron adquiridos utilizando un láser de 785 nm a una potencia de 60 mW, 10 acumulaciones y 0,5 s de tiempo de integración. ...................... 132 Figura 39: Evolución de los espectros Raman de 4-MBA en función del tiempo de encapsulación medidos en una dispersión acuosa de NC a 0,25 nM y una concentración de 4MBA de 10-5 M. Todos los espectros fueron adquiridos utilizando un láser de 785 nm a una potencia de 60 mW, 10 acumulaciones y 0,5 s de tiempo de integración. ............................. 133 Figura 40: Imágenes de microscopio electrónico de transmisión (TEM) de MNPs calentadas a 305 (A), 310 (B) y 315 °C (C), con tamaños medios de 12,2 ± 0,9, 15,5 ± 1,1 y LISTA DE FIGURAS 17 17,8 ± 1,8 nm, respectivamente, y las correspondientes distribuciones del diámetro de, al menos, 300 NPs. ..................................................................................................................... 138 Figura 41: Curvas de magnetización de una muestra de MNPs medidas a temperatura ambiente antes y después del tratamiento térmico (A). Valores de SAR de las MNPs antes y después de dicho tratamiento (B). .......................................................................................... 140 Figura 42: Imágenes de SEM de las MNPs sin tratar (A) y después del tratamiento térmico (B). Barra de escala de 50 nm. Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número obtenido por DLS (C). ............................................................................................................ 141 Figura 43: Representación del protocolo de funcionalización de las MNPs con PMA (arriba). Representación de la apertura de un anillo anhídrido maleico del PMA por un grupo amino (abajo). ......................................................................................................................... 142 Figura 44: Curva de calibrado de la intensidad de fluorescencia del 6-AF6 en agua en función de su concentración medido bajo una excitación de 490 nm (A). Intensidad de fluorescencia frente a la inversa del factor de dilución (1/dilución) de diferentes concentraciones de MNPs recubiertas con PMA-6-AF en agua (B). ................................................................ 143 Figura 45: Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número, medido con DLS (A) y potencial ζ (B) de las MNPs-PMA-6-AF ...................................................................... 144 Figura 46: Evolución de las curvas de histéresis obtenidas mediante magnetometría a temperatura ambiente a diferentes tiempos de recocido de una muestra dopada con un 20 % de Co2+ respecto al Fe2+(A). Curvas de histéresis medidas a diferentes campos magnéticos aplicados (B). .......................................................................................................................... 145 Figura 47: Curvas de magnetización de una muestra de MNPs dopada con Co (en proporción 0,1) medidas a temperatura ambiente con un magnetómetro a 300 kHz y 24 kA.m-1 en agua y tolueno. En la tabla se recogen los valores de la magnetización de saturación, coercividad y SAR para cada caso. ........................................................................................ 146 Figura 48: Curvas de magnetización medidas a 300 KHz y 24 kA.m-1 de muestras de MNPs dopadas con diferentes proporciones de Co normalizado entre 0 y 1 medidas con magnetómetría a temperatura ambiente. La tabla recoge medidas de tamaño hidrodinámico promediado en número y medido a partir de la medida de al menos 300 MNPs en imágenes de SEM. ........ 147 Figura 49: Curvas de histéresis obtenidas a partir de las medidas de SQUID de las MNPs con diferentes grados de dopaje de Co de 0, 0,03, 0,08, 0,11 y 0,30, donde M se encuentra normalizada entre 1 y -1, a 10 (A) y 295 K (B), y una ampliación de la medida a 295 K entre - 0,02 y 0,02 T (C) para facilitar la visualización de la histéresis. La tabla muestra los datos de Hc y Mr correspondientes a las diferentes sustituciones de Co en medidas realizadas a 295 K. ................................................................................................................................................ 148 Figura 50: Imagen de TEM de las MNPs utilizadas para las pruebas de transferencia de fase y su correspondiente distribución de tamaños (tamaño medio de 20,7 ± 1,9 nm ........... 149 Figura 51: Tamaño hidrodinámico promediado en número (A) obtenido por DLS, e imagen de STEM (barra de escala 50 nm) de las MNPs-CTAB transferidas a agua (B). .................. 151 Figura 52: Esquema representativo de la síntesis de MNP@ZIF-8 y tamaño hidrodinámico promediado en número de los MNP@ZIF8. .......................................................................... 153 Aitor Álvarez Lorenzo 18 Figura 53: Imágenes SEM con detectores SE2 (izquierda) y AsB a 20 kV (izquierda) representativas y la correspondiente distribución de tamaño (T) de MNP@ZIF-8 preparados a partir de MNPs a concentraciones de 24 nM (A, B y E) y 12 nM (C, D y F). ....................... 154 Figura 54: MNP@ZIF-8 sintetizados en presencia de diferentes concentraciones de MNPs, 2, 4, 6 y 8 nM (A, C, E y G respectivamente), con sus correspondientes distribuciones de tamaño (B, D, F y H). Relación entre la concentración de MNPs y tamaño final de los MNP@ZIF-8 (I). ................................................................................................................................................ 157 Figura 55: Espectros normalizados de absorción UV-Vis (negro) y de fluorescencia (rojo) del CV ..................................................................................................................................... 158 Figura 56: Imágenes SEM representativas de MNP@ZIF-8(CV) recopiladas con detector InLens a 3 kV (A) y detector AsB a 20 kV (B). Distribución en número del diámetro hidrodinámico de las muestras de MNP@ZIF-8(CV) medidos por DLS (C). Espectro UV-Vis de los MNP@ZIF-8, MNP@ZIF-8(CV) y CV (D). Distribución de tamaño de los MNP@ZIF8 determinados a partir de la medida del diámetro de, al menos 50 NPs en el software ImageJ (medido de vértice a vértice)(E). ............................................................................................ 160 Figura 57: Imágenes SEM representativas de MNP@ZIF-8(CV) redispersadas en agua (A). Correlación entre la concentración de MNP@ZIF-8(CV) determinada por DLS y el factor de dilución. Los puntos se ajustaron con un análisis de regresión lineal (y = 1,82 x -2,066 x 10-4, r2 = 0,995) (B). ........................................................................................................................ 161 Figura 58: Imágenes SEM representativas de MNP@ZIF-8(CV)-PMA-6-AF recopiladas con un detector InLens a 20 kV (A) y 3 kV (C), y detector AsB a 20 kV (B) e imagen STEM (D). .......................................................................................................................................... 162 Figura 59: Viabilidad celular usando el ensayo de resazurina de células HeLa expuestas a concentraciones crecientes de MNP, MNP@ZIF-8 y MNP@ZIF-8(CV) recubiertos con PMA. ................................................................................................................................................ 164 Figura 60: Análisis TGA (A) e Isotermas BET (B) de los MNP@ZIF-8. Análisis WAXS MNP@ZIF-8(CV)-PMA-6-AF medido a una distancia de muestra a detector de 200 mm en comparación con un patrón de referencia de ZIF8 ("FAWCEN") (C). Caracterización FTIR de los MNP@ZIF-8 y CV (D). Cada muestra se corresponde con los siguientes colores: CV (azul), ZIF-8 (negro), MNP@ZIF-8 (violeta), MNP@ZIF-8(CV) (verde), MNP@ZIF-8-PMA-6-AF (amarillo) y MNP@ZIF-8(CV)-PMA-6-AF (rojo). ............................................................... 165 Figura 61: Distribuciones NTA del diámetro hidrodinámico de los MNP@ZIF-8(CV)- PMA-6-AF (A) y MNP@ZIF-8-PMA-6-AF (C). Correlación entre la concentración de MNP@ZIF-8(CV)-PMA-6-AF (B) y MNP@ZIF-8-PMA-6-AF determinada por NTA y el factor de dilución. Los puntos se ajustaron con un análisis de regresión lineal (y = 3,63 x + 7,6 x 10-5, r2 = 0,993) (B) y (y = 3,03 x + 1,8 x 10-4, r2 = 0,993) (D)........................................ 166 Figura 62: Representación de las diferentes moléculas de PEG utilizadas. COOH-PEGNH2 de 5 kDa (A), COOH-PEG-HS de 5 kDa (B) y MeO-PEG-SH de 2 kDa (C). .............. 169 Figura 63: Caracterización de PdNPs: Imagen SEM representativa recogida con detector InLens a 3 kV (A). Distribución de tamaño determinada a partir de la medida del lado de al menos 300 NC con el software ImageJ (medida de vértice a vértice). Imagen TEM de PdNCs (C). Distribuciones promediadas en número del diámetro hidrodinámico de las muestras obtenidas por DLS (D). Imagen TEM de alta resolución (HRTEM) de un PdNC. Detalle de la imagen HRTEM con la medida de un plano cristalográfico expuesto (F). ............................ 171 LISTA DE FIGURAS 19 Figura 64: Caracterización de PdND: Imágenes SEM representativas de PdND1s (A) y PdND2s (E). Imágenes TEM representativas de PdND1s (B) y PdND2 (F). Distribución de tamaño determinada a partir de la medida en imágenes de TEM del diámetro de al menos 100 PdNDs con el software ImageJ de los PdND1s (C) y PdND2s (G). Distribuciones promediadas en número del diámetro hidrodinámico obtenidas por DLS de los PdND1 (D) y PdND2 (H). ................................................................................................................................................ 173 Figura 65: Distribuciones promediadas en número del tamaño hidrodinámico medidas por DLS de los PdNC con diferentes recubrimientos (A). Potenciales ζ de los PdNC con diferentes recubrimientos (B). ................................................................................................................. 175 Figura 66: Representación de una molécula de PEI. ....................................................... 175 Figura 67: Representación de la reacción de reducción del AM a leucometileno. La forma oxidada presenta coloración azul, mientras que la reducida es incolora. ............................... 176 Figura 68: Representación de la absorbancia a 664 nm frente al tiempo para igual masa de Pd de las PdNCs (A), PdNCs@PEG (B), PdNCs@MC (C) y PdNDs (D). A0 es la absorción a 664 nm en el tiempo 0 s. ......................................................................................................... 179 Figura 69: Ajuste cinético (primer orden) de las PdNCs (A), PdNCs@PEG (B), PdNCs@MC (C) y PdNDs (D). ............................................................................................. 179 Figura 70: Representación de la síntesis de los PdNC@ZIF-8. ...................................... 182 Figura 71: Caracterización de PdNC@ZIF-8. Imágenes representativas de SEM con detectores SE2 a 3 kV (A) y AsB a 30 kV (B) e imagen de TEM (C). Distribución de tamaño determinada (tamaño medio = 149 ± 19 nm) a partir de la medida de imágenes de TEM, midiendo el lado de al menos 50 PdNC@ZIF-8 con el software ImageJ (C). Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número de la muestra realizada con DLS, dh= 232 ± 3 nm y PDI=0,02 (D). ................................................................................................................ 183 Figura 72: Imágenes de SEM representativas de PdNC@ZIF-8 utilizando diferentes condiciones sintéticas. 0,4 mg.l-1 de CTAB con diferentes tiempos de síntesis: 30 (A), 60 (B), 90 (C), 180 (D) y 360 min (E). 60 min de tiempo de síntesis a diferentes concentraciones de CTAB: 0,4 (F), 0,5 (G), 0,6 (H), y 0,7 mg.l-1 (I). Refrigerando la muestra con CTAB 0,4 mg.l1 y 60 min de tiempo de síntesis (J). ...................................................................................... 184 Figura 73: Relación entre el tamaño de los NC con el tiempo (A) y con la concentración de CTAB (B) ............................................................................................................................... 186 Figura 74: Ciclo de histéresis de las MNPs y los NC recubiertos con PMA medido con magnetómetro de muestra vibrante (A). Áreas correspondientes a los valores SAR de las MNP6-AF obtenidas mediante medidas calorimétricas usando una frecuencia de 90 kHz (B). .... 197 Figura 75: Cinética de captación de los MNP@ZIF-8-PMA-AF a través de la cuantificación de la fluorescencia de CV en células MiaPaCa-2 (A). Viabilidad celular en MiaPaCa-2 incubadas con diferentes concentraciones de MNP@ZIF-8-PMA-AF a 24, 48 y 72 h. ............................................................................................................................................. 198 Figura 76: Proliferación celular mediante el recuento de células después de la exposición a AFM (A) y RMF (B) durante 7 días. Comparativa de la proliferación celular a los 7 días (C). ................................................................................................................................................ 199 Lista de tablas 21 LISTA DE TABLAS Tabla 1: Ejemplos de técnicas que se emplean en la caracterización de las NPs y los parámetros obtenidos con cada técnica. ................................................................................... 62 Tabla 2: Ejemplos de algunos de los MOFs más utilizados con sus correspondientes centros metálicos, ligandos y topología. ............................................................................................... 70 Tabla 3: Tamaño de las MNPs en función de la temperatura final de la reacción. ........... 86 Tabla 4: Diferentes combinaciones de agentes dispersantes probados para el lavado de los NC. ............................................................................................................................................ 88 Tabla 5: Parámetros termodinámicos de la interacción entre BSA-AuNR PEGilados a 25 °C calculados a partir del ajuste de los datos de calorimetría de valorización isotérmica utilizando un modelo basado en un único conjunto de sitios de unión de proteínas idénticos. ................................................................................................................................................ 114 Tabla 6: Tamaño hidrodinámico promediada en número medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8 lavados con diferentes fases dispersantes y redispersados en H2O, sintetizados con 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1 (B) de CTAB. ........................................................... 119 Tabla 7: Tamaño hidrodinámico promediada en número medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8 lavados con diferentes fases dispersantes y redispersados en PSF, sintetizados con 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1 (B) de CTAB. .......................................................... 119 Tabla 8: Tamaño hidrodinámico promediada en número medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8 lavados con MeOH y redispersados en MeOH, sintetizados con 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1 (B) de CTAB. ........................................................................................... 119 Tabla 9: Tamaño hidrodinámico en número medio obtenido por DLS y tamaño obtenido a partir de las imágenes de SEM, respectivamente, de los AuNS@ZIF-8 utilizando diferentes concentraciones de AuNSs en su síntesis. .............................................................................. 127 Tabla 10: Fluorescencia medida de diferentes concentraciones de MNPs-PMA-6-AF y la relación calculada de moléculas de 6-AF.MNP-1. .................................................................. 143 Tabla 11: Relación máxima de moléculas de 6-AF por cada MNP. ............................... 143 Tabla 12: Correspondencia de los moles de Co (x) añadidos con relación a los de Fe y los moles de Co determinados por ICP. ....................................................................................... 145 Tabla 13: Tamaño hidrodinámico promediado en número de las MNPs transferidas a agua mediante recubrimiento con CTAB siguiendo diferentes condiciones del protocolo 1. ........ 150 Tabla 14: Tamaño hidrodinámico en número medio de las MNPs transferidas a agua medido con DLS siguiendo diferentes condiciones del protocolo 2, precipitados a 15000 rcf. ................................................................................................................................................ 150 Tabla 15: Tamaño hidrodinámico promediado en número de las MNPs transferidas a agua medido obtenido mediante DLS siguiendo diferentes condiciones del protocolo 2, precipitados a 20000 rcf. ............................................................................................................................. 150 Tabla 16: Tamaño hidrodinámico promediado en número obtenido por DLS siguiendo diferentes condiciones del protocolo 3. .................................................................................. 151 Aitor Álvarez Lorenzo 22 Tabla 17: Concentración de CV encapsulado en MNP@ZIF-8 ...................................... 158 Tabla 18: Diámetros hidrodinámicos promediados en número (valor medio numérico ± SD) obtenidos a partir de medidas de DLS de los MNP@ZIF-8(CV) con y sin PMA en diferentes medios (agua, tampón de solución salina de fosfato, medio celular DMEM suplementado con FBS al 10 % (v/v), PSF) y NC en agua. ................................................................................. 163 Tabla 19: Tamaño hidrodinámico promediado en número obtenido con DLS de los PdNC funcionalizados a una densidad de 100 monómeros/nm2 con diferentes PEG. ..................... 174 Tabla 20: Tamaño hidrodinámico promediado en número obtenido con DLS y potencial ζ de los PdNC sin funcionalizar y funcionalizados con HS-PEG-COOH y MC. ..................... 174 Tabla 21: Cantidad de Pd en moles añadido para cada sistema. ..................................... 177 Tabla 22: Comparación de los nanocatalizadores de PdNC y PdND en la reducción de MB usando NaBH4 con otros nanocatalizadores. .......................................................................... 178 Tabla 23: Valores de la constante de reacción para cada sistema. .................................. 180 Tabla 24: Valores de la k normalizados en función de los moles de Pd (knorm=K/molesPd.) ................................................................................................................................................ 181 Tabla 25: Tamaño hidrodinámico de los PdNC@ZIF-8 promediado en número variando las condiciones de síntesis. Todas ellas se llevan a cabo a temperatura ambiente a excepción de la indicada, que se sintetiza a 4°C. ......................................................................................... 185 Aitor Álvarez Lorenzo 24 LISTA DE ACRÓNIMOS Y ABREVIACIONES 4-MBA ácido 4-mercaptobenzoico 6-AF 6-aminofluoresceína AA Ácido ascórbico AM Azul de metileno AMF Campo magnético alterno AO Ácido oléico AuNP Nanoesfera de oro AuNR nanovarilla de oro AuNS Nanoestrella de oro BSA albúmina de suero bovino COOH-PEG-NH2 carboxi-PEG-amina CTAB bromuro de cetiltrimetilamonio CV Violeta de cresilo DDA Dodecilamina DEG Dietilenglicol DMF Dimetilformamida EDTA ácido etilendiaminotetraacético EtOH Etanol HAuCl4 ácido tetracloroáurico (III) ICP-MS Espectrometría de Masas con Plasma Acoplado Inductivamente LSPR resonancia de plasmón superficial localizado MC Mucina MeOH Metanol MeO-PEG-SH mercaptopolietilenglicol monometilo Aitor Álvarez Lorenzo 32 RESUMEN Las NPs, debido a su dimensión, forma y composición, manifiestan una serie de propiedades idiosincrásicas que no se observan en moléculas individuales ni en materiales macroscópicos. Estas particularidades abarcan comportamientos mecánicos, térmicos, magnéticos, electrónicos, ópticos y catalíticos específicos. En el proceso de miniaturización de las NPs a una escala nanométrica, se observa un incremento en la relación superficie-volumen, induciendo transformaciones significativas en sus estructuras atómicas y en sus propiedades fisicoquímicas comparadas con las correspondientes a los materiales macroscópicos. Adicionalmente, la morfología de las NPs juega un rol determinante en sus propiedades, tales como la anisotropía en las propiedades ópticas, magnéticas y catalíticas. Todas estas características posicionan a las NPs como actores potenciales en disciplinas como la biomedicina, la electrónica y la catálisis. Es relevante considerar, sin embargo, las cuestiones emergentes relacionadas con la toxicidad y la seguridad de las NPs, que pueden verse influidas por aspectos como el tamaño, la forma, la composición química, la carga superficial, la actividad catalítica, la dosis y la superficie de las partículas. Adicionalmente, otro desafío inherente a estas es su tendencia a la agregación, la cual puede resultar en la pérdida progresiva de sus propiedades. Específicamente en el contexto biológico, es necesario tener en cuenta fenómenos como la formación de una corona proteica alrededor de las NPs, que puede modificar su interacción con barreras biológicas y células. Se recurre a menudo a ligandos, como el PEG, para estabilizar las NPs y reducir la adsorción inespecífica de proteínas. Una estrategia alternativa para la estabilización de las NPs y la prevención de su agregación consiste en la funcionalización de estas, particularmente a través de su encapsulación en MOFs como el ZIF-8. Los MOFs son materiales porosos que se componen de iones metálicos o conglomerados de metales unidos a moléculas orgánicas, conformando estructuras tridimensionales. La alta porosidad y diversidad química de los MOFs son sus atributos más destacables. Entre las aplicaciones potenciales de las NPs, su uso como vehículos para la administración de fármacos es una innovación relevante en la farmacología. La encapsulación de agentes farmacológicos en nanocompuestos, derivados de la combinación de NPs plasmónicas y ZIF8, permite la liberación controlada de estos compuestos en objetivos terapéuticos específicos mediante la activación con un láser NIR. No obstante, la limitada capacidad de penetración de la luz en los tejidos es un obstáculo de estos sistemas, el cual puede ser superado mediante el uso de MNPs que generan calor en respuesta a campos magnéticos alternos o rotatorios. Una bioaplicación adicional es el empleo de PdNPs en química bioortogonal para promover la conversión localizada de moléculas terapéuticamente inactivas (profármacos) en agentes citotóxicos, en el interior de células. Este procedimiento requiere la funcionalización con agentes biocompatibles que estabilicen y protejan estas nanopartículas en medios biológicos. Esta tesis doctoral se enfoca en la síntesis, caracterización, funcionalización y aplicaciones de distintos tipos de NPs. En el tercer capítulo, se analizan diversos aspectos cruciales de las NPs plasmónicas que se organizan en dos subsecciones: i) la síntesis, funcionalización y el impacto de la coexposición de NPs plasmónicas en su degradación, ii) el influjo de la funcionalización de las Resumen 33 AuNRs con PEG en la dinámica de las proteínas en la biocorona, y la encapsulación de las AuNRs y AuNSs en ZIF-8 para su empleo en aplicaciones como sustratos SERS. En un análisis más detallado, en la primera subsección se sintetizaron AuNPs, AgNPs y CuNPs, estables en CHCl3, de aproximadamente 15 nm de diámetro y se transfirieron a agua mediante un recubrimiento con PMA. Se investigó la estabilidad y degradación de las NPs, tanto individualmente como en combinaciones, así como su potencial citotoxicidad. A través de la espectroscopía UV-Vis y las mediciones de concentración mediante ICP, se encontró que las AuNPs y AgNPs preservan su estabilidad a 37 °C en agua durante, al menos, 72 horas, mientras que las CuNPs mostraron indicios de degradación, reflejados en un desplazamiento al rojo del LSPR y un incremento del Cu2+ disuelto en dispersiones de CuNPs, a medida que discurría el tiempo. Las dispersiones de AuNPs-AgNPs combinadas demostraron estabilidad. No obstante, las mezclas que incluían CuNPs (AuNPs-CuNPs, AgNPs-CuNPs, AuNPs-AgNPsCuNPs) evidenciaron la degradación de las CuNPs, similar al comportamiento de las CuNPs individuales. Dicha degradación fue más notable durante las primeras horas y luego se estabilizó. Por medio del ensayo de viabilidad con resazurina, se estudió la citotoxicidad de las NPs y sus combinaciones en los cultivos celulares A549. Las NPs de Au y Ag manifestaron una toxicidad baja, manteniendo alta la viabilidad celular en todas las concentraciones analizadas. Sin embargo, las CuNPs mostraron una disminución en la viabilidad celular a la concentración más alta de 5 nM, probablemente a causa de la liberación de iones Cu2+ tóxicos. Con respecto a las combinaciones de NPs, se detectó una leve reducción en la