Análisis de la longitud de los telómeros y biomarcadores epigenéticos de la edad en pacientes con artrosis o con artritis reumatoide

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Universidad*de*Santiago*de*Compostela* Facultad!de!Medicina! Departamento!de!Medicina! ! ! ! ! ! Hospital*Clínico*Universitario*de*Santiago*de*Compostela* Instituto!de!Investigaciones!Sanitarias!de!Santiago! Laboratorio!de!Investigación!10! ! ! ! ! ! ANÁLISIS*DE*LA*LONGITUD*DE*LOS*TELÓMEROS*Y*BIOMARCADORES* EPIGENÉTICOS*DE*LA*EDAD*EN*PACIENTES*CON*ARTROSIS*O** CON*ARTRITIS*REUMATOIDE* ! ! ! ! PROGRAMA!DE!DOCTORADO!(RD!1393/2007)! Santiago!de!Compostela! ! ! ! ! ! ! ! TESIS*DOCTORAL* Laura*Vidal*Bralo* 2017* * ! * * * ! ! * El! Dr.! Antonio! González! Martínez-Pedrayo,! investigador! principal! del! Laboratorio! de! Investigación! 10! del! Instituto! de! Investigaciones! Sanitarias! del! Complejo!Hospitalario!Universitario!de!Santiago!de!Compostela,!y!el!Dr.!Antonio!Mera! Varela,!jefe!de!sección!del!Servicio!de!Reumatología!del!Hospital!Clínico!Universitario! de! Santiago! de! Compostela! y! profesor! asociado! de! Medicina! del! Departamento! de! Medicina!de!la!Universidad!de!Santiago!de!Compostela!durante!la!elaboración!de!esta! tesis,! ! ! ! ! CERTIFICAN!QUE:! ! El!presente!trabajo!que!lleva!por!título:! ! ! ! Análisis!de!la!longitud!de!los!telómeros!y!biomarcadores! epigenéticos!de!la!edad!en!pacientes!con!artrosis!o!con!artritis!reumatoide! ! ! ! Realizado! por! Laura! Vidal! Bralo! en! el! Departamento! de! Medicina! de! la! Universidad!de!Santiago!de!Compostela!bajo!nuestra!dirección,!ha!sido!revisado!y!está! en!disposición!de!ser!presentado!para!optar!al!grado!de!Doctora!en!Biología.! ! ! ! ! ! ! ! Fdo:!Dr.!Antonio!González!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!Fdo:!Dr.!Antonio!Mera!Varela! !!Martínez-Pedrayo!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! ************************** **************Director**************************************************************************Tutor* * * * * * * * * * * ! ! * * ! ! * * * * * * * * * * * * * * * * * * * A mi pequeña * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * La medicina ha prolongado nuestra vida, pero no nos ha facilitado una buena razón para seguir viviendo. Miguel Delibes (1920-2010) ! ! ! ! AGRADECIMIENTOS* * Ha llegado el momento de escribir las últimas líneas de esta tesis. La mayoría de mis compañeros aprovechan este momento para manifestar lo duro y largo que es este tramo, del ya de por sí complicado camino de la vida. De lo agotados que se sienten a pesar de que solo quedan unos metros para alcanzar el objetivo. Sin embargo, en estos últimos meses la vida se ha encargado de recordarme lo que verdaderamente importa, y con esta nueva perspectiva, este trayecto ya no me parece tan terrible. Hay muchas situaciones a las que tienes que enfrentarte solo, en las que por más que te esfuerces y luches no obtendrás mejores resultados y ante las que solo queda la resignación. Pero esta no es una de esas situaciones. Por más agotador que parezca, después del esfuerzo y el tiempo dedicados, obtengo una recompensa y finalmente sale a la luz el trabajo de todos estos años. Tampoco es una situación a la que me haya enfrentado sola, y es por ello que tengo que escribir unas palabras de agradecimiento a las personas que me han ayudado cada día, no solo en esta tesis, sino a lo largo de todo mi camino. Y es que no estaría aquí, de no ser por la inspiración de una gran maestra y amiga, Irene, que sembró en mí la semilla del amor por la biología. Tampoco hubiera podido comenzar esta tesis sin la comprensión de la profesora Teresa Barral, que proporcionó la pértiga para saltar un gran escollo burocrático al principio de esta etapa. De ese tedioso Máster de Biomedicina, obligado paso para comenzar esta andadura, me llevo grandes amigos. Jaime y Cynthia en la parte internacional, y por su puesto, mi querida boticaria, ahora renombrada como Laura Boston. Te has convertido en indispensable en las cañas científicas, por tus astutos y mordaces comentarios, que tanto me han hecho reír. Hoy te doy las gracias por cada una de esas carcajadas. He de agradecer también a todo el departamento de Medicina Forense y especialmente a Antonio Salas por acogerme y dirigir mi trabajo final de máster. Has sido un referente del esfuerzo y entusiasmo que se requiere para ser bueno en aquello a lo que uno decide dedicar su vida. A mi director de tesis, Antonio González, agradecerte la oportunidad de realizar este trabajo en tu laboratorio, con todos los medios disponibles a mi alcance y una buena beca; con la ayuda de tus continuos consejos y recomendaciones. Tu esfuerzo en la supervisión exhaustiva de este trabajo es la marca distintiva que evidencia tu implicación. Gracias también al Servicio de Reumatología por su colaboración, especialmente a Juan-Gómez Reino y a Antonio Mera Varela, por haber aceptado ser tutores de esta tesis, a todos los ! ! ! médicos y enfermeras y por su puesto a los pacientes. Sin vosotros nuestro trabajo no sería posible. Gracias a todos los compañeros de laboratorio que cada vez que el camino se volvía escarpado, me empujaron para ayudarme a subir. Aunque en la selección final del trabajo incluido en esta tesis no lo parezca, Manolo, has sido un gran maestro de estadística y un pilar en mis primeros pinitos en la bioinformática. Gracias también al equipo cardio, Ana, Vanesa, Diego y Sandra. Los comienzos siempre son duros, pero me acogisteis como una más y con vosotros descubrí el verdadero compañerismo. Gracias a vuestros sabios consejos los westerns salieron, los días duros pasaron, y seréis siempre un ejemplo a seguir del trabajo en equipo. Aida, sin duda tengo que darte las gracias por acordarte de mí y reclutarme. Tú me enseñaste realmente todos los trucos del genotipado y del manejo de los datos y tu experiencia me ha evitado muchos disgustos. Los vinos y charlas después del trabajo fueron el pilar de nuestra amistad. Sin duda, los echo de menos. También gracias a ti conocí a Marisol, con tu bondad y tu ternura te has hecho un hueco en mi vida. A las “nuevas” compañeras de esta gran recta final de mi tesis, Lorena, Cristina y Rosario, muchísimas gracias. Sois la alegría y la razón por la cual no me importaría seguir trabajando en esta tesis otros tantos años más. Desde vuestra llegada, el laboratorio se ha convertido en un verdadero hogar. De vosotras he aprendido a sobrellevar cualquier contratiempo con una sonrisa, o un vermú, o con un simple “besos”. Guardaré en mi memoria el “No quiero risas”, la franqueza con la que hablan los de Pamplona y la visita a Londres, aunque sabemos que “Europa está sobrevalorada”. Sabéis que me tendréis al otro lado del teléfono para lo que necesitéis. Gracias también a José por recordarme lo bonito que es enseñar y a Fran, por las galletas de avena y por fomentar el club del corneto. Al laboratorio ocho le debo el buen ambiente, el apoyo moral, el café de media mañana y los geniales “novatos”, como Sergio y Celia, con los que tantas risas he compartido. A Carmen Conde, su trato siempre amable y su comprensión. Pero sin duda ha sido gracias a ti, Nerea, que Lab8 ha sido mi segunda casa. Has convertido el compañerismo en amistad. Tu optimismo es fundamental para contrarrestar esa tendencia que tenemos los estudiantes de doctorado de quejarnos por todo y ahogarnos en un vaso de agua. Eres diferente y especial, lluvia fresca que llegó cuando atravesaba un desierto. Pero tengo que reconocer que el bastón en que me apoyé durante todo este viaje, y sin la cual no estaría hoy aquí, ha sido Carmen. Eres la trabajadora incansable y eficiente que todo el mundo ! ! querría a su lado. Gracias a ti, miles de muestras parecen solo cientos, cientos de experimentos se quedan en decenas, y decenas de trabajos se hacen a la vez. Compañera leal y ahora amiga. Si, has leído bien, amiga. Porque aunque te empeñes en no sufrir por todos los estudiantes de doctorado que van pasando a tu lado, conmigo ya has sufrido. Y aquí estaré siempre que lo necesites. Y ahora llega sin duda la parte más difícil. Porque sería injusto no agradecer a aquellas personas que a pesar de no haber influido directamente en esta etapa del camino, forman parte de mi vida y me hacen ser quien soy. Paula, recordaré siempre las noches de “repaso” a última hora que tan buenos resultados nos dieron en la facultad. Sabes que siempre nos tendremos la una a la otra, aunque pase el tiempo y nuestros caminos se separen. Luís, eres un buen amigo, de los que hablan poco y demuestran mucho. Tus abrazos, aunque escasos, son muy reconfortantes. Y María, no creo que sea bueno recordar nuestros comienzos. Me quedo simplemente con tu franqueza, tu lealtad y tus incansables esfuerzos por mantenernos a todos unidos. Y sí, eres la más lista y la mas guapa, queda escrito aquí para siempre. Hemos tenido cenas de la facultad, charlas de laboratorio, cañas de máster y excursiones a Lalín juntos que forman parte de los recuerdos de los mejores años de mi vida. A mis queridas gemes Laura y María, a mi peque Nerea, a mi tocaya Lala, y a Olga, por ser amigas sin necesidad de esfuerzos, porque aunque nos separen años y puntos de vista, me habéis dado buenos consejos, que no siempre he seguido, y habéis recogido y pegado los trozos sin reproches después de cada golpe. Sabéis que os quiero y que con una charla en el sofá hasta altas horas de la madrugada, o una noche de fiesta lunera una vez al año, tenemos suficiente para seguir queriéndonos siempre. Doy las gracias por la gran familia que tengo, siempre unida, en las buenas pero sobre todo en las malas. Sabéis que sois demasiados para nombraros uno a uno, pero con todos y cada uno de vosotros he descubierto la felicidad que ofrece un verdadero hogar. A mi madre y a mi padre, no sólo por criarme y aconsejarme, sino por sacrificar vuestras vidas para que vuestros hijos pudiésemos cumplir nuestros sueños, aún a expensas de los vuestros propios. Por alegraros con cada uno de nuestros logros y sufrir con cada una de nuestras caídas. Ahora os entiendo un poco mejor. Sois los mejores padres que un hijo podría tener. A mis hermanos Álex y Lucía, porque gracias a ellos aprendí a compartir y a querer sin medida, a consolar y a pedir perdón. Os doy las gracias por la maravillosa portada de esta tesis, que no hace más que reflejar la impagable ayuda que siempre estáis dispuestos a brindarme. ! ! 11! INTRODUCCIÓN 1. Concepto de envejecimiento ! El!envejecimiento!se!define!como!una!disminución!de!la!funcionalidad!a!lo!largo! del! tiempo! que! afecta! a! la! gran! mayoría! de! organismos! vivos.! Es! un! proceso! extremadamente!complejo!que!tiene!lugar!a!nivel!sistémico!pero!que!puede!mostrar! grandes! diferencias! entre! tejidos! o! tipos! celulares! del! mismo! individuo.! Por! ello,! es! necesario!diferenciar!en!los!organismos!pluricelulares!un!envejecimiento!celular!y!un! envejecimiento!del!individuo!en!su!conjunto!o!también!conocido!como!envejecimiento! organismal!![1],![2].!! ! August!Weismann,!biólogo!evolucionista,!utilizó!una!aproximación!racional!en! 1881! para! explicar! la! muerte,! proponiendo! como! causa! el! desgaste! que! sufren! los! tejidos! y! su! capacidad! de! renovación! limitada.! Asimismo,! ! observó! que! durante! la! evolución! los! organismos! multicelulares! inmortales! gradualmente! fueron! evolucionando!hacia!organismos!mortales![3].!Dentro!de!los!organismos!inmortales!se! encuentran! las! colonias! de! organismos! unicelulares! que! cooperan! entre! si.! En! estas! colonias!cada!célula!se!divide!de!forma!independiente!mediante!mitosis!y!da!lugar!a! dos! células! idénticas.! Sin! embargo,! en! los! organismos! realmente! pluricelulares! las! células!se!especializan!para!llevar!a!cabo!las!diferentes!funciones,!tróficas,!defensivas!y! reproductoras,!siendo!estas!últimas!células!las!únicas!con!una!capacidad!ilimitada!de! dividirse.!Así,!!el!coste!de!una!diferenciación!en!el!soma!y!por!tanto!una!especialización! de! las! células,! es! el! envejecimiento,! en! contraposición! a! la! indeterminación! y! la! capacidad!de!renovación!infinita!de!la!línea!germinal![4],![5].!! Shtefko! y! Rokhlin! definen! la! edad! biológica! como! el! ritmo! de! crecimiento,! desarrollo,! maduración! y! envejecimiento! característico! de! cada! individuo,! como! medida! que! refleja! la! esperanza! de! vida! individual,! condicionada! tanto! por! el! componente!genético!como!por!las!condiciones!ambientales!a!las!que!está!expuesto! cada! sujeto.! Mientras! el! envejecimiento! atendiendo! a! la! edad! cronológica! hace! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 12! referencia!siempre!a!una!medida!global!del!organismo,!el!envejecimiento!biológico!se! aplica! tanto! a! nivel! del! individuo! como! específicamente! a! cada! órgano! o! tejido! del! mismo.! A! nivel! de! individuo! refleja! la! diferencia! en! esperanza! de! vida! y! capacidad! funcional!en!relación!con!su!población!de!referencia!medida!mediante!biomarcadores! que! cambian! con! la! edad.! Luego,! si! un! individuo! muestra! una! desviación! en! los! biomarcadores!hacia!los!típicos!de!edades!más!avanzadas,!se!considera!que!tiene!una! edad!biológica!mayor!que!la!que!le!corresponde!y!una!menor!esperanza!de!vida.!Por!el! contrario,! si! los! biomarcadores! corresponden! en! su! población! de! referencia! a! más! jóvenes,!indican!una!menor!edad!biológica!que!la!cronológica.!Por!otra!parte,!como!la! exposición! y! acumulación! de! daños! y! la! expresión! de! los! diferentes! genes! son! mecanismos! tejido! específicos,! puede! haber! diferencias! en! como! se! afecta! la! capacidad! funcional! de! los! diferentes! tejidos! y! tipos! celulares! dentro! del! mismo! individuo.! Por! eso,! tiene! sentido! considerar! la! edad! biológica! también! al! nivel! específico!de!diferentes!tejidos.!! Otra!característica!importante! de!este!concepto! de! edad!biológica!es!que!su!interpretación!es!variable!según!los!biomarcadores!utilizados! para!determinarla.!Como!hay!biomarcadores!con!diferente!sensibilidad!a!los!cambios! que! se! producen! en! las! células! y! en! el! organismo,! y! existen! diferentes! cambios! relacionados! con! el! envejecimiento,! no! todos! los! biomarcadores! son! igualmente! informativos!y,!en!ocasiones,!pueden!proporcionar!información!discordante[6].!!! ! El! interés! en! la! edad! biológica! y! la! posibilidad! de! conocerla! y! modificarla! es! evidente.! Además,! se! ha! reforzado! con! el! gran! incremento! en! la! esperanza! de! vida! experimentado! en! el! último! siglo! y! que! se! ha! acompañado! de! un! aumento! de! la!! incidencia! y! repercusión! de! algunas! enfermedades! entre! las! que! destacan! las! enfermedades!degenerativas!(como!la!enfermedad!de!Alzheimer!y!la!enfermedad!de! Parkinson),!inflamatorias!(como!algunas!de!las!enfermedades!reumáticas)!y!el!cáncer! [7],![8]!(Figura!1).!! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 13! Los! factores! que! afectan! a! la! edad! biológica! son! tanto! propios! del! individuo,! incluyendo!los!factores!genéticos!y!psicológicos,!como!de!su!experiencia!vital!en!la!que! inciden! factores! demográficos,! exposiciones! a! factores! ambientales,! enfermedades,! nutrición!y!desarrollo.!! Figura'1.'Cambios'en'la'esperanza'de'vida'del'ser'humano'a'lo'largo'del'tiempo.'Los! cambios! ambientales,! en! la! dieta! y! los! cuidados! médicos! han! incrementado! la! longevidad!del!ser!humano,!sobre!todo!en!los!últimos!200!años.!Modificado!de!Aunan% y%col.!![8].! ! En! cuanto! a! las! características! genéticas,! diferentes! estudios! han! puesto! de! manifiesto!la!asociación!entre!distintas!enfermedades!asociadas!con!el!envejecimiento! y!los!principales!genes!implicados!en!los!procesos!de!senescencia!e!inflamación![9].!Sin! embargo,!la!acumulación!de!daños!debido! a!los!factores!ambientales!externos!sigue! siendo! la! explicación! principal! a! los! cambios! producidos! durante! el! envejecimiento,! relegando!la!importancia!genética!a!la!eficiencia!de!los!mecanismos!de!reparación!de! estos! daños! [10].! Un! caso! aparte! son! los! síndromes! de! envejecimiento! acelerado! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 14! debido! a! mutaciones! de! transmisión! mendeliana,! como! la! progeria! de! HutchinsonGilford!y!el!síndrome!de!Werner.! ! Por! lo! tanto,! el! envejecimiento! y! el! conocimiento! en! profundidad! de! sus! mecanismos!reguladores!constituyen!un!reto!para!la!investigación!biomédica!debido!a! su! implicación! en! distintas! enfermedades,! entre! ellas! en! enfermedades! reumáticas! como!la!artrosis!y!la!artritis!reumatoide.!! ! 2. Mecanismos del envejecimiento ! Desde!que!Hayflic!descubrió!en!1965!que!los!fibroblastos!en!cultivo!tenían!un! número!limitado!de!divisiones!dependiente!de!la!edad!del!individuo!del!que!provenían! [11],! [12],! los! científicos! han! tratado! de! utilizar! los! conocimientos! adquiridos! estudiando!el!envejecimiento!celular!para!encontrar!tratamientos!para!enfermedades! degenerativas![13],![14].!En!los!años!1990,!se!relacionó!el!número!de!divisiones!de!los! fibroblastos! y! otras! células! en! cultivo! con! el! acortamiento! de! los! telómeros! atribuyendo!un!papel!central!a!este!mecanismo!en!el!envejecimiento.!El!acortamiento! de! los! telómeros! se! debe! a! la! ausencia! de! la! enzima! telomerasa! en! las! células! somáticas!diferenciadas.!En!apoyo!al!papel!del!acortamiento!telomérico!hay!múltiples! evidencias.!Una!de!las!más!intrigantes!es!la!identificación!de!organismos!multicelulares! que!pueden!dividirse!de!forma!indefinida!y!que!no!envejecen!como!las!langostas!o!la! medusa!Turritopsis)nutricula.!Sus!células!somáticas!tienen!una!capacidad!ilimitada!de! dividirse!y!mantienen!la!expresión!de!la!enzima!telomerasa.!Sin!embargo,!se!sabe!que! además!del!acortamiento!de!la!longitud!de!los!telómeros!hay!cambios!a!otros!niveles! que!conducen!al!envejecimiento!de!la!célula![13],![14].!Estos!cambios!se!han!agrupado! en!nueve!mecanismos!que!se!pueden!agrupar!en!tres!categorías:!los!cambios!causales! de! daño! (inestabilidad! genómica,! acortamiento! telomérico,! modificaciones! epigenéticas!y!pérdida!de!la!homeostasis!proteica),!los!producidos!como!respuesta!a! estos! daños! (desregulación! de! la! detección! de! nutrientes,! disfunción! mitocondrial! y! senescencia!celular)!y!los!que!son!características!definitorias!del!fenotipo!(extenuación! de!las!células!madre!y!alteraciones!en!la!comunicación!celular)!(Figura!2).!! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 15! ! Figura' 2.' ' Resumen' de' mecanismos'del' envejecimiento' y' su' agrupación' en' tres' categorías'funcionales.'Modificado!de!López-Otín+y+col.'[7].' ! Inestabilidad genómica ! La!inestabilidad!genómica!se!define!como!una!tendencia!progresiva!del!genoma! a! adquirir! mutaciones,! sobre! todo! aquellas! a! gran! escala! como! duplicaciones,! deleciones!o!reorganizaciones!cromosómicas!visibles!en!el!cariotipo!de!la!célula!que!las! presenta.!Esta!acumulación!de!daño!en!el!material!genético!a!lo!largo!del!tiempo!se! produce!como!consecuencia!de!su!constante!exposición!a!agresiones!endógenas!como! las! especies! reactivas! del! oxígeno! (ROS)! y! exógenas! como! la! radiación! ultravioleta.! Dentro! de! la! inestabilidad! genómica! no! solo! se! consideran! los! daños! en! el! genoma! nuclear,!sino!también!el!incorrecto!funcionamiento!de!los!sistemas!de!reparación!de! los! mismos! y! la! pérdida! de! la! arquitectura! de! la! lámina! nuclear.! Además,! la! inestabilidad!genómica!!también!incluye!el!acortamiento!telomérico!y!el!daño!del!ADN! mitocondrial! que! serán! tratados! en! los! siguientes! apartados! debido! a! su! especial! relevancia!en!el!proceso!de!envejecimiento.! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 16! Aunque! las! células! presentan! mecanismos! de! reparación! y! puntos! de! control! para! mitigar! el! alcance! de! los! daños! (Tabla! 1),! existen! evidencias! de! que! la! inestabilidad!genómica!contribuye!al!envejecimiento!celular![15]–[17].!La!acumulación! de! daños! en! el! genoma! nuclear,! se! mencionó! por! primera! vez! como! causa! de! envejecimiento!a!mediados!del!siglo!XX![18].!Estudios!posteriores!demostraron!que!la! acumulación! de! mutaciones! tiene! lugar! de! forma! paralela! al! envejecimiento! y! que! reducen! la! capacidad! proliferativa! de! los! tejidos! [19],! [20].! Dentro! de! los! diferentes! tipos! de! mutaciones,! las! roturas! de! la! hebra! de! ADN! son! la! principal! causa! de! inestabilidad!genómica!debido!a!la!elevada!tasa!de!ocurrencia,!a!la!elevada!gravedad! que! conllevan! sus! daños! y! ! la! menor! fidelidad! de! los! sistemas! de! reparación! de! las! mismas![21].! ! Las! roturas! de! cadena! sencilla! se! han! visto! asociadas! con! la! senescencia! en! células! epiteliales! debido! a! una! disminución! de! la! expresión! y! de! la! actividad! de! la! proteína!polimerasa!poli!ADP!ribosa!(PARP).!Esta!proteína!es!necesaria!para!el!correcto! funcionamiento!del!sistema!de!reparación!de!este!tipo!de!lesiones.!Los!daños!de!este! tipo! desencadenan! la! activación! la! ruta! de! señalización! de! p16! de! arresto! del! ciclo! celular![22].!Estos!hallazgos!son!congruentes!con!las!enfermedades!degenerativas!que! se!producen!en!pacientes!con!mutaciones!en!proteínas!del!sistema!de!reparación!de! rotura! de! hebra! simple! (SSBR)! como! la! tiroxil-ADN! fosfodiesterasa! 1! (TDP1)! y! la! aprataxina!(APTX)![23],![24].!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 17! ! Tabla!1.!Principales!daños!en!el!ADN,!sistemas!de!reparación!de!los!mismos,!causas! más!comunes!y!enfermedades!que!ocasionan.!AMP!=!adenosina!monofosfato;!MGMT! =! O6! -metilguanina! DNA! metiltransferasa;! GG-NER! =! reparación! de! nucleótidos! escindidos! en! el! genoma! global;! TC-NER! =! reparación! de! nucleótidos! escindidos! acoplado!a!transcripción.!Basado!en!Helleday'y'col.![25]! ! Por!otra!parte,!las!roturas!de!doble!cadena!ocurren!de!forma!natural!durante!la! meiosis! y! la! recombinación! programada! del! genoma.! Gracias! a! estos! procesos! se! Tipo de daño Sistema de reparación Fuente de daño Enfermedad relacionada Metilación! Guanina!O6!o! N7! Reparación! directa!(MGMT)! Especies! reactivas!del! oxígeno!(ROS)! ! Aductos!de! ADN!y! proteínas!o! dímeros!de! pirimidinas! Reparación!de! nucleótidos! escindidos! (NER):! GG-NER!y!TCNER! Radiación! ultravioleta! Tricodistrofia!(TTD)! S.!de!sensibilidad!a!UV!(UVSS)! S.!cerebro-oculo-facioesquelético!(COFS)! S.!Cockayne! Oxidaciones! (8oxoG),!sitios! abásicos! Reparación!de! bases! escindidas! (BER)! ROS! ! Roturas! peptídicas,! sitios!3’! fosfoglicolato,! 5’OH,!sitios! AMP! Reparación!de! roturas!de! hebra!simples! (SSBR)! Radiación! ionizante,!ROS! ! Bases! incorrectamen te! emparejadas! Reparación!de! errores!de! emparejamient o!de!bases! (MMR)! Errores!en!la! replicación! ! Rotura!de! doble!cadena! Recombinación! homóloga!(HR)! Radiación! ionizantes,!ROS! ! Ataxia!telangiectasia!(AT)! S.!Similar!a!Ataxia!telangiectasia! (ATLD)! S.!Nijmegen!(NBS)! S.!Werner!(WS)! ! Recombinación! no!homóloga! (NHEJ)! Radiación! ionizantes,!ROS,! quimioterapia! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 18! genera!la!enorme!diversidad!de!los!gametos!y!de!los!anticuerpos!y!receptores!de!los! linfocitos!T.!No!obstante,!las!roturas!de!doble!que!cadena!que!se!producen!fuera!de! estos!procesos!programados!son!las!principales!responsables!de!las!translocaciones!y! deleciones! de! grandes! regiones! de! ADN! que! se! producen! cuando! los! sistemas! de! reparación!no!son!eficaces,!y!que!contribuyen!de!forma!significativa!al!envejecimiento! celular![19].!La!radiación!y!los!fármacos!anticancerígenos!son!la!fuente!exógena!más! común!de!este!tipo!de!lesiones.!También!se!puede!producir!un!gran!aumento!de!las! roturas!de!doble!cadena!por!mutación!en!una!o!varias!de!las!proteínas!del!sistema!de! reparación.! Cuando! es! así,! se! observan! enfermedades! con! características! de! envejecimiento! prematuro! (progeroides)! que! se! asocian! con! un! incremento! en! la! susceptibilidad! al! cáncer.! Entre! estas! enfermedades! están! las! que! afectan! a! varias! helicasas!RECQ,!como!los!síndromes!de!Bloom,!de!Rothmund-Thomson!y!de!Werner,!y! las!que!afecta!al!sistema!de!reparación!de!roturas!de!la!doble!cadena!de!ADN,!como!la! ataxia!telangiectasia![26]–[31]!(Tabla!1).! ! Los! sistemas! de! reparación! de! daños! en! el! ADN! contribuyen! a! mantener! la! integridad! del! genoma! para! permitir! el! correcto! funcionamiento! de! la! célula! y! su! división! (Tabla! 1).! La! acumulación! de! mutaciones! en! los! genes! implicados! en! estos! mecanismos!de!reparación!da!lugar!a!una!disminución!de!su!eficiencia!a!medida!que!la! célula!envejece![32].!Para!evitar!la!proliferación!de!células!aberrantes,!existen!puntos! de!control!en!las!distintas!fases!del!ciclo!celular!que!permiten!su!arresto!en!caso!de! detectarse!daños!irreparables!en!el!material!genético.!La!proteína!p53!juega!un!papel! central! en! la! eliminación! de! estas! células! aberrantes! mediante! el! sistema! inmune! o! mediante!su!transformación!en!células!senescentes,!incapaces!de!proliferar![33],![34].!! ! Además,! la! inestabilidad! genómica! puede! estar! producida! por! mutaciones! en! las! proteínas! de! la! lámina! nuclear,! que! desempeñan! un! papel! ! fundamental! en! la! organización! espacial! y! temporal! del! material! genético! [35].! Entre! ellas! destaca! la! lamina!tipo!A!que!es!un!componente!estructural!que!mantiene!la!arquitectura!de!la! cromatina.! Alteraciones! en! esta! proteína! producen! daños! a! nivel! replicativo,! transcripcional!y!de!reparación!y!silenciamiento!!del!ADN![36].!Mutaciones!en!el!gen! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 19! de!lamina!tipo!A!causan!la!progeria!de!Hutchinson-Gilford!(HGP),!que!es!el!síndrome! de! envejecimiento! prematuro! más! característico,! y! el! síndrome! de! dermopatía! restrictiva!letal![37].!! ! También!hay!estudios!que!indican!la!posibilidad!de!que!en!pacientes!con!AR!o! con!artrosis!haya!un!aumento!de!la!inestabilidad!cromosómica.!Así!se!ha!comunicado! que!los!pacientes!con!artritis!reumatoide!presentan!niveles!elevados!de!roturas!de!la! doble! cadena! del! ADN! en! comparación! con! controles! sanos! ! en! distintas! subpoblaciones!de!células!sanguíneas!como!los!polimorfonucleares,!y!las!células!CD4+! tanto! naïve! como!memoria![38].! Esta! acumulación! de! daños! se! ha! asociado! con! defectos!en!los!sistemas!de!reparación!del!ADN!y!niveles!bajos!de!la!enzima!quinasa! ataxia!telangiectasia!mutada!(AT),!necesaria!para!la!reparación!de!roturas!en!la!doble! hebra!de!ADN![39].!Por!su!parte,!se!han!encontrado!incrementadas!las!aberraciones! cromosómicas,! especialmente! las! trisomías! y! tetrasomías,! en! los! condrocitos! de! 33! pacientes!con!artrosis!de!rodilla!y!cadera!comparados!con!los!condrocitos!procedentes! de!!la! cabeza!femoral!de! 20!controles![40].! Sin!embargo,!algunos!de!estos!hallazgos! han! sido! obtenidos! con! técnicas! indirectas! [37],! la! disminución! en! ATM! no! ha! sido! estudiada! por! grupos! de! investigación! diferentes! del! que! la! describió! [38],! y! las! aberraciones! cromosómicas! descritas! en! la! artrosis,! se! han! observado! en! lesiones! avanzadas,!por!lo!que!no!está!claro!si!representan!el!daño!acumulado!por!el!tejido!o! forman! parte! de! los! mecanismos! patogénicos! [39].! Luego! la! relevancia! de! estos! hallazgos!no!está!clara,!y!aunque!permiten!proponer!la!hipótesis!de!su!participación!en! un!posible!envejecimiento!acelerado!en!la!AR!y!en!la!artrosis,!no!la!demuestran.!!! ! Acortamiento telomérico ! Los! telómeros! son! estructuras! especiales! de! cromatina! formadas! por! repeticiones!en!tándem!de!la!secuencia!TTAGGG!que!alcanzan!10!a!15!kb!de!longitud! en! humanos.! A! esta! secuencia! se! unen! proteínas! específicas! que! protegen! los! extremos! de! los! cromosomas! de! la! degradación! enzimática! y! de! la! acción! de! los! sistemas! de! reparación! de! roturas! del! ADN! (Figura! 3A! y! B).! Debido! al! sistema! de! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 26! ! Figura!5.!Principales!rutas!implicadas!en!el!envejecimiento!sobre!las!que!actúan!las! sirtuinas.!Basada!en!Giblin&y&col.!![71].! ! No! se! han! investigado! las! marcas! de! las! histonas! en! relación! con! el! envejecimiento!en!la!AR!ni!en!la!artrosis,!aunque!se!han!caracterizado!cambios!con!la! edad! en! dos! de! las! marcas! que! regulan! la! expresión! de! un! factor! de! transcripción,! Nfat1,!necesario!para!el!mantenimiento!de!la!homeostasis!del!cartílago!articular!en!el! adulto.!El!incremento!de!la!expresión!de!este!factor!con!la!edad!se!debe!a!la!unión!de! la!histona!H3K4me2!al!promotor!de!Nfat1,!reemplazando!a!la!histona!H3K9me2,!que!lo! mantiene! silenciado! durante! el! desarrollo! [72].! Por! otra! parte,! varios! estudios! han! analizado!los!cambios!que!se!producen!en!algunas!deacetilasas.!Así,!por!ejemplo,!se!ha! visto!que!las!HDAC!y!Sirt1!están!sobreexpresadas!en!el!tejido!sinovial!de!los!pacientes! con!AR![73].!El!TNF!es!uno!de!los!estímulos!que!induce!esta!sobreexpresión.!Además,! los! niveles! elevados! de! HDAC! o! de! Sirt1! contribuyen! a! la! producción! de! citoquinas! inflamatorias,! mientras! que! los! inhibidores! de! HADC! o! el! silenciamiento! de! Sirt1! las! reducen.! Por! ello,! se! ha! propuesto! que! los! inhibidores! de! HDAC! pueden! ser! tratamientos!eficaces! en!la!AR! [73].!En! varios!de! estos!estudios!se! utilizó!sinovia! de! pacientes!con!artrosis!como!comparación!y!siempre!mostró!niveles!más!bajos!de!HDAC! o!de!Sirt1!que!la!de!los!pacientes!con!AR.!Sin!embargo,!la!situación!en!el!cartílago!de! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 27! los!pacientes!con!artrosis!parece!que!es!distinta!de!la!observada!en!la!sinovia.!Así,!una! de! las! HDAC,! HDAC7,! está! elevada! en! este! tejido! y! su! nivel! incrementado! se! correlaciona!con!proteínas!que!participan!en!el!daño!como!MMP13![74].!Posiblemente! esta! es! la! causa! de! que! los! inhibidores! de! HDAC! también! produzcan! efectos! beneficiosos! en! el! cartílago! en! modelos! de! artrosis,! lo! que! hace! que! se! consideren! también!como!posibles!tratamientos!!para!esta!enfermedad.!Por!su!parte,!una!sirtuina,! Sirt6,!está!disminuida!en!el!cartílago!de!pacientes!con!OA!y!cuando!es!inducida!en!el! cartílago!de!ratones!protege!de!OA.!La!protección!está!mediada!por!una!disminución! de!la!senescencia!celular!y!por!el!control!de!la!ruta!del!NFkB![75].!!! ! Por!otra!parte,!otra!sirtuina,!Sirt3,!disminuye!en!el!cartílago!con!la!edad,!y!esta! disminución!se!asocia!con!un!incremento!de!la!acetilación!de!las!lisinas!y!disminución! de!la!capacidad!antioxidante!por!reducción!de!la!expresión!de!la!superóxido!dismutasa! mitocondrial! 2! (SOD2)! [76].! ! Estos! experimentos! que! unen! evidencias! obtenidas! en! ratas,!ratones!y!tejidos!de!pacientes,!indican!que!la!disminución!de!Sirt3!con!la!edad! reduce!la!capacidad!de!neutralizar!la!oxidación!mitocondrial!del!cartílago!y!predispone! a!la!artrosis.!Luego!en!el!cartílago!parece!que!se!unen!aumento!de!alguna!HDAC!con! disminución! de! las! sirtuinas! como! factores! favorecedores! de! la! OA.! Este! panorama! complejo! y! la! falta! de! experimentos! específicos! hacen! que! no! se! pueda! predecir!la! repercusión! que! los! cambios! observados! en! HDAC! y! sirtuinas! pueden! tener! en! el! envejecimiento!celular!ni!en!la!AR!ni!en!la!OA.!! ! Metilación*del*ADN* La! metilación! del! ADN! es! uno! de! los! mecanismos! más! importantes! de! regulación!del!genoma!que!consiste!en!la!adicción!de!un!grupo!metilo!al!carbono!5!de! la!citosina!de!un!dinucleótido!citosina-fosfato-guanina!(CpG).!Una!parte!de!estos!sitios! CpG!se!localizan!en!promotores!y!enhancers!agrupados!en!las!islas!CpG.!Para!que!una! región!se!considere!una!isla!CpG!debe!tener!al!menos!500!pares!de!bases!y!un!50%!de! contenido!de!CG,!siendo!la!ratio!de!sitios!CpG!observados!y!esperados!≥!0.6.!Las!islas! CpG! son! frecuentes! en! los! promotores! de! los! genes! housekeeping,! donde! están! permanentemente!desmetiladas;!pero!también!se!encuentran!en!regiones!repetitivas! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 28! del!genoma!donde!están!constantemente!metiladas.!Parece!que!la!metilación!de!estas! regiones!es!la!responsable!de!su!silenciamiento!debido!a!la!pérdida!de!afinidad!de!los! factores!de!transcripción!y!unión!de!proteínas!de!represión!específicas,!llamadas!MeCP! ("Methyl-Cytosine-binding-Protein")![77].!Sin!embargo,!también!existen!sitios!CpG!que! no! forman! parte! de! las! islas! CpG,! sino! que! se! encuentran! dispersos! a! lo! largo! del! genoma.!La!función!de!estos!sitios!CpG!no!está!todavía!totalmente!esclarecida!pero!su! estudio!ha!cobrado!importancia!al!descubrir!que!los!cambios!de!metilación!de!estos! sitios!están!asociados!con!diferentes!condiciones!y!patologías.!Algunos!de!estos!sitios! también!se!asocian!con!cambios!de!expresión!en!genes!cercanos!o!con!la!procesividad! de!las!polimerasas!de!ARN.!! ! El!estudio!de!los!patrones!de!metilación!de!los!diferentes!tejidos!ha!dado!lugar! al! conocimiento! de! las! distintas! regiones! diferencialmente! metiladas! (DMRs).! Recientemente!este!estudio!se!ha!ampliado!al!estudio!de!los!cambios!cuantitativos!de! metilación!(QDMRs),!que!permiten!distinguir!no!sólo!regiones!totalmente!metiladas!y! totalmente! desmetiladas,! sino! también! con! distintos! grados! de! metilación,! lo! que! ocurre!en!muchos!sitios!CpG!a!lo!largo!de!la!vida!del!individuo![78].!! ! Se! ha! documentado! una! disminución! en! la! metilación! en! los! elementos! repetitivos!del!genoma!durante!el!envejecimiento,!que!se!ha!propuesto!que!promueve! reordenamientos! cromosómicos! y! eleva! la! tasa! de! mutación! [79]–[81].! En! contraposición! se! observa! un! incremento! en! la! metilación! de! las! islas! CpG! de! las! regiones!promotoras,! que!conducen!a!una!disminución!de!la!expresión! de!los!genes! que!regulan,!si!bien!al!suponer!una!menor!proporción!del!genoma!frente!a!las!regiones! repetitivas!se!habla!siempre!de!una!hipometilación!global!del!ADN!con!la!edad! [82],! [83].! Estos! cambios! se! han! apreciado! también! en! células! senescentes! y! en! enfermedades!progeroides![84],![85].!! ! Con!la!aparición!de!los!chips!de!metilación!de!Illumina,!que!permiten!analizar! 27000!o!450000!sondas!a!lo!largo!de!todo!el!genoma,!numerosas!publicaciones!han! comunicado! un! elevado! número! de! cambios! en! los! niveles! y! localización! de! la! de! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 29! metilación!genómica!asociados!con!la!edad!tanto!en!células!sanguíneas!como!en!otros! tejidos! [83],! [86]–[94].! Algunos! de! estos! cambios! se! han! analizado! funcionalmente,! como!es!el!caso!de!la!hipermetilación!del!promotor!del!gen!COX7A1!con!la!edad,!que! está!implicado!en!el!metabolismo!de!la!glucosa,!!y!que!está!asociada!a!la!diabetes!tipo! 2! [95].! La! deposición! de! proteína! β-amilode! en! el! cerebro! también! está! relacionada! con!una!desmetilación!progresiva!de!su!promotor!a!medida!que!el!individuo!envejece.! Esta!desmetilación!también!se!observar!en!pacientes!con!la!enfermedad!de!Alzheimer! [96].! Se! han! considerado! también! cambios! con! mayor! repercusión! como! la! hipermetilación!del!ADN!ribosomal,!lo!que!daría!lugar!a!una!disminución!de!la!síntesis! proteica! durante! el! envejecimiento! [97]–[99].! En! la! misma! línea,! se! ha! descrito! una! hipermetilación!de!los!promotores!de!diferentes!factores!de!transcripción!en!células! madre!de!distintos!tejidos!que!explicarían!en!parte!la!extenuación!de!las!mismas!y!la! pérdida!de!regeneración!tisular!durante!el!envejecimiento![100],![101].!!Sin!embargo!la! mayoría!de!cambios!de!metilación!asociados!con!el!envejecimiento!se!encuentran!en! regiones!intergénicas!y!que!aparentemente!carecen!de!funcionalidad![102],![103].!Así,! el! sitio! CpG! más! asociado! con! la! edad! en! diferentes! estudios,! el! cg16867657!se! encuentra! en! el! gen! ELOVL2! que! codifica! para! una! proteína! transmembrana! que! participa! en! la! elongación! de! ácidos! grasos! poliinsaturados! de! cadena! larga! y! sin! implicación!en!el!envejecimiento!conocida![104].!! ! Ante! la! falta! de! evidencias! sobre! el! mecanismo! específico! por! el! cual! tienen! lugar! cambios! de! metilación! con! la! edad,! se! ha! propuesto! un! modelo! de! deriva! epigenética.!Según!este!modelo,!los!niveles!de!metilación!específicos!de!cada!sitio!CpG! se! modifican! al! azar! por! insuficiente! exactitud! del! sistema! de! mantenimiento! y! los! cambios!se!acumulan!con!el!paso!del!tiempo![105].!De!esta!forma,!los!sitios!CpG!que! están! metilados! en! la! juventud! tenderían! a! desmetilarse! con! el! paso! del! tiempo! y! ocurriría! lo! contrario! con! los! sitios! que! presentan! niveles! de! metilación! bajos! en! edades!tempranas.!Estos!cambios!se! añaden!a!los! que!ocurren!por! otras!razones!ya! que! aunque! los! patrones! de! metilación! de! las! células! somáticas! son! generalmente! estables!y!heredables!a!través!de!las!divisiones!celulares,!incluso!de!manera!completa! como! ocurre! en! las! células! germinales.! A! medida! que! las! células! se! diferencian! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 30! adquieren!los!patrones!característicos!de!cada!tejido!a!la!par!que!se!producen!otros! cambios!en!la!metilación!en!respuesta!a!circunstancias!del!individuo!o!a!exposiciones! ambientales.!Todos!estos!cambios!se!van!produciendo!por!la!maquinaria!de!metilación! y!desmetilación! del!ADN,! !cuyos!errores!se!incrementan!en!las! células!neoplásicas! y! durante!el!envejecimiento![106].!Los!mecanismos!de!control!de!la!metilación!incluyen! metiltransferasas!de!mantenimiento!(DNMT1),!que!copian!el!patrón!de!la!hebra!madre! en! la! hija! durante! la! división! celular,! y! de! metilación! de# novo! (DNMT3A! y! B)! que! añaden!nuevos!sitios!metilados.!Además,!estas!metiltransferasas!interaccionan!con!las! HDAC!para!actuar!conjuntamente!en!la!represión!transcripcional.!Las!desmetilaciones! pueden!tener!lugar!por!la!simple!falta!de!mantenimiento!en!los!procesos!de!metilación! o!por!desmetilación!activa!mediante!las!enzimas!TET!que!oxidan!la!5-metilcitosina!a!5hidroximetil!citosina![107].! ! Aunque!se!sospecha! que! los!cambios!de! metilación! del!ADN!tienen! un! papel! importante!en!la!patogenia!de!la!artrosis!y!de!la!AR,!todavía!no!se!han!estudiado!con! detalle.!Así!se!han!descrito!patrones!de!metilación!que!diferencian!a!los!sinoviocitos!de! pacientes! con! AR! de! los! controles,! incluyendo! una! hipometilación! global! [108].! También!se!ha!visto!que!hay!cambios!en!los!linfocitos!T!CD4!naïve!de!los!pacientes!con! AR!y,!de!forma!destacable,!que!algunos!de!esos!cambios!son!similares!a!los!observados! en! los! sinoviocitos! [108].! Las! consecuencias! que! estos! cambios! puedan! tener! en! la! patogenia! de! la! AR! todavía! no! se! conocen,! aunque! hay! algunos! que! parecen! importantes!como!la! hipometilación!en!el!promotor! del!gen!de!la!IL-6!en!las!células! sanguíneas!se!asocia!con!una!elevada!producción!de!ARNm!de!IL-6!en!experimentos!in# vitro![109].! Tampoco! se! ha! estudiado! si! hay! alguna! relación! de! los! cambios! con! el! envejecimiento! o! si! muestran! signos! de! envejecimiento! acelerado.! En! cuanto! a! la! artrosis,!se!han!descrito!algunos!SNPs!que!dan!lugar!a!la!aparición!de!sitios!CpG!y!que! están! asociados! con! la! susceptibilidad! a! padecer! artrosis,! como! rs225014! en! DIO3! y! rs143383! en! GDF5.! Sin! embargo,! la! mayoría! de! los! cambios! en! la! metilación! observados!en!los!condrocitos!no!son!genéticos!sino!que!probablemente!son!debidos!a! los!mecanismos!de!adaptación!al!estrés!al!que!están!sometidos!a!lo!largo!de!la!vida!del! individuo! [110].! Varios! estudios! del! metiloma! han! observado! diferencias! entre! el! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 31! patrón!de!metilación!de!los!condrocitos!de!los!pacientes!con!OA!en!comparación!con! los! controles! [111].! Sin! embargo,! todavía! no! se! ha! estudiado! si! los! cambios! en! la! metilación!asociados!con!la!artrosis!tienen!relación!con!la!edad!de!los!pacientes,!ni!si! se!asocian!con!envejecimiento!acelerado.!! ! ARN$no$codificante$ Recientemente,! los! ARN! no! codificantes! (ARNnc)! han! emergido! como! importantes!moléculas!reguladoras!de!la!expresión!génica.!Son!ARN!que!no!codifican! proteínas! y! que! regulan! la! expresión! a! nivel! postranscripcional! mediante! varios! mecanismos.!El!más!común!consiste!en!inhibir!la!traducción!a!proteínas!al!unirse!de! forma! complementaria! a! los! transcritos! de! ARNm! [112],! [113].! ! El! conocimiento! de! estos! ARNnc! y! de! su! función! todavía! es! muy! incompleto! pero! algunos! ya! se! han! relacionado!con!el!envejecimiento.!! ! Uno! de! los! ARNnc! más! claramente! relacionados! con! el! envejecimiento! hasta! ahora!es!ANRIL!que!pertenece!al!grupo!de!los!ARN!largos!no!codificantes!(ARNlnc).!La! secuencia!de!este!ARNlnc!se!encuentra!en!el!clúster!génico!INK4A-ARF-INK4B.!Una!vez! expresado,!ANRIL!regula!negativamente!la!expresión!de!las!proteínas!que!se!codifican! en!ese!mismo!clúster.!Estas!proteínas! tienen!un! papel!importante! en!la! senescencia! celular,! como! se! comentará! más! adelante,! y! por! ello! ANRIL! está! implicado! en! la! proliferación!y!senescencia![114]–[116].!Implicación!que!se!refleja!en!que!el!locus!se! ha!asociado!en!estudios!de!genoma!completo!con!varias!enfermedades!características! de! edad! avanzada! y,! dentro! del! locus,! la! expresión! de! ANRIL! es! la! que! mostró! la! asociación!más!fuerte!con!los!múltiples!fenotipos![117].!Por!ello,!se!piensa!que!no!sólo! tiene!un!papel! en!el! envejecimiento!celular! sino! que!alguno! de!sus! alelos! acelera!el! envejecimiento!aumentando!la!susceptibilidad!a!la!enfermedad!coronaria!o!la!diabetes! tipo!2!entre!otras!enfermedades.!Sin!embargo,!no!se!ha!encontrado!asociación!de!este! locus! con! AR! o! con! OA.! Otros! ARNlnc! también! parecen! relacionados! con! el! envejecimiento.! Entre! ellos,! destacan! SAL-RNA1,! MALAT1! y! MIAT! que! retrasan! la! senescencia!según! experimentos!en!los! que!se!veía!que!tenían! un!nivel!reducido!en! células! senescentes,! y! cómo! el! silenciamiento! de! cada! uno! de! ellos! inducia! varias! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 32! características! del! fenotipo! senescente! [118].! Otros! ARNlnc! han! mostrado! expresión! diferencial! en! células! senescentes! y! células! jóvenes! pero! todavía! se! desconocen! los! mecanismos! de! su! implicación! [115],! y! de! otros! se! sabe! que! están! involucrados! en! procesos!inducidos!por!daño!en!el!DNA!por!lo!que!también!podrían!estar!relacionados! con!el!envejecimiento![119].!!! ! En!cuanto!a!los!microARNs,!se!han!descrito!numerosos!cambios!de!expresión! de! los! mismos! en! las! distintas! etapas! de! la! vida! [120]–[122].! La! mayoría! de! estos! estudios! han! analizado! muestras! de! sangre! pero! no! han! mostrado! resultados! consistentes!entre!sí.!Por!lo!tanto,!no!es!posible!todavía!definir!qué!microARNs!están! asociados!con!la!edad!de!una!forma!reproducible!aunque!algunos!se!han!replicado!en,! al!menos,!dos!grupos!de!sujetos!como!miR-24,!-363,!-106a,!-126,!-30d,!y!-21.!Debido!al! diseño!de!estos!estudios!no!es!posible!distinguir!si!se!trata!de!meros!biomarcadores!de! envejecimiento! o! si! los! microARN! tienen! un! papel! causal! en! el! envejecimiento! y! la! senescencia.! En! suero! se! han! encontrado!!microARNs! que!son! diferentes! entre! pacientes! que! han! muerto! jóvenes! o! que! han! llegado! a! centenarios! en! muestras! obtenidas!años!antes!de!la!muerte![122].!Estos!microARNs!podrían!tener!un!papel!más! directo! en! el! envejecimiento,! pero! el! pequeño! tamaño! del! único! estudio! con! este! diseño! no! permite! considerarlo! como! más! que! como! una! posibilidad.! Una! evidencia! más!directa!de!la!implicación!causal!de!los!miRNA!en!el!envejecimiento!se!ha!obtenido! gracias! al! estudio! de! modelos! animales! de! síndrome! de! envejecimiento! acelerado!! [123],![124].!Tres!de!los!miRNA!identificados!en!estos!estudios!son!miR-29,!-124!y!-365.!! La!demostración!de!su!papel!causal!en!el!envejecimiento!tiene!relevancia!también!en! relación!con!el!envejecimiento!uniforme!de!los!distintos!tejidos!del!organismo,!ya!que! se!ha!sugerido!que!los!microARNs!podrían!explicar!este!fenómeno![125].!! ! En!cuanto!a!las!enfermedades!reumáticas,!en!la!artrosis!diversos!micro-ARN!se! han! relacionado! con! cambios! de! expresión! en! diferentes! factores! implicados! en! la! patología.! Así,! miR-146a! reprime! la! expresión! del! gen! de! la! IL-1! además! de! estar! relacionado! con! en! el! dolor! de! los! pacientes! tanto! con! artrosis! como! con! artritis! reumatoide! [126].! Sin! embargo,! en! un! array! de! miR-RNAs! solo! miR-199a-3p,! 193b! y! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 33! 320c,!tenían!una!expresión!en!cartílago!de!pacientes!con!reemplazamiento!de!rodilla! en! relación! con! la! edad! [127].! En! los! pacientes! de! AR! también! el! miR-146a! se! ha! encontrado! incrementado! en! sangre! y! tejido! sinovial! y! junto! con! el! miR-155! han! demostrado! ser! los! miR-RNAs! más! importantes! en! la! AR.! Su! implicación! en! el! envejecimiento!está!todavía!!sin!esclarecer,!si!bien!se!ha!propuesto!que!podrían!jugar! un!papel!en!la!regulación!de!la!inflamación![128],![129].!! ! Pérdida de la homeostasis proteica ! La! homeostasis! proteica! o! proteostasis! es! el! conjunto! de! rutas! biológicas! mediante!las!cuales!la!célula!controla!la!biogénesis,!plegamiento,!tráfico!y!degradación! de! las! proteínas! tanto! internas! como! de! secreción! [130],! [131].! Por! lo! tanto,! los! mecanismos!implicados!en!la!proteostasis!son:!la!maquinaria!de!traducción!ribosomal,! el! sistema! de! plegamiento! mediado! por! chaperonas! y! sobre! todo! los! sistemas! de! degradación,! autofágica,! lisosomal! y! proteasomal.! Estos! mecanismos! de! mantenimiento!se!ven!afectados!durante!procesos!de!estrés,!diferentes!enfermedades! y!durante!el!envejecimiento![132].!! ! La! alteración! de! la! tasa! de! síntesis! proteica! es! el! mecanismo! principalmente! afectado!por!la!edad.!La!simple!reducción!de!la!tasa!de!traducción!es!suficiente!para! incrementar! la! longevidad! en! múltiples! especies.! Se! ha! hipotetizado! que! se! deba! simplemente! a! una! reducción! de! la! carga! sobre! la! maquinaria! de! plegamiento! y! eliminación,!que!tiende!a!ser!más!ineficiente!en!el!organismo!envejecido![133]–[135].! Sin! embargo! también! se! ha! visto! que! la! disminución! de! la! traducción! genera! una! selección! de! los! ARNm! que! van! a! ser! traducidos! favoreciendo! la! síntesis! de! determinadas!proteínas!que!están!implicadas!en!el!incremento!de!la!longevidad![136].!! ! En! cuanto! al! sistema! de! plegamiento! proteico,! el! nivel! de! expresión! de! las! chaperonas!se!incrementa!en!respuesta!al!estrés![137].!Un!ejemplo!es!la!respuesta!al! estrés!térmico!en!C.#Elegans.!Se!ha!establecido!una!relación!causal!entre!el!incremento! de! expresión! de! proteínas! del! sistema! de! respuesta! a! estrés! térmico! ! (Heat# stress# ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 34! response,( HSR)! y! el! incremento! de! la! longevidad;! mientras! que! su! deficiencia! causa! envejecimiento!prematuro![138]–[140].!También!en!ratones!deficientes!en!proteínas! de! este! sistema! tienen! una! menor! longevidad! y! ! fenotipos! progeroides! exacerbados! [141].! Los! problemas! de! plegamiento! proteico! tienen! especial! importancia! en! el! retículo! endoplasmático! (RE)! y! sobre! todo! en! tipos! celulares! especializados! en! la! secreción! de! proteínas! por! su! elevada! demanda! [142].! Además! el! RE! junto! con! el! sistema!de!vesículas!está!relacionado!con!el!tráfico!proteico!cuyo!mal!funcionamiento! está!también!ligado!al!envejecimiento!prematuro![143].! ! Finalmente,! para! una! proteostasis! eficiente! es! fundamental! el! correcto! funcionamiento!de!los!mecanismos!de!degradación!proteica!puesto!que!son!el!punto! final!de!la!ruta!que!impide!la!acumulación!y!agregado!de!proteínas!disfuncionales.!El! mecanismo! principal! de! degradación! de! proteínas! dañadas! o! mal! plegadas! es! el! proteasoma! [144].! Durante! el! envejecimiento! disminuye! la! expresión! de! las! subunidades!proteicas!que!lo!conforman,!se!desensambla!o!se!inactiva!por!interacción! con! agregados! proteicos! [145]–[147].! Esto! genera! una! acumulación! de! proteínas! disfuncionales! que! colapsan! la! célula! e! inducen! su! senescencia! [148].! Además,! fibroblastos! tratados! con! inhibidores! de! proteasomas! presentan! una! capacidad! de! división!menor!y!desarrollan!un!fenotipo!senescente![149].!Ratones!con!deficiencias!en! diferentes!proteínas!de!este!sistema!muestran!envejecimiento!prematuro!y!una!vida! más! corta! [150],! [151].! En! el! caso! de! proteínas! o! agregados! proteicos! de! mayor! tamaño!la!degradación!y!eliminación!se!produce!por!el!sistema!autofágico-lisosomal.! Este! sistema! también! se! ve! afectado! por! el! envejecimiento,! con! la! consiguiente! disminución!en!el!número!de!organelas!dañadas!que!se!eliminan!y!acumulación!de!la! carga!no!digerida!en!los!lisosomas![152],![153].!Así,!numerosas!proteínas!implicadas!en! la!ruta!de!la!autofagia!están!disminuidas!en!los!tejidos!envejecidos![154].!!! ! En!general,!el!sistema!de!proteostasis!está!alterado!en!enfermedades!de!edad! avanzada,! como! las! enfermedades! de! Parkinson,! Alzheimer! o! Huntington,! y! en! los! síndromes! progeroides! [132],! [147].! También! se! han! asociado! con! algunas! de! las! principales!enfermedades!reumáticas.!!La!desregulación!de!la!homeostasis!proteica!en! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 35! la! artrosis! se! ha! asociado! a! la! deficiente! autofagia! que! se! produce! con! el! envejecimiento.!En!los!condrocitos!existe!una!activación!constitutiva!de!la!autofagia,! que! se! ve! comprometida! durante! el! envejecimiento! por! la! disminución! de! AMPK,! molécula! clave! de! la! detección! de! nutrientes,! como! se! explicará! en! el! epígrafe! siguiente.! Este! hecho! se! ha! asociado! con! un! incremento! de! la! apoptosis! y! degeneración!del!cartílago![155].!! Por!el!contrario,!en!la!AR!se!observan!otro!tipo!de!cambios!en!la!homeostasis! proteica.!Por!un!lado,!se!incrementan!numerosas!proteínas!del!sistema!de!respuesta!a! estrés! tanto! en! las! células! sanguíneas! como! en! el! tejido! sinovial! de! los! pacientes.! Consecuentemente! con! el! incremento! de! estas! proteínas! se! ven! incrementados! los! niveles!de!autofagia!en!los!fibroblastos!de!los!pacientes!con!AR,!si!bien!su!papel!en!la! apoptosis!o!la!supervivencia!de!estas!células!es!aún!controvertido! [156],![157].!Otro! aspecto!cuya!repercusión!no!está!todavía!clara!es!que!varios!estudios!indican!que!las! chaperonas! pueden! ser! autoantígenos! de! las! células! T! y! B! en! la! AR! y! que! hay! autoanticuerpos!específicos!contra!proteínas!citrulinadas!del!sistema!de!respuesta!al! estrés.!! ! Desregulación de la detección de nutrientes ! La!desregulación!de!la!detección!de!nutrientes!implica!cualquier!alteración!del! eje!somatotrófico.!Este!eje,!en!los!mamíferos,!comprende!la!hormona!de!crecimiento! (GH),!producida!por!la!pituitaria,!y!su!mediador!secundario,!el!factor!de!crecimiento! insulínico!