Nueva plataforma de administración pulmonar basada en redes metal-orgánicas con potencial aplicación en el tratamiento de la tuberculosis

TESIS DE DOCTORADO NUEVA PLATAFORMA DE ADMINISTRACIÓN PULMONAR BASADA EN REDES METALORGÁNICAS CON POTENCIAL APLICACIÓN EN EL TRATAMIENTO DE LA TUBERCULOSIS Cristina Fernández Paz ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOCTORADO EN INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO DE MEDICAMENTOS SANTIAGO DE COMPOSTELA 2021 DECLARACIÓN DEL AUTOR DE LA TESIS Nueva plataforma de administración pulmonar basada en redes metal-orgánicas con potencial aplicación en el tratamiento de la tuberculosis Dña. Cristina Fernández Paz Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: 1) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. 2) En su caso, en la tesis se hace referencia a las colaboraciones que tuvo este trabajo. 3) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. 4) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mí para la obtención de otros títulos. En Narón, a …………………………………………… 2021 Fdo. Cristina Fernández Paz AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR / TUTOR DE LA TESIS Nueva plataforma de administración pulmonar basada en redes metal-orgánicas con potencial aplicación en el tratamiento de la tuberculosis Da. María del Carmen Remuñán López Da. Patricia Horcajada Cortés INFORMAN: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª. Cristina Fernández Paz, bajo nuestra dirección, y autorizamos su presentación, considerando que reúne los requisitos exigidos en el Reglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como directoras de ésta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declaran también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación de la doctoranda fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, a …………………………………………… 2021 Fdo. María del Carmen Remuñán López Fdo. Patricia Horcajada Cortés A mis padres y hermanos Yo soy la resurrección y la vida; el que cree en mí, aunque este muerto, vivirá. Y todo aquel que vive y cree en mí, no morirá eternamente. Jesús [Juan 11:25-26] En homenaje a Roberto Carlos Fernández Paz Silvia, Manuel, Rubén, Laurin, Andrea, Omar, Santi y Alba, por su compañerismo. A mis más que compañeras: Rebeca, Katia, Ana, Catherine, Lucía Feijoo y Celina por su ayuda, amistad, consejos y buenos momentos juntas… A mi amigo Fernando David, por su apoyo, saber estar, familiaridad y esa sensibilidad especial que le hace tan único. Y a mi amiga Eli, a su papá León y a su hija Emi, que siempre los llevaré en el corazón y por ser mi familia en Medellín. Agradezco la experiencia de conocerlos a todos y por abrir mi mente a diferentes culturas, conocimientos, puntos de vista y, sobre todo, por ser tan buenas personas. Agradecer a los profesores del Departamento de Farmacología, Farmacia y Tecnología Farmacéutica de la Universidad de Santiago de Compostela y, quiero recordar, a los que ya partieron: Juan Torres Lavandeira, Begoña Seijo y José Luis Gómez Amoza. Reconocer especialmente a Noemi Csaba por su confianza, consejos y fantástica ayuda. Mención especial también a Dolores Torres y a Begoña Seijo, dos grandes ferrolanas pero, sobre todo, dos grandes personas que siempre me han ayudado, mostrado su apoyo y su buen hacer, como fruto de su calidad humana. A Rafael Romero… Me sorprendió su retranca gallega y su ingenio pero, sobre todo, su profesionalidad. Agradezco que siempre nos fuese a ayudar en los momentos más complicados, y nos dedicase tiempo dentro de su apretada agenda. A las técnicas/os de microscopía del CACTUS: Raquel, María José, Mercedes, Ramiro, Ezequiel y Javier, por vuestra cercanía, amabilidad, simpatía, ayuda y consejos. A las técnicas del CiMUS: Montse, Ana y Luz por vuestra ayuda y generosidad. A los técnicos de la USC Gonzalo y Miguel Anxo, por su ayuda eficaz. Al Decano Fran, a la anterior Decana Bebel, a la Vicedecana Reyes, a la Vicedecana Paz, a Teresa (de Asuntos Económicos), a la Técnica Chus, al Técnico Julio y a la Secretaria del Departamento Sagrario por vuestra ayuda. A los conserjes Joses, Vicky, María, Alfonso y Chelo, que han sido muy agradables, simpáticos, voluntariosos y súper trabajadores… En especial a Chelo… que es una 16 Cristina Fernández Paz gran amiga. A las señoras que se encargan de la limpieza, que son unas currantas… En concreto, a Socorro, Merche, Celsa y Sandra, por compartir vuestras alegrías, vuestras penas y, sobre todo, por hacernos tanta compañía día tras día y darnos vuestros ánimos. Y no quiero olvidarme de los Profesores Arturo, Monteagudo, Matilde, Creus y Cristina por las charlas distendidas en el café y las risas… A Carlos Calderón… Por ayudarnos en cuanto estaba de su mano como profesional y como amigo. Su eficacia y profesionalidad son resultado de su buen hacer como persona. A mis jefas/es de las Oficinas de Farmacia que me dieron la oportunidad de ganarme la vida honradamente para costearme mis estudios de Máster y Doctorado, y que me permitieron desarrollarme profesionalmente en ese otro ámbito: Farmacia Rodríguez y Rivas C.B. (Ferrol), Farmacia Esteban Pantoja e Hijos C.B. (Cedeira), Farmacia Maceiras Bidegain (Narón), Farmacia del Cantón (Ferrol), Farmacia Benigna Villasuso Cores (Monfero), Farmacia Isabel Campo (Ferrol). A mis compañeras/os de estas Oficinas de Farmacia que me han ayudado y enseñado. A mis amigas/os…A Mariluz, por su cariño, apoyo, ánimos y ser una luz en el camino; a Irene, por ser mi hermana moral (mi trilliza), mi fiel amiga y por su cariño; a Carlos y Rosi, por ser mis amigos del alma; a Eva María, por animarnos siempre, por nuestras charlas divertidas, y por valorar y entender lo que hacíamos en nuestras Tesis; a Celsa, por ser tan comprensiva, por su corazón enorme, su sensibilidad y por valorarnos siempre; a Reyes… por su apoyo y por llamarnos “Señoritas Doctoras”, aunque todavía no lo fuéramos. A Mou, a María, a Lorena, a Almudena, a Noelia, a Tatiana, a Fran y a Merchy… Por todas vuestras palabras de ánimo, por vuestra confianza en nosotras, por ser tan buenas/os amigas/os, por vuestro apoyo en los buenos y malos momentos… y, sobre todo, por vuestro cariño. ¡Gracias a todas/os! A Sonia, a Manolo y a Óscar por ser parte de mi familia durante mucho tiempo. Agradezco el cariño, el apoyo y los ánimos que nos dieron para seguir adelante. Óscar… ¡Deseo que seas muy feliz en el cielo! 17 Agradecimientos A mi familia: mi tías/os Julia, Manel, Rafael y Carmen; a mis primas/os: Jose, Pablo, Sergio, Rafita, María del Mar, Bárbara y Antía; por confiar en nosotras y valorar nuestro esfuerzo desde pequeñas. A Fran, que es como otro primo, le agradezco toda su ayuda. Y al resto de mi familia, que nos dan su apoyo. A mi familia del cielo, que siempre siento su amor: a mi tía Rosa, por ser mi segunda madre y la mejor tía que pudiera tener; a mi primo Fran, por enseñarme que por muy dura que sea la vida, hay que aprender y luchar hasta el final; a mis abuelos paternos Manolo y Magdalena, por vuestro amor y generosidad, por compartir lo que teníais con nosotras y por transmitir el trabajo duro a través de la familia; a mi abuelo materno Andrés, por ser mi padrino, un cachito de pan, un bromista, un gran abuelo y, sobre todo, una gran persona; y a mi hermano Roberto Carlos (Killo), por cuidarnos, por mostrarnos que hay más mundo detrás de los libros, por enseñarnos que por “perder” un año académico, o dos o tres en la vida no pasa nada… por enseñarnos que cada día hay que ser feliz… por su alegría, por valorarnos, por darnos ánimo, por el orgullo que siente por nosotras y por su apoyo que sé que nos está dando desde el cielo: “¡Seguid adelante, niñas!”. ¡Gracias por todos los momentos felices vividos como hermanos! A mis padres, Carlos y Reme por vuestro amor, por darnos el apoyo que tanto necesitábamos para crecer personal, profesional y académicamente, por enseñarnos desde pequeñas a entender el valor que tienen las cosas y el esfuerzo del trabajo duro. Concretamente, a mi padre por enseñarme a ser respetuosa con todo el mundo y a cada uno dedicarle el tiempo que se merece; por enseñarme que hay que levantarse cuando la vida te tira al suelo; a que el éxito sólo es para aquellas personas que creen en él... Y a cruzar las “piedras del río”… A mi madre, en especial, por enseñarnos desde pequeñas a ser autosuficientes; por demostrarnos que se pueden sacar fuerzas de donde sea, aunque se esté pasando por los momentos más duros; por ser el pilar de la familia; por darnos el ejemplo de lo que es ser una “mujer campeona”… Y porque, aunque no entendiera bien lo que hacíamos, nos seguía animando diciéndonos: “Vosotras sabéis lo que tenéis que hacer” y “Si es bueno para vosotras, es bueno para mí”. 18 Cristina Fernández Paz Me gustaría terminar mis agradecimientos con la persona que más se lo merece: mi hermana Fany. Agradecer toda la ayuda que me ofreció desde pequeña… Nunca me imaginé llegar tan lejos; por confiar en mí; por ser mi maestra de los estudios y de la vida; por darme el apoyo cuando lo he necesitado; por hacerme reír tantas veces; por ser “mi muy mejor amiga” y “compañera de la vida”; por enseñarme a ser mejor persona; por ser mi referente y modelo a seguir en la vida; por el amor que me da… El más bonito de todos… ¡No podría ser más afortunada! Finalmente, me gustaría agradecer a Dios y a la vida las oportunidades que me han dado y que me están dando de seguir siempre adelante, de crecer como persona, de desarrollarme profesionalmente, de salir de mi zona de confort y de descubrir que soy capaz de hacer cosas espectaculares. Cristina Fernández Paz En Narón, 25 de agosto de 2021 19 Agradecimientos TABLA DE CONTENIDO Tabla de contenido Tabla de contenido Listados ................................................................................................................................27 Abreviaturas (I, con letras latinas) .............................................................29 Abreviaturas (II, con letras griegas) ...........................................................35 Fórmulas químicas ....................................................................................... 35 Sistemas microy nanoparticulados ..........................................................36 Unidades ........................................................................................................37 Listado de figuras ...............................................................................................................38 Listado de tablas .................................................................................................................45 1. Resumen ..........................................................................................................................49 2. Introducción ...................................................................................................................53 2.1. Redes metal-orgánicas (MOFs) ...............................................................55 2.2. Interés de las MOFs para aplicaciones biomédicas ...............................56 2.3. Aplicación de las MOFs en administración de fármacos ..................... 59 2.3.1. Vía parenteral .....................................................................................59 2.3.2. Vía cutánea ..........................................................................................66 2.3.3. Vía oral ................................................................................................72 2.3.4. Vía bucal ..............................................................................................77 2.3.5. Vía ocular ............................................................................................79 2.3.6. Vía rectal .............................................................................................82 2.3.7. Vía pulmonar ...................................................................................... 85 2.4. Interés de la vía pulmonar para la administración de fármacos .........88 2.4.1. Anatomofisiología del tracto respiratorio .......................................88 2.4.2. Administración de AIs para efectos local y sistémico ...................91 2.4.3. Interés de la administración de antibióticos por vía pulmonar ... 98 23 2.4.4. Tuberculosis pulmonar .....................................................................99 2.4.5. Tratamiento de la tuberculosis: Isoniazida (INH) ....................... 100 2.5. Biocompatibilidad de las mofs con el pulmón.....................................103 2.5.1. Estudios in vitro .............................................................................103 2.5.2. Estudio ex vivo ............................................................................... 104 2.5.3. Estudios in vivo ..............................................................................105 2.6. Perspectiva actual: ensayos clínicos y comercialización de medicamentos a base de mofs para la administración pulmonar de fármacos ...........................................................................................................106 3. Antecedentes, hipótesis y objetivos ......................................................................... 107 4. Materiales y métodos ................................................................................................. 113 4.1. Materiales .................................................................................................115 4.2. Síntesis y caracterización de las MOFs .................................................116 4.2.1. Síntesis y activación de MIL-100 ...................................................116 4.2.2. Encapsulación de isoniazida (INH) ..............................................116 4.2.3. Cálculo del porcentaje de humedad y porcentaje de materia seca de las MOFs ................................................................117 4.2.4. Dispersión de las MOFs ..................................................................118 4.2.4.1. MOFs destinadas a estudios celulares .....................................118 4.2.4.2. MOFs destinadas a formulación por atomización ................119 4.2.5. Caracterización fisicoquímica y morfológica de las MOFs dispersadas ........................................................................................121 4.3. Microencapsulación de las MOFs y caracterización de las microsferas (MS) obtenidas ...........................................................................121 4.3.1. Preparación de MS control y selección del mejor excipiente de atomización ...............................................................121 4.3.2. Microencapsulación de las NPs MIL-100 e INH@MIL100: Obtención de Ma-MIL-100 MS y Ma-IHN@MIL-100 MS 122 4.3.3. Caracterización morfológica y aerodinámica de las MS ............123 4.3.4. Estudio de composición e integridad estructural de las MS ......124 4.4. Estudio de liberación de las nps mil-100 e inh@mil-100 a partir de las microsferas de manitol (Ma MS). Estabilidad coloidal y química, y liberación de isoniazida (INH) ...............................................126 4.5. Estudios in vitro en la línea celular a549 .............................................127 24 Cristina Fernández Paz 4.5.1. Línea celular A549 ...........................................................................127 4.5.2. Preparación y caracterización de formulaciones .........................127 4.5.3. Preparación de las soluciones test de Ma ......................................128 4.5.4. Estudios de viabilidad celular ......................................................... 128 4.5.5. Captación intracelular y distribución ............................................130 4.5.6. Cuantificación de células A549 internalizadas con NPs: Citometría de flujo ...........................................................................132 4.6. Estudios in vivo .....................................................................................133 4.6.1. Distribución pulmonar de las NPs MIL-100 e INH@ MIL-100 microencapsuladas ..........................................................134 4.6.1.1. Estudio histológico .................................................................... 134 4.6.1.2. Biodistribución ..........................................................................135 4.6.2. Examen toxicológico .......................................................................136 4.6.2.1. Determinación de interleucina-6 (IL-6) .................................136 4.6.2.2. Estudio histopatológico de los pulmones ...............................136 5. Resultados y discusión ............................................................................................... 