viabilidad celular a 5 nM para las combinaciones AgNPs-CuNPs y AuNPs-AgNPs-CuNPs, lo que podría indicar un efecto sinérgico de las AgNPs en el aumento de la toxicidad de las CuNPs. Estos descubrimientos iniciales sugieren la necesidad de realizar investigaciones más profundas para entender mejor la interacción entre distintas NPs, su degradación y la citotoxicidad resultante. Este estudio podría expandirse para incluir diferentes tipos de cultivos celulares y una gama más extensa de concentraciones de NPs, proporcionando una perspectiva más detallada del impacto de la co-exposición a distintas NPs. En el siguiente subapartado, describe la síntesis de AuNRs que fueron posteriormente sometidos a un proceso de PEGilación para manipular su carga superficial. Las cargas superficiales fueron modificadas a positivas, negativas o neutras utilizando diferentes PEGs tiolados. Nuestra caracterización detallada de las partículas resultantes indicó que tales modificaciones no provocaron alteraciones significativas en la LSPR. Los AuNRs funcionalizados se emplearon para investigar las interacciones con la BSA como un modelo de biocorona protéica. Encontramos que la magnitud de la interacción y la constante de disociación eran dependientes de la carga superficial de las NPs. Además, se investigó la internalización de las AuNRs en células HeLa, y se evaluó cómo la formación de biocorona y el tratamiento fototérmico influían en este proceso. Aunque la PEGilación y la formación de la corona de proteínas atenuaban la internalización celular, la adsorción de BSA disminuía notablemente después del tratamiento fototérmico, especialmente en las muestras con carga positiva. Sin embargo, la internalización de las AuNRs tras este tratamiento sólo disminuyó significativamente en las muestras no PEGiladas, lo que sugiere que las cargas superficiales no influyeron de manera notable en la captación celular. Aitor Álvarez Lorenzo 34 Seguidamente, se procedió con el encapsulamiento de AuNRs en ZIF-8, generando así un nanocompuesto de estructura núcleo-caparazón. Los AuNRs se estabilizaron con CTAB, y se estudió el impacto del empleo de diferentes concentraciones de CTAB durante la síntesis en la morfología de los NCs, comprobando que el tamaño de los NCs disminuyó al aumentar la concentración de CTAB. Los tamaños promedio de los NCs se obtuvieron utilizando el software ImageJ, dando como resultado, por ejemplo, 169 ± 13 nm y 160 ± 8 nm para las concentraciones de 0,2 y 0,4 g.l-1 de CTAB, respectivamente. Asimismo, se evaluó la estabilidad de los NCs en varios medios, utilizando DLS para rastrear las variaciones de tamaño hidrodinámico en el tiempo. Observamos que los NCs de AuNR@ZIF-8 redispersados en agua presentaban una disminución significativa de tamaño. Se encontraron resultados similares para los NCs redispersados en PSF. Para proteger los NCs de la degradación en medios acuosos, se recubrieron con PMA. Tras el procedimiento de recubrimiento, los NCs conservaron su morfología y el análisis de DLS indicó que eran estables en agua. Finalmente, se abordó la síntesis y la aplicación de NCs basados en AuNSs y ZIF-8 como sustratos para SERS. Este enfoque capitalizó la sinergia entre las características distintivas de los AuNSs y el ZIF-8, en particular, las propiedades plasmónicas de los AuNSs y la porosidad junto con la amplia superficie de la ZIF-8. Para los ensayos de SERS, se eligieron dos compuestos, 4-MBA y RoB. Las pruebas iniciales sugieren que las moléculas pueden difundirse a través de los poros del ZIF-8 hasta alcanzar las AuNSs alojadas en el núcleo del nanocompuesto, permitiendo así la detección de estas moléculas mediante SERS. Se observó una relación lineal entre la intensidad del pico Raman a 1074 cm-1 y la concentración de 4-MBA en el rango de 10-6 a 10-5 M, lo que sugiere la aplicabilidad de este sistema para la cuantificación de analitos. El capítulo 4 se divide en dos subapartados, i) la síntesis, funcionalización y caracterización de las MNPs, estudió la influencia del dopaje con Co sobre las propiedades magnéticas de las MNPs y el proceso de transferencia a un medio acuoso y ii) la elaboración de nanocompuestos estables. En el primer subapartado, se describe el proceso de síntesis de las MNPs mediante un método de descomposición térmica de un precursor metálico. Con este método se obtuvieron MNPs esféricas de diferentes tamaños y baja polidispersidad. Se encontró que estas MNPs exhibían propiedades magnéticas, insuficientes para generar calor, que fueron mejoradas al someter a las MNPs a un proceso de recocido. A continuación, se aborda la funcionalización y estabilidad de las MNPs en un medio acuoso utilizando PMA. Las MNPs fueron recubiertas con PMA para mejorar su estabilidad en soluciones acuosas y permitir su funcionalización con moléculas que presenten un grupo amino terminal. Un ejemplo de dicha funcionalización implicó el uso de 6-AF. Sin embargo, solo una pequeña fracción de la cantidad total de 6-AF añadida se adhirió a las MNPs, probablemente debido al exceso de PMA que se eliminó durante el lavado posterior al recubrimiento polimérico. Se examinó la influencia del dopado con Co en las propiedades magnéticas de las MNPs. Se sintetizaron MNPs-Co reemplazando parcialmente los iones Fe2+ en las posiciones octaédricas de la estructura de la magnetita con iones Co2+ en varias proporciones. Las MNPs se transfirieron a agua mediante un recubrimiento con PMA y se caracterizaron las propiedades magnéticas por medio del SQUID. Las mediciones realizadas a diferentes temperaturas Resumen 35 mostraron que la concentración de Co tuvo un impacto significativo en las propiedades magnéticas de las MNPs. A una temperatura de 10 K, las MNPs con mayor concentración de Co presentan una mayor magnetización remanente. A 295 K, se observó un comportamiento inusual en las propiedades magnéticas de las nanopartículas dopadas con cobalto. A medida que aumentaba la concentración de dopado de Co2+, se produjo una transición de una anisotropía magnética negativa a una positiva. Además, las nanopartículas dopadas con un 0,08 de Co mostraron un comportamiento superparamagnético. Estos hallazgos indican la complejidad de las interacciones magnéticas en los materiales dopados Se estudió la transferencia de MNPs a medios acuosos mediante la utilización de CTAB. Las MNPs recubiertas de AO fueron transferidas a un medio acuoso empleando un protocolo basado en la formación de una bicapa AO-CTAB. A través de las mediciones de tamaño hidrodinámico usando DLS, se buscó un procedimiento eficiente para transferir MNPs al medio acuoso minimizando la agregación. Posteriormente, con las MNPs estabilizadas en agua, se sintetizaron nanocompuestos de MNP recubierto con ZIF-8, con el objetivo final de diseñar un sistema capaz de lograr la liberación controlada de moléculas en el interior de las células mediante estímulos externos como AMF o RMF. La eficiencia de encapsulamiento de MNPs y el control sobre su tamaño se demostraron mediante la medición de los tamaños hidrodinámicos y la caracterización morfológica a través de SEM. Los resultados revelaron que al aumentar la concentración de MNPs en la síntesis, disminuyó el tamaño de los nanocompuestos de ZIF-8, lo que sugiere una alta eficiencia de encapsulamiento y un cierto grado de control sobre su tamaño. Se estudió la encapsulación de CV en MNPs recubiertas de MNP@ZIF-8 para su aplicación en la entrega controlada de medicamentos. Los resultados mostraron que la encapsulación del CV no afectó la morfología, tamaño, o radio hidrodinámico de los NCs. Para evitar la degradación de ZIF-8 en medios acuosos y asegurar la estabilidad de los MNP@ZIF-8(CV), se llevó a cabo un recubrimiento con PMA, lo que permitió la estabilidad coloidal en medios acuosos. La evaluación de la estabilidad térmica y la porosidad de los MNP@ZIF-8(CV)-PMA-6-AF mediante análisis termogravimétrico y BET, respectivamente, indicó una buena estabilidad térmica hasta 400°C y confirmó la microporosidad de los NCs. Además, se empleó WAXS para evaluar la cristalinidad de los MNP@ZIF-8(CV)-PMA6-AF, los resultados confirmaron la alta cristalinidad y que la funcionalización con PMA no afectó la estructura cristalina de los MNP@ZIF-8. El capítulo 5 abarca la síntesis y caracterización y funcionalización de PdNPs, el estudio de su eficiencia como catalizadores y el encapsulado en ZIF-8. En primer lugar, se sintetizaron y caracterizaron PdNCs y PdNDs debido a su desempeño catalítico prometedor debido a su tamaño y forma. Las PdNDs, por su morfología amorfa, presentan una mayor superficie específica, lo que se debería traducir en mejores propiedades catalíticas. Las PdNCs estabilizadas en agua mediante CTAB presentan citotoxicidad por lo que se estudió la posibilidad de reemplazar el CTAB por moléculas no citotóxicas que pudiesen estabilizar las NPs en medios acuosos. Se investigó la estabilización de las PdNPs con PEG y MC, y se examinó el impacto de estos recubrimientos en las propiedades catalíticas de las NPs. Se utilizaron PEG y MC. Se utilizaron tres tipos de PEG, el metoxi-polietilenglicol-tiol (MeOPEG-SH) que se une a la superficie del Pd a través del grupo tiol, estabilizando las nanopartículas por impedimento estérico. El carboxi-polietilenglicol-tiol (COOH-PEG-HS) y Aitor Álvarez Lorenzo 36 el carboxi-polietilenglicol-amino (COOH-PEG-NH2) que también se unen mediante sus grupos tiol y amino respectivamente, con la estabilización lograda a través de la repulsión electrostática y el impedimento estérico. La interacción entre las NPs y las MCs se produce principalmente a través de interacciones hidrofóbicas, la adsorción de diferentes aminoácidos a la superficie de las NPs, y enlaces S-Pd con el aminoácido cisteína. Las mediciones del tamaño hidrodinámico de las PdNCs funcionalizadas mostraron que COOH-PEG-HS era más estable que NH2-PEG-COOH, que mostraron un considerable aumento en el tamaño hidrodinámico después de 24 horas. Esto puede deberse a la debilidad del enlace entre el grupo amino y el Pd en comparación con el enlace formado por el grupo tiol y el Pd. En el caso de las PdNDs, no fue posible la funcionalización siguiendo el mismo protocolo. Estas PdNDs se estabilizan con PEI, la estructura altamente ramificada de este polímero, junto con su abundancia de grupos amino, proporciona múltiples puntos de anclaje en la superficie de Pd, lo cual dificulta el reemplazo de PEI por otro polímero. Para estudiar las propiedades catalíticas de las PdNPs funcionalizadas, se utilizó la reducción del AM con NaBH4 en agua como reacción modelo. La evaluación se realizó mediante espectroscopía UV-Vis, siguiendo la progresiva decoloración de la solución. Se recurrió al modelo de Langmuir-Hinshelwood para describir la cinética de la reacción, postulando que los reactivos se adsorben primero en la superficie del catalizador antes de reaccionar. La k para cada sistema catalítico basado en Pd se determinó considerando una cinética de primer orden. Los resultados revelaron que los sistemas evaluados presentaban valores de k superiores a los reportados en la literatura para la reducción del AM con catalizadores basados en NPs de Pd. Se encontró que los sistemas que utilizan PdNC y PdNCs@PEG presentaron las mejores constantes cinéticas. En contraposición, se observó que la funcionalización con PEG o MC no disminuyó significativamente la constante cinética. También se investigó la reutilización de los sistemas catalíticos a través de tres reacciones consecutivas, aunque no fue eficiente para todos los sistemas, el sistema con MC mostró los resultados más favorables. Finalmente, se examinó el encapsulamiento de PdNC en corazas de ZIF-8 de distintos grosores como estrategia para lograr la estabilización de los PdNC en entornos fisiológicos. Además de proporcionar protección a las NPs, el ZIF-8 permite el flujo controlado de los reactivos hacia el núcleo catalizador del nanocompuesto debido a sus propiedades porosas. Se estudiaron diversas variables en la síntesis de los NCs, como la concentración de CTAB, el tiempo de síntesis y la temperatura, en el efecto en el tamaño final de los nanocompuestos. Se observó que el tiempo de exposición afectó el tamaño de los nanocompuestos, aunque no su forma. A medida que se aumentaba el tiempo de síntesis, el tamaño de los nanocompuestos también aumentaba hasta alcanzar un tamaño estable después de 3 horas. Además, se encontró que la concentración de CTAB influía en el tamaño de los nanocompuestos, con un tamaño menor a medida que se aumentaba la concentración de CTAB. La temperatura también tuvo un efecto en el tamaño de los nanocompuestos, con un tamaño más pequeño cuando la síntesis se realizaba a bajas temperaturas. En general, se observó una relación exponencial entre el diámetro hidrodinámico y el tiempo de síntesis, así como una relación lineal entre el diámetro hidrodinámico y la concentración de CTAB. La reducción en el tamaño de los nanocompuestos a medida que se aumentaba la concentración de CTAB se atribuyó al efecto de las moléculas de CTAB en la cinética de crecimiento del ZIF-8. Aitor Álvarez Lorenzo 38 RESUMO As NPs, debido á súa dimensión, forma e composición, manifestan un conxunto de propiedades idiosincrásicas que non se observan en moléculas individuais nin en materiais macroscópicos. Estas peculiaridades abranguen comportamentos mecánicos, térmicos, magnéticos, electrónicos, ópticos e catalíticos específicos. No proceso de miniaturización das NPs a unha escala nanométrica, obsérvase un incremento na relación superficie-volume, inducindo transformacións significativas nas súas estruturas atómicas e nas súas propiedades fisicoquímicas en comparación cos materiais macroscópicos correspondentes. Adicionalmente, a morfoloxía das NPs xoga un papel determinante nas súas propiedades, tales como a anisotropía nas propiedades ópticas, magnéticas e catalíticas. Todas estas características posicionan ás NPs como actores potenciais en disciplinas como a biomedicina, a electrónica e a catálise. É relevante considerar, sen embargo, as cuestións emerxentes relacionadas coa toxicidade e a seguridade das NPs, que poden verse influídas por aspectos como o tamaño, a forma, a composición química, a carga superficial, a actividade catalítica, a dose e a superficie das partículas. Adicionalmente, outro desafío inherente a estas é a súa tendencia á agregación, a cal pode resultar na perda progresiva das súas propiedades. Especificamente no contexto biolóxico, é necesario ter en conta fenómenos como a formación dunha coroa proteica ao redor das NPs, que pode modificar a súa interacción con barreiras biolóxicas e células. Recórrese ás veces a ligandos, como o PEG, para estabilizar as NPs e reducir a adsorción inespecífica de proteínas. Unha estratexia alternativa para a estabilización das NPs e a prevención da súa agregación consiste na funcionalización destas, particularmente a través da súa encapsulación en MOFs como o ZIF-8. Os MOFs son materiais porosos que se compoñen de iones metálicos ou conxuntos de metais unidos a moléculas orgánicas, conformando estruturas tridimensionais. A alta porosidade e diversidade química dos MOFs son os seus atributos máis destacables. Entre as aplicacións potenciais das NPs, o seu uso como vehículos para a administración de fármacos é unha innovación relevante na farmacoloxía. A encapsulación de axentes farmacolóxicos en nanocompostos, derivados da combinación de NPs plasmónicas e ZIF-8, permite a liberación controlada destes compostos en obxectivos terapéuticos específicos mediante a activación cun láser NIR. Non obstante, a capacidade limitada de penetración da luz nos tecidos é un obstáculo destes sistemas, o cal pode ser superado mediante o uso de MNPs que xeran calor en resposta a campos magnéticos alternos ou rotatorios. Unha bioaplicación adicional é o emprego de PdNPs en química bioortogonal para promover a conversión localizada de moléculas terapeuticamente inactivas (profármacos) en axentes citotóxicos, no interior de células. Este procedemento require a funcionalización con axentes biocompatibles que estabilicen e protexan estas nanopartículas en medios biolóxicos. Esta tese de doutoramento enfócase na síntese, caracterización, funcionalización e aplicacións de distintos tipos de NPs. No terceiro capítulo, analízanse diversos aspectos cruciais das NPs plasmónicas que se organizan en dúas subseccións: i) a síntese, funcionalización e o impacto da co-exposición de NPs plasmónicas na súa degradación, ii) a influencia da funcionalización das AuNRs con PEG na dinámica das proteínas na biocoroa, e a encapsulación das AuNRs e AuNSs en ZIF-8 para o seu uso en aplicacións como substratos SERS. Resumo 39 Nunha análise máis detallada, na primeira subsección sintetizáronse AuNPs, AgNPs e CuNPs estables en CHCl3, de aproximadamente 15 nm de diámetro, e transfiríronse a auga mediante un revestimento con PMA. Investigouse a estabilidade e degradación das NPs, tanto individualmente como en combinacións, así como a súa potencial citotoxicidade. A través da espectroscopía UV-Vis e das medicións de concentración mediante ICP, atopouse que as AuNPs e AgNPs preservan a súa estabilidade a 37 °C en auga durante, polo menos, 72 horas, mentres que as CuNPs mostraron indicios de degradación, reflectidos nun desprazamento ao vermello do LSPR e un aumento do Cu2+ disolto en dispersións de CuNPs, á medida que transcorría o tempo. As dispersións de AuNPs-AgNPs combinadas demostraron estabilidade. Non obstante, as mesturas que incluín CuNPs (AuNPs-CuNPs, AgNPs-CuNPs, AuNPsAgNPs-CuNPs) evidenciaron a degradación das CuNPs, similar ao comportamento das CuNPs individuais. Dita degradación foi máis notable durante as primeiras horas e logo estabilizouse. A través da proba de viabilidade con resazurina, estudouse a citotoxicidade das NPs e as súas combinacións nos cultivos celulares A549. As NPs de Au e Ag manifestaron unha toxicidade baixa, mantendo alta a viabilidade celular en todas as concentracións analizadas. Non obstante, as CuNPs mostraron unha diminución na viabilidade celular á concentración máis alta de 5 nM, probablemente debido á liberación de íons Cu2+ tóxicos. Con respecto ás combinacións de NPs, detectouse unha leve redución na viabilidade celular a 5 nM para as combinacións AgNPs-CuNPs e AuNPs-AgNPs-CuNPs, o que podería indicar un efecto sinérgico das AgNPs no aumento da toxicidade das CuNPs. Estes descubrimentos iniciais suxiren a necesidade de realizar investigacións máis profundas para entender mellor a interacción entre diferentes NPs, a súa degradación e a citotoxicidade resultante. Este estudo podería expandirse para incluír diferentes tipos de cultivos celulares e unha gama máis extensa de concentracións de NPs, proporcionando unha perspectiva máis detallada do impacto da co-exposición a diferentes NPs. Na seguinte subsección, descríbese a síntese de AuNRs que posteriormente foron sometidos a un proceso de PEGilación para manipular a súa carga superficial. As cargas superficiais foron modificadas a positivas, negativas ou neutras utilizando diferentes PEGs tiolados. A nosa caracterización detallada das partículas resultantes indicou que tales modificacións non provocaron alteracións significativas no LSPR. Empregáronse as AuNRs funcionalizadas para investigar as interaccións coa BSA como un modelo de biocoroa protéica. Atopamos que a magnitude da interacción e a constante de disociación dependían da carga superficial das NPs. Ademais, investigouse a internalización das AuNRs en células HeLa e avaliouse como a formación da biocoroa e o tratamento fototérmico influían neste proceso. Aínda que a PEGilación e a formación da coroa de proteínas atenuaban a internalización celular, a adsorción de BSA diminuíu notablemente despois do tratamento fototérmico, especialmente nas mostras con carga positiva. Con todo, a internalización das AuNRs tras este tratamento só diminuíu significativamente nas mostras non PEGiladas, o que suxire que as cargas superficiais non influíron de maneira notable na captación celular. A continuación, procedeuse á encapsulación de AuNRs en ZIF-8, xerando así un nanocomposto de estrutura núcleo-cascarón. As AuNRs estabilizáronse con CTAB e estudouse o impacto do emprego de diferentes concentracións de CTAB durante a síntese na morfoloxía dos NCs, comprobando que o tamaño dos NCs diminuíu ao aumentar a concentración de CTAB. Os tamaños promedio dos NCs obtivéronse utilizando o software ImageJ, dando como Aitor Álvarez Lorenzo 40 resultado, por exemplo, 169 ± 13 nm e 160 ± 8 nm para as concentracións de 0,2 e 0,4 g.l-1 de CTAB, respectivamente. Tamén se avaliou a estabilidade dos NCs en varios medios, utilizando DLS para rastrexar as variacións de tamaño hidrodinámico ao longo do tempo. Observamos que os NCs de AuNR@ZIF-8 redispostos en auga presentaban unha diminución significativa de tamaño. Atopáronse resultados semellantes para os NCs redispostos en PSF. Para protexer os NCs da degradación en medios acuosos, foron recubertos con PMA. Tras o procedemento de recubrimento, os NCs conservaron a súa morfoloxía e o análise de DLS indicou que eran estables en auga. Finalmente, abordouse a síntese e aplicación de NCs baseados en AuNSs e ZIF-8 como substratos para SERS. Este enfoque capitalizou a sinerxia entre as características distintivas das AuNSs e o ZIF-8, en particular, as propiedades plasmónicas das AuNSs e a porosidade xunto coa ampla superficie do ZIF-8. Para os ensaios de SERS, elixíronse dous compostos, 4-MBA e RoB. As probas iniciais suxiren que as moléculas poden difundirse a través dos poros do ZIF-8 ata alcanzar as AuNSs aloxadas no núcleo do nanocomposto, permitindo así a detección destas moléculas mediante SERS. Observouse unha relación lineal entre a intensidade do pico Raman a 1074 cm-1 e a concentración de 4-MBA no rango de 10-6 a 10-5 M, o que suxire a aplicabilidade deste sistema para a cuantificación de analitos. O capítulo 4 divídese en dous subapartados, i) a síntese, funcionalización e caracterización das MNPs, estudou a influencia do dopaxe con Co nas propiedades magnéticas das MNPs e o proceso de transferencia a un medio acuoso e ii) a elaboración de nanocompostos estables. No primeiro subapartado, descríbese o proceso de síntese das MNPs mediante un método de descomposición térmica dun precursor metálico. Con este método obtivéronse MNPs esféricas de diferentes tamaños e baixa polidispersidade. Atopouse que estas MNPs exhibían propiedades magnéticas, insuficientes para xerar calor, que foron melloradas ao someter as MNPs a un proceso de recozido. A continuación, abórdase a funcionalización e estabilidade das MNPs nun medio acuoso utilizando PMA. As MNPs foron recubertas con PMA para mellorar a súa estabilidade en solucións acuosas e permitir a súa funcionalización con moléculas que presenten un grupo amino terminal. Un exemplo desa funcionalización implicou o uso de 6-AF. Sen embargo, só unha pequena fracción da cantidade total de 6-AF engadida adhíriuse ás MNPs, probablemente debido ao exceso de PMA que se eliminou durante o lavado posterior ao recubrimiento polimérico. Examinouse a influencia do dopado con Co nas propiedades magnéticas das MNPs. Sintetizáronse MNPs-Co reemprazando parcialmente os ións Fe2+ nas posicións octaédricas da estrutura da magnetita con ións Co2+ en varias proporcións. As MNPs transfiríronse a auga mediante un recubrimiento con PMA e caracterizáronse as propiedades magnéticas por medio do SQUID. As medidas realizadas a diferentes temperaturas mostraron que a concentración de Co tivo un impacto significativo nas propiedades magnéticas das MNPs. A unha temperatura de 10 K, as MNPs con maior concentración de Co presentan unha maior magnetización remanente. A 295 K, observouse un comportamento inusual nas propiedades magnéticas das nanopartículas dopadas con cobalto. A medida que aumentaba a concentración de dopado de Co2+, produciuse unha transición dunha anisotropía magnética negativa a unha positiva. Ademáis, as nanopartículas dopadas con un 0,08 de Co mostraron un comportamento Resumo 41 superparamagnético. Estas descubertas indican a complexidade das interaccións magnéticas nos materiais dopados. Estudouse a transferencia de MNPs a medios acuosos mediante a utilización de CTAB. As MNPs recubertas de AO foron transferidas a un medio acuoso empregando un protocolo baseado na formación dunha bicapa AO-CTAB. A través das medidas de tamaño hidrodinámico usando DLS, buscouse un procedemento eficiente para transferir MNPs ao medio acuoso minimizando a agregación. Posteriormente, coas MNPs estabilizadas en auga, sintetizáronse nanocompostos de MNP recubierto con ZIF-8, co obxectivo final de deseñar un sistema capaz de lograr a liberación controlada de moléculas no interior das células mediante estímulos externos como AMF ou RMF. A eficiencia de encapsulamento de MNPs e o control sobre o seu tamaño demostráronse mediante a medición dos