(IGF-1).!!Existen!otros!sistemas!secundarios!de!detección!de!nutrientes!que! participan! en! la! generación! de! energía! y! están! presentes! en! la! mayoría! de! los! tipos! celulares! (Figura! 6).! Algunas! de! las! primeras! evidencias! indicando! que! estas! rutas! participan!en!la!longevidad!se!obtuvieron!en!modelos!animales!con!mutaciones!en!los! genes!para!estas!proteínas.!Otras!evidencias!provienen!de!cambios!en!la!expresión!de! estas! proteínas! en! animales! sometidos! a! restricción! calórica! para! prolongar! su! esperanza!de!vida![158]!(Figura!6).!! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 42! Es! importante! destacar! que! las! células! senescentes! difieren! de! las! células! quiescentes!o!que!pierden!la!capacidad!de!replicación!en!que!estas!lo!hacen!debido!al! proceso! de! diferenciación! y! no! en! respuesta! al! estrés! o! daños! en! el! ADN.! Por! otra! parte,!! las!células!senescentes!tienen!resistencia! a!la! apoptosis!y! alteraciones!en!las! funciones!celulares![227]!y!nunca!alcanzarían!el!fenotipo!SASP![228].!! ! En!cuanto!a!las!enfermedades!reumáticas,!diversos!marcadores!de!senescencia! como!p53,!p16!y!SA-β-gal!celular!se!han!visto!incrementados!en!el!tejido!sinovial!tanto! de!AR!establecida!como!de!reciente!comienzo!e!incluso!se!han!visto!variantes!mutadas! de!p53!que!favorecen!la!proliferación!de!los!fibroblastos!y!la!producción!de!IL-6![229].! Diversos! estudios! apuntan! a! que! la! senescencia! afecta! también! a! las! células! madre! hematopoyéticas! de! la! médula! ósea! durante! la! AR.! Así,! estas! células! tienen! menor! capacidad!para!formar!colonias!que!las!derivadas!de!controles!sanos!y!mayor!tasa!de! apoptosis.!Sin!embargo,!esta!senescencia!de!las!células!madre!es!independiente!de!la! actividad!de!la!enfermedad!y!su!duración,!e!incluso!indiferente!en!pacientes!tratados!y! no! tratados! si! bien! la! elevación! de! TNF-α! en! la! médula! ósea! parece! incrementar! la! apoptosis!de!las!células!madre!hematopoyéticas![230].!! ! En!relación!a!la!artrosis,!a!pesar!de!que!los!condrocitos!tienen!tasas!bajas!de! replicación,!se!han!descubierto!linajes!destinados!a!la!regeneración!y!mantenimiento!! del! cartílago! que! pierden! su! capacidad! proliferativa! agravando! la! enfermedad! [155].! Además,!se!ha!descubierto!que!las!senescencia!de!los!condrocitos!es!dependiente!de! la!p16INK4a,!estando!relacionada!en!mayor!medida!con!la!respuesta!al!estrés!celular!que! con!el!fin!de!la!capacidad!de!replicación![231].!Sin!embargo,!el!papel!más!importante! de!las!células!senescentes!en!esta!patología!se!debe!al!desarrollo!del!fenotipo!SASP.!La! producción!de!citoquinas!inflamatorias!y!enzimas!que!degradan!la!matriz!extracelular! agravan! la! patogénesis! de! la! artrosis! erosionando! la! matriz! extracelular! y! retroalimentando!los!procesos!de!degradación![232].!!! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 43! Extenuación de las células madre ! Las! células! madre! se! caracterizan! por! su! capacidad! de! autorrenovación! mediante! divisiones! asimétricas! y! de! diferenciación! en! uno! o! más! tipos! celulares! distintos.! El! tamaño! de! la! población! de! células! madre! puede! por! tanto! crecer! si! se! favorece! la! autorrenovación! o! disminuir! si! se! favorece! el! proceso! de! diferenciación! [233].! Las! células! madre! de! adultos! residen! en! diferentes! órganos! y! en! condiciones! normales!son!capaces!de!diferenciarse!en!un!número!limitado!de!tipos!celulares!que! conforman! dicho! órgano.! Son! más! frecuentes! en! tejidos! con! mayor! desgaste! y! necesidad!de!regeneración!como!la!piel!o!la!mucosa!intestinal!que!en!otros!como!el! cerebro!y!el!músculo![234]–[236].!En!comparación!con!las!células!madre!embrionarias,! las! células! madre! del! adulto! tienen! una! capacidad! limitada! de! mantenimiento! de! la! longitud!de!sus!telómeros.!!Los!niveles!de!actividad!de!la!enzima!telomerasa!medidos! no!parecen!ser!suficientes!para!evitar!su!acortamiento!y!por!lo!tanto!estas!poblaciones! no! son! inmortales! como! ocurre! en! las! células! embrionarias! [237].! Esta! capacidad! proliferativa!finita!parece!estar!relacionada!también!con!las!rutas!de!INK4b/ARF-p53! [238].!! El!papel!de!las!células!madre!en!el!envejecimiento!se!ha!descrito!en!diferentes! modelos! murinos! deficientes! en! genes! como! Terc(-/-),! Ku86(-/-),! LIG4(Y288C),! XPD(R722W/R722W),!etc.!En!los!que!se!inhibe!la!renovación!de!los!tejidos!y!se!acelera! la! aparición! de! características! del! envejecimiento! [212–215].! Durante! el! envejecimiento!!normal! se! produce!un!aclaramiento! de! las!células!senescentes,! que! lleva!aparejado! una!movilización!de!las!células!progenitoras!para! renovar!el!tejido!y! mantener!el!número!de!células!del!mismo.!En!los!organismos!envejecidos!este!proceso! de!recambio!se!vuelve!ineficiente!debido!a!la!pérdida!de!la!capacidad!de!división!de!las! células! progenitoras,! favoreciendo! la! acumulación! de! células! senescentes.! El! agotamiento!de!las!células!madre!puede!deberse!a!todas!las!características!descritas! en!los!puntos!anteriores,!agravando!el!proceso!de!envejecimiento.!Existen!por!tanto! células!madre!envejecidas,!que!se!caracterizan!por!un!incremento!en!la!generación!de! ROS!intracelular,!daños!mitocondriales,!activación!de!la!ruta!PI3K-mTOR,!daños!en!el! ADN,! desequilibrios! en! la! proteostasis! y! bajos! niveles! de! SIRTUINA! 1! y! factores! de! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 44! trascripción!como!FOXO,!que!regulan!los!procesos!de!envejecimiento!como!ya!se!ha! descrito! anteriormente.! La! generación! de! ROS! fuerza! a! las! células! madre! a! salir! del! estado!de!quiescencia!y!dividirse!mediante!la!activación!de!la!ruta!de!señalización!de! PI3K-AKT.! Además! se! desencadena! la! respuesta! a! estrés! dependiente! de! FOXO! y! se! promueve! la! autofagia.! También! se! producen! alteraciones! epigenéticas,! incluidas! la! metilación!del!ADN!y!la!acetilación!de!las!histonas!que!juegan!aquí!!un!papel!clave!ya! que!son!los!principales!mecanismos!implicados!en!la!diferenciación!de!la!célula!madre! a!los!distintos!tipos!de!células!diferenciadas!a!los!que!puede!dar!lugar![239].! ! Conocer! los! mecanismos! moleculares! que! conducen! al! envejecimiento! de! las! células! madre! es! una! aproximación! crítica! a! la! hora! de! estudiar! los! causas! comunes! que!pueden!subyacer!a!distintas!comorbilidades![239].!Además!muchas!de!las!terapias! contra!el!envejecimiento!prematuro!de!ciertos!tejidos!se!han!centrado!en!el!estudio!de! la!reprogramación!de!las!células!madre!pluripotenciales![240].! !! En! la! artritis! reumatoide,! diversos! estudios! han! sugerido! alteraciones! en! los! niveles! de! las! células! madre! hematopoyéticas! ! como! causa! del! envejecimiento! prematuro! de! las! células! T! periféricas! observado! en! los! pacientes.! Además,! estas! células! sufren! una! tasa! mayor! de! apoptosis! en! los! pacientes! con! AR! que! está! relacionado! con! defectos! en! la! ruta! ERK! (! ruta! de! quinasas! regulada! por! señales! extracelulares)![241],![242].!! ! En! la! artrosis,! se! ha! demostrada! la! existencia! de! células! en! la! superficie! del! cartílago! embrionario! que! constituyen! un! reservorio! de! células! progenitoras! para! la! maduración!de!los!futuros!condrocitos!de!las!capas!profundas.!Sin!embargo,!el!papel! de!la!senescencia!o!el!envejecimiento!prematuro!de!estas!células!en!la!artrosis!todavía! no!ha!sido!esclarecidos[232],![243].!! ! ! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 45! Alteraciones de la comunicación intracelular ! El!envejecimiento!afecta!no!solo!a!la!célula!de!forma!individual!sino!también!a! las! comunicaciones! intercelulares! tanto! endocrinas,! como! neuroendocrinas! y! neuronales.! La! producción! de! hormonas! por! parte! del! sistema! nervioso! tiende! a! reducirse! con! la! edad! mientras! que! las! señales! inflamatorias! se! incrementan! y! en! general!el!ambiente!extracelular!cambia!con!el!envejecimiento![244],![245].!! ! En!relación!a!la!infamación!se!ha!descrito!un!fenotipo!característico!conocido! en!inglés!como!“inflammaging”!que!se!caracteriza!por!un!incremento!de!la!inflamación! de!forma!espuria!en!los!mamíferos!envejecidos.!Esta!inflamación!puede!deberse!a!la! ineficiencia! del! sistema! inmune! para! eliminar! patógenos! o! células! disfuncionales,! al! fenotipo!SASP!de!las!células!senescentes,!al!incremento!de!la!activación!del!factor!de! transcripción! NF-kB! o! a! mecanismos! defectuosos! de! autofagia! [246].! Estos! desencadenantes! inician! la! formación! del! inflamasoma,! que! es! un! gran! complejo! multiproteico!que!se!expresa!en!las!células!del!sistema!inmune!innato!y!que!controla!la! activación! de! la! caspasa-1! y! la! secreción! de! IL-1β! y! IL-18![247].! Su! activación! es! dependiente! de! la! proteína! mitocondrial! NLRP3,! cuya! depleción! conlleva! una! disminución!de!activación!de!este!complejo!y!una!disminución!de!la!respuesta!inmune! innata! a! medida! que! el! organismo! envejece.! Diversos! estudios! han! enfatizado! la! importancia!de!esta!inflamación!a!nivel!transcripcional![248],!y!se!ha!demostrado!que! la! inhibición! de! la! transcripción! de! NF-KB! rejuvenece! tejidos! como! la! piel! [249],! y! previene!el!fenotipo!envejecido!en!modelos!de!ratón![250],![251].! ! Sin!embargo,!de!forma!paralela!a!este!incremento!en!la!inflamación!basal,!se! produce! una! disminución! de! la! respuesta! del! sistema! inmune! adaptativo! e! innato,! conocida! como! inmunosenescencia! [252].! Esta! disminución! tiene! lugar! debido! a! la! involución! del! timo! y! la! sustitución! de! la! médula! ósea! por! tejido! graso,! fenómenos! clásicamente!asociados!con!el!envejecimiento.!Pero!además,!a!medida!que!el!individuo! envejece! se! reduce! la! capacidad! de! fagocitosis,! de! migración! celular,! tienen! lugar! cambios!en!el!número!y!proporción!de!las!células!sanguíneas!y!disminuye!también!la! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 46! producción!de!anticuerpos!específicos![253].!Esta!disminución!de!la!respuesta!inmune! es!responsable!de!un!incremento!del!riesgo!a!sufrir!infecciones,!un!peor!aclaramiento! de!las!células!senescentes!y!un!incremento!de!células!tumorales![254].! ! Se!ha!estudiado!también!otro!tipo!de!sistemas!de!comunicación!entre!células! que! facilita! la! homogeneización! de! la! información! entre! las! células! del! órgano! que! conforman.!Un!ejemplo!son!las!uniones!adherentes,!que!facilitan!el!tránsito!de!ROS!y! citoquinas!generando!lo!que!se!conoce!como!“efecto!espectador”,!en!el!que!a!medida! que!aumenta!el!número!de!células!implicadas!en!un!proceso!resulta!más!fácil!que!las! células!vecinas!se!involucren!en!él![255].!!De!esta!forma,!el!envejecimiento!en!un!tejido! conduce! a! deterioro! en! otros! tejidos,! dando! lugar! al! fenómeno! conocido! como! envejecimiento!organismal![256].!! ! En!muchas!de!las!enfermedades!reumáticas!la!inflamación!es!un!componente! clave!en!el!desarrollo!de!la!patogénesis.!En!los!pacientes!con!artritis!reumatoide!se!han! observado!cambios!de!los!niveles!de!diferentes!tipos!celulares!del!sistema!inmune!así! como!incrementos!sistémicos!en!los!niveles!de!enzimas!proinflamatorias.!Además,!los! fibroblastos!derivados!de!pacientes!de!AR!que!se!vuelven!senescentes!tras!varios!pases! celulares,!producen!una!mayor!cantidad!del!IL-6,!IL-8,!VEGF!y!PGE2!en!respuesta!a!IL1β!que! las!células!de! pases!tempranos,! lo!que! típicamente!se! ha!relacionado! con!el! fenotipo!SASP![257].!! ! Tras! esta! breve! descripción! los! mecanismos! implicados! en! el! envejecimiento! podemos! afirmar! que! se! trata! de! un! proceso! complejo,! resultado! de! la! sinergia! de! todos!estos!mecanismos,!que!presentan!relaciones!intrincadas!entre!si.!Por!esta!razón,! resulta!difícil!encontrar!dianas!terapéuticas!que!puedan!ser!objeto!de!fármacos!para! revertir! los! efectos! patológicos! de! un! envejecimiento! exacerbado.! ! Sin! embargo,! en! algunas! enfermedades! se! ha! sugerido! la! implicación! de! forma! más! destacable! de! alguno!de! estos!componentes,! cuya!desregulación! prevalece!sobre!otros!factores.!El! estudio!de!estos!casos!particulares!ha!dado!lugar!a!!la!aparición!de!diferentes!teorías! del!envejecimiento!que!resumiremos!a!continuación.!! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 47! 3. Teorías sobre el envejecimiento ! Desde! la! teoría! de! Weissman! en! 1881,! mencionada! al! principio! de! este! documento,! se! han! sucedido! y! coexistido! otras! y! muy! diversas! teorías! acerca! del! envejecimiento,! sin! que! existan! suficientes! evidencias! científicas! para! descartar! o! postular! ninguna! de! ellas! como! verdadera.! Tanto! es! así,! que! algunas! de! las! teorías! clásicas! han! sido! actualizadas! en! base! a! los! nuevos! descubrimientos! científicos! manteniéndose! las! mismas! premisas! de! base.! Es! el! caso! de! la! teoría! de! Weissman,! revisada! por! Minot! en! 1907,! que! mantiene! la! idea! de! que! el! envejecimiento! es! el! precio! a! pagar! por! la! diferenciación! celular! o! las! teoría! de! los! radicales! libres! de! Harman,!1956,!revisada!por!Gerschman!en!1962![258].!! ! La!mayoría!de! teorías!propuestas!hasta!el! momento!apuntan!a! alguno!de!los! mecanismos! expuestos! anteriormente! como! causa! del! envejecimiento:! teoría! de! acumulación! de! mutaciones,! teoría! metabólica,! teoría! del! acortamiento! telomérico,! teoría!de!la!resistencia!a!la!insulina,!teoría!del!detrimento!del!sistema!inmune,!teoría! del!daño!mitocondrial,!etc.!lo!que!no!hace!más!que!evidenciar!la!compleja!y!variable! etiología!del!envejecimiento![259],![260].!! ! Sin!embargo!todas!estas!teorías!podrían!agruparse!en!dos!grandes!corrientes! de! pensamiento:! la! del! envejecimiento! como! un! evento! programado! y! la! del! envejecimiento! como! consecuencia! de! la! acumulación! de! daños.! En! la! primera! se! incluyen!teorías!como!la!antagonista!pleiotrópica!de!Williams!(1957),!que!propone!la! existencia! de! genes! que! se! expresan! de! forma! beneficiosa! para! el! organismo! en! las! etapas!tempranas!de!su!vida!pero!son!nocivos!pasada!la!madurez!sexual!del!individuo! [261].! Se! englobarían! en! esta! categoría! también! las! teorías! que! postulan! el! envejecimiento!como!consecuencia!del!decaimiento!del!sistema!inmune!o!endocrino! [262].!Así!por!ejemplo,!en!las!enfermedades!reumáticas!se!postula!un!decaimiento!del! sistema!inmune! como!posible! causa!del! desarrollo!de! la!patología,!observándose!en! múltiples!casos!que!la!inmunosenescencia!precede!al!desarrollo!de!la!enfermedad.!De! esta!forma!el!envejecimiento!prematuro!ocasionaría!la!aparición!de!las!enfermedades! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 48! conocidas!como!de!edad!avanzada!en!el!individuo![55],![263].!En!el!lado!opuesto!se! encuentran!las!teorías!del!uso!y!desgaste,!en!las!cuales!el!organismo!acumula!daños!en! ADN!o!proteínas!que!reducen!la!funcionalidad!de!los!tejidos![264].!En!línea!con!esta! teoría,!recientemente!varios!artículos!han!postulado!que!el!envejecimiento!prematuro! da! lugar! a! un! incremento! en! la! vulnerabilidad! de! los! tejidos! afectados,! pudiendo! desencadenarse! enfermedades! como! la! artrosis! [265],! [266]! o! las! enfermedades! neurodegenerativas![267].! ! 4. Medición del envejecimiento como proceso biológico ! Basándose! en! estas! teorías! que! resaltan! el! carácter! multifactorial! del! envejecimiento,!es!improbable!que!exista!un!único!biomarcador!capaz!de!recoger!toda! la! variabilidad! existente! y! proporcionar! una! medida! universalmente! válida! de! edad! biológica.! ! Sin! embargo,! existe! la! necesidad! de! medir! la! edad! biológica! para! poder! distinguir! entre! un! envejecimiento! saludable! y! normal,! de! un! envejecimiento! prematuro! o! acelerado! que! podría! ser! factor! de! riesgo! de! múltiples! enfermedades! [268].! Existen! intentos! recientes! de! combinar! datos! de! diferentes! marcadores! mediante! análisis! de! componentes! principales! para! obtener! medidas! de! edad! biológicas! que! engloben! los! diferentes! aspectos! etiológicos! mencionados,! si! bien! queda! mucho! camino! por! recorrer! para! su! validación! [269],! [270].! Actualmente! el! proyecto!europeo!MARK-AGE!tiene!como!objetivo!el!análisis!de!diferentes!parámetros! en!!3200!individuos!para!lograr!la!combinación!óptima!que!prediga!la!edad!biológica! [271].!Sin!embargo,!intentos!previos!de!biomarcadores!globales!no!han!sido!replicados! o!han!mostrado!peores!resultados!que!algunos!marcadores!únicos![272],![273].!! ! Existen! una! serie! de! características! establecidas! por! la! Federación! Americana! de!investigación! del!envejecimiento!para!que!un! biomarcador!de! edad!biológica! sea! considerado!válido![274]:! a) Predecir!la!tasa!de!envejecimiento,!o!en!otras!palabras,!predecir! en!qué!posición!se!encuentra!un!individuo!dentro!de!su!esperanza!de!vida.!Por! lo!tanto,!debe!ser!mejor!predictor!de!la!mortalidad!que!la!edad!cronológica.!! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 49! b) Reflejar! el! proceso! básico! de! envejecimiento! y! no! efectos! de! enfermedades!relacionadas.! c) Determinarse!de!forma!repetida!de!forma!no!invasiva.! d) Ser!válido!en!humanos!y!modelos!animales!como!el!ratón.!!! ! Esta!última!característica!ha!sido!cuestionada!debido!a!la!gran!diferencia!en!la! tasa!de!envejecimiento!entre!los!diferentes!mamíferos!usados!como!modelos!animales! [271].! Sin! embargo,! si! bien! el! biomarcador! idóneo! tendrá! como! objetivo! reflejar! la! esperanza!de!vida!del!individuo,!hay!que!tener!en!cuenta!que!existen!biomarcadores! que!presentan!una!baja!correlación!con!la!mortalidad!pero!son!ampliamente!utilizados! por! su! elevada! correlación! con! otras! manifestaciones! del! envejecimiento! como! la! disminución!en!la!capacidad!cognitiva!y!la!forma!física!del!individuo.!De!esta!forma,!en! función! de! la! finalidad! del! estudio,! existirán! biomarcadores! con! mayor! o! menor! utilidad,!independientemente!de!su!relación!con!la!esperanza!de!vida.!! ! Sin!embargo,!la!optimización!de!los!distintos!biomarcadores!de!la!edad!cuenta! también! con! una! serie! de! problemas! específicos! de! los! biomarcadores! del! envejecimiento!que!dificultan!su!búsqueda!y!su!aplicación.! En! primer! lugar! cabe! destacar! que! los! distintos! tejidos! y! órganos! de! un! individuo! pueden! tener! tasas! de! envejecimiento! diferentes.! Este! punto! es! especialmente! conflictivo,! pues! como! se! ha! mencionado! previamente,! existe! un! envejecimiento! a! nivel! local! o! tisular,! diferente! del! envejecimiento! organismal,! más! difícil! de! capturar! con! un! único! biomarcador,! si! bien! probablemente! sea! de! mayor! utilidad.!Además,!se!debe!buscar!un!equilibrio!entre!las!diferentes!variables!y!su!peso,! para! que! la! medida! no! esté! más! influenciada! por! unos! aspectos! concretos! del! envejecimiento,! llegando! a! un! compromiso! que! no! implique! un! número! demasiado! elevado!de!variables.! ! La!población!objeto!de!estudio!para!la!búsqueda!de!los!biomarcadores!es!otro! de!los!puntos!conflictivos.!Si!bien!lo!ideal!es!que!el!rango!de!edad!sea!lo!más!amplio! posible,! existe! una! diferencia! importante! entre! la! tasa! de! envejecimiento! a! edades! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 50! tempranas!y!en!la!etapa!adulta.!Por!otra!parte,!los!individuos!de!edad!más!avanzada! tienen! mayor! probabilidad! de! padecer! enfermedades! y! han! acumulado! durante! un! mayor!periodo!de!tiempo!los!efectos!dañinos!de!exposición!a!diferentes!parámetros! ambientales,! como! el! tabaco,! ! que! podrían! sesgar! los! resultados! en! función! de! la! frecuencia!de!la!exposición!de!los!diferentes!!en!la!población!estudiada.!Por!ello,!!se!ha! sugerido! el! estudio! de! grupos! de! edad! media! con! un! rango! de! al! menos! 30! años,! excluyendo! individuos! afectados! por! enfermedades,! tanto! en! el! momento! de! la! recogida! de! la! muestra! como! anteriores,! así! como! hábitos! o! estilos! de! vida! que! pudiesen! repercutir! en! su! salud,! si! bien! es! difícil! tener! en! cuenta! todos! estos! parámetros! cuando! se! trata! de! poblaciones! grandes.! Asimismo,! deben! evaluarse! las! diferencias!entre!sexos!y!si!existen!diferencias!en!las!tasas!de!cambio!en!la!juventud,! para!establecer!la!población!en!la!que!son!útiles!cada!uno!de!los!marcadores![275].!! ! Por!otra!parte,!modelizar!una!o!más!variables!para!realizar!una!estimación!de! edad! biológica! requiere! de! algunas! consideraciones! estadísticas! cuya! solución! no! es! siempre!sencilla.!La!primera!de!ellas!es!el!hecho!de!que!a!diferentes!edades!la!ratio!de! envejecimiento!es!diferente.!Por!lo!tanto,!es!importante!centrar!los!modelos!en!etapas! concretas! o! bien! utilizar! modelos! que! incluyan! este! cambio! en! la! tasa! de! envejecimiento!para!minimizar!la!introducción!de!sesgos!en!las!predicciones.!Además,! los!modelos!tanto!univariantes!como!multivariantes!de!regresión!lineal,!presentan!un! sesgo!poco!reconocido!en!la!literatura!y!que!ha!adoptado!nombres!como!regresión!a!la! media!o! “dilution( regression( bias”.! Este! sesgo! implica! un! incremento! del! error! de! predicción! con! la! edad! inherente! al! uso! de! la! regresión! pero! cuya! influencia! en! los! resultados! debe! evitarse! utilizando! individuos! pareados! por! edad! en! los! grupos! de! estudio!sometidos!a!comparación.!Esta!medida!solventa!!a!la!vez!el!problema!de!las! diferentes! ratios! de! envejecimiento! a! diferentes! edades.! Si! esto! no! es! posible,! los! análisis!deben!realizarse!de!forma!estratificada!por!grupos!de!edad!o!bien!corregir!por! la!propia!edad!cronológica![275],![276].!! ! Por! último,! las! medidas! de! edad! biológica! suponen! la! determinación! de! determinadas!modificaciones!relacionadas!con!el!envejecimiento!en!el!transcurso!de!la! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 51! vida!de!un!individuo.!Por!ello,!en!los!estudios!transversales!incluyen!todos!los!posibles! factores!de!confusión!que!previamente!han!influido!en!la!edad!biológica!del!individuo,! aunque! no! necesariamente! estén! presentes! en! el! momento! del! estudio.! El! hábito! tabáquico,!el!estrés!o!las! enfermedades!infecciosas! ejemplifican!de! forma!clara! este! problema.! Por! ello,! es! preferible! la! validación! de! los! biomarcadores! de! la! edad! en! estudios!longitudinales,!que!permiten!determinar!los!cambios!de!la!edad!biológica!de! forma! más! próxima! a! la! realidad.! Sin! embargo,! determinados! biomarcadores! presentan! un! error! demasiado! grande! teniendo! en! cuenta! que! las! determinaciones! realizadas!en!las!cohortes!longitudinales!suelen!llevarse!a!cabo!en!periodos!de!10!años! [276],![277].!! ! Si!bien!existen!en!la!bibliografía!diferentes!biomarcadores!correlacionados!con! la! edad,! solo! incluiré! aquellos! más! relevantes! y! utilizados! en! el! estudio! de! las! enfermedades!reumáticas.!! ! Deleciones mitocondriales ! Las! mutaciones! son! eventos! estocásticos! que! implican! el! cambio! de! una! o! varias! bases! del! genoma.! En! las! células! somáticas,! ! las! mutaciones! en! el! ADN! mitocondrial! se! acumulan! con! el! paso! del! tiempo! dando! lugar! a! un! patrón! tejido! específico.!Se!expanden!desde!el!momento!en!que!aparecen!y! a!medida!que! tienen! lugar!las!divisiones!celulares,!no!obstante,!se!ha!calculado!que!se!necesitan!unas!tres! décadas!para!que!sea!detectable!una!mutación!en!el!ADN!mitocondrial!de!una!célula! somática.! Esto! hace! que! estas! mutaciones! tengan! una! tasa! de! acumulación! de! 104! desde!la!infancia!hasta!la!vejez![278].! !! Para!la!estimación!de!la!edad!biológica,!la!deleción!4977!es!la!más!común!y!por! tanto,! estudiada! en! gran! variedad! de! tejidos! [279]! (Figura! 7A).! Se! puede! analizar! mediante!PCR!en!tiempo!real,!que!se!considera!el!estándar!oro,!ensayos!de!hibridación! o!PCR!de!diluciones!seriadas,!si!bien!este!último!método!tiene!grandes!discordancias! con!otros!métodos!de!PCR!utilizados.!El!coeficiente!de!correlación!entre!la!frecuencia! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 58! System!(OSS),!se!basa!en!determinadas!modificaciones!catalogadas!en!la!figura!6D,!que! sufre!el!sistema!esquelético!durante!el!desarrollo!del!individuo!adulto.!Se!ha!visto!que! el! OSS! está! relacionado! con! el! estado! global! de! salud! del! individuo! y! predice! la! mortalidad,! sobre! todo! en! individuos! de! mediana! edad.! Además,! su! varianza! está! explicada!principalmente!por!factores!genéticos!