137 5.1. Síntesis y caracterización de las MOFs .................................................139 5.1.1. Encapsulación de isoniazida (INH) ..............................................139 5.1.2. Cálculo del porcentaje de humedad y porcentaje de materia seca de las MOFs ................................................................142 5.1.3. Caracterización fisicoquímica y morfológica de las MOFs dispersadas .....................................................................................143 5.2. Microencapsulación de las MOFs y caracterización de las microsferas (MS) obtenidas ...........................................................................145 5.2.1. Caracterización de MS control y selección del mejor excipiente de atomización ...............................................................145 5.2.2. Caracterización de las Ma-MIL-100 MS y Ma-INH@ MIL-100 MS: Morfología y propiedades aerodinámicas ............148 5.2.3. Estudio de composición e integridad estructural de las MS ......152 5.3. Estudio de liberación de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100 a partir de las microsferas de manitol (Ma MS). Estabilidad coloidal y química, y liberación de isoniazida (INH) ...............................................161 5.4. Estudios in vitro en la línea celular A549 .............................................169 5.4.1. Estudios de viabilidad celular ......................................................... 169 5.4.2. Captación intracelular y distribución ............................................173 25 Tabla de contenido Ma D-mannitol D-manitol Man D-(+)-mannose D-(+)-manosa MFI mean fluorescence intensity intensidad media de fluorescencia MIL material of Institut Lavoisier material del Instituto Lavoisier MOF/s metal-organic framework/s red/es metal-orgánicas MP/s microparticle/s micropartícula/s MRI magnetic resonance imaging imagen de resonancia magnética MS microsphere/s microsfera/s MW molecular weight peso molecular nanoMOF/s nano-sized metalorganic framework/s red/es metal-orgánica/s de tamaño nanométrico NC/s nanocapsule/s nanocápsula/s Nic nicotinamide nicotinamida NP/s nanoparticle/s nanopartícula/s Ola oleanolic acid ácido oleanólico PBS phosphate buffered saline tampón fosfato salino PDA photodiode array matriz de fotodiodos PDD cisplatin cisplatino PdI polydispersity index índice de polidispersión PEG polyethylene glycol polietilenglicol PLGA poly(lactic-co-glycolic acid) ácido poliláctico-coglicólico POA pyrazinoic acid ácido pirazinoico 32 Cristina Fernández Paz P/S Prussian blue Azul de Prusia PU polyurethane poliuretano PVA polyvinyl alcohol alcohol polivinílico PXRD powder X-ray diffraction difracción de rayos X en polvo PY process yield rendimiento del proceso PZA pyrazinamide pirazinamida RFB rifabutin rifabutina RGD peptide arginineglycine-aspartic acid péptido arginina-glicinaácido aspártico ROS reactive oxygen species especies de oxígeno reactivas RT room temperature temperatura ambiente SA salicylic acid ácido salicílico S.D. standard deviation desviación estándar SDS sodium dodecyl sulphate dodecilsulfato sódico SDZ sulfadiazine sulfadiazina SEM scanning electron microscope microscopía electrónica de barrido SIDA acquired immunodeficiency syndrome síndrome de inmunodeficiencia adquirida SLF simulated lung fluid fluido pulmonar simulado SLN solid lipid nanoparticles nanopartículas lipídicas sólidas Sor D-sorbitol D-sorbitol SSC side scattering dispersión lateral 33 Listados Sub BG sub background línea base t time tiempo TB tuberculosis tuberculosis TEM transmission electron microscopy Microscopía electrónica de barrido TGA thermogravimetric analysis análisis termogravimétrico T Inlet inlet temperature temperatura de entrada TM timolol timolol T Outlet outlet temperature temperatura de salida TPP tripolyphosphate tripolifosfato Tre D-(+)-trehalose dihydrate D-(+)-trehalosa dihidrato t.s.c. total solids content contenido en sólidos totales Vp pore volume volumen de poros UiO University of Oslo Universidad de Oslo WHO World Health Organization Organización Mundial de la Salud (OMS) ZIF zeolitic imidazole frameworks redes de imidazol zeolítico ZJU University of Zhejiang Universidad de Zhejiang 34 Cristina Fernández Paz Abreviaturas (II, con letras griegas) Fórmulas químicas Listado de abreviaturas (II, con letras griegas) Abreviatura Inglés Español α-CD α-cyclodextrin ciclodextrina α λ dynamic shape factor factor de forma dinámica λ Ex/Em excitation and emission wavelength values valores de longitud de onda de excitación y de emisión 𝜌𝜌𝑟𝑟𝑒𝑒𝑎𝑎𝑙𝑙 real density densidad real TNF-α tumor necrosis factor alpha factor de necrosis tumoral alfa Listado de fórmulas químicas Fórmula Inglés Español CO carbon monoxide monóxido de carbono EtOH ethanol etanol FeCl 3 .6H 2 O iron(III) chloride hexahydrate cloruro férrico hexahidratado H 3 BTC trimesic acid or 1,3,5benzenetricarboxylic acid ácido trimésico o ácido benceno-1,3,5tricarboxílico H 3 PO 4 phosphoric acid ácido fosfórico KF potassium fluoride fluoruro de potasio MeOH methanol metanol NO nitric oxide óxido nítrico H 2 O 2 hydrogen peroxide peróxido de hidrógeno H2S hydrogen sulfide sulfuro de hidrógeno 35 Listados Sistemas microy nanoparticulados Listado de sistemas microy nanoparticulados Sistema Inglés Español MIL-100 NP/s* nanoparticle/s of iron (III) trimesate metalorganic framework/s nanopartícula/s de red/es metal orgánica/s de trimesato de hierro (III) INH@MIL-100 NP/s nanoparticle/s of isoniazid-loaded iron (III) trimesate metalorganic framework/s nanopartícula/s de red/es metal orgánica/s de trimesato de hierro (III) cargada/s de isoniazida Ma MS mannitol microsphere/s microsfera/s de manitol Ma-MIL-100 MS mannitol microsphere/s containing iron (III) trimesate metal-organic frameworks nanoparticles microsfera/s de manitol conteniendo nanopartículas de redes metal orgánicas de trimesato de hierro (III) Ma-INH@MIL-100 MS mannitol microsphere/s containing isoniazid-loaded iron (III) trimesate metalorganic frameworks nanoparticles microsfera/s de manitol conteniendo nanopartículas de redes metal orgánicas de trimesato de hierro (III) cargadas con isoniazida α-CD MS α-cyclodextrin microsphere/s microsfera/s de ciclodextrina α 36 Cristina Fernández Paz Unidades Dex MS dextran microsphere/s microsfera/s de dextrano Man MS mannose microsphere/s microsfera/s de manosa Tre MS trehalose microsphere/s microsfera/s de trehalosa Sor MS sorbitol microsphere/s microsfera/s de sorbitol Fru MS fructose microsphere/s microsfera/s de fructosa * Las MIL-100 pueden estar constituidas de diferentes metales (ej.: Fe, Al, Cr) pero, cuando se emplee este término en el presente trabajo de Tesis, será para referenciar a las MOFs de trimesato de hierro (III): MIL-100(Fe); en concreto, a los carboxilatos de Fe (III): Fe3O-(H2O)2OH(BTC)2]·nH2O. Listado de unidades Símbolo Inglés Español rpm revolutions per minute revoluciones por minuto tap·min-1 taps per minute golpes por minuto v/v volume/volume volumen/volumen wt% percentage in weight porcentaje en peso w/v weight/volume peso/volumen w/w weight/weight peso/peso 37 Listados Listado de figuras Listado de figuras Figura 1. Esquema simplificado de formación de una MOF. La unión de ligandos orgánicos polidentados (representados con palos rojos) y unidades inorgánicas (indicadas mediante esferas azules), dan lugar a la estructura en forma de red de la MOF. (Figura de nueva creación) ................................................................ 55 Figura 2. Formación de la estructura de MOF MIL-100. En el cuadro, se representan los trímeros de los átomos del metal(III) hexacoordinado (en forma de octaedro) que, tras la coordinación con el ligando trimesato, forman un supertetraedro híbrido. El ensamblado de los supertetrahedros da lugar a la formación de una estructura cúbica de tipo zeolítico (imagen TEM), en donde hay dos tipos de cavidades mesoporosas (25 y 29 Å), accesibles a través de ventanas penta- (4.5*5.5 Å) y/o hexagonales (12 Å). Para su mejor comprensión, los poliedros metálicos se representan en naranja, los átomos de carbono en negro, los átomos de oxígeno en rojo y los átomos de hidrógeno han sido eliminados para mayor claridad. (Figura adaptada del trabajo de Liu et al. [61], ACS Appl. Mater. Interfaces. 9 (2017) 2025520275. Copyright © 2017, American Chemical Society) .................. 58 Figura 3. Ramificaciones dicotómicas del tracto respiratorio a medida en que se profundiza en el pulmón. (Imagen libre de derechos de autor) ............................................................................................. 89 Figura 4. Anatomía del tracto respiratorio. (Imagen libre de derechos de autor) ............................................................................................. 90 Figura 5. Mecanismos de depósito de las partículas inhaladas en el tracto respiratorio. (Figura adaptada del trabajo de Davenport et al. [129], Front. Physiol. 1 (2010) 139-146. Open Access Statement) 93 Figura 6. Estructura del ascensor mucociliar. (Figura adaptada del trabajo de Pérez et al. [147], Rev. médica Chile. 142 (2014) 606-615. Bajo licencia Creative Commons) ...................................... 96 38 Cristina Fernández Paz Listado de figuras Figura 7. Estructura química de la isoniazida (INH). (Figura de nueva creación) .......................................................................................... 101 Figura 8. (a) Patrones PXRD, (b) TGA e (c) Isotermas de adsorción/ desorción de N2 a 77 K de las NPs MIL-100 e INH@MIL100. El patrón PXRD de la INH libre se ha incluido para su comparación en la Figura 8a. Los símbolos coloreados y huecos en la Figura 8c indican la rama de adsorción y desorción, respectivamente. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) ...................................................................................... 140 Figura 9. Espectros FTIR de los materiales INH, INH@MIL-100 y MIL-100: (a) en un rango de espectro amplio, aproximadamente de 4000 a 400 cm-1 y (b) una sección de ese espectro, alrededor de 1800 a 400 cm-1. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) ...................................................................................... 142 Figura 10. Microfotografías TEM de: (a) NPs MIL-100 y (b) NPs INH@MIL-100 dispersadas en agua MilliQ. Escala: 100 nm. (Figura de nueva creación) .............................................................. 145 Figura 11. Microfotografías SEM de MS control de: (a) Ma, (b) α-CD, (c) Dex y (d) Tre. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) ...................................................................................... 147 Figura 12. Microfotografías SEM de Ma-MIL-100 MS preparadas con una relación MIL-100:Ma de: (a) 1:5, (b) 1:10 y (c) 1:100. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors)..... 149 Figura 13. Microfotografías SEM de Ma MS preparadas a: (a) 170 °C y (b) 160 °C. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) ............................................................................................ 150 39 Listados Figura 14. Microfotografía SEM de: (a) Ma-MIL-100 MS y (b) Ma-INH@MIL-100 MS. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) .................................................. 151 Figura 15. Patrones PXRD de: (a) MIL-100, INH@MIL-100 e INH, y (b) INH@MIL-100, Ma-INH@MIL-100 MS y Ma MS. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) ....................... 153 Figura 16. Espectros de superficie RAMAN de: (a) Ma MS y (b) MaMIL-100 MS. (Figura de nueva creación) ....................................... 155 Figura 17. Espectros RAMAN en diferentes planos de una MaMIL-100 MS: pico específico de MIL-100 (flecha de color naranja, columna de la izquierda) y pico característico de Ma (flecha de color verde, columna de la derecha). Los planos son: (a y h) Plano 2: 0.38 µm, (b y i) Plano 4: 0.76 µm, (c y j) Plano 6: 1.14 µm y (d y k) Plano 8: 1.52 µm. (Figura de nueva creación) 156 Figura 17 (continuación). Espectros RAMAN en diferentes planos de una Ma-MIL-100 MS: pico específico de MIL-100 (flecha de color naranja, columna de la izquierda) y pico característico de Ma (flecha de color verde, columna de la derecha). Los planos son: (e y l) Plano 10: 1.90 µm, (f y m) Plano 12: 2.28 µm y (g y n) Plano 14: 2.66 µm. (Figura de nueva creación) .......................... 157 Figura 18. Imágenes RAMAN en diferentes planos de una MaMIL-100 MS, donde las NPs MIL-100 están representadas en color rojo y el excipiente Ma, en azul: (a) Plano 2: 0.38 µm, (b) Plano 4: 0.76 µm, (c) Plano 6: 1.14 µm, (d) Plano 8: 1.52 µm, (e) Plano 10: 1.90 µm, (f) Plano 12: 2.28 µm y (g) Plano 14: 2.66 µm. (Figura de nueva creación) ............................................... 158 40 Cristina Fernández Paz Figura 19. Imágenes de CLSM de Ma-MIL-100 MS: Ma-Bodipy (canal rojo, primera columna), NPs MIL-100 (canal verde, segunda columna) y canales superpuestos (tercera columna). (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [195], ACS Appl. Mater. Interfaces. 12 (2020) 25676-25682. Copyright © 2020, American Chemical Society) ................................................. 160 Figura 20. Estabilidad coloidal de las NPs MIL-100 liberadas a partir de las MS en: (a) agua, (b) PBS y (c) SLF, mostrando la evolución del tamaño de las NPs (negro, izquierda) y de la carga superficial (rojo, derecha) vs. tiempo (media ± S.D.; n = 3). (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [195], ACS Appl. Mater. Interfaces. 12 (2020) 25676-25682. Copyright © 2020, American Chemical Society) ............................ 162 Figura 21. Estabilidad coloidal de las NPs INH@MIL-100 liberadas a partir de las MS en: (a) agua, (b) PBS y (c) SLF, mostrando la evolución del tamaño de las NPs (negro, izquierda) y de la carga superficial (rojo, derecha) vs. tiempo (media ± S.D.; n = 3). (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors)..... 163 Figura 22. Liberación de INH (%) (rojo) desde las NPs INH@MIL-100 y degradación de MOFs (%) (azul) en agua (círculo), PBS (pH = 7.4) (cuadrado) y SLF (triángulo) vs. tiempo durante: (a) 168 h y (b) las primeras 8 h (media ± S.D.; n = 3). (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) ........................................ 166 Figura 23. Microfotografías TEM de las NPs de INH@MIL-100 liberadas desde Ma MS en: (a) agua MilliQ, (b) PBS y (c) SLF. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors)..... 167 Figura 24. Patrones PXRD de: (a) NPs de MIL-100 liberadas en SLF y Ma-MIL-100 MS; (b) NPs de INH@MIL-100 liberadas en SLF y Ma-INH@MIL-100 MS. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) .................................................. 168 41 Listados 1. Resumen 1. RESUMEN El principal objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido el diseño y desarrollo de un nuevo sistema micro-nanoparticulado a base de redes metal-orgánicas (MOFs) para el tratamiento pulmonar de la tuberculosis (TB), sin fibrosis subyacente. De este modo, las nanopartículas (NPs) de trimesato de hierro (III) mesoporoso MIL-100 fueron microencapsuladas en microsferas de manitol (Ma MS) mediante una técnica simple y eficiente de atomización. Además, el fármaco antituberculoso (anti-TB) de primera línea isoniazida (INH) se encapsuló en las MOFs (NPs INH@MIL-100), alcanzado una gran carga farmacológica. Se caracterizaron las Ma MS control, las Ma-MIL-100 MS y las MaINH@MIL-100 MS obtenidas, presentando propiedades morfológicas y aerodinámicas adecuadas para su llegada a la zona profunda del pulmón. Se llevó a cabo la liberación del sistema y del fármaco en medios fisiológicos simulados (agua MilliQ, tampón fosfato salino (PBS) y fluido pulmonar simulado (SLF)) a 37 °C. Se demostró que las partículas fueron liberadas con un tamaño nanométrico y carga negativa, siendo la INH más fácilmente liberada en PBS que en agua. Además, se realizaron estudios in vitro empleando la línea celular de adenocarcinoma epitelial basal alveolar humano A549. Se examinó la biocompatibilidad de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100, así como del excipiente Ma demostrando baja citotoxicidad de los sistemas. La presencia y ubicación de ambos nanosistemas dentro de las células, fueron corroboradas mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Finalmente, se realizaron diferentes estudios in vivo administrando de forma intratraqueal las Ma MS control, Ma-MIL100 MS y Ma-INH@MIL-100 MS a ratas Wistar-Kyoto. Las NPs se liberaron en el fluido alveolar, observándose una distribución homogénea de las mismas en el pulmón profundo. Además, se produjo una pequeña retención de la formulación en la tráquea. No hubo embolismo pulmonar, como se confirmó mediante observación macro y microscópica. El examen histopatológico de los pulmones demostró la presencia de un parénquima normal, con la apariencia típica de alvéolos de paredes delgadas y la ausencia de cualquier signo de inflamación. 