tamaños hidrodinámicos e a caracterización morfolóxica a través de SEM. Os resultados revelaron que ao aumentar a concentración de MNPs na síntese, diminuíu o tamaño dos nanocompostos de ZIF-8, o que sugire unha alta eficiencia de encapsulamento e certo grado de control sobre o seu tamaño. Estudouse a encapsulación de CV en MNPs recubertas de MNP@ZIF-8 para a súa aplicación na entrega controlada de medicamentos. Os resultados mostraron que a encapsulación do CV non afectou a morfoloxía, tamaño, ou radio hidrodinámico dos NCs. Para evitar a degradación de ZIF-8 en medios acuosos e asegurar a estabilidade dos MNP@ZIF-8(CV), levouse a cabo un recubrimiento con PMA, o que permitiu a estabilidade coloidal en medios acuosos. A avaliación da estabilidade térmica e a porosidade dos MNP@ZIF-8(CV)-PMA-6-AF mediante análise termogravimétrico e BET, respectivamente, indicou unha boa estabilidade térmica ata 400°C e confirmou a microporosidade dos NCs. Ademáis, empregouse WAXS para avaliar a cristalinidade dos MNP@ZIF-8(CV)-PMA6-AF, os resultados confirmaron a alta cristalinidade e que a funcionalización con PMA non afectou a estrutura cristalina dos MNP@ZIF-8. O capítulo 5 aborda a síntese, caracterización e funcionalización das PdNPs, o estudo da súa eficiencia como catalizadores e a súa encapsulación en ZIF-8. Primeiramente, sintetizáronse e caracterizáronse PdNCs e PdNDs debido ao seu rendemento catalítico prometedor grazas ao seu tamaño e forma. As PdNDs, pola súa morfoloxía amorfa, presentan unha superficie específica maior, o que debería reflectirse en mellores propiedades catalíticas. As PdNCs estabilizadas en auga mediante CTAB presentan citotoxicidade, polo que se estudou a posibilidade de substituír o CTAB por moléculas non citotóxicas que puidesen estabilizar as NPs en medios acuosos. Investigouse a estabilización das PdNPs con PEG e MC, e examinouse o impacto destes revestimentos nas propiedades catalíticas das NPs. Utilizáronse tres tipos de PEG: o metoxi-polietilenglicol-tiol (MeO-PEG-SH), que se une á superficie do Pd a través do grupo tiol, estabilizando as nanopartículas por impedimento estérico; o carboxipolietilenglicol-tiol (COOH-PEG-HS) e o carboxi-polietilenglicol-amino (COOH-PEG-NH2) que tamén se unen mediante os seus grupos tiol e amino respectivamente, conseguindo a estabilización a través da repulsión electrostática e o impedimento estérico. A interacción entre as NPs e as MCs prodúcese principalmente por interaccións hidrofóbicas, adsorción de diferentes aminoácidos na superficie das NPs, e ligazóns S-Pd co aminoácido cisteína. Aitor Álvarez Lorenzo 48 showed the best kinetic constants. In contrast, functionalization with PEG or MC did not significantly decrease the kinetic constant. The reusability of the catalytic systems was also investigated through three consecutive reactions, although it was not efficient for all systems. The system with MC showed the most favorable results. Finally, the encapsulation of PdNCs in ZIF-8 shells with varying thicknesses was examined as a strategy to achieve the stabilization of PdNCs in physiological environments. In addition to providing protection to the NPs, ZIF-8 allows for controlled flow of reactants to the catalytic core of the nanocomposite due to its porous properties. Several variables in the synthesis of the NCs, such as CTAB concentration, synthesis time, and temperature, were studied for their effect on the final size of the nanocomposites. It was observed that the exposure time affected the size of the nanocomposites, although not their shape. As the synthesis time increased, the size of the nanocomposites also increased until reaching a stable size after 3 hours. Furthermore, it was found that the CTAB concentration influenced the size of the nanocomposites, with smaller sizes obtained as the CTAB concentration increased. Temperature also had an effect on the size of the nanocomposites, with smaller sizes observed when the synthesis was carried out at lower temperatures. Overall, an exponential relationship between the hydrodynamic diameter and the synthesis time was observed, as well as a linear relationship between the hydrodynamic diameter and the CTAB concentration. The reduction in size of the nanocomposites with increasing CTAB concentration was attributed to the effect of CTAB molecules on the growth kinetics of ZIF-8. Aitor Álvarez Lorenzo 50 OBJETIVOS Objetivos generales • Síntesis, funcionalización y caracterización de diversas NPs plasmónicas, estudio de su interacción con proteínas y su potencial aplicación en espectroscopía SERS. • Síntesis, caracterización y dopaje de MNPs, así como el desarrollo de nanocompuestos estables y controlados para aplicaciones biomédicas potenciales, aprovechando las propiedades magnéticas. • Síntesis, caracterización y estabilización de PdNPs en medios acuosos con recubrimientos no citotóxicos, análisis de cómo estos recubrimientos afectan a sus propiedades catalíticas y explorar la estrategia de encapsulamiento en corazas de ZIF-8 para lograr su estabilización en entornos fisiológicos. Objetivos específicos Capítulo 3: 1) Síntesis y funcionalización de NPs plasmónicas: El primer objetivo de la tesis es abordar la síntesis y post-funcionalización de NPs plasmónicas de diferentes materiales (Au, Ag y Cu) y morfologías (esferas, barras y estrellas). Se busca obtener NPs con dimensiones equivalentes y transferirlas desde una fase de disolvente orgánico al agua mediante el recubrimiento de su superficie con una capa de PMA, un polímero anfifílico. El estudio se enfoca en la co-exposición de estas NPs plasmónicas para analizar cómo afecta a sus propiedades ópticas y su degradación con el tiempo, centrándose específicamente en el efecto del material, eliminando la influencia del tamaño y la química superficial. 2) Funcionalización de NPs plasmónicas con PEG y estudio de la dinámica de la biocorona proteica: El segundo objetivo se centra en la funcionalización de AuNRs y análisis del impacto de su funcionalización con PEG en la dinámica de la biocorona proteica en medios biológicos. Se estudia la interacción de diferentes AuNRs PEGilados con diferentes cargas superficiales con la BSA antes y después de la irradiación láser en el rango NIR. 3) Recubrimiento de AuNRs y AuNSs con ZIF-8 y empleo como sustratos SERS: El tercer objetivo trata sobre el recubrimiento de AuNRs y AuNSs con un recubrimiento de ZIF-8 para evitar la degradación en medios acuosos. Se explora la posibilidad de crecer capas de ZIF-8 de diferente grosor. Además, se investiga el uso de nanocompuestos formados por agregados de AuNSs recubiertas con ZIF-8 como sustratos para espectroscopía SERS. Objetivos 51 Capítulo 4: 1) Síntesis y dopaje de MNPs: El primer objetivo del capítulo 4 es abordar la síntesis de MNPs estables en medio orgánico y examinar el impacto del dopaje con bajas proporciones de Co en sus propiedades magnéticas. 2) Elaboración de nanocompuestos estables: El segundo objetivo se enfoca en la transferencia de las MNPs desde un medio orgánico a un medio acuoso y la elaboración de nanocompuestos estables en ambientes acuosos. Estos nanocompuestos constan de un núcleo de MNP recubierto por una estructura porosa de ZIF-8. Se busca diseñar nanocompuestos que puedan ser activados por estímulos externos (campos magnéticos) para liberar moléculas de manera controlada en células, lo que podría tener aplicaciones en el campo de la liberación de fármacos u otras terapias dirigidas. Capítulo 5: 1) Síntesis y funcionalización de PdNPs estables en medios acuosos: Síntesis de PdNPs y estudio de la posibilidad de reemplazar el surfactante catiónico CTAB, que presenta citotoxicidad, por otras moléculas no citotóxicas para estabilizar las PdNPs en medios acuosos. Se utilizaron tres tipos de PEG (metoxi-PEG-tiol, carboxi-PEG-amina y tiol-PEG-carboxi) y MC para este propósito. 2) Investigar el impacto de los recubrimientos en las propiedades catalíticas de las PdNPs: Analizar cómo los diferentes recubrimientos, como PEG y MC, afectan las propiedades catalíticas de las PdNPs. Se busca entender si los recubrimientos seleccionados afectan positiva o negativamente la actividad catalítica de las NPs y su potencial para aplicaciones en catálisis. 3) Explorar el control del encapsulamiento de PdNCs en corazas de ZIF-8: Como una estrategia adicional para lograr la estabilización de las PdNCs en entornos fisiológicos, se examina el control del encapsulamiento de PdNCs en corazas de ZIF-8 de distintos grosores. Capítulo 1 Aitor Álvarez Lorenzo 54 1. INTRODUCCIÓN Y ESTADO DEL ARTE 1.1. Conceptos generales 1.1.1. Los inicios de la nanotecnología Aunque el término "nanotecnología" es relativamente reciente, la existencia y aplicaciones de las NPs se pueden rastrear a lo largo de distintas épocas históricas. En la antigüedad, las NPs se utilizaban en la fabricación de artefactos artísticos y ornamentales, tal como se evidencia en la célebre copa de Licurgo, datado en el siglo IV. Esta pieza exhibe distintos comportamientos ópticos en función de la iluminación, ya sea interna o externa: en luz reflejada, adopta una apariencia verde-amarillenta, mientras que, en luz transmitida, adquiere un tono rojo rubí. Dichos efectos se atribuyen a la presencia de NPs de plata (AgNP) y oro (AuNP) incrustadas en el vidrio.1 Entre los siglos IV y V, se produjeron vidrieras con NPs para ornamentar iglesias, como es el caso del vidrio rubí.2 En el siglo XVII, Johann Kunckel, un alquimista y vidriero alemán, escaló la producción de vidrio rubí mediante la adición de NPs de oro al vidrio fundido.3 A lo largo de la historia, se han explorado y analizado las propiedades de las NPs, lo que ha facilitado su aplicación en diversos ámbitos, incluyendo la medicina, la electrónica y la ciencia de materiales.2 El término 'nano' proviene del prefijo griego que significa 'enano' o 'muy pequeño' y representa la milmillonésima parte de un metro (10-9 m). La nanociencia comprende el estudio de estructuras, dispositivos y sistemas con propiedades y funciones singulares que surgen de la organización de sus átomos constituyentes en una escala de 1 a 100 nm.4 Los orígenes de la nanociencia y la nanotecnología se remontan a varias décadas atrás, cuando los investigadores comenzaron a explorar y comprender el mundo a escala nanométrica. El término nanociencia fue acuñado por el destacado físico Richard Feynman, quien, en diciembre de 1959, durante la reunión anual de la American Physical Society en el Instituto de Tecnología de California (Caltech), impartió una conferencia titulada "There's Plenty of Room at the Bottom".5 En esta presentación, Feynman propuso la posibilidad de manipular y controlar átomos y moléculas de manera individual. A pesar de que las ideas de Feynman eran visionarias en aquel momento, su discurso estableció los fundamentos para la investigación futura en el campo de la nanociencia, centrada en el estudio de estructuras y moléculas a una escala de nanómetros. Asimismo, contribuyó al desarrollo de la nanotecnología, la cual se refiere a la aplicación práctica de la nanociencia en la creación de dispositivos y tecnologías a nivel nanométrico. A lo largo de las décadas siguientes, se llevaron a cabo avances significativos en la capacidad para observar y manipular la materia a escala nanométrica. El progreso en el desarrollo de herramientas de microscopía, como el microscopio de efecto túnel (STM, por sus siglas en inglés) en 1981 y el microscopio de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés) en 1986, permitió a los investigadores visualizar y manipular átomos y moléculas con una resolución sin precedentes.6 No obstante, fue durante la década de 1990 en la que este campo empezó a recibir una atención y financiación sustanciales.4 De manera paralela a estos avances, los investigadores iniciaron la síntesis y el estudio de diferentes tipos de NMs, así como la exploración de sus propiedades singulares y aplicaciones potenciales. Entre todas las topologías de tamaño nanométrico que se empezaron a estudiar y analizar, se ha desarrollado una amplia gama de NPs inorgánicas, incluyendo óxidos metálicos, Introducción y estado del arte 55 semiconductores y materiales magnéticos, entre otras. Este proceso ha fomentado un crecimiento exponencial del estudio de este tipo de materiales en el ámbito de la nanociencia y la nanotecnología. 1.1.2. Clasificación de los NMs Los NMs abarcan una amplia gama de materiales con propiedades y aplicaciones diversas, que pueden ser clasificadas según sus dimensiones o composición. Los NMs presentan al menos una dimensión en el rango de 1 a 100 nm. Según sus dimensiones pueden clasificarse en las siguientes categorías: NMs de dimensión cero (0D): En estos NMs las tres dimensiones se encuentran en el rango nanométrico. Algunos ejemplos son, por ejemplo, NPs esféricas como los puntos cuánticos, y NPs de oro y plata.7 NMs unidimensionales (1D): Estos NMs tienen una dimensión en la escala nanométrica (1-100 nm), mientras que las otras dos dimensiones son más grandes. Algunos ejemplos de NMs unidimensionales incluyen nanovarillas (NRs, del inglés nanorods), nanotubos y nanohilos.7 NMs bidimensionales (2D): Presentan dos dimensiones en la escala nanométrica, mientras que la tercera dimensión es más grande. Los NMs bidimensionales incluyen láminas delgadas, como el grafeno y los óxidos metálicos bidimensionales, así como películas delgadas y recubrimientos.7 NMs tridimensionales (3D): Los NMs tridimensionales tienen sus tres dimensiones son mayores que la escala nanométrica. Ejemplos de NMs tridimensionales incluyen nanoestructuras porosas, como aerogeles y esponjas de carbono, así como nanocompuestos y ensamblajes de NPs.7 Más concretamente, las NPs generalmente se clasifican en inorgánicas, orgánicas y basadas en carbono; dentro de estas categorías, pueden dividirse en subgrupos basándose en su composición y la estructura: NPs inorgánicas:8 ✓ Metálicas: Estas NPs comprenden elementos metálicos puros como oro, plata, platino, hierro y cobre. ✓ Basadas en óxidos metálicos: Incluyen óxidos metálicos como, por ejemplo, el dióxido de titanio (TiO2), óxido de zinc (ZnO), óxido de hierro (Fe3O4) y óxido de cerio (CeO2). ✓ De compuestos semiconductores: Incluyen materiales como sulfuros, seleniuros y fosfuros metálicos. ✓ Magnéticas: Contienen elementos magnéticos como el óxido de hierro y las ferritas. NPs orgánicas:8 ✓ Lipídicas: Están constituidas por lípidos, como fosfolípidos y triglicéridos. ✓ Dendrímeros: Son estructuras poliméricas tridimensionales ramificadas que presentan una geometría bien definida y una alta densidad de grupos funcionales. Aitor Álvarez Lorenzo 56 ✓ Nanocápsulas orgánicas: En esta categoría, se encuentran estructuras en las que un núcleo bioactivo (fármacos como la doxorrubicina,9 paclitaxel,10 adriamicina,11 y proteínas terapéuticas12 entre otros) está rodeado por una capa o membrana orgánica. ✓ De proteínas y polisacáridos: Estas NPs están formadas por macromoléculas biológicas como proteínas, enzimas y polisacáridos. NPs basadas en carbono:8 En esta categoría, se encuentran estructuras de carbono como los nanotubos de carbono, el grafeno y los puntos cuánticos de carbono. Esta clasificación proporciona una visión general de las distintas categorías de NPs inorgánicas y orgánicas. Es importante tener en cuenta que esta clasificación no es exhaustiva y que existen otras categorías y subcategorías de NPs. 1.1.3. Proceso de crecimiento de las NPs inorgánicas Para optimizar el rendimiento de las NPs en aplicaciones específicas, es crucial comprender y controlar los mecanismos que regulan su formación y crecimiento. La investigación sobre la preparación de partículas coloidales uniformes tiene sus raíces en la década de 1940. Los pioneros en este campo, entre ellos LaMer y sus colegas, llevaron a cabo experimentos fundamentales al preparar aerosoles de aceite e hidrosoles de azufre, y propusieron un modelo simplificado para el crecimiento cristalino que divide el proceso en etapas distintas de nucleación y crecimiento.13 Durante la etapa de nucleación, la concentración de átomos libres provenientes de la descomposición de un precursor alcanza un nivel crítico conocido como sobresaturación, lo cual da lugar a la formación de clústeres metálicos debido a la estabilización termodinámica que esto implica.14 Cuando la concentración de átomos libres disminuye por debajo de la concentración de sobresaturación, se detiene la nucleación y se inicia una etapa de crecimiento. Durante esta etapa, los núcleos experimentan un aumento en su tamaño a medida que se adhieren más átomos a su superficie.14-15 Durante el proceso de crecimiento de las NPs, pueden ocurrir diversos mecanismos, entre ellos el conocido como crecimiento de Ostwald.16 El crecimiento de Ostwald se fundamenta en la disolución de partículas de menor tamaño y la posterior deposición de átomos disueltos en partículas de mayor tamaño.16 Este proceso se debe a las diferencias en la energía superficial entre partículas de diferentes dimensiones, específicamente, las NPs se tornan progresivamente más inestables a medida que disminuye el tamaño de la partícula debido al incremento relativo del área superficial disponible y, por consiguiente, de la energía del sistema. La ecuación de Gibbs-Thomson16 expresa el efecto del tamaño de la partícula en la solubilidad y la estabilidad de las partículas en una fase sólida o líquida. Dicha estabilidad de fase se expresa en función de la concentración de solubilidad, C(r), correspondiente a una partícula con radio r: C(r)=C𝑜 exp (2γV𝑚 𝑟𝑅𝑇) ( 1 ) donde C° es la solubilidad de un átomo extraído de una superficie plana infinita, Vm es el volumen molar de la partícula, γ denota la energía superficial, R es la constante de gas y T indica la temperatura. Introducción y estado del arte 57 Por otro lado, el mecanismo de ensamblaje orientado se desarrolló para explicar el comportamiento del crecimiento de las NPs que parecía desviarse del crecimiento convencional de Ostwald.17 Este se produce durante la evolución de los nanocristales/núcleos, en el cual partículas con orientaciones cristalográficas análogas (o con diferencias mínimas) colisionan y se fusionan para generar estructuras de mayor tamaño. Esta unión de partículas ocurre con el propósito de minimizar la energía total del sistema. Durante este proceso, se establecen orientaciones preferenciales que presentan una energía mínima. Estas orientaciones pueden ser inherentes a las partículas o pueden ser impuestas por ligandos que restringen el crecimiento en aquellas partículas que presentan una menor energía. Como resultado de este fenómeno, se forman nanoestructuras con morfologías irregulares y anisotrópicas, como nanovarillas, cuando se utilizan NPs como unidades básicas de construcción.17 Figura 1: Representación esquemática de los mecanismos principales de crecimiento de NP. Las interacciones de Coulomb y las fuerzas de Van der Waals también desempeñan un papel importante en el crecimiento de las NPs coloidales.18 Estas interacciones influyen en la estabilidad de las suspensiones de NPs y en la morfología y propiedades finales de las nanoestructuras resultantes. Estas interacciones débiles son especialmente relevantes en la nucleación y el crecimiento de partículas a escala nanométrica, donde las fuerzas de Van der Waals pueden ser comparables o incluso mayores que las fuerzas electrostáticas. Las interacciones de Coulomb, originadas por la atracción o repulsión entre partículas cargadas, pueden regular la cinética de ensamblaje de NPs pequeñas en sistemas coloidales. Además, estas interacciones electrostáticas pueden contribuir a la orientación y alineación de las NPs durante el proceso de crecimiento, lo cual puede conducir a la formación de nanoestructuras específicas. Por otro lado, las fuerzas de Van der Waals, que son interacciones débiles entre átomos y moléculas debido a fluctuaciones temporales en la distribución de electrones, adquieren una importancia particular en la interacción y ensamblaje de NPs. Esto se debe al aumento en la superficie de contacto y al efecto de proximidad que se presenta en escalas nanométricas. Estas fuerzas pueden propiciar el crecimiento de NPs y la formación de estructuras más grandes y complejas, como nanoagregados o nanocompuestos. En el contexto del crecimiento de NPs, las interacciones de Coulomb y las fuerzas de Van der Waals pueden competir o colaborar, afectando el proceso de ensamblaje y la formación de nanoestructuras específicas.18-19 Por último, para lograr un crecimiento controlado y obtener la simetría final deseada en las partículas, es necesario realizar modificaciones en las condiciones de síntesis. Estas modificaciones implican la separación de las fases de nucleación y crecimiento (crecimiento mediado por semillas) así como la adición de ligandos que dirigen la morfología de las NPs. La Aitor Álvarez Lorenzo 64 comparable o incluso inferior a la longitud de onda de los electrones, lo que da lugar a un comportamiento cuántico de las partículas.45 Esto implica que los electrones están confinados en un espacio reducido, lo que modifica las propiedades de absorción y emisión de luz de las partículas, permitiendo su utilización en una diversidad de aplicaciones, incluyendo la imagen celular, la administración de fármacos y agentes de contraste para detección de cáncer.46 Las NPs metálicas, específicamente las de oro y plata, exhiben características ópticas singulares atribuibles a su comportamiento plasmónico. Este fenómeno plasmónico se deriva de la oscilación colectiva de los electrones de conducción inducida por la incidencia de la luz. Como resultado, estas NPs manifiestan propiedades ópticas únicas.47 Las NPs de oro y plata pueden absorber y dispersar luz de una manera altamente eficiente, lo que las hace útiles en una variedad de aplicaciones, desde la detección de moléculas48 hasta la terapia fototérmica, en la que se utilizan para generar calor y destruir células cancerosas.47 Por otro lado, las MNPs pueden exhibir propiedades superparamagnéticas incluso a temperatura ambiente. Esta característica implica que, una vez eliminado el campo magnético externo, las partículas dejan de manifestar interacción magnética entre sí.49 Este atributo las convierte en candidatas especialmente atractivas para aplicaciones médicas.50 Por ejemplo, se emplean en la hipertermia magnética, un proceso en el cual generan calor para destruir células cancerosas. Además, se utilizan en el desarrollo de biosensores, en la administración dirigida de fármacos, y como agentes de contraste en la resonancia magnética (MRI), entre otras aplicaciones.50 La reactividad inherente a una NP catalítica se ve principalmente influenciada por la energía de los átomos superficiales, un parámetro que puede evaluarse a través del número de átomos adyacentes, así como por los modos de enlace y las energías asociadas a las moléculas pequeñas que se transformarán en la superficie de la NP.51 La eficacia catalítica, que representa la habilidad de un catalizador para estimular una reacción química, es notablemente mayor en las NPs en comparación con sus homólogos macroscópicos. Este incremento en la eficacia se atribuye mayormente a la alta relación superficie-volumen que las NPs ostentan, resultando en una disponibilidad ampliada de sitios activos, es decir, los lugares en la superficie del catalizador donde se produce la reacción. La actividad de las NPs catalíticas puede ser modulada por diversos factores, como el pH, la temperatura, el entorno circundante y los iones metálicos.52 Estas han encontrado aplicaciones en diversas áreas, como los biosensores, el tratamiento de la contaminación ambiental, el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, como agentes antibacterianos, y en la citoprotección contra biomoléculas específicas en la célula, entre otras.52 1.1.8. Toxicidad de las NPs inorgánicas El potencial tóxico de las NPs inorgánicas puede verse modulado por diversas características intrínsecas, incluyendo el tamaño, la forma, la composición química, la solubilidad, la agregación, los ligandos presentes, el estado de oxidación y la absorción de partículas, como se comentó con anterioridad. Estos factores pueden influir significativamente en la interacción de las NPs con sistemas biológicos y su capacidad para atravesar barreras biológicas.53 Es importante destacar que la toxicidad de las NPs no es homogénea entre los diferentes individuos y especies, y puede variar significativamente debido a las diferencias genéticas, las condiciones de exposición y los factores ambientales.53 Introducción y estado del arte 65 Los mecanismos subyacentes de la toxicidad asociada a las NPs inorgánicas a menudo implican la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). La producción excesiva de ROS puede inducir estrés oxidativo, provocar inflamación, causar daños en el ADN, y