(57%)!mientras!que!el!sexo,!la!altura,! el! BMI,! el! nivel! de! estrógenos! y! la! menopausia! explican! apenas! un! 6%.! Estas! características! lo! hacen! idóneo! para! la! predicción! de! la! edad! biológica! del! individuo! [285].!! ! El! OSS! suele! restringirse! al! análisis! de! la! mano! por! razones! prácticas,! ya! que! mediante!una!única!radiografía!permite!la!evaluación!de!27!huesos!completos,!cuyos! cambios! están! relacionados! con! la! edad.! Sobre! las! radiografía! de! los! distintos! individuos! se! realizan! medidas! osteométricas! (de! longitud,! grosor! y! densidad! de! los! huesos)! y! osteográficas! (determinación! de! la! presencia! de! centros! de! osificación,! osteofitos,!nódulos!de!Heberden!entre!otras!modificaciones!que!aparecen!típicamente! con! el! paso! del! tiempo).! De! esta! forma! se! establece! un! sistema! de! puntuación! que! permite!asignar!un!valor!a!cada!individuo!!en!función!de!la!aparición!de!determinadas! características!en!la!radiografía!dorso!palmar![296]!(Figura!7D).!! !! Este! sistema! de! puntuación! oseográfico! tiene! una! correlación! elevada! con! la! edad! cronológica! (r=0.8)! aunque! varía! en! función! del! grupo! étnico! y! el! sexo.! La! desviación! estándar! de! la! predicción! oscila! entre! 1! y! 8! años! incrementándose! de! sujetos!jóvenes!a!ancianos!progresivamente![296].!! ! En!estudios!más!recientes!se!han!realizado!algunas!modificaciones!sobre!este! sistema!de!puntuación!de!forma!que!se!tenga!en!cuenta!no!solo!el!número!de!cambios! radiográficos! sino! su! naturaleza,! ponderados! según! su! prevalencia,! severidad! y! localización.! Además,! se! ha! señalado!la! fiabilidad! intraobservador! como! satisfactoria! para! diversas! características! analizadas,! si! bien! no! existe! ningún! estudio! en! el! que! diversos!examinadores!evalúen!el!OSS!en!la!misma!cohorte![297].!! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 59! Longitud de los telómeros ! El!acortamiento!telomérico!es!la!medida!de!edad!biológica!más!utilizada!hasta! el! momento.! El! conocimiento! del! mecanismo! mediante! el! cual! la! longitud! de! los! telómeros!disminuye!con!el!paso!del!tiempo!y!el!hecho!de!que!está!relacionado!con! múltiples!enfermedades!de!edad!avanzada!así!como!con!el!cáncer!ha!hecho!de!este! marcador!el!método!por!excelencia,!si!bien!hoy!se!sabe!que!solo!recoge!una!parte!de! la!etiología!compleja!del!envejecimiento.!Además,!la!demostración!de!que!la!medición! de!la!longitud!de!los!telómeros!en!células!de!sangre!periférica!estaba!correlacionada! con! el! acortamiento! sufrido! en! los! tejidos! afectados! por! diversas! enfermedades! permitió! su! expansión! como! biomarcador! de! envejecimiento.! Sin! embargo,! como!! puntos! débiles! de! este! biomarcador! cabe! destacar! la! baja! sensibilidad! y! ! la! heterogeneidad!de!las!técnicas!para!su!determinación,!que!han!dado!lugar!a!una!falta! de!reproducibilidad!de!los!resultados!de!asociación![280].!! ! El! acortamiento! telomérico! puede! determinarse! mediante! diversas! técnicas! basadas!en!la!especificidad!de!la!secuencia!de!ácidos!nucleicos,!es!decir,!la!unión!de! una! sonda! o! cebador! específico! de! la! región! telomérica.! Los! diferentes! métodos! descritos!pueden!aplicarse!al!conjunto!de!células!de!la!muestra,!a!una!célula!única!y!a! cada! cromosoma! individualmente,! existiendo! por! tanto! diferencias! en! las! medidas! para!un!mismo!individuo.!El!método!considerado!actualmente!como!el!estándar!oro!es! el!Southern)blot.!Mediante!este!método!se!obtiene!una!medida!absoluta!de!la!longitud! de! los! telómeros! promedio! de! las! diferentes! células! que! componen! la! muestra.! Sin! embargo,! es! un! método! laborioso,! que! requiere! del! corte! del! ADN! con! enzimas! de! restricción,! su! separación! en! geles! de! agarosa! y! transferencia! a! una! membrana! de! nylon,! donde! se! hibridan! con! sondas! específicas.! El! resultado! es! un! bandeado! que! revela!la!longitud!de!los!telómeros!de!todas!las!células!de!la!muestra,!de!forma!que!se! asigna!un!valor!promedio!para!cada!muestra.!Sin!embargo,!esta!técnica!muy!laboriosa,! requiere! de! una! gran! cantidad! de! ADN! y! tiene! la! limitación! de! que! en! la! medida! se! incluyen!las!regiones!subteloméricas![298].! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 60! Otro! de! los! métodos! basado! en! la! hibridación! de! sondas! es! el! ensayo! de! protección! (HPA;! Hybridisation, protection, assay),! mediante! el! cual! se! hibridan! oligonucleótidos! directamente! con! el! lisado! celular! y! se! mide! la! intensidad! de! quimioluminiscencia.! El! punto! crítico! de! la! técnica! radica! en! la! realización! de! los! lavados!para! eliminar!las!sondas! no!hibridadas.!La!medida!debe!ser! relativizada!a! la! cantidad! total! de! ADN! incluido! midiendo! simultáneamente! una! sonda! inespecífica,! como! un! elemento! Alu.! Las! ventajas! frente! al! Southern, blot! son! la! importante! disminución! en! la! cantidad! de! ADN! requerido! (del! orden! de! nanogramos)! y! que! no! incluye!las!regiones!subteloméricas![298]! ! El!método!actualmente!más!utilizado!sin!embargo!es!la!qPCR.!Por!un!lado!se! encuentra! la! qPCR! que! ofrece! una! medida! única! promedio! de! la! longitud! de! los! telómeros! de! todos! los! cromosomas! de! la! muestra,! puesto! que! la! secuencia! de! los! cebadores!es! complementaria!a!la!propia!repetición! telomérica.!! Es!una! técnica!que! resulta!menos!laboriosa!que!el!Southern,blot,!pudiendo!aplicarse!a!un!número!mayor! de!muestras.!Por!otra!parte!está!el!método!STELA,!que!combina!la!técnica!qPCR!con!el! conocimiento! de! la! secuencia! subtelomérica! para! amplificar! únicamente! la! región! telomérica! de! un! único! cromosoma! [299],! [300].! Sin! embargo,! estas! técnicas! tienen! una!variabilidad!mayor!y!menor!reproducibilidad!que!la!técnica!de!Southern,blot,[301].! En! el! caso! de! la! qPCR! se! han! descrito! diferentes! metodologías,! que! difieren! básicamente!en!los!genes!de!referencia!utilizados!y!la!optimización!de!los!parámetros! de!PCR!para!los!mismos,!diferentes!reactivos!y!aparatos!de!medición[298],![300].!Los! genes!de!referencia!más!comúnmente!utilizados!en!humanos!son!el!gen!de!la!proteína! de!ARN!ribosómico!36B4!y!la!albúmina,!pero!teóricamente!podría!utilizarse!cualquier! gen!de!copia!única,!a!fin!de!obtener!un!valor!para!relativizar!la!media!de!la!longitud!de! los! telómeros! de! las! diferentes! muestras! ensayadas.! Debido! a! los! problemas! para! ajustar!las!variaciones!técnicas!entre!los!diferentes!pocillos!de!la!PCR!se!desarrollaron! métodos! basados! en! la! tecnología! multiplex! para! determinar! la! longitud! de! los! telómeros! y! de! los! genes! de! referencia! en! el! mismo! pocillo,! utilizando! diferentes! fluoróforos![302].!Otra!adaptación!para!solventar!este!problema!ha!sido!la!inclusión!de! una!recta!patrón!con!muestras!de!ADN!cuya!longitud!de!los!telómeros!es!conocida,!lo! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 61! que!permite!además!de!estandarizar!entre!pocillos!proporcionar!un!valor!absoluto!en! vez!de!una!medida!relativa![303].!! ! Por! último,! se! encuentran! los! métodos! de! análisis! de! cromosomas! mediante! hibridación! de! sondas! fluorescentes! in# situ! (Q-FISH).! Estas! técnicas! requieren! la! disponibilidad!de!células!del!tejido!que!se!pretende!estudiar.!Pese!a!ser!laboriosa,!la! técnica!Q-FISH!determina!la!longitud!de!todos!los!telómeros!mediante!la!hibridación! de!las! sondas!en! los!cromosomas! de!la!célula!en!metafase.!El!acoplamiento! de!esta! técnica!a! la!citometría!de! flujo!(Flow-FISH)! ha!permitido!disminuir! la!laboriosidad,! si! bien! sigue! siendo! compleja! y! costosa! para! la! aplicación! en! muchas! muestras.! Para! reducir!dicha!complejidad!Freulet-Marrier!et#al.!propusieron!una!determinación!de!la! longitud! de! los! telómeros! de! forma! indirecta,! basada! hibridación! con! la! cola! de! guaninas! (T-OLA,! Telomeric-oligonucleotide# ligation# assay)! que! se! correlaciona! directamente! con! la! longitud! de! los! telómeros! y! que! se! aplica! directamente! a! las! células!en!cultivo!sin!necesidad!de!la!purificación!del!ADN![298].!! ! El!principal!problema!de!la!determinación!de!la!longitud!de!los!telómeros!es!la! baja!reproducibilidad!de!los!resultados!encontrados.!Así,!Cawthon#y#col.!demostraron! en!2003!una!asociación!inversa!entre!la!longitud!de!los!telómeros!y!la!supervivencia!en! individuos!mayores!de!60!años,!que!no!fue!replicada!por!Bischoff#y#col.!en!2005.!en! individuos! mayores! de! 73! años.! Salvando! las! diferencias! poblacionales,! en! el! primer! estudio!se!utilizó!el!método!de!qPCR!descrito!por!el!propio!Cawthon!para!determinar! la!longitud!de!los!telómeros,!mientras!que!en!el!segundo!estudio!se!empleó!la!técnica! de! Southern# blot# [48],! [304].! Posteriormente! tampoco! Martin-Ruiz# y# col.!fueron! capaces!de!replicar!los!resultados!utilizando!qPCR!en!individuos!de!más!de!75!años!y! parejas! de! gemelos,! si! bien! un! estudio! de! 2007! de! Bakaysa# y# col.! lo! confirmaron! mediante! Southern# blot# la! correlación! de! la! longitud! de! los! telómeros! con! la! mortalidad![47],![305].!Tampoco!se!ha!descrito!el!mismo!grado!de!correlación!entre!la! longitud!de!los!telómeros!y!la!edad!con!las!diferentes!técnicas,!si!bien!las!diferencias! más!importantes!se!deben!al!rango!de!edad![306].!Si!bien!hay!estudios!metodológicos! que! indican! una! alta! correlación! entre! las! medidas! de! longitud! de! los! telómeros! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 62! obtenidas!con!diferentes!metodologías![301];!en!la!práctica,!los!resultados!obtenidos! por!diferentes!grupos!de!investigación!no!siempre!se!confirman.!! ! Metilación del ADN ! En!los!últimos!años!se!ha!producido!un!gran!volumen!de!datos!de!metilación! basados! en! arrays! que! determinan! cientos! de! sitios! CpGs! distribuidos! a! lo! largo! de! todo!el!genoma.!Gracias!a!los!datos!de!individuos!sanos!de!diferentes!estudios!casocontrol,! se! ha! podido! estudiar! la! relación! de! muchos! de! estos! sitios! con! la! edad! cronológica!del!individuo!en!el!momento!de!la!recogida!de!la!muestra.!Según!diversos! estudios,!más!de!un!tercio!de!los!!sitios!CpG!del!array!450!o!27K!de! Illumina!tienen! niveles! de! metilación! correlacionados! con! la! edad! [88],! [89],! [94].! Como! se! ha! mencionado!anteriormente,!no!se!ha!determinado!el!mecanismo!específico!ni!la!razón! por!la!cual!la!metilación!de!distintos!sitios!cambia!progresivamente!con!la!edad,!si!bien! se!ha!propuesto!un!modelo!de!deriva!epigenética.!! ! En! base! a! estos! cambios,! diversos! autores! han! elaborado! modelos! de! predicción! de! edad! usando! el! nivel! de! metilación! en! una! serie! de! sitios! CpG! de! diferentes! genes! que! conforman! los! conocidos! como! relojes! epigenéticos! o! como! DmAM!(por!sus!siglas!en!inglés!DNA$methylation$age$measures),!como!nos!referiremos! a! ellos! en! este! trabajo! [104],! [307].! Los! sitios! CpG! más! comúnmente! utilizados! se! encuentran!en!los! genes! !CELF6,!NHLRC1,! GLRA1,! LAG3,!HTR7,! SCGN,!ELOVL2,!FHL2,! PENK,!ASPA!y!EDARADD!con!varios!sitios!CpG!que!se!hipermetilan!o!hipometilan!con!la! edad! [308].! Se! han! propuesto! diferentes! DmAM!con! diferencias! en! el! método! de! selección! de! los! sitios! CpG,! tejido! sobre! el! que! se! aplican,! fuente! de! información! utilizada!y!el!número!de!variables!incluidas!en!el!modelo,!que!resultan!en!diferencias! en!la!precisión!de!la!estimación!de!la!edad,!como!se!puede!ver!resumido!en!la!Tabla!2.!! ! A!pesar!de!que!los!arrays!de!metilación!permiten!evaluar!múltiples!sitios!para! cada! muestra,! diversos! autores! han! utilizado! pirosecuenciación! o! técnicas! de! hibridación!con! objetivo!de! buscar!cuáles!de!los! sitios!CpGs! de!estos! genes!generan! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 63! mejores! modelos! de! predicción! de! edad! (Tabla! 2).! Su! utilización! queda! restringida! sobre! todo! al! ámbito! forense! debido! a! los! elevados! costes! económicos! y! de! tiempo! que!requiere!esta!técnica!cuando!se!pretenden!analizar!múltiples!sitios!en!diferentes! amplicones!para!muchas!muestras.!! ! Los!niveles!de!la!metilación!de!los!diferentes!sitios!CpG!del!genoma!son!tejido! específicos!y!cambian!a!lo!largo!de!las!diferentes!etapas!de!desarrollo!del!individuo.! Así,!se!han!desarrollado!DmAM!específicas!para!los!diferentes!tejidos,!siendo!los!más! utilizados! hasta! el! momento,! sangre! y! saliva! (Tabla2).! Sin! embargo,! recientemente! Horvath!ha!desarrollado!una!DmAM!que!permite!la!estimación!de!la!edad!mediante! 353!sitios!en!una!gran!variedad!de!tejidos!y!tipos!celulares.!Así,!con!un!mismo!modelo! puede!estimarse!la!edad!de!múltiples!tejidos!de!un!mismo!individuo,!si!bien!algunos!de! ellos!muestran!pobres!correlaciones!con!la!edad![94].!Previamente!también!la!DmAM! propuesta! por! Hannum! había! mostrado! ya! ! buena! correlación! con! la! edad! en! otros! tejidos! (piel,! mama,! riñón! y! pulmón).! Sin! embargo,! ambas! DmAM! necesitan! de! un! elevado! número! de! sitios! CpG,! siendo! desventajosas! para! el! estudio! de! muchas! muestras!(Tabla!2)![88],![94].! ! Por! otra! parte,! las! DmAM! que! utilizan! un! número! más! bajo! de! sitios! CpG! pretenden!realizar!predicciones!en!un!rango!muy!amplio!de!edad,!que!incluye!tanto!la! juventud! como! la! edad! adulta.! Esto! supone! mayores! errores! de! predicción! en! los! individuos!!de!mayor!edad!como!ya!se!ha!explicado!en!el!epígrafe!anterior.!La!DmAM! de!Florath(y(col.!es!una!excepción,!sin!embargo,!ni!los!sitios!CpG!ni!los!parámetros!de! esta!medida!están!públicamente!disponibles![89].!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Tabla!2.!DNA$methylation$age$measures$(DmAM)!ordenadas!de!mayor!a!menor!correlación!con!la!edad.!De!izquierda!a!derecha!las! columnas!indican:!el!apellido!del!primer!autor!de!la!publicación!donde!se!presenta!la!DmAM,!la!disponibilidad!de!los!parámetros!del! modelo!de!predicción!de!edad!biológica,!el!número!de!sitios!CpG!necesarios,!el!método!estadístico!utilizado!para!la!predicción,!el!tejido! en!el!que!se!ha!optimizado!el!modelo,!la!técnica!mediante!la!cual!se!determinan!los!niveles!de!metilación!de!los!sitios!CpG!necesarios,!el! tamaño!muestral!utilizado!para!la!optimización!de!la!DmAM,!el!rango!de!edad!de!la!población!utilizada!para!la!optimización,!la!MAD! (mean% absolute% deviation)! o! desviación! absoluta! media! del! modelo! en! la! cohorte! de! optimización,! la! correlación! con! la! edad! y! la! referencia!de!la!publicación.!! Autor& Público& Nº&de& CpGs& Modelo& Tejido& Técnica& determinación& Tamaño& muestral& Rango& edad& MAD& Correlación& Ref.& Horvath( SI( 353( Elastic(Net(( Varios( Illumina(( 8000( 0-112( 3.6( 0.96( [94]( Wediner(2( NO( 102( R.(Lineal( Sangre( Illumina(( 576( 0-78( 3.34( 0.98( [309]( Hannum( SI( 71( Elastic(Net(( Sangre( Illumina(( 482( 19-101( 3.9( 0.963( [88]( Florath( NO( 17( R.(Lineal( Sangre( Illumina(( 400( 50-75( 2.6( 0.84( [89]( Shao(Hua(Yi( SI( 8( LOOCV( Sangre( EpiTYPER( 65( 11-72( -( 0.918( [310]( Freire-Aradas( SI( 7( R.(cuantílica( Sangre( EpiTYPER( 725( 18-104( 3.07( 0.979( [315]( Bocklandt( NO( 6( LOOCV( Saliva( Illumina(( 34(gemelos( 21-55( 5.2( 0.83( [307]( Zbièc-Piekarska( SI( 5( Lineal( Sangre( Pirosecuenciación( 300( 2-75( 3.4( 0.94( [311]( Bekaert( SI( 4( R.((cuadrática( Sangre(y(dentina( Pirosecuenciación( 206( 0-91( 3.75( 0.96( [312]( Yun(Huang( SI( 4( R.(Lineal( Sangre( Pirosecuenciación( 89( 9-75( 7.87( 0.819( [313]( Soares( NO( 3( LOOCV( Saliva(y(sangre( Pirosecuenciación( 44( 5-72( 6.9( 0.8( [212]( Weidner(1( SI( 3( R.(Lineal( Sangre( Pirosecuenciación( 82( 0-78( 5.4( -( [309]( ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 65! En!resumen,!las!DmAM!disponibles!públicamente!presentan!limitaciones!para! predecir!la!edad!biológica!mediante!el!uso!de!un!número!reducido!de!CpGs!y!centrada! en!un!rango!de!edad!adulta.!De!esta!forma,!es!necesaria!la!optimización!de!un!modelo! que!permita!realizar!predicciones!en!muchas!muestras!de!forma!eficiente!en!términos! de!tiempo!y!costes.!La!nueva!DmAM!propuesta!en!esta!tesis!está!centrada!en!un!rango! de!edad!habitual!en!los!estudios!caso-control!de!diferentes!enfermedades!habituales! en!la!edad!adulta,!como!lo!son!las!enfermedades!reumáticas,!utilizando!además!una! tecnología! ampliamente! disponible! en! los! laboratorios! y! que! permite! el! análisis! de! muchas!muestras!en!poco!tiempo.!! Actividad β-Galactosidasa ! La! determinación! de! la! actividad! β-Galactosidasa! se! considera! uno! de! los! biomarcadores! tradicionales! presentes! en! las! células! senescentes! de! un! tejido.! Sin! embargo,!actualmente!no!existe!un!consenso!a!la!hora!de!delimitar!las!características! de! las! células! senescentes! y! por! tanto! tampoco! se! puede! considerar! este! u! otros! biomarcadores! como! universales.! De! esta! forma,! existen! marcadores! que! reflejan! mejor! los! daños,! los! cambios! en! la! estructura! heterocromática! y! las! modificaciones! epigenéticas!en!el!ADN,!mientras!que!otros!marcadores!se!centran!en!los!productos!de! secreción!característicos!del!fenotipo!SASP!o!en!el!arresto!del!ciclo!celular!![309].!! ! Dimri%y%col.!demostraron!en!1995!que!la!enzima!β-Galactosidasa!se!expresaba! solo!en!las!células!senescentes,!y!no!en!las!quiescentes,!células!diferenciadas!o!células! madre! [310].! Esto! hace! posible! una! detección! de! este! tipo! de! células! mediante! la! adicción!de!un!substrato,!X-gal,!que!a!pH!6.0!adquiere!color!azul!al!ser!procesado!por! el! enzima! β-Galactosidasa! [311].! ! Posteriormente! se! ha! demostrado! que! este! biomarcador!aparece!tanto!en!aquellas!células!con!senescencia!replicativa!como!en!las! que!adquieren!el!estado!de!senescencia!debido!a!factores!extrínsecos!como!el!estrés.!! Además,!mostró!una!correlación!aparente!con!la!edad!de!los!donantes!de!las!células! en!cultivo!que!fueron!analizadas.!Sin!embargo,!hasta!el!momento!solo!un!estudio!ha! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 66! establecido! el! valor! de! correlación! entre! la! edad! cronológica! y! la! tinción! de! células! senescentes!mediante!X-GAL.! A!pesar! de!que! la! correlación!descrita! es!de!0.85,! hay! que!destacar!que!está!basada!en!solo!6!individuos!de!10!a!80!años!y!en!un!tipo!celular! muy!específico:!células!de!músculo!liso!de!la!pared!venosa![312].!!! ! Se!han!propuesto!otros!métodos!combinados!de!varios!marcadores!de!células! senescentes,!como!Ki68!o!p16,!si!bien!no!existe!ningún!experimento!que!demuestre! una!mejoría!en!la!correlación!con!la!edad![313].!! ! 5. El envejecimiento en las enfermedades reumáticas ! El! envejecimiento! es! un! factor! de! riesgo! y! está! implicado! en! el! desarrollo! de! múltiples!enfermedades!como!el!cáncer!o!la!ateroesclerosis.!Sin!embargo,!no!existe!un! mecanismo!mediante!el!cual!se!pueda!explicar!la!participación!del!envejecimiento!en! estas!enfermedades.!Se!ha!hipotetizado!que!las!células!desarrollan!una!hiperactividad! para!contrarrestar!los!efectos!de!la!acumulación!de!daños!a!medida!que!envejecen,!lo! que! podría! causar! este! tipo! de! patologías! caracterizadas! por! la! aparición! de! nuevas! células!o!!productos!de!secreción!de!las!células![7].!También!se!ha!hipotetizado!con!la! acción! de! alguno! de! los! mecanismos! del! envejecimiento! de! forma! específica! en! los! tejidos! afectados! en! determinadas! patologías,! como! la! artrosis! o! las! enfermedades! neurodegenerativas![265],![267].!!! ! Existen!diversas!evidencias!de!un!envejecimiento!prematuro!en!las!diferentes! enfermedades! reumáticas! con! base! autoinmune! como! en! el! lupus! eritematoso! sistémico,!la!artritis!reumatoide,!el!síndrome!de!Sjogren!y!la!esclerosis!múltiple;!pero! también! en! ! la! artrosis! y! la! osteoporosis.! Así,! algunas! enfermedades! se! desarrollan! típicamente! a! edades! en! las! que! el! acortamiento! telomérico! comienza! a! ser! crítico,! cincuenta!o!sesenta!años,!mientras!que!otras!tienen!un!desarrollo!más!temprano![55].! A!pesar!de!que!todas!ellas!afectan!al!aparato!locomotor!o!musculoesquelético,!debido! a! la! heterogeneidad! etiológica! que! presentan! debe! abordarse! su! estudio! de! forma! independiente.!! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 67! Envejecimiento en la artrosis ! La! artrosis! (en! inglés! osteoarthritis,* OA)! es! una! enfermedad! crónica! y! degenerativa! que! afecta! a! la! articulación! en! su! conjunto,! pero! especialmente! al! cartílago!articular,!produciendo!dolor,!que!se!agrava!con!el!uso!y!con!la!proliferación! de!hueso!subcondral.!Afecta!generalmente!a!las!rodillas,!cadera,!dedos!de!las!manos,! dedo!gordo!del!pie!y!también!a!la!columna!cervical!y!lumbar!y!a!algunas!articulaciones! del!hombro.!En!España,!esta!enfermedad!afecta!al!10%!de!la!población,!representando! casi!la!cuarta!parte!del!total!de!los!pacientes!de!enfermedades!reumáticas.!En!cuanto!a! la!prevalencia,!difiere!según!la!articulación,!siendo!del!10.2%!para!la!artrosis!de!rodilla! y! de! un! 6.2%! para! la! artrosis! de! mano! [314].! La! artrosis! es! la! segunda! causa! de! incapacidad!laboral!en!España,!tanto!permanente!como!temporal,!consumiendo!una! parte! importante! de! los! recursos! sanitarios! y! reduciendo! la! calidad! de! vida! de! los! pacientes![315].!! ! Los! factores! de! riesgo! principales! de! la! artrosis! son! el! sexo! femenino,! sobre! todo! en! el! caso! de! la! artrosis! de! rodilla! y! mano;! la! obesidad,! principalmente! en! la! artrosis!de!rodilla!y!la!cadera! y!la!edad,! que!es!el!factor!de!riesgo!más!fuertemente! correlacionado!con! todos!los! tipos!de! artrosis.! Sin!embargo,! los!mecanismos! por!los! cuales!la!enfermedad!se!desarrolla!en!mayor!medida!en!individuos!a!partir!de!los!50! años! son! todavía! desconocidos! [314],! [316].! En! el! caso! del! sexo! femenino,! tras! la! menopausia!descienden!los!niveles!de!estrógenos,!que!influyen!no!solo!en!la!síntesis! de! proteoglicanos! sino! también! en! la! masa! muscular.! Además,! los! traumatismos,! la! sobreutilización! de! la! articulación! en! determinadas! profesiones! y! algunas! enfermedades! que! modifican! la! estructura! de! la! articulación! contribuyen! al! desencadenamiento! y! progresión! de! la! artrosis,! siendo! considerada! en! estos! casos! como!artrosis!secundaria.!Por!último,!existe!un!componente!genético!que!da!lugar!a! una! predisposición! familiar! de! la! enfermedad.! Esta! amplia! variedad! etiológica! ha! generado!diferentes! clasificaciones,!destacando! la!de!Herrero-Beaumount*y*col.,! que! separa!los!tres!factores!de!riesgo!más!importantes:!artrois!de!tipo!I,!de!causa!genética;! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 74! propensos! a! sufrir! eventos! autoinmunes! y! son! las! principales! productoras! de! autoanticuerpos! [344],! [345].! Además,! se! ha! descrito! un! descenso! de! las! células! B! productoras!de!IL-10,!una!de!las!principales!interleuquinas!antiinflamatorias![346].!! ! Los! monocitos! CD14dimCD16bright! se! consideran! el! subtipo! senescente! de! monocitos! debido! a! su! menor! longitud! de! los! telómeros! ! y! positividad! para! la! βgalactosidasa! en! comparación! con! los! monocitos! clásicos! (CD14brightCD16-).! Además,! estos! monocitos! senescentes! expresan! citoquinas! proinflamatorias! y! receptores! de! quimioquinas!que!facilitan!su!migración!a!tejidos.!Se!han!encontrado!incrementados! en! pacientes! ancianos! con! aterosclerosis! y! pacientes! de! AR! en! comparación! con! sujetos! jóvenes! [347],[348].! Existe! también! otra! subpoblación! de! monocitos! que! expresan!CD56,!típico!de!las! células!NK,!y!que!también! se!incrementan!con!la!edad.! Estos!monocitos!CD14brightCD56+!producen!elevadas!cantidades!de!citoquinas!y!ROS.!Se! han!encontrado!expandidos! en! pacientes!de! AR! de!menos!de! 40! años!en! relación! a! controles! sanos! pero! su! abundancia! tampoco! se! correlaciona! con! la! duración! de! la! enfermedad,!el!tratamiento!o!los!niveles!de!PCR![349].!! ! Por!último,!las!células!T!sufren!también!cambios!durante!el!envejecimiento.!La! característica! más! notable! de! estas! células! con! el! envejecimiento! es! la! expansión! clonal! de! las! CD4+! y! sobre! todo! de! las! CD8+! que! carecen! de! CD28.! Este! receptor! es! necesario! para! la! activación! eficiente! de! las! células! T! y! por! ello! su! proliferación! y! activación! disminuyen! progresivamente! con! la! edad,! causando! la! adquisición! de! características!de!células!NK!en!las!primeras!y!la!pérdida!de!la!función!reguladora!en! las! segundas! [350],! [351].! En! un! principio,! se! encontró! una! expansión! de! las! células! CD4+CD28-!en!los!pacientes!con!enfermedades!crónicas!autoinmunes,!incluidos!los!de!! AR! y! de! AR! de! reciente! comienzo,! sobre! todo! aquellos! portadores! del! alelo! de! susceptibilidad!HLA-DRB1*04,!que!parecía!asociada!a!un!aumento!de!la!producción!de! citoquinas!proinflamatorias!y!la!citotoxicidad.!Además,!las!células!CD4+CD28-!derivadas! de! células! sanguíneas! periféricas! de! pacientes! con! AR! producen! mayor! cantidad! de! TNF!y!de!IFN!que!las!CD4+CD28+![352].!Sin!embargo,!posteriormente!se!observó!que! esta! expansión! clonal! está! presente! solamente! en! los! individuos! expuestos! al! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 75! citomegalovirus!humano.!Además,!la!capacidad!de!estas!células!CD4+CD28-!de!producir! citoquinas!está!directamente!relacionada!con!la!exposición!al!virus!y!no!parece!tener! relación!con!los!niveles!de!anti-CCP!o!el!grado!de!erosiones!en!los!pacientes!con!AR! [353].! Además! de! la! inmunosenescencia,! también! se! han! visto! exacerbados! otros! mecanismos! del! envejecimiento! en! pacientes! de! AR.! ! Así,! los! pacientes! con! artritis! reumatoide! presentan! cambios! epigenéticos,! en! la! homeostasis! proteica! y! en! la! senescencia,! tanto! a! nivel! articular! como! sistémico.! Algunos! de! estos! cambios! relacionados!con!el! envejecimiento!se!han!descrito! también!en!pacientes! con!AR!de! reciente! comienzo,! apuntando! a! un! posible! papel! causal! en! el! desarrollo! de! la! enfermedad,! independiente! de! los! daños! y! el! estrés! celular! producidos! por! la! respuesta!autoinmune![173].! ! Los!sinoviocitos!de!AR!presentan!alteraciones!epigenéticas!importantes! como! una! hipometilación! global! [354],! una! hipometilación! de! los! elementos! LINE-1! y! promotores! DR-3,! un! incremento! de! la! actividad! HDAC! y! una! sobreexpresión! de! sirtuina! 1.! Además,! la! presencia! de! TNF-alfa! incrementa! la! inducción! de! HDAC! y! sirtuina!1![355],![356].!En!las!células!sanguíneas!de!los!pacientes!de!AR!también!se!han! observado!niveles!incrementados!de!actividad!HDAC!pero!no!cambios!en!la!sirtuina!1! [357].!Existen!también!otras!hipometilaciones!que!juegan!un!papel!importante!en!la! respuesta!autoinmune,!como!la!!hipometilación!de!un!sitio!CpG!en!el!promotor!de!la! IL-6,! que! se! da! con! frecuencia! en! las! ! células! sanguíneas! de! pacientes! con! AR! en! comparación!con!los!controles!sanos,!y!!la!hipometilación!que!da!lugar!a!la!aparición! de!las!CD4+CD28-,!pero!en!estos!casos!no!se!ha!establecido!ninguna!vinculación!con!la! edad![109],![352].!! ! En!cuanto!a!la!homeostasis!proteica,!se!ha!visto!incrementada!la!expresión!de! las!proteínas!del! sistema!de! respuesta! al!estrés! térmico! tanto!en! células!sanguíneas! como! en! el! tejido! sinovial! de! los! pacientes! con! artritis! reumatoide.! Además,! varios! estudios!apuntan!a!las!chaperonas!como!autoantigenos!de!las!células!T!y!B!en!la!AR,!y! se! han! encontrado! autoanticuerpos! específicos! contra! proteínas! citrulinadas! de! este! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 76! sistema! de! respuesta! al! estrés.! Consecuentemente! con! el! incremento! de! estas! proteínas! se! ven! incrementados! los! niveles! de! autofagia! en! los! fibroblastos! de! pacientes!de!AR,!si!bien!su!papel!en!la!apoptosis!o!la!supervivencia!de!la!célula!es!aún! controvertido![156],![157].!! ! Los! marcadores! de! senescencia! celular! como! p53,! p16! y! β-galactosidasa! también!se!han!visto!incrementados!en!el!tejido!sinovial!tanto!de!AR!establecida!como! de!reciente!comienzo!e!incluso!se!han!visto!variantes!mutadas!de!p53!que!favorecen!la! proliferación! de! los! fibroblastos! y! la! producción! de! IL-6! [229].! Diversos! estudios! apuntan!a!que!la!senescencia!afecta!también!a!las!células!madre!hematopoyéticas!de! la!médula!ósea!durante!la!AR.!Así,!estas!células!tienen!menor!capacidad!para!formar! colonias!que!las!derivadas!de!controles!sanos!y!mayor!tasa!de!apoptosis.!Sin!embargo,! esta! senescencia! de! las! células! madre! es! independiente! de! la! actividad! de! la! enfermedad!y!su!duración,!e!incluso!indiferente!en!pacientes!tratados!y!no!tratados!si! bien!la!elevación!de!TNF-α!en!la!médula!ósea!parece!incrementar!la!apoptosis!de!las! HSC! [230].! Además,! los! fibroblastos! derivados! de! pacientes! de! AR! que! se! vuelven! senescentes! tras! varios! pases! celulares! producen! significativamente! mayor! cantidad! del! IL-6,! IL-8,! VEGF! y! PGE2! en! respuesta! a! IL-1β! que! los! de! pases! tempranos,! típicamente!relacionados!con!el!fenotipo!SASP![257].!! ! Aunque! es! más! conocida! la! relación! entre! la! inmunosenescencia! y! la! artritis! reumatoide,!existen!otros!mecanismos!del!envejecimiento!presentes!en!la!AR!llevan!a! pensar! que! un! posible! envejecimiento! prematuro! pueda! jugar! un! papel! en! el! desarrollo!de!la!enfermedad.!Entre!la!búsqueda!de!la!confirmación!de!esta!hipótesis!se! encuentran!algunos!trabajos!sobre!cómo!los!tratamientos!anti-inflamatorios!revierten! este!fenotipo!envejecido.!Así,!se!ha!demostrado!in!vitro!y!en!algunos!estudios!in!vivo! que! el! tratamiento! con! anti-TNF! revierte! el! fenotipo! CD28! negativo! de! las! células! T! [358],![359].!Además,!se!ha!observado!un!descenso!de!los!niveles!de!apoptosis!de!las! células!HSC!y!mayor!formación!de!colonias!con!los!tratamiento!que!bloquean!el!TNF! mientras!que!no!se!ha!observa!ningún!efecto!en!pacientes!tratados!con!MTX![173].!! ! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 77! Sin! embargo,! se! ha! dedicado! un! esfuerzo! considerablemente! menor! a! la! estimación!de!la!magnitud!de!este!envejecimiento!prematuro!en!la!artritis!reumatoide.! Así,! solo! unos! pocos! estudios! abordan! este! punto,! mediante! la! medición! del! acortamiento!telomérico!y!los!productos!de!glicosilación!avanzada.!!! ! En!cuanto!al!acortamiento!telomérico!!existen!resultados!contradictorios.! Por! una!parte!se!encuentran!los!estudios!que!abordan!el!acortamiento!telomérico!en!las! células!madre!hematopoyéticas,! como!evidencia! del!proceso! de! inmunosenescencia.! Así,! Kastrinaki) y) col.! demostraron! un! acortamiento! telomérico! mayor! ! en! células! mesenquimales!de!la!médula!ósea!de!pacientes!con!artritis,!si!bien!en!controles!sanos! también!se!observó!un!acortamiento!progresivo!desde!los!30!hasta!los!70!años![360].! También!se!observó!una!erosión!de!los!telómeros!mayor!en!células!hematopoyéticas! CD34+! de! pacientes! con! AR! [230].! Por! otra! parte,! se! ha! descrito! un! acortamiento! telomérico! tanto! en! sangre! completa! como! en! poblaciones! sanguíneas! aisladas,!! células! T! y! granulocitos! [59]–[61].! Sin! embargo,! en! otros! estudios! no! se! han! encontrado! diferencias! significativas! o! incluso! los! pacientes! con! artritis! reumatoide! mostraron! telómeros! más! largos! que! los! controles! [62],! [63].! Además,! existen! discrepancias!en! cuanto!a!la! magnitud!del!acortamiento,!que!van! desde!los!15! años! hasta!los!60!años![361],![362].!En!cualquier!caso,!no!parece!existir!una!relación!clara! entre!la!longitud!de!los!telómeros!y!la!duración!o!la!actividad!de!la!enfermedad![361].! En!esta!línea,!parece!existir!una!relación!entre!determinados!alelos!del!HLA,!como!el! DR1! y! el! DR4,! y! el! acortamiento! telomérico,! lo! que! podría! implicar! una! relación! indirecta!entre!el!acortamiento!telomérico!y!el!desarrollo!de!la!AR![363].!! Tampoco!las!publicaciones!que!analizan!los!productos!de!glicosilación!avanzada! han! centrado! su! atención! en! la! magnitud! del! efecto! ni! su! relevancia! en! el! envejecimiento! prematuro! en! la! AR.! En! las! primeras! aproximaciones! se! trató! de! abordar!el! papel!de!los! AGEs!en!la!inmunogenicidad!y! su!presencia!y! correlación!en! suero,!líquido!sinovial!y!orina![292].!Cabe!destacar!que!muchos!de!los!artículos!tienen! como! objetivo! la! comprobación! de! la! posible! utilidad! de! estos! productos! de! glicosilación! como! biomarcadores! de! la! enfermedad,! analizando! su! relación! con! diferentes!marcadores! de!inflamación!y! características!clínicas! de!la! AR! [364],![365].! ! ! ! INTRODUCCIÓN* ! ! ! 78! Sin! embargo,! existen! resultados! controvertidos! al! respecto,! puesto! que! en! algunos! estudios! no! se! observa! correlación! con! las! variables! clínicas! [366].! Finalmente,! los! estudios!más!recientes! han!descrito!el!efecto!del!tratamiento!con! metotrexato!y!los! tratamientos! biológicos! en! el! nivel! sérico! de! los! AGEs,! donde! parece! claro! que! los! pacientes!con!AR! tratados! presentan!niveles! menores! que!los!pacientes! no!tratados! [367],![368].!!! ! En!resumen,!existen!evidencias!de!un!envejecimiento!prematuro!en!la!artritis! reumatoide,! especialmente! en! aquellos! aspectos! relacionados! con! la! inmunosenescencia,! pero! no! se! ha! podido! esclarecer! su! importancia! debido! a! las! discrepancias!en!relación!con!la!duración!de!la!enfermedad!o!las!características!clínicas! de!los!pacientes!y!a!la!magnitud!de!dicho!envejecimiento.!! ! En! esta! introducción! se! ha! descrito! brevemente! la! importancia! de! los! mecanismos! del! envejecimiento! en! las! enfermedades! reumáticas,! principalmente! la! artrosis!y!la!artritis!reumatoide,!objeto!de!este!estudio.!En!cuanto!a!la!artrosis,!existen! evidencias!que!apuntan!a!un!posible!papel!del!envejecimiento!prematuro!como!factor! de!riesgo!en!su!desarrollo,!si!bien!no!está!claro!si!su!implicación!se!restringe!a!nivel! articular,!o!si!podría!tratarse!de!un!envejecimiento!sistémico.!En!la!artritis!reumatoide,! a! pesar! de! que! existen! diversos! estudios! que! sugieren! una! implicación! de! la! inmunosenescencia,!no!se!ha!abordado!el!estudio!de!la!magnitud!y!la!relevancia!de!un! envejecimiento! prematuro! en! la! enfermedad.! Con! la! aparición! de! un! nuevo! biomarcador!de!edad!biológica,!las!“DNA$methylation$Age$Measures”!(DmAM),!se!abre! una! puerta! para! poder! abordar! las! cuestiones! no! resueltas! sobre! el! papel! del! envejecimiento! en! las! enfermedades! reumáticas.! Además,! este! nuevo! biomarcador! basado! en! cambios! en! los! niveles! de! metilación! del! ADN! permite! estudiar! posibles! diferencias!con!el!acortamiento!telomérico,!hasta!ahora!el!biomarcador!de!edad!más! utilizado.! Abordar! el! estudio! de! la! edad! biológica! como! factor! de! riesgo! desde! una! nueva!perspectiva,!los!cambios!de!metilación,!es!importante!en!tanto!en!cuanto!existe! una! amplia! variedad! de! mecanismos! implicados! en! el! envejecimiento,! con! una! regulación!compleja!y!sinérgica!entre!ellos.! ! ! 81! OBJETIVOS ! ! 1. Desarrollar!y!validar!una!medida!de!edad!biológica!basada!en!la!metilación!del! ADN!que!permita!el!estudio!de!muchas!muestras!de!sangre!utilizando!PCR!y!un! secuenciador!capilar.! ! 2. Analizar!los!componentes!sistémico!y!local!del!envejecimiento!prematuro!en!los! pacientes! con! artrosis! mediante! biomarcadores! de! edad! biológica! aplicados! a! muestras!de!sangre,!hueso!y!cartílago.! ! 3. Analizar!el! posible!envejecimiento! acelerado!en! la!sangre! de!los! pacientes!con! artritis!reumatoide!mediante!biomarcadores!basados!en!la!metilación!del!ADN!o! con!el!acortamiento!de!los!telómeros.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 85! MATERIALES Y MÉTODOS 1. Colecciones de muestras Colecciones de muestras para la optimización de la DmAM de 8CpGs ! Como! cohorte! de! entrenamiento! para! optimizar! la! estimación! de! edad! en! sangre!de!adultos!utilizamos!390!individuos!mayores!de!20!años!obtenidos!de!Weidner! et! al! [369]! (Tabla! 3).! Este! set! de! datos! consiste! en! muestras! de! ADN! genómico! de! sangre!obtenidas!de!caucásicos!de!20!a!78!años!(media=61.2;!DS=11.6)!con!un!96.7%! de!mujeres.!Todos!los!perfiles!de!metilación!se!generaron!en!!array!de!Illumina!Human! Methylation!27!BeadChip!y!están!disponibles!al!público!en!la!base!de!datos!GEO!bajo! los!códigos!!GSE19711,!GSE20242,!GSE20236,!GSE23638.!! ! Como! cohorte! de! validación! 1! se! utilizaron! los! datos! de! metilación! de! los! controles!disponibles!en!GSE42861![370],!cuyas!características!se!detallan!en!la!Tabla! 3.!La!cohorte!se!compone!de!individuos!recogidos!entre!mayo!de!1996!y!febrero!de! 2001!en!el!centro!y!sur!de!Suecia!como!controles!poblacionales!para!el!estudio!de!la! artritis!reumatoide,!por!lo!que!fueron!excluidos!aquellos!que!presentan!síntomas!de!la! misma.! Todos! los! sujetos! del! estudio! cumplimentaron! un! amplio! cuestionario! con! información!detallada!de!hábito!tabáquico![371]–[373].!! Para!analizar!la!influencia!de!los!tipos!celulares!sanguíneos!principales!se!utilizó! una!cohorte!de!92!controles![374].!Esta!cohorte!de!voluntarios!sanos!de!Vancouver!de! entre!24!a!45!años!(media=!33.03,!DS=5.03)!tiene!un!62.0%!de!mujeres!(Tabla!3).!El! ADN! ! se! obtuvo! de! células! mononucleares! de! sangre! periférica! y! los! valores! de! metilación! se! obtuvieron! mediante! un! arrray! de! Illumina! Infinium! HumanMethylation27! BeadChip! disponible! en! GSE37008.! Además,! el! diseño! del! estudio! incluyó! el! análisis! de! sangre! en! el! momento! de! la! extracción! mediante! un! sistema! Advia! 70! (Siemens! Medical)! que! permitió! determinar! el! recuento! de! células! totales,!monocitos,!linfocitos,!neutrófilos,!basófilos!y!eosinófilos!de!cada!muestra.!! ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 86! Tabla 3. Descripción detallada de las colecciones de muestras utilizadas en este estudio. N= tamaño muestral, DS = Desviación standard ! ! Finalmente,! se! utilizó! una! cohorte! combinada! de! controles! utilizada! para! estudios!de!pacientes!con!artrosis!y!con!artritis!para!la!validación!del!modelo!mediante! datos!de!metilación!obtenidos!por!MS-SNuPE.!Las!características!de!esta!cohorte!se! detallan! en! la! Tabla! 3! y! los! procedimientos! de! recolección! pueden! verse! en! los! subsiguientes! apartados! de! colecciones! de! muestras! utilizadas! para! los! análisis! de! artrosis!y!artritis!reumatoide.!! ! Colección de muestras utilizadas para el análisis de artrosis ! A. Muestras*de*sangre* Se!utilizaron!un!total!de!890!muestras!de!individuos!con!ascendencia!española! (Tabla!4).!Se!recogieron!los!consentimientos!informados!y!la!utilización!de!ADN!en!el! estudio!fue!aprobada!por!el!Comité!Ético!de!Investigación!Clínica!de!Galicia!(CEIC),!tal!y! como!se!detalla!en![375].!Esta!colección!de!muestras!incluye!182!controles!recogidos! en! el! momento! de! la! urografía! intravenosa! que! no! muestran! signos! ni! síntomas! de! artrosis!en!la!exploración!de!ambas!manos,!en!el!cuestionario!general!!que!contestan! los!pacientes,!ni!en!las!radiografías!de!cadera!o!columna!vertebral.!Los!708!individuos! restantes!son!pacientes!con!OA!primaria!según!el!criterio!de!un!reumatólogo!que!les! Colección Aplicación Estudio N Edad (DS) Rango de edad % Mujeres Entrenamiento Entrenamiento Weidner CI et al. 390 61.2 (11.6) 20 a 78 96.7 Validación 1 Comparación de DmAMs Liu Y et al. 335 52.8 (11.5) 20 a 70 71.3 Validación 2 Estudio de la composición sanguínea Lam L et al. 92 52.8 (11.5) 25 a 45 71.3 Validación 3 Validación por MS-SNuPE Presente estudio 557 65.9 (10.0) 45 a 89 51.4 ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 87! ha!evaluado!y!revisado!los!datos!de!su!historia!clínica.!Los!pacientes!con!artrosis!en!las! rodillas! (229)! y! en! la! cadera! (273)! se! seleccionaron! en! el! momento! de! la! cirugía! de! remplazamiento!articular,!con!entre!55!y!75!años.!Los!pacientes!con!artrosis!de!mano,! 206,! se! seleccionaron! en! la! Unidad! de! Reumatología! por! el! cumplimiento! de! los! criterios!de!clasificación!del!American!College!of!Rheumatology!(ACR)!para!artrosis!de! mano![376].!Antecedentes!de!inflamación,!infección,!trauma!o!patologías!congénitas! se! consideraron! criterios! de! exclusión,! así! como! las! lesiones! debidas! a! depósitos! de! cristales!de!pirofosfato!de!calcio!y!la!osteonecrosis.!!La!obesidad!mórbida!y!la!actividad! ocupacional!de!los!pacientes!no!se!tuvieron!en!cuenta!como!criterios!de!exclusión.!! ! B. Muestras*de*tejido! Se!obtuvieron!los!valores!β!de!metilación!para!los!353!sitios!CpG!necesarios!para! realizar!la!predicción!de!edad!biológica!mediante!el!modelo!de!Horvath![94]!a!partir!de!! diversos!estudios!de!metilación!realizados!en!hueso!y!en!cartílago![377]–[380]!(Tabla! 3).!Las!muestras!de!hueso!que!se!habían!utilizado!corresponden!a!45!controles!y!33! pacientes!con!artrosis!en!la!cadera.!Los!controles!correspondían!a!tejido!de!la!cabeza! femoral! de! 34! sujetos! con! fractura! de! cadera! debida! a! osteoporosis! y! 7! cadáveres,! todos! ellos! sin! lesiones! macroscópicas! compatibles! con! artrosis! [377].! Las! piezas! se! obtuvieron!evitando! las! regiones!de! hueso!subcondral! y!las!regiones! fracturadas.!Se! excluyeron! los! pacientes! con! fracturas! debidas! a! traumas! severos! o! enfermedades! causales! de! osteoporosis! o! artrosis! secundaria.! También,! se! incluyeron! los! datos! de! otras!cuatro!muestras!de!hueso!de!cadáveres!que!carecían!de!información!clínica!y!de! localización! detallada! del! tejido! [377].! Las! piezas! de! hueso! de! los! 33! pacientes! con! artrosis!de!cadera!se!obtuvieron!de!la!cabeza!femoral!en!el!momento!de!la!cirugía!de! reemplazamiento!articular!debido!a!artrosis!primaria![377].!! ! ! ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 94! Medición de la longitud de los telómeros ! Para!la!determinación!de!la!longitud!de!los!telómeros!se!utilizó!el!método!de! qPCR! previamente! descrito! por! Cawthon! [300].! Este! método! se! basa! en! la! amplificación! de! la! repetición! de! la! secuencia! telomérica! referenciada! a! la! amplificación! de! un! gen! de! copia! única,! proporcionando! una! medida! relativa! en! pacientes! respecto! a! controles.! Para! ambos! amplicones,! telómero! y! gen! de! copia! única,!en!este!caso!el!gen!36B4,!se!llevaron!a!cabo!las!reacciones!en!un!volumen!de! 15μL! utilizando! el! robot! pipeteador! automático! CAS-1200! (Corbett,! Mortlake,! Australia)! para! asegurar! la! máxima! precisión! de! pipeteo.! Las! secuencias! de! los! cebadores!fueron:!! tel1:!GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT;!! tel2:!TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA,!! 36B4u:!CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC!! 36B4d:!CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA! ! La!PCR!del!amplicón!del!telómero!contiene:!35ng!de!ADN!genómico,!7.5μL!de! SYBR! Green! Fast! qPCR! Master! Mix! 2X! (Biotool,! Munich,! Alemania),! 0.27pmol! de! cebador! derecho! (Tel1),! 0.9pmol! del! cebador! reverso! (Tel2)! y! agua! destilada! hasta! completar!los!15μL.!Las!condiciones!de!amplificación!fueron:!incubación!inicial!de!95ºC! durante!15!minutos,!seguida!de!20!ciclos!de!95ºC,!15s!y!54ºC!durante!2!minutos.!!La! PCR!del!amplicón!del!gen!de!copia!única!contiene!los!mismos!reactivos!a!excepción!de! los!primers,!que!consistieron!en!0.3pmol!del!cebador!derecho!(36B4u)!y!0.5pmol!del! reverso! (36B4d).! Las! condiciones! de! amplificación! fueron:! una! incubación! inicial! de! 95ºC!durante!15!minutos,!seguida!de!30!ciclos!de!95ºC,!15s!y!58ºC!durante!1!minuto.! Se! utilizó! para! llevar! a! cabo! la! amplificación! el! termociclador! Rotor-Gene! 6000! (Corbett,!Mortlake,!Australia).!La!curva!standard!se!realizó!con!diluciones!desde!1.25ng! a! 100ng! de! ADN! por! reacción.! En! cada! rotor! se! incluyeron! tres! calibradores! para! normalización!de!los!resultados.! ! ! ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 95! ! Tabla 7. Parámetros de la regresión lineal múltiple de la DmAM de 8 CpGs. El modelo se calibró utilizando la cohorte de entrenamiento. Err Std = Error estándar. ! 3. Análisis de los resultados Estimación de la edad biológica basada en 8 sitios CpG ! Se! utilizaron! 390! donantes! sanos! de! ascendencia! caucásica! de! entre! 20! y! 80! años! [369],! que! conforman! la! designada! como! cohorte! de! entrenamiento! (Tabla! 2),! para!definir!los!parámetros!del!modelo!de!8!sitios!CpG.!Los!datos!disponibles!para!esta! cohorte! constan! de! los! valores! β! de! metilación! para! 102! sitios! CpG! fuertemente! correlacionados! con! la! edad! cronológica! de! los! donantes! (correlación! de! Pearson! r>0.85! o! r<-0.85)! de! los! cuales! seleccionamos! aquellos! más! informativos! mediante! regresión!por!pasos!hacia!delante.!En!cada!paso!de!la!regresión!se!comprobó!que!el! sitio! CpG! candidato! era! apto! para! el! ensayo! mediante! methylation-sensitive. singlenucleotide.primer.extension!(MS-SNuPE)![388].!Si!el!sitio!podía!incluirse!en!el!ensayo! multiplex!se!incorporaba!al!modelo!de!regresión;!en!caso!contrario,!se!descartaba!y!se! procedía! nuevamente! a! la! regresión! por! pasos! sin! este! sitio! CpG.! Los! sitios! CpG! se! incorporaron!en!el!modelo!con!un!umbral!de!p!de!0.05.!!Los!coeficientes!B,!obtenidos! por! regresión! múltiple! en! la! cohorte! de! entrenamiento,! de! los! 8! sitios! CpG!! constituyeron! la! medida! de! edad! biológica! utilizada! para! sangre! completa! en! este! Parámetro B Err Std t-valor p-valor Intercepto 84.7 4.3 19.5 < 1.0 x10-16 cg16386080 59.5 4.9 12.3 2.4 x10-29 cg24768561 33.9 5.9 5.8 1.5 x 10-08 cg19761273 -44.0 9.8 4.48 1.0 x10-05 cg25809905 -19.7 5.4 3.7 2.9 x10-04 cg09809672 -22.8 6.5 3.5 5.0 x10-04 cg02228185 -16.8 4.8 3.5 5.5 x10-04 cg17471102 -17.7 6.5 2.7 0.006 cg10917602 -11.4 5.1 2.2 0.026 ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 96! estudio!(Tabla!7).!La!DmAM!se!evaluó!en!las!cohortes!de!validación!(Tabla!3).!Se!utilizó! la!cohorte!de!validación!1!debido!a!la!disponibilidad!de!datos!del!chip!de!metilación! Human!Methylation!450K!Bead-Chip!para!la!comparación!de!la!DmAM!de!8!sitios!CpG! con!otras!DmAM!previamente!publicadas!(Horvath,!Hannun,!Weidner).!!Esta!cohorte! consta!de!335!controles!sanos!no!utilizados!previamente!en!la!calibración!de!ninguno! de!las!DmAM!sometidas!a!comparación.!La!precisión!de!las!predicciones!de!edad!se! evaluó! mediante! correlación! y! desviación! absoluta! media! (por! sus! siglas! en! inglés! mean%absolute%deviation,!MAD)!entre!edad!predicha!y!observada.!! ! Análisis del reloj biológico basado en la metilación del ADN ! Estimamos!la!edad!biológica!de!muestras!de!sangre,!tanto!de!los!pacientes!con! artrosis! como! de! los! pacientes! con! artritis! reumatoide! y! sus! respectivos! controles,! utilizando!los!niveles!de!metilación!de!8!sitios!CpG!que!conforman!la!DmAM!definida! anteriormente.! Por! otra! parte! se! utilizó! la! DmAM! de! Horvath,! basado! en! 353! sitios! CpG,!para!la!predicción!de!la!edad!biológica!de!las!muestras!de!hueso!y!cartílago,!por! su! demostrada! validez! en! múltiples! tejidos! [94].! Las! comparaciones! entre! grupos! (pacientes! y! controles)! se! llevaron! a! cabo! con! análisis! de! covarianza! (ANCOVA)! incluyendo!la!edad!cronológica!y!el!sexo!como!covariables.!Las!diferencias!medias!en! las! estimaciones! de! la! edad! biológica! se! calcularon! tras! ajustar! por! sexo! y! edad! mediante!el!análisis!de!residuales!de!regresión!lineal!múltiple.!Para!todos!estos!análisis! se! utilizó! el! software! Statistica! 7.0! (Stat! Soft,! Inc.).! El! análisis! post-hoc!de! poder! estadístico!se!realizó!con!G*Power!3!utilizando!α!=!0.05![389].!! ! En!la!cohorte!de!validación!de!pacientes!de!AR,!se!utilizó!también!la!DmAM!de! Horvath![94]!y!de!Hannum![88]!para!estimar!la!edad!biológica!de!pacientes!y!controles.! Posteriormente! se! realizó! el! análisis! caso-control! mediante! ANCOVA! de! las! estimaciones! de! edad! biológica! obtenidas! con! los! distintas! DmAM,! corrigiendo! por! sexo! y! edad.! ! Se! utilizó! también! la! corrección! descrita! por! Houseman! de! subpoblaciones!sanguíneas.!Esta!corrección!se!basa!en!la!estimación!de!las!cantidades! ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 97! relativas! de! cada! subpoblación! sanguínea! para! cada! individuo! según! los! datos! de! metilación!del!array!de!Illumina,!tal!y!como!se!describe!previamente![390].! ! Estimación del acortamiento telomérico ! Se!llevó!a!cabo!una!normalización!de!los!resultados!entre!rotores!basada!en!los! tres!calibradores!de!160,!35! y! 2! ng! incluidos!en!cada!rotor.!Para! ello,! se! utilizó! una! regresión!lineal!para!estimar!la!pendiente!y!el!punto!de!intercepción!(PI)!de!la!recta! que!conformaban!estos!tres!puntos!en!cada!rotor!utilizando!la!ecuación!Y!=!pendiente! *!X!+!PI,!donde!Y!es!el!valor!Ct!y!X!el!log10!de!la!cantidad!de!ADNg.!!Posteriormente,!se! ajusta!la!recta!de!cada!rotor!individual!a!la!recta!media!de!todos!los!rotores!a!fin!de! estandarizar!y!corregir!las!desviaciones!entre!rotores.!! ! Las!eficiencias!de!cada!reacción!se!calcularon!utilizando!la!ecuación!E!=!10(1/- pendiente),!donde!el!100%!de!eficiencia!sería!E=2!a!partir!de!la!curva!de!calibración!con! diluciones!seriadas.!Se!obtuvo!un!valor!de!1.8!para!la!amplificación!de!los!telómeros!y! de!2.0!para!el!gen!36B4.!Cada!una!de!las!curvas!de!calibración!mostró!un!coeficiente! de!correlación!lineal!superior!a!0.99.!! ! Finalmente,!los!valores!Ct!se!obtuvieron!automáticamente!mediante!el!análisis! de!cuantificación!comparativa!en!el!Rotor-Gene!6000,!que!estima!un!punto!para!cada! pocillo!utilizando!el!método!del!máximo!de!la!segunda!derivada!en!base!a!un!modelo! de!curva!de!amplificación!sigmoidal.!El!cálculo!de!la!ratio!T/S!se!obtuvo!de!la!ecuación! ETEL^CtTEL/E36B4^Ct36B4.!!Se!aplicó!!el!Ln!a!todos!los!ratios!T/S!para!transformar!los!datos!a! una!distribución!normal.!! ! Una! vez! obtenidos! los! valores! de! Ln(T/S),! se! realizó! el! análisis! caso-control! mediante! ANCOVA! corrigiendo! por! sexo! y! edad.! Los! valores! de! los! controles! y! los! pacientes! se! correlacionaron! en! conjunto! con! la! edad! cronológica! mediante! correlación!de!Spearman!utilizando!para!ambos!análisis!el!software!Statistica!7.0!(Stat! Soft,!Inc.).! ! ! ! MATERIALES)Y)MÉTODOS) ! ! ! 98! Análisis de la mortalidad en la AR ! Los!controles!y!pacientes!con! artritis!reumatoide!incluidos!en!este!análisis!se! reclutaron!desde!el!2001!hasta!el!2009!y!la! valoración!del!estado!final!se!realizó!en! Noviembre! de! 2015.! Se! consideraron! como! puntos! finales! la! fecha! del! fallecimiento! (datos!completos)!o!la!fecha!de!la!