51 Resumen De este modo, los resultados confirman que nuestro sistema micro-nanoparticulado es un candidato prometedor para el tratamiento local de enfermedades infecciosas mediante la vía pulmonar, siendo interesante para el tratamiento de la TB. 52 Cristina Fernández Paz 2. Introducción 2. INTRODUCCIÓN 2.1. Redes metal-orgánicas (MOFs) Figura 1. Esquema simplificado de formación de una MOF. La unión de ligandos orgánicos polidentados (representados con palos rojos) y unidades inorgánicas (indicadas mediante esferas azules), dan lugar a la estructura en forma de red de la MOF. (Figura de nueva creación) 2.1. Redes metal-orgánicas (MOFs) La Nanotecnología es un área de investigación dentro de la Tecnología Farmacéutica de gran interés para la creación de nuevos vehículos farmacológicos destinados para uso terapéutico en el tratamiento de diferentes enfermedades [1]. Las MOFs constituyen en la actualidad uno de los materiales más prometedores para la administración de fármacos y otros ingredientes activos (AIs) [2,3]. Las MOFs son materiales híbridos cristalinos porosos basados en la asociación ionocovalente de subunidades inorgánicas (cationes aislados, clústeres, cadenas, planos o, incluso redes tridimensionales de cationes) y ligandos orgánicos polidentados que actúan como espaciadores entre los centros metálicos (carboxilatos, fosfonatos, compuestos nitrogenados, etc.). Esta unión crea un sistema tridimensional cristalino (Figura 1) con una gran versatilidad estructural y composicional, y una porosidad excepcional [2,4-6]. Gracias a estas propiedades, los MOFs se han propuesto en numerosas aplicaciones de interés social e industrial [7], como adsorción [8], catálisis [9],pilas de combustible [10], separación [11], sensores [12], alimentación [13] o medio ambiente [14], entre otros. Figura 1. Esquema simplificado de formación de una MOF. La unión de ligandos orgánicos polidentados (representados con palos rojos) y unidades inorgánicas (indicadas mediante esferas azules), dan lugar a la estructura en forma de red de la MOF. (Figura de nueva creación) 55 Introducción 2.2. Interés de las MOFs para aplicaciones biomédicas Aunque su aplicación en biomedicina no surgió hasta 2006 [15], utilizando MOFs micrométricos basados en cromo como prueba de concepto, no fue hasta 2010 cuando se propusieron varias nanopartículas de MOF biocompatibles a base de hierro como sistemas de liberación de fármacos combinado a diagnóstico (teragnóstico) [16]. En este campo, se han estudiado principalmente MOFs basados en cationes biocompatibles o inertes como Ca, Mg, Zn, Fe, Zr y Ti [3]. Como ligandos, se han propuesto diversas moléculas orgánicas polidentadas de baja toxicidad o, incluso, biomoléculas contribuyendo a la bioseguridad y a la actividad terapéutica de la MOF resultante (también llamadas bioMOFs) [17,18]. Algunos ejemplos de moléculas biológicas empleadas son los aminoácidos, péptidos y proteínas, nucleobases, ciclodextrinas y porfirinas, entre otras [18-20]. Las MOFs presentan propiedades que las convierten en “únicas” para aplicaciones biomédicas. Entre ellas, cabe destacar su elevada porosidad (superficies BET de hasta 7000-8000 m2·g-1 con tamaños de poro de 3 a 90 Å) [21] y poseer una composición altamente versátil (tanto el ligando orgánico como las subunidades inorgánicas son modulables) [22]. Incluso, la superficie interna y externa de las MOFs se puede modificar para mejorar la funcionalidad [23]. En definitiva, las características morfológicas, estructurales y fisicoquímicas de las MOFs están determinadas por las propiedades de los ligandos orgánicos y las subunidades inorgánicas, siendo sistemas muy prometedores como vehículos para la administración de diferentes AIs [24-27]. 2.2. Interés de las MOFs para aplicaciones biomédicas Las MOFs presentan varias características que los hacen excelentes candidatos para diferentes aplicaciones biomédicas [2830]: i) pueden sintetizarse de forma homogénea y estable [30-32], ii) presentan elevadas superficies de poros y, por lo tanto, buena capacidad de adsorción de fármacos (elevada carga farmacológica) [16]; iii) puede funcionalizarse la superficie interna (poros) y externa para establecer interacciones específicas con el AI [23], permitiendo el 56 Cristina Fernández Paz proceso reversible de adsorción/desorción con el mismo, optimizar su estabilidad in vivo y/o mejorar su biodistribución [25,33]; iv) realizar la liberación del fármaco de forma controlada, evitando el "efecto burst", que es la liberación rápida del AI durante las primeras horas; v) posibilidad de emplear agentes de contraste saludables y componentes bioactivos (como cationes o ligandos orgánicos) en sus estructuras, llamados dichos sistemas bioMOFs) [17,18]; vi) estabilidad para llevar a cabo su función en el organismo y biodegradabilidad, impidiendo su acumulación endógena y, por tanto, los efectos tóxicos asociados [34]. Las MOFs pueden cargar y vehiculizar de forma controlada numerosos AIs, incluyendo fármacos [24-27,35,36], cosméticos [37,38], o macromoléculas, como material genético [39-44], proteínas [45-48] y vacunas [49]. Además, las MOFs pueden utilizarse también en la producción y liberación de gases terapéuticos [50-53] e, incluso, para el tratamiento de intoxicaciones orales causadas por sobredosis de fármacos [54,55]. Aún más, dependiendo de los materiales constituyentes, algunos tipos de MOFs pueden ser utilizadas como agentes de diagnóstico múltiple (con propiedades de imagen), en terapias avanzadas combinadas y en teragnosis [3]. Por ejemplo, los preparados con Mn, Gd o Fe pueden usarse en imágenes de resonancia magnética (MRI) [28,29,56,57]. Por tanto, las MOFs tienen un gran potencial en teragnosis (basada en la estrategia combinada de diagnóstico y tratamiento del paciente a la vez) [16,58], ofreciendo muchas ventajas en el seguimiento y tratamiento de los pacientes al mismo tiempo. Además, las MOFs pueden presentar otras ventajas, como propiedades antibacterianas, por ejemplo en aquellas con Ag, Cu o Zn en su estructura. En consecuencia, la multifuncionalidad de las MOFs permite unas amplias aplicaciones biomédicas [59]. En este trabajo, nos centraremos en la aplicación de las MOFs en la liberación controlada de fármacos. Para ello, las MOFs se pueden adaptar fácilmente en función de la carga del fármaco deseada, la vía de administración por la que se pretenden administrar en el organismo, los perfiles de liberación y las necesidades terapéuticas [25,33,39,60]. Además, de entre la gran variedad de MOFs, hemos 57 Introducción Tabla 1 (continuación 2). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía parenteral. Tabla 1 (continuación 2). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía parenteral. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. cancerosa MIL100(Fe) GMP Suspensión inyectable Estabilidad de las MOFs en suero de rata Estabilidad de MOFs en PBS suplementado con albúmina de suero bovino Liberación de fármacos Estudio in vivo (Ratones C57BL/6J) Estudio histológico Aparición de agregados de tamaños micrométricos a los 30 min de incubación en suero de rata y desaparición a las 3 h en suero y a las 6 h en PBS suplementado con albúmina de suero bovino Desagregación posiblemente debida a la adsorción de proteínas del medio en la superficie de las MOFs Liberación en PBS suplementado del 40% y 60% de GMP a las 0.25 h y 4 h, respectivamente Ausencia de distrés pulmonar en los animales Falta de toxicidad aguda o necrosis en cortes histológicos pulmonares [82] 64 Cristina Fernández Paz Tabla 1 (continuación 3). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía parenteral. Tabla 1 (continuación 3). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía parenteral. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. Sistemas RGDAu@FeMOF (RAMOFs) DOX Suspensión inyectable Viabilidad celular Estudios in vivo (Ratones macho Balb/c) Tolerancia a los tejidos sanos RAMOFs: sin efectos citotóxicos importantes en las células MD-MBA-231 RAMOFs-DOX: citotoxicidad dependiente de la dosis de fármaco administrada RAMOF-DOX + Laser: mejor tratamiento (efecto sinérgico en el tumor) Longitud de onda óptima: 808 nm Tejidos sanos que rodean los tumores apenas afectados Ausencia de daño tisular o inflamación visible en los órganos principales (como los pulmones) [84] 65 Introducción 2.3.2. Vía cutánea 2.3.2. Vía cutánea En los últimos 5 años, ha habido un desarrollo significativo de formas de dosificación basadas en MOFs para la administración transdérmica y cutánea de AIs, en forma de parches o hidrogeles. Los parches se preparan generalmente utilizando biopolímeros (tales como, alcohol polivinílico (PVA) y gelatina de piel de cerdo (GEL)), MOFs (ej. MIL-100, MIL-127(Fe) y UiO-66(Zr)), y diversos fármacos (ej. ácido salicílico (SA), ibuprofeno (IBU), ácido azelaico (AzA), nicotinamida (Nic) (ver Tabla 2) [37,85-87]. Los procesos de liberación, bajo condiciones cutáneas simuladas, mostraron distintas cinéticas. Las MOFs de pequeño tamaño de poro (como MIL-127(Fe)) producen una liberación más lenta que las redes de poros de grandes dimensiones (como MIL-100). Además, la naturaleza hidrófila/hidrófoba del fármaco influye en la velocidad de liberación, siendo más lenta para el IBU (hidrófobo) que para el SA (hidrófilo) a partir de la matriz de UiO-66 [85]. Otros ejemplos de MOFs empleadas para esta vía son las MIL-53, MIL-53-(OH)2, MIL-163, UiO-66-NH2 y ZIF-8 cargadas con diferentes cantidades de SA, según el tipo de MOF y la relación MOF:SA (véase el Tabla 2) [88]. Adicionalmente, MIL-53(Al) y MIL-53-(Zn,Al) se cargaron con sulfadiazina (SDZ) [89] y se evaluó su liberación in vitro (con células eucariotas) y ex vivo (con piel de cerdo) (ver Tabla 2), y se demostró ausencia de toxicidad en las células. Los estudios ex vivo e in vivo, llevados a cabo con piel de oreja de cerdo y con voluntarios humanos, respectivamente, demostraron que los parches de MIL-100 y MIL127(Fe) cargados con una combinación de fármacos antiacné (AzA y Nic) son seguros [86]. Además, se evaluaron hidrogeles de polietilenglicol diacrilado (PEG) conteniendo MOFs (basados en Cu, Co o Zn) con glutarato y ligandos 1,2-bis (4-piridil)etileno [90] para demostrar su actividad antibacteriana (empleando Escherichia coli y Staphylococcus aureus) y se realizaron estudios de citotoxicidad (utilizando fibroblastos dérmicos humanos HDF) (ver Tabla 2). Los resultados mostraron que los efectos son diferentes empleando E. coli con respecto a S. aureus, y que su bioactividad está más influenciada por el metal empleado y la 66 Cristina Fernández Paz estructura de la MOF, que por el ligando utilizado [91]. Finalmente, la MOF con Cu se reveló como la más adecuada para fines antibacterianos porque mostró una ausencia de toxicidad para los HDFs y un comportamiento bactericida. 67 Introducción Tabla 2. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. Tabla 2. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. MIL100(Fe) IBU Parches a base de MIL-100 Preparación: - Molienda de componentes - Mezclado - Preparación de obleas ejerciendo presión Encapsulación de fármacos Liberación de fármacos Alta carga de fármaco: - 33 wt% en NPs MIL-100 - 17.5 wt% en el parche Baja liberación de fármaco (30% a las 2 h) debido a su carácter hidrofóbico [37] MIL100(Fe), MIL127(Fe), UiO-66(Zr) SA IBU - Carga de fármaco: - Equilibrio hidrofílico/hidrofóbico - Accesibilidad de los fármacos a través de la matriz Liberación de fármaco: - Control de perfiles cinéticos de liberación Carga de fármaco elevada Gran estabilidad acuosa Liberación adecuada de la carga de fármaco (entre 1 y 7 días), siendo más lento para: - IBU (fármaco hidrofóbico) que para SA (fármaco hidrofílico) - MOFs de poros estrechos [MIL127(Fe)] que para MOFs de poros anchos [MIL-100] [85] 68 Cristina Fernández Paz Tabla 2 (continuación 1). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. Tabla 2 (continuación 1). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. Cu-MOF 1, Co-MOF 2, Zn-MOF 3 - Hidrogeles embebiendo MOFs Preparación de hidrogeles embebiendo MOFs Ensayo antibacteriano: - Escherichia coli (G(-)) - Staphylococcus aureus (G(+)) Degradación y liberación de iones metálicos Ensayos de citotoxicidad con fibroblastos humanos (HDFs) Actividad antibacteriana de: - MOF libres: Cu-MOF 1> Co-MOF 2> ZnMOF 3 (MBC: 20 μg · mL− 1, 1000 μg·mL− 1 y 2000 μg·mL−1, respectivamente) - Hidrogeles embebiendo MOFs: hidrogel@Cu-MOF 1 e hidrogel@CoMOF 2 exhibieron 99.9%, mientras que el hidrogel@Zn-MOF 3 no presentó actividad bactericida (MBC: 2000 μg·mL− 1) Liberación de iones metálicos de 5.6 ppm El hidrogel@Cu-MOF 1 a 20 μg·mL− 1 (MBC) no es tóxica para los HDFs y es bactericida [90] MIL100(Fe), MIL127(Fe) AzA Nicotinamida Parches (PVAMOFs) a base de MOFs con alcohol polivinílico (PVA) Síntesis de MOFs Encapsulación de fármacos Liberación de fármacos Alta carga de fármaco: - 77.4 wt% en NPs MIL-100 - 48.1 wt% en NPs MIL-127 NPs - 38.8 wt% en el parche PVA-MIL-100 [86] 69 Introducción Tabla 2 (continuación 2). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. Tabla 2 (continuación 2). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. Elaboración de parches Permeación de fármacos ex vivo (piel de oreja de cerdo) Irritación de la piel Extracción de fármacos desde la piel In vivo (voluntarios) - 24.2 wt% en el parche PVA-MIL-127 Los parches permiten la administración controlada de fármacos Los parches son seguros ex vivo e in vivo MIL-53(Al), MIL-53- (Zn,Al) SDZ - Carga de SDZ Liberación de fármacos Estudio in vitro (células eucariotas) Estudio ex vivo (piel de cerdo) MIL-53-(Zn,Al) liberan fármaco más rápidamente que MIL-53(Al) No toxicidad para las células eucariotas SDZ y ligando penetran a través de la piel de cerdo durante 3 h [89] 70 Cristina Fernández Paz Tabla 2 (continuación 3). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. Tabla 2 (continuación 3). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía cutánea. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. UiO-66, UiO-66NH2, MIL163, MIL127, MIL53, MIL53-(OH)2, MIL-100, ZIF-8 SA - Adsorción de SA mediante MOFs Estabilidad de las MOFs Liberación de SA desde UiO-66-NH2 SA se adsorbe en función de la relación MOFs:SA: - 1:0.5  MIL-53-(OH)2 ≈ MIL-100 ≈ MIL-127 ≈ MIL-163 < MIL-53 ≈ UiO-66 < ZIF-8 < UiO-66-NH2 - 1:2  MIL-100 ≈ MIL-127 < ZIF-8 < MIL-163 < UiO-66 < MIL-53-(OH)2 << UiO-66-NH2 << MIL-53 UiO-66-NH2 es el mejor candidato UiO-66-NH2 presenta alta carga de fármaco (12.1 wt%) UiO-66-NH2 exhibe una estabilidad importante La cinética de liberación de SA desde UiO-66-NH2 es adecuada por vía cutánea [88] 71 Introducción 2.3.3. Vía oral 2.3.3. Vía oral Diferentes tipos de MOFs, como NPs de MIL-100, se recubrieron con diferentes polímeros como quitosano (CS) y carboximetilcelulosa (CMC) [92-94] para favorecer su administración por vía oral (ver Tabla 3). Se comprobó que el CS protege a las MOFs frente a la degradación enzimática, facilita su bioadhesión y mejora la absorción del fármaco. En efecto, el CS promueve el transporte de las NPs a través de la mucosa intestinal [95]. Se evaluó la biocompatibilidad de las MIL-100 no recubiertas y recubiertas con CS (CS_MIL-100) in vitro en células de carcinoma colorrectal humano (Caco-2), observándose una disminución de la citotoxicidad en los sistemas recubiertos con CS. Además, un estudio de evaluación de la respuesta inflamatoria, demuestra que las NPs CS_MIL-100 disminuyen la respuesta inmune debido a que no inducen la activación del complemento. Esto podría explicarse por una disminución del reconocimiento de las NPs por el recubrimiento de CS que, además, mejora la biocompatibilidad y otorga funciones adicionales, como una mejora de la estabilidad química en fluidos orales simulados, la bioadhesividad y el paso a través de la barrera intestinal. Además, varias MOFs (UiO-66, UiO-66-NH2, UiO-66-COOH, UiO-67 y ZrNDC) se cargaron con 5-FU (ver Tabla 3) para el tratamiento de cáncer (mamá, colorrectal (CRC), tracto digestivo, etc.), siendo las MOFs de Zr-NDC las que asocian la mayor cantidad de fármaco. Las Zr-NDC también fueron recubiertas con CS para permitir una administración adecuada de 5-FU por vía oral [92], obteniéndose una elevada liberación del fármaco (70%). Como se mencionó anteriormente, también se usó CMC para recubrir MOFs destinadas al tratamiento de cáncer de colon vía oral. Así, el MOF-5 se asoció con el 5-FU y se recubrió con CMC sensible al pH (CMC/5-FU@MOF-5) para proteger las NPs 5-FU@MOF-5 [93] frente al ambiente ácido del estómago, y provocar una liberación específica en el medio intestinal (ver Tabla 3). Se demostró in vitro que el 5-FU se libera de manera sostenida durante un período de tiempo prolongado, atribuido al comportamiento sensible al pH de la CMC, mostrando una toxicidad notable contra la línea celular HeLa. 72 Cristina Fernández Paz Además, las NPs UiO-66-PDC cargadas con ibuprofeno sódico (IBUNa), utilizando el ácido 2,5-piridindicarboxílico como ligando, y las NPs ZJU-16 conteniendo IBUNa (NPs IBUNa@ZJU-16) también se emplearon como sistemas sensibles al pH [96] (ver Tabla 3). De esta forma, en ambos casos la liberación del fármaco depende del pH del medio, siendo más rápida y en mayor extensión bajo condiciones intestinales (pH = 7.4) que en el medio gástrico (pH = 2.0). Por tanto, todas estas MOFs han demostrado ser interesantes como sistemas de administración oral de fármacos en el tratamiento de enfermedades como el cáncer de colon [92-94,96,97]. 