alteraciones en la función celular.54 Además, se ha observado que determinadas NPs tienen la capacidad de acumularse en órganos vitales, como el hígado, los pulmones y los riñones. Este fenómeno puede conllevar daños en las mitocondrias, mutaciones en el ácido desoxirribonucleico (ADN) y, en última instancia, apoptosis o muerte celular.55 1.2. NPs plasmónicas Las NPs plasmónicas son materiales de particular interés debido a su capacidad para interactuar con la radiación electromagnética, lo que hace que tengan una gran potencial aplicación en diversas áreas como la biomedicina, energía y la electrónica, como se comentó anteriormente.56-57 En particular, las NPs plasmónicas presentan una resonancia plasmónica de superficie localizada (LSPR del inglés Localized Surface Plasmon Resonance), que se produce cuando los electrones libres en la superficie metálica son excitados por la componente eléctrica de la radiación electromagnética, generando una oscilación coherente de los electrones de conducción alrededor de la partícula a una frecuencia resonante que produce un campo electromagnético localizado.58 En NPs metálicas de oro, plata, cobre, entre otras, la frecuencia del LSPR se encuentra en la región del espectro visible, dando lugar a una intensa absorción y dispersión de luz en dicha región, siendo la razón de las intensas coloraciones que exhiben sus dispersiones coloidales.59 El LSPR concentra el campo eléctrico de la luz sobre la superficie de la partícula, amplificándolo en varios órdenes de magnitud. Este campo electromagnético se debilita gradualmente a medida que se aleja de la superficie de la NP.60 Las características espectrales del LSPR dependen del tamaño, la geometría, la composición y el índice de refracción del entorno de la NP.61-62 Por lo tanto, el control de estas propiedades resulta esencial para su aplicación en distintas áreas. Por ejemplo, la absorción y dispersión de luz se pueden ajustar mediante la modificación de la forma y tamaño de las NPs plasmónicas, lo que permite la sintonización de su espectro de absorción a diferentes longitudes de onda.62 A medida que aumenta el tamaño de la NP, la posición de la LSPR se desplaza hacia longitudes de onda mayores (rojo) y la intensidad de la resonancia aumenta. Este fenómeno es atribuible a la modificación del confinamiento espacial y la distribución de los electrones libres en la superficie de las NPs. Sin embargo, un aumento excesivo en el tamaño de la NP puede llevar a la aparición de modos plasmónicos de orden superior y a una disminución de la calidad de la LSPR.63 En lo que respecta a la forma, las NPs plasmónicas presentan geometrías variadas, como esferas, barras, cubos y estrellas, con perfiles de LSPR distintos. Por ejemplo, las AuNR exhiben dos modos de resonancia plasmónica: uno transversal y otro longitudinal. El modo longitudinal es más sensible a los cambios en el entorno de la NP y presenta una mayor intensidad de campo cercano en comparación con el modo transversal.64 El entorno de las NPs plasmónicas, incluyendo el índice de refracción del medio circundante y la presencia de moléculas o partículas cercanas, afecta también significativamente a la LSPR. Las variaciones en el índice de refracción pueden ocasionar desplazamientos en la posición del LSPR, lo cual facilita el desarrollo de sensores basados en NPs plasmónicas sensibles a cambios en el medio.60 Aitor Álvarez Lorenzo 66 1.2.1. La teoría de Mie Para modelar y predecir cómo las NPs metálicas interactúan con la luz, incluyendo la absorción, dispersión y las propiedades ópticas resultantes, se hace uso de la teoría de Mie.61, 65 La teoría fue desarrollada por Gustav Mie en 1908 y es una generalización de la teoría más simple de Rayleigh, que solo es aplicable a partículas mucho más pequeñas que la longitud de onda de la luz. La teoría de Mie permite calcular la eficiencia de absorción y dispersión en función de la composición, el tamaño y el índice de refracción de la partícula y del medio circundante. Cuando sobre una solución de NPs metálicas dispersas en agua incide la luz, las NPs absorben y dispersan luz, la cual puede ser cuantificada mediante un espectrofotómetro. La interacción entre una suspensión coloidal ideal diluida de concentración N partículas por volumen y la luz de intensidad I0, a lo largo de un camino óptico de x cm, resulta en la atenuación de la intensidad de luz que llega al detector del equipo, pudiéndose expresar la absorbancia de la siguiente forma: A=log[I0I(x)⁄ ]=Nσx 2,303 ⁄ ( 2 ) donde σ es la sección eficaz de extinción de una partícula, que puede expresarse como61 σ= 2π (kR)2∑(2n+1)Re{an+bn} n=∞ n=1 ( 3 ) siendo an y bn los coeficientes de dispersión, R el radio de la partícula, Re se refiere a la parte real y n los distintos órdenes de multipolo, siendo k,61 k=2π√εm λ ( 4 ) donde εm es la constante dieléctrica del medio en el que están dispersas las partículas. Para NPs esféricas pequeñas con radios mucho más pequeños que la longitud de onda de la luz incidente (R ∼ 10 nm), es posible simplificar la ecuación ( 3 ) y considerar únicamente la contribución dipolar (n=1), mediante la ecuación,61 𝜎=24π2R3εm 32 ⁄ λε´´ (ε´+2εm)2+ε´´2 ( 5 ) siendo ε´(λ)+iε´´(λ) la función dieléctrica compleja del metal. Bajo estas circunstancias, la extinción de luz por las NPs depende del radio de las partículas, la composición de estas (constantes dieléctricas ε´ y ε´´) y la constante dieléctrica del medio (εm). El denominador de la ecuación ( 5 ) predice un máximo cuando, ε´=−2εm (si ε´´<<ε´+2εm) ( 6 ) Introducción y estado del arte 67 lo cual ocurre en el visible para AuNP, plata y cobre siendo la explicación a la intensa coloración que presentan estas dispersiones coloidales.63 Si la dispersión de la luz es despreciable, se pueden distinguir dos casos límite en la ecuación ( 5 ) en los que la σ es 0. El primero es una partícula de un material que no absorba radiación, cuya constate dieléctrica es nula (ε´´=0), y el segundo una partícula que refleja toda la luz (ε´´=∞.). En el caso de partículas de tamaño en el que la dispersión de la luz no es despreciable, se producen variaciones en la frecuencia de resonancia, desplazándose la posición del plasmón hacia longitudes de onda mayores al aumentar el tamaño de la partícula. Aunque la teoría de Mie proporciona resultados precisos para NPs esféricas, su aplicación a NPs con formas más complejas requiere de aproximaciones numéricas, como el método de los elementos finitos (FEM) o el método de los momentos discretos (DMM).66 Estos métodos permiten abordar casos más complicados y adaptarse a una variedad más amplia de situaciones y aplicaciones en las que las NPs metálicas juegan un papel crucial. 1.2.2. Aplicaciones de las NPs plasmónicas Numerosas aplicaciones aprovechan la capacidad de ajuste del LSPR, como por ejemplo la espectroscopia Raman mejorada por superficie (SERS, por sus siglas en inglés), las etiquetas plasmónicas, terapias basadas en partículas, detección de analitos o la catálisis, entre otras.61 De entre estas aplicaciones, se aborda de manera concisa la espectroscopía SERS, dado que es de relevancia para la presente tesis. La espectroscopia Raman es una técnica de caracterización no destructiva basada en la interacción entre la luz y las vibraciones moleculares de los materiales. Esta técnica ha demostrado ser una herramienta versátil y confiable en el análisis de composición química y propiedades estructurales de una amplia gama de materiales. Sin embargo, la señal Raman intrínseca de muchos compuestos es débil, lo que limita su aplicabilidad en la detección de especies en bajas concentraciones y sistemas complejos.67 Para superar esta limitación, se ha desarrollado la técnica de SERS, que permite la detección de moléculas de baja concentración a través de la amplificación de campos electromagnéticos generados por la excitación de plasmones de superficie localizados.68 La SERS es una variante de la espectroscopía Raman tradicional que emplea nanoestructuras metálicas para amplificar la señal Raman de las moléculas adsorbidas en la superficie. Dos mecanismos principales contribuyen a la mejora de la señal: el electromagnético y el químico.68 El mecanismo electromagnético es el que más contribuye a la mejora de la señal Raman. Este surge de la amplificación de la luz mediante la excitación de la LSPR, que ocurre predominantemente en los huecos, hendiduras y puntas de los materiales plasmónicos. Dependiendo del material, el factor de mejora teórico puede alcanzar valores entre 1010 y 1011.68 Por otro lado, el mecanismo químico se debe a los procesos de transferencia de carga entre la molécula y la superficie metálica, con factores teóricos de mejora que pueden llegar hasta 103.68 Desde su descubrimiento por R. Van Duyne y colaboradores en 1977,69 la técnica de SERS ha experimentado un desarrollo acelerado en términos de diseño de sustratos, optimización de Aitor Álvarez Lorenzo 68 condiciones experimentales y aplicaciones prácticas. Este avance constante destaca la relevancia y versatilidad de SERS en el campo de la espectroscopía. 1.3. Marcos organometálicos Los marcos organometálicos (MOFs por sus siglas en inglés) son una clase de materiales porosos híbridos constituidos por centros metálicos y ligandos orgánicos (Figura 5). Estos componentes se unen mediante enlaces de coordinación para formar estructuras tridimensionales caracterizadas generalmente por una elevada área superficial y porosidad.70 El concepto de MOF fue introducido por primera vez en la literatura científica en 1995.71 Desde entonces, estos materiales han despertado un interés creciente en la comunidad científica, gracias a sus singulares propiedades y su extraordinaria versatilidad. Esta combinación de factores ha dado lugar a un amplio espectro de aplicaciones, convirtiendo a los MOFs en un área de investigación de enorme relevancia en el campo de los materiales avanzados.70 El avance en el diseño y desarrollo de los MOFs ha sido impulsado por la necesidad de materiales con propiedades particulares y funciones específicas para una diversidad de aplicaciones. Entre estas se incluyen el almacenamiento de gases,72 la catálisis,73 la separación de gases,74 y la liberación controlada de fármacos,75 entre otros. La versatilidad inherente a los MOFs radica en su estructura modular, la cual permite una considerable variabilidad en la selección de centros metálicos y ligandos orgánicos, así como en la configuración y topología de las redes que los constituyen. Esta diversidad estructural se traduce en una amplia gama de propiedades, lo que hace que los MOFs sean materiales altamente prometedores y adaptables a diferentes necesidades.70 Figura 5: Representación esquemática de los MOF, mostrando algunas de las Unidades de Construcción Secundaria y conectores representativos (Adaptado con permiso de la referencia 76) Introducción y estado del arte 69 La importancia de los MOFs en el desarrollo tecnológico radica en su capacidad para combinar las propiedades de los materiales inorgánicos y orgánicos en una sola estructura. Esta característica híbrida les confiere una serie de ventajas frente a otros materiales porosos tradicionales, como las zeolitas y los carbones activados, entre las que destacan su mayor porosidad, área superficial y posibilidad de modificación química.77 Los MOFs pueden clasificarse en función del tamaño de los poros presentes en la estructura, distinguiéndose entre microporosidad (< 2 nm), mesoporosidad (2-50 nm) y macroporosidad (> 50 nm). En términos generales, los MOFs suelen presentar poros en el espectro de la microporosidad y mesoporosidad. Además, la superficie específica de un MOF es un parámetro que indica la cantidad de área superficial disponible por unidad de masa del material, y está directamente relacionada con la capacidad de adsorción y la eficiencia catalítica del MOF. Algunos MOFs pueden alcanzar áreas superficiales extremadamente elevadas, con un área superficial BET que oscila entre 1000 y 7000 m²/g.78 Esta es notablemente superior a las áreas superficiales de otros materiales porosos convencionales como, por ejemplo, las NPs mesoporosas de silicio, que generalmente se encuentran en el rango de 700 a 1200 m²/g.77-78 La síntesis de MOFs se puede llevar a cabo mediante una variedad de métodos que permiten controlar y ajustar las características estructurales y funcionales del material obtenido. Los factores que influyen en la síntesis de MOFs incluyen la temperatura, el tiempo, la presión, la concentración de los reactivos y la presencia de moduladores o aditivos en la mezcla de reacción.79 El control adecuado de estos parámetros puede resultar en la obtención de MOFs con características específicas y mejoradas, como una mayor estabilidad química y térmica, o una mayor área superficial y porosidad. Se han identificado y desarrollado diversas familias de Marcos Orgánicos Metálicos (MOFs), cada una con características y composiciones distintivas. Algunas de las familias y tipos más relevantes de MOFs comprenden: o ZIFs (Zeolitic Imidazolate Frameworks): La familia ZIF se caracteriza por el uso de imidazolatos como ligandos orgánicos.80 o UiO (Universitetet i Oslo): Los MOFs UiO utilizan zirconio como centro metálico y se enlazan a través de varios tipos de ácidos orgánicos, como el ácido tereftálico. UiO-66 y UiO-67 son dos de los MOFs más estudiados en esta familia.81 o HKUST-1 (Hong Kong University of Science and Technology-1): El HKUST-1 es un MOF tridimensional compuesto por centros metálicos de cobre y ligandos orgánicos basados en ácidos tricarboxílicos.82 o MIL (Materials Institute Lavoisier): La serie MIL de MOFs utiliza una variedad de centros metálicos, incluyendo aluminio, cromo, hierro y escandio. Los enlaces orgánicos suelen ser ácidos orgánicos, como el ácido tereftálico.83 o PCN (porous coordination network): Los MOFs PCN utilizan zirconio como centro metálico y una variedad de ligandos orgánicos, como la porfirina.84 o NU (Northwestern University): Los MOFs NU utilizan zirconio como centro metálico y una variedad de ligandos orgánicos. Algunos ejemplos incluyen NU-1000 y NU1100.85 Aitor Álvarez Lorenzo 70 Tabla 2: Ejemplos de algunos de los MOFs más utilizados con sus correspondientes centros metálicos, ligandos y topología. MOF Centros metálicos Ligandos Topología Ref ZIF-8 Zn 2-metilimidazolato Sodalita (sod) 86 UiO-66 Zr Ácido tereftálico Cúbica centrada en las caras (fcu) 87 HKUST-1 Cu 1,3,5-bencenetricarboxilato Boracita retorcida (tbo) 88 MIL-53 Al, Ga, Cr, Fe, Sc 1,4-bencenodicarboxilato Poros unidimensionales 89 PCN-222 Zr6 meso-tetrakis (4-carboxifenil)porfirina Csq 90 NU-1000 Zr6 1,3,6,8-tetrakis(p-ácidobenzoico)pireno Csq 91 Dentro del contexto de esta tesis, es pertinente abordar con mayor detenimiento la familia de MOFs de los ZIFs. Los ZIFs son una clase de materiales porosos que denominan "zeolíticos" por la similitud estructural que presentan estos materiales con las zeolitas, un tipo de materiales porosos muy utilizados en la industria para la adsorción y separación de moléculas. Las zeolitas son aluminosilicatos cristalinos con una estructura porosa, es decir, presentan una red tridimensional de canales y cavidades conectados entre sí que permiten la difusión de moléculas a través de ellas. Los ZIFs presentan una estructura porosa similar a la de las zeolitas, pero en lugar de aluminosilicatos, están formados por iones metálicos y ligandos imidazolatos que se organizan de forma ordenada y repetitiva, lo que da lugar a estructuras porosas con una alta superficie específica y capacidad de adsorción (Figura 6, A y B).92 De esta forma, los ZIFs comparten las propiedades porosas y selectivas de las zeolitas. Los ZIFs pueden contener una variedad de centros metálicos, incluyendo zinc (Zn), cobalto (Co), níquel (Ni), cobre (Cu), hierro (Fe), entre otros. El tipo de centro metálico presente en un ZIF puede influir en las propiedades físicas y químicas del material, incluyendo la estabilidad térmica, la selectividad de adsorción y las propiedades catalíticas. Respecto a los imidazolatos, existen gran variedad de ligandos, como MI, 2-etilimidazol, 2-benzimidazol, entre otros, que pueden variar en longitud y ramificación, lo que puede influir en la estructura y propiedades del ZIF resultante (Figura 6, B). Además, se puede modificar la estructura y las propiedades de los imidazolatos, con la introducción de grupos funcionales específicos para mejorar la capacidad de adsorción selectiva o la actividad catalítica de los ZIFs.93 Introducción y estado del arte 71 Figura 6: Comparación entre la estructura formada por la unión del imidazolato con los centros metálicos del ZIF con la de la unión del oxígeno-silicio de las zeolitas (a). Diferentes ligandos que pueden presentar los ZIFs (b). Estructura representativa del Zn tetracoordinado con ligandos imidazolato del ZIF-8 (c). Red tridimensional representativa del ZIF-8 (d). Dentro de la familia de los ZIFs, el ZIF-8 ha sido ampliamente estudiado y utilizado en aplicaciones en diversos campos como la separación94, sensores95, catálisis96, y la nanomedicina97, entre otros. El ZIF-8 está compuesto por iones de zinc y ligandos imidazolato. Los iones de Zn están conectados entre sí a través de cuatro imidazolatos, formando una red tridimensional (Figura 6, C y D). Cada imidazolato tiene dos átomos de nitrógeno que se coordinan con dos iones de zinc vecinos, formando enlaces metal-ligando. El resultado es una estructura altamente porosa con una topología cristalina tipo sodalita, es decir, una estructura cristalina tridimensional que se caracteriza por tener grandes cavidades en su interior, con una alta superficie específica y un tamaño de poro uniforme. Los poros tienen un diámetro de 11,6 Å, conectados a través de pequeñas aperturas de 3.4 nm, lo que los hace adecuados para la adsorción y separación de moléculas de tamaño pequeño a medio. Además, el ZIF-8 presenta una excelente estabilidad térmica y química, lo que lo hace adecuado para aplicaciones en catálisis, separación y almacenamiento de gases, entre otros campos.98 La síntesis del ZIF-8 es relativamente sencilla y se realiza mediante la mezcla de sales de zinc y MI en una solución acuosa o en un solvente orgánico, como el MeOH o el DMF. La formación del ZIF-8 ocurre en un proceso de autoensamblaje a temperatura ambiente o a temperaturas moderadas. A) B) C) D) Aitor Álvarez Lorenzo 72 1.4. NPS MAGNÉTICAS Las NPs magnéticas están compuestas de elementos magnéticos, como hierro, níquel, cobalto y sus óxidos. Su comportamiento magnético único está fuertemente influenciado por el efecto de su tamaño y superficie, así como por su interacción con el campo magnético aplicado. La principal característica es que pueden ser manipuladas por un campo magnético externo, propiedad que las convierten en una herramienta valiosa en una variedad de bioaplicaciones como, por ejemplo, la administración dirigida de fármacos y genes, ingeniería de tejidos, seguimiento de células, imagen de resonancia magnética y bioseparación.99 1.4.1. Magnetismo Los fundamentos del magnetismo están relacionados principalmente con el movimiento de los electrones. Hay dos contribuciones principales al momento magnético de un electrón: el momento magnético orbital, que se origina por el movimiento del electrón alrededor del núcleo atómico, y el momento magnético de espín, que está asociado con el espín intrínseco del electrón. En ciertos materiales, los momentos magnéticos de los electrones se alinean de manera paralela o antiparalela, lo que resulta en la formación de momentos magnéticos netos, también conocidos como momentos de espín. Los materiales magnéticos pueden clasificarse, según cómo interactúan con los campos magnéticos en ferro(ferri)magnéticos, antiferromagnéticos, paramagnéticos y diamagnéticos. Los materiales ferromagnéticos presentan una magnetización espontánea y remanente, incluso en ausencia de un campo magnético externo, debido a la interacción de intercambio entre los momentos magnéticos de los electrones. Estos materiales, como el hierro y el cobalto, tienen una alta susceptibilidad magnética y muestran un comportamiento de histéresis.100 Los materiales ferrimagnéticos, al igual que los ferromagnéticos, pueden retener la magnetización después de que se retira el campo magnético. Sin embargo, la magnetización en materiales ferrimagnéticos es el resultado de las contribuciones magnéticas opuestas pero desiguales de dos subredes de átomos.100 Ejemplos de este tipo de materiales son la magnetita (Fe3O4) y la maghemita (γ-Fe2O3). En los materiales antiferromagnéticos los momentos magnéticos de los átomos o iones están alineados en direcciones opuestas, lo que da como resultado una magnetización neta cero en ausencia de un campo magnético externo. Sin embargo, en presencia de un campo magnético externo, estos materiales pueden mostrar una respuesta paramagnética.100 Los materiales paramagnéticos exhiben una respuesta magnética positiva a un campo magnético externo, lo que significa que se magnetizan en la misma dirección del campo magnético aplicado. Sin embargo, a diferencia de los materiales ferromagnéticos, no retienen la magnetización después de que se retira el campo magnético. Ejemplos de materiales paramagnéticos incluyen el aluminio y el oxígeno gaseoso.100 Los materiales diamagnéticos no tienen momentos magnéticos intrínsecos y desarrollan una magnetización inducida débil en dirección opuesta al campo magnético aplicado; ejemplos de ellos incluyen gases nobles y líquidos iónicos.100 Introducción y estado del arte 73 1.4.2. Histéresis En el caso de materiales ferromagnéticos y ferrimagnéticos, la relación entre la intensidad del campo magnético aplicado (H) y la resultante magnetización del material (M) se representa mediante una curva, denominada de histéresis. Esta curva, característicamente no lineal y que no intercepta el origen, sugiere que la magnetización del material no es simplemente proporcional al campo magnético aplicado. Un aspecto fundamental del ciclo de histéresis es la presencia de una magnetización remanente y el campo coercitivo. La magnetización remanente se refiere a la magnetización residual del material una vez que el campo magnético aplicado ha sido disminuido a cero. Por otro lado, el campo coercitivo es el campo magnético inverso necesario para anular la magnetización del material. Ambas propiedades son indicativas de la resistencia del material a modificaciones en su estado de magnetización. Los materiales magnéticos se clasifican en "blandos" y "duros", basándose en sus características de histéresis. Los materiales blandos exhiben un ciclo de histéresis estrecho, lo que indica que pueden ser magnetizados y desmagnetizados con facilidad. Contrariamente, los materiales duros presentan un ciclo de histéresis más amplio, lo cual significa que requieren una mayor cantidad de energía para alterar su estado de magnetización. Esta diferenciación es esencial para el diseño y la selección de materiales en diversas aplicaciones magnéticas. 1.4.3. Magnetismo a escala nano El magnetismo en las NPs se ve influenciado por el tamaño y la dimensionalidad de las partículas. A medida que el tamaño de las partículas disminuye hasta llegar a la escala nanométrica se producen cambios en sus propiedades magnéticas. La anisotropía magnética es una propiedad intrínseca de los materiales magnéticos que describe la preferencia de orientación del momento magnético en relación con una dirección específica. En el caso de las NPs magnéticas, la anisotropía se ve afectada por el tamaño, la forma y la estructura cristalina de las partículas. La anisotropía magnética influye en la estabilidad del momento magnético y, por tanto, en las propiedades magnéticas de las NPs.101 En los materiales magnéticos de escala macroscópica, la minimización de la energía magnetostática del material se logra mediante la formación de dominios magnéticos. Estos dominios están separados por paredes de Bloch, zonas de transición donde los momentos magnéticos varían de manera gradual de un dominio a otro. La formación de estas paredes de Bloch se origina a través de un proceso guiado por el equilibrio entre dos factores: En primer lugar, la energía magnetostática, que incrementa proporcionalmente al volumen del material; y en segundo lugar, la energía de la pared de dominio, que aumenta en proporción directa con el área interfacial entre los dominios.102 Al alcanzar un diámetro de partícula crítico, la energía necesaria para la formación de las paredes de dominio supera la requerida para soportar la energía magnetostática externa. Como consecuencia de este fenómeno, la formación de paredes de dominio cesa, resultando en un material que es monodominio. El diámetro crítico102 para que esto suceda en el caso de MNPs esféricas viene dado por: Aitor Álvarez Lorenzo 80 2. MÉTODOS Y MATERIALES 2.1. REACTIVOS Citrato de sodio (Na3C6H5O7, Sigma Aldrich #W302600);; ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, #E26282); ácido tetracloroáurico (III) (HAuCl4, #254169), borohidruro de sodio (NaBH4, #452882); nitrato de plata (AgNO3, #209139); ácido ascórbico (AA, #A1300000); bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, #MKBX6159V); ácido tánico (AT, #1401-55-4); oleylamina (OLAM, #O7805); cloroformo (CHCl3, #48603); acetilacetonato de cobre (II) (Cu(acac)2, #C87851), Cloruro de hierro (III) (FeCl3, #44944); cloruro de hierro (II) (FeCl2, #372870); cloruro de cobalto (II) (CoCl2, #C8661); oleato de sodio (C₁₈H₃₃NaO₂, #26125); hexano (C₆H₁₄, #270504); 1-octadeceno (ODE, #8.22112); ácido oleico (AO, #364525); acetilacetonato de paladio(II) (Pd(acac)2, #209015); tetraclorepaladato (II) de potasio (K2PdCl4, #323411); dimetilformamida (DMF, #227056); dietilenglicol (DEG, #H26456); oleilamina (OLAM, #O7805); polietilenimina (PEI, #408727); 2-metilimidazol (MeIm; #M50850); nitrato de zinc hexahidratado (Zn(NO3)2·6H2O; #96482); violeta de cresilo (CV, #C5042); tetrahidrofurano (THF, #401757); poli(isobutilen-alt-maleico anhídrido) (PMA, #531278); MeOH (DDA, #D222208); hidróxido de sodio (NaOH, #S5881); PEG 5 kDa; mucina (MC, #M2378); 6-aminofluoresceina (6-AF, #201634); amino-PEG-tiol ((HS-PEG5K-NH2 #JKA5145); carboxi-PEG-tiol (HS-PEG5K-COOH, #757845); albúmina sérica bovina (BSA, #A2153) fueron comprados en Sigma-Aldrich. El ácido cítrico (C₆H₈O₇, Acros # 11905071) y ácido clorhídrico (HCl) fueron comprados en Fisher Scientific. El medio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM, #41966-029), Rodamina B isotiocianato (# 283924) y la fluoresceína-5-isotiocianato (FITC, #1245460250) fue comprador en Thermo Fisher Scientific. La (and-6)-Carboxitetrametilrodamina (TAMRA, #AS-81120-1) fue comprada en AnaSpec. El etanol absoluto (EtOH, #ET00052500) fue comprado en Scharlab. 