última!visita!o!análisis!médico!recopilada!en!la!base! de!datos!del!JANUS!(datos!censurados).!!!Debido!a!la!falta!de!datos!y!aparentes!sesgos! en!los!disponibles!no!se!analizaron!las!causas!específicas!de!fallecimiento.! ! Los!análisis!de!supervivencia!se!llevaron!a!cabo!mediante!regresión!de!riesgo! proporcional! de! Cox,! ajustando! por! edad,! sexo,! hábito! tabáquico! y! presencia! de! la! enfermedad.!Se!obtuvieron!las!estimaciones!de!las!tasas!riesgo!para!los!biomarcadores! de!edad!biológica,!el!ratio!T/S!y!la!edad!predicha!mediante!la!8CpG!DmAM,!así!como! para!las!covariables!incluidas!en!el!análisis.!! ! ! 101! RESULTADOS ! 1. Predicción de edad biológica mediante 8 sitios CpG ! Las! medidas! de! edad! biológica! basados! en! metilación! del! ADN,! DmAM,!! previamente! definidos! en! la! literatura! no! eran! aptos! para! la! aplicación! en! nuestro! estudio,!bien!por!requerir!la!realización!de!un!chip!de!metilación!de!Illumina,!dado!el! elevado! número! de! sitio! CpG! que! incluyen,! o! bien! por! utilizar! rangos! de! edad! y! metodologías!no!adaptadas!a!nuestro!estudio!y!laboratorio![88],![391].!Por!lo!tanto,! definimos!una!nueva!medida!de!edad!biológica.!Esta!DmAM!se!ha!desarrollado!a!partir! de!los!datos!de!390!sujetos!sanos!mayores!de!20!años!a!los!que!nos!referiremos!como! cohorte!de!entrenamiento!(Tabla!3).!! ! Para!ello,!seleccionamos!mediante!regresión!lineal!por!pasos!hacia!delante!de! entre!los!120!sitos!CpG!más!correlacionados!con!la!edad!disponibles!en!Weidner!et!al! [369],!aquellos!más!asociados!con!la!edad!que!además!pueden!ser!determinados!con! un!ensayo!MS-SNuPE.!Todos!los!sitios!CpG!seleccionados!mostraron!una!contribución! significativa! al! modelo! de! regresión! múltiple! (Tabla! 7).! Solo! dos! de! los! sitios! ! CpG! seleccionados!mostraron!un!incremento!de!metilación!con!la!edad,!mientras!que!los! otros! 6! disminuyen! con! la! misma.! El! nuevo! modelo! de! 8CpGs! dio! lugar! a! una! estimación! precisa! de! la! edad! en! la! cohorte! de! entrenamiento! de! 390! muestras! de! sangre!(R2!=!0.68,!P!<!10-16;!y!MAD=5.07!años;!Figura!8).! ! La! precisión! de! la! estimación! fue! similar! en! los! diferentes! rangos! de! edad! a! partir! de! los! 30! años! (Tabla! 8),! mostrando! la! mayor! MAD! en! los! extremos! de! la! distribución!y!siendo!la!estimación!más!precisa!cerca!de!la!media,!efecto!común!en!las! DmAM!modelizadas!mediante!regresión.!! ! ! ! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 102! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura 8. Estimación de la edad mediante la DmAM de 8 CpGs en las muestras de sangre. En los gráficos de dispersión se representa la edad en el eje de las abscisas y la estimación mediante la DmAM de 8 CpGs en el eje de ordenadas de los 390 controles sanos de la cohorte de entrenamiento. La línea representa la regresión de mínimos cuadrados de los datos. ! ! ! Tabla 8. Precisión de la DmAM de 8 CpGs en los diferentes intervalos de edad de la cohorte de entrenamiento. N= tamaño muestral, MAD = Desviación absoluta de la media. Intervalo de edad Edad media N MAD Diferencia media 20 a 29 25.4 17 9.2 9.0 30 a 49 39.5 23 6.6 3.1 50 a 59 56.3 93 4.9 3.6 60 a 69 64.0 158 4.1 -0.3 70 a 78 72.8 99 5.7 -5.2 Total 61.2 390 5.1 0.00 ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 103! Para! comparar! la! precisión! del! modelo! con! otros! modelos! previamente! publicados![88],![94],![369]!!utilizamos!la!cohorte!de!validación!1!(Tabla!3),!no!utilizada! previamente!para!la!estimación!de!ninguno!de!los!modelos!a!comparar![370].!El!mejor! modelo! fue! el! de! Horvath! ! [94],! seguido! del! de! Hannum! [88],! ambos! con! el! mayor! número!de!CpGs!y!la!función! matemática!más!sofisticada! para!la!predicción.!Ambos! mostraron!las!menores!MAD!y!la!mayor!correlación!con!la!edad.!Es!importante!tener! en! cuenta! que! ! en! el! modelo! de! Hannum! se! han! incluido! solamente! los! datos! de! metilación!y!no!las!variables!clínicas!(Tabla!9).! ! ! Tabla 9. Comparativa entre la DmAM de 8 CpGs y otras DmAMs en la cohorte de validación 1. MAD = Desviación absoluta de la media. ! Nuestro!modelo!de!8CpGs!predice!la!edad!con!una!precisión!intermedia!entre! los!modelos!con!mayor!número!de!CpGs!y!el!modelo!basado!en!solo!3!CpGs.!En!cuanto! a!los!coeficientes!de!correlación,!este!modelo!se!encuentra!más!cercano!a!los!modelos! de! Hannum! y! Horvath! que! al! modelo! de! Weidner.! Además,! muestra! una! menor! diferencia! entre! la! media! de! edad! observada! y! la! media! de! edad! estimada! que! el! modelo!de!Hannum.!! ! Por! lo! tanto,! el! modelo! desarrollado! de! 8CpGs! es! menos! preciso! que! los! basados!en!decenas!o!cientos!de!sitios!CpGs,!que!requieren!el!uso!de!microarrays!de! metilación,!pero!más!preciso!que!el!modelo!de!solo!tres!CpGs,!indicando!que!alcanza! un!compromiso!entre!la!precisión!de!la!estimación!y!la!viabilidad!del!ensayo!para!su! aplicación!a!muchas!muestras.!! DmAM Nº CpGs MAD R2 Ajustada Rho Spearman Diferencia media Horvath 353 4.4 0.77 0.87 -1.0 Hannum et al. 71 7.1 0.84 0.90 -6.7 8 CpGs 8 7.3 0.60 0.75 -4.8 Weidner et al. 3 8.5 0.33 0.57 3.8 ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 104! ! ! ! ! ! ! ! ! Tabla 10. Análisis de regresión múltiple entre la estimación de 8 CpGs y los recuentos celulares por cada 10-9 litros de sangre. Err. Std. = Error estándar. ! La!complejidad!de!la!sangre!y!la!variabilidad!de!los!niveles!de!metilación!en!los! distintos! tipos! celulares! que! la! componen! pueden! ser! factores! de! confusión! que! afectan! a! los! DmAM.! Por! ello,! determinamos! la! influencia! de! las! distintas! subpoblaciones! sanguíneas! en! la! nueva! DmAM! de! 8! CpGs.! Para! ello! se! utilizó! la! cohorte!de!validación!de!Lam!et!al,![374].!Este!análisis!mostró!que!la!variación!en!las! subpoblaciones! celulares! mayoritarias! no! alteraba! significativamente! los! resultados! (Figura!9).!De!hecho,!todos!los!coeficientes!β!correspondientes!a!las!subpoblaciones!! fueron! inferiores! a! 0.03! con! p-valores! mayores! de! 0.7! (Tabla! 10)! a! pesar! de! que! la! asociación!con!la!edad!tuvo!un!coeficiente!β!!de!0.77!y!un!p-valor!menor!de!10-18!. Beta Err. Std. p-valor Edad 0.77 0.07 3.63 x10-18 Neutrófilos 0.01 0.07 0.9 Linfocitos -0.02 0.07 0.7 Monocitos 0.004 0.08 0.9 Basófilos 0.03 0.08 0.7 Eosinófilos 0.03 0.07 0.7 ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 105! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura 9. Ausencia de variación de la estimación mediante la DmAM de 8 CpGs en relación a la composición sanguínea de la cohorte de validación 2. Cada!rectángulo! representa!la!regresión!lineal!de!la!diferencia!entre!la!estimación!mediante!8CpGs!y!la! edad!frente!al!recuento!del!número!de!células!!de!sangre!total,!neutrófilos,!linfocitos,! monocitos,!eosinófilos!y!basófilos,!respectivamente.!Estos!recuentos!se!consideraron! como!puntuaciones! Z!tras! transformación!en!una!distribución!normal! estandarizada,! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 112! Acortamiento telomérico en pacientes con artrosis ! Se!analizó!la!longitud!de!los!telómeros!en!las!890!muestras!de!sangre!que!se! han! descrito! previamente! (Tabla! 3),! mediante! qPCR.! ! Los! resultados! cumplieron! los! requisitos!de!control!de!calidad.!Así,!los!coeficientes!de!variación!entre!ensayos!de!los! calibradores!de!160,!35!y!2!ng!fueron!4.8,!4.3!y!2.8!%,!respectivamente.!Además,!estos! CV!se!redujeron!todavía!más!tras!la!normalización!entre!rotores!hasta!el!1.0,!1.7!y!0.8! %,!respectivamente.!Por!otra!parte,!el!CV!medio!de!los!duplicados!de!las!muestras!fue! de! 0.79! %! para! el! amplicón! del! telómero! (rango! =! 0.00! a! 4.69)! y! de! 0.28! %! para! el! amplicón!del!gen!36B4!usado!como!referencia!(rango!=!0.00!a!3.71).!! ! La!ratio!T/S!que!mide!la!longitud!relativa!de!los!telómeros!se!correlacionó!con! la!edad!cronológica!en!el!análisis!conjunto!de!casos!y!controles!con!un!coeficiente!de! correlación! de! Spearman! de! 0.18! ! (p! =! 3.0! x! 10-8).! No! se! encontraron! diferencias! significativas!en!la!longitud!de!los!telómeros!entre!casos!y!controles.!Esto!fue!así,!para! los! pacientes! con! artrosis! de! mano! (ΔT/S! ratio(pacientes-controles)! =! 0.04;! p-valor! =! 0.42)! (Figura!14A),!o!con!artrosis!de!rodilla!(ΔT/S!ratio!=!0.004,!p-valor!=!0.92)!(Figura!14B),!o! de! cadera! (ΔT/S! ratio! =! 0.03;! p-valor! =! 0.42)(Figura! 14C).! Tampoco! se! hallaron! diferencias! significativas! en! el! análisis! conjunto! de! todos! los! pacientes! con! artrosis! comparados! con! los! controles! (ΔT/S! ratio! =! 0.03;! p-valor! =! 0.48).! Todos! los! datos! fueron!analizados!mediante!ANCOVA!incluyendo!las!covariables!sexo!y!edad.! ! En! todos! los! grupos! los! varones! presentaron! una! longitud! de! los! telómeros! menor!que!las!mujeres,!si!bien!solo!se!alcanzan!diferencias!significativas!en!el!análisis! conjunto!(ΔT/S!ratio(varones-mujeres)!=!0.07;!p-valor!=!0.02).!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 113! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 114! Figura& 14.& Ausencia& de& acortamiento& telomérico& en& la& sangre& de& pacientes& con& artrosis.&Los!gráficos!de!dispersión!representan!la!edad!en!el!eje!de!abscisas!frente!a!la! medida!relativa! de!la!longitud!de!los! telómeros!en! el!eje!de!ordenadas.!Los!círculos! vacíos!corresponden!a!los!controles!libres!de!artrosis!(N=!182)!junto!con!A)!pacientes! con!artrosis!en!la!mano!(N=206),!B)!pacientes!con!artrosis!en!la!rodilla!(N=!229)!y!C)! pacientes! con! artrosis! en! la! cadera! (N=273),! todos! representados! mediante! puntos! negros.!Las!líneas!(punteadas!en!el!caso!de!controles!y!continuas!para!los!pacientes)! representan!la!regresión!de!mínimos!cuadrados!de!los!datos.! & 3. Estudio de envejecimiento celular en pacientes con artritis reumatoide ! Reloj biológico de metilación en pacientes con artritis reumatoide ! Se!analizaron!735!muestras!de!ADN!de!sangre!completa!mediante!MS-SNuPE! para! los! 8! CpGs! que! componen! la! DmAM! de! edad! previamente! descrita.! La! tasa! de! resultados! válidos! para! los! 8! sitios! fue! de! 97.6! %.! Los! demás! datos! de! control! de! calidad!incluyeron!el!CV!entre!placas!descrito!en!el!análisis!de!las!muestras!de!artrosis! y!el!CV!entre!los!duplicados!de!las!muestras!específicas!de!este!análisis!que!fue!menor! al!3.1%!tanto!en!casos!como!en!controles,!con!una!media!de!2.9%.!! ! La! edad! biológica! obtenida! con! el! DmAM! de! 8! CpG! mostró! una! R2=0.35! (p<0.0001)!con!la! edad!cronológica!y! una!MAD!de! 5.79!años! en! los!controles.! Estos! resultados!contribuyen!a!mostrar!la!validez!de!esta!DmAM.!Las!diferencias!de!DmAM! entre! casos! y! controles! tras! ajustar! por! sexo! y! edad! mostraron! un! envejecimiento! significativo!en!los!pacientes!con!AR!(DmAM!pacientes!=!67.20,!DS!=!5.83,!vs.!controles! =!65.30,!DS!=!5.51;!p-valor!=!0.000005).!Sin!embargo,!la!magnitud!de!la!diferencia!fue! pequeña!(ΔDmAM!=!1.90!años;!IC!95%!=!1.08!a!2.72)!(Figura!15).!! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 115! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura!15.!Comparación!de!las!DmAM!de!8!CpG!en!la!sangre!de!pacientes!con!AR!y!de! controles.!DmAM!en!pacientes!con!AR!(puntos!oscuros)!y!controles!(círculos!huecos)! en! relación! con! la! edad! cronológica.! Las! líneas! se! corresponden! con! la! regresión! de! mínimos! cuadrados! de! cada! grupo.! Hay! diferencias! significativas! en! el! punto! de! intersección!con!la!Y,!pero!no!en!las!pendientes.!!! ! En! base! a! esta! diferencia! entre! casos! y! controles,! se! analizó! la! DmAM! en! relación!a!las!características!clínicas!en!los!pacientes!con!artritis!reumatoide.!Ninguna! característica,!ni!la!presencia!de!erosiones,!del!epítopo!compartido,!de!los!anticuerpos! anti-CCP,! del! FR,! ni! la! edad! de! inicio! de! la! enfermedad! o! la! duración! de! la! misma! mostraron!asociación!con!la!DmAM.!Tampoco!el!hábito!tabáquico!mostró!asociación! con! el! envejecimiento! prematuro,! si! bien! en! esta! cohorte! de! pacientes! existe! un! porcentaje!bajo!de!fumadores!(Tabla!12).!!Solo!se!encontraron!diferencias!en!relación! al!sexo,!ya!que!las!mujeres!presentan!menor!DmAM!que!los!hombres!(ΔDmAM!=!-2.12! años;!IC!95%!=!-2.96!a!-1.28;!p-valor!=!0.00001).! ! ! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 116! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Tabla% 12.!Análisis% de% posibles% factores% asociados% con% la% DmAM% entre% las% características%clínica%de%los%pacientes%con%AR.%Los!valores!de!beta!que!se!muestran!se! obtuvieron! considerando! como! referencia! las! mujeres! para! el! sexo,! no! ser! fumador! para!el!tabaquismo,!y!la!presencia!de!erosiones,!FR!o!anticuerpos!anti-CCP.!Error!Std.=! Error!estándar.! ! Para!confirmar!los!resultados!se!utilizó!una!cohorte!independiente!de!pacientes! con!AR!y!sus!controles.!Los!datos!de!metilación!fueron!obtenidos!por!Liu!et#al.,!con!el! Human!Methylation!450!K!Bead-Chip.!Gracias!a!estos!datos,!se!pudieron!las!DmAM!de! Horvath,!de!Hannum!y!de!los!8!CpG.!Se!encontraron!resultados!inconsistentes!entre! las!tres!DmAM!utilizados.!La!DmAM!de!8CpGs!mostró!un!envejecimiento!en!pacientes! con! AR.! La! misma! tendencia! se! encontró! utilizando! la! DmAM! de! Hannum! si! bien! el! resultado! no! alcanzaba! el! nivel! de! significación! de! 0.05.! Sin! embargo,! la! DmAM! de! Horvath!mostró!valores!de!DmAM!significativamente!menores!en!los!pacientes!con!AR! respecto!a!los!controles!(Tabla!13).!!Para!excluir!la!heterogeneidad!en!la!composición! de!células!sanguíneas!como!factor!de!confusión!en!los!análisis,!se!aplicó!la!corrección! descrita! por! Houseman! a! las! tres! DmAM.! Los! análisis! ajustados! por! subpoblaciones! sanguíneas!mostraron!valores!significativamente!menores!de!DmAM!en!los!pacientes! con!AR!que!en!los!controles!en!las!tres!DmAM.!Las!diferencias!fueron!pequeñas,!todas! inferiores! a! los! dos! años.! El! cambio! introducido! por! este! ajuste! fue! mínimo! para! la! DmAM! de! Horvath,! probablemente! reflejando! su! insensibilidad! a! variación! en! la! DmAM Beta valor Error Std. p-valor Intercepto 38,40 3,00 < 1,0 x 10-16 Edad 0,42 0,04 < 1,0 x 10-16 Sexo -1,01 0,47 0,03 Tabaquismo -0,27 0,54 0,62 Erosiones 0,23 0,40 0,57 FR 0,27 0,43 0,52 Anti-CCP -0,64 0,42 0,13 ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 117! composición! sanguínea.! Sin! embargo,! fue! notable! para! las! otras! dos! DmAM,! lo! que! muestra!su!mayor!sensibilidad!a!esta!fuente!de!confusión.!Estos!resultados!sugieren! que!la!tendencia!al!envejecimiento!prematuro!observada!en!la!sangre!de!los!pacientes! con!AR!con!dos!de!las!DmAM!no!puede!distinguirse!de!efectos!debidos!a!cambios!en!la! composición! sanguínea! entre! pacientes! y! controles.! Por! desgracia,! la! falta! de! información!sobre!los!sitios!CpG!necesarios!para!aplicar!esta!corrección!en!los!datos!de! nuestra! colección! de! muestras! impidió! comprobar! si! el! envejecimiento! prematuro! observado!en!esas!muestras!era!debido!al!mismo!tipo!de!factor!de!confusión.! ! ! Tabla% 13.% Diferencias% en% las% DmAM% entre% los% pacientes% con% AR% y% los% controles% del% estudio%de%validación%analizadas%con%diferentes%métodos.%!Se!utilizaron!las!tres!DmAM! mencionadas,! ajustadas! por! sexo! y! edad! o! ajustadas! además! por! el! método! de! Houseman! para! variabilidad! en! la! composición! de! las! subpoblaciones! sanguíneas! (Total).!ΔDmAM!=!DmAM!casos!–!DmAM!controles.!% ! Acortamiento telomérico en la artritis reumatoide ! La!longitud!de!los!telómeros!se!determinó!de!forma!relativa!mediante!qPCR!de! las! 735! muestras! de! la! cohorte! de! descubrimiento,! previamente! descritas.! Los! resultados!superaron!los!criterios!de!control!de!calidad,!incluyendo!un!CV!medio!de!los! duplicados!de!las!muestras!de!0.62%!(rango!=!0.00!a!4.95)!para!el!amplicón!telomérico! y! de! 0.26%! para! el! gen! de! referencia! (rango! =! 0.00! a! 2.29);! así! como! CV! entre! los! DmAM% ΔDmAM! IC%95%% p-valor! 8%CpGs%Ajuste%Básico% 0.74! 0.2!!a!1.28! 0.005! Hannum%Ajuste%Básico% 0.42! -0.23!a!1.07! 0.18! Horvath%Ajuste%Básico% -1.47! -2.23!a!-0.71! 0.00007! 8%CpGs%Ajuste%Total% -0.63! -1.17!a!-0.09! 0.03! Hannum%Ajuste%Total% -0.72! -1.38!a!-0.06! 0.04! Horvath%Ajuste%Total% -1.57! -2.38!a!-0.76! 0.0002! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 118! distintos! rotores! de! 3.7,! 2.65! y! 2.19%! para! el! ratio! T/S! correspondiente! a! los! calibradores!de!160,!35!y!2!ng,!respectivamente!que!disminuyeron!hasta!1.07,!1.77!y! 0.8%,!respectivamente,!tras!la!normalización!de!los!rotores.!! ! Los!resultados!mostraron!una!correlación!positiva!entre!el!ratio!T/S!y!la!edad! cronológica!(correlación!de!Spearman!=!0.13;!p!=!0.0002)!a!pesar!de!que!el!rango!de! edad!de!los!sujetos!de!esta! cohorte! es! estrecho.! Los! hombres! mostraron!telómeros! más!cortos!que!las!mujeres,!pero!sin!alcanzar!valores!de!p!significativos!(diferencia!en! la!ratio!T/S!=!0.05,!IC!95%!=!-0.0005!a!0.1).!Se!realizó!un!ANCOVA!ajustando!por!sexo!y! edad!como!covariables.!No!se!encontró!un!acortamiento!telomérico!significativo!en!los! pacientes!de!AR!e!incluso!éstos!mostraron!telómeros!más!largos!que!los!controles!tras! ajustar!por!sexo!y!edad!(Diferencia!en!la!ratio!T/S!=-0.08,!IC!95%!=! -0.13!a!-0.03;!pvalor! =! 0.005)! (Figura! 16).! Sin! embargo,! ninguna! característica! clínica! mostró! asociación!con!la!ratio!T/S!en!los!pacientes!de!AR,!ni!en!el!análisis!conjunto!(Tabla!14),! ni!tampoco!en!análisis!univariantes!corregidos!por!sexo!y!edad!(datos!no!mostrados).!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Tabla%14.!Análisis%de%la%longitud%de%los%telómeros%en%la%sangre%de%los%pacientes%con% AR.%ANCOVA%para%el%ratio%T/S%en%relación%a%las%características%de%los%pacientes%con% AR.! Los! valores! de! beta! se! refieren! a! mujeres! para! el! sexo,! no! fumadores! para! el! tabaquismo,!y!a!presencia!para!las!erosiones,!el!FR!y!los!anticuerpos!anti-CCP.!Error! Std.=!Error!estándar.! Ratio T/S Beta valor Error Std. p-valor Intercepto -6,851 0,187 < 1,0 x 10-16 Edad 0,007 0,003 0,01 Sexo -0,016 0,029 0,59 Tabaquismo -0,028 0,034 0,41 Erosiones -0,008 0,025 0,76 FR 0,024 0,027 0,37 Anti-CCP 0,023 0,026 0,39 ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 119! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Figura! 16.! Análisis! del! acortamiento! telomérico! con! la! edad! en! la! sangre! de! los! pacientes!con!AR!y!los!controles.!Distribución!de!la!ratio!T/S!en!los!pacientes!con!AR! (puntos!oscuros)!y!los!controles!(círculos!huecos)!en!relación!con!la!edad!cronológica.! Las!líneas!se!corresponden!con!la!regresión!de!mínimos!cuadrados.! ! Estudio de mortalidad en pacientes con artritis reumatoide ! En!estudios!previos!se!ha!relacionado!la!DmAM!con!un!incremento!del!riesgo! de! mortalidad.! Se! realizó! un! análisis! en! nuestra! cohorte! de! pacientes! y! controles! ajustando!por!sexo,!edad!y!hábito!tabáquico.!Un!total!de!364!pacientes!que!cumplen! los! criterios! de! clasificación! de! la! ACR! fueron! incluidos! en! este! análisis.! Se! inició! la! recogida!de!datos!en!2001!hasta!2009!y!se!realizó!un!seguimiento!de!los!hasta!2015.!El! tiempo!medio!de!seguimiento!fue!de!114.85!meses!(SD!=!81.07).!La!media!de!personas! año!fue!de!7063.69.!!Al!final!del!estudio,!242!sujetos!habían!fallecido!de!un!total!de! 738,!lo!que!corresponde!a!un!33.24%.!La!tasa!de!mortalidad!es!de!42.27!‰!(IC!=!33.04! ! ! ! RESULTADOS* ! ! ! 120! a!54.08)!en!pacientes!con!AR!y!de!26.70!‰!en!pacientes!(IC!=!18.28!a!39.00).!El!riesgo! relativo!de!los!pacientes!con!AR!mostró!un!incremento!frente!a!controles!después!del! ajuste! (Tabla! 15),! observándose! una! mortalidad! 1.86! veces! mayor.! Sin! embargo,! la! edad!biológica,!tanto!determinada!!mediante!la!DmaM!de!!8!CpGs!como!mediante!la! ratio!T/S,!no!mostró!asociación!con!el!riesgo!de!mortalidad!de!los!pacientes!de!AR.!! ! Tabla%15.%Riesgo%relativo%de%mortalidad%en%los%pacientes%con%AR%en%relación%con%los% controles%sanos.%%Los!resultados!fueron!obtenidos!en!una!regresión!según!el!modelo! de!riesgo!proporcional!de!Cox.!! !! Riesgo%Relativo% IC%95%% p-valor%% Edad% 1,13! 1,1! 1,15! 5,20!x!10-30! Pacientes%con%AR% 1,86! 1,42! 2,42! 4,79!x!10-06! Sexo%(femenino)% 1,4! 1,09! 1,83! 0,01! ΔDmAM% 0,99! 0,97! 1,01! 0,28! Ratio%T/S% 0,8! 0,51! 1,23! 0,31! ! ! 123! DISCUSIÓN ! Los!resultados!presentados!reflejan!los!tres!objetivos!planteados!y!así!van!a!ser! discutidos.! En! primer! lugar,! se! ha! desarrollado! y! validado! una! medida! de! edad! biológica!basada!en!la!metilación!del!ADN!que!permite!el!estudio!de!muchas!muestras! de!sangre!utilizando!PCR!y!un!secuenciador!capilar!de!forma!eficiente!y!exacta.!Esta! medida! se! ha! utilizado! en! los! otros! dos! objetivos.! Así! nos! ha! servido,! junto! a! otros! biomarcadores!de!envejecimiento,!para!analizar!los!componentes!sistémico!y!local!del! envejecimiento!prematuro!en!los!pacientes!con!artrosis.!Esta!nueva!medida!de!edad! biológica! nos! ha! permitido! confirmar! evidencias! previas! de! envejecimiento! en! el! cartílago!de!la!articulación!afectada,!pero!no!fuera!de!esa!localización.!Estos!resultados! tienen!implicaciones!sobre!la!magnitud!de!la!afectación!en!la!artrosis.!Por!último,!el! análisis! de! los! mimos! biomarcadores! de! envejecimiento! en! muestras! de! sangre! de! pacientes! con! artritis! reumatoide! no! ha! demostrado! envejecimiento! acelerado! consistente,!lo!que!cuestiona!algunos!resultados!previos!y!nos!lleva!a!interpretar!de! una!forma!más!restrictiva!el!aumento!de!mortalidad!observado!en!estos!pacientes.! ! Predicción de edad biológica mediante 8 sitios CpG ! En! este! trabajo! hemos! desarrollado! una! nueva! medida! de! edad! biológica! (la! DmAM!de!8!CpG)!apropiada!para!grandes!estudios!de!muestras!de!sangre!completa!en! sujetos! adultos! realizados! en! laboratorios! que! cuenten! con! un! secuenciador! de! capilares.!! ! Con!esta!DmAM!se!alcanzó!un!compromiso!entre!su!facilidad!para!la!aplicación! a! grandes! tamaños! muestrales! y! la! precisión! en! la! estimación! de! la! edad! biológica.! Permite!la!detección!de!cambios!en!la!edad!epigenética!ligeramente!menos!precisos! que! otros! modelos! desarrollados! previamente! pero! que! necesitan! de! una! mayor! inversión! económica! por! muestra,! pues! requieren! de! la! obtención! de! los! niveles! de! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 130! pacientes! con! artrosis! y! sus! respectivos! controles.! Dado! que! ningún! estudio! ha! replicado!el!hallazgo!de!Zhai!y!col.![58],!existe!la!necesidad!de!replicar!los!resultados! encontrados! para! validar! o! descartar! la! implicación! del! envejecimiento! a! nivel! sistémico!en!la!artrosis.! ! Nuestro!estudio!no!encontró!ninguna!evidencia!de!acortamiento!telomérico!en! las! 890! muestras! estudiadas.! La! correlación! con! la! edad! fue! comparable! a! la! encontrada!en!otros!estudios!de!acortamiento!telomérico!en!sangre,!y!posiblemente!a! la!del!estudio!de!Zhai,!si!bien!no!reportan!el!valor!de!correlación!sino!solo!el!número! de!pares!de!bases!que!disminuye!por!año!y!la!significación!de!la!misma!(16!+-!2!pb;!p!<! 0.001)![58].!! ! No!encontramos!asociación!entre!el!acortamiento!telomérico!con!la!artrosis!de! mano,!única!estudiada!en!el!trabajo!de!Zhai!y!col.,!ni!con!la!de!cadera!o!rodilla,!que!no! habían!sido!previamente!estudiadas.!Además,!tampoco!encontramos!asociación!en!el! conjunto! de! las! muestras! de! artrosis! sin! estratificar! por! articulación.! Las! diferencias! encontradas!en!el!estudio!anterior!indican!un!acortamiento!de!281!pb!en!los!pacientes! con! artrosis! en! la! mano,! que! se! reduce! a! 178! pb! tras! ajustar! por! las! variables! de! confusión.! Este! acortamiento! es! equivalente! a! unos! 11! años! de! envejecimiento! si! tenemos!en!cuenta!la!tasa!de!acortamiento!por!año!que!se!describe!en!la!cohorte.!Sin! embargo,! otros! estudios! han! mostrado! una! tasa! mayor! de! acortamiento! de! los! telómeros,! entre! 20! y! 40! pb! por! año,! con! lo! que! reduciría! a! entre! 9! y! 4! años! el! envejecimiento!de!los!pacientes!con!artrosis!en!la! mano![399].!En!cualquier!caso,!la! magnitud! del! envejecimiento! observado! en! el! estudio! de! Zhai! y! colaboradores! es! llamativa.!Podría!explicar!sin!problemas!el!aumento!de!comorbilidades!asociadas!con! el! envejecimiento! y! de! mortalidad! observado! en! algunos! estudios! epidemiológicos! [332]–[335].!Por!otra! parte,!serían! una! indicación!clara! de!un!estado! de!fragilidad!o! debilidad!sistémica!como!parte!de!la!artrosis!de!mano.!Precisamente!por!esta!razón! estos!resultaros!tuvieron!gran!repercusión!cuando!fueron!publicados.!Además,!como! la!tasa!de!erosión!de!los!telómeros!en!condrocitos!es!semejante!a!la!encontrada!en! sangre! periférica,! entre! 22! y! 40! pb! al! año! [331],! sería! interesante! comparar! el! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 131! acortamiento! en! la! sangre! de! los! pacientes! con! el! encontrado! en! condrocitos! de! pacientes!con!artrosis.!Por!desgracia,!esto!no!es!posible!debido!a!la!utilización!de!una! técnica! relativa! en! los! dos! estudios! de! longitud! de! los! telómeros! realizados! hasta! el! momento![57],![58].!! ! Solamente!otro!estudio,!de!Tamayo!y!colaboradores,!ha!abordado!el!análisis!de! la!longitud!de!los!telómeros!en!sangre!periférica!de!pacientes!con!artrosis!mediante!la! técnica!de!qPCR.!Sin!embargo,!en!este!estudio!se!incluyen!solamente!34!muestras!sin! estratificar!por!edad,!por!lo!que!a!pesar!de!no!encontrar!diferencias!significativas!entre! casos!y!controles,!no!puede!considerarse!como!una!validación!definitiva![62].! ! Parece!probable!que!las!diferencias!encontradas!entre!nuestros!resultados!y!el! estudio! de! Zhai! y! colaboradores! puedan! deberse! a! variabilidad! entre! las! series! de! pacientes.! Es! muy! probable! que! las! series! sean! distintas,! la! nuestra! basada! en! pacientes!con!artrosis!clínicamente!definida,!la!de!Zhai!y!colaboradores!basada!en!la! utilización! de! radiografías! como! único! criterio! de! inclusión! [58].! Los! cambios! radiográficos!característicos!de!la!artrosis!de!manos!son!muy!frecuentes!con!la!edad! avanzada,!pero,!a!menudo,!no!están!acompañados!de!la!sintomatología!característica! de!la!artrosis![400].!Si!estos!cambios!se!pueden!confundir!con!envejecimiento,!como!se! sugiere! por! un! biomarcador! de! edad! biológica! basado! en! el! sistema! de! puntuación! oseográfico![285],!sería!posible!que!se!diese!lugar!al!resultado!observado!por!Zhai!y! colaboradores.! ! Por! último! en! relación! con! este! punto,! la! técnica! de! determinación! de! la! longitud! de! los! telómeros! que! hemos! utilizado! supone! una! limitación! a! la! hora! de! comparar! los! resultados! entre! estudios.! La! técnica! de! qPCR! permite! únicamente! un! análisis! relativo! de! la! longitud! de! los! telómeros! entre! las! muestras! estudiadas,! haciendo!imposible!la!comparación!entre!estudios.!Esta!es!una!limitación!que!no!tiene! el! Southern! blot! que! por! su! naturaleza! permite! comparaciones! entre! ensayos.! Sin! embargo,! la! cuantificación! de! la! longitud,! siempre! difícil! en! el! Southern! blot,! se! ve! complicada! por! el! bandeado! múltiple! que! se! produce! al! analizar! telómeros! en! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 132! muestras! de! sangre! completa.! Por! ello,! la! cuantificación! con! esta! técnica! tiene! una! limitada!reproducibilidad! y!consistencia! entre!ensayos!y!entre!laboratorios![301].!En! nuestro! estudio,! intentamos! aumentar! la! precisión! y! exactitud! de! los! resultados! aplicando! todos! los! pasos! detallados! en! el! protocolo! tanto! en! el! diseño! como! en! el! análisis! de! los! resultados.! Dos! factores! muy! importantes! fueron! la! utilización! de! un! robot!para!automatizar!el!proceso!de!pipeteado!en!todos!los!pasos!de!las!qPCR!y!la! utilización!de!replicados!de!cada!muestra,!lo!que!nos!permitió!repetir!las!muestras!con! elevados!coeficientes!de!variación.!De!esta!forma!se!aseguró!que!las!determinaciones! fueran! altamente! reproducibles,! tanto! a! nivel! de! muestra! entre! replicados,! como! a! nivel! de! ensayos! entre! rotores.! Estas! características! aportan! confianza! en! los! resultados!aunque!no!contribuyen!a!explicar!la!discordancia!con!el!estudio!de!Zhai!y! colaboradores.! ! Por! otro! lado,! la! ausencia! de! una! aceleración! en! la! edad! epigenética! de! la! sangre! y! el! hueso! no! se! puede! atribuir! a! la! falta! de! potencia! estadística.! Nuestros! análisis! con! la! DmAM! de! 8! CpG! en! las! muestras! sanguíneas! cuentan! con! suficiente! poder! estadístico! para! excluir! un! envejecimiento! de! la! mitad! de! magnitud! que! el! observado!en!cartílago!(1-!β!>!0.95!para!excluir!una!diferencia!de!1.83!años!para!cada! una! de! las! comparaciones! según! articulación).! El! análisis! de! hueso! con! la! DmAM! de! Horvath,! sin! embargo,! es! suficientemente! potente! como! para! detectar! un! envejecimiento!de!igual!magnitud!que!el!observado!en!cartílago!(1-!β!=!0.90).!!Además,! el!uso!de!diferentes!DmAM!para!los!diferentes!tejidos!no!ha!interferido!en!el!análisis! debido!a!que!en!cada!caso!se!han!utilizado!controles!específicos!para!cada!tejido,!y!no! se! han! hecho! comparaciones! entre! los! diferentes! tejidos.! También! se! ha! evitado! el! sesgo!debido!a!diferencias!en!edad!!y!sexo!entre!los!grupos!de!pacientes!y!controles! ajustando! por! ambas! variables,! como! se! recomienda! en! este! tipo! de! estudios! [88],! [94],![369].!Además,!la!precisión!del!predictor!de!Horvath!utilizada!para!la!estimación! de!la!edad!biológica!de!cartílago!es!de!4!años,!similar!a!la!precisión!de!8!CpG!utilizado! en! sangre! (5.07! años).! Hay! que! tener! en! cuenta! que! en! el! caso! de! la! DmAM! de! Horvath,! el! error! absoluto! medio! (MAD)! se! ha! estimado! utilizando! únicamente! muestras!incluidas!en!la!cohorte!de!entrenamiento,!mientras!que!en!nuestro!caso!se! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 133! calcula!en!una!cohorte!de!validación!diferente!a!la!de!entrenamiento,!lo!que!siempre! incrementa!los!valores!de!MAD![94],![401].!! ! Sin! embargo,! existen! limitaciones! en! este! estudio! como! la! ausencia! de! muestras!de!diferentes!tejidos!del!mismo!individuo,!que!permitiría!una!estimación!más! precisa!de!la!magnitud!del!envejecimiento!prematuro!del!cartílago!respecto!a!la!edad! biológica!de!otros!tejidos!del!individuo;!la!ausencia!de!otros!tejidos!articulares,!como! el! tejido! sinovial,! que! podrían! sufrir! en! mayor! medida! que! el! hueso! los! efectos! del! envejecimiento!prematuro!y!finalmente!un!número!mayor!de!muestras!de!cartílago!de! la!cabeza!femoral!que!permitiese!un!análisis!específico!de!los!pacientes!con!artrosis!en! la!cadera.!También!hubiera!sido!deseable!poder!estudiar!la!longitud!de!los!telómeros! en!muestras!de!tejidos,!pues!aunque!no!es!la!aplicación!para!la!que!esta!técnica!se!ha! validado! de! forma! más! extensa,! hay! antecedentes! en! cartílago! artrósico! y! nos! permitiría!comparar!distintas!medidas!de!envejecimiento!en!las!mismas!muestras.! ! En! resumen,! hemos! encontrado! un! envejecimiento! prematuro,! medido! mediante!metilación!del!ADN,!específico!del!cartílago!de!las!articulaciones!afectadas! por! la! artrosis.! El! conocimiento! de! los! mecanismos! de! este! tipo! de! medida! del! envejecimiento! podría! ayudar! a! entender! en! mayor! profundidad! esta! patología.! Sin! embargo!por!el!momento,!lo!único!que!puede!concluirse!acerca!de!los!mecanismos!de! envejecimiento!es!que!no!actúan!a!nivel!sistémico.!Esto!puede!afirmarse!debido!a!que! se! ha! estudiado! el! envejecimiento! mediante! la! metilación! del! ADN! en! el! hueso! próximo! a! la! articulación! afectada! y! en! sangre! de! pacientes! con! artrosis! y! los! resultados! no! muestran! el! envejecimiento! encontrado! en! cartílago.! Además,! el! envejecimiento!sistémico!se!ha!descartado!también!mediante!el!análisis!de!la!longitud! de!los!telómeros!en!sangre!periférica!de!pacientes!y!controles.!Sin!embargo,!no!puede! excluirse! que! otros! mecanismos! del! envejecimiento! pudiesen! afectar! de! forma! más! extensa!que!los!cambios!en!metilación!y!la!longitud!de!los!telómeros!a!diversos!tejidos! durante!la!artrosis.!La!ausencia!de!un!envejecimiento!sistémico!en!la!artrosis!reforzaría! la! hipótesis! de! acumulación! de! daños! durante! el! envejecimiento! que! afecta! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 134! mayoritariamente!al!cartílago!de!la!articulación!dañada,!siguiendo!la!teoría!de!uso!y! desgaste![402].!! ! Estudio de envejecimiento celular en pacientes con artritis reumatoide ! Nuestro! estudio! no! muestra! indicios! de! un! envejecimiento! prematuro! en! las! células!sanguíneas!de!los!pacientes!con!artritis!reumatoide!comparados!con!controles! de! la! misma! edad.! Las! dos! medidas! de! edad! biológica! utilizadas,! basadas! en! la! metilación! del! ADN! y! en! la! longitud! de! los! telómeros,! nos! llevan! a! esta! conclusión! aunque! algunos! resultados! necesitan! ser! considerados! con! prudencia! y! resaltan! la! necesidad!de!considerar!cuidadosamente!todos!los!posibles!factores!de!confusión.!! ! En!efecto,!encontramos!un!envejecimiento!prematuro!en!los!pacientes!con!AR! en!la!cohorte!de!descubrimiento!utilizando!la!nueva!DmAM!de!8!CpG.!El!incremento! observado! de! 1.9! años! es! pequeño! pero! claramente! significativo,! sin! lugar! a! dudas,! debido! al! considerable! número! de! muestras! analizadas.! Sin! embargo,! hay! toda! una! serie!de!evidencias!que!nos!hacen!cuestionar!el!significado!de!esta!diferencia.!Tanto!la! ausencia! de! correlación! entre! el! envejecimiento! prematuro! encontrado! y! las! características! clínicas! de! los! pacientes! de! AR,! como! la! ausencia! de! contribución! al! riesgo!incrementado! de!mortalidad!de! los!mismos,!sugieren! que!este!incremento!es! biológicamente! irrelevante! a! pesar! de! ser! estadísticamente! significativo.! Pero! la! evidencia! más! importante! y! la! única! definitiva! para! dudar! de! este! resultado! es! la! obtenida!del!estudio!de!replicación.! ! En! la! cohorte! de! validación,! los! pacientes! con! AR! muestran! también! un! incremento! de! DmAM! respecto! a! los! controles! con! nuestra! DmAM! de! 8CpG.! Sin! embargo,!la!DmAM!de!Hannum!no!alcanzó!un!resultado!significativo!y!la!de!Horvath! mostró!la!dirección!opuesta.!Estas!dos!DmAM!no!pudieron!aplicarse!en!la!colección!de! descubrimiento!por!falta!de!información!en!los!sitios!CpG!necesarios.!Los!resultados! contradictorios!entre!la!DmAM!de!8CpG!y!de!la!Horvath!son!especialmente!llamativos! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 135! pues! los! dos! fueron! significativos,! pero! en! sentido! opuesto.! Las! diferencias! podrían! deberse!a!problemas!de!falta!de!precisión!de!las!tres!DmAM!ya!que!son!pequeñas!en! magnitud,!2.21!años!entre!las!dos!DmAM!más!diferentes,!lo!que!entra!dentro!del!error! esperable!y!que!no!nos!hubiese!parecido!digno!de!mención!si!se!hubiesen!obtenido!en! la! misma! dirección.! Se! puede! pensar! que! diferencias! en! características! clínicas! y! poblacionales!entre!la!cohorte!de!replicación!y!la!cohorte!de!descubrimiento!podrían! haber!influido!en!estas!discordancias!ya!que!hay!algunas!que!son!notables.!Así,!todos! los! pacientes! de! Liu! y! colaboradores! son! anti-CCP! positivos,! pero! sólo! el! 64! %! en! la! cohorte!de!descubrimiento.!Además!la!media!de!edad!es!unos!20!años!menor!en!la! cohorte!de!validación,!y!el!porcentaje!de!fumadores!es!muy!inferior!en!los!pacientes! de!nuestro!estudio.!Sin!embargo,!la!DmAM!de!8!CpG!mostró!resultados!similares!en! los! dos! estudios! (envejecimiento! acelerado! en! los! pacientes),! y! ninguna! de! estas! características!diferentes!entre!las!dos!colecciones!parece!afectar!a!los!resultados!de! las!diferentes!DmAM,!ya!sea!cuando!han!sido!analizadas!en!sus!respectivos!procesos! de!validación!(excepto! por!los!anticuerpos! anti-CP),! o!en! las! muestras!analizadas! en! este!estudio.!! ! La!discordancia!también!nos!llevó!a!considerar!la!variabilidad!en!composición! sanguínea!como!posible!causa.!A!priori,!no!parecía!una!buena!explicación!pues!las!tres! DmAM!habían!sido!validadas!como!insensibles!a!este!tipo!de!variable.!Sin!embargo,!los! resultados! obtenidos! al! aplicar! la! corrección! de! Houseman! han! mostrado! que! esa! insensibilidad! es! probablemente! relativa! e! insuficiente! para! los! cambios! en! composición!sanguínea!asociados!con!la!artritis!reumatoide.!De!todas!formas,!parece! que!la!DmAM!de!Horvath,!que!es!la!que!valora!más!sitios!CpG!y!la!que!ha!sido!validada! en!más!tejidos,!es!la!menos!sensible!a!estos!cambios.!De!hecho,!sólo!se!observó!una! diferencia!de!0.1!años!entre!el!valor!corregido!y!sin!corregir,!lo!que!es!despreciable.! Por!el!contrario,!la!DmAM!de!8!CpG!mostró!un!cambio!de!1.37!años,!y!la!desarrollada! por! Hannum! y! sus! colaboradores! de! 1.14! años.! Ninguna! de! estas! diferencias! es! de! magnitud! preocupante! y! parecen! compatibles! con! los! resultados! de! las! validaciones! que!mostraban! su!insensibilidad!a! este!tipo!de!variabilidad.!En! nuestro!caso,!se!han! unido!un!tamaño!muestral!importante!con!un!nivel!de!diferencia!en!la!DmAM!cercano! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 136! a!0!para!resaltar!estos!efectos.!Como!detalle!adicional,!se!puede!comentar!que!en!la! corrección! de! Houseman! tienen! un! peso! importante! las! células! NK! que! no! están! incluidas!entre!las!poblaciones!valoradas!en!la!colección!de!validación!del!DmAM!de!8! CpG.!Sin!embargo,!estas!células!son!poco!abundantes!en!la!sangre!y!no!se!han!descrito! cambios!importantes!en!su!frecuencia!total!en!los!pacientes!con!artritis!reumatoide,! por!lo!que!es!improbable!que!puedan!explicar!el!factor!de!confusión!por!sí!solas.!! ! Por!último,!se!debe!comentar!que!la!DmAM!de!Horvath!aunque!no!cambia!por! efecto! de! la! corrección! muestra! una! diferencia! significativa! hacia! un! envejecimiento! menor.! Lo! mismo! le! ocurre! a! la! DmAM! de! 8! CpG! tras! corrección! por! composición! sanguínea.!Estos! resultados!sugieren! la!posibilidad! de!que!además!del!problema!del! cambio!en!la!composición!sanguínea,!la!artritis!reumatoide!se!acompañe!de!cambios! en!la!metilación!que!produzcan!un!sesgo!en!los!resultados!de!los!DmAM.!Este!tipo!de! efecto!es!posible!pues!se!ha!observado!una!hipometilación!predominante!en!algunas! subpoblaciones!sanguíneas!de!estos!pacientes,!así!como!cambios!específicos!en!sitios! CpG!tanto!hacia!la!disminución!como!hacia!el!aumento!de!la!metilación! [354].!En!el! momento! actual,! no! se! puede! aventurar! nada! más! pues! haría! falta! validar! los! resultados!en!otras!colecciones!de!muestras.!En!este!sentido,!es!de!lamentar!que!por! la! falta! de! información! sobre! los! sitios! CpG! necesarios! para! la! corrección! por! composición! sanguínea! de! Houseman! no! podamos! aplicarla! a! los! resultados! de! la! colección!de!descubrimiento.!Aun!así,!interpretamos!que!el!envejecimiento!prematuro! observado!en!esa!colección!de!muestras!no!es!genuino,!sino!probablemente!debido!al! efecto!de!variación!en!la!composición!sanguínea!una!vez!comprobado!lo!sucedido!con! la!cohorte!de!replicación.! ! Los!resultados!obtenidos!con!el!análisis!de!la!longitud!de!los!telómeros!apoyan! esta!interpretación,!pues!en!la!misma!colección!de!pacientes!y!controles!no!muestran! acortamiento! telomérico! acelerado! en! los! pacientes.! Este! es! un! argumento! limitado! pues,! como! ya! se! ha! comentado,! los! distintos! biomarcadores! de! envejecimiento! pueden!tener!una!sensibilidad!diferente!en!distintos!tejidos!o!enfermedades.!Además,! con! anterioridad! se! ha! descrito! acortamiento! telomérico! acelerado! en! los! pacientes! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 137! con! AR! que! equivaldría! a! unos! 20! años! [361].! Esta! cifra! parece! elevada,! pues! otras! evidencias!de!posible!envejecimiento!no!muestran!una!diferencia!tan!marcada,!ni!el! aumento! de! mortalidad! o! incapacidad! observados! en! la! artritis! reumatoide! parecen! compatibles! con! un! efecto! tan! dramático.! Otros! estudios! de! poblaciones! muy! específicas! de! linfocitos,! especialmente! de! linfocitos! T,! han! encontrado! signos! de! envejecimiento!acelerado![61],![105][173].!Sin!embargo,!no!parece!que!esos!cambios! específicos!se!reflejen!a!nivel!de!la!sangre!completa.!Además,!parecen!tener!lugar!sólo! en! pacientes! muy! jóvenes,! por! debajo! de! los! 40! años,! una! edad! a! la! que! sólo! una! fracción!minoritaria!de!los!pacientes!han!desarrollado!la!enfermedad.!! ! El!hecho!de!que!los!dos!estudios!mostrando!acortamiento!telomérico!acelerado! en!los!pacientes!con!artrosis!de!manos!y!con!artritis!reumatoide!se!hayan!realizado!por! el!mismo!grupo!y!en!la!misma!colección!de!sujetos!(la!cohorte!de!gemelos!TwinsUK)! indica!la!posibilidad!de!que!haya!alguna!característica!distintiva!en!esa!colección!o!en! los!análisis!realizados.!Este!comentario!se!aplica!también!a!nuestros!resultados,!ya!que! la! metodología! utilizada! para! el! estudio! de! los! telómeros! ha! sido! la! misma! en! la! artrosis!y!en!la!artritis!reumatoide.!Sin!embargo,!ni!los!casos,!ni!la!mayor!parte!de!los! controles!son!compartidos!entre!nuestros!dos!estudios!por!lo!que!la!peculiaridad!de!la! población!es!menos!probable.!!En!cualquier!caso,!nos!parece!muy!deseable!que!haya! más! grupos! que! analicen! esta! cuestión! con! independencia.! No! es! que! no! haya! sido! analizada,! sino! que! lo! ha! sido! con! estudios! pequeños.! En! la! artrosis,! ya! se! ha! comentado! con! anterioridad! que! sólo! hay! dos! estudios! pequeños,! el! de! Zhai! y! sus! colaboradores,!y!el!nuestro!que!es!el!mayor!realizado.!Lo!mismo!sucede!en!la!artritis! reumatoide,!solo!hay!estudios!pequeños![61],![62],!con!excepción!del!realizado!por!el! grupo!de!TwinsUK,!y!el!nuestro!que!vuelve!a!ser!el!mayor!número!de!muestras.!! ! Uno! de! los! aspectos! más! atractivos! de! los! análisis! de! edad! biológica! lo! constituye! la! interpretación! de! esa! edad! como! un! marcador! del! estado! de! salud! en! relación!con!el!estado!medio!de!la!población!de!la!misma!edad!cronológica.!Por!ello,! parecía!interesante!comprobar!si!el!aumento!de!la!mortalidad!que!se!observa!en!los! pacientes! con! artritis! reumatoide,! y! que! hemos! confirmado! en! nuestros! pacientes,! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 138! tenía!relación!con!un!aumento!de!la!edad!biológica.!No!ha!sido!así.!Esta!ausencia!de! relación! se! debe! contrastar! con! el! claro! incremento! de! mortalidad! en! los! pacientes! respecto! a! los! controles! de! 1.86! veces.! Este! exceso! de! mortalidad! muestra! una! tendencia! a! anularse,! tras! la! aplicación! de! las! nuevas! terapias! biológicas! y! el! diagnóstico!precoz!de!la!enfermedad![403]–[405].!Pero!todavía!sigue!estando!elevado! en!la!mayoría!de!los!estudios.!No!hubiese!sido!sorprendente!encontrar!una!asociación! con! la! DmAM,! ya! que! se! han! publicado! estudios! en! los! que! la! edad! biológica! así! evaluada! se! ha! asociado! a! un! aumento! de! la! mortalidad! de! un! 11-21%! en! cohortes! longitudinales! de! sujetos! de! ! avanzada! edad! [406].! ! También! han! encontrado! asociación! con! la! mortalidad! otros! estudios! con! otros! diseños! diferentes,! bien! longitudinales!en!la!población!general!o!de!gemelos!discordantes!![407].!Sin!embargo,! todos! estos! estudios! que! han! encontrado! asociación! tenían! una! gran! potencia! estadística,! bien! porque! eran! muy! grandes,! más! de! 4.500! sujetos,! porque! tenían! carácter! longitudinal,! o! porque! al! estudiar! gemelos! discordantes! disminuyen! mucho! los!factores!de!confusión.!Por!lo!tanto,!es!posible!que!nuestro!estudio!carezca!de!la! potencia!estadística!necesaria!para!revelar!este!tipo!de!asociación.!! ! La! relación! de! la! longitud! de! los! telómeros! con! la! mortalidad! es! mucho! más! controvertida.!Hay!estudios!que!las!han!relacionado![408]–[410],!pero!otros!no!lo!han! hecho![411],![412].!Nuestros!resultados!se!unen!a!este!segundo!grupo:!no!muestran! asociación!entre!la!longitud!de!los!telómeros!y!la!mortalidad,!ni!entre!los!pacientes,!ni! entre!los! controles.!Si! bien!los! pacientes!de! AR!de! nuestro!estudio! no!presentan! un! acortamiento! telomérico! respecto! a! los! controles,! podría! esperarse! que! tanto! pacientes! como! controles! con! los! telómeros! más! cortos! tuviesen! un! riesgo! incrementado! de! mortalidad.! Pero! no! ha! sido! así.! Es! posible! que! también! en! este! análisis! el! poder! estadístico! del! estudio! sea! insuficiente.! Sin! embargo,! las! múltiples! diferencias! entre! distintos! estudios! dificultan! la! identificación! de! un! posible! factor! común! que! separe! los! estudios! que! encuentran! asociación! de! los! que! no! lo! hacen,! como!el!nuestro.!Entre!los!posibles!factores,!se!pueden!incluir!diferencias!en!la!técnica! de! determinación! del! acortamiento,! en! las! características! de! la! población! y! en! las! metodologías!de!análisis.!! ! ! ! DISCUSIÓN( ! ! ! 139! ! En! resumen! de! este! apartado! final,! no! hemos! encontrado! evidencias! consistentes!de!un!envejecimiento!prematuro!en!la!sangre!de!los!pacientes!con!artritis! reumatoide!tras!analizar!dos!marcadores!de!edad!biológica:!la!metilación!del!ADN!y!la! longitud! de! los! telómeros.! Se! necesitará! analizar! la! implicación! de! estos! y! otros! biomarcadores!de!envejecimiento!en!las!subpoblaciones!sanguíneas!específicas!y!en!el! tejido!sinovial!para!clarificar!el!proceso!de!envejecimiento!en!la!artritis!reumatoide.!! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 150! [43]! M.! Blasco,! “Telomeres! and! human! disease:! ageing,! cancer! and! beyond.,”! Nat.% Rev.%Genet.,!vol.!6,!no.!8,!pp.!611–22,!2005.! [44]! M.!Armanios,!J.!K.!Alder,!E.!M.!Parry,!B.!Karim,!M.!A.!Strong,!and!C.!W.!Greider,! “Short!Telomeres! are!Sufficient! to!Cause! the!Degenerative!Defects!Associated! with!Aging,”!Am.%J.%Hum.%Genet.,!vol.!85,!no.!6,!pp.!823–832,!2009.! [45]! M.!A.!Blasco,!H.!W.!Lee,!M.!P.!Hande,!E.!Samper,!P.!M.!Lansdorp,!R.!A.!DePinho,! and!C.!W.!Greider,!“Telomere!shortening!and!tumor!formation!by!mouse!cells! lacking!telomerase!RNA.,”!Cell,!vol.!91,!no.!1,!pp.!25–34,!1997.! [46]! E.!Herrera,!E.!Samper,!J.!Mart??n-Caballero,!J.!M.!Flores,!H.!W.!Lee,!and!M.!A.! Blasco,!“Disease!states!associated!with!telomerase!deficiency!appear!earlier!in! mice!with!short!telomeres,”!EMBO%J.,!vol.!18,!no.!11,!pp.!2950–2960,!1999.! [47]! S.! L.! Bakaysa,! L.! A.! Mucci,! P.! E.! Slagboom,! D.! I.! Boomsma,! G.! E.! Mcclearn,! B.! Johansson,!and!N.!L.!Pedersen,!“Telomere!length!predicts!survival!independent! of!genetic!influences,”!Aging%Cell,!vol.!6,!no.!6,!pp.!769–774,!2007.! [48]! R.! M.! Cawthon,! K.! R.! Smith,! E.! O’Brien,! A.! Sivatchenko,! and! R.! A.! Kerber,! “Association!between!telomere!length!in!blood!and!mortality!in!people!aged!60! years!or!older,”!Lancet,!vol.!361,!no.!9355,!pp.!393–395,!2003.! [49]! M.!Jaskelioff,!F.!L.!Muller,!J.-H.!Paik,!E.!Thomas,!S.!Jiang,!A.!C.!Adams,!E.!Sahin,! M.! Kost-Alimova,! A.! Protopopov,! J.! Cadiñanos,! J.! W.! Horner,! E.! Maratos-Flier,! and! R.! a.! DePinho,! “Telomerase! reactivation! reverses! tissue! degeneration! in! aged!telomerase-deficient!mice.,”!Nature,!vol.!469,!no.!7328,!pp.!102–6,!2011.! [50]! M.!Armanios!and!E.!H.!Blackburn,!“The!telomere!syndromes,”!Nat.%Rev.%Genet.,! vol.!13,!no.!10,!pp.!693–704,!2012.! [51]! S.!A.!Savage,!N.!Giri,!G.!M.!Baerlocher,!N.!Orr,!P.!M.!Lansdorp,!and!B.!P.!Alter,! “TINF2,!a!Component!of!the!Shelterin!Telomere!Protection!Complex,!Is!Mutated! in! Dyskeratosis! Congenita,”! Am.% J.% Hum.% Genet.,! vol.! 82,! no.! 2,! pp.! 501–509,! 2008.! [52]! F.!Zhong,!S.!A.!Savage,!M.!Shkreli,!N.!Giri,!L.!Jessop,!T.!Myers,!R.!Chen,!B.!P.!Alter,! and! S.! E.! Artandi,! “Disruption! of! telomerase! trafficking! by! TCAB1! mutation! causes!dyskeratosis!congenita,”!Genes%Dev.,!vol.!25,!no.!1,!pp.!11–16,!2011.! [53]! T.!Wang,!S.!C.!Mei,!R.!Fu,!H.!Q.!Wang,!and!Z.!H.!Shao,!“Expression!of!shelterin! component! POT1! is! associated! with! decreased! telomere! length! and! immunity! condition!in!humans!with!severe!aplastic!anemia,”!J.%Immunol.%Res.,!vol.!2014,! 2014.! [54]! P.!Martinez!and!M.!A.!Blasco,!“Role!of!shelterin!in!cancer!and!aging,”!Aging%Cell,! vol.!9,!no.!5.!pp.!653–666,!2010.! [55]! A.! Z.! a! Dehbi,! T.! R.! D.! J.! Radstake,! and! J.! C.! a! Broen,! “Accelerated! telomere! shortening! in! rheumatic! diseases:! cause! or! consequence?,”! Expert% Rev.% Clin.% Immunol.,!vol.!9,!no.!12,!pp.!1193–204,!2013.! [56]! J.!S.!Price,!J.!G.!Waters,!C.!Darrah,!C.!Pennington,!D.!R.!Edwards,!S.!T.!Donell,!and! I.!M.!Clark,!“The!role!of!chondrocyte!senescence!in!osteoarthritis.,”!Aging%Cell,! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 151! vol.!1,!no.!1,!pp.!57–65,!2002.! [57]! M.! Harbo,! L.! Bendix,! A.-C.! Bay-Jensen,! J.! Graakjaer,! K.! Søe,! T.! L.! Andersen,! P.! Kjaersgaard-Andersen,!S.!Koelvraa,!and!J.-M.!Delaisse,!“The!distribution!pattern! of!critically!short!telomeres!in!human!osteoarthritic!knees.,”!Arthritis'Res.'Ther.,! vol.!14,!no.!1,!p.!R12,!2012.! [58]! G.!Zhai,!!a!Aviv,!D.!J.!Hunter,!D.!J.!Hart,!J.!P.!Gardner,!M.!Kimura,!X.!Lu,!!a!M.! Valdes,! and! T.! D.! Spector,! “Reduction! of! leucocyte! telomere! length! in! radiographic!hand!osteoarthritis:!a!population-based!study.,”!Ann.'Rheum.'Dis.,! vol.!65,!no.!11,!pp.!1444–1448,!2006.! [59]! E.!a.!Blinova,!E.!V.!Zinnatova,!M.!S.!Barkovskaya,!V.!I.!Borisov,!!a.!E.!Sizikov,!V.!S.! Kozhevnikov,! N.! B.! Rubtsov,! and! V.! a.! Kozlov,! “Telomere! Length! of! Individual! Chromosomes!in!Patients!with!Rheumatoid!Arthritis,”!Bull.'Exp.'Biol.'Med.,!vol.! 160,!no.!6,!pp.!779–782,!2016.! [60]! S.!O.!Schönland,!C.!Lopez,!T.!Widmann,!J.!Zimmer,!E.!Bryl,!J.!J.!Goronzy,!and!C.! M.! Weyand,! “Premature! telomeric! loss! in! rheumatoid! arthritis! is! genetically! determined!and!involves!both!myeloid!and!lymphoid!cell!lineages.,”!Proc.'Natl.' Acad.'Sci.'U.'S.'A.,!vol.!100,!no.!23,!pp.!13471–6,!2003.! [61]! K.!Koetz,!E.!Bryl,!K.!Spickschen,!W.!M.!O’Fallon,!J.!J.!Goronzy,!and!C.!M.!Weyand,! “T!cell!homeostasis!in!patients!with!rheumatoid!arthritis.,”!Proc.'Natl.'Acad.'Sci.' U.'S.'A.,!vol.!97,!no.!16,!pp.!9203–9208,!2000.! [62]! M.!Tamayo,!A.!Mosquera,!J.!I.!Rego,!J.!L.!Fernández-Sueiro,!F.!J.!Blanco,!and!J.!L.! Fernández,!“Differing!patterns!of!peripheral!blood!leukocyte!telomere!length!in! rheumatologic!diseases,”!Mutat.'Res.'