73 Introducción Tabla 5. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía ocular. Tabla 5. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía ocular. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. NH2-MIL88(Fe) Bri Mucoadhesivo Síntesis solvotermal Caracterización de NPs Carga con Bri Liberación de fármacos Estudio in vivo (conejos) NH2MIL-88(Fe) presenta propiedad mucoadhesiva Buena capacidad de carga de fármaco La liberación de Bri se mantiene hasta 12 h Los estudios in vivo muestran que: - NH2-MIL-88(Fe)/Bri permanece en la superficie ocular de conejos durante 4 h - alta biodisponibilidad del fármaco - prolongación del efecto de la disminución de la presión intraocular [104] UiO-67 a base de Zr Bri Film de nanocompuestos poliméricos Análisis de estabilidad Microscopía SEM Medidas de adsorción de etileno (25ºC) TGA Análisis FTIR Mediciones de Synchrotron PXRD Estabilidad mejorada de MOFs en matriz de PU Distribución homogénea de MOFs en matriz de PU ≥ 45% de las MOFs son accesibles para la adsorción de moléculas no polares Adsorción mejorada de la matriz de PU (tras la inclusión de NPs UiO-67) Presencia demostrada de Bri en la película UiO-67@PU [105] 80 Cristina Fernández Paz Tabla 5 (continuación). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía ocular. Tabla 5 (continuación). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía ocular. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. Carga de Bri: - 58.4 mg·g-1 sistema - 194.7 mg·g-1 MOF Buen proceso de adsorción/liberación de fármaco NH2-MIL88(Fe) TM Mucoadhesivo Síntesis solvotermal Caracterización de NPs Carga de TM Liberación de fármacos Estudio de viabilidad Estudio de inestabilidad NH2-MIL-88(Fe) presenta propiedad mucoadhesiva Buena capacidad de carga de fármaco Liberación mantenida de TM hasta 10 h (hasta 63%) Alta viabilidad tras interacción de células de la retina con NH2-MIL-88(Fe) e interacción persistente con TM@NH2MIL-88(Fe) [103] 81 Introducción 2.3.6. Vía rectal 2.3.6. Vía rectal Se han investigado NPs MOFs para la administración rectal, especialmente para tratar el CRC (ver Tabla 6). Para ello, se propusieron las NPs MOFs PCN-223(Zr) cargadas con 5-FU y otras NPs MOFs cargadas con cisplatino (PDD) y ácido oleanólico (Ola) recubiertas adicionalmente de ácido hialurónico (HA) (HA/PDD/Ola) (ver Tabla 6) [106,107]. Concretamente, el sistema 5-FU@PCN-223 proporciona una liberación sostenida en células HCT-116 (línea celular de CRC humano), mejorando el efecto anticanceroso y disminuyendo la viabilidad celular en comparación con un tratamiento de solución de 5-FU en bolo. Además, las NPs HA/PDD/Ola son altamente biocompatibles con la sangre [107], liberando ambos fármacos de forma más prolongada en condiciones fisiológicas (pH = 7.4) que en entornos patológicos. Esta diferencia de liberación podría deberse al pH del medio, ya que la descomposición de la MOF está fuertemente influenciada por el pH. Además, se probó la biocompatibilidad en células HCT-116, demostrando que la combinación de PDD y Ola presentaban un efecto sinérgico anticanceroso mayor que la de los fármacos administrados por separado. Incluso, la presencia de HA en la estructura promovió la acumulación del sistema en HCT-116 [107]. En resumen, los sistemas basados en MOFs también parecen muy atractivos para la administración rectal de fármacos para el tratamiento de enfermedades como el CRC. 82 Cristina Fernández Paz Tabla 6. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía rectal. Tabla 6. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía rectal. MOFs FÁRMACO ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. PCN-223 5-FU Síntesis solvotermal Caracterización de NPs Carga con 5-FU Captación intracelular Viabilidad celular Carga de fármaco de 79.4 µg·mg-1 Liberación sostenida de 5-FU PCN-223 y 5-FU@PCN-223 se internalizan en células HCT-116 en, aprox., 2 h 5-FU@PCN-223 disminuye la viabilidad celular en comparación con un tratamiento de solución de 5-FU en bolo PCN-223 parece mejorar la eficacia del fármaco en poco tiempo de exposición [106] - PDD y Ola Síntesis de HM/PDD/Ola por método de coprecipitación Estabilidad Estudio de biocompatibilidad Liberación de fármacos Estudio de viabilidad Efecto de apoptosis Efecto de HA HM/PDD/Ola son estables en condiciones fisiológicas Las NPs son altamente biocompatibles con la sangre Los estudios de liberación de fármacos muestran que: - en ambientes fisiológicos (pH = 7.4), ambos fármacos se liberan de forma lenta (PDD: 33.26% y Ola: 25.4% a las 120 h post-incubación) - en ambientes patológicos, ambos fármacos se liberan de forma rápida [107] 83 Introducción Tabla 6 (continuación). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía rectal. Tabla 6 (continuación). Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía rectal. MOFs FÁRMACO ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. (PDD: 90.8% y Ola: 69.6%) Descomposición de MOF dependiente del pH La combinación de PDD y Ola mejora el efecto anticanceroso (contra las células HCT-116) a dosis más bajas A concentración farmacológica de 0.82/8.2 µM y tras 72 h de incubación, el efecto de apoptosis es: HM/PDD de: 43.6% HM/Ola de: 31.4% HM/PDD/Ola de: 72.3% HA promueve la acumulación del sistema en las células HCT-116 84 Cristina Fernández Paz 2.3.7. Vía pulmonar 2.3.7. Vía pulmonar La vía pulmonar permanece casi inexplorada para la administración de sistemas de liberación a base de MOFs. Se han propuesto varias estrategias para administrar las MOFs por vía pulmonar, incluyendo: i) agrupaciones de MOFs constituyendo partículas de tamaños micrométricos [108]; ii) asociaciones de MOFs con otras moléculas (como ciclodextrinas), que no son objeto de este trabajo de Tesis [109]; y iii) MOFs incluidas en microsistemas de excipientes (como Ma) [110]. En el primer caso, se sintetizó partículas de CuPOA2 MOFs a partir de Cu (con potencial sinergia anti-TB con algunos fármacos [111-113]) y ácido pirazinoico (POA; considerado un profármaco del fármaco antituberculoso de primera línea, pirazinamida (PZA)) a baja temperatura (RT o 60ºC) (ver Tabla 7) [108]. Mediante un método de atomización, se prepararon micropartículas huecas de un tamaño alrededor de 2.6 µm. Aunque este sistema parecía adecuado para la vía pulmonar, sus propiedades aerodinámicas no fueron suficientemente evaluadas (tales como, la densidad real y la densidad aparente) para corroborar su idoneidad [114,115]. Además, aunque estas partículas están dentro del tamaño aerodinámico comúnmente aceptado (1-5 μm), es más fácil alcanzar el pulmón profundo con partículas no huecas de tamaño comprendido entre 1-5 μm o con partículas huecas de diámetro aerodinámico (Daer) inferior, fenómenos observados en estudios previos con otros materiales [116-118]. Por tanto, teóricamente, su llegada al pulmón profundo no es probable. Además, aunque así fuese, sería necesario que las partículas fuesen sonicadas en abundante agua para su posible internalización celular; ya que, ante el bajo volumen de fluido alveolar, sería esperable una bioacumulación del sistema en la región pulmonar. Es por ello que resulta muy interesante la inclusión de las MOFs en MS o micropartículas (MPs) de un excipiente para su adecuada administración por vía pulmonar. Además, los excipientes pueden conferir ventajas, como es el caso del Ma (que es termoprotector, osmótico y mucolítico [119]). 85 Introducción Por otro lado, también dirigido a su futura aplicación vía pulmonar, se realizó un estudio ex vivo utilizando el material Fe-MIL101-NH2 cargado con INH para el tratamiento de la TB [120] (ver Tabla 7). Para ello, se extirparon los pulmones de ratas Wistar y se les administraron intratraquealmente MPs de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) y leucina (LC) conteniendo Fe-MIL-101-NH2 cargado con INH. Los resultados mostraron que estos micronanosistemas eran biocompatibles y capturados de manera eficiente por los macrófagos RAW 246.9. De este modo, los micronanosistemas a base de MOFs parecen también buenos candidatos para la administración de antibióticos por vía pulmonar. 86 Cristina Fernández Paz Tabla 7. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía pulmonar. Tabla 7. Algunos ejemplos de MOFs investigadas para la administración de fármacos por vía pulmonar. MOFs FÁRMACO SISTEMA ESTUDIOS PRINCIPALES HALLAZGOS REF. CuPOA2 POA, profármaco de PZA Partículas formadas por Cu y POA Atomización Caracterización de partículas Ventajas: - Daer ( 2.6 µm) - Morfología esférica - Alta carga de fármaco Desventajas: - Incompleta caracterización de las partículas - Propiedades aerodinámicas de dudosa calidad - Imposibilidad de liberación en volumen acuoso bajo - Riesgo de bioacumulación y obstrucción respiratoria [108] Fe-MIL101-NH2 INH Micronanosistemas formados por MPs de: - PLGA - LC conteniendo FeMIL-101-NH2 cargadas de INH Administración pulmonar ex vivo de los micronanosistemas Estudio de biocompatibilidad ex vivo con macrófagos Ventajas: - Biocompatibilidad con macrófagos RAW 246.9 - Eficiente captación por macrófagos RAW 246.9 Desventaja: - Potencial no demostrado in vivo [120] 87 Introducción 2.4. Interés de la vía pulmonar para la administración de fármacos 2.4.1. Anatomofisiología del tracto respiratorio 2.4. Interés de la vía pulmonar para la administración de fármacos La vía pulmonar es una ruta muy atractiva para la administración de AIs (ej., fármacos, ácidos nucleicos, y péptidos) para tratar no sólo enfermedades pulmonares locales, sino también enfermedades sistémicas. Mediante esta vía, se puede conseguir un acceso directo y preciso del AI al lugar de acción deseado en pulmón para tratar localmente una enfermedad respiratoria [121-123]. Esta vía presenta interesantes ventajas para la administración de medicamentos: i) es no invasiva e indolora, lo que favorece la comodidad y el cumplimiento posológico por el paciente [124], ii) permite aumentar la concentración del fármaco en el lugar de acción, a la vez que se reduce la dosis administrada y los posibles efectos secundarios adversos asociados con la administración no pulmonar; iii) presenta una gran superficie (70-140 m2 en humanos adultos) y una membrana alveolar-capilar extremadamente fina (0.1-0.2 μm) muy vascularizada [125], que favorece la absorción de fármacos (en los alvéolos); iv) menor actividad enzimática y menor degradación con respecto a otras vías de administración (como la vía oral) [121123]; y v) ausencia de efecto de primer paso hepático [126,127]. De todos modos, antes de comprender el proceso por el cual un AI es capaz de llegar a la zona deseada del pulmón para realizar su efecto terapéutico, es fundamental conocer tanto la estructura del árbol respiratorio como su fisiología para conseguir una adecuada biodistribución y eficacia terapéutica. 2.4.1. Anatomofisiología del tracto respiratorio Los sistemas respiratorio y cardiovascular son los encargados de suministrar oxígeno a todas las células del organismo, así como de expulsar al exterior el dióxido de carbono a través del intercambio de gases con el medio ambiente [128,129]. El órgano más importante es el pulmón, que está en contacto con el exterior a través de conductos que se subdividen dicotómicamente a medida en que se profundiza, de 88 Cristina Fernández Paz Figura 3. Ramificaciones dicotómicas del tracto respiratorio a medida en que se profundiza en el pulmón. (Imagen libre de derechos de autor) tal forma que disminuye el diámetro de los conductos y aumenta, sin embargo, la superficie (Figura 3) [130]. Figura 3. Ramificaciones dicotómicas del tracto respiratorio a medida en que se profundiza en el pulmón. (Imagen libre de derechos de autor) Anatómicamente, el árbol respiratorio se subdivide en dos partes: el tracto respiratorio superior y el inferior. El tracto superior está formado por la boca, la cavidad nasal, la faringe y la laringe; mientras que el inferior, está compuesto por la tráquea, los bronquios primarios, los bronquiolos primarios y sus ramificaciones, y el área alveolar (ver Figura 3) [131]. En el tracto respiratorio inferior existen dos áreas funcionales: el área de conducción y el área respiratoria. El área de conducción es la que está constituida por la tráquea, los bronquios y los bronquiolos, llegando hasta los bronquiolos terminales, y está dedicada a la filtración, calentamiento y humidificación del aire inspirado. A continuación, está el área respiratoria, formada por bronquiolos terminales y sacos alveolares respiratorios (que tienen una 89 Introducción Figura 6. Estructura del ascensor mucociliar. (Figura adaptada del trabajo de Pérez et al. [147], Rev. médica Chile. 142 (2014) 606-615. Bajo licencia Creative Commons) (encargadas de las secreciones) y células ciliadas (encargadas del movimiento del fluido hacia el exterior) (Figura 6) [146]. Figura 6. Estructura del ascensor mucociliar. (Figura adaptada del trabajo de Pérez et al. [147], Rev. médica Chile. 142 (2014) 606-615. Bajo licencia Creative Commons) Cuando las partículas inhaladas se depositan en bronquios y en bronquiolos, se adhieren a la capa de mucus y son impulsadas hacia la faringe por medio del movimiento de los cilios. Este mucus con partículas se puede expulsar al exterior o deglutirse, pasando al tracto gastrointestinal. Por lo tanto, cuando se tratan de partículas medicamentosas, éstas apenas contribuyen al efecto terapéutico a nivel sistémico. Además, la existencia de enzimas como peroxidasas o lisozimas contribuyen a su eliminación [146]. En el caso de que la persona presente una situación fisiológica normal, la aclaración es en torno a 1L de moco por día; mientras que en condiciones patológicas, se produce exceso de moco, pudiendo llegar a producirse obstrucción, como en el caso de Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) y en asma. En estas situaciones patológicas, actúan otros mecanismos de defensa como la tos y el estornudo. Tos: es un acto reflejo que sirve para la desobstrucción de las vías aéreas. Comienza por el estímulo de receptores sensoriales de áreas tusígenas, situadas en cuerdas bucales, laringe, mucosa traqueal, mucosa bronquial y en pleura. En función del lugar en donde se produce el estímulo, estos receptores envían una señal a través de diferentes nervios (glosofaríngeo, laríngeo superior, vago o trigémino) al bulbo raquídeo, en donde se encuentra el Centro Tusígeno. Allí se 96 Cristina Fernández Paz origina una respuesta que es enviada mediante los nervios eferentes. A continuación, se produce una fase de inspiración, el cierre de la glotis (mediante un aumento de la presión pulmonar) y la apertura súbita de la glotis con exhalación [148]. Estornudo: es un acto reflejo que se produce por la estimulación del nervio trigémino en nariz y orofaringe a causa de agentes irritantes. Éstos pueden estimular terminaciones nerviosas sensoriales o desencadenar la liberación de ciertas moléculas mediadoras como, por ejemplo, la histamina. Cuando se estimulan los nervios trigéminos, se transmiten señales al centro del estornudo, situado en la médula ubicada en el tronco del encéfalo. Allí se activan neuronas parasimpáticas que se comunican con las glándulas lacrimales, pero también se activan neuronas motoras que conducen a los músculos faciales y del tracto respiratorio. Se cree que este mecanismo de defensa ayuda a evitar no sólo la entrada de partículas irritantes y patógenas en los pulmones, si no también la formación de elevadas densidades de bacterias antes de que desarrollen biopelículas patógenas [148]. Macrófagos alveolares: son células fagocíticas que derivan de monocitos y que son el principal mecanismo de defensa que hay en los alvéolos pulmonares. Teniendo en cuenta que allí no hay cilios, las partículas extrañas que han llegado a la zona alveolar y que no han pasado al torrente circulatorio, pueden ser eliminadas mediante fagocitosis por los macrófagos. La fagocitosis es altamente dependiente de varios factores, como son la composición, carga superficial, tamaño y forma los nanosistemas, así como la presencia o ausencia de ligandos en su superficie [149,150]. Así, por ejemplo, la fagocitosis aumenta con partículas que contienen en su composición fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y ácido hialurónico; partículas con alta carga superficial positiva o negativa; partículas de tamaños comprendidos entre 100-200 nm y 1-6 µm; partículas esféricas; y partículas cuya superficie está modificada con manosa, proteína surfactante A y D, O-esteroil amilopectina, albúmina de suero bovino maleilada, tuftsina [150]. Una vez fagocitadas las partículas, éstas pueden eliminarse por el sistema linfático o ser llevadas al ascensor 97 Introducción 2.4.3. Interés de la administración de antibióticos por vía pulmonar mucociliar para su llegada a la faringe y, desde allí, pueden deglutirse o ser expulsadas hacia el exterior [149]. Actividad enzimática: las enzimas presentes en el tracto respiratorio (ej.: inhibidores de proteasas, isoenzimas de la familia del citocromo P-450 y lisozimas) [151] se encargan de degradar las partículas inhaladas, por lo que influyen en la biodisponibilidad de los fármacos inhalados. Esta actividad enzimática es menor en comparación con otras vías como, por ejemplo, la oral [151]. En general, estos mecanismos de defensa disminuyen el tiempo en que permanecen las partículas e AIs en los pulmones. Por consiguiente, cuando se pretende un efecto local, es de suma importancia que el fármaco se libere muy rápidamente y se disuelva para realizar su acción terapéutica a tiempo, antes de ser eliminado. 