2.2. MÉTODOS 2.2.1. Consideraciones generales. Todo el material de vidrio fue lavado con agua y detergente, agua regia y enjuagado con agua Milli-Q y acetona. El agua regia fue preparada, antes de su uso, mezclando 3 volúmenes de ácido clorhídrico (HCl) por cada volumen de ácido nítrico (HNO3). El agua regia es un oxidante fuerte y corrosiva por lo que debe prepararse y manipularse con extrema precaución. Métodos y materiales 81 2.2.2. Síntesis de AuNPs Las AuNPs monodispersas y estabilizadas con citrato se sintetizaron mediante un protocolo estándar previamente descrito.26 Un matraz de fondo redondo de tres bocas, conteniendo 144 ml de agua Milli-Q se llevó a ebullición mediante el uso de una manta calefactora. Se utilizó un condensador para prevenir la evaporación del agua. Una vez iniciada la ebullición, se añadieron 3.5 ml de citrato de sodio (Na3C6H5O7) (60 mM) y 1,5 ml de ácido cítrico (C₆H₈O₇) (60 mM) y se agitó (450 RPM) durante 30 min. A continuación, se introdujeron 0,1 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) dentro de la mezcla seguido de la adición de 1 ml de ácido tetracloroáurico (III) (HAuCl4) (25 mM). Tras unos segundos, se observó un cambio de color desde amarillo pálido hasta azul para finalmente cambiar a rojo-vino, lo que indicó la formación de AuNPs. Finalmente, se enfrió la dispersión hasta la temperatura ambiente y se determinó el tamaño y la concentración de las AuNPs a partir del máximo de absorbancia del plasmón medido por espectroscopía ultravioleta visible (UV-Vis). El tamaño se calculó a partir de la posición del plasmón, y la concentración se determinó mediante la ecuación de Lambert Beer: 𝐴(𝜆)=𝜀𝑁𝑃(𝜆).𝑙∗𝐶𝑁𝑃 ( 12 ) donde 𝜀𝑁𝑃(𝜆) es el coeficiente molar de extinción, que es función del tamaño de las NPs, 𝐴(𝜆) la absorbancia, 𝑙 es la longitud del camino óptico de la cubeta y 𝐶𝑁𝑃 es la concentración de NPs. 2.2.3. Síntesis de AuNRs Las AuNRs estabilizadas con CTAB se sintetizaron siguiendo un método de crecimiento mediado por semillas, de acuerdo al protocolo descrito por el grupo de C. Murphy.120 Este método implicó la adición de una solución de semilla de oro a una solución de reactivo de crecimiento que contiene CTAB como agente estabilizante. La temperatura y la relación molar de reactantes se controlaron cuidadosamente para promover el crecimiento preferencial de las AuNR en lugar de las NPs esféricas. El primer paso en la síntesis de las semillas de oro consistió en la adición de 0,25 ml de una solución de HAuCl4 (0.01 M) a 7,5 ml de una disolución de CTAB (0,2 M) a una temperatura de 26 °C. Posteriormente, se agregó con rapidez 0,6 ml de una solución recién preparada de borohidruro de sodio (NaBH4) (0.01 M), mientras se agitaba la solución a una velocidad de 350 rpm durante un período de 2 minutos. La adición de NaBH4 provocó un cambio inmediato del color de la solución de amarillo a marrón. Las semillas de oro resultantes se dejaron en reposo durante 1 hora antes de su uso, para garantizar la descomposición completa del NaBH4. La segunda parte del proceso de síntesis implicó el crecimiento de las AuNRs a partir de las semillas previamente sintetizadas. Para ello, se preparó una disolución de 100 ml de CTAB (0,2 M) a una temperatura de 26°C, y se agitó mientras se añadieron 4.25 ml de una solución de HAuCl4 (0,01 M) y 1,23 ml de una solución de nitrato de plata (AgNO3) (0,01 M). Tras agitar la solución durante 2 minutos, se añadieron 0.68 ml de una solución de AA (0,1 M). Después de agitar durante 10 minutos, se agregó 1,1 ml de la solución de semillas y se agitó durante 2 minutos más. Finalmente, la solución se dejó en reposo durante toda la noche a una temperatura de 26 °C. Aitor Álvarez Lorenzo 82 Las AuNR resultantes se purificaron mediante centrifugación a 10000 rcf durante 30 minutos en dos ocasiones. Posteriormente, se dispersaron los sedimentos en una solución de CTAB (0,16 mg/mL) para garantizar la estabilidad de los AuNRs durante su almacenamiento. 2.2.4. Determinación de la concentración de AuNRs por ICP Se digirieron 20 µl de la dispersión de AuNRs con agua regia. Para ello, sobre los 20 µl se añadieron 120 µl de HNO3 y 360 µl de HCl. Se dejó la mezcla, al menos, 3 h para asegurarse de la completa digestión de las NPs. A continuación, se añadieron 4,5 ml de H2O ultrapura y se determinó la concentración de Au mediante ICP, siendo la concentración de Au en la muestra: 𝐶𝑚=𝑑∗𝐶𝐼𝐶𝑃 =250∗𝐶𝐼𝐶𝑃 ( 13 ) donde Cm es la concentración de Au de la muestra original en g.l-1, d la dilución de la muestra que se mide en el ICP respecto a la original y CICP la concentración determinada por el ICP en g.l-1. La masa de un solo AuNR (mAuNR) se calculó como: 𝑚𝐴𝑢𝑁𝑅 =𝜌𝐴𝑢∗𝑣=19,3∗𝜋∗ℎ∗𝑟2 ( 14 ) siendo ρAu la densidad del Au en gcm-3, v el volumen medio de un AuNRs en cm3, h y r son la altura y radio medio de los AuNRs en cm, respectivamente. Conocida la concentración de Au y la masa de un AuNR, la masa molar (MAuNRs) se calculó como: 𝑀𝐴𝑢𝑁𝑅𝑠 =𝑚𝐴𝑢𝑁𝑅∗𝑁𝐴 ( 15 ) siendo NA el número de Avogadro. 2.2.5. Cálculo del coeficiente de extinción de los AuNRs A partir de la concentración de la muestra de AuNRs determinada mediante ICP-MS, se pudo calcular el coeficiente de extinción de estos y, así, poder obtener también su concentración a partir del espectro UV-Vis. De acuerdo con la ley de Beer-Lambert, la absorbancia de una muestra es directamente proporcional a su concentración molar (C), al camino óptico (L) y al coeficiente de extinción molar de la muestra (ε), si despejamos ε, teniendo en cuenta que L es 1 cm, queda: 𝜀=𝐶 𝐴 ( 16 ) Representando medidas de absorbancia a λ=450 nm de longitud de onda a diferentes concentraciones de NP, la pendiente de la recta que se ajustó a los puntos experimentales es el coeficiente de extinción molar. Métodos y materiales 83 2.2.6. Recubrimiento de los AuNRs con BSA La BSA se marcó con FITC. Primero, el FITC se disolvió en DMSO para preparar soluciones de reserva de 10 mgmL-1. Luego, el colorante se incubó con la BSA durante 4 h a temperatura ambiente en un tampón de carbonato (50 mM, pH 9,2) para permitir la reacción entre los grupos isotiocianato y los grupos amina de la proteína. La proporción utilizada para la conjugación fue de 25 moléculas de colorante por molécula de BSA. A continuación, se utilizó una columna de exclusión de tamaño (PD-10, MWCO = 5000 Da; #GE17-0851-01) para purificar la proteína marcada (BSA-FITC) del exceso de colorante libre. Se utilizó el ensayo de Bradford (Pierce TM Coomassie Plus Assay Kit; ThermoFisher #23236) para determinar las concentraciones de proteínas (CP). Para ello, se mezclaron 150 µL de muestras de proteína estándar diluida (estándar BSA inicial de 2 mg.ml-1) en un rango de trabajo de 1-25 µg.ml-1 y muestras desconocidas con 150 µL de reactivo de Coomassie en una microplaca de 96 pocillos. La absorbancia a 570 nm se leyó utilizando un lector de microplacas (TECAN, Infinite 200 pro). Luego, se preparó una curva de calibración midiendo la fluorescencia de varias diluciones de BSA conocidas con concentración CP. La fluorescencia se midió utilizando un lector de placas, lo que nos permitió correlacionar la concentración de proteína y la fluorescencia. Las muestras de BSA-FITC se protegieron de la luz y se almacenaron a 4 ˚C. La BSA-FITC (0.12 mM) se utilizó para formar la corona proteica en los AuNRs. Los complejos AuNRs@BSA se prepararon justo antes de cada experimento. Los AuNRs se incubaron con BSA (utilizando una proporción de 4000 BSA por AuNR) en un tampón de PBS (con una concentración final de AuNRs de 1.0·1012 AuNRs.ml-1) a temperatura ambiente en un agitador. Después de 1 h de incubación, se centrifugaron los AuNRs@BSA a 13000 rcf y se resuspendieron en PBS fresco para eliminar la proteína no unida. Se repitió este paso de lavado tres veces en total. Finalmente, las partículas se resuspendieron en PBS. 2.2.7. Experimento de irradiación láser de los AuNR@BSA Se irradió 0,5 ml de una dispersión de AuNR@BSA PEGilada a concentración 5 nM con un láser de diodo de infrarrojo cercano (NIR) (λ = 805 nm, potencia de salida de 500 mW). La irradiación láser a 4 W.cm-2 se llevó a cabo durante 3 min. Tras la irradiación, las muestras se precipitaron mediante centrifugación y se analizó la cantidad de BSA que quedó adsorbida en la superficie de los AuNRs. La BSA@FITC adsorbida en la superficie de los AuNRs se midió antes y después de la irradiación láser (cuando los AuNRs estaban dispersos en PBS o en medios de cultivo celular completos) mediante medidas de intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas (TECAN, Infinite 200 Pro.). 2.2.8. Síntesis de AuNSs Las AuNSs se sintetizaron empleando AuNPs como semillas, cationes de plata como agentes de terminación y AA como agente reductor. Las AuNPs se sintetizaron por reducción con citrato de sodio mediante el protocolo descrito por F. Schulz et al.121 La síntesis de semillas consistió en calentar 1 l de agua Milli Q hasta alcanzar el punto de ebullición con agitación a 400 rpm. Posteriormente, se añadieron 26 ml de citrato de sodio (60 mM) y 8,7 ml de ácido cítrico (60 mM), manteniendo la ebullición durante un período de 30 min. A continuación, se agregaron 0,7 ml de EDTA (30 mM) y 6,9 ml de HAuCl4. Tras transcurrir 1 min se observó un cambio en el color de la solución, pasando de amarillo pálido a rojo vino indicando, así, la Aitor Álvarez Lorenzo 84 síntesis de nanopartículas esféricas. Seguidamente, se enfrió la dispersión en un baño de agua helada hasta alcanzar la temperatura ambiente. Para la síntesis de las AuNSs, a 100 ml de una solución de HAuCl4 (0,25 mM) contenida en un vaso de precipitados, agitando a 250 rpm, se añadieron 150 µL de HCl (1M) y 4 ml de semillas de AuNP (2 nM). A continuación, se agregaron simultáneamente 1.5 ml de AgNO3 (1 mM) y 0,75 ml de AA (66,7 mM), lo que provocó que la solución adquiriera un color azul oscuro. Tras 5 minutos, se añadieron 25 ml de una solución de bromuro de CTAB (0,2 M) para detener el crecimiento de las AuNSs. La mezcla se agitó durante 2 minutos más y se sumergió en un baño de hielo durante 5 minutos. Por último, las AuNS se centrifugaron durante 10 minutos a 7000 rcf y se lavaron 2 veces con una solución acuosa de CTAB con una concentración de 0,16 mg.ml-1. Finalmente, las AuNS se dispersaron en 2 ml de una solución acuosa de CTAB con una concentración de 0,16 mg.ml-1 para garantizar su estabilidad durante el almacenamiento. Suponiendo que se formó una AuNS a partir de cada AuNP, y que durante los lavados no se perdieron semillas, se supuso una concentración final de AuNSs de 4 nM. 2.2.9. Síntesis de NPs de plata (AgNPs) en medio acuoso Las AgNPs se sintetizaron siguiendo el método descrito por V. Puntes et al.122 En un vaso de precipitados de 250 ml, se disolvieron 42,5 mg de ácido tánico (0,25 mM) y 147,0 mg de citrato de sodio (5 mM) en 100 ml de agua Milli-Q. La solución se calentó hasta alcanzar los 100 °C y, una vez que comenzó a hervir, se adicionó 1 ml de AgNO3 (25 mM). Tras 10 segundos de reacción, se enfrió rápidamente la solución sumergiéndola en un baño de hielo. Finalmente, las NPs se purificaron mediante una centrifugación a 16000 rcf durante 20 min y se descartó el sobrenadante. El precipitado obtenido se dispersó en agua Milli-Q para su posterior uso. 2.2.10. Síntesis de NPs de plata (AgNPs) en medio orgánico Las AgNPs fueron sintetizadas por descomposición térmica de un precursor de plata utilizando el método descrito por S. Peng et al.123 En un matraz de 100 ml, se mezclaron 1 mmol de AgNO3 y 20 ml de OLAM. La mezcla fue desgasificada calentándola a 60 °C bajo vacío durante 20 min. A continuación, la solución se calentó hasta 240 °C bajo una atmósfera de N2 y se dejó durante 1 h. Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, se añadieron 25 ml de EtOH y se precipitó la mezcla a 2000 rpm durante 10 minutos. Finalmente, el precipitado se suspendió en 10 ml de cloroformo (CHCl3). 2.2.11. Síntesis de NPs de cobre (CuNPs) Las CuNPs fueron sintetizadas siguiendo el método descrito por M. Shi et al.124 En un matraz de 50 ml de tres bocas, se disolvieron 0,1 g de acetilacetonato de cobre (II) (Cu(acac)2) en 10 ml de OLAM y se desgasificó durante 1 h bajo vacío a temperatura ambiente. A continuación, se calentó lentamente hasta 230 °C bajo una atmósfera de N2 y se dejó durante 3 h. Para purificar las NPs, una vez que la dispersión estaba a temperatura ambiente, se añadieron 30 ml de EtOH desoxigenado y se centrifugó a 2500 rcf durante 10 min. A continuación, se dispersó el precipitado en CHCl3 desoxigenado y se volvió a lavar con EtOH. Las CuNPs se almacenaron bajo vacío hasta su uso. Métodos y materiales 85 2.2.12. Síntesis de MNPs de óxido de hierro Las MNPs fueron sintetizadas por descomposición térmica siguiendo un protocolo adaptado del descrito previamente por P. Anikeeva et al.125 Se sintetizaron MNPs con fórmula Co(x)Fe(3-x)O4 con diferentes proporciones de Co. Para preparar 1 mmol de precursor organometálico (Co(x)Fe(3-x) (C18H33O2)8) se disolvieron 2 mmoles de cloruro de hierro (III) (FeCl3), 1-x mmoles de cloruro de hierro (II) FeCl2), x mmoles de cloruro de cobalto (II) (CoCl2) y 8 mmoles de oleato de sodio (C₁₈H₃₃NaO₂) en una mezcla formada por 10 ml de EtOH, 10 ml de H2O Milli-Q y 20 ml de hexano (C₆H₁₄). Alternativamente, se pueden preparar precursores de Fe2+ (Fe(C18H33O2)2), Fe3+ (Fe2(C18H33O2)6), y Co2+ (Co(C18H33O2)2), por separado, cuantificar la concentración de metal mediante ICP y mezclarlos en las proporciones adecuadas para obtener el precursor organometálico con la proporción de Co deseada. En el caso de preparar 1 mmol de precursor se mezclan 2 mmoles de oleato de Fe3+, 1-x mmoles de oleato de Fe2+ y x mmoles de oleato de Co2+. A continuación, se calentó la mezcla a reflujo a 75 °C con agitación magnética (400 rpm) durante 4 h y se separó la fase orgánica, la cual se lavó con agua Milli-Q en un embudo de decantación. En un matraz redondo de 50 ml, se calentó la fase orgánica durante 2 h a 85 °C con agitación magnética (250 rpm), y después a vacío a 113 °C durante 2 h adicionales (Figura 8). Figura 8: Esquema de la preparación del oleato de hierro. Montaje del sistema de reflujo para la síntesis (izquierda) y representación de la coordinación de cationes de Fe 2+ y Fe3+ con aniones oleato (derecha). Para sintetizar MNPs de 15 nm, se disolvió 1 mmol de precursor con la proporción de Co deseada en 5 ml de ODE y 175 µl de AO en un matraz de 3 bocas de 50 ml (Figura 9). Se calentó a 110 ºC a vacío durante 1 hora. Seguidamente, se calentó hasta 200 °C bajo flujo de N2; finalmente, se incrementó la temperatura hasta 310 °C con un gradiente de 1 °C.min-1 y se Aitor Álvarez Lorenzo 86 mantuvo durante 1 h. La mezcla se recogió en 40 ml de una mezcla 1:1 de EtOH:C₆H₁₄ y se centrifugó (7000 rcf durante 10 min). El precipitado se dispersó en 10 ml de C₆H₁₄, 5 ml de EtOH y se centrifugó (7000 rcf durante 10 min) dos veces. Finalmente, el sedimento se dispersó en 10 ml de C₆H₁₄. Figura 9: Esquema del montaje para la síntesis de MNPs. Cambiando la temperatura final de la rampa de calentamiento, se pudieron obtener diferentes tamaños de NP como se indica en la Tabla 3. Tabla 3: Tamaño de las MNPs en función de la temperatura final de la reacción. Tamaño / nm Temperatura final / °C 12 305 15 310 18 315 2.2.13. Síntesis de PdNCs Los PdNCs cóncavos fueron sintetizados siguiendo el método químico en solución adaptado del protocolo descrito por L. Cai et al.126 Una sal de paladio, tetracloropaladato (II) de potasio (K2PdCl4), fue reducida con AA en presencia de CTAB, que actuó como agente estabilizador. En un vaso de precipitados de 50 ml con agitación magnética (250 rpm), se disolvieron 0,5 ml de CTAB (0,1 M) y 2,5 ml de K2PdCl4 (10 mM) en 21,2 ml de agua MilliQ. A continuación, se añadieron 0,75 ml de AA (0,1 M) y se introdujo el vaso de precipitados en un baño de agua a 35 °C. Se agitó la mezcla a 35 °C hasta que el color de la solución cambió a negro (~5 min), lo que indicó la formación de PdNCs. Por último, se purificó la suspensión coloidal mediante centrifugación (7200 rcf durante 10 min) dos veces y se redispersó en una solución acuosa de CTAB (0,16 mg.ml-1). Métodos y materiales 87 2.2.14. Síntesis de PdNDs Se sintetizaron dos tipos de PdNDs utilizando un método químico húmedo adaptado del protocolo descrito por I. Pastoriza-Santos et al.127 Para ello, se redujeron dos sales de paladio, acetilacetonato de paladio(II) (Pd(acac)2) y tetracloropaladato(II) de potasio (K2PdCl4) en DMF y una mezcla de DEG con OLAM, respectivamente, en presencia de PEI, un polímero cargado positivamente. 2.2.14.a. Síntesis de PdND1 Se añadieron 209 µl de PEI con una jeringa a 8 ml de DMF contenidos en un matraz de 2 bocas de 50 ml. Se agitó la solución durante 20 minutos (250 rpm). A continuación, se calentó hasta 130°C con una manta calefactora y se añadieron 7,6 mg de Pd(aca)2. Seguidamente, se elevó la temperatura hasta 150 °C y se mantuvo durante 1 h. Tras enfriar a temperatura ambiente, la muestra se transfirió a un tubo cónico de 15 ml, se agregaron 8 ml de EtOH y se centrifugó (16000 rcf durante 10 min). El precipitado fue suspendido en 15 ml de EtOH. Este proceso se repitió con acetona (C3H6O) y agua Milli-Q. Finalmente, el precipitado fue suspendido en 4 ml de agua Milli-Q. 2.2.14.b. Síntesis de PdND2 Se añadieron 209 µl de PEI con una jeringa a un matraz de 3 bocas de 50 ml que contenía 4 ml de DEG y 4 ml de OLAM, y se agitó la mezcla durante 20 min a 250 rpm. Manteniendo la agitación, se añadieron 24 mg de K2PdCl4 a la mezcla, se calentó hasta 110 °C y se mantuvo durante 1 h bajo vacío. Por último, bajo una corriente de N2, se elevó la temperatura hasta 150 °C y se mantuvo durante 1 h. Después de enfriar a TA, el contenido se transfirió a tubos cónicos de 15 ml y se adicionaron 5 ml de EtOH. La muestra se purificó por centrifugación (7200 rcf durante 10 min). El precipitado se suspendió en 8 ml de EtOH, y este proceso se repitió con C3H6O y agua Milli-Q. Finalmente, el precipitado se suspendió en 4 ml de agua Milli-Q. 2.2.15. Determinación de las constantes de reacción En un vial de 2 ml, se mezclaron 4,5 µl de la dispersión de PdNC de una concentración de Pd de 1 mM, 25 µl de AM (0,3 mg.ml-1) y 965 µl de MeOH. La mezcla se introdujo en una cubeta UV-Vis y, sobre la mezcla ya introducida en el equipo, se añadió el NaBH4 en exceso, específicamente, 5 µl de NaBH4 (5 mg.ml-1), y se midió la absorbancia a 664 nm de longitud de onda durante 80 s. Se representó el Ln(A.A0-1) en función del tiempo, y se ajustaron los puntos obtenidos a una línea recta mediante el empleo de una regresión lineal. La pendiente de dicha recta se interpretó como el valor negativo de k. Se repitió el mismo procedimiento para cada uno de los sistemas, pero mezclando 5,3; 100 y 55 µl de una dispersión de 1 mM en Pd para los PdNC@PEG, PdNC@MC y PdND, respectivamente. 2.2.16. Síntesis de ZIF-8 Estas partículas se sintetizan siguiendo un protocolo previamente publicado por el grupo donde he desarrollado esta tesis.128 Con el fin de controlar el tamaño y forma de las partículas, se utilizó CTAB durante la síntesis. En un vial de vidrio de 5 ml bajo agitación magnética y a Aitor Álvarez Lorenzo 88 TA, se mezcla 1 ml de solución acuosa de MI (1,3 M), 1 ml de solución acuosa de nitrato de zinc hexahidratado (Zn(NO3)2•6H2O) (0,025 M) y 1 ml de solución acuosa de CTAB (0,16 mg.ml-1). La mezcla se agitó durante 5 min y se dejó en reposo durante 3 h a TA. La aparición de turbidez blanca indicó la formación de los ZIF-8. Finalmente, las partículas se precipitaron por centrifugación (7000 rcf, 10 min) y se lavaron dos veces con MeOH. Tras el lavado se dispersaron en 1 mL de MeOH. Finalmente, se determinó la concentración mediante el DLS. Para ello se prepararon varias diluciones (1:2500, 1:2000, 1:1500, 1:1000 y 1:500) de la muestra en agua. Se midió la concentración en el DLS en NPs.ml-1 por triplicado y los valores medios se convirtieron a nmoles de NPs.l-1, multiplicando por 1011 y dividiendo por el número de Avogadro. Por último, se representó la concentración en nM frente a la inversa del factor de dilución (por ejemplo, en el caso de la dilución 1:2500, la inversa del factor de dilución es 2500-1), los puntos se ajustaron por regresión lineal a una recta, cuya pendiente fue la concentración de ZIF-8 en nM en la muestra original. El procedimiento de determinación de la concentración fue extensible para todos los nanompuestos y ZIF-8 cargados descritos en los siguientes apartados. 2.2.17. Síntesis del nanocompuesto (NC) formados por NP recubiertas de ZIF-8 (NP@ZIF-8) En la síntesis de NC, las NPs fueron utilizadas como semillas sobre las cuales se creció una capa de ZIF-8. Este protocolo fue equivalente al descrito anteriormente para el ZIF-8 con la modificación de que se añadió 1 ml de disolución acuosa de CTAB (0,2 g.l-1) con las NPs (AuNR, AuNS, MNP o PdNP) dispersas a una concentración de 2 nM. La purificación de los NC fue la misma que la del ZIF-8. Dado que para la síntesis se añadió 1 ml de NPs a una concentración de 2 nM, y suponiendo que un NC creció a partir de cada NP, se estimó que la concentración final de NCs fue de 2 nM. Además, se llevaron a cabo experimentos para analizar el efecto de distintos procesos de lavado en los AuNRs@ZIF-8 resultantes. Estos lavados consistieron en dos etapas de centrifugación (7000 rcf, 10 min) y redispersión en 1 ml de diferentes combinaciones de agentes dispersantes (Tabla 4). Tabla 4: Diferentes combinaciones de agentes dispersantes probados para el lavado de los NC. 1ª redispersión 2ª redispersión MeOH H2O H2O H2O MeOH PSF H2O PSF PSF PSF MeOH MeOH 2.2.18. Síntesis de NP@ZIF-8 cargado con CV Este protocolo es equivalente al descrito anteriormente para los NCs con la modificación de que se añadió en la disolución acuosa de CTAB (0,16 g.l-1), CV (0.1 g.l-1), las NPs a una Métodos y materiales 89 concentración de 2 nM y tan solo se lavó 1 vez con MeOH para evitar eliminar el CV encapsulado. Al no contar con un recubrimiento polimérico de protección, el CV adsorbido en las superficies internas del ZIF-8 se puede eliminar con facilidad. 2.2.19. Síntesis del nanocompuesto NPagregadas@ZIF-8 Este procedimiento fue análogo al de los NP@ZIF-8 con la diferencia que las NPs dispersas en agua a una concentración de 4 nM, y solo el CTAB residual de la síntesis de las AuNSs. 2.2.20. Medidas SERS con los NPagregados@ZIF-8 En un recipiente de 1 ml, se añadieron 25 µl de una suspensión de NPagregadas@ZIF-8 a una concentración de 5 nM. A continuación, se añadió el volumen requerido de una solución de 4-MBA o RoB, dependiendo de la concentración deseada para el experimento. La mezcla se completó con agua Milli-Q hasta alcanzar un volumen final de 500 µl. La solución se agitó durante un período de una noche a temperatura ambiente. Posteriormente, se extrajeron 400 µl de la mezcla y se transfirieron a un tapón de polipropileno con un diámetro de 24 mm. Se colocó el tapón bajo el láser del equipo y se procedió a medir la señal Raman utilizando un láser de 808 nm bajo las condiciones seleccionadas. 