-'Fundam.'Mol.'Mech.'Mutagen.,!vol.!683,! no.!1–2,!pp.!68–73,!2010.! [63]! M.!J.!Ormseth,!J.!F.!Solus,!!a.!M.!Oeser,!!a.!Bian,!T.!Gebretsadik,!!a.!Shintani,!P.! Raggi,! and! C.! M.! Stein,! “Telomere! Length! and! Coronary! Atherosclerosis! in! Rheumatoid!Arthritis,”!J.'Rheumatol.,!2016.! [64]! G.! Taormina! and! M.! G.! Mirisola,! “Longevity:! Epigenetic! and! biomolecular! aspects,”!Biomol.'Concepts,!vol.!6,!no.!2,!pp.!105–117,!2015.! [65]! K.!Luger,!M.!L.!Dechassa,!and!D.!J.!Tremethick,!“New!insights!into!nucleosome! and!chromatin!structure:!an!ordered!or!a!disordered!affair?,”!Nat'Rev'Mol'Cell' Biol,!vol.!13,!no.!7,!pp.!436–447,!2013.! [66]! T.!Suganuma!and!J.!L.!Workman,!“Signals!and!combinatorial!functions!of!histone! modifications.,”!Annu.'Rev.'Biochem.,!vol.!80,!pp.!473–499,!2011.! [67]! M.! Blasco,! “The! epigenetic! regulation! of! mammalian! telomeres.,”! Nat.' Rev.' Genet.,!vol.!8,!no.!4,!pp.!299–309,!2007.! [68]! G.!Schotta,!M.!Lachner,!K.!Sarma,!A.!Ebert,!R.!Sengupta,!G.!Reuter,!D.!Reinberg,! and! T.! Jenuwein,! “A! silencing! pathway! to! induce! H3-K9! and! H4-K20! trimethylation!at!constitutive!heterochromatin,”!Genes'Dev.,!vol.!18,!no.!11,!pp.! 1251–1262,!2004.! [69]! D.!V.!Firsanov,!L.!V.!Solovjeva,!and!M.!P.!Svetlova,!“H2AX!phosphorylation!at!the! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 152! sites!of!DNA!double-strand!breaks!in!cultivated!mammalian!cells!and!tissues,”! Clin.&Epigenetics,!vol.!2,!no.!2,!pp.!283–297,!2011.! [70]! B.!D.!Price!and!A.!D.!D.!Andrea,!“Chromatin!Remodeling!at!DNA!Double!Strand! Breaks,”!Cell,!vol.!152,!no.!6,!pp.!1344–1354,!2013.! [71]! W.!Giblin,!M.!E.!Skinner,!and!D.!B.!Lombard,!“Sirtuins:!Guardians!of!mammalian! healthspan,”!Trends&Genet.,!vol.!30,!no.!7,!pp.!271–286,!2014.! [72]! M.!Rodova,!Q.!Lu,!Y.!Li,!B.!G.!Woodbury,!J.!D.!Crist,!B.!M.!Gardner,!J.!G.!Yost,!X.! B.! Zhong,! H.! C.! Anderson,! and! J.! Wang,! “Nfat1! regulates! adult! articular! chondrocyte! function! through! its! age-dependent! expression! mediated! by! epigenetic!histone!methylation,”!J.&Bone&Miner.&Res.,!vol.!26,!no.!8,!pp.!1974– 1986,!2011.! [73]! J.!Gillespie,!S.!Savic,!C.!Wong,!A.!Hempshall,!M.!Inman,!P.!Emery,!R.!Grigg,!and! M.! F.! McDermott,! “Histone! deacetylases! are! dysregulated! in! rheumatoid! arthritis! and! a! novel! histone! deacetylase! 3-selective! inhibitor! reduces! interleukin-6! production! by! peripheral! blood! mononuclear! cells! from! rheumatoid! arthritis! patients,”! Arthritis& Rheum,! vol.! 64,! no.! 2,! pp.! 418–422,! 2012.! [74]! R.! Higashiyama,! S.! Miyaki,! S.! Yamashita,! T.! Yoshitaka,! G.! Lindman,! Y.! Ito,! T.! Sasho,! K.! Takahashi,! M.! Lotz,! and! H.! Asahara,! “Correlation! between! MMP-13! and!HDAC7!expression!in!human!knee!osteoarthritis,”!Mod.&Rheumatol.,!vol.!20,! no.!1,!p.!11,!Feb.!2010.! [75]! Y.! Wu,! L.! Chen,! Y.! Wang,! W.! Li,! Y.! Lin,! D.! Yu,! L.! Zhang,! F.! Li,! and! Z.! Pan,! “Overexpression!of!Sirtuin!6!suppresses!cellular!senescence!and!NF-κB!mediated! inflammatory!responses!in!osteoarthritis!development!Material!and!Methods,”! Nat.&Publ.&Gr.,!no.!October,!pp.!1–11,!2015.! [76]! Y.!Fu,!M.!Kinter,!J.!Hudson,!K.!M.!Humphries,!R.!S.!Lane,!J.!R.!White,!M.!Hakim,!Y.! Pan,! E.! Verdin,! and! T.! M.! Griffin,! “Aging! Promotes! SIRT3-dependent! Cartilage! SOD2!Acetylation!and!Osteoarthritis,”!Arthritis&Rheumatol.,!p.!n/a-n/a,!2016.! [77]! F.!Antequera,!“Structure,!function!and!evolution!of!CpG!island!promoters,”!Cell.& Mol.&Life&Sci.,!vol.!60,!no.!8,!pp.!1647–58,!2003.! [78]! H.! Nagase! and! S.! Ghosh,! “Epigenetics:! Differential! DNA! methylation! in! mammalian!somatic!tissues,”!FEBS&Journal,!vol.!275,!no.!8.!pp.!1617–1623,!2008.! [79]! P.! Jintaridth,! R.! Tungtrongchitr,! S.! Preutthipan,! and! A.! Mutirangura,! “Hypomethylation! of! Alu! Elements! in! Post-Menopausal! Women! with! Osteoporosis,”!PLoS&One,!vol.!8,!no.!8,!p.!e70386,!2013.! [80]! N.! E.! Lange,! J.! Sordillo,! L.! Tarantini,! V.! Bollati,! D.! Sparrow,! P.! Vokonas,! A.! Zanobetti,!J.!Schwartz,!A.!Baccarelli,!A.!A.!Litonjua,!and!D.!L.!Demeo,!“Alu!and! LINE-1! methylation! and! lung! function! in! the! normative! ageing! study.,”! BMJ& Open,!vol.!2,!no.!5,!p.!e001231-,!2012.! [81]! P.! Jintaridth! and! ! a.! Mutirangura,! “Distinctive! patterns! of! age-dependent! hypomethylation!in!interspersed!repetitive!sequences,”!Physiol.&Genomics,!vol.! 41,!no.!February!2010,!pp.!194–200,!2010.! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 153! [82]! B.!C.! Christensen,!E.!A.!Houseman,!C.! J.!Marsit,! S.!Zheng,!M.! R.!Wrensch,! J.!L.! Wiemels,!H.!H.!Nelson,!M.!R.!Karagas,!J.!F.!Padbury,!R.!Bueno,!D.!J.!Sugarbaker,! R.!F.!Yeh,!J.!K.!Wiencke,!and!K.!T.!Kelsey,!“Aging!and!environmental!exposures! alter!tissue-specific!DNA!methylation!dependent!upon!CPG!island!context,”!PLoS% Genet.,!vol.!5,!no.!8,!2009.! [83]! H.! Heyn,! N.! Li,! H.! J.! Ferreira,! S.! Moran,! D.! G.! Pisano,! ! a.! Gomez,! J.! Diez,! J.! V.! Sanchez-Mut,! F.! Setien,! F.! J.! Carmona,! ! a.! a.! Puca,! S.! Sayols,! M.! a.! Pujana,! J.! Serra-Musach,!I.!Iglesias-Platas,!F.!Formiga,!!a.!F.!Fernandez,!M.!F.!Fraga,!S.!C.! Heath,! ! a.! Valencia,! I.! G.! Gut,! J.! Wang,! and! M.! Esteller,! “Distinct! DNA! methylomes!of!newborns!and!centenarians,”!Proc.%Natl.%Acad.%Sci.,!vol.!109,!no.! 26,!pp.!10522–10527,!2012.! [84]! H.!a!Cruickshanks,!T.!McBryan,!D.!M.!Nelson,!N.!D.!Vanderkraats,!P.!P.!Shah,!J.! van!Tuyn,!T.!Singh!Rai,!C.!Brock,!G.!Donahue,!D.!S.!Dunican,!M.!E.!Drotar,!R.!R.! Meehan,!J.!R.!Edwards,!S.!L.!Berger,!and!P.!D.!Adams,!“Senescent!cells!harbour! features! of! the! cancer! epigenome.,”! Nat.% Cell% Biol.,! vol.! 15,! no.! 12,! pp.! 1495– 506,!2013.! [85]! H.!Heyn,!S.!Moran,!and!M.!Esteller,!“Aberrant!DNA!methylation!profiles!in!the! premature!aging!disorders!Hutchinson-Gilford!Progeria!and!Werner!syndrome.,”! Epigenetics,!vol.!8,!no.!1,!pp.!28–33,!2013.! [86]! A.! E.! Teschendorff,! U.! Menon,! A.! Gentry-Maharaj,! S.! J.! Ramus,! D.! J.! Weisenberger,!H.!Shen,!M.!Campan,!H.!Noushmehr,!C.!G.!Bell,!!a.!P.!Maxwell,!D.! a.! Savage,! E.! Mueller-Holzner,! C.! Marth,! G.! Kocjan,! S.! a.! Gayther,! A.! Jones,! S.! Beck,! W.! Wagner,! P.! W.! Laird,! I.! J.! Jacobs,! and! M.! Widschwendter,! “Agedependent! DNA! methylation! of! genes! that! are! suppressed! in! stem! cells! is! a! hallmark!of!cancer,”!Genome%Res.,!vol.!20,!no.!4,!pp.!440–446,!2010.! [87]! V.! K.! Rakyan,! T.! a.! Down,! S.! Maslau,! T.! Andrew,! T.! P.! Yang,! H.! Beyan,! P.! Whittaker,!O.!T.!McCann,!S.!Finer,!A.!M.!Valdes,!R.!D.!Leslie,!P.!Deloukas,!and!T.! D.! Spector,! “Human! aging-associated! DNA! hypermethylation! occurs! preferentially!at!bivalent!chromatin!domains,”!Genome%Res.,!vol.!20,!no.!4,!pp.! 434–439,!2010.! [88]!G.! Hannum,! J.! Guinney,! L.! Zhao,! L.! Zhang,! G.! Hughes,! S.! Sadda,! B.! Klotzle,! M.! Bibikova,! J.! B.! Fan,! Y.! Gao,! R.! Deconde,! M.! Chen,! I.! Rajapakse,! S.! Friend,! T.! Ideker,! and! K.! Zhang,! “Genome-wide! Methylation! Profiles! Reveal! Quantitative! Views!of!Human!Aging!Rates,”!Mol.%Cell,!vol.!49,!no.!2,!pp.!359–367,!2013.! [89]! I.! Florath,! K.! Butterbach,! H.! Müller,! M.! Bewerunge-hudler,! and! H.! Brenner,! “Cross-sectional! and! longitudinal! changes! in! DNA! methylation! with! age:! An! epigenome-wide! analysis! revealing! over! 60! novel! age-associated! CpG! sites,”! Hum.%Mol.%Genet.,!vol.!23,!no.!5,!pp.!1186–1201,!2014.! [90]! Z.!Xu!and!J.!a.!Taylor,!“Genome-wide!age-related!DNA!methylation!changes!in! blood!and!other!tissues!relate!to!histone!modification,!expression!and!cancer,”! Carcinogenesis,!vol.!35,!no.!2,!pp.!356–364,!2014.! [91]! R.!S.!Alisch,!B.!G.!Barwick,!P.!Chopra,!L.!K.!Myrick,!G.!a.!Satten,!K.!N.!Conneely,! and! S.! T.! Warren,! “Age-associated! DNA! methylation! in! pediatric! populations,”! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 154! Genome&Res.,!vol.!22,!no.!4,!pp.!623–632,!2012.! [92]!Å.! Johansson,! S.! Enroth,! and! U.! Gyllensten,! “Continuous! Aging! of! the! Human! DNA! Methylome! Throughout! the! Human! Lifespan,”! PLoS& One,! vol.! 8,! no.! 6,! 2013.! [93]! K.!Day,!L.!L.!Waite,!A.!Thalacker-Mercer,!A.!West,!M.!M.!Bamman,!J.!D.!Brooks,! R.! M.! Myers,! and! D.! Absher,! “Differential! DNA! methylation! with! age! displays! both!common!and!dynamic!features!across!human!tissues!that!are!influenced! by!CpG!landscape.,”!Genome&Biol.,!vol.!14,!no.!9,!p.!R102,!2013.! [94]! S.!Horvath,!“DNA!methylation!age!of!human!tissues!and!cell!types.,”!Genome& Biol,!vol.!14,!no.!10,!p.!R115,!2013.! [95]! T.!Ronn,!P.!Poulsen,!O.!Hansson,!J.!Holmkvist,!P.!Almgren,!P.!Nilsson,!T.!Tuomi,! B.!Isomaa,!L.!Groop,!A.!Vaag,!and!C.!Ling,!“Age!influences!DNA!methylation!and! gene!expression!of!COX7A1!in!human!skeletal!muscle,”!Diabetologia,!vol.!51,!no.! 7,!pp.!1159–1168,!2008.! [96]! H.! Tohgi,! K.! Utsugisawa,! Y.! Nagane,! M.! Yoshimura,! Y.! Genda,! and! M.! Ukitsu,! “Reduction! with! age! in! methylcytosine! in! the! promoter! region! -224! approximately! -101! of! the! amyloid! precursor! protein! gene! in! autopsy! human! cortex.,”!Brain&Res.&Mol.&Brain&Res.,!vol.!70,!no.!2,!pp.!288–292,!Jul.!1999.! [97]! C.!C.!Oakes,!D.!J.!Smiraglia,!C.!Plass,!J.!M.!Trasler,!and!B.!Robaire,!“Aging!results! in!hypermethylation!of!ribosomal!DNA!in!sperm!and!liver!of!male!rats.,”!Proc.& Natl.&Acad.&Sci.&U.&S.&A.,!vol.!100,!no.!4,!pp.!1775–1780,!2003.! [98]! L.!M.!Reynolds,!J.!Ding,!J.!R.!Taylor,!K.!Lohman,!N.!Soranzo,!A.!de!la!Fuente,!T.!F.! Liu,! C.! Johnson,! R.! G.! Barr,! T.! C.! Register,! K.! M.! Donohue,! M.! V! Talor,! D.! Cihakova,!C.!Gu,!J.!Divers,!D.!Siscovick,!G.!Burke,!W.!Post,!S.!Shea,!D.!R.!Jacobs,!I.! Hoeschele,!C.!E.!McCall,!S.!B.!Kritchevsky,!D.!Herrington,!R.!P.!Tracy,!and!Y.!Liu,! “Transcriptomic! profiles! of! aging! in! purified! human! immune! cells.,”! BMC& Genomics,!vol.!16,!no.!1,!p.!333,!2015.! [99]! !a!Machwe,!D.!K.!Orren,!and!V.!a!Bohr,!“Accelerated!methylation!of!ribosomal! RNA! genes! during! the! cellular! senescence! of! Werner! syndrome! fibroblasts.,”! FASEB&J.,!vol.!14,!no.!12,!pp.!1715–1724,!2000.! [100]! J.! West,! S.! Beck,! X.! Wang,! and! A.! E.! Teschendorff,! “An! integrative! network! algorithm! identifies! age-associated! differential! methylation! interactome! hotspots!targeting!stem-cell!differentiation!pathways.,”!Sci.&Rep.,!vol.!3,!p.!1630,! 2013.! [101]! V.!Van!Den!Boom,!S.!M.!Kooistra,!M.!Boesjes,!B.!Geverts,!A.!B.!Houtsmuller,!K.! Monzen,!I.!Komuro,!J.!Essers,!L.!J.!Drenth-Diephuis,!and!B.!J.!L.!Eggen,!“UTF1!is!a! chromatin-associated!protein!involved!in!ES!cell!differentiation,”!J.&Cell&Biol.,!vol.! 178,!no.!6,!pp.!913–924,!2007.! [102]! M.!F.!Fraga,!E.!Ballestar,!M.!F.!Paz,!S.!Ropero,!F.!Setien,!M.!L.!Ballestar,!D.!HeineSuñer,! J.! C.! Cigudosa,! M.! Urioste,! J.! Benitez,! M.! Boix-Chornet,! A.! SanchezAguilera,!C.!Ling,!E.!Carlsson,!P.!Poulsen,!A.!Vaag,!Z.!Stephan,!T.!D.!Spector,!Y.-Z.! Wu,!C.!Plass,!and!M.!Esteller,!“Epigenetic!differences!arise!during!the!lifetime!of! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 155! monozygotic!twins.,”!Proc.&Natl.&Acad.&Sci.&U.&S.&A.,!vol.!102,!no.!30,!pp.!10604– 10609,!2005.! [103]! K.!C.!Jung!and!C.!K.!Sang,!“Environmental!effects!on!gene!expression!phenotype! have!regional!biases!in!the!human!genome,”!Genetics,!vol.!175,!no.!4,!pp.!1607– 1613,!2007.! [104]! P.!Garagnani,!M.!G.!Bacalini,!C.!Pirazzini,!D.!Gori,!C.!Giuliani,!D.!Mari,!A.!M.!Di! Blasio,! D.! Gentilini,! G.! Vitale,! S.! Collino,! S.! Rezzi,! G.! Castellani,! M.! Capri,! S.! Salvioli,! and! C.! Franceschi,! “Methylation! of! ELOVL2! gene! as! a! new! epigenetic! marker!of!age,”!Aging&Cell,!vol.!11,!no.!6,!pp.!1132–1134,!2012.! [105]! A.! E.! Teschendorff,! J.! West,! and! S.! Beck,! “Age-associated! epigenetic! drift:! Implications,!and!a!case!of!epigenetic!thrift?,”!Hum.&Mol.&Genet.,!vol.!22,!no.!R1,! pp.!7–15,!2013.! [106]! A.! Bird,! “DNA! methylation! patterns! and! epigenetic! memory,”! Genes& and& Development,!vol.!16,!no.!1.!pp.!6–21,!2002.! [107]! R.! M.! Kohli! and! Y.! Zhang,! “TET! enzymes,! TDG! and! the! dynamics! of! DNA! demethylation,”!Nature,!vol.!502,!no.!7472,!pp.!472–479,!2013.! [108]! B.! Rhead,! C.! Holingue,! M.! Cole,! X.! Shao,! H.! L.! Quach,! D.! Quach,! K.! Shah,! E.! Sinclair,! J.! Graf,! T.! Link,! R.! Harrison,! E.! Rahmani,! E.! Halperin,! W.! Wang,! G.! S.! Firestein,!L.!F.!Barcellos,!and!L.!A.!Criswell,!“Rheumatoid!arthritis!naïve!T!cells! share! hypermethylation! sites! with! synoviocytes.,”! Arthritis& Rheumatol.& (Hoboken,&N.J.),!2016.! [109]! C.! J.! Nile,! C.! R.! Robert,! A.! Mohammed,! W.! D.! Gordon,! and! G.! W.! Anthony,! “Methylation!status!of!a!single!CpG!site!in!the!<I>IL6</I>!promoter!is!related!to! <I>IL6</I>! messenger! RNA! levels! and! rheumatoid! arthritis,”! Arthritis& Rheum.,! vol.!58,!no.!9,!pp.!2686–2693,!2008.! [110]! W.! den! Hollander! and! I.! Meulenbelt,! “DNA! methylation! and! osteoarthritis,”! Curr.&Genomics,!vol.!16,!pp.!419–126,!2015.! [111]! M.!D.!Rushton,!L.!N.!Reynard,!M.!J.!Barter,!R.!Refaie,!K.!S.!Rankin,!D.!A.!Young,! and!J.!Loughlin,!“Characterization!of!the!Cartilage!DNA!Methylome!in!Knee!and! Hip! Osteoarthritis,”! Arthritis& Rheumatol.& (Hoboken,& N.j.),! vol.! 66,! no.! 9,! pp.! 2450–2460,!Sep.!2014.! [112]! S.! E.! Castel! and! R.! a! Martienssen,! “RNA! interference! in! the! nucleus:! roles! for! small!RNAs!in!transcription,!epigenetics!and!beyond.,”!Nature&reviews.&Genetics,! vol.!14,!no.!2.!pp.!100–12,!2013.! [113]! J.!L.!Rinn!and!H.!Y.!Chang,!“Genome!regulation!by!long!noncoding!RNAs.,”!Annu.& Rev.&Biochem.,!vol.!81,!pp.!145–166,!2012.! [114]! W.! Y.! Kim! and! N.! E.! Sharpless,! “The! Regulation! of! INK4/ARF! in! Cancer! and! Aging,”!Cell,!vol.!127,!no.!2,!pp.!265–275,!2006.! [115]! K.!L.!Yap,!S.!Li,!A.!M.!Muñoz-cabello,!S.!Raguz,!L.!Zeng,!J.!Gil,!M.!J.!Walsh,!and!M.! Zhou,! “Molecular! Interplay! of! the! Non-coding! RNA! ANRIL! and! Methylated! Histone!H3!Lysine!27!by!Polycomb!CBX7!in!Transcriptional!Silencing!of!INK4a,”! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 156! Mol$Cell,!vol.!38,!no.!5,!pp.!662–674,!2010.! [116]! A.!Matheu,!A.!Maraver,!M.!Collado,!I.!Garcia-Cao,!M.!Canamero,!C.!Borras,!J.!M.! Flores,! P.! Klatt,! J.! Vina,! and! M.! Serrano,! “Anti-aging! activity! of! the! Ink4/Arf! locus.,”!Aging$Cell,!vol.!8,!no.!2,!pp.!152–161,!Apr.!2009.! [117]! E.! Pasmant,! A.! Sabbagh,! M.! Vidaud,! and! I.! Bièche,! “ANRIL,! a! long,! noncoding! RNA,! is! an! unexpected! major! hotspot! in! GWAS.,”! FASEB$ J.,! vol.! 25,! no.! 2,! pp.! 444–448,!2011.! [118]!K.! Abdelmohsen,! A.! Panda,! M.! J.! Kang,! J.! Xu,! R.! Selimyan,! J.! H.! Yoon,! J.! L.! Martindale,! S.! De,! W.! H.! Wood,! K.! G.! Becker,! and! M.! Gorospe,! “Senescenceassociated! lncRNAs:! Senescence-associated! long! noncoding! RNAs,”! Aging$ Cell,! vol.!12,!no.!5,!pp.!890–900,!2013.! [119]! V.!Sharma!and!T.!Misteli,!“Non-coding!RNAs!in!DNA!damage!and!repair,”!FEBS$ Letters,!vol.!587,!no.!13.!pp.!1832–1839,!2013.! [120]! C.!Y.!Lai,!Y.!T.!Wu,!S.!L.!Yu,!Y.!H.!Yu,!S.!Y.!Lee,!C.!M.!Liu,!W.!S.!Hsieh,!H.!G.!Hwu,!P.! C.!Chen,!S.!F.!Jeng,!and!W.!J.!Chen,!“Modulated!expression!of!human!peripheral! blood!microRNAs!from!infancy!to!adulthood!and!its!role!in!aging,”! Aging$Cell,! vol.!13,!no.!4,!pp.!679–689,!2014.! [121]! S.!Weilner,!E.!Schraml,!H.!Redl,!R.!Grillari-Voglauer,!and!J.!Grillari,!“Secretion!of! microvesicular!miRNAs!in!cellular!and!organismal!aging,”!Exp.$Gerontol.,!vol.!48,! no.!7,!pp.!626–633,!2013.! [122]! T.!Smith-Vikos,!Z.! Liu,! C.!Parsons,!M.!Gorospe,! L.! Ferrucci,!T.!M.! Gill,! and!F.!J.! Slack,!“A!serum!miRNA!profile!of!human!longevity:!findings!from!the!Baltimore! Longitudinal!Study!of!Aging!(BLSA),”!Aging$(Albany$NY),!vol.!8,!no.!11,!pp.!2971– 2983,!Nov.!2016.! [123]! A.!P.!Ugalde,!Y.!Español,!and!C.!López-Otín,!“Micromanaging!aging!with!miRNAs:! New!messages!from!the!nuclear!envelope,”!Nucleus,!vol.!2,!no.!6,!pp.!549–555,! 2011.! [124]! A.!Dallaire,!C.!Garand,!E.!R.!Paquet,!S.!J.!Mitchell,!R.!D.!de!Cabo,!M.!J.!Simard,! and! M.! Lebel,! “Down! regulation! of! miR-124! in! both! Werner! syndrome! DNA! helicase! mutant! mice! and! mutant! Caenorhabditis! elegans! wrn-1! reveals! the! importance!of!this!microRNA!in!accelerated!aging,”!Aging$(Albany.$NY).,!vol.!4,! no.!9,!pp.!636–647,!2012.! [125]! F.!Olivieri,!M.!C.!Albertini,!M.!Orciani,!A.!Ceka,!M.!Cricca,!A.!D.!Procopio,!and!M.! Bonafè,! “DNA! damage! response! (DDR)! and! senescence:! shuttled! inflammamiRNAs!on!the!stage!of!inflamm-aging,”!Oncotarget,!vol.!6,!no.!34,!pp.!35509– 35521,!2015.! [126]! M.!J.!Barter!and!D.!A.!Young,! “Epigenetic!mechanisms!and!non-coding!rnas! in! osteoarthritis,”!Curr.$Rheumatol.$Rep.,!vol.!15,!no.!9,!2013.! [127]!T.!Ukai,!M.!Sato,!H.!Akutsu,!A.!Umezawa,!and!J.!Mochida,!“MicroRNA-199a-3p,! microRNA-193b,! and! microRNA-320c! are! correlated! to! aging! and! regulate! human!cartilage!metabolism,”! J.$ Orthop.$Res.,!vol.! 30,! no.!12,!pp.!1915–1922,! 2012.! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 157! [128]! X.! Li,! F.! Tian,! and! F.! Wang,! “Rheumatoid! arthritis-associated! microrna-155! targets!socs1!and!upregulates!TNF-α!and!IL-1β!in!PBMCs,”!Int.%J.%Mol.%Sci.,!vol.! 14,!no.!12,!pp.!23910–23921,!2013.! [129]! Q.!Zhou,!S.!Haupt,!J.!T.!Kreuzer,!A.!Hammitzsch,!F.!Proft,!C.!Neumann,!J.!Leipe,! M.!Witt,!H.!Schulze-Koops,!and!A.!Skapenko,!“Decreased!expression!of!miR-146a! and! miR-155! contributes! to! an! abnormal! Treg! phenotype! in! patients! with! rheumatoid!arthritis.,”!Ann.%Rheum.%Dis.,!pp.!1–11,!2014.! [130]! E.!T.!Powers,!R.!I.!Morimoto,!A.!Dillin,!J.!W.!Kelly,!and!W.!E.!Balch,!“Biological! and! chemical! approaches! to! diseases! of! proteostasis! deficiency.,”! Annu.% Rev.% Biochem.,!vol.!78,!no.!August,!pp.!959–991,!2009.! [131]! W.!E.!Balch,!R.!I.!Morimoto,!A.!Dillin,!and!J.!W.!Kelly,!“Adapting!proteostasis!for! disease!intervention.,”!Science,!vol.!319,!no.!5865,!pp.!916–9,!2008.! [132]! J.! Labbadia! and! R.! I.! Morimoto,! “The! Biology! of! Proteostasis! in! Aging! and! Disease,”!Annu.%Rev.%Biochem.%Biochem,!vol.!84,!no.!1,!pp.!435–464,!2015.! [133]!F.! Gebauer! and! M.! W.! Hentze,! “Molecular! mechanisms! of! translational! control.,”!Nat.%Rev.%Mol.%Cell%Biol.,!vol.!5,!no.!10,!pp.!827–835,!2004.! [134]! M.!Hansen,!S.!Taubert,!D.!Crawford,!N.!Libina,!S.!J.!Lee,!and!C.!Kenyon,!“Lifespan! extension! by! conditions! that! inhibit! translation! in! Caenorhabditis! elegans,”! Aging%Cell,!vol.!6,!no.!1,!pp.!95–110,!2007.! [135]! A.! Chiocchetti,! J.! Zhou,! H.! Zhu,! T.! Karl,! O.! Haubenreisser,! M.! Rinnerthaler,! G.! Heeren,! K.! Oender,! J.! Bauer,! H.! Hintner,! M.! Breitenbach,! and! L.! BreitenbachKoller,! “Ribosomal! proteins! Rpl10! and! Rps6! are! potent! regulators! of! yeast! replicative!life!span,”!Exp.%Gerontol.,!vol.!42,!no.!4,!pp.!275–286,!2007.! [136]! K.!K.!Steffen,!V.!L.!MacKay,!E.!O.!Kerr,!M.!Tsuchiya,!D.!Hu,!L.!A.!Fox,!N.!Dang,!E.!D.! Johnston,!J.!A.!Oakes,!B.!N.!Tchao,!D.!N.! Pak,!S.!Fields,!B.!K.!Kennedy,!and! M.! Kaeberlein,!“Yeast!Life!Span!Extension!by!Depletion!of!60S!Ribosomal!Subunits! Is!Mediated!by!Gcn4,”!Cell,!vol.!133,!no.!2,!pp.!292–302,!2008.! [137]! R.! I.! Morimoto,! “Proteotoxic! stress! and! inducible! chaperone! networks! in! neurodegenerative!disease!and!aging,”!Genes%and%Development,!vol.!22,!no.!11.! pp.!1427–1438,!2008.! [138]! M.! J.! Muñoz! and! D.! L.! Riddle,! “Positive! selection! of! Caenorhabditis! elegans! mutants!with!increased!stress!resistance!and!longevity,”!Genetics,!vol.!163,!no.! 1,!pp.!171–180,!2003.! [139]!A.!Ben-Zvi,!E.!a!Miller,!and!R.!I.!Morimoto,!“Collapse!of!proteostasis!represents! an!early!molecular!event!in!Caenorhabditis!elegans!aging.,”!Proc.%Natl.%Acad.%Sci.% U.%S.%A.,!vol.!106,!no.!35,!pp.!14914–14919,!2009.! [140]!A.-L.!Hsu,!C.!T.!Murphy,!and! C.!Kenyon,!“Regulation!of! Aging!and!Age-Related! Disease!by!DAF-16!and!Heat-Shock!Factor,”!Science%(80-.%).,!vol.!300,!no.!5622,! pp.!1142–1145,!2003.! [141]!J.-N.! Min,! R.! A.! Whaley,! N.! E.! Sharpless,! P.! Lockyer,! A.! L.! Portbury,! and! C.! Patterson,! “CHIP! deficiency! decreases! longevity,! with! accelerated! aging! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 158! phenotypes! accompanied! by! altered! protein! quality! control.,”! Mol.% Cell.% Biol.,! vol.!28,!no.!12,!pp.!4018–4025,!2008.! [142]! M.!Schröder!and!R.!J.!Kaufman,!“the!Mammalian!Unfolded!Protein!Response,”! Annu.%Rev.%Biochem.,!vol.!74,!no.!1,!pp.!739–789,!2005.! [143]! A.! V.! Samuelson,! C.! E.! Carr,! and! G.! Ruvkun,! “Gene! activities! that! mediate! increased!life!span!of!C.!elegans!insulin-like!signaling!mutants,”!Genes%Dev.,!vol.! 21,!no.!22,!pp.!2976–2994,!2007.! [144]! A.! Ciechanover,! “Proteolysis:! from! the! lysosome! to! ubiquitin! and! the! proteasome.,”!Nat.%Rev.%Mol.%Cell%Biol.,!vol.!6,!no.!1,!pp.!79–87,!2005.! [145]! D.! a! Ferrington,! A.! D.! Husom,! and! L.! V! Thompson,! “Altered! proteasome! structure,!function,!and!oxidation!in!aged!muscle.,”!FASEB%J.,!vol.!19,!no.!6,!pp.! 644–646,!2005.! [146]! V.!A.!Vernace,!L.!Arnaud,!T.!Schmidt-Glenewinkel,!and!M.!E.!Figueiredo-Pereira,! “Aging!perturbs!26S!proteasome!assembly!in!Drosophila!melanogaster.,”!FASEB% J.,!vol.!21,!no.!11,!pp.!2672–82,!2007.! [147]! I.! Saez! and! D.! Vilchez,! “The! Mechanistic! Links! Between! Proteasome! Activity,! Aging! and! Age-related! Diseases.,”! Curr.% Genomics,! vol.! 15,! no.! 1,! pp.! 38–51,! 2014.! [148]! V.!Andersson,!S.!Hanzén,!B.!Liu,!M.!Molin,!and!T.!Nyström,!“Enhancing!protein! disaggregation!restores!proteasome!activity!in!aged!cells,”!Aging%(Albany.%NY).,! vol.!5,!no.!11,!pp.!802–812,!2013.! [149]! C.! Torres,! L.! Lewis,! and! V.! J.! Cristofalo,! “Proteasome! inhibitors! shorten! replicative! life! span! and! induce! a! senescent-like! phenotype! of! human! fibroblasts,”!J.%Cell.%Physiol.,!vol.!207,!no.!3,!pp.!845–853,!2006.! [150]! U.!Tomaru,!S.!Takahashi,!A.!Ishizu,!Y.!Miyatake,!A.!Gohda,!S.!Suzuki,!A.!Ono,!J.! Ohara,!T.!Baba,!S.!Murata,!K.!Tanaka,!and!M.!Kasahara,!“Decreased!proteasomal! activity! causes! age-related! phenotypes! and! promotes! the! development! of! metabolic!abnormalities,”!Am.%J.%Pathol.,!vol.!180,!no.!3,!pp.!963–972,!2012.! [151]! L.!Li,!D.!Zhao,!H.!Wei,!L.!Yao,!Y.!Dang,!A.!Amjad,!J.!Xu,!J.!Liu,!L.!Guo,!D.!Li,!Z.!Li,!D.! Zuo,!Y.!Zhang,!J.!Liu,!S.!Huang,!C.!Jia,!L.!Wang,!Y.!Wang,!Y.!Xie,!J.!Luo,!B.!Zhang,!H.! Luo,! L.! a! Donehower,! R.! E.! Moses,! J.! Xiao,! B.! W.! O’Malley,! and! X.! Li,! “REGγ! deficiency!promotes!premature! aging!via! the!casein!kinase! 1!pathway.,”! Proc.% Natl.%Acad.%Sci.%U.%S.%A.,!vol.!110,!no.!27,!pp.!11005–10,!2013.! [152]! D.!C.!Rubinsztein,!G.!Mari??o,!and!G.!Kroemer,!“Autophagy!and!aging,”!Cell,!vol.! 146,!no.!5.!pp.!682–695,!2011.! [153]!W.-L.! Yen! and! D.! J.! Klionsky,! “How! to! live! long! and! prosper:! autophagy,! mitochondria,!and!aging.,”!Physiology,!vol.!23,!no.!70,!pp.!248–262,!2008.! [154]! A.!Meléndez,!Z.!Tallóczy,!M.!Seaman,!E.-L.!Eskelinen,!D.!H.!Hall,!and!B.!Levine,! “Autophagy!genes!are!essential!for!dauer!development!and!life-span!extension! in!C.!elegans.,”!Science,!vol.!301,!no.!5638,!pp.!1387–91,!2003.! [155]! M.!Lotz!and!R.!F.!Loeser,!“Effects!of!aging!on!articular!cartilage!homeostasis,”! ! ! ! BIBLIOGRAFÍA* ! ! ! 159! Bone,!vol.!51,!no.!2.!pp.!241–248,!2012.! [156]! C.! a! Martin,! S.! E.! Carsons,! R.! Kowalewski,! D.! Bernstein,! M.! Valentino,! and! F.! Santiago-Schwarz,! “Aberrant! extracellular! and! dendritic! cell! (DC)! surface! expression! of! heat! shock! protein! (hsp)70! in! the! rheumatoid! joint:! possible! mechanisms!of!hsp/DC-mediated!cross-priming.,”!J.'Immunol.,!vol.!171,!no.!11,! pp.!5736–42,!2003.! [157]! V.! Goeb,! M.! Thomas-L’Otellier,! R.! Daveau,! R.! Charlionet,! P.! Fardellone,! X.! Le! Loet,!F.!Tron,!D.!Gilbert,!and!O.!Vittecoq,!“Candidate!autoantigens!identified!by! mass! spectrometry! in! early! rheumatoid! arthritis! are! chaperones! and! citrullinated!glycolytic!enzymes,”!Arthritis'Res'Ther,!vol.!11,!no.!2,!p.!R38,!2009.! [158]! L.! Fontana,! L.! Partridge,! and! V.! D.! Longo,! “Extending! Healthy! Life! Span--From! Yeast!to!Humans,”!Science'(80-.').,!vol.!328,!no.!5976,!pp.!321–326,!2010.! [159]! R.!Martins,!G.!J.!Lithgow,!and!W.!Link,!“Long!live!FOXO:!unraveling!the!role!of! FOXO!proteins!in!aging!and!longevity.,”!Aging'Cell,!vol.!15,!no.!2,!pp.!196–207,! Apr.!2016.! [160]!E.!L.!Greer!and!A.!Brunet,!“FOXO!transcription!factors!at!the!interface!between! longevity!and!tumor!suppression.,”!Oncogene,!vol.!24,!no.!50,!pp.!7410–7425,! Nov.!2005.! [161]! A.! Ortega-Molina,! A.! Efeyan,! E.! Lopez-Guadamillas,! M.! Mu??oz-Martin,! G.! G??mez-L??pez,!M.!Ca??amero,!F.!Mulero,!J.!Pastor,!S.!Martinez,!E.!Romanos,! M.!Mar!Gonzalez-Barroso,!E.!Rial,!A.!M.!Valverde,!J.!R.!Bischoff,!and!M.!Serrano,! “Pten! positively! regulates! brown! adipose! function,! energy! expenditure,! and! longevity,”!Cell'Metab.,!vol.!15,!no.!3,!pp.!382–394,!2012.! [162]! L.!C.!Foukas,!B.!Bilanges,!L.!Bettedi,!W.!Pearce,!K.!Ali,!S.!Sancho,!D.!J.!Withers,! and!B.!Vanhaesebroeck,!“Long-term!p110??!PI3K!inactivation!exerts!a!beneficial! effect!on!metabolism,”!EMBO'Mol.'Med.,!vol.!5,!no.!4,!pp.!563–571,!2013.! [163]! 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D.!E.!Harrison,!R.!Strong,!Z.!D.!Sharp,!J.!F.!Nelson,!C.!M.!Astle,!K.!Flurkey,!N.!L.! Nadon,! J.! E.! Wilkinson,! K.! Frenkel,! C.! S.! Carter,! M.! Pahor,! M.! A.! Javors,! E.! Fernandez,! and! R.! A.! Miller,! “Rapamycin! fed! late! in! life! extends! lifespan! in!