2.4.3. Interés de la administración de antibióticos por vía pulmonar Entre los distintos tipos de enfermedades que afectan al pulmón, cabe destacar las infecciones bacterianas, fúngicas y víricas. Todas ellas llegan a afectar a gran parte de la población mundial, siendo más populares las infecciones bacterianas, cuyo tratamiento se ve frecuentemente dificultado por las resistencias a los antibióticos. Para conseguir mejores efectos terapéuticos, resulta de gran interés la administración de los antibióticos directamente al pulmón por vía inhalatoria. Ésta presenta importantes ventajas, como son la administración directa del fármaco en el lugar de acción, que da lugar a una mayor eficacia terapéutica, una reducción de la dosis administrada en comparación a otras vías (como la oral) y una disminución de los efectos secundarios/adversos asociados a la administración sistémica. Además, entre otras ventajas, se disminuye la aparición de resistencias. Entre las infecciones bacterianas, la TB tiene una elevada incidencia y produce una gran cantidad de muertes en todo el mundo cada año (ver sección 2.4.4). Por ello, se están dirigiendo muchos esfuerzos de investigación a su comprensión y tratamiento. 98 Cristina Fernández Paz 2.4.4. Tuberculosis pulmonar 2.4.4. Tuberculosis pulmonar Actualmente, la TB es una de las 10 principales causas de muerte en todo el mundo [152,153]. En el año 2020, en el ranking de fallecimientos producidos en todo el mundo debido a enfermedades infecciosas, la TB fue la segunda causa (1.5 millones de personas en el mundo [154]), tan solo por detrás de la reciente pandemia ocasionada por el SARS-CoV-2 (> 1.9 millones) [155]. La TB se ocasiona principalmente por la bacteria Mycobacterium tuberculosis [156]. La transmisión de la enfermedad se produce habitualmente por la emisión de gotitas infectadas con el bacilo al aire por personas con TB pulmonar activa. Estas gotitas presentan un tamaño inferior a 50 mm. En suspensión, se secan rápidamente originando partículas sólidas denominadas núcleos de gotitas, con tamaños de 1 a 5 mm, y pueden permanecer en el aire durante horas. Estas partículas infectadas se inhalan y se depositan en las vías respiratorias profundas. La enfermedad afecta principalmente a los pulmones, pero también puede extenderse a otros órganos [157]. La probabilidad de que un sujeto pueda infectarse por M. tuberculosis es mayor con el incremento de la concentración de núcleos de gotitas infecciosos en el ambiente, una ventilación de aire inadecuada, un tiempo prolongado en el espacio contaminado y un estado de salud general deficiente [158-160]. Para que una persona desarrolle TB, primero debe ocurrir la infección por M. tuberculosis y, en segundo lugar, dicha infección debe progresar a la enfermedad de TB [161]. Después de la infección inicial, M. tuberculosis puede ser erradicado por la respuesta inmune o, de lo contrario, avanzar la enfermedad, desarrollando TB activa. En este caso, el sujeto puede presentar síntomas de tipo pulmonar o extrapulmonar (por ejemplo, tos productiva, fatiga, fiebre, malestar, sudores nocturnos y pérdida de peso). Alternativamente, la respuesta inmune puede prevenir una mayor proliferación y diseminación de M. tuberculosis y el individuo no desarrollar TB activa, pero los bacilos permanecen vivos en los pulmones o en otros órganos durante años, ocasionando una infección latente. El 5% de los sujetos con infección latente desarrollará la enfermedad más adelante en la vida debido a una depresión inmunitaria, generalmente como consecuencia de, por 99 Introducción 2.4.5. Tratamiento de la tuberculosis: Isoniazida (INH) ejemplo, una desnutrición o el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) [162,163]. Las primeras células que se encuentran con M. tuberculosis son los macrófagos alveolares, que presentan una importancia en la protección del cuerpo humano contra la infección. Además, estos macrófagos son un nicho de crecimiento, donde los bacilos residen y se multiplican. La terapia convencional para el tratamiento de la tuberculosis (TB) recomendada por la Organización Mundial de la Salud (WHO) consiste en un difícil régimen diario de múltiples fármacos por vía oral, que comprende la toma durante los dos primeros meses de isoniazida, rifampicina, etambutol y pirazinamida (fármacos antituberculosos de primera línea) y los cuatro meses siguientes de isoniazida y rifampicina [164]. Sin embargo, aunque se estimó que la eficacia del tratamiento era del 85% [165], existen varios factores que pueden afectar a la tasa de éxito, como el uso inadecuado de medicamentos antiTB, el empleo de medicamentos de calidad deficiente o las malas condiciones de almacenamiento de los medicamentos antituberculosos. Asimismo, el tratamiento del paciente es una tarea difícil por varios motivos, ya que los fármacos antiTB presentan baja estabilidad y absorción, importante metabolismo hepático, y dificultades para llegar a los granulomas y penetrar en las bacterias. Además, el tratamiento es demasiado prolongado y lleva asociados importantes efectos secundarios indeseables (por ejemplo, tos productiva, fatiga, fiebre, malestar, sudores nocturnos y pérdida de peso [157]). Por tanto, el cumplimiento del tratamiento por parte de los pacientes puede verse comprometido [166] y, además, se pueden desarrollar resistencias bacterianas graves y generalizadas [165]. 2.4.5. Tratamiento de la tuberculosis: Isoniazida (INH) La INH es un fármaco antiTB empleado para combatir M. tuberculosis, utilizándose desde hace más de 60 años en el tratamiento de primera línea en todos los tipos de TB, siendo uno de los más efectivos hasta la fecha [167]. Fue descubierto de forma casi accidental en el año 1945 ya que, por entonces, se conocía la acción 100 Cristina Fernández Paz Figura 7. Estructura química de la isoniazida (INH). (Figura de nueva creación) tuberculostática de la estructura nicotinamida (que forma parte de la molécula INH). La INH, o piridina-4-carbohidrazida, es un polvo blanco (incoloro) sintético. Su fórmula molecular es C6H7N3O; su peso molecular, 137.14 g·mol-1; su punto de fusión, 173 °C y el LogP es de -0.64. Presenta una baja solubilidad en agua (~ 14% a 25 °C, ~ 26% a 40 °C), siendo inferior en etanol (~ 2% a 25 °C) y aún menor en cloroformo (~ 0,1% a 25 °C). En solventes orgánicos (ejemplo, éter etílico) ya es prácticamente insoluble. Además, la INH es estable a temperatura ambiente (RT). Al 1% en solución acuosa, su pH es de 5.5 a 6.5; y su pKa es de 1.82, a 20 °C [168]. La estructura de la INH (Figura 7) consta de un anillo de piridina y un grupo hidracina unido en posición “para” al nitrógeno de la piridina. Figura 7. Estructura química de la isoniazida (INH). (Figura de nueva creación) Tanto la INH como sus derivados son heterociclos con nitrógeno en su estructura y, por ello, han sido objeto de un gran interés en la química farmacéutica al tener una gran versatilidad farmacológica: antibacteriana, antimicobacteriana, antifúngica, antivírica, antitumoral, anticonvulsiva, etc. [169-172]. Concretamente, dentro del espectro antibacteriano, la INH actúa contra micobacterias de crecimiento rápido; mientras que tiene una acción bacteriostática en aquéllas de crecimiento lento o latente [168]. De hecho, la actividad más destacada de la INH es la anti-TB. Su espectro comprende varias 101 Introducción especies dentro del género Mycobacterium, como M. tuberculosis, M. kansaii y M. bovis. Realmente, uno de los grandes éxitos del uso de este fármaco es su baja concentración inhibitoria (de 0.1 a 0.7 µM [168]) contra M. tuberculosis y, aunque habitualmente se coadministra con otros fármacos, también se ha usado sola en tratamiento profiláctico. Inicialmente, la INH penetra en la bacteria cruzando la pared celular por difusión pasiva [173]. Cuando está dentro de la bacteria, la INH no es bactericida de por sí, ya que es un profármaco que, a su vez, es activado por una catalasa llamada KatG [167,168]. El metabolito obtenido origina especies de oxígeno reactivas (ROS), como son el peróxido de hidrógeno, superóxido, peroxinitrito e isonicotinoilo [174]. Este último radical interfiere en una serie de procesos celulares que conducen en último término a la inhibición de la síntesis de la pared celular, produciendo la muerte de la bacteria [175]. Asimismo, las ROS también dañan otras estructuras o moléculas vitales, como los lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, membranas, etc. [167,168], favoreciendo el efecto bactericida. Sin embargo, el uso de INH a largo plazo hace que la aparición de resistencias sea cada vez más común. En efecto, los mecanismos de resistencia más habituales son los relacionados con la enzima KatG y con el gen inhA (responsable, en último término, de la formación de la pared bacteriana), evitando que la INH se transforme en un metabolito activo. También, hay resistencias a la INH relacionadas con mutaciones de los genes ahpC, KasA y ndh [176]. Por ello, cada vez es más urgente el uso de derivados de la INH o de nuevas estrategias más específicas y efectivas del uso de la INH para el correcto tratamiento de la TB. En el primer caso, se ha sugerido el empleo de análogos de la INH más lipófilos (mediante la adición de estructuras lipofílicas a la molécula INH [177]) para mejorar su permeabilidad en las bacterias, incrementando el efecto antituberculoso. En el segundo caso, es importante tener en cuenta que las vías de administración empleadas para la INH son la oral, intravenosa e intramuscular, siendo la más usada la vía oral. Por esta ruta, el fármaco se absorbe rápidamente, alcanzando el pico de concentración sérica a las 0.5-2 h; pero existien varios factores que 102 Cristina Fernández Paz 2.5. Biocompatibilidad de las mofs con el pulmón 2.5.1. Estudios in vitro disminuyen de forma importante su biodisponibilidad, como es la toma concomitante de alimentos o la presencia de enfermedades subyacentes (ejemplo, SIDA) [178]). La distribución del fármaco en fluidos y tejidos del organismo es amplia (en torno al 61% del peso corporal), produciéndose una unión baja a proteínas en sangre. La metabolización se produce principalmente por acetilación en el hígado, siendo fuertemente dependiente de factores genéticos. La vida media es de 0.5-4 h, eliminándose a través de la orina el fármaco y los metabolitos en un 75 al 96%, a las 24 h [168]. De hecho, su principal efecto secundario es la toxicidad hepática [167]. Por ello, es interesante plantear estrategias más específicas, efectivas y con menor dosis de INH que permitan mejorar la actividad y el éxito terapéutico, disminuyendo la toxicidad y acortando los tiempos de tratamiento. 2.5. Biocompatibilidad de las MOFs con el pulmón Se ha investigado la biocompatibilidad de las MOFs en las diferentes rutas biológicas para determinar su posible toxicidad en células y tejidos, destacando especialmente los estudios dirigidos a la vía parenteral [78]. De todas las vías de administración, la vía pulmonar (objeto de este estudio) es muy interesante por ser una vía de administración novedosa y alternativa debido a sus ventajas respecto a las vías tradicionales parenteral y oral (ver sección 2.4.). Los avances más significativos en los estudios de biocompatibilidad de las MOFs destinadas al pulmón se detallan a continuación, agrupados en estudios in vitro, ex vivo e in vivo. 2.5.1. Estudios in vitro Previamente a la utilización de las MOFs como portadores de fármacos por vía pulmonar, es muy importante evaluar su biocompatibilidad mediante estudios in vitro. Así, se ha evaluado su citotoxicidad en contacto con diferentes líneas celulares. Específicamente, las NPs de Fe-MIL-101-NH2 cargadas con INH se evaluaron en fibroblastos L929 [179]; las NPs MIL-100(Fe) y el tereftálato de cromo MIL-101(Cr) (recubiertas o no de bicapas 103 Introducción 2.5.2. Estudio ex vivo lipídicas de soporte de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina) [180] se examinaron en células epiteliales alveolares murinas MLE12 [181]; NPs MIL-100(Fe), en células A549 y en la línea celular de cáncer de pulmón humano Calu-3 [182]; y las NPs de UiO-66, en células A549 [183]. En todos los casos, se observó una viabilidad elevada en todas las líneas celulares investigadas. Además, en el primer caso, las NPs se ubicaron dentro de las células L929, preservando la integridad celular. En el segundo estudio, se demostró que las bicapas lipídicas mejoran la biocompatibilidad de las NPs MIL-100(Fe) y MIL-101(Cr) en MLE12. En el tercer caso, se observó una elevada viabilidad, incluso a la concentración más alta empleada de NPs (50 µg.mL-1). Las MOFs de UiO-66 y MIL-100(Fe) han demostrado ser estables en agua por lo que, en principio, podrían ser candidatos adecuados para la administración de fármacos en el fluido pulmonar [184-186]. Además, exhiben estabilidad dependiente del pH, degradabilidad en condiciones intracelulares y resistencia a la degradación en ambientes extracelulares. La citotoxicidad evaluada con NPs de varios niveles de defectividad mostró altas viabilidades, revelando una buena biocompatibilidad de ambas NPs, UiO-66 y MIL-100(Fe) como vehículos de fármacos por vía pulmonar. Por lo tanto, y a la vista de estos resultados prometedores, se podría apoyar la biocompatibilidad de las MOFs para administración pulmonar. 2.5.2. Estudio ex vivo Los estudios ex vivo resultan también muy interesantes para conocer la biocompatibilidad. En el caso de las MOFs, se llevó a cabo un estudio ex vivo con NPs de Fe-MIL-101-NH2 en macrófagos murinos RAW 246.9 [120]. Para ello, inicialmente se extirparon los pulmones de ratas Wistar y se administraron MPs de PLGA y LC que contenían NPs Fe-MIL-101-NH2 cargadas con INH a través de la tráquea. Se comprobó que las MPs no originaban toxicidad en el tejido pulmonar y, a las 24 h, se localizaron en los macrófagos. Como era de esperar, se produjo un aumento de la concentración de INH en los macrófagos durante el experimento, especialmente con las MPs de PLGA, que activaron la fagocitosis [187-189]. Por lo tanto, además de 104 Cristina Fernández Paz 2.5.3. Estudios in vivo ser biocompatibles, estas MOFs fueron capturadas de manera eficiente por los macrófagos RAW 246.9. 2.5.3. Estudios in vivo Aunque los estudios in vitro y ex vivo son muy útiles para estudiar los sistemas, previamente a los ensayos in vivo, existen numerosos fenómenos imposibles de determinar mediante los estudios anteriores (como, por ejemplo, efectos inflamatorios). Aunque previamente a esta Tesis, no existían ensayos in vivo por vía pulmonar, existe un estudio donde las NPs de MIL-100 cargadas con GMP se administraron por vía intravenosa a ratones para el tratamiento del cancer de pulmón [82]. Se confirmó que el nanosistema llegaba a los capilares pulmonares por direccionamiento pasivo, filtrándose y accediendo al tumor [190,191]. Los resultados demostraron que las NPs de MIL-100 eran biocompatibles con el tejido pulmonar, habiendo una disminución en la proliferación de células cancerosas de los animales tratados con MIL-100-GMP. En cualquier caso, como ya se comentó, para el tratamiento de enfermedades pulmonares, es preferible una administración directa por vía pulmonar para evitar los problemas asociados a las vías oral y parenteral (dolor, efecto de primer paso hepático, etc.). Un estudio reciente propuso la administración pulmonar NPs de UiO-66 mediante instilación orotraqueal a ratones hembra C57BL/6J [183]. Tras 24 h de la administración, se comprobó que las NPs originaban una baja activación proinflamatoria en macrófagos alveolares y no se encontraba un aumento importante de los niveles de TNF-α e IL-6. Las NPs de UiO-66 se eliminaron del organismo después de 7 días de su administración. Los resultados demostraron que las NPs de UiO-66 son biocompatibles y seguras como portadores de fármacos por vía pulmonar. Sin embargo, teniendo en cuenta las barreras fisiológicas mencionadas anteriormente, así como la escasa estabilidad de las formulaciones líquidas, reviste más interés su formulación como polvos secos [192]. 