2.2.21. Transferencia de MNPs estabilizadas en medio orgánico a agua mediante el uso de CTAB En un vial de 10 ml de CTAB (0,05 g.l-1) se añadió 1 ml de MNP dispersadas en CHCl3 o hexano, se tapó y agitó vigorosamente hasta que se formó una emulsión, y se sometió a sonicación (a temperatura ambiente durante 1 min a 200 W). Si se observaba que se separaban las fases orgánica y acuosa, se añadía 1 ml adicional de CTAB (0,05 g.l-1), se agitó y sonicó de nuevo; si se seguía observando fase orgánica, se adicionaba 1 ml adicional de CTAB y así sucesivamente hasta q se consiguió una emulsión estable. A continuación, se agitó la mezcla a 1200 rpm, se calentó en un baño de agua a 55 °C durante 10 min y se aumentó la temperatura a un gradiente de 1 °C.min-1 hasta 75 °C, dejándola durante 30 min para evaporar la fase orgánica. Para lavar las NP, se precipitaron mediante centrifugación y se dispersaron en CTAB (0,16 g.l-1). Después de 2 lavados, se precipitaron una vez más y se dispersaron en CTAB (0,4 g.l-1). Por último, con el propósito de eliminar los agregados de MNPs, se centrifugó durante 3 minutos a 3000 rcf. Como resultado, se obtuvo un precipitado compuesto por agregados de MNP, los cuales fueron descartados, permaneciendo en el sobrenadante tan solo las MNP que estaban bien dispersas. 2.2.22. Evaluación de la degradación de NP mediante ICP Se prepararon diferentes viales conteniendo 10 ml de dispersiones individuales de NPs esféricas de Au, Ag y Cu, así como también sus respectivas mezclas, todas ellas a una concentración de 1 nM. Estos viales se colocaron en un baño de agua a una temperatura constante de 37 °C. A intervalos de tiempo específicos, se extrajeron alícuotas de 0,5 ml de Aitor Álvarez Lorenzo 96 Figura 12: Correlación entre la concentración de CV y la intensidad de emisión de fluorescencia (λ = 621 nm). Los puntos se ajustaron con un análisis de regresión lineal en H2O (y = 4.38 × 109 x + 5.01 × 105, r2 = 0,967) (A) y en MeOH (y = 2.60 × 109 x + 1.43E × 106, r2 = 0,994) (B). Figura 13: Correlación entre la concentración de 6-AF en MeOH y la intensidad de emisión de fluorescencia (λ = 518 nm). Los puntos se ajustaron con un análisis de regresión lineal (y = 212.2 x + 582.2, r2 = 0,999). 2.4. INSTRUMENTOS Y TÉCNICAS Para la caracterización óptica de las diferentes suspensiones coloidales se utilizó un espectrofotómetro UV-visible Biochrom Libra S60. La caracterización de la fluorescencia se llevó a cabo mediante un fluorímetro Horiba FluoroMax-3. Cada medida se obtuvo mediante el cálculo de la media de tres réplicas independientes. 4×10-4 8×10-4 2×106 3×106 4×106 C / gL-1 I 0 5×10-4 1×10-3 0 2×106 4×106 6×106 C / gL-1 I 0 10 20 30 0 2×103 4×103 6×103 8×103 C / M I A B Métodos y materiales 97 Las medidas de espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) se realizaron en un espectrómetro Perkin Elmer Spectrum Two con ATR; las muestras secas en polvo se colocaron en la ventana ATR y se analizaron desde 700 hasta 4000 cm-1. Cada medida se obtuvo a partir de la media de 3 réplicas. Las medidas Raman se realizaron con un equipo Renishaw inVia Reflex sobre un sustrato de vidrio con un haz láser a 785 nm y con un objetivo de 50X. Las muestras se irradiaron con una potencia de 10 mW con tiempo de adquisición de 13 s y 4 acumulaciones. Para tratar los espectros se utilizó el software Wire 3.2. El análisis termogravimétrico (TGA) de muestras en polvo se realizó con un TA Intruments Inc. Q5000, bajo atmósfera de nitrógeno con un flujo de gas de 20 ml.min-1 de aire y las muestras se analizaron con un gradiente de temperatura de 10 °C.min-1 desde 30 hasta 800 °C. El tamaño hidrodinámico y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron por dynamic light scattering (DLS) utilizando un equipo Malvern Zetasizer Nano ZSP equipado con un láser de 10 mW de He-Ne que operó a 633 nm de longitud de onda y un ángulo de dispersión fijado a 173 °. El resultado de la medida se obtuvo mediante el cálculo del valor medio de tres réplicas independientes, en las cuales se realizaron tres escaneos consecutivos de una duración de 10 segundos cada uno. El potencial Z (ζ) de las NP se determinó por anemometría de láser Doppler con el mismo equipo Malvern Zetasizer Nano ZSP. El valor medio se obtuvo a partir de tres réplicas, siendo cada una de ellas compuesta por un total de diez escaneos. La concentración de los nanocompuestos se midió mediante análisis de seguimiento de NPs (NTA). Todas las muestras se analizaron en agua utilizando un NanoSight NS300 (Malvern Instrument Ktd) equipado con un láser de 405 nm. Todas las mediciones se realizaron a 24 °C. Cada medida se obtuvo mediante el cálculo de la media de tres réplicas independientes. A su vez, cada réplica se generó a partir del análisis de un total de 1498 frames. Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) se obtuvieron con un equipo HRTEM libra 200 FE OMEGA operado a 200 kV. Las imágenes de microscopía electrónica de barrido se adquirieron con un microscopio FSEM Zeiss Ultra Plus operado a 3 kV. La espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) se llevó a cabo utilizando un Agilent 5800 ICP-OES. Para la medición de los ciclos de magnetización y pérdidas magnéticas de las MNPs, se empleó un magnetómetro de la serie AC Hyster de Nanotech Solutions. Este magnetómetro está equipado con dos bobinas: la bobina Sens, que realiza mediciones en 8 frecuencias diferentes que van desde 10 hasta 100 kHz, y la bobina Advance, que realiza mediciones en 8 frecuencias que abarcan desde 25 hasta 350 kHz. Ambas bobinas operan en campos magnéticos que varían desde 4 hasta 24 kA.m-1, a excepción de la máxima frecuencia de la bobina Advance, que trabaja a 20 kA.m-1. Para llevar a cabo las mediciones, se introdujo una muestra de 40 µl en el magnetómetro. La muestra se preparó con una concentración de Fe de 0.3 g.l-1. La muestra se introdujo en un capilar específico (WG-3000-3 3 mm NMR Economy Sample Tube w/o Cap, 3) diseñado para contenerla adecuadamente durante el proceso de medición. Las isotermas de adsorción de N2 a 77 K se midieron en un analizador de adsorción Micromeritics 3Flex. Las muestras (alrededor de 20 a 30 mg) se activaron durante la noche a alto vacío a 90 °C antes del análisis. El área de superficie específica se extrapoló dentro del intervalo de presión relativa (P/P0, donde P0 es la presión de saturación) de 0,05-0,3 aplicando Aitor Álvarez Lorenzo 98 la ecuación de Brunauer, Emmett & Teller (BET). Los datos se analizaron utilizando el software 3Flex V5.03 (Micromeritics Instrument Corp., Norcross, GA, Estados Unidos). Las mediciones de WAXS y SAXS se realizaron utilizando un Anton Paar SAXSpoint 5.0 equipado con una fuente de micro rayos X de Cu (λ = 0,154 nm) con un detector 2D Pilatus3 R 1 M a 2 distancias diferentes: 288 mm para WAXS y 1343 mm para SAXS – en tubo capilar marca Hilgenberg de 1 mm de diámetro externo. Capítulo 3 En el apartado 3.31. de este capítulo se van a reproducir los resultados de la siguiente referencia: Ester Polo, Vida Araban, Beatriz Pelaz, Aitor Alvarez, Pablo Taboada, Morteza Mahmoudi, Pablo del Pino. Photothermal effects on protein adsorption dynamics of PEGylated gold nanorods. Applied Materials Today, Volume 15, Pages 599-604 (2019). NPs plasmónicas y su funcionalización 101 3. NPS PLASMÓNICAS Y SU FUNCIONALIZACIÓN 3.1. INTRODUCCIÓN Con el aumento en los últimos años de la aplicación de NP plasmónicas en la producción industrial y el consumo doméstico, están surgiendo una serie de cuestiones acerca de la seguridad de estas partículas. La toxicidad de estas NPs está influenciada por una variedad de factores, incluyendo su tamaño, forma, composición química, carga superficial, actividad catalítica, dosis y superficie.130 Sin embargo, la toxicidad asociada con la exposición simultánea a diferentes NPs plasmónicas ha recibido poca atención. La toxicidad, en este caso, puede deberse a la interacción entre las NPs individuales debido a sus diversas propiedades fisicoquímicas. Por otra parte, las NPs debido a su alta energía superficial son termodinámicamente inestables y susceptibles de agregarse, lo que resulta en la perdida de las propiedades con el paso del tiempo. Para muchas de las nuevas aplicaciones es necesario la preparación de NPs que se mantengan inalterables durante largos periodos de tiempo en diferentes ambientes, lo cual se consigue a través de la funcionalización de las NPs. Una de las estrategias para evitar su degradación es la encapsulación o crecimiento en el interior de MOFs. El ZIF-8, uno de los MOFs más estudiados, puede crecer sobre NPs inorgánicas de diferentes morfologías (esferas, cubos, estrellas, barras, etc.) y composiciones.131-132 Los múltiples sitios de coordinación y la estructura bien definida de los poros del MOF estabiliza las NPs al proporcionar confinamiento espacial y evitar que se agreguen.133 Como resultado se obtienen nanocompuestos (NC) que combinan las propiedades de las NP con las del ZIF-8. Estos NC se han presentado, por ejemplo, como plataformas para promover la liberación de fármacos en células vivas controlados mediante un estímulo externo (luz).131 Para bioaplicaciones, cuando las NPs se encuentran dispersas en un medio biológico, las proteínas del medio se adsorben sobre la superficie de la NP, formando una corona de proteína que influye en las interacciones de las NPs con barreras biológicas y células.134 La corona proteica está influida por varios factores como son el tamaño de la NP, la composición superficial de la NP, esto es, los ligandos presentes en su superficie, y su carga superficial.135 Los ligandos como el poli (etilenglicol) (PEG) se usan comúnmente para proporcionar NPs con estabilidad coloidal a través de interacciones electrostáticas y estéricas, así como para reducir la adsorción inespecífica de proteínas En este capítulo, se aborda la síntesis y post-funcionalización de NPs plasmónicas de diversos materiales (Au, Ag y Cu) y morfologías (esferas, barras y estrellas). El capítulo se estructura en tres secciones en las que se examina la influencia de la co-exposición de NPs plasmónicas en su degradación, el efecto de la funcionalización con PEG en la dinámica de las proteínas presentes en la biocorona que se puede formar en la superficie de las NPs, y la encapsulación de las NPs en ZIF-8 para su empleo como sustratos de espectroscopía SERS. Así, en la primera sección, se describe la síntesis de tres variedades de NPs plasmónicas (oro, plata y cobre) con dimensiones equivalentes (dc ≈ 15 nm) y su transferencia desde una fase de disolvente orgánico al agua mediante el recubrimiento de la superficie con una capa de polímero anfifílico (poli(isobutileno-alt-anhídrido maleico)-injerto-dodecilo, PMA). Se evalúa a continuación cómo la co-exposición de las NPs plasmónicas afectó a sus propiedades ópticas y a la degradación a lo largo del tiempo, eliminándose así la influencia del tamaño y la química superficial de las NPs para centrarse exclusivamente en el efecto del material. Esta sección Aitor Álvarez Lorenzo 102 forma parte de un estudio más amplio que busca comprender cómo la co-exposición de estas NPs influye en la toxicidad, aunque este aspecto no se aborda en esta tesis. La segunda sección se enfoca en la síntesis de AuNR y el análisis del impacto de su funcionalización con PEG en la dinámica de la corona proteica en medios biológicos antes y después de la irradiación con luz. En este trabajo, se investigó la interacción de diferentes AuNRs PEGilados con diversas cargas superficiales con la proteína albúmina sérica bovina (BSA) antes y después de la irradiación láser en el rango del infrarrojo cercano (NIR). La última sección aborda el recubrimiento de nanovarillas y nanoestrellas de Au con ZIF8. Para evitar la degradación en medios acuosos, los NC se recubrieron con PMA. Según las aplicaciones se puedes crecer capas de ZIF-8 de diferente grosor. Finalmente, se exploró el uso de NC compuestos por agregados de AuNS recubiertos con ZIF-8 como sustratos SERS. 3.2. SÍNTESIS, FUNCIONALIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE AUNP, PLATA, COBRE Y SUS MEZCLAS Se llevó a cabo la síntesis de NPs esféricas plasmónicas de oro (AuNPs), plata (AgNPs) y cobre (CuNPs) hidrofóbicas. Posteriormente, fueron transferidas a fase acuosa, recubriendo su superficie con una capa de PMA. El PMA es un polímero anfifílico que presenta un esqueleto hidrofílico y ancla cadenas de dodecilamina (DDA) hidrofóbicas (su síntesis se describe en el apartado 2.2.23.a). Se utilizó una proporción de 4000, 300 y 300 monómeros.nm-2 para las AuNPs, AgNPs y CuNPs, respectivamente. Sobre las NPs dispersas en fase orgánica, se adicionó el PMA disuelto en cloroformo, se secó y se hidrolizaron los anillos maleicos del esqueleto del polímero con una solución básica (NaOH 0.1 M). Como resultado se obtuvieron NPs revestidas con PMA que presentaron sobre la superficie grupos carboxílico cargando negativamente la superficie, lo que confirió estabilidad a las NPs en medios acuosos. Tras el revestimiento, fue necesario centrifugar las muestras para purificar las NP y eliminar las micelas de PMA libres formadas debido a la utilización de un exceso de polímero. Por último, se estudiaron las propiedades ópticas y estabilidades de las dispersiones acuosas de estas NP y sus mezclas. Las AuNPs se sintetizaron en agua siguiendo una modificación del método de Turkevich136, a partir de la reducción de ácido cloroáurico (HAuCl4) con citrato de sodio a la temperatura de ebullición del agua (2.2.2). Las AuNPs sintetizadas presentaron buena monodispersidad con un diámetro medio de 13.7 ± 1.6 nm obtenido a partir del análisis de imágenes de TEM de ca. 300 NPs (Figura 14, A). Tras la síntesis, las partículas se transfirieron a cloroformo (protocolo descrito en el apartado 2.2.23.h), mediante un proceso de intercambio de ligandos en el que los citratos fisisorbidos sobre la superficie del Au fueron sustituidos por moléculas de PEG. Las AuNPs fueron de nuevo transferidas a medio acuoso recubriéndolas con PMA (protocolo descrito en el apartado 2.2.23.d). Las AuNPs@PMA presentaron estabilidad coloidal con un diámetro hidrodinámico en número medio de 18.1 ± 3.1 nm y su LSPR se ubicó en SPR= 524 nm (Figura 14, C-D). NPs plasmónicas y su funcionalización 103 Figura 14: Imagen de TEM representativa de las AuNPs (A). Representación de los histogramas de frecuencia de tamaño correspondientes a la distribución numérica N (N = 300) del diámetro de los AuNP (dc) según lo determinado a partir del análisis de imágenes TEM (B). Espectro de absorción UV-Vis de las AuNPs@PMA que muestra su pico de resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR) en λ = 524 nm (C). Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número obtenido por DLS de las AuNPs@PMA (D). Las AgNPs fueron sintetizadas siguiendo un método de descomposición térmica de AgNO3 disuelto en OLAM (protocolo 2.2.10). Las AgNPs obtenidas presentaron un diámetro medio de 13.2 ± 1.7 nm obtenido a partir de la medida de 300 NP en las imágenes de TEM (Figura 15, A). Tras la síntesis, se funcionalizaron con PMA (siguiendo el protocolo descrito en el apartado 2.2.23.d) para transferirlas a agua. Las AgNPs@PMA presentaron estabilidad coloidal con un diámetro hidrodinámico en número medio de 15.7 ± 1.8 nm y su LSPR se ubicó en SPR= 402 nm (Figura 15, C-D). 400 600 800 0.0 0.1 0.2 0.3  / nm A 10-1 100101102103104 0 10 20 30 dh(N) / nm N / % A D C B Aitor Álvarez Lorenzo 104 Figura 15: Imagen de TEM representativa de los AgNPs (A). Representación de los histogramas de frecuencia de tamaño correspondientes a la distribución numérica N (N = 300) del diámetro de los AgNP según lo determinado a partir del análisis de imágenes TEM (B). Espectro de absorción UV-Vis de las AgNPs@PMA que muestra su pico de resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR) en λ = 402 nm (C). Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número obtenido por DLS de las AgNPs@PMA (D). Las CuNPs fueron sintetizadas por descomposición térmica de acetilacetonato de cobre (II) en OLAM (protocolo 2.2.11). Se sintetizaron CuNPs con un tamaño medio de 15.7 ± 2.6 nm de diámetro, según el análisis de imágenes obtenidas mediante SEM (Figura 16, A). Tras el recubrimiento con PMA el diámetro hidrodinámico en número medio fue de 25.3 ± 3.0 nm y su resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR, del inglés Localized Surface Plasmon Resonance) se ubicó en SPR= 578 nm (Figura 16, C-D). 400 600 800 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8  / nm A 10-1 100101102103104 0 10 20 dh(N) / nm N / % C D A B NPs plasmónicas y su funcionalización 105 Figura 16: Imagen de SEM representativa de los CuNPs (A). Representación de los histogramas de frecuencia de tamaño correspondientes de la distribución numérica N (N = 300) del diámetro de las CuNPs según lo determinado a partir del análisis de imágenes SEM (B). Espectro de absorción UV-Vis de las CuNPs@PMA que muestra su pico de resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR) en λ = 578 nm (C). Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número obtenido por DLS de las CuNPs@PMA (D). 3.2.1. Estudio de la degradación de NPs metálicas y sus mezclas. Se estudió la estabilidad de NPs plasmónicas y sus combinaciones a través de la medición de espectros UV-Vis y concentraciones por ICP durante un período de 72 h a 37 °C en agua. Este análisis se inscribió en el marco de una investigación más extensa que no se abordó en esta tesis doctoral, en la cual se pretende determinar si la exposición simultánea a diversas NPs plasmónicas podría generar una citotoxicidad incrementada debido a la degradación acelerada de las CuNPs. Para examinar las propiedades ópticas de las mezclas de NPs, se emplearon dispersiones equimolares de AuNPs y CuNPs a una concentración de 0.2 nM. En el caso de las AgNPs, se utilizó una concentración cuatro veces menor (0.05 nM), ya que el coeficiente de extinción de la LSPR de las AgNPs es significativamente más alto en comparación con el de AuNPs y CuNPs. Por consiguiente, fue necesario trabajar con una menor concentración de AgNPs para realizar una comparación adecuada entre los tres espectros analizados. 400 600 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4  / nm A 10-1 100101102103104 0 10 20 30 dh(N) / nm N / % B C D A Aitor Álvarez Lorenzo 112 Figura 22: Espectros de absorción UV-Vis de AuNRs-CTAB (línea verde), AuNRs@PEG+ (línea roja), AuNRs@PEG- (línea azul) y AuNRs@PEG0 (línea negra) que muestra el pico de resonancia de plasmón superficial localidad (LSPR) en λ ≈ 780 nm (A). Potenciales ζ de los AuNRs: AuNRs@PEG+(ζ = 19,9±5,3 mV) (B); AuNRs@PEG- (ζ = -21,1±9,1 mV) (C); AuNRs@PEG0 (ζ = 3,6±4,0 mV) (D). Comparación del potencial ζ de diferentes muestras AuNRs@PEG@BSA, PEG+ (rojo), PEG-(azul) y PEG0(negro) normalizados a la unidad (E). Comparación del potencial ζ de los AuNRs@PEG+ (rojo), AuNRs@PEG-(azul) y AuNRs@PEG0(negro), en presencia (barras sin relleno) y ausencia de BSA (barras con relleno) (F). A continuación, los AuNRs funcionalizados se utilizaron para estudiar el efecto del calentamiento plasmónico sobre la dinámica de las proteínas de la biocorona formada alrededor de los AuNRs@PEG. La albúmina fue la proteína elegida como modelo (BSA, Figura 23, A), ya que es la proteína más abundante en la sangre. A pesar de que la interacción entre la BSA y las NPs es débil, debido a su abundancia en la sangre, se produce la asociación de la BSA con la superficie de las NP. -20 0 20 mV A B C D E F NPs plasmónicas y su funcionalización 113 Figura 23: Representación esquemática de la estructura de BSA con los residuos de aminoácidos cargados positivamente coloreados en azul y los residuos de aminoácidos cargados negativamente coloreados en rojo (software Pymol®)139 (A). Migración de los AuNRs PEGilados con diferentes cantidades de BSA adsorbidas en su superficie. La movilidad electroforética relativa del complejo AuNRs@BSA se calcula como la distancia que ha migrado cada banda correspondiente de AuNRs@BSA normalizada por la distancia del control AuNRs (sin proteína) (B) Para ello, se midió la movilidad electroforética de los AuNRs incubados con concentraciones crecientes de BSA para estudiar la interacción de la proteína con la superficie de los AuNRs@PEG. La movilidad electroforética depende de la carga superficial, número de moléculas de BSA que interaccionen con la superficie de los AuNRs y la fuerza de la interacción de las uniones AuNRs-BSA. Así, los AuNRs@PEG+ presentaron una movilidad electroforética mayor en comparación con los PEGilados con carga negativa y neutros (Figura 23, B). Como consecuencia, el potencial ζ de las muestras incubadas con BSA fue -5.5 ± 5.6, - 14.9 ± 8.2 y -11.0 ± 4.1 mV (Figura 22, E y F) correspondiente a las muestras PEGiladas con carga positiva, negativa y neutra, respectivamente. Todos los AuNRs funcionalizados presentaron carga negativa tras la incubación con BSA debido a la formación de la corona proteica. Los resultados de calorimetría de valorización isotérmica mostraron una unión más fuerte entre la BSA y los AuNRs PEGilados con carga positiva y negativa en comparación con los de carga neutra. La fuerza de las interacciones entre los AuNRs y la BSA siguió el siguiente orden de mayor a menor: PEGilados con carga positiva < PEGilados con carga negativa < PEGilados con carga neutra. Además, se observó una clara dependencia de la constante de disociación de unión con la carga superficial de los AuNRs, presentando constantes de disociación (K) de 4.22 x 10-6, 3.51 x 10-6 y 2.81 x 10-6 M-1 ( A B Aitor Álvarez Lorenzo 114 Tabla 5) para las partículas PEGiladas con carga positiva, negativa y neutra, respectivamente. Esto pudo deberse a que, aunque la PEGilación reduce la afinidad de los AuNRs a las proteínas, la carga final de la superficie afecta a la cantidad de proteína adsorbida. Tabla 5: Parámetros termodinámicos de la interacción entre BSA-AuNR PEGilados a 25 °C calculados a partir del ajuste de los datos de calorimetría de valorización isotérmica utilizando un modelo basado en un único conjunto de sitios de unión de proteínas idénticos. Muestra K 10-6 / M-1 ΔH / KJmol-1 ΔS / KJmol-1 ΔG / KJmol-1 Neutral 2.81 -84.7 -0.18 -31.6 Negativo 3.51 -308.8 -0.93 -31.1 Positivo 4.22 -552 -1.75 -30.6 Por último, se investigó la internalización de los AuNRs@BSA en células HeLa, tanto en ausencia como en presencia de irradiación lumínica en el NIR. Resultados previos, como los obtenidos por S. Suslick et al.140 han señalado que a pesar de que la irradiación láser tiene efectos mínimos en la carga superficial total de la corona proteica, el calentamiento plasmónico ocasiona cambios significativos en la composición de dicha corona proteica. Este mismo patrón se observó en los resultados obtenidos en el presente trabajo. Los cambios en la corona proteica podrían tener implicaciones en la absorción de las AuNRs y en su potencial efecto biológico. Mientras que el enfoque de Suslick et al. se centró en el efecto de la temperatura resultante del calentamiento plasmónico sobre la corona de proteínas, en este estudio se investigó cómo estos cambios en la corona proteica pueden afectar a la internalización de las AuNRs en células HeLa. A diferencia de los estudios previos, en este caso se consideró el efecto de la carga del PEG en la adsorción de las proteínas. Se observó, en concordancia con estudios previos,140-141 que la internalización de las muestras PEGiladas fue baja en comparación con la internalización de los AuNRs no PEGilados (Figura 24, A). La internalización de los AuNRs PEGilados por las células fue reducida debido a las propiedades de sigilo que les confiere la capa de PEG, haciéndose más acentuada la reducción debido a la corona de BSA preformada (Figura 24, B). Para estudiar el efecto del calentamiento fototérmico en la internalización tras la irradiación con láser (λ = 805 nm, potencia de 4W.cm2 durante 3 min), las muestras se precipitaron y se determinó la cantidad de BSA que permanecía adsorbida sobre la superficie de los AuNRs (descrito en el apartado 2.2.7). La disminución de la BSA adsorbida fue significativa en las muestras PEGiladas con carga positiva y moderada en las muestras con carga negativa y neutra, tanto en PBS como en DMEM (Figura 24, C). Sin embargo, tras el tratamiento fototérmico de los AuNRS recubiertos con BSA, la internalización fue significativamente menor solo en el caso de las muestras no PEGiladas (Figura 24, D). En general, las PEGilaciones con carga superficial diferente afectaron a la formación de la corona de proteínas, especialmente tras el tratamiento fototérmico; sin embargo, estos efectos no afectaron significativamente a la captación celular.141-143 NPs plasmónicas y su funcionalización 115 Figura 24: Interacciones de los AuNRs@BSA PEGilados con células: Internalización celular