105 Introducción Objetivos Diseñar y desarrollar una plataforma micro-nanoparticulada para administrar fármacos antituberculosos por vía pulmonar, consistente en redes metal-orgánicas (MOFs) de tamaño nanométrico MIL100(Fe) conteniendo un fármaco anti-tuberculoso y microencapsuladas en microsferas de manitol (Ma MS). Este objetivo general se desglosa en los siguientes objetivos específicos: Objetivo I: Cargar las nanopartículas (NPs) MIL-100(Fe) con isoniazida (INH), un fármaco antituberculoso de primera línea, utilizando el método de impregnación en dos pasos de las NPs MIL100(Fe) en una solución acuosa de INH. Objetivo II: Optimizar el procedimiento de atomización y seleccionar el excipiente más adecuado para la microencapsulación de MOFs. Objetivo III: Microencapsular las MOFs (con y sin fármaco) con el mejor excipiente de atomización y determinar la mejor relación NPs:excipiente. Objetivo IV: Caracterizar las MS obtenidas en cuanto a morfología, diámetro aerodinámico teórico, diámetro geométrico, densidad real y densidad aparente. Objetivo V: Comprobar si las MOFs y la INH son liberadas en medios pulmonares simulados. Objetivo VI: Evaluar la biocompatibilidad de las MOFs y del excipiente de atomización en cultivo de células pulmonares, así como la distribución pulmonar del sistema. 112 Cristina Fernández Paz 4. Materiales y métodos 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1. Materiales 4.1. Materiales Ácido trimésico (H3BTC, 95%, Peso Molecular-MW: 210.14 g·mol-1), cloruro férrico hexahidratado (FeCl3.6H2O ≥99%, MW: 162.20 g·mol1), isoniazida (INH, ≥99%, MW: 137.14 g·mol-1), D-manitol (Ma, ≥98%, MW: 182.17 g·mol-1), ciclodextrina α (α-CD, ≥99%, MW: 972.84 g·mol-1), dextrano (Dex, ≥99%, MW = 72200 g·mol-1), D-(+)- manosa (Man, ≥99%, MW: 180.16 g·mol-1), D-(+)-trehalosa dihidrato (Tre, ≥99%, MW: 378.33 g·mol-1), D-sorbitol (Sor, ≥98%, MW: 182.17 g·mol-1), D-(-)-fructosa (Fru, ≥99%, MW: 180.16 g·mol-1), Lglutamina, dodecilsulfato sódico (SDS) y comprimidos de tampón fosfato salino (PBS, pH = 7.4) fueron adquiridos a Sigma Aldrich (Madrid, España). La línea celular A549 fue obtenida de ATCC (Manassas, EE.UU.). El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino (FBS), tripsina-EDTA (0.05%) y Fluoromount® fueron comprados a GibcoTM (ThermoFisher Scientific, Madrid, España). Fluoruro de potasio (KF, 99%, MW: 58.09 g·mol-1) fue obtenido de Acros OrganicsTM (Madrid, España). Triton® X-100 (grado biológico molecular) fue adquirido a Laboratorios Scharlab S.L. (Barcelona España). CellTiter-Blue (AlamarBlue®) fue obtenido de Promega (Fitchburg, EE.UU.). LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit fue adquirido a InvitrogenTM (Waltham, EE.UU.). 4',6diamidino-2-fenilindol (DAPI) fue obtenido de Emp-Biotech (Berlin, Germany). Trypan Blue fue conseguido de Logos Biosystems (Sainghin-en-Mélantois, Francia). Formalina neutra tamponada (10% v/v) fue comprada a Bio-Optica (Milan, Italia). Agua MilliQ fue obtenida por filtración (filtros 0.2 μm, Millex®-GN, Millipore Iberica, Madrid, España). Etanol (96%) fue adquirido a Labkem (Murcia, España). Curosurf® (surfactante pulmonar porcino, 80 mg·mL-1 de fosfolípidos pulmonares) fue facilitado por el Profesor Almeida (de la Universidad de Lisboa, Portugal), quien lo obtuvo de Angelini Pharmacêutica, Lda. (Lisboa, Portugal). Todos los materiales se usaron sin purificación adicional. 115 Materiales y métodos 4.2. Síntesis y caracterización de las MOFs 4.2.1. Síntesis y activación de MIL-100 4.2.2. Encapsulación de isoniazida (INH) 4.2. Síntesis y caracterización de las MOFs 4.2.1. Síntesis y activación de MIL-100 Cantidades de 6.0 mmol de FeCl3.6H2O y 4.0 mmol de H3BTC fueron disueltas en 30 mL de agua destilada. La reacción se llevó a cabo mediante una síntesis asistida por microondas con un Mars-5 instrument, CEM (Midland, Canadá) a 130 °C durante 30 s, manteniendo a esta temperatura durante 5 min y 30 s. Al finalizar la reacción, se dejó que descendiera la temperatura hasta 80-90°C y se introdujeron los tubos reactores en hielo. Después, se recuperaron las NPs mediante centrifugación (a 10500 rpm, durante 25 min, a 20 °C) y, posteriormente, se lavaron con 20 mL de agua MilliQ (6 veces) y EtOH (1 vez) en una centrífuga Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R (Loughborough, Reino Unido) [195]. A continuación, se llevó acabo la “activación” o purificación de las NPs MOFs para eliminar posibles reactivos no reaccionados y dejar accesibles los poros. Para ello, las NPs se resuspendieron en 20 mL de una solución de 0.1 M de KF y se dejaron en agitación magnética durante 1 h y 40 min. Después, se recuperaron las NPs mediante centrifugación (a 15000 rpm, durante 10 min, a 20 °C) y luego se lavaron con 20 mL de agua MilliQ (2 veces) y EtOH (1 vez). A continuación, las NPs se almacenaron a RT con unas pocas gotas de EtOH para impedir el secado completo de las NPs [62]. 4.2.2. Encapsulación de isoniazida (INH) La encapsulación de INH en las NPs MIL-100 se llevó a cabo mezclando una suspensión de NPs MIL-100 (0.029 mmol de polvo seco en 500 μL de agua MilliQ) con 0.6 mL de solución de INH (0.15 M), bajo agitación durante 4 h. El sólido conformado por NPs INH@MIL-100 obtenido se recuperó por centrifugación (a 14500 rpm, durante 10 min, a 20 °C) y se resuspendió en una nueva solución de INH, repitiendo el mismo procedimiento. La cantidad de INH incorporada en las NPs MIL-100 se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, Jasco LC-4000 series, equipado con 116 Cristina Fernández Paz 4.2.3. Cálculo del porcentaje de humedad y porcentaje de materia seca de las MOFs un detector PDA MD-4015 y un multimuestreador AS-4150 controlado por un software ChromNav (Jasco Inc, España)) y análisis termogravimétrico (TGA, termobalanza SDT Q‐600, TA Instruments, New Castle, De, EE.UU.). Las condiciones de HPLC fueron: la fase móvil consistió en una solución 98:2 (v/v) de PBS (0.02 M, pH = 6.8) y MeOH. El volumen de inyección se fijó a 30 µL, la tasa de flujo fue de 1 mL·min-1 y la temperatura de la columna se estableció en 25 °C. La curva estándar de calibración presentó un buen coeficiente de correlación (≥ 0.99). El cromatograma de las soluciones estándar presentó un tiempo de retención de 8.77 min, identificado como INH (λmax a 266 nm). Los TGA se realizaron en una termobalanza SDT Q600 (TA Instruments, New Castle, EE.UU.), usando un perfil de calentamiento general (desde 30 °C a 600 °C), con una velocidad de calentamiento de 5 °C·min-1, bajo aire con un flujo de 100 mL·min-1. Las NPs INH@MIL-100 fueron conservadas a RT en la cantidad justa de agua MilliQ. 4.2.3. Cálculo del porcentaje de humedad y porcentaje de materia seca de las MOFs Para trabajar con cantidades controladas y conocidas de NPs MIL-100 (en EtOH) e INH@MIL-100 (en agua MilliQ), se determinó el porcentaje de humedad de los lotes preparados y su correspondiente porcentaje de materia seca. Inicialmente, se pesó una determinada cantidad de muestra (superior a 1 mg para que se reduzca el error). Se secó en estufa a 100 ºC durante 5 h. A continuación, se pesó la muestra seca. Para calcular el % de humedad y el % de MOFs secas, se calculó de la siguiente forma: 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 ( 2) 𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 El estudio se hizo por triplicado (n = 3). 117 Materiales y métodos 4.2.4. Dispersión de las MOFs 4.2.4.1. MOFs destinadas a estudios celulares 4.2.4. Dispersión de las MOFs La dispersión de las MOFs se hizo siempre del mismo modo, pero con pequeñas variaciones en función del uso al que se fuera a destinar (estudios celulares o atomización), así como de la muestra de NPs de la que se parte (MIL-100 (en EtOH) o INH@MIL-100 (en agua MilliQ)). 4.2.4.1. MOFs destinadas a estudios celulares Las MOFs se dispersaron en agua MilliQ, utilizando la siguiente metodología: a) Dispersión de NPs MIL-100: Se pesó en éppendorf la cantidad de MOFs (en EtOH) necesaria en función del estudio. Se eliminó el EtOH mediante lavados con agua MilliQ. Para ello, se añadió volumen suficiente de agua MilliQ (hasta 1.5 mL) y se vortexeó la muestra. Se centrifugó a 10500 rpm, 20 min y a 14 °C con una centrífuga Beckman CoulterTM Microfuge® 22R (Hyland Scientific, Stanwood, EE.UU). A continuación, se eliminó el sobrenadante, se añadió otra vez agua MilliQ hasta 1.5 mL, se vortexeó y se volvió a centrifugar en las mismas condiciones. Tras eliminar el sobrenadante, se pesaron las MOFs húmedas, se añadió el correspondiente volumen de agua MilliQ (hasta que el volumen total fuese de 1.5 mL) y se vortexeó nuevamente. Se sonicó con una punta de ultrasonidos Ultrasonic Processor UP400 S – Hielscher 700 W Digital Sonifer, Alemania) a 10% de amplitud, 30 s, seguido de dos pulsos de 1 s, manteniendo la muestra en un baño de agua-hielo (para evitar el calentamiento de las NPs y, por consiguiente, su agregación durante el proceso). Después, se realizó la caracterización físicoquímica (determinación de tamaño y potencial ζ) de las muestras (se explicará en el apartado 4.2.5.) y se hicieron diluciones seriadas hasta conseguir las concentraciones oportunas para los estudios celulares (apartado 4.5.4.). 118 Cristina Fernández Paz 4.2.4.2. MOFs destinadas a formulación por atomización b) Dispersión de NPs INH@MIL-100: Se pesó en éppendorf la cantidad de MOFs necesaria en función del estudio. Como en este caso la muestra no contiene EtOH, se omitió el paso de eliminación de este solvente y se añadió el correspondiente volumen de agua MilliQ (hasta que el volumen total fue de 2.1 mL) y se vortexeó nuevamente. Se sonicó con una punta de ultrasonidos Ultrasonic Processor UP400 S – Hielscher 700 W Digital Sonifer, Alemania) a 10% de amplitud, 30 s, seguido de dos pulsos de 1 s, manteniendo la muestra en baño de agua-hielo (para evitar el calentamiento de las NPs y, por consiguiente, su agregación durante el proceso). Después, se realizó la caracterización fisicoquímica (determinación de tamaño y potencial ζ) de las muestras (se explicará en el apartado 4.2.5.) y se hicieron diluciones seriadas hasta conseguir las concentraciones oportunas para los estudios celulares (apartado 4.5.4.). 4.2.4.2. MOFs destinadas a formulación por atomización La dispersión de las NPs se hace en solución del excipiente de atomización (solución de Ma) en una relación 1:10 (NPs:Ma), previo a su microencapsulación. Además, hay una pequeña variación teniendo en cuenta si se parte de NPs MIL-100 con o sin INH. Por lo tanto, la metodología de su dispersión se realiza como sigue: a) Dispersión de NPs MIL-100: Se pesó en falcon la cantidad de NPs MIL-100 (en EtOH) calculada para atomización. Como la muestra contiene EtOH, se eliminó el solvente mediante lavados con agua MilliQ. Para ello, se añadió volumen suficiente de agua MilliQ (hasta 11 mL) y se vortexeó la muestra. Se centrifugó con una centrífuga Beckman CoulterTM Microfuge® 22R (Hyland Scientific, Stanwood, EE.UU) a 10500 rpm, 20 min y a 14 °C. A continuación, se eliminó el sobrenadante, se añadieron hasta 11 mL de agua MilliQ, se vortexeó y se volvió a 119 Materiales y métodos centrifugar en las mismas condiciones. Tras eliminar el sobrenadante, se añadió parte de la solución de Ma (previamente preparada) hasta 10 mL y se vortexeó nuevamente. Se sonicó con una punta de ultrasonidos Ultrasonic Processor UP400 S – Hielscher 700 W Digital Sonifer, Alemania) a 10% de amplitud, 30 s, seguido de dos pulsos de 1 s, manteniendo la muestra en baño de agua-hielo (para evitar el calentamiento de las NPs y, por consiguiente, su agregación) durante el proceso. Después, se vertió la muestra en un vaso de precipitados y se barrieron las NPs que quedaron en el falcon con la restante solución de Ma, que se vortexeó e incluyó también en el vaso. Las MIL-100 se sonicaron otra vez empleando las mismas condiciones. A continuación, a la muestra se le aplicó un baño de ultrasonidos (Branson 1210, North Hampton, EE.UU) durante 15 min (condición óptima de dispersión). Finalmente, se realizó la caracterización físicoquímica (determinación de tamaño y potencial ζ) de las muestras (apartado 4.2.5.) antes de la atomización. b) Dispersión de NPs INH@MIL-100: Se pesó en falcon la cantidad de INH@MIL-100 en agua MilliQ calculada para atomización. Como en este caso la muestra no contiene EtOH, se omitió el paso de eliminación de este solvente. Se añadió parte de la solución de Ma (previamente preparada) hasta 10 mL y se vortexeó. Se sonicó con una punta de ultrasonidos Ultrasonic Processor UP400 S – Hielscher 700 W Digital Sonifer, Alemania) a 10% de amplitud, 30 s, seguido de dos pulsos de 1 s, manteniendo la muestra en baño de agua-hielo (para evitar el calentamiento de las NPs y, por consiguiente, su agregación) durante el proceso. Después, se vertió la muestra en un vaso de precipitados y se barrieron las NPs que quedaron en el falcon empleando la restante solución de Ma, que se vortexeó e incluyó también en el vaso. Las NPs INH@MIL-100 se sonicaron otra vez empleando las mismas condiciones. A continuación, a la muestra se le aplicó un baño de ultrasonidos (Branson 1210, North Hampton, EE.UU) durante 15 min (condición óptima de dispersión). Finalmente, se realizó la caracterización físico120 Cristina Fernández Paz 4.2.5. Caracterización fisicoquímica y morfológica de las MOFs dispersadas 4.3. Microencapsulación de las MOFs y caracterización de las microsferas (ms) obtenidas 4.3.1. Preparación de MS control y selección del mejor excipiente de atomización química (determinación de tamaño y potencial ζ) de las muestras (apartado 4.2.5.) antes de la atomización. 4.2.5. Caracterización fisicoquímica y morfológica de las MOFs dispersadas Las NPs MOFs se caracterizaron en cuanto a tamaño, PdI y potencial ζ mediante dispersión dinámica de luz (DLS) y anemometría láser doppler (LDA) usando un Zetasizer® Nano-ZS (Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, Reino Unido). El análisis se realizó a 25 °C, con un tiempo de estabilización de 0 s. Las medidas se hicieron por triplicado (n = 3). Además, la caracterización morfológica se realizó por Microscopía electrónica de barrido (TEM, Jem-2010 Electron Microscope, Oberkochen, Alemania) a 120 KV. Para su observación, se depositaron 10 µL de muestra en rejillas de cobre con películas de carbono y se tiñeron durante 2 min con ácido fosfotúngstico al 2% (w/v). 4.3. Microencapsulación de las MOFs y caracterización de las microsferas (MS) obtenidas 4.3.1. Preparación de MS control y selección del mejor excipiente de atomización Se eligieron siete sacáridos (Ma, α-CD, Dex, Man, Tre, Sor y Fru) como excipientes de atomización. Pertenecen a la Lista Modelo de Medicamentos Esenciales de la WHO [196] y/o a la búsqueda de ingredientes inactivos para productos farmacéuticos aprobados de la Food and Drug Administration (FDA) [197]. Se utilizan en aplicaciones médicas, en cuidado de la salud, y en la industria alimentaria y de bebidas [198]. Las soluciones de estos excipientes se atomizaron mediante una técnica sencilla, empleando un Mini Secador por aspersión Buchi® B-290 (Flawil, Suiza). El contenido en sólidos totales (t.s.c.) se fijó en 3.7 wt% y las condiciones de atomización fueron de temperatura de entrada (TInlet): 102 °C y 160 °C, aspirador: 121 Materiales y métodos 4.5.3. Preparación de las soluciones test de Ma 4.5.4. Estudios de viabilidad celular pulsos de 1 s, utilizando un baño de agua-hielo. Las NPs MIL-100 se lavaron previamente dos veces con agua MilliQ para eliminar el etanol, empleando una centrífuga Beckman CoulterTM Microfuge® 22R (Hyland Scientific, Stanwood, EE.UU.). Se caracterizaron las propiedades fisicoquímicas de las NPs MIL100 e INH@MIL-100. El tamaño de las partículas y los potenciales ζ se determinaron mediante DLS y LDA utilizando un Zetasizer (como se explicó en el apartado 4.2.5.) fijado a 25 °C. Las propiedades fisicoquímicas se analizaron por triplicado (n = 3). 4.5.3. Preparación de las soluciones test de Ma Se preparó una solución de Ma al 15% (w/v) disolviendo directamente el excipiente Ma en DMEM suplementado en condiciones estériles. Luego, se realizó una dilución en serie a la cuarta parte utilizando DMEM suplementado estéril para probar la viabilidad celular a diferentes concentraciones de solución de Ma. 4.5.4. Estudios de viabilidad celular Los estudios de viabilidad de células A549 tratadas con dispersiones acuosas de NPs MIL-100 e INH@MIL-100, y solución de Ma se realizaron utilizando CellTiter-Blue® como reactivo de viabilidad. Se sembraron dos placas de 96 pocillos con 100 µL de células A549 y DMEM (9000 células/pocillo) y se incubaron a 37 °C durante 48 h, empleando una atmósfera humidificada de 5% CO2 y 95% aire, para producir el crecimiento y desarrollo de las células hasta su confluencia. Los medios se reemplazaron con 100 µL de una mezcla de: i) 1:10 (v/v) agua MilliQ:DMEM (control positivo), ii) 1:10 (v/v) NPs MIL-100:DMEM, iii) 1:10 (v/v) NPs INH@MIL100:DMEM, iv) 1:10 (v/v) Triton (1% (v/v)):DMEM (control negativo) y v) Ma:DMEM. Se ensayaron diferentes concentraciones de nanoMOFs (NPs MIL-100 e INH@MIL-100) y Ma en DMEM (ver Tabla 8). 128 Cristina Fernández Paz Tabla 8. Concentraciones de nanoMOFs en DMEM y de Ma en DMEM evaluadas en células A549. Tabla 8. Concentraciones de nanoMOFs en DMEM y de Ma en DMEM evaluadas en células A549. nanoMOFs (mg·mL -1 ) Ma (mg·mL -1 ) 0.32 15.00 0.16 3.75 0.08 0.94 0.04 0.23 0.02 0.059 0.01 0.015 0.005 0.0037 Después de 4 h de incubación a 37 °C, se retiraron los controles y las muestras, y las células se lavaron con PBS (pH = 7.4). A continuación, se añadieron 100 µL de DMEM fresco a cada pocillo. Las células se incubaron durante 24 y 48 h. Se añadieron en oscuridad 20 µL de CellTiter-Blue® a cada pocillo para marcar los núcleos celulares y se midió la capacidad metabólica de las células vivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante después de la lisis con SDS al 3% (w/v). Brevemente, los lisados se colocaron en una placa negra de 96 pocillos y se midió la fluorescencia en un lector de microplacas (SYNERGY H1M BioTek®, Friedrichshall, Alemania) a 539 nm de longitud de onda de excitación y a 620 nm de longitud de onda de emisión mediante el software Gen5 (Image Sofware BioTek®). La viabilidad celular (%), en comparación con las células control, se calculó de la siguiente manera: 𝑎𝑎𝑎 𝑎𝑎 𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑒𝑒𝑎𝑎 𝑎𝑎𝑎𝑎𝑙𝑙 ( ) 𝑎𝑎 𝑙𝑙𝑙𝑒𝑒𝑙 𝑒𝑒𝑙 𝑎𝑎 𝑎𝑒𝑒 𝑎𝑎𝑎𝑎 𝑒𝑒𝑙𝑒𝑙𝑙𝑎𝑎 𝑎𝑎 𝑙𝑙𝑙𝑒𝑒𝑙 𝑒𝑒𝑙 𝑎𝑎 𝑎𝑒𝑒𝑎𝑎 𝑙𝑙𝑒𝑙𝑙𝑙𝑎𝑎 𝑙𝑙 𝑒 𝑙 ( 4) El estudio se realizó por cuadriplicado (n = 4). Además, se llevó a cabo un ensayo complementario para probar la viabilidad celular utilizando el instrumento Luna II (Contador Celular Automatizado Luna IITM, Logos Biosystems, Annandale, EE.UU.). 129 Materiales y métodos 4.5.5. Captación intracelular y distribución Para ello, se sembraron placas de 24 pocillos con 400 µL de células A549 y DMEM (60000 células/pocillo) y se incubaron a 37 °C durante 48 h, empleando una atmósfera humidificada de 5% CO2 y 95% aire para facilitar la crecimiento y desarrollo de las células hasta su confluencia. Los medios se reemplazaron con 400 µL de una mezcla de: i) 1:10 (v/v) agua MilliQ:DMEM (control positivo), ii) 1:23 (v/v) NPs MIL-100:DMEM, iii) 1:20 (v/v) NPs INH@MIL100:DMEM y iv) 1:10 (v/v) Triton:DMEM (control negativo). Originalmente, ambas dispersiones de nanoMOFs en agua MilliQ presentaban una concentración de 3.2 mg·mL-1 y, posteriormente, diluidas con DMEM fueron de 0.14 y 0.16 mg·mL-1 por pocillo para NPs MIL-100 e INH@MIL-100, respectivamente. Las placas se incubaron a 37 °C durante 4 h y, luego, las células se lavaron 3 veces con PBS (pH = 7.4, 5 min, a RT, en agitación de balanceo con 15° de inclinación, usando un agitador de plataforma oscilante VWR 230V (Lutterworth, Reino Unido). Las células se desprendieron mediante 120 µL de tripsina (5 min, 37 ºC). Para desactivar la tripsina, se agregaron 280 µL de DMEM. Las células se centrifugaron a 1477 rpm (Eppendorf 5415R Refrigerated Centrifuge, North Hampton, EE.UU.) durante 5 min, obteniendo un pellet que se resuspendió en 500 µL de PBS (pH = 7.4) suplementado con FBS al 10% (v/v). Se mezclaron 10 µL de muestra con 10 µL de tinción Trypan Blue (al 0.4%, w/v) mediante vórtex y las células se observaron en una cámara de contaje para obtener los valores de viabilidad mediante recuento automático de imágenes. El estudio se realizó por triplicado (n = 3). 4.5.5. Captación intracelular y distribución Se sembraron placas de 24 pocillos con 400 µL de células A549 en DMEM (60000 células/pocillo) empleando, previamente, cubreobjetos tratados con polilisina en el fondo de los pocillos. Como se indicó anteriormente, las células se incubaron a 37 °C durante 48 h, empleando una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95% para facilitar el crecimiento y desarrollo de las células hasta su confluencia. Los medios se reemplazaron con 400 µL de: i) DMEM (control) y una mezcla de: ii) 1:23 (v/v) NPs MIL-100:DMEM y iii) 130 Cristina Fernández Paz 1:20 (v/v) NPs INH@MIL-100:DMEM. Originalmente, ambas dispersiones de nanoMOFs en agua MilliQ presentaban una concentración de 3.2 mg·mL-1 y, posteriormente, diluidas con DMEM fueron de 0.14 mg·mL-1/pocillo. En el caso de las NPs cargadas con fármaco, para verificar su mejor visualización mediante microscopía confocal, se ensayaron diferentes volúmenes (20, 30, 40 y 50 µL) de dispersión acuosa de NPs INH@MIL-100 de 3.2 mg·mL-1. Las células se incubaron a 37 ºC durante 4 h y, posteriormente, se lavaron 3 veces con PBS (pH = 7.4, 5 min, a RT, en agitación de balanceo con 15° de inclinación). Las células se fijaron mediante la adición de 350 µL de formalina neutra tamponada al 10% (v/v) (15 min, a RT, en agitación de balanceo con 15° de inclinación). Entonces, se realizaron otros 3 lavados y se marcaron los núcleos de las células con 200 µL de una dilución 1:1000 (v/v) de DAPI en PBS (1 mg·mL-1). El exceso de DAPI se eliminó lavando 3 veces como se mencionó anteriormente. Los cubreobjetos de vidrio se colocaron sobre portaobjetos de vidrio empleando medio de montaje acuoso Fluoromount® para su visualización por CLSM (Leica TCS SP5 X, Wetzlar, Alemania), empleando un objetivo HCX PL APO CS 63.0 x 1.30 GLYC 21 °C UV (a 63X) y un láser blanco. Para visualizar las muestras, se añadió una gota de aceite de inmersión (lente de inmersión en aceite HCX PL Fluotar). La visualización de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100 se obtuvo mediante autorreflexión del Fe (λEx/Em: 488/485-490 nm). El color verde se configuró manualmente para las NPs MIL-100 e INH@MIL100 empleando el software LAS AF (Leica Application Suite Advanced Fluorescence). Para visualizar los núcleos de las células marcadas con DAPI, se empleó otro canal (λEx/Em: 405/414-440 nm) y se fijó el color azul. Por lo tanto, las dos señales se recopilaron utilizando canales separados. Las condiciones empleadas en CLSM se resumen en la Tabla 9. 131 Materiales y métodos 4.5.6. Cuantificación de células A549 internalizadas con NPs: Citometría de flujo Tabla 9. Condiciones empleadas en el estudio de captación y distribución intracelular de NPs de MIL100 e INH@MIL-100 (3.2 mg·mL-1 en agua MilliQ) en células A549. Tabla 9. Condiciones empleadas en el estudio de captación y distribución intracelular de NPs de MIL-100 e INH@MIL-100 (3.2 mg·mL-1 en agua MilliQ) en células A549. Muestra Volumen de dispersiones de NPs (µL) Número de acumulaciones por plano Sin NPs - 2 MIL-100 17.2 2 INH@MIL-100 17.2 2 INH@MIL-100 20.0 16 INH@MIL-100 30.0 16 INH@MIL-100 40.0 16 INH@MIL-100 50.0 16 4.5.6. Cuantificación de células A549 internalizadas con NPs: Citometría de flujo Para cuantificar las células A549 internalizadas con nanoMOFs, se llevó a cabo un estudio basado en citometría de flujo (FCM). Se sembraron placas de 24 pocillos con 400 µL de células A549 y DMEM (60000 células/pocillo). Como se indicó anteriormente, las células se incubaron a 37 °C durante 48 h, empleando una atmósfera humidificada de CO2 al 5% y aire al 95% para el crecimiento y desarrollo de las células hasta su confluencia. Los medios se reemplazaron con 400 µL de: i) DMEM (control) y una mezcla de: ii) 1:23 (v/v) NPs MIL-100:DMEM y iii) 1:20 (v/v) NPs INH@MIL100:DMEM. Originalmente, ambas dispersiones de nanoMOFs en agua MilliQ presentaban una concentración de 3.2 mg·mL-1 y, posteriormente, diluidas con DMEM fueron de 0.14 y 0.16 mg·mL-1 por pocillo para NPs MIL-100 NPs e INH@MIL-100, respectivamente. Las células se incubaron a 37 °C durante 4 h y luego, se lavaron 3 veces con PBS (pH = 7.4, 5 min, a RT, en agitación de balanceo con 15° de inclinación). Entonces, a excepción del control, las células se trataron con 200 µL de LIVE/DEADTM Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit diluido en PBS (1 µL de Aqua en 2 mL de PBS (v/v)) (15 min, a RT, en agitación de balanceo con 15° de inclinación). 132 Cristina Fernández Paz 4.6. Estudios in vivo Las células A549 se lavaron con PBS como se mencionó anteriormente y, posteriormente, se desprendieron mediante 120 µL de tripsina (5 min, 37 °C). Para desactivar la tripsina, se agregaron 280 µL de DMEM. Las células se centrifugaron a 1477 rpm (Eppendorf 5415R Refrigerated Centrifuge, North Hampton, EE.UU.) durante 5 min obteniendo un pellet que se resuspendió en 500 µL de PBS (pH = 7.4) suplementado con FBS al 10% (v/v). Finalmente, se contaron automáticamente un total de 10000 eventos, aproximadamente, empleando un citómetro modelo Accuri Becton Dickinson (BD AccuriTM, Ann Arbor, EE.UU.) y se analizaron con el software de muestra BD (BD Biosciences, San José, EE.UU.). La cuantificación de las células internalizadas con NPs MIL-100 e INH@MIL-100 se realizó por complejidad, empleando el detector de dispersión lateral (SSC-A). Además, para verificar la viabilidad de las células internalizadas se utilizó el filtro BP 515/20 (Waltham, EE.UU.) para el reactivo de viabilidad Aqua. El estudio se realizó por triplicado (n = 3). 4.6. Estudios in vivo Los procedimientos experimentales fueron realizados en la Université Paris Sud 11 (Chatenay-Malabry, Francia), de acuerdo con la normativa Europea 2010/63/EU sobre principios de cuidado de los animales de laboratorio. Así, los procedimientos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Facultad de Farmacia de la Université Paris-Sud 11 (Proyecto número 8314/201609191924867). Las ratas hembras Wistar Kyoto (7 meses, 225±14 g) fueron proporcionadas por el Centro de cría y cuidado animal Janvier Labs, Francia. Se escogió este modelo animal, debido a los excelenles resultados obtenidos previamente por nuestro grupo de investigación [192]. Además, se emplearon ratas Wistar Kyoto porque se previó que su tejido pulmonar facilitaría la visualización del sistema a nivel pulmonar. Se garantizó el uso del mínimo número de ratas para estos estudios. 133 Materiales y métodos 4.6.1. Distribución pulmonar de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100 microencapsuladas 4.6.1.1. Estudio histológico 4.6.1. Distribución pulmonar de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100 microencapsuladas 4.6.1.1. Estudio histológico Como prueba de concepto para la evaluación de la administración pulmonar, el modelo de rata parece ser apropiado ya que presenta muchas ventajas: i) bajo coste, ii) gran disponibilidad y iii) pruebas de farmacocinética y biodistribución realizadas de manera óptima en este modelo. Las ratas se dividieron aleatoriamente en grupos de 6 animales (teniendo en cuenta los estudios de biodistribución de MOFs previos y la variabilidad interindividual bastante importante previamente evidenciada). Todos los animales se agruparon en jaulas de 2 animales por jaula y se mantuvieron en una habitación con aire acondicionado (20-24 °C) en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con agua y comida disponible. Se estudiaron cuatro grupos diferentes que recibieron Ma MS control y dosis distintas (bajas o altas) de Ma-MIL-100 MS, sacrificando a los animales en diferentes momentos (0.5 o 24 h). Los grupos se denominaron: "Control" (Ma MS administradas) y "MaMIL-100-XY" correspondiente a las Ma MS que contienen NPs MIL100 (donde X = tiempo de sacrificio, 0.5 o 24 h, e Y = LD: dosis baja8 mg, o HD: dosis alta-20 mg). Previamente a la administración, se anestesió a los animales mediante inyección inguinal de un anestésico (ketamina y xilacina en solución salina). Se administraron 8 o 20 mg de cada muestra a través de una cánula traqueal (adaptador en Y, apertura de 1.3 mm) conectada a un ventilador Harvard® (Inspira ASV 55-7058, EE.UU., Aparato Harvard) en funcionamiento de 80 respiraciones·min-1, volumen total = 1.53 cm3, para simular la respiración normal de los animales. Después de 0.5 o 24 h de administración de polvo, se sacrificaron los animales, se extrajeron los pulmones y se enjuagaron con NaCl al 0.9%. Para realizar la observación histológica, los pulmones se fijaron con solución de formaldehído al 4% durante 48 h, se lavaron con PBS (pH = 7.4) y se almacenaron en solución de EtOH 134 Cristina Fernández Paz 4.6.1.2. Biodistribución (70%) a 4 °C. Posteriormente, los pulmones se tiñeron con el colorante azul de Prusia (P/S), y con hematoxilina y eosina para la identificación de NPs MIL-100 y el examen histológico de rutina, respectivamente. Se realizaron cortes histológicos transversales de diferentes secciones de pulmón (apical, medio, basal) para considerar la penetración de las NPs MIL-100. 4.6.1.2. Biodistribución La cuantificación del ligando H3BTC se realizó mediante HPLC utilizando un sistema de HPLC de fase reversa (Jasco LC-4000 series, Madrid, España), equipado con un detector PDA MD-4015 y un muestreador múltiple AS-4150 controlado por el software ChromNav (Jasco Inc, Madrid, España). Se utilizó una columna de fase reversa Purple ODS (5 μm, 4.6 x 150 mm, Análisis Vínicos, Tomelloso, España). La fase móvil empleada consistió en una solución 50:50 (v/v) de PBS (0.02 M, pH = 2.5) y MeOH. El volumen de inyección se fijó en 30 μL con un caudal de 1 mL·min-1 y la temperatura de la columna se estableció en 25 °C. La curva de calibración estándar presentó un buen coeficiente de correlación ≥ 0.99. El cromatograma de soluciones estándar mostró un tiempo de retención de 3.51 min (identificado como H3BTC, λmáx a 225 nm). Las muestras se prepararon como sigue: se añadieron 2 g de hígado, 0.1 g de bazo o riñón y 0.2 g de pulmón a 10 mL de solución de hidróxido de sodio 0.5 M. La homogeneización se realizó mediante molienda, con ayuda de un Potter. Luego, las muestras se agitaron durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente. El sobrenadante se recogió por centrifugación (14500 rpm durante 10 min) y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0.2 µm. Antes de la inyección en el sistema HPLC, las muestras se diluyeron en la fase móvil. 135 Materiales y métodos 4.6.2. Examen toxicológico 4.6.2.1. Determinación de interleucina-6 (IL-6) 4.6.2.2. Estudio histopatológico de los pulmones 4.6.2. Examen toxicológico 4.6.2.1. Determinación de interleucina-6 (IL-6) Se realizó un estudio serológico preliminar de detección de la IL6. De este modo, se extrajeron 700 µL de sangre de la cola de la rata 10 días antes del estudio para determinar los valores normales. Durante el estudio in vivo, se extrajeron otros 700 µL de sangre de rata mediante punción cardíaca. Ambos tipos de muestra de sangre se recogieron en tubos heparinizados y, a partir de ahí, se obtuvieron muestras de suero para realizar el análisis de IL-6. Los resultados obtenidos tras el estudio fueron comparados con los valores normales de IL-6. Las muestras fueron analizadas siguiendo las instrucciones especificadas en el Kit ELISA de IL-6 humana. Además, durante este estudio, la absorbancia fue medida a 450 nm en un lector de placas ELISA (Spectrostar Omega, BMG LABTECH, Offenburg, Alemania). 4.6.2.2. Estudio histopatológico de los pulmones Este estudio se hizo conjuntamente con el de la distribución pulmonar de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100 microencapsuladas. Como se explicó anteriormente, después de 0.5 h o 24 h tras la administración del polvo, se sacrificaron los animales, se extrajeron los pulmones y se enjuagaron con NaCl al 0.9%. Los pulmones se fijaron con solución de formaldehído al 4% (24 - 48 h), se lavaron con PBS (pH = 7.4) y se almacenaron en solución de EtOH (70%) a 4 °C. A continuación, para realizar el examen histológico de rutina, los pulmones se tiñeron con hematoxilina y eosina. Después, se realizaron cortes histológicos transversales de diferentes secciones de pulmón (apical, medio, basal) y se buscaron signos de daño o inflamación tisular. 