de AuNRs@BSA en células HeLa después de 3 h de incubación analizada por citometría de flujo. El incremento en la intensidad de fluorescencia media (IFM) para la intensidad de fluorescencia de la fluoresceína (FITC) demuestra la internalización de los AuNRs debido al marcado de la BSA con la sonda fluorescente (A). Internalización celular de AuNRs y AuNRs@BSA en células HeLa después de 18 h de incubación analizada por citometría de flujo. El incremento de IFM de la fluorescencia de la rodamina, demuestra la internalización de los AuNRs marcados con rodamina (B). Experimentos en tubo de ensayo de liberación de BSA desde la superficie de los AuNRs en diferentes medios (tampón PBS y medios de células completas) desencadenada por la irradiación con un láser de 805 nm de longitud de onda, durante 3 min y una potencia de 4 W/cm2 (C). Internalización celular de AuNRs@BSA en células HeLa después de 3 h de incubación analizada por citometría de flujo. Aumento de la IFM de la internalización de AuNRs en células HeLa antes y después de la irradiación con láser. Las barras de error representan la desviación estándar entre tres réplicas. En todos los datos, la significación estadística se evaluó mediante la prueba t: cada muestra se comparó con la muestra sin tratamiento (ns, no significativa; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). AuNRs@PEG+ AuNRs@PEGAuNRs@PEG0 AuNRs CTAB 0 1 2 3 4 Incremento de IFM (525/30) AuNRs@PEG+ AuNRs@PEGAuNRs@PEG0 0 1 2 3 4 5 Incremento de IFM (583/26) sin BSA con BSA ***** **** AuNRs@PEG+ AuNRs@PEGAuNRs@PEG0 AuNRs CTAB 0 500 1000 1500 Intensidad de fotoluminiscencia PBS PBS láser DMEM DMEM láser **** **** **** **** **** *** * *** AuNRs@PEG+ AuNRs@PEGAuNRs@PEG0 AuNRs CTAB 0 2 4 6 8 Incremento de IFM (525/30) sin láser con láser ns ns ns **** D C A B Aitor Álvarez Lorenzo 116 3.3.2. Encapsulado en ZIF-8 de AuNR (AuNR@ZIF-8) Los AuNRs estabilizados por CTAB se recubrieron con una capa de ZIF-8 siguiendo el procedimiento descrito en los métodos (2.2.17) formando un nanocompuesto (NC) con una estructura tipo núcleo-caparazón en la que el AuNR ocupó el centro del ZIF-8. La síntesis del NC implicó la adición de los AuNRs dispersos en una solución de CTAB sobre los precursores del ZIF-8. La mezcla se agitó durante 5 min y se dejó reposar durante 3 h, tiempo durante el cual se observó la aparición gradual de turbidez roja, lo que indicó la formación de los NCs. Tras la síntesis y purificación de los AuNR@ZIF-8, estos se redispersaron en 100 µl de MeOH (Figura 25). Figura 25: Esquema representativo de la síntesis de AuNR@ZIF-8. En este caso se utilizaron diferentes concentraciones de CTAB durante la síntesis: 0,2; 0,4; 0,6 y 0,8 g.l-1 y se analizó su influencia en la morfología de los NCs mediante SEM. A concentraciones altas de CTAB (≥ 0,6 g.l-1), se produjeron ZIF-8 con dos morfologías y tamaños: Por un lado, se encontraron ZIF-8 cúbicos sin encapsulamiento de NPs, y, por otro lado, se encontraron ZIF-8 amorfos de tamaño reducido que contienen AuNRs encapsulados, estando la mayoría de los ZIF-8 vacíos. Por el contrario, las imágenes de SEM mostraron que tanto las muestras de NCs sintetizados utilizando concentraciones de CTAB de 0,2 como de 0,4 g.l-1 no presentaron ZIF-8 vacíos. Para la medición del tamaño promedio de los NC se utilizó el software ImageJ para dibujar círculos alrededor de, al menos, 50 NC y medir su diámetro, considerando este valor como el tamaño de cada NC debido a la forma irregular de los cubos. Así, se obtuvieron tamaños medios de 169 ± 13 nm y 160 ± 8 nm para las concentraciones de 0,2 y 0,4 g.l-1 de CTAB, respectivamente. NPs plasmónicas y su funcionalización 117 Figura 26: Imágenes de SEM con detector InLens a 5 kV, representativa de las AuNR@ZIF-8 utilizando diferentes concentraciones de CTAB durante la síntesis: 0,2 g.l-1(A), 0,4 g.l-1(D); 0,6 g.l-1 (G) y 0,8 g.l-1 (H). imágenes de SEM obtenidas con detector As y representaciones correspondientes de los histogramas de frecuencia del tamaño del diámetro medio del círculo que rodea una partícula AuNR@ZIF-8, obtenidos a partir de la medida de 50 AuNR@ZIF-8, utilizando diferentes concentraciones de CTAB: 0,16 g.l-1 (B,C) y 0,4 g.l-1 (E,F). Por otra parte, se estudió la influencia del proceso de lavado en la estabilidad de los NCs sintetizados a concentraciones de 0,2 y 0,4 g.l-1 de CTAB. Para ello, se llevaron a cabo diferentes tipos de lavado con distintos agentes dispersantes, tales como agua, MeOH y PSF. En particular, se evaluaron las siguientes combinaciones de lavado y redispersión: lavado con MeOH seguido de redispersión en MeOH (MeOH/MeOH), lavado con MeOH y redispersión en agua (MeOH/H2O), lavado y redispersión en agua (H2O/H2O), lavado con MeOH y redispersión en PSF (MeOH/PSF), lavado con agua y redispersión en PSF (H2O/PSF), y finalmente, lavado y redispersión con PSF (PSF/PSF). A B C D G H E F Aitor Álvarez Lorenzo 118 Figura 27: Tamaño hidrodinámico promediado en número medido a lo largo de 144 h (escala Log2) con DLS de los AuNR@ZIF-8 utilizando diferentes lavados y sintetizados en presencia de 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1(B) de CTAB. Los lavados marcados (*) indica que en la siguiente medida los AuNR@ZIF-8 se agregaron. Para evaluar la estabilidad de los NCs sintetizados, se empleó el DLS para medir la evolución del tamaño hidrodinámico en número medio en diferentes instantes temporales posteriores a la síntesis, específicamente a las 1, 5, 24 y 144 h. Los resultados obtenidos mostraron que, tras 5 h de la síntesis, los AuNR@ZIF-8 redispersos en agua experimentaron una significativa reducción en su tamaño hidrodinámico, y que la degradación continuó a lo largo del tiempo (Figura 27, Tabla 6). En relación a la estabilidad del ZIF-8 en medios acuosos, existen discrepancias en la literatura científica. En contraposición a los hallazgos presentados en este capítulo, diversos estudios han confirmado la estabilidad del ZIF-8 en condiciones acuosas. Yaghi et al.,98 por ejemplo, fueron los primeros en reportar que el ZIF-8 preservaba su estructura cristalina y porosidad tanto en agua a temperatura ambiente como en agua en ebullición. Esta estabilidad fue atribuida a la naturaleza hidrofóbica del ZIF-8 y a la fuerte unión coordinativa entre el zinc y el nitrógeno presente en los ligandos de imidazol. Además, se ha documentado que la estructura cristalina del ZIF-8 permanece inalterada después de la adsorción de diversos compuestos, como el benzotriazol,144 ácido ftálico y ftalato de dietilo,145 y furfural,146 en soluciones acuosas. Incluso se ha observado que el ZIF-8 puede mantener su estabilidad en agua de mar durante 15 días.147 Por otro lado, y en concordancia con lo que se presenta en este capítulo, numerosos estudios sostienen que el ZIF-8 no es estable en condiciones acuosas.148-150 La síntesis del ZIF-8 se realiza en agua, y la estructura es estable hasta que se lava el ZIF-8 y se dispersa en agua. Esta observación concuerda con los resultados publicados por Y.S. Lin,149 quien propone que la estabilidad del ZIF-8 depende de la concentración de imidazolato, el cual, en nuestro caso, está presente en exceso en la solución acuosa previa al lavado. Además, se ha observado que la estabilidad en agua es independientemente del tamaño de los cristales de ZIF-8 y de los métodos de preparación.151 0.5 2 8 32 128 0 100 200 Log2 t / h dh / nm * 0.5 2 8 32 128 0 100 200 Log2 t / h dh / nm MeOH/MeOH MeOH/H2O H2O/H2O * * 0.5 2 8 32 128 0 100 200 Log2 t / h dh / nm * 0.5 2 8 32 128 0 100 200 Log2 t / h dh / nm MeOH/MeOH MeOH/H2O H2O/H2O * * A B NPs plasmónicas y su funcionalización 119 Tabla 6: Tamaño hidrodinámico promediada en número medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8 lavados con diferentes fases dispersantes y redispersados en H2O, sintetizados con 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1 (B) de CTAB. Tamaño hidrodinámico / nm H2O/H2O MeOH/H2O CTAB / g.l-1 t / h 0,2 0,4 0,2 0,4 0 183 ± 3 143 ± 6 187 ± 8 154 ± 6 1 184 ± 9 151 ± 3 176 ± 9 152 ± 8 5 167 ± 7 126 ± 7 149 ± 12 145 ± 11 24 81 ± 42 32 ± 18 137 ± 9 111 ± 21 144 626 ± 494.4 93 ± 107 34 ± 6 1026 ± 395 Tabla 7: Tamaño hidrodinámico promediada en número medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8 lavados con diferentes fases dispersantes y redispersados en PSF, sintetizados con 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1 (B) de CTAB. Tamaño hidrodinámico / nm MeOH/PSF H2O/PSF PSF/PSF CTAB / g.l-1 t / h 0,2 0,4 0,2 0,4 0,2 0,4 0 1,7 ± 0,8 1,8 ± 0,7 2,2 ± 0,9 3,9 ± 1,7 2,5 ± 1,2 2,6 ± 1,2 1 1,8 ± 0,7 2,3 ± 0,8 2 ± 0,6 2,3 ± 0,5 3,1 ± 1,9 3,2 ± 1,9 5 1,8 ± 0,4 2,3 ± 0,1 1,4 ± 0,4 5,4 ± 3,2 3,4 ± 1,7 2,1 ± 0,1 24 2,1 ± 0,4 1,4 ± 0,4 1,6 ± 0,1 1,8 ± 0,3 9,0 ± 8,7 1,6 ± 0,3 144 1,7 ± 0,1 1,7 ± 0,3 1,5 ± 0,1 1,1 ± 0,4 22,3 ±96 1,8 ± 0,4 Tabla 8: Tamaño hidrodinámico promediada en número medido a lo largo de 144 h con DLS de los AuNR@ZIF-8 lavados con MeOH y redispersados en MeOH, sintetizados con 0,2 g.l-1 (A) y 0,4 g.l-1 (B) de CTAB. Tamaño hidrodinámico / nm MeOH/MeOH CTAB / g.l-1 t / h 0,2 0,4 0 188 ± 2 158 ± 2 1 186 ± 2 162 ± 2 5 186 ± 2 164 ± 1 24 198 ± 4 165 ± 2 144 194 ± 4 161 ± 2 Los resultados obtenidos para los NCs redispersos en PSF (Tabla 7) indicaron que estos no poseen estabilidad en dicho medio. La observación de valores tan reducidos en el tamaño hidrodinámico sugiere que los NCs experimentaron agregación y precipitación, lo que justifica dichos valores bajos. En contraposición, los NCs lavados y redispersados con MeOH (Figura Aitor Álvarez Lorenzo 120 27, Tabla 8) presentaron un comportamiento estable durante al menos 144 horas después de la síntesis. Así, a partir de las imágenes de SEM se confirmó que los NCs no eran estables en PSF, rompiéndose en cuanto eran redispersados (Figura 28, A, B y C). Sin embargo, cuando se redispersaron en agua se apreció una conservación de la morfología, aunque los análisis realizados mediante DLS revelaron un proceso de degradación con el tiempo. Por otra parte, para los NCs lavados y redispersados en MeOH, no se apreciaron signos de deterioro, lo que sugirió una mayor estabilidad en este medio (Figura 28, F). Figura 28: Imágenes de SEM con detector SE2 a 5 kV, representativas de las AuNR@ZIF-8 redispersados en PSF y lavados con MeOH (A), H2O (B) y PSF (C); redispersados en H2O y lavados con H2O (D) y MeOH (E); lavados y redispersados en MeOH (F). Como se ha mostrado previamente, el ZIF-8 es estable en MeOH pero sufre degradación en medios acuosos. Con el fin de prevenir el contacto del ZIF-8 con el agua y, por lo tanto, asegurar su estabilidad en medios acuosos, los NC se recubrieron con un polímero anfifílico, PMA (Figura 29). El proceso de síntesis del PMA (2.2.23.a) y el protocolo de recubrimiento se describen en detalle en los métodos (2.2.23.d). La Figura 30 muestra un esquema representativo del recubrimiento con PMA. A B C E F D NPs plasmónicas y su funcionalización 121 Figura 29: Esquema representativo de la reacción de 20 mmoles de poli(isobutilen-altmaleico anhídrido) y 15 mmoles de MeOH dando lugar al PMA, polímero anfifílico formado por un esqueleto hidrofílico (rojo) al que se anclan cadenas hidrofóbicas de MeOH (azul). La optimización del recubrimiento con PMA se basó en lograr la estabilidad coloidal de los NCs@PMA en medios acuosos utilizando la cantidad mínima de PMA para evitar la formación de un exceso de micelas poliméricas libres. Este enfoque permitió el desarrollo de una estrategia efectiva para recubrir los NC con PMA, lo que resultó en una protección efectiva contra la degradación en medios acuosos. No obstante, el proceso de recubrimiento de los NCs con PMA requirió conocer previamente la concentración de los NCs, considerando que por cada NP iba a crecer un NC. Dado que en cada síntesis se utilizó 1 ml de una dispersión de 2 nM de AuNRs, y que, tras la purificación los NCs se llevaron a un volumen final de 100 µl de MeOH, esto dió como resultado una concentración final de NCs 20 nM. En el proceso de recubrimiento con PMA, se utilizó una relación de 600 monómeros de PMA por cada nm² de superficie de ZIF-8. Esta cantidad de monómeros se consideró suficientemente elevada para lograr la estabilización deseada de los ZIF-8, evitando así la presencia de un exceso de polímero libre tras el proceso de recubrimiento. Figura 30: Esquema representativo de la funcionalización de los AuNR@ZIF-8 con PMA. Aitor Álvarez Lorenzo 128 3.3.4. Desarrollo de un nanocompuesto AuNS@ZIF-8 como sustrato SERS A continuación, se estudió la aplicación de los NCs como sustratos para espectroscopía de Raman mejorada por superficie (SERS). En particular, se emplearon NCs formados por agregados de AuNSs recubiertos con una capa de ZIF-8, sintetizados siguiendo el procedimiento detallado en la sección de métodos (2.2.19). Posteriormente, se aplicó una capa de PMA sobre los NCs para estabilizarlos en soluciones acuosas, de acuerdo con lo descrito en la sección de metodología (2.2.23.d). Desplazamiento Raman / cm-1 Modo 1075 Vibración de tensión C-S 1582 Vibración de tensión C=C Desplazamiento Raman / cm-1 Modo 1200 Fruncimiento del anillo de xanteno 1281 Estiramiento Puente C-C 1358 Flexión C-H 1508 Flexión C-C anillo aromático 1531 Flexión anillo aromático C-H 1651 Estiramiento C-O Figura 36: Imagen de SEM a 20 kV, representativa de las AuNS@ZIF-8 con detector SE2 (A) y AsB (B). Estructura del 4-MBA y sus señales Raman más intensas (C). Estructura de RoB y sus señales Raman más intensas (D). A B C D NPs plasmónicas y su funcionalización 129 Se seleccionaron el 4-MBA y la RoB como compuestos prueba Raman. La Figura 36 C y D, muestran las estructuras moleculares del 4-MBA y RoB, así como las bandas Raman más intensas correspondientes a cada compuesto. Figura 37: Espectros Raman del 4-MBA medido en una dispersión acuosa de NC a 0,1 nM y una concentración de 4-MBA de 10-5 M comparado con el espectro del 4-MBA en agua y el tapón de polipropileno sobre el que se realizan las medidas (A). Espectro Raman de la RoB medido en una dispersión acuosa de NC a 0,1 nM y una concentración de RoB de 10 -3 M comparado con el espectro de la RoB en agua junto con el tapón de sobre el que se realizan las medidas (B). Espectros Raman del 4-MBA medidos en dispersiones acuosa de NC: a 0,1 nM y una concentración de 4-MBA de 10-5 M a diferentes números de adquisiciones (C), a diferentes concentraciones de NC y 30 acumulaciones (D). Todos los espectros fueron adquiridos utilizando un láser de 785 nm a una potencia láser de 60 mW y 0,5 s de tiempo de integración. A B C D Aitor Álvarez Lorenzo 130 Así, se prepararon suspensiones acuosas de los NCs con agregados de AuNSs en su interior a una concentración de 0,1 nM y diferentes concentraciones de 4-MBA y RoB (en el apartado 2.2.20 describe la preparación de las muestras para medir en el Raman). Estas suspensiones se agitaron durante una noche para permitir que las moléculas difundiesen a través de los canales porosos del ZIF-8, hasta alcanzar el núcleo del NC, donde estaban inmovilizadas la AuNSs. Las concentraciones de pruebas Raman utilizadas fueron 10-3 y 10-5 M. En el caso de la RoB se detectó señal a concentraciones de 10-3 M; sin embargo, no se detectó señal a 10-5 M. En el caso del 4-MBA se detectó señal a ambas concentraciones. Posteriormente, se repitieron las medidas a concentraciones de 10-3 M en el caso de la RoB y 10-5 M en el caso del 4-MBA, pero en ausencia de NCs, sin detectarse señal en ningún caso (Figura 37). Esto indicó que solo era posible detectar estas moléculas a estas concentraciones en presencia de NCs dispersos, lo que implicó que las moléculas podían difundir a través de los poros del ZIF-8 hasta alcanzar el núcleo del NC, entrando en contacto con las AuNSs y produciéndose, al irradiar la muestras con el láser, el aumento de la señal Raman. Al aumentar el número de acumulaciones a 30 s, aumentó significativamente la intensidad de la señal Raman, aunque esto implicó un aumento considerable en el tiempo de adquisición (Figura 37, C). Por otro lado, también se observó un aumento significativo en la intensidad Raman al aumentar la concentración de NCs de 0,1 a 0,25 nM; sin embargo, no se observó un aumento significativo adicional en la intensidad de la señal Raman al aumentar la concentración de NCs hasta 0,5 nM (Figura 37, D). A continuación, se estudia la evolución del espectro Raman del 4-MBA en función del tiempo permitido para la encapsulación de la sonda. A partir de una dispersión de NC a una concentración de 0,1 nM con 4-MBA disuelto a una concentración de 10-5 M, se toman alícuotas a diferentes tiempos, desde 0 hasta los 240 min y se mide el espectro Raman bajo las mismas condiciones. Se observa que 15 min después de la preparación de la mezcla ya se detectan las señales del 4-MBA. La intensidad de las señales va en aumento hasta los 60 min, momento a partir el cual, la señal permanece invariable (Figura 39). Por último, se procedió a realizar mediciones de los espectros Raman para diferentes concentraciones de 4-MBA utilizando los NCs como sustratos. Con la finalidad de garantizar una carga máxima, se estableció un tiempo de carga de 120 min. Las mediciones fueron realizadas utilizando el láser de 785 nm, con una potencia de 60 mW, 10 acumulaciones, 0,5 s de integración y una concentración de NCs de 0,25 nM. Se midieron concentraciones que oscilaron entre 10-5 M y 10-7 M, evidenciándose que la disminución de la concentración de 4MBA se correlacionó con una disminución en la intensidad de la señal Raman. Además, se mantuvo una relación lineal entre la intensidad del pico a 1074 cm-1 y la concentración entre 10-6 y 10-5 M. Es importante destacar que, incluso a las concentraciones más reducidas (10-7 M), se continuó detectando la señal Raman del 4-MBA. En la literatura científica existen diversos ejemplos de sustratos para SERS que combinan el uso de ZIF-8 con NPs plasmónicas. Un ejemplo de ello es el trabajo de Hai et al. quienes desarrollaron un material compuesto por NPs de oro y plata inmovilizadas sobre una superficie de vidrio y recubiertas con ZIF-8.153 Este sustrato presenta una alta estabilidad y sensibilidad, lo que le permite evitar la agregación excesiva de las NPs y lograr una rápida determinación de carbendazim, un fungicida sistémico que induce efectos tóxicos agudos en humanos y es un importante contaminante detectable en alimentos, suelos y agua.154 Este sustrato ha demostrado ser capaz de detectar el carbendazim en muestras de agua de mar, con un límite de detección NPs plasmónicas y su funcionalización 131 (LOD) de 0,2 μg.kg−1 y un rango de detección lineal amplio entre 10−9 y 10−5 M. En relación a la detección del 4-MBA, se han reportado sustratos SERS basados en nanoestrellas de tipo núcleo-capa de oro-plata recubiertas de sílice conjugados con anticuerpos,155 que permiten la detección lineal de este compuesto a concentraciones que van desde 1.9 x 10-5 M hasta 1.9 x 10-11 M de 4-MBA, En otro trabajo, R. Alvarez-Puebla et al.156 diseñaron un nanocompuesto compuesto por AuNS individuales encapsuladas en ZIF-8, formando estructuras conocidas como "cáscaras de yema huecas", diseñadas específicamente para la detección por espectroscopía Raman de realce superficial (SERS). Los autores destacan que el principal beneficio de estas estructuras radica en el amplio volumen existente entre el núcleo plasmónico y la cáscara de ZIF-8, que puede utilizarse para la acumulación óptica, la catálisis o el almacenamiento de medicamentos. Adicionalmente, esta singular estructura ofrece una mejora significativa en la estabilidad coloidal y la capacidad de tamizar moléculas en función de su tamaño o carga. Aunque los autores sostienen que la cubierta de ZIF-8 es estable en agua, es importante destacar que, como se evidencia en este capítulo y la literatura cinetífica148-151, la cobertura de ZIF-8 no es estable en entornos acuosos a menos que se proteja con una capa polimérica. El sustrato diseñado se sometió a diferentes pruebas para la detección de cuatro analitos, siendo el 4-MBA uno de los evaluados. Los sustratos se cargaron durante 30 min en disoluciones de diferentes concentraciones, logrando detectar el 4-MBA a una concentración de 10-7 M, que es la misma concentración detectable con los sustratos descritos en esta sección. Comparados con otros sustratos SERS previamente documentados en la literatura científica, los resultados obtenidos mediante los NCs presentados en este capítulo podrían ser considerados modestos. En efecto, mientras que el nanocompuesto descrito en este estudio exhibe un rango de detección lineal de hasta 10−6 M para 4-MBA, se han citado sustratos SERS capaces de alcanzar niveles de detección hasta de 1.9 x 10-11 M. No obstante, es crucial destacar que el objetivo principal de este experimento es demostrar la viabilidad de emplear este tipo de nanocompuestos para la detección mediante SERS. A este respecto, es claro que existe un amplio margen para mejorar su rendimiento y optimizar los límites de detección y cuantificación alcanzados. Además, los NCs aquí desarrollados presentan una ventaja significativa en términos de estabilidad coloidal, a diferencia de la mayoría de los sustratos SERS que utilizan ZIF-8 descritos en estudios anteriores. Aitor Álvarez Lorenzo 132 Figura 38: Espectros Raman del 4-MBA medidos en dispersiones acuosas de NC a 0,25 nM a diferentes concentraciones de 4-MBA (A) y detalle del espectro de la sonda entre 1040 y 1110 cm-1 (B). Correlación entre la concentración de 4-MBA y la intensidad de la señal Raman a 1074 cm-1). Los puntos se ajustaron mediante un análisis de regresión lineal (y = 6,2 × 107 x + 98,3, r2 = 0,999) (C). Todos los espectros fueron adquiridos utilizando un láser de 785 nm a una potencia de 60 mW, 10 acumulaciones y 0,5 s de tiempo de integración. A B C NPs plasmónicas y su funcionalización 133 Figura 39: Evolución de los espectros Raman de 4-MBA en función del tiempo de encapsulación medidos en una dispersión acuosa de NC a 0,25 nM y una concentración de 4-MBA de 10-5 M. Todos los espectros fueron adquiridos utilizando un láser de 785 nm a una potencia de 60 mW, 10 acumulaciones y 0,5 s de tiempo de integración. Capítulo 4 Aitor Álvarez Lorenzo 136 4. MNPS Y SU FUNCIONALIZACIÓN 4.1. INTRODUCCIÓN La utilización de NPs como vehículos para la administración de fármacos representa una estrategia novedosa y prometedora en el campo de la farmacología, con el potencial de optimizar la eficacia terapéutica y mitigar los efectos secundarios asociados con los tratamientos farmacológicos convencionales.157-158 Esta técnica se basa en la capacidad de las NPs para encapsular agentes farmacológicos y liberarlos de manera controlada en objetivos terapéuticos específicos, tales como tumores o células en estado inflamatorio. Asimismo, las NPs ofrecen la ventaja adicional de conferir protección al fármaco frente a procesos de degradación o metabolización prematura, lo cual contribuye a una liberación más prolongada y sostenida del compuesto activo en el organismo.159 Las NPs destinadas a la administración de fármacos pueden ser elaboradas a partir de una diversidad de materiales, incluyendo polímeros, lípidos y metales. La posibilidad de manipulación a escala nanométrica permite diseñar estas partículas con una amplia gama de tamaños, formas y propiedades fisicoquímicas. Estas características pueden ser utilizadas para controlar la velocidad y el lugar de liberación del fármaco en el cuerpo.159 Una metodología en el ámbito de la administración de fármacos mediante NPs consiste en la incorporación de estos agentes farmacológicos en nanocompuestos, conformados por una NP plasmónica encapsulada en un MOF. Por ejemplo, el grupo donde he desarrollado esta tesis diseñó recientemente un nanocompuesto que consta de estrellas de oro encapsuladas en ZIF-8 que al ser irradiados con un láser de 808 nm, absorben luz y generan calor, liberando la carga de forma controlada por efecto de la termoforesis.131 No obstante, la principal limitación de estos sistemas radica en la capacidad restringida de penetración de la luz en los tejidos, lo que circunscribe la utilización de estos sistemas a las regiones más superficiales del cuerpo. Con el objetivo de solventar la limitación inherente a la capacidad de penetración de la luz, se pueden emplear MNPs como fuentes generadoras de calor. Estas NPs, al ser sometidas a un AMF de alta frecuencia, producen calor,160 lo que ofrece una estrategia efectiva para abordar las limitaciones de las técnicas basadas en la utilización de la luz. De esta manera, se puede alcanzar un control más eficaz de la liberación de fármacos en regiones más profundas del organismo, lo cual potencialmente expande la gama de aplicaciones de estas tecnologías nanométricas en la administración de fármacos. Este capítulo se compone de dos secciones principales. En la primera, se aborda la síntesis de NPs magnéticas (MNPs) de magnetita estables en medio orgánico y se examina el impacto del dopaje con bajas proporciones de cobalto sobre en sus propiedades magnéticas. La dopación de MNPs con Co se ha asociado con un aumento en la anisotropía magnética, lo cual se refleja en una mayor eficiencia en hipertermia y en el contraste en resonancia magnética en comparación con las nanopartículas de magnetita del mismo tamaño que carecen de cobalto.161 Sin embargo, el uso de estas MNPs dopadas con Co en aplicaciones biomédicas ha generado controversia debido a la toxicidad inherente del cobalto. La literatura científica reporta una toxicidad significativa para las nanopartículas de CoFe2O4 sin recubrimiento.161-162 Para abordar esta problemática, se han investigado recubrimientos utilizando sílice o polímeros, los cuales han demostrado mejorar considerablemente la biocompatibilidad de las MNP dopadas con Co.162 MNPs y su funcionalización 137 En la segunda sección de este capítulo, se detalla el proceso de transferencia de las MNPs a un medio acuoso así como la elaboración de nanocompuestos estables en ambientes acuosos. Estos nanocompuestos se componen de un núcleo de MNP que se encuentra recubierto por una estructura porosa de ZIF-8. Estos nanocompuestos han sido diseñados con el propósito de lograr la liberación controlada de moléculas en el interior de las células, siendo esta activada por estímulos externos tales como campos magnéticos alternos (AMF) o campos magnéticos rotativos (RMF). 