136 Cristina Fernández Paz 5. Resultados y discusión 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 11. Características fisicoquímicas de las MOFs dispersadas en agua MilliQ (para estudios celulares) y en solución de Ma (para atomización) sin/con INH (media ± S.D.; n = 3). Tabla 11. Características fisicoquímicas de las MOFs dispersadas en agua MilliQ (para estudios celulares) y en solución de Ma (para atomización) sin o con INH (media ± S.D.; n = 3). Formulación destinada a Sistema (sin/con INH) Tamaños (nm) Potencial ζ (mV) estudios celulares NPs MIL-100 (en agua MilliQ) 101 ± 19 -10 ± 1 NPs INH@MIL-100 (en agua MilliQ) 137 ± 25 -17 ± 2 atomización NPs MIL-100 (en solución de Ma) 289 ± 38 -20 ± 1 NPs INH@MIL-100 (en solución de Ma) 355 ± 44 -23 ± 1 Como se puede observar en la Tabla 11, las MOFs sin o con INH dispersadas en agua MilliQ (destinadas a estudios celulares) presentan unos tamaños inferiores a 162 nm, así como unos potenciales ζ negativos entre -9 y -19 mV; siendo más grandes y negativas las MOFs cargadas con INH (ver Figura 10). Incluso, las MOFs dispersadas en solución de Ma (destinadas a atomización), permanecen con un tamaño submicrométrico (entre 251 y 399 nm) y con un potencial ζ algo más negativo (-19 a -24 mV). En estos casos, el aumento de tamaño es debido a la presencia de Ma, que establece ciertas interacciones con las MOFs, motivo por el cual también descienden sus respectivas cargas negativas, ya que el Ma tiene por propia naturaleza una carga ligeramente negativa (−8 ± 6 mV). Se cree que las NPs de carga negativa son menos tóxicas e inducen menos reacciones infamatorias que las cargadas positivamente [204], por lo que su uso es interesante. Por tanto, se puede confirmar la correcta dispersión de las formulaciones, presentando características físicoquímicas adecuadas para su utilización en posteriores estudios. 144 Cristina Fernández Paz 5.2. Microencapsulación de las MOFs y caracterización de las microsferas (ms) obtenidas 5.2.1. Caracterización de MS control y selección del mejor excipiente de atomización Figura 10. Microfotografías TEM de: (a) NPs MIL-100 y (b) NPs INH@MIL-100 dispersadas en agua MilliQ. Escala: 100 nm. (Figura de nueva creación) Figura 10. Microfotografías TEM de: (a) NPs MIL-100 y (b) NPs INH@MIL-100 dispersadas en agua MilliQ. Escala: 100 nm. (Figura de nueva creación) En las microfotografías TEM recogidas en la Figura 10, se puede comprobar cómo las NPs INH@MIL-100 presentan mayor tamaño y desviación que las NPs MIL-100, corroborando los resultados mostrados en la Tabla 11. 5.2. Microencapsulación de las MOFs y caracterización de las microsferas (MS) obtenidas Previo a la dispersión de las MOFs en la solución del excipiente de atomización, se llevó a cabo un estudio para la selección del mejor excipiente de atomización; para lo cual, se prepararon MS control (sin NPs MOFs) a partir de diferentes excipientes: Ma, α-CD, Dex, Man, Tre, Sor y Fru. 5.2.1. Caracterización de MS control y selección del mejor excipiente de atomización Se caracterizaron los polvos obtenidos tras atomización de los diferentes excipientes testados (sección 4.3.3.), prestando especial atención al PY, morfología y densidad aparente (Tabla 12). Se obtuvieron PY elevados para α-CD y Ma (74.0 ± 3.0 wt% y 58.5 ± 3.5wt %, respectivamente), en contraposición con los PY bajos 145 Resultados y discusión Tabla 12. Rendimiento del proceso de atomización (wt%), morfología y densidad aparente (g·cm-3) de MS control (polvos secos) preparadas con diferentes excipientes (media ± S.D.; n = 3). calculados para Tre y Dex (27.0 ± 1.0 wt% y 10.5 ± 1.5 wt%, respectivamente). Sor, Man y Fru no permitieron la recuperación de cantidades medibles de polvo; por lo tanto, fueron descartados. Las muestras restantes se analizaron mediante SEM (Figura 11), demostrando que la morfología de las MS depende en gran medida del excipiente utilizado. Ma MS son partículas esféricas, no agregadas, bien definidas, con una superficie lisa y homogénea (Figura 11a); mientras que α-CD MS y Dex MS son más irregulares y con una superficie más heterogénea (Figura 11b y Figura 11c, respectivamente). Por el contrario, las estructuras de Tre no resultan aptas para la administración pulmonar porque están aglomeradas. Se podría esperar que las Ma MS esféricas regulares, con menos puntos de contacto entre las partículas y menos fricción entre ellas [205], presenten mejores propiedades de flujo, facilitando su administración pulmonar. Tabla 12. Rendimiento del proceso de atomización (wt%), morfología y densidad aparente (g·cm-3) de MS control (polvos secos) preparadas con diferentes excipientes (media ± S.D.; n = 3). Formulación Excipiente atomizado PY (% en peso) Morfología Densidad aparente (g·cm-3) Ma MS manitol 58.5 ± 3.5 Esférica 0.43 ± 0.01 α-CD MS ciclodextrina α 74.0 ± 3.0 Menos esférica 0.36 ± 0.01 Dex MS dextrano 10.5 ± 1.5 Menos esférica - 1 Tre MS trehalosa 27.0 ± 1.0 Aglomerado - 1 1Muestra insuficiente para realizar este cálculo. 146 Cristina Fernández Paz Figura 11. Microfotografías SEM de MS control de: (a) Ma, (b) α-CD, (c) Dex y (d) Tre. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) Figura 11. Microfotografías SEM de MS control de: (a) Ma, (b) α-CD, (c) Dex y (d) Tre. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) La mayor densidad aparente obtenida para Ma MS (0.43 ± 0.01 g·cm-3), en comparación con α-CD MS (0.36 ± 0.01 g·cm-3; Tabla 12), puede explicarse por la diferente morfología de superficie. De hecho, la densidad aparente de α-CD MS fue muy similar a la de las MS de goma de algarrobo (alrededor de 0.37 g·cm-3), que presentan una morfología superficial análoga [137]. Las densidades aparentes de MS de Dex y de Tre no pudieron determinarse debido a su bajo PY (928%). El Ma fue el único excipiente que resultó en MS control con buenas propiedades de manipulación, probablemente porque el Ma permite obtener polvos con bajo contenido de humedad [206], lo que también debería facilitar la aerosolización in vivo. Teniendo en cuenta el elevado PY de secado por aspersión, así como las ventajas del polvo seco de las Ma MS (como, por ejemplo, la esfericidad regular de sus partículas y su menor contenido en humedad, que confieren 147 Resultados y discusión 5.2.2. Caracterización de las Ma-MIL-100 MS y Ma-INH@MIL-100 MS: Morfología y propiedades aerodinámicas propiedades de flujo mejoradas), se seleccionó el Ma como el excipiente para la microencapsulación de las nanoMOFs. El Ma se ha utilizado ampliamente en aerosolización [207], está aceptado por las autoridades reguladoras para su uso en productos farmacéuticos de inhalación, tiene características adecuadas para el secado por aspersión (lo que permite una fácil adaptación de la morfología y tamaño de las partículas [208]), mejora la manipulación de la formulación en polvo en comparación con otros excipientes (como la lactosa [151]) y, además, ayuda a la penetración de las NPs en el tracto respiratorio, debido a su efecto mucolítico y osmótico [209], resultando un excipiente prometedor para realizar la formulación con las NPs MIL-100. 5.2.2. Caracterización de las Ma-MIL-100 MS y Ma-INH@MIL-100 MS: Morfología y propiedades aerodinámicas Una vez seleccionado el Ma como el excipiente de atomización, se procedió a la preparación de las MS teniendo en cuenta varios parámetros; como por ejemplo, la temperatura de la boquilla, que puede afectar a la estabilidad del fármaco y al efecto de adsorción en la interfaz aire/líquido tras el secado de las gotitas [210]. La relación de NPs INH@MIL-100:Ma se eligió después de algunas pruebas preliminares de secado por aspersión de NPs MIL100 en solución de Ma. Para ello, se ensayaron tres proporciones distintas de NPs MIL-100:Ma (1:5, 1:10, 1:100), y el proceso de secado por aspersión se llevó a cabo con un limpiador de boquilla fijado a 5 (diámetro de 0.7 mm), una velocidad de alimentación de 2 mL·min-1, manteniendo una TInlet: 170 ± 2 °C, que fue superior a la posteriormente utilizada en la microencapsulación de NPs INH@MIL100, que fue una TInlet: 160 ± 2 °C, para asegurar la estabilidad de la INH (temperatura de fusión: 173 °C). Los resultados mostraron que las MS tenían una forma redondeada, presentando una porosidad característica (ver Figura 12). 148 Cristina Fernández Paz Figura 12. Microfotografías SEM de Ma-MIL-100 MS preparadas con una relación MIL-100:Ma de: (a) 1:5, (b) 1:10 y (c) 1:100. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) Figura 12. Microfotografías SEM de Ma-MIL-100 MS preparadas con una relación MIL-100:Ma de: (a) 1:5, (b) 1:10 y (c) 1:100. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) Como se puede ver en la Figura 12, la porosidad de la superficie de las MS disminuye a medida que aumenta el contenido de Ma. Todas las muestras de polvo obtenidas presentaron un tamaño similar, estando en el rango de 1.8 - 2.2 µm. Inicialmente, se descartaron las MS con una proporción de 1:5 ya que las MS estaban menos definidas en comparación a los otros polvos (Figura 12). Finalmente, elegimos la formulación con relación 1:10 porque permitió una mayor carga de NPs que las MS de proporción 1:100. Por precaución, la TInlet del proceso de microencapsulación de INH@MIL-100 se ajustó a 160 °C debido a la presencia de INH, cuya temperatura de fusión es 173 °C. De este modo, también se prepararon Ma MS control a 160 °C. Las apariencias de superficie de las Ma MS preparadas a ambos TInlets (170 y 160 °C) son diferentes (comparar 149 Resultados y discusión Figura 13. Microfotografías SEM de Ma MS preparadas a: (a) 170 °C y (b) 160 °C. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) imágenes de la Figura 13). Las Ma MS preparadas a 170 °C tienen una superficie más porosa (Figura 13a) que las obtenidas a 160 °C (Figura 13b). Esto podría explicarse por la temperatura de fusión del manitol (166ºC), apareciendo con un aspecto fundido a 170 °C, en contraste con una morfología intacta a 160ºC. Figura 13. Microfotografías SEM de Ma MS preparadas a: (a) 170 °C y (b) 160 °C. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) Los rendimientos de los polvos obtenidos tras la atomización de las NPs MIL-100 e INH@MIL-100 fueron elevados (ver Tabla 13). Además, las MS no están aglomeradas, presentan forma esférica y bien definida, y una superficie lisa (ver Figura 14). 150 Cristina Fernández Paz Figura 14. Microfotografía SEM de: (a) MaMIL-100 MS y (b) Ma-INH@MIL-100 MS. (Figura adaptada del trabajo de FernándezPaz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) Tabla 13. Rendimientos de los procesos de atomización utilizando Ma (media ± S.D.; n = 3). Tabla 13. Rendimientos de los procesos de atomización utilizando Ma (media ± S.D.; n = 3). Formulación Relación MOF:Ma T Inlet (°C) Rendimiento de atomización (%) Ma (control) - 170 55.8 ± 4.0 Ma (control) - 160 58.5 ± 3.5 MIL-100:Ma 1:5 170 53.3 ± 2.1 MIL-100:Ma 1:10 170 65.7 ± 5.8 MIL-100:Ma 1:100 170 72.2 ± 4.3 MIL-100:Ma 1:10 160 68.0 ± 8.0 INH@MIL-100:Ma 1:10 160 74.5 ± 3.5 Figura 14. Microfotografía SEM de: (a) Ma-MIL-100 MS y (b) Ma-INH@MIL-100 MS. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) Para evaluar el potencial interés de las Ma-MIL-100 MS y las Ma-INH@MIL-100 MS para administración pulmonar, se caracterizaron (sección 4.3.3.) sus propiedades aerodinámicas y físicas (ver Tabla 14). Tradicionalmente, los diámetros entre 1 y 5 µm están asociados a un depósito pulmonar profundo; mientras que, los obtenidos en el presente estudio, alcanzan valores por debajo de 1 µm (Tabla 14). De todos modos, teniendo en cuenta que sus propiedades aerodinámicas son similares a las de otras formulaciones previas que alcanzaron el pulmón profundo con excelentes resultados in vivo [151,193], se puede considerar que las formulaciones preparadas 151 Resultados y discusión 5.2.3. Estudio de composición e integridad estructural de las MS Tabla 14. Propiedades aerodinámicas y físicas de Ma MS, Ma-MIL-100 MS y Ma-INH@MIL-100 MS (media ± S.D.; n = 3). podrían ser aptas para la administración pulmonar. Cabe señalar que los bajos diámetros aerodinámicos obtenidos están relacionados con una naturaleza hueca de las MS. Como se esperaba, la densidad aparente de Ma-INH@MIL-100 MS (0.52 ± 0.01 g·cm-3) fue mayor que la de Ma-MIL-100 MS (0.44 ± 0.02 g·cm-3), teniendo en cuenta la carga adicional de INH (Tabla 14). La baja densidad aparente de cada formulación junto a su diámetro pequeño se relaciona con un buen comportamiento del flujo aerodinámico, tal como se demostró anteriormente para otras formulaciones [114,115]. De hecho, los valores de densidades reales y diámetros aerodinámicos están en el mismo rango que los obtenidos para otro tipo de partículas huecas que resultaron aptas para administración pulmonar [117,118]. Por lo tanto, las Ma-MIL-100 MS y las Ma-INH@MIL-100 MS presentan características teóricamente adecuadas para su llegada al pulmón profundo. Tabla 14. Propiedades aerodinámicas y físicas de Ma MS, Ma-MIL100 MS y Ma-INH@MIL-100 MS (media ± S.D.; n = 3). A la vista de los resultados presentados en la Tabla 14, las formulaciones preparadas con Ma dieron buenos resultados, así como ocurrió anteriormente para otras formulaciones microencapsuladas en Ma MS, como es en el caso de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN), CS NPs o las nanocápsulas de quitosano (CS NCs) [116,192,193]. 5.2.3. Estudio de composición e integridad estructural de las MS Los estudios de PXRD (sección 4.3.4.) muestran que la estructura cristalina de las NPs MIL-100 se mantiene no sólo tras la encapsulación de INH (Figura 15a) sino también tras su formulación Muestra Diámetro geométrico (µm) Densidad real (g.cm -3 ) Densidad aparente (g.cm -3 ) Diámetro aerodinámico (µm) Ma MS 2.3 ± 1.0 0.0666 ± 0.0001 0.43 ± 0.01 0.594 ± 0.010 Ma-MIL-100 MS 1.8 ± 0.7 0.0550 ± 0.0001 0.44 ± 0.02 0.422 ± 0.007 Ma-INH@MIL-100 MS 1.4 ± 0.4 0.0907 ± 0.0003 0.52 ± 0.01 0.422 ± 0.007 152 Cristina Fernández Paz Figura 15. Patrones PXRD de: (a) MIL-100, INH@MIL-100 e INH, y (b) INH@MIL-100, Ma-INH@MIL-100 MS y Ma MS. (Figura adaptada del trabajo de Fernández-Paz et al. [199], Molecules. 26 (2021) 6408. Copyright: © 2021 by the authors) en forma de MS, como lo demuestra la presencia de los picos característicos de Bragg de las NPs MIL-100 (Figura 15b). Por otro lado, no se observan reflexiones debidas a INH recristalizada, apoyando su encapsulación dentro de los poros. Además, los picos de difracción típicos de Ma están presentes en las MS (sobre 20 2 θ (°)). Figura 15. Patrones PXRD de: (a) MIL-100, INH@MIL-100 e INH, y (b) INH@MIL-100, Ma-INH@MIL-100 MS y Ma MS. (Figura adaptada del trabajo de 153 Resultados y discusión 256 Cristina Fernández Paz 257 Permisos 258 Cristina Fernández Paz 259 Permisos 260 Cristina Fernández Paz 261 Permisos 11. Listas de verificación 11. LISTAS DE VERIFICACIÓN Lista de verificación para Tesis con animales de experimentación. EXPERIMENTACIÓN ANIMAL ARRIVE Sí/No/NA Página Título Sí Proporcionar una descripción tan exacta y concisa como sea posible sobre el contenido del trabajo. 133136 Resumen Sí Proporcionar un resumen preciso de los antecedentes, los objetivos de la investigación, incluyendo detalles de la especie y cepa de los animales utilizados, métodos relevantes, hallazgos principales y conclusiones del estudio. 133136, 182191, 195 Antecedentes Sí Incluir suficientes antecedentes científicos (incluyendo las referencias pertinentes al trabajo anterior) a fin de comprender la motivación y el contexto para el estudio, y explicar las bases y el enfoque experimental. 133 Sí Explicar cómo y por qué la especie y el modelo animal utilizados permiten abordar los objetivos científicos y, cuando sea apropiado, la relevancia del estudio para la biología humana. 133 Objetivos Sí Describir claramente los objetivos primarios y secundarios del estudio, o las hipótesis específicas que se van a probar. 111, 112, 133136 Declaración Ética Sí Indicar el permiso del comité ético, y las leyes o decretos pertinentes para el cuidado y uso de animales, bajo las que se realiza la investigación. 133, 257, 258 Diseño del estudio Sí Número de grupos experimentales y control. 134 Sí Cualquier medida adoptada para minimizar los efectos de sesgo subjetivo al asignar los animales a los grupos de tratamiento (por ej., procedimiento aleatorio) y al evaluar los resultados (por ej., si se hace, describir quiénes eran ciegos y cuándo). 134 Sí La unidad experimental (por ej., un solo animal, grupos o 134 265 Listas de verificación 265 Listas de verificación FINANCIACIÓN La Doctoranda Cristina Fernández Paz agradece a las entidades que han financiado sus estudios de Doctorado:  Proyecto I+D+I PID2019-107500RB-I00, financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033  Instituto de Salud Carlos III de España (Acción de Salud Estratégica, Proyectos FIS PS09/00816 y FIS PSI14/00059)  Xunta de Galicia (Grupos de referencia competitivos, ED431C 2021/17-FEDER)  Proyecto H + MOF Ramón Areces  Programa español Ramón y Cajal (Proyecto 2014-16823) 273 Financiación 13. Premio 13. PREMIO DECLARACIÓN DEL PREMIO RECIBIDO POR LA DOCTORANDA Cristina Fernández Paz recibió el Primer Premio al: Best Collaborative Poster Contribution at the International Conference on Aerogels for Biomedical and Environmental Applications (Santiago de Compostela, España; Febrero de 2020), por el póster titulado: “A new micro-nanoMOF platform for pulmonary drug delivery”. Además, fue invitada a presentar una publicación en la revista Molecules, que fue financiada con dicho premio. 277 Premio 278 Cristina Fernández Paz 279 Premio