4.2. SÍNTESIS, FUNCIONALIZACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LAS MNPS La magnetita (Fe3O4) se caracteriza por su estructura cristalina de espinela cúbica inversa. Esta estructura específica se deriva de una fórmula química de la forma general AB2O4. En el caso de la magnetita, los cationes que ocupan los sitios A y B son iones Fe(II) y Fe(III), respectivamente. Los iones Fe(III) ocupan principalmente las posiciones tetraédricas, mientras que las posiciones octaédricas albergan tanto iones Fe(II) como Fe(III).163 En lo que respecta a sus propiedades magnéticas, la magnetita exhibe un comportamiento ferrimagnético, esto es, los momentos magnéticos de los átomos se alinean en direcciones opuestas, pero con magnitudes diferentes, como se comentó con anterioridad. La magnetita dopada con cobalto (Co) implica la sustitución de iones Fe(II) en las posiciones octaédricas por iones Co(II). Este dopaje altera las propiedades magnéticas de la magnetita. La síntesis de NPs de Fe3O4 se realizó a través de un método denominado termólisis, que implicó la descomposición térmica de un precursor organometálico, específicamente un oleato metálico, disuelto en un disolvente de elevado punto de ebullición, como el ODE. La presencia de un agente tensioactivo orgánico, como el ácido oleico, actuó como estabilizador en el medio orgánico de las MNPs. Este procedimiento ofreció un control meticuloso de la composición y el tamaño de las MNPs. Sin embargo, las partículas resultantes exhibieron valores de saturación magnética relativamente bajos en comparación con el material a escala macroscópica. Esta disminución en la saturación magnética se atribuyó a la formación de fases de wüstita, las cuales muestran propiedades antiferromagnéticas a temperatura ambiente.125 En los protocolos típicos descritos para sintetizar MNPs, comúnmente se emplean gradientes de calentamiento de 3,3 °C.min-1; bajar el gradiente a 1 °C.min-1 evitó el solapamiento entre la fase de nucleación y la de crecimiento de las NPs, resultando en una menor polidispersidad en la distribución del tamaño de las MNPs. Como disolvente se utilizó ODE debido a su elevado punto de ebullición (315 °C a 1013 hPa). A través de la variación de la temperatura final de la síntesis, fue posible controlar el tamaño de las MNPs. A medida que se incrementó la temperatura final, el tamaño de las MNPs también aumentó. Así, temperaturas finales de 305, 310 y 315 °C se correspondieron con tamaños de partícula de 12,2 ± 0,9; 15,5 ± 1,1 y 17,8 ± 1,8 nm, respectivamente. (Figura 40). Este método permitió la síntesis de MNPs esféricas con baja polidispersidad, aunque cabe destacar que el incremento de su tamaño contribuyó a una ligera elevación de la polidispersidad relativa, pasando de un 7,4% en el caso de las NPs de 12,2 ± 0,9 nm hasta el 10,1% en el caso de partículas de 17,8 ± 1,8 nm. Aitor Álvarez Lorenzo 144 hidrodinámico de 22,4 ± 0,9 nm y un PDI de 0,137, indicando una distribución homogénea en tamaño y forma. Además, presentaron un potencial ζ de -27,9 ± 5,6 mV. (Figura 45). Figura 45: Distribución de tamaño hidrodinámico promediada en número, medido con DLS (A) y potencial ζ (B) de las MNPs-PMA-6-AF 4.2.2. Influencia sobre las propiedades magnéticas del dopado con cobalto de NPs de Fe3O4 En esta parte del trabajo, se pretendió investigar la influencia del dopaje con cobalto en las propiedades magnéticas de NPs de magnetita. Para ello, se sintetizaron MNPs de fórmula Co(x)Fe(3-x)O4 (MNPs-Co) de entre 18-20,5 nm mediante la sustitución parcial de los iones Fe2+ en posiciones octaédricas de la estructura de la magnetita con iones Co2+ en diferentes proporciones (x entre 0,01 y 0,6). El protocolo de síntesis de las partículas se describe en el apartado 2.2.12. La correspondencia entre la cantidad de Co teórica añadida durante la síntesis y la determinada en las MNPs dopadas mediante ICP fue adecuada, especialmente en los dopados bajos de Co. Se consideró que el dopaje con sustituciones de Co entre el 1 y el 5% fue prácticamente estequiométrico, como se observa en la Tabla 12. No obstante, a partir de un dopaje igual o superior a 0,10 moles de Co se evidenció que la cantidad de Co detectada en las MNPs era menor que la añadida. Al igual que en el caso de las MNPs de magnetita, estas MNPs tras la síntesis se sometieron a un proceso de recocido de 72 h necesario para que se produjese la oxidación total del Fe y Co, observándose un incremento de la pérdida de histéresis y, por lo tanto, del SAR (Figura 46). Además, las MNPs-Co se funcionalizaron con 600 monómeros de PMA por nm2 para su transferencia a medio acuoso. 1 100 10000 0 5 10 15 20 25 dh(N) / nm N / % -100 0 100 0 1.5×104 3×104 4.5×104  / mV N /  MNPs y su funcionalización 145 Tabla 12: Correspondencia de los moles de Co (x) añadidos con relación a los de Fe y los moles de Co determinados por ICP. X moles de Co añadidos x moles de Co determinados por ICP Co (x) determinado por ICP respecto al añadido / % 0,01 0,01 110 0,02 0,02 95 0,03 0,03 93 0,04 0,04 98 0,05 0,05 100 0,05 0,05 102 0,10 0,08 80 0,10 0,09 90 0,15 0,11 73 0,15 0,12 80 0,15 0,13 87 0,60 0,30 50 Figura 46: Evolución de las curvas de histéresis obtenidas mediante magnetometría a temperatura ambiente a diferentes tiempos de recocido de una muestra dopada con un 20 % de Co2+ respecto al Fe2+(A). Curvas de histéresis medidas a diferentes campos magnéticos aplicados (B). La Figura 47 presenta las curvas de histéresis obtenidas en tolueno antes de la funcionalización con PMA y en agua después de la funcionalización de una muestra de MNPsCo dopadas con una proporción de 10% de Co. Como resultado de este recubrimiento polimérico, el tamaño hidrodinámico de las NPs se incrementó desde 21,5 ± 0,9 nm hasta 26,3 ± 2,3 nm. La magnetización de saturación (Ms), que representa la magnetización máxima que puede alcanzar el material, se mantuvo constante en ambos medios. La coercividad (Hc) se refiere a la resistencia de un material magnético a su desmagnetización. Valores elevados de coercividad indican una mayor resistencia a perder su magnetización. Así, se observa que las MNPs dispersas en tolueno presentaron una coercividad superior a las que se encontraban en fase acuosa. En relación con su alta coercividad, la SAR -30 -15 15 30 -100 -50 50 100 H / kAm-1 M / Am2kg-1 24 h 72 h Sin tratar 48 h -30 -15 15 30 -100 -50 50 100 H / kAm-1 M / Am2kg-1 16 kA/m 24 kA/m 12 kA/m 20 kA/m Aitor Álvarez Lorenzo 146 para las partículas en tolueno fue considerablemente superior a la de las partículas en agua. Este resultado sugiere que las partículas en tolueno tienen una mayor capacidad para absorber energía. La diferente viscosidad de los disolventes es uno de los factores que podría estar contribuyendo a esta diferencia. Como se ha reportado en estudios anteriores,165 los valores de Hc y SAR, a valores bajos de viscosidad, tienden a incrementarse a medida que la viscosidad disminuye. Dado que el tolueno presenta una viscosidad inferior al agua, esto podría explicar la mayor SAR observada para las partículas en tolueno. Disolvente Ms / emug-1 Hc / kAm-1 SAR / Wg-1 Tolueno 95,0 ± 4,2 9,1 ± 0,4 1021,5 ± 11,2 Agua 93,5 ± 9,7 5,8 ± 0,2 608,5 ± 61,4 Figura 47: Curvas de magnetización de una muestra de MNPs dopada con Co (en proporción 0,1) medidas a temperatura ambiente con un magnetómetro a 300 kHz y 24 kA.m-1 en agua y tolueno. En la tabla se recogen los valores de la magnetización de saturación, coercividad y SAR para cada caso. A continuación, se evaluó una selección de MNPs dispersas en tolueno con diámetros que oscilaban entre los 18 y 20,5 nm con distintas proporciones de Co (3, 8, 11 y 30 %, respecto a la proporción de Fe2+ en la Fe3O4). La medición de sus curvas de histéresis se realizó mediante un magnetómetro a temperatura ambiente, a un campo de 24 kA.m-1 y una frecuencia de 300 kHz. La Figura 48 representa las curvas normalizadas correspondientes a estas MNPs-Co. Así, se observó que a medida que aumenta la proporción de Co en las MNPs, la apertura de la curva de histéresis se amplió significativamente. A continuación, se determinaron las curvas de histéresis a temperaturas de 295 K y 10 K utilizando un dispositivo cuántico de interferencia superconductora, conocido como SQUID (Superconducting Quantum Interference Device). Las MNPs se pipetearon sobre un trozo de papel para su posterior análisis. Sin embargo, debido a la sensibilidad de las mediciones a la masa del material magnético, se tomó la decisión de transferir las MNPs a agua. La transferencia de las MNPs-Co al agua se realizó mediante recubrimiento con PMA (2.2.23.d), con el propósito de reducir los posibles errores asociados al proceso de pipeteo de disolventes orgánicos (con micropipetas diseñadas para agua) y, así, mejorar la precisión de las mediciones. Al emplear agua como disolvente se logró una mejor estandarización de la cantidad de MNPs pipeteadas, lo cual fue fundamental para obtener resultados más confiables y precisos en los experimentos. -30 -15 15 30 -100 -50 50 100 H / kAm-1 M / A·m2kg-1 Agua Tolueno MNPs y su funcionalización 147 Co / % Tamaño hidrodinámico / nm Tamaño SEM / nm 0 18,4 ± 1,4 17,9 ± 1,6 3 17,4 ± 0,3 18,0 ± 1,3 8 20,1 ± 0,7 20,7 ± 1,3 11 20,1 ± 0,4 19,6 ± 1,5 30 18,2 ± 0,4 20,5 ± 1,2 Figura 48: Curvas de magnetización medidas a 300 KHz y 24 kA.m-1 de muestras de MNPs dopadas con diferentes proporciones de Co normalizado entre 0 y 1 medidas con magnetómetría a temperatura ambiente. La tabla recoge medidas de tamaño hidrodinámico promediado en número y medido a partir de la medida de al menos 300 MNPs en imágenes de SEM. La concentración de Co tuvo un efecto significativo en las propiedades magnéticas de las NPs tal como se observa en la Figura 49. Al comparar las medidas a las dos temperaturas ensayadas se pudieron observar algunas tendencias claras. Así, se observó que la Ms aumentó incluso con una pequeña incorporación de Co, indicando que la presencia de este metal potenció la alineación de los momentos magnéticos dentro de las NPs. Por otro lado, a una temperatura de 10 K se apreció un incremento tanto de la magnetización remanente (Mr), que define la magnetización residual en un material una vez eliminado el campo magnético aplicado, como de la Hc a medida que se incrementó la concentración de Co. Es decir, a temperaturas más bajas, las NPs con mayor concentración de Co tendieron a retener más magnetización después de la eliminación del campo magnético externo y también requirieron un campo magnético más potente para ser desmagnetizadas. Además, a 295 K se observó un comportamiento inusual, aunque recientemente predicho teóricamente:166 La coercitividad disminuyó inicialmente entre las concentraciones de Co de 0 y 0,08, pero luego aumentó a concentraciones de Co superiores. Este comportamiento contraintuitivo (disminución de la anisotropía magnética a medida que su aumenta el dopado de Co2+), se puede entender como una transición del sistema desde una constante de energía de anisotropía cúbica negativa (Fe3O4) a una positiva (CoFe2O4). La remanencia mostró una tendencia similar, pero menos acentuada. De particular interés fue el caso de las NPs dopadas con 0,08 de Co. A 295 K, estas MNPs mostraron un comportamiento superparamagnético, en el que los momentos magnéticos pueden cambiar libremente de dirección, resultando en una magnetización neta cero en ausencia de un campo magnético externo. Esta observación fue evidente en la ausencia de histéresis a esta concentración de dopado, incluso al ampliar la escala de observación, en contraste con lo observado con las otras concentraciones de Co. Al comparar las medidas a ambas temperaturas, respecto a la Hc, los valores fueron considerablemente más altos a 10 K en comparación con los de 295 K para todas las concentraciones de Co. Esta tendencia sugirió que, a temperaturas más bajas, las NPs muestran una mayor resistencia a ser desmagnetizadas. Esto puede deberse a una reducción de los 0.0 0.5 1.0 0.0 0.5 1.0 H / kAm-1 M / Am2kg-1 30 % 11 % 8 % 3 % 0 % Aitor Álvarez Lorenzo 148 movimientos térmicos que permiten a los momentos magnéticos reorientarse y facilitar la desmagnetización. % Co µHc / T Mr / emu g-1 0 2,64 x 10-3 5,69 3 1,89 x 10-3 5,27 8 5,43 x 10-4 1,19 11 2,09 x 10-3 3,81 30 3,10 x 10-2 22,1 Figura 49: Curvas de histéresis obtenidas a partir de las medidas de SQUID de las MNPs con diferentes grados de dopaje de Co de 0, 0,03, 0,08, 0,11 y 0,30, donde M se encuentra normalizada entre 1 y -1, a 10 (A) y 295 K (B), y una ampliación de la medida a 295 K entre - 0,02 y 0,02 T (C) para facilitar la visualización de la histéresis. La tabla muestra los datos de Hc y Mr correspondientes a las diferentes sustituciones de Co en medidas realizadas a 295 K. Finalmente, la Mr fue también más alta a 10 K en comparación con su valor a 295 K para todas las concentraciones de Co. Esto implicó que las NPs retienen más su magnetización después de la retirada del campo magnético a temperaturas más bajas, lo que puede ser otro indicador de la influencia de los movimientos térmicos en las propiedades magnéticas de las NPs. -6 6 -1.2 1.2 0H / T M / emu·g-1 0 % 3 % 8 % 11 % 30 % -6 6 -1.2 1.2 0H / T M / emu·g-1 0 % 3 % 8 % 11 % 30 % -0.02 0.02 -0.5 0.5 0H / T M / emu·g-1 -6 6 -1.2 1.2 H / kAm-1 M / Am2kg-1 0 % 3 % 8 % 11 % 30 % A B C MNPs y su funcionalización 149 4.2.3. Estabilización de las MNPs en medios acuosos con CTAB. Previamente a la síntesis de NCs basados en MNPs recubiertas por ZIF-8, fue necesario estabilizar con CTAB las MNPs en agua. La superficie de las MNPs está recubierta por ácido oleico (AO), adsorbido por quimisorción. Varios estudios han probado que la quimisorción se lleva a cabo por la formación de un enlace entre el ácido carboxílico de AO y el Fe de las MNPs.167 . Con el objetivo de transferir las MNPs a un medio acuoso, se probaron adaptaciones de diferentes protocolos previamente descritos. Estos métodos se basan en el recubrimiento con una bicapa AO-CTAB. En total, se probaron tres protocolos diferentes, cuyo éxito se evaluó mediante la medición del tamaño hidrodinámico con DLS. En definitiva, lo que se buscó fue un procedimiento sencillo con el que conseguir que las MNPs fuesen transferidas de la manera menos agregada posible a la fase acuosa. Para estos experimentos se emplearon MNPs de 20,7 ± 1,9 nm de diámetro promedio (Figura 50). Figura 50: Imagen de TEM de las MNPs utilizadas para las pruebas de transferencia de fase y su correspondiente distribución de tamaños (tamaño medio de 20,7 ± 1,9 nm En el protocolo 1168 se trabajó con MNPs dispersadas en 600 µl de hexano o tolueno a una concentración de 0,3 µM, a las cuales se agregó diferentes volúmenes (recogidos en la Tabla 13) de una solución acuosa de CTAB de 0,02 mol.l-1 para alcanzar una relación de moléculas de CTAB.nm-2 deseada. Posteriormente, se añadió agua Milli-Q a la solución hasta completar 6 ml, y se sonicó durante 10 min. A continuación, se llevaron a cabo cuatro ciclos de lavado de las MNPs, precipitándolas a 8000 rcf. Finalmente, estas se redispersaron en 1 ml de agua MilliQ y se centrifugaron a 3000 rcf durante 3 min para eliminar agregados. Se probaron diferentes relaciones de moléculas CTAB.nm-2 (Tabla 13) observándose que, al utilizar la misma relación reportada en procedimientos previos (1,1 x 102 moléculas de CTAB.nm-2), las MNPs no precipitaban al ser lavadas. Sin embargo, al disminuir la relación de surfactante, se logró transferir las MNPs a agua, pero se observó que los tamaños hidrodinámicos resultantes eran demasiado elevados, lo que sugirió la formación de agregados (Tabla 13). Aitor Álvarez Lorenzo 150 Tabla 13: Tamaño hidrodinámico promediado en número de las MNPs transferidas a agua mediante recubrimiento con CTAB siguiendo diferentes condiciones del protocolo 1. Condición V CTAB/ ml Diámetro NP / nm Moléculas CTAB.nm-2 Tamaño hidrodinámico / nm Referencia168 11 1,1 x 102 20,7 ± 2,5 1 0,5 20,2 ± 2,3 1,1 x 102 No precipitan 2 0,15 20,2 ± 2,3 4,3 x 101 78,6 ± 4,1 3 0,13 20,2 ± 2,3 1,3 x 101 67,3 ± 5,7 En el segundo protocolo169 se evaluaron diferentes relaciones de CTAB.nm-2 y distintos procedimientos de lavado. El protocolo consistió en mezclar 9 ml de una disolución acuosa de CTAB 0,1 mol.l-1 con 2 ml de isopropanol y adicionar 700 μl de a la concentración requerida de MNPs para obtener la relación CTAB.nm-2 deseada. La solución resultante se sonicó durante 3 h, agitando cada 15 min para evitar que las fases se separasen y, finalmente, se mantuvo la muestra en un baño a 35 °C durante 8 h para evaporar la fase orgánica. En este caso se utilizaron relaciones de moléculas CTAB.nm-2 más altas, consiguiendo obtener radios hidrodinámicos menores respecto a los obtenidos en el protocolo 1. Por otro lado, se probaron diferentes lavados en agua sin y con CTAB 0,16 g.l-1, precipitando las partículas a 15000 (Tabla 14) o 20000 rcf (Tabla 15). Finalmente, también se evaluó la precipitación de agregados de partículas, y para ello, luego de lavar las MNPs, estas se precipitaron a 3000 rcf durante 3 min, quedando las NPs no agregadas suspendidas en el sobrenadante y descartando el precipitado rico en agregados de MNPs. En general, se obtuvieron los mejores resultados en términos de DLS trabajando en un rango de 1,1 x 104 – 2,3 x 104 moléculas de CTAB.nm-2, lavando las NP con CTAB 0,16 g.l-1 y precipitando los potenciales agregados. A valores altos de moléculas CTAB.nm-2, los tamaños hidrodinámicos fueron más elevados, lo que indicó que un exceso de CTAB no es adecuado para la transferencia a fase acuosa. Tabla 14: Tamaño hidrodinámico en número medio de las MNPs transferidas a agua medido con DLS siguiendo diferentes condiciones del protocolo 2, precipitados a 15000 rcf. Tamaño hidrodinámico / nm Moléculas CTAB.nm-2 Lavado con H2O sin precipitar agregados Lavado con H2O Lavado con CTAB 0,16 g.l-1 1,1 x104 58,0 ± 2,0 50,7 ± 1,3 44,4 ± 20,7 2,3 x104 63,3 ± 8,8 62,0 ± 4,4 58,0 ± 5,8 4,5 x104 84,1 ± 5,4 62,9 ± 3,3 81,6 ± 8,4 9,0 x104 71,3 ± 8,5 1,8 x105 82,6 ± 18,5 3,6x105 138,8±48,2 Tabla 15: Tamaño hidrodinámico promediado en número de las MNPs transferidas a agua medido obtenido mediante DLS siguiendo diferentes condiciones del protocolo 2, precipitados a 20000 rcf. Tamaño hidrodinámico / nm Moléculas CTAB.nm-2 Lavado con H2O sin precipitar agregados Lavado con H2O 1,1x104 63,7 ± 9,2 56,0 ± 3 2,3 x104 56,8 ± 3,9 4,5 x104 71,4 ± 9,2 MNPs y su funcionalización 151 Por último, el tercer protocolo170 consistió en mezclar 9 mg de MNPs dispersas en cloroformo, con 5 ml de una disolución acuosa de CTAB 0,2 M y agitar vigorosamente durante 40 min. A continuación, se calentó la disolución a 65 °C durante 30 min para evaporar la fase orgánica. En este caso se probó con MNPs de diferentes tamaños, entre 20 y 12 nm, lo que implicó diferentes relaciones de moléculas CTAB.nm-2. También se evaluó la potencial influencia del disolvente en el que se encontraban dispersadas las MNPs, empleando cloroformo y hexano. De los 3 protocolos testados, este último fue el más sencillo y con el que se obtuvieron los tamaños hidrodinámicos promediados en número más bajos (Tabla 16). Con los experimentos llevados a cabo, no se pudo afirmar que hubiese diferencia entre la utilización de cloroformo o hexano como dispersante. Además, los tamaños hidrodinámicos más bajos se obtuvieron con las MNPs de mayor tamaño, lo que pudo deberse a una relación CTAB más adecuada y/o a una menor tendencia a la agregación en el caso de las MNPs de mayor tamaño. Tabla 16: Tamaño hidrodinámico promediado en número obtenido por DLS siguiendo diferentes condiciones del protocolo 3. Diámetro NP / nm Disolvente Moléculas CTAB.nm-2 Tamaño hidrodinámico / nm 20,7 ± 1,9 CHCl3 1,2 x 103 33,5 ± 1,7 17,8 ± 2,2 1,0 x 103 40,4 ± 2,2 18,3 ± 2,0 Hexano 1,0 x 103 42,0 ± 11,5 16,7 ± 2,0 8,7 x 102 56,5 ± 11,9 11,9 ± 0,9 7,0 x 102 49,1 ± 4,5 Los resultados del DLS indicaron que las MNPs con un tamaño de 20,7 ± 1,9 nm, tras ser transferidas a un medio acuoso, presentaron un tamaño hidrodinámico coherente con el tamaño medido mediante imágenes de TEM. Figura 51: Tamaño hidrodinámico promediado en número (A) obtenido por DLS, e imagen de STEM (barra de escala 50 nm) de las MNPs-CTAB transferidas a agua (B). 1 100 10000 0 5 10 15 20 25 dh(N) / nm N / % A B Aitor Álvarez Lorenzo 152 4.3. SÍNTESIS, CARACTERIZACIÓN Y APLICACIONES DE NCS MNPS@ZIF-8 Los estudios previos para sintetizar NCs de MNPs@ZIF-8 han seguido principalmente dos estrategias diferentes: la impregnación y la estrategia núcleo-carcasa. La impregnación consiste en crecer las MNPs en los poros del MOF, obteniendo NPs o clústers de pequeño tamaño depositados en el interior de los poros del ZIF-8.171 La estrategia núcleo-carcasa consiste en crecer el ZIF-8 sobre la superficie de MNPs producidas mediante síntesis solvotermal, funcionalizadas con polidopamina o poliestireno de sulfonato de sodio (PSS)172-173. Otro procedimiento descrito consiste en recubrir con sílice mesoporosa las MNPs y crecer el ZIF-8 sobre la sílice.174 También se utilizan MNPs sintetizadas por termólisis estabilizadas con PVP, sobre las que crece el ZIF-8 mediante diferentes estrategias, solvotermal (DMF, MeOH), asistido por microondas, sonoquímico, mecanoquímico, gel seco y método microfluídico.175 Estos métodos implican que los NCs descritos están formados generalmente por MNPs grandes (>50 nm) con una carcasa de ZIF-8 fina, que se utilizan para catálisis172-173, eliminar contaminantes del agua172 o para separaciones176, o bien, son propuestos como sistemas para la liberación controlada de fármacos al exponer los NCs a campos magnéticos alternos.171 En el caso de estos últimos, las MNPs son todavía pequeñas para generar el suficiente calor, tal que los NCs deben ser expuestos a campos magnéticos alternos muy intensos. En este trabajo, se llevó a cabo la síntesis de NCs de MNP@ZIF-8 mediante una estrategia de núcleo-carcasa. La estructura de estos nanocompuestos estaba compuesta por un núcleo de MNP con un diámetro aproximado de 20 nm encapsulado con una capa de ZIF-8. Una vez transferidas las MNPs a agua mediante la ayuda de la concentración de CTAB adecuada como se comentó en el apartado anterior, se determinó su concentración utilizando la metodología descrita en el apartado 4.2.1. Para crecer el ZIF-8 sobre las MNPs (MNP@ZIF8), sobre una mezcla de los precursores (MI y Zn(NO3)2) se añadieron las MNPs dispersas en una disolución de CTAB 0,2 g.l-1. La disolución mezcla se agitó durante 5 min y se dejó en reposo durante 3 h, tiempo suficiente para completar el crecimiento de los cristales de ZIF-8 sobre las MNPs. Con el objetivo de determinar cómo influye la concentración de MNPs a la síntesis, se llevaron a cabo pruebas utilizando dos concentraciones diferentes de MNPs, 24 y 12 nM. Para purificar los NCs, estos se centrifugaron a 8000 rcf y se redispersaron en MeOH (Figura 52). Los tamaños hidrodinámicos obtenidos mediante DLS mostraron que a medida que aumentó la concentración de MNPs, disminuyó el tamaño hidrodinámico promediado en número de los NCs. Esto sugirió que la técnica utilizada fue eficaz para producir NCs con una alta eficiencia de encapsulamiento de MNPs y un cierto grado de control sobre su tamaño. (Figura 52). MNPs y su funcionalización 153 Figura 52: Esquema representativo de la síntesis de MNP@ZIF-8 y tamaño hidrodinámico promediado en número de los MNP@ZIF8. A B [NP] / nM DLS en número medio / nm PDI 24 168,6 0,03 12 191,7 0,02